JP2020536529A - 食道組織および／または臓器組成物およびそれを作製する方法 - Google Patents

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Abstract

【解決手段】 本開示は、有向分化を通じて哺乳動物胚葉内胚葉（ＤＥ）細胞を特定の組織または器官に変換する方法に関する。特に、本開示は、分化した胚体内胚葉から形成される食道組織および／またはオルガノイドの形成に関する。【選択図】 １Ａ

Description

本出願は、２０１７年１０月１０日に提出されたジェームズ ウェルズの米国仮出願６２／５７０，１８２の優先権および利益を主張し、その内容はすべての目的のためにその全体が組み込まれる。
本発明は、米国政府の支援ＮＩＨ許可番号Ｐ０１ＨＤ０９３３６３を用いて行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
食道は、口腔および咽頭から胃への食物の通過を積極的に促進する。成層扁平上皮、筋肉層、およびストレッチを感知して蠕動を制御する腸神経系で構成される。食道閉鎖症などの先天性疾患は、管腔の狭窄または不連続をもたらす遺伝子変異によって引き起こされる。食道癌、好酸球性食道炎、アカラシアおよびその他の運動障害など、他の病気は晩年に食道に影響を与える。気管および食道の障害は人間に蔓延しており、マウスで正確にモデル化することは困難である。前述の病状の有病率にもかかわらず、マウスとヒトの食道との間の組織構造には実質的な違いがあるため、当技術分野では研究のためのヒトの食道組織モデルが必要である。本開示は、当技術分野における前述の必要性の１つまたは複数に対処する。
本開示は、有向分化を通じて哺乳動物胚葉内胚葉（ＤＥ）細胞を特定の組織または器官に変換する方法に関する。特に、本開示は、分化した胚体内胚葉から形成される食道組織および／またはオルガノイドの形成に関する。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するだろう。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
図１Ａ〜１Ｋ。前腸スフェロイド発達中にＷｎｔおよびレチノイン酸シグナル伝達を調節することにより前前腸運命を特定する。（１Ａ）Ｗｎｔ活性化の持続時間（カイロン−ｃｈｒ）を操作することにより、前軸スフェロイドを前後軸に沿ってパターン化する実験プロトコル。（１Ｂ−１Ｃ）（１Ｂ）前腸マーカーＳＯＸ２および中／後腸マーカーＣＤＸ２、および（１Ｃ）前部前腸（「ＡＦＧ」）マーカーＨＮＦ１Ｂ、および後部前腸マーカーＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６によって測定される前腸スフェロイドのパターン化におけるさまざまなカイロン治療期間のｑＰＣＲ分析。 （Ｄ−Ｅ）１日（１Ｄ）および３日（１Ｅ）のカイロンで処理された新生スフェロイド（６日目）のＨＮＦ１Ｂ、ＳＯＸ２、およびＣＴＮＮＢ１によるホールマウント免疫蛍光（「ＩＦ」）分析。 （１Ｆ）レチノイン酸（ＲＡ）を使用して前後軸に沿って前腸スフェロイドをパターン化する実験プロトコル。 （１Ｇ）ＳＯＸ２、ＴＰ６３（△Ｎアイソフォーム）、ＧＡＴＡ４、およびＰＤＸ１で測定された、３日齢の前腸スフェロイドに対するＲＡ治療期間の変化の影響。（１Ｈ）スフェロイドあたりのＳＯＸ２＋およびｐ６３＋上皮細胞の割合の定量化。スケールバー＝２５μｍ。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。 （１Ｊ−１Ｋ）未処理のスフェロイド（１Ｉ）、およびＲＡで１日（１Ｊ）または４日間（１Ｋ）処理されたスフェロイドにおける初期食道マーカーＳＯＸ２およびｐ６３のＩＦ分析。１ｌ−１、１Ｊ−１、および１Ｋ−１は、ｐ６３染色のみを示す（１Ｈ）スフェロイドあたりのＳＯＸ２＋およびｐ６３＋上皮細胞の割合の定量化。スケールバー＝２５μｍ。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。図８および図９Ａ〜Ｒも参照。 ２Ａ−２Ｉ．前部前腸スフェロイドは食道呼吸能力を持つ。（２Ａ）背腹軸に沿ってＡＦＧスフェロイドをパターン化するための実験プロトコルを示す概略図。（２Ｂ）マウスとカエルの胚のＡＦＧの背腹パターン形成を導く手がかりの現在の簡略化されたモデル。 （２Ｃ−２Ｇ）背側マーカーＳＯＸ２とＭＮＸ１（２Ｃ＋２Ｅ）を使用した、３日間のＮｏｇｇｉｎ、未処理（−ｃｔｒｌ）、またはカイロンとＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理された３日齢のスフェロイド（９日）のｑＰＣＲ分析、呼吸マーカーＮＫＸ２−１（２Ｄ）、ＴＰ６３の△Ｎスプライスバリアント（２Ｆ）、および重層扁平上皮マーカーＫＲＴ４（２Ｇ）。 （２Ｈ−２Ｉ）Ｎｏｇｇｉｎ（２Ｈ）対カイロン＋ＢＭＰ４（２Ｉ）で処理したスフェロイドにおけるＳＯＸ２、ＮＫＸ２−１、ＣＤＨ１、および核（ＤＡＰＩ）のＩＦ染色。スケールバー＝２５μｍ。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。図１０Ａ〜１０Ｊも参照。 図３Ａ〜３Ｙ．背側前腸スフェロイドは、食道マーカーを発現する重層扁平上皮で構成されるオルガノイドを形成する。（３Ａ）ＤＥのヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）への分化を示す略図。 （３Ｂ−３Ｆ）ＨＥＯへの新生スフェロイドの成長を描いた明視野画像。 （ＧＲ）Ｅ１７．５食道（Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｋ）と１および２か月前のＨＥＯ（３Ｈ−３Ｉ、３Ｋ−３Ｌ、３Ｎ−３Ｏ、３Ｑ−３Ｒ）の比較、ＩＦ分析転写因子Ｓｏｘ２およびｐ６３（３Ｇ−３Ｉ）、上皮マーカーＫｒｔ８対Ｋｒｔ１４（３Ｊ−３Ｏ）、および基底上マーカーＫｒｔ１３（３Ｐ−３Ｒ）。 （３Ｓ−３Ｖ）階層化された扁平上皮マーカーｐ６３、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、ＩＶＬ、ＣＲＮＮによるヒトの胃および腸のオルガノイド（ＨＧＯおよびＨＩＯ）および小児の食道生検と比較した、生後１ヶ月および２ヶ月の食道オルガノイドの同一性と成熟のｑＰＣＲ分析。 （３Ｗ）消化管のさまざまな生検と比較した２か月のＨＥＯの未スーパーバイズの階層的クラスタリング。 （３Ｘ）１か月前のＨＩＯ、ＨＧＯ、およびＨＥＯの主成分分析。 （３Ｙ）複製全体で平均化された、選択された遺伝子（食道、胃、腸）のｌｏｇ２変換正規化ＴＰＭ値のヒートマップ。ＳＳＥ＝重層扁平上皮；ｂ＝基礎；ｓｂ＝基底上。スケールバー＝５００μｍ（３Ｂ−３Ｆ）、５０μｍ（３Ｇ−３Ｌ）、１００μｍ（３Ｏ−３Ｒ）、２５μｍ（３Ｏ−１−３Ｒ−１）。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。図１１Ａ〜１１ＣＣも参照。 図４Ａ−４ＢＢ．ＨＥＯには、分化した重層扁平上皮を生じさせる前駆細胞が含まれる。（４Ａ−４Ｂ）７週間のＨＥＯを、ケラチノサイト由来のＨＥＯを使用して生成された器官型ラフトと比較したＨ&Ｅ染色。（４Ｃ−４Ｎ）転写因子ＳＯＸ２およびｐ６３（４Ｃ−４Ｄ）、基底マーカーＫＲＴ１４（４Ｅ−４Ｆ）、基底上ケラチンＫＲＴ４（４Ｇ−４Ｈ）およびＫＲＴ１３（４Ｉ−４Ｊ）のＩＦ分析による７週間ＨＥＯと器官型ラフトの比較、および分化マーカーＩＶＬ、ＣＲＮＮ、およびＦＬＧ（４Ｋ−４Ｎ）。 （４Ｃ−４Ｎ）転写因子ＳＯＸ２およびｐ６３（４Ｃ−４Ｄ）、基底マーカーＫＲＴ１４（４Ｅ−４Ｆ）、基底上ケラチンＫＲＴ４（４Ｇ−４Ｈ）およびＫＲＴ１３（４Ｉ）のＩＦ分析による７週間ＨＥＯと器官型ラフトの比較−４Ｊ）、および分化マーカーＩＶＬ、ＣＲＮＮ、およびＦＬＧ（４Ｋ−４Ｎ）。 （４Ｏ−４Ｕ）ＳＯＸ２およびＴＰ６３（４Ｏ）、ＫＲＴ５（４Ｐ）、ＫＲＴ１４（４Ｑ）、ＫＲＴ４およびＫＲＴ１３（４Ｒ）、ＩＶＬの食道生検、７週間のＨＥＯ、ＨＥＯ由来ケラチノサイト、および器官型ラフトのｑＰＣＲ分析（４Ｓ）、ＣＲＮＮ（４Ｔ）、および食道特異的マーカーＴＭＰＲＳＳ１１Ａ／Ｄ（４Ｕ）。 （４Ｖ）ＨＥＯでのＥｄＵパルス追跡標識実験のプロトコル。（４Ｗ−４Ｚ）ラベル付け後のさまざまな時点でのＨＥＯのＩＦ画像。 （４ＡＡ−４ＢＢ）Ｐ６３強度とＥｄＵ強度の２Ｄヒストグラムを使用したＩＦ画像の分析。（４ＡＡ）と、上皮ベースからの距離に対する総ＥｄＵ標識細胞の割合の１Ｄヒストグラム（４ＢＢ）。ｂ＝基礎、ｓｂ＝基底上。スケールバー＝５０μｍ（Ｃ−Ｎ）、１００μｍ（４Ａ−４Ｂ、４Ｓ−４Ｖ）。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。図１２Ａ〜１２Ｒも参照。 （４ＡＡ−４ＢＢ）Ｐ６３強度とＥｄＵ強度の２Ｄヒストグラムを使用したＩＦ画像の分析。（４ＡＡ）と、上皮ベースからの距離に対する総ＥｄＵ標識細胞の割合の１Ｄヒストグラム（４ＢＢ）。ｂ＝基礎、ｓｂ＝基底上。スケールバー＝５０μｍ（Ｃ−Ｎ）、１００μｍ（４Ａ−４Ｂ、４Ｓ−４Ｖ）。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。図１２Ａ〜１２Ｒも参照。 図５Ａ−５Ｌ。Ｓｏｘ２の初期の内胚葉性欠損は、マウスの食道形成不全を引き起こす。（５Ａ−５Ｄ）コントロール胚（Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）およびＳｏｘ２条件付き内胚葉ノックアウト胚（Ｓｏｘ２−ＤＥ−ＬＯＦ、ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲ；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）のＳｏｘ２およびＮｋｘ２−１のＩＦ分析。画像がマスクされるＥ９．５（５Ａ−５Ｂ）の胚切片とＥ１１．５（５Ｃ−５Ｄ）のホールマウントＩＦでは、内胚葉が強調表示される。 （５Ｅ−５Ｆ）Ｎｋｘ２−１（５Ｅ）およびｐ６３（５Ｆ）の全体マウント画像（５Ｃ−５Ｄ）に相対セクションが示されるセクションのＩＦ画像。インセットには、Ｓｏｘ２チャネル（左）と緑／右（Ｎｋｘ２−１またはｐ６３）チャネルのみが表示される。 （５Ｅ−５Ｆ）Ｎｋｘ２−１（５Ｅ）およびｐ６３（５Ｆ）の全体マウント画像（５Ｃ−５Ｄ）に相対セクションが示されているセクションのＩＦ画像。インセットには、Ｓｏｘ２チャネル（左）と緑／右（Ｎｋｘ２−１またはｐ６３）チャネルのみが表示される。 （５Ｇ−５Ｈ）８．５ｄｐｃで強制飼養された妊娠中のダムからのＥ１０．５ Ｓｏｘ２ ｃＫＯ（Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）胚における切断されたカスパーゼ３染色による細胞死の分析。ボックスで囲まれた領域は拡大されて（５Ｇ−１−５Ｈ−１）で示され、内胚葉は白で囲まれ、切断されたカスパーゼ３のみが表示する。 （５Ｉ−５Ｌ）９．５ｄｐｃで強制飼養された妊娠中のダムからのＥ１１．５マウスコントロールとＳｏｘ２ ｃＫＯ胚のＩＦ分析（Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）。（５Ｉおよび５Ｊ）側面および正面投影からの前腸のＮｋｘ２−１およびＦｏｘａ２のホールマウントＩＦ。（５Ｋおよび５Ｌ）Ｎｋｘ２−１（５Ｋ）およびｐ６３（５Ｊ）で染色され、黄色の矢印が変異食道を有するホールマウントＩＦプロジェクション（５Ｉ−５Ｊ）での相対位置に対応するＥ１１．５前腸のセクション。スケールバー＝すべてのＩＦセクションで５０μｍ、すべてのＩＦホールマウント投影で１００μｍ。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。ｆｇ＝前腸、ｄｆｇ＝背側前腸、ｖｆｇ＝腹側前腸、ｅｓｏ＝食道、ｔｒ＝気管、ｂｒ＝気管支、ｓｔ＝胃。図１３Ａ〜１３Ｆも参照。 図６Ａ〜６Ｔ．Ｓｏｘ２は呼吸の運命を抑制し、背（食道）系統を促進する。（６Ａ−６Ｆ）コントロールのｎｋｘ２−１（６Ａ、６Ｃ、６Ｅ）またはＳｏｘ２ ＭＯ注入（６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、Ｂｉｏ（ＧＳＫ３β阻害剤）およびＢｉｏ＋で処理されたステージＮＦ３５で分析されたアフリカツメガエル内胚葉外植片ＢＭＰ４。（６Ｇ）ヒト背側（Ｎｏｇｇｉｎ）および腹側（ＢＭＰ）ＡＦＧ培養を生成するための実験プロトコルを示す概略図。＋ＳＯＸ２はテット誘導性ＳＯＸ２を示し、−ＳＯＸ２はＳＯＸ２ ＣＲＩＳＰＲｉを示す。 （６Ｈ−６Ｎ）３日目から９日目にＤｏｘ誘導性ＣＲＩＳＰＲｉを使用した背部培養におけるＳＯＸ２ノックダウンの有無にかかわらず、背腹軸に沿ってパターン化された９日目のＡＦＧ培養の分析；（６Ｈ−６Ｋ）ＳＯＸ２およびＮＫＸ２−１の培養物のＩＦ染色および（６Ｌ）の定量化。 （６Ｍ−６Ｔ）これらのパターン化条件に応じたＳＯＸ２およびＮＫＸ２−１のｑＰＣＲ分析。 （６Ｏ−６Ｔ）８日目の腹部培養における外因性ＳＯＸ２のドキシサイクリン誘発発現および９日目の分析。（６Ｏ−６Ｒ）ＮＫＸ２−１およびＨＡ−ＳＯＸ２の培養物のＩＦ染色。（６Ｓ−６Ｔ）パターン条件に応じたＳＯＸ２およびＮＫＸ２−１のｑＰＣＲ分析。スケールバー＝ＩＦ画像の場合は５０μｍ、Ｘｅｎｏｐｕｓ外植片画像の場合は２００μｍ。詳細については、定量化と統計分析のセクションを参照。 図７Ａ〜７Ｌ．Ｓｏｘ２は、背側前腸内胚葉において、分泌されたＷｎｔアンタゴニストの発現とＷｎｔシグナル伝達活性を調節する。（７Ａ）９日目背側（＋Ｎｏｇｇｉｎ）または腹側（＋ＢＭＰ４）ＡＦＧカルチャー（＋ｄｏｘ）あり、ＳＯＸ２ ＣＲＩＳＰＲ干渉なし（ＣＲＩＳＰＲｉ）のＲＮＡシーケンスからの発現遺伝子のクラスター化ヒートマップ。 （７Ｂ）ＣＲＩＳＰＲｉによるＳＯＸ２ノックダウン後に上昇または減少する遺伝子と比較した、背側および腹側培養で上方制御された遺伝子のベン図分析。 （７Ｃ）ＳＯＸ２によって積極的に制御される遺伝子の生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語分析。 （７Ｄ）背側および腹側培養で濃縮された遺伝子の数、およびそれらの発現がＳＯＸ２依存性であったかどうか。 （７Ｅ）遺伝子オントロジー用語「Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節」の遺伝子セット濃縮分析。赤色はより高い発現を示し、青色は低い発現を示す。 （７Ｆ７Ｇ）（７Ｆ）コントロール（Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）および（７Ｇ）Ｓｏｘ２−ＤＥ−ＬＯＦ（ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲ；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）胚におけるＥ９．５マウス前腸のＷｎｔ応答遺伝子Ａｘｉｎ２のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。（７Ｈ−７Ｉ）（７Ｈ）コントロール（Ｓｏｘ２ｆｌ／＋）および（７Ｉ）８．５ｄｐｃで強制飼育されたダムから採取された（７Ｉ）Ｓｏｘ２ ｃＫＯ（Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）胚のＥ１０．５マウス胚前腸におけるＡｘｉｎ２のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。分析した胚の数が左上に表示される。ボックスで囲まれた領域（７Ｆ−７Ｉ）は、背側前腸領域を強調する。 （７Ｊ）ＳＯＸ２を外因的に発現させた、または伴わずに９日目の背側および腹側前腸培養物におけるＡＸＩＮ２のｑＰＣＲ分析。（７Ｋ）ＡＦＧ培養のＲＮＡ−ｓｅｑからのＷｎｔアンタゴニストＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、およびＤＫＫ１のＴＰＭ値のプロット。（７Ｌ）前腸前部の背腹パターン形成におけるＳｏｘ２の役割について提案されたモデル。スケールバー＝１００μｍ。詳細については、材料と方法および定量化と統計分析のセクションを参照。図１４Ａ〜１４Ｄも参照。 図８Ａ−８Ｖ．Ｗｎｔとレチノイン酸のシグナル伝達の持続時間を調節して、前後軸を横断する前腸のパターン形成を調整する。（８Ａ）ＣＨＩＲ９９０２１（カイロン、またはｃｈｒ）とレチノイン酸（ＲＡ）を使用して、前後軸に沿って前腸スフェロイドをパターン化する実験プロトコルを示す概略図。（８Ｂ−８Ｇ）レチノイン酸処理ありまたはなしでのカイロン処理の期間の変化から生じる６日目のスフェロイドのｑＰＣＲ分析、（Ｂ）前方および後方前腸マーカーＨＮＦ１Ｂ、（８Ｃ−８Ｄ）後方前腸マーカーＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６、（８Ｅ）後腸マーカーＣＤＸ２、（８Ｆ−８Ｇ）および咽頭マーカーＰＡＸ９およびＯＴＸ２。 （８Ｈ−８Ｎ）（８Ｈ）前腸マーカーＳＯＸ２、（８Ｉ）ＨＮＦ１Ｂ、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ６、およびＣＤＸ２のｑＰＣＲ分析による内胚葉に対するカイロンとＷｎｔ３ａ治療の比較、（８Ｊ）Ｗｎｔターゲット遺伝子ＡＸＩＮ２、ＬＥＦ１、およびＴＣＦ１、および（８Ｋ）上皮および神経マーカーＣＤＨ１およびＮＥＳＴＩＮ、各々。１日のカイロン処理で生成されたスフェロイドは、２日間のＷｎｔ３ａで生成されたものと同じ遺伝子発現プロファイルを持つ。 （８Ｌ−８Ｎ）Ｗｎｔ３ａ処理に対するカイロンから生じる新生スフェロイドの明視野イメージングは、スフェロイド生成の効率が異なる条件で影響を受けないことを示す。 （８Ｏ−８Ｒ）５日目から開始するレチノイン酸処理の期間を変更することから生じる９日目のスフェロイドの分析。 （８Ｓ）合成阻害剤ＤＥＡＢを使用してレチノイン酸シグナル伝達を変調するための実験プロトコルを示す概略図。（８Ｔ−８Ｕ）６日目の（８Ｔ）前腸マーカーのｑＰＣＲ分析、（８Ｕ）９日目の背側前腸マーカーＳＯＸ２およびＴＰ６３（△Ｎアイソフォーム）、および（８Ｖ）９日目のＲＡターゲットＨＯＸＡ１およびＨＯＸＢ１＝（８Ｌ−８Ｎ）でスケールバー＝５００μｍ、（８Ｐ−８Ｒ）で５０μｍ。エラーバーはＳＤを示す。両側ｔ検定の＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。 図９Ａ〜９Ｒ．Ｗｎｔとレチノイン酸シグナル伝達の初期の変調は、人間の食道オルガノイドへの後の分化に影響を与える。（９Ａ）カイロンで１日または３日間処理した前腸スフェロイドで始まるオルガノイドを生成するための実験プロトコルを示す概略図。（９Ｂ−９Ｃ）（９Ｂ）層状扁平上皮マーカーＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、およびＫＲＴ１３の３５日目（１か月前）オルガノイドのｑＰＣＲ分析、および（９Ｃ）後部前腸マーカーＧＡＴＡ４およびＰＤＸ１。（９Ｄ−９Ｏ）５日目から開始するレチノイン酸処理の期間を変更することで発生する、３５日目（１か月前）のオルガノイドの分析。（９Ｄ）前腸前部基礎転写因子ＳＯＸ２およびＴＰ６３の△ＮアイソフォームのｑＰＣＲ分析、（９Ｅ）幽門洞および膵臓マーカーＰＤＸ１、および（９Ｆ）重層扁平上皮マーカーＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、およびＩＶＬ。 （９Ｇ−９Ｉ）ＳＯＸ２およびｐ６３、（９Ｊ−９Ｌ）ＫＲＴ１３、および（９Ｍ−９Ｏ）ＰＤＸ１を使用した１か月前のオルガノイドの免疫蛍光分析。 （９Ｐ）合成阻害剤ＤＥＡＢを使用してレチノイン酸シグナル伝達を調節するための実験プロトコルを示す概略図。（９Ｑ−９Ｒ）（９Ｑ）食道基底マーカーＳＯＸ２およびＴＰ６３の３５日目のオルガノイドのｑＰＣＲ分析、（９Ｒ）層状扁平上皮マーカーＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、およびＩＶＬ。これらのデータは、各実験でｎ＝３ウェルの２つの個別の実験を表す。スケールバー＝１００μｍ。エラーバーはＳＤを示す。両側ｔ検定の＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。 図１０Ａ−１０Ｊ．ＴＧＦβ阻害は、これらの培養条件で前腸を前腸スフェロイドにパターン化する必要はない。（１０Ａ）前腸の前後パターン形成におけるＴＧＦβシグナル伝達の要件をテストするための実験プロトコルを示す概略図。（１０Ｂ−１０Ｆ）（１０Ｂ−１０Ｃ）前腸マーカーＳＯＸ２および後腸マーカーＣＤＸ２、（１０Ｄ）前腸マーカーＨＮＦ１Ｂ、および（１０Ｅ−１０Ｆ）後部前腸マーカーＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６のためのＷｎｔ３ａおよびＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２、１０μＭ）で処理した、または処理しない６日目の前腸スフェロイドのｑＰＣＲ分析。（１０Ｇ）呼吸誘導に応答するためにＷｎｔ３ａまたはＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２で処理した、または処理していない前腸スフェロイドの能力をテストするための実験プロトコルを示す概略図。 （Ｈ−Ｊ）（１０Ｈ−１０Ｉ）免疫蛍光および（１０Ｊ）ｑＰＣＲによるＮＫＸ２−１の９日目のスフェロイドの分析。スケールバー＝５０μｍ。エラーバーはＳＤを示す。両側ｔ検定の＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。 図１１Ａ−１１ＣＣ．人間の食道オルガノイドの堅牢な伸長とマウス胚性食道発生との比較。（１１Ａ−１１Ｅ）（Ａ−Ｄ）明視野イメージングと（１１Ｅ）画像の定量化によって分析された、６−１３日目からＦＧＦ１０で処理されたオルガノイドのスフェロイド成長効率の改善。 （１１Ｆ−１１Ｑ）Ｅ１２．５（１１Ｆ、１１Ｊ、１１Ｎ）およびＥ１４．５（１１Ｇ、１１Ｋ、１１Ｏ）のマウス胚性食道と２週間（１１Ｈ、１１Ｌ）のヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）の免疫蛍光染色による比較分析、１１Ｐ）と３週間（１１Ｉ、１１Ｍ、１１Ｑ）。 （Ｒ１１）マウス食道における層状扁平上皮マーカーの経時的遺伝子発現。ＧＥＯデータセットＧＳＥ３４７２８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）から取得した公開データ。 （１１Ｓ）層状扁平上皮マーカーの胚体内胚葉からヒト食道オルガノイドへの分化中のさまざまな時点のｑＰＣＲ分析。 （１１Ｔ）ＫＲＴ５とＫＲＴ１３に陽性の上皮の面積％に対する６２日目のＨＥＯの定量。各ポイントは個別のオルガノイドであり、サブパネル「ａ」および「ｂ」は、このグラフに示される異なるオルガノイドの代表的な画像である。 （１１Ｕ）ＳＯＸ２およびｐ６３に陽性の上皮核の割合に対する６２日目のＨＥＯの定量。各ポイントは個別のオルガノイドである。 （１１Ｖ−１１ＣＣ）食道濃縮マーカーＳＯＸ２とｐ６３（１１Ｖ−１１Ｙ）、およびＫＲＴ１３（１１Ｚ−１１ＣＣ）を調べて、テストしたさまざまな細胞株にわたる１か月前のＨＥＯの免疫蛍光分析。スケールバー＝（１１Ａ−１１Ｄ）で５００μｍ、（１１Ｆ−１１Ｑ、１１Ｖ−１１ＣＣ）で５０μｍ、（１１Ｔ−１１Ｕ）で１００μｍ。エラーバーはＳＤを示す。両側ｔ検定の＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１２Ａ−１２Ｒ。人間の食道オルガノイドの成熟と拡大の代替方法。（１２Ａ−１２Ｆ）免疫不全マウスの腎臓被膜への移植後２か月間成長したＨＥＯの（１２Ａ−１２Ｅ）初期（ＫＲＴ８）および分化した（ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＩＶＬ）食道特異的マーカーの免疫蛍光画像、および（１２Ｆ）Ｈ&Ｅ。 （１２Ａ−１２Ｆ）免疫不全マウスの腎臓被膜への移植後２か月間成長したＨＥＯの（１２Ａ−１２Ｅ）初期（ＫＲＴ８）および分化した（ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＩＶＬ）食道特異的マーカーの免疫蛍光画像、および（１２Ｆ）Ｈ&Ｅ。 （１２Ｇ−１２Ｒ）２回機械的に継代された（解離および再培養された）ＨＥＯの分析。（１２Ｇ−１２Ｎ）（１２Ｇ−１２Ｈ）転写因子ＳＯＸ２およびｐ６３の継代オルガノイドのＩＦ画像、（１２Ｉ−１２Ｊ）未成熟（ＫＲＴ８）および基底マーカー（ＫＲＴ１４）、（１２Ｋ−１２Ｌ）基底（ＫＲＴ５）および基底上（ＫＲＴ１３）マーカー、および（１２Ｍ−１２Ｎ）基底上分化マーカーＫＲＴ４、ＣＲＮＮ、およびＩＶＬ。 （１２Ｏ−１２Ｒ）（１２Ｏ）転写マーカーＳＯＸ２およびＴＰ６３、（１２Ｐ）層状扁平上皮マーカーＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、ＩＶＬ、および（１２Ｑ−１２Ｒ）肺のパターン化マーカー（ＮＫＸ２−１）、胃（ＧＡＴＡ４）、および腸（ＧＡＴＡ４およびＣＤＸ２）について、継代ＨＥＯを正常なＨＥＯおよび胃オルガノイド（ｈＡＧＯ）と比較するｑＰＣＲ分析。両側ｔ検定の＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１３Ａ〜１３Ｖ．原腸形成後の内胚葉性または広範なＳｏｘ２ノックアウトは、食道無形成の同様の表現型をもたらす。（１３Ａ−１３Ｂ）Ｅ９．５コントロール（Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）およびＳｏｘ２−ＤＥ−ＬＯＦ（ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲ；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）の背側マーカーＳｏｘ２（赤）、呼吸マーカーＮｋｘ２−１（緑）のホールマウント免疫蛍光（ＩＦ）分析胚。（１３Ｃ−１３Ｄ）Ｅ１０．５コントロール（Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）およびＳｏｘ２−ＤＥ−ＬＯＦ（ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲ；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ）胚におけるＳｏｘ２、Ｎｋｘ２−１のホールマウントＩＦ分析。白い矢印は、正常と異所性のＮｋｘ２−１発現を強調する。（１３Ｅ−１３Ｆ）頂端マーカーａＰＫＣ（緑）に関するＥ１１．５胚の前腸切片のＩＦ分析。 （Ｇ−Ｈ）Ｅ１１．５コントロール（Ｓｏｘ２ｆｌ／＋）およびＳｏｘ２−ｃＫＯ（Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）の胚の８．５ｄｐｃで強制飼養された胚から採取したＮｋｘ２−１のホールマウントＩＦ分析。（１３Ｉ−１３Ｌ）（１３Ｉ−１３Ｊ）Ｓｏｘ２とＮｋｘ２−１、および（１３Ｋ−１３Ｌ）Ｓｏｘ２とｐ６３のＥ１１．５胚（１３Ｅ−１３Ｆと同様）の免疫蛍光分析。 （１３Ｍ−１３Ｔ）Ｅ１０．５コントロール（Ｓｏｘ２ｆｌ／＋）およびＳｏｘ２−ｃＫＯ（Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）胚の８．５ｄｐｃで強制飼育された胚からの前部（１３Ｍ、１３Ｎ）から後部（１３Ｓ、１３Ｔ）軸。 （１３Ｓ、１３Ｔ）８．５ｄｐｃで強制飼育されたダムから採取されたコントロール（Ｃｒｅ−、Ｓｏｘ２ｆｌ／＋）およびＳｏｘ２ ｃＫＯ（Ｃｒｅ＋、Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）胚の背側および腹側前腸の分離点での細胞死に対するＥ１０．５マウス胚前腸の染色する（１３Ｕ）切断カスパーゼ３および（１３Ｖ）Ｋｉ６７ ＩＦの定量化。スケールバー＝（１３Ａ−１３Ｄ、１３Ｇ−１３Ｈ）では１００μｍ、（１３Ｉ−１３Ｔ）では５０μｍ、（１３Ｅ−１３Ｆ）では２５μｍ。Ｓｏｘ２−ＤＥ−ＬＯＦ胚の場合、Ｅ９．５での各遺伝子型のｎ＝３胚、Ｅ１１．５での各遺伝子型の各分析のｎ＝２胚（各分析と時点で最低２リットルが採取された）。Ｓｏｘ２駆動型Ｓｏｘ２ｃＫＯ胚の場合、各遺伝子型に対してｎ＝３胚。エラーバーはＳＤを示します。＊両側ｔ検定の場合、ｐは０．０５以下である。ｆｇ＝前腸、ｄｆｇ＝背側前腸、ｖｆｇ＝腹側前腸、ｐｈ＝咽頭内胚葉、ｅｓｏ＝食道、ｒ＝呼吸器前駆細胞、ｔｈｙ＝甲状腺、ｔｒ＝気管、ｂｒ＝気管支、ｓｔ＝胃。 図１４Ａ〜１４Ｄ．人間の文化におけるＳｏｘ２の機能の喪失または獲得の分析。（１４Ａ）ＳＯＸ２ありおよびなし（ＤＯＸ処理なしまたはＣＲＩＳＰＲ干渉構築物を活性化するため）の背腹軸に沿ってパターン化された、９日目の前腸前培養から生じるトランスクリプトームの主成分分析。背側対腹側前部前腸（ｄＡＦＧ対ｖＡＦＧ）は、それぞれｃｈｒ＋Ｎｏｇおよびｃｈｒ＋ＢＭＰ４として示される。ノックダウンは＋Ｄｏｘで示される。 （１４Ｂ）８日目のＤｏｘ処理による腹側培養での外因性ＨＡタグ付きＳＯＸ２の誘導を含む、ＳＯＸ２およびＮＫＸ２−１のＴＰＭ値。（１４Ｃ）背側（ｄＡＦＧ）と腹側（ｖＡＦＧ）軸に沿ってパターン化された、９日目の前腸前培養におけるＳＦＲＰ２のｑＰＣＲ分析。 （１４Ｄ）ＧＥＯデータセットＧＳＥ６１４７５（Ｔｓａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．、２０１５）のｈＰＳＣ由来内胚葉（ＧＳＭ１５０５７６４）および中内胚葉（ＧＳＭ１５０５７６７）のＳＦＲＰ２遺伝子座におけるＳｏｘ２ピークのゲノムブラウザービュー。スケールバー＝５００μｍ。エラーバーはＳＤを示す。＊両側ｔ検定の場合、ｐは０．０５以下である。 図１５Ａ〜１４Ｅ．前部前腸分離後の食道の発生におけるＳｏｘ２の役割。（１５Ａ）マウス育種およびタモキシフェン投与スキームの概略図。（１５Ｂ）Ｅ１４．５（左）、Ｅ１７．５（中央）、およびＰ７（右）１１．５ｄｐｃ（左）、１４．５ｄｐｃ（中央）、および子犬で強制飼養された妊娠中のダムの食道切片の共焦点免疫蛍光（ＩＦ）画像それぞれＰ１で強制給餌（右）。Ｅ−カドヘリンが上皮、Ｓｏｘ２、およびＮｋｘ２−１を視覚化して呼吸の同一性を確認できるように、切片を染色した。 （１５Ｃ）さまざまなマーカーについて１１．５ｄｐｃで強制投与された妊娠中のダムからのＥ１７．５食道のＩＦ画像：食道の同一性を確認するためのｐ６３およびＳｏｘ２、基底マーカーＫｒｔ１４、基底上マーカーＫｒｔ１３、未熟または円柱状マーカーＫｒｔ８、増殖マーカーＫｉ６７。右下の中央パネルにある緑色の矢印は、基底上Ｋｉ６７染色を示す。（１５Ｄ）Ｅ−カドヘリンの１１．５ｄｐｃで強制投与された妊娠中のダムからのＥ１７．５食道の高倍率ＩＦ画像。 （１５Ｅ）パターン化マーカーのために１１．５ｄｐｃで強制投与された妊娠中のダムからのＥ１７．５食道のＩＦ画像：腸マーカーＣｄｘ２、胃／腸マーカーＧａｔａ４およびＰｄｘ１、呼吸マーカーＮｋｘ２−１、および平滑筋マーカーＤｅｓｍｉｎ。黄色の矢印は、変異食道のまれなＮｋｘ２−１陽性細胞を示す。スケールバー＝（１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｅ）で１００μｍ、（１５Ｄ）で２５μｍ。 図１６Ａ〜１６Ｇ。ＨＥＯにおけるファンコニー貧血（ＦＡＮＣＡ喪失）の影響のモデリング。（１６Ａ）ＨＡＮを（＋ｄｏｘ）付きまたはＦＡＮＣＡなしで生成するための実験プロトコルを示す概略図。＊＊注：ヒドロキシ尿素（ＨＵ）は（１６Ｅ）のウエスタンブロット分析に使用される。（１６Ｂ）前腸マーカーＳＯＸ２（緑）と後腸マーカーＣＤＸ２（赤）で染色された６日目のＡＦＧ単層ＩＦ画像。 （１６Ｃ）オルガノイドの成長の０週目（６日目）、２週目（２０日目）、および４週目（３５日目）のドキシサイクリン処理ありまたはなしで成長させたＨＥＯの明視野画像。 （１６Ｄ）ＳＯＸ２および増殖マーカーＫＩ６７のＨＥＯのＩＦ画像。 （１６Ｅ）ＦＡＮＣＡおよびＦＡＮＣＤ２のウエスタンブロット分析による、ｄｏｘ誘導ＦＡＮＣＡタンパク質の発現および機能の確認。（１６Ｆ）明視野画像からの２週齢のＨＥＯのサイズ定量。（１６Ｇ）１か月（３６日目）の古いＨＥＯにおける増殖性（ＫＩ６７＋）上皮細胞の定量。スケールバー＝（１６Ｂ、１６Ｄ）では１００μｍ、（１６Ｃ）では２５０μｍ。マンホイットニーノンパラメトリック検定の＊ｐは０．０５以下、および＊＊ｐは０．０１以下である。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＡＦＧ＝前部前腸；ＨＥＯ＝ヒト食道オルガノイド。 図１７Ａ−１７Ｌ．ヒト前腸およびＨＥＯ培養におけるＣＤＸ２の誘導。（１７Ａ）前腸培養およびＨＥＯ培養においてＣＤＸ２を誘導する実験プロトコルを示す概略図。（１７Ｂ）ドキシサイクリンの投与時にＣＤＸ２を誘導する形質導入レンチウイルスベクターの略図。（１７Ｃ）前腸マーカーＳＯＸ２および後腸マーカーＣＤＸ２について、さまざまなレベルのドキシサイクリン（２０、１００、および５００ｎｇ／ｍＬ）で処理された６日目の前前腸単層のＩＦ分析。 （１７Ｄ＋１７Ｅ）ＳＯＸ２対ＣＤＸ２強度の（１７Ｄ）散布図によるＩＦ画像（１７Ｃと同様）の定量化。散布図内の縦線は、ＣＤＸ２＋対ＣＤＸ２−細胞を定義するための「ゲート」である。 （１７Ｅ）パーセントＣＤＸ２＋細胞の棒グラフ。（１７Ｆ）層状扁平上皮マーカーＳＯＸ２およびｐ６３、および後腸（誘導）マーカーＣＤＸ２について、ドキシサイクリンの有無にかかわらず処理された１か月のＨＥＯのＩＦ分析。（１７Ｇ−１７Ｌ）後腸マーカーのｑＰＣＲ分析（１７Ｇ）ＣＤＸ１、（１７Ｈ）ＣＤＸ２、（１７Ｉ）ＣＤＨ１７、（１７Ｊ）ＭＵＣ２、および前腸／層別扁平上皮マーカー（１７Ｋ）ＳＯＸ２および（１７Ｌ）ｐ６３。スケールバー＝１００μｍ。＊＊ｐは０．０１以下である、＊＊＊ｐは０．００１以下である、および＊＊＊＊ｐは０．０００１以下である。スチューデントのｔ検定では、両側分散は等しい分散を仮定していない。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＦＧ＝前菜；ＡＦＧ＝前部前腸；ＨＥＯ＝ヒト食道オルガノイド。 図１８Ａ−１８Ｉ．１８Ａ）ＨＥＯにおけるＣＤＸ２の後期誘導は、食道転写因子ＳＯＸ２およびｐ６３の抑制をもたらす。１８Ａ。より成熟したＨＥＯ（６〜７週齢）でＣＤＸ２を誘導する実験プロトコルを示す概略図。層状扁平上皮マーカーＳＯＸ２およびｐ６３および後腸マーカーＣＤＸ２のドキシサイクリン処理あり（＋ＣＤＸ２）ありまたはなしの５８日目のＨＥＯの１８Ｂ ＩＦ画像。 （１８Ｃ−１８Ｅ）（１８Ｃ）ＣＤＸ２、（１８Ｄ）ＳＯＸ２、および（１８Ｅ）ｐ６３の５８日目のＨＥＯのｑＰＣＲ分析。（１８Ｆ）ＣＤＸ２対ｐ６３強度のＨＥＯ基底上皮細胞の散布図によるＩＦ画像（１８Ｂなど）の分析。垂直線は、ｐ６３陰性（左）とｐ６３陽性（右）のセルを分割する。水平線は、ＣＤＸ２陰性（下）、ＣＤＸ２低（中央）、およびＣＤＸ２高（上）のセル（１８Ｇ−１８Ｉ）を分割する（１８Ｇおよび１８Ｆを参照）すべてのＣＤＸ２高およびＣＤＸ２−ｌｏｗ基底細胞（１８Ｈ）ＣＤＸ２−ｈｉｇｈおよびＣＤＸ２−ｌｏｗ基底細胞（ＳＯＸ２＋）、（１８Ｉ）ＣＤＸ２−ｈｉｇｈおよびＣＤＸ２−ｌｏｗ基底細胞（ｐ６３＋）。スケールバー＝１００ｕｍ。＊＊＊分散が等しいと仮定しない両側分布のスチューデントのｔ検定の場合、ｐは０．０００１である。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＡＦＧ＝前部前腸；ｄＡＦＧ＝背側前部前腸；ＨＥＯ＝人間の食道オルガノイド。 図１９Ａ−１９Ｈ．ＣＤＸ２誘発ＨＥＯにおける食道分化の喪失。（１９Ａ）ＨＥＯにおけるＮｏｔｃｈ阻害の有無にかかわらずＣＤＸ２を誘導する実験プロトコルの概略図。（１９Ｂ−１９Ｇ）層状扁平上皮マーカー（１９Ｂ）ＫＲＴ５、（１９Ｃ）ＫＲＴ１３、および（１９Ｄ）ＩＶＬ、（１９Ｅ）腸上皮マーカーＣＤＨ１７、（１９Ｆ）ＮｏｔｃｈターゲットＨＥＳ５、および（１９Ｇ）ＢＭＰターゲットＩＤ１のｄ５８ ＨＥＯのｑＰＣＲ分析。 （１９Ｂ−１９Ｇ）層状扁平上皮マーカー（１９Ｂ）ＫＲＴ５、（１９Ｃ）ＫＲＴ１３、および（１９Ｄ）ＩＶＬ、（１９Ｅ）腸上皮マーカーＣＤＨ１７、（１９Ｆ）ＮｏｔｃｈターゲットＨＥＳ５、および（１９Ｇ）ＢＭＰターゲットＩＤ１のｄ５８ ＨＥＯのｑＰＣＲ分析。（１９Ｈ）ＣＤＨ１７、ＫＲＴ５、およびＫＲＴ１３のドキシサイクリンおよびγ−セクレターゼ（Ｎｏｔｃｈ）阻害剤ＤＡＰＴで処理されたＨＥＯのＩＦ画像（最上行）；分化した層状扁平上皮マーカーＣＲＮＮおよびＩＶＬ（最下行）。スケールバー＝１００μｍ。＊ｐは０．０５以下である、＊＊ｐは０．０１以下であり、および＊＊＊ｐは０．００１以下である。スチューデントのｔ検定では、両側分散は等しい分散を想定していない。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＡＦＧ＝前部前腸；ｄＡＦＧ＝背側前部前腸；ＨＥＯ＝ヒト食道オルガノイド。 図２０Ａ−２０Ｈ．ＩＬ−１３で処理されたＨＥＯはＩＬ−１３標的遺伝子を上方制御し、増殖を増加させる。（２０Ａ）後期ＨＥＯのＩＬ−１３を治療するための実験プロトコルを示す概略図。（２０Ｂ−２０Ｅ）既知のＩＬ−１３ターゲット遺伝子（２０Ｂ）ＣＣＬ２６、（２０Ｃ）ＣＤＳ２６、（２０Ｄ）ＣＡＰＮ１４、および（２０Ｅ）ＳＥＲＰＩＮＢ４の収穫前に２日間ＩＬ−１３で処理された６２日目のＨＥＯのｑＰＣＲ分析。 （２０Ｆ）ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＣＤＨ２６、およびハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＳの収穫前に、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）で１週間処理した５０日目のＨＥＯのウエスタンブロット分析。（２０Ｇ）採取前に、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）で２週間、ＥｄＵ（１０ｕＭ）で２日間処理した６２日目のＨＥＯのＩＦ画像。（２０Ｈ）すべての基底ｐ６３細胞のＥｄＵ標識パーセントの（２０Ｇの）定量。ｑＰＣＲデータの場合、等分散を仮定しない両側分布のスチューデントのｔ検定の＊ｐは０．０５以下であり、および＊＊ｐは０．０１以下である。オルガノイドＥｄＵ取り込みの定量化の場合、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック検定で＊ｐは０．０５未満である。スケールバー＝１００ｕｍ。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＡＦＧ＝前部前腸；ＨＥＯ＝ヒト食道オルガノイド。 図２１Ａ−Ｌ．ＩＬ−１３で処理されたＨＥＯの分化障害と形態変化。（２１Ａ）収穫前に２週間ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理された６２日目のＨＥＯのＩＦ分析。（２１Ｂ）構造タンパク質および分化タンパク質を採取する前に、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）で１週間処理した５６日目のＨＥＯのウエスタンブロット分析。（２１Ｃ−２１Ｆ）（２１Ｃ）ＩＶＬ、（２１Ｄ）ＣＲＮＮ、およびＢＭＰアンタゴニスト（２１Ｅ）ＮＯＧと（２１Ｆ）の採取前に、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）で２週間処理された６２日目のＨＥＯのｑＰＣＲ分析ＦＳＴ。 （２１Ｇ）Ｈ&Ｅ染色（左の列）と電子顕微鏡写真（右の列）による固定の前に、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）で２週間処理した６２日目のＨＥＯの構造分析。（２１Ｈ−２１Ｌ）（１３Ｈ）ＳＯＸ２、（２１Ｉ）ＣＣＬ２６、（２１Ｊ）ＣＤＨ２６、（２１Ｋ）ヘッジホッグターゲットについて、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理された６２日目のＨＥＯのｑＰＣＲ分析ＰＴＣＨ１、および（２１Ｌ）ＢＭＰターゲットＩＤ３。スケールバー＝ＩＦおよびＨ&Ｅ画像の場合は１００μｍ、電子顕微鏡写真の場合は６μｍ。＊ｐは０．０５以下であり、＊＊ｐは０．０１以下であり、＊＊＊ｐは０．００１以下であり、および＊＊＊＊ｐは０．０００１以下である。スチューデントのｔ検定の場合、両側分散は等しい分散を仮定しない。 図２２Ａ−２２Ｈ。人間の腸のオルガノイド（ＨＩＯ）におけるＳＯＸ２誘導は、重層扁平上皮マーカーを上方制御する」。（２２Ａ）ＨＩＯにＳＯＸ２を誘導するための実験プロトコルを示す概略図。（２２Ｂ）ドキシサイクリンの投与時にＨＡタグ付きＳＯＸ２を誘導する形質導入レンチウイルスベクターの模式図（２２Ｃ）前腸マーカーＳＯＸ２および後腸マーカーＣＤＸ２（中）前腸のドキシサイクリンありまたはなしで処理した３６日目のＨＩＯのＩＦ画像マーカーｐ６３、胃／腸のマーカーＰＤＸ１、およびＨＡタグ。 （下）腸マーカーＣＤＨ１７および胃マーカーＣＬＤＮ１８（２２Ｄ−２２Ｈ）さまざまな地域マーカーのｑＰＣＲ分析（２２Ｄ）ＳＯＸ２、（２２Ｅ）ｐ６３、（２２Ｆ）ＰＤＸ１、および（２２Ｇ）ＣＤＸ２、および（２２Ｈ）基底上層化扁平上皮マーカーＫＲＴ１３。スケールバー＝１００ｕｍ。＊ｐは０．０５以下であり、＊＊ｐは０．０１以下であり、および＊＊＊＊ｐは０．０００１以下であり、等分散を仮定しない両側分布のスチューデントのｔ検定である。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＨＧ＝後腸；ＨＩＯ＝人間の腸のオルガノイド。 図２３Ａ〜２３Ｊ。ＨＥＯのＢＭＰ活性化は、増殖と分化の喪失をもたらす。（２３Ａ）後期ＨＥＯでＢＭＰシグナル伝達を活性化する実験プロトコルを示す概略図。（２３Ｂ）ＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍＬ）ありまたはなしで処理された６２日目のＨＥＯのＩＦ画像：（左）ｐＳＭＡＤ１／５／９およびＳＯＸ２、（中央）ｐ６３およびＥｄＵ、（右）ＩＶＬおよびＣＲＮＮ。 （２３Ｃ）ＢＭＰ４ありまたはなしのＨＥＯにおけるすべての基底の上皮細胞のラベルされたＥｄＵパーセントの定量化。（２３Ｄ−２３Ｊ）さまざまなマーカーに対する６２日目のＨＥＯのｑＰＣＲ分析：（Ｄ）ＳＯＸ２、（２３Ｅ）ｐ６３、（２３Ｆ）ＩＤ３、（２３Ｇ）ＫＲＴ５、（２３Ｈ）ＫＲＴ１３、（２３Ｉ）ＩＶＬ、および（２３Ｊ）ＣＲＮＮ。スケールバー＝１００μｍ。ｑＰＣＲデータの場合、スチューデントのｔ検定の＊ｐは０．０５以下であり、および＊＊＊＊ｐは０．０００１以下である。オルガノイドＥｄＵ取り込み定量化（２３Ｃ）の場合、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック検定で＊＊ｐは０．０１以下である。ＤＥ＝胚体内胚葉；ＡＦＧ＝前部前腸；ｄＡＦＧ＝背側前部前腸；ＨＥＯ＝ヒトー＝食道オルガノイド。
特に明記しない限り、用語は、当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に開示されている材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、１つ以上の用量および当業者に既知のその等価物への言及などを含む。
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば測定システムの制限に一部依存するだろう。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
用語「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」は、治療、観察および／または実験の対象である動物を指すために互換的に使用される。一般に、この用語はヒト患者を指すが、方法および組成物は、他の哺乳動物などの非ヒト対象にも等しく適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、用語はヒトを指す。さらなる実施形態では、これらの用語は子供を指す場合がある。
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉（ＤＥ）細胞」という用語は、原腸形成のプロセスによって産生される３つの一次胚葉のうちの１つを意味する。
本明細書で使用する場合、「ｗｎｔシグナル伝達経路」という用語はｗｎｔ／ベータ−カテニン経路を意味し、ベータ−カテニンタンパク質を介して作用するＷｎｔリガンドおよび縮れた細胞表面受容体によって媒介されるシグナル伝達経路である。
本明細書で使用する場合、「ｗｎｔ経路」などの経路に関して「活性化剤」という用語は、Ｗｎｔ／ベータ−カテニン標的が増加するようにＷｎｔ／ベータ−カテニン経路を活性化する物質を意味する。
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子」という用語は、ＦＧＦ標的が増加するようにＦＧＦ経路を活性化する物質を意味する。
本明細書で使用する場合、「ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤」という用語は、ＢＭＰ経路を妨害し、ＢＭＰ標的を減少させる物質である。
本明細書で使用される場合、「成長因子」という用語は、成長、増殖、形態形成または分化を含むがこれらに限定されない細胞プロセスを刺激することができる物質を意味する。
本明細書で使用される場合、マーカーの「安定した発現」という用語は、成長環境の改変によって変化しない発現を意味する。
本明細書で使用される場合、「全能性幹細胞」（全能性幹細胞としても知られる）という用語は、胚細胞型および胚外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子と精子細胞の融合から生成される。受精卵の最初の数分裂によって生成された細胞も全能性である。
本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、一般にＰＳ細胞としても知られ、ほぼすべての細胞、すなわち内胚葉（内部の胃の内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞に分化できる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、全能性細胞の子孫であるか、胚（胚性生殖細胞を含む）に由来するか、または特定の遺伝子の発現を強制することにより、成体の体細胞などの非多能性細胞の誘導を通じて得られる。
本明細書で使用される場合、用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、一般にｉＰＳ細胞とも略され、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することにより、成体の体細胞などの通常は非多能性の細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞のタイプを指す。
本明細書で使用する場合、「前駆細胞」という用語は、本明細書に記載の方法で使用できる任意の細胞を包含し、それによって１つまたは複数の前駆細胞がそれ自体を再生するかまたは１つまたは複数の特殊化した細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞（誘導または非誘導）、多能性幹細胞、単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、胚、幼児、子供、または成人に由来し得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド治療を介して多能性が付与されるような治療を受けやすい体細胞であり得る。
発生生物学では、細胞分化は、あまり特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、用語「指定分化」は、あまり特殊化されていない細胞が特定の特殊化された標的細胞型になるプロセスを表す。特殊化された標的細胞タイプの特異性は、初期細胞の運命を定義または変更するために使用できる任意の適用可能な方法によって決定され得る。例示的な方法には、遺伝子操作、化学的処理、タンパク質処理、および核酸処理が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「細胞構成要素」という用語は、例えば、個々の遺伝子、タンパク質、ｍＲＮＡ発現遺伝子、および／またはタンパク質修飾（例えば、リン酸化）の程度などの他の可変細胞成分またはタンパク質活性である。これは、通常、当業者によって生物学的実験（例えば、マイクロアレイまたは免疫組織化学による）で測定される。生命システムの基礎となる生化学プロセスの複雑なネットワーク、一般的な人間の病気、および遺伝子の発見と構造決定に関連する重要な発見は、現在、研究プロセスの一部としての細胞成分存在量データの適用に帰することができる。細胞成分の存在量データは、バイオマーカーの特定、疾患のサブタイプの識別、および毒性のメカニズムの特定に役立つ。
胚細胞に由来する多能性幹細胞
いくつかの実施形態において、重要な工程は、多能性であるか、または多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞に由来し、これは、初期哺乳動物胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無制限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤葉細胞から胚性幹細胞を誘導する方法は、当技術分野でよく知られる。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９−ｈＥＳＣ）は、本出願に記載される例示的な実施形態において使用されるが、本明細書に記載される方法およびシステムが任意の幹細胞に適用可能であることは当業者によって理解されるだろう。
本発明による実施形態で使用することができる追加の幹細胞には、国立幹細胞銀行（ＮＳＣＢ）、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）におけるヒト胚幹細胞研究センター；Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣセルバンク、ウィスコンシン大学幹細胞および再生医療センター（ＵＷ−ＳＣＲＭＣ）；Ｎｏｖｏｃｅｌｌ、Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンディエゴ）；Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（スウェーデン、ヨーテボリ）；ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（シンガポール）、イスラエル工科大学（イスラエル、ハイファ）のテクニオン、プリンストン大学とペンシルバニア大学がホストする幹細胞データベースによってホストされるデータベースによって提供されるデータベースに記載、または提供されるそれらに限定されないがそれらを含む本発明に記載の実施形態で使用される。本発明による実施形態で使用することができる例示的な胚性幹細胞には、ＳＡ０１（ＳＡ００１）；ＳＡ０２（ＳＡ００２）；ＥＳ０１（ＨＥＳ−１）；ＥＳ０２（ＨＥＳ−２）；ＥＳ０３（ＨＥＳ−３）；ＥＳ０４（ＨＥＳ−４）；ＥＳ０５（ＨＥＳ−５）；ＥＳ０６（ＨＥＳ−６）；ＢＧ０１（ＢＧＮ−０１）；ＢＧ０２（ＢＧＮ−０２）；ＢＧ０３（ＢＧＮ−０３）；ＴＥ０３（１３）；ＴＥ０４（１４）；ＴＥ０６（１６）；ＵＣ０１（ＨＳＦ１）；ＵＣ０６（ＨＳＦ６）；ＷＡ０１（Ｈ１）；ＷＡ０７（Ｈ７）；ＷＡ０９（Ｈ９）；ＷＡ１３（Ｈ１３）；ＷＡ１４（Ｈ１４）が含まれるが、これらに限定されない。
胚性幹細胞に関するより詳細は、例えば、トムソン他、１９９８年、「ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３９１）：１１４５−１１４７；に見出され得る。アンドリュース他、２００５年、「胚性幹（ＥＳ）細胞と胚性癌（ＥＣ）細胞：同じコインの反対側」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３３：１５２６−１５３０；マーティン１９８０、「奇形癌および哺乳類胚発生」。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９（４４５８）：７６８−７７６；Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ、１９８１、「マウス胚からの多能性細胞の培養における確立」、Ｎａｔｕｒｅ ２９２（５８１９）：１５４−１５６；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．、２００５、「フィーダー細胞なしで誘導されたヒト胚性幹細胞」、Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４７１）：１６３６−１６４１；これらの夫々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、特定の幹細胞関連遺伝子を成体線維芽細胞などの非多能性細胞にトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは通常、レトロウイルスなどのウイルスベクターを介して行われる。トランスフェクトされた遺伝子には、マスター転写レギュレーターＯｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導効率を高めることが示唆される。３〜４週間後、トランスフェクトされた少数の細胞が形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、通常は形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子と抗生物質の選択により分離される。本明細書で使用する場合、ｉＰＳＣには、第１世代のｉＰＳＣ、マウスにおける第２世代のｉＰＳＣ、およびヒト誘導多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、レトロウイルス系を使用して、４つの重要な遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを使用して、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換する。別の実施形態では、レンチウイルス系を使用して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で体細胞を形質転換する。ｉＰＳＣで発現が誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ−３／４（例：Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５など）Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５など）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃなど）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、非ウイルスベースの技術を使用して、ｉＰＳＣを生成する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚および肝細胞のＤＮＡに輸送し、胚性幹細胞と同一の細胞を生じさせることができる。アデノウイルスはそれ自体の遺伝子を標的とする宿主と組み合わせないため、腫瘍を形成する危険性が排除される。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、非常に低い効率ではあるが、ウイルストランスフェクションシステムをまったく使用せずに、プラスミドを介して達成することができる。他の実施形態において、タンパク質の直接送達は、ｉＰＳＣを生成するために使用され、したがって、ウイルスまたは遺伝子改変の必要性を排除する。一部の実施形態では、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である：ポリアルギニンアンカーを介して細胞にチャネリングされる特定のタンパク質による細胞の繰り返し処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態では、多能性誘導遺伝子の発現は、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによっても増加させることができる。
胚性幹細胞に関するさらなる詳細は、例えば、Ｋａｊｉ他、２００９、「多能性のウイルスを含まない誘導およびその後の再プログラミング因子の切除」、Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７７１−７７５；およびＪ．Ｗｏｌｔｊｅｎ他、２００９、「ｐｉｇｇｙＢａｃ転位は、線維芽細胞を再誘導して多能性幹細胞を誘導する」、Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７６６−７７０；オキタ他、２００８、「ウイルスベクターを使用しないマウス誘発多能性幹細胞の生成」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４９−９５３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、２００８、「ウイルス統合なしに生成された人工多能性幹細胞」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４５−９４９；Ｚｈｏｕ他、２００９、「組換えタンパク質を使用した人工多能性幹細胞の生成」、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ４（５）：３８１−３８４；これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、例示的なｉＰＳ細胞株は、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９；ｉＰＳ−ＤＦ４−３；ｉＰＳ−ＤＦ６−９；ｉＰＳ（包皮）；ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）；およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）を含むがこれに限定されない。
ＤＥ発達に関連するシグナル伝達経路の機能に関するさらなる詳細は、例えば、ＺｏｒｎおよびＷｅｌｌｓ、２００９年、「脊椎動物の内胚葉の発達および器官形成」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５：２２１〜２５１に見出すことができる。 Ｄｅｓｓｉｍｏｚ他、２００６、「ＦＧＦシグナリングは、生体内の前後軸に沿って腸管ドメインを確立するために必要である」、Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １２３：４２−５５；ＭｃＬｉｎ他、２００７、「前内胚葉におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の抑制は、肝臓と膵臓の発達に不可欠である。」、１３４：２２０７−２２１７、Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：１５６３−１５７２；ｄｅ Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ他、２００３、「腸上皮の発達と分化」、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０（７）：１３２２−１３３２；これらの夫々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を作製するための任意の方法が、本明細書に記載される方法に適用可能である。いくつかの実施形態では、多能性細胞は桑実胚に由来する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞には、胚幹細胞が含まれ得るが、これに限定されない。胚性幹細胞は、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起から得ることができる。胚性幹細胞または生殖細胞は、ヒトを含む様々な哺乳動物種を含むがこれらに限定されない様々な動物種に由来し得る。いくつかの実施形態では、ヒト胚性幹細胞を使用して、胚体内胚葉を作製する。いくつかの実施形態では、ヒト胚性生殖細胞を使用して、胚体内胚葉を作製する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを使用して胚体内胚葉を作製する。
気管障害および食道障害はヒトに蔓延しており、マウスで正確にモデル化することは難しい。したがって、出願人は、ヒト多能性幹細胞の有向分化を通じて食道発生の三次元オルガノイドモデルを確立した。ＢＭＰ、ＷＮＴ、およびＲＡシグナル伝達経路の順次操作により、前胚葉、前部前腸（ＡＦＧ）、および背側ＡＦＧスフェロイドへの胚体内胚葉のパターンが可能になった。３Ｄマトリックスで成長した背側ＡＦＧスフェロイドはヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）を形成し、ＨＥＯ細胞は２次元培養に移行し、食道器官型ラフトとして成長する可能性がある。どちらの構成でも、食道組織には増殖性の基底前駆細胞と分化した重層扁平上皮があった。ＨＥＯ文化を使用して人間の食道先天性欠損症をモデル化した出願人は、Ｓｏｘ２が背側ＡＦＧでのＷｎｔシグナル伝達を抑制し、生存を促進することで食道の仕様を一部促進することを確認した。一貫して、マウスのＳｏｘ２アブレーションは食道無形成を引き起こします。したがって、ＨＥＯは、人間の病理や組織工学をモデル化するための強力なプラットフォームを提供する。
多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した、または臓器から直接得られたヒト組織オルガノイドは、組織生理学および病理学の優れたモデルであることが証明されている（ＭｃＣａｕｌｅｙ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ、２０１７）。一般に、ＰＳＣを臓器細胞型に変換するプロセスは、胚体内胚葉（ＤＥ）の形成、前腸、中腸、後腸への前後のパターン形成、臓器の仕様、および特定の臓器系統への分化など、器官形成を再現する段階的な分化に依存する。このアプローチは、呼吸器、胃、小腸および結腸を含むヒトの前内胚葉オルガノイドと後部内胚葉オルガノイドを生成するために使用される（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｄｙｅ ｅｔ ａｌ．、２０１５、２０１６、ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４、２０１７；Ｍｕｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。ただし、人間のＰＳＣ由来の食道組織は報告されていない。ＤＥ誘導後のＢＭＰおよびＴＧＦβの二重阻害により、前腸前部（ＡＦＧ）が生成される。しかし、これにより、咽頭、食道、呼吸器の内胚葉を含む組織の混合が生じた（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｌｏｎｇｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。これは、ＰＳＣの食道への分化を特異的に指示するためには、食道の発達を制御する経路に基づくより洗練されたパターン化アプローチが必要であることを示唆する。
いくつかのシグナル伝達経路は、発生中の食道の分化および形態形成を導く。食道上皮は、原腸形成時に形成される細胞の２次元シートである胚体内胚葉（ＤＥ）に由来する（Ｚｏｒｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ、２００７）。次に、ＤＥはＷｎｔ、ＢＭＰおよびＦＧＦシグナル伝達によって前後軸に沿ってパターン化され、前腸、中腸、および後腸に大別される原始的な腸管を形成する（Ｄｅｓｓｉｍｏｚ ｅｔ ａｌ．、２００６；ＭｃＬｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｚｏｒｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ、２００９）。前腸はさらに、レチノイン酸（ＲＡ）によって後部前腸にパターン化される（Ｂａｙｈａ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｎｉｅｄｅｒｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００６）。前部前腸（ＡＦＧ）は、食道と気道を生じさせる。ＷｎｔとＢＭＰの活性化に応答する呼吸の仕様は、転写因子Ｎｋｘ２−１の発現をもたらすが、背側前腸におけるＢＭＰの阻害は、Ｓｏｘ２を発現する食道上皮の発達を促進する（Ｄｏｍｙａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｈａｒｒｉｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００６；Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。食道は単純な立方上皮から始まるが、複数のケラチンタンパク質を発現する重層扁平上皮と、Ｓｏｘ２とｐ６３を発現する基底層に発達する（Ｒｏｓｅｋｒａｎｓ ｅｔ ａｌ．、２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。
本明細書に開示されるのは、ヒトＰＳＣを食道オルガノイドに分化させるための上記のシグナル伝達経路の一時的な操作である。ＤＥ形成に続いて、出願人は、ＢＭＰ、ＷＮＴ、およびＲＡ経路の正確な時間的操作がＡＦＧスフェロイドの形成を指示することを確認した。生体内データと一致して、ＡＦＧスフェロイドはＷＮＴおよびＢＭＰ経路の活性化を通じて呼吸運命を獲得したが、ＢＭＰ阻害は背側前腸スフェロイドの形成を促進し、１〜２か月間継続して成長するとヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）を形成した。ＨＥＯには、異なる基底細胞と内腔の細胞層のある層状扁平上皮が含まれており、増殖性食道前駆細胞が潜んでおり、器官型培養では食道上皮に分化する。マウス胚と並行して使用されるＨＥＯは、ヒトおよびマウスにおける食道閉鎖症の原因の１つであるＳＯＸ２機能喪失の影響を受ける分子経路を特定するために使用できる（Ｄｏｍｙａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００７）。Ｓｏｘ２機能の低下がマウスの食道閉鎖症につながる一方で、マウス前腸内胚葉のＳｏｘ２が完全に失われると、食道の無形成が生じる。ＳＯＸ２機能の喪失とヒトおよびマウスの前腸の転写プロファイリングにより、ＳＯＸ２がＳＦＲＰ２などのＷｎｔ拮抗薬の背側発現を調節することがわかり、ＳＯＸ２がＷｎｔが背側前腸で呼吸運命を誘発する能力を抑制することが示唆された。ネット、出願人は、開示されたＨＥＯが人間の食道器官形成、先天性欠損症、および疾患を研究するための補足的なプラットフォームを提供することを発見した。
一態様では、食道オルガノイド（ＥＯ）を作製する方法が開示される。この方法は、胚体内胚葉を、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ活性化因子、ＦＧＦ活性化因子、およびレチノイン酸（ＲＡ）と接触させる工程を含み得る。この接触工程は、前部前腸培養物を形成するのに十分な最初の期間であり得る。一態様では、前腸前培養物は、このような最初の期間の後にＳＯＸ２およびＨＮＦ１Ｂを発現し、ＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６を実質的に発現しない。この方法は、前部前腸培養物をＢＭＰ阻害剤（ノギン）およびＥＧＦ活性化因子と背側前部前腸（「ｄＡＦＧ」）スフェロイドを形成するのに十分な第２の期間接触させる工程をさらに含み得、ｄＡＦＧはＰＯＸ１、ＰＡＸ９、またはＮＫＸ２．１ではなく、ＳＯＸ２およびＴＰ６３発現し得る。この方法は、食道オルガノイド（ＥＯ）の形成を可能にするのに十分な第３の期間、ｄＡＦＧを培養する工程をさらに含み得、前記培養は、ＥＧＦの存在下で行われ、さらに必要に応じて、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、好ましくはＦＧＦ１０を含む。一態様では、ＥＯはヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）である。
例示的な遺伝子（または遺伝子が利用できない場合はｍＲＮＡ）のアクセッション番号は、以下のように提供される：ＳＯＸ２（ＮＧ＿００９０８０．１）；ＨＮＦ１Ｂ（ＮＧ＿０１３０１９．２）、ＰＲＯＸ１（ＮＣ＿０００００１．１１）；ＨＮＦ６（ＮＭ＿２１４６５９．１）；ＴＰ６３（ＮＧ＿００７５５０．１）；ＰＤＸ１（ＮＧ＿００８１８３．１）、ＰＡＸ９（ＮＧ＿０１３３５７．１）；およびＮＫＸ２．１（ＮＧ＿０１３３６５．１）。上記の遺伝子名（すなわち、「ＳＯＸ２、ＨＮＦ１Ｂなど」）は、当業者が列挙された遺伝子を同定するのに十分であることに留意されたい。命名された遺伝子は、遺伝子のバリエーションを包含することが意図されており、提供される例示的なアクセッション番号の命名によって限定されることは意図されていない。すなわち、提供されたアクセッション番号は、遺伝子および／またはクレームの範囲を限定することを意図したものではなく、これらの遺伝子／ｍＲＮＡ／タンパク質の多くの識別子の１つであり、本質的に単なる例示である。つまり、識別子は、多くの１つである特定のアイソフォーム／バリアントのみを参照する場合がある。この区別は、当業者によって容易に理解され、当業者は、列挙された遺伝子が、上記の受入番号に関連するものとは異なる配列を有する変異体および遺伝子を包含することを理解するだろう。
一態様では、胚体内胚葉は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、および後腸細胞から選択される前駆細胞に由来しても良い。一態様では、胚体内胚葉は、多能性幹細胞に由来し得る。一態様では、胚体内胚葉は、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞に由来し得る。一態様では、ＤＥはＤＥ単層であっても良く、ＤＥ単層中の細胞の９０％超がＦＯＸＡ２およびＳＯＸ１７を同時発現する。
一態様において、胚体内胚葉は、多能性幹細胞を、成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループであるアクチビン；Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、およびそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の分子と接触させることに由来し得る。
一態様では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、およびそれらの組み合わせから選択され得る。一態様では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）である。ＢＭＰ阻害剤は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。
一態様では、ＷＮＴ活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫβ阻害剤（例、ＣＨＩＲ９９０２１、つまり「ＣＨＩＲＯＮ」）、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ−２１６７６３、リチウム、ヤマアラシ阻害剤ＩＷＰ、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＳＦＲＰ阻害剤ＷＡＹ−３１６６０６、β−カテニン活性剤ＤＣＡからなる群から選択される１つ以上の分子から選択され得る。Ｗｎｔ経路活性化因子の濃度は、例えば、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。Ｗｎｔ／ベータ−カテニン経路を活性化するには多くの方法がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｎｕｓｓｅｌａｂ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｎｔ／を参照）。適切な既存のいくつかのｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子には、タンパク質ベースの活性化因子が含まれるが、これに限定されない。これには、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ８などのＷｎｔリガンドが含まれるが、これらに限定されない。活性化Ｗｎｔフリズルド受容体（ＬＲＰ）共受容体、Ｒ−スポンジンタンパク質、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔリガンド分泌および輸送（Ｗｎｔｌｅｓｓ、ポーキュパイン）のレギュレーター、ベータカテニン分解ＡＰＣの抑制など、Ｗｎｔリガンド活性の修飾因子ＧＳＫ３ｂｅｔａ阻害、活性化β−カテニン、構成的に活性なＴＣＦ／Ｌｅｆタンパク質、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を活性化または阻害する２８以上の既知の化学物質を含む可能性のある化学的活性化物質も含まれるが、これに限定されず、また、このいくつかの活性化剤には、ＧＳＫ３−ベータ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲＯＮ）、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ−２１６７６３、リチウム、ヤマアラシ阻害剤ＩＷＰ、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＳＦＲＰ阻害剤ＷＡＹ−３１６６０６、ベータ−カテニン活性化剤ＤＣＡが含まれるが、これらに限定されない。
一態様では、ＦＧＦ活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、およびそれらの組み合わせ、好ましくはＦＧＦ４またはＦＧＦ１０、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の分子であり得る。一態様では、ＦＧＦ経路活性化因子の濃度は、約５０から約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で使用されても良い。ＦＧＦ受容体を刺激するタンパク質と化学物質、およびＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ＥＲＫタンパク質などの受容体の下流のシグナル伝達コンポーネントと、それらの活性を調節する化学物質。ＦＧＦシグナル伝達は、Ｓｐｒｏｕｔｙタンパク質ファミリーメンバーを含むがこれに限定されないＦＧＦシグナル伝達経路の阻害剤を阻害することにより活性化され得る。
一態様では、工程ａのレチノイン酸は、約１２時間から約４８時間、または約２０時間から約４０時間、または約２４時間、またはまで、ＤＥと接触させることができる。処置は、ＰＤＸ発現およびｐ６３発現の喪失をもたらす。
１つの態様では、前記工程ｃは、ＫＲＴ８を欠く重層上皮の形成に十分な期間実行されても良い。一態様では、工程ｃは、局所ケラチンを発現する重層扁平上皮の形成に十分な期間実施されても良い。一態様では、工程Ｈは、前記ＨＥＯがＩＮＶを発現するのに十分な期間実行されても良い。
一態様では、第１の期間は、約３日±２４時間の期間であり得る。一態様では、第２の期間は、約３日±２４時間の期間であり得る。一態様では、第３の期間は、約２８日±４８時間、または約２１日〜約９０日、または約３０日〜約６０日の期間であり得る。一態様では、工程ａからｃは、インビトロで行われ得る。
一態様では、方法は、工程ａ）の前腸前培養物または工程ｂ）のスフェロイドを、コラーゲン、基底膜マトリックス（マトリゲル）、またはそれらの組み合わせから選択されるマトリックスと接触させる工程をさらに含み得る。
一態様では、本明細書に記載の食道組成物は、神経支配および／または血管がないことを特徴とすることができる。一態様では、組成物は、ヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）組成物であり、ＨＥＯ組成物は、粘膜下腺、移行帯、脈管構造、免疫細胞、または粘膜下層のうちの１つまたは複数を実質的に含まない。
一態様では、器官型培養に組織化することができる食道前駆細胞が開示される。食道前駆細胞は、本明細書に開示される方法に由来し得る。
一態様では、重層扁平上皮を作製する方法が開示される。この方法は、本明細書に記載のＨＥＯを酵素的に解離して前駆細胞を放出する工程を含むことができ、ＨＥＯは、約３週間から約１０週間、または約４週間から約８週間、または約５週間の年齢であり、前記前駆細胞を単層に拡大する工程と、および、解離したＨＥＯを、非角質化重層扁平上皮を生じるのに十分な期間、コラーゲン被覆膜上の重層扁平上皮に再分化させる工程を有し、前記非角質化重層扁平上皮は、角質およびＩＶＬ、ＣＲＮＮ、およびＦＬＧから選択される１つ以上のマーカーを発現する。一態様では、重層扁平上皮は、実質的にシートの形態で組織化された食道細胞を含み得る。
一態様では、先天性疾患（閉鎖症）、機能性疾患（アカラシアおよび他の運動障害）、免疫学的疾患（好酸球性食道炎）、病理学的疾患（バレット食道および食道癌）、およびそれらの組み合わせから選択され、本明細書に開示される食道組成物（ＨＥＯまたは食道シートなど）を前記個体に接触させる工程を含む。
一態様では、疾患は、食道の潰瘍または潰瘍組織を含み得、開示された食道組成物は、潰瘍組織に接触して修復するために使用され得る。例えば、一態様では、食道組成物は、実質的にシートの形態で組織化された食道細胞を含み得、これは患者と接触され得る。
一態様では、好酸球性食道炎の治療を特定する方法が開示される。この態様では、方法は、関心対象の潜在的治療薬を本明細書に記載のようなオルガノイドまたは食道組織と接触させる工程と、好酸球性食道炎活性の測定値を検出する工程と、および関心のある潜在的な治療薬が好酸球性食道炎の活動の測定を改善するかどうかを決定する工程を含むことができる。
一態様では、ファンコニーの貧血疾患モデルを作成する方法が開示される。この態様では、開示された製造方法およびＨＥＯまたは食道シートは、本明細書に記載されているように実施され、ＤＥは、ＦＡＮＣＡが欠損している前駆細胞から得られる。
一態様では、バレット化生疾患モデルを作成する方法が開示される。この態様では、方法は、本明細書に開示される方法に従って作製されたＨＥＯまたは食道シートにおいてＣＤＸ２を誘導し、ＢＭＰを活性化する工程を含み得る。
一態様では、好酸球性食道炎疾患モデルを作製する方法が開示される。この態様では、方法は、本明細書に開示される方法に従って作製されたＨＥＯまたは食道シートを、ＣＣＬ２６およびＣＡＰＮ１４の発現を増加させ、ＣＲＮＮおよびＩＶＬの発現を減少させるのに十分な時間、ＩＬ−１３と接触させる工程を含み得る。
一態様では、食道の疾患状態を治療することができる活性剤を同定する方法が開示される。本明細書に開示される方法に従って作製されたＨＥＯまたは食道シートに、前記疾患モデルにおいて生理学的変化を誘発するのに十分な期間、試験薬剤を接触させる工程を含む。ＥＣＬのＣＣＬ２６とＣＡＰＮ１４の発現の減少とＣＲＮＮとＩＶＬの発現の増加を検出する。または、ＳＯＸ２、ｐ６３、ＫＲＴ１３、ＣＲＮＮ、ＩＶＬなどの食道遺伝子発現の増加と、バレットの腸遺伝子の喪失を検出する。
以下の非限定的な例は、本明細書に開示される本発明の実施形態をさらに例示するために提供される。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが見出されたアプローチを表し、したがって、その実施のためのモードの例を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、そしてなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
Ｗｎｔおよびレチノイン酸シグナル伝達は、前部対後部前腸運命を制御する
前腸誘導体を生成するために、ｈＰＳＣを最初にＤＥに誘導し、その後、以前に記載されているように（図１）（Ｄ'Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｄｙｅ ｅｔ ａｌ．、２０１６；ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４、２０１７）三次元（３Ｄ）ＳＯＸ２発現前腸スフェロイドを誘導した。食道オルガノイドの生成を試み、最初の課題は、正しい地域のアイデンティティの前腸組織を生成することだった。内胚葉のパターン形成は、ＢＭＰ、ＷＮＴ、およびＲＡのシグナル伝達の差異によって制御される。これらの経路の最高レベルの活性化は中腸および後腸の運命を促進し、低レベルは前腸の運命を促進する（Ｂａｙｈａ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．、２０１６；Ｍａｔｔ ｅｔ ａｌ．、２００３；ＭｃＬｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｔｉｓｏ ｅｔ ａｌ．、２００２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００６）。シグナル伝達の持続期間が分化にとって重要であることを示す以前の研究に基づき、出願人は前部スフェロイド形成中のＷｎｔ活性化の持続期間が前後同一性に及ぼす影響をテストした（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。出願人は、ＤＥ形成後のカイロン、正規のＷｎｔ経路活性化因子（ＧＳＫ３β阻害による）、またはＷｎｔ３ａ治療の持続時間が短いと、前部前腸（ＡＦＧ）スフェロイドが形成され、後部前腸マーカーＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６のレベルが低いことを発見した（図１Ａ−１Ｅ、８Ａ−８Ｇ）。ＨＮＦ１βは咽頭内胚葉では発現されず、ＡＦＧスフェロイドが咽頭ではなかったことを示す（図１Ｃ〜１Ｅ、８Ｂ）。中／後腸マーカーであるＣＤＸ２は発現されない（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ）。このことから、出願人は、これらの前腸スフェロイド（ＨＮＦ１Ｂ＋／ＳＯＸ２＋、ＰＲＯＸ１−／ＨＮＦ６−）の地域のアイデンティティは咽頭の遠位であり、後部前腸の近位であると結論付けた。
４日間のＲＡ治療はまた、前腸スフェロイドを後方化することが知られており（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４）、ＲＡシグナル伝達の喪失は、後方前腸器官の異常な発達をもたらす（Ｂａｙｈａ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００６）。したがって、出願人は、前腸培養におけるＲＡシグナル伝達の期間を短くすると、より前の運命が促進されるかどうかを調査した。ＲＡで４日間処理した前腸培養物は後部前腸マーカー、ＧＡＴＡ４とＰＤＸ１を発現するが、ＲＡ処理の１日は、発生中の食道で発現するマーカーであるＴＰ６３を発現するスフェロイドをもたらした（図１Ｆ−Ｋ、８Ｏ−８Ｒ）。ＲＡを欠く、またはＤＥＡＢ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤（ＲＡ合成をブロックする）を含む培養物は、ＴＰ６３発現が最小で、咽頭マーカーＰＡＸ９およびＯＴＸ２のレベルが増加したスフェロイドを生成した（図１Ｇ−１Ｋ、８Ｆ−８Ｇ、８Ｓ−８Ｖ）。一緒に、データはＲＡの短い活性化が推定食道ドメインと一致する前腸の地域のアイデンティティを促進することを示唆する。
前前腸スフェロイドは、食道または呼吸器系統を形成する能力がある。
前腸の推定食道／呼吸領域は、背腹（Ｄ−Ｖ）軸に沿ってパターン化され、その結果、それぞれ食道運命および呼吸運命が特定される。出願人は、ＡＦＧスフェロイドが食道または呼吸の運命のいずれかを獲得するためにＤ−Ｖパターンの手がかりに応答すると予測した。脊椎動物の胚に関する研究は、ＢＭＰおよびＷｎｔシグナル伝達が呼吸の運命（ＮＫＸ２−１＋ＳＯＸ２−）を促進することを実証し、背側前腸管におけるＢＭＰシグナル伝達のＮｏｇｇｉｎを介した阻害は食道発生に必要である（Ｄｏｍｙａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｆａｕｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、２０１４；Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｈａｒｒｉｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）。したがって、出願人は、６日目のＡＦＧスフェロイドを３日間のカイロンおよびＢＭＰ４で、あるいはノギン（ＢＭＰシグナリングを阻害するため）で処理した（図２Ａ〜２Ｂ）。カイロン＋ＢＭＰ４による治療はＮＫＸ２−１の誘導とＳＯＸ２の抑制をもたらしたが、ノギン背側化スフェロイドによる治療は、ＳＯＸ２、ＭＮＸ１、ＫＲＴ４、およびＴＰ６３のレベルの上昇によって特徴付けられる（図２Ｃ−Ｉ）（Ｄａｎｉｅｌｙ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、２００９）。一緒に取られて、ＡＦＧスフェロイドの培養におけるＢＭＰシグナル伝達の阻害は背側前腸のアイデンティティを促進した。
重層扁平上皮を伴う食道オルガノイドの形成
背部がパターン化されたＡＦＧスフェロイドが食道オルガノイドに成長する能力があるかどうかを決定するために、出願人は、ＥＧＦ単独で、またはＷｎｔ活性化（カイロン）を含む食道発生を促進すると予測される他の経路の操作の文脈でそれらをマトリゲルに懸濁して培養した。ＢＭＰ阻害（ノギン）、ヘッジホッグの活性化（ＳＡＧ、平滑化アゴニスト）、およびＦＧＦ１０。出願人は、６日目から１３日目までの培養にＦＧＦ１０を追加すると、スフェロイドのオルガノイド成長への効率が向上し（図１１Ａ−１１Ｅ）、食道オルガノイドへのパターン化と分化に影響はなかった（データ未掲載）ことを認識した。
次に、出願人は、推定ヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）の形態学的および分子的発達を、胚性マウス食道の正常な発達と比較した。胚の成長と発達中に、食道はＥ１２．５の単純な立方上皮からＥ１４．５とＥ１７．５の間の多層化／重層上皮に移行する（図３Ｇ、３Ｊ、３Ｍ、３Ｐ、１１Ｆ−１１Ｏ、１１Ｒ）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。同様に、１か月の間に、ＨＥＯのサイズは直径約５０ μｍから２００〜４００μｍに拡大した（図３Ｂ〜３Ｆ）。さらに、オルガノイド上皮は、主にＳＯＸ２、ｐ６３が二重陽性である単純な上皮から、食道の重層扁平上皮のマーカーを発現する多層上皮に移行した（図１１Ｈ〜１１Ｑ、１１Ｓ）。１か月後、ＨＥＯは基礎マーカーｐ６３とＫＲＴ１４、および基底マーカーＫＲＴ１３を発現した（図３Ｈ、３Ｋ、３Ｎ、３Ｑ）。この発現パターンは、多層上皮から構成されるＥ１７．５食道に類似する（図３Ｇ、３Ｊ、３Ｍ、３Ｐ）。
広範なＳＯＸ２上皮発現および未熟な食道のマーカーであるＫＲＴ８の発現によって証明されるように、１ヶ月のＨＥＯは依然として比較的未熟であった（図３Ｊ、１１Ｌ〜１１Ｍ）。したがって、出願人は培養期間を２か月に延長し、ＫＲＴ８を欠く追加の成長と層状上皮の形成をもたらした。出願人は、基底層全体のＫＲＴ１４ならびに分化した基底上層全体のＫＲＴ１３およびＩＶＬの強力な発現を観察し、層状扁平上皮の存在を示した（図３Ｉ、３Ｌ、３Ｏ、３Ｒ）。組織学的には、２ヶ月のＨＥＯには基底層がより明確であり、扁平上皮細胞も基底上にあり、角質化の証拠はなかった（図４Ａ）。ＨＥＯの上皮形態は、胃（ＨＧＯ）、腸（ＨＩＯ）または結腸オルガノイドを含む他のオルガノイドと容易に区別され、各オルガノイドはその臓器の種類に固有の上皮形態を持つ（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４、２０１７；Ｍuｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｓｐｅｎｃｅら、２０１１）。
ＨＥＯがヒト食道上皮であることを示すために、出願人は、１ヶ月および２ヶ月のＨＥＯを、ヒトの食道生検ならびにｑＰＣＲによる１ヶ月のＨＧＯおよびＨＩＯと比較した。主要な層状扁平上皮マーカーｐ６３、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、ＩＶＬ、およびＣＲＮＮは、ヒトの食道生検および２か月のＨＥＯで最も高く発現したが、ＨＧＯおよびＨＩＯはこれらの転写産物を無視して発現した（図３Ｓ〜３Ｖ）。さらに、出願人は、ＨＥＯのトランスクリプトーム全体を、食道、肺、皮膚、胃、小腸、結腸、ＨＧＯ、およびＨＩＯから分離された他のヒト上皮組織のトランスクリプトームと比較した。ＲＮＡシーケンスデータのクラスター分析により、胃、小腸、および結腸ではなく、ＨＥＯがヒト食道および食道ケラチノサイト細胞株であるＥＰＣ２に最も密接に関連することが明らかになった（図３Ｗ）。出願人は主成分分析を使用してＨＥＯをＨＩＯおよびＨＧＯと比較し、１か月のＨＥＯでも他の消化管オルガノイドとは完全に異なることを発見した（図３Ｘ）。食道、皮膚、胃、および結腸のマーカーを比較すると、ＨＥＯはヒトの食道と非常に類似しており、ｑＰＣＲ分析が再確認された。皮膚と食道の間に有意な重複があったが、皮膚のＫＲＴ１と食道のＫＲＴ４と１３を含む明確な違いもあった。注目すべきことに、ＨＥＯは胃または腸のマーカーＴＦＦ２、ＣＬＤＮ１８、ＧＡＴＡ４、ＰＤＸ１、ＣＤＸ２、およびＣＤＨ１７を発現しなかった（図３Ｙ）。
インビボでのＰＳＣ由来オルガノイドの成長がさらなる成熟および機能を促進することが示されるとすると、出願人は、インビボでＨＥＯを研究するために３つの異なる移植ベースのアプローチを利用した。出願人は最初に１ヶ月齢のＨＥＯを免疫不全（ＮＳＧ）マウスの腎臓被膜に生着させ、それらを８週間成長させ、移植されたオルガノイドのサブセットに成熟をもたらした（２／５）（図１２Ａ−１２Ｆ）。出願人は、成功しなかった他の２つの移植アプローチを使用し、生分解性ＰＥＧ足場にＨＥＯを播種し、それらをマウスの脂肪パッドに移植するか、またはＮＳＧマウスの前胃にＨＥＯを生着させるか行った（データ未掲載）（Ｄｙｅ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。全体として、スフェロイドとオルガノイドの生成は、さまざまなＥＳおよびｉＰＳ系統にわたって堅牢であり、各世代の結果、大部分のオルガノイドが層状扁平上皮マーカーを発現する（図Ｔ−１１ＣＣ）。ともに、データはＰＳＣ由来の背側前腸スフェロイドが高分化、非角質化重層扁平上皮と食道オルガノイドを形成することを示す。
ＨＥＯは、重層扁平上皮を再構成することが可能な前駆細胞を含む。
食道は、分化した層状層のすべてを生じさせることができる基底前駆細胞を含む（ＤｅＷａｒｄｅｔ ａｌ．、２０１４；Ｄｏｕｐｅｅｔ ａｌ．、２０１２；Ｋａｌａｂｉｓｅｔ ａｌ．、２００８）。この特性により、食道細胞を分離し、培養で拡大し、その後、層状扁平上皮に再分化させることができる。出願人はまず、ＨＥＯに食道前駆細胞が含まれているかどうかを５週間のＨＥＯを酵素で単一細胞に分離し、単層培養で拡大し、器官型ラフト培養法を使用して層状扁平上皮に再分化する能力をテストした（Ｈｏｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、２００９）。器官型培養の１４日後、ＨＥＯ由来のケラチノサイトは、適切なケラチンと分化したマーカーＩＶＬ、ＣＲＮＮ、ＦＬＧを発現する非角質化重層扁平上皮を生じさせた。（図４Ａ−４Ｎ）。ＨＥＯ、ＨＥＯ由来のケラチノサイト、器官型ラフト培養物はすべて、高レベルの基礎マーカーｐ６３、ＫＲＴ５、およびＫＲＴ１４（図４Ｏ−Ｑ）を発現したが、器官型ラフトは最も分化しており、ヒト食道生検に匹敵するレベルでＣＲＮＮ、ＩＶＬ、ＫＲＴ１３、ＴＭＰＲＳＳ１１ＡおよびＤを発現した（図４Ｒ−４Ｕ）。ただし、これらの前駆細胞を３Ｄオルガノイド文化で長期的に拡大する取り組みは失敗した。３Ｄ−マトリゲルに再播種された解離オルガノイドは数週間にわたって成長し、パターン化を維持し（ＳＯＸ２＋ｐ６３＋）、数回継代（再解離）された（図１２Ｇ−１２Ｈ、１２Ｏ、１２Ｑ−１２Ｒ）。しかしながら、継代効率は時間とともに減少し、出願人はこれらの継代オルガノイドにおいて分化または層別化を誘導することができなかった（図１２Ｉ〜Ｎ、１２Ｐ）。この結果は、ヒト食道に由来する食道前駆細胞と同様であり、これらの細胞を長期間培養することが一般的に不可能であることを示す（Ｋａｓａｇｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。
基礎前駆細胞分化を研究するための別の方法は、増殖する基礎前駆細胞のパルス追跡標識付け、および経時的に層化層に分化する際の標識細胞の追跡によるものである。出願人は、ＥｄＵの１日処理により４０日目のＨＥＯの増殖細胞を標識し、直ちに（０日目）、または追跡後２、６、および１３日間の追跡期間後に分析した（図４Ｖ−４ＢＢ）。ＥｄＵ標識細胞は、最初はｐ６３発現基底細胞に出現したが、時間の経過とともに、これらの細胞は基底上コンパートメントに移動し、ｐ６３発現を失い、標識後１３日までに内腔に放出された（図４Ｗ−４ＢＢ）。したがって、ＨＥＯには食道上皮と同様に、分化して層状層に移動する基底前駆細胞が含まれると考えられる。
食道発生のメカニズムを特定するためのＨＥＯおよびマウス遺伝学の使用
ＰＳＣ由来のＨＥＯモデルシステムを確立することは重要な進歩であるが、ＨＥＯがヒトの発達および疾患を研究するために使用できることを実証する必要がある。出願人は、ＨＯＸを２つの定評のある脊椎動物モデルシステムであるマウスとアフリカツメガエルと並行して使用して、ＳＯＸ２の機能喪失を研究することにより食道先天異常をモデル化することを選択した。最初に、出願人は、Ｓｏｘ２の完全な喪失の結果を決定した。これは、ヒトとマウスのＳＯＸ２機能の部分的な喪失が食道（閉鎖）の部分的な喪失につながるためである（ＯＭＩＭ ２０６９００、Ｆａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００６）。出願人は、食道発生の開始前に前腸内胚葉のＳｏｘ２を誘導的に削除する２つのマウスモデル（ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲ；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌおよびＳｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ）を生成した（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｓｈａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、２００９）。どちらのモデルでも、前腸でのＳｏｘ２の早期削除により完全な食道無形成が生じ、咽頭と胃の間の前腸領域はｐ６３を欠き、呼吸マーカーＮｋｘ２−１を広く発現する１つの管として残った（図５Ｃ−５Ｆ、１３Ａ−１３Ｄ））。肺芽は、対照胚とほぼ同様であり、細胞極性は影響を受けなかった（図１３Ｅ〜Ｆ）。食道発生の開始後のＳｏｘ２の削除は、食道の領域の部分的な損失をもたらし、食道の領域はＥ１１．５でひどく低形成する。一部の地域では、食道の幅はわずか２〜３の細胞で、単純な立方上皮のままで、ｐ６３の発現がなく、一部の細胞ではＮｋｘ２−１を発現する（図５Ｉ〜５Ｌ）。これらのデータは、Ｓｏｘ２機能が食道の発達を開始するために必要であることを示唆するが、１日後のＳｏｘ２の喪失は食道組織と同一性の低下をもたらす。
食道の無形成が細胞死および増殖の変化によって引き起こされたのか、または一般的な前腸からの隔壁形成の欠如によって引き起こされたのかを調査するために、出願人は隔壁形成の開始時にＥ１０．５胚を分析した。Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌ胚は、分離が通常発生するレベルで背側前腸の切断されたカスパーゼ３染色が増加しており、推定食道の細胞が細胞死を起こすことを示唆する（図５Ｇ−５Ｈ、１３Ｕ）。増殖は、Ｋｉ６７＋細胞によって示されるように、変化しなかった（図１３Ｖ）。対照およびＳｏｘ２ノックアウト前腸の両方で、上皮が背腹軸に沿って途中で狭くなる点があり、Ｓｏｘ２タンパク質の存在に関係なく上皮が２つの管に分離しようとしていることを示唆する（図Ｓ６Ｍ−Ｔ）。マウスでの結果は、Ｓｏｘ２が食道の発生、生存、およびＮｋｘ２−１を腹側／呼吸ドメインに制限するために前腸で必要であることを示す。
Ｎｋｘ２−１発現の抑制におけるＳｏｘ２のＢＭＰ非依存的役割
次に、出願人は、ヒトおよびアフリカツメガエルの前培養のインビトロの利点を利用して、Ｓｏｘ２が食道の発達をどのように開始するかを機構的に探求したいと考えた。以前の研究から、Ｓｏｘ２は呼吸器（腹）の発達を抑制し、食道（背）の発達を促進すると考えられる。腹側のアイデンティティを促進するために、ＢＭＰシグナル伝達は腹側前腸のＳｏｘ２を抑制すると考えられており、Ｗｎｔを介したＮｋｘ２−１発現の誘導を可能にする（Ｄｏｍｙａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。出願人は、ＢＭＰの唯一の機能がＳｏｘ２を阻害し、次にＷｎｔを活性化することによってＳｏｘ２を阻害することであるかどうかをテストした。これは、ＢＭＰがない場合にＮｋｘ２−１を活性化するのに十分であると予測される。アフリカツメガエルの内胚葉外植片でモルホリノ注射を使用してＳｏｘ２をノックダウンし、Ｂｉｏで標準的なＷｎｔシグナル伝達をアクティブにしても、ＢＭＰ４の非存在下ではｎｋｘ２−１発現はアクティブにならなかった（図６Ａ−Ｂ、６Ｅ−６Ｆ）。しかしながら、ＢｉｏおよびＢＭＰ４での処理は、マウスＳｏｘ２ノックアウトにおけるように、ｓｏｘ２ノックダウン時にｎｋｘ２−１ドメインを拡大した（図６Ｃ〜６Ｄ）。これらのデータは次の２つのことを示唆する。２つ目は、呼吸ドメイン外の異所性Ｎｋｘ２−１発現を抑制するためにＳｏｘ２が必要である。
ＮＫＸ２−１の異所性発現を防止するためにヒトＳＯＸ２が必要かどうかを決定するために、出願人は、ｉＰＳＣ株を使用して、ＳＯＸ２遺伝子座での転写を抑制するＣＲＩＳＰＲタンパク質の抑制因子形態（ＣＲＩＳＰＲｉ−ＳＯＸ２）を誘導的に発現した（Ｍａｎｄｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。ヒト背側前腸前培養（ｄＡＦＧ）におけるＳＯＸ２ノックダウンは、ＮＫＸ２−１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の異所性発現をもたらした（図６Ｇ−６Ｊ、６Ｌ−６Ｍ）。前腹部前腸（ｖＡＦＧ）における最適なＮＫＸ２−１誘導は、依然としてＢＭＰの存在に依存した（図６Ｋ〜６Ｎ）。ＳＯＸ２の発現がＮＫＸ２−１を抑制するのに十分であるかどうかを判断するために、出願人は、呼吸誘導中に腹側前腸でＨＡタグ付きＳＯＸ２を発現する安定したｔｅｔ誘導性ｈＰＳＣ系統を作成した。前腹部におけるＳＯＸ２の発現は、ＮＫＸ２−１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の有意なダウンレギュレーションをもたらした（図６Ｑ〜６Ｔ）。ともに、これらのデータはＢＭＰが呼吸誘導のための追加機能を持っていることを示唆し、すべてのコンテキストでＮＫＸ２−１発現にはＷｎｔシグナル伝達が必要であることを確認する。さらに、ＳＯＸ２の発現は、未知のメカニズムを通じてＮＫＸ２−１の発現を抑制するのに十分である。
Ｓｏｘ２は、背腹パターン形成中にＷｎｔ拮抗体の発現を調節する
前腸培養の操作の容易さおよび拡張性は、「オミック」アプローチに理想的に適する。したがって、出願人は、ＲＮＡシーケンスベースのアプローチを採用して、背腹（食道呼吸）のパターン形成中にＳＯＸ２および／またはＢＭＰシグナル伝達によって制御される遺伝子を特定した。主成分分析（ＰＣＡ）により、調節された遺伝子の最大のグループが背腹パターン形成（±ＢＭＰ４またはＮｏｇｇｉｎ）およびＳＯＸ２調節遺伝子（±ｄｏｘ−ＳＯＸ２ ＣＲＩＳＰＲｉ）であることが確認された（図１４Ａ）。さらに、クラスターヒートマップおよび主成分軸１に沿ったＰＣＡに示されるように、ＳＯＸ２は、腹側（ＢＭＰ４）培養と比較して、背側（Ｎｏｇｇｉｎ）培養の異なる遺伝子セットを調節する（図７Ａ、１４Ａ）。ＢＭＰ４またはＮｏｇｇｉｎを使用すると、ＮＫＸ２−１のアップレギュレーションや腹側（ＢＭＰ−ｈｉｇｈ）培養でのＳＯＸ２、ＭＮＸ１、ＫＲＴ４、ＰＡＸ９の抑制など、背腹パターンマーカーに予想される変化が生じた。ただし、ＳＯＸ２の喪失により、ＮＫＸ２−１の発現の増加、ＦＯＸＥ１、ＮＴＮ１、およびＧＤＮＦの発現の減少など、背側前腸に多くの転写変化が、腹側前腸に比較的少ない（図７Ａ−７Ｂ、７Ｄ、１４Ｂ）。
背側および腹側の遺伝子のうち、ＣＲＩＳＰＲｉ−ＳＯＸ２（上昇または低下のいずれか）に応答して変化した転写物および変化しなかった（ＳＯＸ２非依存性）遺伝子があった。例えば、背側前腸に豊富な５４２遺伝子のうち、７５．６％（４１０遺伝子）はＳＯＸ２に依存しない。背側前腸の１７．２％（９３遺伝子）は、ＳＯＸ２ノックダウン時にダウンレギュレートされた。これは、出願人によって「ＳＯＸ２によって積極的に制御されている」と呼ばれる。ＳＯＸ２ノックダウンに反応して上昇した転写産物は３９あり、これらは「ＳＯＸ２によって負に調節される」ことを示唆する。腹側培養では、ＢＭＰ処理により３７４遺伝子がアップレギュレートされ、ＳＯＸ２の喪失に応答して、３８遺伝子が減少し、５遺伝子が増加した（図７Ｄ）。当然のことながら、腹側のＳＯＸ２の発現はＢＭＰに応答してすでに大幅にダウンレギュレートされるため、背側前腸において、より多くの遺伝子がＳＯＸ２によって制御された。出願人は、交差分析を使用して、ＢＭＰがＳＯＸ２の抑制を通じて制御する可能性が高い遺伝子を特定し、ＢＭＰ処理とＳＯＸ２ノックダウンの両方によって上方制御される４６遺伝子（１２．３％）を発見した（「ＳＯＸ２によって負に制御される遺伝子」）。出願人はまた、ＢＭＰ処理およびＳＯＸ２ノックダウンの両方によってダウンレギュレートされる８１個の遺伝子（１４．９％）を発見した（「ＳＯＸ２によって正に調節される遺伝子」）（図７Ｂ）。さらに、＞８０％のＢＭＰ調節転写産物は、ＳＯＸ２ノックダウンに反応して変化せず、ＢＭＰはＳＯＸ２抑制とは関係なく腹側前腸の特定に役割を果たすという結論と一致する。
ＳＯＸ２ノックダウンに応答してｄＡＦＧで発現が低下したすべての４０４個のユニークな遺伝子の遺伝子オントロジー分析を行うと、Ｗｎｔシグナル伝達経路を含む２つの用語を含む多くの重要な遺伝子オントロジー用語が得られた（図７Ｃ）。遺伝子セット濃縮分析はまた、いくつかのＷｎｔシグナル伝達成分がＳＯＸ２ノックダウンに応答して有意に変化することを見出した（図７Ｅ）。分泌された標準的なＷｎｔシグナル伝達阻害剤ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ１はすべて、ＳＯＸ２の喪失時にダウンレギュレートされました（図７Ｅ、７Ｋ）。さらに、腹側培養におけるＳＯＸ２の過剰発現はＳＦＲＰ２をアップレギュレートした。これは、ｈＰＳＣ由来の中内胚葉および内胚葉の公表されたＣｈＩＰ−ｓｅｑデータと一致し、ＳＦＲＰ２遺伝子座でＳＯＸ２結合ピークを示す（図１４Ｃ−１４Ｄ）（Ｔｓａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。
ＳＯＸ２はＷｎｔ拮抗体の発現を正に調節するので、出願人は、ＳＯＸ２が背側前腸における標準的なＷｎｔシグナル伝達を阻害し得ると仮定した。これを調査するために、出願人は２つの遺伝的モデルＦｏｘａ２ＣｒｅＥＲ；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌおよびＳｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｆｌを使用してマウス前腸からＳｏｘ２を削除し、Ｗｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２の発現を分析することにより正規のＷｎｔ／β−カテニン活性を測定した（Ｊｈｏ ｅｔ ａｌ．、２００２；Ｌｕｓｔｉｇ ｅｔ ａｌ．、２００２）。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、腹側前腸内胚葉に高レベルのＡｘｉｎ２ ｍＲＮＡがあり、対照胚の背側前腸内胚葉に低レベルがあった。対照的に、Ｓｏｘ２が削除された場合、背側前腸はＡｘｉｎ２染色が増加した（図７Ｆ−７Ｉ）。同様に、ＡＸＩＮ２転写産物レベルは、ＳＯＸ２が外因的に発現されたヒト腹側前腸培養物で減少した（図６Ｇ、７Ｊ）。正規のＷｎｔ遺伝子の発現の増加に加えて、Ｎｋｘ２−１発現ドメインが背側前腸に拡大された（図５Ｅ、１３Ｃ−１３Ｄ）。ヒト前腸培養からのデータとともに、出願人は、Ｓｏｘ２が背側前腸における分泌されたＷｎｔアンタゴニストの発現を積極的に調節するモデルを提案する。これは、背側前腸における標準的なＷｎｔシグナル伝達を抑制し、Ｎｋｘ２−１の発現を腹側前腸に制限する。
議論
ＨＥＯおよび器官型ラフト培養物の生成は、初代食道細胞および細胞株から記載される（Ａｎｄｌ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｋａｌａｂｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１２；Ｋａｓａｇｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。さらに、ヒトＰＳＣ由来の前部前腸（ＡＦＧ）内胚葉培養は、複数のＡＦＧ誘導体の不均一な混合を引き起こす（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｌｏｎｇｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。このようなアプローチで食道内胚葉を濃縮するには、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．が達成したように、細胞の選別とその後の培養に頼らなければならない。あるいは、食道のような特定の前腸派生物への方向付けられた分化は、初期の臓器発達のより詳細な要約から恩恵を受ける。ここでは、出願人は、ＤＥ形成、前腸のパターン化と形態形成、ＡＦＧパターン化を推定的な食道呼吸領域に、そして最後に背側前腸パターン化に近似した段階的な方法を使用して、ヒトＰＳＣを特にＨＥＯに分化させた。このアプローチは、１つが食道オルガノイドに成長する背側ＡＦＧ内胚葉が残るように、内胚葉分化の可能性を徐々に制限する。
１つの課題は、前腸の呼吸食道前部領域を生成するが、最も前の咽頭領域を生成しない状態を見出すことだった。ＢＭＰ阻害は前腸の特定に不可欠であり、出願人は、一過性のＷｎｔおよびＲＡ活性化パターンが咽頭内胚葉ではなく食道−呼吸器への前腸にあることを発見した。さらに、出願人は、ＲＡの１日がＴＰ６３およびＫＲＴ４の発現を促進し、後部前腸マーカーＧＡＴＡ４およびＰＤＸ１を促進しないことを発見した。理論によって制限されるつもりはないが、ＲＡはケラチノサイトでＫＲＴ４とＴＰ６３の発現を促進するため、ＲＡのこの効果は直接的である可能性がある（Ｂａｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００２）。特定の食道マーカーがないため、出願人は、局所的に発現したマーカーの有無に依存して、初期前腸内胚葉の同一性を判断し、咽頭、呼吸器、肝臓、膵臓、および胃の内胚葉を除外した。
出願人はまた、機能アッセイを使用して、前腸の食道呼吸領域が生成されたことを示した。前腸のこの前後レベルは、食道および呼吸器系譜を生じさせる能力があるはずである。出願人は、ＮＫＸ２−１を上方制御することにより、ＡＦＧスフェロイドが呼吸誘導信号（カイロン（ｃｈｉｒｏｎ）によるＢＭＰ４およびＷｎｔ活性化）に応答できることを示した。逆に、ＢＭＰシグナル伝達の抑制は、ＳＯＸ２、ＴＰ６３、およびＭＮＸ１の発現に基づいてスフェロイドを背側化する。興味深いことに、出願人の培養条件では、他のプロトコル（図１０Ａ−Ｊ）とは対照的に、前腸誘導時のＴＧＦβ阻害剤の添加により後部前腸マーカーが増加し、ＮＫＸ２−１の上方制御が減少し、タイミングとコンビナトリアルシグナル伝達経路の操作がどのように行われるかを例示すると、異なる結果をもたらす可能性がある。
背側前腸スフェロイドからの食道系列関与の最後の証拠は、それらが局所ケラチンを発現する重層扁平上皮を有する三次元ＨＥＯへの成長であった。拡張培養またはｉｎ ｖｉｖｏ移植では、ＨＥＯは形態的にも後期食道マーカー（ＩＶＬ、ＣＲＮＮ、ＦＬＧ）の分析によっても成熟度が大幅に増加する。さらに、ＨＥＯは解離し、ケラチノサイトとして拡大し、器官型ラフト培養で層状扁平上皮に分化する可能性があり、ＨＥＯにはヒト食道と同様の基底前駆細胞があることを示す（Ｄｏｕｐｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２；Ｋａｌａｂｉｓ ｅｔ ａｌ．、２００８）。実際、器官型ラフト培養における分化マーカーの発現レベルは、ヒトの食道の発現レベルに近づいた。人間のＰＳＣからの完全に分化した成熟した細胞型の生成は、臓器系全体での課題であり、我々のデータは、ＰＳＣ由来の食道上皮がこれまでに派生した最も高度に分化した組織の１つであることを示唆する。
ＨＥＯは、間違いなく、ヒトの食道疾患の研究を容易にするだろう。一例として、出願人は、ＨＥＯがどのようにしてヒトの食道先天性欠損をモデル化するかを示した。ＳＯＸ２変異はマウスとヒトに食道閉鎖症を引き起こす可能性があるため、出願人はＨＥＯを使用して、ＳＯＸ２の作用の根底にあるメカニズムが不明であるため、ＳＯＸ２がヒトの食道発達を制御する方法を特定した（Ｆａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００６）。出願人は、最初にＳＯＸ２の喪失時に起こる転写変化を特定した。現在のモデルは、ＢＭＰシグナル伝達の主な役割は、Ｎｋｘ２−１を抑制するＳｏｘ２を抑制することであることを示唆する。しかしながら、出願人は、ＢＭＰシグナル伝達がＳＯＸ２とは無関係に多くの転写変化を調節することを確認し、現在のモデルが過度に単純化されていることを示唆する（Ｄｏｍｙａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２）（図２Ｂ）。さらに、データは、ＳＯＸ２が正規のＷｎｔシグナル伝達を抑制し、背側内胚葉の生存を促進することを示唆する。他の状況では、Ｓｏｘ２は、ＴＣＦ／ＬＥＦへの直接結合や分泌されたＷｎｔアンタゴニストの調節など、さまざまなメカニズムによってＷｎｔシグナル伝達を抑制および促進できる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００８； Ｋｏｒｍｉｓｈ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２０１６；Ｓｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。分泌されたＷｎｔアンタゴニスト、Ｓｆｒｐ１およびＳｆｒｐ２の、気管食道隔壁における役割は、Ｂａｒｘ１ノックアウトマウスを使用して示す（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。人間の前腸培養では、ＳＯＸ２はＳＦＲＰ２の転写産物レベルも調節し、ＳＯＸ２の喪失は背側前腸におけるＷｎｔ活性の増加を引き起こす。このことから、出願人は、ＳＯＸ２が、おそらく標準的なＷｎｔシグナル伝達を抑制することによって、背側前腸内胚葉からの呼吸系統を制限すると結論付ける。
要約すると、出願人は、初期内胚葉および前腸をパターン化する信号の時間的操作に基づいて、ヒトＰＳＣ由来ＨＥＯを生成する方法を開発した。ＨＥＯの発達は、マウスの食道の発達と驚くほど似ており、パターン化された層状扁平上皮をもたらす。出願人は、人間の前腸培養とマウスとカエルの遺伝的アプローチを使用して、背腹パターン形成と食道の仕様中にＳｏｘ２によって調節される分子経路を特定した。出願人は、ヒトとマウスの両方で、ＳＯＸ２がＷｎｔ活動を抑制し、それを怠ると呼吸プログラムの背側の活性化が不適切になることを確認した。したがって、ＨＥＯは食道の発達と疾患を研究するための強力なモデルを提供する。
実験モデルおよび被験者の詳細
動物
すべてのマウスおよびカエルは、実験動物の世話および使用に関するＮＩＨガイドラインに従って、シンシナティ小児病院医療センター（ＣＣＨＭＣ）の動物施設に収容された。動物は１２時間の明暗サイクルで飼育し、水と標準的な固形飼料を自由に摂取させた。野生型および変異マウスおよびアフリカツメガエルを前腸および食道胚発生の研究に使用した。胚の性別は決定されていない。８−１６週齢のオスの免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ−ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスを移植実験に使用した。すべての実験で健康な動物を使用した。すべての実験は、ＣＣＨＭＣの施設内動物管理および使用委員会（プロトコルＩＡＣＵＣ２０１６−０００４およびＩＡＣＵＣ２０１６−００５９）の承認の下で行われた。
ヒトＥＳＣ／ＩＰＳＣ
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）株Ｈ１（ＷＡ０１）は、ＷｉＣｅｌｌから購入した。変更されていないｉＰＳＣ系統６５．８、７２．３、および２６３．１０は、ＣＣＨＭＣ多能性幹細胞施設のいずれかから生成および取得され、ＣＣＨＭＣの機関審査委員会によって承認された。ＣＲＩＳＰＲ干渉ｉＰＳＣ系統（ＷＴＣ１１遺伝的背景）は、カリフォルニア大学サンフランシスコのＣｏｎｋｌｉｎラボから生成および取得された（Ｍａｎｄｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。Ｈ１ラインはオス、ｉＰＳＣ６５．８ラインはメス、ｉＰＳＣ７２．３ラインはオス、ｉＰＳＣ２６３．１０ラインはオス、ＳＯＸ２ ＣＲＩＳＰＲ干渉ライン（ＣＲＩＳＰＲｉ−ＳＯＸ２）はオスである。すべてのｉＰＳＣ系統をチェックし、核型が正常であると判断し、ｉＰＳＣ６５．８およびｉＰＳＣ７２．３をイン ビボ奇形腫アッセイでテストした。
ヒト生検組織
研究目的で食道生検標本を提供することに同意した小児患者（すべて男性、３〜１３歳）の内視鏡検査時にヒト食道組織を収集したが、これはＣｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（プロトコル２００８−００９０）の機関審査委員会によって承認された。ＲＮＡ定量化により、サンプルを食道組織同一性の陽性対照として使用した。
方法の詳細：
実験計画
多能性幹細胞株および維持
ヒト胚性および人工多能性幹細胞（ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ）の両方が、フィーダーフリー培養で維持された。細胞をｈＥＳＣ認定のマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）にプレーティングし、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を毎日交換しながら３７℃、５％ＣＯ２で維持する。Ｄｉｓｐａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞を４日ごとに定期的に継代した。Ｈ１ ＨＡタグ付きＳＯＸ２ ｄｏｘ誘導可能ラインは、ヒトＳＯＸ２ ＯＲＦをｐＩＮＤＵＣＥＲ２０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４４０１２、Ｍｅｅｒｂｒｅｙ ｅｔ ａｌ．、２０１１）にクローニングし、ＣＣＨＭＣのウイルスベクターコア機能を利用してレンチウイルスを生成し、ｈＥＳＣをウイルス２μＬ；このラインは、ｍＴｅＳＲ１およびＧ４１８（５００μｇ ｍＬ−１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での選択時に維持された。
前腸前培養物およびスフェロイドの分化
コンフルエントなｈＰＳＣ培養物をＡｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して、ｍＴｅＳＲ１およびＹ−２７６３２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）に単一細胞として再懸濁し、マトリゲルにプレーティングした。翌日、前述のように胚体内胚葉への分化が行われた（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。簡単に言うと、細胞は、ＲＰＭＩ １６４０メディア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、初日にアクチビンＡ（１００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム、ミネアポリス、ミネソタ州）およびＢＭＰ４（５０ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）で処理された。次の２日間の細胞を、ＲＰＭＩ １６４０のアクチビンＡ（１００ｎｇ ｍＬ−１）のみで処理し、濃度を０．２％および２％のＨｙＣｌｏｎｅ定義のウシ胎仔血清（ｄＦＢＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。
前部前腸単層培養について、細胞を、３日間、ノギン（２００ｎｇ ｍＬ−１）中、２％ｄＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中処理し、３日目にオールトランスレチノイン酸（２μＭ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）で処理した。
あるいは、前胚葉スフェロイドの生成のために、胚体内胚葉から、細胞をＦＧＦ４（５００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）、Ｎｏｇｇｉｎ（２００ｎｇ ｍＬ−１）で２％ｄＦＢＳでＲＰＭＩ１６４０中で３日間処理した。この間、ＣＨＩＲ９９０２１（「カイロン」（ｃｈｉｒｏｎ）または「ｃｈｒ」、２μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｗｎｔ３ａ（５００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＤＥＡＢ（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）、およびレチノイン酸（２μＭ）などの追加の要因がテストされた（結果で説明）。
前部前腸スフェロイドの三次元培養およびヒト食道オルガノイドへの分化
前前腸スフェロイドをマトリゲルの５０μＬの液滴に移し、Ｂ２７サプリメント（１Ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎ２サプリメント（１Ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＥＰＥＳ（１３ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１Ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＥＧＦ（１００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のベース（「Ｇｕｔ」）培地で３〜５８日間培養する。この基本培地に加えて、最初の３日間はＮｏｇｇｉｎ（２００ｎｇ ｍＬ−１）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ ｍＬ−１）、およびＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅサプリメント（１Ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補われた。ＦＧＦ１０とＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅの補充は、３次元培養の最初の週の終わりまで続けられる。メディアは３〜４日ごとに交換された。ＥｄＵ標識の場合、培地に一定期間ＥｄＵ（１０μＭ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、滅菌ＰＢＳで２回洗浄して除去してから、ＥｄＵを含まない培地と交換した。
ケラチノサイトおよび器官型ラフト培養
４１日目のＨＥＯは、３７℃で３０〜４０分間、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して解離され、その間、それらは、２２ １／２および２７ １／２ゲージの針で粉砕された。解離後、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ ｍＬ−１）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１Ｘ）を添加した完全なケラチノサイト無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ）で細胞を再構成し、その後、約１．５ｘ１０４細胞ｃｍ−２でのＩＶ（Ｓｉｇｍａ）コーティングプレート（１．５μｇ ｃｍ−２）でコラーゲン上にプレーティングした。９０％の集密度に達した後、ＨＥＯ由来のケラチノサイトは、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで単一細胞に分離され、器官型ラフト培養に移された。器官型ラフトは、以前に記述されたようにマイナーな変更を加えて生成された（Ｈｏｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、２００９）。手短に言えば、埋め込まれたマウス線維芽細胞（Ｊ２−３Ｔ３細胞）を有する２４ｍｍコラーゲンマトリックス（ラットテール、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に１．２×１０６個のＨＥＯ由来ケラチノサイトをプレーティングした。ラフトは最初に４日間培養され、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）が加えられた後、液体−空気界面に曝されて層状上皮が生成された。１４日後、ラフトを４％ＰＦＡで固定し、パラフィンに包埋した。切片をＨ&Ｅで染色し、通常の顕微鏡で組織病理学を調べた。
マウスモデル
実施されたすべての動物実験は、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＨＭＣ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲマウスはアンムーンの研究室（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、２００８）から、Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌマウスはリチャードラングの研究室（Ｓｈａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、２００９）から、Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ（在庫＃０１７５９３、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．、２０１１）から入手した。ジャクソン研究所から入手した。マウスはＣＣＨＭＣ動物施設に収容され、時限交配が適切な段階で胚を得るために使用された。妊娠中のダムは、適切な段階でＣｒｅＥＲを活性化するために０．１２ｍｇ／ｇマウスのタモキシフェンで様々な段階で強制飼養された。具体的には、ＦｏｘＡ２ＣｒｅＥＲ実験の妊娠中のダムは、効率的な組換えを達成するために６．５ｄｐｃで強制飼養された。Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ実験では、妊娠中のダムを８．５ｄｐｃで強制投与して気管食道分離の前にＳｏｘ２をノックアウトし、９．５ｄｐｃで気管食道分離中／後にＳｏｘ２をノックアウトした。
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）実験
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）成虫は、ナスコ（ウィスコンシン州、フォートアトキンソン）から購入され、ＣＣＨＭＣ ＩＡＣＵＣプロトコルに従って収容された。排卵、体外受精、胚の脱ゼリーは、記載のように行われた（Ｓｉｖｅ ｅｔ ａｌ．、２０００）。５'ＵＴＲ（Ｓｏｘ２−ＵＴＲ ＭＯ）とＡＴＧ開始コドン（Ｓｏｘ２−ＡＴＧ ＭＯ）をターゲットとする以前に検証されたＳｏｘ２モルフォリノ（ＭＯ；Ｖａｎ Ｒａａｙ ｅｔ ａｌ．、２００５）の混合物を、８セルの段階でそれぞれに注入した内胚葉を対象とする８細胞期に各植物割球（割球あたり合計２ｎｇ、胚あたり合計８ｎｇ）に注入された。ＭＯは合成され、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓから購入した。等量の対照ＭＯを対照注射に使用した。
アフリカツメガエル外植片研究のために、ステージＮＦ２０前腸内胚葉組織を１Ｘ ＭＢＳ（改変バースの生理食塩水；Ｓｉｖｅら、２０００）＋５０μｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシン（ＭＰ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、＋４％フィコール−４００（Ｓｉｇｍａ）と外植片を０．５Ｘ ＭＢＳ＋０．１％Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｆｒｅｅ ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）＋５０ｕｇ／ｍＬゲンタマイシン硫酸塩で培養し、ＮＦ２５−ＮＦ３８ステージの低分子または組換えタンパク質を次の濃度で、または含まずに（約４８時間））：３．５μＭＢｉｏ（Ｔｏｃｒｉｓ）、５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＢＭＰ４（Ｒ&Ｄシステム）でマイクロ解剖した。
Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
マウス切片上のインサイチュハイブリダイゼーションは、線形化マウスｃＤＮＡプラスミドからＤＩＧ標識プローブを生成することにより行われた。プローブを６５ｏＣで一晩ハイブリダイズさせ、翌日、ＭＡＢバッファー（マレイン酸バッファー、１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）＋１０％加熱不活化ラム血清（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ブロッキング試薬（Ｓｉｇｍａ）で４℃で一晩）で１：５，０００希釈した抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ）でブロックおよびインキュベートする前に、プローブを完全に洗浄した。ＢＭパープルを使用してスライドを作成する前に、いくつかの洗浄が行われた。アフリカツメガエルの外植片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、（Ｓｉｖｅ ｅｔ ａｌ．、２０００）に記載されているように実行された。簡単に言えば、胚と外植片をＭＥＭＦＡ（０．１Ｍ ＭＯＰＳ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、３．７％ホルムアルデヒド）で４０Ｃで一晩固定し、１００％エタノールで直接脱水して、−２０℃で保存した。ｉｎ−ｓｉｔｕプロトコルに次の小さな変更を加えた。１日目のプロテイナーゼＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を外植片で２ｕｇ／ｍＬで１０分間使用した。ＲＮＡｓｅ Ａの工程は２日目に省略された。そして最後に、抗ＤＩＧ−アルカリホスファターゼ抗体を、ＭＡＢバッファーで１：５，０００に希釈して使用し、＋１０％の熱不活化ラム血清＋２％のブロッキング試薬を２／３日目に使用した。
線形マウントされたアフリカツメガエル胚のＩｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、アンチセンスＤＩＧ標識されたｎｋｘ２−１Ｉｎ Ｓｉｔｕプローブを生成することによって行われ、線形化されたプラスミド全長ｎｋｘ２−１ ｃＤＮＡテンプレートを使用して生成された（Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ ２０００；線形化のためのＸｂａｌ、製造元の指示に従って１０Ｘ ＤＩＧ ＲＮＡラベリングミックス（Ｓｉｇｍａ）でアンチセンスＲＮＡを合成するＴ７）。
免疫蛍光分析
組織培養物を、室温で１５分間、４℃で２時間の凍結切片化、または４℃で一晩のパラフィン包埋／切片化およびマウス胚のいずれかで、４％パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋とセクショニングのために、固定後、組織を脱水し、パラフィンブロックに包埋した。その後、パラフィン切片化されたスライドを脱パラフィンし、染色の前に３０分間１０ｍＭクエン酸ナトリウム中で抗原回復に供した。凍結切片化のために、組織をＰＢＳで完全に洗浄し、３０％スクロースに一晩放置し、ＯＣＴ化合物（ＶＷＲ）に埋め込み、厚さ８μｍで切片化した。一般的に、スライドはその後、ＰＢＳ中の０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理され、５％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で１時間ブロックされ、一次抗体で一晩４℃でインキュベートされた。翌日、スライドをＰＢＳで完全に洗浄し、二次抗体（１：５００）で１時間インキュベートした後、再度完全に洗浄した。ＥｄＵの視覚化のために、出願人はブロッキングの前にＣｌｉｃｋ−ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８イメージングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ホールマウント免疫蛍光染色では、固定直後に胚を１００％メタノールに配置した。次に、胚をデントブリーチ（４：１：１ＭｅＯＨ：ＤＭＳＯ：３０％Ｈ２Ｏ２）で室温で２時間透過処理し、メタノール洗浄で再水和し、室温で数時間、４℃で一晩ブロックした。一次抗体を適用し、胚を４℃で一晩インキュベートした。次に、胚をＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で完全に洗浄した後、４℃で二次抗体で一晩インキュベートした。最後に、胚を再度洗浄し、メタノール洗浄で脱水し、イメージングの少なくとも１５分前にＭｕｒｒａｙ'ｓ Ｃｌｅａｒ（２：１安息香酸ベンジル：ベンジルアルコール、Ｓｉｇｍａ）で透明にした。使用する抗体と希釈液のリストについては、表２を参照。
ＲＮＡ単離およびｑＰＣＲ
スフェロイドおよびオルガノイドは、包埋マトリゲルを含めて、合計で収集された。器官型ラフト培養からのコラーゲンプラグは、１４日目にトランスウェルから最初に取り除かれ、その後合計で採取された。トータルＲＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して分離され、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。ｑＲＴ−ＰＣＲの場合、出願人はＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６マシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を実行した。使用したプライマーのリストについては、表１を参照。
表１：ｑＰＣＲ分析に使用されるプライマーのリスト。図１〜７に関連する。
Figure 2020536529
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表２：免疫蛍光染色に使用される抗体のリスト。図１〜７に関連する。
Figure 2020536529
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リソース表
Figure 2020536529
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ＲＮＡ配列決定および分析
前前腸培養物およびＨＥＯ（全条件または時点あたりｎ＝３）の全トランスクリプトームＲＮＡ配列決定は、分離したトータルＲＮＡから生成されたポリ（Ａ）およびＴｒｕＳｅｑライブラリからのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ−Ｓｅｑ２５００プラットフォーム上のＤＮＡ配列決定および遺伝子型決定コア施設によって行われた。ＲＮＡシーケンスパラメーターは、サンプルあたり１０Ｍリードの深さでの７５ｂｐシングルエンドシーケンスだった。各サンプルのＦａｓｔｑ読み取りファイルを取得し、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓバージョン２．１（ＣＳＢＢ−ｖ２．１、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｓｂｂ−ｖ２−１／）を使用して調整した。生のトランスクリプトカウントと１００万あたりの正規化されたトランスクリプト（ＴＰＭ）値が取得され、ＣＳＢＢ−ｖ２．１による差次的発現と遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．、２００５）について分析された。差次的発現について、統計的および生物学的有意性は、Ｐ＜０．０５、ＦＤＲ＜０．０５、ｌｏｇ ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ＞ １に設定され、６つのサンプルのうち３つで最低３つの転写物カウントがあった。ヒートマップの視覚化と階層的クラスター分析のために、Ｍｏｒｐｈｅｕｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｍｏｒｐｈｅｕｓ／）が使用された。
前部前腸トランスクリプトーム分析は、ＨＯＭＥＲを使用してＧＥＯセット（ＧＳＥ６１４７５、Ｔｓａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．、２０１５；ＧＳＥ４７０５８、Ｗａｔａｎａｂｅｅｔ ａｌ．、２０１４）からのＳＯＸ２およびＳＭＡＤ１ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークと相互参照され、その発現を有する遺伝子のリストを取得した。これらの転写因子によって潜在的に調節される。ピークカットオフ距離は、特定の遺伝子の転写開始部位から５０ｋｂに設定された。
ＨＥＯ分析は、皮膚、食道、小腸、胃、結腸、および肺の組織を含む、インビトロ生成オルガノイド（腸および胃）、ＥＰＣ２培養物、およびＥＮＣＯＤＥロードマッププロジェクトからの生検に関する以前に発表されたＲＮＡ−ｓｅｑサンプルと比較された。社内データを公開データと比較するために、出願人はＥＤＡＳＥＱ［ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｖｉｇｎｅｔｔｅｓ／ＥＤＡＳｅｑ／ｉｎｓｔ／ｄｏｃ／ＥＤＡＳｅｑ．ｐｄｆ］の［Ｕｐｐｅｒ Ｑｕａｎｔｉｌｅ［ｂｅｔｗｅｅｎ−Ｌａｎｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ］］を使用した。出願人は、ＣＳＢＢの［生物情報学者および生物学者のための計算スイート］バージョン３．０［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｓｂｂｃｏｍｐｂｉｏ／ＣＳＢＢ−ｖ３．０］のＵｐｐｅｒＱｕａｎｔｉｌｅモジュールを使用した。出願人は、社内および公共のサンプル全体で遺伝子の発現行列を生成し、ＣＳＢＢ−ｖ３．０のＵｐｐｅｒＱｕａｎｔｉｌｅモジュールを使用して分位正規化した。次に、出願人のｌｏｇ２は、Ｒ．Ｌｏｇ２の分位正規化行列に変換した。
変換されたマトリックスをすべての下流分析に使用した。
出願人はまた、ｌｏｇ２でＳＶＡ［ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｖｉｇｎｅｔｔｅｓ／ｓｖａ／ｉｎｓｔ／ｄｏｃ／ｓｖａ．ｐｄｆ］を使用した−潜在変数があるかどうかを確認するために変位値正規化行列／修正する代理変数に変換した。出願人は、修正する代理変数が見つからなかった。このアプローチは、上位二分位正規化とそれに続くＬｏｇ２変換がデータからバッチとシーケンスの影響を取り除くのに十分堅牢であることを出願人に確信を与えた。
定量化および統計分析
スフェロイドパターン化、オルガノイド成長、およびラフト実験を含む実験の場合、「ｎ」は、各実験で実行された複製の数を表す（３〜７個のオルガノイドの１ウェルまたは３０〜５０個のスフェロイドがマトリゲル培養で各複製について収集された。器官型ラフト培養の１ウェルからのすべてのサンプルは、単一の複製と見なされる）。動物実験では、「ｎ」は分析された胚の数を表す。すべてのデータ定量化は、平均±ＳＤとして表される。回転楕円体のパターン化とオルガノイドの成長でテストされたさまざまな条件を比較するために、等しくない（つまり等しくない）分散を仮定しない両側分布のｔ検定をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで使用した。ここで＊ｐは０．０５以下、＊＊ｐは０．０１以下、＊＊＊ｐは０．００１以下、および＊＊＊＊ｐは０．０００１以下である。
図１〜７の定量化および統計分析の詳細
図１：１Ｈについて、２つの実験からの最小２０のスフェロイドが評価された。すべてのｑＰＣＲ結果のデータは、各実験でｎ＝３ウェル（各ウェルに５０〜１００個のスフェロイド）を使用した最低２つの個別の実験を表す。ＲＡ実験は、Ｈ１とｉＰＳ２６３．１０の両方の細胞株で再現された。
図２：データは、Ｈ１ ｈＥＳＣラインを利用する各実験において、ｎ＝３ウェル（平均ウェルあたり３０〜５０のスフェロイド）での２つの別個の実験を表す。
図３：オルガノイドの生成は、４つのｈＥＳおよびｉＰＳ細胞株：Ｈ１、ｉＰＳ６５．８、ｉＰＳ７２．３、ｉＰＳ２６３．１０にわたる４０以上の実験の代表である。ｑＰＣＲデータは、ｎ＝３ウェル（ウェルあたり３−１２オルガノイド）の２つの個別の実験の代表であり、ｎ＝５の患者生検サンプルと比較された。
図４：ＨＥＯから器官型ラフト培養実験までのｎ＝２〜４のウェル。ＥｄＵ実験の各時点でのｎ＝６−１０オルガノイド。ｎ＝人の患者の食道生検サンプル。実験はＨ１ ｈＥＳＣラインで行われた。
図５：Ｓｏｘ２−ＤＥ−ＬＯＦ胚について、Ｅ９．５での各遺伝子型のｎ＝３胚、およびＥ１１．５での各遺伝子型の各分析タイプについてのｎ＝２胚。Ｓｏｘ２駆動のＳｏｘ２ｃＫＯ胚の場合、タモキシフェン投与の各段階のＩＦおよび対応する段階の収穫について、ｎ＝３胚を分析した。
図６：ヒトＰＳＣ由来培養物からのすべてのデータは、実験ごとの各条件についてｎ＝３ウェルでの３つの別個の実験の代表である。
データおよびソフトウェアの可用性
生成されたデータのアクセッション番号は、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）：ＧＳＥ１１２８８６である。これには、オルガノイド成長の比較（１対２か月のヒト食道オルガノイド、図３）と、背側および腹側前腸前培養におけるＳＯＸ２ノックダウン実験（図７および図１４Ａ〜１４Ｄ）が含まれる。
ＳＯＸ２およびＳＭＡＤ１のＣｈＩＰ−ｓｅｑデータのＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、それぞれアクセッション番号ＧＳＥ６１４７５（Ｔｓａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．、２０１５）およびＧＳＥ４７０５８（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．、２０１４）を用いて、公共データベースＧＥＯからダウンロードされた。生検およびＥＰＣ２培養のＲＮＡ−ｓｅｑデータは、公共データベースＧＥＯからダウンロードされた。サンプルのアクセッション番号は、ＧＳＭ１１２０３１３とＧＳＭ１１２０３１４（小腸）、ＧＳＭ１０１０９４６とＧＳＭ１１２０３０８（肺）、ＧＳＭ１１２０３０７とＧＳＭ１１０１０９６０（胃）、ＧＳＭ１１２０３１５とＧＳＭ１０１０９７４（大腸）、ＧＳＭ１０１０９５６とＧＳＭ１１２０３０３（食道）、ＧＳＭ２３４３８４１およびＧＳＭ２３４５６４（下肢皮膚）、およびＧＳＭ１５９２６０９−ＧＳＭ１５９２６１１（ＥＰＣ２日０培養）である。完全なＲＮＡ−ｓｅｑ処理パイプラインは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓバージョン２．１（ＣＳＢＢ−ｖ２．１）を使用して行われ、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｓｂｂ−ｖ２−１／で入手できる。
病気の状態
本明細書に記載されるヒト食道オルガノイドモデルの出現により、出願人は、このシステムを適用して、食道に影響を及ぼす様々な疾患を研究しようとした。出願人は、前腸のパターン化と分離、および食道の形成におけるＳｏｘ２の役割を調べた。食道閉鎖症は主に食道と気道の適切な解消に焦点を当てるが、人間の患者のその続発症はこの主要な問題をはるかに超える。これは、食道閉鎖症の治療が解剖学的欠損を修復するための手術であるためである。ただし、主な欠陥につながった根本的なメカニズムと、それらが食道（および気道）の適切な発達をどのように損なう可能性があるかについては触れられていない。食道閉鎖症に関連する多くの遺伝子の中で、食道発生における２つの遺伝子、Ｓｏｘ２とＦａｎｃｏｎｉ貧血遺伝子（ＦＡＮＣＡ）の役割をここで説明する。
以前の研究は、食道の発達およびホメオスタシスにおけるＳｏｘ２の役割を検討した。Ｓｏｘ２ハイポモルフィック胚では、前腸分離が起こった変異胚の食道は、層状扁平上皮マーカーｐ６３およびＫｒｔ１４の発現の欠如、ならびに胃および腸のマーカーの発現（Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００７）を含む、特性が変化した。ただし、これらの結果は、Ｓｏｘ２が食道の成長と成熟を促進するための継続的な要件とは対照的に、変異体前腸における早期の誤パターン化の結果である可能性があるため、これらの結果をＳｏｘ２の早期対後期の食道発生における役割で解釈することは困難である。成人の食道での研究は、Ｓｏｘ２が発達段階を過ぎても役割を果たし続けることを示唆する。食道内のＳｏｘ２発現細胞はホメオスタシスを維持するために重要であり、アブレーションを行うと、基底層と食道内に存在する異型細胞が完全に失われる（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。成人の食道における基底細胞のマーカーとしての役割を果たすだけでなく、食道におけるＳｏｘ２の過剰発現は、基底コンパートメントの拡大と基底上層の分化の低下をもたらす（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。食道とは別に、Ｓｏｘ２は他の内胚葉性器官で恒常性維持の役割を果たす。気管では、出生後にＳｏｘ２が失われると、増殖が減少し、基底細胞（ｐ６３＋が少ない）、繊毛細胞、クララ細胞の割合が減少する（Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００９）。しかし、成人の胃では、Ｓｏｘ２は腫瘍抑制の役割を果たす可能性があるが、組織のホメオスタシスには不可欠ではないようである（Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。それにもかかわらず、食道の発達（前腸分離）におけるＳｏｘ２の役割はまだ慎重に検討されていないため、食道閉鎖症患者の他の問題に対する洞察が得られる可能性がある。
ファンコーニ貧血は（任意の特定のＦＡＮＣ相補群遺伝子の）劣性障害であり、他のＧＩ欠陥の中でも特に食道閉鎖症に関連するが、これらのＧＩ問題は患者のサブセット（すなわち、低浸透率）でのみ発生する（ＦａｕｓｅｔｔおよびＫｌｉｎｇｅｎｓｍｉｔｈ）、２０１２）。多くの患者には複数の臓器系にまたがる欠陥があるが、一部の患者には大きな先天性欠陥はない。さまざまな患者で、血液学的問題に加えて、存在する欠陥は、脊椎、肛門、心臓、気管食道、腎臓、および四肢の欠陥からなる、ＶＡＣＴＥＲＬの症状の関連と類似する（Ａｕｅｒｂａｃｈ、２００９）。ファンコニ貧血を引き起こすすべてのＦＡＮＣ補完グループ遺伝子のうち、最も一般的なのはＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧである（Ａｕｅｒｂａｃｈ、２００９；Ｎｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。Ｓｈｈ変異体とファンコーニ貧血の症状の類似性に基づき、Ｓｈｈシグナル伝達経路がファンコーニ貧血に関与する可能性があると考えられる（Ｌｕｂｉｎｓｋｙ、２０１５）。ただし、ファンコニー貧血の一部の症例で食道閉鎖症がどのように発症するかについては、ほとんど何もわかっていない。ファンコニ貧血患者で食道閉鎖症がどのように発症するかを理解する上での障害は、ファンコニ貧血のマウスモデルではほとんどの発生異常が再現されない（Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。したがって、開発の人間のオルガノイドモデルを使用すると、ファンコニー貧血のさまざまなＧＩ奇形の病因を理解する上で画期的な可能性がある。
先天性疾患である食道閉鎖症に加えて、出願人は、バレット食道などの食道に影響を与える後期の疾患にも関心がある。バレット食道（またはバレット化生）は、食道の層状扁平上皮が円柱状（腸のような）上皮に変化し、食道腺癌の素因となる（Ｄｅ Ｊｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。この変換の基になるメカニズムは活発に研究されており、この異所性円柱上皮の起源細胞に関する複数の仮説がある。これらのうち、より可能性の高いモデルには、食道細胞の腸様細胞への変換、胃食道接合部での移行上皮の変換、および粘膜下腺の変換が含まれる（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｌｅｅｄｈａｍ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ａｌ．、２０１０）。
この仮説を試験する以前の研究は、酸および胆汁酸塩が培養食道細胞においてＣｄｘ１およびＣｄｘ２を、おそらくＣｄｘ２プロモーターを調節することによってアップレギュレートすることを見出した（Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｋａｚｕｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．、２００６、２００９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、２００７）。さらに、培養では、酸性塩と胆汁酸塩が重層扁平上皮遺伝子のダウンレギュレーションを引き起こす（Ｇｈａｔａｋ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。ただし、Ｃｄｘ２誘導だけでは食道細胞を完全に形質転換することはできないようだが、一部の重層扁平上皮遺伝子の穏やかなダウンレギュレーション、腸内遺伝子（Ｍｕｃ２、Ｖｉｌｌｉｎ）の上方制御、上皮の形態の穏やかな変化（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌら、２０１１；Ｌｉｕら、２００７）。ＢＭＰの活性化は、単独で、またはＣｄｘ２と組み合わせて、マウスの食道および培養ヒト食道細胞の重層扁平上皮遺伝子をダウンレギュレートする強力な効果があるように見えるが、これらの変化は、形態学または円柱上皮による完全な形質転換にはまだほど遠いです遺伝子発現（Ｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。ＷｎｔやＮｏｔｃｈなどの他のシグナル伝達経路は、胆汁酸に曝された食道細胞で変化する可能性がある（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。Ｎｏｔｃｈ阻害は、培養食道細胞にいくつかの変化をもたらす。これには、重層扁平上皮遺伝子のダウンレギュレーション、円柱上皮遺伝子のアップレギュレーション、および基底コンパートメントの細胞間スペースの増加が含まれる（Ｋａｓａｇｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８；Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。ただし、これらの研究から、他のすべての形態学的変化の結果として単に変更されるのではなく、バレット化生の病因にどのシグナル伝達経路が関与しているかは不明である。したがって、ＨＥＯは、より生物学的に関連性の高いモデルで、これらの疑わしいシグナル伝達経路の迅速なコンビナトリアルスクリーニングを可能にする可能性がある。
小児および成人の食道に影響を与える別の疾患は、好酸球性食道炎であり、これは、摂食または食物収着、嘔吐、および腹痛の困難を引き起こす慢性免疫介在性疾患である。罹患した食道は、線維症からの食道狭窄、筋肉壁の肥厚、基底細胞過形成および上皮内の細胞間空間の拡張、および食道上皮における高レベルの好酸球の特徴的な所見を含むいくつかの変化を受ける（Ｆｕｒｕｔａ ａｎｄ Ｋａｔｚｋａ、２０１５）。古典的には、炎症を起こした食道が免疫細胞を動員し、障害のあるバリアをさらに維持するため、バリアの障害と特定の抗原への曝露が病気を開始し、維持すると考えられる（Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｆｕｒｕｔａ ａｎｄ Ｋａｔｚｋａ、２０１５）。
動員された２型ヘルパーＴ細胞（および他の免疫細胞）は、食道上皮および周囲の層に広範な変化を引き起こす複数のサイトカインを分泌する。上皮では、ＩＬ−１３は好酸球を誘引するケモカインであるエオタキシン−３（またはＣＣＬ２６）をアップレギュレートする。ＣＣＬ２６およびその他の標的炎症遺伝子に加えて、ＩＬ−１３への曝露は、マウス食道の基底細胞過形成、および分化した重層扁平上皮マーカー（ＦＬＧ、ＩＶＬ、ＳＰＲＲファミリーのタンパク質など）のダウンレギュレーションを引き起こす（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１５；ＫＣ ｅｔ ａｌ．、２０１５；Ｒｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１７）。ＩＬ−１３で処理された食道ケラチノサイトの気液界面培養も経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の低下を示し、バリア機能障害を示す（Ｄ'Ｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、２０１６；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。
結果
後期食道発生におけるＳｏｘ２の役割
食道の発生および成熟（気道からの食道の分離）におけるＳｏｘ２の役割を調べるために、出願人は、前の章と同じマウスモデルを利用して、Ｓｏｘ２発現細胞においてＳｏｘ２を条件付きでノックアウトした。出願人は、雄のＳｏｘ２ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスと雌のＳｏｘ２ｆｌ／ｆマウスを交配させ、Ｅ１１．５とＥ１４．５のタモキシフェンでダムを強制経口投与したか、Ｐ１の子犬にタモキシフェンを注入し、様々な発達段階（図１Ａ）の食道におけるＳｏｘ２欠損の影響を調べるために強制飼養後数日間採取した。野生型と比較して条件付きノックアウトの食道にあるほとんど単純な円柱上皮から明らかなように、Ｓｏｘ２の早期喪失（Ｅ１１．５での強制給与）は、Ｅ１４．５での層別化の遅延をもたらし、この段階で２つの層に層化する（図１Ｂ）。層状化は正常に見えるが、Ｓｏｘ２（Ｅ１４．５胃管栄養法）を後でノックアウトすると、食道はやや小さくなる。最後に、Ｓｏｘ２（Ｐ１）の生後早期のノックアウトでは、食道に大きな変化は見られない（図１Ｂ）。前腸の分離後にＳｏｘ２がノックアウトされたこれらの胚では、Ｅ１１．５強制胃はＥ１７．５でＮｋｘ２−１を発現する食道にいくつかの細胞を有していた（図１Ｂ、１Ｅ）が、食道ではＮｋｘ２−１の即時の再発現はなかった。
最も明白な変化はＥ１１．５強制栄養胚でのみ起こったので、出願人は様々なパターン化および分化マーカーについてＥ１７．５でこれらの食道をより注意深く調べた。概して、食道上皮は（それ自体の上で）折り畳みが少なく、平均管腔直径が大きかった。Ｓｏｘ２の確認的な損失に加えて、Ｓｏｘ２ノックアウト食道の基底層は正常に見える−ｐ６３とＫｒｔ１４を発現し、Ｋｒｔ８発現を欠く（図１Ｃ）。ただし、基底上層は明らかに変更される。Ｋｒｔ１３は存在せず、Ｋｒｔ８はしっかりと表現される。野生型食道には存在しない増殖性（Ｋｉ６７＋）の陽性細胞がある。そして、上皮形態は円柱上皮として存続する（図１Ｃ〜Ｄ）。ただし、出願人はＭｕｃ２またはＭｕｃ５ａｃの産生の証拠を見つけられなかったが、今後の分析（アルシアンブルー染色など）により粘液の生成が明らかになる可能性がある（データ未掲載）。Ｓｏｘ２ノックアウト食道でＮｋｘ２−１を発現するいくつかの細胞は別として、他の重要な腸および胃のマーカーは、Ｓｏｘ２ノックアウト食道のどちらの野生型でも発現されなかった（図１Ｅ）。Ｓｏｘ２が初期のパターン形成で果たす重要な役割に加えて、これらのデータは、気道から食道を分離した後の適切な食道の発達と成熟にＳｏｘ２が必要であることを直接示す。
ファンコーニ貧血および初期の食道発達
Ｓｏｘ２に加えて、他の様々な遺伝子が食道閉鎖症に関連しており、これらの遺伝子のいくつかの変異に起因する前腸欠損の根底にあるメカニズムは不明である。ファンコニ貧血補完群遺伝子の喪失は、閉鎖症（食道、十二指腸、肛門）、ＣＮＳ欠損、腎欠損、成長異常などのＧＩ問題（Ａｕｅｒｂａｃｈ、２００９；Ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１０）を含む浸透度の変動に関する複数の問題を引き起こす可能性がある。これらの遺伝子が食道閉鎖症をもたらす方法を理解するために、出願人は、ＨＥＯを使用した食道発生におけるＦＡＮＣＡ欠乏症の影響をモデル化しようとした。
出願人は、ｄｏｘ誘導性ＦＡＮＣＡ構築物を使用して維持／救済され得るＦＡＮＣＡを欠く患者から生成されたｉＰＳＣ系統を使用した。この系統は、ドキシサイクリン処理の有無にかかわらず、本明細書に記載されているＨＥＯの生成に成功した（図２Ａ）。前腸のパターン形成は、ＦＡＮＣＡの発現が低いか、または存在しない場合に変化するようには見えなかった（図２Ｂ）。背側前部前腸スフェロイドがＨＥＯに成長すると（２〜４週間）、ＦＡＮＣＡ欠損オルガノイドは「コントロール」／レスキュー（＋ｄｏｘ）オルガノイドよりも一貫して小さいように見える（図２Ｃ、２Ｆ）。しかしながら、ファンカ欠損ＨＥＯは、１ヶ月で対照ＨＥＯと比較してＫＩ６７＋細胞の数が増加した（図２Ｄ、２Ｇ）。どちらの条件でも（細胞分裂したカスパーゼ３染色による）細胞死に違いはないようである（データ未掲載）。さらに、出願人は、２つの条件間での重層扁平上皮マーカーの発現に有意差を認めなかった（データ未掲載）。オルガノイドがドキシサイクリン処理に応答し、ＦＡＮＣＡを発現したことを確認するために、出願人はＦＡＮＣＡが存在する場合のＦＡＮＣＡとヒドロキシ尿素処理に対するＦＡＮＣＤ２の応答を調査した。ウエスタンブロッティングにより、ドキシサイクリン処理の有無によるＦＡＮＣＡのノックアウトとレスキュー、およびドキシサイクリンとヒドロキシ尿素処理時のＦＡＮＣＤ２タンパク質サイズの変化が明らかになった（図２Ｅ）。
ＨＥＯを使用したバレット食道のモデリング
出願人はまた、前腸および食道の発達における初期の欠陥を研究することに加えて、バレット化生などの食道に影響を与える後の疾患をモデル化するためにＨＥＯを適用することも望んだ。起源細胞を特定し、層状扁平上皮が腸（円柱）上皮に変化するメカニズムを理解しようとする多くの研究があった。ただし、マウスの人間の病理学的プロセスを正確にモデル化することは難しいため、ＨＥＯモデルを使用すると、バレット食道がどのように発生するかを理解するための補足的なアプローチとして役立つと考えられる。
出願人は、前腸および食道の初期の発達に焦点を当てることから始めた。出願人は、ｈＰＳＣにおいて安定に形質導入されるｄｏｘ誘導性ＣＤＸ２構築物を利用し、次いでこれを使用してＨＥＯを生成する（図３Ａ〜３Ｂ）。最初に、前部前腸（ＡＦＧ）培養物をドキシサイクリンで１日間さまざまな用量で処理し、ほとんどの細胞でＣＤＸ２を誘導するのに必要な適切な濃度を測定し、これは１００−５００ｎｇ／ｍＬ前後で飽和するように見えた（図３Ｃ−３Ｅ）。興味深いことに、ＳＯＸ２の発現は前腸前腸細胞におけるＣＤＸ２の短時間（２４時間）の誘導では抑制されず、ＣＤＸ２（単独）はＳＯＸ２の転写を直接抑制しないことが示唆された（図３Ｃ−３Ｄ）。
ＨＥＯの増殖における最初の月のドキシサイクリン治療の継続は、ＭＵＣ２が変化しないままである一方で、ＨＥＯがＣＤＸ１およびＣＤＨ１７などのいくつかの腸マーカーを上方制御する結果となった（図３Ｇ−３Ｊ）。重層扁平上皮マーカーｐ６３は抑制され、ＳＯＸ２は適度にダウンレギュレートされているように見え、これは、６日目の前腸前培養における以前の結果と一致する（図３Ｄ、３Ｋ−３Ｌ）。さらに、成層扁平上皮マーカーＫＲＴ５およびＫＲＴ１３は、発達中のＨＥＯでＣＤＸ２誘導によって変化しない（データ未掲載）。これらの２つの主要な転写因子（前腸のＳＯＸ２と後腸のＣＤＸ２）間の調節相互作用をさらに調べるために、出願人はヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）にＳＯＸ２を誘導した（図８Ａ−８Ｂ）。これらの培養において、出願人は、ＳＯＸ２でのＨＩＯの処理が、層状扁平上皮マーカーｐ６３およびＫＲＴ１３（穏やかに）の上方調節、ならびにＣＤＨ１７およびＣＤＸ２の下方調節をもたらすことを見出した（図８Ｃ−Ｅ、８Ｇ−８Ｈ）。ＳＯＸ２によって誘発されたＨＩＯでは、胃で発現されるマーカーであるＣＬＤＮ１８のアップレギュレーションも見られるが、コントロールＨＩＯにはある程度のばらつきがあることに注意することが重要である（図８Ｃ、データ未掲載）。ＰＤＸ１、遠位胃または近位腸のマーカーは、ＳＯＸ２誘導によるダウンレギュレーションに向かう傾向があるが、その発現もしばしばコントロールＨＩＯで変動する（図８Ｆ）。ともに、これらのデータは、ＳＯＸ２が中／後腸の運命を阻害するより強い効果を発揮する一方で、ＣＤＸ２だけでは、初期の発達中に前腸／食道の運命をしっかりと抑制することができないことを示唆する。
可塑性が古典的にますます制限されていると古典的に考えられているときに、開発後期（またはＨＥＯプロトコル）でＣＤＸ２の調節作用が持続するかどうかを決定するために、出願人はＨＥＯを６週齢まで成長させ、８日間ドキシサイクリンで処理した（図４Ａ）。この場合、ＳＯＸ２とｐ６３は、ＣＤＸ２誘導に応答してダウンレギュレートされたが、最小限の応答および／または最小限のＣＤＸ２誘導を持ついくつかのＨＥＯがあった（図４Ｂ−４Ｅ、データ未掲載）。ＣＤＸ２誘導性システムの変動性のため、出願人は細胞分解能での分析を選択した。出願人は、細胞をカウントし、３つのカテゴリーに分類した：未誘導、ＣＤＸ２低（誘導）、およびＣＤＸ２高（誘導）（図４Ｆ−４Ｇ）。分析を基底細胞に限定すると、ＳＯＸ２とｐ６３の両方がＣＤＸ２高基底細胞では強く抑制されるが、多くの細胞は、ＳＯＸ２またはｐ６３をＣＤＸ２低基底細胞でＣＤＸ２と共発現できる（図４Ｈ−４Ｉ）。これは、すべての細胞が高レベルでＣＤＸ２を発現した場合、これらの主要な食道転写因子が効果的に抑制されることを示唆する。
食道（層状扁平上皮）のアイデンティティを抑制することにおけるＣＤＸ２の役割をさらに調べるために、出願人は、ＣＤＸ２誘導を伴う食道の分化マーカーを、ならびにノッチ（γ−セクレターゼ）阻害剤と一緒にＤＡＰＴと併せて調べた（図５Ａ）。食道におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の標的遺伝子であるＨＥＳ５は、ＤＡＰＴを添加するとダウンレギュレートされる（図５Ｆ）。一部のオルガノイドがＫＲＴ５発現を完全に失うことから明らかなように、ＫＲＴ５はＣＤＸ２誘導によりダウンレギュレートされ、ＤＡＰＴ添加によりさらにダウンレギュレートされる（図５Ｂ、５Ｈ）。ＫＲＴ１３もダウンレギュレートされるが、ＤＡＰＴ治療との相乗効果は見られない（図５Ｃ）。ＤＡＰＴ処理ありまたはなしのＣＤＸ２誘導ＨＥＯでは、より分化したマーカーＩＶＬおよびＣＲＮＮがダウンレギュレートされる（図５Ｄ、５Ｈ）。最後に、ＣＤＨ１７の目に見えるタンパク質発現を有するオルガノイドを見つけることはまれだったが、ＣＤＨ１７は、ＣＤＸ２誘導によって適度に上方制御されているように見える（図５Ｅ、５Ｈ）。これは、ＣＤＸ２が層状扁平上皮マーカーを抑制できることを示唆しており、Ｎｏｔｃｈの阻害によりこの効果は最小限に抑えられる。
ＢＭＰシグナル伝達は食道から腸細胞への変換に関係するので、出願人はＨＥＯにおけるＢＭＰシグナル伝達の影響も調べた（図９Ａ）（Ｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。さらに２週間ＢＭＰ４で６週齢のＨＥＯを処理すると、層別化と分化マーカーの発現が失われる（図９Ｂ、９Ｇ−９Ｊ）。残りの基底細胞はアクティブなＢＭＰシグナリング（ｐＳＭＡＤ１／５／９＋）を持ち、ｐ６３を発現するが、ＳＯＸ２の発現を失う（図９Ｂ、９Ｄ−９Ｅ）。さらに、ＢＭＰ４で処理されたＨＥＯにはＥｄＵの取り込みが最小限であった。これは、細胞のターンオーバーが劇的に遅くなったことを意味する（図９Ｂ〜９Ｃ）。ＣＤＸ２の発現は、ＢＭＰ４で処理されたＨＥＯでは変化しなかったが、ＣＤＸ２の誘導により、ＢＭＰのターゲットであるＩＤ１がダウンレギュレーションされた（図５Ｇ、データ未掲載）。まとめると、これは、ＢＭＰシグナル伝達が、ＣＤＸ２が誘導されたときにＢＭＰシグナル伝達の減衰を打ち消すことにより、重層扁平上皮のダウンレギュレーションを強化する可能性があることを示唆する。
ＨＥＯを使用した好酸球性食道炎のモデル化
最後に、出願人は、ＨＥＯを使用して、食道に影響を与える炎症性疾患である好酸球性食道炎をモデル化できるかどうかを試験した。出願人は、好酸球性食道炎のモデル化でＨＥＯを検証するために、食道に広範な変化をもたらすことが知られるサイトカインであるＩＬ−１３に対する上皮反応に焦点を当てた。出願人は、６〜８週齢のＨＥＯを様々な期間ＩＬ−１３で処理し、ＨＥＯの複数の特性を調べた（図６Ａ）。最初に、出願人は、短期間のＩＬ−１３治療に対する標的遺伝子ＣＣＬ２６、ＣＤＨ２６、ＣＡＰＮ１４、およびＳＥＲＰＩＮＢ４の応答を検証した（図６Ｂ〜６Ｅ）。ＩＬ−１３による長期治療は、いくつかの標的遺伝子ＳＥＲＰＩＮＢ１３およびＣＤＨ２６の上方制御を維持した（図６Ｆ）。これらの標的遺伝子のアップレギュレーションに加えて、ＥｄＵの取り込みは最も基底のｐ６３＋細胞で増加しており、基底細胞がＩＬ−１３への長時間の曝露でより増殖性であることを示唆する（図６Ｇ−６Ｈ）。
次に、出願人は、ＩＬ−１３での処置の際の重層扁平上皮の形態および分化を調べた。ＩＬ−１３で処理されたＨＥＯは、後期分化および構造タンパク質ＤＳＧ１、ＩＶＬ、およびＣＲＮＮをダウンレギュレートしたが、対照オルガノイドは、ＲＮＡによるこれらの分化マーカーの発現に有意な変動性を有した（図７Ａ〜７Ｄ）。さらに、上皮は細胞間空間を基底上で拡張し、電子顕微鏡を使用すると、個々の細胞間の空間が増加し、細胞間接触が減少した（図７Ａ、７Ｇ）。これらのデータは、他のモデルシステムと比較した場合、ほとんどの場合、ＨＥＯがＩＬ−１３治療に期待どおりに反応することを示唆する。
最後に、ＢＭＰシグナル伝達は好酸球性食道炎にも関与しており、特にＢＭＰ拮抗薬であるフォリスタチンが罹患した食道でダウンレギュレートされるため、出願人はＢＭＰ活性化が疾患過程のいくつかの側面を逆転できるかどうかを調べた（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。しかし、ＩＬ−１３で誘発されたマウス食道とは異なり、ＨＥＯはＢＭＰアンタゴニストであるＮＯＧおよびＦＳＴを上方制御しなかった（図７Ｅ−Ｆ）（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。これは、ＢＭＰ標的遺伝子ＩＤ３のＩＬ−１３（およびＢＭＰ４）処理への穏やかな増加によって反映される（図７Ｌ）。これにもかかわらず、ＩＬ−１３およびＢＭＰ４でのＨＥＯの処置により、ＩＬ−１３のみと比較して、ＳＯＸ２およびＰＴＣＨ１の発現は正常化して対照に戻る（図７Ｈ、７Ｋ）。ＩＬ−１３の標的であるＣＣＬ２６およびＣＤＨ２６も、ＢＭＰ４の添加によりダウンレギュレートされた（図７Ｉ〜７Ｊ）。ただし、層状扁平上皮マーカーであるＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、ＩＶＬ、およびＣＲＮＮは、ＩＬ−１３処理のみと比較して、ＢＭＰ４およびＩＬ−１３の添加によって一貫して変化しなかった（データ未掲載）。したがって、ＢＭＰシグナル伝達の活性化は、ＩＬ−１３によって誘発される疾患プロセスのいくつかの側面を逆転または打ち消す可能性がある。
結果は、以前に公開された実験といくつかの類似点を共有した。胚発生の全体にわたって低いＳｏｘ２レベルを有したｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃなＳｏｘ２モデルとは対照的に、出願人は、食道発生においてＳｏｘ２が必要であるプロセスと時期を注意深く調べることができた。したがって、出願人は食道の基底層がＫｒｔ１４およびｐ６３の発現によりＳｏｘ２の中胚葉性（Ｅ１１．５）ノックアウトでは無傷であるのに対し、以前のノックアウト（Ｅ８．５）または低形性Ｓｏｘ２では食道が区別された胚はこれらのタンパク質の発現が低下しているか、存在していなかった（Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００７）。結果は、後のＳｏｘ２ノックアウトの時期までに食道でのｐ６３発現の確立が原因である可能性があり、その後、ｐ６３だけで基礎発生を維持できる可能性がある。グローバルなＳｏｘ２ハイポモルフと胚中期のＳｏｘ２ノックアウトのもう１つの違いは、後のＳｏｘ２ノックアウト食道は異なる組織アイデンティティー（腸、胃、呼吸器）を獲得していないようであり、食道運命の確立がＥ１１．５によって設定されたことを示唆する。興味深いことに、この結果は、Ｅ１１．５でのＳｏｘ２の喪失が基底上分化の喪失と基底上増殖の増加をもたらしたことを示す。これは、Ｓｏｘ２が胃の発達中に増殖を抑制する方法と似ている（Ｈａｇｅｙ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。Ｓｏｘ２の出生後期または出生後早期のノックアウトによる食道への影響は最小限であるように見え、Ｓｏｘ２は成人の食道では主要な役割を果たさず、気管と比較して胃に類似している可能性がある（Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。したがって、食道運命は中胚発生によって設定される可能性があるが、結果は、前部前腸の最初のパターン形成後の継続的なＳｏｘ２発現が適切な食道の分化と成熟に必要であることを示す。ただし、より多くのマウスおよび損傷モデルを用いた長期研究により、胚発生後期および出生後の食道におけるＳｏｘ２の役割が明らかになる可能性がある。
他の疾患、ファンコニー貧血、バレット食道、および好酸球性食道炎について、出願人は、ＨＥＯを使用して食道の変化をモデル化することを試みた。ファンコニ貧血の食道閉鎖症をＨＥＯでモデル化しようとする場合、主な障害は、ファンコニー貧血の少数の患者だけがＧＩ奇形を持っている。この研究でｉＰＳ系統の生成に使用された特定の患者には、食道閉鎖症がなかったが、ＦＡＮＣＡ変異は食道閉鎖症と関連する（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。ＦＡＮＣＡが失われるとＤＮＡ損傷に対する感受性が高まるため、出願人は細胞死を調べたが（切断されたカスパーゼ３染色により）、差は認められなかった（どちらの場合も正確には、細胞死の有意な量は認められなかった）。これは、化学療法剤を追加しなかったため予測されなかったかもしれない。興味深いことに、ＦＡＮＣＡ欠損ＨＥＯはサイズが小さいにもかかわらず、対照ＨＥＯに比べて増殖性細胞が多く、これは培養中のＦＡＮＣＡ欠損皮膚ケラチノサイトで見られた結果と似ている（Ｈｏｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、２００９）。ただし、この違いは別として、出願人は分化の変化を発見できなかった。ＨＥＯを使用して食道閉鎖症をモデル化する際の注意点の１つは、培養条件が不足を補ったり補完したりする可能性があることである。さらに、１か月の時点での分析は、プロトコルの初期段階で欠乏がその影響のほとんどをもたらした可能性があるという点で、遅すぎる場合がある。
次に、出願人は、ＨＥＯを使用してバレット食道をモデル化しようとした。以前のＨＥＯで、出願人は、ＣＤＸ２誘導がいくつかの重層扁平上皮マーカーのダウンレギュレーションにつながることを発見し、これは、食道ケラチノサイト株（ＥＰＣ２）で行われた同様の実験で生じた最小限の変化とは対照的です（Ｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。出願人の結果は、ＣＤＸ２誘導が腸の遺伝子を確実に上方制御できないことと一致しており、他のモデルでＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を使用することで示すように、追加の因子の必要性を示唆する（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００９、２０１１；Ｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。ノッチ抑制は、器官型ラフト培養を使用した以前の研究とは異なり、ＨＥＯでこの変換を穏やかに（または無視できるほど）増加させるように見えた（Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。出願人は同様に、ＢＭＰの活性化も重層扁平上皮遺伝子をダウンレギュレートすることを発見したが、私たちの場合、これは幹細胞／前駆細胞の細胞周期停止によって媒介される可能性がある（Ｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。
出願人はまた、ＨＥＯまたはＨＩＯ分化プロトコルにおいてＣＤＸ２およびＳＯＸ２を（それぞれ）誘導して、運命間のこの切り替えを調節する転写ネットワークを調べる。マウスでの研究と一致して、ＨＩＯでのＳＯＸ２誘導はＣＤＸ２をダウンレギュレートし、さまざまな前腸系統、ｐ６３、ＫＲＴ１３、およびＣＬＤＮ１８の遺伝子をアップレギュレートするが、上皮は依然として主に円柱状である（Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。興味深いことに、初期の前腸培養における短時間のＣＤＸ２誘導は、ＳＯＸ２発現を直接調節／抑制せず、初期内胚葉で、いくつかのＳＯＸ２＋ＣＤＸ２＋二重陽性細胞が存在することが示される（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、２００９）。ただし、培養とＣＤＸ２誘導を初期（または後期）ＨＥＯに拡張すると、ＳＯＸ２とｐ６３が抑制され、ＣＤＸ２がＳＯＸ２とｐ６３を調節する下流のターゲットを変更する可能性があることを示唆する。また、後期のＣＤＸ２誘導とは異なり、ＣＤＸ２誘導を早期に開始すると、ＣＤＨ１７の有意な上方制御が生じ、オルガノイドが成熟するにつれて早期に可塑性が失われることが示唆する。したがって、これは、食道上皮を腸上皮に、またはその逆に完全に変換するには、複数の変更が必要であることを示唆する。あるいは、バレット食道の化生を引き起こす細胞は、重層扁平上皮ではない可能性がある。
最後に、ＨＥＯを使用して好酸球性食道炎の上皮変化をモデル化することができる。ＨＥＯをＩＬ−１３で処理すると、分化した重層扁平上皮遺伝子のダウンレギュレーションなど、ＩＬ−１３で処理された気液界面（ＡＬＩ）食道培養を使用して同様の応答が得られた（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．、２０１０； ＫＣ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。さらに、ＩＬ−１３で処理されたＨＥＯの増殖の増加は、基底細胞過形成の開始を示している可能性があるが、ＨＥＯでは、オルガノイドが自由に拡大できるため、実際の基底層の肥厚を評価することは困難で、発生しない場合があります三次元の文化に吊り下げられる。他の研究と同様に、細胞間空間の増加やＤＳＧ１のダウンレギュレーションなど、バリア機能障害の兆候が見られれるが、バリア機能は、ＡＬＩ培養のように経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することで直接評価されていない（Ｄ'Ｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、２０１６；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１６；Ｋａｓａｇｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。したがって、ＨＥＯはＩＬ−１３治療に対して予想通りに反応するようである。
好酸球性食道炎において誤調節される可能性のある様々なシグナル伝達経路が調査された。好酸球性食道炎のヒト生検およびマウス食道でＩＬ−１３が誤発現した実験では、ＢＭＰシグナル伝達が低下し、ＢＭＰ拮抗薬であるフォリスタチンが上方制御された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。しかしながら、出願人は、ＩＬ−１３で処理されたＨＥＯにおけるＢＭＰ拮抗薬およびＢＭＰ活性化における穏やかであるが反対の変化を発見した。しかし興味深いことに、ＩＬ−１３で処理されたＨＥＯのＢＭＰ活性化は、ＳＯＸ２といくつかのＩＬ−１３標的遺伝子のダウンレギュレーションから明らかなように、ＩＬ−１３のみで処理されたＨＥＯで発生するいくつかの変化を覆す。さらに、ＰＴＣＨ１をヘッジホッグシグナリングアクティビティの読み取り値として使用すると、ＩＬ−１３処理によりＰＴＣＨ１が上方制御される（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。ハリネズミシグナル伝達のこの潜在的な増加は、上皮の増殖の増加と分化の減少にリンクしている可能性がある。これは、Ｐｔｃｈ１変異マウス食道と食道扁平上皮癌の研究に似ている（ｖａｎ Ｄｏｐ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。これらの選択した食道の病状をモデル化することにより、出願人は、これらの根本的なメカニズムと、できれば食道に影響を及ぼす他の疾患をよりよく理解するための補足モデルとしてＨＥＯを使用できることを実証した。
材料および方法
マウス
野生型および変異マウスを、前腸および食道発生に関する研究に使用した。Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌマウスはＲｉｃｈａｒｄ Ｌａｎｇの研究室（Ｓｈａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、２００９）から、Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ（素材＃０１７５９３、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．、２０１１）はジャクソン研究所から入手した。妊娠中のダムは、適切な段階でＣｒｅＥＲを活性化するために０．１２ｍｇ／ｇマウスのタモキシフェンで様々な段階で強制飼養された。マウスは、実験動物の世話と使用に関するＮＩＨガイドラインに従って、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＨＭＣ）の動物施設に収容された。動物を１２時間の明暗サイクルで維持し、水と標準的な固形飼料を自由に摂取させた。すべての実験で健康な動物を使用した。すべての実験は、ＣＣＨＭＣの施設内動物管理および使用委員会（プロトコルＩＡＣＵＣ２０１６−０００４）の承認の下で行われた。
ヒトＥＳＣ／ＩＰＳＣおよびメンテナンス
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｈ１（ＷＡ０１、男性）は、ＷｉＣｅｌｌから購入した。 ｉＰＳＣラインｉＰＳ１０６は社内で生成され、ＣＣＨＭＣの機関審査委員会によって承認された。すべてのｈＰＳＣはフィーダーフリーの培養で維持された。細胞はｈＥＳＣ認定のマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）に播種され、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を毎日交換して３７℃、５％ＣＯ２で維持された。Ｄｉｓｐａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞を４日ごとに定期的に継代した。ＨＡタグ付きＳＯＸ２、ＣＤＸ２、またはＦＡＮＣＡ ｄｏｘ誘導株は、最初にヒトＳＯＸ２ ＯＲＦ、ＣＤＸ２ ＯＲＦ、またはＦＡＮＣＡ ＯＲＦをｐＩＮＤＵＣＥＲ２０（それぞれ）にクローニングすることによって生成された（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４４０１２、Ｍｅｅｒｂｒｅｙ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。次に、レンチウイルスはＣＣＨＭＣのウイルスベクターコアファシリティの助けを借りて生成された。ＨＡ−ＳＯＸ２およびＣＤＸ２用のレンチウイルスは、２μＬのウイルスを含むｈＥＳＣに導入された。これらの系統は、ｍＴｅＳＲ１とＧ４１８（５００μｇ ｍＬ−１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での選択で維持された。ＦＡＮＣＡのレンチウイルスは、ｈＰＳＣプロパティの維持にＦＡＮＣＡが必要であるため、ｉＰＳ１０６系統の生成前に形質導入された。ｉＰＳ１０６ラインを使用したＨＥＯのファンコニ貧血モデリングを除くすべての実験で、ｈＥＳＣ Ｈ１ライン（および変換された誘導体）が使用された。
前腸前培養物およびスフェロイドの分化
コンフルエントなｈＰＳＣ培養物をＡｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して、ｍＴｅＳＲ１およびＹ−２７６３２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）に単一細胞として再懸濁し、マトリゲルにプレーティングした。翌日、前述のように胚体内胚葉への分化が行われた（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。簡単に言うと、細胞は、ＲＰＭＩ １６４０メディア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、初日にアクチビンＡ（１００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム、ミネアポリス、ミネソタ州）およびＢＭＰ４（５０ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）で処理された。次の２日間の細胞を、ＲＰＭＩ １６４０のアクチビンＡ（１００ｎｇ ｍＬ−１）のみで処理し、濃度を０．２％および２％のＨｙＣｌｏｎｅ定義のウシ胎仔血清（ｄＦＢＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。
前胚葉スフェロイドの生成のために、胚体内胚葉から、細胞をＷｎｔ３ａ（５００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）で２日間、およびＦＧＦ４（５００ｎｇ ｍＬ−１、Ｒ&Ｄシステム）、ノギン（２００ｎｇ ｍＬ−１）で２％ｄＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０で３日間処理した。上記のように、前部前腸スフェロイドの三次元培養およびヒト食道オルガノイドへの分化が得られた。
免疫蛍光分析
組織培養を、室温で１５分間（単層培養の場合）、または４℃で一晩（オルガノイドの場合）のいずれかで４％パラホルムアルデヒドで固定した。組織をＰＢＳで完全に洗浄し、単層培養用に染色し、オルガノイドを完全に洗浄してから、３０％スクロースに一晩放置し、ＯＣＴ化合物（ＶＷＲ）に埋め込み、厚さ８μｍで薄切した。その後、スライドをＰＢＳ中の０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理し、５％の通常のロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で最低１時間ブロックし、一次抗体中で一晩４℃でインキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳで完全に洗浄し、二次抗体（１：５００）で１時間インキュベートした後、再度完全に洗浄した。 ＥｄＵの視覚化には、ブロッキングの前にＣｌｉｃｋ−ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。使用した抗体と希釈液を表１に示す。
ＲＮＡ単離およびｑＰＣＲ
単層培養物およびオルガノイドは、プレーティング／包埋マトリゲルを含めて、合計で収穫された。トータルＲＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して分離され、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。ｑＲＴ−ＰＣＲの場合、出願人はＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６マシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を実行した。使用したプライマーを表２に示す。
文献
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Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｔｅｖｅｂａｕｇｈ，Ｗ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｑｕｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｘ．（２０１２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｙｎａｍｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ１ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，７（５），ｅ３６５０４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３６５０４
Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．，ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ａ．Ｌ．Ｒ．Ｔ．，Ｈｏ，Ｓ．−Ｈ．，Ｉｓｌａｍ，Ｍ．Ｎ．，Ｖｏｌｐｉ，Ｓ．，Ｎｏｔａｒａｎｇｅｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｃｉａｎｃａｎｅｌｌｉ，Ｍ．，Ｃａｓａｎｏｖａ，Ｊ．−Ｌ．，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｊ．，Ｌｉａｎｇ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９（５），５４２−５４９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｂ３５１０
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Ｄａｎｉｅｌｙ，Ｙ．，Ｌｉａｏ，Ｇ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｒ．Ｉ．，Ｌｏｒｉ，Ａ．，Ｒａｎｄｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．，Ｏｒｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｊｅｔｔｅｎ，Ａ．Ｍ．（２００４）．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐ６３ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｒｍａｌ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ａｎｄ ｔｒａｃｈｅｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２８７（１），Ｃ１７１−Ｃ１８１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００２２６．２００３ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｃ．，Ｄｉｅｋｍａｎｎ，Ｕ．，Ｂｕｄｄｅ，Ｉ．，Ｄｅｔｅｒｉｎｇ，Ｎ．，ａｎｄ Ｎａｕｊｏｋ，Ｏ．（２０１６）．Ｔｈｅ Ａｎｔｅｒｉｏｒ−Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ，Ｗｎｔ− ａｎｄ ＢＭＰ−Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，３４（１１），２６３５−２６４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｓｔｅｍ．２４２８
Ｄｅｓｓｉｍｏｚ，Ｊ．，Ｏｐｏｋａ，Ｒ．，Ｋｏｒｄｉｃｈ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００６）．ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｇｕｔ ｔｕｂｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２３（１），４２−５５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｄ．２００５．１０．００１
ＤｅＷａｒｄ，Ａ．Ｄ．，Ｃｒａｍｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｌａｇａｓｓｅ，Ｅ．（２０１４）．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｏｎｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９（２），７０１−１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０９．０２７
Ｄｏｍｙａｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｅ．，Ｔｈｒｏｃｋｍｏｒｔｏｎ，Ｋ．，Ｍｉｓｈｉｎａ，Ｙ．，Ｎｉｃｏｌｉｓ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ Ｓｕｎ，Ｘ．（２０１１）．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ＢＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｅｇｕｔ ｖｉａ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｘ２．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ），１３８（５），９７１−９８１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．０５３６９４
Ｄｏｕｐｅ，Ｄ．Ｐ．，Ａｌｃｏｌｅａ，Ｍ．Ｐ．，Ｒｏｓｈａｎ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｇ．，Ｋｌｅｉｎ，ａ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｈ．（２０１２）．Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｗｉｔｃｈｅｓ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｔｏ Ｍａｉｎｔａｉｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９８），１０９１−１０９３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１８８３５
Ｄｙｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｄｅｄｈｉａ，Ｐ．Ｈ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｎａｇｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ｓ．，Ｓｈｅａ，Ｌ．Ｄ．，ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．（２０１６）．Ａ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｉｃｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．ＥＬｉｆｅ，５（Ｓｅｐｔｅｍ ｂｅｒ２０１６）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１９７３２
Ｄｙｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．−Ｈ．，Ｎａｇｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｙａｌ，Ｒ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｎａｔｔｉｖ，Ｒ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｏ．Ｄ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｕｎｇ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．ＥＬｉｆｅ，４，ｅ０５０９８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０５０９８
Ｆａｎｔｅｓ，Ｊ．，Ｒａｇｇｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｓ．−Ａ．，ＭｃＧｉｌｌ，Ｎ．Ｉ．，Ｃｏｌｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．Ｏ．，Ｈｏｗａｒｄ−Ｐｅｅｂｌｅｓ，Ｐ．Ｎ．，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃ．，Ｖｉｖｉａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｋ．，ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ，Ｖ．，ａｎｄ ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｒ．（２００３）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＳＯＸ２ ｃａｕｓｅ ａｎｏｐｈｔｈａｌｍ ｉａ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３３（４），４６１−４６３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｇ１１２０
Ｆａｕｓｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｒｕｎｅｔ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋｌｉｎｇｅｎｓｍｉｔｈ，Ｊ．（２０１４）．ＢＭＰ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｂｙ Ｎｏｇｇｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｆｏｒｅｇｕｔ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３９１（１），１１１−２４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２０１４．０２．００８
Ｇｏｓｓ，Ａ．Ｍ．，Ｔｉａｎ，Ｙ．，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｌｕ，Ｍ．Ｍ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｐ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．（２００９）．Ｗｎｔ２／２ｂ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｒｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ａｎｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｙ ｌｕｎｇ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｅｇｕｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ，１７（２），２９０−８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００９．０６．００５
Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ａ．，Ｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．−Ｃ．，ｄ'Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｈａｎｉｅｌ，Ｃ．，Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ，Ｉ．Ｒ．，Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ，Ｖ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｓｎｏｅｃｋ，Ｈ．−Ｗ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９（３），２６７−７２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．１７８８ Ｈａｒｒｉｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｄｏｍｙａｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｕｎ，Ｘ．（２００９）．ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｆｏｒｅｇｕｔ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０６（３８），１６２８７−９２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０２２７４１０６
Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｔ．Ａ．，Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｈａｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｐａｒｄｙ，Ｎ．，Ｃｈａ，Ｅ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｐ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｋｅｎｈｅｉｓｅｒ−Ｂｒｏｋａｍｐ，Ｋ．Ａ．，Ｄｕｅｎｓｉｎｇ，Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｉ．（２００９）．Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎｅｍｉａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒａｆｔ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２８（５），６７４−６８５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｏｎｃ．２００８．４１６
Ｊｈｏ，Ｅ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｄｏｍｏｎ，Ｃ．，Ｊｏｏ，Ｃ．−Ｋ．，Ｆｒｅｕｎｄ，Ｊ．−Ｎ．，ａｎｄ Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．（２００２）．Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／Ｔｃｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｘｉｎ２，ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２（４），１１７２−８３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＭＣＢ．２２．４．１１７２
Ｋａｌａｂｉｓ，Ｊ．，Ｏｙａｍａ，Ｋ．，Ｏｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．，Ｍｉｃｈａｙｌｉｒａ，Ｃ．Ｚ．，Ｓｔａｉｒｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ，Ｊ．，Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｕ．，Ｄｉｅｈｌ，Ｊ．Ａ．，Ｈｅｒｌｙｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｒｕｓｔｇｉ，Ａ．Ｋ．（２００８）．Ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌｓ ｈａｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，（１１８），３８６０−３８６９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ３５０１２
Ｋａｌａｂｉｓ，Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｓ．，Ｖｅｇａ，Ｍ．Ｅ．，Ｎａｔｓｕｉｚａｋａ，Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｈｅｒｌｙｎ，Ｍ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｒｕｓｔｇｉ，Ａ．Ｋ．（２０１２）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ３Ｄ ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，７（２），２３５−２４６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．４３７
Ｋａｓａｇｉ，Ｙ．，Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｅｅｓｗａｒａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｗｈｅｌａｎ，Ｋ．Ａ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｖ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ａ．Ｊ．，ＤｅＭａｒｓｈａｌｌ，Ｍ．，Ｔｏｂｉａｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｔｈｅ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｎｏｔｃｈ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ．Ｃｍｇｈ，５（３），３３３−３５２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｍｇｈ．２０１７．１２．０１３
Ｋｅａｒｎｓ，Ｎ．ａ，Ｇｅｎｇａ，Ｒ．Ｍ．Ｊ．，Ｚｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｋａｐｉｎａｓ，Ｋ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｈ．，Ｂｒｅｈｍ，Ｍ．ａ，Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，ａｎｄ Ｍａｅｈｒ，Ｒ．（２０１３）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１（３），１００３−１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｃｒ．２０１３．０６．００７
Ｋｏｒｍｉｓｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｉｎｎｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２０１０）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＯＸ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ： Ａｎ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ，２３９（Ａｕｇｕｓｔ ２００９），５６−６８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｄｖｄｙ．２２０４６ Ｌｉ，Ｈ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｆｕ，Ｘ．，ａｎｄ Ｘｉａｏ，Ｒ．（２０１６）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ： ａｎ ａｔｔｅｍｐｔ ｗｉｔｈ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ & Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ａｎｉｍａｌ，５２（８），８８５−８９３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１６２６−０１６−００２４−２
Ｌｏｎｇｍｉｒｅ，Ｔ．ａ，Ｉｋｏｎｏｍｏｕ，Ｌ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｆ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ，Ｃ．，Ｃａｏ，Ｙ．，Ｊｅａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｗｏｋ，Ｌ．Ｗ．，Ｍｏｕ，Ｈ．，Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｓ．Ｓ．，Ｄｏｗｔｏｎ，Ａ．ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１０（４），３９８−４１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１２．０１．０１９
Ｌｕｓｔｉｇ，Ｂ．，Ｊｅｒｃｈｏｗ，Ｂ．，Ｓａｃｈｓ，Ｍ．，Ｗｅｉｌｅｒ，Ｓ．，Ｐｉｅｔｓｃｈ，Ｔ．，Ｋａｒｓｔｅｎ，Ｕ．，ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．，Ｓｃｈｌａｇ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｗ．，ａｎｄ Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｊ．（２００２）．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｌｏｏｐ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ／ａｘｉｎ２ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２（４），１１８４−９３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＭＣＢ．２２．４．１１８４
Ｍａｎｄｅｇａｒ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｅｂｓｃｈ，Ｎ．，Ｆｒｏｌｏｖ，Ｅ．Ｂ．，Ｓｈｉｎ，Ｅ．，Ｔｒｕｏｎｇ，Ａ．，Ｏｌｖｅｒａ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｍｉｙａｏｋａ，Ｙ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｋ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．Ｉ．，Ｊｕｄｇｅ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１８（４），５４１−５５３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０１．０２２
Ｍａｔｔ，Ｎ．，Ｇｈｙｓｅｌｉｎｃｋ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，Ｏ．，Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｒｋ，Ｍ．（２００３）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ａｒｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＲＡＲβ／ＲＸＲ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３０（１０），２０８３−２０９３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．００４２８
ＭｃＣａｕｌｅｙ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１７）．Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ： ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ ｇｒｏｗ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ａ ｄｉｓｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４４（６），９５８−９６２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．１４０７３１
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ａｉｈａｒａ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｒｏｄａ，Ｔ．，Ｔｒｅｇｕｉｅｒ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１７）．Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｆｕｎｄｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，５４１（７６３６），１８２−１８７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１０２１
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｃａｔａ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｉｎａｇｏｇａ，Ｋ．Ｌ．，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｒｏｃｋｉｃｈ，Ｂ．Ｅ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．−Ｈ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｚａｖｒｏｓ，Ｙ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１４）．Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，５１６（７５３１），４００−４０４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３８６３
ＭｃＬｉｎ，Ｖ．ａ，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．ａ，ａｎｄ Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２００７）．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ），１３４（１２），２２０７−１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．００１２３０
Ｍｅｅｒｂｒｅｙ，Ｋ．Ｌ．，Ｈｕ，Ｇ．，Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｏａｒｔｙ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｍ．Ｚ．，Ｆａｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｅｒｓｃｈｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ａ．
Ｃｉｃｃｉａ，Ａ．，Ｓｕｎ，Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｔｈｅ ｐＩＮＤＵＣＥＲ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０８（９），３６６５−３６７０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９７３６１０８
Ｍｕｎｅｒａ，Ｊ．Ｏ．，Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｈｉｌｌ，Ｄ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．，Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｎ．Ｓｉｎａｇｏｇａ，Ｋ．Ｌ．，Ｚａｒｚｏｓｏ−Ｌａｃｏｓｔｅ，Ａ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＭＰ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２１（１），５１− ６４．ｅ６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．０５．０２０
Ｎｉｅｄｅｒｒｅｉｔｈｅｒ，Ｋ．，Ｓｕｂｂａｒａｙａｎ，Ｖ．，Ｄｏｌｌｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．（１９９９）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｍｏｕｓｅ ｐｏｓｔ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１（４），４４４−４４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／７７８８
Ｐａｒｋ，Ｅ．Ｊ．，Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｎｉｃｈｏｌ，Ｐ．，Ｓａｉｊｏｈ，Ｙ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍｏｏｎ，Ａ．Ｍ．（２００８）．Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｅ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｏｘａ２ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，２３７（２），４４７−４５３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｄｖｄｙ．２１４１５
Ｑｕｅ，Ｊ．，Ｃｈｏｉ，Ｍ．，Ｚｉｅｌ，Ｊ．Ｗ．，Ｋｌｉｎｇｅｎｓｍｉｔｈ，Ｊ．，ａｎｄ Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｍ．（２００６）．Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｃｈｅａ ａｎｄ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｎｏｇｇｉｎ ａｎｄ Ｂｍｐｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，７４（７），４２２−４３７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１４３２−０４３６．２００６．０００９６．ｘ
Ｑｕｅ，Ｊ．，Ｏｋｕｂｏ，Ｔ．，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｎａｍ，Ｋ．−Ｔ．，Ｋｕｒｏｔａｎｉ，Ｒ．，Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．，Ｔａｒａｎｏｖａ，Ｏ．，Ｐｅｖｎｙ，Ｌ．Ｈ．，ａｎｄ Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｍ．（２００７）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｏｘ２ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ），１３４（１３），２５２１−３１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．００３８５５
Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｈａｎ，Ｌ．，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｋｅｎｎｙ，Ａ．Ｐ．，Ａｎｇｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｇｒｉｇｇ，Ｅ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２０１６）．Ａ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ−Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｃａｓｃａｄｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ Ｍｅｓｏｄｅｒｍ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｌｕｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１６（１），６６−７８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｊ．ＣＥＬＲＥＰ．２０１６．０５．０６０
Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．ａ，Ｇａｌｌａｓ，Ａ．Ｌ．，Ｎｅｔｏ，Ａ．，Ｇoｍｅｚ−Ｓｋａｒｍｅｔａ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２０１２）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｍｐ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ Ｏｓｒ１ ａｎｄ Ｏｓｒ２ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｕｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ），１３９（１６），３０１０−２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．０７８２２０
Ｒｏｓｅｋｒａｎｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｂａａｎ，Ｂ．，Ｍｕｎｃａｎ，Ｖ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．（２０１５）．Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ − Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３０９（４），Ｇ２１６−２２８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５２／ａｊｐｇｉ．０００８８．２０１５
Ｓｈａｈａｍ，Ｏ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｎ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｔａｋｅｔｏ，Ｍ．Ｍ．，Ｌａｎｇ，Ｒ．ａ，ａｎｄ Ａｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ，Ｒ．（２００９）．Ｐａｘ６ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｌｅｎｓ ｆｉｂｅｒ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ），１３６（１５），２５６７− ２５７８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．０３２８８８
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．−Ｙ．Ａ．，ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．（２００９）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ： Ａｎ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ，２３８（１），２９−４２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｄｖｄｙ．２１８１０
Ｓｉｎｎｅｒ，Ｄ．，Ｋｏｒｄｉｃｈ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｐｏｋａ，Ｒ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｊｏｎａｔａｎ，Ｄ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００７）．Ｓｏｘ１７ ａｎｄ Ｓｏｘ４ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／Ｔ−ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７（２２），７８０２−７８１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＭＣＢ．０２１７９−０６
Ｓｉｖｅ，Ｈ．，Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｈａｒｌａｎｄ，Ｒ．（２０００）．Ｅａｒｌｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．ａ，Ｋｕｈａｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｏｌｌｅ，Ｋ．，Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ，Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｉ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｎ．Ｆ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ，４７０（７３３２），１０５−１０９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６９１
Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｐ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｍ．，Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｙｕｋａｗａ，Ｍ．，Ｂａｒｓｋｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２０１７）．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ ａｎｄ ＢＭＰ／Ｓｍａｄ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｆｏｒｅｇｕｔ ａｎｄ ｈｉｎｄｇｕｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４４（７），１２８３−１２９５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｅｖ．１４５７８９
Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．Ｋ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ａ．，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ，Ａ．，Ｐｏｍｅｒｏｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ａｎｄ Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ．Ｐ．（２００５）．Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０２（４３），１５５４５−１５５５０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０６５８０１０２
Ｔｉｓｏ，Ｎ．，Ｆｉｌｉｐｐｉ，Ａ．，Ｐａｕｌｓ，Ｓ．，Ｂｏｒｔｏｌｕｓｓｉ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｒｇｅｎｔｏｎ，Ｆ．（２００２）．ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１８（１−２），２９−３７．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１２３５１１６７
Ｔｓａｎｋｏｖ，Ａ．Ｍ．，Ｇｕ，Ｈ．，Ａｋｏｐｉａｎ，Ｖ．，Ｚｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｄｏｎａｇｈｅｙ，Ｊ．，Ａｍｉｔ，Ｉ．，Ｇｎｉｒｋｅ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．（２０１５）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，５１８（７５３９），３４４−９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２３３
Ｖａｎ Ｒａａｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｂ．，Ｉｏｒｄａｎｏｖａ，Ｉ．，Ｓｔｅｅｌｅ，Ｍ．，Ｊａｍｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ａ．，ａｎｄ Ｖｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．（２００５）．Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｇｏｖｅｒｎｓ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｒｅｔｉｎａ．Ｎｅｕｒｏｎ，４６（１），２３−３６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２００５．０２．０２３
Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｄｏｌｌｅ，Ｐ．，Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｗ．Ｖ．，ａｎｄ Ｎｉｅｄｅｒｒｅｉｔｈｅｒ，Ｋ．（２００６）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｆｏｒｅｇｕｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９７（２），４３３−４４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２００６．０５．０１９
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｍａ，Ｑ．，Ｐｅｎｇ，Ｓ．，Ａｄｅｌｍａｎｔ，Ｇ．，Ｓｗａｉｎ，Ｄ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｏｘ，Ｃ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｅｄａｍａｌｌｕ，Ｃ．Ｓ．，ＤｅＬｕｃａ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ａ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．ＳＯＸ２ ａｎｄ ｐ６３ ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ ａｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｉ ｉｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２４（４），１６３６−１６４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ７１５４５ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｋ．ａ．，Ｈｅｖｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｒａｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｍａｇｅｅ，Ａ．，Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｚ．，Ｋｅｎｇ，Ｗ．Ｔ．，Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｆ．Ｈ．，ＭｃＧｉｌｌ，Ｎ．，Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＳＯＸ２ ｃａｕｓｅ ａｎｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ−ｇｅｎｉｔａｌ （ＡＥＧ）ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５（９），１４１３−１４２２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｌ０６４
Ｗｏｏ，Ｊ．，Ｍｉｌｅｔｉｃｈ，Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｂ．−Ｍ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｐ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｒ．ａ．（２０１１）．Ｂａｒｘ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｆｏｒｅｇｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｒａｃｈｅｏ−ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，６（７），ｅ２２４９３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２２４９３
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｊｉａｎｇ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｅ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｋ．，Ｌａｎ，Ｘ．，ａｎｄ Ｑｕｅ，Ｊ．（２０１６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ & Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６６，２５−３５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１６．１２．００８
Ｚｈｏｕ，Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｙｕ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ Ｊｉｎ，Ｙ．（２０１６）．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＳＯＸ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＥＳＣｓ ａｎｄ ＮＰＣｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（２），１７１−１８９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｃｒ．２０１６．１５
Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ （Ｖｏｌ．２５９，ｐｐ．４９−１１１）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００７４−７６９６（０６）５９００２−３ Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００９）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５（１），２２１−２５１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｃｅｌｌｂｉｏ．０４２３０８．１１３３４４
Ａｒｎｏｌｄ，Ｋ．，Ｓａｒｋａｒ，Ａ．，Ｙｒａｍ，Ｍ．Ａ．，Ｐｏｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．，Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｓ．，Ｓｅａｎｄｅｌ，Ｍ．，Ｇｅｉｊｓｅｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．（２０１１）．Ｓｏｘ２＋ Ａｄｕｌｔ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，９（４），３１７−３２９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１１．０９．００１
Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ａ．Ｄ．（２００９）．Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，６６８（１−２），４−１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｒｆｍｍｍ．２００９．０１．０１３
Ｂａｋｋｅｒ，Ｓ．Ｔ．，ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ Ｒｉｅｌｅ，Ｈ．ｔ．（２０１３）．Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｆｒｏｍ ａ ｐａｒａｄｏｘ： ｒｅｃｅｎｔ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎａｅｍｉａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ & Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，６（１），４０−４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｍｍ．００９７９５
Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｃ．，Ｓｔｕｃｋｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｕｒｗｉｎｋｅｌ，Ｋ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．Ｈ．，Ａｈｒｅｎｓ，Ａ．，Ｂｕｃｋｍｅｉｅｒ，Ｂ．Ｋ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｋａｕｌ，Ａ．，Ｆｒａｎｃｉｏｓｉ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩＬ−１３ ａｎｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ Ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８４（７），４０３３−４０４１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０９０３０６９
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Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｋ．，Ｆａｎ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｐｅｎｇ，Ｎ．，Ｔｏｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊｉ，Ｇ．（２０１２）．Ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ ａｎｄ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ．Ｃｌｉｎｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，３６（５），４７３−４８３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｌｉｎｒｅ．２０１２．０６．００１
Ｄ'Ｍｅｌｌｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．，Ａｚｏｕｚ，Ｎ．Ｐ．，Ｗｅｎ，Ｔ．，Ｓｈｅｒｒｉｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｏｇａｎ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（２０１６）．ＬＲＲＣ３１ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＬ−１３ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９（３），７４４−７５６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｍｉ．２０１５．９８
Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｓｔｕｃｋｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｈｏｒｋｉ，Ｍ．Ｅ．，Ｌｉｔｏｓｈ，Ｖ．Ａ．，Ｒｙｍｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｒｏｃｈｍａｎ，Ｍ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｊ．，Ｋｏｔｔｙａｎ，Ｌ．Ｃ．，ａｎｄ Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（２０１６）．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｃａｌｐａｉｎ １４ ｉｓ ａｎ ＩＬ−１３−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，１（４）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．８６３５５
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Ｆｅｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｒ．，Ｄａ，Ｍ．，Ｑｉａｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｍｏ，Ｘ．（２０１８）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＦＡＮＣＡ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ａｔｒｅｓｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
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Ｇｈａｔａｋ，Ｓ．，Ｒｅｖｅｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｔｏｉａ，Ｌ．，Ｉｖａｎｏｖ，Ａ．，Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ｈ．（２０１３）．Ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ａｔ ｌｏｗ ｐＨ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＥＧＦＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ３−Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ Ｔｒａｃｔ，１７（１０），１７２３−３１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１６０５−０１３−２２８７−１
Ｈａｇｅｙ，Ｄ．Ｗ．，Ｋｌｕｍ，Ｓ．，Ｋｕｒｔｓｄｏｔｔｅｒ，Ｉ．，Ｚａｏｕｔｅｒ，Ｃ．，Ｔｏｐｃｉｃ，Ｄ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｏ．，Ｂｅｒｇｓｌａｎｄ，Ｍ．，ａｎｄ Ｍｕｈｒ，Ｊ．（２０１８）．ＳＯＸ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＳ ａｎｄ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎｓ．ＰＬＯＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４（２），ｅ１００７２２４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００７２２４
Ｈｕｏ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｉ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｅ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｇｅｎｔａ，Ｒ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｐｅｃｈｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｏｕｚａ，Ｒ．Ｆ．（２０１０）．Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｂｉｌｅ Ｓａｌｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＤＸ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ａｎｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３９（１），１９４−２０３．ｅ１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１０．０３．０３５
Ｊｉａｎｇ，Ｍ．，Ｋｕ，Ｗ．，Ｚｈｏｕ，Ｚ．，Ｄｅｌｌｏｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｆａｌｋ，Ｇ．Ｗ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｋａｔｚｋａ，Ｄ．ａ，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．ＢＭＰ−ｄｒｉｖｅｎ ＮＲＦ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２５（１４），１−１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ７８８５０ＤＳ１
Ｊｉａｎｇ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｋ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｌａｎ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｚｈｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｏｌｕｍｎａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ，５５０（７６７７），５２９−５３３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４２６９
Ｋａｓａｇｉ，Ｙ．，Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｅｅｓｗａｒａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｗｈｅｌａｎ，Ｋ．Ａ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｖ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ａ．Ｊ．，ＤｅＭａｒｓｈａｌｌ，Ｍ．，Ｔｏｂｉａｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｔｈｅ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｎｏｔｃｈ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ．Ｃｍｇｈ，５（３），３３３−３５２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｍｇｈ．２０１７．１２．０１３
Ｋａｚｕｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｙ．（２００９）．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃａｕｄａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ Ｃｄｘ１ ｉｎ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｇｕｔ，５８（５），６２０−６２８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１３６／ｇｕｔ．２００８．１５２９７５
Ｋａｚｕｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．，Ｒｕｍｉ，Ｍ．Ａ．Ｋ．，Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｙ．，ａｎｄ Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｙ．（２００６）．Ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｕｇｍｅｎｔ ｃａｕｄａｌ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ Ｃｄｘ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｇｕｔ，５５（１），１６−２５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１３６／ｇｕｔ．２００５．０６６２０９
ＫＣ，Ｋ．，Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓｈｅｒｒｉｌｌ，Ｊ．Ｄ．（２０１５）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｋｅｒａｔｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，１０（６），ｅ０１２７７５５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２７７５５
Ｋｏｎｇ，Ｊ．，Ｃｒｉｓｓｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｓ．，Ｋｒｅｉｎｄｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ｊ．Ｐ．（２０１１）．Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｃｄｘ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ ｍｏｄｅｌｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，６（４），１−１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８２８０
Ｋｏｎｇ，Ｊ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．，Ｉｓａｒｉｙａｗｏｎｇｓｅ，Ｂ．Ｋ．，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｓ．，Ｓｉｌｂｅｒｇ，Ｄ．Ｇ．，Ｒｕｓｔｇｉ，Ａ．ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ｊ．Ｐ．（２００９）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ａ ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，３０（１），１２２−１３０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｎ２２７
Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，Ａ．Ｎ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．，Ｄ'Ａｌｅｓｓｉｏ，Ａ．Ｃ．，Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｉｔｔｋｏ，Ｉ．Ｍ．，Ｃａｍｐａｎａｔｉ，ａｎｄ ＭｃＫａｙ，Ｒ．Ｄ．（２０１２）．Ｓｏｘ２ ａｃｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｏｘ２１ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２（１８），１７０５−１７１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１２．０７．０１３
Ｌｅｅｄｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｓ．Ａ．Ｃ．，Ｅｌｉａ，Ｇ．，Ｂｈａｎｄａｒｉ，Ｐ．，Ｐｏｌｌｅｒ，Ｄ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．，Ｎｏｖｅｌｌｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｎ．Ａ．（２００８）．Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｒｙｐｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ．Ｇｕｔ，５７（８），１０４１−１０４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１３６／ｇｕｔ．２００７．１４３３３９
Ｌｉｕ，Ｋ．，Ｊｉａｎｇ，Ｍ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｓ．，Ｋｕ，Ｗ．−Ｙ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．，Ｋｉｔａ，Ｙ．，Ｎａｔｓｕｇｏｅ，Ｓ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｓｏｘ２ Ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔａｔ３ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｇｕｔ Ｂａｓａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１２（３），３０４−３１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．０１．００７
Ｌｉｕ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓｏ，Ｃ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｙａｎ，Ｌ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｓ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｘ．（２００７）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｄｘ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｄｘ２ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２８（２），４８８−４９６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｌ１７６
Ｌｕｂｉｎｓｋｙ，Ｍ．（２０１５）．Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＶＡＣＴＥＲＬ，ａｎｄ Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎｅｍｉａ： Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｐａｒｔ Ａ，１６７（１１），２５９４−２５９８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｊｍｇ．ａ．３７２５７
Ｍａｒｉ，Ｌ．，Ｍｉｌａｎｏ，Ｆ．，Ｐａｒｉｋｈ，Ｋ．，Ｓｔｒａｕｂ，Ｄ．，Ｅｖｅｒｔｓ，Ｖ．，Ｈｏｅｂｅｎ，Ｋ．Ｋ．，Ｆｏｃｋｅｎｓ，Ｐ．，Ｂｕｔｔａｒ，Ｎ．Ｓ．，ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａｄａｔｈ，Ｋ．Ｋ．（２０１４）．Ａ ｐＳＭＡＤ／ＣＤＸ２ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７（４），１１９７−１２１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０３．０７４
Ｍｅｅｒｂｒｅｙ，Ｋ．Ｌ．，Ｈｕ，Ｇ．，Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｏａｒｔｙ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｍ．Ｚ．，Ｆａｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｅｒｓｃｈｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ａ．Ｅ．，Ｃｉｃｃｉａ，Ａ．，Ｓｕｎ，Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｔｈｅ ｐＩＮＤＵＣＥＲ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０８（９），３６６５−３６７０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９７３６１０８
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Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｈ．，Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｎ．Ｊ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｄｕｐｕｙ，Ａ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｓｚｃｚｅｐｎｙ，Ａ．，Ｃｏｒｃｏｒａｎ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｉ．Ｍ．，Ｗｉｌｂｕｒｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｅ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓＭｅｔａｐｌａｓｉａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３８（５），１８１０−１８２２．ｅ２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１０．０１．０４８
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すべてのパーセンテージと比率は、特に明記しない限り、重量で計算される。
すべてのパーセンテージおよび比率は、特に明記しない限り、全組成に基づいて計算される。
本明細書を通して与えられるすべての最大の数値制限は、あたかもそのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に書かれたかのように、すべてのより低い数値制限を含むことを理解されたい。本明細書を通して与えられるすべての最小数値制限は、あたかもそのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に書かれたかのように、より高い数値制限をすべて含む。本明細書を通して与えられるすべての数値範囲は、あたかもそのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に書かれたかのように、そのようなより広い数値範囲内に入るすべてのより狭い数値範囲を含む。
本明細書に開示される寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。代わりに、特に明記しない限り、そのような各寸法は、列挙された値とその値を取り囲む機能的に同等の範囲の両方を意味することを意図する。例えば、「２０ｍｍ」として開示されている寸法は、「約２０ｍｍ」を意味することを意図する。
相互参照または関連する特許または出願を含む、本明細書で引用されるすべての文書は、明示的に除外されるか、または他に制限されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いかなる文書の引用も、それが本明細書に開示または主張される発明に関する先行技術であること、または単独で、または他の参考文献との任意の組み合わせにおいて、そのような発明を教示、示唆または開示することの承認ではない。さらに、このドキュメント内の用語の意味または定義が、参照により組み込まれたドキュメント内の同じ用語の意味または定義と矛盾する範囲で、このドキュメント内のその用語に割り当てられた意味または定義が適用される。
本発明の特定の実施形態を図示し説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の様々な変更および修正を行えることが当業者には明らかだろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更および修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。

Claims (31)

  1. 食道オルガノイド（ＥＯ）の製造方法であって、
    ａ．前腸前培養を形成するために胚体内胚葉をＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ活性化因子、ＦＧＦ活性化因子、およびレチノイン酸（ＲＡ）と第１の期間接触させる工程であって、前記前腸前培養はＳＯＸ２およびＨＮＦ１Ｂを発現し、前記前腸前培養はＰＲＯＸ１とＨＮＦ６を実質的に発現しない、前記接触させる工程と、
    ｂ．前記前腸前培養物をＢＭＰ阻害剤（ノギン）およびＥＧＦ活性化因子と背側前前腸（「ｄＡＦＧ」）スフェロイドを形成するのに十分な第２の期間接触させる工程であって、前記ｄＡＦＧはＳＯＸ２およびＴＰ６３を発現するがＰＤＸ１、ＰＡＸ９、またはＮＫＸ２．１を発現しない、前記接触させる工程と、
    ｃ．前記ｄＡＦＧを食道オルガノイド（ＥＯ）の形成を可能にするのに十分な第３の期間培養する工程であって、前記培養はＥＧＦの存在下で行われ、さらに任意にＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、好ましくは図１０を含む、前記培養する工程と、
    を含む、製造方法。
  2. 請求項１記載の方法において、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ?１およびそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はノギンである、方法。
  3. 請求項１または２記載の方法において、前記ＢＭＰ阻害剤は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、方法。
  4. 請求項１〜３記載の方法において、前記ＷＮＴ活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫβ阻害剤（例、ＣＨＩＲ９９０２１、すなわち「カイロン（ＣＨＩＲＯＮ）」）、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ−２１６７６３、リチウム、ポーキュパイン阻害剤ＩＷＰ、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＳＦＲＰ阻害剤ＷＡＹ−３１６６０６、ベータ−カテニン活性化因子ＤＣＡからなる群から選択される１またはそれ以上の分子から選択される、方法。
  5. 請求項１〜４いずれかに記載の方法において、前記Ｗｎｔ経路活性化因子の濃度は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度である、方法。
  6. 請求項１〜５記載の方法において、前記ＦＧＦアクチベーターは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、およびそれらの組み合わせ、好ましくはＦＧＦ４またはＦＧＦ１０、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれ以上の分子から選択される、方法。
  7. 請求項１〜６いずれかに記載の方法において、前記ＦＧＦ経路活性化因子の濃度は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度である、方法。
  8. 請求項１〜７いずれかに記載の方法において、前記第１の期間は、約３日±２４時間である、方法。
  9. 請求項１〜８いずれかに記載の方法において、前記第２の期間は、３日±２４時間である、方法。
  10. 請求項１〜９いずれかに記載の方法において、前記第３の期間は、約２８日±４８時間、または約２１日〜約９０日、または約３０日〜約６０日である、方法。
  11. 請求項１〜１０いずれかに記載の方法において、前記胚体内胚葉が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後内胚葉細胞、および後腸細胞、好ましくは多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉、より好ましくは胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択された多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉細胞から選択される前駆細胞に由来する、方法。
  12. 請求項１〜１１いずれかに記載の方法において、前記胚体内胚葉は、多能性幹細胞を、成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループ：Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、およびそれらの組み合わせであるアクチビンから選択される１またはそれ以上の分子と接触させることに由来する、方法。請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、前記ＤＥは、ＤＥ単層であり、前記ＤＥ単層中の細胞の９０％超がＦＯＸＡ２およびＳＯＸ１７を同時発現する、方法。
  13. 請求項１〜１２いずれかに記載の方法において、前記ＢＭＰ阻害剤は、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ?１、およびそれらの組み合わせから選択される、方法。
  14. 請求項１〜１３いずれかに記載の方法において、前記工程ａの前記レチノイン酸は、約１２時間〜約４８時間、または約２０時間〜約４０時間、または約２４時間の期間、または治療がＰＤＸ発現およびｐ６３発現の喪失をもたらすまで前記ＤＥと接触される、方法。
  15. 請求項１〜１４いずれかに記載の方法において、前記工程ｃは、ＫＲＴ８を欠く重層上皮の形成に十分な時間行われる、方法。
  16. 請求項１〜１５いずれかに記載の方法において、前記工程ｃは、局所ケラチンを発現する重層扁平上皮の形成に十分な時間行われる、方法。
  17. 請求項１〜１６いずれかに記載の方法において、前記工程ｃは、前記ＨＥＯがＩＮＶを発現するのに十分な期間行われる、方法。
  18. 請求項１〜１７いずれかに記載の方法において、前記工程ａ〜ｃは、インビトロで行われる、方法。
  19. 請求項１〜１８いずれかに記載の方法であって、さらに、工程ａ）の前記前腸前培養物または工程ｂ）のスフェロイドを、コラーゲン、基底膜マトリックス（マトリゲル）、またはそれらの組み合わせから選択されるマトリックスと接触させる工程を含む、方法。
  20. 請求項１〜１９いずれかに従って製造された食道組織を含む組成物であって、前記食道組織は、神経支配および／または血管がないことを特徴とする、組成物。
  21. ヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）組成物であって、前記ＨＥＯ組成物は、１またはそれ以上の粘膜下腺、移行帯、脈管構造、免疫細胞、または粘膜下層を実質的に含まない、組成物。
  22. 器官培養に組織化することが可能な食道前駆細胞であって、前記食道細胞は、請求項１〜１９いずれかに記載の方法に由来する、食道前駆細胞。
  23. 層状扁平上皮を作製する方法であって、
    ａ．前駆細胞を放出するために請求項１〜１９いずれかに記載のＨＥＯを酵素的に解離する工程であって、前記ＨＥＯは約３週間〜約１０週間、または約４週間〜約８週間、または約５週間の年齢である、前記解離する工程と、
    ｂ．前記前駆細胞を単層に拡大する工程と、および
    ｃ．非角質化重層扁平上皮を生じるのに十分な期間、コラーゲン被覆膜上の前記重層扁平上皮に前記解離されたＨＥＯを再分化する工程であって、前記非角質化重層扁平上皮は、ケラチンおよびＩＶＬ、ＣＲＮＮ、およびＦＬＧから選択される１またはそれ以上のマーカーを発現する、前記再分化する工程と、
    を含む方法。
  24. 請求項２３記載の層状扁平上皮において、前記層状扁平上皮は、シートの形態で実質的に組織化された食道細胞を含む、層状扁平上皮。
  25. それを必要とする個体における食道の疾患を治療する方法であって、前記疾患は、先天性疾患（閉鎖症）、機能性疾患（アカラシアおよび他の運動障害）、免疫学的疾患（好酸球性食道炎）、病理学的疾患（バレット食道および食道癌）、およびそれらの組み合わせから選択され、請求項１（ＨＥＯ）または請求項（食道シート）に記載の食道組成物を前記個体に接触させる工程を含む、方法。
  26. 請求項２５記載の方法であって、前記疾患は潰瘍を含み、前記食道組成物はシートの形態で実質的に組織化された食道細胞を含み、さらに、前記シートを前記潰瘍と接触させる工程を含む、方法。
  27. 好酸球性食道炎の治療を同定する方法であって、関心ある潜在的治療薬を前述の請求項いずれかに記載のオルガノイドに接触させる工程と、好酸球性食道炎活性の測定値を検出する工程と、および前記関心ある潜在的治療薬が前記好酸球性食道炎活性の前記測定を改善するかどうかを決定する工程と、を含む方法。
  28. ファンコーニ貧血疾患モデルを作製する方法において、請求項１〜１９いずれかに記載の工程を含み、前記ＤＥは、ＦＡＮＣＡが欠損する前駆細胞から取得される、方法。
  29. バレット化生疾患モデルを作製する方法において、請求項１〜１９いずれかに記載のＨＥＯにおいてＣＤＸ２を誘導する工程と、ＢＭＰを活性化する工程とを含む、方法。
  30. 好酸球性食道炎の疾患モデルを作製する方法であって、請求項１〜１９いずれかに記載の前記ＨＥＯは、ＣＣＬ２６およびＣＡＰＮ１４の発現を増加させ、ＣＲＮＮおよびＩＶＬの発現を減少させるのに十分な時間、ＩＬ?１３と接触される、方法。
  31. 食道疾患状態を治療することができる活性剤を同定する方法であって、試験剤を請求項２８〜３０いずれかに記載の疾患モデルと、前記疾患モデルにおいて生理学的変化を誘発するのに十分な時間接触させる工程と、ＥｏＥのＣＣＬ２６とＣＡＰＮ１４の発現の減少とＣＲＮＮとＩＶＬの発現の増加を検出する工程と、または、ＳＯＸ２、ｐ６３、ＫＲＴ１３、ＣＲＮＮ、ＩＶＬなどの食道遺伝子発現の増加およびバレットの腸遺伝子の喪失を検出する工程と、を含む方法。
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