JP2015511482A - 3dインビトロ二相性軟骨構造物 - Google Patents
3dインビトロ二相性軟骨構造物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015511482A JP2015511482A JP2014559215A JP2014559215A JP2015511482A JP 2015511482 A JP2015511482 A JP 2015511482A JP 2014559215 A JP2014559215 A JP 2014559215A JP 2014559215 A JP2014559215 A JP 2014559215A JP 2015511482 A JP2015511482 A JP 2015511482A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cartilage
- culture
- tissue
- artificial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title claims abstract description 139
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 104
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 67
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 252
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 139
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 56
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 claims description 53
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 52
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 32
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 26
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 15
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 10
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 claims description 10
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 10
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 10
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 10
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 claims description 10
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 10
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 10
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 10
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 10
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 230000021368 organ growth Effects 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 210000002163 scaffold cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 65
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 56
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 38
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 37
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 21
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 21
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 20
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 19
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 19
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 19
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 15
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 15
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 15
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 14
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 14
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 11
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 11
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 11
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 11
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 11
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 11
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 11
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 10
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 10
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 10
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 10
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 10
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 9
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 8
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 8
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 7
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 7
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 6
- 102000004427 Collagen Type IX Human genes 0.000 description 5
- 108010042106 Collagen Type IX Proteins 0.000 description 5
- 102000009736 Collagen Type XI Human genes 0.000 description 5
- 108010034789 Collagen Type XI Proteins 0.000 description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 5
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 5
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 5
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100036601 Aggrecan core protein Human genes 0.000 description 4
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 4
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 4
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 102000014870 Collagen Type XII Human genes 0.000 description 3
- 108010039001 Collagen Type XII Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 3
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 102100032702 Protein jagged-1 Human genes 0.000 description 3
- 101150117830 Sox5 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 2
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 2
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010041834 Growth Differentiation Factor 15 Proteins 0.000 description 2
- 102000000597 Growth Differentiation Factor 15 Human genes 0.000 description 2
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 2
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108700003486 Jagged-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 101100096242 Mus musculus Sox9 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108700037966 Protein jagged-1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002310 elbow joint Anatomy 0.000 description 2
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 2
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 2
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 2
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPJDHSYCSQAODE-UHFFFAOYSA-N 5-chloromethylfluorescein diacetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(CCl)=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 IPJDHSYCSQAODE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 108091008928 CXC chemokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000054900 CXCR Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000012432 Collagen Type V Human genes 0.000 description 1
- 108010022514 Collagen Type V Proteins 0.000 description 1
- 102000030746 Collagen Type X Human genes 0.000 description 1
- 108010022510 Collagen Type X Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000015775 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000994439 Danio rerio Protein jagged-1a Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000014736 Notch Human genes 0.000 description 1
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197993 Transcription factor SOX-5 Proteins 0.000 description 1
- 102100036692 Transcription factor SOX-5 Human genes 0.000 description 1
- 101710198026 Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000034373 developmental growth involved in morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000004821 effect on bone Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000011773 genetically engineered mouse model Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 102000034345 heterotrimeric G proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006093 heterotrimeric G proteins Proteins 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000002346 layers by function Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 102000043253 matrix Gla protein Human genes 0.000 description 1
- 108010057546 matrix Gla protein Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);zirconium(4+) Chemical compound [O-2].[O-2].[Zr+4] RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000352 supercritical drying Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical group C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910001928 zirconium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/02—Inorganic materials
- A61L27/10—Ceramics or glasses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
- A61L27/3843—Connective tissue
- A61L27/3847—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
- A61L27/3843—Connective tissue
- A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
- A61L2300/64—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/1171—Haematopoietic stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1311—Osteocytes, osteoblasts, odontoblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1317—Chondrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
- C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/10—Mineral substrates
- C12N2533/14—Ceramic
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
Abstract
Description
(a)一層の人工軟骨組織、および
(b)一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含むその人工骨組織
を含み、前記の一層の人工軟骨組織が前記の一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを提供する。
‐構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種するステップ、
‐前記構造付与性スキャフォールド上で前記間葉系幹細胞を2〜10日間、好ましくは5〜8日間、より好ましくは7日間培養するステップ、
‐骨髄構造を植えつけられた構造付与性スキャフォールドを含む一層の人工骨組織を調製するために、その構造付与性スキャフォールド上の間葉系幹細胞に造血幹細胞を添加し、そして、その結果の混合物を少なくとも5日間、好ましくは5日間〜8週間、より好ましくは1週間〜4週間培養するステップ、
‐請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法によって調製された人工軟骨組織を供給するステップ、および
‐前記の一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に前記の人工軟骨組織の層を配置するステップ
を含む、またはそれらのステップから成る。
‐本発明の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法も対象とする。
(a)間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
(b)それらの間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む方法も対象とする。
‐本発明の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐その各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法を対象とする。
(a)単離された間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
(b)それらの間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む。
‐本発明の人工軟骨形成細胞凝集体または本発明の方法によって調製された細胞凝集体またはそれらに由来する組織の試料を提供するステップ、
‐各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと前記の処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む方法をさらに教示する。
I.人工骨組織の形成
細胞
標準的な手法により間葉系幹細胞(MSC)を単離する。簡単に説明すると、骨髄吸引物をPBSで徹底的に濯ぎ、そして、フィコール密度勾配遠心分離によりPBMC(末梢血単核球)を単離した。プラスチック接着により間葉系前駆細胞を単離し、最大で4継代の増殖期がそれに続く。MACS技術(ミルテニー(Miltenyi)バイオテク社)を用いてCD34の発現によって臍帯血試料からヒト造血幹細胞を単離した。補足培地(ステムスパン(Stemspan)(登録商標)+100ng/mlのTPO、FLT3、IL6およびSCF)中でHSCを培養した。
人工骨髄のためのプラットフォームは3Dセラミックスキャフォールド(スポンセラム(Sponceram)(登録商標)、ツェルベルク(Zellwerk)社)によって提供される。協調的増殖、分化および微小環境の再調整を誘導するため、細胞外マトリックスの沈着とシグナル伝達分子の発現に応じて、造血幹細胞の添加の1週間前にこのセラミックスに間葉系幹細胞を播種する。その後、静置培養か連続栄養供給に適した潅流システムのどちらかでそのセラミックスをさらに培養する。遺伝子発現分析、FACS技術による異なる細胞集団の構成、および典型的な生物学的機能(HSCの維持と増殖、個々の幹細胞ニッチの発生、免疫学的問題)の判定によって骨髄の機能性を評価する。
骨関節炎とリウマチ性関節炎は両方とも軟骨構造を冒す退行性疾患である。軟骨内の細胞は非常にわずかな固有の自己修復能力しか持たないので、様々な要因(例えば、機械的過剰負荷、年齢、傷害、および炎症)が口火となって、組織構造が不可逆的に失われる。それ故、軟骨の再生過程を誘導するための代替的戦略を見出すことに多くの努力が過去数十年間に払われてきた。近年では、再生医療における自律的細胞の適用が精力的な研究の対象である。しかしながら、間葉系前駆細胞の理想的な供給源とインビトロ分化に最適な培養条件の両方が確立されずにいる。間葉系間質細胞/幹細胞は、骨髄供給源または他の組織供給源から得ることができる細胞の数は限定的であるが、全ての間葉系組織において分化するそれらの能力のために傑出している。したがって、健康な組織から単離され、続いて増殖された自律的細胞を使用することがこの課題を解く1つの有望な戦略である。
初代軟骨細胞の単離と培養
自発的なドナーに由来する膝関節軟骨をシャリテ(ドイツ、ベルリン医科大学)のベルリン筋骨格研究センターならびにウィルヒョーキャンパスのシャリテ実験病理学研究所から得た。本研究は地区倫理委員会(ベルリン大学病院、シャリテ・ミッテキャンパス)によって認可された。軟骨組織を小片に細かく切り刻み、そして、DMEM中のコラーゲナーゼ(1mg/ml、シグマ・アルドリッチ社)を使用して37℃で一晩酵素消化することにより軟骨細胞を遊離させた。細胞を70μmのナイロン製セルストレイナー(BDファルコン(商標)、ベルギー)を通す濾過により消化された組織から分離し、PBSで洗浄し、そして、10%FCSを含有するDMEM中で培養した。37℃の加湿大気(5%CO2/空気)を有するウォータージャケット型恒温器内で、10%FCSとペニシリン/ストレプトマイシン(ギブコ社)を添加されたDMEM培地(ギブコ社)中で初代軟骨細胞を培養した。それらの細胞は少なくとも10回継代させられて完全脱分化表現型になった。
FACSによる表面発現分析。脱分化軟骨細胞の様々な間葉系幹細胞(MSC)表面マーカー分子の発現についてそれらの脱分化軟骨細胞を直接免疫蛍光染色により分析した。細胞をトリプシン処理と遠心分離により回収し、そして、細胞ペレットをPBS/BSA(0.5%)に再懸濁した。細胞を蛍光標識抗体と共に15分間室温で保温した。イソタイプ対照として、MSC抗体と同じイソタイプのT細胞マーカー分子で細胞を染色した。次に染色アッセイ物をPBS/BSAで洗浄し、そして、遠心分離して未結合の抗体を除去した。細胞ペレットを400μlのPBS/BSAに再懸濁し、FACSカリバー(商標)(BDバイオサイエンス社)で分析した。死細胞の検出については、サイトメトリー分析の直前にヨウ化プロピジウムを添加した。CellQuest(商標)ソフトウェアを使用して30,000イベントを捕捉し、分析した。
3D低結合性培養のため、脱分化軟骨細胞を回収し、ml当たり106細胞の単一の細胞懸濁液を産出するために10%FCS含有DMEMに再懸濁した。その細胞懸濁液(ウェル当たり1ml)を24ウェル低結合性プレート(ウルトラ・ロウ・クラスタープレート、コーニング社、ドイツ)に添加した。標準的な組織培養皿の負に帯電した親水性表面と対照的に、その超低結合性プレートは、付着タンパク質の結合を大いに減少させる電気的に中性の親水性ヒドロゲル被覆表面を有する。この特別な培養皿を使用することによって、細胞が、微小塊培養の場合のように、細胞接着により少数の層からなる構造体の状態に定着することがない。2D単層培養物の形成が防止され、細胞はこの懸濁液培養維持条件下で球形を保持した。さらに、細胞が遠心分離によって強制的に定着させられるペレット培養系と対照的に、低結合性培養系は初期凝縮過程の間に自由な細胞運動と細胞間相互作用の機会を提供する。一定の培養条件を確実にするために培地を3日毎に定期的に交換した。低結合性培養においてG‐タンパク質共役受容体により誘発される走化性シグナル伝達に干渉するため、低結合性凝縮実験における培地に様々な濃度で(10、100および1000ng/ml)百日咳毒素(シグマ社、ドイツ)を投与した。
回収した凝集体の切片を5μmの厚みのクライオスタットで作製し、スーパーフロスト・プラス・スライドガラス(メンツェル社)に固定した。スライドを乾燥および固定した。
完全な表現型の脱分化を達成するために単離された軟骨細胞を単層で少なくとも10継代培養した。前に説明したように、それらの細胞はMSC表面マーカー(CD105、CD106、CD44、CD73、CD90およびCD13)の発現および多分化能(脂肪細胞および骨細胞)(図1)(Rosowski et al., 2006)によって示される一定の前駆細胞の表現型を帯びた。細胞表面発現によると脱分化軟骨細胞の均一な集団が観察された。
この培養技法の基本的な考えは、培養皿の表面への細胞付着を避け、細胞の移動能を維持することである。付着単層培養物の形成を防止するため、特別に処理した表面を有する低結合性プレートのウェルに細胞を播種した。数時間の内に細胞は互いに対して接着し始め、網状の構造体が生じた。次の72時間の間にそのメッシュ構造が凝縮して、最後には平均で1〜2ミリメーターの直径を有する高密度細胞凝集体がウェル当たり1つ生じた(図2)。細胞凝集体をさらに4週間培養したが、サイズまたは形状に明確な変化は全くなかった。その培養過程を初期段階と後期段階に細分し、個々に評価した。
第1段階では、軟骨形成性分化に特徴的な遺伝子の発現を分析した(図3)。転写因子SOX‐5のmRNAレベルは培養から12時間後でやや発現上昇した。それより後の時点では発現が単層レベルまで低下した。驚くことに、転写調節因子SOX‐9は単層培養と比べて3倍発現低下することが分かった。この低下したmRNAレベルは凝縮形成の最初の3日の間に維持された。それにもかかわらず、両方の転写因子は、GAPDH比で表されるように、単層培養と低結合性培養の両方で高発現した。脱分化軟骨細胞はTGF‐β1のはっきりした発現を示した。しかしながら、この成長因子は細胞凝縮期では変化せずにいた。予想通り、N‐カドヘリン発現は低結合性凝縮において凝縮の最初の1時間の間におおいに発現上昇した。凝縮体が形成されたそれより後の時点では接着分子について4倍の遺伝子発現の低下が検出された。驚くことに、選択されたマトリックス分子のmRNAレベルの重大な変化が3D培養の初期段階においても測定された。1A1型コラーゲンは単層培養では豊富に発現することが分かったが、この分子は3D培養誘導から4時間後に10倍発現低下し、そして、次の90時間の間にさらなる段階的低下を示した。対照的に、軟骨性マトリックス分子である2A1型コラーゲンの発現は低結合性培養から90時間後に12倍誘導されることが分かった。しかしながら、プロテオグリカン成分であるアグレカンのmRNAレベルは非常に初期の時点(4時間)で実質的に10倍低下し、そして、3D培養の次の4日の間にさらに低下した(図3)。
本低結合性3D培養系の軟骨形成能を分析するために特定の細胞外マトリックス成分の蓄積を明らかにした(図4)。さらに、軟骨形成関連遺伝子の発現をリアルタイムPCRにより定量した(図4)。28日後に組織学的分析のために凝集体の切片を作製した。凝集体切片のヘマトキシリン染色は高い細胞密度を示した。また、細胞外マトリックスであるプロテオグリカンの大量の蓄積をアルシアンブルー染色によって観察することができた。3D培養から4週間後における2A1型コラーゲン発現の3桁の上昇が所定のマトリックス分子に関する最も顕著な結果であった。2A1型コラーゲン発現の免疫組織学的動態分析によって、3D培養の初期段階の間であっても2A1型コラーゲンが蓄積することが示された。培養誘導後から最初の2日の間に2A1型コラーゲンシグナルを検出することができなかった。しかしながら、細胞凝縮の誘導から8日後にはかなりのシグナルが、そして、培養から4週間後には2A1型コラーゲンのさらに広範囲の沈着が明らかであった。さらに、1A1型コラーゲンの発現低下は単層培養物と比べて25倍のmRNAレベルの低下によって明らかであった。予期せぬことに、アグレカンmRNAレベルは増殖性2D培養物と比べて5倍低下した(図4)。驚くことに、転写因子Sox‐9はGAPDH比によって表される増殖性単層細胞における例外的に高レベルの遺伝子発現を示した。凝集体形成の間の一時的な発現低下の後にそのmRNAレベルは単層基本値まで戻った。他方、Sox‐5の14倍までのさらなる発現の増加を検出することができた。したがって、Sox‐5の相対的発現は低結合性培養から4週間後における相対的Sox‐9発現よりも多かった。さらに、TGFβ1と接着分子N‐カドヘリンのmRNAレベルのさらなる上昇を3D培養において測定することができた(図4)。
無スキャフォールド型分化系を利用するためにゲノムワイドマイクロアレイ分析を用いて細胞分化をさらに研究し、ならびに、凝縮過程の間の発現パターンの変化を特徴解析した。個々の初代細胞培養物を用いる2つの独立した実験を実施した。蛍光標識プローブをアジレント社の44K DNAチップにハイブリダイズした。結果生じた両方のチップのデータを評価のために統合した。両方のアレイが少なくとも2倍の遺伝子発現の変化を示した場合、遺伝子は発現調節を受けた遺伝子であることが示された。p値カットオフをp<0.05に前もって指定した。この特定の調査された生物学的過程の一般的な考えを得るために、発現調節を受けた遺伝子はパンサーGO分類に従ってグループ化された(表1〜5)。初期段階と後期段階の両方で最大数の発現調節を受けた遺伝子を有するグループは細胞間伝達、発生過程およびシグナル伝達(図5)であり、分化過程を誘導するために必要とされる機能グループ内の遺伝子発現の大規模な調節を示している。しかしながら、本3D培養系の目的は脱分化軟骨細胞の再分化である。よって、パンサー分類である「骨格系の発生」がより詳細に問われた。
表1および2が示すように、成長因子TGF‐β3とGDF‐15ならびに転写因子Fosがこの分類グループで最も発現上昇した遺伝子である。顕著なことに、Hox‐Aクラスターのいくつかのメンバーの発現が凝縮期の間に上昇することが明らかにされた。TGF‐βグループメンバーであるインヒビン‐_Bは最も大幅に発現低下した遺伝子であり、その上、発現抑制は培養から28日後でも明らかであった。
28日後において最も顕著な発現上昇した遺伝子は軟骨関連マトリックス分子であるII型コラーゲン、IX型コラーゲンおよびXI型コラーゲンである。マトリックスGlaタンパク質および軟骨酸性タンパク質もmRNAレベルの増加を示し、一方、予期しなかったがリアルタイムPCRのデータと一致して、アグレカンとアグレカン合成酵素であるHASが下方制御されるようであった。この分類グループにおいて最も発現上昇した遺伝子の中に転写因子FosおよびRunx2ならびに成長因子GDF‐15が存在し、一方、非軟骨マトリックス分子であるI型コラーゲンおよびXII型コラーゲンは大幅に減少した。
間充織凝縮の過程は緩い間充織凝集を特徴とする。それにもかかわらず、この始原細胞密度の増加がどのように仲介されるのかほとんど分かっていない。パンサー分類内のいくつかのタンパク質ファミリーの多機能性のため、接着分子と走化性分子をKEGGデータベースに従って狭義でさらに下位グループに分けた。この3D培養系を利用する最初の試みでDNAマイクロアレイデータは差次的に発現したケモカインと対応する受容体を示した(表5)ので、ケモカインと移動性細胞活性の潜在的な関与を凝縮過程の間に分析すべきである。大多数のケモカイン受容体は7回経膜受容体ファミリーの部分である。このクラスのタンパク質はG‐タンパク質共役シグナル伝達によってそれらのシグナル伝達を誘発する。百日咳毒素(PTX、百日咳菌(Bordetella pertussis))はヘテロ三量体G‐タンパク質複合体のGサブユニットのADPリボシル化によりこの経路を混乱させる。凝縮中にケモカイン活性を無効にするためにさまざまな濃度PTXを添加して低結合性培養実験を実行した。予期せぬことに、PTX処理培養物の細胞凝縮物は、適用した濃度と無関係に最初の72時間の間は対照実験と区別することができないようであった(図6)。培養誘導の直後に細胞は小細胞クラスターを形成し、網様移行段階を経てさらに高密度化して初めてPTX投与と無関係に、類似の動態で最終的に1つの高密度細胞凝集体が形成された。この観察結果は、ケモカイン介在性細胞移動が細胞凝集過程に関与しないことを示している。興味深いことに、マイクロアレイ評価の結果は差次的に発現した接着分子の75%が発現上昇するようであることを示し、凝縮段階中の細胞間相互作用の増加を示唆した(表5)。この仮説はより詳細な顕微鏡観察によって確認された。複数の小凝集体が生じる明確な移行期において、細胞突起のような長い樹状突起が現れた。1つの細胞副中心から次の副中心まで結合が直接的に形成されるか(図7A〜C)、または反対方向に伸びる2つの突起を有する1つの細胞によって結合が構築された(図7D)。それより後の段階でこれらの細い糸が全ての小凝集体を最終的な凝集体に結合するのに用いられる。そのようにして、ケモカイン介在性細胞移動よりもむしろ、細胞相互作用を強化することになる接着分子の発現上昇によって凝縮過程が強行される。
自律的始原細胞の適用は骨関節炎において損傷軟骨組織を再生する有望な戦略である。機能性があり、活性がある軟骨細胞へ分化するようにこれらの細胞を誘引することができ、結果として新規に合成された軟骨が生じる。これまで、この目的のためにいくつかの培養系が確立された。軟骨形成性分化はインビボでの間充織凝縮段階によって開始されるので、最初の系列特異的段階をインビトロで完全に特徴解析することが非常に興味深い。したがって、初期凝縮期を含む軟骨形成の全過程を模倣して無スキャフォールド型低結合性3D培養系を開発した。その培養系は、重要な転写因子であるSox‐5とII型コラーゲンおよびIX型コラーゲンの遺伝子発現の上昇によって示される軟骨形成性分化を誘導することができる。他の確立された3D培養系と比べて低結合性プレート培養を使用することによって、前に単離し、増殖させた間葉系起源のヒト初代細胞の単一細胞懸濁液から始まって、様々な段階の細胞凝集を分析するための利点が提供される。初期段階の分析により、凝縮過程はケモカインシグナル伝達よりもむしろ細胞間接着の増加によって仲介されることが示される。したがって、本低結合性3D培養系は、最終的には、軟骨形成性分化のインビボでの誘導または治療用途の移植物のインビトロでの作製に必須である重要な因子の同定に役立ち得る。
図8において本発明の自立型3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置が示される。
材料と方法
1.MSCの単離と増殖
前に述べたように、ベルリン医科大学シャリテの倫理委員会のガイドラインに従って同意書を得て、関節置換手術の後に得た大腿骨骨頭骨髄からヒトMSCを単離した。次に、4.5g/lのグルコース(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)を有し、10%FBS(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)とペニシリン‐ストレプトマイシン(PAAラボラトリーズ社)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)においてそれらの細胞を増殖させた。継代4と継代7の間のMSCを共培養実験に使用した。
ベルリン医科大学シャリテの倫理委員会のガイドラインに従って同意書を得て、ヒトHSPCを臍帯血から単離した。臍帯血をPBS‐BSA‐EDTA溶液中に収集し、そして、単核球を密度勾配遠心分離により単離した。次に、MACS CD34+単離キット(ミルテニー・バイオテク社、ドイツ)を使用し、製造業者の使用説明書に従って免疫磁性分離によりHSPCを分離した。次に新しく単離された細胞を2×104細胞/培養物の密度で様々な培養系に導入した。
ドイツのツェルベルクGmbH社より1mmの厚みと1cmの直径を有する酸化ジルコニウムベースのハイドロキシアパタイト被覆スポンセラムHA(登録商標)セラミックディスクを購入した。そのディスクを使用前にオートクレーブした。
HSCの播種7日前にセラミックディスクにMSCを約106細胞/ディスクの密度で播種した。超低結合性24ウェルプレート(コーニング社、米国)中の10%FBS(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)とペニシリン‐ストレプトマイシンを含有するDMEM‐高グルコース(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)中にそれらのセラミックディスクを浸した。プレートを37℃、5%CO2で維持した。培地を48時間毎に交換した。同時に6ウェルプレートにもMSCを播種し、それらは24時間以内に集密に達した。これらのプレートのうちの1つのセットをセラミックスの培養と同じ培地で培養し、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびβ‐グリセロリン酸(シグマ社、米国)を含有する骨誘導性培地で別のセットを処理した。MSCの播種から7日後に新しく単離されたHSPCを4つの培養条件に導入した:1つ目の培養条件、セラミックスに播種されたMSCを用いる3D共培養;2つ目の培養条件、6ウェルプレートに播種されたMSC単層を用いる2D共培養;3つ目の培養条件、6ウェルプレートに播種された骨誘導MSC単層を用いる2D共培養;および4つ目の培養条件、100ng/mlのIL‐6、SCF、TPOおよびFLT‐3L(ペプトテック(Peprotech)社、英国)を添加されたStemspan培地(ステムセル・テクノロジーズ社、カナダ)中での懸濁培養。9つの独立したMSC試料およびHSC試料をこの研究のために利用した。培養開始から1週間後、2週間後および4週間後に各培養系に由来する細胞をフローサイトメトリーと免疫組織化学によって分析した。追加の8週間の時点で長期培養能を確認するために3D培養物を分析した。
NucleoSpin(登録商標)RNA IIキット(マッハライ‐ナーゲル社、ドイツ)を使用し、提供された使用説明書に従ってRNAの単離を実施した。セラミックス中に培養された細胞をそのセラミックス上で直接的に溶解した。TaqMan(登録商標)逆転写試薬cDNAキット(アプライド・バイオシステムズ社、米国)を製造業者の使用説明書に従って使用することによってmRNAの逆転写を実施した。96ウェルPCRプレート(バイオザイム・サイエンティフィック社、ドイツ)中で1μlのプライマー混合物およびSensiFAST(商標)Sybr No‐ROXキット(バイオライン社、ドイツ)と共に1μlのcDNAを使用してリアルタイムPCRを実施し、そして、Stratagene MX3005P(商標)マルチプレックス定量的PCRシステム(アジレント・テクノロジーズ社、米国)で読み込みを行った。TIBMolBiol社(ドイツ)へプライマーを注文した。
蛍光顕微鏡観察によるHSPCとMSCの長期追跡のため、培養前にQtracker(登録商標)525細胞標識キットとCellTracker(商標)レッドCMTPX(インビトロジェン社、米国)を製造業者の使用説明書に従ってそれぞれ使用して細胞を標識した。細胞分裂を追跡するため、単離直後に2.5μΜの濃度でカルボキシフルオレセインジアセテート・スクシンイミジルエステル(CFSE、インビトロジェン社、米国)を製造業者の使用説明書に従って使用してHSPCを標識した。次に、1週間後、2週間後および4週間後にフローサイトメトリーを用いて緑色標識細胞をゲートアウトし、そして、細胞分裂を追跡した。
セラミックスキャフォールド内のECMとシグナル伝達分子を視覚化するために、細胞追跡されるHSPCを播種してから2週間後に細胞を含むセラミックスをアセトン(シグマ社、米国)中において−20℃で固定した。次に、解剖刀を使用してそれらのディスクを切断し、そして、96ウェルプレート中において総計150μlの体積でI型コラーゲン(マウス抗ヒト、シグマ社、米国)、C‐Kit(マウス抗ヒト、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国)、フィブロネクチン(マウス抗ヒト、ミリポア社、米国)、インテグリン4a(マウス抗ヒト、Abcam社、英国)およびN‐カドヘリン(マウス抗ヒト、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国)に対する一次抗体を使用してそれらのディスクを染色した。次に、Alexa350またはAlexa594(インビトロジェン社、米国)と連結させたヤギ抗マウス二次抗体でそれらの試料を染色し、洗浄し、そして、顕微鏡観察により視覚化した。
1週間後、2週間後、4週間後および8週間後の本共培養系中におけるQtracker(登録商標)グリーン追跡HSPCの存在をDAPI(シグマ社、米国)による細胞核の対比染色の後にデジタル蛍光顕微鏡(BZ9000、キーエンス社、ドイツ)下でそれらを視覚化することにより確認した。2光子顕微鏡(Trimscope II、ラビジョン・バイオテック(LaVision BioTec)社、ドイツ)を使用してECMとシグナル伝達分子を3Dスタックとして視覚化し、Imaris第7.5版(ビットプレーン・サイエンティフィック・ソフトウェア(Bitplane Scientific Software)社、スイス)を使用して表示した。
細胞播種セラミック培養系と骨髄の間の構造的類似性を、および、HSPCとMSCに対する物理的相互作用も視覚化するためにSEMを使用した。共培養から2週間後のMSCおよびHSPCを含むセラミックディスクと大腿骨骨頭から切り出した1cm2の小片の骨髄を、アセトンを使用して固定および脱水し、そして、臨界点乾燥により準備した。次にこれらの試料を金および銀で被覆し、日立S‐520SEM(日立、日本)を使用して視覚化した。
全ての培養系に由来するHSPCの表現型をフローサイトメトリー分析により表面マーカー発現に基づいて比較した。恒温器内で1×トリプシン‐EDTA(PAAラボラトリーズ社、オーストリア)と37℃で30分間保温することによって全ての接着性培養系から細胞を収集した。懸濁細胞を収集用チューブに単にピペットで分注した。次にそれらの細胞を製造業者の使用説明書に従って次の抗体で染色した:CD34‐APC(ミルテニー・バイオテク社、ドイツ)、CD38‐PE(eBioscience(登録商標)社、米国)、アネキシンV‐パシフィックブルー(バイオレジェンド社、米国)、ヨウ化プロピジウム(シグマ社、米国)。MACSQuant(登録商標)アナライザー(ミルテニー社、ドイツ)フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー分析を実施し、そして、FlowJoソフトウェア、第7.6.5版(ツリー・スター(Tree Star)社、米国)を使用してデータを分析した。
播種から1週間後、2週間後、4週間後および8週間後に本セラミック共培養系から得られたHSPCの骨髄分化能を、顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球コロニー形成ユニットアッセイを用いて試験した。1000細胞をCFU‐GEMM培地(ミルテニー・バイオテク社、ドイツ)中に播種し、2週間後にコロニーを視覚化し、採点を行った。
2元配置ANOVA分析とそれに続くボンフェローニ補正が、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェア第5.0版(グラフパッド・ソフトウェア社、米国)を使用してデータセットに適用された。0.05以上のP値を有意と見なした。データは平均値±標準偏差として表される。
1.セラミックス内での7日の培養の間にMSCは骨髄に構造的に非常に類似した微小環境を作り出す。
骨髄MSCにおける分化とECM産生に対する3D培養条件の影響は広範囲に考証されてきた。この研究において使用されたセラミックスのような堅いスキャフォールドがMSCを骨形成性分化する方向に持っていくことが示されている。したがって、MSCに対するセラミックスキャフォールド中での3D培養の効果がHSPCの導入の前に判定された。
HSPCを維持する手段としての本3D共培養系の検証について第1の検討事項は、セラミックスに播種されたHSPCがその中に入り込み、かなりの期間にそこに留まるかということであった。セルトラッカー・グリーン標識HSPCが播種から1週間後、2週間後、4週間後および8週間後に(図10A)共培養系において蛍光顕微鏡観察を用いて検出された。このことは、HSPCがMSC播種セラミックスに浸潤し、最大で8週間安定的に維持されることを示す。さらなる時点を試験することはなかった。
次に、第1週、第2週および第4週におけるCFSE標識HPSCのフローサイトメトリー分析によって、本3D共培養系におけるHSPCの増殖を先に述べた従来の培養方法と比べた。1回以下の分裂(CFSEヒストグラムの右から最初の2つのピーク)を行った細胞を緩慢増殖性と見なし、一方、全ての他の細胞を急速増殖性であると見なした。
初期HSPC表現型は本3D培養において最もよく維持されることが立証されたので、早期アポトーシスの広く用いられる指標であるアネキシンVの発現の測定および後期アポトーシス性細胞とネクローシス性細胞によって取り込まれるヨウ化プロピジウム(PI)により全ての培養系におけるそれらの細胞の生存度を判定した。
本3D共培養系において維持されるHSPCはそれらの初期表現型を保持し、且つ、生存可能であると確認した後に我々はCFU‐GEMMアッセイを用いてこれらの細胞がHSPCに特徴的な多系列分化能を保持しているか試験した。
最後に、骨髄HSPCニッチ内の相互作用が本セラミックス共培養系内でかなりの程度まで模倣されていることを示すために本セラミックス系内でのHSPCとMSCの物理的相互作用を調査した。HSPCとMSCの共局在が以前に観察されたが(図10A)、物理的接触の証拠または相互作用機構の兆候は全く得られなかった。
造血性幹細胞・前駆細胞(HSPC)が緩慢増殖性初期細胞として維持される骨内膜造血性ニッチは非常に複雑な系であることが分かっている。骨芽細胞、骨形成性前駆細胞および間葉系幹細胞を含むいくつかの異なる細胞種がECM分子産生、細胞間直接接触、およびシグナル伝達分子産生などの様々な機構によりニッチ制御に寄与することが分かった。個々の細胞種、シグナル伝達経路および物理的基準さえもニッチ維持の様々な態様に関係づけられてきたが、これらの因子とそのニッチにおけるそれらの正確な役割の間の関係は不明のままである。骨内膜ニッチを効率的に模倣するインビトロモデルの開発は、それ故、そのニッチの相互作用の研究に非常に有用だろう。
我々のセラミックスベースの3D共培養系は骨内膜HSPCニッチの最も重要な態様を厳密に模倣しており、そして、健康な状態および疾患状態の両方の状態におけるそのニッチの相互作用を調査するための有用なインビトロモデルを提供するだろう。その3D共培養系は、そのニッチのあらゆる部分を標的とする薬物についての物質試験プラットフォームとしての大きな能力も有する。この系は移植のための効果的なHSPC増殖戦略の基盤を形成することもできるだろう。
Claims (15)
- (a)一層の人工軟骨組織、および
(b)一層の人工骨組織であって、構造付与性スキャフォールドおよび骨髄構造を含む前記人工骨組織
を含み、前記一層の人工軟骨組織が前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に接触する、3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。 - 前記人工軟骨組織が間葉系前駆細胞を用いて、好ましくはCD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+およびCD13+である細胞のうちの少なくとも50%を含む、または前記細胞から成る間葉系前駆細胞を用いて調製され、より好ましくは単離された初代軟骨細胞から調製される、請求項1に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工軟骨組織が請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項1または2に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の骨髄構造が前記構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種することにより調製される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の骨髄構造が、前記構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種し、そして、前記構造付与性スキャフォールド上で間葉系幹細胞を2〜10日間培養した後に造血幹細胞を添加することにより調製される、請求項4に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の構造付与性スキャフォールドが生物性材料または非生物性材料を含む、または生物性材料もしくは非生物性材料から成る、請求項1〜5のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 前記人工骨組織の構造付与性スキャフォールドが3Dセラミックスキャフォールドを含む、または3Dセラミックスキャフォールドから成る、請求項1〜6のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイド。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを作製する方法であって、
‐構造付与性スキャフォールドに間葉系幹細胞を播種するステップ、
‐前記構造付与性スキャフォールド上で前記間葉系幹細胞を2〜10日間培養するステップ、
‐骨髄構造を植えつけられた構造付与性スキャフォールドを含む一層の人工骨組織を調製するために、前記構造付与性スキャフォールド上の前記間葉系幹細胞に造血幹細胞を添加し、そして、その結果の混合物を少なくとも5日間培養するステップ、
‐請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法によって調製された人工軟骨組織を供給するステップ、および
‐前記一層の人工骨組織の少なくとも一方の面に前記人工軟骨組織の層を配置するステップ
を含む前記方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを含む移植物。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドまたは請求項9に記載の移植物、および少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- 軟骨組織または骨組織の特性を調節する物質をインビトロでスクリーニングするための方法であって、
‐請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドの試料を提供するステップ、
‐前記の各試料を複数の部分に分割するステップ、
‐スクリーニングを受ける物質と共に少なくとも1つの部分を培養するステップ、および
‐スクリーニングを受ける前記物質と共に培養されなかった別の部分について測定されたパラメーターと前記の処理された部分について測定されたパラメーターを比較するステップ
を含む前記方法。 - 少なくとも1つの培地供給用貯留槽、請求項1〜7のいずれか一項に記載の3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドを収容する少なくとも1つの器官収容空洞を含む少なくとも1つの器官成長区画を含み、前記培地供給用貯留槽がマイクロ流体供給チャンネルによって前記の少なくとも1つの器官成長区画に連結されている自立型3Dインビトロ二相性軟骨オルガノイドオンチップ装置。
- 軟骨形成細胞凝集体を調製する方法であって、
(a)間葉系前駆細胞を供給するステップ、および
(b)前記間葉系前駆細胞を非接着性条件下で培養して軟骨形成細胞凝集体を形成するステップ
を含む前記方法。 - 前記間葉系前駆細胞がCD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+およびCD13+である細胞のうちの少なくとも50%を含む、または前記細胞から成る、請求項13に記載の方法。
- 前記間葉系前駆細胞が単離された初代軟骨細胞を含む、または単離された初代軟骨細胞から成る、請求項13または14に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12157484.2 | 2012-02-29 | ||
EP12157484.2A EP2634251A1 (en) | 2012-02-29 | 2012-02-29 | 3D in vitro bi-phasic cartilage-bone construct |
PCT/EP2013/054030 WO2013127921A1 (en) | 2012-02-29 | 2013-02-28 | 3d in vitro bi-phasic cartilage-bone construct |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015511482A true JP2015511482A (ja) | 2015-04-20 |
JP2015511482A5 JP2015511482A5 (ja) | 2016-03-10 |
Family
ID=48083111
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014559215A Pending JP2015511482A (ja) | 2012-02-29 | 2013-02-28 | 3dインビトロ二相性軟骨構造物 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9856458B2 (ja) |
EP (2) | EP2634251A1 (ja) |
JP (1) | JP2015511482A (ja) |
CN (1) | CN104204191B (ja) |
DK (1) | DK2834348T3 (ja) |
ES (1) | ES2739201T3 (ja) |
HK (1) | HK1201072A1 (ja) |
HU (1) | HUE044561T2 (ja) |
RU (1) | RU2615439C2 (ja) |
SG (2) | SG10201607179SA (ja) |
TR (1) | TR201911258T4 (ja) |
WO (1) | WO2013127921A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019505346A (ja) * | 2015-12-30 | 2019-02-28 | エックスセル セラピューティックス インク.Xcell Therapeutics Inc. | 3d軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 |
WO2023032441A1 (ja) * | 2021-08-31 | 2023-03-09 | 公立大学法人横浜市立大学 | 造形可能かつ足場不要な軟骨組織の創出法 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011140441A2 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
EP3712254A1 (en) | 2014-05-28 | 2020-09-23 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation |
JP6804438B2 (ja) | 2014-10-17 | 2020-12-23 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のin vivoモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法 |
US9238090B1 (en) | 2014-12-24 | 2016-01-19 | Fettech, Llc | Tissue-based compositions |
WO2017048193A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Agency For Science, Technology And Research (A*Star) | Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells |
CN105754856B (zh) * | 2016-04-12 | 2018-06-22 | 中国航天员科研训练中心 | 一种抽屉式三维类血管化组织培养器官芯片及其构建方法 |
CN105754855B (zh) * | 2016-04-12 | 2018-08-21 | 中国航天员科研训练中心 | 一种流加式两层细胞共培养器官芯片 |
WO2017192997A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Children's Hospital Medical Center | Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same |
KR101836475B1 (ko) * | 2016-08-02 | 2018-03-08 | 아주대학교산학협력단 | 연골 재생용 조성물 및 이의 제조방법 |
KR102558606B1 (ko) | 2016-12-05 | 2023-07-26 | 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 | 결장 유사장기 및 이를 제조 및 사용하는 방법 |
WO2019183204A1 (en) * | 2018-03-21 | 2019-09-26 | Natural Enamel, Llc | Methods for densification and structural alignment of biomineralized material |
CN111494711B (zh) * | 2019-01-31 | 2023-06-23 | 华东理工大学 | 干细胞发生器产生的干细胞用于治疗造血损伤 |
CN115369079B (zh) * | 2022-06-22 | 2023-10-13 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种组合物及其在制备细胞薄膜中的应用 |
CN115671397B (zh) * | 2022-11-10 | 2023-10-13 | 上海大学 | 一种多肽和双生长因子梯度分布的含细胞骨软骨支架及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070123996A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-05-31 | Kiminobu Sugaya | Stem cell comprising tissue substitutes |
JP2011528653A (ja) * | 2008-06-04 | 2011-11-24 | ウヴェ・マルクス | オンチップ臓器デバイス |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4414644A1 (de) | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Bosch Gmbh Robert | Fahrzeugsicherungsanordnung |
US20100167401A1 (en) * | 2007-03-19 | 2010-07-01 | Vasif Hasirci | Stacked, patterned biomaterials and/or tissue engineering scaffolds |
US20110274729A1 (en) * | 2008-11-24 | 2011-11-10 | Collins Daniel P | Implantable compositions for repairing osteochondral defects |
WO2012016711A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Technische Universität Berlin | Circulation system |
-
2012
- 2012-02-29 EP EP12157484.2A patent/EP2634251A1/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-02-28 TR TR2019/11258T patent/TR201911258T4/tr unknown
- 2013-02-28 JP JP2014559215A patent/JP2015511482A/ja active Pending
- 2013-02-28 RU RU2014136268A patent/RU2615439C2/ru active
- 2013-02-28 DK DK13715147.8T patent/DK2834348T3/da active
- 2013-02-28 ES ES13715147T patent/ES2739201T3/es active Active
- 2013-02-28 WO PCT/EP2013/054030 patent/WO2013127921A1/en active Application Filing
- 2013-02-28 SG SG10201607179SA patent/SG10201607179SA/en unknown
- 2013-02-28 HU HUE13715147 patent/HUE044561T2/hu unknown
- 2013-02-28 EP EP13715147.8A patent/EP2834348B1/en active Active
- 2013-02-28 CN CN201380011832.7A patent/CN104204191B/zh active Active
- 2013-02-28 SG SG11201403907VA patent/SG11201403907VA/en unknown
- 2013-02-28 US US14/381,216 patent/US9856458B2/en active Active
-
2015
- 2015-02-12 HK HK15101554.9A patent/HK1201072A1/xx unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070123996A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-05-31 | Kiminobu Sugaya | Stem cell comprising tissue substitutes |
JP2011528653A (ja) * | 2008-06-04 | 2011-11-24 | ウヴェ・マルクス | オンチップ臓器デバイス |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ARTIF.ORGANS,2006,30(10),P.775-84, JPN6016042472, ISSN: 0003654023 * |
CYTOTECHNOLOGY,2010,62(5),P.439-48, JPN6016042470, ISSN: 0003654022 * |
J.BIOMECH.,2007,40(4),P.750-65, JPN6016042474, ISSN: 0003654024 * |
OPEN BIOMED.ENG.J.,2007,1,P.85-90, JPN6016042467, ISSN: 0003654021 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019505346A (ja) * | 2015-12-30 | 2019-02-28 | エックスセル セラピューティックス インク.Xcell Therapeutics Inc. | 3d軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 |
WO2023032441A1 (ja) * | 2021-08-31 | 2023-03-09 | 公立大学法人横浜市立大学 | 造形可能かつ足場不要な軟骨組織の創出法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9856458B2 (en) | 2018-01-02 |
SG10201607179SA (en) | 2016-10-28 |
SG11201403907VA (en) | 2014-09-26 |
EP2834348B1 (en) | 2019-05-08 |
WO2013127921A1 (en) | 2013-09-06 |
TR201911258T4 (tr) | 2019-08-21 |
HK1201072A1 (en) | 2015-08-21 |
ES2739201T3 (es) | 2020-01-29 |
RU2615439C2 (ru) | 2017-04-04 |
US20150093428A1 (en) | 2015-04-02 |
CN104204191A (zh) | 2014-12-10 |
HUE044561T2 (hu) | 2019-11-28 |
CN104204191B (zh) | 2017-02-22 |
DK2834348T3 (da) | 2019-08-05 |
EP2834348A1 (en) | 2015-02-11 |
RU2014136268A (ru) | 2016-03-27 |
EP2634251A1 (en) | 2013-09-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2615439C2 (ru) | 3d in vitro двухфазный костно-хрящевой конструкт | |
Raic et al. | Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells | |
Wagner et al. | Adhesion of hematopoietic progenitor cells to human mesenchymal stem cells as a model for cell− cell interaction | |
JP2021090459A (ja) | 心筋細胞シート | |
CN105209609B (zh) | 用于限定条件下的人多潜能干细胞的血内皮分化的方法和材料 | |
Mendelson et al. | Chondrogenesis by chemotactic homing of synovium, bone marrow, and adipose stem cells in vitro | |
Hsu et al. | Isolation of the multipotent MSC subpopulation from human gingival fibroblasts by culturing on chitosan membranes | |
AU2002360741B2 (en) | Endothelial stem cells, populations, methods of isolation and use thereof | |
Altmann et al. | Promotion of osteoblast differentiation in 3D biomaterial micro-chip arrays comprising fibronectin-coated poly (methyl methacrylate) polycarbonate | |
KR20130040748A (ko) | 자기조립 세포외 기질 메트릭스 제조 방법 및 이것의 용도 | |
Liu et al. | Cell-derived extracellular matrix-coated silk fibroin scaffold for cardiogenesis of brown adipose stem cells through modulation of TGF-β pathway | |
JP2012080874A (ja) | 擬微小重力環境下での三次元組織構築方法 | |
Abay et al. | Bone formation from porcine dental germ stem cells on surface modified polybutylene succinate scaffolds | |
Laowanitwattana et al. | Osteoblastic differentiation potential of human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells in different culture conditions | |
Voeltzel et al. | A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes | |
JP6228117B2 (ja) | 造血幹細胞の骨髄ニッチのinvitroモデリング:造血の調節の研究のための、造血移植片の生着能の評価のための、および医薬品の薬理毒性の試験のためのツール | |
JP2003507035A (ja) | 三次元バイオリアクターにおいて、骨髄から機能的な破骨細胞をエクスビボで産生する方法 | |
Gautrot et al. | Biomimetic Artificial Bone Marrow Niches for the Scale Up of Hematopoietic Stem Cells | |
Mäkelä et al. | Establishment of 3D co-culture model of mesenchymal stem cells and mononuclear cells for studying vasculogenesis/angiogenesis, and the magnetic isolation of endothelial progenitor cells from mononuclear cells | |
Bosch-Fortea et al. | Biomimetic Artificial Bone Marrow Niches for the Scale Up of Hematopoietic Stem Cells | |
Kanthi | Simulation of the bone marrow microenvironment | |
Abrego | Towards Mimicking the Foetal Liver Niche | |
Joshi | Master of Veterinary | |
KR101442783B1 (ko) | 적혈구 분화 유도용 조성물 | |
Piccinini | Engineered three-dimensional microenvironments as functional in vitro models of stromal tissues |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160118 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160118 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161108 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170207 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170410 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170508 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171003 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180424 |