CN111394297A - 内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用 - Google Patents

内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用，具体地，本发明提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，包括步骤：在第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得功能性的肝母细胞和/或肝实质细胞。本发明的功能性的肝母细胞和/或肝实质细胞具有非常高的分化率和纯度，并且，本发明的肝实质细胞还具有有效的治疗肝脏相关疾病的作用。

Description

内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方 法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和细胞治疗领域。具体地，本发明涉及内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用。
背景技术
肝脏是人体内的最大分泌腺体，其同时具有内分泌和外分泌功能。内分泌功能主要为分泌多种激素如胰岛素样生长因子、血管紧张肽原、促血小板生成素。与之对应的外分泌功能则为胆汁的合成。肝实质细胞以胆固醇为原料，经多个步骤合成初级胆汁酸，其中关键酶为胆固醇7α-羟化酶。将胆固醇转化为胆汁酸，这是肝脏清除胆固醇的主要方式。此外，肝脏在人体内的重要作用还表现在：(1)糖原储存，肝脏将血液中多余的葡萄糖以肝糖原的形式储存，为机体大量耗能之时提供能量；(2)药物代谢及解毒功能，肝脏内药物代谢及解毒酶类分为①药物代谢一相酶，其主要家族为CYP450超家族，其参与外源及内源有机物质的氧化作用；②药物代谢二相酶，其主要是以一相酶反应产物为底物进行结合反应的催化酶类；③药物代谢三相酶，其主要作用为将肝脏细胞内代谢有毒物质转出肝脏；(3)调节胆固醇的合成和转运；(4)尿素代谢；(5)分泌血清蛋白，幼年肝脏分泌的主要血清蛋白为AFP，在成年肝脏中主要的血清蛋白为ALBUMIN,此外肝脏还分泌血清胰蛋白酶抑制剂AAT。
正因肝脏具有如此重要的生理功能，肝炎，肝硬化，急慢性肝衰竭等肝脏疾病致死率高居不下。中国为世界上人口最多的国家，也是乙型肝炎后肝硬化和原发性肝癌的高发国家，每年有50万HBV肝炎新发病例，慢性乙型肝炎症患者达1300万，肝硬化发生率为30.2/10万，重症肝病的发生率在1％-3％之间，如果得不到有效救治，每年约有50多万人死于上述疾病导致的终末期肝病，为家庭和社会带来了严重的经济负担。
现阶段对于重症肝病患者最有效的治疗方法为肝脏移植，然而，肝脏供体来源十分短缺，病人往往在肝源等待中丧失了生命。因此，找到新型的治疗方法为亟需解决的问题。近来，肝实质细胞移植性治疗为肝病患者带来了希望，肝实质细胞移植是在体外将游离的、有生物学活性的肝实质细胞以一定的方式直接或间接移植到受体肝脏内，在受体内生长增殖并发挥正常肝实质细胞的作用，以修复受损肝脏或代替部分肝功能。但其仍然面对肝实质细胞资源短缺等严重问题。近年来，科学家们发现可在体外模拟肝脏发育的过程，将胚胎干细胞或是多能诱导干细胞直接分化形成具有肝脏功能的肝实质样细胞，其能够分泌血清白蛋白，以及具有部分CYP酶的解毒功能，但其分化存在以下几点问题：1)安全性问题——任何残留在分化体系中的未分化多能干细胞都有可能在体内形成肿瘤(畸胎瘤/Teratoma)；2)分化细胞的功能问题——由多能干细胞直接分化为功能性细胞十分困难，目前由多能干细胞直接分化的终末分化细胞和成体细胞相比，在功能上都有很大的差距；3)分化细胞的纯度问题——多能干细胞的分化多能性决定了：诱导分化成的目标细胞中会参杂相当比例的同一和其他胚层的细胞类群，因而纯化目标细胞十分困难，同时，也使有关胚层之间相互作用的研究难以进行。
近来，日本研究小组报道，将人类胚胎干细胞和脐静脉内皮细胞以及间充质干细胞在体外共培养可诱导分化形成Liver Buds，所得Liver Buds在植入小鼠体内能够形成小型的肝组织。但其所得肝实质细胞仍处于人类肝脏胚胎发育出生前阶段，成熟肝脏相关功能较为缺失。因此，其仍不能满足体外药物筛选平台，终末急性肝脏疾病治疗等应用。随后，Gordon Keller实验室报道三维悬浮培养方法结合cAMP信号能够促进由人类胚胎干细胞所得肝实质样细胞的进一步成熟。但其分化过程涉及较多消化处理及细胞重聚等复杂过程，限制了功能性肝实质细胞的规模化制备。
此外，目前由病毒性肝炎、药物性肝炎、肝癌等疾病引起的急慢性肝损伤，除肝脏移植外尚无真正有效的治疗方法，死亡率高居不下。然而，近来细胞治疗为肝病患者带来了福音。胚胎干细胞或诱导多能干细胞经体外诱导分化可形成具有一定肝脏功能的肝实质样细胞，但其分化效率低，细胞纯度差，同时具有成瘤的危险。
因此，本领域迫切需要开发一种能够规模化制备可用于疾病模型及细胞移植的功能性肝母细胞和/或肝实质细胞的方法。
发明内容
本发明公开了一种能够规模化制备可用于疾病模型及细胞移植的功能性肝母细胞和/或肝实质细胞的方法。
在本发明第一方面，提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，包括步骤：
(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF和BMP4因子；
(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞，从而获得肝母细胞；和
(c)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得肝实质细胞；其中，所述培养体系包括HGF、OSM、Dex、Compound E和A83。
在另一优选例中，所述的内胚层干细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞。
在另一优选例中，所述多能干细胞选自下组：人胚胎干细胞系(如H9、Hes2)、人诱导多能干细胞系(如WT-B5-G7)、或其组合。
在另一优选例中，所述的内胚层干细胞选自下组：H9、Hes2、WT-B5-G7、或其组合。
在另一优选例中，所述第一培养条件含有第一培养基。
在另一优选例中，所述第一培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述培养体系为含有第二培养基和添加物的培养液，所述添加物包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子。
在另一优选例中，所述第二培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。
在另一优选例中，所述第二培养条件含有第三培养基。
在另一优选例中，所述第三培养基选自下组：HCM、SFD、DMEM/F12、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(a)中，将内胚层干细胞在第一培养条件下培养2-10天，较佳地，3-8天，更佳地，6-7天。
在另一优选例中，在步骤(b)中，将肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞培养2-10天，较佳地，3-8天，更佳地，6-7天。
在另一优选例中，在步骤(c)中，将肝母细胞在第二培养条件下培养10-30天，较佳地，15-20天，更佳地，18-19天。
在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：
(i)高肝母细胞和/或肝实质细胞分化率，所述分化率为80-98％，较佳地，90-95％；
(ii)在培养过程中，每1ml的培养液中接种1×106个内胚层干细胞，可产生15×106或8×106个肝母细胞和/或肝实质细胞。
在另一优选例中，在步骤(a)－(c)中，所述培养体系中还含有促进分化的其他物质，选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(BasementMembrane Extracts)、或其组合。
在另一优选例中，所述方法包括治疗性和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的培养体系中，内胚层干细胞的密度为0.5×106－2×106细胞/ml,较佳地，0.8×106-1.5×106-细胞/ml。
在另一优选例中，所述的培养体系为体积50-125ml，较佳地80-125ml，最佳地为80－100ml。
在另一优选例中，所述的获得的肝母细胞的数量M2与所述内胚层干细胞的数量M1之比M2/M1为10－20，较佳地13－18，更佳地15－18。
在另一优选例中，所述的获得的肝实质细胞的数量M3与所述内胚层干细胞的数量M1之比M3/M1为5－20，较佳地5－15，更佳地5－10。
在另一优选例中，所述肝母细胞和/或肝实质细胞为功能性肝母细胞和/或肝实质细胞。
本发明第二方面提供了一种肝母细胞，所述肝母细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝母细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝母细胞大小60-80μm，细胞层厚度6－12μm。
在另一优选例中，所述的肝母细胞具有选自以下一种或多种特征：
(a)90-98％的细胞为内胚层相关表面标识物表达阴性；
(b)90-95％的细胞为HNF4A与SOX9，CK19共表达阳性；
(c)90-95％的细胞为AFP表达阳性。
在另一优选例中，所述内胚层相关表面标识物选自下组：CXCR4、CD117、或其组合。
在另一优选例中，所述的肝母细胞由权利要求1所述方法制备获得。
在另一优选例中，所述的肝母细胞由内胚层干细胞诱导获得。
在另一优选例中，所述的肝母细胞的制备方法如下：
(a)EnSCs经由0.25％胰酶消化为单个细胞，并以1x106每毫升的细胞密度于125ml的搅拌瓶生物反应器内进行肝脏定向分化；
(b)在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、BMP4的诱导因子作用下通过六天的连续培养完成肝脏特化；
(c)在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、Dex的诱导因子的条件下经由六天的定向分化形成肝母细胞。
在另一优选例中，所述肝母细胞具有选自下组的一个或多个特征：
(i)内胚层相关表面标识物低表达；
(ii)HNF4A与SOX9、CK19共表达；
(iii)肝母细胞标志物AFP表达高。
本发明第三方面提供了一种肝实质细胞，所述肝实质细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝实质细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝实质细胞大小80-100μm，细胞层厚度8－15μm。
在另一优选例中，所述的肝实质细胞具有选自以下一种或多种特征：
(a)90-95％的细胞为HNF4A表达阳性；
(b)90-95％的细胞为ALBUMIN表达阳性；
(c)90-98％的细胞为CEBPA表达阳性；
(d)20-30％的细胞为CYP3A4表达阳性；
(e)30-45％的细胞为AFP表达阴性；
(f)30-50％的细胞为ASGPR1表达阳性；
(g)90-97％的细胞为ALBUMIN表达阳性；
(h)30-50％的细胞为ALBUMIN表达阳性和AFP表达阴性(ALBUMIN+AFP-)。
(i)90－95％的细胞为HNF4A与E-cadherin、ZO-1和MRP2共表达阳性。
在另一优选例中，所述的肝实质细胞由权利要求1所述方法制备获得。
在另一优选例中，所述的肝实质细胞由内胚层干细胞诱导获得。
在另一优选例中，所述的肝实质细胞的制备方法如下：
(a)EnSCs经由0.25％胰酶消化为单个细胞，并以1x106每毫升的细胞密度于125ml的搅拌瓶生物反应器内进行肝脏定向分化；
(b)在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、BMP4的诱导因子作用下通过六天的连续培养完成肝脏特化；
(c)在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、Dex的诱导因子的条件下经由六天的定向分化形成肝母细胞；
(d)肝母细胞在以HCM为基础培养基，含有HGF、OSM、Dex、Compound E、A83的肝实质细胞成熟条件下，经过18天的连续培养形成成熟的肝实质细胞(E-heps)；分化过程中每两天换液一次。
在另一优选例中，所述肝实质细胞具有选自下组的一个或多个特征：
(a)HNF4A高表达；
(b)ALBUMIN高表达；
(c)CEBPA高表达；
(d)CYP3A4高表达；
(e)AFP低表达
(f)ASGPR1高表达；
(g)ALBUMIN高表达；
(h)ALBUMIN高表达，且AFP低表达。
(i)HNF4A与E-cadherin、ZO-1和MRP2共表达。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述肝母细胞或本发明第三方面所述的肝实质细胞的用途，用于制备治疗肝脏相关疾病的药物组合物。
在另一优选例中，所述肝脏相关疾病选自下组：病毒性肝炎、药物性肝炎、肝癌、或其组合。
本发明第五方面提供了一种组合物，所述药物组合物含有本发明第二方面所述的肝母细胞和/或本发明第三方面所述的肝实质细胞。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂、冻干制剂、溶液制剂。
本发明第六方面提供了一种诱导培养基，所述诱导培养基含有基础培养基和添加物；其中所述基础培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、HCM、或其组合；并且，所述添加物包括HGF、OSM、Dex、Compound E和A83。
在另一优选例中，所述添加物还包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子。
在另一优选例中，所述添加物还包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子。
在另一优选例中，所述的诱导培养基含有第一培养基、第二培养基、和第三培养基；其中，所述第一培养基包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；所述第二培养基包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子；所述第三培养基包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和A83。
在另一优选例中，所述第一培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中，所述第二培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。
在另一优选例中，所述第三培养基选自下组：HCM、SFD、DMEM/F12、或其组合。
在另一优选例中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基位于同一容器或不同的容器。
在另一优选例中，所述诱导培养基中，第一培养基、第二培养基、第三培养基的体积比(v/v/v)为1:1:1。
本发明第七方面提供了一种诱导组合物，包括：
(a)第一诱导因子，所述第一诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)第二诱导因子，所述第二诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子；
(c)第三诱导因子，所述第三诱导因子包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和/或A83；和
(d)促进分化的其他物质，所述促进分化的其他物质选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement Membrane Extracts)、或其组合。
本发明第八方面提供了本发明第七方面所述的诱导组合物的用途，用于诱导内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞。
本发明第九方面提供了一种治疗肝脏相关疾病的方法，向需要的对象施用安全有效量的本发明第二方面所述的肝母细胞、或本发明第三方面所述的肝实质细胞、或本发明第五方面所述的组合物。
在另一优选例中，所述的施用包括局部注射施用。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括非人灵长类动物(如猴)、或啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了EnSCs规模化制备肝母细胞细胞与肝实质细胞；其中，
A.利用转瓶生物反应器由EnSCs细胞规模化制备肝母细胞与肝实质细胞流程图。
B.用于肝母细胞与肝实质细胞规模化制备的分步分化方案。
C.肝实质细胞形成过程中相关基因动态表达变化。在肝实质细胞形成过程中，其经历肝脏特化(T6)、肝母细胞形成(T12)及终末肝实质细胞成熟等阶段。终末肝实质细胞中，成熟肝脏相关因子HNF4A、ALBUMIN、CEBPA、CYP3A4表达显著增加，肝母细胞及不成熟肝实质细胞标识物AFP的表达逐步减弱。
D.流式细胞分析肝母细胞形成过程中内胚层表面标识物CXCR4、CD117与肝实质细胞标识物AFP、ALBUMIN的动态变化过程。在肝母细胞形成过程中，内胚层特性逐渐丢失，如其表面标志物(CXCR4、CD117)的表达逐渐减弱。肝母细胞标志物(AFP)显示，肝母细胞纯度高达90％。
E.细胞免疫荧光激光共聚焦分析肝母细胞相关标识物HNF4A、SOX9、CK19的共表达情况。
F.流式细胞分析终末肝实质细胞中ASGPR1与AFP、ALBUMIN阳性细胞比例。
G.细胞免疫荧光激光共聚焦分析肝实质细胞标识物HNF4A、MRP2与上皮样细胞标物E-cadherin、ZO-1的共表达情况。
图2显示了Eheps体外功能鉴定；其中，
A.不同来源的Eheps培养基中Albumin的分泌能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，PH代表人类原代肝实质细胞。
B.不同来源的Eheps培养基中尿素分泌能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，PH代表人类原代肝实质细胞。
C.不同来源的Eheps培养基中胆汁分泌能力。Ehep1、Ehep2分别代表胚胎干细胞H9及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，PH代表人类原代肝实质细胞。
D.Eheps对ICG的吸收与外排能力。
E.Eheps的PAS染色。表明Eheps具有糖原储备能力。
D.Eheps的Dil-ac-LDL染色。
图3显示了Eheps药物代谢能力；其中，
A.不同来源的Eheps药物代谢酶基因CYP3A4的表达水平及对其对特定诱导剂利福平响应能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，AD代表人类成体肝实质细胞。
B.不同来源的Eheps药物代谢酶基因CYP1A2的表达水平及对其对特定诱导剂Lansoprazole响应能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，AD代表人类成体肝实质细胞。
C.不同来源的Eheps药物代谢酶基因CYP2C9的表达水平及对其对特定诱导剂利福平响应能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，AD代表人类成体肝实质细胞。
D.不同来源的Eheps药物代谢酶CYP3A4的代谢能力及对其对特定诱导剂利福平响应能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，PH代表体外培养三天的人类原代肝实质细胞。
E.不同来源的Eheps药物代谢酶CYP1A2的代谢能力及对其对特定诱导剂Lansoprazole响应能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，PH代表体外培养三天的人类原代肝实质细胞。
F.不同来源的Eheps药物代谢酶CYP2C9的代谢能力及对其对特定诱导剂利福平响应能力。Ehep1、Ehep2、Ehpe3分别代表胚胎干细胞H9、Hes2及诱导多能干细胞WT-B5-G7来源的肝实质细胞，PH代表体外培养三天的人类原代肝实质细胞。
图4显示了Eheps细胞移植治疗Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠；其中，
A.Eheps移植到FRG小鼠内的实验方案简述。
B.移植Eheps的FRG小鼠(n＝13)，未移植Eheps的FRG小鼠(n＝6)，在撤离NTBC撤离情况下的生存曲线。*：p<0.05。
C.移植Eheps的FRG小鼠，未移植Eheps的FRG小鼠血清中ALT与AST变化。*：P<0.05。
D.免疫组化染色检测移植Eheps的FRG小鼠(八周后)肝脏组织切片中FAH蛋白的表达情况。箭头所示为FAH表达区域。
E.移植Eheps的FAH小鼠，未移植Eheps的FRG小鼠血清中人源血清白蛋白水平。
F.PCR检测移植Eheps的FRG小鼠(八周后)肝脏组织中人源基因hAlu情况。HumangDNA为阳性对照，ddH2O、Mouse gDNA、W/O E-hep FRG为阴性对照。
图5显示了Eheps细胞移植治疗D-GalN诱导的急性大鼠肝衰模型；其中，
A.Eheps移植到D-GalN诱导的急性肝衰大鼠内的实验方案简述。
B.移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠，未移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠血清中ALT与AST随移植时间的变化。D0、D1、D2、D14分别代表移植后血清收取时间。
C.移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠(n＝7)，未移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠(n＝6)，在注射D-GalN后的生存曲线。
D.移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠血清中人源血清白蛋白的表达水平。D3、D7分别代表移植后血清的取样时间。
E.移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠，未移植Eheps的D-GalN诱导的急性肝衰大鼠肝脏组织切片的H&E染色。箭头所指示的为坏死的肝实质细胞。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在本发明的第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下，在培养体系中培养内胚层干细胞，能够获得成熟的功能性的且具有特定结构的肝母细胞和/或肝实质细胞，并且本发明的肝母细胞和/或肝实质细胞的分化率＞90％(如95％)，纯化后的肝母细胞和/或肝实质细胞具有＞90％，如92％的纯度。并且，本发明的肝母细胞和/或肝实质细胞还具有有效的治疗肝脏相关疾病的作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“人类内胚层干细胞”、“内胚层干细胞”能互换使用，均指衍生自人类多能干细胞。本文的内胚层干细胞可以来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞。
肝母细胞
在本发明中，内胚层干细胞在肝向特定因子下形成的具有生成胆管上皮细胞与肝实质细胞的双潜能肝向祖细胞。
在一优选实施方式中，本发明的肝母细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝母细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝母细胞大小60-80μm，细胞层厚度6－12μm。
肝实质细胞
在本发明中，肝母细胞在肝实质细胞成熟诱导因子的作用下形成具有肝脏功能的实质细胞。
在一优选实施方式中，本发明的肝实质细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝实质细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝实质细胞大小80-100μm，细胞层厚度8－15μm。
内胚层干细胞
在本发明中，人类多能干细胞在定向内胚层特化因子的作用下形成的可在体外无限增值，并保持内胚层特性的干细胞。
肝母细胞和/或肝实质细胞的诱导培养方法
本发明的肝母细胞和/或肝实质细胞的起始细胞为人类内胚层干细胞，优选地，在第一培养基、第二培养基、第三培养基存在的培养体系中进行共培养，从而获得功能性的具有特定结构的肝母细胞和/或肝实质细胞；其中，所述第一基础培养基包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；所述第二培养基包括FGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子；所述第三培养基包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和A83。
在另一优选例中，所述第一培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
在另一优选例中，所述第二培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。
在另一优选例中，所述第三培养基选自下组：HCM、SFD、DMEM/F12、或其组合。
在一优选实施方式中，本发明的培养系统还可含有促进分化的其他物质，选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement MembraneExtracts)、或其组合。
在一优选实施方式中，本发明的人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法包括：
1.内胚层干细胞(EnSCs)的制备与维持
人类多能干细胞在高浓度Activin A的体外诱导作用下形成定向内胚层(D’Amouret al.,2006；Nostro et al.,2011)。进而通过流式细胞分选技术分离定向内胚层中CXCR4+CD117+细胞类群，在含有BMP4、bFGF、EGF、VEGF的无血清培养条件下维持内胚层干细胞系(Cheng et al.,2012)。
2.由内胚层干细胞(EnSCs)规模化制备肝母细胞与肝实质细胞
该系统利用H9、Hes2、WT-B5-G7人类多能干细胞来源的内胚层干细胞来制备肝母细胞及肝实质细胞。EnSCs经由0.25％胰酶消化为单个细胞，并以1x106细胞每毫升的细胞密度于125ml的搅拌瓶生物反应器内进行肝脏定向分化。其在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、BMP4的诱导因子的条件下通过六天的连续培养完成肝脏特化。随后，在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、Dex的诱导因子的条件下经由六天的定向分化形成肝母细胞。最终，在以HCM为基础培养基，含有HGF、OSM、Dex、Compound E、A-83的肝实质细胞成熟诱导条件下，经过18天的连续培养形成成熟的肝实质细胞(E-heps)。分化过程中每两天换液一次。
在本发明中，基础培养基的选择没有特别限制。
在一优选实施方式中，第一培养基、第二培养基中的基础培养基为SFD(Serumfree differentiation medium)，包括以下组分：
75％Iscove的改良Dulbecco's培养基(IMDM)(Cellgro)，添加有1％的N2和B27补充剂(Gibco-BRL)，1％青霉素/链霉素，0.05％牛血清白蛋白的25％Ham's F12培养基(Cellgro)。
在本发明中，第三培养基中的基础培养基为HCM(hepatocyte culture medium)，可市售获得(Commercial medium:Lonza:CC-4182)(Ogawa,S.,Surapisitchat,J.,Virtanen,C.,Ogawa,M.,Niapour,M.,Sugamori,K.S.,...&Zhao,B.(2013).Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of humanpluripotent stem cell-derived hepatocytes.Development,140(15),3285-3296.)。
肝脏相关疾病
本发明的肝母细胞和/或肝实质细胞、或其药物组合物可用于治疗肝脏相关疾病，尤其是慢性肝衰竭或急性肝衰竭。
组合物
本发明提供了一种包括本发明所述肝母细胞和/或肝实质细胞的组合物。
优选地，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。
本发明的药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分：本发明所述的肝母细胞和/或肝实质细胞。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的载体”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于治疗胆管疾病。
肝母细胞和/或肝实质细胞诱导组合物
本发明还提供了一种用于诱导内胚层干细胞分化成肝母细胞和/或肝实质细胞的诱导组合物。在一优选实施方式中，所述的诱导组合物含有：
(a)第一诱导因子，所述第一诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)第二诱导因子，所述第二诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子；
(c)第三诱导因子，所述第三诱导因子包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和/或A83；和
(d)促进分化的其他物质，所述促进分化的其他物质选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement Membrane Extracts)、或其组合。
通常，所述诱导组合物中的各组分适合存放于独立的容器中，可在所需进行诱导前，在适合的环境下进行混合并培养，其方法为本领域技术人员所知。当然，所述诱导组合物还可是一混合物，根据现有技术中不诱发细胞分化且能维持细胞生存的条件下进行储存和运输，并在需要进行诱导前，更换诱导培养的条件，从而触发细胞分化的诱导。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，在本发明的第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下，在培养体系中培养内胚层干细胞，可获得极高分化率(高达90％)的功能性肝母细胞和/或肝实质细胞，并且本发明的功能性肝母细胞和/或肝实质细胞的纯度也非常高，高达90％。
(2)本发明首次以内胚层特异胚层干细胞为起点，在体外合适诱导剂的作用下，高效制备均一的肝母细胞与肝实质细胞，为细胞治疗提供源源不断的肝实质样细胞带来了新的希望。
(3)本发明首次通过优化体外诱导分化条件，利用悬浮三维培养方法来制备功能性肝母细胞与肝实质样细胞。并在小鼠疾病模型内进行细胞移植实验，进一步验证肝实质样细胞的生理功能。最终利用规模化培养技术得到足够数量的可用于细胞移植的功能性肝细胞。
(4)本发明首次发现，本发明所得的肝实质细胞具有广泛的应用前景：1)为肝脏药物筛选提供很好的模式细胞及筛选平台；2)为包括Wilson疾病等肝脏疾病的治疗提供源源不断的成熟的功能性肝脏细胞；3)为治疗急性肝衰病人的人工肝装置提供良好的种子细胞；
(5)本发明为肝脏器官的体外构建提供良好的种子细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另有说明，否则本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
通用材料和方法
1.内胚层干细胞(EnSCs)的制备与维持
人类多能干细胞在高浓度Activin A的体外诱导作用下形成定向内胚层(D’Amouret al.,2006；Nostro et al.,2011)。进而通过流式细胞分选技术分离定向内胚层中CXCR4+CD117+细胞类群，在含有BMP4、bFGF、EGF、VEGF的无血清培养条件下维持内胚层干细胞系(Cheng et al.,2012)。
2.由内胚层干细胞(EnSCs)规模化制备肝母细胞与肝实质细胞
该系统利用H9、Hes2、WT-B5-G7人类多能干细胞来源的内胚层干细胞来制备肝母细胞及肝实质细胞。EnSCs经由0.25％胰酶消化为单个细胞，并以1x106细胞每毫升的细胞密度于125ml的搅拌瓶生物反应器内进行肝脏定向分化。其在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、BMP4的诱导因子的条件下通过六天的连续培养完成肝脏特化。随后，在以SFD为基础培养基，含有bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、Dex的诱导因子的条件下经由六天的定向分化形成肝母细胞。最终，在以HCM为基础培养基，含有HGF、OSM、Dex、Compound E、A-83的肝实质细胞成熟诱导条件下，经过18天的连续培养形成成熟的肝实质细胞(E-heps)。分化过程中每两天换液一次。
3.流式细胞检测
分化形成的肝细胞球在经由胶原酶B消化处理两个小时后，利用0.25％胰酶进一步消化20分钟，最终细胞球消化为单个细胞。对于细胞表面标志物的染色则在含有0.2％BSA的PBS溶液中进行。对于Albumin和AFP的染色，细胞则利用4％的多聚甲醛进行固定，染色缓冲液为含有10％FBS的PBS溶液。利用流式细胞仪(Calliabur BD)对染色后细胞进行比例分析。
4.细胞免疫荧光
分化形成的细胞球在37度，4％PFA条件下固定一小时，随后用0.3％Triton-100通透处理5分钟，PBS室温清洗三次，3％BSA常温封闭两小时。一抗四度过夜，PBS清洗三次，二抗常温两小时，PBS清洗三次，利用DAPI进行细胞核染色。Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜对染色细胞球进行结果分析。
5.RNA提取与实时定量PCR
细胞球离心收集，随后细胞裂解液处理所得细胞团。根据RNA提取试剂盒说明进行RNA提取。制备后的RNA利用逆转录酶试剂盒进一步完成cDNA合成。实时定量PCR在SYBRGreen荧光染料的指示下利用ABI 7900 fast(Invitrogen)完成。基因表达利用内参基因TBP进行校准。
6.高效液相质谱药物代谢检测
为检测EnSCs细胞分化所得肝实质细胞球相应药物代谢酶CYP3A4与CYP1A2的药物诱导及药物代谢能力，分别利用利福平(25μM)与兰索拉唑(10μM)对肝实质细胞球与人类原代肝实质细胞诱导处理48小时。对照人类原代肝细胞来源于5个不同人类供体。经特定诱导剂诱导后的细胞分别经CYP3A4底物睾丸酮(100μM)与CYP1A2底物非那西汀(200μM)处理三小时。利用高效液相质谱对反应上清进行最终检测分析。CYP2C9代谢酶活性检测则利用其代谢底物双氯芬酸处理三小时，收集反应上清进行高效液相质谱检测。
7.血清白蛋白分泌检测
在肝细胞球培养24小时后，收集细胞培养上清。此外，收集接受移植两个月后的FRG小鼠血清。利用血清白蛋白分泌检测试剂盒对收集样品进行白蛋白分泌检测。
8.尿素分泌检测
收集培养24小时的细胞培养液，参照尿素检测试剂盒说明书，对培养液中的尿素含量进行检测。
9.胆汁分泌检测
收集培养24小时的细胞培养液，参照胆汁检测试剂盒说明书，对培养液中的胆汁含量进行检测。
10.FRG小鼠肝实质细胞球移植
移植实验中所有接受者均为延胡索酸乙酰乙酸水解酶缺失及缺乏B细胞，T细胞及天然杀伤细胞的免疫缺损型慢性肝损伤小鼠(FRG)。分化所得肝实质细胞球通过脾脏植入已撤离NTBC水的FRG小鼠内。移植后，每周检测小鼠体重两次。在移植后8周，牺牲存活小鼠并收集血清与肝脏样本进行结果分析。
11.D-半乳糖苷诱导急性肝衰大鼠模型肝实质细胞球移植
选取平均体重为200g至270g免疫缺损型大鼠，腹腔注射950mg/kg的D-半乳糖苷，诱导急性肝衰模型生成。近1x107E-hep细胞通过腹腔植入诱导所得急性肝衰大鼠内。收集血清样本与肝脏样本进行结果分析。
实施例1内胚层干细胞规模化制备肝母细胞细胞与肝实质细胞
前期研究表明，三维系统能够在一定程度上促进多能干细胞所得肝实质细胞的功能成熟。但这些系统多基于共培养或经历分化过程中的二维向三维转变的手动处理过程，从而限制肝母细胞或肝实质细胞的规模化获取。在此，本发明以内胚层干细胞为种子细胞，利用搅拌瓶生物反应器规模化制备肝母细胞与肝实质细胞(图1，A)。同时，经过反复尝试，发明适合内胚层干细胞肝向定向分化的分步分化方法(图1，B)。实时定量PCR结果表明定向分化第六天内胚层干细胞完成肝脏特化，伴随内胚层转录因子SOX17与EOMES基因表达的显著下调，以及TBX3的瞬时高表达。基因AFP与CK19及SOX9的共表达表明，在细胞分化第十二天形成肝母细胞(图1，C)。此外，流式细胞检测表明，在肝母细胞形成过程中内胚层相关表面标识物表达逐渐关闭，并在分化十二天肝母细胞的纯度可高达90％(图1，D)。细胞免疫荧光染色进一步表明，肝母细胞阶段HNF4A与SOX9、CK19共表达情况(图1，E)。随着肝母细胞逐渐成熟为肝实质细胞，肝母细胞及不成熟肝实质细胞标识物AFP的表达逐步减弱，肝脏成熟相关因子HNF4A、ALBUMIN、CEBPA、CYP3A4表达显著增加(图1，C)。部分成熟肝实质细胞表面标识物ASGPR流式检测显示，终末分化肝实质细胞(Eheps)约含有50％ASGPR1阳性细胞(图1，F)。ALBUMIN阳性细胞可高达95％，其包含近40％ALBUMIN+AFP-的成熟肝脏实质细胞(图1，F)。E-hep细胞免疫荧光分析表明分化所形成细胞球为中空囊腔球状结构，肝脏重要转录因子HNF4A与上皮细胞相关因子E-cadherin，及细胞紧密连接相关分子ZO-1与肝脏重要转运体MRP2，均呈现共表达状态(图1，G)。每一个输入的EnSC能够形成的肝母细胞为15.5±0.51，能够形成的终末肝实质细胞为8.7±0.35。该结果进一步表明我们通过内胚层干细胞可规模化制备细胞成分均一的肝母细胞与分子特征成熟的上皮样肝实质细胞。
实施例2 Eheps体外成熟肝脏功能评估
肝脏作为人体最大腺体，其重要细胞组成之一为肝实质细胞，该类型细胞具有内分泌与外分泌功能，包括血清白蛋白分泌、尿素分泌、胆汁合成与糖原合成等重要功能。体外血清白蛋白分泌实验表明不同多能干细胞来源的Eheps具有较强的白蛋白分泌能力，显著优于在体外培养少于72小时的原代肝细胞(图2，A)。同时，不同多能干细胞来源的Eheps仍表现出较强的尿素合成能力与胆汁分泌能力(图2，B，C)。
同时，Eheps具备ICG吸收与外排能力，PAS染色显示其能够储存糖原，并能够转运Dil标记的ac-LDL(图2，D，F)。
此外，肝脏的另一重要功能为对外源物质的代谢解毒能力。首先通过qRT-PCR在mRNA验证不同内胚层干细胞来源的肝脏细胞药物代谢酶类表达情况及对特定诱导剂的响应能力。结果显示，CYP3A4、CYP1A2及CYP2C9基因表达水平与未培养的成体肝实质细胞相类似，并在特定酶类诱导剂(Lansoprazole及Rifamipicin)的作用下具有3-6倍的表达提升(图3，A，B，C)。其次，利用高效液相质谱进一步从蛋白水平验证不同细胞系来源Eheps的药物代谢能力。高效液相质谱显示Eheps能够代谢CYP3A4代谢酶类特定底物睾酮，对特定诱导剂具有与基因表达水平相似的响应能力，并与来自于五个不同供体的原代肝脏细胞具有相似的代谢能力。此外，不同来源Eheps同样具有CYP1A2代谢能力，其能够有效将其底物Phenacetin转变为Acetaminophen，同时CYP1A2代谢酶诱导剂Lansoprazole能够有效提升其代谢能力，并接近原代肝脏细胞。不同来源Eheps同样具有CYP2C9代谢能力，在特定诱导剂利福平的作用下其代谢功能接近原代肝实质细胞(图3，D，E，F)。
实施例3 Eheps体内功能评估
多能干细胞所得肝实质细胞在肝脏内的整合能力是评估体外所得肝实质细胞的又一重要参数。目前，延胡索酸乙酰乙酸水解酶缺失及缺乏B细胞、T细胞及天然杀伤细胞的慢性肝损伤小鼠(FRG)为研究外源肝实质细胞体内整合较为理想的动物模型。正常情况下FRG小鼠需喂养NTBC水来维持寿命，NTBC水撤离4-6周后小鼠则因肝脏衰竭而死亡(图4，A)。通过脾脏注射一百万Ehep细胞到FRG小鼠内。未注射细胞的实验小鼠在撤离NTBC水四周内全部死亡。而实验组小鼠在扯水八周后仍有近50％的生存率(图4，B)。血清ALT与AST检测表明细胞移植小组相比于空白组肝损情况明显缓解(图4，C)。其次，人类FAH免疫组织化学染色较为直观显示Ehep在小鼠体内的整合(图4四，D)。小鼠血清中人源血清白蛋白及小鼠肝脏内人源血清白蛋白基因PCR检测表明Ehep已较好整合到FAH小鼠肝脏内(图4，E，F)。以上结果表明Ehep能够较好整合到小鼠肝脏内并发生肝脏细胞功能。
对急性肝衰动物模型的治疗效果是评估体外所得肝实质细胞的体内功能实验的又一方案。利用D-半乳糖苷诱发免疫缺损大鼠急性肝衰竭，一般发病时间在给药24-48时内。用于治疗的细胞则在给药14-16小时内通过腹腔注射(图5，A)。实验大鼠血清内ALT与AST结果显示Ehep能有效减缓急性肝衰程度(图5，B)。移植后生存结果显示没有给予细胞移植的小鼠则于2-4内死亡率达100％，而移植组则在移植后两周生存率达80％(图5，C)。急性肝衰大鼠内人源血清的检测表明移植细胞能够在大鼠体内存活(图5，D)。进一步，H-E染色从形态学角度表明Ehep能有效缓解急性肝衰大鼠肝脏损伤情况(图3，E)。
讨论
(1)在由多能干细胞获得成熟肝实质细胞，较多前期研究尝试建立三维分化系统，以期高度模仿体内发育状态。然而，多能干细胞作为起始细胞需经历较多的分化步骤，如中内内胚层、定向内胚层、肝向内胚层、肝母细胞，及终末的肝细胞等阶段。因此，终末细胞的总体分化效率与细胞纯度具有一定的局限性。更为重要的是，多能干细胞分化系统中任何未分化的细胞在受体病人内具有形成畸胎瘤的风险。此外，这些分化过程多涉及较复杂的消化过程或细胞重聚团过程，进一步限制终末细胞的规模化制备。为克服以上不足，本发明选择内胚层干细胞作为分化的起点，其能够分化为内胚层特异性细胞类型，体内无成瘤性，在无血清培养条件下体外能够无限扩增。
(2)干细胞所得肝向细胞在药物筛选，体外肝脏器官构建及细胞治疗中的应用需要规模化制备肝母细胞及肝实质细胞。在此，本发明建立了高效三维悬浮分化系统以规模化制备系列肝向细胞类型，包括肝母细胞，成熟肝实质细胞。
(3)该三维分化系统优势体现在以下几方面：1)增殖能力极强的内胚层干细胞与肝向内胚层在三维悬浮培养条件下能够高效形成极性囊腔状类器官；2)据我们所知，内胚层干细胞所得肝母细胞，肝实质细胞具有极高细胞纯度；3)内胚层干细胞所得肝实质细胞具有强大的体外药物代谢及分泌功能，能够有效缓解肝脏衰竭动物模型的病理情况。
(4)在此三维分化系统基础上，本发明将进一步通过改变分化过程中细胞因子组合、细胞外基质、以及不同胚层来源细胞共培养等方式，以期制备功能更加成熟的肝实质细胞。
(5)该规模化系统所得肝母细胞与肝实质细胞为较多应用提供较为理想的细胞来源，包括出生后肝脏成熟发育学模型、体外药物代谢高通量研究、人工肝装置、肝脏器官体外重构，及终末基于细胞或器官治疗等相关应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞，从而获得肝母细胞；和
(c)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得肝实质细胞；其中，所述培养体系包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和/或A83。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述培养体系为含有第二培养基和添加物的培养液，所述添加物包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)－(c)中，所述培养体系中还含有促进分化的其他物质，选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement Membrane Extracts)、或其组合。
4.一种肝母细胞，其特征在于，所述肝母细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝母细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝母细胞大小60-80μm，细胞层厚度6－12μm。
5.一种肝实质细胞，其特征在于，所述肝实质细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝实质细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝实质细胞大小80-100μm，细胞层厚度8－15μm。
6.一种权利要求4所述肝母细胞或权利要求5所述的肝实质细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗肝脏相关疾病的药物组合物。
7.一种组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求4所述的肝母细胞和/或权利要求5所述的肝实质细胞。
8.一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基含有基础培养基和添加物；其中所述基础培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、HCM、或其组合；并且，所述添加物包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和/或A83。
9.一种诱导组合物，其特征在于，包括：
(a)第一诱导因子，所述第一诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)第二诱导因子，所述第二诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子；
(c)第三诱导因子，所述第三诱导因子包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和/或A83；和
(d)促进分化的其他物质，所述促进分化的其他物质选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basement Membrane Extracts)、或其组合。
10.权利要求9所述的诱导组合物的用途，其特征在于，用于诱导内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012178215A1 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 The Children's Hospital Of Philadelphia Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells and methods of use thereof
CN106754636A (zh) * 2015-11-19 2017-05-31 中国人民解放军第二军医大学 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用
CN107904207A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法
CN108865969A (zh) * 2017-05-11 2018-11-23 北京大学 Mapk/pkc信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012178215A1 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 The Children's Hospital Of Philadelphia Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells and methods of use thereof
CN106754636A (zh) * 2015-11-19 2017-05-31 中国人民解放军第二军医大学 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用
CN108865969A (zh) * 2017-05-11 2018-11-23 北京大学 Mapk/pkc信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟
CN107904207A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONG DU ET AL.: ""Highly efficient and expedited hepatic differentiation from human pluripotent stem cells by pure small-molecule cocktails"", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 *
THOMAS TOUBOUL ET AL.: ""Stage-specific regulation of the WNT/β-catenin pathway results in improved differentiation of hESCs to functional hepatocytes"", 《J HEPATOL》 *
VALERIE GOUON-EVANS ET AL.: ""BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm"", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
成军: "《程序性细胞死亡与疾病》", 28 February 1997, 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社 *

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