JP2014519854A - ヒト多能性幹細胞から生じる自己複製する内胚葉前駆細胞株とその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
ヒトESC細胞株H9およびCHB8は、それぞれ国立幹細胞バンクおよびマサチューセッツヒト幹細胞バンクから得た。ヒトiPSC細胞株、iPSC1(CHOP_WT1.2)およびiPSC2(CHOP_WT2.2)は、下記のように野生型ヒト線維芽細胞由来である。ヒトPSCsは既述の通り維持した(Kennedy et al.,2007)。5日目の一過性内胚葉細胞を生み出すため、ヒトPSCsを胚様細胞塊(EB)(Gouon−Evans et al.,2006)または単層培養(D’Amour et al.,2006;Nostro et al.,2011)として、無血清分化(SFD)培地(Gadue et al.,2006)において分化させた。さらなる詳細は以下に記述する。成長因子を含まない1リットルのSFDは、以下の構成要素を含む。
CXCR4+/CD117high細胞をソーティングし、マウス線維芽細胞フィーダー(MEF)細胞(0.5×106/58cm2)と共にマトリゲル(BD Biosciences社)上で肝臓誘導培地においてそれらを培養することにより、EP細胞を最初にH9 ESCsの27日目の肝細胞分化培養から精製した。EP細胞を維持するための至適培養条件は、先述したようにマトリゲルおよびMEFs上で細胞を培養し、肝細胞分化を促進するサイトカインを除去することにより確立した。この培地はBMP4(50ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、およびEGF(10ng/ml)を添加したSFDベースの培地から成り、EP基礎培地と呼んだ。他のPCS細胞株からのEP細胞は、CXCR4+/CD117high細胞をソーティングし、先述したようにそれらを5%CO2、5%O2、90%N2環境において維持することにより5日目の一過性内胚葉から樹立した。細胞には2日おきに供給し、6日おきにトリプシン処理により1×106/58cm2でスプリットした。低分子阻害剤PD0325901(Sebolt−Leopold et al.,2004;Ying et al.,2008)、PD173074(Mohammadi et al.,1998)、およびSB431542(Laping et al,2002;Inman et al.,2002)は、それぞれ、Cayman Chemicals社およびStemgent社から購入した。
3〜5分間37℃で0.25%トリプシンを用い5日目の一過性内胚葉、EP細胞培養またはEP細胞分化培養組織を剥がすことにより単一細胞懸濁液を得た。細胞表面抗原染色は10%ウシ胎児血清を添加したIMDMにおいて行った。細胞内染色のため、細胞を20分間37℃で1.6%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences社)で固定し、その後、PBS+1%BSAで二度洗浄した。固定した細胞は、1x透過性洗浄バッファー(BioLegend社、421002)で透過し、染色した。染色した細胞はBD FACS CantoIIフローサイトメーター(BD Biosciences社)で分析し、データはFlowjoソフトウェア(TreeStar社)を用い分析した。一次、二次抗体およびアイソタイプコントロールの起源および濃度は、以下に記載する。
H9 ESCs(T0、ES)、H9 ESC由来のDE(T5、DE)およびEP細胞(EPC)をSSEA3high/SSEA4highの未分化細胞またはCXCR4high/CD117high集団を(T5 DEおよびEPCのために)ソーティングすることにより精製した。各々のサンプルにおいておよそ1×105細胞を得た。各々の細胞型(ES、DEおよびEPC)の3つの生物学的複製を準備し、全RNAはRNeasyミニキット(Qiagen社)を用い抽出した。品質評価したRNAサンプルを、アフィメトリクスGeneChip HumanGene1.0STアレイにハイブリダイズした。アフィメトリクススキャナで得た9つの生データファイルは、アフィメトリクス発現コンソールによるRNA標準化に先立つデータのクオリティー確認工程を通過した。マイクロアレイデータには、NCBI遺伝子発現オムニバス、登録番号GSE35461、でアクセスすることが可能である。
肝臓分化のため、EP細胞を0.25%トリプシンEDTAで剥がし、マトリゲル(1:6希釈)被覆またはゼラチン被覆した12ウェル組織培養プレート(BD社)に付着性培養としてウェルにつき1×105細胞を再度播いた。EP細胞の肝臓分化培地はアスコルビン酸(50g/ml)、モノチオグリセロール(4.5×10−4M)、および様々なサイトカインを添加したSFDベースのものである。分化の最初の6日間の間に、以下のサイトカインおよび成長因子を添加した。BMP4(50ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)、TGF(20ng/ml)、HGF(100ng/ml)およびデキサメタゾン(1x10−7M)。次の6日間、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、EGF(20ng/ml)、HGF(100ng/ml)、OSM(20ng/ml)、デキサメタゾン(2x10−7M)、ビタミンK1(6g/ml)、およびγ−セクレターゼ阻害剤X(Calbiochem社、565771、2M)を加えた。分化の最初の12日間の間、1%DMSOを培地に添加したが、最後の2週において除外した。12日目から以後、培地はHGF(100ng/ml)、OSM(20ng/ml)、デキサメタゾン(2x10−7M)、ビタミンK1(6g/ml)、および1%非必須アミノ酸(NEAA)(Invitrogen社)を含んだ。培地は3日おきに交換した。薬剤誘導性解析は、P450−GloTM CYP3A4ルシフェリンIPAキット(Promega社、V9002)を用い行った。簡潔に言うと、H9−EP細胞(継代15)を24日間肝細胞に分化させ、それから3日間、リファンピシン(Sigma社、25μM)存在下(リファンピシン)またはリファンピシンの非存在下(DMSO)で培養し、HepG2細胞と比較した。誘導された活性がCYP3A4酵素に特異的であったことを確認するため、抑制のコントロールには、リファンピシン(25μM)の存在下において、選択的な阻害剤ケトコナゾール(Sigma社、1μM)を含有させた。ネットシグナルは、バックグラウンドの発光値(非細胞存在のコントロール)をリファンピシンまたはDMSOの値から差し引くことにより計算した。
神経外胚葉または中胚葉に分化するEP細胞の可能性を評価すべく、H9−EP細胞(継代5)およびH9 ESCを神経外胚葉(Greber et al.,2011)または中胚葉に、hESC分化を促進するために確立された条件で誘導した。未分化H9 ESまたはEP細胞を小さな細胞集塊に解離させ、その後、1ウェルにつき4.5×105細胞で、マトリゲルで被覆した12ウェルプレート上へ再度播いた。
サンプルをパラフィンに包埋し、6〜10umで切片にした。クエン酸ナトリウムバッファーで30分間スライドを蒸し、補足の表で示す抗原のサブセットの抗原回復を行った。切片を30分間適切な血清中(1xDPBS+0.5%トリトン−X中の5%血清)でブロッキングした。一次抗体をブロッキングバッファーで希釈し、4℃で3時間または一晩、切片の上でインキュベートした。スライドを洗浄し、室温で2時間ブロッキングバッファーで二次抗体をインキュベートした。使用した抗体および希釈剤のリストについては、表を参照のこと。染色画像は、三相画像化ソフトウェア(Nikon社)でニコンエクリプスE800蛍光顕微鏡を用い得た。
既述の通り、H9−EP細胞を18日間マトリゲルで被覆した12ウェル培養皿上で分化させた。ヒト膵島はマトリゲルで被覆した12ウェル培養皿に付着させた。細胞を10分間37℃で4%PFAでウェルに固定し、それから冷却した(CaCl2およびMgCl2を加えた)DPBS+0.1%BSA(洗浄バッファー)で二度洗浄し、20分間0.2%トリトン−X100を加えた洗浄バッファー中で透過した。二度洗浄した後、細胞を室温で(CaCl2およびMgCl2を加えた)DPBS+2%BSA中の10%ヤギ血清で30分ブロッキングした。これまでに報告のある通り(Gouon−Evans et al.,2006)、以下の抗体を用い免疫蛍光を行った。4℃にて、マウス抗PDX1、ウサギ抗ヒトC−ペプチドおよびマウス抗Glucagonで一晩。アイソタイプコントロールの濃度は、一次抗体に同じである。用いた二次抗体は、ヤギ抗ウサギIgG−Cy3、ヤギ抗マウスIgG1−Alexa488およびヤギ抗マウスIgG2b−Alexa488である。細胞を室温で1時間二次抗体と共にインキュベートした。一次および二次抗体は、(CaCl2およびMgCl2を加えた)DPB+2%BSA+0.05%トリトン−X100で希釈した。DAPI(Invitrogen社)を加えたProlong Gold Antifade試薬は核を対比染色するのに用いた。染色された細胞は蛍光顕微鏡(ライカDMI4000B)を用い可視化し、画像はライカApplication Suiteソフトウェアを用い取り込んだ。
EP細胞(8〜10x106)をサイトカインの組合せを添加した冷却した高濃度マトリゲル(BD Biosciences社)の300μl中に再懸濁した。インビボ消化管様の内胚葉分化にはBMP4(50ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)およびEGF(10ng/ml)またはインビボ肝細胞分化にはFGF10(400ng/ml)、VEGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)およびBMPR1A(500ng/ml)。細胞をSCID/Beigeマウスの首に皮下注射した。同様に、H9 ESCの5日目内胚葉培養由来の1x107個の細胞、またはH9 ESCの5日目内胚葉培養からソーティングした5x106個のCXCR4+/CD117high細胞を注射し、既述の通り解析した。また、20日目のH9 ESCs細胞の肝細胞分化培養由来、または9日目のH9−EP細胞の肝細胞分化培養由来の1x107個の細胞をFGF10(200ng/ml)、VEGF(50ng/ml)、EGF(50ng/ml)、およびHGF(200ng/ml)のサイトカイン組合せと共に注射した。結果として生じるマトリゲルプラグ/移植を記述の通り解析した。
全RNAはRNAeasyマイクロキット(Qiagen社)を用い調製し、RNaseを含まないデオキシリボヌクレアーゼ(Qiagen社)で処理した。RNA(1ugから500ng)はSuperscriptIII逆転写酵素(Invitrogen社)でランダムヘキサマーおよびオリゴ(dT)を用いcDNAに逆転写した。これまでに報告のある通り(Nostro et al.,2008)、QPCRはライトサイクラー480SYBRグリーンIマスターミックス(Roche社)を用い、ライトサイクラー480II(Roche社)で行った。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子PPIG(サイクロフィリン)により標準化した。オリゴヌクレオチド配列は、表にリストした。全ヒト腸RNAは、Biochain社から購入した。
我々は、これまでにマウスおよびヒトESCsからDEおよびその肝臓系列派生物を誘導することが示された無血清培地において段階的分化プロトコルを適応させた(Gadue et al.,2006;Gouon−Evans et al.,2006)。このプロトコルは、胚形成を模倣するプロセスにおいて、DEを誘導するためアクチビンAを用い、その後DEから肝臓運命を決定するためBMP4およびbFGF作動薬の他の因子を用いる。このプロトコルのバリエーションを用い(実験手順を参照)、我々は誘導の2週後、肝細胞を生み出すことが可能であった(データ図示せず)。興味深いことに、3〜4週後に、これらの培養は異なった形態を持つ2つの細胞集団を含んだ(図1A)。一方の集団は大きく非常に空胞化されており未成熟肝細胞に似ていた(図1A、「分化した細胞」)が、他方の集団は未分化ESCコロニーの様であった(図1A、「前駆コロニー」)。これらの混合した培養を、9ヵ月以上の間継代した後、両方のコロニータイプを維持した(データ図示せず)。我々は手作業で所定の形態のコロニーを単離するためピペットを用い、QRT−PCRを用い遺伝子発現解析を行った(図1B)。ESCマーカーであるNANOGおよびOCT4はどちらの細胞型においても発現しておらず、これらのコロニーが培養中、ESCのコンタミネーションによるものでなかったことを示唆する。初期の汎内胚葉マーカーであるSOX17が推定上の前駆コロニーで亢進されるが、初期の肝細胞マーカーであるAFPは分化したコロニーで亢進された。初期の内胚葉/肝臓/膵臓マーカーであるHNF4A((Duncan et al.,1997)は、両方において認められた。これらの解析結果に基づき、我々は、未分化コロニーが内胚葉前駆(EP)細胞が培養において自己再生および肝細胞への分化の両方を経ていることを表す可能性があるものと仮定した。
我々は、精製したH9 ESCs、アクチビンAにより誘発した5日目一過性内胚葉、およびH9−EP細胞のトランスクリプトームを比較するため、遺伝子発現マイクロアレイを用いた(図2A)(方法を参照)。マイクロアレイデータのクラスター解析によりEP細胞がESCsより5日目の一過性内胚葉と類似することが明らかとなった(図5A)。主成分分析法は、EP細胞がESCsより一過性内胚葉と類似するが、それらはまた一過性の内胚葉とは異なることを明らかにした(図5B)。予想されるように、多能性マーカーであるNANOG、OCT4、SOX2、およびDNMT3Bの高レベルの発現はESCに限られていた(図5Cおよび5D)。興味深いことに、プロトオンコジーンMYCNはESCsおよびEP細胞両方において発現した。MYCNはマウスESCsの多能性および自己再生に必須であり(Varlakhanova et al.,2010)、EP細胞において類似した役割を持つ可能性がある。EOMESおよびLHX1を含む遺伝子のサブセットは両方の細胞型において維持されるが、CER1、FGF17、FGF8、GSCおよびMIXL1を含む原始線条または中内胚葉において発現した遺伝子は、EP細胞でなく5日目一過性内胚葉において発現する(図5Cおよび5D)。予想されたように、FOXA2、FOXA3、GATA4およびSOX17を含む大部分の内皮遺伝子の発現は5日目内胚葉およびEP細胞に限られた(図5Cおよび5D)。
次に我々は、培養条件を操作すると増殖したEP細胞は多能性内皮分化能を保持するかどうかをテストした。EP細胞株はインビトロでの肝細胞、膵臓または腸への分化決定を促進する既知の条件下で分化させた(Gouon−Evans et al.,2006;Nostro et al.,2011;Spence et al.,2011)。全ての誘導プロトコルにより、EP細胞はDE段階にあるものと推測され、そのように刺激した。多クローン性H9−EP細胞株および2つの単一細胞由来のサブクローンにおける代表的なデータを示す(図6、7、8、9、および10)。これに加え、2つのiPSC由来のEP細胞株(iPS1−EPおよびiPS2−EP)からの肝細胞および膵臓分化を解析し、類似した結果となった(図8および9)。
奇形腫を形成するというESCsおよびiPSCsの傾向は、移植研究にとり大きな障害を意味する。EP細胞が腫瘍形成能を保持するかどうか判定するため、50万個のH9 ESCsまたはH9−EP細胞を、免疫不全マウスに筋内注射で移植した。4〜6週後、同数のEP細胞を注射したマウスでは発生しなかったが、H9 ESCsを注射した全てのマウスは腫瘍を発生した(図12A)。実際、これらの条件下において任意の注射したEP細胞を検出することは困難であった。したがって、より大量のEP細胞(8〜10x106)を、細胞生存を促進させ、ホスト血管を補充するため成長因子を含む濃縮マトリゲル中に移植した(方法を参照)。こうした条件下にて、EP細胞由来の腫瘍は、3〜60週間にわたり35件の移植(図12B)において発生しなかった。これとは対照的に、ESCsの5日目の一過性内胚葉分化培養由来の細胞をこの系において移植した場合、全ての動物が奇形腫を発生した。驚くべきことに、5日目のESC分化培養から細胞ソーティングにより単離した精製CXCR4+CD117+DE細胞でさえ、移植6週以内で腫瘍を発生した(図12B)。CXCR4+CD117+DE細胞が完全には内胚葉に分化することが決定されず、まだ奇形腫形成能を維持する可能性、または細胞ソーティング後でさえ少数のコンタミネーションしているESCsが存在し、腫瘍形成を誘導する可能性がある。これに加え、ESCsの肝臓分化20日目の培養からの細胞を移植した場合、5匹中4匹の動物はそれでもまだ奇形腫を発生した(図12B)。これらのデータはEP細胞がESCs、iPSCs、一過性内胚葉およびESC由来の肝臓培養より腫瘍形成性を持たないないことを示す。
インビトロで自己複製し、培養条件または動物への移植操作の後、様々な成熟組織に分化する幹細胞株を生み出す能力は、生物学に革命をもたらし、医学的応用に対し極めて有望なものを提供する。この点において、異なる発生能を持つ異なる幹細胞株がユニークな応用に利用される可能性が高い。例えば、マウス胚盤胞の3つの異なった細胞型から発生する、ESCs、栄養外胚葉幹(TS)細胞、および胚体外内胚葉幹(XEN)細胞は、それらのそれぞれの前駆に類似した発生能を示す(Tanaka et al.,1998;Kunath et al.,2005)。本明細書において、我々はヒトESCsおよびiPSCsから連続的に複製を行うクローン性の内胚葉系幹細胞株の樹立を解説する。EP細胞と呼ばれるこれらの細胞は、後述するとおり、自己複製し、特に前腸および中腸―後腸の両方から内皮系列を生み出す事が可能な最初の幹細胞集団である。
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Claims (17)
- 機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆(EP)細胞を生成する方法であって、
a)無血清分化培地で幹細胞をアクチビンAに接触させる工程であって、それにより胚体内胚葉(DE)細胞の形成を誘導するものである、前記接触させる工程と、
b)基質および選択的に繊維芽細胞フィーダー層で覆われたプレート上で、BMP4、VEGF、bFGF、およびEGF、あるいはそれらのホモログとともに低酸素でDE細胞を培養する工程であって、それによりEP細胞を生成するものである、前記培養する工程と
を有する方法。 - 請求項1記載の方法において、前記細胞はSOX17、FOXA2、およびHNF4Aを発現し、且つOCT4あるいはNANOGを欠損しているものである、方法。
- 請求項2記載の方法において、前記細胞は内胚葉組織に分化するように誘導されるものである、方法。
- 請求項3記載の方法において、前記組織は、肝組織、膵臓組織あるいは腸組織から成る群から選択されるものである、方法。
- 請求項4記載の方法において、前記組織は膵臓組織であり、且つ前記組織中の細胞はKCIでの化学的脱分極に機能的に応答するものである、方法。
- 請求項4記載の方法において、前記組織は膵臓組織であり、且つ前記組織中の細胞はD−グルコースによる刺激に機能的に応答するものである、方法。
- 請求項4記載の方法において、前記組織は腸の組織であり、且つ前記細胞はCDX2、KLF5、およびLYZを発現するものである、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記幹細胞は、胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞である、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記EP細胞は、免疫欠損マウスの中に移植される場合、ESCあるいはiPSCの腫瘍形成能力をもたないものである、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記細胞は、繊維芽細胞フィーダー細胞層上に培養されるものである、方法。
- 請求項1記載の方法によって生成される、機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆(EP)細胞。
- 機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆(EP)細胞を生成する方法であって、
a)無血清分化培地で幹細胞をアクチビンAに接触させる工程であって、それにより胚体内胚葉(DE)細胞の形成を誘導するものである、前記接触させる工程と、
b)基質および選択的に繊維芽細胞フィーダー層で覆われたプレート上で、TGF−ベータ誘導剤の存在下でDE細胞を培養する工程であって、それによりEP細胞を生成するものである、前記培養する工程と
を有する方法。 - 請求項12記載の方法において、前記細胞はSOX17、FOXA2、およびHNF4Aを発現し、且つOCT4あるいはNANOGを欠損しているものである、方法。
- 請求項12記載の方法において、前記細胞は内胚葉組織に分化するように誘導されるものである、方法。
- 請求項12記載の方法によって生成される、機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆(EP)細胞。
- 請求項1記載の方法において、BMP4のホモログあるいはファミリーメンバーは、BMP4と代替するものである、方法。
- 請求項1記載の方法において、bFGFのホモログあるいはファミリーメンバーは、bFGFと代替するものである、方法。
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