WO2014148321A1 - 筋芽細胞を含む細胞シート積層体およびその製造方法 - Google Patents

筋芽細胞を含む細胞シート積層体およびその製造方法 Download PDF

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宏信 高橋
清水　達也
岡野　光夫
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学校法人東京女子医科大学
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    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a cell sheet laminate containing myoblasts useful in fields such as biology and medicine, and a method for producing the same.
  • a tissue-like cell monolayer called a “cell sheet” has been developed and a new field of tissue regeneration technology has been established.
  • Poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) a temperature-responsive polymer grafted onto a cell culture substrate, allows confluent cells to reach a temperature below 32 ° C., the critical solution temperature (LCST) of PIPAAm. It became possible to extract
  • a cell sheet laminate containing vascular endothelial cells or neurons with the same orientation as the cell group containing myoblasts is also used. Successful. The present invention has been completed based on such findings.
  • Item 1-3 is a cell sheet containing a group of cells containing each myoblast, which is obtained by culturing myoblasts on a temperature-responsive polymer-coated substrate and detaching them from the substrate.
  • the cell sheet laminate according to any one of the above.
  • Item 6. A step of superimposing a cell sheet containing a cell group containing a second myoblast having a random orientation on a cell sheet containing a cell group containing a first myoblast having a controlled orientation.
  • the cell sheet laminate comprising myoblasts of the present invention is controlled in the orientation of each layer, myotubes can be easily formed, and application to fields such as biology, medicine, and regenerative medicine can be expected.
  • the orientation of the muscle tissue needs to be aligned in the same way as that of the living body. Since the cell sheet laminate can be efficiently engrafted in a living body in a short time and can completely recover the function of the damaged site, it can be suitably used for regenerative medicine.
  • FIG. 5 shows control of myoblast arrangement using a patterned temperature-responsive cell culture substrate and peeling of the aligned myoblast sheet.
  • A Schematic diagram of a patterned or non-patterned surface and a photograph showing the results of culturing myoblasts derived from human skeletal muscle on the patterned or non-patterned surface.
  • B Schematic diagram and photograph showing the detachment of the aligned myoblast cell sheet and a photograph of the contracted cell sheet after detachment (the original size of the adherent cell sheet was 20 ⁇ 20 mm).
  • C Schematic diagram of the process of recovering the myoblast sheet adhered to the gelatin gel from the substrate surface, and a photograph showing the culture result of the moved cell sheet.
  • the number of cell sheets containing myoblasts to be stacked is preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6, and more preferably 2 to 4.
  • the thickness of the laminate is, for example, 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 10 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the size of each sheet is not particularly limited depending on the transplant site and the intended use.
  • the medium for myoblast culture is not particularly limited as long as it uses a medium normally used for myoblasts, and a known medium can be used, but the obtained cell sheet containing the laminated myoblasts is used.
  • a medium normally used for myoblasts and a known medium can be used, but the obtained cell sheet containing the laminated myoblasts is used.
  • the components of the medium to be used have a clear origin or are recognized as pharmaceuticals.
  • Examples of materials having cell adhesion due to physicochemical properties include basic polymers such as hydrophilic polystyrene and polylysine, aminopropyltriethoxysilane, and N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane. And basic compounds such as these and condensates containing them.
  • Examples of biochemical cell adhesion materials include fibronectin, laminin, tenascin, vitronectin, RGD (arginine-glycine-aspartic acid) sequence-containing peptide, YIGSR (tyrosine-isoleucine-glycine-serine-arginine).
  • Examples include sequence-containing peptides, collagen, atelocollagen, gelatin, agarose and mixtures thereof such as Matrigel, PuraMatrix, fibrin and the like. Further examples include various glasses, plasma-treated polystyrene, polypropylene, nonwoven fabric, and paper. Of these, gelatin can be preferably used, and in particular, gelatin from porcine skin can be preferably used. By having excellent adhesion to myoblasts and low cytotoxicity, the cell sheet containing the micropatterned myoblasts can be stably transferred.
  • a cell sheet laminate containing myoblasts having regions in which the orientation of myoblasts in each sheet is the same can be obtained by using only one cell sheet containing myoblasts with controlled orientation.
  • the orientation of each sheet is made the same by self-organization by culturing a cell sheet laminate containing myoblasts using a myoblast growth medium, and then the myotubes using a differentiation-inducing medium. It is preferable to induce differentiation.
  • Cells can be obtained by arranging and culturing cells to form a layer of vascular endothelial cells or nerve cells and laminating a cell sheet containing myoblasts thereon. Since vascular endothelial cells or neurons are cultured on myoblasts with controlled orientation, they are oriented in the same direction as myoblasts with controlled orientation, so the orientation is the same as the cell group containing myoblasts. A cell sheet laminate comprising vascular endothelial cells or nerve cells is obtained. The cell sheet containing myoblasts to be laminated on the layer of vascular endothelial cells or nerve cells cultured on the myoblasts whose orientation is controlled may be previously oriented in the same direction. However, the orientation may be random.
  • the use of the cell sheet laminate comprising myoblasts according to the present invention is not limited at all, but it is preferably used for transplantation medicine and regenerative medicine for repairing muscle tissue damaged by trauma or disease, for example. it can.
  • the photoresist After irradiating with ultraviolet rays using a photomask (stripe width: 50 ⁇ m / 50 ⁇ m), the photoresist is developed in the irradiated area with a developer (2.38% tetramethylammonium hydroxide solution) (NMD-3) (Tokyo Ohka Kogyo).
  • NMD-3 tetramethylammonium hydroxide solution
  • the exposed reactive DTB group of the PIPAAm brush was converted to an inert maleimide group for selective removal using and preventing further polymerization.
  • the two cell sheets were allowed to adhere to each other, and then the sheets were harvested together by lowering the culture temperature (20 ° C.). After transfer onto a new TCPS dish or glass substrate, they were further incubated at 28 ° C. for 30 minutes and the gelatin gel was dissolved by incubating at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the cells were treated with AlexaFluor 568-conjugated phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) (1: 200 dilution in BSA-phosphate buffered saline). For 1 hour at RT.
  • MHC staining cells were treated with fluorescein-conjugated mouse anti-human MHC antibody (1:50) (R & D system, Minneapolis, Minn., USA) for 1 hour at RT.
  • the cell sheet is treated with an anti-fibronectin antibody (Abcam, Cambridge, Mass., USA) and then with a secondary antibody labeled with AlexaFluor 488 (Invitrogen). did. Images of fluorescently stained cells were acquired with a confocal laser scanning microscope (LSM510; Oberkochen, Carl Zeiss Oberkochen, Germany).
  • the transferred myoblast sheet was cultured in a differentiation induction medium (DMEM / F12 (1: 1) medium containing 2% horse serum). Although no difference in cell orientation was observed, the morphology was clearly changed microscopically when cultured in a differentiation-inducing medium (FIG. 6). As evident from the myosin heavy chain (MHC) stained image, the aligned myoblasts efficiently differentiated into myotubes, and those cells remained well aligned on normal culture dishes. (Fig. 2a, b). The myotube diameters did not differ significantly between the aligned myoblasts (Aligned) and the randomly oriented myoblasts (Random) group (FIG. 2c), while the myotube length was It was markedly increased by controlling the myoblast sequence (FIG. 2d).
  • DMEM / F12 (1: 1) medium containing 2% horse serum a differentiation-inducing medium
  • the self-organization behavior found in this study enables the creation of unique myotube formation.
  • the cell orientation of the lower sheet changes and aligns with the upper sheet, but only in the area in contact with the upper sheet Met.
  • FIG. 5a From the three-dimensional confocal image, it was confirmed that the actin fibers of the two-layered cell sheet were arranged in two different directions (FIG. 5a).
  • a myotube construct having a two-dimensionally different sequence could be created. This self-organizing behavior was also useful for making well-aligned myotube constructs consisting of multiple cell sheets.
  • a patterned PIPAAm graft glass substrate (20 ⁇ 20 mm) is placed on a TCPS dish (35 mm diameter) and human skeletal muscle myoblasts (passage: ⁇ 5) are placed 5 ⁇ on the polymer brush surface. Seeding at a density of 10 4 cells / cm 2 . Until reaching confluence, the cells were cultured in a growth medium (SkGM-2: Lonza) at 5% CO 2 and 37 ° C. to produce an orientation-controlled myoblast cell sheet.
  • SkGM-2 Lonza
  • human umbilical vein-derived vascular endothelial cells previously stained with CellTracker were seeded on an orientation-controlled myoblast sheet at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • another orientation-controlled myoblast cell sheet is recovered with a gelatin gel stamp, and the HUVEC is separated into two cells. They were laminated so as to be sandwiched between sheets, and cultured in a vascular endothelial cell growth medium.
  • the fluorescence image before laminating another orientation control type myoblast cell sheet is shown in the upper left of FIG.
  • a patterned PIPAAm graft glass substrate (20 ⁇ 20 mm) is placed on a TCPS dish (35 mm diameter) and human skeletal muscle myoblasts (passage: ⁇ 5) are placed on the polymer brush surface at 5 ⁇ 10 5 Seeding at a density of 4 cells / cm 2 .
  • the cells were cultured in a growth medium (SkGM-2: Lonza) at 5% CO 2 and 37 ° C. to produce an orientation-controlled myoblast cell sheet.

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Abstract

　筋芽細胞を含む細胞シートを複数積層させてなる、細胞シート積層体であって、各細胞シートは制御された配向性の筋芽細胞を含む細胞群を含有することを特徴とする、細胞シート積層体。好ましくは、各シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する前記細胞シート積層体。

Description

筋芽細胞を含む細胞シート積層体およびその製造方法
　本発明は、生物学、医学等の分野において有用な筋芽細胞を含む細胞シート積層体およびその製造方法に関するものである。
　天然組織の一部は、細胞および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の高度に組織化された配向性を有する。筋組織の整列された配向性は、筋線維の平行束からなる高度に組織化された構造を有する天然の骨格筋における機械的な機能を生み出す鍵となる因子である。成熟した骨格筋の発達の初期に、前駆体筋細胞である筋芽細胞が融合して筋管を形成し、新たに形成された筋管は、互いに平行に方向を合わせた後に、最終的に筋線維に成熟する。したがって、筋芽細胞の配列を制御することは、生体を模倣した筋組織を構築するための重要なステップである。
　今日まで、多数の微細加工された材料が、筋芽細胞の配列を制御するために開発されてきた（非特許文献１～５）。しかし、筋芽細胞は、基本的にこれらの微細加工された表面と分離することができないので、生体組織工学分野において成功が得られていない。この分離不可能な結び付きは、３次元を指向する筋芽細胞および筋管構造の設計を妨げてきた。
　「細胞シート」と呼ばれる組織様の細胞単層が開発され、組織再生技術の新しい分野が確立されてきた。細胞培養基材上にグラフトされた温度応答性ポリマーであるポリ（Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）により、コンフルエントな細胞が、培養温度をＰＩＰＡＡｍの臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）である３２℃より低い温度に下げることによって単一の細胞シートとして損傷なく採取されることが可能になった（特許文献１、２）。細胞シートを、その関連するＥＣＭを完全なまま伴って採取することができるので、縫合などの追加処置なしに損傷した組織に移植することができる。この技術に基づいて、筋芽細胞シートは、重症心不全を治療するのに埋め込まれている（非特許文献６）。さらに、この細胞シートに基づいた生体組織工学により、複数の細胞シートを積層することによってスキャホールド無しの３Ｄ組織を創出することが可能になった（非特許文献７，８）。個々の細胞シート上に保持されたＥＣＭのために、層をなした細胞シートは、しっかりとした層状になり、物理的にも生物学的にも互いに相互作用することができる（非特許文献９，１０）。
　また、特許文献３には筋芽細胞からなる心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体が開示されており、特許文献４には筋芽細胞などの細胞シート積層体が開示されているが、これらは各層における細胞の配向が制御されたものではなかった。
　また、非特許文献７には、筋芽細胞シートの間に血管内皮細胞をサンドイッチして培養したことが開示されている。しかし、これらもまた各層における細胞の配向が制御されたものではなかった。
特開2012-105587号公報 国際公開WO2011/024963号パンフレット 特開2012-139541号公報 再表2010/101225号公報
Biomaterials 27, 4340-4347 (2006). Biomaterials 29, 2899-2906 (2008). Biomaterials 30, 1401-1412 (2009). Biotech. Bioeng. 102, 624-631 (2009). Acta Biomater. 6, 1948-1957 (2010). Surg. Today 42, 181-184 (2012). Biomaterials 31, 1646-1654 (2010). Nat. Protoc. 7, 850-858 (2012). Biomaterials 27, 4765-4774 (2006). J. Biosci. Bioeng. 113, 128-131 (2012).
　本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものであり、配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シート積層体およびその製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シート（以下、筋芽細胞含有細胞シート、または単に筋芽細胞シートとも呼ぶ）を積層することにより、３次元筋管構築物を所望の配向性をもって構築することが可能になった。また、筋芽細胞を含む細胞シートの積層体を作り上げる際に、他の細胞シートの上に置いた配向性を有する細胞シートによって、その下にある、層をなした幾つかの細胞シートにおける細胞配向性を変えることができることを見出した。これにより、配向のよく一致した筋芽細胞を含む細胞シート積層体が作り出され、３次元を指向する筋芽細胞および筋管構築物を創出できるようになった。さらに、配向が制御された筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シート間に、筋芽細胞を含む細胞群と配向が同一の血管内皮細胞又は神経細胞を含む細胞シート積層体の作製にも成功した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．筋芽細胞を含む細胞シートを複数積層させてなる、細胞シート積層体であって、各細胞シートは制御された配向性の筋芽細胞を含む細胞群を含有することを特徴とする、細胞シート積層体。
項２．各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する、項１に記載の細胞シート積層体。
項３．前記細胞シート積層体は、筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シート間に、筋芽細胞を含む細胞群と配向が同一の血管内皮細胞又は神経細胞を含む、項２に記載の細胞シート積層体。
項４．各筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートが、温度応答性ポリマー被覆基材上で筋芽細胞を培養し、基材から剥離することにより得られたものである、項１～３のいずれか一項に記載の細胞シート積層体。
項５．各細胞シートにおける、筋芽細胞の割合が５０％以上である、項１～４のいずれか一項に記載の細胞シート積層体。
項６．制御された配向性を有する第１の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートに、ランダムな配向性を有する第２の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートを重ねる工程を含む、各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する、細胞シート積層体の製造方法。
項７．制御された配向性を有する第１の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シート上に、血管内皮細胞又は神経細胞の層を形成させ、その上に第２の筋芽細胞を含む細胞シートを重ねる工程を含む、各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群と血管内皮細胞又は神経細胞の配向が互いに同一である領域を有する、筋芽細胞および血管内皮細胞又は神経細胞を含む細胞シート積層体の製造方法。
項８．制御された配向性を有する第１の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートの下に、第１の筋芽細胞を含む細胞シートとは異なる方向の配向性を有する第２の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートを配置する工程を含む、各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する、細胞シート積層体の製造方法。
　本発明の筋芽細胞を含む細胞シート積層体は各層の配向性が制御されているため、筋管の形成が容易であり、生物学、医学、再生医療等の領域への応用が期待できる。
　再生筋組織が生体の筋組織と同様の筋力を発揮するためには筋組織の配向が生体のものと同様にそろっている必要があると考えられ、この観点から、本発明の配向制御された細胞シート積層体は、短時間で効率よく生体に生着することができ、損傷を受けた部位の機能を完全に回復させるため、再生医療に好適に使用することができる。
パターン化温度応答性細胞培養基材を使用した筋芽細胞配列の制御、および整列筋芽細胞シートの剥離を示す図。（ａ）パターン化表面または非パターン化表面の模式図、およびヒト骨格筋由来の筋芽細胞をパターン化表面または非パターン化表面で培養した結果を示す写真。（ｂ）整列筋芽細胞シートの剥離を示す模式図と写真、および剥離後の収縮した細胞シートの写真（接着細胞シートのもともとのサイズは２０ｘ２０ｍｍであった）。（ｃ）ゼラチンゲルに接着した筋芽細胞シートを基材表面から回収する工程の模式図、および移動した細胞シートの培養結果を示す写真。細胞シートは移動して３週間後でも、その整列された配向性を維持した。蛍光画像は、アクチン線維および核もまた、よく整列されていることを示す。 整列筋芽細胞シートを通常の細胞培養ディッシュに移動した後、培養することによって形成された筋管を示す図。（ａ）パターン化温度応答性表面（Ａｌｉｇｎｅｄ）および非パターン化温度応答性表面（Ｒａｎｄｏｍ）から細胞シートを移した後の筋管の共焦点顕微鏡画像（写真）。移動後、筋芽細胞シートを分化誘導培地中で５日間インキュベーションし、ミオシン重鎖をフルオレセインで染色した。スケールバー：２００μｍ。（ｂ）パターン化表面（Ａｌｉｇｎｅｄ）および非パターン化表面（Ｒａｎｄｏｍ）（ｎ＝５）から剥離し、ディッシュに移動後、培養して得られた細胞シート中の筋管の配列の分布。（ｃ，ｄ）ランダムに配向された筋芽細胞（Ｒａｎｄｏｍ）および整列された筋芽細胞（Ａｌｉｇｎｅｄ）からなる細胞シート中の筋管の直径および長さを示す図（＊＊ｐ＜０．０１）（ｎ＝５）。 ２層をなした細胞シートにおける配向性を示す図。（ａ）ランダムに配向された筋芽細胞シートおよび整列された筋芽細胞シートから成る、２層をなした筋芽細胞シート積層体の共焦点顕微鏡画像（写真）。非パターン化表面（Ｒａｎｄｏｍ）および／またはパターン化表面（Ａｌｉｇｎｅｄ）上で作製された２枚の筋芽細胞シートを、ゼラチンゲルでコーティングしたスタンプを使用して積層し、７日間インキュベーションした。アクチン線維を、細胞シート積層直後または積層後７日目に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８で染色した。整列筋芽細胞シートを直角に積層したときの、積層して０、６、１２、および１８時間後の下側の整列細胞シートの蛍光画像（写真）（ｂ）、および再配置分析結果（ｎ＝５）（ｃ）。（ｄ）ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーンおよびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）オレンジで染色した２層をなした筋芽細胞シートの積層２４時間後の蛍光画像（写真）。（ｅ）整列細胞シートと相関するフィブロネクチンの共焦点顕微鏡画像（写真）。２枚の整列筋芽細胞シートを直角に積層し、積層して０時間または２４時間後に蛍光染色した。スケールバー：１００μｍ。 多層の筋芽細胞シートからなる積層体における配向性変化を示す図。一番下の細胞シートを、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーンで染色した。スケールバー：１００μｍ。（ａ）整列（Ａｌｉｇｎｅｄ）シートを、蛍光染色した１枚のランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シート上に積層した結果を示す写真。（ｂ）３枚のランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シートを、蛍光染色したランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シート上に積層し、次に整列（Ａｌｉｇｎｅｄ）シートを、前記４枚の積層されたランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シートの上に置いた結果を示す写真。積層して４８時間後に、幾つかの細胞は、まだランダムに配向されていた（白い矢印で示す）。 細胞シートの自己組織化プロセスを介した整列された筋管形成の構築を示す図。スケールバー：２００μｍ。（ａ）整列細胞シートを、もう一方の整列筋芽細胞シートの半分の領域の上だけに積層し、２４時間後、アクチン線維を、アレクサフルオル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）５６８で染色した結果、および積層された筋芽細胞シートを、分化誘導培地中で５日間さらに培養し、次にミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性筋管を蛍光染色した結果を示す写真。（ｂ）１枚の整列（Ａｌｉｇｎｅｄ）シートを、２枚のランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シート上に積層し、次に生育培地中で２日間インキュベーションした結果を示す写真（整列／ランダム／ランダム（Ａｌｉｇｎｅｄ／Ｒａｎｄｏｍ／Ｒａｎｄｏｍ））。対照群として、３枚のランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シートを一緒に積層した（ランダム／ランダム／ランダム（Ｒａｎｄｏｍ／Ｒａｎｄｏｍ／Ｒａｎｄｏｍ））。（ｃ）初めに、２枚の整列細胞シートを分化誘導培地中で個々に５日間培養した後、その２枚の細胞シートを、細胞シート積層プロセスを通して直角に積層した結果を示す写真。 細胞培養ディッシュに移動された筋芽細胞シート中での筋管形成を示す写真。筋芽細胞シートを非パターン化表面（ａ，ｃ）またはマイクロパターン化（ｂ，ｄ，ｅ）表面から移動し、次にＴＣＰＳディッシュ上で、筋芽細胞の生育培地（ａ，ｂ）または分化誘導培地（ｃ～ｅ）中で５日間培養インキュベーションした。スケールバー：（ａ～ｄ）５００μｍ、（ｅ）１００μｍ。 筋芽細胞シート上で培養されたHUVEC細胞の染色結果を示す図（写真）。スケールバーは１００μｍを示す。 筋芽細胞シート上で培養されたHUVEC細胞の二重染色結果を示す図（写真）。スケールバーは２００μｍを示す。緑がHUVEC細胞、赤がアクチンを示す。 筋芽細胞シート上で培養された神経細胞の二重染色結果を示す図（写真）。スケールバーは１００μｍを示す。緑がＤｅｓｍｉｎ、赤がＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔを示す。
　本発明の細胞シート積層体は、筋芽細胞を含む細胞シートを複数積層させてなる、細胞シート積層体であって、各筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートは制御された配向性を有することを特徴とする。
　筋芽細胞とは、好ましくは骨格筋芽細胞であり、CD56、MyoDまたはmyogeninなどのマーカー遺伝子の発現で特徴づけられる。筋芽細胞を含む細胞シートの材料である筋芽細胞は単離されたものでも、幹細胞より分化させたものでもよい。筋芽細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
　本発明において、筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートは筋芽細胞を含んでいればよく、線維芽細胞など他の細胞が混在していてもよい。細胞シートは全細胞の５０％以上が筋芽細胞で構成されていることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の筋芽細胞で構成されている。
　「制御された配向性」とは、細胞が規則的なパターンにしたがって配置されていることを意味し、好ましくは細胞が一定方向に整列されて配置されていることを意味する。
　本発明の筋芽細胞を含む細胞シート積層体においては、例えば、第２のシートは第１のシートに対し直交する配向を有するなど、シート間で筋芽細胞の配向（配列方向）が異なっていてもよいが、好ましくは、各シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向（配列方向）が互いに同一である領域を有する。
　積層する筋芽細胞を含む細胞シートの枚数は好ましくは２～１０枚、より好ましくは２～６枚、より好ましくは２～４枚である。積層体の厚さは例えば、１０μｍ～１００μｍ、好ましくは１０μｍ～２０μｍである。各シートの大きさは移植部位、使用用途にもより、特に限定されない。
　なお、筋芽細胞を含む細胞シートは一部または全部が分化してミオシン重鎖陽性の筋管を形成していてもよい。その場合、分化させたものを積層させてもよいし、積層させてから分化させてもよい。
　本発明の筋芽細胞を含む細胞シート積層体の製造方法は特に制限されないが、パターン化された表面を有する温度応答性ポリマー被覆基材上で筋芽細胞を含む細胞群を培養して配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シートを製造し、これを基材から剥離し、積層することで得ることができる。
　以下、筋芽細胞を含む細胞シートの好ましい作製方法について説明する。
　筋芽細胞を含む細胞シートは、例えば、ａ）パターン化された表面を有する温度応答性ポリマー被覆基材上で筋芽細胞を含む細胞群を培養して該基材上に筋芽細胞を含む細胞シートを形成する工程；および、ｂ）培養温度をその温度応答性ポリマーの臨界溶解温度範囲外にして筋芽細胞を含む細胞シートを剥離する工程を含む方法により作製される。
　温度応答性ポリマーとしては０～８０℃で水和力が変わる温度応答性ポリマーが好ましい。そのような温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有するポリマーが挙げられるが、それらのポリマーは１種類以上であってもよい。
　具体的には、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、及び、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等を挙げることができ、なかでもＰＩＰＡＡｍ、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドを好ましく用いることができ、特に、ＰＩＰＡＡｍを好ましく用いることができる。ＰＩＰＡＡｍは、３２℃付近に下限臨界溶液温度を有することから、この場合、通常の培養温度（例えば、３７℃前後）から培養液を２０℃前後にすることによって、容易に細胞シートを作製することができる。
　温度応答性ポリマーはホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、上述のほかに、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されるポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－（若しくはＮ，Ｎ－ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらのうちの任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、重合体同士のグラフトまたは共重合、あるいはホモポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
　基材上に被覆される温度応答性ポリマー層の膜厚としては、温度応答性を発揮することができるものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、０．５ｎｍ～３００ｎｍの範囲内であることが好ましく、なかでも１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
　基材としては、上記刺激応答性層および細胞接着阻害層を支持することができるものであれば特に限定されるものではない。このような基材としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレートなどのアクリル系材料、セルロース、ガラス、改質ガラス、セラミックス類等が挙げられる。ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、もしくはその共重合体のような生分解性ポリマーであってもよい。また、基材が多孔質なものであってもよい。また、上記温度応答性層そのものを基材として用いるものであっても良い。
　基材の厚さとしては、上記刺激応答性層等を安定的に支持することができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、１０μｍ～１０００μｍの範囲内、好ましくは、５０μｍ～２００μｍの範囲内である。
　温度応答性ポリマーの基材への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混線等の物理的吸着等により行うことができる。
　温度応答性層の形状としては、通常、上記基材の全表面を被覆するものが用いられるが、筋芽細胞の配向を制御するためには、上記基材上にパターン状に形成されることが好ましい。上記温度応答性層が上記基材上にパターン状に形成される場合には、上記温度応答性材料組成物の塗膜を形成した後に、フォトリソ法によりパターンニングする方法や、上記温度応答性材料組成物を、グラビア印刷、フレキソ印刷、スクリーン印刷、インクジェット法等のパターン印刷法を用いてパターン状に塗布する方法を用いることができる。
　また、温度応答性層は、必要に応じて、表面処理が施されているものとすることができる。表面処理の種類により、種々の機能を付与することができるからである。表面処理としては、例えば、シラン処理などの親水性処理を挙げることができる。シラン処理などの親水性処理を施すことにより、温度応答性層の露出した表面のパターン形状を精度良く形成することができるからである。したがって、所望のパターンのマイクロパターン化筋芽細胞をより確実に得ることができる。
　シラン処理としては、例えば、シランカップリング剤を塗布するものすることができる。シランカップリング剤としてはメタクリロキシシラン、ビニルシラン、アミノシラン、エポキシシラン等を挙げることができ、なかでも、メタクリロキシシランを好ましく用いることができる。シランカップリング剤の塗布方法としては、上記シランカップリング剤を溶解しうる有機溶媒を使用して溶解させ、これを慣用の塗布方法、例えば、スピンナー法、ダイコート法、浸漬法、グラビア印刷法、ＣＶＤ（化学蒸着法）等により上記刺激応答性層を塗布する方法を挙げることができる。例えば、スピンナー法で行う場合、条件は、７００ｒｐｍ～２０００ｒｐｍで、３秒～２０秒程度とすることができる。
　筋芽細胞の培養は上述のようにして製造された温度応答性ポリマー被覆基材上で行われる。培地温度は、基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶液温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶液温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、当該分野において周知の技術を用いることができ、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。筋芽細胞を含む細胞シートの使用目的に合わせて培養時間を設定すればよい。
　筋芽細胞培養のための培地は筋芽細胞に対し通常用いられるものを用いれば特に制約されず、公知の培地を使用することができるが、得られた積層化筋芽細胞を含む細胞シートをヒトの治療に用いる場合は用いる培地の成分は由来が明確なもの、もしくは医薬品として認められているものが望ましい。
　また、筋芽細胞を筋組織に分化させるためには、分化誘導培地を用いることが好ましい。分化誘導培地としてはウマ血清を含む培地が例示される。
　培養した筋芽細胞を含む細胞シートを基材材料から剥離回収するには、培養された筋芽細胞を含む細胞シートをそのまま、または必要に応じ高分子膜に密着させ、細胞の付着した基材材料の温度を基材の被覆ポリマーの上限臨界溶液温度以上若しくは下限臨界溶液温度以下にすることによって、培養された筋芽細胞を含む細胞シートを単独で、若しくは高分子膜に密着させた場合は高分子膜とともに剥離することができる。なお、筋芽細胞を含む細胞シートを剥離することは細胞を培養していた培養液において行うことも、その他の等張液において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。
　筋芽細胞を含む細胞シートを密着させる際に使用することのできる高分子膜としては、物理化学的特性により細胞接着性を有する材料および生物化学的に細胞接着性を有する材料を挙げることができる。
　物理化学的特性により細胞接着性を有する材料としては、例えば、親水化ポリスチレン、ポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。
　また、生物化学的に細胞接着性を有する材料としては、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン－グリシン－アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン－イソロイシン－グリシン－セリン－アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、アガロースおよびこれらの混合物、例えばマトリゲル、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ、フィブリン等が挙げられる。さらに、各種ガラス、プラズマ処理を施したポリスチレン、ポリプロピレンや、不織布、紙等が挙げられる。なかでも、ゼラチンを好ましく用いることができ、特に豚皮由来ゼラチン（Gelatin from porcine skin）を好ましく用いることができる。筋芽細胞との優れた接着力および低い細胞毒性を有することにより、上記マイクロパターン化筋芽細胞を含む細胞シートの転写を安定的に行うことができる。
　筋芽細胞を含む細胞シートを、細胞シート回収用高分子膜から剥離する方法としては、筋芽細胞を含む細胞シートを安定的に剥離することができる方法であれば特に限定されるものではない。このような方法としては、例えば、移植先や、他の人工組織等の被着体との接着力の差により剥離する方法や、高分子膜を除去する方法が挙げられる。例えば、高分子膜がゼラチンを含むものである場合には、ゼラチン膜と筋芽細胞を含む細胞シートを接触させた後、培養温度に保温した状態にする。ゼラチンは培養に適した温度付近、具体的には、３３℃～４０℃の範囲内に温めることにより溶解し、筋芽細胞を含む細胞シートから除去することができる。
　このようにして得られた配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シート（マイクロパターン化筋芽細胞含有細胞シート）を積層することにより、各シートが制御された配向を有する筋芽細胞を含む細胞シート積層体が得られる。なお、筋芽細胞を含む細胞シートを高分子膜を用いて基材から剥離する場合、筋芽細胞を含む細胞シートを高分子膜と接着した状態で積層し、その後加温することにより、高分子膜を溶解させて筋芽細胞を含む細胞シート積層体を得てもよい。
　また、配向が制御された（一定方向に配列された）筋芽細胞を含む細胞シートに、配向がランダムな筋芽細胞を含む細胞シートを重ねることにより、配向がランダムな筋芽細胞を含む細胞シートは、配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シートに合わせて配向を変化させるため、各シートにおける筋芽細胞の配向が互いに同一である領域を有する筋芽細胞を含む細胞シート積層体を得ることができる。このような各シートにおける筋芽細胞の配向が互いに同一である領域を有する筋芽細胞を含む細胞シートは筋管など筋組織の形成に有利である。この方法によれば配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シートを一枚用いるだけで各シートにおける筋芽細胞の配向が互いに同一である領域を有する筋芽細胞を含む細胞シート積層体が得られるため、有利である。なお、この場合、筋芽細胞増殖培地を用いて筋芽細胞を含む細胞シート積層体を培養することで自己組織化により各シートの配向を同一にさせ、その後、分化誘導培地を用いて筋管に分化誘導することが好ましい。
　また、配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シートの下に、それとは異なる方向の配向性を有する（例えば、直交する配向性を有する）筋芽細胞を含む細胞シートを配置すると、下側の筋芽細胞を含む細胞シートは上側の筋芽細胞を含む細胞シートに合わせて配向を変化させるため、各シートにおける筋芽細胞の配向が互いに同一である領域を有する筋芽細胞を含む細胞シート積層体を得ることができる。なお、この場合、筋芽細胞増殖培地を用いて筋芽細胞を含む細胞シート積層体を培養することで自己組織化により各シートの配向を同一にさせ、その後、分化誘導培地を用いて筋管に分化誘導することが好ましい。
　なお、それぞれの筋芽細胞を含む細胞シートを分化誘導させ筋管を形成させてから、これらの細胞シートを積層した場合、自己組織化は起こらず、それぞれの細胞シートの配向性が維持された細胞シート積層体を得ることができる。この場合、各層で異なる配向性を有する積層体をデザインすることができる。
　また、筋芽細胞を含む細胞シート積層体は、筋芽細胞を含む細胞群を有する細胞シート間に、筋芽細胞を含む細胞群と配向が同一の血管内皮細胞又は神経細胞を含むものであってもよい。血管内皮細胞又は神経細胞は生体から単離されて培養されたものでもよいし、iPS細胞などの幹細胞から誘導されたものでもよい。
　このような血管内皮細胞又は神経細胞をサンドイッチした筋芽細胞を含む細胞シート積層体は、例えば、配向が制御された筋芽細胞を含む細胞群を含む細胞シートの上に、血管内皮細胞又は神経細胞を配置して培養することにより血管内皮細胞又は神経細胞の層を形成させ、その上に、筋芽細胞を含む細胞シートを積層することで得ることができる。血管内皮細胞又は神経細胞は配向が制御された筋芽細胞上で培養されることにより、配向が制御された筋芽細胞と同一方向に配向するため、筋芽細胞を含む細胞群と配向が同一の血管内皮細胞又は神経細胞を含む細胞シート積層体が得られる。
　なお、配向が制御された筋芽細胞上に培養された血管内皮細胞又は神経細胞の層の上に積層させる筋芽細胞を含む細胞シートは、あらかじめ同一方向に配向されたものであってもよいし、配向がランダムのものでもよい。配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シート上に血管内皮細胞又は神経細胞の層を形成させ、その上に配向がランダムな筋芽細胞を含む細胞シートを重ねることにより、配向がランダムな筋芽細胞を含む細胞シートは配向が制御された筋芽細胞を含む細胞シートに合わせて配向を変化させるため、各シートにおける筋芽細胞の配向が互いに同一である領域を有する筋芽細胞および血管内皮細胞又は神経細胞を含む細胞シート積層体を得ることができる。
　本発明で示される筋芽細胞を含む細胞シート積層体の用途は、何ら制約されるものではないが、例えば外傷や疾病により損傷した筋組織を修復するための移植医療や再生医療に好適に使用できる。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜方法＞
マイクロパターン化温度応答性表面の作製
　マイクロパターン化温度応答性表面を作製するオリジナルの手順は、以前に報告されている（Biomacromolecules 12, 1414-1418 (2011)）。具体的には、ＰＩＰＡＡｍブラシを表面開始可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合法（Biomacromolecules 11, 1991-1999 (2010)）によってガラス基材上に形成し、次にポジ型フォトレジスト（ＯＦＰＲ‐８００　ＬＢ、３４ｃｐ）（東京応化工業）を、ＰＩＰＡＡｍブラシ表面上に、スピンコーターＡＣＴ‐３００Ｄ（ＡＣＴＩＶＥ）で８，０００ｒｐｍにて３０秒間スピンコートした。フォトマスク（ストライプ幅：５０μｍ／５０μｍ）を用いて紫外線を照射した後、照射領域でフォトレジストを現像液（２．３８％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド溶液）（ＮＭＤ‐３）（東京応化工業）を用いて選択的に取り除き、さらなる重合を防ぐために、ＰＩＰＡＡｍブラシの露わになった反応性末端ＤＴＢ基を、不活性なマレイミド基に変換した。残留フォトレジストをアセトンで取り除いた後、親水性ポリマーＰＡｃＭｏを、ＤＴＢを末端にもつＰＩＰＡＡｍブラシ領域上に、空間選択的に重合して、ＰＡｃＭｏ‐ｂ‐ＰＩＰＡＡｍブロックポリマーブラシおよびＰＩＰＡＡｍブラシ領域（５０μｍ／５０μｍストライプ）から成るマイクロパターンを生じた（図１ａ左上）。対照として、表面にＰＡｃＭｏのマイクロパターンを有しない、ＰＩＰＡＡｍポリマーがグラフトされたガラス基材を用意した（図１ａ左下）。
細胞培養
　ヒト骨格筋の筋芽細胞を、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）ディッシュ上で５％ＣＯ2、３７℃にて骨格筋の筋芽細胞の生育培地（ＳｋＧＭ‐２：Ｌｏｎｚａ）中で培養した。上記で作製した、パターン化または非パターン化ＰＩＰＡＡｍグラフトガラス基材（２０ｘ２０ｍｍ）を、ＴＣＰＳディッシュ（直径３５ｍｍ）に置き、筋芽細胞（継代：＜５）を、該ポリマーブラシ表面上に５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種した。コンフルエントに達するまで、接着細胞を５％ＣＯ2、３７℃にて培養し、顕微鏡ＥＣＬＩＰＳＥ　ＴＥ２０００‐Ｕ（ニコン、東京、日本）を用いて位相差顕微鏡での観察を行った。
　筋芽細胞を分化誘導培地（２％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２　１：１）で５日間培養することによって筋管形成が達成された。細胞培養用の全試薬は、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国）から入手した。
細胞シートの操作および積層化
　ゼラチンゲルをＰＩＰＡＡｍグラフト表面上に作られた筋芽細胞シート上に置き、それらを共に３０分間２８℃でインキュベーションして、ゼラチンゲルを筋芽細胞シートに接着させた。次に、それらを３０分間２０℃でインキュベーションして、基材表面から筋芽細胞シートを剥離させた。ゼラチンゲルとともに細胞シートを新しいＴＣＰＳディッシュ上に移動し、ディッシュ中で３７℃にて培地中でさらにインキュベーションし、ゼラチンゲルを溶かした。
　細胞シートの積層については、採取した第２の細胞シートをもう一方の細胞シート上に移動した。２層をなした細胞シートを２８℃にて３０分間インキュベーションし、２枚の細胞シートを互いに接着させ、次に培養温度（２０℃）を下げることによって、それらのシートを一緒に採取した。新しいＴＣＰＳディッシュまたはガラス基材上に移動した後、さらにそれらを２８℃で３０分間インキュベーションし、３７℃にて３０分間インキュベーションすることによってゼラチンゲルを溶かした。
　細胞シート積層後の細胞配向性の逐次的な変化を観察するために、下の細胞シート中の筋芽細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーン（インビトロジェン社）を用いて染色した。パターン化表面または非パターン化表面に接着した筋芽細胞の細胞シートを、色素（最終濃度：３μＭ）を含有する無血清培地中で１５分間インキュベーションした。新鮮な血清含有培地と交換した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）オレンジ（インビトロジェン社）で染色した細胞シート、または染色していない細胞シートを、上記と同じ方法で、処理した細胞シート上に積層した。いずれの場合も、整列した配向性を有する筋芽細胞シートは、多層細胞シート構築物の上に置いた。
免疫蛍光染色
　コンフルエントな細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで１５分間３７℃にて固定し、リン酸緩衝食塩水中の０．５％トリトンＸ‐１００で５分間、室温（ＲＴ）にて透過処理をした。固定した細胞を、リン酸緩衝食塩水中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間、ＲＴにてブロックした。リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、細胞を、アレクサフルオル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）５６８結合ファロイジン（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）（ＢＳＡ‐リン酸緩衝食塩水中で１：２００の希釈）で１時間、ＲＴにてインキュベーションした。ＭＨＣ染色については、フルオレセイン結合マウス抗ヒトＭＨＣ抗体（１：５０）（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）で、１時間、ＲＴにて細胞を処理した。フィブロネクチンを観察するために、細胞シートを、抗フィブロネクチン抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）で処理し、次にアレクサフルオル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）４８８（インビトロジェン社）で標識された二次抗体で処理した。共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ５１０；オーバーコッヘン（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）、カールツァイスオーバーコッヘン（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ　Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）、ドイツ）によって、蛍光染色した細胞の画像を取得した。
　筋管の配列、長さ、および直径を評価するために、ＭＨＣ陽性の筋管の免疫蛍光画像を、４０および２００倍率で３つの代表的な視野の下で取り、全データを平均値＋／－標準偏差（ｎ＝５）として表わした。筋管配向性に関して、値０°はストライプパターンの軸に平行な配列を示し、９０°は、直角な配列を表わす。統計的有意性を、スチューデントｔ検定によって計算した。
＜結果＞
　筋芽細胞の配向性を制御するために、親水性のポリ（Ｎ‐アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭｏ）を、従来のフォトリソグラフィー技術を使用して温度応答性ＰＩＰＡＡｍブラシ表面上に空間選択的にグラフトした。結果として、２つの異なるポリマー領域のストライプパターン（５０μｍ）が、その表面上に形成された（図１ａ）。
　ヒト骨格筋の筋芽細胞を、一度の細胞播種によってマイクロパターン化表面上に配列した。細胞は、２つの異なる領域間の細胞親和性の違いを認識し、その結果、ＰＩＰＡＡｍおよびＰＩＰＡＡｍ‐ｂ‐ＰＡｃＭｏブラシのストライプパターンと同じ方向に広がった。さらに、整列された筋芽細胞は、その細胞配列を維持してコンフルエントに達した。
　温度を下げることにより、ＰＩＰＡＡｍをグラフトされた表面から、整列された筋芽細胞の単一の細胞シートが剥離された（図１ｂ）。細胞シート上に置いた、ゼラチンゲルでコーティングしたスタンプを使用して、細胞シートを採取および移動することができる。移動された筋芽細胞は、通常の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）ディッシュ上でさえも、移動後少なくとも３週間、よく整列したままであった（図１ｃ）。
　筋管への分化を開始するために、移動された筋芽細胞シートを、分化誘導培地（２％ウマ血清含有ＤＭＥＭ/Ｆ１２（１：１）培地）で培養した。細胞配向性における違いは観察されなかったけれども、分化誘導培地で培養することにより、その形態は顕微鏡的に見て明らかに変化した（図６）。ミオシン重鎖（ＭＨＣ）染色画像からも明らかなように、整列された筋芽細胞は、効率的に筋管に分化し、それらの細胞は、通常の培養ディッシュ上でもよく整列したままであった（図２ａ，ｂ）。整列した筋芽細胞（Ａｌｉｇｎｅｄ）とランダムに配向された筋芽細胞（Ｒａｎｄｏｍ）群（図２ｃ）との間では、筋管の直径は、大きく異ならなかった一方で、筋管の長さは、筋芽細胞の配列を制御することによって顕著に増加した（図２ｄ）。
　ゼラチンゲルでコーティングしたスタンプを利用して、ランダムな配向性をもつ筋芽細胞シート（ランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シート）および整列された配向性をもつ筋芽細胞シート（整列（Ａｌｉｇｎｅｄ）シート）を積層した。ランダムに配向された筋芽細胞は、整列シートに積層したとき、その配向性を変え、最終的には、それらの細胞自体が、上または下の細胞シートにかかわらず、積層された整列シートと同じ方向に整列された（図３ａ；上列および中列）。その結果として、２層をなした筋芽細胞シート中の筋芽細胞すべてが、整列細胞シートと同じ方向に配列された。
　次に、２枚の整列筋芽細胞シートを直角に積層した。興味深いことに、下のシートにおける筋芽細胞配向性が、上のシートの配向に従って変化した（図３ａ；下列）。この挙動を逐次的に観察するために、下の細胞シートのみを蛍光染色し、次に染色していない整列細胞シートを、染色した細胞シート上に直角に積層した。実際には、この挙動は約２４時間以内に急速に起こり、下の細胞の約半分が積層後１２時間でその配向性を再配置した（図３ｂ，ｃ）。加えて、自己組織化した２層をなした筋芽細胞シートでは、上および下の細胞シートを形成していた細胞は、図３ｄに示されるようにシート間を移動し、その結果分けることができなくなった。ＥＣＭとして存在するフィブロネクチンは、筋芽細胞と同様に配向しており、細胞配向性の変化と密接に関連した。具体的には、下の細胞シートのフィブロネクチンも、２層をなした細胞シートの細胞配向性の変化に伴い、整列細胞シートとの積層によって再配置した（図３ｅ）。
　また、この自己組織化挙動は、幾つかの層をなした筋芽細胞シートでも観察された。例えば、３枚のランダムシートを、１枚の染色したランダムシート上に置き、次にこれら４枚の積層されたランダムシートの上に整列シートを積層した。３枚の細胞シートが、一番上の整列シートと一番下のランダムシートとの間に存在するにもかかわらず、一番下のシート内の大部分の細胞は、その配向性を自己組織化して、一番上の整列細胞シートと同方向に配列した（図４ｂ）。２枚の積層された細胞シート（図４ａ）と比較すると、３枚のランダムなシートを加えることは、一番下のシートの配向性の変化を遅らせ、一番下のシートの幾つかの細胞は、積層して２４時間後にまだ、ランダムな配向性を有していた。さらに、積層して４８時間後に至っても少数の細胞がランダムな配向性を有していた（図４ｂ）。
　本研究で見出された自己組織化挙動により、特有の筋管形成の創出が可能になる。２枚の整列シートを、図５ａに示されるように部分的に積層した場合、下のシートの細胞配向性が変化し、上のシートと整列するが、それは、上のシートと接触した領域のみであった。３次元共焦点画像から、２層をなした細胞シートのアクチン線維が２つの異なる方向に配列されていることが確認された（図５ａ）。この筋芽細胞構築物を分化誘導培地中で培養することによって、二次元的に異なる配列をもつ筋管構築物を創り出すことができた。
　また、この自己組織化挙動は、複数の細胞シートから成るよく整列された筋管構築物を作るのに有用であった。２枚のランダム（Ｒａｎｄｏｍ）シート上に積層したとき、１枚の整列（Ａｌｉｇｎｅｄ）シートは、下部の筋芽細胞配向性を変え、最終的には３重の層をなした細胞シートにおいてすべての筋管がよく同一方向に整列された（図５ｂ）。すなわち、１枚の整列筋芽細胞シートがあれば、複数の細胞シートから整列された筋管構築物を作るのに十分であった。
　他方、３Ｄ直角指向筋管形成もまた、２枚の整列筋芽細胞シートの積層によって創出可能であった。初めに分化誘導培地中で培養して筋管を形成させ、次に整列筋管構築物を、細胞シート積層プロセスを使用して直角に積層した。筋管配向性は設計通り維持されることから、整列細胞シートを積層することによって、垂直に異なる配向性をも作ることができた（図５ｃ）。
血管内皮細胞の導入
　パターン化ＰＩＰＡＡｍグラフトガラス基材（２０ｘ２０ｍｍ）を、ＴＣＰＳディッシュ（直径３５ｍｍ）に置き、ヒト骨格筋の筋芽細胞（継代：＜５）を、該ポリマーブラシ表面上に５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種した。コンフルエントに達するまで、生育培地（ＳｋＧＭ‐２：Ｌｏｎｚａ）中で５％ＣＯ2、３７℃にて培養し、配向制御型の筋芽細胞シートを作製した。次に、あらかじめＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒで染色したヒト臍帯静脈由来の血管内皮細胞（HUVEC）を5x104 cells/cm2の密度で配向制御型の筋芽細胞シート上に播種した。３時間程度～１日培養してHUVECが筋芽細胞シート上に十分に接着したことを確認した後、別の配向制御型筋芽細胞シートをゼラチンゲルスタンプにより回収し、HUVECを２枚の細胞シートで挟むように積層し、血管内皮細胞増殖培地で培養した。別の配向制御型筋芽細胞シートを積層する前の蛍光像を図７左上に、積層後の蛍光像を図７左下に示す。
　対照として、ランダムな配向を有する筋芽細胞シートの上にHUVECの層を形成させ（図７左下）、その上に、別のランダムな配向を有する筋芽細胞シートを作製した（図７右下）。
　その結果、HUVECの細胞層を配向制御型の筋芽細胞シートでサンドイッチした場合、筋芽細胞と同一の方向に、HUVECによる血管のネットワーク構造が形成されることが分かった。
　また、作製した細胞シート積層組織を血管内皮細胞増殖培地で７日間培養した後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、HUVECを蛍光標識したUlex Europaeus Agglutinin-1（ＵＥＡ－Ｉ）と反応させて緑に、筋芽細胞のアクチンを蛍光標識したphalloidinと反応させて赤に染色する。結果を図８に示す。ランダムな配向を有する筋芽細胞シートでサンドイッチした場合は血管の方向はばらばらであったのに対し、配向制御型の筋芽細胞シートでサンドイッチした場合、筋芽細胞と同一の方向に、HUVECによる血管のネットワーク構造が形成された。
神経細胞の導入
　パターン化ＰＩＰＡＡｍグラフトガラス基材（２０ｘ２０ｍｍ）を、ＴＣＰＳディッシュ（直径３５ｍｍ）に置き、ヒト骨格筋の筋芽細胞（継代：＜５）を、該ポリマーブラシ表面上に５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種した。コンフルエントに達するまで、生育培地（ＳｋＧＭ‐２：Ｌｏｎｚａ）中で５％ＣＯ2、３７℃にて培養し、配向制御型の筋芽細胞シートを作製した。次に、ヒトiPS細胞から分化させた神経細胞（iCell Neurons, Cellular Dynamics international社製）を1x103～2x104 cells/cm2の密度で配向制御型の筋芽細胞シート上に播種した。24時間培養して神経細胞が筋芽細胞シート上に十分に接着したことを確認した後、別の配向制御型筋芽細胞シートをゼラチンゲルスタンプにより回収し、神経細胞を２枚の細胞シートで挟むように積層し、神経細胞増殖培地で5日間培養した。その後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーのニューロフィラメントを赤に、筋芽細胞マーカーのデスミンを緑に、それぞれ抗体を用いて染色した。結果を図９左に示す。
　対照として、ランダムな配向を有する筋芽細胞シートの上に神経細胞の層を形成させ、その上に、別のランダムな配向を有する筋芽細胞シートを作製した（図９右）。
　その結果、神経細胞の層を配向制御型の筋芽細胞シートでサンドイッチした場合、筋芽細胞と同一の方向に、神経のネットワーク構造が形成されることが分かった。
　本発明を利用すれば、配向性が制御された筋芽細胞を含む細胞シート積層体を効率よく得ることができ、再生医療などの分野で有用である。

Claims (8)

  1. 筋芽細胞を含む細胞シートを複数積層させてなる、細胞シート積層体であって、各細胞シートは制御された配向性の筋芽細胞を含む細胞群を含有することを特徴とする、細胞シート積層体。
  2. 各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する、請求項１に記載の細胞シート積層体。
  3. 前記細胞シート積層体は、筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シート間に、筋芽細胞を含む細胞群と配向が同一の血管内皮細胞又は神経細胞を含む、請求項２に記載の細胞シート積層体。
  4. 各筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートが、温度応答性ポリマー被覆基材上で筋芽細胞を培養し、基材から剥離することにより得られたものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞シート積層体。
  5. 各細胞シートにおける、筋芽細胞の割合が５０％以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞シート積層体。
  6. 制御された配向性を有する第１の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートに、ランダムな配向性を有する第２の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートを重ねる工程を含む、各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する、細胞シート積層体の製造方法。
  7. 制御された配向性を有する第１の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シート上に、血管内皮細胞又は神経細胞の層を形成させ、その上に第２の筋芽細胞を含む細胞シートを重ねる工程を含む、各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群と血管内皮細胞又は神経細胞の配向が互いに同一である領域を有する、筋芽細胞および血管内皮細胞又は神経細胞を含む細胞シート積層体の製造方法。
  8. 制御された配向性を有する第１の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートの下に、第１の筋芽細胞を含む細胞シートとは異なる方向の配向性を有する第２の筋芽細胞を含む細胞群を含有する細胞シートを配置する工程を含む、各細胞シートにおける筋芽細胞を含む細胞群の配向が互いに同一である領域を有する、細胞シート積層体の製造方法。
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