CN116478904A - 肝样细胞和人工肝组织的制备方法以及应用 - Google Patents

肝样细胞和人工肝组织的制备方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了将多能干细胞诱导为肝样细胞团的方法，其包括将多能干细胞封装在第一微凝胶中进行分化培养，得到所述肝样细胞团。本申请还提供了人工肝组织的制备方法，其包括将通过上述方法制备的肝样细胞团与其它功能细胞封装在第二水凝胶中进行培养，得到所述人工肝组织。本申请还提供了通过上述方法制备的肝样细胞团和人工肝组织及其用途。

Description

肝样细胞和人工肝组织的制备方法以及应用
发明领域
本申请属于生物与新医药技术领域，具体地，涉及诱导多能干细胞分化为肝样细胞团的方法以及通过肝样细胞团制备人工肝组织的方法。
发明背景
肝脏是人体最重要的器官之一并承担着许多重要功能，而肝脏中的肝功能主要是由肝细胞所提供。在大多数肝病中，肝细胞逐渐减少并进一步导致肝衰竭，而肝移植是目前唯一有效的肝衰竭的治疗方式。然而由于肝脏供体数量有限，中国香港特别行政区每年约有40％的人在等待肝移植的过程中死亡。因此，尝试肝细胞移植疗法或构建人工肝组织作为肝移植的替代疗法具有重要的临床意义。除了临床需求，肝细胞也可用于体外药物代谢研究和药物毒理评价。药物性肝损伤是到达临床试验的许多药物的主要障碍，许多创新药因毒性问题而下架。这其中部分是由于用于评估药物肝损伤的体外细胞模型和小鼠毒性模型的限制。然而由于新鲜肝组织中分离的肝细胞数量有限，同时肝细胞在体外具有不可增殖的特点，因此目前工业上和临床上对于优质来源的肝细胞仍然有着迫切需求。
目前已经有研究表明多能干细胞可以用于肝方向的分化，然而大部分多能干细胞产生的肝样细胞仅仅表达胎儿肝细胞标志物同时缺乏主要的药物代谢酶细胞色素P450(CYP)活性。因此，迄今为止还没有人工分化的肝样细胞进入临床实验。因此，促进多能干细胞分化的不成熟的胎儿肝样细胞进一步分化为具有成体肝细胞特性的肝样细胞具有重要的临床意义。
肝细胞移植疗法的另一个挑战是植入的肝细胞在肝脏中难以留存，而利用成熟的肝样细胞构建人工肝组织从而帮助肝细胞在肝脏中定植是一种可能的解决办法。在传统的构建人工肝组织的方法中(如将干细胞接种到水凝胶或聚合物支架中)，由于缺乏血管，营养交换会受到限制，因此构建的人工肝组织的大小具有局限性。虽然3D打印技术可以用于构建血管化的组织，但对用于打印的“生物墨水”(生物材料和细胞的混合物)有着极高要求，这限制了3D打印在构建可植入人体的组织中的应用。使用脱细胞支架也可以构建血管化的人工肝组织，但将细胞注入支架的过程繁琐，并且难以精确控制细胞的接种位置，因此难以建立功能性的血管网络。
鉴于可用于临床的成熟的肝样细胞和人工肝组织的缺乏，开发出新的能够产生大量成熟可用的肝样细胞的方法以及构建人工肝组织的方法对于肝脏临床医学和再生医学的研究有着重要的意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了将多能干细胞诱导为肝样细胞团的方法，其包括将多能干细胞封装在第一微凝胶中进行分化培养，产生具有成熟肝功能的肝样细胞团。
在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶包含胶原蛋白。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶的大小为80-120μm。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶包含10-20个所述多能干细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述培养的时间为至少17天。
在第一方面的一些实施方案中，所述培养包括以下阶段：分化为定形内胚层的阶段；分化为肝母细胞团的阶段；以及肝母细胞团进一步分化和成熟的阶段。
第二方面，本申请提供了肝样细胞团，其通过第一方面所述的方法制备。
第三方面，本申请提供了人工肝组织的制备方法，其包括将通过第一方面所述的方法制备的肝样细胞团或第二方面所述的肝样细胞团与其它功能细胞封装在第二水凝胶中进行培养，得到所述人工肝组织。
第四方面，本申请提供了人工肝组织，其通过第三方面所述的方法制备。
第五方面，本申请提供了第二方面所述的肝样细胞团和第四方面所述的人工肝组织在制备用于治疗肝脏相关疾病的产品、药物筛选、毒性测定或再生医学中的用途。
附图简述
图1显示了hESC在2D条件下向肝细胞分化的结果。其中，(A)诱导hESC分化为肝细胞的三阶段分化策略示意图；(B)第0、2、7和17天分化细胞的细胞形态，比例尺：100μm；(C)第0、2、7和17天细胞的OCT4、FOXA2、AFP和ALB的表达，比例尺：200μm；(D)第0、2、7和17天细胞中不同阶段的肝谱系标记基因表达；(E)第0天和第17天细胞的PAS染色，比例尺：100μm；(F)第17天细胞的尿素和白蛋白分泌；n＝3，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图2显示了I型胶原蛋白水凝胶支持hESC的3D培养和细胞团形成的结果。其中，(A)在第3天，不同细胞密度的hESC的成胚状体(简称EB)形成，比例尺：100μm；(B)在第1天，第3天，在I型胶原蛋白水凝胶中hESC的活死染色，比例尺：100μm。
图3显示了I型胶原蛋白微凝胶中的hESC微囊化和EB形成的结果。其中，(A)用于生成载有hESC的I型胶原蛋白微凝胶的微流体芯片；(B)微流控芯片产生的I型胶原蛋白液滴，比例尺：200μm；(C)I型胶原蛋白液滴和I型胶原蛋白微凝胶的直径分布(>100个样品被用于分析)；(D)将hESC微囊化到I型胶原蛋白微凝胶中，比例尺：200μm、100μm；(E)I型胶原蛋白微凝胶中的EB形成，其中用钙绿黄素AM标记EB，比例尺：100μm和200μm。
图4显示了EB在微凝胶中的肝分化结果。其中，(A)肝分化过程中载有hESC的微凝胶的形态，比例尺：100μm；(B)第0、2、7和17天细胞中不同阶段的肝谱系标志物基因的表达；(C)原代肝细胞以及第7天和第17天肝分化细胞中AFP、CK18和ALB的表达的荧光图片，比例尺：100μm；(D)原代肝细胞以及第7天和第17天肝分化细胞中ALB与AFP(左图)，以及CK18与AFP的表达量的比值(右图)；(E)肝脏分化过程中尿素(左图)和白蛋白(右图)的分泌；n＝3，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图5显示了I型胶原蛋白微凝胶中HLC的成熟肝细胞标志物的表达的结果。其中，(A)在第17天，HLC中CK18、AFP、ALB、E-钙粘蛋白和MRP2的免疫染色，比例尺：100μm；(B)在第17天，HLC的TEM图像，比例尺：2μm；(C)在第17天，HLC的油红和PAS染色，比例尺：100μm。
图6显示了微凝胶封装促进hESC肝分化和成熟的结果。其中，(A)在第17天引入至2D后，原代肝细胞、2D、I型胶原蛋白凝胶(bCOL1)和I型胶原蛋白微凝胶(mCOL1)HLC的形态，箭头表示双核细胞；比例尺：50μm；(B)2D、I型胶原蛋白凝胶和I型胶原蛋白微凝胶的第17天HLC的肝细胞标志物基因的表达；(C)I型胶原蛋白凝胶和I型胶原蛋白微凝胶的第17天HLC的肝细胞标志物的表达，第一行是I型胶原蛋白凝胶，第二行是I型胶原蛋白微凝胶，比例尺：100μm；n＝3，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图7显示了HLC细胞团和人脐静脉内皮细胞自组装形成预血管化的肝组织构建体的过程的示意图。
图8显示了HLC细胞团和人脐静脉内皮细胞在自组装室(高为2mm，直径为3.5mm)中自组装成异质组织的结果。其中，第一列为细胞形态明场图片和示意图；第二列为使用DAPI、CD31-内皮细胞标志物和白蛋白-肝细胞标志物ALB进行免疫染色的图片；第三列为明场图片与荧光图片的复合图片。
发明详述
本申请的发明人通过将多能干细胞封装在第一微凝胶中进行分化培养，得到肝样细胞团。通过本申请的方法获得的肝样细胞具有更高的成熟度，展现出成熟肝细胞特有的形态，其包括多角形上皮形态、明显的圆形细胞核和含有各种颗粒的大量细胞质，在肝样细胞团中也观察到双核细胞形成，具有低的AFP基因表达和高的ARG1和ALB基因表达，上调的代谢酶基因CYP3A4和CYP1A2表达，一些其它肝细胞标志物基因AAT(编码α-1抗蛋白酶)和TAT(编码酪氨酸氨基转移酶)的mRNA水平也上调，CK18、MRP2和E-钙粘蛋白在肝样细胞团中分散在相邻细胞膜上，与这些蛋白质在肝组织中的分布相似。利用本申请的肝样细胞团在包含纤维蛋白和凝血酶的第二水凝胶中可以构建出血管化的具有肝功能的人工肝组织。本申请的肝样细胞团和人工肝组织为进行肝脏相关疾病治疗、医药应用和研究等提供了有效的工具。
定义
提供以下定义用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另外说明，本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同，例如，涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其它公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本申请所用的术语“多能干细胞”是指具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，其具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
如本申请所用的术语“胚胎干细胞”是指早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
如本申请所用的术语“诱导性多能干细胞”是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程获得的多能性干细胞。
如本申请所用的术语“微凝胶”属于微米级的凝胶颗粒，是一种具有分子内交联结构的聚合物微粒，具有优良的生物学性能。
如本申请所用的术语“约(about)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于值是如何测量或确定的，即，测量系统的局限性。例如，“约”可以意指根据本领域的实践在1个或大于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的高达20％、优选地高达10％、更优选地高达5％并且还更优选地高达1％的范围。在于本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
具体实施方案
第一方面，本申请提供了将多能干细胞诱导为肝样细胞团的方法，其包括将多能干细胞封装在第一微凝胶中进行分化培养，得到所述肝样细胞团。
在第一方面的一些实施方案中，所述肝样细胞团为具有成熟肝功能的肝样细胞团。
在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述多能干细胞为胚胎干细胞，例如hESC细胞系H9细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶包含胶原蛋白。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶包含Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型或Ⅺ型胶原蛋白。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一微凝胶包含Ⅰ型胶原蛋白。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一微凝胶为I型胶原蛋白微凝胶(简称mCOL1)。
在第一方面的一些实施方案中，用于制备所述第一微凝胶的胶原蛋白的浓度为1-3mg/mL，例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3mg/mL，或上述任意两个数值之间的数值或范围。
在第一方面的一些具体实施方案中，用于制备所述第一微凝胶的胶原蛋白的浓度为1.5mg/mL。
在第一方面的一些具体实施方案中，将胶原蛋白溶液与所述多能肝细胞混合后通过微流控技术制备成封装有所述多能肝细胞的第一微凝胶。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶的大小为80-120μm，例如80、85、90、95、100、105、110、115、120μm，或上述任意两个数值之间的数值或范围。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一微凝胶的大小为约100μm。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶包含10-20个所述多能干细胞，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个所述多能干细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一微凝胶包含10个所述多能干细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述培养的时间为至少17天，例如17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45或50天，或上述任意两个数值之间的数值或范围。
在第一方面的一些实施方案中，所述培养包括以下阶段：分化为定形内胚层的阶段；分化为肝母细胞团的阶段；以及肝母细胞团进一步分化和成熟的阶段。
在第一方面的一些实施方案中，所述分化为定形内胚层的阶段使用定形内胚层分化培养基培养所述第一微凝胶(例如24-48h)，获得包含定形内胚层的微凝胶。
在第一方面的一些实施方案中，所述定形内胚层分化培养基包含定形内胚层诱导培养基和/或定形内胚层孵育培养基。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述定形内胚层诱导培养基可以为含有激活素A(例如100ng/mL激活素A)和Wnt3A(例如25ng/mL的Wnt3A)的RPMI培养基。所述定形内胚层孵育培养基可以为含有FBS(例如0.2％FBS)和激活素A(例如100ng/mL激活素A)的RPMI培养基。
在第一方面的一些实施方案中，在分化到定形内胚层阶段后，可以将细胞维持在含有例如2％FBS和100ng/mL激活素A的RPMI培养基中。
在第一方面的一些实施方案中，所述分化为肝母细胞团的阶段使用含有二甲基亚砜的培养基培养所述包含定形内胚层的微凝胶(例如5天)，获得包含肝母细胞团的微凝胶。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述含有二甲基亚砜的培养基为敲除DMEM基础培养基，其包含20％KOSR、0.5％GlutaMAX、1％NEAA、0.2％β巯基乙醇、1％PiS和1％二甲基亚砜。
在第一方面的一些实施方案中，所述肝母细胞团进一步分化和成熟的阶段使用维持肝细胞表型表达的培养基培养所述包含肝母细胞团的微凝胶(例如10天)以获得肝样细胞团。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述维持肝细胞表型表达的培养基为HepatoZYME培养基培养，其包含5％KOSR、1％氢化可的松21-半琥珀酸酯、1％GlutaMAX、1％Pis、10ng/mL HGF和20ng/mL OSM。
第二方面，本申请提供了肝样细胞团，其通过第一方面所述的方法制备。
在第二方面的一些实施方案中，所述肝样细胞团具有以下特征中的至少一种：具有双核结构；具有贮存糖原和脂肪的功能；能够分泌尿素和白蛋白；具有低水平的AFP基因表达；具有高水平的ARG1、ALB、CYP3A4、CYP1A2、AAT和TAT基因表达；和/或表现出肝细胞极性。
第三方面，本申请提供了人工肝组织的制备方法，其包括将通过第一方面所述的方法制备的肝样细胞团或第二方面所述的肝样细胞团与其它功能细胞封装在第二水凝胶中进行培养，得到所述人工肝组织。
在第三方面的一些实施方案中，所述其它功能细胞为血管内皮细胞，例如人脐静脉血管内皮细胞或多能干细胞诱导得到的血管内皮细胞。
在第三方面的一些具体实施方案中，所述其它功能细胞为人脐静脉血管内皮细胞。
在第三方面的一些实施方案中，所述其它功能细胞为其它肝脏细胞，例如肝巨噬细胞或肝星状细胞。
在第三方面的一些实施方案中，所述第二凝胶原料包含纤维蛋白和/或凝血酶。
第四方面，本申请提供了人工肝组织，其通过第三方面所述的方法制备。
第五方面，本申请提供了第二方面所述的肝样细胞团和第四方面所述的人工肝组织在制备用于治疗肝脏相关疾病的产品、药物筛选、毒性测定或再生医学中的用途。
在第五方面的一些实施方案中，导致肝衰竭的遗传病症可受益于利用本申请的肝样细胞团或人工肝组织的疗法。导致肝衰竭的非限制性的遗传病症的列表包括：进行性家族性肝内胆汁淤积、III型糖原类疾病、酪氨酸血症、脱氧鸟苷激酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、先天性红细胞生成异常性贫血、多囊肝病、多囊肾病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、尿素循环障碍、有机酸血症、溶酶体累积病以及脂肪酸氧化障碍。同样受益于基于细胞的疗法的其它病症包括威尔森氏病(Wilson’s Disease)和遗传性淀粉样变性(FAP)。
在第五方面的一些实施方案中，其它非肝细胞相关致因的肝衰竭仍可受益于通过利用本申请的肝样细胞团或人工肝组织的疗法的一些暂时修复的功能，所述肝衰竭需要整个肝脏移植以实现完全疗效。这样的病症的非限制性实例的列表包括：原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、Aglagille综合征、纯合子家族性高胆固醇血症、伴有肝硬化的乙型肝炎、伴有肝硬化的丙型肝炎、布加综合征(Budd-Chiari syndrome)、原发性高草酸尿症、自身免疫性肝炎以及酒精性肝病。
在第五方面的一些实施方案中，本申请的肝样细胞团或人工肝组织可用于治疗涉及肝细胞失调的遗传性疾病的方法中，此类疾病可以是早发型或晚发型。早发型疾病包括代谢相关的器官衰竭(如α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、糖原累积病(如GSD II、庞佩氏病(Pompe’s disease))、酪氨酸血症、轻度DGUOK、I型CDA、尿素循环障碍(如OTC缺乏症)、有机酸血症以及脂肪酸氧化障碍。晚发型疾病包括原发性甘草酸尿症、家族型高胆固醇血症、威尔森氏病、遗传性淀粉样变性以及多囊肝病。用由本发明的肝脏的类器官产生的健康肝细胞部分或全部替换可用于修复肝功能或延缓肝衰竭。
在第五方面的一些实施方案中，本申请的肝样细胞团或人工肝组织可用于治疗慢性或急性肝衰竭。
在第五方面的一些实施方案中，本申请提供了用于肝脏再生、更换或矫正肝功能缺损的肝细胞的新的肝细胞来源。
在第五方面的一些实施方案中，本申请的肝样细胞团和人工肝组织在再生医学中是有用的，例如在肝上皮细胞的辐射后和/或手术后修复中，在患有慢性或急性肝衰竭或疾病的患者的上皮细胞修复中。所述肝脏相关疾病包括但不限于肝细胞癌、艾欧吉勒综合征(Alagille Syndrome)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、胆管闭锁、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊肿、脂肪肝、半乳糖血症、吉尔伯特氏综合征(Gilbert’s Syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性硬化性胆管炎、雷尔氏综合征(Reye’s Syndrome)、肉样瘤病、酪氨酸血症、I型糖原累积病、威尔逊氏病(Wilson’sDisease)、新生儿肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、卟啉症以及血色沉着病。
在第五方面的一些实施方案中，本申请的肝样细胞团或人工肝组织在毒性分析测定中的用途。这样的毒性分析测定可利用本申请的肝样细胞团或人工肝组织进行体外分析测定。本申请的肝样细胞团或人工肝组织易于培养，并且与例如目前在毒性分析测定中使用的上皮细胞系如Caco-2(ATCC HTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和XBF(ATCC CRL 8808)相比，更加接近于原始上皮细胞。可预期的是，用本申请的肝样细胞团或人工肝组织获得的毒性结果更加接近于由患者获得的结果。将基于细胞的毒性测试用于确定器官特异性细胞的细胞毒性。
第五方面的一些实施方案中，本申请的肝样细胞团或人工肝组织在其它非治疗用途的实例包括：研究肝脏胚胎学，肝细胞谱系以及分化途径；基因表达研究，包括重组基因表达；参与肝损伤和修复的机制；研究肝脏的炎症性和感染性疾病；研究致病机制；以及研究肝细胞转化机制和肝癌病因学。
第五方面的一些实施方案中，本申请的肝样细胞团或人工肝组织可进一步代替在潜在的新药物或者已知或新的食品补充剂的毒性测试测定中使用的细胞系，如Caco-2细胞。
实施例
下面结合实施例示例性描述本申请的发明，但实施例部分的内容不以任何方式限制本申请的各项发明。
本申请的发明人开发了基于液滴的微流控技术，该技术允许以生物相容性和高通量方式高通量生成载有细胞的微凝胶，以用于细胞和生长因子的均匀封装。发明人研究了微囊化hESC中分化的HLC的肝脏分化和成熟。将I型胶原蛋白用作支架以支持hESC的3D培养，因为它具有良好的生物相容性。肝脏分化将通过肝脏特异性标志物、标志物基因的表达和肝脏功能(包括尿素和白蛋白分泌、脂滴和糖原储存)来评估。此外，将通过细胞形态、特定肝极性以及肝基因和标志物的表达来评估微凝胶内HLC的成熟度，并与2D和3D分化的HLC进行比较。
1.方法和材料
1.1 hESC的2D培养
在这些实验中，使用第5-10代的并且根据支原体检测试剂盒(Vazyme，中国)检测不含支原体的hESC系细胞H9。将H9细胞在mTeSRTM1培养基中，在无饲养层的培养条件下，在MatrigelTM上扩增和传代。
1.2 hESC的3D培养的优化
本申请的发明人研究了I型胶原蛋白在hESC的3D培养中的潜力。根据制造商的说明书对I型胶原蛋白进行中和。将不同细胞密度的H9细胞(1×106、2×106、3×106个细胞/mL)悬浮在1.5mg/mL的I型胶原蛋白溶液中。通过将hESC-I型胶原蛋白溶液吸移到PDMS模具中直径为3mm的孔中并在37℃下孵育30min以形成I型胶原蛋白凝胶，来形成载有hESC的I型胶原蛋白水凝胶。mTeSRTM1培养基被用于hESC的3D培养。
1.3 hESC的微囊化
1.3.1 PDMS微流控芯片的制备
通过常规软光刻技术制造由聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成的微流控芯片。使用DraftSight软件(Art Service，美国)设计芯片掩膜并打印。根据制造商的提供的方案，从厚度为100μm的SU-8 3050(MicroChem，Newton，MA)负性光刻胶制备图案化硅模具。将PDMS预聚合物和交联剂(Sylgard 184硅弹性体试剂盒，Dow Corning,Midland,MI)以10:1的比例混合，然后倒在图案化的硅片上并脱气。PDMS模具在60℃下固化过夜。用打孔机(Technical Innovations,Brazoria,TX)打出直径为1mm的通道入口和出口的孔。在室温下进行60sec的氧等离子体处理(PLASMA CLEANER PDC-002，德国)后，将PDMS模具粘合到盖玻片上。
1.3.2I型胶原蛋白微凝胶的生成
在油相中形成水性I型胶原蛋白液滴。将1.5mg/mL中和的I型胶原蛋白溶液用作内相。将补充有Pico-Surf TM 2表面活性剂(1％)(Dolomite Microfluidics，Charlestown，MA)的Novec-7500(Miller-Stephenson Chemical Co.Inc.，Danbury，CT)用作油相。两个注射泵(PHD2000，Harvard Apparatus，Holliston，MA)被用于控制两相的流速，其中分别为I型胶原蛋白溶液200μL/h和油相800μL/h。I型胶原蛋白液滴形成过程在冷室中进行，以防止I型胶原蛋白在液滴形成之前交联。将收集的I型胶原蛋白液滴保持在37℃以促进I型胶原蛋白交联。通过40μm的细胞过滤器从油相中释放I型胶原蛋白微凝胶。将微凝胶用DPBS溶液洗涤几次以去除多余的油。
1.3.3载有hESC的微凝胶的制备和表征
通过将hESC与中和的I型胶原蛋白溶液混合来制备微凝胶前体。将hESC重悬于中和的I型胶原蛋白溶液中并保持在4℃直至使用。如上所述生产封装有hESC的微凝胶。3天后在微凝胶中形成用于肝分化的hESC细胞团。使用Image J软件从至少三个由>100个样品组成的明场图像中对微凝胶和hESC细胞团的大小进行量化。
1.4 hESC肝谱系分化
图1概述了肝脏谱系分化过程，其中使用模拟肝脏发育步骤的三阶段分化方案。2D、3D和微凝胶封装的hESC都按照相同的分化方案进行了分化。在2D中，在包被有Matrigel(Corning)的表面上接种hESC后大约18-20小时开始分化。在3D和微凝胶中，在hESC细胞团于凝胶/微凝胶中形成后的第3天开始分化。简而言之，将达到80％汇合的细胞并在定形内胚层(Definitive Endoderm，DE)诱导培养基(含有100ng/mL激活素A和25ng/mL的Wnt3A(R&D Systems,Minneapolis,MN)的RPMI(Invitrogen)培养基)中孵育24h。然后，将细胞用DE孵育培养基(含有0.2％FBS(Sigma Aldrich)和100ng/mL激活素A的RPMI培养基)处理24h。在48h后，可以将细胞维持在含有2％FBS和100ng/mL激活素A的RPMI培养基中。将分化到DE阶段的细胞在基于敲除DMEM基础培养基(Thermofisher)的第II阶段培养基中培养5天以进行肝母细胞团分化，其中敲除DMEM基础培养基含有20％KOSR(Thermofisher)、0.5％GlutaMAX、1％NEAA、0.2％β巯基乙醇(Thermofisher)、1％PiS(Thermofisher)和1％二甲基亚砜(Thermofisher)。在这个阶段，每2天更换一次培养基。然后将分化的肝母细胞团在第III阶段培养基中分化和成熟10天以使HLC成熟。在静态培养中，每48小时更换一次培养基。在第III阶段分化期间，在细胞分化和成熟之后，在HepatoZYME培养基(Thermofisher)中进行培养，HepatoZYME培养基含有5％KOSR、1％氢化可的松21-半琥珀酸酯(Sigma，美国)、1％GlutaMAX、1％Pis、10ng/mL HGF(Peprotech，美国)和20ng/mL OSM(Peprotech)。
1.5活死细胞染色
根据制造商的说明书进行活死细胞染色。简而言之，通过将1μL EthD-1和1μL钙黄绿素-AM添加到1mL生理盐水中来制备活-死细胞染色溶液。将培养的细胞在培养箱中在制备的染色溶液中培养20min，并在成像前用DPBS冲洗两次。活死细胞染色后，在荧光显微镜下可以观察到活细胞具有绿色荧光，死细胞具有红色荧光。使用具有ZDC(日本)的OlympusIX83倒置显微镜获取荧光图像。
1.6总RNA提取
用TRIzol试剂提取总RNA。简而言之，在第3天将细胞样品加入TRIzol试剂中以裂解细胞。加入氯仿(与TRIzol试剂的比例为1:5)，然后剧烈涡旋30sec。在室温下静置10min后，将这些样品在4℃下以12000g离心10min，将混合物分离成较低的红色苯酚氯仿、中间相和无色的上层水相。小心地将2/3水相转移到新管中。将异丙醇(与TRIzol试剂的比例为1:5)加入水相中，然后轻轻振荡30sec。在室温下静置10min后，将这些样品在4℃下以12000g离心10min。总RNA沉淀会在管底部形成白色沉淀。弃去上清液，将RNA沉淀重悬于500μL的75％乙醇中，然后在4℃下以7500g离心5min。弃去上清液，将RNA沉淀风干30min。将沉淀溶解在20μL无RNase的水中。基于A260和A280的分光光度法测定RNA浓度，并将RNA样品储存在-80℃直至使用。
1.7 cDNA逆转录和实时定量PCR
人肝细胞总RNA购自Zenbio。使用具有gDNA Eraser(Vazyme)的HiScript III RTSuperMix，用1μg总RNA合成cDNA。使用QuantStudio7(QS7，美国)Flex实时PCR系统(AppliedBiosystems,美国)，用TB Green Premix Ex TaqII(TAKARA,日本)进行定量PCR。列出了使用的引物(表1)。将结果标准化为GAPDH的结果，由2-ΔΔCt方法确定相对表达的定量。
表1.RT-qPCR的引物序列
基因 正向引物 反向引物
ALB GCACAGAATCCTTGGTGAACAG ATGGAAGGTGAATGTTTTCAGCA
HNF-4α GTACTCCTGCAGATTTAGCC CTGTCCTCATAGCTTGACCT
OCT4 CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC
FOXA2 GCACTCGGCTTCCAGTATGC GCGTTCATGTTGCTCACGGA
SOX17 CAAGGGCGAGTCCCGTATC CGACTTGCCCAGCATCTTGC
AFP AAATGCGTTTCTCGTTGCTT GCCACAGGCCAATAGTTTGT
GAPDH ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG GCCATCACGCCACAGTTTC
CYP3A4 TGTGCCTGAGAACACCAGAG GTGGTGGAAATAGTCCCGTG
ARG1 TGGACAGACTAGGAATTGGCA CCAGTCCGTCAACATCAAAACT
CYP1A2 GATGCTGTTTGGCATGGGCA CGTAGATGGGGGTCAGGTCG
AAT ATGCTGCCCAGAAGACAGATA CTGAAGGCGAACTCAGCCA
G6PC ACTGGCTCAACCTCGTCTTTA CGGAAGTGTTGCTGTAGTAGTCA
TAT CTGGACTCGGGCAAATATAATG GTCCTTAGCTTCTAGGGGTGC
1.8免疫荧光
2D染色：将2D培养的细胞用PBS冲洗并在室温下用4％多聚甲醛固定15min，然后用0.3％TritonX-100透化5min。在室温下用5％BSA封闭30min后，将细胞与在1％BSA中的一抗一起于4℃下孵育过夜，然后与在1％BSA中的二抗一起在室温下孵育1小时。表7中列出了本研究中使用的抗体。最后，使用DAPI进行核染色，孵育15min。在一抗和二抗以及DAPI染色后，将样品在室温下用PBS洗涤3次，每次10分钟。
3D凝胶和微凝胶结构染色：将3D样品在4℃下用4％PFA固定过夜。随后的染色步骤如上所述(按照单层染色的方法进行)。
所有免疫荧光图像均使用Leica TCS-SP8共聚焦显微镜获取。LAS X软件(Leica)被用于图像处理。提供了所用一抗和二抗的完整列表(表2)。
表2.用于免疫染色的抗体
抗体 目录号
OCT4 Abcam:Ab181557
FOXA2 Abcam:Ab256493
AFP Abcam:Ab253704
ALB Abcam:Ab207327
CK18 Abcam:Ab181597
MRP2 Abcam:Ab172630
E-钙粘蛋白 Abcam:Ab11512
山羊抗兔二抗 Abcam:Ab150077
山羊抗大鼠二抗 Abcam:Ab150165
山羊抗鼠二抗 Abcam:Ab150113
1.9苏木精伊红和高碘酸-希夫染色
根据制造商的说明书进行苏木精伊红(H&E)和高碘酸-希夫(PAS)染色。对于3D凝胶和微凝胶，将3D样品在室温下用4％PFA固定过夜，用PBS洗涤，然后嵌入ShandonPathCentre组织处理器(Thermo Scientific)。将3D样品脱水、包埋在石蜡中并切成5μm的切片。将石蜡包埋切片用二甲苯脱蜡，再水化。随后的染色步骤按照制造商的说明书进行。所有免疫荧光图像均使用NikonNi-UEclipse直立显微镜(光/荧光)获取。
1.10透射电子显微镜
将载有细胞的微凝胶用Sorensen磷酸盐缓冲液冲洗，并在4℃下用2.5％戊二醛固定剂固定过夜。用Sorensen磷酸盐缓冲液冲洗3次后，将微凝胶在分级醇(70％、80％、90％和100％)中脱水，在环氧丙烷中澄清并嵌入Epon812和环氧丙烷的混合物中。首先，在Ultratome(Leica UCT7)上切割成半薄切片并用甲苯胺蓝染色。随后，在相同的超薄切片机上切割超薄切片，收集到包被有formvar碳的铜网上，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅复染，并在Hitachi H-7700透射电子显微镜(Hitachi，日本)下检查。
1.11白蛋白和尿素测定
使用白蛋白ELISA试剂盒测量人白蛋白的产生。使用尿素测定试剂盒评估尿素的产生。将细胞在新鲜培养基中培养24小时后，在不同时间点收集上清液，用于白蛋白和尿素产生的测试。将细胞用胰蛋白酶消化并使用血细胞计数器计数。
1.12人工肝组织的制备
将纤维蛋白用EMBM完全培养基稀释至终浓度为6mg/mL。将凝血酶用EMBM完全培养基稀释至终浓度为4U/mL。将在I型胶原蛋白微凝胶培养获得HLC细胞团和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用于构建预血管化肝组织。收集在I型胶原蛋白微凝胶中培养获得HLC细胞团并过滤以获得直径为约100μm的细胞团。将HUVEC和HLC细胞团重新悬浮在稀释的凝血酶-纤维蛋白混合溶液中。HUVEC和HLC的最终浓度均为5×107个细胞/mL。如图7中所示，将这些细胞-水凝胶混合物接种到PDMS通孔模具(孔径为3.0mm)中，以在3天内形成预血管化的肝组织构建体。
1.13统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用单向方差分析(ANOVA)评估不同组的比较。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件8.0.1版进行。统计显著性值定义为p<0.05。
2.结果
2.1 hESC肝分化
发明人在2D中验证了hESC的肝分化潜能。发明人使用模拟体内肝细胞发育过程的常见肝分化方案来诱导hESC肝分化。发明人利用DE分化培养基产生了DE细胞，在DE分化后，超过90％的细胞表达DE细胞标志蛋白FOXA2。随后通过添加DMSO，发明人实现了DE细胞的肝方向分化。在培养5天后，分化的细胞表达AFP蛋白，表明细胞分化为肝谱系细胞。随后发明人通过添加HGF和OSM诱导了肝母细胞的进一步成熟，在第17天，在一些细胞中可以检测到ALB蛋白表达，这是肝母细胞成熟为肝样细胞的标志。然而，2D分化第17天只有有限的细胞表达ALB，表明肝母细胞的成熟效率较低(图1C)。此外，发明人还检测了不同分化阶段的hESC、DE、肝母细胞和成熟肝细胞标志物基因的表达。在分化第0天可以观察到ESC标志物OCT4基因有最高的表达。在第2天，DE标志物FOXA2和SOX17的基因表达显著上调，而在第7天，SOX17的表达达到峰值。然而，在第17天，细胞仍然维持FOXA2和SOX17基因的低表达，这表明部分细胞仍然维持在DE细胞阶段。而HNF4α在肝脏分化和肝功能调节中起重要作用，它在2D分化过程中始终保持低表达状态，这意味着2D分化过程中hESC朝着肝方向分化效率较低。在第7天的细胞中可以观察到肝母细胞标志物AFP基因的表达上调，并在第17天达到峰值。分化第17天的细胞具有肝细胞标志物ALB和CYP3A4基因的表达(图1D)，并且能够分泌尿素和白蛋白以及储存糖原(图1E&F)。这些结果表明hESC可以分化为HLC并具有一些肝脏特异性功能，包括尿素和白蛋白分泌以及糖原储存。然而，在2D条件下这些分化的肝样细胞保持了未成熟肝脏标志物的高表达，例如AFP的基因表达。
2.2 hESC的3D培养
随后，发明人将hESC封装到I型胶原中进行3D分化。在第3天，大多数被封装到I型胶原蛋白水凝胶中的hESC可以聚集成EB(图2A)。并且当hESC以3×106个细胞/mL的密度进行封装时，形成的EB数量最多(图2B)。这些结果表明I型胶原蛋白水凝胶支持hESC的3D培养和增殖和EB的形成。
2.3 I型胶原蛋白微凝胶中hESC微囊化和EB形成
发明人进一步利用微流控装置去产生球形的封装有hESC的I型胶原蛋白微凝胶。如图3中所示的，入口“a”为油入口，入口“b”为I型胶原蛋白溶液入口。I型胶原溶液可以在水相和油相的交界处形成水性I型胶原蛋白液滴并分散在油乳液中。随后发明人将I型胶原蛋白液滴在37℃下孵育30min以促进I型胶原蛋白交联从而形成I型胶原蛋白微凝胶。形成的微凝胶的平均尺寸为100μm左右。hESC可以成功被封装到I型胶原蛋白微凝胶中，封装有hESC的每个微凝胶中约有10个细胞。将含有hESC的微凝胶培养3天后，hESC在I型胶原蛋白微凝胶中可以形成致密的EB。并且活-死细胞染色结果表明微凝胶中的EB有着较高的细胞活力。
2.4 I型胶原蛋白微凝胶中EB的肝分化
随后发明人利用微凝胶中的EB进行肝分化。EB的肝分化与2D hESC肝分化过程相似。细胞团的大小在EB分化过程中逐渐增加(图4A)。随后发明人在不同的分化阶段检查hESC、DE、肝母细胞和肝细胞标志物基因的表达。与2D分化相似，在第0天，细胞具有最高mRNA水平的ESC标志物OCT4基因的表达，并在分化过程中不断下调。分化第2天的细胞有着最高水平的DE标志物基因FOXA2的表达，并在第7天保持较高表达，而另一个DE标志物基因SOX17的表达在第7天达到最高。在第17天，细胞的FOXA2和SOX17的表达下降到相对较低的水平。而肝转录因子基因HNF4α的表达在肝分化过程中逐渐上调，并在第17天保持高水平，表明细胞在微凝胶中可以有效地进行肝方向的分化。在分化过程中，肝母细胞标志物基因AFP的表达在第7天上调，而第17天的细胞显著性高表达肝细胞特异性标志物基因ALB和CYP3A4基因(图4B)。这些结果表明微凝胶中的EB能够进行肝细胞方向的分化。免疫染色结果显示，分化第7天的细胞高表达AFP蛋白不表达ALB蛋白。而与第7天的细胞相比，第17天的细胞显著性低表达AFP并且高表达ALB蛋白(图4C)，并且第17天分化得到的肝样细胞具有与原代肝细胞相似的ALB/AFP蛋白表达(图4D)。而2D分化中只有少量细胞表达了ALB蛋白。随后发明人进一步检测了在分化的肝样细胞的尿素和白蛋白分泌情况。结果表明，随着肝母细胞不断成熟，分化得到的肝样细胞的白蛋白和尿素的合成和分泌也不断增加(图4E)，这意味着肝样细胞的进一步成熟。
2.5 I型胶原蛋白微凝胶中分化的HLC的成熟肝细胞标志物的表达
随后发明人进一步检测了在微凝胶中分化得到的HLC(第17天的细胞)中的一些其它成熟肝细胞标记物的表达情况。免疫荧光结果表明，几乎所有分化的HLC都表达肝细胞特异性标志物蛋白ALB和CK18以及人类特异性转运蛋白(MRP2)和粘附连接标志物蛋白(E-钙粘蛋白)。MRP2和E-钙粘蛋白的分布表明在分化的HLC中建立了肝脏特异性极性。而TEM结果表明分化的肝细胞是多边形细胞，具有双核结构和大量线粒体(图5B)。此外，分化的第17天的HLC中能够储存糖原和脂肪(图5C)。这些结果表明在微凝胶中分化的HLC具有成熟肝细胞的特征，并且能够发挥正常肝细胞的功能。
2.6微凝胶封装促进hESC肝分化和成熟
随后发明人对2D，I型胶原蛋白凝胶和微凝胶中的分化的HLC进行了比较。结果表明，微凝胶分化的HLC展现出成熟肝细胞特有的形态，包括多角形上皮形态、明显的圆形细胞核和含有各种颗粒的细胞质成分(图6A)，并且部分微凝胶中分化的HLC具有双核结构。此外，与2D和I型胶原蛋白凝胶HLC相比，I型胶原蛋白微凝胶HLC显著性低表达AFP基因和高表达ARG1和ALB基因。与2D HLC相比，微凝胶中分化的HLC明显著性高表达CYP3A4和CYP1A2基因和其它肝细胞标志物基因AAT(编码α-1抗蛋白酶)和TAT(编码酪氨酸氨基转移酶)(图6B)。免疫染色结果表明，I型胶原蛋白凝胶和微凝胶中分化的HLC均表达CK18、MRP2和E-钙粘蛋白。然而，CK18、MRP2和E-钙粘蛋白在I型胶原蛋白凝胶HLC中分散在整个细胞中，而这些标志物在微凝胶分化的HLC中则主要集中在相邻细胞的细胞膜上，与这些蛋白质在肝组织中的分布相似(图6C)。这些结果表明，在细胞形态、肝功能基因表达和肝细胞标志物表达方面，与2D和I型胶原蛋白凝胶的HLC相比，微凝胶中的HLC具有更高的成熟度。与2D和I型胶原蛋白凝胶相比，微凝胶封装可以进一步促进hESC肝分化和成熟。
2.7人工肝组织构建
随后发明人将分化得到的肝样细胞团和HUVEC包裹在纤维蛋白凝胶中去构建人工肝组织。结果如图8所示，第1天，I型胶原蛋白微凝胶团均匀分布在纤维蛋白凝胶中，被HUVEC包围。而培养3天后，纤维蛋白凝胶体积减少，HLC细胞团和HUVEC整合形成纤维蛋白凝胶中的大而致密的组织结构。其中HLC细胞团相互粘附，在几个HLC细胞团的接触区域观察到HUVEC的管状形态，而CD31的免疫染色结果表明相邻HLC细胞团之间形成了血管网络。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

Claims (10)

1.将多能干细胞诱导为肝样细胞团的方法，其包括将多能干细胞封装在第一微凝胶中进行分化培养，得到所述肝样细胞团。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一微凝胶包含胶原蛋白，优选为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型或Ⅺ型胶原蛋白，更优选为Ⅰ型胶原蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一微凝胶的大小为80-120μm，优选为约100μm；和/或
所述第一微凝胶包含10-20个所述多能干细胞，优选包含10个所述多能干细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述培养的时间为至少17天。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述培养包括以下阶段：
分化为定形内胚层的阶段，优选地使用定形内胚层分化培养基培养所述第一微凝胶，获得包含定形内胚层的微凝胶；
分化为肝母细胞团的阶段，优选地使用含有二甲基亚砜的培养基培养所述包含定形内胚层的微凝胶，获得包含肝母细胞团的微凝胶；
肝母细胞团进一步分化和成熟的阶段，优选地使用维持肝细胞表型表达的培养基培养所述包含肝母细胞团的微凝胶以获得肝样细胞团。
7.肝样细胞团，其通过权利要求1-6中任一项所述的方法制备；
优选地，所述肝样细胞团中的肝细胞具有以下特征中的至少一种：
具有双核结构；
具有贮存糖原和脂肪的功能；
能够分泌尿素和白蛋白；
具有低水平的AFP基因表达；
具有高水平的ARG1、ALB、CYP3A4、CYP1A2、AAT和TAT基因表达；和/或
表现出肝细胞极性。
8.人工肝组织的制备方法，其包括将通过权利要求1-6中任一项所述的方法制备的肝样细胞团或权利要求7所述的肝样细胞团与其它功能细胞封装在第二水凝胶中进行培养，得到所述人工肝组织；
优选地，所述其它功能细胞为血管内皮细胞或其它肝脏细胞；更优选地，所述血管内皮细胞为人脐静脉血管内皮细胞或多能干细胞诱导得到的血管内皮细胞；和/或所述其它肝脏细胞为肝巨噬细胞或肝星状细胞；和/或
所述第二水凝胶包含纤维蛋白和/或凝血酶。
9.人工肝组织，其通过权利要求8所述的方法制备。
10.权利要求7所述的肝样细胞团或权利要求9所述的人工肝组织在制备用于治疗肝脏相关疾病的产品、药物筛选、毒性测定或再生医学中的用途。
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