JP2015511482A - 3dインビトロ二相性軟骨構造物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)一層の人工軟骨組織、および
(b)一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含むその人工骨組織
を含み、前記の一層の人工軟骨組織が前記の一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを提供する。
‐構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種するステップ、
‐前記構造付与性スキャフォールド上で前記間葉系幹細胞を2〜10日間、好ましくは5〜8日間、より好ましくは7日間培養するステップ、
‐骨髄構造を植えつけられた構造付与性スキャフォールドを含む一層の人工骨組織を調製するために、その構造付与性スキャフォールド上の間葉系幹細胞に造血幹細胞を添加し、そして、その結果の混合物を少なくとも5日間、好ましくは5日間〜8週間、より好ましくは1週間〜4週間培養するステップ、
‐請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法によって調製された人工軟骨組織を供給するステップ、および
‐前記の一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に前記の人工軟骨組織の層を配置するステップ
を含む、またはそれらのステップから成る。
‐本発明の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法も対象とする。
(a)間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
(b)それらの間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む方法も対象とする。
‐本発明の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐その各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法を対象とする。
(a)単離された間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
(b)それらの間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む。
‐本発明の人工軟骨形成細胞凝集体または本発明の方法によって調製された細胞凝集体またはそれらに由来する組織の試料を提供するステップ、
‐各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと前記の処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法をさらに教示する。
I.人工骨組織の形成
細胞
標準的な手法により間葉系幹細胞(MSC)を単離する。簡単に説明すると、骨髄吸引物をPBSで徹底的に濯ぎ、そして、フィコール密度勾配遠心分離によりPBMC(末梢血単核球)を単離した。プラスチック接着により間葉系前駆細胞を単離し、最大で4継代の増殖期がそれに続く。MACS技術(ミルテニー(Miltenyi)バイオテク社)を用いてCD34の発現によって臍帯血試料からヒト造血幹細胞を単離した。補足培地(ステムスパン(Stemspan)(登録商標)+100ng/mlのTPO、FLT3、IL6およびSCF)中でHSCを培養した。
人工骨髄のためのプラットフォームは3Dセラミックスキャフォールド(スポンセラム(Sponceram)(登録商標)、ツェルベルク(Zellwerk)社)によって提供される。協調的増殖、分化および微小環境の再調整を誘導するため、細胞外マトリックスの沈着とシグナル伝達分子の発現に応じて、造血幹細胞の添加の1週間前にこのセラミックスに間葉系幹細胞を播種する。その後、静置培養か連続栄養供給に適した潅流システムのどちらかでそのセラミックスをさらに培養する。遺伝子発現分析、FACS技術による異なる細胞集団の構成、および典型的な生物学的機能(HSCの維持と増殖、個々の幹細胞ニッチの発生、免疫学的問題)の判定によって骨髄の機能性を評価する。
骨関節炎とリウマチ性関節炎は両方とも軟骨構造を冒す退行性疾患である。軟骨内の細胞は非常にわずかな固有の自己修復能力しか持たないので、様々な要因(例えば、機械的過剰負荷、年齢、傷害、および炎症)が口火となって、組織構造が不可逆的に失われる。それ故、軟骨の再生過程を誘導するための代替的戦略を見出すことに多くの努力が過去数十年間に払われてきた。近年では、再生医療における自律的細胞の適用が精力的な研究の対象である。しかしながら、間葉系前駆細胞の理想的な供給源とインビトロ分化に最適な培養条件の両方が確立されずにいる。間葉系間質細胞/幹細胞は、骨髄供給源または他の組織供給源から得ることができる細胞の数は限定的であるが、全ての間葉系組織において分化するそれらの能力のために傑出している。したがって、健康な組織から単離され、続いて増殖された自律的細胞を使用することがこの課題を解く1つの有望な戦略である。
初代軟骨細胞の単離と培養
自発的なドナーに由来する膝関節軟骨をシャリテ(ドイツ、ベルリン医科大学)のベルリン筋骨格研究センターならびにウィルヒョーキャンパスのシャリテ実験病理学研究所から得た。本研究は地区倫理委員会(ベルリン大学病院、シャリテ・ミッテキャンパス)によって認可された。軟骨組織を小片に細かく切り刻み、そして、DMEM中のコラーゲナーゼ(1mg/ml、シグマ・アルドリッチ社)を使用して37℃で一晩酵素消化することにより軟骨細胞を遊離させた。細胞を70μmのナイロン製セルストレイナー(BDファルコン(商標)、ベルギー)を通す濾過により消化された組織から分離し、PBSで洗浄し、そして、10%FCSを含有するDMEM中で培養した。37℃の加湿大気(5%CO2/空気)を有するウォータージャケット型恒温器内で、10%FCSとペニシリン/ストレプトマイシン(ギブコ社)を添加されたDMEM培地(ギブコ社)中で初代軟骨細胞を培養した。それらの細胞は少なくとも10回継代させられて完全脱分化表現型になった。
FACSによる表面発現分析。脱分化軟骨細胞の様々な間葉系幹細胞(MSC)表面マーカー分子の発現についてそれらの脱分化軟骨細胞を直接免疫蛍光染色により分析した。細胞をトリプシン処理と遠心分離により回収し、そして、細胞ペレットをPBS/BSA(0.5%)に再懸濁した。細胞を蛍光標識抗体と共に15分間室温で保温した。イソタイプ対照として、MSC抗体と同じイソタイプのT細胞マーカー分子で細胞を染色した。次に染色アッセイ物をPBS/BSAで洗浄し、そして、遠心分離して未結合の抗体を除去した。細胞ペレットを400μlのPBS/BSAに再懸濁し、FACSカリバー(商標)(BDバイオサイエンス社)で分析した。死細胞の検出については、サイトメトリー分析の直前にヨウ化プロピジウムを添加した。CellQuest(商標)ソフトウェアを使用して30,000イベントを捕捉し、分析した。
3D低結合性培養のため、脱分化軟骨細胞を回収し、ml当たり106細胞の単一の細胞懸濁液を産出するために10%FCS含有DMEMに再懸濁した。その細胞懸濁液(ウェル当たり1ml)を24ウェル低結合性プレート(ウルトラ・ロウ・クラスタープレート、コーニング社、ドイツ)に添加した。標準的な組織培養皿の負に帯電した親水性表面と対照的に、その超低結合性プレートは、付着タンパク質の結合を大いに減少させる電気的に中性の親水性ヒドロゲル被覆表面を有する。この特別な培養皿を使用することによって、細胞が、微小塊培養の場合のように、細胞接着により少数の層からなる構造体の状態に定着することがない。2D単層培養物の形成が防止され、細胞はこの懸濁液培養維持条件下で球形を保持した。さらに、細胞が遠心分離によって強制的に定着させられるペレット培養系と対照的に、低結合性培養系は初期凝縮過程の間に自由な細胞運動と細胞間相互作用の機会を提供する。一定の培養条件を確実にするために培地を3日毎に定期的に交換した。低結合性培養においてG‐タンパク質共役受容体により誘発される走化性シグナル伝達に干渉するため、低結合性凝縮実験における培地に様々な濃度で(10、100および1000ng/ml)百日咳毒素(シグマ社、ドイツ)を投与した。
回収した凝集体の切片を5μmの厚みのクライオスタットで作製し、スーパーフロスト・プラス・スライドガラス(メンツェル社)に固定した。スライドを乾燥および固定した。
完全な表現型の脱分化を達成するために単離された軟骨細胞を単層で少なくとも10継代培養した。前に説明したように、それらの細胞はMSC表面マーカー(CD105、CD106、CD44、CD73、CD90およびCD13)の発現および多分化能(脂肪細胞および骨細胞)(図1)(Rosowski et al., 2006)によって示される一定の前駆細胞の表現型を帯びた。細胞表面発現によると脱分化軟骨細胞の均一な集団が観察された。
この培養技法の基本的な考えは、培養皿の表面への細胞付着を避け、細胞の移動能を維持することである。付着単層培養物の形成を防止するため、特別に処理した表面を有する低結合性プレートのウェルに細胞を播種した。数時間の内に細胞は互いに対して接着し始め、網状の構造体が生じた。次の72時間の間にそのメッシュ構造が凝縮して、最後には平均で1〜2ミリメーターの直径を有する高密度細胞凝集体がウェル当たり1つ生じた(図2)。細胞凝集体をさらに4週間培養したが、サイズまたは形状に明確な変化は全くなかった。その培養過程を初期段階と後期段階に細分し、個々に評価した。
第1段階では、軟骨形成性分化に特徴的な遺伝子の発現を分析した(図3)。転写因子SOX‐5のmRNAレベルは培養から12時間後でやや発現上昇した。それより後の時点では発現が単層レベルまで低下した。驚くことに、転写調節因子SOX‐9は単層培養と比べて3倍発現低下することが分かった。この低下したmRNAレベルは凝縮形成の最初の3日の間に維持された。それにもかかわらず、両方の転写因子は、GAPDH比で表されるように、単層培養と低結合性培養の両方で高発現した。脱分化軟骨細胞はTGF‐β1のはっきりした発現を示した。しかしながら、この成長因子は細胞凝縮期では変化せずにいた。予想通り、N‐カドヘリン発現は低結合性凝縮において凝縮の最初の1時間の間におおいに発現上昇した。凝縮体が形成されたそれより後の時点では接着分子について4倍の遺伝子発現の低下が検出された。驚くことに、選択されたマトリックス分子のmRNAレベルの重大な変化が3D培養の初期段階においても測定された。1A1型コラーゲンは単層培養では豊富に発現することが分かったが、この分子は3D培養誘導から4時間後に10倍発現低下し、そして、次の90時間の間にさらなる段階的低下を示した。対照的に、軟骨性マトリックス分子である2A1型コラーゲンの発現は低結合性培養から90時間後に12倍誘導されることが分かった。しかしながら、プロテオグリカン成分であるアグレカンのmRNAレベルは非常に初期の時点(4時間)で実質的に10倍低下し、そして、3D培養の次の4日の間にさらに低下した(図3)。
本低結合性3D培養系の軟骨形成能を分析するために特定の細胞外マトリックス成分の蓄積を明らかにした(図4)。さらに、軟骨形成関連遺伝子の発現をリアルタイムPCRにより定量した(図4)。28日後に組織学的分析のために凝集体の切片を作製した。凝集体切片のヘマトキシリン染色は高い細胞密度を示した。また、細胞外マトリックスであるプロテオグリカンの大量の蓄積をアルシアンブルー染色によって観察することができた。3D培養から4週間後における2A1型コラーゲン発現の3桁の上昇が所定のマトリックス分子に関する最も顕著な結果であった。2A1型コラーゲン発現の免疫組織学的動態分析によって、3D培養の初期段階の間であっても2A1型コラーゲンが蓄積することが示された。培養誘導後から最初の2日の間に2A1型コラーゲンシグナルを検出することができなかった。しかしながら、細胞凝縮の誘導から8日後にはかなりのシグナルが、そして、培養から4週間後には2A1型コラーゲンのさらに広範囲の沈着が明らかであった。さらに、1A1型コラーゲンの発現低下は単層培養物と比べて25倍のmRNAレベルの低下によって明らかであった。予期せぬことに、アグレカンmRNAレベルは増殖性2D培養物と比べて5倍低下した(図4)。驚くことに、転写因子Sox‐9はGAPDH比によって表される増殖性単層細胞における例外的に高レベルの遺伝子発現を示した。凝集体形成の間の一時的な発現低下の後にそのmRNAレベルは単層基本値まで戻った。他方、Sox‐5の14倍までのさらなる発現の増加を検出することができた。したがって、Sox‐5の相対的発現は低結合性培養から4週間後における相対的Sox‐9発現よりも多かった。さらに、TGFβ1と接着分子N‐カドヘリンのmRNAレベルのさらなる上昇を3D培養において測定することができた(図4)。
無スキャフォールド型分化系を利用するためにゲノムワイドマイクロアレイ分析を用いて細胞分化をさらに研究し、ならびに、凝縮過程の間の発現パターンの変化を特徴解析した。個々の初代細胞培養物を用いる2つの独立した実験を実施した。蛍光標識プローブをアジレント社の44K DNAチップにハイブリダイズした。結果生じた両方のチップのデータを評価のために統合した。両方のアレイが少なくとも2倍の遺伝子発現の変化を示した場合、遺伝子は発現調節を受けた遺伝子であることが示された。p値カットオフをp<0.05に前もって指定した。この特定の調査された生物学的過程の一般的な考えを得るために、発現調節を受けた遺伝子はパンサーGO分類に従ってグループ化された(表1〜5)。初期段階と後期段階の両方で最大数の発現調節を受けた遺伝子を有するグループは細胞間伝達、発生過程およびシグナル伝達(図5)であり、分化過程を誘導するために必要とされる機能グループ内の遺伝子発現の大規模な調節を示している。しかしながら、本3D培養系の目的は脱分化軟骨細胞の再分化である。よって、パンサー分類である「骨格系の発生」がより詳細に問われた。
表1および2が示すように、成長因子TGF‐β3とGDF‐15ならびに転写因子Fosがこの分類グループで最も発現上昇した遺伝子である。顕著なことに、Hox‐Aクラスターのいくつかのメンバーの発現が凝縮期の間に上昇することが明らかにされた。TGF‐βグループメンバーであるインヒビン‐_Bは最も大幅に発現低下した遺伝子であり、その上、発現抑制は培養から28日後でも明らかであった。
28日後において最も顕著な発現上昇した遺伝子は軟骨関連マトリックス分子であるII型コラーゲン、IX型コラーゲンおよびXI型コラーゲンである。マトリックスGlaタンパク質および軟骨酸性タンパク質もmRNAレベルの増加を示し、一方、予期しなかったがリアルタイムPCRのデータと一致して、アグレカンとアグレカン合成酵素であるHASが下方制御されるようであった。この分類グループにおいて最も発現上昇した遺伝子の中に転写因子FosおよびRunx2ならびに成長因子GDF‐15が存在し、一方、非軟骨マトリックス分子であるI型コラーゲンおよびXII型コラーゲンは大幅に減少した。
間充織凝縮の過程は緩い間充織凝集を特徴とする。それにもかかわらず、この始原細胞密度の増加がどのように仲介されるのかほとんど分かっていない。パンサー分類内のいくつかのタンパク質ファミリーの多機能性のため、接着分子と走化性分子をKEGGデータベースに従って狭義でさらに下位グループに分けた。この3D培養系を利用する最初の試みでDNAマイクロアレイデータは差次的に発現したケモカインと対応する受容体を示した(表5)ので、ケモカインと移動性細胞活性の潜在的な関与を凝縮過程の間に分析すべきである。大多数のケモカイン受容体は7回経膜受容体ファミリーの部分である。このクラスのタンパク質はG‐タンパク質共役シグナル伝達によってそれらのシグナル伝達を誘発する。百日咳毒素(PTX、百日咳菌(Bordetella pertussis))はヘテロ三量体G‐タンパク質複合体のGサブユニットのADPリボシル化によりこの経路を混乱させる。凝縮中にケモカイン活性を無効にするためにさまざまな濃度PTXを添加して低結合性培養実験を実行した。予期せぬことに、PTX処理培養物の細胞凝縮物は、適用した濃度と無関係に最初の72時間の間は対照実験と区別することができないようであった(図6)。培養誘導の直後に細胞は小細胞クラスターを形成し、網様移行段階を経てさらに高密度化して初めてPTX投与と無関係に、類似の動態で最終的に1つの高密度細胞凝集体が形成された。この観察結果は、ケモカイン介在性細胞移動が細胞凝集過程に関与しないことを示している。興味深いことに、マイクロアレイ評価の結果は差次的に発現した接着分子の75%が発現上昇するようであることを示し、凝縮段階中の細胞間相互作用の増加を示唆した(表5)。この仮説はより詳細な顕微鏡観察によって確認された。複数の小凝集体が生じる明確な移行期において、細胞突起のような長い樹状突起が現れた。1つの細胞副中心から次の副中心まで結合が直接的に形成されるか(図7A〜C)、または反対方向に伸びる2つの突起を有する1つの細胞によって結合が構築された(図7D)。それより後の段階でこれらの細い糸が全ての小凝集体を最終的な凝集体に結合するのに用いられる。そのようにして、ケモカイン介在性細胞移動よりもむしろ、細胞相互作用を強化することになる接着分子の発現上昇によって凝縮過程が強行される。
自律的始原細胞の適用は骨関節炎において損傷軟骨組織を再生する有望な戦略である。機能性があり、活性がある軟骨細胞へ分化するようにこれらの細胞を誘引することができ、結果として新規に合成された軟骨が生じる。これまで、この目的のためにいくつかの培養系が確立された。軟骨形成性分化はインビボでの間充織凝縮段階によって開始されるので、最初の系列特異的段階をインビトロで完全に特徴解析することが非常に興味深い。したがって、初期凝縮期を含む軟骨形成の全過程を模倣して無スキャフォールド型低結合性3D培養系を開発した。その培養系は、重要な転写因子であるSox‐5とII型コラーゲンおよびIX型コラーゲンの遺伝子発現の上昇によって示される軟骨形成性分化を誘導することができる。他の確立された3D培養系と比べて低結合性プレート培養を使用することによって、前に単離し、増殖させた間葉系起源のヒト初代細胞の単一細胞懸濁液から始まって、様々な段階の細胞凝集を分析するための利点が提供される。初期段階の分析により、凝縮過程はケモカインシグナル伝達よりもむしろ細胞間接着の増加によって仲介されることが示される。したがって、本低結合性3D培養系は、最終的には、軟骨形成性分化のインビボでの誘導または治療用途の移植物のインビトロでの作製に必須である重要な因子の同定に役立ち得る。
図8において本発明の自立型3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置が示される。
材料と方法
1.MSCの単離と増殖
前に述べたように、ベルリン医科大学シャリテの倫理委員会のガイドラインに従って同意書を得て、関節置換手術の後に得た大腿骨骨頭骨髄からヒトMSCを単離した。次に、4.5g/lのグルコース(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)を有し、10%FBS(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)とペニシリン‐ストレプトマイシン(PAAラボラトリーズ社)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)においてそれらの細胞を増殖させた。継代4と継代7の間のMSCを共培養実験に使用した。
ベルリン医科大学シャリテの倫理委員会のガイドラインに従って同意書を得て、ヒトHSPCを臍帯血から単離した。臍帯血をPBS‐BSA‐EDTA溶液中に収集し、そして、単核球を密度勾配遠心分離により単離した。次に、MACS CD34+単離キット(ミルテニー・バイオテク社、ドイツ)を使用し、製造業者の使用説明書に従って免疫磁性分離によりHSPCを分離した。次に新しく単離された細胞を2×104細胞/培養物の密度で様々な培養系に導入した。
ドイツのツェルベルクGmbH社より1mmの厚みと1cmの直径を有する酸化ジルコニウムベースのハイドロキシアパタイト被覆スポンセラムHA(登録商標)セラミックディスクを購入した。そのディスクを使用前にオートクレーブした。
HSCの播種7日前にセラミックディスクにMSCを約106細胞/ディスクの密度で播種した。超低結合性24ウェルプレート(コーニング社、米国)中の10%FBS(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)とペニシリン‐ストレプトマイシンを含有するDMEM‐高グルコース(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)中にそれらのセラミックディスクを浸した。プレートを37℃、5%CO2で維持した。培地を48時間毎に交換した。同時に6ウェルプレートにもMSCを播種し、それらは24時間以内に集密に達した。これらのプレートのうちの1つのセットをセラミックスの培養と同じ培地で培養し、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびβ‐グリセロリン酸(シグマ社、米国)を含有する骨誘導性培地で別のセットを処理した。MSCの播種から7日後に新しく単離されたHSPCを4つの培養条件に導入した:1つ目の培養条件、セラミックスに播種されたMSCを用いる3D共培養;2つ目の培養条件、6ウェルプレートに播種されたMSC単層を用いる2D共培養;3つ目の培養条件、6ウェルプレートに播種された骨誘導MSC単層を用いる2D共培養;および4つ目の培養条件、100ng/mlのIL‐6、SCF、TPOおよびFLT‐3L(ペプトテック(Peprotech)社、英国)を添加されたStemspan培地(ステムセル・テクノロジーズ社、カナダ)中での懸濁培養。9つの独立したMSC試料およびHSC試料をこの研究のために利用した。培養開始から1週間後、2週間後および4週間後に各培養系に由来する細胞をフローサイトメトリーと免疫組織化学によって分析した。追加の8週間の時点で長期培養能を確認するために3D培養物を分析した。
NucleoSpin(登録商標)RNA IIキット(マッハライ‐ナーゲル社、ドイツ)を使用し、提供された使用説明書に従ってRNAの単離を実施した。セラミックス中に培養された細胞をそのセラミックス上で直接的に溶解した。TaqMan(登録商標)逆転写試薬cDNAキット(アプライド・バイオシステムズ社、米国)を製造業者の使用説明書に従って使用することによってmRNAの逆転写を実施した。96ウェルPCRプレート(バイオザイム・サイエンティフィック社、ドイツ)中で1μlのプライマー混合物およびSensiFAST(商標)Sybr No‐ROXキット(バイオライン社、ドイツ)と共に1μlのcDNAを使用してリアルタイムPCRを実施し、そして、Stratagene MX3005P(商標)マルチプレックス定量的PCRシステム(アジレント・テクノロジーズ社、米国)で読み込みを行った。TIBMolBiol社(ドイツ)へプライマーを注文した。
蛍光顕微鏡観察によるHSPCとMSCの長期追跡のため、培養前にQtracker(登録商標)525細胞標識キットとCellTracker(商標)レッドCMTPX(インビトロジェン社、米国)を製造業者の使用説明書に従ってそれぞれ使用して細胞を標識した。細胞分裂を追跡するため、単離直後に2.5μΜの濃度でカルボキシフルオレセインジアセテート・スクシンイミジルエステル(CFSE、インビトロジェン社、米国)を製造業者の使用説明書に従って使用してHSPCを標識した。次に、1週間後、2週間後および4週間後にフローサイトメトリーを用いて緑色標識細胞をゲートアウトし、そして、細胞分裂を追跡した。
セラミックスキャフォールド内のECMとシグナル伝達分子を視覚化するために、細胞追跡されるHSPCを播種してから2週間後に細胞を含むセラミックスをアセトン(シグマ社、米国)中において−20℃で固定した。次に、解剖刀を使用してそれらのディスクを切断し、そして、96ウェルプレート中において総計150μlの体積でI型コラーゲン(マウス抗ヒト、シグマ社、米国)、C‐Kit(マウス抗ヒト、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国)、フィブロネクチン(マウス抗ヒト、ミリポア社、米国)、インテグリン4a(マウス抗ヒト、Abcam社、英国)およびN‐カドヘリン(マウス抗ヒト、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国)に対する一次抗体を使用してそれらのディスクを染色した。次に、Alexa350またはAlexa594(インビトロジェン社、米国)と連結させたヤギ抗マウス二次抗体でそれらの試料を染色し、洗浄し、そして、顕微鏡観察により視覚化した。
1週間後、2週間後、4週間後および8週間後の本共培養系中におけるQtracker(登録商標)グリーン追跡HSPCの存在をDAPI(シグマ社、米国)による細胞核の対比染色の後にデジタル蛍光顕微鏡(BZ9000、キーエンス社、ドイツ)下でそれらを視覚化することにより確認した。2光子顕微鏡(Trimscope II、ラビジョン・バイオテック(LaVision BioTec)社、ドイツ)を使用してECMとシグナル伝達分子を3Dスタックとして視覚化し、Imaris第7.5版(ビットプレーン・サイエンティフィック・ソフトウェア(Bitplane Scientific Software)社、スイス)を使用して表示した。
細胞播種セラミック培養系と骨髄の間の構造的類似性を、および、HSPCとMSCに対する物理的相互作用も視覚化するためにSEMを使用した。共培養から2週間後のMSCおよびHSPCを含むセラミックディスクと大腿骨骨頭から切り出した1cm2の小片の骨髄を、アセトンを使用して固定および脱水し、そして、臨界点乾燥により準備した。次にこれらの試料を金および銀で被覆し、日立S‐520SEM(日立、日本)を使用して視覚化した。
全ての培養系に由来するHSPCの表現型をフローサイトメトリー分析により表面マーカー発現に基づいて比較した。恒温器内で1×トリプシン‐EDTA(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)と37℃で30分間保温することによって全ての接着性培養系から細胞を収集した。懸濁細胞を収集用チューブに単にピペットで分注した。次にそれらの細胞を製造業者の使用説明書に従って次の抗体で染色した:CD34‐APC(ミルテニー・バイオテク社、ドイツ)、CD38‐PE(eBioscience(登録商標)社、米国)、アネキシンV‐パシフィックブルー(バイオレジェンド社、米国)、ヨウ化プロピジウム(シグマ社、米国)。MACSQuant(登録商標)アナライザー(ミルテニー社、ドイツ)フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー分析を実施し、そして、FlowJoソフトウェア、第7.6.5版(ツリー・スター(Tree Star)社、米国)を使用してデータを分析した。
播種から1週間後、2週間後、4週間後および8週間後に本セラミック共培養系から得られたHSPCの骨髄分化能を、顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球コロニー形成ユニットアッセイを用いて試験した。1000細胞をCFU‐GEMM培地(ミルテニー・バイオテク社、ドイツ)中に播種し、2週間後にコロニーを視覚化し、採点を行った。
2元配置ANOVA分析とそれに続くボンフェローニ補正が、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェア第5.0版(グラフパッド・ソフトウェア社、米国)を使用してデータセットに適用された。0.05以上のP値を有意と見なした。データは平均値±標準偏差として表される。
1.セラミックス内での7日の培養の間にMSCは骨髄に構造的に非常に類似した微小環境を作り出す。
骨髄MSCにおける分化とECM産生に対する3D培養条件の影響は広範囲に考証されてきた。この研究において使用されたセラミックスのような堅いスキャフォールドがMSCを骨形成性分化する方向に持っていくことが示されている。したがって、MSCに対するセラミックスキャフォールド中での3D培養の効果がHSPCの導入の前に判定された。
HSPCを維持する手段としての本3D共培養系の検証について第1の検討事項は、セラミックスに播種されたHSPCがその中に入り込み、かなりの期間にそこに留まるかということであった。セルトラッカー・グリーン標識HSPCが播種から1週間後、2週間後、4週間後および8週間後に(図10A)共培養系において蛍光顕微鏡観察を用いて検出された。このことは、HSPCがMSC播種セラミックスに浸潤し、最大で8週間安定的に維持されることを示す。さらなる時点を試験することはなかった。
次に、第1週、第2週および第4週におけるCFSE標識HPSCのフローサイトメトリー分析によって、本3D共培養系におけるHSPCの増殖を先に述べた従来の培養方法と比べた。1回以下の分裂(CFSEヒストグラムの右から最初の2つのピーク)を行った細胞を緩慢増殖性と見なし、一方、全ての他の細胞を急速増殖性であると見なした。
初期HSPC表現型は本3D培養において最もよく維持されることが立証されたので、早期アポトーシスの広く用いられる指標であるアネキシンVの発現の測定および後期アポトーシス性細胞とネクローシス性細胞によって取り込まれるヨウ化プロピジウム(PI)により全ての培養系におけるそれらの細胞の生存度を判定した。
本3D共培養系において維持されるHSPCはそれらの初期表現型を保持し、且つ、生存可能であると確認した後に我々はCFU‐GEMMアッセイを用いてこれらの細胞がHSPCに特徴的な多系列分化能を保持しているか試験した。
最後に、骨髄HSPCニッチ内の相互作用が本セラミックス共培養系内でかなりの程度まで模倣されていることを示すために本セラミックス系内でのHSPCとMSCの物理的相互作用を調査した。HSPCとMSCの共局在が以前に観察されたが(図10A)、物理的接触の証拠または相互作用機構の兆候は全く得られなかった。
造血性幹細胞・前駆細胞(HSPC)が緩慢増殖性初期細胞として維持される骨内膜造血性ニッチは非常に複雑な系であることが分かっている。骨芽細胞、骨形成性前駆細胞および間葉系幹細胞を含むいくつかの異なる細胞種がECM分子産生、細胞間直接接触、およびシグナル伝達分子産生などの様々な機構によりニッチ制御に寄与することが分かった。個々の細胞種、シグナル伝達経路および物理的基準さえもニッチ維持の様々な態様に関係づけられてきたが、これらの因子とそのニッチにおけるそれらの正確な役割の間の関係は不明のままである。骨内膜ニッチを効率的に模倣するインビトロモデルの開発は、それ故、そのニッチの相互作用の研究に非常に有用だろう。
我々のセラミックスベースの3D共培養系は骨内膜HSPCニッチの最も重要な態様を厳密に模倣しており、そして、健康な状態および疾患状態の両方の状態におけるそのニッチの相互作用を調査するための有用なインビトロモデルを提供するだろう。その3D共培養系は、そのニッチのあらゆる部分を標的とする薬物についての物質試験プラットフォームとしての大きな能力も有する。この系は移植のための効果的なHSPC増殖戦略の基盤を形成することもできるだろう。
Claims (15)
- (a)一層の人工軟骨組織、および
(b)一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含む前記人工骨組織
を含み、前記一層の人工軟骨組織が前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する、3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。 - 前記人工軟骨組織が間葉系前駆細胞を用いて、好ましくはCD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+およびCD13+である細胞のうちの少なくとも50%を含む、または前記細胞から成る間葉系前駆細胞を用いて調製され、より好ましくは単離された初代軟骨細胞から調製される、請求項1に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工軟骨組織が請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項1または2に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の骨髄構造が前記構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種することにより調製される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の骨髄構造が、前記構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種し、そして、前記構造付与性スキャフォールド上で間葉系幹細胞を2〜10日間培養した後に造血幹細胞を添加することにより調製される、請求項4に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の構造付与性スキャフォールドが生物性材料または非生物性材料を含む、または生物性材料もしくは非生物性材料から成る、請求項1〜5のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の構造付与性スキャフォールドが3Dセラミックスキャフォールドを含む、または3Dセラミックスキャフォールドから成る、請求項1〜6のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを作製する方法であって、
‐構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種するステップ、
‐前記構造付与性スキャフォールド上で前記間葉系幹細胞を2〜10日間培養するステップ、
‐骨髄構造を植えつけられた構造付与性スキャフォールドを含む一層の人工骨組織を調製するために、前記構造付与性スキャフォールド上の前記間葉系幹細胞に造血幹細胞を添加し、そして、その結果の混合物を少なくとも5日間培養するステップ、
‐請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法によって調製された人工軟骨組織を供給するステップ、および
‐前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に前記人工軟骨組織の層を配置するステップ
を含む前記方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを含む移植物。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドまたは請求項9に記載の移植物、および少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- 軟骨組織または骨組織の特性を調節する物質をインビトロでスクリーニングするための方法であって、
‐請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐前記の各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと前記の処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む前記方法。 - 少なくとも1つの培地供給用貯留槽、請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを収容する少なくとも1つの器官収容空洞を含む少なくとも1つの器官成長区画を含み、前記培地供給用貯留槽がマイクロ流体供給チャンネルによって前記の少なくとも1つの器官成長区画に連結されている自立型3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置。
- 軟骨形成細胞凝集体を調製する方法であって、
(a)間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
(b)前記間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む前記方法。 - 前記間葉系前駆細胞がCD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+およびCD13+である細胞のうちの少なくとも50%を含む、または前記細胞から成る、請求項13に記載の方法。
- 前記間葉系前駆細胞が単離された初代軟骨細胞を含む、または単離された初代軟骨細胞から成る、請求項13または14に記載の方法。
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