JP2020536529A5 - - Google Patents
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Description
食道は、口腔および咽頭から胃への食物の通過を積極的に促進する。成層扁平上皮、筋肉層、およびストレッチを感知して蠕動を制御する腸神経系で構成される。食道閉鎖症などの先天性疾患は、管腔の狭窄または不連続をもたらす遺伝子変異によって引き起こされる。食道癌、好酸球性食道炎、アカラシアおよびその他の運動障害など、他の病気は晩年に食道に影響を与える。気管および食道の障害は人間に蔓延しており、マウスで正確にモデル化することは困難である。前述の病状の有病率にもかかわらず、マウスとヒトの食道との間の組織構造には実質的な違いがあるため、当技術分野では研究のためのヒトの食道組織モデルが必要である。本開示は、当技術分野における前述の必要性の1つまたは複数に対処する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある(国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む)。
(先行技術文献)
(特許文献)
(特許文献1) 米国特許出願公開第2017/0240866号明細書
(特許文献2) 米国特許出願公開第2012/0135519号明細書
(特許文献3) 米国特許出願公開第2013/0217005号明細書
(特許文献4) 米国特許出願公開第2016/0237401号明細書
(特許文献5) 国際公開第2017/192997号
(非特許文献)
(非特許文献1) JOHANNESSON at al. "FGF4 and Retinoic Acid Direct Differentiation of hESCs into PDX1−Expressing Foregut Endoderm in a Time− and Concentration−Dependent Manner." PLoS One,11 March 2009 (11.03.2009).Vol.4,No.3,e4794,Pgs.1−13.entire document
(非特許文献2) TRISNO at al."Esophageal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Delineate Sox2 Functions during Esophageal Specification," Cell Stem Cell,20 September 2018 (20.09.2018),Vol.23,No.4,Pgs.501−515.entire document
(非特許文献3) AMERI et al."FGF2 Specifies hESC−Derived Definitive Endoderm into Foregut/Midgut Cell Lineages in a Concentration−Dependent Manner," Stem Cells,01 January 2010 (01.01.2010),Vol.28,No.1,Pgs.45−56.entire document
(非特許文献4) DEWARD et al."Cellular Heterogeneity in the Mouse Esophagus Implicates the Presence of a Nonquiescent Epithelial Stem Cell Population," Cell Reports,23 October 2014 (23.10.2014),Vol.9,No.2,Pgs.701−711.entire document
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある(国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む)。
(先行技術文献)
(特許文献)
(特許文献1) 米国特許出願公開第2017/0240866号明細書
(特許文献2) 米国特許出願公開第2012/0135519号明細書
(特許文献3) 米国特許出願公開第2013/0217005号明細書
(特許文献4) 米国特許出願公開第2016/0237401号明細書
(特許文献5) 国際公開第2017/192997号
(非特許文献)
(非特許文献1) JOHANNESSON at al. "FGF4 and Retinoic Acid Direct Differentiation of hESCs into PDX1−Expressing Foregut Endoderm in a Time− and Concentration−Dependent Manner." PLoS One,11 March 2009 (11.03.2009).Vol.4,No.3,e4794,Pgs.1−13.entire document
(非特許文献2) TRISNO at al."Esophageal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Delineate Sox2 Functions during Esophageal Specification," Cell Stem Cell,20 September 2018 (20.09.2018),Vol.23,No.4,Pgs.501−515.entire document
(非特許文献3) AMERI et al."FGF2 Specifies hESC−Derived Definitive Endoderm into Foregut/Midgut Cell Lineages in a Concentration−Dependent Manner," Stem Cells,01 January 2010 (01.01.2010),Vol.28,No.1,Pgs.45−56.entire document
(非特許文献4) DEWARD et al."Cellular Heterogeneity in the Mouse Esophagus Implicates the Presence of a Nonquiescent Epithelial Stem Cell Population," Cell Reports,23 October 2014 (23.10.2014),Vol.9,No.2,Pgs.701−711.entire document
Claims (29)
- インビトロでの食道オルガノイド(EO)の製造方法であって、
a.前腸前培養を形成するために胚体内胚葉をBMP阻害剤、Wnt活性化因子、FGF活性化因子、およびレチノイン酸(RA)と第1の期間接触させる工程であって、前記前腸前培養はSOX2およびHNF1Bを発現し、前記前腸前培養はPROX1とHNF6を実質的に発現しない、前記接触させる工程と、
b.前記前腸前培養物をBMP阻害剤およびEGF活性化因子と背側前前腸(「dAFG」)スフェロイドを形成するのに十分な第2の期間接触させる工程であって、前記dAFGはSOX2およびTP63を発現するがPDX1、PAX9、またはNKX2.1を発現しない、前記接触させる工程と、
c.前記dAFGを食道オルガノイド(EO)の形成を可能にするのに十分な第3の期間EGFで培養する工程と、
を含む、製造方法。 - 請求項1記載の方法において、前記BMP阻害剤は、ノギン、ドルソモルフィン、LDN189、DMH−1、およびそれらの組み合わせから選択される、方法。
- 請求項1または2記載の方法において、前記BMP阻害剤はノギンである、方法。
- 請求項1〜3いずれか1項に記載の方法において、前記BMP阻害剤は、約50〜約1500ng/mlの間の濃度で存在する、方法。
- 請求項1〜4いずれか1項に記載の方法において、前記WNT活性化因子は、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSKβ阻害剤、CHIR99021、BIO、LY2090314、SB−216763からなる群から選択される1またはそれ以上の分子から選択される、方法。
- 請求項1〜5いずれか1項に記載の方法において、前記Wnt経路活性化因子の濃度は、約50〜約1500ng/mlの間の濃度である、方法。
- 請求項1〜6いずれか1項に記載の方法において、前記FGF活性化因子は、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1またはそれ以上の分子から選択される、方法。
- 請求項1〜7いずれか1項に記載の方法において、前記FGF活性化因子は、FGF4またはFGF10、または両方である、方法。
- 請求項1〜8いずれか1項に記載の方法において、前記FGF活性化因子の濃度は、約50〜約1500ng/mlの間の濃度である、方法。
- 請求項1〜9いずれか1項に記載の方法において、前記工程cの前記dAFGは、FGF活性化因子でさらに培養される、方法。
- 請求項1〜10いずれか1項に記載の方法において、前記第1の期間は、約3日±24時間である、方法。
- 請求項1〜11いずれか1項に記載の方法において、前記第2の期間は、3日±24時間である、方法。
- 請求項1〜12いずれか1項に記載の方法において、前記第3の期間は、約21日〜約90日である、方法。
- 請求項1〜13いずれか1項に記載の方法において、前記胚体内胚葉が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、および人工多能性幹細胞から選択される前駆細胞に由来する、方法。
- 請求項1〜14いずれか1項に記載の方法において、前記胚体内胚葉は、多能性幹細胞を、成長因子のTGF−βスーパーファミリーのBMPサブグループ:Nodal、Activin A、Activin B、BMP4、Wnt3a、およびそれらの組み合わせであるアクチビンから選択される1またはそれ以上の分子と接触させることに由来する、方法。
- 請求項1〜15いずれか1項に記載の方法において、前記工程cは、広範なSOX2上皮発現、前記EOの前記基底細胞層におけるp63の発現、およびKRT8の発現によって特徴付けられるような期間で行われる、方法。
- 請求項1〜15いずれか1項に記載の方法において、前記工程cは、前記EOがKRT8を欠く重層上皮の形成、局所ケラチンを発現する重層扁平上皮の形成、および/またはKRT13、KRT14、およびINVの発現によって特徴づけられるような期間で行われる、方法。
- 請求項17記載の方法において、前記KRT13およびINVの発現は、前記EOの基底層上で起こり、KRT14の発現は前記EOの基底層で起こる、方法。
- 請求項1〜18いずれか1項に記載の方法であって、さらに、工程a)の前記前腸前培養物または工程b)のスフェロイドを、コラーゲン、基底膜マトリックス、またはそれらの組み合わせから選択されるマトリックスと接触させる工程を含む、方法。
- 請求項1〜19いずれか1項に従って製造された食道組織を含む組成物であって、前記食道組織は、神経支配および/または血管がないことを特徴とする、組成物。
- ヒト食道オルガノイド(HEO)組成物であって、前記HEO組成物は、1またはそれ以上の粘膜下腺、移行帯、脈管構造、免疫細胞、または粘膜下層を実質的に含まない、組成物。
- 重層扁平上皮を作製する方法であって、
a.前駆細胞を放出するために請求項1〜19いずれかに記載の方法によって製造されたEOを酵素的に解離する工程であって、前記EOは3週間〜10週間の年齢である、前記解離する工程と、
b.前記前駆細胞を単層に拡大する工程と、および
c.非角質化重層扁平上皮を生じるのに十分な期間、コラーゲン被覆膜上の前記重層扁平上皮に前記前駆細胞を再分化する工程であって、前記非角質化重層扁平上皮は、ケラチンおよびIVL、CRNN、およびFLGから選択される1またはそれ以上のマーカーを発現する、前記再分化する工程と、
を含む方法。 - 請求項22記載の方法によって製造された重層扁平上皮において、前記重層扁平上皮は、シートの形態で実質的に組織化された食道細胞を含む、重層扁平上皮。
- それを必要とする個体における食道の疾患を治療する際に使用の請求項20記載の食道組織を含む組成物。
- 請求項24記載の使用の食道組織を含む組成物において、前記食道の疾患は閉鎖症、アカラシア、好酸球性食道炎、バレット食道、食道癌、またはそれらの組み合わせから選択される、組成物。
- 請求項1〜19いずれか1項記載の方法であって、さらに、前記EOにおいてCDX2を誘導するまたはBMPを活性化する工程を含み、前記EOはバレット化生疾患モデルである、方法。
- 請求項1〜19いずれか1項記載の方法であって、さらに、CCL26およびCAPN14の発現を増加させ、CRNNおよびIVLの発現を減少させるのに十分な時間、IL−13と前記EOを接触させる工程を含み、前記EOは好酸球性食道炎疾患モデルである、方法。
- 食道疾患状態を治療することができる活性剤を同定する方法であって、試験剤を請求項26または27記載の方法によって製造された疾患モデルと、前記疾患モデルにおいて生理学的変化を誘発するのに十分な時間接触させる工程と、および前記疾患モデルにおける前記生理学的変化の存在または不在を検出する工程と、を含む方法。
- 請求項28記載の方法において、前記生理学的変化の存在または不在を検出する工程は、好酸球性食道炎のためのCCL26とCAPN14の発現の減少とCRNNとIVLの発現の増加を検出する工程と、または、バレット化生のためのSOX2、p63、KRT13、CRNN、IVLなどの食道遺伝子発現の増加および腸遺伝子の喪失を検出する工程と、を含む方法。
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