CN105209609B - 用于限定条件下的人多潜能干细胞的血内皮分化的方法和材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于使多潜能干细胞分化成内皮和造血细胞系细胞的方法和组合物。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月13日提交的美国临时专利申请系列号61/779,564的权益。
关于联邦资助研究/开发的声明
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HL099773和HL116221资助完成。政府对本发明拥有某些权利。
背景技术
人多潜能干细胞技术的到来已经提供了体外生成内皮和造血细胞以用于功能性研究和治疗的机会。先前，采用小鼠骨髓基质细胞系OP9的共培养系统已被用于建立人多潜能干细胞(hPSC)向内皮和血液细胞系的有效且可调的分化。然而，依赖于小鼠饲养细胞和血清(即，异种来源的)共培养系统在研究hPSC对于特异性生长因子的响应方面具有受限的效用。此外，当考虑制造临床级别的治疗性血细胞时，所述系统具有额外的限制。
鉴于现有技术中培养系统的缺点，需要新型培养系统来提供适用于临床条件且没有引入异种污染物的风险的内皮和血液细胞系来源。
发明内容
本文提供的一个方面中，提供一种使人多潜能干细胞分化的方法，所述方法包括：(a)提供人多潜能干细胞；和(b)在缺氧条件下于细胞培养基中培养所述人多潜能干细胞约两天，以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的细胞群，所述细胞培养基包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl。
在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：(c)在缺氧条件下，使步骤(b)的处于原始中胚层阶段的细胞与包含组分FGF2和VEGF的混合物接触约1-2天，以获得包含具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)的群。在一些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(d)使步骤(c)的处于血管中胚层阶段的细胞与包含组分FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO和IL3的混合物接触约一天，以实现CD144+CD73+CD235a/CD43-非血原性内皮祖细胞(非HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43-血原性内皮祖细胞(HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43+41a-血管原性造血祖细胞(AHP)和CD43+CD41a+造血祖细胞的形成。在一实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(e)在正常氧压下使HEP和出现的造血祖细胞与FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO、IL3的混合物继续接触约三天，导致造血扩增，以获得由CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞组成的CD43+造血祖细胞的群。
在一些实施方式中，任何前述方法中所用的混合物基本由所述组分组成。在一些实施方式中，待用的混合物是无异种的。
在一些实施方式中，所述人多潜能干细胞在基质上提供，所述基质经生腱蛋白-C处理。
在另一个方面中，本文提供一种无异种的培养基，所述培养基用于使人多潜能干细胞分化，所述培养基包含补充有如下物质的IF9S培养基：约50-约250ng/ml BMP4；约10-约15ng/ml激活素A；约10-约50ng/ml FGF2；和约1mM-约2mM LiCl。
本文提供的一个相关方面中，提供一种无异种的培养基，所述培养基用于使人多潜能干细胞分化，所述培养基包含补充有如下物质的IF9S培养基：约10-约50ng/ml FGF2；和约20-约50ng/ml VEGF。在一些实施方式中，当所述培养基包含FGF2和VEGF时，所述培养基还包含造血细胞因子。在一些实施方式中，所述造血细胞因子包括：约50-约100ng/mlSCF；约50-约100ng/ml TPO；约50-约100ng/ml IL-6；和约5-约15ng/ml IL-3。在一些实施方式中，任何前述的培养基基本由IF9S培养基和所述补充的组分组成。在一些实施方式中，任何前述的培养基以浓缩形式提供。
在另一个方面中，本文提供一种无异种的细胞培养系统，用于使人多潜能干细胞分化成中胚层、内皮和造血祖细胞，所述细胞培养系统包括：以单细胞悬液形式接种在基质上的人多潜能干细胞，所述基质包含浓度为至少约0.25μg/cm2-1μg/cm2的生腱蛋白C的层；和包含IF9S培养基的无异种的培养基，所述IF9S培养基补充有如下物质：约50-约250ng/mlBMP4；约10-约15ng/ml激活素A；约10-约50ng/ml FGF2；和约1-约2mM LiCl。
在另一个方面中，本文提供一种使多潜能干细胞分化的方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供人多潜能干细胞；(b)将所述细胞以单细胞悬液的形式接种于基质上，所述基质经生腱蛋白C处理；和(c)在缺氧条件下，在补充有BMP4、激活素A、FGF2和LiCl的IF9S培养基中培养所述接种的细胞约两天，以获得具有间充质成血管细胞潜能的约30％的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞。
在一些实施方式中，上述方法还包括如下步骤：在缺氧条件下，在补充有FGF2和VEGF的IF9S培养基中培养处于EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层阶段的细胞约1-2天，以获得具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-血管中胚层前体。
在另一个方面中，本文提供通过任何前述的用于使人多潜能干细胞分化的方法生成的纯化细胞群，其中，所述细胞未与非人成分接触。
本文提供的一个相关方面中，提供通过本文所述方法产生的纯化细胞群，其中所述细胞是多于约35％的具有形成间充质成血管细胞集落的潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞。
在另一个方面中，本文提供一种纯化细胞群，其中所述细胞是多于约35％的具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层，和多于30％的具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-血管中胚层细胞。
在另一个方面中，本文提供一种纯化的细胞群，其中所述群包括多于约40％的CD144+细胞，所述CD144+细胞包含CD144+CD73-CD235a/43-血原性内皮祖细胞(HEPs)、CD144+CD73-CD235a/CD43+CD41a-血管原性造血祖细胞和CD144+CD73+CD235a/43-非血原性内皮祖细胞(非HEP)。
在另一个方面中，本文提供一种细胞群，其中所述群包括多于约30％的CD43+造血祖细胞，所述CD43+造血祖细胞由CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞组成。
在另一个方面中，本文提供一种产生间充质成血管细胞的方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供人多潜能干细胞；(b)将所述细胞接种在用有效量的胶原处理的基质上；和(c)在缺氧条件下，使所述干细胞与包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的混合物接触约两天，以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的群。在一些实施方式中，待用的胶原包含胶原IV。
在另一个方面中，本文提供一种用于使人多潜能干细胞分化的细胞培养基，其包含：64mg/L L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、40μl/L单硫代甘油、8.4μg/L额外的亚硒酸钠、10mg/L聚乙烯醇、1x GLUTAMAX、1x非必需氨基酸、0.1x化学限定的脂质浓缩物、10.6mg/L全转铁蛋白(Holo-Transferrin)和20mg/L胰岛素。
在另一个方面中，本文描述一种使人多潜能干细胞分化的方法，所述方法包括：(a)提供人多潜能干细胞；和(b)在缺氧条件下于细胞培养基中培养所述人多潜能干细胞约两天，以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的细胞群，所述细胞培养基包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl。
在一些实施方式中，所述人多潜能干细胞培养在生腱蛋白C上。在一些实施方式中，所述细胞培养基包含IF9S细胞培养基。在一些实施方式中，所述细胞培养基中的浓度为：BMP4约50ng/ml-约250mg/ml；激活素A约10ng/ml-约15ng/ml；FGF2约10ng/ml-约50ng/ml；且LiCl约1mM-约2mM。
在一些实施方式中，所述方法还包括(c)在缺氧条件下，在包含FGF2和VEGF的细胞培养基中培养步骤(b)中获得的细胞群约1-2天，以获得包含具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)的细胞群。在一些实施方式中，所述细胞培养基中的浓度如下：FGF2约10ng/ml-约50ng/ml；且VEGF约20ng/ml-约50ng/ml。
在一些实施方式中，所述方法还包括(d)在缺氧条件下，在细胞培养基中培养步骤(c)的血管中胚层细胞约一天，以获得包含CD144+CD73+CD235a/CD43-非血原性内皮祖细胞(非HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43-血原性内皮祖细胞(HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43+41a-血管原性造血祖细胞(AHP)和CD43+CD41a+造血祖细胞的细胞群，所述细胞培养基包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO和IL3。在一些实施方式中，所述细胞培养基中的浓度为：FGF2约10ng/ml-约50ng/ml；VEGF约20ng/ml-约50ng/ml；SCF约50ng/ml-约100ng/ml；TPO约50ng/ml-约100ng/ml；IL-6约50ng/ml-约100ng/ml和IL-3约5ng/ml-约15ng/ml。
在一些实施方式中，所述方法还包括(e)在正常氧压下，在培养基中培养所述HEP和造血祖细胞约三天，以获得CD43+造血祖细胞的扩增的群，所述扩增的群包含CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞，所述培养基包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO、IL3。
在一些实施方式中，所述方法还包括：进一步使所述CD34+CD43+造血祖细胞的扩增的群在过表达DLL4的OP9细胞上共培养约三周，以获得包含CD4+CD8+双阳性T细胞的细胞群，其中，使步骤(b)的人多潜能干细胞在生腱蛋白C基质上培养。
本文提供的一个相关方面中，提供一种使人多潜能干细胞分化的方法，所述方法包括如下步骤中的至少一个：(i)在缺氧条件下，在包含包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的细胞培养基中培养人多潜能干细胞约两天，以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的细胞群；(ii)在缺氧条件下，在包含FGF2和VEGF的细胞培养基中培养具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞约1-2天，以获得包含如下组成的细胞群：具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和在具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的细胞中富含的血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)；(iii)在缺氧条件下，在包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO和IL3的细胞培养基中培养血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)细胞约一天，以实现CD144+CD73+CD235a/CD43-非血原性内皮祖细胞(非HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43-血原性内皮祖细胞(HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43+41a-血管原性造血祖细胞(AHP)和CD43+CD41a+造血祖细胞的形成；(iv)在正常氧压下，在包含FGF2，VEGF，IL6，SCF，TPO，IL3的培养基中培养血原性内皮祖细胞(HEP)和CD43+CD41a+造血祖细胞约三天，以获得CD43+造血祖细胞的扩增的群，所述CD43+造血祖细胞的扩增的群包含CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞；和(v)使CD34+CD43+造血祖细胞在过表达DLL4的OP9细胞上共培养约三周，以获得包含CD4+CD8+T细胞的细胞群。
在另一个方面中，本文提供一种适于使人多潜能干细胞的血内皮分化的细胞培养基，其包含基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、单硫代甘油、额外的亚硒酸钠、聚乙烯醇、GlutamaxTM、非必需氨基酸(NEAA)、化学限定的液体浓缩物、全转铁蛋白和胰岛素。
在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含BMP4、激活素A、FGF2和LiCl。
在其它实施方式中，所述培养基还包含FGF2和VEGF。
在其它实施方式中，所述培养基还包含FGF2、VEGF、SCF、TPO、IL-6和IL-3。
在一些实施方式中，所述细胞培养基包含IF9S培养基。在一些实施方式中，所述IF9S细胞培养基具有表2的IF9S细胞培养基配方。
本文提供的一个相关方面中，提供一种9S浓缩培养基补充物，其中，9S浓缩培养基补充物在IMDM/F12基础培养基中稀释产生IF9S细胞培养基。在一个实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述9S浓缩培养基补充物和BMP4、激活素A、FGF2、LiCl、SCF、TPO、IL-6、IL-3和生腱蛋白C中的一种或多种。
在另一个方面中，本文提供一种用于使人多潜能干细胞的血内皮分化的限定细胞培养系统，其包含IF9S细胞培养基和生腱蛋白C基质，供于人多潜能干细胞或其沿血内皮细胞系分化的后代的附着生长。在一些实施方式中，所述IF9S细胞培养基保持在缺氧条件下。在一些实施方式中，所述限定细胞培养系统还包含在生腱蛋白C基质上生长的人多潜能干细胞。
通过引用纳入
本说明书中提到的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物和专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。
附图说明
图1显示造血分化的示意性图表，其显示造血发展通路，特异性标志物和功能分析，以用于鉴定用于hPSC在化学限定培养基中分化的各发展阶段和条件。显示利用与OP9饲养细胞和目前的化学限定培养物共培养的分化研究之前的主要细胞亚组。
图2过度生长的OP9基质细胞的独特分子签名的鉴定(a)Venn图表，显示第8天的过度生长的OP9对比第4天的新鲜融合的OP9以及MS5和S17中的差异表达基因之间的重叠。相比所有其它测试细胞系，用灰色背景标记的21种基因在第8天于OP9细胞中独特地过度表达。(b)示于(a)中的差异表达的重叠基因的热图。在过度融合的OP9细胞中，生腱蛋白-C(Tnc)是过表达差异最大的基因之一。
图3在化学限定条件下于ColIV对比TenC上分化2、3和4天的hESC培养物中的中胚层发育(a)比较第2天和第3天EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+(A+P+)原始中胚层群的百分比的流式细胞术图谱和图表。(b)比较第4天KDRhiCD31-(HVMP)、CD31+和KDRloCD31-的百分比的流式细胞术图谱和图表。(c)第2天、第3天和第4天的培养物的MB/HB-集落形成潜能的比较。(d)从与OP9共培养7天之后，在化学限定条件下分化第4天的细胞分离的KDRhiCD31-和KDRloCD31-细胞的造血和内皮潜能。上图显示TRA-1-85+门控的人细胞的流式细胞术结果，下图显示OP9共培养的KDRhiCD31-和KDRloCD31-细胞的细胞免疫荧光染色。(a)、(b)和(c)，短线是3个实验的平均值+SE(*p<0.01)。
图4化学限定条件下于ColIV或TenC上分化5天的培养物中的内皮祖细胞的发育(a)流式细胞分析显示，在化学限定条件下，在ColIV和TenC上培养hESC 5天后的产生的VE-钙粘蛋白+(VEC；CD144+)祖细胞的主要亚组。(b)ColIV和TenC培养物中产生的VEC+(CD144+)细胞和亚组的百分比。误差线是3个实验的平均值+SE(*p<0.01)。(c)含有FGF2和造血细胞因子的无血清克隆原性培养基中分离的VEC+(CD144+)亚组的CFC潜能。(d)第5天VEC+(CD144+)亚组的内皮和造血潜能。经分选和培养的祖细胞亚组的内皮条件下7天后的后续管形成(tube formation)试验，或在OP9上7天后的免疫荧光和流式细胞术结果。比例尺，100μm。
图5在化学限定条件下于ColIV上分化8天的培养物中的造血祖细胞的发育(a)流式细胞术分析显示ColIV和Ten上的培养物中生成的CD43+细胞的主要亚组。(b)TenC上的培养物在3个实验间产生显著更多的CD43+细胞(*p<0.01)。(c)含血清培养基中的造血-CFC潜能被限制于CD43+亚群。(d)TenC上分化的培养物的CFC潜能高于ColIV上分化的培养物，在3个实验间具有统计学显著性(*p<0.01)。
图6在化学限定条件下于ColIV和TenC上分化9天的H1 hESC收集的CD43+细胞的T细胞潜能(a)在OP9DLL4上培养3周之后的ColIV和TenC条件收集的细胞的流式细胞术分析。(b)通过基因组PCR进行的T细胞受体重排的分析。H1 T-细胞是源自分化中的H1的T-细胞；PB对照是外周血阳性对照；H1 hESC是未分化的H1 hESC。
图7 TGFβ抑制剂对化学限定条件中从H1 hESC的造血发育的影响。仅第2天-第4天的SB-431542，添加TGFβ抑制剂之后的分化第3、4、5和8天的流式细胞术收集的代表性点图。在第3天，SB-431542减少了PDGFRα表达，但截至第4天和第5天，内皮祖细胞增加。截至第8天，CD43+造血祖细胞有显著增加。
图8采用不同基础培养基和基质蛋白的培养物中的KDRhiCD31+血内皮祖细胞的产生。TeSR1基础培养基是不含细胞因子的TeSR1。DF4S是基于DMEM/F12的培养基，其补充有4种补充物：64mg/L L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、8.4μg/L亚硒酸钠、10.6mg/L全转铁蛋白和20mg/L胰岛素。I4S是含有基于IMDM的培养基而不是基于DMEM/F12的培养基的DF4S，但含有上述四种补充物。IF4S是含有基于IMDM/F12的培养基而不是基于DMEM/F12的培养基的DF4S，但含有上述四种补充物。VTN是玻连蛋白基质；MTG是
基质；ColIV是胶原IV基质。流式细胞术图显示缺氧条件下，补充有50ng/ml FGF2、BMP4和VEGF的各培养基中分化第4天细胞的KDRhiCD31+内皮前体百分比。
图9 iPSC和H9 hESC在化学限定条件下的造血分化。上图表示从细胞被置于TenC或ColIV上的第1天开始直到分化第9天的培养物中产生的细胞的数量。CD31+和CD43+细胞的数量如下计算：将细胞总数乘以基于流式细胞术的阳性细胞的百分比。下图显示在ColIV或TenC上的分化8天的，CD43+细胞及其19-9-7T人成纤维细胞iPSC细胞系、BM19-9人骨髓原性iPSC细胞系和H9人ESC细胞系的亚组的百分比的点图。
图10是相较于在胶原IV对比生腱蛋白C上的分化效率的造血分化时间线的图表。
发明详述
人多潜能干细胞(hPSC)技术提供了研究人的体外发育，和不依赖于HLA-匹配供者来开发患者特异性血细胞的机会。先前，开发了采用在小鼠基质细胞系(OP9)上进行共培养方法的用于造血干细胞/祖细胞的分化的有效方案(Vodyanik，等，2005；Vodyanik，等，2006)。该系统再现了造血的原始和明确的波动(wave)，并可用于获得具有HSC表型的lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD117+CD43+CD45-/+多能确定性造血祖细胞和淋巴细胞，包括T和B细胞(Carpenter，等，2011；Kutlesa，等，2009；Schmitt和Zuniga-Pflucker，2002；Vodyanik，等，2005)。
人多潜能干细胞与OP9细胞共培养诱导了中内胚层(mesendodermal)和血原性内皮分化。将hPSC铺到OP9细胞上之后，hPSC开始表达中胚层标志物爱佩琳(apelin)受体(APLNR)、VEGFR2(KDR)和PDGFRα，并获得间充质成血管细胞(MB)和成血管细胞(HB)潜能(分化的第2-3天)。随着提前成熟，KDR+APLNR+中胚层细胞上调KDR表达并下调PDGFR，其富含于具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的细胞中。
在分化的第2-3.5天，KDR+APLNR+细胞缺乏典型内皮(CD31，VE-钙粘蛋白(CD144))，内皮/间充质(CD73，CD105)和造血(CD43，CD45)标志物，即具有EMHlin-表型。EMHlin-细胞缺乏内皮(CD31和CD144)，间充质/内皮(CD73，CD105)和造血(CD43和CD45)标志物，而lin-细胞缺乏分化的造血细胞的标志物，包括CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19和CD20。截至第4天，出现VE-钙粘蛋白+(CD144)细胞。出现的VE-钙粘蛋白+细胞代表了异质群，其包括CD144+CD235a/43-CD73+非血原性内皮祖细胞(非HEP)，CD144+CD73-CD235a/43-血原性内皮祖细胞(HEP)和CD144+73-CD43+CD235a+CD41a-血管原性造血祖细胞。HEP具有产生多能lin-CD34+CD43+CD45+/-造血祖细胞的潜能。
不幸的是，OP9系统依赖小鼠饲养细胞和血清，这限制了其在研究hPSC对特定生长因子的响应和制造临床级别的治疗性血细胞中的效用。此外，OP9共培养系统对血清治疗、基质细胞保持性和用于分化的PSC集落的变化非常敏感。
尽管其他研究者已经开发了不含饲养者(feeder)的分化方案，这些方案仍依赖于形成用于造血分化的拟胚体(EB)。EB方法通常依赖于血清，并且也具有显著的缺点，例如，不同步的分化和高变异性。最近已开发出若干方案以在无血清条件下诱导造血(Salvagiotto，等，2011；Wang，等，2012)；然而，他们仍需要异种组分，血清白蛋白，和/或相关补充物。仍然不清楚这些方案是否能够再现OP9上所见的独特造血峰。
此外，大多数方案是使MEF或
上生长的hPSC分化。鉴于已描述了一种新的、完全化学限定的用于hPSC-衍生和维持的无异种的培养基和基质(Chen，等，2011)，需要开发一种类似化学限定的无异种的定向分化方案，用于从hPSC衍生造血祖细胞。
除非本所明书中另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员参照已公开内容所理解的通常含义相同。
应注意，术语“一个”或“一种”指一个(种)或多个(种)；例如，“一种分子”应理解为代表一种或多种分子。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和至少一个(种)在本文中可以互换使用。本文所用的术语“约”指的是大小为给定数值+/-10％的值的范围。例如，"约3克"指的是2.7-3.3克的值，如此等等。
本文中述及的术语"限定条件"或"限定培养基"，指的是已知各组分的特征和数量。本文中所用的术语"组分"指的是已知分子特征和数量的组分。
本文公开的是有效且可再现的方法和重点描述的支持性组合物，其完全限定、是无异种的系统，OP9共培养系统中观察到的造血发展经历早期中胚层、血管中胚层前体和血原性内皮阶段。
表1提供了细胞类型、相关细胞标志物表型和本文所用的相应简称的列表。
用于人多潜能干细胞(hPSC)的血内皮分化的方法
本文公开用于使人多潜能干细胞(人胚胎或人诱导性多潜能干细胞)在限定条件下分化的方法，并且优选地，不存在拟胚体形成的情况。该分化的至少一种所需结果是提供内皮和造血细胞群，其可以作为这些细胞系的功能研究的来源和临床治疗的来源。
在一些实施方式中，本文提供的分化方法包括如下步骤：(a)提供人多潜能干细胞(例如，人胚胎干细胞(hESC)或人诱导性多潜能干细胞(hiPSC))，和(b)在缺氧条件下于细胞培养基中培养所述人多潜能干细胞约两天以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的细胞群，所述细胞培养基包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl。优选地，所述人多潜能干细胞在不形成拟胚体的情况下培养。
在一些实施方式中，所述人多潜能干细胞以如下初始密度铺板：约5000个细胞/cm2-约15,000个细胞/cm2，例如，6000个细胞/cm2，7000个细胞/cm2，8000个细胞/cm2，9000个细胞/cm2，或者约5000个细胞/cm2-约15,000个细胞/cm2的其它铺板密度，在一些实施方式中，所述分化方法还包括如下步骤(c)在缺氧条件下，在包含FGF2和VEGF的细胞培养基中培养步骤(b)中获得的细胞群约1-2天以获得包含具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层，和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的细胞中富集的血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)的细胞群。在其它实施方式中，所述分化方法还包括如下步骤(d)在缺氧条件下，在包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO和IL3的细胞培养基中培养步骤(c)的血管中胚层细胞约一天，以实现CD144+CD73+CD235a/CD43-非血原性内皮祖细胞(非HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43-血原性内皮祖细胞(HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43+41a-血管原性造血祖细胞(AHP)和CD43+CD41a+造血祖细胞的形成。
在一些实施方式中，所述分化方法还包括如下步骤(e)在正常氧压下，在包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO、IL3的培养基中培养HEP和造血祖细胞约三天以获得包含CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞的CD43+造血祖细胞的扩增的群。
在一些实施方式中，本文公开的分化方法包括如下步骤中至少一个：(i)在不形成拟胚体的情况下，在缺氧条件下，在包含包含FGF2、BMP4、激活素A和LiCl的细胞培养基中培养人多潜能干细胞约两天，以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的细胞群；(ii)在缺氧条件下，在包含FGF2和VEGF的细胞培养基中培养具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞约1-2天，以获得包含如下组成的细胞群：具有成血管细胞(HB-CFC)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮细胞簇的潜能的细胞中富含的血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)；(iii)在缺氧条件下，在包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO和IL3的细胞培养基中培养血管中胚层细胞(EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-)细胞约一天，以实现CD144+CD73+CD235a/CD43-非血原性内皮祖细胞(非HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43-血原性内皮祖细胞(HEP)、CD144+CD73-CD235a/CD43+41a-血管原性造血祖细胞(AHP)和CD43+CD41a+造血祖细胞的形成；和(iv)在正常氧压下，在包含FGF2，VEGF，IL6，SCF，TPO，IL3的培养基中培养血原性内皮祖细胞(HEP)和CD43+CD41a+造血祖细胞约三天，以获得CD43+造血祖细胞的扩增的群，所述CD43+造血祖细胞的扩增的群包含CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞。
在一些实施方式中，缺氧条件指的是，环境氧(例如，细胞培养孵育箱气体混合物)的水平是约3％O2-约10％O2。在一些实施方式中，缺氧条件是约5％O2。在细胞培养基被允许在缺氧条件下平衡的实施方式中，相较于在正常氧压条件(例如，包含约20％氧气的气体混合物)下平衡的细胞培养基，所述细胞培养培养基因为溶解氧的水平低而变成含氧低的细胞培养基。
在一些实施方式中，待用于任何上述分化方法的培养基包含本文所述的IF9S培养基。在一个实施方式中，待用的IF9S培养基是具有表2的配方的IF9S培养基。
在一些实施方式中，将任何上述细胞(例如，人多潜能干细胞)培养在生腱蛋白C上。在一些实施方式中，将任何所述细胞接种在基质上，所述基质经生腱蛋白-C处理，所述生腱蛋白-C的量足够使10,000个细胞/cm2附着至该基质。在一些实施方式中，待用的生腱蛋白-C是人生腱蛋白C。在一些实施方式中，所述基质用如下浓度的生腱蛋白C处理：至少约0.25μg/cm2-1μg/cm2，例如，0.4μg/cm2、0.5g/cm2、0.7μg/cm2、0.8μg/cm2，或至少约0.25μg/cm2-1μg/cm2的其它浓度。
在一些实施方式中，在待用于上述分化方法的细胞培养基中，浓度如下：BMP4约50ng/ml-约250mg/ml；激活素A约10ng/ml-约15ng/ml；FGF2约10ng/ml-约50ng/ml；LiCl约1mM-约2mM；VEGF约20ng/ml-约50ng/ml；SCF约50ng/ml-约100ng/ml；TPO约50ng/ml-约100ng/ml；IL-6约50ng/ml-约100ng/ml和IL-3约5ng/ml-约15ng/ml。
在一些实施方式中，将任何上述细胞培养于无异种的细胞培养基中。临床治疗的关键重点在于，在衍生的细胞群中不存在异种物质，即，没有非人细胞、细胞碎片、血清、蛋白质等。优选地，本发明通过采用生腱蛋白C或胶原IV作为平台，获得了无异种的分化的细胞，其能够基本替代先前的分化系统中所利用的与OP9细胞的接触。此外，本文公开的培养基是化学限定的，并且，在一些实施方式中，制成无异种形式，并纳入人蛋白质，其能采用重组技术生成，或源自胎盘或其它人组织，以替代动物源性的蛋白质。在一些实施方式中，添加至所述培养基的所有蛋白质均为重组蛋白质。
虽然分化过程包括有序、依序的事件，所述事件的时间可有至少20％的变化。例如，虽然一个实施方式中公开的具体步骤耗时为一天，该事件可持续多于一天或少于一天。例如，“一天”可包括约18-约30个小时的时长。指示的时间长度为多天时间的，可具有“一天”差异，例如，例如，两天，可以约36-约60个小时的时长，如此等等。在另一个实施方式中，可减少时间变化，例如，第2天是从d0起的48+/-3小时；第4天是从d0起的96+/-3小时，而第5天是从d0起的120小时+/-3小时。
通过本发明可获得的具有潜能的和/或分化的细胞系的示例包括：具有HB和MBCFC潜能的KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞，具有在OP9上培养时能够形成血内皮簇的潜能的EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-血管中胚层细胞，VE-钙粘蛋白+(CD144+)亚组细胞，例如HEP(CD144+CD73-CD235a/43-、非HEP(CD144+CD73+CD235a/43-和AHP(CD144+CD73-CD235a/43+41a-)、CD43+造血祖细胞，例如CD43+CD235a+41a+红巨核细胞造血祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞。本文中所用的术语细胞系-("lin-)，指的是造血前体或祖细胞，其还没有变成任何其衍生的血液细胞系，因为其保留着分化成其中任意一种的能力。该特点通过寻找细胞表面标志物的缺失来监测，所述细胞表面标志物指示分化成任何衍生细胞系。本发明的另一大优势在于，因生腱蛋白C平台而能够利用克隆细胞群，所述平台消除了细胞团(例如拟胚体)中常见的对非限定随机事件的依赖，以生成分化的群。此外，相较于先前在饲养层细胞系统中所见的情况，所述克隆细胞群显示分化过程中的较大均一性，这提供了同步化细胞的较高产率。因此，本发明还描述了一种比现有那些更为有效、更优越的可调的分化系统。
组合物
限定细胞培养培养基和浓缩的培养基补充物
本文中的一些实施方式公开了一种分化培养基，其包含基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、单硫代甘油、亚硒酸钠(除基础培养基中存在的任何那些以外)、聚乙烯醇、GlutamaxTM、非必需氨基酸(NEAA)、化学限定的液体浓缩物、全转铁蛋白和胰岛素。用于本文所述的分化培养基的合适的基础培养基包括但不限于，伊氏(Iscoves)改良型达氏(Dulbecco's)培养基/F12(IMDM/F12)、TeSR1基础培养基，其为mTeSR1TM基础培养基，(干细胞技术参见Ludwig和Thomson(2007)，Curr Protoc Stem Cell Biol.，第1章:单元1C.2和美国专利号7,449,334)，其中不含FGF2和TGF-β；DF4S基础培养基，其为基础8TM培养基(生命技术公司；还称作"E8"培养基-参见Chen和Thomson(2011)，Nat Methods，8(5):424-429和美国专利申请公开号20120178166)，其中不含FGF2和TGF-β，I4S基础培养基，其为以伊氏改良型达氏培养基(IMDM)替代DMEM/F12的DF4S基础，而IF4S基础是以IMDM/F12替代DMEM/F12的DF4S基础。优选地，待用的基础培养基不含白蛋白。IMDM/F12是适于快速增殖、添加了营养混合物的高密度细胞培养物的高度富集的合成培养基。
在一些实施方式中，本文中所用的分化培养基，在本文中一般称作"IF9S"培养基，其包含IMDM/F12、L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、单硫代甘油、亚硒酸钠(除基础培养基中存在的任何那些以外)、聚乙烯醇、GlutamaxTM、非必需氨基酸(NEAA)、化学限定的液体浓缩物(生命技术公司；目录号1905031)，全转铁蛋白和胰岛素。
在一个实施方式中，IF9S培养基包含IMDM/F12(1x)、L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐(64mg/L)、单硫代甘油(50mg/L)、亚硒酸钠(除基础培养基中存在的任何那些以外；8.4ug/L)、聚乙烯醇(10mg/L)、GlutamaxTM(1x)、NEAA(1x)、化学限定的液体浓缩物(0.1x)、全转铁蛋白(10.6mg/L)和胰岛素(20mg/L)。
如本文描述，在hPSC的血内皮分化的不同时间点/阶段，待用的完全分化培养基包含细胞因子、生长因子，和/或小分子的不同组合。根据本文所述的方法，取决于血内皮分化的阶段，合适的完全分化培养基将补充有细胞因子的不同组合，其浓度在本文关于完全分化培养基所述的范围内。
在一些实施方式中，完全分化培养基包含IF9S培养基、BMP4、激活素A、FGF2和LiCl。在其它实施方式中，完全分化培养基包含IF9S培养基、FGF2和VEGF。在其它实施方式中，完全分化培养基包含IF9S培养基、FGF2、VEGF、SCF、TPO、IL-6和IL-3。在一些实施方式中，所述最终完全培养基的浓度为：BMP4约50ng/ml-约250mg/ml；激活素A约10ng/ml-约15ng/ml；FGF2约10ng/ml-约50ng/ml；LiCl约1mM-约2mM；VEGF约20ng/ml-约50ng/ml；SCF约50ng/ml-约100ng/ml；TPO约50ng/ml-约100ng/ml；IL-6约50ng/ml-约100ng/ml和IL-3约5ng/ml-约15ng/ml。在一些实施方式中，所述完全分化培养基中所用的全部蛋白质均为重组人蛋白质。在其它实施方式中，所述完全分化培养基包含一种或多种非人蛋白质(例如，重组非人蛋白质)。
在一些实施方式中，完全分化培养基包含IF9S培养基和以所示浓度列于表3的"细胞因子"组合之一。在一些实施方式中，上述完全分化培养基中所用的IF9S培养基配方是表2中所示的IF9S培养基配方。
尽管本文公开的培养基可包含特定形成素、小分子和本文公开的造血细胞因子，设想具有相同、等效或相似相知的其它组分(如本领域已知的其它组分)可额外使用或替代本文所述的那些。
在一些实施方式中，本文所述的培养基可包含异种(即，非人、生物衍生的)材料。例如，异种材料可以是异种来源的重组蛋白。本文所述的培养基还可以浓缩形式制成，该浓缩形式在使用前稀释，例如2X、10X、100X或1000X浓度。
此外，本发明培养基中某些异种材料的替代产生了比前述无异种培养基条件更好、意料之外的益处。例如，据信用聚乙烯醇替代牛血清白蛋白会导致“更稠的”培养基，其预料之外地提高细胞存活率。
表2. IF9S培养基的一个示例性实施方式的描述。
| IF9S组分 | 浓度 |
| IMDM/F12 | 基础组分 |
| L-抗坏血酸2-磷酸Mg2<sup>+</sup>盐 | 64mg/L |
| 单硫代甘油 | 40ul/L |
| 额外的亚硒酸钠 | 8.4ug/L |
| 聚乙烯醇 | 10mg/L |
| GLUTAMAX | 1x |
| 非必需氨基酸 | 1x |
| 化学限定脂质浓缩物 | 0.1x |
| 全转铁蛋白 | 10.6mg/L |
| 胰岛素 | 20mg/L |
表3.细胞因子补充物组合和hPSC(在IF9S培养基中)开始血内皮分化之后的不同天数的示例性浓度的总览。
浓缩培养基补充物
本文还公开一种浓缩"9S"培养基补充物，其包含L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、单硫代甘油、额外的亚硒酸钠、聚乙烯醇、GlutamaxTM(或谷氨酰胺)、非必需氨基酸(NEAA)、化学限定的液体浓缩物、全转铁蛋白和胰岛素。在一些实施方式中，所述浓缩9S培养基补充物以一旦稀释于基础培养基的最终工作浓度的10x-1000x的浓度包含各组分。在一些实施方式中，浓缩补充物中全部9S组分的浓度是表3中所列浓度的10x-1000x。在一些实施方式中，所述补充物待在IMDM/F12培养基中稀释以获得本文所述的IF9S培养基。
试剂盒
本文还设想用于hPSC的血内皮分化的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含本文所述的9S浓缩培养基补充物，BMP4、激活素A、FGF2、LiCl、SCF、TPO、IL-6和IL-3中的一种或多种，以及用于产生IF9S培养基和如本文所述用于hPSC的血内皮分化的方法的说明书。在一些实施方式中，试剂盒还包含IMDM/F12培养基。在一些实施方式中，所述试剂盒包含9S浓缩培养基补充物、激活素A、FGF2、LiCl、SCF、TPO、IL-6、IL-3，以及用于产生本文所述的IF9S培养基和hPSC的血内皮分化的方法的说明书。在其它实施方式中，任何上述试剂盒还包含生腱蛋白C(例如，人生腱蛋白C)，其用作基质供于本文所述分化方法的附着生长。
用于hPSC的血内皮分化的限定细胞培养系统
本文还描述一种用于hPSC的血内皮分化的限定细胞培养系统。所述细胞培养系统包含本文所述的限定分化培养基，例如，IF9S培养基、用于hPSC或其沿血内皮细胞系分化的后代的附着生长的生腱蛋白C蛋白基质。在一些实施方式中，生腱蛋白C以至少0.25μg/cm2-约1μg/cm2使用以产生合适的附着基质。
在一些实施方式中，所述细胞培养系统包含补充有BMP4、激活素A、FGF2和LiCl的IF9S培养基。在一些实施方式中，所述IF9S培养基补充有FGF2和VEGF。在一些实施方式中，用于所述细胞培养系统的所述IF9S培养基补充有FGF2、VEGF、SCF、TPO、IL6和IL-3。在一些实施方式中，用于所述细胞培养系统的IF9S培养基按照表2中所述的培养基配制。在一些实施方式中，所述限定细胞培养系统包含缺氧的细胞培养基，其易于通过如下方式实现：采用允许调节氧气水平的细胞培养孵育箱，并通过在设置为约3％O2-约10％O2(例如，5％O2)的细胞培养孵育箱中平衡细胞培养基。
在其它实施方式中，所述限定细胞培养系统还包含贴壁型人多潜能干细胞，其按照本文所述的方法培养在IF9S培养基中的生腱蛋白C基质上。
可使细胞在，例如，生腱蛋白C被覆的细胞培养皿、多孔细胞培养板或微载体珠上生长。优选地，所述生腱蛋白C蛋白是人生腱蛋白C(GenBank登录号CAA55309.1；市售可得，例如，密理博目录号CC065)。
利用生腱蛋白C和缺氧条件允许产生百分比高于胶原IV或OP9细胞上接种的细胞的内皮和造血细胞的富集的群，例如当比较每阶段每平台上的情况时，高出10％，或高出约20％，高约50％，或高出约60％(参见图10和实施例)。在一个实施方式中，可通过本发明获得的目标群的百分比，就KDR+APLNR+PDGFRα+中胚层细胞而言可高出约35％，或就VE-钙粘蛋白+CD43-内皮细胞而言高出约20％，且就CD34+CD43+造血祖细胞而言高出约40％。此外，关于图10，在生腱蛋白C平台上获得的细胞的百分比是示出的百分数或更高。此外，图10代表在Col IV或TenC上分化时的总培养物的目标群(例如，根据流式细胞术具有对应表型的中胚层祖细胞、内皮祖细胞、造血祖细胞)的百分比。
所述方法和材料可合并成细胞培养系统，以提供新型分化平台。在一个实施方式中，基础细胞培养系统包含在生腱蛋白C上接种的多潜能干细胞。在另一个实施方式中，细胞培养系统包含在补充有激活素A的培养基中于胶原IV上接种的干细胞。这些系统具有生成富集有造血祖细胞的细胞群的能力。
本文设想的细胞培养系统可以是模块化的，其中其可纳入改变从所述系统衍生的所得细胞群的额外的组分。例如，所述细胞培养系统可纳入对于某些所需外来物无异种的培养基。然而，如果(例如)所衍生的细胞群不设想用于临床治疗，其可包括含有异种的培养基。此外，所述细胞培养系统可基于不同尺寸的培养容器，如本领域已知，以实现所需的细胞群生成规模。
在一些情况中，可取代IF9S培养基中的一些组分。例如，抗坏血酸和单硫代甘油可被具有抗氧化剂性质的任选化合物和/或含硫醇化合物补充物替代。GLUTAMAXTM可被L-谷氨酰胺的任选补充物替代。"非必需氨基酸(NEAA)"是一个通用术语，指的是能够由其它氨基酸人体生成的氨基酸，所述非必需氨基酸可由任选氨基酸补充物替代。"化学限定的液体浓缩物"是由生命技术公司特定分布的溶液，其可由任选脂质补充物替代。额外的亚硒酸盐、胰岛素和全转铁蛋白可由任何ITS补充物替代。ITS代表"胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐"。一些公司(例如，生命技术公司)，售卖在其它基础培养基(例如DMEM)中待用作补充物的ITS溶液。然而，制造商并不提供各组分浓度。聚乙烯醇可用任选生物学失活的培养基增稠化合物补充物替代。
以下实施例表示用于实现本发明的优选的材料和方法。然而，应理解，这些实施例仅以说明目的提供，本文中的内容不应被理解为对于本发明总体范围的限制。
实施例
实施例1基于IMDM/F12的培养基显著地提高hPSC向血内皮细胞系分化的分化效率
先前，我们实验室开发了采用在小鼠基质细胞系(OP9)上的共培养方法来使造血hPSC有效分化的方案9,13。尽管OP9系统支持有效产生HE和多向造血祖细胞(图1)，该系统对用于分化的血清质量、基质细胞维持性和hPSC集落和细胞团的尺寸的变化非常敏感13,14。形成拟胚体(EB)是诱导从hPSC形成HE和血液的另一种常用方法7,15,16。然而，EB方法通常依赖于血清或非限定培养基，并且同样具有显著的缺陷，例如不同步的分化、高变异度和对初始细胞团大小的依赖性。此外，因为用于维持hPSC的白蛋白批次的差异性导致的hPSC质量的不一致性可能会造成血液生成效率方面的差异。
为了克服这些限制，我们决定鉴定能够支持H1人胚胎干细胞(hESC)单细胞悬液的无血清血内皮分化的化学限定培养基和基质蛋白质，所述H1人胚胎干细胞(hESC)在玻连蛋白(VTN)上于E8完全限定无异种培养基中扩增17。
方法
人多潜能干细胞维持
将人多潜能干细胞(H1和H9 hESC，成纤维细胞源性的iPSC 19-9-7T和源自骨髓单核细胞的BM119-9 iPSC)维持在E8培养基中的玻连蛋白或基质胶上，所述E8培养基为内部制备，其中补充有FGF2和TGFβ(派普泰克公司(Peprotech))。细胞达到80％融合度时，采用PBS中的0.5mM EDTA对其传代。所述细胞维持在含5％CO2的正常氧压条件下。
人多潜能干细胞分化
当达到80％融合度时，采用1x TrypLE(生命技术公司)将人多潜能干细胞从玻连蛋白或基质胶上分离，并视细胞系而定，以5000个细胞/cm2-15,000个细胞/cm2的优化密度铺板至E8培养基中的6孔板上，所述6孔板被覆有0.5μg/cm2的ColIV(西格玛-奥德里奇公司)或0.5μg/cm2的生腱蛋白-C(密理博)，所述E8培养基补充有10μM Rho激酶抑制剂(Tocris Y-27632)。在24小时(第0天)之后，将培养基更换成补充有50ng/ml BMP4(派普泰克)、15ng/ml激活素A(派普泰克)、50ng/ml FGF2(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotech))、2mM LiCl(西格玛)以及视情况而定的1μM Rho激酶抑制剂的IF9S培养基中，以增加细胞活力。在第2天，将培养基更换成补充有50ng/ml FGF2和50ng/ml VEGF和10μM SB-431542(Tocris)(提到时)的IF9S培养基。在第4天，将培养基更换成补充有50ng/ml FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-6和10ng/ml IL-3的IF9S培养基。在第6天，向培养物添加补充有相同6种因子的额外的IF9S培养基，此时不除去旧培养基(表3表3)。IF9S(含9种补充物的IMDM/F12)为内部制备，含有：50％IMDM 50％F12(生命技术公司)，其中补充有：64mg/L L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐(西格玛-奥德里奇公司)、40ul/L单硫代甘油(西格玛-奥德里奇公司)、8.4μg/L额外的亚硒酸钠(西格玛-奥德里奇公司)、10mg/L聚乙烯醇(西格玛－奥德里奇)、1xGlutamax(生命技术公司)、1x非必需氨基酸(生命技术公司)、0.1x化学限定的液体浓缩物(生命技术公司)、10.6mg/L全转铁蛋白(西格玛-奥德里奇公司)和20mg/L胰岛素(西格玛-奥德里奇公司)(表2)。从第0天至第5天在缺氧条件下进行分化，并在第6天至第9天转移到正常氧压条件(图1)。采用1x TrypLE来分离和收集细胞供于分析。
间充质-(MB)和成血管细胞(HB)分析
采用补充有FGF2试验的无血清CFC培养基来检测MB和HB，如先前所述11。第2或3天，采用1x TrypLE(生命技术公司)将培养物分离并制备成单细胞悬液，并将总培养物的5,000个细胞在CFC培养基中铺板。在单细胞悬液铺板后12天评价MB和HB集落。
造血CFC试验.
造血CFC采用含血清的H4436 MethocultTM检测，该H4436 MethocultTM补充有人重组SCF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6和EPO(干细胞技术公司)。AHP的造血潜能采用无血清SFH4236 Methocult评价，该无血清SF H4236 Methocult添加有FGF2(20ng/ml)、SCF(20ng/mL)、IL3(10ng/mL)、IL6(10ng/mL)和EPO(2U/mL)(干细胞技术公司)，如先前所述6。将1000-10000个分化的细胞于CFC培养基中铺板，并在培养14天后评价集落。
流式细胞术和FACS
流式细胞术采用FACSCalibur流式细胞仪和如下抗体进行：CD31-FITC(克隆WM59)、CD34-FITC(8G12)、CD41a-FITC/APC(克隆HIP8)、CD43-FITC/PE/APC(克隆1G10)、CD45-APC(克隆HI30)、CD73-FITC/PE(克隆AD2)、CD144-FITC/PE/AlexaFluor647(克隆55-7H1)、CD235a-FITC/PE/APC(克隆GA-R2)、KDR-PE/AlexaFluor647(克隆89106)、PDGFRα-PE(克隆aR1)(BD生命科学公司)、TRA-1-85-FITC/PE(克隆TRA-1-85)和APLNR-APC(克隆72133)(R&D系统公司)。分选在FACS Aria上进行，如先前所述46。分离的群的纯度是92-95％。
分化的hPSC在OP9上的二次培养
将OP9细胞维持在α-MEM(吉布科公司(Gibco))中，该α-MEM补充有20％FBS(海克隆公司(Hyclone))如先前所述10。分选的第4天或第5天的培养物如先前所述6以5,000个细胞/孔的密度铺板在6孔板中的α-MEM(吉布科)中的OP9细胞的融合层上，该α-MEM(吉布科)补充有10％FBS(海克隆)，补充有100μM MTG、50μg/ml抗坏血酸、50ng/ml SCF、TPO、IL-6和10ng/ml IL-3。4-7天之后，通过收集悬浮细胞并用1x TrypLE分离整个培养物来制备用于流式细胞术的培养物。
第9天培养物的T-细胞分化
我们实验室利用慢病毒建立了组成型表达人δ-样配体4(DLL4)的OP9细胞系(OP9-DLL4)，并以类似于OP9的方式维持。在人多潜能干细胞分化9天之后，收集悬浮细胞，通过70μm细胞染剂(BD生命科学公司)染色，并冲洗。然后，将其重悬于T-细胞分化培养基中，所述T-细胞分化培养基由α-MEM(吉布科)组成，补充有20％FBS(海克隆)，补充有IL7(5ng/ml)，Flt3L(5ng/ml)和SCF(10ng/ml)。然后，将其铺板于OP9-DLL4之上，并在37℃和5％CO2下培养。4天后，采用胶原酶IV(吉布科)溶液(DMEM/F12中1mg/ml，吉布科)和1x TrypLE(英杰公司)收获细胞，并在新鲜OP9-DLL4层上传代。3天后，再次传代细胞。后续传代每7天至多至4周进行一次，之后收集悬浮细胞进行流式分析，并提取基因组DNA用于TCR重排试验。
TCR重排试验
基因组DNA采用快速-gDNA MiniPrep(Zymo研究公司)分离。TCRβ和TCRγ克隆性采用PCR扩增试剂盒(英维快博公司(Invivoscribe))和AmpliTaq
DNA聚合酶(应用生物系统公司)检测，如先前所述33。PCR产物采用异源双链体分析法在6％聚丙烯酰胺凝胶上分析，该6％聚丙烯酰胺凝胶用溴化乙锭染色。
小鼠基质细胞系的微阵列分析
小鼠骨髓基质细胞系(OP9)获自Toru Nakano博士(日本大阪大学微生物疾病研究所)，S17获自Kenneth Dorshkind博士(加利福尼亚大学洛杉矶分校)，而MS-5获自德国组培收集所(German Tissue Culture Collection)。基质细胞系按先前所述培养9。无DNA的RNA采用RiboPureTM RNA和DNA酶，使用TURBOTM无DNA试剂(安碧公司(Ambion))分离。所有样品在麦迪逊的威斯康星大学的生物技术中心的基因表达中心进行处理，并采用NimbleGen系统公司(威斯康星州麦迪逊)制造的A4543-00-01 MM8 60mer expr Mus肌1-Plex阵列标准阵列分析。基因表达原始数据采用NimbleScan软件v2.1提取。考虑到RNA样品的信号分布与gDNA样品不同，所有八个阵列中的RNA通道的信号强度采用强多芯片分析(RMA)算法47标准化。分开地，对来自gDNA样品的那些进行相同的标准化处理。对于给定基因，随后如下计算在其来自RNA通道的标准化强度和来自gDNA通道的标准化强度之间的中值调节比率：比率＝来自RNA通道的强度/(来自gDNA通道的强度+来自gDNA通道的所有基因的中值强度)。认为表达上具有多于3倍差异的基因是差异表达。仅选择表达水平>1的基因进行分析。
结果
基于IMDM/F12的培养基显著地提高hPSC向血内皮细胞系分化的分化效率
我们将单细胞形式的hESC铺板，并允许其在E8培养基中的基质胶(MTG)、VTN或胶原IV(ColIV)上附着超过24小时，该E8培养基补充有10μM Rho激酶抑制剂。然后，将培养基更换成不含动物蛋白质，或不含生长因子TeSR1，补充有人重组BMP4、FGF2和VEGF因子的三种基础培养基之一，所述因子常用于诱导始于hPSC的血形成18,19。分化4天之后，评价细胞培养物中KDRhiCD31+细胞的存在，该KDRhiCD31+细胞在血内皮祖细胞中高度富集6。流式细胞术分析显示，在补充有L-抗坏血酸2-磷酸Mg2+盐、8.4μg/L额外的亚硒酸钠、全转铁蛋白和胰岛素的IMDM/F12培养基中的ColIV-被覆的板上分化的细胞最有效地分化成KDRhiCD31+血内皮前体(图8)。之后，我们发现添加聚乙烯醇、NEAA、Glutamax、化学限定的液体浓缩物和单硫代甘油增加了细胞活力和分化效率(数据未显示)。后续基础培养基称作IF9S(IMDM/F12加9种补充物)。这些结果证明，所选的培养基和补充物使其能够在化学限定的、无异种条件下，在ColIV基质上由保持在E8培养基中的hPSC获得血内皮细胞。
实施例2对于造血-支持性基质细胞的独特分子签名的分析确定了生腱蛋白C作为
促进造血前体发育和维持的胞外基质。
先前，我们显示OP9在诱导造血分化方面优于其它基质细胞系，例如S17和MS59。还发现第8天过度生长的OP9培养物在诱导造血-CFC(包括多能GEMM-CFC)方面优于第4天新鲜融合的OP99。鉴于基质细胞的融合度会影响分化效率，这使我们相信存在胞外基质影响血内皮分化。为了找到对于OP9的造血-支持性活性至关重要的基质蛋白，我们对具有低造血诱导潜能的S17和MS5基质细胞系和OP9细胞进行了分子概况分析。此外，我们比较了过度生长的OP9(第8天)和新鲜融合的OP9(第4天)单层。转录组分析显示，相较于所有基质细胞，21种基因在第8天过度生长OP9细胞中差异表达(图2a)。这些包括编码Ptn(多效生长因子)的基因，Ptn是一种分泌的HSC扩增和再生调节剂20，编码Rspo3(R-脊椎蛋白3)的基因，Rspo3是Wnt信号转导和内皮成血管发育的重要调节剂21，和编码胞外基质蛋白质Postn(骨膜蛋白)的基因，Postn是B淋巴细胞生成所必需的22。有趣的是，在过度融合OP9中显示最显著表达变化的一种基因是Tnc(生腱蛋白C)(图2b)。TenC在间充质细胞(潜在造血簇)主动脉-性腺-中肾(AGM)区域中表达，并且是胚内和产后造血所必需的23-25。其也在骨髓干细胞小生境25中表达。因为这些独特性质，我们测试了TenC是否能够比ColIV更有效地支持造血分化。
实施例3 FGF2、BMP4、激活素A、LiCl和VEGF的时间和剂量依赖性处理诱导发育的
中胚层、内皮和造血阶段
我们的先前研究鉴定了与OP9共培养中hPSC分化之后的血内皮发育的不同阶段(图1)6,9-11,26。将hPSC铺板至OP9基质细胞上诱导原始条痕板和中胚层细胞的形成，其可基于表达爱佩琳受体(APLNR)和KDR(VEGFR2)11和缺乏表达内皮(CD31、CD144(VE-钙粘蛋白))、内皮/间充质(CD73，CD105)和造血(CD43，CD45)标志物，即通过EMHlin-表型来检测。在OP9中共培养出现的首个KDR+中胚层细胞在分化第2天表达APLNR和PDGFRα(EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+，后文称作A+P+细胞)。这些细胞表现间充质成血管细胞(MB)潜能，即形成集落的能力，同时具有间充质干细胞(MSC)和血管潜能。在分化第3天，A+P+细胞获得胚细胞(BL)-CFC或成血管细胞(HB)潜能11。MB和HB潜能均可采用集落形成试验检测，该试验在补充有FGF2的无血清克隆原性培养基中进行11。随着进一步成熟，中胚层细胞丧失了BL-CFC活性，并上调KDR表达且下调PDGFRα，即获得了KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-血管祖细胞(HVMP)表型，其在具有在OP9上形成血内皮簇的潜能的细胞中富集6。发育的内皮阶段通过内皮特异性标志物VE-钙粘蛋白(CD144)的表达来确定。截至分化第4天，KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-中胚层细胞中出现首个VE-钙粘蛋白+(CD144+)细胞。出现的VE-钙粘蛋白+(CD144+)细胞代表异质群，其包含CD43-CD73+(CD144+CD43-CD73+)非血原性内皮祖细胞(非HEP)和CD43-CD73-(CD144+CD43+CD73-)血原性内皮祖细胞(HEPs)6。HEP缺乏造血CFC潜能，但在与基质细胞培养后获得了该潜能。发育的造血阶段通过造血特异性标志物CD436,10的表达来确定。分化第4-5天，在VE-钙粘蛋白+(CD144+)细胞中出现了首个CD43+细胞。这些细胞表达低水平的CD43，且共表达CD235a，但缺乏CD41a表达，即具有CD144+CD43/235a+41a-表型。因为这些细胞具有在FGF2和造血细胞因子存在下形成造血集落的能力，以及在纤连蛋白上生长内皮细胞的能力，我们指定其为血管原性造血祖细胞(AHP)。首个CD41a细胞在CD235a阳性细胞中出现。CD235a+CD41a+细胞是高度富集的红巨核细胞祖细胞，且缺乏内皮潜能。在CD235a+CD41a+细胞出现后不久，能在hPSC培养物中检测到具有宽髓淋巴样潜能和lin-CD34+CD43+CD45+/-表型的祖细胞。通过lin-细胞获取的CD45表达与进行性骨髓定型相关联10。
为了再现OP9共培养中观察到的血内皮程序，我们决定选择最优的形成素组合用于中胚层诱导和血内皮特异性，并确定在ColIV和TenC上，于化学限定条件中，阶式进行的朝向HE和血细胞分化的hPSC培养物中的特定生长因子(图1)。胚胎发育过程中，已发现BMP4、Wnt和TGFβ/Nodal/激活素A的信号转导对于起始原始条痕板形成和后续中胚层发育中起关键作用27,28。已显示，这些信号转导通路的活化是必需的，以诱导鼠短尾突变体表型和KDR(Flk-1，VEGFR2)的表达，并起始小鼠和人PSC的中胚层定型18,19,29-32。我们已发现，高浓度的BMP4(50ng/ml)结合低浓度的激活素A(15ng/ml)和LiCl补充物(2mM)在hESC的单细胞悬液在化学限定条件中于ColIV上培养两天之后持续诱导中胚层表面标志物APLNR，KDR和PDGFRα的表达，如上所述。然而，这些条件较差地支持着细胞存活率和需要添加FGF2和缺氧条件(5％O2，5％CO2)以改善细胞活力和中胚层细胞的输出。第2天，在这些条件中分化的KDR+中胚层细胞表达APLNR和PDGFRα，即成为APLNR+PDGFRα+细胞，并显示与在OP9共培养中分化的hPSC第2天获得的APLNR+PDGFRα+中胚层细胞相似的MB集落形成潜能11(图3)。分化2天之后，我们发现APLNR+PDGFRα+中胚层仅需要FGF2和VEGF来在分化和朝向HVMP的特定中胚层进行的第3天获得HB潜能，这由分化第4天的CD31-中胚层细胞中的APLNR+细胞中KDR表达增加和PDGFRα表达下降来指示(KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-表型)。在ColIV和TenC上培养的细胞中的发育模式相似，然后，后者产生显著较高的APLNR+PDGFRα+细胞，MB和HB集落(图3a，3c)。
分化第4天的hESC丧失形成HB集落的能力(图3c)，然而这些细胞在分选并铺板在αMEM中的OP9上时能够形成血内皮簇，所述αMEM补充有10％FBS，SCF，TPO，IL6和IL3。血内皮簇潜能受限于KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-CD31-HVMPs(图3d)。KDRloCD31-细胞仅形成内皮簇，其几乎没有血原性活性(图3d)，而KDR-细胞无法生长内皮和血细胞(未显示)。该也与OP9共培养中的分化相一致6。KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-HVMPs细胞的百分比在TenC培养物中持续较高(图3a)。
因为HVMP在hPSC/OP9共培养中的形成之后紧接着是HE和blood祖细胞的发育，除了VEGF和FGF2以外，我们在分化第4天开始向我们的培养物中补充SCF、TPO、IL-6和IL-3造血细胞因子。尽管我们注意到用FGF2和VEGF持续处理培养物对于诱导内皮祖细胞和造血特异性而言是足够的，添加造血细胞因子是必需的，以增加这些细胞在化学限定培养物中的输出。在这些条件中分化的第5天，出现了先前鉴定的CD144+群的3种主要亚组6：CD144+CD43-CD73+、CD144+CD43-CD73-和CD144+CD43/CD235a+CD41a-(图4)。当这些亚组被分选并在内皮条件中铺板时，它们全部形成VE-钙粘蛋白表达型细胞的单层，该细胞在管形成试验中具有摄取AcLDL和形成脉管的能力，与OP9共培养一致(图4d)。然而，造血CFC潜能大多数受限于CD144+CD43/CD235a+CD41a-细胞(图4c)。重要地，与第5天OP9共培养产生的CD144+亚组的发现相似，CD144+CD43/CD235a+CD41a-细胞的造血CFC潜能仅在除造血细胞因子以外存在FGF2的无血清培养基中测出，表示这些细胞与hPSC/OP9共培养中鉴定的AHP基本一致6。我们先前确定HEP为缺乏造血CFC潜能的CD144+CD43-CD73-细胞，但其能够在OP9上培养之后获得该潜能。为确定完全限定条件中产生的CD144+CD43-CD73-是否与OP9-诱导的HEP相似，我们分选了第5天的CD144+亚组，并如先前所述与OP9培养6。在这些条件中，HEP形成内皮和造血细胞，其具有大量的HE-簇，而AHP主要形成造血细胞，其几乎不具有内皮细胞和血内皮簇。CD144+CD43-CD73+细胞形成内皮簇，仅与非HEP表型一致(图4d)。相较于在ColIV上分化的培养物而言，在TenC上分化的培养物具有较大的总CD144+细胞的群，由此具有增加的HEP、非HEP和AHP群(图4a，b)。
当许多悬浮圆造血细胞在第6天的培养物中变得可见时，缺氧条件不是支持造血发育所必需的。因此，自分化第6天，将培养物转移细胞至正常氧压孵育箱(20％O2，5％CO2)。截至分化第8天，培养物显示大量CD43+造血细胞的发育，其由CD235a+CD41a+细胞组成，CD235a+CD41a+细胞在红-巨核细胞祖细胞和lin-CD43+CD45-/+细胞中富集，其表达CD34(图5)且缺乏其它细胞系标志物(未显示)。与OP9上分化的细胞一致，造血集落形成潜能受限于CD43+亚群(图5c)。TenC上扩增的CD43+造血祖细胞显著地多于ColIV(图5b)。此外，TenC上培养物的GEMM-CFC潜能显著地高于ColIV上的培养物(图5d)。
尽管该分化方案最初采用H1 hESC开发，我们发现本文所述的化学限定条件也支持从成纤维细胞或骨髓单核细胞产生的其它hESC(H9)和hiPSC生成HE和血液(图9)。先前，我们发现相较于成纤维细胞源性的(FB)hiPSC，通过脐带血单核细胞获得的hiPSC(CBhiPSC)以较低效率在OP9饲养层上分化成血细胞33。当我们在ColIV上分化CB和FB iPSC时，再现了这些发现结果。然而，TenC上的分化使CB hiPSC的造血分化潜能恢复至hESC和FBhiPSC所见的水平(图9)，由此证实TenC在促进从hPSC起始的造血分化方面优于ColIV。
实施例4生腱蛋白C独特支持从hPSC起始的T淋巴祖细胞特异性
为了研究我们的培养系统是否支持建立来自hPSC的确定的造血程序，我们分析了我们的系统中产生的血细胞的T细胞潜能，作为确定的造血的指标7。当我们从第9天分化的培养物收集CD43+悬浮细胞，并将其重新铺板到补充有20％FBS、Flt3L、IL-7和SCF的α-MEM中的表达DLL-4的OP9细胞上时，截至二次共培养2周，开始出现CD7+CD5+淋巴祖细胞。截至第3周，出现CD4+CD8+双阳性T-细胞(图6a)。
有趣的是，在ColIV和TenC基质上产生的CD43+细胞具有产生CD5+CD7+淋巴祖细胞的能力。然而，仅从TenC上而非ColIV上产生的CD43+细胞观察到朝向CD4+CD8+T淋巴细胞的进展。为了证实T细胞发育，我们分析了来自这些培养物的基因组DNA是否存在TCR重排。该分析证明了γ-位的随机V-J和D-J重排和γ-位的多V-J及重排的多重PCR产物的存在，这指示多克隆T细胞系功能(图6b和6c)。总体而言，这些结果表示，胞外基质生腱蛋白C对于在完全化学限定条件中支持确定的造血而言是必需的。
实施例5 TGF-β的抑制促进化学限定条件中的血内皮特异性
近期研究显示，在中胚层特异性之后但在内皮发育之前添加TGF-β抑制剂能增加确定的造血分化。我们发现，在第2天-第4天添加10μM的SB-431542(一种强力但非特异性TGFβ抑制剂)时，第3天其显著地减少了PDGFRα-阳性中胚层细胞的发育，且第4天CD31+的分化增加。在第4天之后，不再添加SB-431542，但2天处理的作用持续增加CD43+群到第9天(图7)。
最近十年，已实现来自hPSC的造血分化的显著进展。已开发用于造血分化的多个方案，并使其能够常规产生用于实验的血细胞。然而，从hPSC产生具有长期重建潜能的血细胞HSC仍面临巨大挑战。在胚胎中，造血细胞和HSC出现自内皮(HE)的特定亚组1-5，因此在完全化学限定环境中询问导向HE特异性并转化成血细胞的信号转导通路的能力是鉴定HSC特异性和用于重新产生HSC的最终发育条件所需因素所必需的。尽管原始的造血分化方案已采用异种的、饲养层和/或血清，近期已描述若干不含血清的和不含饲养者的造血分化系统18,34,35。然而，这些方案仍需要血清组分(白蛋白)，并且仍然不清楚这些方案能否再现造血特征波，包括，产生在原始分化系统中观察到的具有淋巴髓潜能的HE。最近Kennedy等人7已开发出不含饲养层和不含间质的条件用于基于EB的hPSC的造血分化，并显示这些条件再现造血的原始和特征波，并且产生具有T淋巴潜能的HE。然而，该方案采用在包含非公开化学和人蛋白含量的专有培养基中于MEF上生长的hPSC用于基于EB的造血分化。我们首次开发了能够有效地在不含血清和异种蛋白质的完全化学限定条件中，从维持在化学限定E8培养基中的hPSC的单细胞悬液产生血细胞的方案12。该方案消除了在EB系统中观察到的与动物或人源性白蛋白、异种基质、团块大小和不同步分化相关联的变异性，并重现了典型的造血波动，包括形成HE和确定的造血祖细胞，这在OP9上分化的hPSC中观察到。重要的是，基于OP9和具有不同造血诱导活性的基质细胞系的分子概况分析，我们发现TenC基质蛋白在OP9中独特表达，具有强健的血诱导潜能，强力促进来自hPSC的血内皮和T淋巴发育。TenC是二硫化物连接的六聚糖蛋白，其主要在胚胎发育过程中表达。尽管TenC多数在成人组织中消失，其在创伤修复、新血管形成和瘤形成过程中表达上调36。有趣的是，发现TenC在其表达的成人骨髓中主要处于骨内膜区域37,38，并在清髓(myeloablation)之后上调25。TenC支持骨髓造血细胞39增殖和红细胞生成40。TenC-缺陷型小鼠具有较低的骨髓CFC潜能24，在骨髓融除之后无法重新造血，并显示支持野生型HSC25植入的能力下降。还检测到了人和鸡主动脉-性腺-中肾(AGM)区域23,41、出现首个HSC的位置，以及人胎肝的造血位置42的TenC的高表达水平。因为TenC表达在造血簇正下方的主动脉下间质中高度富集，表明TenC在胚胎发生过程中的HSC发育中起关键作用23。TenC还涉及血管生成和心内皮祖细胞的调控43。我们的研究证明TenC在促进始于hPSC的造血方面具有优异性质。TenC的积极效果在分化的所有阶段均显著，并且包括血原性中胚层、HE和CD43+造血祖细胞生成的增强。重要的是，TenC能够支持具有T淋巴潜能的确定的造血细胞的发育，但我们无法在ColIV上的培养物中获得此类细胞。TenC分子由如下部分组成：氨基酸-末端寡聚化区域，随后是七个重复，EGF-样和纤连蛋白III型重复和纤朊原球36。对这些结构域的功能知之甚少。据信TenC与细胞的作用和相互作用需要多个结构域的整体作用44，尽管在该分子中鉴定出了能够诱导造血细胞增殖的数种独特的促有丝分裂结构域39。已经鉴定出细胞与TenC的相互作用中暗含的数种信号转导机制，包括对纤连蛋白活化的粘着斑激酶介导的和Rho介导的信号转导的抑制，和对Wnt信号转导的刺激(综述参见45)。意图鉴定TenC对hPSC及其造血衍生物的作用机制的其它研究对于理解该基质蛋白在造血发育中的作用具有价值。
总而言之，本文提供的结果鉴定了能够支持从hPSC可调地产生HE和确定的血细胞的TenC基质蛋白质和不含血清/血清组分和动物蛋白质的完全化学限定条件。该分化系统允许对于造血分化中涉及的信号转导分子的准确询问，并提供用于产生供于临床应用cGMP级别的血细胞平台。
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Claims (25)
1.一种使人多潜能干细胞分化成EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在缺氧条件下，使诱导性多潜能干细胞或人胚胎干细胞与包含支持无血清生长的基础培养基、约10ng/ml-约50ng/ml FGF2、约50ng/ml-约250mg/ml BMP4、约10ng/ml-约15ng/ml激活素A和约1mM-约2mM LiCl的无异种无血清白蛋白混合物接触约两天以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的群且不存在拟胚体形成或与基质细胞系的共培养；其中，所述人胚胎干细胞得自可购得的已建立人胚胎干细胞系或是未经体内发育的受精14天以内的人胚胎干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(b)在缺氧条件下，使步骤(a)的原始中胚层细胞暴露于包含组分FGF2和VEGF的无血清无白蛋白混合物约1-2天，以获得包含具有成血管细胞-CFC潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮簇的潜能的细胞中富集的EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-血管中胚层细胞的群。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(c)使步骤(b)的处于血管中胚层阶段的细胞与包含组分FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO和IL3的无血清无白蛋白混合物接触约一天，以实现CD144+CD73+CD235a/CD43-非血原性内皮祖细胞、CD144+CD73-CD235a/CD43-血原性内皮祖细胞、CD144+CD73-CD235a/CD43+41a-血管原性造血祖细胞和CD43+CD41a+造血祖细胞的形成。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(d)在正常氧压下，使HEP和出现的造血祖细胞与包含FGF2、VEGF、IL6、SCF、TPO、IL3组分的混合物继续接触约三天，导致造血扩增，以获得由CD43+CD235a+CD41a+红巨核细胞祖细胞和lin-CD34+CD43+CD45+/-多能造血祖细胞组成的CD43+造血祖细胞的群。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物由所述组分组成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞被接种在经生腱蛋白-C处理的基质上。
7.一种用于使人多潜能干细胞分化的无异种的培养基，其包含补充有如下物质的支持无血清生长的基础培养基：
约50-约250ng/ml BMP4；
约10-约15ng/ml激活素A；
约10-约50ng/ml FGF2；和
约1-约2mM LiCl。
8.一种用于使人多潜能干细胞分化成EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的无异种的细胞培养系统，其包含：
以单细胞悬液形式接种在基质上的诱导性多潜能干细胞或人胚胎干细胞，所述基质包含浓度为约0.25μg/cm2-约1μg/cm2的生腱蛋白C的层；和
包含补充有如下物质的支持无血清生长的基础培养基的无异种的培养基：
约50-约250ng/ml BMP4；
约10-约15ng/ml激活素A；
约10-约50ng/ml FGF2；和
约1-约2mM LiCl；
其中，所述人胚胎干细胞得自可购得的已建立人胚胎干细胞系或是未经体内发育的受精14天以内的人胚胎干细胞
9.一种使人多潜能干细胞分化成EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将人多潜能干细胞以单细胞悬液的形式接种在经生腱蛋白C处理的基质上；和
(b)在缺氧条件下，在补充有约10ng/ml-约50ng/ml FGF2、约50ng/ml-约250mg/mlBMP4、约10ng/ml-约15ng/ml激活素A和约1mM-约2mM LiCl的支持无血清生长的基础培养基中培养所述接种的细胞约两天，以获得具有间充质成血管细胞潜能的约30％的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞且不存在拟胚体形成或与基质细胞系的共培养，其中，所述人多潜能干细胞是诱导性多潜能干细胞或人胚胎干细胞；其中，所述人胚胎干细胞得自可购得的已建立人胚胎干细胞系或是未经体内发育的受精14天以内的人胚胎干细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在缺氧条件下，在补充有FGF2和VEGF的培养基中培养处于EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层阶段的细胞约1-2天，以获得具有成血管细胞-CFC潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层和具有在OP9细胞上培养时形成血内皮细胞簇的潜能的EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFRαlo/-血管中胚层前体。
11.一种产生EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将诱导性多潜能干细胞或人胚胎干细胞接种在用有效量的胶原处理的基质上；和
(b)在缺氧条件下，使所述干细胞与包含支持无血清生长的基础、约10ng/ml-约50ng/ml FGF2、约50ng/ml-约250mg/ml BMP4、约10ng/ml-约15ng/ml激活素A和约1mM-约2mMLiCl的混合物接触约两天以形成具有间充质成血管细胞潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞的群；
其中，所述人胚胎干细胞得自可购得的已建立人胚胎干细胞系或是未经体内发育的受精14天以内的人胚胎干细胞
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述胶原包括胶原IV。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述无异种无白蛋白混合物包含：约10ng/ml-约50ng/ml FGF2和约20ng/ml-约50ng/ml VEGF。
14.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(c)中的无异种无白蛋白混合物包含：约10ng/ml-约50ng/ml FGF2；约20ng/ml-约50ng/ml VEGF；约50ng/ml-约100ng/ml SCF；约50ng/ml-约100ng/ml TPO；约50ng/ml-约100ng/ml IL-6和约5ng/ml-约15ng/ml IL-3。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述无异种无血清白蛋白混合物包含：
约50-约250ng/ml BMP4；
约10-约15ng/ml激活素A；
约10-约50ng/ml FGF2；和
约1-约2mM LiCl。
16.如权利要求4所述的方法，其中，所述无异种无血清白蛋白混合物包含：
约50-约100ng/ml SCF，
约50-约100ng/ml TPO，
约50-约100ng/ml IL-6，和
约5-约15ng/ml IL-3。
17.如权利要求1所述的方法，其中，人多潜能干细胞以单细胞悬液形式接种在基质上，所述基质包含浓度为约0.25μg/cm2-1μg/cm2的生腱蛋白C的层；所述无异种无血清白蛋白混合物包含：
约50-约250ng/ml BMP4；
约10-约15ng/ml激活素A；
约10-约50ng/ml FGF2；和
约1-约2mM LiCl。
18.如权利要求6所述的方法，其中，所述生腱蛋白C的层的浓度为约0.25μg/cm2-1μg/cm2。
19.如权利要求6所述的方法，其中，所述生腱蛋白C的层的浓度为约0.5μg/cm2。
20.如权利要求1所述的方法，其中，所述缺氧条件含约3％O2-约10％O2水平的环境氧。
21.如权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞接种在含有胶原IV的基质上。
22.如权利要求1所述的方法，其中，所述人多潜能干细胞是得自H1或H9人胚胎干细胞系的人胚胎干细胞。
23.如权利要求8所述的培养系统，其中，所述人多潜能干细胞是得自H1或H9人胚胎干细胞系的人胚胎干细胞。
24.如权利要求9所述的方法，其中，所述人多潜能干细胞是得自H1或H9人胚胎干细胞系的人胚胎干细胞。
25.如权利要求11所述的方法，其中，所述人多潜能干细胞是得自H1或H9人胚胎干细胞系的人胚胎干细胞。
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