JP2010534065A - ヒト胚盤胞幹細胞に、胚体内胚葉(DE‐hep)を介して由来する新規な肝細胞の集団 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、胚体内胚葉に由来する肝芽様細胞および肝細胞様細胞、DE‐hep前駆体、ならびにDE‐hep細胞に関する。
i)第I段階、ここでhBS細胞は、胚体内胚葉細胞に発達するために誘導され、第I段階はアクチビンを含む第1の第I段階の培養培地中でのhBS細胞の2〜6日間の培養を含み、ここで培地は培養の1日後に、アクチビン、1つ以上の増殖因子、および必要に応じて血清を含む、第2の第I段階の培養培地によって置き換えられ、
ii)第II段階、ここで第I段階から得られる細胞は増殖され、そして第II段階は、1つ以上の増殖因子および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第II段階の培養培地中で第I段階からの細胞を培養する工程を含み、
iii)第III段階、ここで第II段階から得られる細胞は、肝細胞様細胞(DE‐hep細胞)に成熟され、第III段階は、1つ以上の成熟因子および必要に応じて分化誘導因子を含む第III段階の培養培地中で第II段階からの細胞を培養する工程を包含する。
A.薬物輸送体
i)少なくとも1%の細胞、または、適切な場合、細胞核が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
ii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OATP‐2(=OATP‐C、OATP1B1)、および/またはOATP‐8(OATP1B3)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iv)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OATP‐A(=OATP‐1A2)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
v)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、NTCPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vi)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MDR1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MDR3のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
viii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OCT‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
B.薬物代謝酵素
ix)少なくとも20%の細胞、または適切な場合、細胞核が、GST‐A1‐1および/またはGSTM1‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
x)少なくとも5%の細胞、または適切な場合、細胞核が、以下の、CYP‐1A1、CYP‐1A2、CYP‐1B1、CYP‐2A6、CYP‐2B6、CYP‐2C8、CYP‐2C9、CYP‐2C19、CYP‐2D6、CYP‐2E1、CYP‐3A4、CYP‐3A7、およびCYP‐7A1のうちの少なくとも2個の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
xi)少なくとも5%の細胞、または適切な場合、細胞核が、UGT1A6および/またはUGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す。
少なくとも20%の細胞が、GST A1‐1および/またはGSTM1‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表し、ならびに
少なくとも20%の細胞が、CYP‐1A1、CYP‐1A2、CYP‐1B1、CYP‐2A6、CYP‐2B6、CYP‐2C8、CYP‐2C9、CYP‐2C19、CYP‐2D6、CYP‐2E1、CYP‐3A4、CYP‐3A7、およびCYP‐7A1のうちの少なくとも7個の、好ましくは9個の、さらにより好ましくは全てのタンパク質および/または遺伝子の発現を表し、
少なくとも5%の細胞が、UGT1A6および/またはUGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す。
定義および略語
本明細書中で使用されるように、用語「胚盤胞由来肝細胞」は、BS細胞と示され、そしてヒト形態は「hBS細胞」と呼ばれる。文献において、細胞はしばしば、胚幹細胞、およびより具体的にはヒト胚幹細胞と呼ばれる。
第I段階の産物:胚体内胚葉(DE)細胞、
第II段階の産物:DE‐hep前駆体、例えば、胚体内胚葉を介して誘導される肝芽様細胞、
第III段階の産物:DE‐hep細胞、例えば、胚体内胚葉を介して誘導される機能的な肝細胞様細胞。
本明細書中で使用されるように、支持細胞は、単独でまたは組み合わせて使用される支持細胞型を意味することが意図される。細胞型はさらに、ヒトまたは他の種起源であり得る。支持層が由来し得る組織としては、胚、胎児、新生児、子供、または成体の組織が挙げられ、およびこれらとしてはさらに、包皮、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質、または胸を含む皮膚に由来する組織が挙げられる。支持細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、および上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来し得る。支持細胞を導くために使用され得る特定の細胞型の例としては、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および/または線維細胞、胎児筋細胞、胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍帯、間葉細胞、胎盤線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤内皮細胞、出生後包皮線維芽細胞および/または線維細胞、出生後筋細胞、出生後皮膚細胞、出生後内皮細胞、成体皮膚線維芽細胞および/または線維細胞、成体筋細胞、成体卵管内皮細胞、成体腺内皮細胞、成体間質内皮細胞、成体乳癌実質細胞、成体内皮細胞、成体上皮細胞、または成体ケラチン生成細胞が挙げられる。支持細胞がhBS細胞に由来する場合、細胞は線維芽細胞であり得る。
本発明に従うDE‐hep前駆体およびDE‐hep細胞は、いくつかの肝臓の疾患および異常の処置および/または予防のために有利に使用され得る。従って、本発明に従うDE‐hep前駆体およびDE‐hep細胞は、薬剤中で使用され得る。
DE細胞は通常、アクチビンA、ならびに必要に応じて、1つ以上の増殖因子、例えば、FGF2、および血清、特にFCSを含む培養培地中でhBS細胞を培養することにより得られる。Wnt3aのような他の適切な物質がまた含まれ得る。
1日目:第1の第I段階の培養培地は、アクチビンを含む(例えば、プロトコル1)、
1日目:第1の第I段階の培養培地は、アクチビンおよび増殖因子、特にFGF2を含む(例えば、プロトコル2および3)、
1日目:第1の第I段階の培養培地は、アクチビンを含む(例えば、プロトコル4)。
2日目:第2の培養培地は、アクチビンおよび血清(例えば、プロトコル1)、ならびに必要に応じてFGF2を含む。
2日目:第2の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にFGF2を含む(例えば、プロトコル2、3、および4)。
3〜4日目:第2の培養培地は、アクチビン、FGF2、および血清を含む(例えば、プロトコル1)。
3〜4日目:第2の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にFGF2を含む(例えば、プロトコル2、3、および4)。
本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹(hBS)細胞に、胚体内胚葉を介して由来するDE‐hep前駆体細胞の調製のための方法に関する。
第II段階の1日目〜4日目:第II段階の培養培地は、FGF2、BMP4、1つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にBMP2、血清、特にFBS、PEST、および、GlutaMAX、ならびに必要に応じて1つ以上のさらなる増殖因子、特にaFGFを含む(例えばプロトコル1)、
第II段階の1日目〜8日目:第II段階の培養培地はHGFを含む(例えば、プロトコル2)、
第II段階の1日目〜5日目:第II段階の培養培地は、FGF4、BMP2を含む(例えば、プロトコル3)、
第II段階の1日目〜3日目:第II段階の培養培地は、FGF2、BMP4、血清、特にFBSを含む(例えば、プロトコル4)、
第II段階の4日目〜10日目:第II段階の培養培地は、FGF2、BMP4、血清、特にFBS、およびHGFを含む(例えば、プロトコル1)、
第II段階の6日目〜10日目:HGF(例えば、プロトコル3)、
第II段階の4日目〜8日目:第II段階の培養培地は、HGF、FGF2、EGF、および血清、例えばFBSを含む(プロトコル4)。
プロトコル1
RPMI改変培地またはDMEM培地、1%PEST、1%GlutaMAXで補充され、そしてさらに以下で補充される;
5日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(それぞれ、100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2%FCS。
6日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(それぞれ、100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2%FCS。
7日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
8日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
9日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
6日目:BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2%FCS、
7日目:BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2%FCS、
8〜9日目:FGF1(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、1%FCS、
10日目:HGF、FGF2(それぞれ、50ng/ml、4ng/ml)、1%FCS
11〜13日目:HGF、FGF2、EGF(それぞれ、50ng/ml、4ng/ml、10ng/ml)、1%FCS
1日目:アクチビンA、bFGF(100ng/ml、5ng/ml)。
2〜5日目:アクチビンA、bFGF(100ng/ml、5ng/ml)、0.2%FCS。
5〜7日目:培地の変化なし
8〜14日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2%FCS。
15〜21日目:bFGF、HGF(2ng/ml、20ng/ml)で補充されるWME+SQ。
本位明細書中の実施例において示されるように、得られるDE‐hep前駆体細胞は、EpCAM、HNF1、HNF3b、HNF4a、Desmin、CD133、c‐kit、CAM1(=CD54)、CK8、CK18、およびCK19のうちの、1個以上の、例えば、2個以上の、4個以上の、6個以上の、8個以上の、10個以上の、12個以上の、または全ての遺伝子の発現を表す(実施例7、表2、および実施例8を参照のこと)。
本明細書中に以前に記載されるように、本発明の方法はまた、DE‐hep細胞、すなわちDE細胞に、hBS細胞を介して由来する肝細胞様細胞を提供する。このような細胞を得るために、さらなる段階が、すなわち第III段階が、上記の方法において含まれる。第III段階は、第II段階(および必要に応じて第I段階)において記載されるように得られるDE‐hep前駆体細胞を、必要に応じて例えば、DMSO、デキサメタゾン、オメプラゾール、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような分化および/またはCYP誘導物質が、単独で、または;
ITS混合物;
BMPおよび/またはTGFP、OSMおよび/またはEGF、特にBMP4および/またはHGFと、組み合わせて補充される、例えば、William E基本培地、Leibovitz L‐15培地、またはHCM Cambrex培地、もしくは比較可能な培地のような、培養培地中で培養することに関する。
1.hBS細胞株確立物およびLOT調製物(WO03055992)
2.支持細胞非含有培養系に移されるhBS細胞(WO2004099394)
3.異種非含有調製物(WO2007042225)
4.酵素的に継代されるhBS細胞(WO07107303)
本発明はまた、上記の第III段階により得られるDE‐hep細胞に関し、これは、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、アルブミン、UGT2B7、CYP3A4、ADH1A、OATP‐2、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP2D6の増加されたタンパク質および/または遺伝子の発現を表し、ここで本発明者らはコントロール実験に使用されるプロトコルの詳細記載を必要とする。
A.薬物輸送体
i)少なくとも1%の細胞、または、適切な場合、細胞核が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
ii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OATP‐2(=OATP‐C、OATP1B1)、および/またはOATP‐8(OATP1B3)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iv)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OATP‐A(=OATP‐1A2)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
v)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、NTCPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vi)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MDR1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MDR3のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
viii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OCT‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
B.薬物代謝酵素
ix)少なくとも20%の細胞、または適切な場合、細胞核が、GST A1‐1および/またはGSTM1‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
x)少なくとも5%の細胞、または適切な場合、細胞核が、以下の、CYP‐1A1、CYP‐1A2、CYP‐1B1、CYP‐2A6、CYP‐2B6、CYP‐2C8、CYP‐2C9、CYP‐2C19、CYP‐2D6、CYP‐2E1、CYP‐3A4、CYP‐3A7、およびCYP‐7A1のうちの少なくとも2個の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
xi)少なくとも5%の細胞、または適切な場合、細胞核が、UGT1A6および/またはUGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す。
薬物輸送体および薬物代謝酵素の発現に起因して、本発明のDE‐hep細胞およびDE‐hep前駆体細胞の両方は、医薬品における使用に十分に適切である。従って、本明細書中に記載される細胞集団は、例えば、肝組織の変性のような組織変性、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫異常;脂質異常症を含む代謝異常;例えば、アルコール乱用によって引き起こされる肝臓異常;例えば、B型肝炎、C型肝炎、およびA型肝炎のようなウイルスにより引き起こされる疾患;例えば、薬物に対する急性毒性反応により引き起こされる肝臓壊死;ならびに肝細胞癌を被る患者における腫瘍除去からなる群より選択される、肝臓異常により引き起こされる病変および/または疾患の予防および/または処置のための医薬品の製造に有用であり得る。
方法
開始材料
適切な材料、未分化のヒト胚盤胞由来肝細胞は、以下の4つの異なる方法において得られ得、以下の特許出願において詳細に記載される;
1.hBS細胞株確立物およびLOT調製物(WO03055992)
2.支持細胞非含有培養系に移されるhBS細胞(WO2004099394)
3.異種非含有調製物(WO2007042225 A3)
4.酵素的に継代されるhBS細胞(WO07107303)
DE‐hep細胞が治療目的のために使用される場合、異種非含有調製物は特に重要である。
本発明についての開始材料は、適切に多能性の未分化のhBS細胞であり、例えば、未分化のhBS細胞株である。このような材料は、CELLARTIS AB、www.cellartis.comから得ることができる。CELLARTIS ABは、世界的な、規定されるhBS細胞株の最も大きな供給源であり、そして今日利用可能な30個を超えるhBS細胞株およびサブクローンを有する。国立衛生研究所(NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH(NIH)のヒト胚幹細胞登録所、http://stemcells.nih.gov/research/registry/において2個の細胞株が、および英国幹細胞バンク(UK STEM CELL BANK)において20個の細胞株が列挙される。さらに、CELLARTISは、日本、ドイツ、およびフランスのような主要な市場により、研究使用のために承認されるhBS細胞株を提供し得る。本発明のために、hBS細胞株SA002、SA002.5、SA034、SA167、SA181、SA348、およびSA461が特に使用された。開始材料として推奨されるhBS細胞の特性は以下のようである:アルカリホスファターゼ、SSEA‐3、SSEA‐4、TRA 1‐60、TRA 1‐80、Oct‐4についてポジティブ、SSEA‐1についてネガティブ、テロメラーゼ活性、およびインビトロおよびインビボでの多能性(後者は、免疫不全マウスにおける奇形腫形成により示される)。(以前に示されるような方法およびプロトコル、HEINSら、WO03055992)。
hBS細胞株のLOT調製は、標準的な方法に従う、1つの単一の継代において、培養におけるhBS細胞の拡張、およびその後の100を超えるストローの凍結を構成する(WO200498285)。hBS細胞株の形態学は、凍結の前および後に、そしてLOTからの細胞の解凍後の、続く培養における連続的な継代においてまた、モニターされる。LOT凍結の品質は、解凍回復率の試験により評価され、これは各ストローについて、10解凍の100%の解凍率を示し、すなわち、細胞材料は、解凍の際に、個々に評価された各ストローから継代培養され得る。次いで、微生物学的安全性を確認する安全性試験が、細胞が汚染されないことを確実にするために、凍結物の継代において細胞および培地に対して行われる。行われる特徴づけプログラムは、hBS細胞株の分化状態を評価するための広範な方法を包含する。最初に、未分化の細胞について一般に受容されるマーカー(SSEA‐1、SSEA‐3、SSEA‐4、TRA‐1‐60、TRA‐1‐80、Oct‐4、およびALP)のマーカー発現解析が行われる。継代および凍結‐解凍サイクルを介する細胞の遺伝的安定性が、染色体解析およびFISHを介して確認される。テロメラーゼ活性が、Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAPLUSキットを使用して測定される。hBS細胞の多能性は、胚様体段階を介するインビトロ分化により、および免疫不全SCIDマウスの腎臓皮膜下のhBS細胞の移植によるインビボ分化を介して、試験される。
未分化のhBS細胞をインビトロで維持および増殖された。継代の4〜7日後、未分化のhBS細胞コロニーは、基本的な分化プログラムに従って試験された。このプロトコルにおける各工程は、必要不可欠である以下の重要な成分により特徴づけられる;
第I段階、胚体内胚葉(DE):低血清およびアクチビンA
第II段階、DE‐hep前駆体細胞:TGFβスーパーファミリーのタンパク質のメンバー、特にBMP4
第III段階、機能的なDE‐hep細胞:HGF
増殖因子曝露時間、濃度、それらの種々の組み合わせ、処理の長さにおける変化が試験された。
以前に、hBS細胞は、十分に規定された増殖因子(アクチビンA)への曝露の際、胚体内胚葉細胞型に分化し得ることが示された。本発明において、いくつかの細胞株(SA001、SA002、SA002.5、SA034、SA167、SA181、SA348、およびSA461)が、増殖因子(GF)によって誘導されて、胚体内胚葉(DE)を介して肝細胞を生成し、次いでこれはDE‐hep細胞と呼ばれる。本発明者らの戦略は、以下に記載されるように、肝発生における重要な段階を模倣する3つの分化段階を含む。分化の第1相(第I段階、図1Aを参照のこと)において、アクチビンAはhBS細胞をDEに誘導し、これは1〜5日間かかる。第II段階において、初期の肝細胞型が、BMP4または/および他の因子により誘導され、そしてこれらの初期の肝細胞は拡張し、そして成熟する。最終相、第III段階において、最終成熟が、数日までの間にHGF、OSM、DEXによって達成される(図1A)。
第II段階(図1)において、細胞は、肝臓発生を誘導するために増殖因子の組み合わせに曝露された。培養物は、培養培地に添加される増殖因子に強力に応答し、そして小さなクラスター中に集合する均一な上皮細胞を形成する。さらにもう数日後、肝臓様細胞の比較的不均一な集団が発達し、その中で多くの細胞型が、クラスター中で互いに集合する(図6)。さらに、第II段階において、6〜9日後(アクチビンAによる誘導後)、最初の多角形の細胞が、いくつかの2核形成される細胞を伴って出現した(図6)。
第III段階において、培養物は、続いて、HGF、FGF2、およびFGF1を含有する培地に2〜3日間交換された。プロトコル1、本発明の特定の実施態様(図1B)において、培地は、第II段階の間、aFGF、bFGF、BMP2、BMP4、HGFを異なる濃度で、および0.2%血清ともに含有する異なる培地に交換された。これらの段階後、多くのDE‐hep細胞が出現し、そして多角形状を伴う典型的な肝細胞形態学を表し、核小体と異なる核を含んだ。興味深いことに、それらは、小さな島様クラスターに配置された、第II段階の半ばから後に開始された(図6および9)。
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル1において使用された、図1Bを参照のこと。
胚体内胚葉は、1%PEST、1%GlutaMAX、およびFGF2(4または5ng/ml)で、ならびに付加的に以下で補充された、RPMI改変培地またはDMEM培地または同等の培地における培養により、第I段階において誘導された;
1日目:アクチビンA、Wnt3a(100ng/ml、25ng/ml)、0%FCS
2日目:アクチビンA(100ng/ml)、0.2%FCS
3日目:アクチビンA(100ng/ml)、0.2%FCS
4日目:アクチビンA(100ng/ml)、0.2%FCS。
DE‐hep前駆体の誘導および発現、RPMI改変培地またはDMEM培地または同等の培地が使用され、そして1%PEST、1%GlutaMAX、および付加的に以下で補充された;
5日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(それぞれ、100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2%FCS。
6日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(それぞれ、100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2%FCS。
7日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
8日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
9日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
6日目:BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2%FCS、
7日目:BMP4(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、0.2%FCS、
8〜9日目:FGF1(50ng/ml)、FGF2(4ng/ml)、1%FCS、
10日目:HGF、FGF2(それぞれ、50ng/ml、4ng/ml)、1%FCS
11〜13日目:HGF、FGF2、EGF(それぞれ、50ng/ml、4ng/ml、10ng/ml)、1%FCS
胚体内胚葉に由来する肝細胞(DE‐hep細胞)の成熟のために、William E基本培地またはHCM培地または同等の培地が使用され、および1%PEST、1%GlutaMAXで補充され、そして10日目に、付加的に以下で補充された:OSM、Dex、ITS混合物、BMP4、HGF(それぞれ、10ng/ml、10−7M、1×、200ng/ml、50ng/ml)、0%FCS。15日目まで、培地は毎日交換された。
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル2において使用され、図1Bを参照のこと。
胚体内胚葉を、1%PEST、1%GlutaMAX、およびbFGF(4または5ng/ml)で、ならびに付加的に以下で補充された、RPMI改変培地またはDMEMまたは同等の培地における培養により、第I段階において誘導した;
1日目:アクチビンA(100ng/ml)、0%FCS
2〜3日目:アクチビンA(100ng/ml)、0.2%FCS。
DE‐hep前駆体の誘導および発現のために、HCM培地(いくつかの場合において、HCM抗体ミックスGA1000が省略された)またはWilliam E基本培地または同等の培地が使用され、そして1%PEST、1%GlutaMAX、および付加的にHGF(20ng/ml)および0%FCSで補充された。
胚体内胚葉に由来する肝細胞(DE‐hep細胞)の成熟のために、HCM培地(いくつかの場合において、HCM抗体ミックスGA1000が省略された)またはWilliam E基本培地または同等の培地が使用され、および1%PEST、1%GlutaMAXで補充され、そして13日目に、以下で付加的に補充された:OSM、Dex、(10ng/ml、10−7M)、0%FCS。培地交換は、2〜3日毎であった。DE‐hep細胞は、最小22日間から35日間まで、この培地において培養された。
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル3において使用され、図1Bを参照のこと。
胚体内胚葉を、1%PEST、1%GlutaMAX、およびbFGF(4または5ng/ml)で、ならびに付加的に以下で補充された、RPMI改変培地またはDMEMまたは同等の培地における培養により、第I段階において誘導した;
1日目:アクチビンA(100ng/ml)、0%FCS
2〜3日目:アクチビンA(100ng/ml)、0.2%FCS。
DE‐hep前駆体の誘導および発現のために、HCM培地(いくつかの場合において、HCM抗体ミックスGA1000が省略された)またはWilliam E基本培地または同等の培地が使用され、そして1%PEST、1%GlutaMAX、および付加的に以下で補充された;
6〜9日目:FGF4、BMP2(それぞれ、30ng/ml、20ng/ml)、0%FCS
10〜15日目:HGF(20ng/ml)、0%FCS。
胚体内胚葉に由来する肝細胞(DE‐hep細胞)の成熟のために、HCM培地(いくつかの場合において、HCM抗体ミックスGA1000が省略された)またはWilliam E基本培地または同等の培地が使用され、および1%PEST、1%GlutaMAXで補充され、そして16日目に、以下で付加的に補充された:OSM、Dex、(10ng/ml、10−7M)、0%FCS。DE‐hep細胞は、最小22日間から35〜40日間まで、この培地において培養された。
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル4において使用され、図1Bを参照のこと。
胚体内胚葉を、1%PEST、1%GlutaMAX、および付加的に以下で補充された、RPMI改変培地またはDMEMまたは同等の培地における培養により、第I段階において誘導した;
1日目:アクチビンA(100ng/ml)、0%FCS
2〜3日目:アクチビンA、FGF2(それぞれ、100ng/ml、4ng/ml)、0.2%FCS
4〜5日目:アクチビンA、FGF2(それぞれ、100ng/ml、4ng/ml)、1%FCS。
DE‐hep前駆体の誘導および発現のために、RPMI改変培地またはDMEMまたは同等の培地が使用され、そして1%PEST、1%GlutaMAX、および付加的に以下で補充された;
6〜7日目:BMP4、FGF2(それぞれ、50ng/ml、4ng/ml)、0.2%FCS。
8〜9日目:aFGF、FGF2(それぞれ、50ng/ml、4ng/ml)、1%FCS。
10〜12日目:HGF、FGF2、EGF(それぞれ、50ng/ml、2ng/ml、10ng/ml)、1%FCS。
胚体内胚葉に由来する肝細胞(DE‐hep細胞)の成熟のために、HCM培地(いくつかの場合において、HCM抗体ミックスGA1000が省略された)またはWilliam E基本培地または同等の培地が使用され、および1%PEST、1%GlutaMAXで補充され、ならびに付加的に以下で補充された;
13〜14日目:OSM、ITS混合物、HGF(それぞれ、10ng/ml、1×、50ng/ml)、0%FCS
15〜26日目:OSM、ITS混合物、HGF、Dex(それぞれ、10ng/ml、1×、50ng/ml、10−7M)、0%FCS。
アクチビンA処理は、コロニーの形態学的な変化、および異なる分化パターンに関連した。アクチビンを含有する培地によって処理された、3〜5日後、細胞は互いに集まり、そしてコロニーの周囲に上皮細胞の環を形成した(図2)。これらの均一に増殖する細胞は、プレート上に拡張し、そしてマウス支持細胞層を含有するプレートに継代され得た。
初期の分化段階で、Sox7は胚体外内胚葉(ExE)についてのマーカーとして認識され得、および胚体内胚葉(DE)において発現されない(D’AMOURら、2006)。Sox17ポジティブ細胞は、ExEおよびDEの両方に存在する。このことは、Sox17+/Sox7−細胞は、DE起源であることを示唆する。Sox7およびSox17での免疫染色が、DE‐hep細胞が胚体内胚葉から生成されたことを確認するために行われた。アクチビンAを伴った4日後、大多数の細胞がSox17ポジティブおよびSox7ネガティブである(図3)。
異なる細胞型における遺伝子発現レベルを調査するために、TaqMan(登録商標)低密度アレイ(384‐Well Micro Fluidic Cards、Applied Biosystems)が使用された。比較のために、市販の胎児肝臓、ヒト成体肝臓、播種されたヒト初代肝細胞、新鮮に単離されたヒト初代肝細胞、およびHepG2からの全RNAが、並行して解析された。cDNA合成が、Superscript3(カタログ番号18080‐051 invitrogen)を使用して行われた。相対的な遺伝子発現レベルが、CREBBPの発現に対して正規化された。
1つの遺伝子についてのいくつかのプローブ
1つのプローブは、特異的なmRNA転写産物(スプライシング変異体)を表し、そしてこれらの転写産物は、完全に異なる発現プロフィールを示し得る。これは転写レベルに対するデータであるので、タンパク質発現に対するマッピングの場合、時として混乱を引き起こす。目的のタンパク質をコードするスプライシング変異体がどれであるのかを知るために、異なる戦略が使用され得る:1)最も高い発現を伴う変異体が選択され得る;2)平均が算定され得る;3)予期される発現プロフィールの「生物学的」解釈が選択され得る。第3の代替は、遺伝子が周知である場合に使用され得る。あまり知られない遺伝子については、第1の戦略が使用され得る。各プローブは、プローブがどのくらい特異的であるのかを示す旗を有する。プローブの名前はプロットにおいて左側に含まれる。非常に特異的なプローブを欠く遺伝子について、本発明者らは、最も特異的に利用可能なプローブを示した。1よりも低い値は、log2目盛においてネガティブな値である、以下の表を参照のこと。
3つの細胞株、SA167、SA002、およびSA461が使用された。実験設定は、以下のようであった:未分化のhBS細胞(UD)、5日目の胚体内胚葉(DE5)、5日目の内因的に分化されたhBS細胞(EE5)、10日目のDE誘導性肝前駆体(DE10)、10日目の内因的に分化されたhBS細胞(EE10)、20日目のDE誘導性肝前駆体(DE20)、20日目の内因的に分化されたhBS細胞(EE20)。コントロールとして、胎児肝臓(FL)、成体肝臓(AL)、播種された初代肝細胞(PH)、および新鮮な初代肝細胞(FPH)、およびHepG2が使用された。
培養物は、第II段階において、因子(重要な成分BMP4)の曝露に強力に応答し、そして小さなクラスターに集合される均一な上皮細胞を形成した。さらに2日後、比較的不均一な集団が、多くの上皮細胞型の間で得られた。さらに、第II段階において、6〜9日後、最初の多角形細胞が、いくつかの二核形成された細胞を伴って出現した(図8)。これらの細胞はしばしば、線維芽細胞様細胞の三次元的な隆起の近隣に位置された。
DE‐hep前駆体集団を、免疫蛍光マーカーにより確認し、表2を参照のこと、第II段階からの初期DE‐hep前駆体の免疫組織学的標識による解析をまとめる、図8および実施例7においてもまた示される。DE‐hep前駆体細胞は、EpCAMを発現する細胞を伴う領域においてしばしば見出される、図9。
サンプルのRNA濃度は、NanoDrop ND‐1100を使用して決定された。異なるサンプルからの同じ量のRNAが、逆転写において使用され、これはcDNAを作製するために二連で行われた。ゲノムDNAの量についてのコントロールとして、NoRTコントロールが行われ、ここでは逆転写(RT)酵素は何も添加されなかった。NoRTコントロールにおけるシグナルは、ゲノムDNAの量を反映する。遺伝子のQPCRが二連のサンプルからのcDNAに対して、およびNoRTコントロールに対して行われた。使用された解析は:NHF3B、NHF4A、EpCAM、AFP、AAT、Desmin、CD133、Notch2、ICAM‐1、CK7、CK18、およびCK19である。
DE‐hep前駆体の拡張および精製のために、培養物は、第II段階5日目に、0.2%トリプシン‐EDTAで酵素的に処理されるか(プロトコル1および4)、または手作業でばらばらにされ、そして以下に記載されるスキームに従って、複製のためにMatrigelでコートされた組織培養プレートに移された。DE‐hep前駆体のMatrigel培養物について、RPMI改変培地またはDMEM、または同等の培地が使用され、そして1%PEST、1%GlutaMAX、および必要に応じて以下で補充された;
5日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(それぞれ、100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、5%FCS;
6日目:aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(それぞれ、100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0.2%FCS;
7日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS;
8日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS;
9日目:bFGF、BMP4、HGF(それぞれ、50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)、0.2%FCS。
第III相において、培養物はHCM培地に交換された(図1Aおよび実施例2を参照のこと)。この段階で、多くのDE‐hep細胞が出現し、そして多角形を伴う典型的な肝細胞形態学を表し、核小体と異なる核を含んだ(図11)。興味深いことに、それらは、線維芽細胞様細胞により取り囲まれる小さな島様クラスターにおいて配置された(図12)。この形態学は、内因的分化により誘導される肝細胞様細胞の形態学とは異なる(図12;またSOEDERDAHLら、2007を比較のこと)。
全コロニーを固定し、そして免疫細胞化学により解析した。表1におけるデータは、DE‐hep培養物において、多くの細胞がCYP1A2、CYP3A4/7、CK18、CK8、CK19、およびHNF4αにポジティブであったことを示した。興味深いことに、極性化転写因子タンパク質MRP2の発現は、DE‐hep前駆体培養物において検出され得たが、未処理のコントロール培養物(内因的分化)においては検出され得なかった。表3Aは、現在までに第III段階でのDE‐hep細胞、コントロール培養物、In Vitro Technologiesから市販されるHepG2および初代ヒト肝細胞に対して行われた免疫細胞化学分析をまとめる。空欄は、染色されていないか、または解析されていない。
表は、第III相のDE‐hep培養物の特徴づけデータを取り上げ、これは内因的に分化されたhBS細胞の培養物、HepG2細胞株、およびヒト初代肝細胞培養物に比較された。「+」および「−」は、半定量的測定であり、解析されたマーカーのおよそのレベルを記載する。
これらのDE‐hep前駆体細胞が機能的であるか否かを評価するために、それらはインドシアニングリーンの取り込みおよび分泌(実施例17)、グリコーゲン貯蔵(実施例18)、アルブミン分泌(実施例15)、LDL‐取り込み、異なる薬物の代謝能力(実施例16)、およびアンモニア代謝(実施例20)について試験された。
hBS細胞由来のDE‐hep培養物、および十分なコントロール(VitroHESTMの僅かな培地変化を伴ってMEF上で内因的に分化されたhBS細胞、またはHepG2細胞のいずれか)のサンプルが、肝臓関連性遺伝子の発現についてQPCRにより解析された。アルブミン、HNF4a、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1、およびUGT2B7の発現が、表4において特定されるように解析された。
cDNAが全RNAから調製され、そして適切な濃度を得るためにRNASE/DNASE非含有水中にそれが希釈された(以下を参照のこと)。以下の成分が混合された:cDNA(1〜100NG)、5μl、RNASE/DNASE非含有水、TaqMan Universal PCR、45μl、Masterミックス(2×)、50μl、合計100μl。その後サンプルをLDAカード上にロードし(各サンプルミックスは、100μl、および170NG cDNA/サンプルである)。そして遠心分離し、その後LDAカードを密封した。最後に、手引きにおける製造業者の指示に従って、ABI 7900HT実時間PCR系上でカードを実行し、そして結果をSDS 2.2.1ソフトウェアおよび相対的な定量化を使用することにより解析した。
プロトコル2で誘導されるDE‐hep細胞(3つの独立した実験)は、48時間培養されたヒト初代肝細胞と等しく高いCYP3A4発現を示し、HepG2細胞よりも100倍高い発現を示す。内因的に分化されたhBS細胞培養物における肝細胞様細胞(3つの独立した実験、プロトコル2に並行に行われる)は、DE‐hep培養物に比較してCYP3A4のより低い発現レベルを示す。プロトコル2で誘導されるDE‐hep細胞は、成体肝臓関連性遺伝子CYP7A1およびグルコース6ホスファターゼを発現することが見出される(表5AおよびBを参照のこと)。DE‐hep培養物が均一な細胞集団ではなく、および発現レベルは、混合培養物からDE‐hep細胞を富化する場合、より高くなることに留意のこと。
アルブミン分泌が、Klinsk Kemi、C‐lab、Sahlgrenska University Hospital、Gothenburgのアルブミン定量キット(カタログ番号03576108、COBAS)を使用して解析された。アルブミンは、14G/日の速度で肝臓実質細胞において合成され、血漿において2つの主な機能:膠質浸透圧の維持(血漿中のアルブミンに起因して80%)および輸送を有する。これは、低い水溶性を有する物質(例えば、遊離脂肪酸、ビリルビン、金属イオン、ホルモン、および薬剤)について最も重要な輸送タンパク質である。試験原理は、免疫比濁アッセイに基づき、抗‐アルブミン抗体を使用する。これらの抗体は、サンプル中の抗原と反応して、抗原/抗体複合体を形成し、これは凝集後、比濁的に測定される。血清/血漿における期待値は35〜52g/l(532〜790μモル/L)である。
第III段階でのhBS由来のDE‐hep細胞が、第I相の酵素CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9についての3つのプローブ薬物を代謝するそれらの能力について試験された。26μMフェナセチン(CYP1A2により代謝される;ALDRICHから購入された)、9μMジクロフェナク(CYP2C9により代謝される;SIGMAから購入された)、および3μMミダゾラム(CYP3A4により代謝される;SIGMAから購入された)は、カクテルとして、12〜17時間、37℃および5%CO2にて、フェノールレッド非含有培地中でインキュベートされた。培養上清のサンプルは回収され、そして5〜20分間、500〜4000Gの速度にて遠心分離されて、任意の細胞残渣を除去した。100〜120μlの澄明化された上清サンプルを、96ウェルプレートに移し、そして15μlのアセトニトリルを各ウェルに添加した。所望される場合、アセトニトリルの添加は省略され得た。サンプルは−20℃にて凍結され、そして培養上清中の代謝物濃度が、LC−MSによって測定された(CYP1A2についてアセトアミノフェン、CYP3A4について1ヒドロキシル‐ミダゾラム(1 OH‐Midazolam)、およびCYP2C9についてヒドロキシル‐ジクロフェナク(OH‐Dicrofenac)。
(実施例16)
肝細胞膜を横切る輸送は、肝臓クリアランスにおける重要なパラメータであり、および通常、異なる担体媒介系を介して生じる。
アニオン性化合物の胆汁排出は、多剤耐性タンパク質2(MRP2)によって媒介される。MRP2免疫蛍光は、第III段階でのDE‐hep細胞培養物において見出される(図14 AおよびBを参照のこと)。DE‐hep細胞におけるMRP2の発現が、LDAカード上でmRNAレベルに対して確認された(表5A+Bを参照のこと)。
インドシアニングリーン(ICG、カーディオグリーン(Cardiogreen)とまた呼ばれる、Sigma、12633)は、非毒性であり、および肝臓によって専ら排出され、それゆえ、一般に、肝機能を評価するための試験物質として臨床的に使用される有機アニオンである。(SHINOHARAら、1996)。ICGは、滅菌バイアル中で5mlの溶媒中に溶解され、次いで10%FBSを含有する20mlのDMEMに添加された。得られるインドシアニングリーン(ICG)溶液の最終濃度は、1mg/mlであった。ICG溶液は、細胞培養皿に添加され、そして37℃にて60分間、インキュベートされる。皿が、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で3回リンスされた後、ICGの細胞の取り込みが、立体顕微鏡で試験された。試験後、皿は10% FBSを含有するDMEMで再充填された。ICGは一晩で細胞から排出された。
ヒト肝細胞はグリコーゲンを合成し、そして貯蔵する。本発明者らは、第III段階のDE‐hep細胞における、および内因的に分化された細胞における、過ヨウ酸‐シッフ(Schiff)染色により、グリコーゲンレベルを解析した(DE‐hep細胞のグリコーゲン染色:図15:内因的に分化された細胞のグリコーゲン染色:SOEDERDAHLら、2007を参照のこと)。内因的に分化された脂肪におけるよりも有意に高いグリコーゲン貯蔵が、DE‐hep細胞において見出され、そして肝細胞様形態学を伴う細胞に関連され得る。図15Bにおいていくつかのグリコーゲンポジティブ細胞が二核形成されることに留意のこと。
一次抗体の使用:
アルブミン(ウサギ)1:500、DAKOCytomation、A0001
AAT(ウサギ)1:200、DAKOCytomation、A0012
CD133(マウス)1:50、Miltenyi、clone AC141
c‐kit(ヤギ)1:100、R&D、AF332
CK7(ウサギ)1:200、Novocastra,NCL‐CK7 560
CK8(マウス IgG1)1:200、Santa Cruz、sc‐52324
CK18(マウス)1:200、DAKOCytomation、M7010
CK19(マウス IgG1)1:150、Novo Castra、NCL‐CK19
Desmin(マウス IgG1)1:200、Chemicon、MAB 1698
EpCAM(マウス IgG1)1:50、GeneTex、Inc.VU‐ID9
EGFR‐1(マウス IgG2b)1:100、abcam、ab30
e‐cadherin(マウス IgG1)1:500、ZYMED、13‐1700
LFABP(ヤギ)1:500、Santa Cruz、sc‐16064
HNF3b(ヤギ)1:250、Santa Cruz、sc‐6554
HNF4a(ウサギ)1:500、Santa Cruz、sc‐8987
HNF1a(ウサギ)1:400、Santa Cruz、sc‐22840
Nestin(マウス IgG1),1:250,BD Biosciences,611658
Notch2(ウサギ)1:100、Santa Cruz、25‐255
Oct‐4(マウス)1:500、Santa Cruz、sc‐5279
c‐Met(HGF受容体、マウス)1:100、upstate、05‐237
α6‐integrin(CD49f、ラット)1:250、BD Biosciences、555736
ICAM‐1(CD54;マウス)1:500、BD Pharmingen、559047
PDGFRa(マウス)1:500、Chemicon,CBL1366
Sox17(ウサギ)1:2000、(E.Baetgeからの親切な贈物)
Vimentin(mouseIgG1)1:300、SIGMA、V‐6630
‐ロバ抗ヤギ‐Alexa488、1:500、Molecular Probes、番号A‐11055
‐ロバ抗マウス‐Cy3、1:1000、Jackson Immuno Research、番号715‐165‐151
‐ロバ抗マウス‐Cy2、1:100、Jackson Immuno Research、番号715‐225‐151
‐ロバ抗ウサギ‐Alexa488、1:1000、Molecular Probes、番号A‐21206
‐ロバ抗ウサギ‐Alexa594、1:1000、Molecular Probes、番号A‐21207
‐ロバ抗ラット‐Cy3、1:500、Jackson Immuno Research、番号712‐165‐153
‐ロバ抗ラット‐Cy2、1:100、Jackson Immuno Research、番号712‐225‐153
細胞内タンパク質について:
4%PFA中での15分間の固定、2×PBS洗浄、30分間の0.1%PBT中の5%FBS、一晩4℃にてPBS中の1%FBS中でインキュベートされる一次抗体、1時間室温でのPBS中の1%FBS中の二次抗体、PBS中での全ての洗浄、5分間室温での0.05mg/mlでのDAPI、DAKOCytomationマウンティング培地中にマウントされる。
4%PFA中での15分間の固定、2×PBS洗浄、30分間のPBT中の5%FBS、一晩4℃にてPBS中の1%FBS中でインキュベートされる一次抗体、1時間室温でのPBS中の1%FBS中の二次抗体、PBS中での全ての洗浄、5分間室温での0.05mg/mlでのDAPI、DAKOCytomationマウンティング培地中にマウントされる。
薬物は、ヒト/哺乳動物において、2つの連続的な経路によって代謝されるかまたは分解される。第I相の酵素は、チトクロームP450ファミリーからなる。このクラスの酵素からのタンパク質は、反応を触媒して、それらの生体異物基質に対して、官能基および反応中心、例えば、SH、OH、‐NH2、および‐COOH基の付加を生じる。DE‐hep細胞は、以下のCYP:1A2、3A4/7について免疫反応性を示す(2つのサブタイプ間で強力な抗体交差反応)。
‐CYP1A2(ウサギ)1:100、Biomol、CR3130;ヒトCYP1A2の合成トリデカペプチドにチアして惹起され、それゆえおそらくCYP1A1と交差反応しない
‐CYP1A2(ウサギ)1:200、Cypex、PAP021;製造業者による情報によるとウェスタンブロットにおいてCYP1A1と交差反応しない
‐CYP3A4(ヒツジ)1:100、Biomol、CR3345;製造業者による情報によるとCYP3A7と交差反応しない
‐CYP3A4(ウサギ)1:200、Cypex、PAP011;CYP3A7とおそらく交差反応する
‐ロバ抗ウサギ‐Alexa488、1:1000、Molecular Probes、番号A‐21206
‐ロバ抗ヒツジ‐Alexa488、1:1000、番号A‐11015
4%PFA中での15分間の固定、2×PBS洗浄、30分間の0.1%PBT中の5%FBS、一晩4℃にてPBS中の1%FBS中でインキュベートされる一次抗体、3時間室温でのPBS中の二次抗体、PBS中での全ての洗浄、5分間室温での0.05mg/mlでのDAPI、DAKOCytomationマウンティング培地中にマウントされる。
DE‐hep細胞は、輸送体MRP2について免疫反応性を示す(図14B)。MRP2は、肝細胞様培養物およびDE‐hep細胞培養物の両方において発現される。
MRP2(ウサギ):1:50、Santa Cruz、sc‐20766
‐ロバ抗ウサギ‐Alexa488、1:1000、Molecular Probes、番号A‐21206
免疫染色プロトコル
4%PFA中での15分間の固定、2×PBS洗浄、30分間の0.1%PBT中の5%FBS、一晩4℃にてPBS中の1%FBS中でインキュベートされる一次抗体、1時間室温でのPBS中の二次抗体、PBS中での全ての洗浄、5分間室温での0.05mg/mlでのDAPI、DAKOCytomationマウンティング培地中にマウントされる。
尿素の測定は、腎臓機能の評価について最も広範囲に使用される試験である。尿素は、タンパク質およびアミノ酸代謝の最終分解産物である。このプロセスにおいて形成されるアンモニアは、肝臓において尿素に合成され、そしてヒトの体内の過剰な窒素を排除するために最も重要な触媒経路を構成する。Roche UREA/BUNアッセイは、尿素の測定のために全体的に酵素手順を使用する、TalkeおよびSchubert法に基づき、共役ウレアーゼ/グルタミン酸脱水素酵素(GLDH)酵素系を使用する。簡潔には、尿素は、ウレアーゼにより加水分解されてCO2およびアンモニアを形成する。次いで、形成されたアンモニアは、GLDHの存在下、α‐ケトグルタル酸およびNADHと反応して、グルタミン酸およびNAD+を生じる。NADHの消費に起因する吸光度の減少が動力学的に測定される。血清/血漿における通常値は10〜50mg/dL(1.7〜8.3mmol/L)である。
DE‐hep培養物は、DE‐hep細胞以外の他の細胞型を含むので、細胞/細胞核当たりの特異的なCYP活性を算定することを可能にするために、CYPを発現する細胞の数を決定することが望ましい。1つの可能性は、自動化細胞解析系(例えば、In Cell解析器)を使用して、特異的なCYPについて免疫ポジティブである、それらのヒト核を計測することである(DAPIのような核染色および抗ヒト核抗体で同時標識される)。
分化プロトコルを開始する前に、hBS細胞は、コラゲナーゼで単一の細胞および細胞のクラスターに分離された。その後、単一の細胞および細胞のクラスターは、マウス胚線維芽細胞(MEF)または他のマトリクス上に播種され、そしてDE‐hep分化戦略または内因的分化戦略のいずれかに従って培養された。以下において、このような実験の4つの例が、プロトコルA〜Dとして記載される。これらのプロトコルは全て、培養において5〜7日間の長さを有する。その後、細胞の培養は、プロトコル1〜4に従って継続される(図1Bを参照のこと)。
DE‐hep培養物は混合性の集団であるので、これは所望される細胞集団、例えば、DE‐hep前駆体またはDE‐hep細胞に精製する必要性があり得る。精製は、磁性活性化細胞選別(MACS)もしくは蛍光活性化細胞選別(FACS)のような抗体ベースの方法、またはFICOLLもしくはPERCOLLのような勾配遠心分離に基づく方法を用いて行われ得る。抗体ベースの方法(FACSおよびMACSのような)について、細胞外エピトープに指向される抗体、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR1)または薬物輸送体が必要とされる。FACSについて、抗体の代替は、薬物輸送体についての蛍光基質、例えば、OATP‐8についてFLUO‐3、またはCYPについて、例えば、7‐ベンジルオキシ‐4‐トリフルオロメチル‐クマリン(BTC)を使用することである。これらの非毒性の蛍光基質は、所望される細胞集団を一過的に標識し、従って、細胞の永久的な変化または障害を伴うことなく細胞を選別することを許容する。
第I段階において、5日目に、MEF上のhBS細胞に由来するDE細胞は、TripleSelectで分離され、そしてマトリゲルおよび/またはコラーゲンでコートされたプレートに移される。播種密度は250 000細胞/CM2であった。第II段階の培地(図1Bおよび実施例2を参照のこと)の存在下、細胞は迅速に肝前駆体細胞に向かって分化し、そしてまた増殖した(形態学については図17を参照のこと)。第II段階において16日目に、多くの細胞がEpCAM、CK7、CK19、およびCD54免疫ポジティブであった(データ示されず、DE‐hep前駆体において発現されたマーカーについて表2を比較のこと)。
DE‐hep細胞以外に、腸細胞または他の腸管細胞のような他の内胚葉細胞型が、hBSに由来し得る。このような細胞型の検出のための適切なマーカーは、尾側関連性ホメオボックス2(Cdx2)および腸管脂肪酸結合タンパク質(IFABP)である。Cdx2は、腸管上皮において、および結腸癌細胞株Caco‐2において高度に発現される(データ示されず)。IFABPは、小腸の腸細胞において発現される(データ示されず)。Cdx2およびIFABPのいずれも、肝臓切片において、免疫組織化学により検出され得ず(データ示されず)、それゆえDE‐hep培養物において腸細胞と肝細胞との間を区別するために適切である。
初代ヒト肝細胞は、2D細胞培養物において、単純な3D系、例えば、いわゆるサンドイッチ配座(これは、マトリゲルまたはコラーゲン重層が細胞上に置かれることを意味する)、が適用される場合、改善された機能性を示すことが知られる。それゆえ、本発明者らは、このようなサンドイッチ配座をまた、DE‐hep細胞に対して試験し、そして最後の1〜2週間、培養物上にマトリゲルの重層を置いた。表9において示されるように、このことはCYP1A2およびCYP3A4の活性を増加し、従ってDE‐hep細胞の機能性に対してポジティブな効果を有した。ビーズ、ゲルのような他の3D系は、機能性を同様に改善し得ることが意図される。
生体異物は、2つの連続的な系、第I相および第II相の酵素系により代謝される。第I相系は、チトクロームP450酵素(CYP)ならなり、および第II相系は、例えばウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)、およびスルホトランスフェラーゼ(SULT)からなる。
培養条件の異なる変化が、DE‐hep細胞においてCYP2C9の発現を改善するために適用された。
本発明者らのプロトコルと、CAIらにより公表されたプロトコルとを比較するために、本発明者らは、hBS細胞に対して両方のプロトコルを適用し、そしていくつかの重要な肝臓遺伝子のmRNA発現を解析した。本発明者らのDE‐hepプロトコルによって分化された細胞は、アルブミン、CYP1A2、CYP2C9、およびCYP3A4のより高いmRNAレベルを発現した、図21。
細胞株SA002からのSCED(酵素的に分離される単一細胞)細胞を、TRYLE SELECTでの単一細胞への酵素的分離により支持細胞から分離し、一方大部分のHHFFをプレートに付着させた。hBS細胞は、30%セルロースを含有するVitroHES培地中、5日間、再凝集のために吊り下げ点滴液に移され、そしてコラーゲンがコートされた培養皿上に播種された。次いで、hBS細胞は、本発明者らのDE‐hepプロトコルおよびCaiらにより公表されたプロトコルに曝露された。得られる細胞培養物は、実時間PCRにより、いくつかの肝臓マーカーの肝臓遺伝子発現について解析された。
フローサイトメトリーが、第3段階でのDE‐hep培養物(SA002、28日目)および初代肝細胞の中のCYP1A2ポジティブ細胞の百分率を定量するために、CYP1A2抗体を使用して行われた。DE‐hep細胞は、TiPISで20分間、37℃にて分離された。初代肝細胞は新鮮に単離された。
未分化のhESC株SA002は、5ng/mlbFGFの存在下、5日間、アクチビンA(100ng/ml)またはアクチビンB(100ng/ml)のいずれかに曝露され、そして遺伝子発現について解析された。内胚葉マーカーのFoxa2、Sox17、およびCxcr4のmRNA発現は、アクチビンAに比較して、アクチビンB曝露の際に同じであるか、さらにより高かった。さらに、胚体外(ExE)マーカーのSox7、CDX2、およびAATは、アクチビンAに比較して、アクチビンBで培養された細胞において、同じであるか、またはより低かった。このことは、アクチビンBが、内胚葉の誘導についてアクチビンAと等しく良好であるか、またはアクチビンAよりもさらに良好であることを示す。図23を参照のこと。
Foxa2、Sox17、Cxcr4、Sox7、CDX2、およびAATのmRNA発現は、ABI/TaqMan法を使用する実時間PCRにより測定された。簡潔には、RNAは、QiagenのRNeasy系を使用することにより細胞培養物から単離された。cDNAは、ABI高性能cDNA合成キットを使用することにより合成された。RT‐PCRは、TAQMANプローブを使用することによりABI 7500において行われた。発現レベルは、CREBBP発現に正規化された。
・WO03055992、多能性ヒト胚盤胞由来の幹細胞株、CELLARTIS ABの確立のための方法
・WO2004098285、密閉ストローガラス化法の使用によるヒト胚盤胞幹細胞の低温保存
・WO2004099394、ヒト胚盤胞由来の肝細胞の、支持細胞で支持された培養系から支持細胞非含有培養系への効果的な移動のための方法。
・NOAKSSON K、ZORIC N、ZENG X、RAO MS、HYLLNER J、SEMB H、KUBISTA M、SARTIPY P、実時間PCRを使用してヒト胚幹細胞の分化をモニタリングする。STEM CELLS.2005 11〜12月;23(10):1460‐7。電子出版 2005年8月4日。
・SJOEGREN−JANSSON E、ZETTERSTROEM M、MOYA K、LINDQVIST J、STREHL R、ERIKSSON PS. 支持細胞非含有培養系における4つの未分化のヒト胚幹細胞株の大規模増殖、DEV DYN.2005年8月;233(4):1304‐14。
・D’AMOUR KA、BANG AG、ELIAZER S、KELLY OG、AGULNICK AD、SMART NG、MOORMAN MA、KROON E、CARPENTER MK、BAETGE EE.、ヒト胚幹細胞からの膵臓ホルモンを発現する内分泌細胞の生成。、NAT BIOTECHNOL.2006年11月;24(11):1392‐401
・D’AMOUR KA、AGULNICK AD、ELIAZER S、KELLY OG、KROON E、BAETGE EE.、ヒト胚幹細胞の、胚体内胚葉への効果的な分化。、NAT BIOTECHNOL.2005年12月;23(12):1534‐41。
・CAI J、ZHAO Y、LIU Y、YE F、SONG Z、QIN H、MENG S、CHEN Y、ZHOU R、SONG X、GUO Y、DING M、DENG、H.、ヒト胚幹細胞の機能的肝細胞への直接的な分化。、HEPATOLOGY.2007年5月;45(5):1229‐39。
・SOEDERDAHL T、KUPPERS−MUNTHER B、HEINS N、EDSBAGGE J、BJOERQUIST P、COTGREAVE I、JERNSTROEM B.「ヒト胚幹細胞に由来する肝細胞様細胞におけるグルタチオントランスフェラーゼ」。TOXICOL IN VITRO.2007年8月;21(5):929‐37、電子出版2007年2月2日。
第II段階‐DE‐hep前駆体
1.ヒト胚盤胞由来の幹(hBS)細胞に、胚体内胚葉を介して由来するDE‐hep前駆体細胞の調製のための方法であって、方法は、
i)増殖因子、特にFGF2、および骨形態形成タンパク質、特にBMP4を含む培養培地中で、hBS細胞に由来する胚体内胚葉細胞を、5日間以上、培養する工程、
ii)必要に応じて、得られた胚芽様前駆体細胞を採集する工程、を包含する。
1日目および2日目:培養培地は、FGF2、BMP4、1つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にBMP2、血清、特にFCS、PEST、およびGlutaMAX、ならびに必要に応じて1つ以上のさらなる増殖因子、特にαFGFを含む。
3日目:培養培地は、FGF2、BMP4、血清、特にFCS、PEST、GlutaMAX、および必要に応じて、肝細胞増殖因子を含む。
4日目:培養培地は、FGF2、BMP4、HGF、血清、特にFCS、PEST、GlutaMAX、および肝細胞増殖因子を含む、または、代替的に、培養培地は、FGF1、FGF2、および血清、特にFCSを含む。
5日目:培養培地は、FGF2、BMP4、HGF、血清、特にFCS、PEST、GlutaMAX、または、代替的に、培養培地は、HGF、FGF2、および血清、特にFCSを含む。
6〜8日目:培養培地は、FGF2、HGF、血清、特にFCS、PEST、GlutaMAXを含む。
15.得られた細胞が、HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、Desmin、CD133、Notch2、ICAM1、CK7、CK18、およびCK19のうちの1つ以上の遺伝子発現を表す、項目1〜14のいずれかに記載の方法。
18.胚体内胚葉細胞が、アクチビンA、ならびに必要に応じて、1つ以上の増殖因子、Wnt3a、および血清、特にFCSを含む培養培地中でhBS細胞を培養することにより得られる、項目1〜17のいずれかに記載の方法。
1日目:培養培地は、アクチビン、Wnt3a、および増殖因子、特にFGF2を含む。
2日目:培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にFGF2を含む。
3日目および4日目:培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にFGF2を含む。
26.項目1〜23のいずれかにおいて規定されるように得られるDE‐hep前駆体細胞を、必要に応じて、例えば、デキサメタゾン、オメプラゾール、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような分化誘導物質が、単独で、または;
ITS混合物;
BMPおよび/またはTGFP、特にBMP4、および/または
HGF
と組み合わせて補充される、例えば、William E基本培地またはHCM Cambrex培地のような培養培地中で、培養する工程をさらに包含する、項目1〜25のいずれかに記載の方法。
29.得られる細胞集団中の少なくとも20%の細胞または細胞核が、以下の特性、グルコース6ホスファターゼ、アポリポタンパク質E、CYP7A1(コレステロール7Aヒドロキシラーゼ)、アルコールデヒドロゲナーゼ1、チトクローム P450 レダクターゼ、HNF4a、α‐1‐アンチトリプシン、CK18、HNF3b、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質のうちの、少なくとも1個、例えば、少なくとも4個、少なくとも6個、少なくとも8個、少なくとも10個、または全て、ならびに以下の11個の特性、
A.薬物輸送体
i)少なくとも1%の細胞、または、適切な場合、細胞核が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
ii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OATP‐2(=OATP‐C、OATP1B1)、および/またはOATP‐8(OATP1B3)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iv)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OATP‐A(=OATP‐1A2)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
v)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、NTCPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vi)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MDR1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、MDR3のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
viii)少なくとも1%の細胞、または適切な場合、細胞核が、OCT‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
B.薬物代謝酵素
ix)少なくとも20%の細胞、または適切な場合、細胞核が、GST‐A1‐1および/またはGSTM1‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
x)少なくとも5%の細胞、または適切な場合、細胞核が、以下の、CYP‐1A1、CYP‐1A2、CYP‐1B1、CYP‐2A6、CYP‐2B6、CYP‐2C8、CYP‐2C9、CYP‐2C19、CYP‐2D6、CYP‐2E1、CYP‐3A4、CYP‐3A7、およびCYP‐7A1のうちの少なくとも2個の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
xi)少なくとも5%の細胞、または適切な場合、細胞核が、UGT1A6および/またはUGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
のうちの少なくとも2個、例えば、少なくとも4個、少なくとも6個、少なくとも8個、少なくとも10個、または全てを表す、項目26〜28のいずれかに記載の方法。
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
iii)細胞の少なくとも1%が、OATP‐2および/またはOATP‐8のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
v)細胞の少なくとも20%が、以下の、CYP450‐1A2、CYP450‐2A6、CYP450‐2B6、CYP450‐2C8、CYP450‐2C9、CYP450‐2C19、CYP450‐2D6、CYP450‐2E1、CYP450‐3A4、およびCYP450‐3A7のうちの少なくとも2個の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
vi)細胞の少なくとも5%が、GST M1‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、
のうちの少なくとも2つを表す、項目26〜29のいずれかに記載の方法。
Claims (81)
- ヒト胚盤胞由来の幹(hBS)細胞に、胚体内胚葉を介して由来するDE‐hep前駆体細胞の調製のための方法であって、
i)第I段階であって、ここでhBS細胞は、胚体内胚葉に発達するように誘導され、第一段階は、アクチビンを含む第1の第I段階の培養培地中でのhBS細胞の1〜7日間、好ましくは2〜6日間の培養を包含し、ここで培地は、培養の1〜2日後に、アクチビン、1つ以上の増殖因子、および必要に応じて血清を含む第2の第I段階の培養培地により置き換えられる、第I段階、
ii)第II段階であって、ここで第I段階から得られる細胞は増殖され、そして第II段階は、1つ以上の増殖因子、および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第II段階の培養培地中で、第I段階からの細胞を培養する工程、
必要に応じて、DE‐hep前駆体を採集する工程を包含する、第II段階
を包含する、方法。 - 第1および/または第2の、第I段階の培養培地が、RPM1改変培地またはDMEM培地である、請求項1に記載の方法。
- 第1および/または第2の、第I段階の培養培地が、1つ以上の増殖因子、特に、FGF2、Wnt3a、および血清、特にFBSで補充される、請求項1または2に記載の方法。
- hBS細胞が以下のスキーム:
1日目:第1の第I段階の培養培地は、アクチビンおよび必要に応じてWnt3aを含む(例えば、プロトコル1)、
1日目:第1の第I段階の培養培地は、アクチビンおよび増殖因子、特にFGF2を含む(例えば、プロトコル2および3)、
1日目:第1の第I段階の培養培地は、アクチビンを含む(例えば、プロトコル4)、
のうちの1つに従って培養される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - hBS細胞が以下のスキーム:
2日目:第2の培養培地は、アクチビンおよび血清を含む(例えば、プロトコル1)、
2日目:第2の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にFGF2を含む(例えば、プロトコル2、3、および4)、
のうちの1つに従って培養される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - hBS細胞が以下のスキーム:
3〜4日目:第2の培養培地は、アクチビンおよび血清を含む(例えば、プロトコル1)、
3〜5日目:第2の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にFGF2を含む(例えば、プロトコル2、3、および4)、
に従って培養される、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 第2の第II段階の培養培地が、増殖因子、特にFGF2、および必要に応じて骨形態形成タンパク質、特にBMP4を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 第II段階の培養培地が、RPM1改変培地、DMEM培地、HCM培地、William E基本培地、またはVitroHES(登録商標)などを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 第II段階の培養培地が、FGF2、PEST、および/またはGlutaMAXで補充される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 第II段階の培地が、毎日、または2日毎に交換される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 第II段階の培地がさらに、1つ以上の増殖因子、特にaFGF、および骨形態形成タンパク質、特にBMP2を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 第II段階の培地が、例えばFBSのような血清をさらに含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 第II段階の培地がさらにHGFを含む、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 細胞が以下のスキーム:
第II段階の1〜4日目:第II段階の培養培地は、FGF2、BMP4、1つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にBMP2、血清、特にFBS、PEST、およびGlutaMAX、ならびに必要に応じて1つ以上のさらなる増殖因子、特にαFGFを含む(例えば、プロトコル1)、
第II段階の1〜8日目:第II段階の培養培地は、HGFを含む(例えば、プロトコル2)、
第II段階の1〜5日目:第II段階の培養培地は、FGF4、BMP2を含む(例えば、プロトコル3)、
第II段階の1〜3日目:第II段階の培養培地は、FGF2、BMP4、血清、特にFBSを含む(例えば、プロトコル4)、
のうちの1つに従って培養される、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。 - 細胞が以下のスキーム:
第II段階の4〜10日目:第II段階の培養培地は、FGF2、BMP4、血清、特にFBS、およびHGFを含む(例えば、プロトコル1)、
第II段階の6〜10日目:HGF(例えば、プロトコル3)、
第II段階の4〜8日目:第II段階の培養培地は、HGF、FGF2、EGF、および血清、例えばFBSを含む(プロトコル4)、
のうちの1つに従って培養される、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。 - 第II段階における細胞が8日間培養され、血清、例えばFBSの濃度が6日目に増加され、および増殖因子、特にEGFの補充が6日目に与えられ、ならびに培地が6日目〜8日目まで毎日に交換された、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 第II段階から得られた細胞が、HNF3b、HNF4a、EpCAM、Desmin、CD133、ICAM1、CK8、CK18、およびCK19のうちの1つ以上の遺伝子発現を表す、項目1〜16のいずれかに記載の方法。
- HNF1、HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、Desmin、CD133、ICAM1(CD54)、CK8、CK18、およびCK19のうちの1つ以上のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、DE‐hep前駆体細胞。
- CK8、CK18、およびCK19、ICAMの遺伝子発現を表す、請求項18に記載のDE‐hep前駆体細胞。
- EpCAM、およびHNF1、HNF3b、HNF4aのうちの1つ以上、好ましくは全てのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項18または19に記載のDE‐hep前駆体細胞。
- 請求項1〜17のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることが可能な請求項18〜20のいずれかに記載のDE‐hep前駆体細胞。
- 請求項18〜21のいずれかにおいて規定されるようなDE‐hep前駆体細胞を含む細胞集団。
- 少なくとも25%の細胞がDE‐hep前駆体細胞である、請求項22に記載の細胞集団。
- ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞に、胚体内胚葉を介して由来するDE‐hep細胞の調製のための方法であって、方法は、以下
ii)第II段階であって、ここでDE細胞は増殖され、そして第II段階は1つ以上の増殖因子および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第II段階の培養培地中で第I段階からの細胞を培養する工程を含む、第II段階、
iii)第III段階であって、ここで第II段階から得られる細胞は、DE‐hep前駆体に成熟され、第III段階は、1つ以上の増殖因子および分化誘導物質を含む第III段階の培養培地中で、第II段階からの細胞を培養する工程を含む、第III段階、
を含む培養条件にhBS細胞を供する工程を包含する、方法。 - 請求項24に記載の方法であって、
i)第I段階であって、ここでhBS細胞は胚体内胚葉に発達するように誘導され、第I段階は、アクチビンを含む第1の第I段階の培養培地中の1〜7日間、好ましくは2〜6日間のhBS細胞の培養を含み、ここで培地は、培養の1日後に、アクチビン、1つ以上の増殖因子、および必要に応じて血清を含む第2の第I段階の培養培地により置き換えられる、第I段階を含み、
ここで工程i)は工程ii)の前であり、および工程ii)において用いられるDE細胞は、第I段階から得られる細胞である、方法。 - 第I段階および/または第II段階が、請求項1〜16いずれかにおいて規定されるように行われる、請求項24および25に記載の方法。
- 得られるDE‐hep細胞が、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、以下:アルブミン、UGT2B7、CYP3A4の増加されたタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項24〜26に記載の方法。
- アルブミンのタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも2倍、例えば、少なくとも5倍である、請求項27に記載の方法。
- UGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも2倍、例えば、少なくとも3倍である、請求項27または28に記載の方法。
- CYP3A4のタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも2倍、例えば、少なくとも4倍である、請求項27〜29のいずれかに記載の方法。
- アルブミンのタンパク質および/または遺伝子の発現が、少なくとも5倍であり、UGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現が、少なくとも3倍である、請求項27〜30のいずれかに記載の方法。
- 第III段階の培地が、例えば、William E基本培地またはHCM Cambrex培地のような培養培地を含み、必要に応じて、
例えば、デキサメタゾン、オメプラゾール、OSM、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような誘導物質が、単独で、または;
ITS混合物;
BMPおよび/またはTGFP、特にBMP4、および/または
HGF
と組み合わせて補充される、請求項24〜31のいずれかに記載の方法。 - 第III段階の培養が、10〜60日間またはそれ以上行われる、請求項24〜32のいずれかに記載の方法。
- 第III段階の培養培地が、15日目まで2〜3日毎に交換され、適切な場合、残りの培養期間は2日または3日毎に交換される、請求項24〜33のいずれかに記載の方法。
- ヒトまたはマウスの支持細胞のような支持細胞の使用をさらに包含する、請求項24〜34のいずれかに記載の方法。
- 支持細胞の使用を何ら包含しない、請求項24〜35のいずれかに記載の方法。
- 適切な場合、自己支持細胞の使用を包含する、請求項24〜36のいずれか記載の方法。
- 細胞の培養が、内側に1つ以上のタンパク質が、単独で、または組み合わせて、コートされるプラスチック製細胞培養容器の使用を包含する、請求項24〜37のいずれかに記載の方法。
- 1つ以上のタンパク質が、コラーゲン、ラミニン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
- 前記細胞集団が、3D環境、例えば多孔性フィルターを使用して得られる、請求項38または39のいずれかに記載の方法。
- 薬物輸送、薬物代謝酵素、および/または1つ以上の転写因子についてのマーカーのうちの1つ以上の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、DE‐hep細胞。
- 薬物輸送についてのマーカー、特にBSEP、MRP2、OATP‐2(=OATP‐C、OATP1B1)、OATP‐8(OATP1B3)、OATP‐A(=OATP1A2)、NTCP、MDR1、MDR3、OCT‐1のうちの1つ以上の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項41に記載のDE‐hep細胞。
- 薬物輸送についての以下のマーカー:MRP2、OATP‐2(=OATP‐C、OATP1B1)、OATP‐A(=OATP1A2)、NTCP、およびOCT‐1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項42に記載のDE‐hep細胞。
- 薬物輸送についての以下のマーカー:MDR1および/またはMDR3のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項42または43に記載のDE‐hep細胞。
- 薬物代謝酵素についてのマーカー、特に、GST A1‐1、GSTM1‐1、CYP(CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1、UGT1A6、UGT1A、および/またはUGT2B7のうちの1つ以上の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項41に記載のDE‐hep細胞。
- 以下の薬物代謝酵素、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、およびCYP3A4のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項45に記載のDE‐hep細胞。
- CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1の、ならびにUGT1A6、UGT1A、UGT2B7の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項46に記載のDE‐hep細胞。
- 転写因子についてのマーカー、特にFXR、RXRα、RXRβ、RXRγ、HNF1α、HNF3α、HNF3β、HNF4α、HNF6、C/EBP A、C/EBP Bのうちの1つ以上の、タンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項41に記載のDE‐hep細胞。
- 転写因子についての以下のマーカー:RXRγのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項48に記載のDE‐hep細胞。
- FXR、RXRα、RXRβ、HNF1α、HNF3α、HNF3β、HNF4α、HNF6、C/EBP A、C/EBP Bのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項48または49のいずれかに記載のDE‐hep細胞。
- 請求項24〜40のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることができる、請求項42〜50のいずれかに記載のDE‐hep細胞。
- 請求項42〜51のいずれかにおいて規定されるようなDE‐hep細胞を含む細胞集団。
- 少なくとも25%の細胞が、請求項42〜52のいずれかにおいて規定されるようなDE‐hep細胞である、細胞集団。
- インビトロで誘導されるDE‐hep細胞であって、ここで細胞は、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、以下:アルブミン、UGT2B7、CYP3A4の増加されたタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、細胞。
- アルブミンのタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも2倍、例えば、少なくとも5倍である、請求項54に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- UGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも2倍、例えば、少なくとも3倍である、請求項54〜55に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- CYP3A4のタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも2倍、例えば、少なくとも4倍である、請求項54〜56に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- アルブミンのタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも5倍、ならびにUGT2B7のタンパク質および/または遺伝子の発現の増加が、少なくとも3倍である、請求項54〜57に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 細胞または細胞核が、アルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1A)のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項54〜58に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 細胞または細胞核が、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP2D6のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項54〜59に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 細胞または細胞核が、CYP7A1のタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項54〜60に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 細胞または細胞核が、UGT1A6およびUGT1Aのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項54〜61に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 細胞または細胞核が、薬物輸送体についての少なくとも1つのマーカーおよび薬物代謝についての1つのマーカーのタンパク質および/または遺伝子の発現を表す、請求項54〜62のいずれかに記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 薬物輸送体が、OAT、MDR、BSEP、MRP、およびNTCPからなる群より選択される、請求項63に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 薬物代謝についてのマーカーがチトクローム450およびUGTから選択される、請求項63に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 細胞または細胞核が、本明細書中の表4、表5A、または表5Bにおいて列挙されるマーカーのタンパク質および/または遺伝子の発現を表し、0とは異なって計数される、請求項54〜62に記載のインビトロで誘導されるDE‐hep細胞。
- 薬物送達プロセスにおける使用のための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 薬物輸送体を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 薬物代謝酵素を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 肝形成、例えば、初期肝形成を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- ヒト肝再生異常を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- インビトロ肝毒性試験のための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 医薬品における、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 組織変性、例えば、肝組織の変性により引き起こされる、病変および/または疾患の予防および/または処置のための医薬品の製造のための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 肝臓異常の処置のための医薬品の製造のための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫異常;脂質異常症を含む代謝異常;例えば、アルコール乱用によって引き起こされる肝臓異常;例えば、B型肝炎、C型肝炎、およびA型肝炎のようなウイルスにより引き起こされる疾患;例えば、薬物に対する急性毒性反応により引き起こされる肝臓壊死;ならびに例えば、肝細胞癌を被る患者における腫瘍除去からなる群より選択される、肝臓異常の予防および/または処置のための医薬品の製造のための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 代謝病変および/または疾患の処置および/または予防のための医薬品の製造のための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞の使用。
- 代謝的に改善される肝細胞様細胞を得るための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞からの1つ以上の細胞の使用。
- 肝細胞様細胞に向かう成熟を研究するための、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞のからの1つ以上の細胞の使用。
- 化合物を、肝細胞毒性についてスクリーニングするための方法であって、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞を、化合物に曝露する工程、および化合物が細胞に対して毒性であるか否かを決定する工程を包含する、方法。
- 化合物を、肝細胞機能を調節するその能力についてスクリーニングするための方法であって、請求項54〜66のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるDE‐hep細胞を、化合物に曝露する工程、化合物との接触から得られる細胞における任意の表現型的な、および代謝的な変化を決定する工程、ならびに肝細胞機能を調節する能力と変化とを相関する工程を包含する、方法。
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---|---|---|---|
JP2010517377A Pending JP2010534065A (ja) | 2007-07-20 | 2008-07-18 | ヒト胚盤胞幹細胞に、胚体内胚葉(DE‐hep)を介して由来する新規な肝細胞の集団 |
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013512658A (ja) * | 2008-12-03 | 2013-04-18 | インターナショナル ステム セル コーポレイション | 幹細胞から分化細胞を得る方法 |
JP2014519854A (ja) * | 2011-06-23 | 2014-08-21 | ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア | ヒト多能性幹細胞から生じる自己複製する内胚葉前駆細胞株とその使用方法 |
JP2016517266A (ja) * | 2013-02-18 | 2016-06-16 | ユニバーシティー ヘルス ネットワーク | 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法 |
JP2016529920A (ja) * | 2013-09-19 | 2016-09-29 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 肝細胞様細胞を産生するための方法および組成物 |
JP2018504093A (ja) * | 2014-11-26 | 2018-02-15 | アクセラレイテッド・バイオサイエンシズ・コーポレーション | 誘導肝細胞およびそれらの使用 |
WO2019093340A1 (ja) * | 2017-11-07 | 2019-05-16 | 国立大学法人京都大学 | ナイーブ型多能性幹細胞からの原始内胚葉誘導方法 |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2684022C (en) | 2002-05-17 | 2014-09-23 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
US20070298016A1 (en) * | 2004-09-29 | 2007-12-27 | Nico Heins | Methods For The Generation Of Hepatocyte-Like Cells From Human Blastocyst-Derived Stem (Hbs) |
US8874380B2 (en) | 2010-12-09 | 2014-10-28 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Method of overcoming therapeutic limitations of nonuniform distribution of radiopharmaceuticals and chemotherapy drugs |
WO2009013254A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-29 | Cellartis Ab | A novel population of hepatocytes derived via definitive endoderm (de-hep) from human blastocysts stem cells |
US9284531B2 (en) | 2009-06-18 | 2016-03-15 | Takara Bio Europe Ab | Differentiation of human pluripotent stem cells into cells expressing mature hepatocyte markers by 2D and bioreactor culture |
WO2011009294A1 (zh) * | 2009-07-23 | 2011-01-27 | 北京华源博创科技有限公司 | 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法 |
EP2550355B1 (en) | 2010-03-22 | 2016-11-16 | Takara Bio Europe AB | Directed differentiation and maturation of pluripotent cells into hepatocyte like cells by modulation of wnt-signalling pathway |
AU2011263652B2 (en) * | 2010-06-11 | 2014-11-20 | Takara Bio Europe Ab | 3-dimensional scaffolds for improved differentiation of pluripotent stem cells to hepatocytes |
CN102465115B (zh) | 2010-11-04 | 2014-03-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种新的制备肝实质细胞的方法 |
WO2012175633A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Novo Nordisk A/S | Efficient induction of definitive endoderm from pluripotent stem cells |
GB201119335D0 (en) | 2011-11-09 | 2011-12-21 | Univ Leuven Kath | Hepatitis virus infectable stem cells |
WO2013096457A1 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | The Florida State University Research Foundation, Inc. | Hepatitis virus culture systems using stem cell-derived human hepatocyte-like cells and their methods of use |
CN109354623B (zh) * | 2012-04-25 | 2022-06-24 | 华辉安健(北京)生物科技有限公司 | 乙肝肝炎病毒功能性受体的组成以及相关应用 |
JP2016500512A (ja) * | 2012-09-21 | 2016-01-14 | アンテグラジャンIntegragen | 肝臓サンプルの分類ならびに限局性結節性異形成、肝細胞腺腫および肝細胞癌の診断のための新規方法 |
CN104955837A (zh) * | 2012-11-12 | 2015-09-30 | 海德堡吕布莱希特-卡尔斯大学 | Hbv和/或hdv易感细胞、细胞系和非人动物的开发 |
EP3401391A1 (en) | 2012-11-29 | 2018-11-14 | Takara Bio Europe AB | Maturation of hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells |
ITMI20130513A1 (it) * | 2013-04-05 | 2014-10-06 | Euroclone S P A | Metodo diagnostico per patologie autoimmuni del fegato |
US9772325B2 (en) | 2013-06-14 | 2017-09-26 | Biotranex, Llc | Method for measuring bile salt export transport and/or formation activity |
CN104694456B (zh) * | 2013-12-06 | 2018-05-29 | 中国科学院上海药物研究所 | 体外培养肝样细胞的方法及采用该方法培养的优化后肝样细胞 |
CN104297442B (zh) * | 2014-11-03 | 2016-08-17 | 天津中医药大学 | 内源性小分子物质在快速检测早期心脏毒性方面的应用 |
HUE041518T2 (hu) * | 2015-02-20 | 2019-05-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Laminin alkalmazása pluripotens sejtek hepatocita sejtvonalhoz tartozó sejtekké történõ differenciálódásához |
US10889805B2 (en) | 2015-03-13 | 2021-01-12 | National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition | Intestinal epithelioid cells |
US10280401B2 (en) | 2015-04-16 | 2019-05-07 | Biotranex, Llc | Method of measuring inhibition of phosphatidylcholine export transport and/or formation activity |
EP3303566B1 (en) | 2015-06-03 | 2020-10-14 | Takara Bio Europe AB | Maturation of mammalian hepatocytes |
EP3287521B1 (en) * | 2016-08-25 | 2021-06-23 | Philip Morris Products S.A. | Cell culture |
KR101918817B1 (ko) * | 2016-10-06 | 2018-11-14 | (주) 넥셀 | 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포 |
CN107034170B (zh) * | 2017-01-11 | 2020-10-30 | 暨南大学 | 脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法 |
EP3802791A4 (en) * | 2018-05-25 | 2021-09-08 | Valorisation-HSJ, Limited Partnership | METHOD FOR PRODUCING CELL POPULATIONS OF THE HEPATIC LINE FROM ENDODERMAL CELLS AND CELLULAR COMPOSITIONS THEREOF |
WO2022061290A1 (en) * | 2020-09-21 | 2022-03-24 | Duke University | Methods of detecting and using biomarkers for glycogen storage diseases |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002534974A (ja) * | 1999-01-19 | 2002-10-22 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | ヒト肝前駆細胞 |
JP2003520596A (ja) * | 2000-01-19 | 2003-07-08 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | 肝臓組織源 |
JP2004510434A (ja) * | 2000-10-03 | 2004-04-08 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ | 肝前駆細胞のクローン増殖方法 |
JP2004510432A (ja) * | 2000-10-03 | 2004-04-08 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ | 両能性肝前駆細胞の単離方法 |
JP2004531270A (ja) * | 2001-06-22 | 2004-10-14 | ステムセルズ インコーポレーティッド | 肝移植細胞、アッセイ法、およびその使用法 |
WO2007059501A2 (en) * | 2005-11-16 | 2007-05-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Extracellular matrix components for expansion or differentiation of hepatic progenitors |
WO2007071339A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Universite Catholique De Louvain | Isolated liver stem cells |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005510232A (ja) * | 2001-11-26 | 2005-04-21 | アドバンスド セル テクノロジー、インク. | 再プログラムされたヒト体細胞核ならびに自系および同系なヒト幹細胞の製造および使用方法 |
US20050095703A1 (en) | 2001-12-28 | 2005-05-05 | Henrik Semb | Method for the establishment of a pluripotent human blastocyst - derived stem cell line |
WO2004099394A2 (en) | 2003-05-08 | 2004-11-18 | Cellartis Ab | A method for efficient transfer of human blastocyst-derived stem cells (hbs cells) from a feeder-supported to a feeder-free culture system |
JP2006525006A (ja) | 2003-05-08 | 2006-11-09 | セルアーティス アーベー | 閉塞ストローガラス化方法を利用するヒト胚盤胞由来幹細胞の低温保存法 |
WO2005063971A2 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Cythera, Inc | Definitive endoderm |
US20070298016A1 (en) * | 2004-09-29 | 2007-12-27 | Nico Heins | Methods For The Generation Of Hepatocyte-Like Cells From Human Blastocyst-Derived Stem (Hbs) |
US7989204B2 (en) * | 2006-04-28 | 2011-08-02 | Viacyte, Inc. | Hepatocyte lineage cells |
CN1884494B (zh) * | 2006-06-16 | 2012-05-23 | 北京大学 | 诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基 |
GB0622394D0 (en) * | 2006-11-09 | 2006-12-20 | Univ Cambridge Tech | Differentiation of pluripotent cells |
WO2009013254A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-29 | Cellartis Ab | A novel population of hepatocytes derived via definitive endoderm (de-hep) from human blastocysts stem cells |
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2008
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002534974A (ja) * | 1999-01-19 | 2002-10-22 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | ヒト肝前駆細胞 |
JP2003520596A (ja) * | 2000-01-19 | 2003-07-08 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | 肝臓組織源 |
JP2004510434A (ja) * | 2000-10-03 | 2004-04-08 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ | 肝前駆細胞のクローン増殖方法 |
JP2004510432A (ja) * | 2000-10-03 | 2004-04-08 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ | 両能性肝前駆細胞の単離方法 |
JP2004531270A (ja) * | 2001-06-22 | 2004-10-14 | ステムセルズ インコーポレーティッド | 肝移植細胞、アッセイ法、およびその使用法 |
WO2007059501A2 (en) * | 2005-11-16 | 2007-05-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Extracellular matrix components for expansion or differentiation of hepatic progenitors |
WO2007071339A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Universite Catholique De Louvain | Isolated liver stem cells |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013512658A (ja) * | 2008-12-03 | 2013-04-18 | インターナショナル ステム セル コーポレイション | 幹細胞から分化細胞を得る方法 |
JP2014519854A (ja) * | 2011-06-23 | 2014-08-21 | ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア | ヒト多能性幹細胞から生じる自己複製する内胚葉前駆細胞株とその使用方法 |
JP2019213538A (ja) * | 2013-02-18 | 2019-12-19 | ユニバーシティー ヘルス ネットワーク | 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法 |
JP2016517266A (ja) * | 2013-02-18 | 2016-06-16 | ユニバーシティー ヘルス ネットワーク | 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法 |
JP7208870B2 (ja) | 2013-02-18 | 2023-01-19 | ユニバーシティー ヘルス ネットワーク | 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法 |
JP2016529920A (ja) * | 2013-09-19 | 2016-09-29 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 肝細胞様細胞を産生するための方法および組成物 |
US11291691B2 (en) | 2013-09-19 | 2022-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for producing hepatocyte-like cells |
US10765704B2 (en) | 2014-11-26 | 2020-09-08 | Accelerated Biosciences Corp. | Induced hepatocytes and uses thereof |
US11026979B2 (en) | 2014-11-26 | 2021-06-08 | Accelerated Biosciences Corp. | Human hepatocytes and uses thereof |
JP2018504093A (ja) * | 2014-11-26 | 2018-02-15 | アクセラレイテッド・バイオサイエンシズ・コーポレーション | 誘導肝細胞およびそれらの使用 |
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