ES2720196T3 - Métodos y materiales para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas en condiciones definidas - Google Patents

Métodos y materiales para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas en condiciones definidas Download PDF

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Abstract

Un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina adecuado para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, en donde el medio de cultivo es adecuado para producir células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto, comprendiendo el medio de cultivo un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio, alcohol polivinílico, GlutamaxTM, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo- Transferrina, insulina, BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl, en donde el medio comprende: aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4; aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A; aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mM de LiCl.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y materiales para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas en condiciones definidas
Antecedentes de la invención
La aparición de las tecnologías de células madre pluripotentes humanas ha brindado la oportunidad de producir células endoteliales y hematopoyéticas in vitro para estudios funcionales y terapias. Anteriormente, los sistemas de cocultivo que utilizan la línea celular del estroma de médula ósea de ratón, OP9, se han utilizado para establecer una diferenciación eficaz y escalable de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en linajes endoteliales y sanguíneos. Sin embargo, los sistemas de cocultivo que dependen de células alimentadoras de ratón y suero (es decir, fuentes xenogénicas) tienen una utilidad limitada para estudiar la respuesta de hPSC a factores de crecimiento específicos. Además, tales sistemas tienen limitaciones adicionales cuando se consideran en el contexto de la fabricación de células sanguíneas terapéuticas de grado clínico.
A la luz de las deficiencias de los sistemas de cultivo anteriores, se necesitan nuevos sistemas de cultivo para proporcionar fuentes de linajes endoteliales y sanguíneos que sean adecuados para su uso en entornos clínicos sin el riesgo de la introducción de contaminación xenogénica.
Sumario de la invención
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas que comprende: (a) cultivar células madre pluripotentes humanas en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población celular de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto sin la formación de cuerpos embrioides o cocultivos con líneas celulares del estroma en donde la concentración en el medio de cultivo celular, de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM.
En algunas realizaciones, el método también incluye la etapa de (b) cultivar, en condiciones hipóxicas, la población celular obtenida en la etapa (a) en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGF durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprenda células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-Cf C) y de mesodermo hematovascular (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) enriquecido en células con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9. En algunas realizaciones, el método incluye la etapa de: (c) cultivar las células de mesodermo hematovascular de la etapa (b) en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 durante aproximadamente un día para obtener una población celular que comprende células progenitoras endoteliales no hemogénicas (no HEP) CD144+CD73+CD235a/CD43-, células progenitoras endoteliales hemogénicas (HEP) CD144+CD73-CD235a/CD43-, células progenitoras hematopoyéticas angiogénicas (AHP) CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+. En otras realizaciones, el método comprende también la etapa: (d) cultivar, en normoxia, los HEP y las células progenitoras hematopoyéticas en un medio de cultivo que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante aproximadamente tres días, dando como resultado una expansión hematopoyética para obtener una población de progenitores hematopoyéticos CD43+ compuestos por progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-.
En algunas realizaciones, la mezcla a usar en cualquiera de los métodos precedentes consiste esencialmente en los componentes mencionados. En algunas realizaciones, la mezcla a usar es sin xenógenos.
En algunas realizaciones, las células madre pluripotentes humanas se proporcionan sobre un sustrato tratado con Tenascina-C.
La presente invención proporciona un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina adecuado para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, en donde el medio de cultivo es adecuado para producir células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto, comprendiendo el medio de cultivo un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio, alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-Transferrina, insulina, BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl, en donde el medio comprende: aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4; aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A; aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mM de LiCl. También se divulga un medio de cultivo sin xenógenos para diferenciar células madre pluripotentes humanas, que comprende medio IF9S complementado con: aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4; aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A; aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 1mM a aproximadamente 2 mM de LiCl.
También se divulga un medio de cultivo sin xenógenos para diferenciar células madre pluripotentes humanas, que comprende medio IF9S complementado con: aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ng/ml de VEGF. En algunas realizaciones, cuando el medio contiene FGF2 y VEGF, el medio también incluye una citoquina hematopoyética. En algunas realizaciones, la citoquina hematopoyética comprende: aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ng/ml de SCF; aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ng/ml de TPO; aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ng/ml de IL-6; y aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ng/ml de IL-3. En algunas realizaciones, cualquiera de los medios anteriores consiste esencialmente en el medio IF9S y los componentes complementados. En algunas realizaciones, cualquiera de los medios anteriores se proporciona en una forma concentrada.
En otro aspecto, en el presente documento, se proporciona un sistema de cultivo celular sin xenógenos para diferenciar las células madre pluripotentes humanas en células progenitoras de mesodermo, endoteliales y hematopoyéticas, que comprende: células madre pluripotentes humanas sembradas como una suspensión de células sueltas sobre un sustrato que comprende una capa de Tenascina C a una concentración de al menos aproximadamente 0,25 pg/cm2 a 1 pg/cm2; y un medio de cultivo sin xenógenos que comprende medio IF9S complementado con: aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4; aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A; aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mM de LiCl. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un sistema de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina para diferenciar células madre pluripotentes humanas en células progenitoras del mesodermo, endoteliales y hematopoyéticas, que comprende; células madre pluripotentes humanas sembradas como una suspensión de células sueltas sobre un sustrato que comprende una capa de Tenascina C a una concentración de al menos aproximadamente 0,25 pg/cm2 a aproximadamente 1 pg/cm2; y el medio de cultivo sin xenógenos y sin albúmina de la invención.
En otro aspecto, se proporciona, en el presente documento, un método para diferenciar células madre pluripotentes, que comprende las etapas de: (a) sembrar células madre pluripotentes humanas como una suspensión de células sueltas sobre un sustrato tratado con Tenascina C; y (b) cultivar las células cultivadas en medio IF9s complementado con BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl en condiciones hipóxicas durante un período de aproximadamente dos días para obtener aproximadamente un 30% de células de mesodermo primitivo EMHlin'KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto. En particular, la presente invención proporciona un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas, que comprende las etapas de: (a) sembrar células madre pluripotentes humanas como una suspensión de células sueltas sobre un sustrato tratado con Tenascina C; y (b) cultivar las células sembradas en el medio de cultivo sin xenógenos y sin albúmina de la invención en condiciones hipóxicas durante un período de aproximadamente dos días para obtener aproximadamente un 30% de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDG-FRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto.
En algunas realizaciones, el método anterior comprende además la etapa de cultivar las células EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ en estadio de mesodermo primitivo en medio IF9S complementado con FGF2 y VEGF en condiciones hipóxicas durante aproximadamente 1-2 días para obtener mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y precursores mesodérmicos hematovasculares EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/' con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9.
En el presente documento también se divulgan poblaciones purificadas de células generadas por cualquiera de los métodos anteriores para diferenciar células madre pluripotentes humanas, en las que no se han expuesto las células a constituyentes no humanos.
En el presente documento también se divulga una población purificada de células creadas por los métodos descritos en el presente documento, en donde las células son más de aproximadamente el 35% de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con un potencial para formar colonias de mesenquimoangioblastos.
En el presente documento también se divulga una población purificada de células, en donde las células son más de aproximadamente el 35% de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y el 30% de células mesodérmicas hematovasculares EMHlin'KDRhiA-PLNR+PDGFRalfalo/' con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9.
En el presente documento también se divulga una población purificada de células, en donde la población incluye más de aproximadamente el 40% de células CD144+ que comprenden progenitores endoteliales hemogénicos (HEP) CD144+CD73'CD235a/43‘, progenitores hematopoyéticos angiogénicos CD144+CD73'CD235a/CD43+CD41a_, y progenitores endoteliales no hemogénicos (no HEP) CD144+CD73+CD235a/43‘.
En el presente documento también se divulga una población de células, en donde la población incluye más de aproximadamente un 30% de células progenitoras hematopoyéticas CD43+ compuestas de progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin'CD34+CD43+CD45+/'
En un aspecto adicional, el presente documento proporciona un método para producir mesenquimoangioblastos, que comprende las etapas de: (a) sembrar células madre pluripotentes humanas sobre un sustrato tratado con una cantidad eficaz de colágeno; y (b) exponer las células madre a una mezcla sin xenógenos y sin albúmina que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl en condiciones hipóxicas durante un período de aproximadamente dos días para formar una población de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto. En algunas realizaciones, el colágeno a usar comprende Colágeno IV.
T ambién se divulga, en el presente documento, un medio de cultivo celular para diferenciar células madre pluripotentes humanas, que comprende: 64 mg/l de sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 40 pl/l de monotioglicerol, 8,4 pg/l de selenito de sodio adicional, 10 mg/l de alcohol polivinílico, 1x de GLUTAMAX, 1x aminoácidos no esenciales, 0,1x concentrado lipídico definido químicamente, 10,6 mg/l de Holo-T ransferrina y 20 mg/l de insulina.
En un aspecto adicional, se describe en el presente documento un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas que comprende: (a) cultivar células madre pluripotentes humanas en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población celular de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto sin la formación de cuerpos embrioides o cocultivos con líneas celulares del estroma en donde la concentración en el medio de cultivo celular, de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM.
En algunas realizaciones, las células madre pluripotentes humanas se cultivan sobre Tenascina C. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende un medio de cultivo celular IF9S.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente (b) cultivar, en condiciones hipóxicas, la población celular obtenida en la etapa (a) en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGF durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprenda células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y de mesodermo hematovascular (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/') con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9. En algunas realizaciones la concentración, en el medio de cultivo celular, de FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y VEGF es aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente (c) cultivar las células de mesodermo hematovascular de la etapa (b), en condiciones hipóxicas, en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 durante aproximadamente un día para obtener una población celular que comprende células progenitoras endoteliales no hemogénicas (no HEP) CD144+CD73+CD235a/CD43- progenitoras endoteliales hemogénicas (HEP) CD144+CD73'CD235a/CD43‘, progenitoras hematopoyéticas angiogénicas (AHP) CD144+CD73'CD235a/CD43+41a' y progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+. En algunas realizaciones la concentración, en el medio de cultivo celular, de: FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y VEGF es aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; SCF es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; TPO es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; IL-6 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml e IL-3 es aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente (d) cultivar, en normoxia, los HEP y las células progenitoras hematopoyéticas en un medio de cultivo que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante aproximadamente tres días para obtener una población expandida de progenitores hematopoyéticos CD43+ que comprenden progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-.
En algunas realizaciones, el método comprende además cocultivar la población expandida de progenitores hematopoyéticos CD34+CD43+ durante un período de aproximadamente tres semanas sobre células OP9 que sobreexpresan DLL4 para obtener una población celular que comprende linfocitos T doble positivos CD4+CD8+, en donde las células madre pluripotentes humanas de la etapa (a) se cultivan sobre un sustrato de Tenascina C.
En un aspecto relacionado, se proporciona, en el presente documento, un método para diferenciar células madre pluripotentes, que comprende al menos una de: (i) cultivar células madre pluripotentes humanas en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDG-FRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto; (ii) cultivar, en condiciones hipóxicas, células de mesodermo primitivo EMHlin'KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGF durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprende células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y células de mesodermo hematovascular(EMHlin'KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/') enriquecido en células con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9; (iii) cultivar células de mesodermo hematovascular (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-), en condiciones hipóxicas, en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 durante aproximadamente un día para conseguir la formación de células progenitoras endoteliales no hemogénicas (no HEP) CD144+CD73+CD235a/CD43-, células progenitoras endoteliales hemogénicas (HEP) CD144+CD73-CD235a/CD43-, células progenitoras hematopoyéticas angiogénicas (AHP) CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+; (iv) cultivar, en normoxia, progenitores endoteliales hemogénicos (HEP) y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+ en un medio de cultivo que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante aproximadamente tres días para obtener una población expandida de progenitores hematopoyéticos CD43+ que comprenden progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-; y (v) cocultivar progenitores hematopoyéticos CD34+CD43+ durante un período de aproximadamente tres semanas sobre células OP9 que sobreexpresan DLL4 para obtener una población celular que comprende células T CD4+CD8+.
También se divulga, en el presente documento, un medio de cultivo celular adecuado para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, que comprende un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio adicional, alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-Transferrina e insulina.
La presente invención proporciona un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina adecuado para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, en donde el medio de cultivo es adecuado para producir células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto, comprendiendo el medio de cultivo un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio, alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-Transferrina, insulina, BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl, en donde el medio comprende: aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4; aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A; aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mM de LiCl.
En otras realizaciones el medio de cultivo comprende adicionalmente FGF2 y VEGF.
En otras realizaciones, el medio de cultivo comprende adicionalmente FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL-6 e IL-3.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende un medio IF9S. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular IF9S tiene la formulación del medio de cultivo celular IF9S de la Tabla 2.
En un aspecto relacionado, se proporciona en el presente documento un complemento de medio concentrado 9S, en el que la dilución del complemento de medio concentrado 9S en un medio base IMDM/F12 produce un medio de cultivo celular IF9S. También se divulga un kit que comprende el complemento de medio concentrado 9S y uno o más de BMP4, Activina A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, IL-3 y Tenascina C.
En un aspecto adicional se proporciona en el presente documento un sistema de cultivo celular definido para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, que comprende un medio de cultivo celular IF9S y un sustrato de Tenascina C para el crecimiento adherente de células madre pluripotentes humanas o su progenie diferenciada a lo largo del linaje hematoendotelial. En particular, la presente invención proporciona además un sistema de cultivo celular definido para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, que comprende el medio de cultivo de la invención y un sustrato de Tenascina C para el crecimiento adherente de células madre pluripotentes humanas o su progenie diferenciada a lo largo del linaje hematoendotelial. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular IF9S se mantiene en condiciones hipóxicas.
INCORPORACIÓN A MODO DE REFERENCIA
Eliminado
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra un diagrama esquemático de la diferenciación hematopoyética que muestra las vías de desarrollo hematopoyético, marcadores específicos y ensayos funcionales utilizados para identificar cada estadio del desarrollo, y condiciones utilizadas para la diferenciación de hPSC en medio químicamente definido. Se muestran los subgrupos de células principales observados en estudios de diferenciación anteriores que utilizan cocultivo con OP9 alimentadoras y cultivos actualmente definidos químicamente.
FIG. 2 Identificación de una firma molecular única de células del estroma OP9 crecidas en exceso (a) Diagrama de Venn que muestra el solapamiento entre los genes expresados diferencialmente en OP9 crecidas en exceso el día 8 frente a OP9 recientemente confluentes el día 4, y MS5 y S17. Están sobreexpresados de forma única, 21 genes marcados con fondo gris en las células OP9 del día 8 en comparación con todas las otras líneas celulares probadas. (b) Mapa de calor de genes superpuestos expresados diferencialmente como se muestra en (a). Tenascina-C (Tnc) es uno de los principales genes sobreexpresados diferencialmente en las células OP9 confluentes en exceso.
FIG. 3 Desarrollo mesodérmico en cultivos de hESC diferenciadas sobre ColIV frente a TenC durante 2, 3 y 4 días en condiciones definidas químicamente (a) Representaciones y gráficos de citometría de flujo que comparan el porcentaje de población mesodérmica primitiva EMHlin'KDR+APLNR+PDGFRalfa+ (A+P+) en los días 2 y 3. (b) Representaciones y gráficos de citometría de flujo que comparan el porcentaje de poblaciones KDRhiCD31- (HVMP), CD31+, and KDRloCD31‘ en el día 4. (c) Comparación del potencial de formación de colonias MB/HB de los cultivos del día 2, día 3 y día 4. (d) Potenciales hematopoyéticos y endoteliales de células KDRhiCD31- y KDRloCD31‘ aisladas a partir de las células del día 4 diferenciadas en condiciones químicamente definidas después del cocultivo con OP9 durante 7 días. Los paneles superiores muestran citometría de flujo de células humanas seleccionadas con TRA-1-85+ y los paneles inferiores muestran tinción de inmunofluorescencia de células de cocultivos con OP9 con células KDRhiCD31- y KDRloCD31‘. Las barras de (a), (b) y (c) son medias DE de 3 experimentos (* p <0,01).
FIG. 4 Desarrollo de progenitores endoteliales en cultivos diferenciados en ColIV o TenC durante 5 días en condiciones químicamente definidas (a) El análisis por citometría de flujo muestra los principales subgrupos de progenitores de VE-cadherina+ (VEC; CD144+) generados después de 5 días de cultivo de hESC en condiciones químicamente definidas en ColIV y TenC. (b) Porcentajes de células y subgrupos VEC+ (CD144+) generados en cultivos ColIV y TenC. Las barras de error son medias DE de 3 experimentos (* p <0,01). (c) Potencial de CFC del subgrupo VEC+ (CD144+) aislado en medio clonogénico sin suero con FGF2 y citoquinas hematopoyéticas. (d) Potencial endotelial y hematopoyético de los subgrupos VEC+ (CD144+) del día 5. Los subgrupos de progenitores se clasificaron y se cultivaron en condiciones endoteliales con un posterior ensayo de formación de tubos, o en OP9 con resultados de inmunofluorescencia y citometría de flujo después de 7 días. Barras de escala, 100 |jm.
FIG. 5 Desarrollo de progenitores hematopoyéticos en cultivos diferenciados en ColIV o TenC durante 8 días en condiciones químicamente definidas (a) El análisis por citometría de flujo muestra los principales subgrupos de células CD43+ generadas en cultivos en ColIV y TenC. (b) Los cultivos en TenC producen significativamente más células CD43+ en 3 experimentos (* p <0,01). (c) El potencial de CFC hematopoyéticas en medios que contienen suero se limita a las subpoblaciones CD43+. (d) Los cultivos diferenciados en TenC tienen un mayor potencial de CFC que los cultivos diferenciados en ColIV, estadísticamente significativo en 3 experimentos (* p <0,01).
FIG. 6 Potencial de linfocito T de células CD43+ recogidas de hESC H1 diferenciadas durante 9 días en condiciones químicamente definidas en ColIV y TenC (a) Análisis de citometría de flujo de células recogidas de condiciones ColIV y TenC después del cultivo en OP9DLL4 durante 3 semanas. (b) Análisis del reordenamiento del receptor de células T por PCR genómica. Las células T H1 son las células T derivadas de la diferenciación de H1; el control de SP es un control positivo de Sangre Periférica; hESC H1 es hESC H1 no diferenciadas.
FIG. 7 El efecto del inhibidor de TGFp en el desarrollo hematopoyético a partir de hESC H1 en condiciones definidas químicamente. Representaciones de puntos representativas obtenidas por citometría de flujo del día 3, 4, 5 y 8 de diferenciación después de añadir el inhibidor de TGFp, SB-431542 solo desde el día 2 hasta el día 4. En el día 3, SB-431542 disminuye la expresión de PDGFRalfa, pero aumenta los progenitores endoteliales en los días 4 y 5. En el día 8, hay un aumento significativo en los progenitores hematopoyéticos CD43+.
FIG. 8 Generación de progenitores hematoendoteliales KDRhiCD31 en cultivos que utilizan diferentes medios basales y proteína matriz El medio base TeSR1 es TeSR1 sin citoquinas. DF4S es un medio basado en DMEM/F12 complementado con 4 complementos; 64 mg/l de sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 8,4 jg /l de selenito de sodio, 10,6 mg/l de Holo-Transferrina y 20 mg/l de insulina. I4S es DF4S con medios basados en IMDM en lugar de medios basados en DMEM/F12, pero con los cuatro complementos mencionados anteriormente. IF4S es DF4S con medios basados en IMDM/F12 en lugar de medios basados en DMEM/F12, pero con los 4 complementos mencionados anteriormente. VTN es matriz de vitronectina; MTG es sustrato Matrigel®; ColIV es matriz de colágeno IV. Las representaciones gráficas de citometría de flujo muestran el porcentaje de precursores endoteliales KDRhiCD31+ de las células del día 4 diferenciadas en cada medio complementado con 50 ng/ml de FGF2, BMP4 y VEGF en condiciones hipóxicas
FIG. 9 Diferenciación hematopoyética de iPSC y hESC H9 en condiciones definidas químicamente El panel superior representa el número de células generadas en cultivos a partir del día -1 cuando las células se colocan sobre placas con TenC o ColIV, hasta el día 9 de diferenciación. Los números de células CD31+ y CD43+ se calcularon según el número total de células multiplicado por el porcentaje de células positivas según la citometría de flujo. El panel inferior muestra gráficos de puntos del porcentaje de células CD43+ y sus subconjuntos de la línea de iPSC de fibroblastos humanos 19-9-7T, la línea de iPSC derivada de la médula ósea humana BM19-9 y la línea ESC H9 humana diferenciada durante ocho días en ColIV o TenC.
FIG. 10 es un diagrama de una línea de tiempo de diferenciación hematopoyética que compara la eficacia de la diferenciación en Colágeno IV frente a Tenascina C.
Descripción detallada
Las tecnologías de células madre pluripotentes humanas (hPSC) proporcionan la oportunidad de estudiar el desarrollo humano in vitro y desarrollar células sanguíneas específicas de paciente sin depender de donantes HLA compatibles. Anteriormente, se desarrolló un protocolo eficaz para la diferenciación de células madre/progenitoras hematopoyéticas utilizando un método de cocultivo en la línea celular del estroma de ratón, OP9, (Vodyanik, et al., 2005; Vodyanik, et al, 2006). Este sistema reproduce ondas de hematopoyesis primitivas y definitivas y se puede utilizar para obtener progenitores hematopoyéticos definitivos multipotentes lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD117+CD43+CD45-/+ con fenotipo HSC y células linfoides, incluidos linfocitos T y B (Carpenter, et al., 2011; Kutlesa, et al., 2009; Schmitt y Zuniga-Pflucker, 2002; Vodyanik, et al., 2005).
El cocultivo de células madre pluripotentes humanas con células OP9 induce la diferenciación endotelial mesendodérmica y hemogénica. Al sembrar en placas hPSC sobre células OP9, las hPSC comienzan a expresar el marcador mesodérmico del receptor de apelina (APLNR), VEGFR2 (KDR) y PDGFRalfa y adquieren potencial de mesenquimoangioblasto (MB) y hemangioblasto (HB) (días 2-3 de diferenciación). Con la maduración avanzada, las células mesodérmicas KDR+APLNR+ regulan positivamente la expresión de KDR y regulan negativamente PDGFRa, que se enriquece en células con el potencial de formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9.
En el día 2 -3,5 de diferenciación, las células KDR+APLNR+ carecen de los marcadores Endoteliales (CD31, VE-cadherina (CD144)), endoteliales/Mesenquimales (CD73, CD105) y Hematopoyéticos típicos (CD43, CD45), es decir, tienen un fenotipo EMHlin\ Las células EMHlin- carecen de marcadores endoteliales (CD31 y CD144), mesenquimales/endoteliales (CD73, CD105) y hematopoyéticos (CD43 y CD45), mientras que las células lin- carecen de marcadores de células hematopoyéticas diferenciadas, incluidos CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19 e CD20. En el día 4, surgieron células VE-Cadherina+ (CD144). Las células VE-Cadherina+ emergentes representan una población heterogénea, que incluye progenitores endoteliales no hemogénicos (no HEP) CD144+CD235a/43-CD73+, progenitores endoteliales hemogénicos (HEP) CD144+CD73-CD235a/43- y progenitores hematopoyéticos angiogénicos CD144+73'CD43+CD235a+CD41a_. Los HEP tienen el potencial de dar lugar a progenitores hematopoyéticos lin-CD34+CD43+CD45+/- multipotentes.
Desafortunadamente, el sistema OP9 se basa en células alimentadoras y suero de ratón, que limitan su utilidad para estudiar la respuesta de hPSC a factores de crecimiento específicos y para producir células sanguíneas terapéuticas de grado clínico. Además, el sistema de cocultivo OP9 es muy sensible a las variaciones en la calidad del suero, el mantenimiento de las células del estroma y el tamaño de las colonias de PSC utilizadas para la diferenciación.
Aunque otros investigadores han desarrollado protocolos de diferenciación sin alimentadores, estos protocolos se basan en la formación de cuerpos embrioides (EB) para la diferenciación hematopoyética. Los métodos de EB a menudo dependen del suero y también tienen inconvenientes importantes, tal como la diferenciación asíncrona y la alta variabilidad. Recientemente se han desarrollado varios protocolos para inducir la hematopoyesis en condiciones sin suero (Salvagiotto, et al., 2011; Wang, et al., 2012); sin embargo, todavía requieren componentes xenogénicos, albúmina sérica y/o complementos patentados. Tampoco queda claro si estos protocolos reproducen las distintas ondas de hematopoyesis como se ve en OP9.
Además, la mayoría de los protocolos diferencian las hPSC desarrolladas en MEF o Matrigel®. Debido a que se ha descrito un nuevo medio y matriz completamente sin xenógenos y químicamente definidos para la derivación y el mantenimiento de hPSC (Chen, et al., 2011), existe la necesidad de desarrollar un protocolo similar de diferenciación dirigida sin xenógenos químicamente definido para derivar progenitores hematopoyéticos a partir de hPSC.
A menos que se defina lo contrario en la presente memoria descriptiva, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención y por referencia a textos publicados.
Cabe señalar que el término "un" o "una", se refiere a uno o más, por ejemplo, "una molécula", se entiende que representa una o más moléculas. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno o más", y "al menos uno" se usan indistintamente en el presente documento. El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento contempla un intervalo de valores para un número dado de /- 10% la magnitud de ese número. Por ejemplo, "aproximadamente 3 gramos" indica un valor de 2,7 a 3,3 gramos, y similares.
Como se cita en el presente documento, las expresiones "condiciones definidas" o "medio definido" significan que se conoce la identidad y la cantidad de cada ingrediente. El término "ingrediente," como se utiliza en el presente documento, se refiere a un componente cuya identidad molecular y cantidad se conoce.
En el presente documento se divulgan métodos eficaces y reproducibles y composiciones de apoyo que recapitulan, en un sistema completamente definido, sin xenógenos, el desarrollo hematopoyético observado en el sistema de cocultivo OP9 a través del mesodermo temprano, el precursor hematovascular del mesodermo y los estadios endoteliales hemogénicos.
La Tabla 1 proporciona una lista de tipos celulares, fenotipos de marcadores celulares asociados y abreviaturas correspondientes utilizadas en el presente documento.
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Métodos para la Diferenciación Hematoendotelial de Células Madre Pluripotentes Humanas (hPSC)
En el presente documento se divulgan métodos para la diferenciación de células madre pluripotentes humanas (ya sea células madre pluripotentes embrionarias humanas o inducidas humanas) en condiciones definidas y, preferentemente, en ausencia de formación de cuerpos embrioides. Al menos un resultado deseado de esta diferenciación es la provisión de poblaciones de células endoteliales y hematopoyéticas que pueden ser una fuente de estudios funcionales de estos linajes, así como una fuente de terapias clínicas.
En algunas realizaciones, el método de diferenciación proporcionado en el presente documento incluye las etapas de (a) cultivar células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)) en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población celular de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto. Preferentemente, las células madre pluripotentes humanas se cultivan sin formación de cuerpos embrioides. En particular, el medio empleado es un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina adecuado para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, en donde el medio de cultivo es adecuado para producir células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto, comprendiendo el medio de cultivo un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio, alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-Transferrina, insulina, BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl, en donde el medio comprende: aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4; aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A; aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mM de LiCl.
En algunas realizaciones, las células madre pluripotentes humanas se siembran en placas a una densidad inicial de aproximadamente 5.000 células/cm2 a aproximadamente 15.000 células/cm2, por ejemplo, 6.000 células/cm2, 7.000 células/cm2, 8.000 células/cm2, 9.000 células/cm2, u otra densidad de placa de aproximadamente 5.000 células/cm2 a aproximadamente 15.000 células/cm2, En algunas realizaciones, el método de diferenciación incluye además la etapa de (b) cultivar, en condiciones hipóxicas, la población celular obtenida en la etapa (a) en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGF durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprenda células de mesodermo primitivo EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y de mesodermo hematovascular (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/') enriquecido en células con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9. En otras realizaciones, el método de diferenciación incluye además la etapa de (c) cultivar las células de mesodermo hematovascular de la etapa (b), en condiciones hipóxicas, en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 durante aproximadamente un día para conseguir la formación de células progenitoras endoteliales no hemogénicas (no HEP) CD144+CD73+CD235a/CD43-, células progenitoras endoteliales hemogénicas (HEP)CD144+CD73-CD235a/CD43-, células progenitoras hematopoyéticas angiogénicas (AHP) CD144+CD73- CD235a/CD43+41a- y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+.
En algunas realizaciones, el método de diferenciación incluye además la etapa de (d) cultivar, en normoxia, los HEP y las células progenitoras hematopoyéticas en un medio de cultivo que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante aproximadamente tres días para obtener una población expandida de progenitores hematopoyéticos CD43+ que comprenden progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+A
En algunas realizaciones, un método de diferenciación desvelado en el presente documento incluye la etapa de al menos una de: (i) cultivar células madre pluripotentes humanas, sin formación de cuerpo embrioide, en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población celular de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto; (ii) cultivar, en condiciones hipóxicas, células de mesodermo primitivo EMHlin'KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGF durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprende células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y células de mesodermo hematovascular (EMHlin'KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/') enriquecido en células con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9; (iii) cultivar células de mesodermo hematovascular (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-), en condiciones hipóxicas, en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 durante aproximadamente un día para conseguir la formación de células progenitoras endoteliales no hemogénicas (no HEP) CD144+CD73+CD235a/CD43-, células progenitoras endoteliales hemogénicas (HEP) CD144+CD73'CD235a/CD43‘, células progenitoras hematopoyéticas angiogénicas (AHP) CD144+CD73'CD235a/CD43+41a_ y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+; y (iv) cultivar, en normoxia, progenitores endoteliales hemogénicos (HEP) y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+ en un medio de cultivo que comprende FGF2, VEGF, Il6, SCF, TPO, IL3 durante aproximadamente tres días para obtener una población expandida de progenitores hematopoyéticos CD43+ que comprenden progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-.
En algunas realizaciones, las condiciones hipóxicas se refieren a un nivel de oxígeno ambiental (por ejemplo, una mezcla de gases de incubación de cultivo celular) de aproximadamente 3% de O2 a aproximadamente 10% de O2. En algunas realizaciones, las condiciones hipóxicas son aproximadamente 5% de O2. En realizaciones en las que se permite que un medio de cultivo celular se equilibre en condiciones hipóxicas, el medio de cultivo celular se convierte en un medio de cultivo celular hipóxico debido al menor nivel de oxígeno disuelto en comparación con un medio de cultivo celular equilibrado en condiciones normóxicas (por ejemplo, una mezcla de gases que contiene alrededor del 20% de oxígeno).
En algunas realizaciones, el medio de cultivo a utilizar en cualquiera de los métodos de diferenciación descritos anteriormente comprende un medio IF9S, como se describe en el presente documento. En una realización, el medio IF9S a utilizar es el medio IF9S que tiene la formulación expuesta en la Tabla 2.
En algunas realizaciones, cualquiera de las células mencionadas anteriormente (p. ej., células madre pluripotentes humanas) se cultiva sobre Tenascina C. En algunas realizaciones, cualquiera de las células mencionadas se siembra sobre un sustrato tratado con una cantidad de Tenascina C suficiente para adherir 10.000 células/cm2 al sustrato. En algunas realizaciones, la Tenascina C a usar es Tenascina C humana. En algunas realizaciones, el sustrato se trata con Tenascina C a una concentración de al menos aproximadamente 0,25 pg/cm2 a 1 pg/cm2, por ejemplo, 0,4 pg/cm2, 0,5 pg/cm2, 0,7 pg/cm2, 0,8 pg/cm2, u otra concentración de al menos aproximadamente 0,25 pg/cm2 a 1 pg/cm2
En algunas realizaciones, en el medio de cultivo celular a utilizar en los métodos de diferenciación descritos anteriormente, la concentración de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM; y VEGF es aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; SCF es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; TPO es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; IL-6 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml e IL-3 es aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml.
En algunas realizaciones, cualquiera de las células mencionadas anteriormente se cultiva en un medio de cultivo celular sin xenógenos. Para las terapias clínicas es crucial la ausencia de materiales xenogénicos en las poblaciones de células derivadas, es decir, no hay células no humanas, fragmentos de células, suero, proteínas y similares.
Preferentemente, la presente invención llega a las células diferenciadas sin xenógenos mediante el uso de Tenascina C o Colágeno IV como una plataforma, que esencialmente reemplaza el contacto con las células OP9 utilizadas en los sistemas de diferenciación anteriores. Además, los medios divulgados en el presente documento están definidos químicamente y, en algunas realizaciones, se producen sin xenógenos e incorporan proteínas humanas, que pueden producirse utilizando tecnología recombinante o derivarse de placenta u otros tejidos humanos en lugar de proteínas derivadas de animales. En algunas realizaciones, todas las proteínas añadidas al medio son proteínas recombinantes.
Si bien los procesos de diferenciación incluyen eventos ordenados y secuenciales, la duración de los eventos puede variar al menos en un 20 %. Por ejemplo, si bien un paso particular se puede divulgar en una realización como que dura un día, el evento puede durar más o menos de un día. Por ejemplo, "un día" puede incluir un período de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 horas. Los períodos de tiempo indicados que son períodos de varios días pueden ser múltiplos de "un día", tal como, por ejemplo, dos días pueden abarcar un período de aproximadamente 36 a aproximadamente 60 horas, y similares. En otra realización, la variación del tiempo puede reducirse, por ejemplo, donde el día 2 es de 48 /- 3 horas desde d0; el día 4 es de 96 /- 3 horas desde d0, y el día 5 es de 120 horas /- 3 horas desde d0.
Ejemplos de posibles linajes comprometidos y/o diferenciados obtenibles por la presente invención incluyen células de mesodermo primitivo KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de HB y MB de CFC, células de mesodermo hematovascular EMHlin'KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/" con potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9, células del subgrupo VE-Cadherina+ (CD144+), tales como HEP (CD144+CD73-CD235a/43", no-HEP (CD144+CD73+CD235a/43-, y AHP (CD144-CD73-CD235a/43+41a-), células progenitoras hematopoyéticas CD43+ tales como progenitores hematopoyéticos eritromegacariocíticos CD43+CD235a+41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-. El término linaje- ("lin-), como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula precursora o progenitora hematopoyética que no se ha comprometido con ninguno de sus linajes de células sanguíneas derivadas hasta el momento, debido a que conserva la capacidad de diferenciarse en cualquiera de ellos. Esta característica se controla buscando la ausencia de marcadores de superficie celular indicativos de diferenciación en cualquiera de los linajes derivados. Una ventaja significativa adicional de la presente divulgación es la capacidad de usar poblaciones de células clonales debido a la plataforma de Tenascina C, que elimina la dependencia sobre eventos estocásticos indefinidos comunes a los grupos de células, tal como los cuerpos embrioides, para generar poblaciones diferenciadas. Además, las poblaciones de células clonales muestran una mayor uniformidad durante el proceso de diferenciación, lo que proporciona un mayor rendimiento de células sincronizadas que el observado anteriormente en los sistemas de células alimentadoras. Por lo tanto, la presente divulgación también describe un sistema de diferenciación mejor escalable, más eficaz que el disponible anteriormente.
Composiciones
Medios de Cultivo Celular Definidos y complementos de Medios Concentrados
En el presente documento, algunas realizaciones describen un medio de diferenciación que comprende un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio (además de cualquiera presente en el medio base), alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-Transferrina e insulina. Los medios base adecuados para los medios de diferenciación descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, Medio Dulbecco modificado por Iscove/F12 (IMDM/F12), medio base TeSRI, que es medio base mTeSRI ™, (Stem Cell Technologies véanse Ludwig and Thomson (2007), Curr Protoc Stem Cell Biol., Capítulo 1:Unidad 1C.2 y la Patente de Estados Unidos N.° 7.449.334) sin FGF2 y TGF-beta; medio base DF4S, que es un medio Essential 8™ (Life Technologies; también conocido como medio "E8", véanse Chen y Thomson (2011), Nat Methods, 8 (5): 424-429 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N^ 20120178166) sin FGF2 y TGF-beta, medio base I4S, que es base DF4S con el Medio Dulbecco modificado por Iscove ( IMDM) en lugar de DMEM/F12, y la base IF4S es base DF4S con IMDM/F12 en lugar de DMEM/F12. Preferentemente, el medio base que se utilizará es sin albúmina. IMDM/F12 es un medio sintético altamente enriquecido adecuado para cultivos celulares de alta densidad y proliferación rápida con una mezcla de nutrientes añadidos.
En algunas realizaciones, los medios de diferenciación utilizados en el presente documento, denominados genéricamente en el presente documento medios "IF9S", comprenden IMDM /F12, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio (además de cualquiera presente en el medio base), alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente (Life Technologies; número de Cat. 1905031), Holo-Transferrina e insulina.
En una realización, un medio IF9S comprende IMDM/F12 (1x), sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato (64 mg/l), monotioglicerol (50 mg/l), selenito de sodio (además de cualquiera presente en el medio base; 8,4 ug/l), alcohol polivinílico (10 mg/l), Glutamax™ (1x), NEAA (1x), concentrado lipídico químicamente definido (0,1x), Holo-Transferrina (10,6 mg/l) e insulina (20 mg/l).
Como se describe en el presente documento, en varios momentos/ estadios de la diferenciación hematoendotelial de hPSC, el medio de diferenciación completo que se utilizará contiene varias combinaciones de citoquinas, factores de crecimiento y/o moléculas pequeñas. Dependiendo del estadio de la diferenciación hematoendotelial de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, un medio de diferenciación completo adecuado se complementará con diferentes combinaciones de citoquinas con concentraciones dentro de los intervalos descritos para los medios de diferenciación completos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, el medio de diferenciación completo comprende un medio IF9S, BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl. En otras realizaciones, el medio de diferenciación completo comprende un medio IF9S, FGF2 y VEGF. En otras realizaciones, el medio de diferenciación completo comprende un medio IF9S, FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL-6 e IL-3. En algunas realizaciones, la concentración final del medio completo de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 1o ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM; y VEGF es aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; SCF es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; TPO es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; IL-6 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml e IL-3 es aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml. En algunas realizaciones, todas las proteínas utilizadas en el medio de diferenciación completo son proteínas humanas recombinantes. En otras realizaciones, el medio de diferenciación completo comprende una o más proteínas no humanas (por ejemplo, proteínas no humanas recombinantes).
En algunas realizaciones, un medio de diferenciación completo comprende un medio IF9S y una de las combinaciones de "citoquinas" enumeradas en la Tabla 3 en las concentraciones indicadas. En algunas realizaciones, la formulación del medio IF9S utilizada en los medios de diferenciación completos que se acaban de mencionar es la formulación del medio IF9S que se muestra en la Tabla 2.
Si bien los medios actualmente divulgados pueden incluir morfógenos específicos, moléculas pequeñas y citoquinas hematopoyéticas divulgadas en el presente documento, se contempla que se puedan usar componentes adicionales con las mismas, equivalentes o similares propiedades, además de o en lugar de las divulgadas, como se conoce en la técnica.
En algunas realizaciones, los medios divulgados en el presente documento pueden incluir materiales xenogénicos (es decir, derivados biológicamente, no humanos). Por ejemplo, un material xenogénico puede ser una proteína recombinante de origen xenogénico. Los medios divulgados en el presente documento también pueden producirse en formas concentradas que se diluyen antes de su uso, tal como concentraciones 2X, 10X, 100X o 1000X.
Además, la sustitución de ciertos materiales xenogénicos en los medios de la presente invención proporcionó mayores beneficios inesperados que al proporcionar solamente condiciones de cultivo sin xenógenos. Por ejemplo, se cree que la sustitución de la albúmina de suero bovino con alcohol polivinílico llevó a un medio "más denso" que contribuyó inesperadamente a la supervivencia celular.
T l 2. D ri i n n r liz i n m l r n m i IF .
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Tabla 3. Descripción general de las Combinaciones de complementos de Citoquinas y las Concentraciones E m l r n Dif r n Dí D Ini i r l Dif r n i i n H m n li l hP n n m i IF .
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complementos de Medio Concentrados
También se divulga en el presente documento un complemento de medio "9S" concentrado, que comprende Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio adicional, alcohol polivinílico, Glutamax™ (o glutamina), aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-Transferrina e insulina. En algunas realizaciones, el complemento de medio 9S concentrado comprende cada componente a una concentración de 10x a 1000x de la concentración de trabajo final una vez diluido en un medio base. En algunas realizaciones, las concentraciones de todos los componentes 9S en el complemento concentrado son de 10x a 1000x las concentraciones enumeradas en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el complemento debe diluirse en medio IMDM/F12 para obtener el medio IF9S como se describe en el presente documento.
Kits
En el presente documento también se divulgan kits útiles para la diferenciación hematoendotelial de hPSC. En algunos casos, un kit comprende un complemento de medio concentrado 9S, como se describe en el presente documento, uno o más de BMP4, Activina A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6 e IL-3, e instrucciones para generar un medio IF9S y un método para la diferenciación hematoendotelial de hPSC como se describe en el presente documento. En algunos casos, un kit incluye adicionalmente medio IMDM/F12. En algunos casos, el kit comprende un complemento de medio concentrado 9S, Activina A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, IL-3, e instrucciones para generar un medio IF9S y un método para la diferenciación hematoendotelial de hPSC como se describe en el presente documento. En casos adicionales, cualquiera de los kits mencionados anteriormente también incluye Tenascina C (por ejemplo, Tenascina C humana), que se usa como un sustrato para el crecimiento adhesivo de acuerdo con los métodos de diferenciación descritos en el presente documento.
Sistemas de Cultivo Celular Definidos para la Diferenciación Hematoendotelial de hPSC
En el presente documento también se describe un sistema de cultivo celular definido para la diferenciación hematoendotelial de hPSC. Dichos sistemas de cultivo celular incluyen un medio de cultivo de diferenciación definido como se describe en el presente documento, por ejemplo, un medio IF9S, un sustrato de proteína Tenascina C para el crecimiento adherente de hPSC o su progenie diferenciada a lo largo del linaje hematoendotelial. En algunas realizaciones, la Tenascina C se usa, al menos, de 0,25 pg/cm2 a aproximadamente 1 pg/cm2 para generar un sustrato adhesivo adecuado.
En algunas realizaciones, el sistema de cultivo celular incluye un medio IF9S complementado con BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl. En algunas realizaciones, el medio IF9S se complementa con FGF2 y VEGF. En algunas realizaciones, el medio IF9S utilizado en el sistema de cultivo celular se complementa con FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL6 e IL-3. En algunas realizaciones, el medio IF9S utilizado en el sistema de cultivo celular se formula de acuerdo con el medio descrito en la Tabla 2. En algunas realizaciones, el sistema de cultivo celular definido comprende un medio de cultivo celular que es hipóxico, que se logra fácilmente mediante el uso de un incubador de cultivo celular que permite la regulación del nivel de oxígeno, y al equilibrar el medio de cultivo celular en un incubador de cultivo celular configurado a aproximadamente 3% de O2 a aproximadamente 10% de O2 (por ejemplo, 5% de O2).
En otras realizaciones, el sistema de cultivo celular definido incluye adicionalmente células madre pluripotentes humanas adherentes cultivadas sobre el sustrato de Tenascina C en el medio IF9S de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.
Las células pueden crecer, por ejemplo, en placas de cultivo celular recubiertas con Tenascina C, placas de cultivo celular de múltiples pocillos o perlas de microportador. Preferentemente, la proteína Tenascina C es la Tenascina C humana (número de acceso de GenBank CAA55309.1; disponible comercialmente, por ejemplo, Millipore N.° de Cat. CC065).
El uso de Tenascina C y las condiciones hipóxicas permiten la generación de poblaciones enriquecidas de células endoteliales y hematopoyéticas en porcentajes más altos en comparación con las células sembradas sobre Colágeno IV o sobre células OP9, tal como mayor que el 10% o mayor que aproximadamente el 20%, mayor que el aproximadamente el 50%, mayor que aproximadamente el 60% cuando se compara por estadio por plataforma (véanse la Fig. 10 y los Ejemplos). En una realización, los porcentajes de las poblaciones objetivo obtenibles por la presente invención pueden ser mayores que aproximadamente el 35% para las células de mesodermo KDR+APLNR+PDGFRalfa+ o mayores que aproximadamente el 20% de células endoteliales VE-Cadherina+CD43‘ y mayores que aproximadamente el 40% de células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD43+. Además, con respecto a la Fig. 10, los porcentajes de células obtenidas sobre la plataforma de Tenascina C son el porcentaje indicado o mayor. Además, La Fig. 10 representa el porcentaje de la población objetivo (p. ej., progenitor de mesodermo, progenitor endotelial, progenitores hematopoyéticos con los fenotipos correspondientes de acuerdo con la citometría de flujo) del cultivo total cuando se diferencian sobre Col IV o TenC.
Los métodos y materiales actuales se pueden combinar en sistemas de cultivo celular para proporcionar nuevas plataformas de diferenciación. En una realización, un sistema de cultivo celular básico incluye células madre pluripotentes sembradas sobre Tenascina C. En otra realización, un sistema de cultivo celular incluye células madre sembradas sobre Colágeno IV, en un medio complementado con Activina A. Estos sistemas tienen la capacidad de producir poblaciones celulares enriquecidas con células progenitoras hematopoyéticas.
Los sistemas de cultivo celular contemplados en el presente documento, pueden ser modulares, ya que pueden incorporar componentes adicionales que alteran las poblaciones celulares resultantes derivadas del sistema. Por ejemplo, el sistema de cultivo celular puede incorporar medios que son sin xenógenos para ciertos resultados deseados. Sin embargo, pueden incluir medios que contengan xenógenos si, por ejemplo, no se prevén terapias clínicas para las poblaciones de células derivadas. Además, los sistemas de cultivo celular pueden basarse en recipientes de cultivo de diversos tamaños, como se conoce en la técnica, para llegar a la producción en escala de la población celular deseada.
En algunos casos, se puede sustituir algunos de los componentes de un medio IF9S. Por ejemplo, el ácido ascórbico y el monotioglicerol pueden reemplazarse por un complemento opcional de un compuesto y/o un compuesto que contiene tiol con propiedades antioxidantes. GLUTAMAX ™ puede reemplazarse por un complemento opcional de L-glutamina. "Los aminoácidos no esenciales (NEAA)," que es un término general para los aminoácidos que puede producir el cuerpo humano a partir de otros aminoácidos, pueden reemplazarse por un complemento opcional de aminoácidos. "El concentrado lipídico definido químicamente," que es una solución distribuida específicamente por Life Technologies, puede reemplazarse por un complemento opcional de lípidos. El selenito, la insulina y la holotransferrina adicionales se pueden reemplazar por cualquier complemento de ITS. ITS significa "Insulina-T ransferrina-Selenito". Algunas compañías (por ejemplo, Life Technologies), venden soluciones de ITS para utilizarse como complementos en otros medios basales (DMEM, por ejemplo). Sin embargo, el fabricante no proporciona concentraciones para cada componente. El alcohol polivinílico se puede reemplazar por un complemento opcional de un compuesto espesante de medios biológicamente inactivo.
Los siguientes ejemplos exponen materiales y métodos preferidos para la realización de la invención. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y nada en el presente documento debe tomarse como una limitación del alcance general de la invención.
EJEMPLOS de referencia
Ejemplo 1 Los medios basados en IMDM/F12 mejoran significativamente la eficacia de la diferenciación de las hPSC en linaje hematoendotelial
Anteriormente, el laboratorio de los presentes inventores desarrolló un protocolo para la diferenciación eficaz de la diferenciación de hPSC hematopoyética utilizando un método de cocultivo sobre la línea celular del estroma de ratón, OP9.913 Aunque el sistema OP9 soporta la generación eficaz de HE y progenitores hematopoyéticos multilinaje (Fig. 1), este sistema es muy sensible a las variaciones en la calidad del suero, el mantenimiento de las células del estroma y el tamaño de las colonias de hPSC y de los grupos utilizados para la diferenciación.1314 La formación de cuerpos embrioides (EB) es otro enfoque comúnmente utilizado para inducir la formación de HE y sangre a partir de hPSC.7516 Sin embargo, los métodos de EB a menudo dependen del suero o de un medio no definido y también tienen inconvenientes importantes, tal como la diferenciación asíncrona, la alta variabilidad y la dependencia del tamaño inicial del grupo. Adicionalmente, la inconsistencia en la calidad de las hPSC debido a las variaciones en los lotes de albúmina utilizados para el mantenimiento de las hPSC puede introducir variaciones en la eficacia de la producción de sangre.
Para superar estas limitaciones, se decidió identificar el medio químicamente definido y las proteínas de la matriz capaces de soportar la diferenciación hematoendotelial sin suero de la suspensión de células sueltas de células madre embrionarias humanas H1 (hESC) expandidas en medio E8 sin xenógenos completamente definido sobre vitronectina (VTN) 17.
Métodos
Mantenimiento de Células Madre Pluripotentes Humanas
Se mantuvieron células madre pluripotentes humanas (hESC HI y H9, iPSC 19-9-7T derivadas de fibroblastos e iPSC BM119-9 derivadas de células mononucleares de médula ósea) sobre vitronectina o matrigel en medios E8 producidos internamente complementados con FGF2 y TGFp ( Peprotech). Las células se pasaron cuando alcanzaron una confluencia del 80% utilizando EDTA 0,5 mM en p Bs . Las células se mantuvieron en condiciones normóxicas con 5% de CO2.
Diferenciación de Células Madre Pluripotentes Humanas
Las células madre pluripotentes humanas se separaron de la vitronectina o matrigel cuando alcanzaron una confluencia del 80% utilizando 1x TrypLE (Life Technologies) y se sembraron en placas a una densidad optimizada que oscila entre 5000 células/cm2 y 15.000 células/cm2, dependiendo de la línea celular sobre placas de 6 pocillos recubiertas con 0,5 pg/cm2 de CollV (Sigma-Aldrich) o 0,5 pg/cm2 de Tenascina-C (Millipore) en medios E8 complementados con inhibidor de Rho quinasa 10 pM (Tocris Y-27632). Después de 24 horas (día 0), los medios se cambiaron a medios IF9S complementados con 50 ng/ml de BMP4 (Peprotech), 15 ng/ml de Activina A (Peprotech), 50 ng/ml de FGF2 (Miltenyi Biotech), LiCl 2 nM (Sigma), y en ocasiones, inhibidor de Rho quinasa 1 pM para aumentar la viabilidad celular. En el día 2, los medios se cambiaron a medios IF9S complementados con 50 ng/ml de FGF2 y 50 ng/ml de VEGF y SB-431542 10 pM (Tocris) cuando se menciona. En el día 4, los medios se cambiaron a medios IF9S complementados con 50 ng/ml de FGF2, VEGF, TPO, SCF, IL-6 y 10 ng/ml de IL-3. En el día 6, se añadieron medios IF9S adicionales complementados con los mismos 6 factores a los cultivos sin aspirar los medios antiguos (Tabla 3). IF9S (IMDM /F12 con 9 complementos) se realizó internamente con lo siguiente: 50% de IMDM 50% de F12 (Life Technologies) complementado con 64 mg/l de Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, (Sigma-Aldrich), 40ul/l de monotioglicerol (Sigma-Aldrich), 8,4 pg/l de selenito de sodio adicional (Sigma-Aldrich), 10 mg/l de alcohol polivinílico (Sigma-Aldrich), 1x glutamax (Life Technologies), 1x de aminoácidos no esenciales (Life Technologies), 0,1x concentrado lipídico definido químicamente (Life Technologies), 10,6 mg/l de Holo-Transferrina (Sigma-Aldrich y 20 mg/l de Insulina (Sigma-Aldrich) (Tabla 2). La diferenciación se realizó en condiciones hipóxicas desde el día 0 hasta el día 5, y se cambió a condiciones normóxicas desde el día 6 hasta el día 9 (Fig. 1). El 1x TrypLE se usó para disociar y recoger células para el análisis.
Ensayo con Mesenquimoblastos (MB) y Hemangioblastos (HB)
Los MB y HB se detectaron utilizando un medio CFC sin suero complementado con un ensayo de FGF2 como se describe anteriormente11. Los cultivos del día 2 o 3 se disociaron y se prepararon en una suspensión de células sueltas utilizando 1x TrypLE (Life Technologies) y se sembraron en placas 5.000 células del cultivo total en el medio CFC. Las colonias de MB y HB se puntuaron 12 días después de sembrar en placas la suspensión de células sueltas.
Ensayo con CFC hematopoyéticas.
Se detectaron CFC hematopoyéticas utilizando H4436 Methocult™ que contenía suero complementado con SCF humano recombinante, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6 y EPO (Stem Cell Technologies). El potencial hematopoyético de los AHP se evaluó utilizando methocult SF H4236 sin suero con FGF2 (20 ng/ml), SCF (20 ng/ml), IL3 (10 ng/ml), IL6 (10 ng/ml) y EPO (2U/ml) añadidos (Stem Cell Technologies) como se describe anteriormente6. Se sembraron en placas 1000-10000 células diferenciadas en el medio CFC y se puntuaron las colonias después de 14 días de cultivo.
Citometría de Flujo y FACS
La citometría de flujo se realizó utilizando el citómetro de flujo FACSCalibur y los siguientes anticuerpos: CD31-FITC (clon WM59), CD34-FITC (8G12), CD41a-FITC/APC (clon HIP8), CD43-FITC/PE/ APC (clon 1G10), CD45-APC (clon HI30), CD73-FITC/PE(clon AD2), CD144-FITC/PE/AlexaFluor647 (clon 55-7H1), CD235a-FITC/PE/APC (clon GA-R2), KDR-PE/AlexaFluor647 (clon 89106), PDGFRa-PE (clon aR1) (BD Biosciences), TRA-1-85-FITC/PE (clon TRA-1-85) y APLNR-APC (clon 72133) (R&D Systems). La clasificación se realizó en un FACSAria, como se describe anteriormente 46. La pureza de las poblaciones aisladas fue del 92-95%.
Cultivo secundario de hPSC diferenciadas sobre OP9
Las células OP9 se mantuvieron en a-MEM (Gibco) complementado con FBS al 20% (Hyclone) como se describe anteriormente.10 Los cultivos clasificados del día 4 o día 5 se sembraron en placa sobre una capa confluente de células OP9 en a-MEM (Gibco) complementado con FBS al 10% (Hyclone) complementado con MTG 100 pM, 50 pg/ml de ácido ascórbico, 50 ng/ml de CFS, TPO, IL-6 y 10 ng/ml de IL-3 a una densidad de 5.000 células/pocillo de una placa de 6 pocillos como se describe anteriormente6. Los cultivos se prepararon para citometría de flujo de 4 a 7 días más tarde mediante la recogida de células flotantes y la disociación de los cultivos completos utilizando 1x TrypLE.
Diferenciación de linfocitos T de los cultivos del día 9
El laboratorio de los presentes inventores estableció una línea celular OP9 (OP9-DLL4) que expresaba constitutivamente el ligando 4 similar a delta humano (DLL4) utilizando un lentivirus y se mantuvo de manera similar a OP9. Después de que las células madre pluripotentes humanas se diferenciaran durante 9 días, se recogieron las células flotantes, se filtraron a través de un filtro de células de 70 pm (BD Biosciences) y se lavaron. A continuación, se resuspendieron en medios de diferenciación de linfocitos T que consistían en a-MEM (Gibco) complementado con FBS al 20% (Hyclone) complementado con IL7 (5 ng/ml), Flt3L (5 ng/ml) y SCF (10 ng/ml). A continuación, se sembraron en placas sobre una OP9-DLL4 y se cultivaron a 37 ° C y CO2 al 5%. Después de 4 días, las células se recolectaron utilizando solución de colagenasa IV (Gibco) (1 mg/ml en DMEM/F12, Gibco) y 1x TrypLE (Invitrogen), y se pasaron a una capa nueva de OP9-DLL4. Después de 3 días, se pasaron de nuevo las células. Los pasajes posteriores se realizan cada 7 días hasta 4 semanas, después de lo cual las células flotantes se recogen para análisis de flujo y extracción de ADN genómico para el ensayo de reordenamiento de TCR.
Ensayo de reordenamiento de TCR
El ADN genómico se aisló usando Quick-gDNA MiniPrep (Zymo Research). La capacidad de clonación de TCRp y TCRy se detectó utilizando un kit de amplificación por PCR (Invivoscribe) y ADN polimerasa AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) como se describe anteriormente33. Los productos de la PCR se analizaron utilizando análisis heterodúplex en un gel de poliacrilamida al 6% teñido con bromuro de etidio.
Análisis de micromatrices de líneas celulares del estroma de ratón
Se obtuvo una línea celular del estroma de médula ósea de ratón, OP9, del Dr. Toru Nakano (Instituto de Investigación de Enfermedades Microbianas, Universidad de Osaka, Japón), se obtuvo S17 del Dr. Kenneth Dorshkind (Universidad de California, Los Ángeles) y se obtuvo MS-5 de la Colección Alemana de Cultivos Tisulares. Las líneas de células del estroma se cultivaron como se describe9. El ARN libre de ADN se aisló utilizando ARN y DNasa RiboPure ™ utilizando reactivos sin ADN TURBO ™ (Ambion). Todas las muestras se procesaron en el Centro de Expresión Genética del Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, Madison y se analizaron utilizando matrices convencionales de matriz A4543-00-01 MM860mer expr Mus musculus 1-Plex fabricadas por NimbleGen Systems (Madison, WI). Los datos sin procesar de la expresión génica se extrajeron utilizando el software NimbleScan v2.1. Teniendo en cuenta que la distribución de señales de la muestra de ARN es distinta de la de la muestra de ADNg, las intensidades de señal de los canales de ARN en las ocho matrices se normalizaron con un algoritmo de análisis robusto de múltiples chips (RMA)47. Por separado, se realizó el mismo procedimiento de normalización en aquellas de las muestras de ADNg. Para un gen dado, se calculó, a continuación, la relación de mediana ajustada entre su intensidad normalizada del canal de ARN y la del canal de ADNg de la siguiente manera: Relación = intensidad del canal de ARN/(intensidad del canal de ADNg intensidad media de todos los genes del canal de ADNg). Los genes con más de 3 veces las diferencias en la expresión se consideraron expresados diferencialmente. Sólo los genes con nivel de expresión> 1 se seleccionaron para el análisis.
Resultados
El medio basado en IMDM/F12 mejora significativamente la eficacia de diferenciación de las hPSC en linaje hematoendotelial
Se sembraron hESC en placas como células sueltas y se permitió que se unieran durante 24 horas en medios E8 complementados con un inhibidor de la Rho quinasa 10 pM sobre Matrigel (MTG), VTN o Colágeno IV (ColIV). A continuación, los medios se cambiaron a uno de los tres medios basales libres de proteínas animales, o TeSR1 libre de factores de crecimiento, complementados con factores recombinantes humanos BMP4, FGF2 y VEGF que se utilizan comúnmente para inducir la formación de sangre a partir de hPSC1819. Después de 4 días de diferenciación, se evaluaron los cultivos celulares para determinar la presencia de células KDRhiCD31 que están altamente enriquecidas en progenitores hematoendoteliales6. El análisis de citometría de flujo mostró que las células diferenciadas sobre placas recubiertas con ColIV en medios IMDM/F12 complementados con Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 8,4 pg/l de selenito de sodio adicional, Holo-Transferrina, e insulina se diferenciaron más eficazmente en precursores hematoendoteliales KDRhiCD31 (Fig. 8). Posteriormente, encontramos que la adición de alcohol polivinílico, NEAA, Glutamax, concentrado lipídico definido químicamente y monotioglicerol incrementó la viabilidad celular y la eficacia de diferenciación (datos no mostrados). Los medios basales posteriores se denominan IF9S (IMDM/F12 más 9 complementos). Estos resultados demostraron que los medios y complementos seleccionados hicieron posible obtener células hematoendoteliales en condiciones químicamente definidas, sin xenógenos, sobre la matriz de ColIV a partir de hPSC mantenidas en medios E8.
Ejemplo 2 El análisis de una firma molecular única de células del estroma que soportan la hematopoyesis identificó a Tenascina C como una matriz extracelular que promueve el desarrollo y mantenimiento de los precursores hematopoyéticos.
Anteriormente, se demostró que OP9 es superior a otras líneas celulares del estroma como S17 y MS5 en la inducción de diferenciación hematopoyética9. También se encontró que los cultivos de OP9 crecidas en exceso en el día 8 son superiores a las OP9 recién confluentes en el día 4 en la inducción de CFC hematopoyéticas, incluyendo GEMM-CFC9 multipotenciales. Dado que la confluencia de las células del estroma afecta a la eficacia de diferenciación, esto condujo a creer que existe una matriz extracelular que influye en la diferenciación hematoendotelial. Con el fin de encontrar la(s) proteína(s) de la matriz crítica(s) para la actividad de apoyo a la hematopoyesis de OP9, se realizó una caracterización molecular de las líneas de células del estroma S17 y MS5 con bajo potencial inductor de hematopoyesis y de las células OP9. Además, se compararon OP9 crecidas en exceso (día 8) con monocapas de OP9 (día 4) recién confluentes. El análisis del transcriptoma reveló 21 genes expresados diferencialmente en las células OP9 crecidas en exceso en el día 8 en comparación con todas las demás células del estroma (Fig. 2a). Estos incluyen genes que codifican Ptn (pleiotrofina), un regulador secretado de la expansión y regeneración de HSC, 20 Rspo3 (R-espondina 3), un importante regulador de la señalización Wnt y desarrollo de angioblastos 21, y una proteína de matriz extracelular Postn (periostina) requerida para linfopoyesis de linfocitos B, 22 De forma interesante, un gen que mostró el cambio de expresión más significativo en las OP9 con exceso de confluencia fue Tnc (Tenascina C) (Fig. 2b). TenC se expresa en células mesenquimales subyacentes a grupos hematopoyéticos en la región Aorta-Gonada-Mesonefros (AGM) y se requiere para la hematopoyesis intraembronaria y postnatal 23'25. T ambién se expresa en el nicho de células madre de la médula ósea25. Debido a estas propiedades únicas, se probó si TenC podía soportar la diferenciación hematopoyética más eficazmente que ColIV.
Ejemplo 3 El tratamiento dependiente del tiempo y la dosis de FGF2, BMP4, Activina A, LiCl y VEGF induce estadios de desarrollo mesodérmico, endotelial y hematopoyético
Los estudios anteriores de los presentes inventores identificaron distintos estadios del desarrollo hematoendotelial después de la diferenciación de hPSC en cocultivo con OP9 (Fig. 1) 69-1126. La siembra en placas de hPSC en células del estroma OP9 induce la formación de la línea primitiva y células mesodérmicas que pueden detectarse en función de la expresión del receptor de apelina (APLNR) y k Dr (VEGFR2) 11 y la falta de expresión de marcadores Endoteliales (CD31, CD144 (VE-cadherina)), endoteliales/mesenquimales(CD73, CD105) y hematopoyéticos (CD43, CD45), es decir, por el fenotipo EMHlin-. Las primeras células mesodérmicas KDR+ que aparecen en el cocultivo con OP9 en el día 2 de diferenciación expresan (EMHlin'KDR+APLNR+PDGFRalfa+ en lo sucesivo denominadas células A+P+). Estas células presentan potencial de mesenquimoangioblasto (MB), es decir, capacidad para formar colonias tanto con potencial de células madre mesenquimales (MSC) como vascular. En el día 3 de diferenciación, las células A+P+ adquieren potencial de blasto (BL)-CFC o de hemangioblasto (HB) 11. Tanto el potencial de MB como el de HB pueden detectarse utilizando un ensayo de formación de colonias en un medio clonogénico sin suero complementado con FGF211. Con la maduración avanzada, las células mesodérmicas pierden la actividad de BL-CFC y regulan positivamente la expresión de KDR y regulan negativamente PDGFRalfa, es decir, adquieren el fenotipo de progenitor hematovascular (HVMP) KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/' que se enriquece en células con el potencial de formar grupos hematoendoteliales sobre OP96 El estadio endotelial de desarrollo se define por la expresión del marcador específico endotelial VE-cadherina (CD144). Las primeras células VE-Cadherina+ (CD144+) surgen a partir de las células mesodérmicas KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/' en el día 4 de diferenciación. Las células VE-cadherina+ (CD144+) que surgen representan una población heterogénea que incluye progenitores endoteliales no hemogénicos (no-HEP) CD43-CD73+ (CD144+CD43-CD73+) y progenitores endoteliales hemogénicos (HEP) CD43-CD73-(CD144+CD43+CD73-) 6. Los HEP carecen de potencial de CFC hematopoyéticas, pero lo adquieren después del cultivo con células del estroma. El estadio hematopoyético de desarrollo se define por la expresión del marcador específico hematopoyético CD43 610. Las primeras células CD43+ surgen dentro de las células VE-cadherina+ (CD144+) en el día 4-5 de diferenciación. Estas células expresan CD43 de bajo nivel y coexpresan CD235a, pero carecen de expresión de CD41a, es decir, tenían el fenotipo CD144+CD43/235a+41a- Debido a que estas células tienen capacidad para formar colonias hematopoyéticas en presencia de FGF2 y citoquinas hematopoyéticas, así como para hacer crecer células endoteliales sobre fibronectina, se denominaron progenitores hematopoyéticos angiogénicos (AHP). La primera célula CD41a aparece dentro de las células CD235a positivas. Las células CD235a+CD41a+ están altamente enriquecidas y son progenitores eritromegacariocíticos y carecen de potencial endotelial. Los progenitores con amplio potencial mielolfoide y fenotipo lin-CD34+CD43+CD45+/- pueden detectarse en cultivos de hPSC poco después de la aparición de células CD235a+CD41a+. La adquisición de la expresión de CD45 por células lin- se asocia con un compromiso mieloide progresivo. 10
Para reproducir el programa hematoendotelial observado en el cocultivo con OP9, se decidió seleccionar las combinaciones óptimas de morfógenos para la inducción del mesodermo y la especificación hematoendotelial y definir los factores de crecimiento específicos necesarios para la progresión gradual de diferenciación hacia HE y células sanguíneas en cultivos de hPSC (Fig. 1) diferenciados en condiciones químicamente definidas sobre ColIV y TenC. Durante el desarrollo embrionario, se ha encontrado que la señalización de BMP4, Wnt y TGFp/Nodal/Activina A es crítica para iniciar la formación de la línea primitiva y el desarrollo posterior del mesodermo 2728. Se ha demostrado que la activación de estas vías de señalización es esencial para inducir la expresión de braquiosis y KDR (Flk-1, VEGFR2), e iniciar el compromiso mesodérmico de las PSC de ratón y humanas 181929-32. Se ha encontrado que altas concentraciones de BMP4 (50 ng/ml) combinadas con bajas concentraciones de Activina A (15 ng/ml) y un complemento de LiCl (2 mM) indujeron de manera consistente la expresión de los marcadores de superficie mesodérmicos APLNR, KDR y PDGFRalfa después de 2 días de cultivo de suspensión de células sueltas de hESC sobre ColIV en condiciones químicamente definidas como se describe anteriormente. Sin embargo, estas condiciones soportaron mal la supervivencia celular y requirieron la adición de FGF2 y condiciones hipóxicas (5% de O2, 5% de CO2) para mejorar la viabilidad celular y el rendimiento de las células mesodérmicas. Las células mesodérmicas KDR+ del día 2 diferenciadas en estas condiciones expresaron APLNR y PDGFRalfa, es decir, se convirtieron en células APLNR+PDG-FRalfa+ y mostraron un potencial de formación de colonias de MB similar a las células mesodérmicas APLNR+PDGFRalfa+ obtenidas a partir de las hPSC del día 2 diferenciadas en el cocultivo con OP911 (Fig. 3). Después de 2 días de la dirferenciación, se encontró que solo se requiere FGF2 y VEGF para que el mesodermo APLNR+PDGFRalfa+ adquiera el potencial de HB en el día 3 de diferenciación y avance de la especificación del mesodermo hacia las HVMP caracterizadas por el aumento en la expresión de KDR y la disminución en la expresión de PDGFRalfa en las células APLNR+ (fenotipo (KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) en células mesodérmicas CD31- en el día 4 de diferenciación. El patrón de desarrollo fue similar en las células cultivadas sobre ColIV y TenC, sin embargo, el último produjo células APLNR+PDGFRalfa+ significativamente mayores, colonias de MB y de HB (Fig. 3a, 3c).
Las hESC diferenciadas del día 4 perdieron la capacidad de formar colonias de HB (Fig. 3c), sin embargo, estas células fueron capaces de formar agrupaciones hematoendoteliales cuando se clasificaron y se sembraron en placas sobre OP9 en aMEM complementado con FBS al 10%, SCF, TPO, IL6 e IL3. El potencial del grupo hematoendotelial se restringió a HVMP KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/'CD31' (Fig. 3d). Las células KDRloCD31" solo formaron grupos endoteliales casi sin actividad hemogénica (Fig. 3d), mientras que las células KDR no crecieron tanto en células endoteliales como en células sanguíneas (no se muestra). Esto también es consistente con la diferenciación en el cocultivo con OP9 6. El porcentaje de células HVMP KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/'fue consistentemente mayor en los cultivos con TenC (Fig. 3a).
Debido a que la formación de HVMP en cocultivos hPSC/OP9 se sigue de cerca por el desarrollo de HE y progenitores de sangre, los presenten inventores complementaron sus cultivos de los presentes inventores con SCF, TPO, y las citoquinas hematopoyéticas IL-6 e IL-3 además de VEGF y FGF2 a partir del día 4 de diferenciación. Aunque se notó que el tratamiento continuo de los cultivos con FGF2 y VEGF era suficiente para la inducción de progenitores endoteliales y la especificación hematopoyética, la adición de citoquinas hematopoyéticas fue esencial para aumentar la producción de estas células en cultivos químicamente definidos. En el día 5 de diferenciación en estas condiciones, surgieron los 3 subconjuntos principales de las poblaciones 6 de CD144+ identificados previamente: CD144+CD43-CD73+, CD144+CD43'CD73‘ y CD144+CD43/CD235a+CD41a- (Fig. 4). Cuando estos subconjuntos se clasificaron y se sembraron en placas en condiciones endoteliales, todos formaron una monocapa de células que expresan VE-cadherina con capacidad para captar AcLDL y formar tubos vasculares en el ensayo de formación de tubos, consistente con el cocultivo con OP9 (Fig. 4d). Sin embargo, el potencial de CFC hematopoyéticas se limitó principalmente a las células CD144+CD43/CD235a+CD41a- (Fig. 4c). De manera importante, similar al hallazgo con los subconjuntos CD144+ del día 5 generados en cocultivo con OP9, el potencial de CFC hematopoyéticas de las células CD144+CD43/CD235a+CD41a- se detectó solo en medio sin suero en presencia de FGF2 además de las citoquinas hematopoyéticas, indicando que estas células son esencialmente similares a AHP identificadas en el cultivo de hPSC/OP96 Anteriormente se definieron HEP como células CD144+CD43'CD73‘ que carecen de potencial de CFC hematopoyética, pero son capaces de adquirirlo después del cultivo sobre OP9. Para determinar si los CD144+CD43-CD73- se generaron en condiciones completamente definidas similares a los HEP inducidos por OP9, se clasificaron los subconjuntos CD144+ del día 5 y se cultivaron con OP9 como se describe anteriormente 6. En estas condiciones, los HEP formaron células tanto endoteliales como hematopoyéticas con un gran número de grupos de HE, mientras que los AHP formaron predominantemente células hematopoyéticas con pocas células endoteliales y grupos hematoendoteliales. Las células CD144+CD43-CD73+ formaron grupos endoteliales consistentes solamente con el fenotipo no-HEP (Fig. 4d). Los cultivos diferenciados sobre TenC tenían una mayor población de células CD144+ totales, aumentando, de este modo, la población de HEP, no-HEP y AHP en comparación con los cultivos diferenciados sobre ColIV (Fig. 4a, b).
Cuando se hicieron visibles numerosas células hematopoyéticas redondas flotantes en los cultivos en el día 6, no fueron necesarias las condiciones hipóxicas para sostener el desarrollo hematopoyético. Por lo tanto, a partir del día 6 de diferenciación, de los cultivos se transfirieron células a una incubadora normóxica (20% de O2, 5% de CO2). En el día 8 de diferenciación, los cultivos mostraron el desarrollo de un gran número de células hematopoyéticas CD43+ compuestos por células CD235a+CD41a+ enriquecidos en progenitores eritromegacariocíticos y células lin-CD43+CD45-/+ que expresaban CD34 (Fig. 5) y carecían de otros marcadores de linaje (no mostrado). Consistente con las células diferenciadas sobre OP9, el potencial de formación de colonias hematopoyéticas se limitó a las subpoblaciones CD43+ (Figura 5c). Los progenitores hematopoyéticos CD43+ se expandieron significativamente más sobre TenC en comparación con ColIV (Figura 5b). Además, el potencial GEMM-CFC de los cultivos sobre TenC fue significativamente mayor que en los cultivos sobre ColIV (Fig. 5d).
Aunque el protocolo de diferenciación se desarrolló inicialmente utilizando hESC H1, se encontró que las condiciones químicamente definidas descritas aquí también apoyan la formación de HE y sangre a partir de otras hESC (H9) y hiPSC generadas a partir de fibroblastos o células mononucleares de médula ósea (Fig.9). Anteriormente, se encontró que la hiPSC obtenida a través de la reprogramación de células mononucleares de sangre de cordón umbilical (CB hiPSC) se diferencia menos eficazmente en las células sanguíneas sobre OP9 alimentadoras en comparación con las hiPSC33 derivadas de fibroblastos (FB). Estos hallazgos se reprodujeron cuando se diferenciaron las iPSC de CB y FB sobre ColIV. Sin embargo, la diferenciación sobre TenC restauró el potencial de diferenciación hematopoyética de las hiPSC de CB al nivel observado con hESC y hiPSC de FB (Fig. 9), confirmando, de este modo, que TenC es superior a ColIV para promover la diferenciación hematopoyética de las hPSC.
Ejemplo 4 La Tenascina C apoya de forma única la especificación de progenitores de linfocitos T a partir de hPSC
Para averiguar si el sistema de cultivo de los presentes inventores apoya el establecimiento de un programa hematopoyético definitivo a partir de hPSC, se analizó el potencial de linfocitos T de las células sanguíneas generadas en el sistema de los presentes inventores como indicador de hematopoyesis definitiva7. Cuando se recogieron células flotantes CD43+ de los cultivos diferenciados del día 9, y se volvieron a sembrar en placas sobre células OP9 que expresan DLL-4 en a-MEM con FBS al 20%, Flt3L, IL-7 y SCF, los progenitores de linfocitos CD7+CD5+ comenzaron a emerger en la semana 2 de cocultivo secundario. En la semana 3, surgieron linfocitos T doble positivos CD4+CD8+ (Fig. 6a).
De forma interesante, las células CD43+ generadas sobre ambas matrices de CollV y TenC tenían la capacidad de generar progenitores de linfocitos CD5+CD7+. Sin embargo, la progresión hacia linfocitos T CD4+CD8+ se observó solamente en células CD43+ generados sobre T enC pero no sobre CollV. Para confirmar el desarrollo de los linfocitos T, analizamos el ADN genómico de estos cultivos para determinar la presencia de reordenamientos de TCR. Este análisis demostró la presencia de múltiples productos de PCR de reordenamientos aleatorios V-J y D-J en el locus y y múltiples reordenamientos V-J en el locus y indicativo de repertorio de linaje T policlonal (Fig. 6b y 6c). En general, estos hallazgos significan que la matriz extracelular de Tenascina C es esencial para apoyar la hematopoyesis definitiva en condiciones completamente definidas químicamente.
Ejemplo 5 La inhibición de TGF-B promueve la especificación hematoendotelial en condiciones químicamente definidas
Estudios recientes han demostrado que añadir inhibidores de TGF-p después de la especificación del mesodermo pero antes del desarrollo endotelial aumenta la diferenciación hematopoyética definitiva. Se encontró que cuando se añade SB-431542 10 pM, un inhibidor de TGFp potente pero no específico, desde el día 2 hasta el día 4, disminuye significativamente el desarrollo de células de mesodermo PDGFRalfa positivas en el día 3 y aumenta la diferenciación de CD31+ en el día 4. Después del día 4, ya no se añade SB-431542, pero el efecto del tratamiento de 2 días continúa aumentando la población de CD43+ en el día 9 (Fig. 7).
Durante la última década se han logrado avances significativos en la diferenciación hematopoyética a partir de hPSC. Se han desarrollado múltiples protocolos para la diferenciación hematopoyética y han hecho posible la producción rutinaria de células sanguíneas para la experimentación. Sin embargo, la generación de células sanguíneas con potencial de reconstitución a largo plazo, h Sc , a partir de hPSC sigue siendo un desafío importante. En el embrión, las células hematopoyéticas y las HSC surgen de un subconjunto específico del endotelio (HE) 1-5, por lo que la capacidad de examinar las vías de señalización que conducen a la especificación de HE y la transición a células sanguíneas en un entorno completamente definido químicamente es esencial para la identificación de los factores necesarios para la especificación de HSC y eventualmente el desarrollo de condiciones para la generación de HSC de novo. Aunque los protocolos originales para la diferenciación hematopoyética han empleado alimentadores y/o suero xenogénicos, se han descrito recientemente varios sistemas sin suero y sin alimentadores para la diferenciación hematopoyética 183435. Sin embargo, estos protocolos aún requieren componentes del suero (albúmina), y no está claro si estos protocolos reproducen distintas ondas de hematopoyesis, incluida la generación de HE con potencial linfomieloide definitivo, observadas en los sistemas de diferenciación originales. Más recientemente, Kennedy et al, 7 han desarrollado condiciones sin estroma y sin alimentadores para la diferenciación hematopoyética basada en EB de las hPSC y han mostrado que estas condiciones reproducían ondas primitivas y definitivas de hematopoyesis y generaban HE con potencial de linfocitos T. Sin embargo, este protocolo utiliza hPSC que crecen sobre m Ef para la diferenciación hematopoyética basada en EB en un medio patentado con un contenido de proteínas químicas y humanas no divulgadas. En la presente invención se desarrolló por primera vez un protocolo que permite la producción eficiente de células sanguíneas en condiciones completamente definidas químicamente, sin proteínas séricas y xenogénicas a partir de una suspensión de hPSC de células sueltas mantenidas en medio E8 químicamente definido 12 Este protocolo elimina la variabilidad asociada con las albúminas de origen animal y humano, la matriz xenogénica, el tamaño de los grupos y la diferenciación asíncrona observada en el sistema de EB y reproduce las ondas típicas de hematopoyesis, incluyendo la formación de HE y los progenitores hematopoyéticos definitivos, observadas en hPSC diferenciadas sobre OP9. De manera importante, basándose en la caracterización molecular de las líneas celulares OP9 y del estroma con diferente actividad inductora de hematopoyesis, se encontró que la proteína de la matriz de TenC expresada de forma única en OP9 con un fuerte potencial hematoinductor, promueve fuertemente el desarrollo hematoendotelial y de linfocitos T a partir de hPSC. TenC es una glucoproteína hexamérica unida por disulfuro que se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario. Aunque TenC desaparece principalmente en el organismo adulto, su expresión se regula positivamente durante la reparación de heridas, la neovascularización y la neoplasia.36 Resulta interesante que TenC se encuentra en la médula ósea adulta, donde se expresa predominantemente en la región endóstica 3738 y se encuentra regulada positivamente después de la mieloablación 25. La TenC apoya la proliferación de células hematopoyéticas de la médula ósea39 y la eritropoyesis 40 Los ratones deficientes en TenC tenían un potencial menor de CFC 24 de médula ósea, no pudieron reconstituir la hematopoyesis después de la ablación de la médula ósea y mostraron una capacidad reducida para apoyar el injerto de HSC de tipo silvestre 25 También se detectó un alto nivel de expresión de TenC en la región de la aorta-gónada-mesonefros humana y de pollo 2341, el sitio donde emergen las primeras HSC, y los sitios hematopoyéticos en el hígado fetal humano 42. Debido a que la expresión de TenC está altamente enriquecida en el mesénquima subaórtico justo por debajo de los grupos hematopoyéticos, se sugirió que TenC desempeña un papel fundamental en el desarrollo de HSC durante la embriogénesis 23. La TenC también participa en la regulación de la angiogénesis y de los progenitores endoteliales cardíacos 43 Los estudios de los presentes inventores demostraron las propiedades superiores de TenC en la promoción de la hematopoyesis a partir de hPSC. El efecto positivo de TenC fue obvio en todas las etapas de diferenciación e incluyó mejora del mesodermo hemogénico, HE y la producción de progenitores hematopoyéticos CD43+. De manera importante, la TenC fue capaz de apoyar el desarrollo de células hematopoyéticas definitivas con potencial de linfocitos T, mientras que no se puedo obtener dichas células en cultivos sobre ColIV. La molécula de TenC está compuesta por una región de oligomerización amino terminal seguida de repeticiones de heptadas, repeticiones tipo EGF y fibronectina tipo III y globo de fibrinógeno 36. La función de estos dominios está mal comprendida. Se cree que el efecto y la interacción de TenC con las células requiere la acción integrada de múltiples dominios 44, aunque se identificaron varios dominios mitogénicos únicos capaces de inducir una proliferación de células hematopoyéticas dentro de esta molécula 39 Se han identificado varios mecanismos de señalización implicados en la interacción celular con T enC, incluida la supresión de la señalización mediada por quinasa y Rho de la adhesión focal activada por fibronectina y la estimulación de la señalización Wnt (revisada en 45). Estudios adicionales dirigidos a identificar el mecanismo de acción de TenC sobre las hPSC y sus derivados hematopoyéticos serían útiles para comprender el papel de esta proteína de la matriz en el desarrollo hematopoyético.
En resumen, los hallazgos proporcionados en el presente documento identificaron proteínas de la matriz de TenC y condiciones completamente definidas químicamente sin suero/componentes séricos y proteínas animales capaces de apoyar la producción escalable de HE y células sanguíneas definitivas a partir de hPSC. Este sistema de diferenciación permite el examen preciso de las moléculas de señalización implicadas en la diferenciación hematopoyética y proporciona una plataforma para la producción de células sanguíneas con grado GMPc para aplicación clínica.
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina adecuado para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, en donde el medio de cultivo es adecuado para producir células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto, comprendiendo el medio de cultivo un medio base, Sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico 2-fosfato, monotioglicerol, selenito de sodio, alcohol polivinílico, Glutamax™, aminoácidos no esenciales (NEAA), concentrado lipídico definido químicamente, Holo-T ransferrina, insulina, BMP4, Activina A, FGF2 y LiCl, en donde el medio comprende:
aproximadamente 50 a aproximadamente 250 ng/ml de BMP4;
aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ng/ml de Activina A;
aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ml de FGF2; y
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mM de LiCl.
2. El medio de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente (a) citoquinas hematopoyéticas o (b)
aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ng/ml de SCF,
aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ng/ml de TPO,
aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ng/ml de IL-6, y
aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ng/ml de IL-3.
3. El medio de la reivindicación 1 o 2, en donde el medio comprende 64 mg/l de sal de Mg2+ de ácido L-ascórbico, 2-fosfato, 40 |jl/l de monotioglicerol, 8,4 jg /l de selenito de sodio adicional, 10 mg/l de alcohol polivinílico, 1x de GLUTAMAX, 1x de aminoácidos no esenciales, 0,1x concentrado lipídico definido químicamente, 10,6 mg/l de Holo-T ransferrina y 20 mg/l de insulina.
4. Una forma concentrada de los medios de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un sistema de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina para diferenciar células madre pluripotentes humanas en células progenitoras del mesodermo, endoteliales y hematopoyéticas, que comprende;
células madre pluripotentes humanas sembradas como una suspensión de células sueltas sobre un sustrato que comprende una capa de Tenascina C a una concentración de al menos aproximadamente 0,25 jg/cm 2 a aproximadamente 1 jg/cm 2; y
el medio de cultivo sin xenógenos y sin albúmina de la reivindicación 1.
6. Un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas, que comprende las etapas de:
(a) sembrar células madre pluripotentes humanas como una suspensión de células sueltas sobre un sustrato tratado con Tenascina C; y
(b) cultivar las células sembradas en el medio de cultivo sin xenógenos y sin albúmina de la reivindicación 1 en condiciones hipóxicas durante un período de aproximadamente dos días para obtener aproximadamente un 30% de células de mesodermo primitivo EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto.
7. El método de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente la etapa de cultivar las células EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ en estadio de mesodermo primitivo en el medio de cultivo sin xenógenos y sin albúmina de la reivindicación 3 en condiciones hipóxicas durante aproximadamente 1-2 días para obtener mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-CFC) y precursores mesodérmicos hematovasculares EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/' con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9.
8. Un método para producir mesenquimoangioblastos, que comprende las etapas de:
(a) sembrar células madre pluripotentes humanas sobre un sustrato tratado con una cantidad eficaz de colágeno; y
(b) exponer las células madre a una mezcla sin xenógenos y sin albúmina que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl en condiciones hipóxicas durante un período de aproximadamente dos días para formar una población de células de mesodermo primitivo EMHlin'KDR+APLNR+PDG-FRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto, en donde la concentración en el medio de cultivo celular, de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el colágeno comprende Colágeno IV.
10. Un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas que comprende:
(a) cultivar células madre pluripotentes humanas en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población celular de células de mesodermo primitivo EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto sin la formación de cuerpos embrioides o cocultivos con líneas celulares del estroma en donde la concentración en el medio de cultivo celular, de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM.
11. El método de la reivindicación 10, en donde las células madre pluripotentes humanas se cultivan sobre Tenascina C.
12. El método de la reivindicación 10 u 11, que comprende adicionalmente:
-la etapa (b) cultivar, en condiciones hipóxicas, la población celular obtenida en la etapa (a) en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGf durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprenda células de mesodermo primitivo EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-c Fc ) y de mesodermo hematovascular (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) enriquecido en células con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9; o - la etapa (b) definida anteriormente en donde la concentración, en el medio de cultivo celular, de VEGF es aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml.
13. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente:
-la etapa (b) cultivar, en condiciones hipóxicas, la población celular obtenida en la etapa (a) en un medio de cultivo celular que comprende FGF2 y VEGf durante un período de aproximadamente 1-2 días para obtener una población celular que comprenda células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de hemangioblasto (HB-c Fc ) y de mesodermo hematovascular (EMHlin'KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/') enriquecido en células con un potencial para formar grupos hematoendoteliales cuando se cultivan sobre células OP9 y la etapa (c) cultivar las células de mesodermo hematovascular de la etapa (b), en condiciones hipóxicas, en un medio de cultivo celular que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 durante aproximadamente un día para obtener una población celular que comprende células progenitoras endoteliales no hemogénicas (no HEP) CD144+CD73+CD235a/CD43‘, células progenitoras endoteliales hemogénicas (HEP) CD144+CD73-CD235a/CD43‘, células progenitoras hematopoyéticas angiogénicas (AHP) CD144+CD73 CD235a/CD43+41a_ y células progenitoras hematopoyéticas CD43+CD41a+;
- la etapa (b) definida anteriormente y la etapa (c) definida anteriormente en donde la concentración, en el medio de cultivo celular, de: y VEGF es aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; SCF es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; TPO es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml; IL-6 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml e IL-3 es aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml;
- la etapa (b) definida anteriormente, la etapa (c) definida anteriormente y la etapa (d) cultivar, en normoxia, los HEP y las células progenitoras hematopoyéticas en un medio de cultivo que comprende FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante aproximadamente tres días para obtener una población expandida de progenitores hematopoyéticos CD43+ que comprenden progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a/CD41a+ y progenitores hematopoyéticos multipotentes lin'CD34+CD43+CD45+/_; o
- las etapas (b) a (d) definidas anteriormente y que comprenden adicionalmente cocultivar la población expandida de progenitores hematopoyéticos CD34+CD43+ durante un período de aproximadamente tres semanas sobre células OP9 que sobreexpresan DLL4 para obtener una población celular que comprende linfocitos T doble positivos CD4+CD8+, en donde las células madre pluripotentes humanas de la etapa (a) se cultivan sobre un sustrato de Tenascina C.
14. Un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas, que comprende cultivar células madre pluripotentes humanas en condiciones hipóxicas en un medio de cultivo celular sin xenógenos y sin albúmina que comprende FGF2, BMP4, Activina A y LiCl durante un período de aproximadamente dos días para formar una población celular de células de mesodermo primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ con potencial de mesenquimoangioblasto sin la formación de cuerpos embrioides o cocultivos con líneas celulares del estroma, en donde la concentración en el medio de cultivo celular, de: BMP4 es aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml; Activina A es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml; FGF2 es aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml; y LiCl es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM.
15. Un sistema de cultivo celular definido para la diferenciación hematoendotelial de células madre pluripotentes humanas, que comprende el medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un sustrato de Tenascina C para el crecimiento adherente de células madre pluripotentes humanas o su progenie diferenciada a lo largo del linaje hematoendotelial.
16. El sistema de cultivo celular definido de la reivindicación 15, en donde el medio de cultivo se mantiene en condiciones hipóxicas.
17. El sistema de cultivo celular definido de la reivindicación 15 o 16 que comprende adicionalmente células madre pluripotentes humanas cultivadas sobre el sustrato de Tenascina C.
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