JP2009539358A - hBS細胞に由来する新規な肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
iii)細胞の少なくとも1%が、OATP2および/またはOATP−8のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
v)細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
vi)細胞の少なくとも20%が、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示し、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示し、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示し、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示し、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す。
ここで使用しているフィーダ細胞は、単独でまたは組合せで使用する支持細胞型を意味することを目的とする。細胞型は、ヒト又は他の種に起源のものでも良い。フィーダ細胞が由来する組織は、胚、胎児、新生児、少年又は成人組織を含み、それは、更に包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは胸部の皮膚に由来される組織を含む。フィーダ細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を誘導するのに使われてもよい特定の細胞型の実施例は、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および/または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮の細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出産後の包皮線維芽細胞および/または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞および/または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成人間質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮の細胞または成人ケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がhBS細胞に由来されるときに、細胞は線維芽細胞であってもよい。
現在のコンテキストにおいて、用語「肝細胞様細胞」は、アルファ−1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白質の特性のうちの少なくとも1つを示している細胞を意味することを目的とする。本発明の肝細胞様細胞は、さらに、薬品トランスポート及び薬物代謝に関する重要及び安定した特性を有する。
A.薬物輸送体
i) 細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii) 細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
iii) 細胞の少なくとも1%が、タンパク質および/または遺伝子発現OATP2および/またはOATP−8を示し、
B. 薬物代謝酵素
iv) 細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
v) 細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19 −2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
vi) 細胞の少なくとも20%が、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも1%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GSTA1−1の機能的な活性を示し、
v)細胞の少なくとも20%が、薬物代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも10%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも30%が、GSTA1−1の機能的な活性を示し、
v)細胞の少なくとも50%が、薬品代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す。
A.受容体
vii)細胞の少なくとも約5%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B. 細胞間接着分子
viii)細胞の少なくとも約5%が、ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
C.薬物代謝酵素
ix)細胞の少なくとも1%が、UGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
D.転写因子
x)細胞の少なくとも90%が、非Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
このコンテキストにおいて、用語「肝芽細胞様細胞」は、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つのを表示し、増殖能を有する細胞を意味することを目的とする。したがって、本願発明の一実施例は、hBS細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団の細胞の少なくとも約10%が、少なくとも一つのHNF3ベータ及びAFPを表示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の4つの特性のうちの少なくとも2つを有する。
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示し、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示し、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示し、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示し、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す。
F.薬物輸送体:
viii)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
ix)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
薬品トランスポート及び薬物代謝酵素の発現のために、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、医薬品用途に非常に適している。したがって、本発明に記載されている細胞集団が、予防および/または病状治療、および/または例えば、肝臓組織退化、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害からなる群から選択される肝臓障害、脂質異常症を含む代謝障害、例えばアルコール濫用によって生じる肝臓障害、ウイルスによって生じる疾患(例えばB型肝炎、C型肝炎及びA型肝炎)、例えば調合薬に対する急性毒性反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌及び代謝病状および/または、疾患で苦しんでいる患者の腫瘍除去のような組織退化によって生じる疾患のための医薬品の製造に使われることができる。
本発明の細胞集団は、分化誘導薬を用いずに得られるが、それは、一般的に他に使われる。分化誘導薬は、細胞に有毒な欠点を有し、そのような方法によって得られる分化細胞の収穫は低く、さらに、これらの得られた細胞の品質にも影響を及ぼす可能性がある。本発明の発明者は、培養状況を確認することにより、分化誘導薬を使用しないで肝細胞様細胞および/または肝芽細胞様細胞へhBS細胞の分化を可能にする。本発明による肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の製剤方法は、細胞の改良された品質及び改良された収穫を提供する。さらに、得られた細胞は、ここに記載されている特性を有し、この特性が細胞をここに記載の用途以外にも適応させる。
i)無血清培地の支持マトリックスでhBS細胞またはhBS細胞由来前駆を少なくとも5日間、試験管内分化を行う。
ii)培養基を約5日から25日ごとに変える。
iii)機械的隔離によって細胞を分離する。
iv)酵素処理によってステップiii)において得られる細胞を任意に解離する。
v)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
i)hBS細胞を育てることに適している培養基、例えばVitroHES(商標)培養基の中で最大10日から30日間、好ましくは例えば、15日目または23日目までの13日間から27日間、hBS細胞をインビトロで分化させ、例えば、培養基の100%が、新規な肝細胞培養基に取り替えられることができ、50%に変わる。
ii)10−40日目、好ましくは13−35日目、例えば15日目または23日目にHCM培養基のような肝細胞の培養のために最適化される新規な培養基に代わる。培養基は、以下の構成要素の一つ以上を含んでもよい:ウシ血清アルブミン、アスコルビン酸、上皮細胞増殖因子、トランスフェリン、インスリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質。
iii)高い濃度のデキサメタゾンを最大10日、好ましくは8日間、任意に加える。
iv)ナトリウム酪酸塩(NaB)及びHGFを最大10日、好ましくは5日間、任意に加える。
v)細胞を分離する。
vi)酵素処理によってステップii)において得られる細胞を任意に解離する。
vii)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
本発明の別の態様は、以下を含んでいるキットに関する:i)肝細胞様細胞および/または肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団、ii)一つ以上の成熟因子および/または成熟培養基、及びiii)任意的に使用指示書。成熟培養基は、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)、及びあらかじめ調整されたVitroHES(商標)(肝細胞様細胞上ですでに調整された)からなる群から選択されてもよい。
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択される発現マーカーを符号化する遺伝子の少なくとも3つ、例えば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対するPCRプライマー、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル。
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなるグループから選択される発現マーカー抗原の少なくとも3つ、例えば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対抗する抗体、および
ii)ユーザーズ・マニュアル。
本発明のための出発物質は、例えば未分化のhBS細胞株のような最適に多能性未分化のhBS細胞である。前記材料は、Cellartis社から得られることができ、さらにNIH幹細胞レジストリを通して入手できる。http://stemcells.nih.gov/research/registry/。Cellartis ABは、2種のhBS細胞株(SA001及びSA002)を有し、SA002(SA002.5)の1つのサブクローンがNIHを通して入手できる。加えて、20のCellartis細胞株は英幹細胞バンクにリストされる。それらのhBS細胞株及び加えて、Cellartis社からのSA167及びSA348が、本願発明において多用された。出発物質として推薦されるhBS細胞の特性は、以下である:アルカリホスファターゼ、SSEA−3、SSEA−4、TRA 1−60、TRA 1−81、Oct−4の陽性反応、SSEA−1の陰性反応、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及び体内の多分化能(後者は免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される)(図1を参照)(方法及びプロトコルはすでに開示された。ハインズその他、国際公開WO03055992)。
hBS細胞株のLOT調製は、標準化された方法に基づくhBS細胞の培養拡張及び、次の1つの単一通過での100本以上のストローの冷凍を構成する(出願中の特許国際公開WO2004098285)。hBS細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、LOTからの細胞の解凍後の次の培養における連続的な継代でモニタされる。LOT冷凍の品質は、解凍回復率の検査によって確認され、それは、10解凍の各ストローのための100%の解凍速度を示す。すなわち、細胞材料は、解凍時に各々のガラス化ストローから二次培養されることができる。微生物学的に安全に関する安全試験は、細胞に汚染がないかを確認するために、それから細胞及び冷凍継代での培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、hBS細胞株の分化状態を確認するために方法の幅広い範囲を含む。最初に、未分化の細胞(SSEA−1、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、Oct−4及びALP)のための一般に認められたマーカーのマーカー発現分析が、実行される。継代全体における細胞の遺伝子安定性及び冷凍−解凍サイクルは、染色体分析及びFISHで点検される。テロメラーゼ活性は、Telo TAGGG テロメラーゼ PCR ELISAPLUSキットを使用して測定される。hBS細胞の多分化能は、胚様体ステップによる試験管内分化及び、免疫不全SCIDマウスの腎臓被膜でのhBS細胞の移植による体内分化によって調べられる。
内因子プロトコル(分化は、培養基に分泌される内因子への暴露によって誘導される)
a)IVF培養皿(ファルカン)でのmEF細胞層で育てられるhBS細胞は、肝細胞様細胞を得るために、37度、5%のCO2及び95%の湿度の下で最高40日間分化させられる。使用する培養基(4ng/mlの加えられるヒト組み換え型bFGF [インビトロゲン]を有するVitroHES(商標)[ Vitrolife AB ])は、おおよそ1から2mlの旧培養基を放棄し、1から2mlの新しい培養基に加えることによって、7日及び21日ごと、通常14日ごとに変えられる。18日から30日後に、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールとして鋭いミクロ毛細管またはStem Cell Tool(商標)(Vitrolife AB)を使用して培養から分離され、細胞はそれから長期保存(冷凍された)または即時利用のためにプールされるか、または培養皿に直接染色されるかまたは固定されるかまたは、例えばCyp活性分析の生体細胞として使用される。hBS細胞の分化がmEFS(例えばマトリゲル上のhBS細胞培養)の非存在下で徹底的に変更されるので、mEFSは肝細胞様細胞の発育を支える基本的信号を提供するようであり、少ない肝細胞様細胞が、その培養(データは示されてない)から得られることができる。これは、そのような培養物のためのmEF−馴化培地を用いて、培養基へのmEFsによる因子の分泌物を指定して部分的に救われることができる。従って、我々は、培養期間で培養基を二度以上に変えることは、肝細胞様細胞を得るための不利な点であることを観察した。肝細胞様細胞を得るための重要なもう一つの要素は、bFGFで培養基を補充することである。
IVF皿内のmEFで5日から10日間培養された未分化hBS細胞(BE002.5継代42)は、小さい断片に切られ、ガラス毛細管を用いて、400μl培養基を含んでいる24−ウェルプレートのフィルタ挿入紙(孔サイズ:4μmの直径、外植体培養のために特殊化される、ミリポア)に移動される。フィルタは、培養基に細胞がおぼれることを妨げながら、細胞の栄養摂取を可能にし、水分環境をつくる培養基面と接触し、それによって、体内状況は、模倣される。培養基は、50%のVitroHES(商標)及び4ng/mlのbFGFで補充されるmEF内の未分化のhBS細胞からの50%の馴化培地を構成する。半分の培養基は、一日おき又は3日ごとに変えられる。細胞は、分析の前にそれぞれ7、14、21及び31日間分化する。3D−hBS細胞培養は、免疫組織化学によって分析される。培養物は、30%のサッカロースの低温保存の後に4%のPFAに取り付けられ、Sakura O.C.T. tissue−tekに組み込まれる。10μmのアールのクリオ切片は、異なる内胚葉の免疫反応性のマーカー及び肝細胞様マーカーために形態学的に分析される。
マウス胚肝臓の器官形成は、三次元フィルタシステムの肝細胞様細胞へのhBS細胞分化を促進することができる。異なる発育的な段階におけるEGFP(強化された緑の蛍光タンパク質)トランスジェニック・マウス胚の肝臓外植体は分離され、フィルタシステムで培養されるhBS細胞に移植される。対照培養物として、hBS細胞のみ、または肝臓以外のマウス胚外植体(心臓及び卵黄嚢)は、hBS細胞に移植され、フィルタ上で培養された。共同培養物は、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)で培養され、培養基の50%は、第2日又は第3日ごとに交換された。7日目及び14日目に、共培養が免疫組織化学分析のために用意された。HNF3ベータ、AFP、HNF4アルファ、CK18、CYP3A4/7及びCYP1A2/1のような内皮性及び肝臓マーカーが分析された。
肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状、大きい細胞直径(凡そ25−50μM)を有し、よく核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。さらに、それらは肝臓細胞型のために記載されるいくつかのマーカー、例えばアルブミン、アルファ1−抗トリプシン、LFABP、CK18及びHNF3ベータを表示する。それらは未分化の細胞のために使われる幹細胞マーカーであるOct−4をもはや表示しない。おそらくいくつかの未成熟肝細胞様細胞は依然として胎児の肝臓マーカーAFPを表示する。これらの細胞は、優先して分化hBS細胞のコロニーで見つかる。細胞核を視覚化する対照としてのDAPI(4’,6’−diamidino−2−phenylindole dihydrochloride hydrate. Sigma Aldrich)。(マトリゲル(商標)で分化された肝細胞様細胞のCK18発現のために図22を参照。)
アルブミン(ウサギ)1:500、DAKOCytomation、A0001
AAT(ウサギ)1:200、DAKOCytomation、A0012
CK18(マウス)1:200、DAKOCytomation、M7010
LFABP(ヤギ)1:500、サンタクルーズ、sc−16064
HNF3b(ヤギ)1:250、サンタクルーズ、sc−6554
Oct−4(マウス)1:500、サンタクルーズ、sc−5279
c−Met(HGF受容体(マウス))1:100、upstate、05−237
アルファ6−インテグリン(CD49f(ラット))1:250、BD バイオサイエンス、555736
ICAM−1(CD54(マウス))1:500、BD Pharmingen、559047
AFP(マウス)1:200、SIGMA、A8452
HNF4アルファ(ウサギ)1:400、サンタクルーズ、sc−8987
CK19(マウス)1:200、Novocastra、NCL−CK19
CK7(マウス)1:200、Novocastra、NCL−L−CK7−560
EpCAM−FITC(1:200)GeneTex社 GTX28666
−donkey anti−goat−Alexa 488、1:500、Molecular Probes、# A−11055
−donkey anti mouse−Cy3(1:1000)Jackson Immuno Research #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2(1:100)Jackson Immuno Research #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488(1:1000)Molecular Probes #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594(1:1000)Molecular Probes #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3(1:500)Jackson Immuno Research #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2(1:100)Jackson Immuno Research #712−225−153
アルブミン、AAT、CK18、HNF3b、Oct−4、CK19、CK7、AFP:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1% PBTの5%FBSに30分入れ、一次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.1%PBT、0.05mg/mlのDAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤のなかで組み込まれる。
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体をPBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのPBS、DAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1%PBTの5%FBSに30分入れ、0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養される一次抗体を直接活用するFITC、0.05mg/mlのPBS、DAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
フェーズI代謝酵素:
肝細胞様細胞は、以下のCypsの免疫反応性を表示する:1A2、2A6、2B6、2C8/9/19(3つの亜類型間の潜在的抗体交差反応)、2D6、2E1、3A4/7(2つの亜類型間の潜在的抗体交差反応)。(mEFに分化される肝細胞様細胞は図5−11を参照、マトリゲル(商標)で分化された肝細胞様細胞でのCyp1A2及びCyp2B6発現は、図22を参照)。Cyp発現誘導性は、25μMリファムピン、20μMデソキシフェノバルビタール(プリミドン)、100μMデキサメタゾン、88mMのエタノール、25μMオメプラゾール及び100μMイソニアジドを含むCyp誘導混合物に96時間の暴露の後に見られた。(mEFでの肝細胞様細胞のCyp 1A2及び2B6の誘導について、図24及び25を参照)CypsはさらにHepG2内で免疫組織化学的に分析された。それは、いかなる反応も引き起こさなかった(図31を参照)。
Cyp1A2(ウサギ)1:100、biomol、CR3130;
Cyp2A6(ウサギ)1:100、biomol、CR3260;
Cyp2B6(ヒツジ)1:100、biomol、CR3295;
Cyp2C8/9/19(ウサギ)1:100、biomol、CR3280;
Cyp2D6(ヒツジ)1:100、biomol、CR3245;
Cyp2E1(ウサギ)1:100、Chemicon、AB1252;
Cyp3A4/7(ヒツジ)1:100、biomol、CR3345;
Cyp2E1(ウサギ)1:1000、Oxford Biomedical Research、PA26;
Cyp3A4/7(ウサギ)1:1000、Oxford Biomedical Research、PA32。
−donkey anti−goat−Alexa 488, 1:500, Molecular Probes, # A−11055
−donkey anti mouse−Cy3, 1:1000, Jackson Immuno Research, #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488, 1:1000, Molecular Probes, #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594, 1:1000, Molecular Probes, #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3, 1:500, Jackson Immuno Research, #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #712−225−153
−donkey anti−sheep−Alexa488, 1:1000, #A−11015
−donkey anti−sheep−Alexa594, 1:1000, #A−11016
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1%PBT内の5%FBSに30分入れ、
一次抗体を0.1% PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.1% PBT、0.05mg/mlのDAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
Cyp1A2及び3A4/7発現は、ウエスタンブロット法(図12を参照)において確認された。Cyp誘導剤処理で、1A2及び3A4及びまたは3A7のタンパク質量(潜在的交差反応)は、非処理及び誘導の細胞からのタンパク質バンドに比べて肝細胞様細胞の誘導性の視覚化を明らかに強化した。タンパク質は、M−PERタンパク質摘出試薬(ピアス)を使用して細胞から抽出され、1:100プロテアーゼ抑制剤カクテル(シグマ−アルドリッチ)で補充される。タンパク質は、電気泳動法によって12%のSDSポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜組織に変えられる(Biorad、ヘラクレス、CA)。免疫ブロット法のために、(Cyp1A2(ウサギ)及びCyp3A4/7(ウサギ)、両方ともBiomolから)に対する一次抗体は、1%のBSAブロッキングバッファーに希釈された。二次抗体は、対応HRP−共役抗体であった(それぞれヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギ(1:2000; DAKO、Glostrup、デンマーク))。強化化学ルミネセンス(ECL)が、製造業者の指示(Amersham、Piscataway、NJ)によって使われた。HepG2細胞が、陰性対照として使われた。一次ヒト肝細胞(インビトロ テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツにおいて)が、陽性対照として使われた。
PROD分析は、96時間のCyp誘導混合物との処理においてPROD活性の強い誘導、および非処理の肝細胞様細胞で構造性PROD活性を示した。さらに、EROD分析は、特定の構造性及び誘導可能性Cyp 1A2活性を示して実行された(図30を参照)。両方の分析は、初代肝細胞と同程度の誘導活性を示し、さらに、hBS細胞由来肝細胞様細胞におけるいかなる誘導の前に、基礎発現が、弱いけれども、実際にはあった。
フェーズII代謝酵素:
肝細胞様細胞は、GST A1−1の強い免疫反応性及びGST M1−1の弱い免疫反応性を表示する。胎児のGST P1−1の免疫反応性は、ほとんど示されなかった(mEFで分化される肝細胞様細胞について図14を参照)。さらに、肝細胞様細胞は、UGT 1A1及びUGT 1A6のための免疫反応性を示す(図17を参照)。誘導剤処理で、わずかな誘導が、GST A1−1のために観察されたが、GST M1−1またはGST P1−1のためのはっきりした誘導はなかった。(マトリゲル(商標)に育てられた肝細胞様細胞でのGST A1−1発現は、図22を参照。)
GSTA1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS62;
GST M1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS67;
GST P1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS72;
UGT 1A1(ウサギ)1:500、BD バイオサイエンス、458411;
UGT1A6(ウサギ)1:500、BD バイオサイエンス、458416。
−donkey 抗ウサギ−Alexa488、1:1000, Molecular Probes(#A−21206)
−donkey 抗ウサギ−Alexa594(1:1000),Molecular Probes, #A−21207
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBTの1%FBT中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全てが0.05mg/mlのDAPI 、0.1%PBTの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中に組み込まれる。
ウエスタンブロット法分析が、BS細胞株SA002.5(LOT BE002.5)、SA167(LOT CE167)(図15を参照)及びSA002(LOT AL002)(データが示されてない)からの肝細胞様細胞でGST A1−1(25kDa)発現を確認する。より胎児性GST亜類型GST P1−1(25kDa)のための発現は、ウエスタンブロット法によって検出されなかった。ヒトGSTsを共起表現するV79細胞からの細胞溶解物が、陽性対照として使われた。B−アクチン(42kDa)が、内部積載対照として使われた。GST A1−1またはGST P1−1の発現が、株SA002またはSA002.5からの未分化hBS細胞において検出されることができなかった。
1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン(CDNB)へのGST触媒活性が、Habigとその他、1974の分光測光法の分析を使用して決定された。CDNB(1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン)は、一般のGST参照培養基(Mannervik 1988)である。反応混合は、85μlの0.1Mのリン酸カリウム(pH 6.5)、2.5μlの0.2MのGSH、2.5μlの20mMのCDNB及びM−PER渙散バッファ内の10μlのタンパク質溶解物から構成されていた。タンパク質なしで、10μlのM−PER渙散バッファとの完全な分析混合が、対照として使われた。340nm及び30℃の吸光度が、フィリップスPU8720 UV/VIS走査型分光光度計を使用して1分間モニタされた。CDNBへのGST触媒活性が、hBS細胞株SA002(LOT AL002)SA002.5(LOT BE002.5)及びSA167(LOT CE167)及びヒト初代肝細胞培養物に由来した肝細胞様細胞、およびHepG2培養物において検定された。hBS由来肝細胞様細胞が、ヒト初代肝細胞に類似したGST−活性及びHepG2培養より本質的に高いGST活性レベルを示した。図16を参照。
薬物輸送体
免疫組織化学:
肝細胞様細胞は、トランスポータMRP2、BSEP、及びOATP−2および/またはOATP−8のための免疫反応性(潜在的抗体交差反応)を示す(図18、19、20を参照)。BSEPが肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞より小さい集団だけにおいて表示される時、OATP−2/8及びMRP2が、大多数の肝細胞様細胞において表示されるようである。
MRP2(ウサギ)1:50、サンタクルーズ、sc−20766;
BSEP(ヤギ)1:50、サンタクルーズ、sc−17292;
予め希釈されたOATP−2(マウス)、Progen Biotechnik社、クローンmMDQ
−donkey anti−goat−Alexa 488、1:500、分子の調査、# A−11055
−donkey anti mouse−Cy3,、1:1000、Jackson Immuno Research #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488, 1:1000, Molecular Probes, #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594, 1:1000, Molecular Probes, #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3, 1:500, Jackson Immuno Research, #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #712−225−153
−donkey anti−sheep−Alexa488, 1:1000, #A−11015
−donkey anti−sheep−Alexa594, 1:1000, #A−11016
MRP2,OATP−2:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBT内の5%FBSに30分入れ、一次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのDAPI 、0.1%PBTの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBSの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体をPBSの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのDAPI 、PBSの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
肝細胞様細胞でMRP2発現は未分化細胞での発現と比較してそれぞれ11から32倍高い。
肝細胞様細胞が、PAS陽性方法によって検出されるグリコーゲンを保存する(図21を参照)。技術的な陰性対照として、唾液処理された培養物は、培養物の95−99%でグリコーゲン発見の減少を証明した。ブドウ糖余剰がある限りグリコーゲン合成及び貯蔵は人体の多数の細胞型の一般的な機能ある。しかし、肝細胞及び骨格の筋肉は、グリコーゲンを保存する際に特に特殊化される。肝細胞様細胞を選ぶかまたは取り除く前の分化hBS細胞培養において、グリコーゲンを保存する他の細胞集団が、観察され、同じく、グリコーゲンを保存することができない、いくつかの集団も観察される。重要なことに、グリコーゲンを保存しいない培養物の非肝細胞様細胞がある。細胞は、メタノールに希釈される4%のパラホルムアルデヒドに室温で、15分間、取り付けられ、その後、3回をPBSで洗われた。技術的陰性対照として、培養物は室温で、20分間、ヒト唾液で処理され、その後、PBSで洗われた。ヒト唾液は、グリコーゲンを消化するα−アミラーゼを含む。アルデヒドにグリコールを酸化する過沃素酸が処理及び非処理の培養物に5分間室温で、加えられ、PBSにおける繰り返し洗浄が続いた。その後、培養物は室温で、15分間、シッフ試薬で培養され、パラローズアニリン及び異性重亜硫酸ナトリウム間の反応を可能にし、グリコール含有する細胞コンパートメントを明るいピンクに染色するパラローズアニリン製品を作り出す。PBSで洗った後に、細胞は、室温で、90秒間、ヘマトキシリンで対比染色され、マウンティング培養基に取り付ける前にH2Oにおいてすすがれた。ヘマトキシリンは、細胞(青っぽい)の核を染色する。
重要な特定の遺伝子を分析するさらなる別の方法、例えば、下記の物質は量的PCR(QPCR)を用いている。そのような措置は以下の通りである:第1の適切な遺伝子が選ばれ、それらの遺伝子と相補的にマッチするプライマーが考案され、定量化がPCR分析によって行われ、重要な遺伝子の発現レベルがハウスキーピング遺伝子、分化の間に下方対照する遺伝子と比較される(分化の間に安定して表示されることが公知の場合)。いくつかのhBS細胞株の分化の間に、下方対照される適切な遺伝子の実施例は、Cripto、Nanog及びOct−4である。
cDNA(1−100 ng)、5μl
RNase/DNaseフリー水
TaqManの汎用PCR、45のμl
マスター混合物(2X)(50μl)
合計:100μl
hBS細胞及びそれの由来的細胞型、例えば肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、例えば人工中空ファイバー毛細血管膜によって区分される三次元スペースにおいて育てられてもよい。このシステムは、毛細管間のより大きい細胞集団へ細胞を成長させることを可能にし、培養基の潅流及び酸素類のガスによって最適化、天然環境を提供する。密閉生物反応器システムは、細胞(最高10^11細胞)を大量に生産し、細胞の機能的特性の保全を支えるために開発される。酵素潅流による細胞隔離が、密閉したGMPシステムで拡大された。細胞浄化が、例えば膜組織抗原発現に基づくFACソートまたは密度勾配培養基及び遠心分離を使用して、それから実行される。
尿素合成は、肝臓特定の特性であり、したがって、異なる細胞株から肝細胞様細胞へ分化する培養基の尿素濃度が、24時間潜伏の後、異なる時刻で測定された。培養基サンプルは、集められ、分析のために送られた。尿素分泌が、尿素/尿素窒素(ロシュ/日立)の運動UV検査法のためのキットを使用して分析された(Klinisk Kemi、C−研究室、Sahlgrenska大学病院、イェーテボリで)。
サンドイッチ培養系が、更に細胞極性及び肝細胞様細胞の長期の機能性を改善することができる。そのような培養系において、肝細胞様細胞の埋め込みは、低いレベル酸性応力と別の肝臓体内を模倣する三次元環境提供する。それによって、肝細胞様細胞は有極性を示する。すなわち、アピカル側を有する上皮様組織(生体内胆汁側の方へ、疎水性)及び基底外側(生体内血液側の方へ、親水性)を形成する。サンドイッチ培養での肝細胞様細胞のもう一つの潜在的改良は、Cyp発現のより強い誘導性である。
IVF皿で育てられる培養hBS細胞は、室温で、15分間、4%のパラホルムアルデヒドに取り付けられた。細胞は、それから一次抗体によって一晩4℃で培養された(Notch2、1:200 サンタクル\ス、sc5545、USA)。その翌日、細胞は10分間二回1X PBSによって洗われ、1時間、室温の1X PBS内で第2抗体(抗ウサギ−FITC、1:500)によってその後に培養され、それぞれ5分間二度洗われ、5分間1μg/mlのDAPI溶液に暴露される。水でそれぞれ5分間二回細胞を洗った後に、それらは、アクアマウントに取り付けられ、蛍光性顕微鏡検査によって分析される。最近、未分化のhBS細胞がNotch2(Noggleとその他(2006))を表示することが示された。Cellartis hBS細胞株SA002において、大多数の細胞は、分化の第1日にNotch2に弱陽性である。2週後に、Notch2は、肝細胞様および/または肝芽細胞様細胞のほんの少数のサブセットだけで見つかる。すなわち、肝臓形態学に似ている二核小体の細胞である(図35を参照)。
4日間から5日間、前のhBS細胞は、小さい断片に手動で解剖され、マイトマイシンC−に処理され、96−ウェルコーティングされたmEFへ移動される。hBS細胞の2つから3つの断片が各々のウェルに加えられた。培養物は、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)において、37℃、5%のCO2及び95%の湿度で20−30日間培養された。10日目に、培養基の50%が、4ng/mlのbFGFで補充される新しいVitroHES(商標)と取り替えられ、20日目に、培養基の100%が取り替えられた。hBS細胞は、MEF−コーティング、IVF−皿で培養されたhBS細胞コロニーに類似するコロニーに分化され、例えば肝芽細胞様細胞は、HNF4アルファに免疫陽性反応であり、14日目あたりにコロニーの周辺に現れ、20日目の肝細胞様細胞に現れた。96−ウェルの80%が、このプロトコルを用いて20日目に肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させることに成功した。
肝細胞様細胞の再接種の前に、96ウェルプレートのウェルが、異なるコーティングによって予めコーティングされる:ラットの尾からのコラーゲンI (BD Biosciences、#354236)、10%から100%の異なる濃度のマトリゲル(商標)(基底膜マトリックス、BD Biosciences、#356237)、または、mitocycin C処理のmEF細胞層。コーティングは、次のように実行された:コラーゲンIが96ウェルに加えられ、5%のCO2、30min−1hの95%湿度で37℃で培養される。コラーゲンIの余剰が廃棄され、ウェルは、その後いかなる酸性の酸性トレースも取り除くために二回PBSによって洗われた。ウェルは、20%のFCSで補充され、予め暖められた50−100μlのHCM−培養基で満たされた(HBM(商標)、Cambrexからのcc−4316BB、cc−4362BB、cc−4335BB、cc−4313BB、cc−4321BB、cc−4317BB、cc−4381BBのHCM(商標) SingleQoutsで補充されるcc−3199)。マトリゲル(商標)コーティングのために、マトリゲル(商標)の冷凍分割量が、冷蔵庫において一晩解凍された。マトリゲル(商標)は、10%から100%のマトリゲル(商標)を達成するためにHCM−培養基で希釈された。マトリゲル(商標)の異なる濃度は、96−ウェルに加えられ、30分間37℃で培養された。マトリゲル(商標)の余剰は、20%のFCSで補充されるHCM−培養基を加える前に廃棄された。25から38日までの古い培養範囲の肝細胞様細胞が、BDからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、VitroHES(商標)培養基を含んでいる収集ディッシュへ幹細胞ナイフで移動される。領域を含んでいるミクロ解剖した肝細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。クラスタは、37℃で10分間カルシウム及びマグネシウムなしのPBS、加熱プレートでのTrypLe Select(Gibco、#12563)で42℃で3−5分間、または37℃で5−15分間Collagenase IVによって、20%のFCSで補充されるHCM−培養基を含んでいる96−ウェルプレートの異なるコーティング上に再接種する前に処理される。一日以後、肝細胞様細胞を有するクラスタは、表層に付属し、表層上にクラスタから移り始めた。これは、肝細胞様細胞の全ての異なる種類のコーティング及び分離処理にとって真実だった。20%FCSで補充されるHCM−培養基は、無血清HCM−培養基に交換された。培養に、一日おきに、新しいHCM−培養基が提供された。数日後に、肝細胞様細胞は、ウェルを再接種した。肝細胞様細胞は、保持された肝臓典型的形態学を培養物で45日間キープした。大きい多角形及び複数核細胞(図46を参照)は、肝細胞マーカーHNF3ベータ及びCK18(図46)に陽性であった。
異なる分化プロトコルによって得られるhBS細胞由来肝細胞様細胞は、誘発因子の非存在下でフェーズIシトクロムp450酵素、cyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4にそれぞれによって、フェナセチン(アルドリッチ)、ジクロフェナック(SIGMA)及びミダゾラム(SIGMA)を新陳代謝させるその能力のために検査された。培養基へ放出されたそれぞれ物質の代謝物質が、LC−MSで測定された。細胞株SA002、SA002.5及びSA348からの肝細胞様細胞を含んでいる混合培養物が、26日から35日までに試験された。物質は、フェノールレッドなしの培養基、26μMフェナセチン、9μMジクロフェナク及び3μMミダゾラムの中でカクテルとして、6時間、12時間及び24時間、37℃で5%のCO2の条件下で培養された。各々の培養及び時刻からのサンプルはいかなる細胞残屑も取り除くために、集められ、高速で20分間遠心分離機で分離された。100μlの取り除かれた培養基サンプルは、96−ウェルプレートへ移動され、15μlのアセトニトリルは、各々のウェルに加えられた。LC−MSによって代謝物質測定が実行され、分析されるまで、サンプルは冷凍だった。
体内の薬物代謝を予測するために、薬物代謝を分析するときに、肝細胞の範囲内のcyp−活性配合は欠かせない。hBSC−由来肝細胞様細胞のcyp−活性配合がどれくらいよくヒト肝細胞を反映させるかについて分析するために、薬品フェナセチン(26μM)ジクロフェナック(9μM)及びミダゾラム(3μM)、(それぞれcyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4によって新陳代謝される)の混合が、細胞株SA348及びヒト初代肝細胞に由来した肝細胞様細胞に加えられた。薬品カクテルの12時間培養の後に、サンプルは、代謝物質のLC−MS発見のために集められた。サンプルは、前の実施例16に記載されている通りにLC−MSによって調製され、分析された。試験した3つの酵素システム間のcyp活性配合が、分析された。
hBSC−由来肝細胞様細胞を改善するために、リアルタイムPCR技術に基づく選別法が使われた。4つの遺伝子の相対的な発現レベル;HNF4アルファ、Cyp3a4、アルブミン及びUGT2B7が、肝細胞様細胞の改良を示した。Cyp3a4は、成人肝臓内で重要なシトクロムp450酵素である。それは、成人肝臓でのフェーズI酵素活性の60%を構成する。アルブミンは、成熟及び成人肝細胞に高く表示される。UTG2B7は、成人肝臓の重要なフェーズII酵素(グルクロノシルトランスフェラーゼ)である。Cyp3a4、アルブミン及びUTG2B7の上昇レベルが、改良され、成熟し、潜在的により機能的な肝細胞様細胞示す。HNF4アルファは、肝芽細胞様細胞の初期のマーカーである。HNF4アルファ遺伝子発現の上昇レベルは、肝芽細胞様細胞の増加数を示す。アルブミン、Cyp3A4及びUTG2B7の高水準及び、加えて、HNF4アルファの減少されたレベルは、HCLCの成熟した及びより機能的な集団を示す。
1日目
hBS細胞は、手動で断片に切断され、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)−培養基を含み、mEF−コーティングされたIVF皿へ移動された。
10日目
培養基の50%は、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)と取り替えられた。
14−15日目
HNF4−アルファ染色によって示される肝芽細胞様細胞は、コロニーの周辺に存在する。
20日目
培養基の100%が、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)と取り替えられた。肝細胞様細胞は、コロニーの周辺に現れている。
I 異なる培養基
CambrexからのHCM−培養基 表5の実験1、2; 図37−39
a. デキサメタゾン 表6の実験1、2、3; 図40−42
b. HCM−培養基、HGF、ナトリウム酪酸塩 表7の実験1、2; 図40−42
HCM−培養基及びVitroHES(商標) 表8の実験1; 図43−45
肝芽前駆細胞株を確立するために、15日間古いhBS−細胞由来肝芽細胞が、分離され、異なるコーティングに再接種された。肝芽細胞様細胞の再接種の前に、96−ウェルプレートのウェルが、以下の異なるコーティングによって予めコーティングされた;17−20x103細胞/cm2の密度を有するマイトマイシンC−処理のmEF細胞、ラットの尾からのコラーゲンI(BD Biosciences、#354236)または、HCM−培養基に1:3で希釈したマトリゲル(商標)(基底膜マトリックス、BD Biosciences、#356237)。コラーゲンI及びマトリゲル(商標)のためのコーティング手順は前の実施例15で記載されている。ウェルは、20%のFCSで補充される予め暖められた50−100μlのHCM培養基で満たされた(HBM(商標)、Cambrexからのcc−4316BB、cc−4362BB、cc−4335BB、cc−4313BB、cc−4321BB、cc−4317BB、cc−4381BBのHCM(商標) SingleQoutsに補充されるcc−3199)。15日間古い培養からの肝芽細胞様細胞の範囲がBDからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、VitroHES(商標)培養基を含んでいる収集ディッシュに、幹細胞ナイフで移動される。範囲を含むマイクロ解剖された肝芽細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。ところが、mEF−細胞層に再接種される肝芽細胞様細胞は、肝細胞の典型的特性を示しておらず、小さい核を有する肝芽細胞様細はmEF−細胞層上で育てられた(図47D−F及びK、L)。加えて、mEFに育てられる大多数の肝芽細胞様細胞クラスタは、肝芽マーカーCK19(図47J、K)に強く陽性だったが、コラーゲンI及びマトリゲル(商標)上の肝芽細胞様細胞の一部だけが、CK19に陽性であった(図47G、H)。mEF細胞層上の肝芽細胞様細胞及びコラーゲンI及びマトリゲル(商標)コーティング上の肝芽細胞様細胞は、HNF4アルファ陽性核を示したが、mEFに育てられる肝芽細胞様細胞(図47A、B、D、E)と比較して、後者は、より大きくて、強く染色されなかった核を有した。データは、肝細胞様細胞への肝芽細胞様細胞の分化がコラーゲンI及びマトリゲル(商標)コーティング上で可能にされる場合に、mEF細胞層が、前駆状態に肝芽細胞様細胞をキープする能力を有することを示す。
hBSC由来肝細胞様細胞におけるトランスポータに関する機能的なテストが、培養にインドシアニングリーン色素(ICG)を利用することによって分析された。ICGは、5mg/mlの濃度へ蒸留、殺菌された水に溶かされ、その後で、1mg/mlの最終濃度へ培養基で薄められた。ICG溶液は、細胞培養皿に加えられ、おおよそ60分間37℃で培養された。培養の後に、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に洗い落され、ICGの細胞摂取は、ステレオ顕微鏡で検査された。肝細胞様細胞は、ICG色素を表し、細胞の範囲に機能的な薬物輸送体の存在を示唆する(図48)。
Claims (93)
- hBS細胞に由来する細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも20%が、
アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも1つ特性を示すとともに、
細胞集団が、下記六つの特性のうちの少なくとも三つの特性を有する前記細胞集団:
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
iii)細胞の少なくとも1%が、タンパク質および/または遺伝子発現OATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
v)細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7の少なくとも2つのタンパク質および/またはGST A1−1の遺伝子発現を示す特性、
vi)細胞の少なくとも20%がGST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示さない特性。 - 細胞集団は、少なくとも一つの前記薬物輸送体特徴及び少なくとも一つの前記薬物代謝特徴を有する請求項1に記載の細胞集団。
- 細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも四つ、例えば五つの特性を有する請求項1または2に記載の細胞集団。
- 細胞集団が前記特徴のうちの全ての6つの特性を有する請求項1〜3のいずれかに記載の細胞集団。
- 請求項1又は2に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも20%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白特性の少なくとも一つの示し、以下の特性を有する:
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも1%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
細胞の少なくとも20%が、GSTA1−1の機能的な活性を示す特性、
細胞の少なくとも20%が、薬物代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す特性。 - 請求項1又は2に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも75%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白特性を示し、細胞集団が少なくとも以下の特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも10%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも30%が、GSTA1−1の機能的な活性を示す特性、
v)細胞の少なくとも50%が、薬代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す特性。 - 特性i)が、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%である請求項1〜6のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性ii)が、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%にあてはまる請求項1〜7のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性iii)は、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜8のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性iv)が、細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜9のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性v)が、細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜10のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性vi)が、細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜11のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞集団の細胞の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約95%のような少なくとも約30%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも1つを示している請求項1〜12のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP1A2を共発現する請求項1〜13のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2A6を共発現する請求項1〜14のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2B6を共発現する請求項1〜15のいずれかに記載の細胞集団。
- 少なくとも、細胞の約5%が、サイトケラチン18及びCYP2C8、CYP2C9および/またはCYP2C19を共発現する請求項1〜16のいずれかに記載の細胞集団。
- 、細胞の少なくとも約5%が、サイトケラチン18及びCYP2D6を共発現する請求項1〜17のいずれかに記載の細胞集。
- 細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2E1を共発現する請求項1〜18のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞の少なくとも約5%が、サイトケラチン18及びCYP3A4および/またはCYP3A7を共発現する請求項1〜19のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞の少なくとも約5%が、以下の追加的な特性のうちの少なくとも1つを有する請求項1〜20のいずれかに記載の細胞集団。
A.受容体
vii)細胞の少なくとも約5%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
viii)細胞の少なくとも約5%がICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
C.薬物代謝酵素
ix)細胞の少なくとも1%がUGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
D.転写因子
x)細胞の少なくとも90%が、1Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示さない特性。 - 細胞集団は、特性vii)、viii)、ix)またはx)の中で、少なくとも二つ、例えば少なくとも三つを有する請求項21に記載の細胞集団。
- 細胞集団が、特性vii)、viii)、ix)またはx)のうちの4つすべてを有する請求項21または22に記載の細胞集団。
- 特性vii)が、細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%にあてはまる請求項21〜23のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性viii)が、例えば、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも10%にあてはまる請求項21〜24のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性ix)が、例えば、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項21〜25のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性x)が、例えば、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%のような少なくとも10%にあてはまる請求項21〜26のいずれかに記載の細胞集団。
- CYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項1〜27のいずれかに記載の細胞集団。
- GST A1−1および/またはGST M1−1タンパク質の発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項1〜28のいずれかに記載の細胞集団。
- UGTタンパク質の発現は、誘発因子の付加物に誘導できる請求項21〜29のいずれかに記載の細胞集団。
- 誘発因子が、デキサメタゾン、オメプラゾールから成るグループから単独でまたは共に選択される請求項28〜30のいずれかに記載の細胞集団。
- 誘発因子が、リファムプシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含む請求項28−31のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞集団が、特性v)のCYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの酵素活性を示す請求項1〜32のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞集団がGST酵素活性を示す請求項1〜33のいずれかに記載の細胞集団。
- GST酵素活性が、細胞集団の溶解物内のタンパク質の例えば、少なくとも0.03μmol/min/mg、少なくとも0.05μmol/min/mg、少なくとも1.0μmol/min/mg、少なくとも0.07μmol/min/mg、少なくとも0.09μmol/min/mg、少なくとも0.11μmol/min/mg、少なくとも0.13μmol/min/mgまたは少なくとも0.15μmol/min/mgのような少なくとも0.4μmol/min/mgである請求項33に記載の細胞集団。
- 細胞集団が、UGT酵素活性を示す請求項21〜35のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一ヶ月間培養される請求項1〜36のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一週月間培養される請求項1〜37のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも72時間培養される請求項1〜38のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、更にアルファフェトタンパク質を示す請求項1〜39のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得られる請求項1〜40のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、フィーダ細胞がない場合に得られる請求項1〜41のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、細胞外マトリックスを使用して得られ、前記マトリックスは、定義済み又は未定義の組成物である請求項42に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、内側に一つ以上のタンパク質により単独でまたは共にコーティングされるプラスチック細胞培養容器を使用して得られる請求項42または43に記載の細胞集団。
- 一つ以上のタンパク質がコラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せから構成されるグループから選択される請求項44に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、例えば多孔性フィルタのような三次元環境を使用して得られる請求項44または45に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、異種動物由来成分を含まない請求項41〜46のいずれかに記載の細胞集団。
- 細胞集団における細胞の少なくとも約10%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つのを示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の5つの特性のうちの少なくとも2つを有するhBS細胞に由来する細胞集団:
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示す特性、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示す特性。 - 細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも2つを有する請求項48に記載の細胞集団:
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示す特性、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示す特性、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示す特性、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示す特性、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す特性。 - 細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも3つを有する請求項48または49に記載の細胞集団。
- 細胞集団が、前記特性のうちの例えば少なくとも5、少なくとも6または全7つのような少なくとも4つを有する請求項48〜50のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性i)が、細胞の例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のように少なくとも5%にあてはまる請求項48〜51のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性ii)が、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項48〜52のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性iii)が、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項48〜53のいずれかに記載の細胞集団。
- 特性iv)が、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも15%にあてはまる請求項48〜54のいずれかに記載の細胞集団。
- 個体群の細胞の少なくとも約15%、たとえば、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つを示し、増殖能を有する請求項48〜55のいずれかに記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも1つを有する請求項48〜56のいずれかに記載の細胞集団:
F.薬物輸送体
viii)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ix)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性。 - 創薬プロセスのための、請求項1〜57のいずれかに定義した細胞集団の使用。
- 試験管内モデルの薬物輸送体を研究するための、請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 試験管内モデルの薬物代謝酵素を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 試験管内のモデルで早期肝形成のような肝形成を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 試験管内のモデルで ヒト肝再生障害を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 試験管内の肝毒性テストのための、請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 薬剤としての請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 肝臓組織の退化のような組織退化によって生じる疾患および/または病状の治療および/または予防するのための医薬製品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 肝臓疾患治療用の医薬品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 原発性胆汁性肝硬変を含む自動免疫性障害、脂質異常症を含んでいる代謝障害、2型糖尿病、肥満、アルコール等の濫用によって生じる肝臓疾患、B型肝炎、C型肝炎及びA型肝炎などのウイルスによって生じる疾患、調合薬に対する鋭い中毒反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌を患っている患者の腫瘍除去からなる群から選択される肝臓疾患を治療および/または予防する医薬品の製造のための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 代謝病状および/または疾患を治療および/または予防する医薬品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
- 代謝的に改善された肝細胞様細胞を得るための請求項48〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
- 肝細胞様細胞の成熟を研究するための請求項48〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
- 請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物への細胞をさらすことから成る工程、及び、合成物が細胞に有毒かをどうか測定する工程を含む肝細胞性毒性の合成物をスクリーニング方法。
- 請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物へ細胞をさらす工程、合成物との接触による細胞のいかなる表現型又は代謝変化を決定する工程、変化を肝細胞性機能を調整する能力に関連づける工程を含む肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニング方法。
- 請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団を得るために、
i)少なくとも5日間、無血清培地内の支持マトリックス上のhBS細胞から由来するhBS細胞または原種を試験管での分化する工程、
ii)約5日乃至約25日ごとに媒介物を変える工程、
iii)機械的隔離によって細胞を分離する工程、
iv)酵素処理によりステップiii)で得られる細胞を任意に解離する工程、
v)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする工程を含む方法。 - hBS細胞に由来する原種が、少なくとも一つのHNF3ベータ及びAFPを示し、増殖能を有する請求項73に記載の方法。
- 無血清培地が、bFGFから成るVitroHES(商標)である請求項73または74に記載の方法。
- bFGFの濃度が、約4ng/mlから約200ng/mlまでであり、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100のng/ml、約4ng/mlから約50のng/mlまで、または約4ng/mlから約10のng/mlまでである請求項73〜75のいずれかに記載の方法。
- bFGFの濃度が、少なくとも4ng/mlである請求項75に記載の方法。
- ステップi)の試験管内分化が、少なくとも10日間、例えば、少なくとも20日間、少なくとも30日間または少なくとも40日間実行される請求項73〜77のいずれかに記載の方法。
- 支持マトリックスがヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含む請求項73〜78のいずれかに記載の方法。
- 支持マトリックスが、定義済みまたは未定義組成物の細胞外基質を含む請求項73〜78のいずれかに記載の方法。
- 支持マトリックスが、細胞培養のために使用されるプラスチック細胞培養容器の中の内側にコーティングされ、一つ以上のタンパク質の単独または組合せからなるコーティングを含む請求項80に記載の方法。
- 支持マトリックスが、三次元環境、例えば多孔性フィルタを含む請求項73〜81のいずれかに記載の方法。
- 多孔性フィルタが、直径が約4μmの孔サイズを有する請求項82に記載の方法。
- 多孔性フィルタが、単独または組合せによる一つ以上のタンパク質にコーティングされる請求項82〜83のいずれかに記載の方法。
- 一つ以上タンパク質が、コラーゲン、ラミニン及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項81〜84のいずれかに記載の方法。
- ステップii)が、約10日間乃至約20日間ごとに実行される請求項73〜85のいずれかに記載の方法。
- ステップii)が、14日から15日間ごとに実行される請求項73〜86のいずれかによる方法。
- i)請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団、
ii)一つ以上の成熟因子および/または成熟培養基、及び
iii)任意に、使用説明書、
を含むキット。 - 成熟培養基が、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)、あらかじめ自己調整されたVitroHES(商標)、及び肝細胞特異的な培養基からなる群から選択される請求項88に記載のキット。
- 一つ以上の成熟因子が、bFGF、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンMからなる群から選択される請求項88または89に記載のキット。
- 成熟をモニタする道具をさらに含む請求項89に記載のキット。
- 成熟をモニタするための道具が、
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択されるマーカー発現を記録する、少なくとも3つ、少なくとも4つまたは少なくとも5つの遺伝子に対抗するPCRプライマー、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項91に記載のキット。 - 成熟をモニタする道具が、
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択される、少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つのマーカー発現抗原に対する抗体、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項90または91に記載のキット。
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