JP2003507035A - 三次元バイオリアクターにおいて、骨髄から機能的な破骨細胞をエクスビボで産生する方法 - Google Patents

三次元バイオリアクターにおいて、骨髄から機能的な破骨細胞をエクスビボで産生する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、骨を吸収するよう機能する培養破骨細胞、およびそのような破骨細胞を生成させる方法を提供する。本発明は、造血細胞又は補助細胞を単離する段階、培養培地に覆われているか囲まれている足場を有するチャンバー内で造血細胞または補助細胞を培養し、該足場により、培養造血細胞または補助細胞の三次元での細胞間接触が可能となる段階、を含む。本発明の破骨細胞は、破骨細胞形成および／または破骨細胞機能を阻害または刺激する薬物をスクリーニングするために有用である。本発明の破骨細胞は、ある種の骨疾患の治療において、そして骨のリモデリングおよび再生において使用するためにも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、原初、1999年８月13日に米国仮出願第60/148,814号として出願され
たものである。
【０００２】 本明細書に記載された発明は、国立科学財団の契約番号BES-963160による支援
の下、米国政府と共同してなされたものである。従って、本発明は、米国政府の
権利にも属する。
【０００３】 本発明の属する技術分野 本発明は、細胞培養の技術分野に関するものであり、特に、培養破骨細胞に関
連した方法および組成物に関する。
【０００４】 本発明の背景 骨は、カルシウム塩の沈着によって強化される有機基質からなる。この有機基
質の95％はＩ型コラーゲンから構成され、残りの5％は、プロテオグリカンおよ
び数多くの非コラーゲンタンパク質から構成されている。細胞の制御下にある骨
有機基質内に沈着する結晶塩は、主に、ヒドロキシアパタイトの形になったカル
シウムとリン酸である[2]。
【０００５】 骨は、また、少なくとも４種類の異なった細胞型をもつ。造骨細胞、破骨細胞
、および骨管壁細胞（bone lining cells）が骨の表面に存在するのに対し、骨
細胞は鉱化した内部に浸透して行く。破骨細胞は、骨基質を発生させる完全に分
化した細胞である。破骨細胞は、典型的なタンパク質産生細胞であり、Ｉ型コラ
ーゲン、および骨基質の非コラーゲンタンパク質を分泌する。また、破骨細胞は
、まだ、その機構は完全に分かってはいないが、骨基質の鉱質化を調節している
[2]。骨細胞は、骨基質内に存在する成熟した造骨細胞であり、骨基質の維持を
担っている。これらの細胞は、基質を合成することができるばかりでなく、一定
の限度で基質を吸収することもできる[3]。骨の管壁細胞は、平坦で長く伸びた
不活性型細胞で、骨形成も骨吸収も起こらない骨表面を覆っている。これらの細
胞の機能についてはほとんど解っていないが、骨管壁細胞が造骨細胞の前駆細胞
であるかもしれないと推測されている[2]。
【０００６】 破骨細胞は、骨吸収を行なう巨大な多核細胞である。骨吸収および骨形成は、
生体において、正常な骨形態形成およびカルシウム恒常性にとって必須の過程で
ある。その生理学的な役割以外にも、骨吸収は、骨粗鬆症、代謝性骨疾患、骨折
、および悪性高カルシウム血症などの病理障害において重要な役割を果たしてい
る。
【０００７】 骨吸収を行なうとき、破骨細胞は、骨に直接接触する広範に嵌合した絨毛突起
からなる波状縁によって規定される極性を示す。破骨細胞は、直径が40〜100μm
で、細胞当たり10〜20個もの核をもつことがある[5]。活性型破骨細胞は、大量
のミトコンドリア、リソソーム、および十分に発達したゴルジ装置をもつ。また
、これらの細胞は移動性細胞で、骨吸収の過程で骨性表面を頻繁に移動する[6]
。
【０００８】 破骨細胞はマクロファージ系譜から派生する。そのため、造血幹細胞ファミリ
ーの一員である。破骨細胞形成を調節する経路では、あらゆるマクロファージ細
胞の分化で見られる初期段階の多くが利用される。最近の報告では、骨髄および
Ｂリンパ球の転写因子であるPU.1が、破骨細胞形成に重要な役割を果たしている
ことが示されている[7]。転写因子であるc-fosおよびc-srcも、破骨細胞形成に
関与している[8]。この他の動物およびヒトにおける変異も、破骨細胞経路を明
らかにしてきた。特に、破骨細胞微小環境下内で間質細胞によるコロニー刺激因
子１（CFS-1）の産生が障害されると、破骨細胞とマクロファージがなくなる[9]
。
【０００９】 補助細胞形成は、骨吸収過程における最初の段階ではない。特定の部位への細
胞補充、骨への細胞付着、鉱質除去と基質分解、運動性およびアポトーシスが、
吸収過程の一部として生じる過程のすべてである。原型となる骨吸収刺激因子（
副甲状腺ホルモン、ビタミンD3、多くのインターロイキン、甲状腺ホルモン、腫
瘍壊死因子など）が骨吸収を間接的に刺激することが現在では知られている。こ
のことは、破骨細胞上にはこれらの分子に対する受容体がないことを意味してい
る。むしろ、通常、破骨細胞や間質細胞の管壁細胞である補助細胞が、吸収シグ
ナルを受容して、次に、前破骨細胞の分化の最終段階を促進刺激する可溶性因子
を産生する[10]。
【００１０】 破骨細胞に吸収する場所を教えるシグナルは間違って規定されている。しかし
、インテグリン受容体の役割は十分に規定されてからなり、オステオポンチンや
コラーゲンのような骨基質分子に対して高い特異性を示す。インテグリンファミ
リーで広く発現されているサブユニット対であるαvβ3は、破骨細胞上に存在す
る。直接観察したところ、αvβ3による干渉を受けると、骨への破骨細胞の付着
が抑止され、骨吸収が阻害されることが分かった[6]。破骨細胞は、裸出した骨
表面上に確立されると、その方向に極性化するようになる。波状縁や透明帯など
の特別なオルガネラ構造体が出現する。波状縁は、広い表面積を提供し、そこを
通して破骨細胞が骨と相互作用できるようになっている、高度に嵌合した絨毛突
起構造である。骨の無機基質が溶解すると、骨吸収の経路において除去される必
要がある有機基質のコラーゲンと非コラーゲン性タンパク質が露出する。酒石酸
抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）は、骨基質分解に関与すると考えられている
、破骨細胞の重要な酵素である。TRAPは、オステオポンチン蛋白質を脱リン酸化
することができる[11]。
【００１１】 破骨細胞を単離することは、かなり難しい。[15]この難しさは、他の骨細胞の
種類より破骨細胞の数が低く、破骨細胞が骨基質へ付着する傾向、および他の骨
細胞との比較による破骨細胞の脆弱性のために生じる。破骨細胞は、ネズミ造血
性細胞の従来のフラスコ培養でうまく生成される。破骨細胞の超微細構造的特徴
を持つ多核性細胞（MNC)を説明した最初の報告は、MNCをネコの骨髄細胞の長期
間培養で生成した[3]。その後、多くの研究者がこの骨髄培養系を他の動物種、
並びにヒトに対して広げ、応用した。これらの培養物中で形成されるMNCは、多
核性、TRAP活性、およびホルモン応答性のような破骨細胞の特徴を有する。しか
し、いくつかの場合において、特にヒトの骨髄培養物において、形成されたMNC
は、骨を吸収する能力を持たなかった。
【００１２】 これらの障害にうち勝つために、研究者らは、骨巨細胞腫のような骨の巨大細
胞腫瘍を、別の方法では硬い骨基質から抽出できない成熟ヒト破骨細胞の供給源
として用いている[16]。これらの細胞は、新生物細胞型ではなく、正常な表現型
および機能を有している。にもかかわらず、骨巨細胞腫のような骨の巨大細胞腫
瘍は、破骨細胞の発生の研究と臨床応用における破骨細胞の使用に関しての本来
の限界のある癌細胞系である。
【００１３】 最近、マウスの可溶性破骨細胞分化因子（sODF）が、ヒト末梢血単核細胞（PB
MC）培養からの機能的な破骨細胞を生成するために使用されている[17]。ODFは
、通常破骨細胞/間質細胞の生体膜において発現しており、破骨細胞発生抑制因
子（OCIF）のリガンドである。M-CSFのPBMC培養物への添加はまた、破骨細胞発
生などのために必須であった。さらに、デキサメタゾンもまた、付着性細胞群の
培養では必要ではないが、ヒトPBMC培養で破骨細胞の形成に必要とされていた。
【００１４】 本発明は、骨髄で見出されるような造血性または補助細胞から機能的な破骨細
胞を生成するための方法と手段を提供する。機能的な破骨細胞は、骨髄の微小な
環境を模倣する三次元バイオリアクターで、インビボの条件から逸脱する添加物
の必要がなく生成される。
【００１５】 本発明の概要 本発明は、造血細胞または補助細胞から機能的な破骨細胞を産生する方法を提
供するものである。便利なことに、造血細胞または補助細胞は、骨髄細胞、間質
細胞、末梢性細胞、幹細胞、臍帯細胞、胚幹細胞、末梢幹細胞、またはこれらの
細胞を組み合わせたものから単離したり、派生させることができる。本方法は、
造血細胞または補助細胞を単離し、培養培地に覆われているか囲まれている足場
を有するチャンバー内で造血細胞または補助細胞を培養することを含む。この足
場により、造血細胞または補助細胞の三次元での細胞間接触が可能となる。
【００１６】 造血細胞または補助細胞は、好ましくは、哺乳動物の造血細胞または補助細胞
である。より好ましい実施態様では、哺乳動物の造血細胞または補助細胞は、ヒ
トの造血細胞または補助細胞である。
【００１７】 本発明によれば、造血細胞または補助細胞は、細胞試料から成熟赤血球を取り
除いた後に残る細胞である単核細胞でもよい。また、本発明によれば、造血細胞
または補助細胞は、骨髄細胞、間質細胞、末梢血細胞、幹細胞、臍帯細胞、胚幹
細胞、末梢幹細胞、および、これらの細胞のいずれかを組み合わせたものから選
択される。
【００１８】 チャンバーまたは容器で使用される足場は、絡み合った繊維、多孔性粒子、ス
ポンジ、またはスポンジ様材料からできていよう。この足場は、合成ポリマー、
天然物質、および半合成物質からなる群より選択された材料から形成されていて
、分解性でも非分解性でもよい。
【００１９】 本発明によれば、生体内での骨髄環境に存在しない添加物を加えることなしに
、破骨細胞が産生される。しかしながら、望ましい場合には、例えば、1,25ジヒ
ドロキシビタミンD3、その生物活性型誘導体、および/または、IL-1、TNF、CSF-
1、IL-6、リンフォトキシン、破骨細胞分化因子、副甲状腺ホルモン、レチノイ
ド、甲状腺ホルモン、およびロイコトリエンなどの他のコロニー刺激因子を培養
培地に添加することもできる。
【００２０】 また、本発明は、造血細胞または補助細胞を単離し、培養培地に覆われている
か囲まれている足場を有するチャンバー内で造血細胞または補助細胞を培養し、
さらに、骨を吸収する細胞を同定することによって、造血細胞または補助細胞か
ら機能的な破骨細胞を産生する方法を提供する。
【００２１】 さらに、造血細胞または補助細胞を単離し、培養培地に覆われているか囲まれ
ている足場を有するチャンバー内で造血細胞または補助細胞を培養し、さらに、
造血細胞または補助細胞をチャンバーに再接種することによって、造血細胞また
は補助細胞から機能的な破骨細胞を産生する方法が提供される。
【００２２】 本発明に係る方法に従って作製された、造血細胞および/または補助細胞から
培養された補助細胞も提供されている。このような破骨細胞は、骨再生、骨合成
、骨改変、および骨改造などの骨工学において使用することができる。このよう
に、本発明によって、造血細胞または補助細胞を単離する段階、培養培地に覆わ
れているか囲まれている足場を有するチャンバー内で造血細胞または補助細胞を
培養し、該足場により、造血細胞または補助細胞の三次元での細胞間接触を可能
にする段階、そして、支持体によって、または支持体なしで細胞を移植する段階
からなる骨工学法が提供される。破骨細胞は、造血細胞などの他の骨細胞ととも
に、またはそれに連続して移植することができる。
【００２３】 本発明は、また、破骨細胞の骨吸収能に影響を与える薬物をスクリーニングす
る方法も提供する。この方法は、造血細胞または補助細胞を単離する段階、培養
培地に覆われているか囲まれている足場を有するチャンバーまたは容器内で造血
細胞または補助細胞を培養し、該足場により、造血細胞または補助細胞の三次元
での細胞間接触が可能となる段階、培養細胞を除去する段階、および、被検化合
物存在下で破骨細胞の骨吸収能を測定する段階を含む。本方法によれば、ヒト破
骨細胞の骨吸収能を強化または低下させる薬物を同定できる。造血細胞または補
助細胞は、哺乳動物の造血細胞または補助細胞でもよい。
【００２４】 好ましい実施態様において、哺乳動物の造血細胞または補助細胞は、ヒトの造
血細胞または補助細胞であろう。
【００２５】 破骨細胞による骨吸収能に影響を与える薬物をスクリーニングする方法におい
て使用する培養培地は、所望の場合には、1,25ジヒドロキシビタミンD3、または
その生物活性型誘導体を含有する。さらに、破骨細胞による骨吸収能に影響を与
える薬物をスクリーニングする方法において使用するためのチャンバーまたは容
器には、造血細胞または補助細胞を再接種することもできる。
【００２６】 また、本発明では、骨を吸収する、単離された破骨細胞が提供されている。好
ましい実施態様において、単離された破骨細胞はカルシトニン受容体を有する。
別の好ましい実施態様において、破骨細胞は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ
を発現する。培養破骨細胞は、反応中の破骨細胞に関係するさまざまな条件を扱
う上で有用である。遺伝子の塩基配列によって、対象となる破骨細胞を形質転換
することができる。
【００２７】 破骨細胞の形成または機能に関連する遺伝子を同定する方法も提供される。こ
の方法は、造血細胞または補助細胞を単離する段階、培養培地に覆われているか
囲まれている足場を有するチャンバー内で造血細胞または補助細胞を培養し、該
足場によって、造血細胞または補助細胞の三次元での細胞間接触を可能にする段
階、被検培養物の培養条件を一つ以上変更する段階、被検試料における破骨細胞
の数と機能を測定する段階、および、被検試料における破骨細胞の数と機能の変
化に関連する遺伝子をスクリーニングする段階を含む。遺伝子は、例えば、ディ
ファレンシャル遺伝子ディスプレイ法、RNA任意プライミング（arbitrarily pri
med）(RAP)-PCR法、または遺伝子マイクロアレイ分析など、さまざまな公知の方
法を用いてスクリーニングすることができる。
【００２８】 また、本発明は、破骨細胞形成に影響する薬物をスクリーニングする方法を提
供する。この方法は、造血細胞または補助細胞を単離する段階、培養培地に覆わ
れているか囲まれている足場を有する容器またはチャンバー内で造血細胞または
補助細胞を培養し、該足場によって、造血細胞または補助細胞の三次元での細胞
間接触を可能にする段階、被検化合物をバイオリアクターに添加する段階、培養
細胞を除去する段階、および、被検化合物の破骨細胞形成に対する影響力を測定
する段階を含む。
【００２９】 発明の詳細な説明 本発明は、造血性細胞または補助細胞由来の破骨細胞の培養法を提供する。方
法は、造血性細胞および/または補助細胞を単離すること、並びに造血性細胞お
よび/または補助細胞が三次元空間において細胞から細胞へ接触することを考慮
した、培養培地で覆われたまたは取り囲まれた足場を持つチャンバーまたは容器
においてこのような細胞を培養することを含む。本発明の方法によって生成され
る破骨細胞が骨を吸収するために機能することは驚くべき発見である。
【００３０】 本明細書で使用される「造血性細胞」という用語は、血液細胞および造血細胞
を意味し、例えば、幹細胞、骨髄細胞、リンパ球、赤血球細胞、始原細胞、前駆
細胞、並びに赤血球、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、巨核
球、血小板、ナチュラルキラー細胞、T細胞、B細胞、および形質細胞のような成
熟血液細胞を含んでもよい。本明細書で使用される「補助細胞」は、間質細胞の
ような本質的には非造血性である任意の細胞を含む。本明細書で使用される「間
質細胞」は、また、内皮細胞、網様細胞、脂肪細胞、および樹状細胞のような専
門の抗原提示細胞などの細胞を含む。造血性細胞または補助細胞は、例えば骨髄
細胞、間質細胞、末梢血細胞、幹細胞、臍帯細胞、胚性幹細胞、末梢幹細胞、も
しくはこれらの細胞の任意の組み合わせのような多くの様々な供給源から単離さ
れてもよい。
【００３１】 本発明により、バイオリアクターシステムと機能的な破骨細胞を生成する方法
が提供される。本明細書で使用される「機能的な破骨細胞」とは、骨を吸収する
ために機能する破骨細胞を意味する。本発明のバイオリアクターは、天然の細胞
外マトリックスと表面積が広い骨髄を模倣する三次元構造を提供し、組織のよう
な細胞密度で細胞から細胞への相互作用を可能にする。本発明のバイオリアクタ
ーが、三次元構造を提供する限り多くの異なる配置をとってもよいことが理解さ
れる。バイオリアクターに関して、「三次元構造」という用語は、「足場」とい
う用語と相互互換的に使用される。
【００３２】 機能的な破骨細胞を生成する際に使用するバイオリアクターは、少なくとも1
つのチャンバーまたはセクションと、そこに位置する足場とを持つ容器または器
（vessel）を含む。足場は、多孔性または繊維性基質から作成される。培地は多
孔性もしくは繊維性基質の上または周囲に配置される。
【００３３】 図1aは、機能的な破骨細胞を生成するために使用されるバイオリアクターの1
つの可能な配置を図示している。図１において、多孔性または繊維性の足場がよ
り低い培養チャンバーに置かれている。本発明のバイオリアクターが、三次元構
造(足場)を提供する限り多数の配置を有することができる。
【００３４】 容器または器の壁はガラス、セラミック、プラスチック、ポリカーボネート、
ビニル、塩化ビニル（PVC）、金属等のような任意の多数の物質を含んでもよい
。造血性および/または補助細胞の機能的な破骨細胞への成長および分化を支持
すると考えられる培養培地を多孔性または繊維性物質の上および/または周囲に
置く。
【００３５】 多くの異なる多孔性または繊維性物質を、例えば絡み合った繊維、多孔性粒子
、スポンジ、またはスポンジ様物質を、バイオリアクターの足場として使用して
もよい。多孔性または繊維性足場は、造血性および/または補助細胞を増殖させ
、かつ分化へと移行させる。限定するものではなく、例を挙げるためのものであ
るが、適当な足場の基質は、多糖類および繊維タンパク質のような天然ポリマー
、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ポリウレタンのような合成ポリマー
、セラミック、および金属、サンゴ、ゼラチン、ポリアクリルアミド、綿、ガラ
ス繊維、カラゲナン(corrageenans）、およびデキストランを含む無機物を含む
幅広く様々な材料を用いて調製することができる。絡み合った繊維の例としては
、ガラスウール、スチールウール、および針金もしくはメッシュを含む。
【００３６】 多孔性粒子の例には、例えば、ビーズ（ガラス、プラスチック等）、セルロー
ス、寒天、ヒドロキシアパタイト、処理済みもしくは未処理の骨、コラーゲン、
セファクリル、セファデックス、セファロース、アガロース、またはポリアクリ
ルアミドのようなゲルを含む。「処理済み」の骨は、例えば酸性またはアルカリ
性の溶液のような異なる化学薬品にさらされてもよい。このような処理は、骨の
多孔性を変える。所望であれば、基質を、例えば、コラーゲン、マトリゲル（ma
trigel）、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、ヒアルロンおよびコンドロイチン
硫酸、ラミニン、ヘモネクチン（hemonectin）、もしくは、プロテオグリカンな
どの細胞外マトリックスまたは細胞外マトリックス群で覆っても良い。
【００３７】 バイオリアクターの足場として用いられる繊維性または多孔性物質は、造血性
および/または補助細胞が進入する開口部または孔を形成する。一旦進入すると
、細胞は繊維性もしくは多孔性物質の孔に入るか、もしくはこれらの物質に付着
し、その上に定着、および/または凝集する。細胞の吸着と定着は、多孔性もし
くは繊維性基質の上に重層する、および/または取り囲む培養培地に、単に細胞
を播種することによって起こる。細胞の付着と定着は、多孔性もしくは繊維性基
質の上へ直接細胞を播種することによっても起こる。
【００３８】 本発明により、造血性および/または補助細胞は繊維性もしくは多孔性物質の
開口部（孔）に入ることができなければならない。当業者は、異なる大きさの造
血性および補助細胞を認識しており、それによってこのような細胞を収容できる
ことが必要とされる孔の大きさを認識している。一般的には、約15ミクロンから
約1000ミクロンまでの大きさの孔を用いることができる。好ましくは、約100ミ
クロンから約300ミクロンまでの大きさの孔を用いる。
【００３９】 好ましい態様では、メンブレンはガス交換を容易にするためにバイオリアクタ
ーに配置される。メンブレンはガス透過性であり、約10から約100μmまでの厚さ
を有してもよい。より好ましい態様では、メンブレンは約50μmの厚さを有する
。メンブレンは、チャンバーまたは容器の底または側面の開口部の上に置かれる
。バイオリアクターからの培地およびの細胞の過剰な漏出を防ぐために、ガスケ
ットは、開口部、および/または開口部および固定されたアセンブリーの下もし
くは横側に置かれた固体プレートの周囲に配置される。
【００４０】 バイオリアクターに用いられる細胞培地は、骨髄細胞の成長と分化、特に、造
血性および/または補助細胞の機能的な破骨細胞への成長と分化を支持するため
に用いられる幅広く知られている培地のいずれかであってよい。例えば、以下の
典型的な培地は、使用され、所望であれば、ビタミンおよびアミノ酸溶液、血清
、ならびに/または抗生物質を補充される：フィッシャー培地（Fisher's medium
)（Gibco）、イーグル基本培地（Basal Media Eagle）（BME）、ダルベッコ改変
イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Media)（D-MEM）、イスカブス改変
ダルベッコ培地（Iscoves's Modified Dulbecco's Media）、最小必須培地（MEM
)、マッコイ5A培地（McCoy's 5A Media）、およびRPMI培地。
【００４１】 特殊化された培地、例えば、MyeloCult(商標)（Stem Cell Technologies）、
およびOpti-Cell(商標)（ICN Biomedicals）のような培地を用いてもよい。所望
であれば、血清を含まない培地、例えば、StemSpan SFEM（商標）（StemCell Te
chnologies）、StemPro 34 SFM（Life Technologies）およびMarrow-Gro（Quali
ty Biological Inc.）のような培地を用いてもよい。
【００４２】 好ましい態様では、マッコイ5A培地（Gibco）をビタミンとアミノ酸溶液を補
充し、約70％ v/vで用いる。さらにより好ましい態様では、培養培地は、約70％
(v/v）マッコイ5A培地（Gibco）、約1x10-6M ヒドロコルチゾン、約50ug/ml ペ
ニシリン、約50mg/mlストレプトマイシン、約0.2mM L-グルタミン、約0.45% 炭
酸水素ナトリム、約1x MEM ピルビン酸ナトリウム、約1x MEM ビタミン溶液、約
0.4x MEM アミノ酸溶液、約12.5%（v/v）熱失活ウマ血清、および約12.5％ 熱失
活FBSを含む。所望であれば、培地用チャンバーを連続して灌流してもよい。
【００４３】 バイオリアクターは、造血性および/または補助細胞で、バイオリアクターの
三次元の足場部分へ穏やかに添加すること、例えば、ピペッティングによって播
種される。または、造血性および/または補助細胞が三次元の足場を覆うおよび/
または取り囲む培地に添加してもよい。細胞は、足場を構成する多孔性または繊
維性物質に定着または移動すると思われる。バイオリアクターに添加された細胞
の数は、三次元の足場の総面積および培養培地の総体積に依存する。好ましくは
、造血性および/または補助細胞は、本明細書において包括的に述べられている
供給源のいずれかから単離され、フィコール/プラークのような勾配によって遠
心分離し、成熟した赤血球細胞を除去し、単核細胞を得る。
【００４４】 高さ約3/16''、幅約5/16''、長さ約5/16''の培養チャンバーを備え、約0.01g
の多孔性または繊維性基質で充填されたバイオリアクターについて、バイオリア
クターに添加された単核細胞の数は、約104個から109個あたりの単核細胞であっ
てよい。好ましくは、4〜6x106細胞をバイオリアクターに播種するために用いて
もよい。これらの指針を用いて、当業者は、三次元の足場の総面積、培地の総体
積、三次元の足場の種類、並びに造血性および/または補助細胞の供給源に依存
してバイオリアクターに播種するために、用いる細胞数を調整することができる
。
【００４５】 好ましくは、培養培養は、2日毎に培地を与える。様々な他の成分を、破骨細
胞の成長と分化をさらに刺激するために、培地に添加してもよい。従って、例え
ば、ビタミンD3（1,25 ジヒドロキシビタミン D3）、1,25 ジヒドロキシビタミ
ン D3の生物活性型誘導体、破骨細胞分化因子、副甲状腺ホルモン（PTH）、レチ
ノイド、甲状腺ホルモン、ロイコトリエン、インターロイキン-1、インターロイ
キン-6、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子、およびコロニー刺激因子-1を培地に
添加してもよい。
【００４６】 好ましい態様において、ビタミンD3は、破骨細胞の増殖、分化、および機能を
刺激するために使用される。細胞培養物を、数日から数週間、任意の時間で増殖
させる。好ましくは、約3週間後に培養物を採集する。破骨細胞形成の阻害の可
能性を回避するため、ヒドロコルチゾンも、好ましくは、約1〜3週間、培養培地
から除去される。
【００４７】 細胞は、多数の周知の方法で採集されうる。接着細胞を放出するためには、チ
ャンバーを、コラゲナーゼのような任意の適当な薬剤で処理することができる。
非接着細胞を培地中へ放出することによって、収集することができる。振とう、
撹拌等のような物理的手段によって、細胞を基質から除去することもできる。そ
の後、例えばピペッティング又は遠心分離のような当技術分野において既知の任
意の手法を使用して、細胞を収集する。好ましくは、非接着性細胞を、穏和な撹
拌、および多孔質又は繊維性の材料の層との混合により放出させ、次いで遠心分
離又は沈降により収集する。
【００４８】 所望であれば、周知のポジティブ選択法を使用して、バイオリアクターから収
集された細胞試料を、破骨細胞に関して、さらに濃縮することができる。従って
、例えば、破骨細胞と結合する抗体が接合している（ビーズのような）固体支持
体を、細胞試料と混合することができる。次いで、破骨細胞が結合した抗体接合
ビーズを、重力、又は磁性ビーズの場合であれば磁石のようなその他の手段によ
り収集する。
【００４９】 バイオリアクターから取り出された細胞試料中の破骨細胞集団を濃縮する手段
として、ネガティブ選択を使用することもできる。ネガティブ選択スキームでは
、破骨細胞以外の細胞と反応する1個以上の抗体が接合している（ビーズのよう
な）固体支持体を、細胞試料と混合することができる。次いで、破骨細胞以外の
細胞が結合した抗体接合ビーズを、重力、又は磁性ビーズの場合であれば磁石の
ようなその他の手段により収集する。
【００５０】 ポジティブ選択においてもネガティブ選択においても、破骨細胞は、大きさに
基づく濾過によりさらに単離されうる。しかしながら、本発明によると、バイオ
リアクターから取り出された細胞試料は、さらに濃縮することなく、多くの異な
る臨床および薬物スクリーニングの現場で使用されうる機能性破骨細胞を含む。
【００５１】 破骨細胞は、例えば多核性、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性、
カルシトニン（CT）受容体の存在、並びに1,25-ジヒドロキシビタミンD3［1,25(
OH)2D3］、副甲状腺ホルモン（PTH）を含むホルモン、およびある種のサイトカ
インに対する応答性のような、周知の特徴を使用して同定されうる。
【００５２】 本発明の方法により作製された破骨細胞は、骨を吸収するように機能する。本
発明の方法により作製された破骨細胞の骨吸収能は、象牙質を使用した、Jones
et al.1986 Scanning Electron.Micros.4:1571-1580およびBoyde et al.Scannin
g Electron.Micros.3:1259-1271に記載されたアッセイ法、又は骨を使用した、C
hambers et al.1985 Endocrinology 116:234-239およびChambers et al.1984 J.
Cell Sci.66:383-399に記載された方法のような周知の骨吸収アッセイ法を使用
して、アッセイされうる。本発明の培養破骨細胞に関して使用するのに特に適し
た骨吸収アッセイ法は、本明細書の実施例7に記載されている。
【００５３】 本発明の培養破骨細胞は、治療および医薬産業における無数の用途を有する。
例えば、本発明の破骨細胞は、破骨細胞形成又は破骨細胞機能、例えば骨吸収活
性を阻害又は刺激する薬物をスクリーニングするために使用されうる。本明細書
において使用される、「破骨細胞形成」とは、造血幹細胞ファミリーからの破骨
細胞の派生を意味する。「骨吸収」又は「骨吸収活性」とは、細胞動員、細胞の
骨への付着、鉱質除去およびマトリックス分解、運動、およびアポトーシスのよ
うな骨吸収における任意の段階を意味する。
【００５４】 現在、様々な疾患が、過小反応性又は過剰反応性の破骨細胞と関連しているこ
とが知られている。例えば、骨粗鬆症は、過剰量の骨が吸収され、破骨細胞が過
剰反応性である状態である。従って、本発明のアッセイ法により同定された破骨
細胞形成又は骨吸収の阻害剤は、骨粗鬆症のような過剰反応性破骨細胞と関連し
た疾患の治療に有用である。
【００５５】 ある種の型の転移性癌、例えば乳癌および前立腺癌において、癌細胞は、原発
腫瘍から移動し、骨内に滞留する。破骨細胞による骨吸収を阻害することにより
、骨病巣を減少させ、そのような病巣から骨に侵入する癌細胞の発生率を減少さ
せることが可能である。
【００５６】 大理石骨病のような様々な疾患状態が、過小反応性破骨細胞により引き起こさ
れると考えられている。そのような疾患は、本発明のアッセイ法により、破骨細
胞形成又は骨吸収の刺激因子として同定された薬物により治療されうる。
【００５７】 従って、本発明により、破骨細胞形成又は破骨細胞の骨吸収能に影響を与える
薬物をスクリーニングする方法が提供される。本明細書において使用される、「
薬物」又は「試験化合物」には、破骨細胞形成又は破骨細胞機能を阻害又は刺激
する能力を有する任意の因子、分子、化学化合物、ホルモン、増殖因子、ヌクレ
オチド配列（オリゴヌクレオチドを含む）、タンパク質（ペプチドを含む）、お
よび試薬が包含される。
【００５８】 破骨細胞の機能、例えば骨吸収に影響を与える薬物の典型的なスクリーニング
アッセイ法においては、培養破骨細胞を、バイオリアクターから取り出し、破骨
細胞の生存を維持するための十分な培養培地又は緩衝溶液を有するペトリ皿、フ
ラスコ、顕微鏡スライド、マイクロタイター皿等に置く。最終的には、破骨細胞
の機能を阻害又は刺激する薬物が作用するであろう場所であるため、液体培地は
、好ましくは、生体の骨環境を模倣するべきである。好ましくは、pHは約7.2に
、温度は約37℃に維持される。所望であれば、スクリーニングアッセイ中、本発
明の培養破骨細胞を、ヒト生体を模倣する環境で、骨又は象牙質試料の上に置く
こともできる。スクリーニングアッセイ法において使用されうる破骨細胞の数は
、経験に基づく。典型的には、細胞試料中の破骨細胞の数に応じて、全部で1×1
06個の細胞を含有する試料が使用されうる。
【００５９】 細胞試料中の破骨細胞の他の細胞に対する相対数は、顕微鏡下で多核の巨細胞
を計数することにより決定されうる。TRAP染色法、骨吸収アッセイ法、又はそれ
らの組み合わせを、実施することもできる。細胞計数の方法は、当技術分野にお
いて周知であり、また実施例4にも記載されている。試験化合物、即ち破骨細胞
活性の可能性のある阻害剤又は刺激剤としてスクリーニングされる薬物の濃度は
、経験に基づく。当業者であれば、スクリーニングアッセイ法において試験化合
物の効果を最も良好に同定するため、異なる組成物の濃度を調整する方法に精通
している。典型的には、ある濃度範囲が使用され、その範囲のうち、破骨細胞の
生存率に対する重度の有害効果を示す部分が、さらなる研究から排除される。そ
の範囲のうち、破骨細胞の生存率に対する有害効果が比較的少ない部分が同定さ
れ、破骨細胞形成、破骨細胞活性、又は破骨細胞機能性に対する阻害又は刺激効
果のさらなる研究のために使用される。
【００６０】 破骨細胞と試験化合物との混合物を、骨吸収活性の阻害又は刺激が起こるため
に十分な時間と条件の下でインキュベートする。本明細書において定義される、
十分な時間とは、約5分から数時間、又はそれ以上の任意の時間でありうる。破
骨細胞をペトリ皿、フラスコ、顕微鏡スライド、マイクロタイター皿等で試験す
る場合、十分な時間は、数分から数時間でありうる。当然、細胞に対する効果を
観察するため、必要に応じて試験時間を延長することもできる。当業者は、試料
を取り出し、細胞の生存率を顕微鏡で検査することにより、スクリーニングアッ
セイ法を実施するための最適な時間を決定することができる。次いで、骨吸収に
対する薬物の効果を決定するための骨吸収アッセイ法が実施されうる。破骨細胞
を骨又は象牙質上で直接試験する場合、骨吸収活性の阻害又は刺激のための十分
な時間は、延長されうる。例えば、試験時間は、数日から約10日、又はそれ以上
でありうる。
【００６１】 反応において使用するための好ましい緩衝液は、1×非必須アミノ酸、1×L-グ
ルタミン、10％FBS、50U/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンが
補充された非フェノールレッド含有MEMである。好ましい態様において、試験反
応容量は、約0.5mlから約2mlの間である。より好ましい態様において、反応容量
は、約1mLである。好ましい態様において、インキュベーション温度は、およそ3
7℃である。
【００６２】 本発明によると、好ましくは、試験化合物が破骨細胞に添加されないことを除
き、試験アッセイ法と同様に培養破骨細胞が処理される対照アッセイ法が、実施
される。試験化合物が骨吸収を阻害又は刺激するために十分な時間の後、骨吸収
アッセイ法が実施される。骨吸収アッセイ法は、試験化合物の存在下でも実施さ
れうる。破骨細胞による骨吸収をアッセイするための方法は、当技術分野におい
て周知であり、本明細書に記載されている。対照試料中の破骨細胞と試験試料中
の破骨細胞との間で骨吸収を比較することにより、骨吸収を阻害又は刺激する試
験化合物が同定される。
【００６３】 別の態様において、破骨細胞形成を阻害又は刺激する薬物をスクリーニングす
るための方法が提供される。この態様においては、試験化合物をバイオリアクタ
ーに直接添加する。培養培地又は三次元足場へ、試験化合物を添加することもで
きる。試験化合物が添加される時点は、経験に基づくが、比較的初期である。典
型的には、試験化合物がバイオリアクターに添加されない対照ランが実施される
。
【００６４】 試験化合物が破骨細胞形成を阻害又は刺激する能力は、破骨細胞計数、TRAP染
色法、骨吸収アッセイ法、又はそれらの組み合わせにより決定されうる。細胞計
数法は、当分野において周知であり、実施例4にも記載されている。細胞数を、
実験アッセイと対照アッセイとの間で比較する。対照ランと比較した破骨細胞数
の増加は、破骨細胞形成の刺激剤の同定と相関している。対照ランと比較した破
骨細胞数の減少は、破骨細胞形成の阻害剤の同定と相関している。
【００６５】 本発明のアッセイ法においてスクリーニングしてもよい阻害試験化合物の例に
は、例えば、カルシトニンの機能的類似体、IFN-γ、およびTGF-β、破骨細胞形
成阻害因子（OCIF）と共にグルココルチコイド、ならびにエストロゲンおよびア
ンドロゲンの類似体が含まれる。本発明のアッセイ法においてスクリーニングし
てもよい刺激試験化合物の例には、例えば、IL-1、TNF、CSF-1、およびIL-6の機
能的類似体、ならびに破骨細胞分化因子（ODF）が含まれる。しかし、上記のよ
うに、利用可能ないかなる試験化合物を用いて、破骨細胞形成および／または破
骨細胞活性または機能性の有効な阻害剤をスクリーニングしてもよい。
【００６６】 場合によっては、試験化合物が、破骨細胞形成または骨吸収について可能性が
ある阻害剤または可能性がある刺激剤として分類されるか否かは不明であり、ま
ずはアッセイ法によって決定される。
【００６７】 同様に、本発明に従って、骨吸収能を有する破骨細胞を提供する。このように
、本発明の破骨細胞は、反応の弱い破骨細胞に関連した骨疾患を治療するために
用いてもよい。そのような病態の例には大理石骨病が含まれる。一方、パジェッ
ト病は、当初破骨細胞による骨吸収の増加から始まり、その後新しい骨形成の代
償的な増加が起こる。
【００６８】 破骨細胞によって行われる骨吸収は骨形成と骨再形成過程の双方の一部である
ことが知られているため、本発明の破骨細胞はまた、骨および歯の人工器官の調
製を含む骨合成、骨改変、および骨工学に用いてもよい。
【００６９】 本発明のいずれかの局面において、バイオリアクターにおいて形成された機能
的破骨細胞は、バイオリアクターから除去して移植される。本明細書において用
いられるように、「移植する」または「移植」という用語は、エクスビボ骨再生
、合成、改変、または再形成の目的のために他に培養することを含む、さらなる
加工のためにバイオリアクターから破骨細胞を除去することを意味する。本明細
書において用いられるように、「移植」はまた、インビボで骨に直接移植する場
合のように、ヒトの体内に破骨細胞を移植する段階を含む。
【００７０】 本発明の破骨細胞は、例えば、骨芽細胞のような他の骨細胞と共に、または伴
わずに移植してもよい。破骨細胞のみを用いる骨工学（再生、合成、改変、また
は再形成を含む）では、通常骨に存在する層状の骨ではなくて、編まれた構造の
骨が形成される。このように、破骨細胞を用いる現在の骨工学の特性は、本発明
の培養破骨細胞をそれらを組み合わせて用いると改善される。破骨細胞と本発明
の破骨細胞は同時に、または連続して移植してもよい。移植はインビボまたはエ
クスビボであってもい。本発明の破骨細胞以外の骨細胞を培養してもよく、体内
から単離してもい。
【００７１】 本発明の破骨細胞は、支持体（足場構造）と共に、または支持体なしで移植し
てもよい。当技術分野において既知であるように、骨工学に用いられる足場構造
には多くの異なるタイプがある。実施例には、本明細書において十分に考察する
ように、バイオリアクターにおける足場構造において用いられる多孔性または繊
維様材料が含まれる。他の実施例には、チタンコーティングポリマーおよびCell
Foam（商標）が含まれ、後者はタンタルの高温沈殿物によって非常に規則正しい
網状の炭素骨格上の薄膜として形成される。
【００７２】 このように、本発明の破骨細胞はまた、骨再形成または骨形成において役立つ
ために移植してもよい。骨再形成の欠損に関連した様々な病態が存在し、そのよ
うな病態を修正するために、本発明の破骨細胞をインビボまたはエクスビボで移
植してもよい。移植のために用いられる本発明の破骨細胞に、遺伝子のヌクレオ
チド配列をトランスフェクトしてもよい。遺伝子は破骨細胞が形成される種に対
して異種であってもよく、または破骨細胞が形成される種に対して本来の種であ
ってもよい。例えば、本発明の破骨細胞は、破骨細胞分化因子（ODF）をコード
するヌクレオチド配列によって形質転換してもよい。破骨細胞分化因子のヌクレ
オチド配列は既知であり、容易に入手できる。
【００７３】 上記のように、本発明の破骨細胞は、他のタイプの骨細胞、例えば骨芽細胞と
共に、または伴わずに移植してもよい。同様に、本発明の破骨細胞は骨再生にお
いて用いてもよい。このように、例えば、チタンまたはプラスチック製の骨置換
体の代用として本発明の破骨細胞を、骨を再生する方法において欠損した、例え
ば折れたもしくは粉砕された骨に、または他の支持体に移植してもよい。この場
合も、本発明の破骨細胞は、他のタイプの骨細胞、例えば骨芽細胞と共に、もし
くは連続して、または伴わずに移植してもよい。
【００７４】 本発明はまた、破骨細胞形成または機能に関連する遺伝子を同定する方法を提
供する。本発明のこの局面において、例えば、破骨細胞分化因子のような骨破壊
物質を含む栄養成分、温度、酸素濃度、CO2濃度、および栄養組成のような培養
条件の様々なパラメータを変更してもよい。一つまたはそれ以上のパラメータを
変更した後、破骨細胞の数と機能を測定する。破骨細胞数は、TRAP陽性細胞を計
数することによって決定してもよい。破骨細胞機能は、骨吸収アッセイ法によっ
て測定してもよい。対照試料と比較して、破骨細胞数および機能の変化が試験試
料に起これば、その系を用いて、その変化の原因となる遺伝子または複数の遺伝
子に関してさらにスクリーニングしてもよい。遺伝子ディファレンシャルディス
プレイ法、RNA任意プライミング（RAP）-PCR技術のようなその改変型、または遺
伝子マイクロアレイ分析を用いて、関係する遺伝子をさらに同定して特徴を調べ
ることができる。これらの方法は当技術分野で周知である。さらに、試験試料の
破骨細胞に関連した遺伝子は、精製または濃縮した本発明の破骨細胞によって発
現される遺伝子をクローニングすることによって同定してもよい。
【００７５】 本発明はさらに、以下の特定の実施例によって説明するが、これらは本発明の
範囲をいかなるようにも制限すると解釈されない。
【００７６】 実施例１バイオリアクターの調製 バイオリアクターは、ポリカーボネート製のプレートを用いて作製した（図1A
）。培養チャンバー（3/16"H×5/16"W×5/16"L）に非常に多孔性の微小担体0.01
gを充填した。充填した微小担体床に培養培地を上層した。培地チャンバーは（
1/2"H×5/16"W×12/16"L）は、培地0.6 mlを含んだ。ガス交換を容易にするため
にTeflon（商標）メンブレン（厚み50 μm）を用いた。
【００７７】 Cellsnow（商標）-EXタイプL（低イオン荷電）、多孔性セルロース微小担体（
キリン、日本：直径１〜２mm；孔径100〜200 μm；95％多孔性）を、ヒト骨髄細
胞のための人工的足場構造としてこれらの実験の全体を通して用いた（図1B）。
【００７８】 実施例２ヒト骨髄調製物 ロチェスター大学研究被験者倫理委員会の指示に従って同意を得たドナーの腸
骨稜から吸引した骨髄を、マッコイ5A培地（ギブコ社、グランドアイランド、ニ
ューヨーク州）によって１：１に希釈して、フィコール／パック（ファルマシア
社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州、密度1.027 g/ml）上に重ね、200
gで30分間遠心した。単核球層を回収して、３回洗浄し、これを用いてバイオリ
アクターに接種した。細胞の一部を採取して、必要に応じて様々なアッセイ法に
おいて用いた。
【００７９】 実施例３三次元ヒト長期骨髄細胞培養 培養物に、適当数の単核球（４〜６×106個/培養チャンバー）を、バイオリア
クターの多孔性の微小担体部分にピペッティングすることによって接種した。培
養物を湿潤CO2インキュベータ（５％CO2を含む）内で37℃でインキュベートした
。LTBMC培地（毎日交換）は、70％（v/v）マッコイ5A培地（ギブコ社）、１×10 -6 Mヒドロコルチゾン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）、50 μg/mlペ
ニシリン（シグマ社）、50 mg/mlストレプトマイシン（シグマ社）、0.2 mM L-
グルタミン（ギブコ社）、0.045％重炭酸ナトリウム（シグマ社）、１×MEMビル
ビン酸ナトリウム（ギブコ社）、１×MEMビタミン溶液（ギブコ社）、0.4×MEM
アミノ酸溶液（ギブコ社）、12.5％（v/v）熱不活化ウマ血清（ギブコ社）、お
よび12.5％熱不活化FBS（ギブコ社）で構成された。最初の二週間、培養物には
完全な培養培地を２日ごとに与えた。２週間目に、培養物を、多孔性のミクロス
フェアの床を軽く攪拌して混合することによって浮遊させ、非接着細胞を放出さ
せた（50 μl/ウェル）。非接着細胞の生存細胞数は、トリパンブルー色素（シ
グマ社）と血球計算盤を用いる色素排除法によって決定した。２週目から、培養
物に1,25-D-ジヒドロキシビタミンD3（ICNバイオメディカルズ社、オーロラ、オ
ハイオ州）の異なる濃度（10-7、５×10-8、10-8、および10-9 M）を含むヒドロ
コルチゾン不含培地を２日ごとに加えた。培養物を３週目に回収して、緩くピペ
ッティングして、４週目に様々なアッセイ法を行った。
【００８０】 実施例４ディファレンシャル細胞分析 ヒトLTBMCから得られた非接着細胞のサイトスピンスライドガラスを、サイト
スピン遠心装置（シャンドン社、セウィックレー、ペンシルバニア州）を用いて
、サイトスピンの漏斗状装置の中で20,000個/スライドガラスを500 rpmで５分間
遠心することによって調製した。細胞を風乾させてから、ライト染色液（ジオメ
トリックデータ社、ウェイン、ペンシルバニア州）によって15分間染色後、蒸留
水で１分間洗浄した。ディファレンシャル細胞算定は、１試料あたり細胞100個
以上を計数することによって盲検的に実施した。それぞれの培養条件に関して、
同一の培養物６〜９個を確立した[19]。形態学的に識別可能な「破骨細胞様」細
胞は、ビタミンD3添加および非添加培養の双方からの細胞液に認めた（図２）。
これらの巨大な多核細胞は、骨髄塗抹標本において認められる典型的な破骨細胞
の細胞形態学を示し、マクロファージおよび巨核球と容易に区別可能であった。
【００８１】 実施例５細胞形態学の特徴付け バイオリアクターから採取した足場構造と細胞を２％バクトアガー（ギブコ社
）に抱埋した後、10％中性緩衝ホルマリン（フィッシャー社、ピッツバーグ、ペ
ンシルバニア州）において少なくとも１時間固定した。次に、それらにパラフィ
ンを浸透させた[20]。三次元LTBMCのパラフィン薄切片を、連続的に４〜５μmの
厚みに切断して、化学物質をコーティングしたスライドガラスに載せた。パラフ
ィン薄切片をキシレン、100％アルコール、95％アルコール、および70％アルコ
ールの後に水道水ですすぐことによってパラフィンを除去した。次に切片をメイ
ヤーズ、ヘマトキシリン-エオジンによって染色して、細胞形態学の特徴を調べ
るために顕微鏡下で調べたところ、「破骨細胞様」細胞の存在を確認した[20]。
図3Aおよび3Bに示すように、細胞は、波状の境界によって示される極性を示し、
これは、マトリクス表面と直接接しているように思われた。このように、三次元
足場構造は骨髄の空間的構築を模倣し、それによって細胞外マトリクスとの細胞
相互作用が可能となり、その結果、骨において認められる破骨細胞と類似の形態
を示す破骨細胞様細胞が得られる。
【００８２】 実施例６TRAPのサイトスピン調製 三次元培養物から採取した細胞のサイトスピンスライドガラスを実施例４に記
載のように調製した。スライドガラスを風乾して、TRAP染色を行うまで冷蔵庫で
保存した。TRAP染色の前に、スライドガラスを室温にした。酸フォスファターゼ
、白血球キット（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）の製造元の指示に従っ
て、スライドガラスを固定溶液（ホルマリン、アセトン、およびクエン酸塩を含
む）中で30秒間固定した後、蒸留水で洗浄した。次に、スライドガラスを以下の
予め加温した混合液：ジアゾ化ファストガーネットGBC溶液、ナフトールAS-BIホ
スフェート溶液、酢酸塩溶液と共に酒石酸塩溶液において、37℃で少なくとも一
時間遮光して染色した。スライドガラスを蒸留水中ですすぎ、ギルヘマトキシリ
ン中で２分間染色した後、0.3％アンモニア水に８回浸して青色を発色させた[20
、21]。塗抹標本を風乾させて、ツァイスアキシオスコープ顕微鏡（ツァイス社
、ソーンウッド、ニューヨーク州）を用いて観察した。
【００８３】 ライト染色したサイトスピンスライドにおいて同定された大きい、多核の「破
骨細胞様」細胞は、酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（TRAP）に関して強い要請
反応を示した（図４）。これらの多核細胞（３個またはそれ以上の核を含む）の
大多数は、TRAP染色陽性であった。類似の結果が２つの独立した実験において得
られた。
【００８４】 実施例７骨吸収アッセイ法 破骨細胞の機能性は、骨吸収アッセイ法を行うことによって決定した。簡単に
説明すると、三次元バイオリアクターから採取した細胞を、ウシ大腿表層骨から
の骨ウェーハ（４mm×４mm）上で培養した。細胞をウェーハ上に30分間沈降させ
た。次に、ウェーハを96ウェルプレートのウェルに移して、培地を加えた。培地
は、フェノールレッド不含MEM（ギブコ社）、１×非必須アミノ酸（ギブコ社）
、１×L-グルタミン（ギブコ社）、10％熱不活化FBS（ギブコ社）、50 U/mlペニ
シリン、および50 mg/mlストレプトマイシンで構成された。培地に適当な濃度の
ビタミンD3を副甲状腺ホルモン（PTH、10-8 M；シグマ社）と共に、または伴わ
ずに加えた。骨ウェーハを37℃のインキュベータ（５％CO2含有）に入れて、さ
らに10日間培養した。ウェーハをトルエンブルーによって染色して、反射光顕微
鏡（オリンパス社、メルビル、ニューヨーク州）を用いて吸収点を採点した。破
骨細胞の吸収点の数および表面積は、デジタル画像化ソフトウェアを用いて定量
し、これは細胞活性の指標であった[7]。１試料あたり３本を採点した。
【００８５】 異なる実験において、バイオリアクターにおいて４週間培養後、培養物を回収
して、骨吸収アッセイ法をウシ大腿表層骨からの骨ウェーハ上で実施した。無数
の吸収点が形成された（図５）。陰性対照には、吸収点は形成されなかった。骨
ウェーハを吸収点に関して採点した。破骨細胞点の数および表面積を定量し、こ
れは細胞活性の指標であった。ビタミンD3の用量依存性を認めた（図６）。高濃
度のビタミンD3（10-7 M）によって、最高レベルの吸収活性が得られた。その上
、PTHを添加すると、吸収活性をさらに刺激した。この結果は、PTHの刺激的な役
割[23]と一致し、三次元模倣体において形成された「破骨細胞状」細胞が、真の
破骨細胞としての挙動を示すことを確認する。
【００８６】 実施例８吸収後の骨ウェーハ表面の走査型電子顕微鏡（SEM）試験 骨吸収アッセイ法（実施例７）において用いた骨ウェーハを試料ステージに載
せて、デスクIIバキューム（ランド社、ワイコッフ、ニュージャージー州）にお
いて金をコーティングした[22]。レオ982デジタルSEM（レオ電子顕微鏡、イギリ
ス）を用いた。骨ウェーハの走査型電子顕微鏡によって、破骨細胞によって穴を
掘られた吸収小腔(lacunae)が認められた（図7aおよび7b）。顕微鏡写真は、有
機マトリクス、すなわちコラーゲン繊維が分解する前に、無機質の溶解が起こる
ことを示している。
【００８７】 参考文献
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1aは、バイオリアクターの1つの可能な配置の図面である。本
明細書に図示されている配置において、多孔性または繊維性の足場は、培養チャ
ンバーに置かれる。図1bは、バイオリアクターの人工的足場として用いられるマ
クロ孔質セルロース微粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】 ビタミンD3補充三次元培養物からのライト染色された（Wright's
stained）サイトスピンスライドの「破骨細胞様」細胞の顕微鏡写真である。「
破骨細胞様」細胞は、巨大な多核性細胞の特徴を有し、骨髄塗抹標本で観察され
るものと似ている。
【図３】 図3aは、三次元バイオリアクター培養後の薄いパラフィン切片の
「破骨細胞様」細胞の顕微鏡写真である。図3bは、基質（M）の表面と直接接触
したままであるように見える、波打った輪郭によって定められる多孔性を示す破
骨細胞様細胞の同倍率の顕微鏡写真である。培養物にビタミンD3を補充した。
【図４】 三次元擬態におけるTRAP陽性多核性（3つまたはそれ以上の核）
「破骨細胞様」細胞の顕微鏡写真である。培養物にビタミンD3を補充した。
【図５】 図5aは、3-Dバイオリアクターから集めた細胞について骨吸収ア
ッセイ法の結果の顕微鏡写真である。吸収点は、破骨細胞によって形成され、は
っきり見ることができる。実線は、吸収小腔(lacunae)を縁どったものである。
図5bは、図5aに図示されている（ビタミンD3およびPTH非存在下の）同じ骨吸収
アッセイ法の陰性対象からの骨ウェーハの顕微鏡写真である。
【図６】 骨吸収活性に対するビタミンD3濃度とPTHの影響を図示したもの
である。用いたPTH濃度は、10-3Mであった。データは、3つの骨ウェーハからの
平均を示す。アステリスクは、3つのデータの代わりに2つのデータのもので、骨
ウェーハを数えた実験群を示す。
【図７】 バイオリアクターで生成された破骨細胞による吸収後の骨ウェー
ハの表面の走査型電子顕微鏡写真である。矢印は、破骨細胞の残異物を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/06 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 37/00 １０２ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/53 5/00 Ｅ 37/00 １０２ Ｂ 15/00 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 FA16 FA20 FB02 HA16 4B024 AA01 AA11 BA11 BA63 CA02 CA09 DA02 GA11 GA18 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ42 QQ52 QR55 QR69 QR77 QR80 QR82 QS24 QS28 QS34 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA24 BB20 BC41 BC50 CA24 CA31 CA44 4C087 AA03 BB44 BB64 CA04 ZA96 ZA97 ZB21 ZC41

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 造血細胞または補助細胞から破骨細胞を培養する方法であっ
    て、 造血細胞または補助細胞を単離する段階、および 培養培地に覆われているか囲まれている足場を有するチャンバー内で造血細胞
    または補助細胞を培養し、該足場により、培養造血細胞または補助細胞の三次元
    での細胞間接触が可能となる段階、を含む方法。
  2. 【請求項２】 造血細胞または補助細胞が、哺乳動物の造血細胞または補助
    細胞である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 哺乳動物の造血細胞または補助細胞が、ヒトの造血細胞また
    は補助細胞である、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 造血細胞または補助細胞が単核細胞である、請求項１記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 造血細胞または補助細胞が、骨髄細胞、間質細胞、末梢血細
    胞、幹細胞、臍帯細胞、胚幹細胞、末梢幹細胞、および、これらの細胞のいずれ
    かの組み合わせからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 足場が、絡み合った繊維、多孔性粒子、スポンジ、またはス
    ポンジ様材料からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 足場が、金属、ガラス、セラミック、プラスチック、ヒドロ
    キシアパタイト、処理済みまたは未処理の骨、合成ポリマー、天然物質、および
    半合成物質からなる群より選択された材料から形成される、請求項１記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 材料が分解性である、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 材料が非分解性である、請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 培養培地が、1,25ジヒドロキシビタミンD3、1,25ジヒドロ
    キシビタミンD3の生物活性型誘導体、破骨細胞分化因子、副甲状腺ホルモン、レ
    チノイド、甲状腺ホルモン、ロイコトリエン、インターロイキン-１、インター
    ロイキン-６、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子、およびコロニー刺激因子-１を
    含む、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 骨を吸収する細胞を同定する段階をさらに含む、請求項１
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 造血細胞または補助細胞をチャンバーに再接種する段階を
    さらに含む、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１記載の骨髄細胞から培養された破骨細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１記載の方法によって培養された細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載の方法によって培養された細胞を増殖させる
    段階、および該細胞を移植する段階を含む、骨を合成または改変する方法。
  16. 【請求項１６】 造骨細胞および破骨細胞を一緒に移植する、請求項15記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 造骨細胞および破骨細胞を連続して培養する、請求項15記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞を支持体上で増殖させる、請求項15記載の方法。
  19. 【請求項１９】 細胞を支持体なしで増殖させる、請求項15記載の方法。
  20. 【請求項２０】 破骨細胞の骨吸収能に影響を与える薬物をスクリーニング
    する方法であって、 造血細胞または補助細胞を単離する段階、 培養培地に覆われているか囲まれている足場を有する容器内で造血細胞または
    補助細胞を培養し、該足場により、培養造血細胞または補助細胞の三次元での細
    胞間接触が可能となる段階、 培養細胞を除去する段階、および 試験化合物存在下における破骨細胞の骨吸収能を測定する段階、を含む方法。
  21. 【請求項２１】 培養細胞が単離された破骨細胞である、請求項20記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】 培養細胞が、培養液から得られた細胞混合物である、請求
    項20記載の方法。
  23. 【請求項２３】 培養細胞が、培養液から分画された細胞である、請求項20
    記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ヒト破骨細胞の骨吸収能が強化される、請求項20記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 ヒト破骨細胞の骨吸収能が低下する、請求項20記載の方法
    。
  26. 【請求項２６】 造血細胞または補助細胞が、哺乳動物の造血細胞または補
    助細胞である、請求項20記載の方法。
  27. 【請求項２７】 哺乳動物の造血細胞または補助細胞が、ヒトの造血細胞ま
    たは補助細胞である、請求項26記載の方法。
  28. 【請求項２８】 造血細胞または補助細胞が単核細胞である、請求項20記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】 造血細胞または補助細胞が、骨髄細胞、間質細胞、末梢血
    細胞、および、これらの細胞のいずれかの組み合わせからなる群より選択される
    、請求項20記載の方法。
  30. 【請求項３０】 足場が、絡み合った繊維、多孔性粒子、スポンジ、または
    スポンジ様材料からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
  31. 【請求項３１】 足場が、合成ポリマー、天然物質、および半合成物質から
    なる群より選択された材料から形成される、請求項20記載の方法。
  32. 【請求項３２】 材料が分解性である、請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】 材料が非分解性である、請求項31記載の方法。
  34. 【請求項３４】 培養培地が、1,25ジヒドロキシビタミンD3、またはその生
    物活性型誘導体を含む、請求項20記載の方法。
  35. 【請求項３５】 骨を吸収する細胞を同定することによって、破骨細胞を同
    定する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
  36. 【請求項３６】 造血細胞または補助細胞をチャンバーに再接種する段階を
    さらに含む、請求項20記載の方法。
  37. 【請求項３７】 骨を吸収する単離破骨細胞。
  38. 【請求項３８】 破骨細胞がカルシトニン受容体をもつ、請求項37記載の破
    骨細胞。
  39. 【請求項３９】 破骨細胞が酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを発現する、
    請求項37記載の破骨細胞。
  40. 【請求項４０】 破骨細胞が遺伝子の塩基配列によって形質転換されている
    、請求項37記載の単離破骨細胞。
  41. 【請求項４１】 遺伝子の塩基配列が、破骨細胞の由来する生物種とは異種
    のものである、請求項40記載の単離破骨細胞。
  42. 【請求項４２】 遺伝子の塩基配列が、破骨細胞の由来する本来の生物種の
    ものである、請求項37記載の単離破骨細胞。
  43. 【請求項４３】 塩基配列が破骨細胞分化因子をコードしている、請求項41
    または42記載の単離破骨細胞。
  44. 【請求項４４】 破骨細胞の形成または機能に関連する遺伝子を同定する方
    法であって、 （a）造血細胞または補助細胞を単離する段階、 （b）培養培地に覆われているか囲まれている足場を有するチャンバー内で造
    血細胞または補助細胞を培養し、該足場により、培養造血細胞または補助細胞の
    三次元での細胞間接触が可能となる段階、 （c）試験培養物の培養条件を一つ以上変更する段階、 （d）試験試料における破骨細胞の数および機能を測定する段階、ならびに （e）試験試料における破骨細胞の数および機能の変化に関連する遺伝子（単
    数または複数）をスクリーニングする段階、を含む方法。
  45. 【請求項４５】 TRAP陽性細胞を数えることによって破骨細胞数を測定する
    、請求項44記載の方法。
  46. 【請求項４６】 骨吸収測定法（bone resorption assay）によって破骨細
    胞機能を測定する、請求項44記載の方法。
  47. 【請求項４７】 破骨細胞の数および機能の変化に関連する遺伝子(単数ま
    たは複数)のスクリーニング法が、遺伝子のディファレンシャルディスプレイ法
    、RNA任意プライミング（arbitrarily primed）(RAP)-PCR法、または遺伝子マイ
    クロアレイ分析のうち少なくとも一つ以上の方法である、請求項44記載の方法。
  48. 【請求項４８】 破骨細胞形成に作用する薬物をスクリーニングする方法で
    あって、 （a）造血細胞または補助細胞を単離する段階、 （b）培養培地に覆われているか囲まれている足場を有する容器またはチャン
    バー内で造血細胞または補助細胞を培養し、該足場により、培養造血細胞または
    補助細胞の三次元での細胞間接触が可能となる段階、 （c）試験化合物をバイオリアクターに添加する段階、 （d）培養細胞を除去する段階、および、 試験化合物の破骨細胞形成に対する影響力を測定する段階、を含む方法。
  49. 【請求項４９】 破骨細胞数の計数、TRAP染色、骨吸収測定、またはこれら
    を併用した方法によって、試験化合物の破骨細胞形成に対する影響力を測定する
    、請求項48記載の方法。
  50. 【請求項５０】 培養細胞が単離された破骨細胞である、請求項48記載の方
    法。
  51. 【請求項５１】 培養細胞が、培養液から得られた細胞混合物である、請求
    項48記載の方法。
  52. 【請求項５２】 培養細胞が培養液から分画される、請求項48記載の方法。
  53. 【請求項５３】 試験化合物の効果が、破骨細胞形成を刺激するものである
    、請求項48記載の方法。
  54. 【請求項５４】 試験化合物の効果が、破骨細胞形成を阻害するものである
    、請求項48記載の方法。
  55. 【請求項５５】 造血細胞または補助細胞が、哺乳動物の造血細胞または補
    助細胞である、請求項48記載の方法。
  56. 【請求項５６】 哺乳動物の造血細胞または補助細胞が、ヒトの造血細胞ま
    たは補助細胞である、請求項48記載の方法。
  57. 【請求項５７】 造血細胞または補助細胞が単核細胞である、請求項48記載
    の方法。
  58. 【請求項５８】 造血細胞または補助細胞が、骨髄細胞、間質細胞、末梢血
    細胞、および、これらの細胞のいずれかの組み合わせからなる群より選択された
    、請求項48記載の方法。
  59. 【請求項５９】 足場が、絡み合った繊維、多孔性粒子、スポンジ、または
    スポンジ様材料からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
  60. 【請求項６０】 足場が、合成ポリマー、天然物質、および半合成物質から
    なる群より選択された材料から形成される、請求項48記載の方法。
  61. 【請求項６１】 材料が分解性である、請求項60記載の方法。
  62. 【請求項６２】 材料が非分解性である、請求項60記載の方法。
  63. 【請求項６３】 培養培地が、1,25ジヒドロキシビタミンD3、またはその生
    物活性型誘導体を含む、請求項48記載の方法。
  64. 【請求項６４】 造血細胞または補助細胞をチャンバーに再接種する段階を
    さらに含む、請求項48記載の方法。
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