CN102459574B - 用于人多潜能干(hPS)细胞的生长和分化的3D培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及3D培养系统用于从人多潜能干细胞(hPS)衍生肝细胞样细胞的用途。特别地，本发明涉及人多潜能干细胞在3D中空纤维毛细管生物反应器中至肝细胞样细胞的定向分化和成熟。

Description

用于人多潜能干(hPS)细胞的生长和分化的3D培养系统

技术领域

本发明涉及3D培养系统的用途，其用于从人多潜能干细胞(humanpluripotentstemcells，hPS)衍生肝细胞样细胞。特别地，本发明涉及人多潜能干细胞在3D中空纤维毛细管生物反应器中至肝细胞样细胞的定向分化和成熟。

发明背景

为了在再生医学和应用研究例如药物筛选或毒理学测试中开发和实现基于干细胞的应用，需要大量具有良好确定的特征的细胞。因此，需要允许hPS以高得率和纯度定向、可重现地分化至成熟肝细胞样细胞的培养系统。

发明描述

本发明涉及用于获得肝细胞样细胞的方法，所述方法包括

i)在生物反应器中接种hPS或肝前体细胞

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

在本发明的一个方面，本发明涉及肝组织样3D结构，其包含通过用于获得肝细胞样细胞的方法获得的肝细胞样细胞，所述方法包括

i)在生物反应器中接种hPS或肝前体细胞

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

在本发明的其他方面，本发明涉及通过用于获得肝细胞样细胞的方法获得的细胞用于治疗目的，药物发现，药物配制，毒性测试或再生医学的用途，所述方法包括

i)在生物反应器中接种hPS或肝前体细胞

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

在其他实施方案中，本发明涉及生物反应器用于使hPS细胞或肝前体细胞向肝细胞命运分化的用途。

引言

当前，使用聚集体(aggregate)或微载体进行分化的3D悬浮培养模型法受到中央物质交换(centralmassexchange)的限制。通过在更大的细胞群中提供基于灌注的动态培养条件(其具有连续的培养基交换和在可控气体张力下的分散充氧(decentraloxygenation))，3D灌注4区室毛细管膜生物反应器技术使得能够利用两种培养理念的有利方面。此外，适合用于优质生产规范(GMP)条件的分化方案在封闭系统中的应用是可能的。所述技术允许进行改变，并且可控的培养基参数和系统参数包括例如氧张力、气体系数应用、培养基因子梯度或对细胞产生的物理刺激例如流动和压力。

hPS细胞在生物反应器中的培养

为了在再生医学和应用研究(例如药物筛选或毒理学测试)中开发和实现基于干细胞的应用，需要大量具有良好确定的特征的细胞。因此，需要允许未分化的人胚胎干细胞以高得率和纯度定向、可重现地分化至成熟肝细胞的培养系统。

最常使用的培养和分化方法通常利用塑料培养皿形式的2D培养系统，其代表具有不连续培养基更换的静态开放系统，这导致培养环境的周期性改变，表现为培养氧基更换之间培养基中代谢产物的积累和营养物的减少。此外，此类2D培养是劳动密集型的，因为它们需要大量人工干预，从而使得更大细胞数量的操作不现实。

hPS细胞在生物反应器中的分化

由Soto-Gutierrez等人进行的hESC的肝分化研究显示，更复杂的环境(使用复合基质结构或与非实质细胞共培养)支持hESC的肝分化(Soto-Gutierrez等人，2006)。Levenberg等人显示，在用ES细胞或EB接种的PLGA-聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和PLLA-聚(L-乳酸)的生物可降解的支架中，通过用激活蛋白A和IGF进行处理，可能诱导肝组织样结构(Levenberg等人，2003)。Baharvand等人报导了hESC在3D胶原支架中的增强的肝分化(Baharvand等人，2006)。因此，提供3D培养环境的灌注式生物反应器的使用可提供更有效且可扩展的用于胚胎干细胞分化的方法。

新型方法是利用中空纤维生物反应器进行胚胎干细胞的扩增和分化。中空纤维毛细管膜生物反应器技术使得能够实现动态灌注培养条件并且允许增加细胞密度，正如干细胞在天然组织中的那样。此外，按比例放大以用于更大的细胞群是可能的。然而，典型的两区室生物反应器装置(例如，FiberCellDuet，FiberCellsystems，Inc.，www.fibercellsystems.com)(其具有围绕一束周围毛细管的细胞区室，营养物主要通过扩散供应并且使用外部充氧)受限于不均匀的物质交换(沿着数分米的毛细管长度，存在底物梯度间隔)。

在由Gerlach等人开发的3D多区室技术(Gerlach等人1994)中，将另一个培养基区室和另外的充氧膜区室添加至典型的两区室装置中。交织4个区室以形成重复单元，从而使得生物反应器能够具有可扩缩性，提供分散的培养基灌注和更换，并且物质交换得到增强且梯度间隔得以减小。该理念基于在密闭的和从而优质生产规范(GMP)的适当培养环境中培养细胞，这促进了生物技术的应用以及结果的潜在临床转化。使用培养在生物反应器中的原代猪或人肝细胞进行的初步临床研究证明了利用所述系统进行临床体外肝支持的可行性(Sauer等人，2003)。此外，已显示，原代细胞可在这样的体外培养模式中产生它们自已的典型微环境，包括形成具有新生-血窦和胆道结构的肝样组织。成体干细胞可受益于在用于产生anorganotypical微环境的此类系统中进行的实质/非实质细胞共培养(Gerlach等人，2003)。

由于它们的独特特征，hPS细胞在再生医学中作为用于基础科学、药理学药物筛选、毒性测试和基于细胞的疗法的细胞来源具有巨大的潜力。已显示，在某些生长条件下，hPS细胞能够在体外分化成多种体细胞组织和胚胎外组织(Pera等人，2004)。因此，hPS，具体地hES/hBS细胞使得能够研究在早期胚胎发育过程中控制细胞命运的分子途径和控制机制，这在之前是不可能的(因为人胚胎不能用于研究)。hPS细胞的潜在临床应用可见于干细胞衍生的细胞制剂的提供中，所述制剂用于具有器官缺陷如肝功能不全、脊髓损伤或心肌缺陷的患者的基于细胞的治疗。hPS细胞衍生的分化细胞在药物发现中的可能应用可见于临床前活动如靶的鉴定和验证，化合物功效的筛选和安全性评估研究中(Sartipy等人，2007)。关于胚胎毒性测试，未分化的hPS细胞也提供了用于开发更好的测试系统的新型工具。

哺乳动物肝的发育

肝是在胚胎中最早发育的器官之一，其快速成为胎儿的最大器官之一。肝从胚胎前肠的限定性内胚层上皮发育而来。前肠中Wnt和成纤维细胞生长因子信号转导(FGF4)的最初抑制是诱导肝发育所必需的。随后来自心脏中胚层的FGF和来自原始横隔间充质的骨形态发生蛋白(BMP)诱导导致内胚层增厚的空间受限的细胞增殖。细胞随后从上皮脱离并且开始迁移至原始横隔中。从内胚层脱离并且集中在原始横隔中的细胞团称为肝芽。在器官发生的该阶段中，与内皮细胞的相互作用对于该早期出芽期(buddingphase)是至关重要的。肝内胚层细胞在该时间期间在功能和形态学方面是相当不成熟的，并且现被称为成肝细胞(hepatoblast)。来自肝芽的成肝细胞束渗入中胚层，与卵黄和脐静脉(其在肝芽附近汇合形成毛细血管床)混合。这些转变建立了肝的窦状隙结构(sinusoidalarchitecture)，这对于器官功能是至关重要的并且为肝支持胎儿造血创造了条件。迁移入肝芽的造血干细胞分泌制癌蛋白M(OsM)，该蛋白与糖皮质激素一起诱导进一步的肝成熟。对胚胎肝有贡献的其他细胞类型是围绕肝血窦的内皮细胞、枯否细胞和肝星形细胞。由这些细胞产生的肝细胞生长因子(HGF)对于肝的完全功能成熟是重要的。在这些肝分化的更晚期中，Wnt信号转导不再抑制而是促进生长和分化。病因性(causal)肝疗法的缺乏和用于肝移植的供体器官的不充足的可获得性导致需要开发新型的基于细胞的肝疗法。移植能够增殖和分化以替代受损的组织的干细胞可在一些临床适应症中替代整个器官的移植。

hPS细胞的体外肝分化

对指导HPS细胞(特别地hES/hBS细胞)的体外肝分化的策略的研究导致鉴定了对肝分化具有作用的几种细胞因子、生长因子和非蛋白质化合物(综述于Heng等人，2005；Snykers等人，2008中)。所述生长因子包括激活蛋白A、BMP2和BMP4、表皮生长因子(EGF)、FGF1、-2和-4、HGF、胰岛素和OsM。所述非蛋白质因子包括地塞米松(DEX)、二甲亚砜(DMSO)、烟酰胺和丁酸钠。对于各分化因子的作用而言至关重要的是，时间安排、浓度和与其他因子的组合。为了表征hPS衍生的肝细胞样细胞，已利用了不同的标志物和功能测试(由Snykers等人，2008综述)。通过免疫化学、聚合酶链式反应(PCR)或酶联免疫吸附测定(ELISA)检查的标志物包括分泌的血浆蛋白质如甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和尿素、细胞角蛋白(CK8、CK18、CK7、CK19)和多种肝细胞特异性酶如α-1-抗胰蛋白酶(α1AT)、二肽基肽酶IV(DPPIV)和细胞色素P450同工酶。已例如通过检测糖原的贮存和多种特异于细胞色素P450同工酶的测试底物的代谢来检查肝细胞特异性功能的表达。

最早公布的方案描述了用作第一步骤的hPS细胞的肝分化，EB的诱导，然后贴壁培养，使用不同生长因子来富集肝细胞(Lavon等人，2004)。在这些研究中，只报导了非常低的终细胞群体的得率和纯度。到目前为止，所描述的试图模拟肝的器官发育的最成功的分化方案始于hESC的定型内胚层(definitiveendoderm，DE)分化的诱导(Cai等人，2007)。基本上，高浓度的激活蛋白A与低血清/胰岛素条件(用于提供减少的胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)信号转导)一起被用于DE分化，获得多至80％DE细胞的得率(Kubo等人，2004)。此后，用FGF、BMP、HGF、OsM/DEX进行连续处理。对于该方法，描述的肝细胞样细胞的得率为约50％。其他方案包括用抑制组蛋白脱乙酰基酶活性的丁酸钠(NaB)处理hESC(Davie2003)。在分化方案的第一步骤中应用该表观遗传学分化剂导致从hESC产生10％的肝细胞和达到70％的终细胞群体的纯度(Rambhatla等人，2003)。NaB处理与利用激活蛋白A进行的DE诱导的组合显示很有前景的结果，获得高达70％的肝细胞得率(Hay等人，2008)。

概而言之，通过现有方法产生的hESC衍生的肝细胞的得率、纯度和成熟程度仍然欠佳，从而需要新的方法。本发明通过提供用于从hPS例如hBS细胞获得肝细胞(通过将这些细胞或从其衍生的DE细胞接种在其中它们经历分化的生物反应器中)的方法解决了这些问题。

hPS衍生的肝细胞的应用

hPS衍生的肝细胞的未来临床用途可见于它们用于具有肝功能不全的患者(例如在某些遗传缺陷或者急性或慢性肝功能衰竭的情况下)的细胞移植的应用中(Ito等人，2009)。干细胞衍生的肝细胞的移植可在某些临床适应症中替代整个器官的移植，并且--当使用免疫相容性细胞时--使得不需要免疫抑制疗法。其他治疗选择可见于可靠的人细胞来源的提供中，所述人细胞来源用于体外肝支持，以过渡(bridge)肝功能直至移植或直至再生患者器官，这也可解决用于体外肝装置的细胞的可获得性的现存问题。此外，体外系统还可提供有利的治疗选择，以在细胞移植后过渡肝功能直至施用的细胞显示足够的肝特异性代谢性能。药学研究中的潜在应用是，使用hPS细胞衍生的肝细胞来开发药物发现所需的新型肝测定。这可克服现有体外工具的较差的预测力的问题，和导致产生新的基于人细胞的测试系统，该系统将允许在临床前阶段进行更可靠和更相关的测试并且阻止微弱的前导候选物进入临床期(Jensen等人，2009)。

本发明还涉及生物反应器用于产生条件化培养基的用途。用于产生条件化培养基(CM)的标准方法是，在标准培养容器中温育培养基24小时，所述容器以高密度接种灭活的MEF饲养细胞。该方法是劳动密集型的并且十分耗费空间，因为必须产生大量的饲养细胞，所述饲养细胞在它们丧失活性前只能在有限量的时间内用于培养基的条件化。因此，更大体积的CM的产生受限于该方法的较差的可扩缩性。使用CM来培养hBS细胞的备选方法是使用成分确定的培养基。已描述了几种用于hESC的无饲养层培养的成分确定的培养基制剂(Li等人，2005；Ludwig等人，2006)。虽然成分确定的培养基的使用具有几个有利方面，如能够在完全不含动物来源的物质的条件下培养hBS细胞，但其主要不利方面是，这些培养基制剂包含大量昂贵的补充剂，如重组细胞因子和生长因子。

如上文中所概述的，本发明涉及用于获得肝细胞样细胞的方法，所述方法包括

i)将hPS或肝前体细胞接种在生物反应器中

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

肝细胞样细胞可以以包含肝细胞样细胞的肝组织样3D结构的形式存在，从而一起簇集在3D聚集体中。hPS细胞可以是但不限于人胚胎干细胞或诱导的多潜能干(iPS)细胞，如定义中所描述的。肝细胞前体细胞可以是定型内胚层(DE)或与DE不相似，或肝细胞前体细胞可具有胎儿内胚层或肝内胚层的特征。如上文中提及的，生物反应器可以是任选地提供有膜区室的中空纤维毛细管生物反应器。生物反应器可包括两个或更多个毛细管系统和一个或多个中空纤维膜。此外，生物反应器可包括用于灌注培养基通过毛细管系统的工具和用于在毛细管系统中进行气体交换的工具，任选地，生长培养基的灌注通过毛细管系统发生，气体交换通过中空纤维膜系统发生。可配置毛细管系统和一个或多个中空纤维膜以形成整合至室(housing)中的独立交织的纤维毛细管膜系统。

可在步骤i)中接种hPS细胞，并且可按照下列方案进行灌注，只要包括步骤2-6中的至少3个步骤：

可选地，可包括步骤1-6的全部。

如本文中详细描述的，培养基DM-A可包含生长培养基和一种或多种如下成分：激活蛋白A、bFGF、Glutamax-I。

如本文中详细描述的，培养基DM-B可包含生长培养基例如RPMIAdvanced培养基等，和一种或多种如下成分：激活蛋白A、bFGF、GLutamax-I、FCS。

如本文中详细描述的，培养基DM-C可包含生长培养基例如RPMIAdvanced培养基等，和一种或多种如下成分：bFGF、aFGF、BMP2、BMP4、Glutamax-I、FCS。

如本文中详细描述的，培养基DM-D包含肝培养基例如Williams培养基E等，和一种或多种如下成分：BSA、抗坏血酸、Glutamax-I、D-半乳糖/D-山梨醇、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、bFGF、EGF、HGF。

如本文中详细描述的，培养基DM-E包含肝培养基例如Williams培养基E等，和一种或多种如下成分：BSA、抗坏血酸、Glutamax-I、地塞米松、D-半乳糖/D-山梨醇、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、bFGF、EGF、HGF、制癌蛋白M。

列出的所有培养基可任选地包含rho激酶抑制剂例如BIO或BIO的任何变体。

在步骤i)之前，可用灭活的饲养细胞接种生物反应器。此类饲养细胞可以是但不限于hFF或MEF细胞。

此外，可在步骤i)中用hBS细胞和饲养细胞或DE细胞和饲养细胞(无论哪者是相关的)共接种生物反应器。

此外，可在步骤i)中接种肝前体细胞例如DE细胞，并且可省略下表的步骤1和2(用斜体标示)。

如上文中所概述的，本发明涉及hPS细胞例如hESC/hBSC的3D培养，特别地所述细胞在多区室生物反应器系统(作为支持hPS细胞的生长和分化(特别是定向肝分化)的新型体外系统)中的培养。结果显示，生物反应器的3D环境构成了比标准2D培养系统更加像体内的环境，从而与这些系统相比，使得能够实现hPS细胞的改善的生长和分化。

此外，本发明涉及方法，其中在将细胞接种在生物反应器中之前，在常规2D环境中进行细胞的初步分化。有趣地，本发明的发明人已发现，通过在2D环境中起始hPS朝向定型内胚层的分化，且随后将初步分化的细胞接种至生物反应器中，提供了更纯的培养物。在于2D培养物中初步分化成定型内胚层后，将细胞接种在生物反应器中。在表2和表3-5中提供了初始2D分化以及随后的接种以及在生物反应器中的进一步分化的实例。

因此，在第3天至第20天例如第8天至第12天，例如第11天或第12天，可将初始分化的细胞接种在生物反应器中。

对于上述方面，进一步地，可用激活蛋白A，任选地RHO激酶抑制剂和高生长因子水平进一步刺激hPS细胞朝向肝细胞命运的分化。可将所述细胞在给定的时间点(第12天，对于表3中显示的实验；第7天或第11天，对于表4中显示的实验)上接种至生物反应器中，并且允许发生进一步的分化和成熟。

如本文中所描述的，发明人已发现，通过应用3D生物反应器，hPS的肝分化被有效地导向肝细胞命运。可用于促进hPS朝向肝细胞命运的有效分化的详细方案在下文，特别是本文的实施例中进行了详细描述。如本文中所举例说明的，可在使用或不使用饲养细胞例如小鼠胚胎饲养细胞(MEF)或人包皮成纤维细胞(HFF)的情况下，促进hPS细胞的分化。此外，生长培养基可包括任何适当的生长培养基，包括在本文中被描述为hESC培养基和DM-A、DM-B、DM-C、DM-D和DM-E的任何生长培养基。因此，目前提供的本发明还包括对生长培养基组成的任何改变(例如生长培养基成分的去除或添加)，此类改变对于本领域技术人员来说是显然的，并且可用于改变或替代本文中提供的生长和分化培养基。类似地，温育时间、流速或培养条件的任何变化(由于例如延迟的细胞成熟或阶段特异性生长因子的添加)都在本发明的范围内，因为此类微小的调整被认为是本发明的显然应用。

在初始细胞接种之前，可通过再循环适当的生长培养基，进行给定的时间段例如24-72小时来条件化生物反应器。可使用任何适当的培养基和流速，包括在分化的任何阶段用于分化细胞的任何培养基。可选地，可使条件化减小至最低限度，从而允许将细胞几乎立即接种在生物反应器中。

生物反应器中所使用的流可取决于几个因素例如，分化的阶段、接种规模(inoculationsize)、细胞的成熟、生长培养基的粘度等。气体区室中空气/CO₂混合物的流可以为0.2ml/分钟至120ml/分钟，例如10至80ml/分钟，例如30ml/分钟。

根据本发明，可将细胞以任何适当的浓度或数目接种在生物反应器。作为非限定性实例，可将1x10⁶至10x10⁸个细胞，例如2.5x10⁷至10x10⁷个细胞接种在生物反应器中。

可周期性测量pH、氧气(pO₂)和二氧化碳(pCO₂)的分压和酸/碱状态。可改变空气/CO2混合物以维持特定pH值和O₂与CO₂的分压。因此，可调整空气/CO₂的混合比例以维持5至9，例如7.2或7.3的稳定pH。

可在将hPS接种在生物反应器中之前，用饲养细胞例如MEF细胞接种生物反应器。例如，可在将hPS细胞接种在生物反应器中之前5至0天例如1至4天，例如在将hPS细胞接种在生物反应器中之前2天，接种饲养细胞。

在将hPS细胞接种在生物反应器中后，可在确定的间隔后更换生长培养基。取决于细胞分化速度和细胞成熟，可每1至15天更换分化培养基组合物。关于生长培养基的组成、补料速率和更换生长培养基组合物之间的间隔，请参见本文中的表2。

在于生物反应器中分化之前、期间和之后，可监测代谢参数。这可通过测量培养基流出物和再循环培养基中的可溶性因子来进行。参数可包括任何相关的和可测量的参数，例如因子，包括：甲胎蛋白(AFP)、碱性磷酸酶(AP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、c-肽、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段19(Cyfra21-1)、促红细胞生成素、雌二醇、滤泡刺激激素(FSH)、因子II-V-X-XIII、血纤蛋白原、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶(LDH)、促黄体激素、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、渗透压(osmolality)、骨钙素、拟胆碱酯酶(PCHE)、前白蛋白孕酮、催乳素、S-100、促甲状腺激素(TSH)、组织型纤溶酶原激活物(TPA)、转铁蛋白、谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、乳酸、铵、pH、钠(Na+)，钾(K+)、激活蛋白A、胰岛素和白蛋白、尿素、半乳糖和山梨醇。可用于测量所述化合物的任何方法都可以使用。可以例如通过将当天的实际废物体积乘以补给培养基的物质浓度与废物培养基的物质浓度之差来计算每天各种物质的生产率或消耗率。

对于上述参数或物质，进一步地，可测试培养物的代谢活性。例如，可测试生物反应器经由I期细胞色素(CYP)P450酶CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4代谢非那西丁、双氯酚酸(diclophenac)和咪达唑仑的能力。可在分化的任何阶段进行所述测试，以例如在分化过程中调整培养条件和生长培养基的组成。然而，在分化的相对晚期，代谢活性的测试可以是最相关的，此时细胞完全或部分朝向肝细胞命运或分化成肝细胞或肝细胞样细胞。例如，可在分化的第30天至第60天之间，例如在细胞接种后第40天和第47天进行测试。

CYPP450活性测试可以例如按照如下方案来进行：

CYP1A2：非那西汀-＞对乙酰氨基酚

CYP2C9：双氯酚酸-＞4′OH双氯芬酸

CYP3A4：咪达唑仑-＞1′OH咪达唑仑

可将待测物质注射入再循环培养基以在测试开始时获得下列浓度：0.5至10μM例如3μM咪达唑仑、1至25μM例如9μM双氯酚酸和2-60μM例如26μM非那西丁。随后可以以再循环模式操作生物反应器进行24小时。然后在起始实验之前以及之后1、4、8和24小时获取来自再循环物的样品，并且利用例如液相色谱/质谱(LC/MS)就待测物质的代谢产物分析所述样品。

可以通过本领域内已知的任何方法进行RNA的分离、cDNA合成、阵列杂交和数据分析。另外，可利用构成本领域技术人员的可获得的工具箱的一部分的任何设备和试剂进行细胞和生长培养基的电子显微镜分析以及组织化学和免疫组织学分析。

与上文中概述的详细内容一致，可就分化特异性标志物分析所获得的细胞。在一个实例中，可测量4组标志物(肝基因、胎儿/未成熟肝细胞的标志物、转运蛋白和未分化的细胞的标志物)，测量的时间点包括第0天、接种当天和生物反应器关闭当天。为了比较的目的，可以相应地包括和分析只包含在2D培养后获得的细胞的对照组。

本发明的其他方面涉及生物反应器用于产生条件化培养基的用途，所述条件化培养基用于未分化的hPS细胞的培养。

本发明的发明人已观察到，灭活的HFF的存在延迟了hESC分化的起始，直至HFF丧失它们的活性。HFF的支持多潜能性的活性可能与它们产生激活蛋白A相关。为了进一步检查HFF饲养细胞的行为，在2D培养物和在两个生物反应器中进行只使用HFF的几个实验。

在一个实验中，用活性HFF(其在补充有血清和bFGF的培养基中培养，以刺激HFF增殖)接种生物反应器。通过葡萄糖消耗和乳酸产生的水平来监测细胞数目的增加。当达到足够的细胞数目时，将培养基更换成用于条件化的hBS培养基。必须测定最佳培养基交换速率，例如测量条件化培养基中的激活蛋白A和葡萄糖浓度，作为质量控制参数。低葡萄糖水平可能表示需要增加培养基的补给速率，并且低激活蛋白A水平可能表示条件化不充分，不适合用于促进hESC的多潜能性。

来自2D和3D实验的观察结果显示，激活蛋白A的产生受到与含有血清替代物的培养基组合的bFGF的刺激。在补充有血清的培养基中，bFGF不刺激激活蛋白A的产生，而展示对活性HFF的强促有丝分裂作用。该作用也在生物反应器实验HFF-1(其特征在于，在向培养基中添加bFGF后，葡萄糖和乳酸代谢的水平增加)中观察到。该促有丝分裂作用未在生物反应器实验HFF-2(其中使用补充有血清替代物的培养基)中观察到。在该实验中，葡萄糖和乳酸代谢停留在恒定水平上，这显示细胞未增殖。

因此，所述观察结果表明，生物反应器技术可用于产生条件化培养基，其是未分化的hPS细胞的无饲养细胞扩增所需要的。

在生物反应器中培养HFF以产生CM可以是常规方法的备选。其使得能够在可扩缩的系统中产生高细胞密度的人饲养细胞，所述可扩缩的系统允许自动控制培养参数以及培养基流入和流出的确定速率。因此，条件化过程的标准化将是可能的，这导致产生的CM相对于手工方法具有提高的质量。当使用生物反应器时，一个其他的有利方面是，能够使用活性饲养细胞，因为已显示活性饲养细胞也支持多潜能性的维持(Xie等人，2005)。这可减少必须在常规2D培养中产生以用于初始生物反应器接种的活性饲养细胞的数量。

此外，可将包含hESC衍生的分化的细胞的生物反应器用作医学疗法中的体外装置和用作应用中的动物测试(例如畸胎瘤形成和药物代谢研究中的多潜能性测试)的另外的选择。

可选择地，本发明可用作用于产生大量未分化或已分化的hBS细胞(其是基础研究、药理学药物筛选和基于细胞的临床应用所需要的)的可扩缩系统。然而，对于这些应用，方法如本文中公开的和导致细胞制剂高度富集有特定细胞类型的方法，是关键的前提条件。

因此，本发明还涉及包含通过本文中公开的方法获得的肝细胞样细胞的肝组织样3D结构。

肝细胞样细胞或包含根据本发明的肝细胞样细胞的肝组织样3D结构可表达升高水平的一种或多种肝标志物基因或肝转运蛋白基因。

此类肝标志物基因的实例可选自白蛋白、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、CYP7A1、TAT&UGT2B7，并且一个或多个肝标志物的表达通常可类似于在本文图7中列举为样品：生物反应器第26天的肝标志物基因的表达。因此认为，图7构成了本发明的总体发明构思的一部分。

此外，肝细胞样细胞或包含根据本发明的肝细胞样细胞的肝组织样3D结构可表达升高水平的肝转运蛋白基因。所述基因可选自ABCC2/MRP2、FABP1、OATP2、OCT-1。一个或多个肝转运蛋白基因的表达可类似于列举为本文图9中的样品：生物反应器第26天的表达模式。因此认为，图9构成了本发明的总体发明构思的一部分。

本发明的一个方面涉及提供有膜区室的生物反应器中体外衍生的肝细胞样细胞。在一个方面，所述细胞可以在生物反应器中从hPS细胞或肝细胞前体分化成肝细胞样细胞。

如上文中所提及的，生物反应器可以是中空纤维毛细管生物反应器，其任选地提供有膜区室。所述生物反应器可包括两个或更多个毛细管系统和一个或多个中空纤维膜。此外，所述生物反应器可包括用于灌注培养基通过毛细管系统的工具和用于在毛细管系统中进行气体交换的工具，任选地生长培养基的灌注通过毛细管系统发生，气体交换通过中空纤维膜系统发生。毛细管系统和一个或多个中空纤维膜可被配置以形成整合至室中的独立的交织的纤维毛细管膜系统。

此外，生物反应器中的肝细胞样细胞或包含肝细胞样细胞的肝组织样3D结构可在细胞存活因子(例如ROCKRho激酶的抑制剂)存在的情况下生长。

本发明还涉及用于产生条件化培养基的方法，所述方法包括步骤：

a)将饲养细胞接种在生物反应器中

b)培养饲养细胞

如上文中详细描述的，上文中所提及的生物反应器可以是中空纤维毛细管生物反应器，其任选地提供有膜区室。所述生物反应器可包括两个或更多个毛细管系统和一个或多个中空纤维膜。此外，所述生物反应器可包括用于灌注培养基通过毛细管系统的工具和用于在毛细管系统中进行气体交换的工具，任选地生长培养基的灌注通过毛细管系统发生，气体交换通过中空纤维膜系统发生。毛细管系统和一个或多个中空纤维膜可被配置以形成整合至室中的独立的交织的纤维毛细管膜系统。

本发明的其他方面涉及通过本文中的任何方法获得的细胞用于治疗目的、药物发现、药物配制、毒性测试或再生医学的用途。

如本文中公开的，本发明的发明人已发现，3D灌注培养技术代表了用于在高度受控的环境中以高密度进行干细胞扩增和分化的有前景的工具。并且其可用于产生胚胎干细胞或多潜能干细胞-衍生的细胞制剂，所述细胞制剂用于在具有肝功能不全的患者中(例如，在某些遗传缺陷或者急性或慢性肝功能衰竭的情况下)进行移植。其他治疗选择可见于生物反应器技术用于体外肝支持的应用中，所述体外肝支持旨在通过使用hESC衍生的肝细胞作为人细胞来源来过渡肝功能直至移植或直至器官再生。体外系统还可提供有用的治疗选择，以在干细胞移植后过渡肝功能直至所应用的细胞显示足够的功能性能。最后，在生物反应器系统中扩增和维持的干细胞和干细胞衍生的已分化的细胞还可用于产生在体内刺激内源再生过程的再生物质(regenerativesubstances)。

因此，通过本文中描述的方法获得的细胞或3D细胞结构可用于药物发现、毒性测试、肝毒性测试或用于研究药物转运蛋白、药物代谢酶、肝脏发生(hepatogenesis)、早期肝脏发生、肝细胞成熟或人类肝再生障碍。

此外，在生物反应器中生长后获得的和根据本文中描述的任何方法获得的细胞或细胞的3D结构可用作药物或用于制造组合物，所述药物或组合物用于预防和/或治疗由组织变性例如肝组织变性和/或自身免疫病症包括原发性胆汁性肝硬化引起的病状和/或疾病；代谢病症包括血脂异常；由例如酒精滥用引起的肝病症；由病毒引起的疾病例如乙型肝炎、丙型肝炎和甲型肝炎；由对例如药物的急性毒性反应引起的肝坏死；和患有例如肝细胞癌的患者的肿瘤去除。此外，细胞或其3D结构可用于制造用于治疗和/或预防代谢病理状态和/或疾病的组合物，或用作就化合物调节肝细胞功能的能力筛选化合物的方法，所述方法包括将根据本文中公开的任何方法在生物反应器中培养的细胞与化合物接触，测定因与所述化合物接触而引起的细胞的任何表型或代谢变化。

还论述了hPS衍生的细胞的不足的组织相容性的可能性，和关于因在移植的细胞制剂中污染有未分化的hESC而引起的肿瘤形成的内在风险的安全性方面。因此，检查可选择的细胞来源，目的在于衍生可解决此类问题的组织相容性多潜能细胞。生物反应器技术可用于表征和比较候选细胞类型与hESC，此时hESC代表金标准。

作为本发明的一部分，最初进行两个关于hPS细胞(hPSC)在生物反应器中的定向肝分化的预试验，以评估可行性。两个生物反应器实验(HepDiff-1和HepDiff-2)的差异仅在于将灭活的MEF另外接种至一个生物反应器中。所使用的分化方案被开发用于在MEF上培养hPSC(参见表1和2，也参见图3)。接种后，在实验的前4天期间，在包含血清替代物的标准培养基(DM-A，参见表2)中培养hPSC。选择该初始步骤以使未分化的细胞适应新培养环境并且当HFF丧失它们的分化抑制活性时(但在自发分化开始前)起始分化。基于3个观察结果选择该步骤：首先，在初步生物反应器实验中，在细胞接种后观察到由LDH的峰标示的增加的细胞死亡速率。该增加的细胞死亡可能是由从2D培养物收获细胞的过程、接种过程本身引起和/或由细胞必须适应生物反应器的改变的环境引起。第二，用于后续步骤的分化条件对细胞具有高选择压力。因此，在细胞接种后直接应用这些条件是针对细胞的另一个应激因子并且可导致增加的细胞死亡。第三，基于下述观察结果选择在定向分化开始前的4天的培养长度：在先前的实验中，在该时间段内都未检测到分化标志物，并且通过它们的激活蛋白A的产生测量的HFF活性持续降低。

其中接种另外的灭活的MEF的生物反应器HepDiff-2显示，与无饲养细胞的HepDiff-1相比，高得多的葡萄糖和乳酸的代谢(图4)。这表明，灭活的MEF的存在对于hESC是细胞保护性的，并且导致接种后更好的细胞存活。当比较生物反应器中的AFP产生和CYP450活性时，在饲养细胞不存在的情况下更低的细胞存活也变得明显。这些参数的水平在无饲养细胞的生物反应器HepDiff-1中，相对于在具有饲养细胞的生物反应器HepDiff-2中，低至约1/8(图5)。在两个生物反应器中都观察到AFP的产生，其始于约实验的第17天。这可解释为早期肝分化的标志，从而可推测先前细胞的成功的DE分化。AFP是DE细胞分化成成肝细胞(胎儿肝的主要细胞类型)的标志物，但也可表示未分化的细胞至原始内胚层细胞的分化。在生物反应器中检测到CYP1A1/1A2对非那西丁的显著代谢(图6b)。在妊娠的第一个和第二个三个月期间，CYP1A1在胎儿肝中表达，其也可在其他胎儿组织如肺和肾上腺组织中表达，并且不能在成人肝中再被检测到，然而CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4的表达在胎儿肝中不存在，其在成人肝中表达(Hines等人，2002)。

如上文中概述的，分化方案的第一步骤是hPSC朝向定型内胚层(DE)的分化的诱导。在该方案中，通过在低血清条件中用高激活蛋白A浓度处理来获得高比率的hPSC至DE细胞的分化。适当的培养基的实例可基于RPMIAdvanced培养基。培养基可补充有如下成分的一种或多种：0.5-2％的Glutamax-I、1-10ng/ml的bFGF、10-200ng/ml的激活蛋白A或10-200μg/ml的庆大霉素。可选地或为了随后的使用，另一种适当的培养基可基于RPMIAdvanced培养基并且包含如下成分的一种或多种：0.5-2％的Glutamax-I、0.1-1％的FCS(热灭活的)、1-10ng/ml的bFGF、10-200ng/ml的激活蛋白A或10-200μg/ml的庆大霉素。

该步骤对于成功的朝向肝细胞的进一步细胞分化是至关重要的。在DE诱导后，接着的两个分化步骤指导细胞朝向成肝细胞表型分化。最终的步骤应当支持细胞成熟为完全分化的肝细胞。

为了评估使用的分化条件，分析胰岛素和激活蛋白A的水平。该分析显示胰岛素的高水平与激活蛋白A的高水平的重叠(图6a)。观察到的胰岛素的高水平来自包含在培养基(例如，DM-A)中的血清替代物，并且可通过刺激胰岛素样生长因子-1受体信号转导和ERBB2受体信号转导来支持hPSC增殖和自我更新。还显示，与减少的胰岛素/胰岛素样生长因子信号转导组合的通过激活蛋白/结节家族成员的信号转导对于定向至DE的细胞命运是至关重要的。这显示，生物反应器中共存的高胰岛素和激活蛋白A水平的分化条件对于DE的诱导不是最佳的，并且这最可能是肝分化不存在的原因。因此，进行其他实验以精确化hPSC细胞至DE，随后至更成熟的肝表型的定向分化(平行使用2个生物反应器试验，BR2和BR3)。该方法包括，在于特定的时间点上将它们接种在生物反应器中之前，首先在常规2D培养瓶中使用高水平的激活蛋白A和其他生长因子使hPSC朝向DE命运部分分化(在实施例19中详细描述的和在表4和5中示意性显示的方法)。该改进的方法显示，几个主要的肝标志物在于第12天接种至生物反应器中并且于第24天收获的细胞中的表达水平更高(相对于2D对照)；特别地，5个标志物(白蛋白、CYP1A2、CYP2C9、CYP7A1和UGT2B7)都显示在生物反应器-培养的样品中具有显著更高的表达(图7)。几个转运蛋白基因也在生物反应器培养的细胞中被上调(图9)，最显著地是ABCC2/MRP2和FABP1，然而应当指出，这些基因的表达并非完全限定于肝细胞类型。重要地，还发现，相对于原始未分化的起始材料，Nanog和Oct4(未分化的细胞的2个标志物)的表达在生物反应器培养的细胞中(和在2D对照中)未能被检测到(图10)。

此后，重复上述实验以确保结果在一个以上的生物反应器之间是可重现的。如上所述培养细胞，将其在两个不同的时间点上(对于BR121第7天或对于BR168第12天)接种到两个生物反应器之一中(BR121或BR168)。如所描述的(实施例5)使细胞成熟，在如实施例8-11中所述进行处理之前第26天收获细胞。来自BR168的结果显示，几个肝标志物在生物反应器成熟的细胞中被显著上调(相对于2D对照)，包括CYP3A7、CYP7A1、CYP3A4、CYP1A2和TAT(图11B和D)。重要地，当与2D对照相比较时，BR121培养的细胞还显示肝标志物的上调，包括观察到几乎100倍的增加的白蛋白和CYP3A7(图11A和C)。两个生物反应器中的细胞还显示未分化细胞的两个标志物(Oct4和NANOG)的表达显著下调，(图12)，这确认，细胞已分化并且不再具有多能性。

下面提供的是用于hBS细胞的肝分化的建议的方案。取决于起始材料和细胞输出，可省略或重复步骤。本领域技术人员可用一种或多种具有相同功能的成分替代各成分，关于在后面的生物反应器试验中(例如在BR121和BR168中)使用的培养基的细节，也参见表6，其也可部分或整体地用作分化实验的基础。

在分化方案过程中所使用的培养基可包含如下文中所列的成分，然而，可替换成分或调整其浓度，以针对不同的方案最优化培养基。

hPS培养基

DM-A

DM-B

DM-C

DM-D

DM-E

IDM-A，其中可将细胞培养0.5至10天，例如2天

RPMI1640(+0.01％至5％PEST，+0.1至10％Glutamax)

0.5至2xB27

10至200ng/ml激活蛋白A

0.1-10mMNaB

IDM-B，其中可将细胞培养1至10天，例如5天

RPMI1640(+0.01％至5％PEST，+0.1至10％Glutamax)

0.5至2xB27

10至200ng/ml激活蛋白A

0.1-8mMNaB

PM-A，其中可将细胞培养1至10天，例如3天

RPMIA(+0.01％至5％PEST，+0.1至10％Glutamax)

VHM-A，其中可将细胞培养1至10天，例如2天

VitroHES

0.1至10％DMSO

VHM-B，其中可将细胞培养1至20天，例如7天

VitroHES

0.2至20％DMSO

MM-A，其中可将细胞培养1至30天，例如20天

WME+SQ(-GA1000)(+1％Glutamax+0.1％PEST)

(由具有专门浓度的hEGF、转铁蛋白、氢化可的松、BSA、抗坏血酸、胰岛素组成)

缩写

AA；激活蛋白A

白蛋白(ALB)

甲胎蛋白(AFP)

定型内胚层(DE)

FBS；胎牛血清

FGF2；成纤维细胞生长因子2

成纤维细胞生长因子(FGF)

叉头盒A2(FOXA2)

肝细胞核因子4，α(HNF4A)

hPSs；人多潜能干细胞

人胚胎干细胞(hESCs)

KO-SR；敲除血清替代物。

定义

如本文中所使用的，"人多潜能干细胞"(hPS)是指能够在适当的条件下产生人类不同细胞类型的后代(所述后代是所有3个生发层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物)的细胞。hPS细胞可具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养物中形成所有3个生发层的可鉴别的细胞的能力。本发明中使用的人多潜能干细胞是，获自已建立的细胞系、人类经诱导的多潜能干(hiPS)细胞或从睾丸分离的人成体生殖细胞的hPS细胞，其中所述已建立的细胞系的获得不涉及人胚胎的使用。

如本文中所使用的，术语"胚泡衍生的干细胞"称为BS细胞，其人类形式称为"hBS细胞"或"hBSC"。本发明中使用的hBS细胞为商购可得的hBS细胞或细胞系，且其获得不涉及人胚胎的使用。

如本文中所使用的，"hiPS细胞"或“hiPSC"是指人类经诱导的多潜能干细胞。

从睾丸分离的人成体生殖细胞(Conrad等人，2008；Kossack等人，2008；Gallicano等人，2009)展示与hESC相似的特征：它们表达多潜能性的标志物OCT3/4、NANOG、SSEA-4、TRA1-81和TRA1-60，显示高端粒酶活性并且可培养超过40代同时维持正常核型。在体外，它们可分化成所有3个生发层的不同类型的体细胞，并且当被移植入免疫缺陷的小鼠时形成畸胎瘤。最近还显示，通过转导干性(stemness)因子，可将体细胞重编程为多潜能细胞，所谓的诱导的多潜能干细胞(iPSC)。首先，已显示，使用逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的转导，在来自小鼠尾尖的成纤维细胞中诱导了多潜能性能力(Takahashi等人，2006)。其他报导显示，4个转录因子OCT4、SOX2、NANOG和LIN28或OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的组合表达足以将人胎儿包皮或成人真皮成纤维细胞重编程为多潜能细胞(Takahashi等人，2007)。这些人iPSC与人胚胎干细胞相似在于它们的形态学特征和基因表达特征。iPSC具有正常核型，表达端粒酶活性，表达表征人ES细胞的细胞表面标志物和基因，并且维持分化成所有3个原始生发层的晚期衍生物的发育潜能(包括当被移植入免疫缺陷的小鼠时的畸胎瘤形成)。

如本文中所使用的，"定型内胚层(DE)"和定型内胚层细胞(DE-细胞)是指，展示例如但不限于对于定型内胚层的细胞是典型的蛋白质或基因表达和/或形态学的细胞，或包含大量的与定型内胚层的细胞相似的细胞的组合物。

如本文中所使用的，"肝先祖"或"肝先祖细胞"是指，展示标志物例如但不限于对于定型内胚层的细胞是典型的蛋白质或基因表达和/或形态学的细胞，或包含大量的与肝先祖细胞相似的细胞的组合物。

如本文中所使用的，"肝细胞样细胞(HCLC)"意欲表示，表达至少某些成熟肝标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、OATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的细胞类型。

如本文中所使用的，术语"组织样3D结构"意欲表示，从多潜能起始材料衍生的体外衍生的3D(3-维)结构。

如本文中所使用的，术语"肝组织样3D结构"意欲表示，与肝器官样组织相似的体外衍生的组织。

如本文中所使用的，饲养细胞意欲表示，单独或组合使用的支持细胞类型。所述细胞类型可以是人或其他物种来源的细胞类型。饲养细胞可源自的组织包括新生儿、青少年或成人组织，并且其还包括从皮肤衍生的组织，包括包皮、脐带、肌肉、肺、上皮、胎盘、输卵管、小腺、间质或乳腺。饲养细胞可从属于由人成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和上皮细胞组成的组的细胞类型衍生而来。可用于衍生饲养细胞的具体细胞类型的实例包括脐带间充质细胞、胎盘成纤维细胞和/或纤维细胞、胎盘内皮细胞。

如本文中所使用的，术语"mEF细胞"或"MEF细胞"意欲表示小鼠胚胎成纤维细胞。

如本文中所使用的，"CYP"意欲表示细胞色素P，更具体地细胞色素P450，肝的主要I期代谢酶包括许多不同的同工酶，例如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP7A1。

如本文中所使用的，术语"ROCK抑制剂"意欲表示Rho-激酶的小分子抑制剂，例如Y-27632或Fasudil。

实施例

实施例1

人包皮成纤维细胞(HFF)的培养

HFF购自典型培养物保藏中心(TypeCultureCollection)(CRL-2429；Manassas，VA，USA)，并且在含有GlutaMax-1(Invitrogen)、10％胎牛血清和10,000U/10,000μg/ml青霉素/链霉素(全部来自Biochrom,Berlin,Germany)的Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)中进行扩增，进行不超过44次群体倍增。利用具有3000拉德的γ辐照灭活细胞，将其以30,000-70,000个HFF/cm²的密度于补充有10ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF)(PeproTec)的VitroHES培养基(VitrolifeAB,Sweden)或含有20％敲除血清替代物、2mMGLutamax-I(全部来自Invitrogen)、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)、50μg/ml庆大霉素(全部来自Biochrom)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)、10ng/mlhrbFGF(PeproTec,London,UK)的敲除DMEM中涂布在0.1％明胶(Sigma-Aldrich)-包被的培养皿上。将未直接使用的受辐照的细胞于含有10％二甲亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich)的胎牛血清(Biochrom)中以等分冷冻，并在-152℃下贮存以待以后使用。

实施例2

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养

将MEF于含有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA和10,000U/10,000μg/ml青霉素/链霉素(全部来自Biochrom)的Dulbecco′sModifiedEagle′sMedium(DMEM)中扩增2代到最多4代。利用具有3000拉德的γ辐照进行灭活，以65,000个细胞/cm²的密度于VitroHES培养基(VitrolifeAB)中接种在0.1％明胶(Sigma-Aldrich)包被的“体外受精”(IVF)培养皿(Falcon，BectonDickinson)中，或于含有10％DMSO(Sigma-Aldrich)的胎牛血清(Biochrom)中以等分冷冻，并在-152℃下贮存以待以后使用。

实施例3

生物反应器

研究中所使用的多区室生物反应器包含3个独立的、但相互交织的中空纤维毛细管膜系统，所述系统被整合入两组分聚氨酯室(PUR，Morton，Bremen，Germany)中。用于培养基灌注的两个亲水毛细管系统由微孔性聚醚砜毛细管膜(其具有约MW500,000的分子量截断值)(mPES，Membrana，Wuppertal，Germany)制成。第三个毛细管系统由疏水性多层中空纤维膜毛细管(MHF，Mitsubishi，Tokyo，Japan)制成，从而使得能够进行气体交换。位于毛细管外的空间的细胞从而暴露于具有高质量交换率的分散的培养基供应和经由扩散的直接膜充氧。为了进行细胞注射，使用喷头(flowhead)和末端开口的硅橡胶毛细管(Silastic，DowCorning，NewYork，USA)(图1A、B和C)。生物反应器被整合到受处理器控制的灌注装置中，所述装置利用可交换多通道喷头和传动装置调控标准泵(modularpump)的压力和流动，从而进行培养基再循环和替换(图2A和C)。加热单元在灌注回路中提供了恒定温度。空气和CO₂的流速通过使用集成的转子流量计(rotameter)手工地控制或通过使用外部自动化CO₂-调控的pH控制系统进行控制(图2)。控制装置通过集成在生物反应器灌注回路内的光学pH传感器连续测量培养基的pH值，并且调整空气/CO₂混合物以维持预设的pH。具有除泡器的灌注管道(示于图2C中)由标准医学级透析PVC(B.Braun，Melsungen，Germany)制成。用环氧乙烷或甲醛气体进行灭菌，然后进行至少7天的除气期。在实验过程中，灌注装置通过集成的USB端口连接至PC，并且使用通过LabVIEW(NationalInstruments，Munich，Germany)产生的独立测量程序连续记录和图解监测灌注参数(压力、温度、泵速)。该程序还提供了使得能够通过互联网远程监测的web服务器(图2C)。

实施例4

生物反应器的条件化

在初始细胞接种之前，通过培养基的再循环使生物反应器经历24-72小时的条件化期。在细胞接种后，以22-30ml/分钟的流速灌注培养物。使生物反应器保持在37℃。使空气/CO₂混合物在气体区室中的流动维持在40ml/分钟。定期测量pH、氧气(pO₂)和二氧化碳(pCO₂)的分压和酸/碱状态(ABL5，RadioMeterCopenhagen，Copenhagen，Denmark)。在手工控制气体的情况下，调整空气/CO₂混合比率以维持7.2至7.3的稳定pH。为了允许在线贮存，存取和分析在整个实验中产生的代谢和灌注数据，开发了数据库。

实施例5

hESC在生物反应器--HepDiff-1和HepDiff-2中的肝分化

进行两个初步生物反应器试验以检查定向肝分化。在一个实验中，在hESC接种前2天，用灭活的MEF接种生物反应器，而另一个实验在不添加饲养细胞的情况下进行(参见表1和表2)。为了诱导hESC的肝分化，基于申请人开发的分化方案，用5种不同的培养基(DiffMed1-5，表2)连续灌注生物反应器。关于培养基的灌注回路的顺序、组成和新鲜培养基的添加速率的概述示于表2中。

实施例6

灌注培养基的代谢参数

通过测量培养基流出物和再循环培养基中的可溶性因子，每天表征生物反应器内细胞的代谢活性和分化。使用自动化临床化学分析仪(RocheDiagnostics,Heidelberg,Germany)测量下列参数：甲胎蛋白(AFP)、碱性磷酸酶(AP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、c-肽、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段19(Cyfra21-1)、促红细胞生成素、雌二醇、滤泡刺激激素(FSH)、因子II-V-X-XIII、血纤蛋白原、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶(LDH)、促黄体激素、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、渗透压、骨钙素、拟胆碱酯酶(PCHE)、前白蛋白孕酮、催乳素、S-100、促甲状腺激素(TSH)、组织型纤溶酶原激活物(TPA)、转铁蛋白。此外，用BioProfile100Plus装置(NovaBiomedical,Waltham,MA,USA)测量谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、乳酸、铵、pH、钠(Na+)、钾(K+)。按照制造商的推荐，用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量激活蛋白A、胰岛素和白蛋白(对于激活蛋白A，使用来自R&DSystems,Wiesbaden-Nordenstadt,Germany的产品DY338,DY999,DY994,DY995；对于胰岛素，使用来自Invitrogen的ELISA；对于白蛋白，使用来自Albuwell,ExocellInc.,Philadelphia,PA,USA的ELISA)。使用比色测定试剂盒(QuantiChrom,BioAssaySystems,Hayward,CA,USA)测量尿素。利用酶促测定法(RocheDiagnostics)测量半乳糖和山梨醇的浓度。

通过将当天的实验废物体积乘以补给培养基中的物质浓度与废物培养基中的物质浓度之差来计算每天每生物反应器的各种物质的生产速率或消耗速率。

实施例7代谢活性

可测试用肝分化方案处理的生物反应器培养物或测试它们分别通过I期细胞色素(CYP)P450酶CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4代谢非那西丁、双氯酚酸和咪达唑仑的能力。在接种细胞后的第40天和47天，按照下列方案进行CYPP450活性测试：

CYP1A2：非那西汀-＞对乙酰氨基酚

CYP2C9：双氯酚酸-＞4′OH双氯芬酸

CYP3A4：咪达唑仑-＞1′OH咪达唑仑。

为此目的，关闭新鲜培养基流入和培养基流出，将测试物质的混合物注射入再循环培养基，以在测试开始时获得下列浓度：3μM咪达唑仑、9μM双氯酚酸和26μM非那西丁。在接下来的24小时中，以再循环模式(不加入新鲜培养基并且只有培养基再循环泵再循环培养基)运行生物反应器。在开始实验前和在1、4、8和24小时后获取来自再循环的样品，利用液相色谱/质谱(LC/MS)就测试物质的代谢产物分析所述样品。在AstrazenecaAB，Gothenburg，Sweden进行分析。在获取最后一个样品后，以单通过模式(singlepassmode)用2倍的生物反应器和管道系统的体积的新鲜培养基冲洗生物反应器，随后转换至正常灌注模式(用新鲜培养基流入再循环)。

实施例8

从生物反应器获取样品

在预定培养期结束时，关闭生物反应器，分离管道。打开生物反应器底部盖子，使用无菌解剖刀和摄子切下细胞团的样品(包括毛细管层)以用于进一步分析。为了进行组织学分析，如下所述将样品直接固定和包埋。为了进行畸胎瘤测试、FACS和RNA分析，将细胞与毛细管分离，通过用PBSw/oCaMg清洗且于0.05％-0.02％胰蛋白酶-EDTA溶液(Biochrom)中温育3分钟来解离。通过加入含有10％胎牛血清(Biochrom)的DMEM终止胰蛋白酶酶解作用。使用100μm细胞粗滤器(Falcon，BectonDickinson，Heidelberg)通过筛分来实现毛细管与细胞溶液的分离。

实施例9

RNA的分离

为了从生物反应器中培养的细胞/组织分离RNA，用PBSw/oCaMg清洗切下的毛细管，然后于0.05％-0.02胰蛋白酶-EDTA溶液(Biochrom)中温育3分钟。按照制造商的方案，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)分离总RNA。使用TissueLyserII破坏畸胎瘤，然后用QIAshredder(两者都来自Quiagen)进行匀浆。通过将裂解缓冲液直接加入细胞沉淀来裂解单个细胞。使用Nanodrop分光光度计(ThermoFischerScientific)和利用Bioanalyser(Agilent2100Bioanalyser)或通过非变性琼脂糖凝胶电泳来测定分离的RNA的浓度和质量。

实施例10

阵列杂交

使用IlluminaTotalPrepRNAAmplification试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)，利用300ng的经质量检查的总RNA作为输入来产生生物素标记的cRNA。在BeadStation500(Illumina，SanDiego，USA)平台上，使用由制造商提供的试剂并且按照由制造商提供的方案进行芯片杂交、洗涤、Cy3-链霉抗生物素(AmershamBiosciences)染色和扫描。在Illuminahuman-8v2BeadChip(其具有约24,000个RefSeq转录物(Kuhn等人，2004))上杂交cRNA样品。

实施例11

数据分析

使用BeadStudioV3软件(Illumina)产生所有样品的Quantil标准化的和非标准化的原始数据文件。通过将用BeadStudio软件产生的数据输入微阵列数据分析工具MultiExperimentViewer(MeV)(微阵列分析工具的TM4套件的组件)(http://www.tm4.org)(Saeed等人，2003)或Chipster(http://chipster.sourceforge.net/)(其为使用Bioconductor(Gentleman等人，2004)作为其分析后端的图形界面)来进行进一步的数据分析。使用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)(Dennis等人，2003)进行功能富集分析。

实施例12

组织化学

将石蜡包埋的样品固定于4％经缓冲的甲醛溶液中，包埋在石蜡中，然后切成5μm的切片。用二甲苯使切片脱蜡，用递减的醇系列进行再水化，然后进行苏木精和伊红(H&E)染色。

实施例13

免疫组织学

将石蜡包埋的样品固定于4％经缓冲的甲醛溶液中，包埋在石蜡中，然后切成5μm的切片。用二甲苯使切片脱蜡，用递减的醇系列再水化。通过在高压锅中于柠檬酸盐缓冲液(0.01柠檬酸一水合物，pH至6.0；Merck，Darmstadt，Germany)中煮切片25分钟，然后在5％Triton/PBS中温育20分钟来拯救抗原。用5％脱脂牛奶封闭切片；用一抗温育它们30分钟，用PBS洗涤，然后用缀合有荧光的二抗温育。使用下列一抗：单克隆小鼠抗人平滑肌肌动蛋白IgG2a(ASMA)、单克隆小鼠抗人结蛋白IgG1(Dako，Glostrup，Denmark)、单克隆小鼠抗神经元特异性β-III-微管蛋白IgG2a(R&DSystems)、单克隆小鼠抗巢蛋白IgG1(BectonDickinson)、多克隆山羊抗HNF-3βIgG、单克隆小鼠抗OCT-4IgG2b和多克隆兔抗波形蛋白IgG(SantaCruzBiotechnology)。使用下列多克隆抗体作为二抗：山羊抗小鼠IgG-Cy2、山羊抗兔IgG-Cy3(Dianova)、山羊抗小鼠IgG2a-TRICT、山羊抗小鼠IgG-FITC、山羊抗小鼠IgG-FITC、山羊抗小鼠IgG-Cy3、山羊抗小鼠IgG-FITC(JacksonImmunoresearchLaboratories，WestGrove，PA)和驴抗山羊IgG-Cy3(SantaCruzBiotechnology)。关于细胞核的非特异性染色，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，MolecularProbes，Leiden，Germany)温育切片。

随后，用AquaPolymount溶液(PolysciencesInc.，Warrington，PA，USA)封片。使用配备有CCD-照相机(Retiga2000R，QImaging，Burnaby，Canada)的倒置显微镜(Axiovert200M，CarlZeiss，Germany)分析切片。获取照片，使用数字成像软件″ImageProPlus″(MediaCybernetics，SilverSpring，USA)进行处理。

实施例14

透射电子显微镜检查(TEM)

用5％戊二醛(Serva，Heidelberg，Germany)固定来自生物反应器细胞区室的材料。在于60mmol/l磷酸盐缓冲液，pH7.3中浸渍30分钟后，将细胞聚集体于2％OsO₄(Paesel+Lorei，Frankfurt，Germany)中后固定2小时，在乙醇中逐渐脱水，随后包埋在阿拉地胶(Serva，Heidelberg，Germany)中。在电子显微镜检查之前，用醋酸双氧铀和Reynold′s柠檬酸铅(Chroma，Münster，Germany)增强超薄切片的反差。

实施例15

hESC在生物反应器中的改善的肝分化

基于实施例5中描述的初步肝分化试验的结果，进行另外的试验以进一步检查定向肝分化。

在一个实验中，根据本文中描述的分化方案，无饲养细胞培养的hESC在生物反应器外的2D培养物中分化成DE。该至DE(朝向肝细胞)的第一分化步骤诱导了大量细胞死亡。通过在生物反应器外进行该步骤，避免在反应器中产生大量细胞碎片。

此外，在2D中进行第一分化步骤允许更纯地选择定型内胚层细胞，从而导致总体上更纯的培养物，培养物中具有显著量的定型内胚层细胞。

在分化成DE后，将细胞转移至生物反应器，或作为对照，保持在2D中。为了诱导定型内胚层细胞的进一步肝分化，基于由Cellartis开发的分化方案，用不同培养基连续灌注生物反应器。关于培养基灌注回路的顺序、组成和新鲜培养基添加速率的实例的概述示于表2中。

实施例16

利用生物反应器系统产生条件化的培养基以用于培养未分化的hESC

本文中论述的生物反应器实验还显示，灭活的HFF的存在延迟hESC分化的起始，直至HFF丧失它们的活性。HFF的支持多潜能性的活性可与它们的激活蛋白A产生相关。为了进一步检查HFF饲养细胞的行为，在2D培养物和两个生物反应器中进行只使用HFF的几个实验。

在一个实验中，用活性HFF接种生物反应器，将所述活性HFF培养在补充有血清和bFGF的培养基中以刺激HFF增殖。利用葡萄糖消耗和乳酸产生的水平监测细胞数量的增加。当达到足够的细胞数量时，将培养基更换成hBS培养基以进行条件化。必需确定最佳培养基交换速率，例如将条件化的培养基中的激活蛋白A和葡萄糖的浓度测量为质量控制参数。低葡萄糖水平可能表示需要增加培养基补给速率，低激活蛋白A水平可能表示不充分的条件化，其不适合于促进hESC多潜能性。

来自2D和3D实验的结果显示，激活蛋白A的产生受与包含血清替代物的培养基组合的bFGF刺激。在补充有血清的培养基中，bFGF不刺激激活蛋白A的产生，而展示对活性HFF的强促有丝分裂效应。该效应也在生物反应器实验HFF-1(其特征在于，在添加bFGF至培养基后，葡萄糖和乳酸代谢的水平升高)中观察到。该促有丝分裂效应未在使用补充有血清替代物的培养基的生物反应器实验HFF-2中观察到。在该实验中，葡萄糖和乳酸代谢保持在恒定水平上，这显示细胞未增殖。这些结果显示，生物反应器技术的可能应用可以是，未分化的hESC的无饲养细胞增殖所需的条件化培养基的产生。

用于产生条件化培养基(CM)的标准方法是，将培养基在标准培养容器中温育24小时，所述标准培养容器以高密度接种灭活的MEF饲养细胞。该方法是劳动密集型的和耗费空间的，因为必须产生大量的饲养细胞，所述饲养细胞在丧失它们的活性前只能在有限量的时间内用于培养基条件化。因此，更大量的CM的产生受到该方法的较差的可扩缩性限制。用CM来培养hBS细胞的备选方法是，使用成分确定的培养基。已描述了几种用于hESC的无饲养细胞培养的成分确定的培养基制剂(Li等人，2005；Ludwig等人，2006)。虽然成分确定的培养基的使用具有几个有利方面，如能够在完全不含动物来源的物质的条件下培养hBS细胞，但其主要不利方面是，这些培养基制剂包含显著量的昂贵的补充剂，如重组细胞因子和生长因子。

在生物反应器中培养HFF以产生CM可以是在上文背景部分中综述的目前可获得的方法的另外的选择。

其使得能够在可扩缩的系统中实现高细胞密度的人饲养细胞，所述系统允许自动化控制培养参数和培养基流入物和流出物的确定的速率。因此，条件化方法的标准化将是可能的，这导致与手工方法相比较，所产生的CM质量提高。当使用生物反应器时，一个其他的有利方面可以是，能够使用活性饲养细胞，因为已显示，活性饲养细胞也支持多潜能性的维持(Xie等人，2005)。这可减少必须在常规2D培养物中产生的、用于初始接种生物反应器的活性饲养细胞的数目。

实施例17肝成熟的评估

通过测量基因表达、蛋白质表达以及细胞色素P450(CYP)活性的活性测量来分析衍生的肝细胞的成熟程度。

利用Q-PCR和LDA卡进行肝细胞样细胞的基因表达分析

利用QPCR就肝相关基因的表达分析在生物反应器中分化的肝细胞样细胞的样品和足够的对照(2D分化的肝细胞样细胞或来自成人肝的原代肝细胞)。

在下表中所列的LDA微流体卡(microfluiditycard)上表征DE-Hep细胞的基因表达。将来源于样品的总RNA的cDNA与LDA卡杂交，以PCR设置运行实验，并且使用适当的软件进行进一步的分析。按照说明书(AppliedBiosystems7900HTMicroFluidicCardGettingStartedGuide)和下列缩短的方案，在LDA卡上于重复的实验中运行所有样品，并平行地进行足够的对照：

从总RNA制备cDNA，将其稀释在无RNA酶/DNA酶的水中，以达到适当的浓度(参见下文)。混合下列成分：cDNA(1-100ng)，5μl，无RNA酶/DNA酶的水，TaqManUniversalPCR，45μl，Mastermix(2X)，50μl，总共：100μl。然后将样品装载至LDA卡上(各样品混合物为100ul以及170ngcDNA/样品)，离心，随后密封LDA卡。最后，按照手册中的说明，将卡在ABI7900HT实时PCR系统上运行，并通过使用SDS

2.2.1软件和相关定量方法分析结果。

实施例18

肝分化

基于由Cellartis针对在2D标准培养皿中培养的hESC建立的肝分化方案，设计并实施关于hESC在3D生物反应器系统中的定向肝分化的两个预实验。两个生物反应器实验的差异仅在于，将灭活的MEF额外接种在一个生物反应器中。

灌注培养基的代谢参数

两个生物反应器在于培养基中测量的代谢参数方面的比较显示，接种额外的饲养细胞的生物反应器(HepDiff-2)最初在葡萄糖和乳酸代谢方面以及在分化标志物的产生方面具有高得多的细胞活性。然而，在生物反应器HepDiff-2中，在实验过程中观察到葡萄糖消耗和乳酸产生的稳定减少(图4)。在第20天的LDH的峰值据推测是由于灌注系统的加热单元的技术故障而导致。第40天后LDH释放的峰值据推测与生物反应器中的压力建立相关。由于观察到不明培养基成分的沉淀(这可导致毛细管膜凝块)，这可导致细胞的营养物供给欠佳。AFP在该生物反应器中的产量在第17至24天指数增加，随后下降直至实验结束。AFP产量的下调的开始与更换为另一种分化培养基相关。肝分化标志物尿素在第1至20天之间在其产量上显示小的峰值，白蛋白产量在整个实验过程中保持在约0.4μg/小时的相对低的水平上(图5)。

在其中未接种额外的MEF的生物反应器HepDiff-1中，测量到非常低但稳定的葡萄糖消耗和乳酸产生的水平。只有分化因子AFP在第17至35天之间显示小的峰值，在第26天达到最大值，这与生物反应器HepDiff-2中的AFP的时间过程(但非量级)相似(图5)。

除了在上述因子外，测量培养基中的激活蛋白A和胰岛素的浓度，以就分化培养基的交换动力学评估所使用的灌注条件(图6)。这两个因子在诱导未分化的hESC朝向定型内胚层分化中起着重要作用，然而胰岛素通过高激活蛋白A浓度拮抗内胚层诱导。在两个生物反应器中，培养基中的激活蛋白A浓度在第7至8天之间具有26ng/ml的最大值。胰岛素浓度(仅在生物反应器HepDiff-2中在第0至22天测量到)在第3天显示150ng/ml的最大值，并且直至第9天快速减少至2ng/ml，在第7至8天之间具有约35ng/ml的中间浓度。

CYP450活性

为了测试生物反应器中的肝细胞特异性细胞活性，测试了分别通过I期细胞色素P450酶CYP1A2/1A2、CYP2C9和CYP3A4代谢非那西丁、双氯酚酸和咪达唑仑的能力。

在hESC接种后第40天和47天进行所述测试。在两个生物反应器中，未检测到双氯酚酸和咪达唑仑的代谢。与反应器HepDiff-1相比较，非那西丁至对乙酰氨基酚的代谢在生物反应器HepDiff-2中更高，并且在第47天仅轻微下降。

组织学

如上所述，两个生物反应器在实验结束时都展示非常低的代谢活性。该观察结果与下述事实相关：在组织学分析中，在生物反应器HepDiff-2中，只有非常少的区域包含组织结构，并且在生物反应器HepDiff-1的样品中，根本未能发现结构。在生物反应器HepDiff-2中观察到的组织簇中，可观察到许多具有不同上皮形态学的结构，这表示明确的内皮分化。此外，发现了具有疏松结缔组织的区域和包含具有低质核比的细胞的少量细胞聚集体。

实施例19

生物反应器中hESC至肝细胞的分化和成熟

平行地进行的第一轮生物反应器试验：BR2和BR3

在实施例18中描述的方案的基础上，进行几个另外的实验来精细化hESC在生物反应器环境中定向分化至肝细胞的过程，还关注这些细胞类型的改善的成熟。这些实验详述于表3和4(生物反应器BR2和BR3)中，所述表描述了下列总体过程：使用激活蛋白A和高生长因子水平起始hESC至DE细胞的分化，在给定的时间点(对于表3中显示的实验，第12天；对于表4中显示的实验，第7或11天)上将细胞接种在生物反应器中，以及允许发生进一步的分化和成熟。利用2D非-生物反应器对照平行地进行该过程，并且对于两个实验，在于第25或26天关闭生物反应器之前，在指定的时间点上测量CYP450的水平。

在初始实验运行期间，测量4组标志物的表达(肝基因、胎儿/未成熟的肝细胞的标志物、转运蛋白和未分化的细胞的标志物)，测量时间点包括第0天、接种当天和生物反应器关闭当天(对于在生物反应器环境中生长的细胞)以及平行的关闭当天的测量(对于2D对照组)(用于在第12天接种且在第24天收获的细胞，示于图7-10中)。如实施例9-11和17中所述，测量基因表达水平。

平行地进行的第二轮生物反应器试验：BR121和BR168

随后，将两个分开的生物反应器的结果相比较，以确保一致性和可重现性。在2个不同的时间点(第7天和第12天)将细胞接种在生物反应器BR121或B168中，且如下使其成熟直至第26天(图11，A-D)：

在第0天，在实验开始时，通过胰蛋白酶消化选择200x10⁶个未分化的人胚胎干细胞DEFSA121用于传代，且以200000个细胞/cm²于补充有10uMRock抑制剂的ID1中将其接种在基质胶包被的培养瓶中。按照上述方案，每天或每2天更换培养基直至第7天。在诱导内胚层后，在第7天，通过胰蛋白酶消化选择细胞并且进行计数，总共6000万个细胞。将3000万个细胞用于BR121，3000万个细胞用于BR168。

BR121：

在第7天，将2500万个细胞于补充有10uMRock抑制剂的P1中接种在BR121中，并且按照上述方案进行培养，直至第26天实验结束。将500万个细胞以150000个细胞/cm²于补充有10uMRock抑制剂的P1中接种在基质胶包被的48孔中，用作2D对照，并且按照上述方案进行培养，直至第26天实验结束。

BR168：

在第7天，将3000万个细胞于补充有10uMRock抑制剂的P1中接种在2D培养瓶中，并且按照上述方案进行培养。5天后，在第12天，通过胰蛋白酶消化选择细胞并且进行计数，总共7200万个细胞。

将6200万个细胞于补充有10uMRock抑制剂的VH2中接种在BR168中，并且按照上述方案进行培养，直至第26天实验结束。

将700万个细胞以200000个细胞/cm²于补充有10uMRock抑制剂的VH2中接种在基质胶包被的48孔中，用作2D对照，并且按照上述方案进行培养，直至第26天实验结束。

所分析的标志物都是肝标志物，并且将水平与2D对照相比较。培养基组成描述于表6中。

实施例20

动态灌注技术的其他方面是，可容易地在一个灌注回路中实施“成对生物反应器(twinbioreactors)”的组合，其中第一生物反应器的因子或可溶性介质可刺激第二生物反应器，同时细胞保持被区分。如果将使用共培养物的未知的可溶性因子，但又必须避免培养物之间的细胞转移的话，这将是有益的。

附图概述

表1.表1列出了实施的实验Hepdiff1和Hepdiff2以及它们的实验条件。

表2.用于在生物反应器中诱导hESC的肝分化的培养基的顺序和组成的概述。

表3.生物反应器BR1中hESC至肝细胞的成熟；Jellyfish2ml生物反应器，流速2ml/h＝50ml/天/BR＝100ml/天。细胞：SA121DEF，在祖细胞期12接种。粉红色期：DE(定型内胚层)的诱导，绿色期：祖细胞期(小的肝细胞样细胞)，蓝色期：成熟

表4.生物反应器BR2和BR3中hESC至肝细胞的成熟；Jellyfish2ml生物反应器，流速2ml/h＝50ml/天/BR＝100ml/天。细胞：SA121DEF，在第7天(DE期)和祖细胞期(第12天)接种。粉红色期：DE(定型内胚层)的诱导，绿色期：祖细胞期(小的肝细胞样细胞)，蓝色期：成熟

表5.生物反应器BR121和BR168中hESC至肝细胞的成熟；Jellyfish2ml生物反应器，流速2ml/h＝50ml/天/BR＝100ml/天。细胞：SA121DEF，在祖细胞期12接种。粉红色期：DE(定型内胚层)的诱导，绿色期：祖细胞期(小的肝细胞样细胞)，蓝色期：成熟

表6.用于实施例19的培养基和温育时间的图示。

图1.生物反应器的设计。A)具有用于培养基灌注(蓝色，II；红色，IV)、充氧(黄色，III)和细胞调节(I)的独立区室的最小毛细管膜单位；B)构成这些区室的毛细管膜束；C)细胞区室内的毛细管/区室的3D排列；可如B中所示分别灌注区室，从而实现了毛细管单位之间物质梯度间隔的减小，且促进了物质交换。细胞区室内，所有膜区室彼此交织，以平均500μm的毛细管间距离形成紧密的毛细管网络(C)。每个区室的毛细管分别集束成流入喷头(inflowhead)和流出喷头(outflowhead)，与用于灌注的管系统(B)连接。通过末端开口的管将细胞接种入细胞区室，所述管允许注射的细胞在细胞区室内分配(B，d；以灰色显示)。

图2.灌注系统。A)受处理器控制的灌注装置，具有用于调节压力和流动的标准泵，用于培养基再循环和替换的可交换多通道喷头和传动装置，以及外部自动化CO₂-调整的pH控制系统(在左边)。B)连续记录和图解监测压力、温度、泵速、pH和气流的用户监测软件。C)用于给生物反应器灌注培养基和气体的管道系统的示意图。

图3.在3个分开的培养皿中显示的分化的hESC的2D培养物中的β-HGC浓度。培养皿1由在培养的第30天最低的曲线表示，培养皿2由在培养的30天处于中间的曲线表示，培养皿3由在培养的第30天最高的曲线表示。

图4.在生物反应器hESC-1、-2和-3的培养基流出物中测量的代谢参数的时间过程。生物反应器HepDiff-2(a)和HepDiff-1(b)中的细胞的葡萄糖消耗(绿色，在测量开始时处于最低的曲线)、乳酸产生(红色，在测量开始时处于中间的曲线)和LHD释放(蓝色，在测量开始时处于最高的曲线)。

图5.在生物反应器HepDiff-1和-2的培养基流出物中测量的分化标志物的时间过程。生物反应器HepDiff-1(a)和HepDiff-2(b)中的细胞的AFP产量(深蓝色，在第50天处于中间的曲线)、白蛋白产量(深绿色，在第50天处于最高的曲线)和尿素产量(粉红色，在第50天处于最低的曲线)。

图6.在生物反应器HepDiff-1和-2中在培养基中测量的激活蛋白A和胰岛素的浓度和细胞色素活性测量的时间过程。(a)激活蛋白A的浓度(粉红色，点线和实线，在第20天处于最高的曲线)，胰岛素的浓度(蓝绿色，在第20天处于最低的曲线)。

图7.在分化期间表达的和在几个时间点(第0天，第12天，生物反应器第26天，2D对照第26天)上监测的肝标志物基因(白蛋白、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、CYP7A1、TAT和UGT2B7)的直方图。

图8.在分化期间表达的和在几个时间点(第0天，第12天，生物反应器第26天，2D对照第26天)上监测的胎儿/未成熟的肝细胞的标志物(AFP，CYP3A7)的直方图。

图9.在分化期间表达的和在几个时间点(第0天，第12天，生物反应器第26天，2D对照第26天)上监测的肝转运蛋白基因(ABCC2/MRP2、FABP1、OATP2、OCT-1)的直方图。

图10.在分化期间表达的和在几个时间点(第0天，第12天，生物反应器第26天，2D对照第26天)上监测的未分化的细胞的标志物基因(Nanog、Oct4)的直方图。

图11.显示在不同的时间点上被接种至两个不同的生物反应器(121或168)中的细胞的肝基因表达特征谱的4个直方图(A-D)。具有等于1的值的参照样品代表通过2D培养获得的细胞的基因表达。

图12.显示细胞在生物反应器BR121和BR168中的分化和成熟期间未分化的细胞的标志物(Oct4和NANOG)的下调的直方图。具有等于1的值的参照样品代表通过2D培养获得的细胞的基因表达。

参考资料：

Bar，H.，S.V.Strelkov，G.Sjoberg，U.AebiandH.Herrmann(2004).″Thebiologyof

desminfilaments：howdomutationsaffecttheirstructure，assembly，andorganisation？″J

StructBiol148(2)：137-52.

Cai，J.，Y.Zhao，Y.Liu，F.Ye，Z.Song，H.Qin，S.Meng，Y.Chen，R.Zhou，X.Song，Y.

Guo，M.

Chen，Y.G.，Q.Wang，S.L.Lin，C.D.Chang，J.ChuangandS.Y.Ying(2006).″Activin

signalinganditsroleinregulationofcellproliferation，apoptosis，andcarcinogenesis.″

ExpBiolMed(Maywood)231(5)：534-44.

Conrad，S.，M.Renninger，J.Hennenlotter，T.Wiesner，L.Just，M.Bonin，W.Aicher，H.J.

Buhring，U.Mattheus，A.Mack，H.J.Wagner，S.Minger，M.Matzkies，M.Reppel，J.

Hescheler，K.D.Sievert，A.StenzlandT.Skutella(2008).″Generationofpluripotent

stemcellsfromadulthumantestis.″Nature456(7220)：344-9.

Davie，J.R.(2003).″InhibitionofHistoneDeacetylaseActivitybyButyrate.″J.Nutr.

133(7)：2485S-2493-2485S-2493.

Dennis，G.，Jr.，B.T.Sherman，D.A.Hosack，J.Yang，W.Gao，H.C.LaneandR.A.

Lempicki(2003).″DAVID：DatabaseforAnnotation，Visualization，andIntegrated

Discovery.″GenomeBiol4(5)：P3.

DingandH.Deng(2007).″Directeddifferentiationofhumanembryonicstemcellsinto

functionalhepaticcells.″Hepatology45(5)：1229-39.

EldorandJ.A.Thomson(2000).″Clonallyderivedhumanembryonicstemcelllines

maintainpluripotencyandproliferativepotentialforprolongedperiodsofculture.″Dev

Biol227(2)：271-278.

Evans，M.J.andM.H.Kaufman(1981).″Establishmentincultureofpluripotentialcells

frommouseembryos.″Nature292(5819)：154-6.

Gallicano，G.I.，N.Golestaneh，M.Kokkinaki，D.Pant，J.Jiang，D.Destefano，C.

Fernandez-Bueno，J.D.Rome，B.R.HaddadandM.Dym(2009).″PluripotentStemCells

DerivedfromAdultHumanTestes.″StemCellsDev.

Gentleman，R.C.，V.J.Carey，D.M.Bates，B.Bolstad，M.Dettling，S.Dudoit，B.Ellis，L.

Gautier，Y.Ge，J.Gentry，K.Hornik，T.Hothorn，W.Huber，S.Iacus，R.Irizarry，F.

Leisch，C.Li，M.Maechler，A.J.Rossini，G.Sawitzki，C.Smith，G.Smyth，L.Tierney，J.

Y.H.YangandJ.Zhang(2004).″Bioconductor：opensoftwaredevelopmentfor

computationalbiologyandbioinformatics.″GenomeBiology5(10)：R80-R80.

Gerecht-Nir，S.，S.CohenandJ.Itskovitz-Eldor(2004).″Bioreactorcultivationenhances

theefficiencyofhumanembryoidbody(hEB)formationanddifferentiation.″Biotechnol

Bioeng86(5)：493-502.

Gerlach，J.C.，J.Encke，O.Hole，C.M_Iler，C.J.RyanandP.Neuhaus(1994).

″Bioreactorforalargerscalehepatocyteinvitroperfusion.″Transplantation58(9)：984-8.

Gerlach，J.C.，K.Mutig，I.M.Sauer，P.Schrade，E.Efimova，T.Mieder，G.Naumann，A.

Hay，D.C.，D.Zhao，J.Fletcher，Z.A.Hewitt，D.McLean，A.Urruticoechea-Uriguen，J.R.

Black，C.Elcombe，J.A.Ross，R.WolfandW.Cui(2008).″Efficientdifferentiationof

hepatocytesfromhumanembryonicstemcellsexhibitingmarkersrecapitulatingliver

developmentinvivo.″StemCells26(4)：894-902.

Hay，D.C.，D.Zhao，A.Ross，R.Mandalam，J.LebkowskiandW.Cui(2007).″Direct

differentiationofhumanembryonicstemcellstohepatocyte-likecellsexhibiting

functionalactivities.″CloningStemCells9(1)：51-62.

Heng，B.C.，H.Yu，Y.Yin，S.G.LimandT.Cao(2005).″Factorsinfluencingstemcell

differentiationintothehepaticlineageinvitro.″JGastroenterolHepatol20(7)：975-87.

Hines，R.N.andD.G.McCarver(2002).″Theontogenyofhumandrug-metabolizing

enzymes：phaseloxidativeenzymes.″JPharmacolExpTher300(2)：355-60.

Itskovitz-Eldor，J.，M.Schuldiner，D.Karsenti，A.Eden，O.Yanuka，M.Amni，H.Soreqand

N.Benvenisty(2000)，″Differentiationofhumanembryonicstemcellsintoembryoidbodies

compromisingthethreeembryonicgermlayers.″MolecularMedicine6(2)：88？95-88？95.

Jensen，J.，J.HyllnerandP.Bjorquist(2009).″Humanembryonicstemcelltechnologies

anddrugdiscovery.″JCellPhysiol219(3)：513-9.

Kossack，N.，J.Meneses，S.Shefi，H.N.Nguyen，S.Chavez，C.Nicholas，J.Gromoll，P.

J.TurekandR.A.Reijo-Pera(2008).″IsolationandCharacterizationofPluripotent

Human

SpermatogonialStemCell-DerivedCells.″StemCells.

Kubo，A.，K.Shinozak，J.M.Shannon，V.Kouskoff，M.Kennedy，S.Woo，H.J.Fehling

andG.Keller(2004).″Developmentofdefinitiveendodermfromembryonicstemcellsin

culture.″Development131(7)：1651-1662.

Kuhn，K.，S.C.Baker，E.Chudin，M.H.Lieu，S.Oeser，H.Bennett，P.Rigault，D.Barker，

T.K.McDanielandM.S.Chee(2004).″Anovel，high-performancerandomarrayplatform

for

quantitativegeneexpressionprofiling.″GenomeRes14(11)：2347-56.

Lavon，N.，O.YanukaandN.Benvenisty(2004).″Differentiationandisolationofhepatic-

likecellsfromhumanembryonicstemcells.″Differentiation72(5)：230-8.

Levenberg，S.，N.F.Huang，E.Lavik，A.B.Rogers，J.Itskovitz-EldorandR.Langer

(2003).″Differentiationofhumanembryonicstemcellsonthree-dimensionalpolymer

scaffolds.″ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesof

America100(22)：12741-6.

Li，Y.，D.A.Kniss，L.C.LaskyandS.-T.Yang(2003).″Culturinganddifferentiationof

murineembryonicstemcellsinathree-dimensionalfibrousmatrix.″Cytotechnology41(1)：

23-35.

Li，Y.，S.Powell，E.Brunette，J.LebkowskiandR.Mandalam(2005).″Expansionof

human

embryonicstemcellsindefinedserum-freemediumdevoidofanimal-derivedproducts.″

Biotechnol.Bioeng.91(6)：688-698.

Ludwig，T.E.，M.E.Levenstein，J.M.Jones，W.T.Berggren，E.R.Mitchen，J.L.Frane，

L.J.Crandall，C.A.Daigh，K.R.Conard，M.S.Piekarczyk，R.A.LlanasandJ.A.

Thomson(2006).″Derivationofhumanembryonicstemcellsindefinedconditions.″Nat.

Biotechnol.24(2)：185-187.

Pera，M.F.andA.O.Trounson(2004).″Humanembryonicstemcells：prospectsfor

development.″Development131(22)：5515-25.

Przyborski，S.A.(2005).″Differentiationofhumanembryonicstemcellsafter

transplantationinimmune-deficientmice.″StemCells23(9)：1242-50.

Rambhatla，L.，C.P.Chiu，P.Kundu，Y.PengandM.K.Carpentrr(2003).″Generationof

hepatocyte-likecellsfromhumanembryonicstemcells.″CellTransplant12(1)：1-11.

Rao，M.(2004).″Conservedanddivergentpathsthatregulateself-renewalinmouseand

humanembryonicstemcells.″DevBiol275(2)：269-86.

Saeed，A.I.，V.Sharov，J.White，J.Li，W.Liang，N.Bhagabati，J.Braisted，M.Klapa，T.

Currier，M.Thiagarajan，A.Sturn，M.Snuffin，A.Rezantsev，D.Popov，A.Ryltsov，E.

Kostukovich，I.Borisovsky，Z.Liu，A.Vinsavich，V.TrushandJ.Quackenbush(2003).

″TM4：afree，open-sourcesystemformicroarraydatamanagementandanalysis.″

BioTechniques34(2)：374-8.

Sartipy，P.，P.Bjorquist，R.StrehlandJ.Hyllner(2007).″Theapplicationofhuman

embryonicstemcelltechnologiestodrugdiscovery.″DrugDiscovToday12(17-18)：688-

99.

Sauer，I.M.，K.Zeilinger，G.Pless，D.Kardassis，T.Theruvath，A.Pascher，M.Goetz，P.

NeuhausandJ.C.Gerlach(2003).″Extracorporealliversupportbasedonprimary

humanlivercellsandalbumindialysis--treatmentofapatientwithprimarygraft

nonfunction.″JHepatol39(4)：649-53.

Schuldiner，M.，O.Yanuka，J.ltskovitz-Eldor，D.A.MeltonandN.Benvenisty(2000).

″Effectsofeightgrowthfactorsonthedifferentiationofcellsderivedfromhuman

embryonicstemcells.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(21)：11307-11312.

Shih，C.C.，Y.Weng，A.Mamelak，T.LeBon，M.C.HuandS.J.Forman(2001).

″ldentificationofacandidatehumanneurohematopoieticstem-cellpopulation.″Blood

98(8)：2412-22.

Snykers，S.，J.DeKock，V.RogiersandT.Vanhaecke(2008).″Invitrodifferentiationof

embryonicandadultstemcellsintohepatocytes：stateoftheart.″StemCells：

stemcells.2008-0963-stemcells.2008-0963.

Soto-Gutierrez，A.，N.Navarro-Alvarez，J.D.Rivas-Carrillo，Y.Chen，T.Yamatsuji，N.

TanakaandN.Kobayashi(2006).″Differentiationofhumanembryonicstemcellsto

hepatocytesusingdeletedvariantofHGFandpoly-amino-urethane-coatednonwoven

polytetrafluoroethylenefabric.″CellTransplant15(4)：335-41.

Takahashi，K.，K.Tanabe，M.Ohnuki，M.Narita，T.Ichisaka，K.TomodaandS.

Yamanaka

(2007).″Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefined

factors.″Cell131(5)：861-72.

Takahashi，K.andS.Yamanaka(2006).″Inductionofpluripotentstemcellsfrommouse

embryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.″Cell126(4)：663-76.

Thomson，J.A.，J.Kalishman，T.G.Golos，M.Durning，C.P.Harris，R.A.BeckerandJ.

P.

Hearn(1995).″Isolationofaprimateembryonicstemcellline.″Proceedingsofthe

NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica92(17)：7844-8.

Wang，L.，T.C.Schulz，E.S.Sherrer，D.S.Dauphin，S.Shin，A.M.Nelson，C.B.Ware，

M.Zhan，C.Z.Song，X.Chen，S.N.Brimble，A.McLean，M.J.Galeano，E.W.Uhl，K.A.

D′Amour，J.D.Chesnut，M.S.Rao，C.A.BlauandA.J.Robins(2007).″Self-renewalof

humanembryonicstemcellsrequiresinsulin-likegrowthfactor-1receptorandERBB2

receptorsignaling.″Blood110(12)：4111-9.

Xie，C.Q.，G.Lin，D.Yuan，J.Wang，T.C.LiuandG.X.Lu(2005).″Proliferativefeeder

cellssupportprolongedexpansionofhumanembryonicstemcells.″CellBiolInt29(8)：

623-8.

Xie，J.，S.M.Willerth，X.Li，M.R.Macewan，A.Rader，S.E.Sakiyama-ElbertandY.Xia

(2009).″Thedifferentiationofembryonicstemcellsseededonelectrospunnanofibersinto

neurallineages.″Biomaterials30(3)：354-362.

Claims (10)

1.用于将hPS细胞分化成肝细胞样细胞的方法，所述方法包括

i)在2D环境中使hPS细胞朝向定型内胚层(DE)细胞分化；

ii)在生物反应器中接种初步分化的DE细胞；和

iii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞，

其中所述生物反应器是提供有膜区室的中空纤维毛细管生物反应器，所述膜区室包括两个或更多个毛细管系统以及一个或多个中空纤维膜，

其中所述hPS细胞是获自已建立的细胞系、人类经诱导的多潜能干(hiPS)细胞或从睾丸分离的人成体生殖细胞的hPS细胞，并且

其中所述已建立的细胞系的获得不涉及人胚胎的使用。

2.权利要求1的方法，其中所述肝细胞样细胞以包含肝细胞样细胞的肝组织样3D结构的形式存在。

3.权利要求1的方法，其中所述生物反应器包括用于灌注培养基通过毛细管系统的工具和用于在毛细管系统中进行气体交换的工具。

4.权利要求1的方法，其中生长培养基的灌注通过毛细管系统发生，并且气体交换通过中空纤维膜系统发生。

5.权利要求1的方法，其中所述毛细管系统和一个或多个中空纤维膜经配置形成整合在室中的独立的交织的纤维毛细管膜系统。

6.权利要求1-5的任一项的方法，其中在步骤ii)之前用灭活的饲养细胞接种所述生物反应器。

7.权利要求6的方法，其中所述饲养细胞是hFF或MEF细胞。

8.权利要求1-5的任一项的方法，其中用DE细胞和饲养细胞共接种所述生物反应器。

9.权利要求1-5的任一项的方法，其中一种或多种培养基包含细胞存活因子。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞存活因子是ROCKRho激酶的抑制剂。