JP2023542973A - ラフト培養物及びその作製方法 - Google Patents

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Abstract

天然の器官構造により近似する食道ラフト培養組成物が本明細書に開示される。これらの食道ラフト培養物はまた、腸内神経堤細胞との組み合わせにより神経支配され得る。これらのラフト培養組成物は、細胞小器官の機能、発達、及び組織化の研究などの目的に有利である。当該食道ラフト培養組成物を産生する方法も本明細書に開示される。【選択図】図１

Description

連邦政府支援の研究開発に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＰ０１ ＨＤ０９３３６３の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本開示の態様は、一般に、食道ラフト培養組成物及び当該食道ラフト培養組成物を作製する方法に関する。本明細書に開示されるラフト培養物は、天然の器官構造により近似する。
オルガノイドなどの三次元（Three-dimensional、３Ｄ）細胞培養は、従来の二次元培養系と比較して、生物学的機能及び発達のモデルとして非常に有望である。これらの３Ｄ培養は、薬理学的挙動、細胞シグナル伝達、がんの形成及び遊走、又は移植／グラフトなどの適用のためにインビボで見出される器官の特徴をより正確に反映する可能性を有する。しかしながら、生きている生物に見出される複雑な構造を模倣する器官組織のインビトロ形成は、依然として新しい分野である。
現在、例えば、より効率的で、安価で、時間がかからない、より正確な３Ｄ器官モデル及びその作製方法が必要とされている。また、顕著な安全性及び調節の影響を有し得る異種構成要素を任意選択で回避する培養調製物が現在必要とされている。分化した前方前腸細胞からの食道ラフト培養物及びその中間細胞組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、中間細胞組成物は、背側前方前腸細胞及び／又は食道前駆細胞を含む。当該食道ラフト培養物及びその中間細胞組成物を産生する方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはＦＧＦ経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、任意選択で、神経前駆体阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させることを含む。いくつかの実施形態では、次いで、背側前方前腸細胞を単一細胞に解離させ、第１の組織培養容器内で培養して、背側前方前腸細胞を拡大し、それらを食道前駆細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、次いで、拡大させた食道前駆細胞を単一細胞に解離させ、インサート部材（例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ又は細胞インサート）内及び／若しくはその表面上又は、で培養し、この場合、インサート部材は、第２の組織培養容器内に配置され、インサート部材は、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含む。いくつかの実施形態では、インサート部材及び第２の組織培養容器は各々、食道前駆細胞が成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を含む。いくつかの実施形態では、次いで、食道前駆細胞をインサート部材内で培養し、この場合、第２の組織培養容器及び／又はインサート部材は、食道前駆細胞が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容して、食道ラフト培養物を産生する。いくつかの実施形態では、第２の組織培養容器は、第１の組織培養容器と同じである。いくつかの実施形態では、部分的に浸漬された食道前駆細胞又は食道ラフト培養物は、気液界面において培養される。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は、胚体内胚葉細胞から分化する。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞又は胚体内胚葉細胞は、人工多能性幹細胞から分化する。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。
本明細書に開示される方法及び組成物において、食道前駆細胞はまた、神経支配された食道ラフト培養物を調製するために、腸内神経堤細胞と混合され得る。
本明細書で提供される本開示の実施形態は、以下の番号付けされた代替形態によって説明される。
代替形態１．インビトロ食道ラフト培養物であって、
基底上層及び基底層を含む、重層扁平上皮層と、
筋線維を含む、間葉層と、を含み、
重層扁平上皮がＥ－カドヘリン＋であり、基底上層がＫＲＴ１３＋及びＫＲＴ８＋であり、基底層が、ＳＯＸ２＋、Ｐ６３＋、及びＫＲＴ５＋であり、
間葉層が、ＦＯＸＦ１＋、ＮＫＸ６－１＋、及びビメンチン＋であり、筋線維がデスミン＋である、インビトロ食道ラフト組成物。
代替形態２．食道ラフト培養物が、固有層を欠くか、又はラフト培養物と同じ種の成体動物由来の食道組織と比較して固有層が低減している、代替形態１に記載の食道ラフト培養物。
代替形態３．ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの成長培地を更に含む、代替形態１又は２に記載の食道ラフト培養物。
代替形態４．組織培養容器及びインサート部材を更に含み、
食道ラフト培養物がインサート部材内に配置され、インサート部材が組織培養容器内に配置され、
インサート部材が、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含む、代替形態１～３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態５．インサート部材が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、代替形態４に記載の食道ラフト培養物。
代替形態６．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、代替形態５に記載の食道ラフト培養物。
代替形態７．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、代替形態５又は６に記載の食道ラフト培養物。
代替形態８．細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラーゲンＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、代替形態５～７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態９．インサート部材及び組織培養容器が各々、食道ラフト培養物が成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を収容する、代替形態４～８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１０．インサート部材が、ＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせを更に含み、組織培養容器が、ＥＧＦ経路活性化剤を含む、代替形態９に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１１．インサート部材が成長培地を収容せず、組織培養容器が、食道ラフト培養物が成長培地中に部分的に浸漬されるような量の成長培地を収容し、
重層扁平上皮が、成長培地中に部分的に浸漬されるか、又は浸漬されておらず、気液界面に位置する、代替形態４～８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１２．組織培養容器が、ＥＧＦ経路活性化剤を含む、代替形態１１に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１３．インサート部材が、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下である細孔サイズ、あるいは前述のサイズのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細孔サイズを有する、代替形態４～１２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１４．インサート部材が、３μｍの細孔サイズを有する、代替形態４～１３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１５．インビトロ細胞培養物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化因子、若しくは成長補助剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤）、又はそれらの任意の組み合わせで処理された背側前方前腸細胞に由来する食道前駆細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養物。
代替形態１６．ケラチノサイトＳＦＭ又は他の無血清培地などの成長培地を更に含む、代替形態１５記載の細胞培養物。
代替形態１７．成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤若しくはウシ下垂体抽出物（bovine pituitary extract、ＢＰＥ）、又は両方を含む、代替形態１６に記載の細胞培養物。
代替形態１８．
ＥＧＦ経路活性化剤が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度にあるか、あるいは
ＢＰＥが、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度にあるか、あるいは両方である、代替形態１７に記載の細胞培養物。
代替形態１９．組織培養容器を更に含む、代替形態１５～１８のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２０．組織培養容器が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、代替形態１９に記載の細胞培養物。
代替形態２１．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、代替形態２０に記載の細胞培養物。
代替形態２２．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、代替形態２０又は２１に記載の細胞培養物。
代替形態２３．細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラージュＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、代替形態２０～２２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２４．ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、代替形態１５～２３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２５．インビトロ細胞培養物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
代替形態２６．ＲＰＭＩなどの成長培地を更に含み、任意選択で、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、若しくは０．５％ＦＢＳなどのＦＢＳ、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージのＦＢＳを含む、代替形態２５の細胞培養物。
代替形態２７．組織培養容器を更に含む、代替形態２５又は２６に記載の細胞培養物。
代替形態２８．食道ラフト培養物又は細胞培養物が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８日間成長している代替形態１～１４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物又は代替形態１５～２７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２９．食道ラフト培養物又は細胞培養物が、ヒト人工多能性幹細胞に由来する、代替形態２８に記載の食道ラフト培養物又は細胞培養物。
代替形態３０．食道ラフト培養物又は細胞培養物が、スフェロイド又はオルガノイドに由来しない、代替形態２８又は２９に記載の食道ラフト培養物又は細胞培養物。
代替形態３１．食道ラフト培養物を産生する方法であって、
（ａ）前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させることと、
（ｂ）工程（ａ）からの背側前方前腸細胞を単一細胞に解離させることと、
（ｃ）背側前方前腸細胞を第１の組織培養容器内で培養して、背側前方前腸細胞を食道前駆細胞に分化させることと、
（ｄ）工程（ｃ）からの食道前駆細胞を単一細胞に解離させることと、
（ｅ）食道前駆細胞をインサート部材内で培養することであって、
インサート部材が、第２の組織培養容器内に配置され、
インサート部材が、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含み、
インサート部材及び第２の組織培養容器が各々、食道前駆細胞が成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を収容する、培養することと、
（ｆ）食道前駆細胞をインサート部材内で培養することであって、インサート部材が成長培地を収容せず、第２の組織培養容器が、食道前駆細胞が成長培地中に部分的に浸漬されるような量の成長培地を収容する、培養することと、を含む、方法。
代替形態３２．食道前駆細胞が、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、又はＡｃｃｕｔａｓｅなどの解離酵素を使用して解離される、代替形態３１に記載の方法。
代替形態３３．第１の組織培養容器及び／又は第２の組織培養容器が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、代替形態３１又は３２に記載の方法。
代替形態３４．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、代替形態３３に記載の方法。
代替形態３５．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、代替形態３３又は３４に記載の方法。
代替形態３６．細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラーゲンＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、代替形態３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
代替形態３７．（ａ）の接触工程が、少なくとも１、２、３、４、又は５日間にわたって行われる、代替形態３１～３６のいずれか一項に記載の方法。
代替形態３８．（ｃ）の培養工程が、少なくとも１、２、３、４、又は５日間にわたって行われる、代替形態３１～３７のいずれか一項に記載の方法。
代替形態３９．（ｅ）の培養工程が、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８日間にわたって行われる、代替形態３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４０．（ｆ）の培養工程が、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間にわたって行われる、代替形態３１～３９のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４１．工程（ｃ）の背側前方前腸細胞が、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＰＥ、ＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせとともに培養される、代替形態３１～４０のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４２．工程（ｅ）の食道前駆細胞が、インサート部材の成長培地中のＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ、及び第２の組織培養容器の成長培地中のＥＧＦとともに培養される、代替形態３１～４１のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４３．工程（ｆ）の食道前駆細胞が、第２の組織培養容器の成長培地中でＥＧＦ経路活性化剤とともに培養される、代替形態３１～４２のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４４．前方前腸細胞がヒト人工多能性幹細胞に由来する、代替形態３１～４３のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４５．前方前腸細胞が胚体内胚葉細胞に由来し、胚体内胚葉細胞がヒト人工多能性幹細胞に由来する、代替形態３１～４４のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４６．胚体内胚葉細胞が、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせで処理されている、代替形態４５に記載の方法。
代替形態４７．胚体内胚葉細胞を、１、２、３、４、又は５日間処理する、代替形態４５又は４６に記載の方法。
代替形態４８．ヒト人工多能性幹細胞が、ＢＭＰ４及び／又はアクチビンＡで処理される、代替形態４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４９．前記ヒト人工多能性幹細胞が、１、２、３、４、又は５日間処理される、代替形態４４～４８のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５０．
ヒト人工多能性幹細胞をＢＭＰ４及び／又はアクチビンＡと接触させて、前記ヒト人工多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることと、
前記胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、前記胚体内胚葉細胞を工程（ａ）の前方前腸細胞に分化させることと、を更に含む、代替形態３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５１．前記ヒト人工多能性幹細胞を、１、２、３、４、又は５日間接触させる、代替形態５０に記載の方法。
代替形態５２．前記胚体内胚葉細胞を、１、２、３、４、又は５日間接触させる、代替形態５０又は５１に記載の方法。
代替形態５３．インビトロ食道ラフト組成物であって、
基底上層及び基底層を含む、重層扁平上皮層と、
筋線維を含む、間葉層と、を含み、
前記重層扁平上皮がＥ－カドヘリン＋であり、基底上層がＫＲＴ１３＋及びＫＲＴ８＋であり、基底層が、ＳＯＸ２＋、Ｐ６３＋、及びＫＲＴ５＋であり、
間葉層が、ＦＯＸＦ１＋、ＮＫＸ６－１＋、及びビメンチン＋であり、筋線維がデスミン＋である、インビトロ食道ラフト組成物。
代替形態５４．インビトロ細胞組成物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞に由来する背側前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
代替形態５５．インビトロ細胞組成物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
代替形態５６．食道ラフト細胞組成物が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～５５のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態５７．食道ラフト細胞組成物が、約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～５６のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態５８．食道ラフト組成物が、約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２の表面積、又は前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積を有する、代替形態１～５７のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態５９．食道ラフト組成物が、約０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２の表面積、又は前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積を有する、代替形態１～５８のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６０．食道ラフト組成物が、約１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３の体積、又は前述の体積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の体積を有する、代替形態１～５９のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６１．重層扁平上皮細胞層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６０のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６２．重層扁平上皮細胞層が、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６１のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６３．基底上層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６２のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６４．基底上層が、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６３のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６５．基底上層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６４のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６６．基底層が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６５のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６７．間葉層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６６のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６８．間葉層が、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～６７のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態６９．ＥＧＦ経路活性化剤が、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～６８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７０．ＥＧＦ経路活性化剤がＥＧＦである、代替形態１～６９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７１．ＥＧＦ経路活性化剤が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～７０のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７２．ＥＧＦ経路活性化剤が、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、代替形態１～７１のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７３．ＢＭＰ経路阻害剤が、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～７２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７４．ＢＭＰ経路阻害剤がノギンである、代替形態１～７３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物
代替形態７５．ＢＭＰ経路阻害剤が、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～７４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７６．ＢＭＰ経路阻害剤が、２００ｎｇ／ｍＬ又は約２００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、代替形態１～７５のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７７．ＦＧＦ経路活性化剤が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、若しくはＦＧＦ２３、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～７６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７８．ＦＧＦ経路活性化剤がＦＧＦ１０である、代替形態１～７７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態７９．ＦＧＦ経路活性化剤が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～７８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８０．ＦＧＦ経路活性化剤が、５０ｎｇ／ｍＬ又は約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、代替形態１～７９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８１．成長補助剤が、無血清成長補助剤である、代替形態１～８０のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８２．補助剤が、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤である、代替形態１～８１のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８３．補助剤が、１倍又は約１倍の濃度で提供される、代替形態１～８２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８４．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｙ－３０１４１、Ｙ－３９９８３、Ｋｉ－２３０９５、ＳＬｘ－２１１９、チアゾビビン、アザインドール１、ファスジル、リパスジル、ネタルスジル、ＲＫＩ－１４４７、若しくはＧＳＫ４２９２８６Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～８３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８５．ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、代替形態１～８４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８６．ＲＯＣＫ阻害剤が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～８５のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８７．ＲＯＣＫ阻害剤が、１０μＭ又は約１０μＭの濃度で提供される、代替形態１～８６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８８．ＳＭＡＤ阻害剤が、Ａ－８３－０１、ＤＭＨ１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２５、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ヘスペレチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～８７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８９．ＳＭＡＤ阻害剤が、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１である、代替形態１～８８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９０．ＳＭＡＤ阻害剤が、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～８９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９１．ＳＭＡＤ阻害剤が、１μＭ又は約１μＭの濃度で提供される、代替形態１～９０のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
本明細書で提供される本開示の追加の実施形態は、以下の代替的に番号付けされた代替形態によって説明される。
代替形態１．インビトロ食道ラフト培養物であって、
基底上層及び基底層を含む、重層扁平上皮層と、
筋線維を含む、間葉層と、を含み、
重層扁平上皮がＥ－カドヘリン＋であり、基底上層がＫＲＴ１３＋及びＫＲＴ８＋であり、基底層が、ＳＯＸ２＋、Ｐ６３＋、及びＫＲＴ５＋であり、
間葉層が、ＦＯＸＦ１＋、ＮＫＸ６－１＋、及びビメンチン＋であり、筋線維がデスミン＋である、インビトロ食道ラフト組成物。
代替形態２．食道ラフト培養物が、固有層を欠くか、又はラフト培養物と同じ種の成体動物由来の食道組織と比較して固有層が低減している、代替形態１に記載の食道ラフト培養物。
代替形態３．成長培地、任意選択でＤＭＥＭ／Ｆ１２を更に含む、代替形態１又は２に記載の食道ラフト培養物。
代替形態４．
食道ラフト培養物が、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含むインサート部材内及び／又はその表面上に位置し、インサート部材が、組織培養容器内に配置され、
任意選択で、食道ラフト培養物が、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面上に配置されている、代替形態１～３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態５．インサート部材の少なくとも一部分、任意選択で成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、代替形態４に記載の食道ラフト培養物。
代替形態６．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、代替形態５に記載の食道ラフト培養物。
代替形態７．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、代替形態５又は６に記載の食道ラフト培養物。
代替形態８．細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラーゲンＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、代替形態５～７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態９．インサート部材及び／又は組織培養容器が、食道ラフト培養物が成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を収容する、代替形態４～８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１０．インサート部材内に収容される成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせを更に含み、組織培養容器内に収容される成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤を含む、代替形態９に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１１．組織培養容器及び／又はインサート部材が、食道ラフト培養物が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容し、
重層扁平上皮が、成長培地中に部分的にのみ浸漬されるか、又は浸漬されておらず、気液界面を形成し、かつ／又は気液界面に位置する、代替形態４～８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１２．組織培養容器内に収容される成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤を含む、代替形態１１に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１３．インサート部材の透過性である表面が、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下である細孔サイズ、あるいは前述のサイズのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細孔サイズを有する、代替形態４～１２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１４．インサート部材の透過性である表面が、３μｍの細孔サイズを有する、代替形態４～１３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１５．食道ラフト培養物が、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上含まない、代替形態１～１４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１６．食道ラフト培養物が神経支配された食道ラフト培養物であるように、食道ラフト培養物が腸内神経堤細胞（enteric neural crest cell、ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞、及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を更に含み、任意選択で、神経前駆細胞がＳＯＸ１０＋である、代替形態１～１４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養。
代替形態１７．食道ラフト培養物が、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を有しない、代替形態１～１６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
代替形態１８．インビトロ細胞培養物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された背側前方前腸細胞に由来する食道前駆細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養物。
代替形態１９．背側前方前腸細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンでも処理されている、代替形態１８に記載の細胞培養物。
代替形態２０．成長培地、任意選択で無血清培地、任意選択で、ケラチノサイトＳＦＭを更に含む、代替形態１８又は１９に記載の細胞培養物。
代替形態２１．成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤若しくはウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）、又は両方を含む、代替形態２０に記載の細胞培養物。
代替形態２２．
ＥＧＦ経路活性化剤が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度にあるか、あるいは
ＢＰＥが、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度にあるか、あるいは両方である、代替形態２１に記載の細胞培養物。
代替形態２３．細胞培養物が、組織培養容器内及び／又はその表面上に位置する、代替形態１８～２２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２４．組織培養容器の少なくとも一部分が、細胞外マトリックス又はその旺盛要素でコーティングされ、当該食道前駆細胞の集団が、当該部分上にあるか、又はそれと接触している、代替形態２３に記載の細胞培養物。
代替形態２５．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、代替形態２４に記載の細胞培養物。
代替形態２６．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、代替形態２４又は２５に記載の細胞培養物。
代替形態２７．細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラージュＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、代替形態２４～２７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２８．ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、代替形態１８～２７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態２９．腸内神経堤細胞を更に含む、代替形態１８～２８のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態３０．インビトロ細胞培養物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
代替形態３１．前方前腸細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、代替形態３０に記載の細胞培養物。
代替形態３２．成長培地、任意選択で、ＲＰＭＩ、任意選択で、ＦＢＳ、任意選択で、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、若しくは２．５％のＦＢＳ、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージのＦＢＳを更に含む、代替形態３０又は３１に記載の細胞培養物。
代替形態３３．当該細胞培養物が、組織培養容器の中及び／又はその表面上に位置する、代替形態３０～３２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態３４．食道ラフト培養物又は細胞培養物が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８日間成長している、代替形態１～１７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物又は代替形態１８～３３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
代替形態３５．食道ラフト培養物又は細胞培養物が、ヒト人工多能性幹細胞に由来する、代替形態３４に記載の食道ラフト培養物又は細胞培養物。
代替形態３６．食道ラフト培養物又は細胞培養物が、スフェロイド又はオルガノイドに由来しない、代替形態３４又は３５に記載の食道ラフト培養物又は細胞培養物。
代替形態３７．食道ラフト培養物を産生する方法であって、
（ａ）前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させることと、
（ｂ）工程（ａ）からの背側前方前腸細胞を単一細胞に解離させることと、
（ｃ）背側前方前腸細胞を第１の組織培養容器内で培養して、背側前方前腸細胞を食道前駆細胞に分化させることと、
（ｄ）工程（ｃ）からの食道前駆細胞を単一細胞に解離させることと、
（ｅ）食道前駆細胞を、インサート部材内及び／又はその表面上で培養することであって、
インサート部材が、第２の組織培養容器内に配置され、
インサート部材が、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含み、
インサート部材及び第２の組織培養容器が各々、食道前駆細胞が成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を収容する、培養することと、
（ｆ）食道前駆細胞をインサート部材内で培養することであって、第２の組織培養容器及び／又はインサート部材が、食道前駆細胞が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容する、培養することと、を含む、方法。
代替形態３８．前方前腸細胞を、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンと更に接触させる、代替形態３７に記載の方法。
代替形態３９．食道前駆細胞が、解離酵素、任意選択で、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、又はＡｃｃｕｔａｓｅを使用して解離される、代替形態３７又は３８に記載の方法。
代替形態４０．第１の組織培養容器及び／又は第２の組織培養容器の少なくとも一部分が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、代替形態３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４１．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、代替形態４０に記載の方法。
代替形態４２．細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、代替形態４０又は４１に記載の方法。
代替形態４３．細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラーゲンＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、代替形態４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４４．（ａ）の接触工程が、少なくとも１、２、３、４、又は５日間にわたって行われる、代替形態３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４５．（ｃ）の培養工程が、少なくとも１、２、３、４、又は５日間にわたって行われる、代替形態３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４６．（ｅ）の培養工程が、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８日間にわたって行われる、代替形態３７～４５のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４７．（ｆ）の培養工程が、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間にわたって行われる、代替形態３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４８．工程（ｃ）の背側前方前腸細胞が、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＰＥ、ＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせとともに培養される、代替形態３７～４７のいずれか一項に記載の方法。
代替形態４９．工程（ｅ）の食道前駆細胞が、インサート部材の成長培地中のＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ、及び第２の組織培養容器の成長培地中のＥＧＦとともに培養される、代替形態３７～４８のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５０．工程（ｆ）の食道前駆細胞が、第２の組織培養容器の成長培地中でＥＧＦ経路活性化剤とともに培養される、代替形態３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５１．前方前腸細胞がヒト人工多能性幹細胞に由来する、代替形態３７～５０のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５２．前方前腸細胞が胚体内胚葉細胞に由来し、胚体内胚葉細胞がヒト人工多能性幹細胞に由来する、代替形態３７～５１のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５３．胚体内胚葉細胞が、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、Ｎｏｇｇｉｎ、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせで処理されて、胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させる、代替形態５２に記載の方法。
代替形態５４．胚体内胚葉細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、代替形態５３に記載の方法。
代替形態５５．胚体内胚葉細胞が、１、２、３、４、又は５日間処理されている、代替形態５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５６．ヒト人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためにＢＭＰ４及び／又はアクチビンＡで処理されている、代替形態５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５７．ヒト人工多能性幹細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、代替形態５６に記載の方法。
代替形態５８．ヒト人工多能性幹細胞が、１、２、３、４、又は５日間処理されている、代替形態５１～５７のいずれか一項に記載の方法。
代替形態５９．
ヒト人工多能性幹細胞をＢＭＰ４及び／又はアクチビンＡと接触させて、ヒト人工多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることと、
胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、胚体内胚葉細胞を工程（ａ）の前方前腸細胞に分化させることと、を更に含む、代替形態３７～５８のいずれか一項に記載の方法。
代替形態６０．ヒト人工多能性幹細胞及び／又は胚体内胚葉細胞を、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンと更に接触させる、代替形態５９に記載の方法。
代替形態６１．ヒト人工多能性幹細胞を、１、２、３、４、又は５日間接触させる、代替形態５９又は６０に記載の方法。
代替形態６２．胚体内胚葉細胞を、１、２、３、４、又は５日間接触させる、代替形態５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
代替形態６３．食道ラフト培養物が、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上に含まない、代替形態３７～６２のいずれか一項に記載の方法。
代替形態６４．工程（ｄ）の解離された食道前駆細胞を、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）と組み合わせることと、工程（ｅ）及び（ｆ）に従って組み合わされた食道前駆細胞及びＥＮＣＣを培養して、神経支配された食道ラフト培養物を産生することと、を更に含む、代替形態３７～６３のいずれか一項に記載の方法。
代替形態６５．神経支配された食道ラフト培養物が、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を含み、任意選択で、神経前駆細胞がＳＯＸ１０＋である、代替形態６４に記載の方法。
代替形態６６．食道ラフト培養物が、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を含まない、代替形態３７～６５のいずれか一項に記載の方法。
代替形態６７．インビトロ細胞組成物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞に由来する背側前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
代替形態６８．インビトロ細胞組成物であって、
ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
代替形態６９．前方前腸細胞の集団が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、代替形態６８に記載の細胞組成物。
代替形態７０．インビトロ食道ラフト組成物であって、
基底上層及び基底層を含む、重層扁平上皮層と、
筋線維を含む、間葉層と、を含み、
重層扁平上皮がＥ－カドヘリン＋であり、基底上層がＫＲＴ１３＋及びＫＲＴ８＋であり、基底層が、ＳＯＸ２＋、Ｐ６３＋、及びＫＲＴ５＋であり、
間葉層が、ＦＯＸＦ１＋、ＮＫＸ６－１＋、及びビメンチン＋であり、筋線維がデスミン＋である、インビトロ食道ラフト組成物。
代替形態７１．食道ラフト細胞組成物が、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上含まない、代替形態７０に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７２．食道ラフト培養物が神経支配された食道ラフト培養物であるように、食道ラフト細胞組成物が腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞、及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を更に含み、任意選択で、神経前駆細胞がＳＯＸ１０＋である、代替形態７０に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７３．食道ラフト細胞組成物が、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を含まない、代替形態７０～７２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養細胞組成物。
代替形態７４．食道ラフト細胞組成物が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～７３のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７５．食道ラフト細胞組成物が、約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～７４のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７６．食道ラフト組成物が、約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２の表面積、又は前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積を有する、代替形態１～７５のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７７．食道ラフト組成物が、約０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２の表面積、又は前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積を有する、代替形態１～７６のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７８．食道ラフト組成物が、約１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３の体積、又は前述の体積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の体積を有する、代替形態１～７７のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態７９．重層扁平上皮細胞層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～７８のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８０．重層扁平上皮細胞層が、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～７９のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８１．基底上層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～８０のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８２．基底上層が、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～８１のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８３．基底上層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～８２のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８４．基底層が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～８３のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８５．間葉層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～８４のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８６．間葉層が、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、代替形態１～８５のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
代替形態８７．ＥＧＦ経路活性化剤が、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～８６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８８．ＥＧＦ経路活性化剤がＥＧＦである、代替形態１～８７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態８９．ＥＧＦ経路活性化剤が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～８８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９０．ＥＧＦ経路活性化剤が、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、代替形態１～８９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９１．ＢＭＰ経路阻害剤が、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～９０のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９２．ＢＭＰ経路阻害剤がノギンである、代替形態１～９１のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９３．ＢＭＰ経路阻害剤が、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～９２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９４．ＢＭＰ経路阻害剤が、２００ｎｇ／ｍＬ又は約２００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、代替形態１～９３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９５．ＦＧＦ経路活性化剤が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、若しくはＦＧＦ２３、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～９４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９６．ＦＧＦ経路活性化剤がＦＧＦ１０である、代替形態１～９５のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９７．ＦＧＦ経路活性化剤が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～９６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９８．ＦＧＦ経路活性化剤が、５０ｎｇ／ｍＬ又は約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、代替形態１～９７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態９９．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｙ－３０１４１、Ｙ－３９９８３、Ｋｉ－２３０９５、ＳＬｘ－２１１９、チアゾビビン、アザインドール１、ファスジル、リパスジル、ネタルスジル、ＲＫＩ－１４４７、若しくはＧＳＫ４２９２８６Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～９８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１００．ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、代替形態１～９９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１０１．ＲＯＣＫ阻害剤が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～１００のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１０２．ＲＯＣＫ阻害剤が、１０μＭ又は約１０μＭの濃度で提供される、代替形態１～１０１のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１０３．ＳＭＡＤ阻害剤が、Ａ－８３－０１、ＤＭＨ１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２５、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ヘスペレチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替形態１～１０２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１０４．ＳＭＡＤ阻害剤が、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１である、代替形態１～１０３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１０５．ＳＭＡＤ阻害剤が、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、代替形態１～１０４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
代替形態１０６．ＳＭＡＤ阻害剤が、１μＭ又は約１μＭの濃度で提供される、代替形態１～１０５のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
本明細書で説明される特徴に加えて、追加の特徴及び変形が、以下の図面及び例示的な実施形態の説明から容易に明らかになるであろう。これらの図面は、実施形態を示し、範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
本明細書に記載の食道ラフト培養物を産生するための概略図の実施形態を示す。 上皮及び間葉を含む食道ラフト培養物の実施形態を示す。ラフト培養物の頂端層は、食道上皮マーカーＳＯＸ２及びＰ６３、並びに一般的な上皮マーカーＥ－カドヘリン（E-cadherin、Ｅｃａｄ）を発現する（パネルＡ）。上皮は、別個の層において基底（ＫＲＴ５）層及び基底上（ＫＲＴ１３及びＫＲＴ８）層マーカーを発現する重層扁平上皮である（パネルＢ）。２つの異なる層は、ヘマトキシリン／エオシン染色において特定することができる（パネルＣ）。ラフト培養基底層は、間葉マーカーＦＯＸＦ１、ＮＫＸ６－１（パネルＤ）、及びビメンチン（パネルＥ）を発現する。間葉は分化した筋線維のマーカー（デスミン）を発現する（パネルＦ）。細胞核は、一般的なマーカーとしてＤＡＰＩで標識される。スケールバーは１００μｍである。特徴的なマーカーを有する上皮及び間葉の別個の層を有する食道ラフト培養物の概略図も示される（パネルＧ）。 本明細書に記載の食道ラフト培養物を産生するための概略図の実施形態を示し、任意選択の神経前駆体阻害剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤［Ｃｕｌｔ１］）が０～９日目から添加される。神経前駆体阻害剤の添加は、食道ラフト培養物の分化中の神経細胞型の拡大を防止するが、これはいくつかの目的には望ましくない可能性がある。 ０～９日目又は６～９日目のいずれかから神経前駆体阻害剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤）を使用して分化させた食道ラフト培養物を示す実施形態の免疫蛍光画像を示す。食道ラフト培養物を、１）ヘマトキシリン及びエオシン、２）ＳＯＸ２、３）Ｅ－カドヘリン（Ｅｃａｄ）、４）ＳＯＸ、Ｅｃａｄ、及びＤＡＰＩの混合、又は５）βＩＩＩ－チューブリン及びＤＡＰＩについて染色した。破線は間葉－上皮境界を示す。矢印は、６日目以降にＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅのみで処理したラフト培養物の間葉における神経細胞型の存在を示す。これらの神経細胞型は、０～９日目からＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅで成長させた培養物には見られない。神経細胞型は、間葉層におけるＳＯＸ２及びβＩＩＩ－チューブリン（矢印）の発現によって示される。 神経支配された食道ラフト培養物を産生するための実施形態の概略図を示す。食道前駆細胞及び腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）をｈＰＳＣから別個に分化させ、細胞インサート上で共培養して、腸内神経によって神経支配された間葉を有する食道ラフト培養物を生成する。 神経支配された食道ラフト培養物を示す実施形態の免疫蛍光画像を示す。神経支配された食道ラフト培養物を、１）ＳＯＸ２、Ｐ６３、Ｅｃａｄ、及びＤＡＰＩ、２）ＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、及びＤＡＰＩ、３）ＧＦＰ（ＥＮＣＣによって発現される）、ビメンチン、ＫＲＴ８、及びＤＡＰＩ、又は４）ＧＦＰ（ＥＮＣＣによって発現される）、βＩＩＩ－チューブリン、ＫＲＴ８、及びＤＡＰＩから染色した。ＥＮＣＣ神経支配された食道ラフト培養物は、食道上皮マーカーＳＯＸ２、Ｐ６３、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、及びＫＲＴ８、並びに一般的な上皮マーカーＥ－カドヘリン（Ｅｃａｄ）を発現する。ＧＦＰ発現ＥＮＣＣ（矢印）は、ビメンチン発現によって示される食道ラフト培養間葉を神経支配する。ＧＦＰ発現ＥＮＣＣは、神経マーカーβＩＩＩ－チューブリンと共局在し、それらの腸内神経への分化を示す。
本明細書では、ｉＰＳＣ由来食道ラフト培養物及び食道ラフト細胞組成物が開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の食道ラフト培養物及び食道ラフト細胞組成物は、ヒトｉＰＳＣから産生される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物及び食道ラフト細胞組成物は、食道上皮及び食道間葉を含む。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物及び食道ラフト細胞組成物は、神経前駆体の阻害剤（すなわち、神経前駆細胞及び神経細胞型の成長及び／又は分化を阻害する化合物）とともに培養することによって、神経細胞型を排除するように成長させることができる。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物及び食道ラフト組成物は、食道ラフト培養物又はその前駆体、例えば、食道前駆細胞を、神経細胞型に分化する腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）とともに培養することによって、神経支配されるように成長させることができる。食道ラフト培養物及び食道ラフト細胞組成物を作製する方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物及び食道ラフト細胞組成物は、食道オルガノイドとは異なる。胚性器官形成を制御する因子を操作することによって、インビトロ方法は、ＰＳＣの胚生殖細胞系列への段階的分化、その後の上皮細胞、間葉細胞、筋細胞、神経細胞、及び血管細胞などの特定の細胞型への段階的分化を誘導するために開発されている。食道オルガノイドを産生する方法は、国際公開第２０１９／０７４７９３号（参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）において探究されている。他のオルガノイド型及び中間細胞型（例えば、胚体内胚葉及び前方前腸スフェロイド）を産生する更なる方法は、米国特許第９，７１９，０６８号及び同第１０，１７４，２８９号、並びに国際公開第２０１１／１４０４１１号、同第２０１５／１８３９２０号、同第２０１６／０６１４６４号、同第２０１７／１９２９９７号、同第２０１８／１０６６２８号、同第２０１８／２００４８１号、同第２０１８／０８５６１５号、同第２０１８／０８５６２２号、同第２０１８／０８５６２３号、同第２０１８／２２６２６７号、同第２０２０／０２３２４５号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）を使用して神経支配される他のオルガノイド型を作製する方法は、国際公開第２０１６／０６１４６４号（参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）において探究されている。
食道は、口腔及び咽頭から胃への食物の通過を能動的に容易にする。それは、重層扁平上皮、間葉、筋肉層、及び伸展を感知し、蠕動を制御する腸内神経系からなる。食道閉鎖症などの先天性疾患は、管腔の狭窄又は不連続性をもたらす遺伝子変異によって引き起こされる。食道がん、好酸球性食道炎、アカラシア、及び他の運動障害などの他の疾患は、後年に食道に影響を及ぼす。気管及び食道障害は、ヒトにおいて一般的であり、マウスにおいて正確にモデル化することは困難である。改善された食道及び他の胃腸モデルの必要性は明白である。
用語
以下の発明を実施するための形態では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面では、文脈が別途指示しない限り、同様の記号は典型的には、同様の構成要素を特定する。発明を実施するための形態、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図していない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、他の変更が行われてもよい。本明細書で一般的に記載され、図面に図示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、及び設計することができ、それらの全てが本明細書で明示的に企図されることが容易に理解されるだろう。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示に照らして本開示が属する技術分野の当業者によって読まれるときに一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の目的のために、以下の用語を以下に説明する。
本明細書の開示は、多数の実施形態を説明するために肯定的な言葉を使用する。本開示はまた、物質若しくは材料、方法工程及び条件、プロトコル、又は手順などの主題が完全に又は部分的に除外される実施形態を含む。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
「約」とは、参照量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さに対して１０％ほど変動する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを意味する。
本明細書全体を通して、文脈が別途必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含んでいる（comprising）」という語は、記載された工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群を包含することを意味するが、任意の他の工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群を除外することを意味しないことが理解される。「からなる（consisting of）」とは、「からなる（consisting of）」という語句に続くものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要であるか又は必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素について本開示で特定された活性又は作用に干渉又は寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要であるか又は必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に本質的に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、又は「患者」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの明白かつ通常の意味を有し、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類、又はトリ、例えば、ニワトリ、並びに任意の他の脊椎動物又は無脊椎動物を意味する。「哺乳動物」という用語は、その通常の生物学的意味で使用される。したがって、具体的には、サル（チンパンジー、類人猿、サル）及びヒトを含む霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「有効量」又は「有効用量」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの明白かつ通常の意味を有し、観察可能な効果をもたらす列挙された組成物又は化合物の量を指す。本開示の主題の活性組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象及び／又は適用に対して所望の応答を達成するのに有効な活性組成物又は化合物の量を投与するように変更することができる。選択される投薬量レベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、並びに治療される対象の身体的状態及び以前の病歴を含むがこれらに限定されない様々な因子に依存する。いくつかの実施形態では、最小投薬量が投与され、用量は、用量制限毒性の不在下で最小有効量まで漸増される。有効用量の決定及び調整、並びにそのような調整をいつどのように行うかの評価が、本明細書において企図される。
本明細書で使用される場合、「機能」及び「機能的」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの明白かつ通常の意味を有し、生物学的、酵素的、又は治療的機能を指す。
本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、生物学的活性の低減又は防止を指し得る。低減は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％以下であるか、又は約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％以下であるパーセンテージ、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内である量であり得る。本明細書で使用される場合、「遅延させる」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、さもなければ予想されるよりも遅い時間への生物学的事象の緩徐、延期、又は保留を指す。遅延は、０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、１００％、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、少なくとも０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、少なくとも約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以下であるか、若しくは約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以下であるパーセンテージ、又は前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の量であり得る。阻害及び遅延という用語は、必ずしも１００％の阻害又は遅延を示さなくてもよい。部分的な抑制又は遅延が実現され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、（１）最初に産生されたときに（天然及び／又は実験的設定にかかわらず）それが会合していた構成要素のうちの少なくともいくつかから分離された、並びに／又は（２）人の手によって産生、調製、及び／若しくは製造された物質及び／若しくは実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、それらが最初に会合していた他の構成要素の１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％と等しい、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％、少なくとも１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％、１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％以下、又は約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％以下（又は前述の値を含む、及び／若しくはそれに及ぶ範囲）から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された作用物質は、８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％純粋（又は前述の値を含む、及び／若しくはそれに及ぶ範囲）であるか、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、又は１００％純粋であるか、少なくとも８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％純粋であるか、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％純粋であるか、８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％以下純粋であるか、又は約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％以下純粋である。本明細書で使用される場合、「単離された」物質は、「純粋」（例えば、他の構成要素を実質的に含まない）であり得る。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物又は組織に含まれない細胞を指し得る。
本明細書で使用される場合、「インビボ」は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を与えられ、組織抽出物又は死んだ生物とは対照的に、生きている生物、通常は動物、ヒトを含む哺乳動物、及び植物の内部での方法の実施を指す。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を与えられ、天然の状態の変化がほとんどない、生きている生物の外部での方法の実施を指す。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を与えられ、生物学的状態の外部（例えば、ペトリ皿又は試験管中）での方法の実施を指す。
本明細書で使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの明白かつ通常の意味を有し、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）又はリボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、細胞中に天然に出現するもの、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によって生成される断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成される断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）であるモノマー、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性形態）、又は両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾は、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換を含むか、又は糖は、エーテル若しくはエステルとして官能化され得る。更に、糖部分全体を、アザ－糖及び炭素環式糖類似体などの立体的及び電子的に類似する構造で置換することができる。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式置換体が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような連結の類似体によって連結され得る。ホスホジエステル連結の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、又はホスホロアミデートが挙げられる。「核酸分子」という用語はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、これは、ポリアミド骨格に結合した天然に存在する又は修飾された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。「オリゴヌクレオチド」は、核酸と交換可能に使用することができ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを指すことができる。核酸（複数可）は、様々な生物学的系における核酸（複数可）の増幅及び／又は発現のために使用され得る核酸ベクター又は核酸構築物（例えば、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、フォスミド、ファージミド、細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome、ＢＡＣ）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome、ＹＡＣ）、又はヒト人工染色体（human artificial chromosome、ＨＡＣ））中に含まれる。典型的には、ベクター又は構築物はまた、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インデューサー、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、複製起点、クローニング部位、マルチクローニング部位、制限酵素部位、エピトープ、レポーター遺伝子、選択マーカー、抗生物質選択マーカー、標的化配列、ペプチド精製タグ、若しくはアクセサリー遺伝子、又はこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない要素を含む。
核酸又は核酸分子は、異なるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする１つ以上の配列を含むことができる。これらの１つ以上の配列は、隣接して、又は間に余分な核酸、例えば、リンカー、反復、若しくは制限酵素部位を伴って同じ核酸若しくは核酸分子に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長以下である、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の長さの任意の他の配列に連結することができる。本明細書で使用される場合、核酸上の「下流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード配列を含む鎖（センス鎖）上の、前の配列の３’末端の後にある配列を指す。本明細書で使用される場合、核酸上の「上流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード配列を含む鎖（センス鎖）上の、後の配列の５’末端の前にある配列を指す。本明細書で使用される場合、核酸上の「群化された」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、直接的に、又は間に余分な核酸、例えば、リンカー、反復、若しくは制限酵素部位を伴ういずれかで近接して生じる２つ以上の配列、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長以下である、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の長さであるが、一般に、間に機能又は触媒ポリペプチド、タンパク質、若しくはタンパク質ドメインをコードする配列を伴わない任意の他の配列を指す。
本明細書に記載の核酸は、核酸塩基を含む。一次、標準、天然、又は未修飾塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルである。他の核酸塩基としては、プリン、ピリミジン、修飾核酸塩基、５－メチルシトシン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ブロモウラシル、イソグアニン、イソシトシン、アミノアリル塩基、色素標識塩基、蛍光塩基、又はビオチン標識塩基が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの明白かつ通常の意味を有し、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される巨大分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質の多数の機能が当該分野で既知であり、酵素、構造、輸送、防御、ホルモン、又はシグナル伝達が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、常にではないが、しばしば、核酸鋳型を使用してリボソーム複合体によって生物学的に産生されるが、化学合成も利用可能である。核酸鋳型、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を操作することによって、２つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の置換、欠失、切り詰め、付加、複製、若しくは融合などの変異を行うことができる。これらの２つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の融合は、隣接して、又は間に余分なアミノ酸、例えば、リンカー、反復、エピトープ、若しくはタグを伴って同じ分子に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長であるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００塩基長以下である、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の長さの任意の他の配列に連結することができる。本明細書で使用される場合、ポリペプチド上の「下流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、前の配列のＣ末端の後にある配列を指す。本明細書で使用される場合、ポリペプチド上の「上流」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、後の配列のＮ末端の前にある配列を指す。
本明細書で使用される場合、任意の所与の物質、化合物、又は材料の「純度」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、又は材料の実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物、又は材料は、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％純粋（間の全ての小数を含む）であり得る。純度は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞片、小分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクル、若しくは夾雑物、又はそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、望ましくない不純物によって影響され得る。いくつかの実施形態では、物質、化合物、又は材料は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、プラスミドＤＮＡ、混入ウイルス、プロテアソーム、宿主細胞培養構成要素、プロセス関連構成要素、マイコプラズマ、発熱物質、細菌エンドトキシン、及び外来性作用物質を実質的に含まない。純度は、電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、分光法、ＵＶ可視分光法、赤外分光法、質量分析、核磁気共鳴、重量測定、若しくは滴定、又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない技術を使用して測定することができる。
本明細書で使用される場合、任意の所与の物質、化合物、又は材料の「収率」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、予想される全体量に対する物質、化合物、又は材料の実際の全体量を指す。例えば、物質、化合物、又は材料の収率は、予想される全体量の８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％であるか、約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％であるか、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％であるか、少なくとも約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％であるか、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％以下であるか、又は約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％以下（その間の全ての小数を含む）である。収率は、反応若しくはプロセスの効率、望ましくない副反応、分解、投入物質、化合物、若しくは材料の品質、又は産生の任意の工程中の所望の物質、化合物、若しくは材料の消失によって影響を受ける場合がある。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、有効量の本明細書に記載の細胞組成物及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又はそれらの組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物に関する。本明細書に記載の医薬組成物は、ヒト及び／又は獣医学的用途に好適である。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、用いられる投薬量及び濃度で曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性であるか、又は許容されるレベルの毒性を有する担体、賦形剤、及び／又は安定剤を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」、「希釈剤」、「賦形剤」、及び／又は「担体」は、本明細書に照らして理解されるそれらの明白かつ通常の意味を有し、ヒト、ネコ、イヌ、又は他の脊椎動物宿主への投与に適合する、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤などを含むことが意図される。典型的には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、ヒト並びにネコ及びイヌなどの非ヒト哺乳動物を含む動物における使用について、連邦政府、州政府、若しくは他の規制機関の規制機関によって承認された、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙される希釈剤、賦形剤、及び／又は担体である。希釈剤、賦形剤、及び／又は「担体」という用語は、医薬組成物がともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指し得る。そのような薬学的希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの滅菌液体であり得る。水、生理食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液は、液体希釈剤、賦形剤、及び／又は担体として、特に注射用溶液のために用いることができる。好適な薬学的希釈剤及び／又は賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。生理学的に許容される担体の非限定的な例は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体はまた、以下のうちの１つ以上を含み得る：抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、並びに非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）。組成物は、所望する場合、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、徐放性製剤などの形態をとることができる。製剤は、投与様式に好適であるべきである。
凍結保護剤は、大きな氷結晶の形成を防止することによって低温凍結保存の効率及び収率を改善するための細胞組成物添加剤である。凍結保護剤としては、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、トレハロース、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、グリセロール３－リン酸、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、スクロース、トリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、又はヒドロキシエチルデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。凍結保護剤は、細胞の解凍後の生存性を増強するために、栄養素（例えば、アルブミン、血清、ウシ血清、ウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）などの他の構成要素を含む凍結保存培地の一部として使用することができる。これらの凍結保存培地において、少なくとも１つの凍結保護剤は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％であるか、約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％であるか、少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％であるか、少なくとも約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％であるか、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％以下であるか、又は約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％以下である、あるいは前述の数値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージの濃度で見出され得る。
望ましい特性を有する更なる賦形剤としては、保存剤、アジュバント、安定剤、溶媒、緩衝液、希釈剤、可溶化剤、洗剤、界面活性剤、キレート剤、抗酸化剤、アルコール、ケトン、アルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）、クエン酸、塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム糖、デキストロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、ソルビトール、セルロース、血清、アミノ酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、オクチルフェノールエトキシレート、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、ゼラチン、エステル、エーテル、２－フェノキシエタノール、尿素、若しくはビタミン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの賦形剤は、血清、アルブミン、卵白アルブミン、抗生物質、不活性化剤、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、β－プロピオラクトン、ゼラチン、細胞片、核酸、ペプチド、アミノ酸、若しくは成長培地構成要素、又はそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、製造プロセスからの残留量又は夾雑物中に存在し得る。賦形剤の量は、組成物中に、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、少なくとも０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、少なくとも約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗ以下であるか、若しくは約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗ以下であるパーセンテージ、又は前述の数値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、限定されないが、鎮痛剤、治療薬、他の材料などを含む、組成物又は賦形剤の比較的非毒性の無機及び有機酸又は塩基付加塩を含む。薬学的に許容される塩の例としては、鉱酸、例えば、塩酸及び硫酸に由来する塩、並びに有機酸、例えば、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などに由来する塩が挙げられる。塩の形成に好適な無機塩基の例としては、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛などの水酸化物、炭酸塩、及び炭酸水素塩が挙げられる。塩はまた、非毒性であり、そのような塩を形成するのに十分に強いものを含む、好適な有機塩基を用いて形成され得る。例えば、そのような有機塩基のクラスには、モノ－、ジ－、及びトリアルキルアミン（メチルアミン、ジメチルアミン、及びトリエチルアミンを含む）、モノ－、ジ－、又はトリヒドロキシアルキルアミン（モノ－、ジ－、及びトリエタノールアミンを含む）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、及びリジンを含む）、グアニジン、Ｎ－メチルグルコサミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｌ－グルタミン、Ｎ－メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、トリヒドロキシメチルアミノエタンが含まれ得るが、これらに限定されない。
適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書に記載の化合物の製剤化及び投与のための技術は、当業者に既知である。腸内、経口、直腸、局所、舌下、頬側、耳内、硬膜外、皮膚上、エアロゾル、非経口送達（筋肉内、皮下、動脈内、静脈内、門脈内、関節内、皮内、腹膜、髄内注射、くも膜下腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む）を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が当技術分野に存在する。医薬組成物は、一般に、特定の意図される投与経路に合わせられる。
本明細書で使用される場合、「担体」は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、細胞、組織、及び／又は身体器官への化合物の通過、送達、及び／又は組み込みを容易にする化合物、粒子、固体、半固体、液体、又は希釈剤を指す。
本明細書で使用される場合、「希釈剤」は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、薬理学的活性を欠くが、薬学的に必要であるか又は望ましい可能性がある医薬組成物中の成分を指す。例えば、希釈剤は、製造及び／又は投与には質量が小さすぎる強力な薬物のかさを増加させるために使用され得る。それはまた、注射、摂取、又は吸入によって投与される薬物の溶解のための液体であってもよい。当該技術分野における希釈剤の一般的な形態は、限定されないが、ヒト血液の組成を模倣するリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝水溶液である。
本明細書で使用される場合、「ラフト培養物」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、天然の器官組織により近似する細胞の組織化及び機能を有する２つ以上の細胞型を含む三次元細胞培養物を指す。いくつかの実施形態では、名称が示唆するように、培養物は、培養物の一部分は気体又は大気環境に曝露されるが、別の部分は液体成長培地の層上又は層内に位置する気液界面において成長及び維持される。拡散は、成長培地からの栄養素が曝露された細胞にアクセスすることを可能にする。気液界面は、ラフト培養物の重層上皮層への分化を促進し、これは、インビボで環境大気に曝露されるものを含む、全ての器官（肺、食道、及び皮膚を含む）において見出される。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ラフト培養物は、間葉層又は間葉も含む。
本明細書で使用される場合、「インサート部材」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、少なくとも細胞が成長することができる表面を有する任意の構造体又は容器を指し、この場合、水性媒体に透過性であるが細胞には透過性ではなく、細胞がインサート部材及び別個の容器又は他の構造体の両方の環境に曝露されるように別個の容器又は他の構造体内に位置することができる表面又は少なくともその一部分（ただし、細胞は、水性媒体に透過性であるが、細胞には透過性ではなく、必ずしも直接接触していない表面又は少なくともその一部分にわたって別個の容器又は他の構造体の環境に曝露され得る）。本明細書で使用される場合、インサート部材の一般的な例は、ｔｒａｎｓｗｅｌｌであり、これは、透過性表面を有する組織培養容器であり、水性媒体がｔｒａｎｓｗｅｌｌの内部容積又は別個の組織培養容器の内部容積のうちの１つ以上の中に収容され得、２つの水性媒体間の交換が透過性表面にわたって起こり得、細胞がｔｒａｎｓｗｅｌｌ内の水性媒体及び別個の容器中の水性媒体に曝露されるように、細胞が透過性表面又は少なくともその一部分上で接触し得るように、別個の、一般的にはより大きな容積の組織培養容器内に配置され得る。しかしながら、インサート部材の代替構造、例えば、インサート部材が別個の容器に固定され、チャネル若しくは他の開口部が別個の容器の内部容積にアクセスするために利用可能であるもの、又はｔｒａｎｓｗｅｌｌ若しくは別個の容器のいずれか又は両方が従来の内部容積を有せず、インサート部材内の水性媒体と別個の容器との間の接触がマイクロ流体チャネルなどの代替手段を介して行われるものなどが想定される。本明細書に開示されるように、細胞が気液界面内に部分的にのみ浸漬される（すなわち、インサート部材内に水性媒体がほとんど又は全くない）ように、細胞を、別個の容器内のインサート部材の表面又はその一部分上で成長させることができる。
本明細書で使用される場合、「％ｗ／ｗ」又は「％ｗｔ／ｗｔ」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、組成物の総重量に対する成分又は薬剤の重量に１００を乗じて表されるパーセンテージを指す。「ｖ／ｖ％」又は「ｖｏｌ／ｖｏｌ％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、組成物の総液体体積に対する化合物、物質、成分、又は薬剤の液体体積に１００を乗じて表されるパーセンテージを指す。
幹細胞
本明細書で使用される場合、「全能性（totipotent）幹細胞」（全能性（omnipotent）幹細胞としても知られる）という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、胚性及び胚体外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全な生存生物を構築することができる。これらの細胞は、卵及び精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生される細胞も全能性である。
一般にＥＳ細胞とも略される「胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳＣ）」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、多能性であり、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本開示の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、場合によっては胚性生殖細胞も包含するように広く使用される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell、ＰＳＣ）」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、身体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のうちのいずれかに由来する細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内細胞塊細胞の子孫であり得るか、又はある特定の遺伝子の発現を強制することによる、成体体細胞などの非多能性細胞の誘導を介して得ることができる。多能性幹細胞は、任意の好適な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例としては、ヒト、げっ歯類、ブタ、及びウシを含む哺乳動物供給源が挙げられる。
一般にｉＰＳ細胞とも略される「人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、ある特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、成体体細胞などの通常は非多能性の細胞に人工的に由来する多能性幹細胞型を指す。ｈｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣを指す。当技術分野で既知のいくつかの方法において、ｉＰＳＣは、ある特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞などの非多能性細胞へのトランスフェクションによって誘導され得る。トランスフェクションは、レトロウイルス又はレンチウイルスなどのウイルスを使用するウイルス形質導入によって達成することができる。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）及びＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子は誘導の効率を増強し得る。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が、形態学的及び生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間を通じて、又はレポーター遺伝子及び抗生物質選択を通じて単離される。本明細書で使用される場合、ｉＰＳＣは、第１世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第２世代ｉＰＳＣ、及びヒト人工多能性幹細胞を含む。いくつかの方法では、レトロウイルス系を使用して、ヒト線維芽細胞を、４つの重要な遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃを使用して多能性幹細胞に形質転換する。他の方法では、レンチウイルス系を使用して、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８で形質転換する。ｉＰＳＣにおいて発現が誘導される遺伝子としては、Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、及びＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｆｔｈ１１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、若しくはＥ－カドヘリン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において従来から知られている人工多能性幹細胞を産生する他の方法も想定される。
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、又は１つ以上の特殊化した細胞型に分化する能力を獲得する、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は多能性であるか、又は多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、全能性（totipotent）（又は全能性（omnipotent））幹細胞、多能性幹細胞（誘導又は非誘導）、複能性幹細胞、少能性幹細胞、及び単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、胚、乳児、小児、又は成体に由来し得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、遺伝子操作又はタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。前駆細胞には、胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳＣ）、胚性がん細胞（embryonic carcinoma cell、ＥＣ）、及び胚盤葉上層幹細胞（epiblast stem cell、ＥｐｉＳＣ）、並びに人工多能性幹細胞が含まれる。
いくつかの実施形態では、１つの工程は、多能性であるか、又は多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞に由来し、それは、初期哺乳動物胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無制限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚芽細胞（blastocyte）から胚性幹細胞を誘導する方法は、当該技術分野において周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Human embryonic stem cells H9、Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本出願に記載の例示的な実施形態において使用されるが、本明細書に記載の方法及び系が任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解されるであろう。
本開示による実施形態で使用され得る更なる幹細胞としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）、ＷＩＳＣ ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ａｔ ｔｈｅ Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）、及びＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ｈｏｓｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって提供されるか、又はそれらによってホストされるデータベースに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示による実施形態で使用することができる例示的な胚性幹細胞としては、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣＯｌ（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（ＨＩ）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト多能性細胞株としては、ＴｋＤＡ３－４、１２３１Ａ３、３１７－Ｄ６、３１７－Ａ４、ＣＤＨ１、５－Ｔ－３、３－３４－１、ＮＡＦＬＤ２７、ＮＡＦＬＤ７７、ＮＡＦＬＤ１５０、ＷＤ９０、ＷＤ９１、ＷＤ９２、Ｌ２００１２、Ｃ２１３、１３８３Ｄ６、ＦＦ、又は３１７－１２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
発生生物学において、細胞分化は、あまり特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、「分化」又は「指向性分化」という用語は、あまり特殊化されていない細胞が特定の特殊化された標的細胞型になるプロセスを説明する。特殊化された標的細胞型の特殊性は、最初の細胞の運命を定義又は変更するために使用することができる任意の適切な方法によって決定することができる。例示的な方法としては、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、及び核酸処理が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスを使用して必要な４つの遺伝子を輸送し、胚性幹細胞と実質的に同一のｉＰＳＣをもたらすことができる。アデノウイルスはそれ自身の遺伝子のいずれも標的化宿主と結合しないため、腫瘍を創出する危険性は排除される。いくつかの実施形態では、非ウイルスベースの技術を用いてｉＰＳＣを生成する。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、非常に低い効率ではあるが、ウイルストランスフェクション系を全く用いずにプラスミドを介して達成することができる。他の実施形態では、タンパク質の直接送達を使用してｉＰＳＣを生成し、したがってウイルス又は遺伝子修飾の必要性が排除される。いくつかの実施形態では、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である：ポリアルギニンアンカーを介して細胞に向けられたある特定のタンパク質を用いた細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態では、多能性誘導遺伝子の発現は、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによっても増加させることができる。
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるその明白かつ通常の意味を有し、成長因子を培地中に分泌すること、又は細胞表面上に提示することなどによって、多能性幹細胞の成長を支持する細胞を指す。フィーダー細胞は一般に接着細胞であり、成長を停止させることができる。例えば、フィーダー細胞は、照射（例えば、ガンマ線）、マイトマイシン－Ｃ処理、電気パルス、又は穏やかな化学的固定（例えば、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドで）によって成長を停止させる。しかしながら、フィーダー細胞は必ずしも成長を停止させる必要はない。フィーダー細胞は、成長因子を分泌すること、細胞表面上に成長因子を提示すること、培養培地を解毒すること、又は細胞外マトリックスタンパク質を合成することなどの目的に役立ち得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、支持された標的幹細胞に対して同種又は異種であり、これは、下流の適用において意味を有し得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、マウス線維芽細胞、マウス胚性線維芽細胞、マウスＳＴＯ細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＳＮＬ ７６／７細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト脂肪間葉細胞、ヒト骨髄間葉細胞、ヒト羊水間葉細胞、ヒト羊水上皮細胞、ヒト臍帯間葉細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、又はヒト成人卵管上皮細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞から調製された馴化培地が、フィーダー細胞共培養の代わりに、又はフィーダー細胞共培養と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、標的幹細胞の増殖中に使用されない。
ＰＳＣ及び胚体内胚葉の分化
いくつかの実施形態では、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣは、最初に胚体内胚葉（definitive endoderm、ＤＥ）へ、次に前方／前腸系統へ、次に食道組織へと段階的に指向性分化を受ける。いくつかの実施形態では、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣは、ＤＥ形成を促進するための分子（例えば、成長因子、リガンド）及びその後の組織形成のための分子が同時に添加される非段階的に指向性分化を受ける。
胚体内胚葉は、腸管を生じる。前方ＤＥは、前腸並びに食道、肺、胃、肝臓、及び膵臓を含むその関連器官を形成し、後方ＤＥは、中腸及び後腸を形成し、これは、小腸及び大腸並びに泌尿生殖器系の一部を形成する。マウス、ニワトリ、及びカエルの胚を使用した研究は、原腸胚段階でのＤＥにおける前方－後方パターンの確立が、その後の前腸及び後腸発達のための必要条件であることを示唆する。Ｗｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路は、後方内胚葉／後腸又は前方内胚葉／前腸のいずれかの運命を促進するために重要である。
インビトロでＤＥの食道組織への分化を指向する方法は、国際公開第２０１９／０７４７９３号（その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）において探究されている。いくつかの実施形態では、指向性分化は、ｉＰＳＣ及び／又はＤＥ細胞におけるある特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することによって達成される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、ＥＧＦシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｗｎｔ／ＡＰＣシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ノッチシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ＬＫＢシグナル伝達経路、及びＰａｒ極性シグナル伝達経路を含むがこれらに限定されない、食道又は胃腸の発達において活性なものである。
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ又はＥＳＣ）から胚体内胚葉を産生する方法は、本明細書に記載の方法に適用可能である。いくつかの実施形態では、多能性細胞は桑実胚に由来する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞としては、胚性幹細胞を挙げることができるが、これに限定されない。胚性幹細胞は、胚性内細胞塊又は胚性生殖隆起に由来し得る。胚性幹細胞又は生殖細胞は、ヒトを含む様々な哺乳動物種を含むがこれらに限定されない様々な動物種に由来し得る。いくつかの実施形態では、ヒト胚性幹細胞を使用して、胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態では、ヒト胚性生殖細胞を使用して、胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを使用して、胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態では、ヒトｉＰＳＣ（human iPSC、ｈｉＰＳＣ）を使用して、胚体内胚葉を産生する。
いくつかの実施形態では、胚性幹細胞又は生殖細胞又はｉＰＳＣは、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間であるか、約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間であるか、少なくとも６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間であるか、少なくとも約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間であるか、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間以内であるか、若しくは約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間以内である時間にわたって、又は前述の時間のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の時間、例えば、６時間～３００時間、２４時間～１２０時間、４８時間～９６時間、６時間～７２時間、若しくは２４時間～３００時間、１つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子で処理される。いくつかの実施形態では、２つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子が添加される。これらの場合、２つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子を同時に又は別個に添加することができる。
いくつかの実施形態では、胚性幹細胞又は生殖細胞又はｉＰＳＣは、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬであるか、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ～１５０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ、又は１０００ｎｇ／ｍＬ～１５０００ｎｇ／ｍＬの濃度で、１つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子で処理される。いくつかの実施形態では、１つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子の濃度は、治療を通して一定レベルに維持される。いくつかの実施形態では、１つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子の濃度は、治療の過程の間に変化する。いくつかの実施形態では、２つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子が添加される。これらの場合、２つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子は、濃度が異なり得る。
いくつかの実施形態では、ＥＳＣ、生殖細胞、若しくはｉＰＳＣ、又は任意の下流細胞型は、幹細胞の成長を支持する成長培地中で培養される。いくつかの実施形態では、ＥＳＣ、生殖細胞、若しくはｉＰＳＣ、又は任意の下流細胞型は、幹細胞成長培地中で培養される。いくつかの実施形態では、幹細胞成長培地は、無血清培地、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はケラチノサイトＳＦＭ培地である。いくつかの実施形態では、幹細胞成長培地は、ウシ胎仔血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞成長培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％であるか、約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％であるか、少なくとも０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％であるか、少なくとも約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％であるか、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％以下であるか、又は約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％以下である濃度で、あるいは前述の数値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、０％～２０％、０．２％～１０％、２％～５％、０％～５％、又は２％～２０％のパーセンテージでＦＢＳを含む。いくつかの実施形態では、幹細胞成長培地は、異種構成要素を含まない。いくつかの実施形態では、成長培地は、１つ以上の小分子化合物、活性化剤、阻害剤、又は成長因子を含む。
いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞に濃縮された細胞集団が使用される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は単離されるか、又は実質的に精製される。いくつかの実施形態では、単離又は実質的に精製された胚体内胚葉細胞は、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、又はＳＯＸ７マーカーのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ、５つ）よりも高い程度に、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、又はＣＸＲＣ４マーカーのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ）を発現する。
いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞及びｈＥＳＣは、１つ以上の成長因子で処理される。そのような成長因子は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の成長因子は、成長因子のＴＧＦ－βスーパーファミリーのノーダル／アクチビン及び／又はＢＭＰサブグループを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、又はこれらの成長因子のいずれかの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、アクチビン誘導胚体内胚葉（ＤＥ）は、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＢＭＰ、若しくはレチノイン酸、又はそれらの任意の組み合わせ、並びに食道成長、形態形成、及び細胞分化を促進した食道培養系に依存して、前方内胚葉パターン形成、前腸特定化、及び形態形成を更に受けることができる。いくつかの実施形態では、ヒトＰＳＣは、効率的に、食道上皮及び間葉にインビトロで分化するように指向される。成長因子などの分子は、特定の型の胃腸組織形成を促進するために、任意の発達段階に添加され得ることが理解される。
いくつかの実施形態では、指向性分化は、ＰＳＣ、ＤＥ、又は任意の下流の細胞型におけるある特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化及び／又は阻害することによって達成される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、Ｗｎｔ経路、ＦＧＦ経路、ＢＭＰ経路、レチノイン酸経路、ＥＧＦ経路、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）経路、若しくはＳＭＡＤ経路、又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。本明細書に開示されるシグナル伝達経路のうちのいずれか１つの濃度、発現、又は機能を変化させることにより、本開示による分化を駆動することができることは、当業者によって理解されるであろう。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路に関連する細胞構成物、例えば、経路の天然阻害剤、アンタゴニスト、活性化剤、又はアゴニストを使用して、シグナル伝達経路の阻害又は活性化をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路に関連する細胞構成物を標的とするｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡは、これらの経路を阻害又は活性化するために使用される。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、Ｗｎｔ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化剤はＷｎｔタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔタンパク質は組換えＷｎｔタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化剤は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化剤は、ＧＳＫ３シグナル伝達経路阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルステルパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、若しくはＴＷＳ１１９、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｗｎｔ経路活性化剤で処理されない。本明細書で提供されるＷｎｔ経路活性化剤は、本明細書に記載の他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のいずれかと組み合わせて使用され得る。
線維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor、ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、及び胚発達に関与する成長因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面会合ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用は、ＦＧＦシグナル伝達に必須であることが示されている。ＦＧＦは、多種多様な細胞及び組織の増殖及び分化のプロセスにおいて重要な役割を果たす。ヒトにおいて、ＦＧＦファミリーの２２のメンバーが特定されており、それらの全ては、構造的に関連するシグナル伝達分子である。メンバーＦＧＦ１～ＦＧＦ１０は全て、線維芽細胞成長因子受容体（fibroblast growth factor receptor、ＦＧＦＲ）に結合する。ＦＧＦ１は酸性としても知られ、ＦＧＦ２は塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor、ｂＦＧＦ）としても知られる。ＦＧＦ相同因子１～４（ＦＨＦ１～ＦＨＦ４）としても知られるメンバーＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、及びＦＧＦ１４は、ＦＧＦと比較して明確な機能的差異を有することが示されている。これらの因子は際立って類似した配列相同性を有するが、それらはＦＧＦＲに結合せず、ＦＧＦに関連しない細胞内プロセスに関与する。この群は、「ｉＦＧＦ」としても知られる。メンバーＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３は、より新しく、あまり特徴付けられていない。ＦＧＦ１５は、ヒトＦＧＦ１９のマウスオルソログである（したがって、ヒトＦＧＦ１５は存在しない）。ヒトＦＧＦ２０を、Ｘｅｎｏｐｕｓ ＦＧＦ－２０（ＸＦＧＦ－２０）に対するその相同性に基づいて特定した。他のＦＧＦの局所活性とは対照的に、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、及びＦＧＦ２３は、より全身的な効果を有する。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、ＦＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ経路活性化剤はＦＧＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦタンパク質は組換えＦＧＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ経路活性化剤は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５（ＦＧＦ１９、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９）、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、又はＦＧＦ２３のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞はＦＧＦ経路活性化剤で処理されない。本明細書で提供されるＦＧＦ経路活性化剤は、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein、ＢＭＰ）経路活性化剤又はＢＭＰ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰタンパク質は組換えＢＭＰタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、若しくはＩＤＥ２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＢＭＰ経路活性化剤又はＢＭＰ経路阻害剤で処理されない。本明細書で提供されるＢＭＰ経路活性化剤又はＢＭＰ経路阻害剤は、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、レチノイン酸経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、レチノイン酸経路活性化剤は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、若しくはＡＭ５８０、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、レチノイン酸経路活性化剤で処理されない。本明細書で提供されるレチノイン酸経路活性化剤は、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、上皮成長因子（epidermal growth factor、ＥＧＦ）経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞はＥＧＦ経路活性化剤で処理されない。本明細書で提供されるＥＧＦ経路活性化剤は、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤（ROCK inhibitor、ＲＯＣＫｉ）と接触させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫｉは、Ｙ－２７６３２、Ｙ－３０１４１、Ｙ－３９９８３、Ｋｉ－２３０９５、ＳＬｘ－２１１９、チアゾビビン、アザインドール１、ファスジル、リパスジル、ネタルスジル、ＲＫＩ－１４４７、若しくはＧＳＫ４２９２８６Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞はＲＯＣＫｉで処理されない。本明細書で提供されるＲＯＣＫｉは、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、トランスフォーミング成長因子－β（transforming growth factor-beta、ＴＧＦ－β）経路活性化剤又はＴＧＦ－β経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βファミリーは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（differentiation factor、ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン、アクチビン、並びにノーダル経路を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β経路活性化剤は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ノーダル、ＢＭＰ、ＩＤＥ１、ＩＤＥ２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β経路阻害剤は、Ａ－８３－０１、ＤＭＨ１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２５、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ヘスペレチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＧＦ－β経路活性化剤又はＴＧＦ－β経路阻害剤で処理されない。本明細書で提供されるＴＧＦ－β経路活性化剤又はＴＧＦ－β経路阻害剤は、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前方前腸細胞、背側前方前腸細胞、食道前駆細胞、及び／又は食道ラフト細胞を、ＳＭＡＤ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ経路阻害剤は、ＴＧＦ－β経路阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ経路阻害剤は、Ａ－８３－０１、ＤＭＨ１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２５、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ヘスペレチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＭＡＤ経路阻害剤で処理されない。本明細書で提供されるＳＭＡＤ経路阻害剤は、本明細書で提供される他の成長因子、経路活性化剤、又は経路阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、「一工程」プロセスにより分化される。例えば、多能性幹細胞をＤＥ培養物に分化させることができる１つ以上の分子（例えば、アクチビンＡ）を、ＤＥ培養物の指向性分化を促進することができる追加の分子（例えば、ＦＧＦ４、Ｗｎｔ、ノギン、ＲＡ）と組み合わせて、多能性幹細胞を直接処理する。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は体細胞から調製される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、生検から得られた生物学的組織から調製される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は凍結保存される。いくつかの実施形態では、体細胞は凍結保存される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態では、ヒトＰＳＣは、ヒトＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、凍結保存されたＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを、フィーダー細胞基質上で成長させる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）フィーダー細胞基質上で成長させる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを、照射されたＭＥＦフィーダー細胞基質上で成長させる。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞）は、細胞培養において拡大される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）をマトリゲル中で拡大させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を含む細胞培養物中で拡大させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、胚体内胚葉細胞に分化される。多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）をアクチビンＡ、ＢＭＰ４、又は両方と接触させることにより、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）において胚体内胚葉細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度のアクチビンＡ、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１００～２００ｎｇ／ｍＬ、又は５０～１５０ｎｇ／ｍＬの濃度のアクチビンＡと接触させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度のＢＭＰ４、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２００ｎｇ／ｍＬ、１～１００ｎｇ／ｍＬ、２５～２００ｎｇ／ｍＬ、１～８０ｎｇ／ｍＬ、又は２５～１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４と接触させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞を、成長血清を含む培地中で胚体内胚葉細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、若しくは２．５％の成長血清、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、０～２％、１～２．５％、１．５～２．５％、１．５～２％、若しくは０．５～２％のパーセンテージの成長血清を含む。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、ＦＢＳを含む培地中で前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、若しくは２．５％のＦＢＳ、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、０～２％、１～２．５％、１．５～２．５％、１．５～２％、若しくは０．５～２％のパーセンテージのＦＢＳを含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞を、例えば、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、又は２．５％のＦＢＳのうちの２つ以上を含む培地を交換することによって、ＦＢＳ濃度を段階的に増加させた成長培地中で分化させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞を、０％、０．２％、及び２％のＦＢＳを含む培地で段階的に分化させる。これらの実施形態に加えて、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を、当技術分野で既知の任意の他の方法により胚体内胚葉細胞に分化させることができる。
いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を単層として成長させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔタンパク質若しくは経路活性化剤、ＦＧＦタンパク質若しくは経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはレチノイン酸経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと接触させることによって、胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔタンパク質又は経路活性化剤はＷｎｔ３ａである。いくつかの実施形態では、ＦＧＦタンパク質又は経路活性化剤はＦＧＦ４である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤はノギンである。いくつかの実施形態では、レチノイン酸経路活性化剤はレチノイン酸である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔタンパク質若しくは経路活性化剤、ＦＧＦタンパク質若しくは経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはレチノイン酸経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせは、０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、約０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０～６００ｎｇ／ｍＬ、０～２００ｎｇ／ｍＬ、２００～５００ｎｇ／ｍＬ、又は２００～６００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔタンパク質若しくは経路活性化剤、ＦＧＦタンパク質若しくは経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはレチノイン酸経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせは、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、少なくとも０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、少なくとも約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭ以下であるか、又は約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０～３．０μＭ、１．０～３．０μＭ、０～２．０μＭ、又は１．５～３．０μＭの濃度で提供される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔタンパク質若しくは経路活性化剤、ＦＧＦタンパク質若しくは経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはレチノイン酸経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内の日数にわたって接触させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔタンパク質若しくは経路活性化剤、ＦＧＦタンパク質若しくは経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはレチノイン酸経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと接触させることなく、胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはレチノイン酸のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと胚体内胚葉細胞を接触させることなく、前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、成長血清を含む培地中で前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、若しくは２．５％の成長血清、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、０～２％、１～２．５％、１．５～２．５％、１．５～２％、若しくは０．５～２％のパーセンテージの成長血清を含む。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、ＦＢＳを含む培地中で前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、若しくは２．５％のＦＢＳ、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、０～２％、１～２．５％、１．５～２．５％、１．５～２％、若しくは０．５～２％のパーセンテージのＦＢＳを含む。
これらの実施形態に加えて、胚体内胚葉細胞は、当該技術分野において既知の任意の他の方法により前方前腸細胞に分化させることができる。
背側前方前腸細胞の形成
本明細書に開示されるか又はさもなければ当該技術分野において既知である多能性幹細胞から前方前腸細胞を産生するための方法は、本明細書に記載の方法に適用可能である。いくつかの実施形態では、前方前腸スフェロイドを産生するための当技術分野において既知の方法を、前方前腸細胞の産生に適用することができる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は、自然発生的に生成された前方前腸スフェロイドを排除することによって、分化中に細胞単層として得られる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は、自然発生的に生成された前方前腸スフェロイドを単一細胞に解離し、解離した単一細胞を単層にプレーティングすることによって得られる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は、細胞単層として、及び自然発生的に生成された前方前腸スフェロイドを単一細胞に解離することの両方によって得られる。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＳＯＸ２、ＨＮＦ１β、又は両方を発現する背側前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、上皮成長因子（ＥＧＦ）経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはＦＧＦ経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ）、又はそれらの任意の組み合わせと接触させることによって、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、成長補助剤と更に接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと接触させることによって、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、神経前駆体阻害剤（すなわち、神経前駆体及び神経細胞型の成長及び／又は分化を阻害する化合物）と更に接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは神経前駆体阻害剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせと接触させることによって、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ経路活性化剤は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５（ＦＧＦ１９、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９）、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、若しくはＦＧＦ２３、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、成長補助剤は、無血清成長補助剤、例えば、当技術分野において既知のもののうちの任意の１つ、任意選択でＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤である。いくつかの実施形態では、神経前駆体阻害剤は、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ノギン、若しくはＦＧＦ４、又はそれらの任意の組み合わせ（３つ全てを含む）と接触させて、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ノギン、ＦＧＦ４、若しくは神経前駆体阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ（４つ全てを含む）と接触させて、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させる。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞をＥＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦであるか、又はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１５０ｎｇ／ｍＬ、又は５０～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１００ｎｇ／ｍＬであるか、約１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬであるか、１００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＢＭＰ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤は、ノギンであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１００～３００ｎｇ／ｍＬ、１００～２５０ｎｇ／ｍＬ、又は１５０～３００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＢＭＰ経路阻害剤（例えば、ノギン）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、２００ｎｇ／ｍＬであるか、約２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬであるか、２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＢＭＰ経路阻害剤（例えば、ノギン）と接触させる。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞をＦＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ経路活性化剤は、ＦＧＦ１０であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、５～１００ｎｇ／ｍＬ、５～７５ｎｇ／ｍＬ、又は２５～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＦＧＦ経路活性化剤（例えば、ＦＧＦ１０）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、５０ｎｇ／ｍＬであるか、約５０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬであるか、５０ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約５０ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＦＧＦ経路活性化剤（例えば、ＦＧＦ１０）と接触させる。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、成長補助剤と接触させる。いくつかの実施形態では、成長補助剤は、当該技術分野で一般的に知られているものなどの無血清成長補助剤である。いくつかの実施形態では、成長補助剤は、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、製造者の推奨濃度に従って、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、少なくとも０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、少なくとも約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍以下であるか、又は約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍以下である成長補助剤の濃度で、成長補助剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１倍であるか、約１倍であるか、少なくとも１倍であるか、少なくとも約１倍であるか、１倍以下であるか、又は約１倍以下である濃度で成長補助剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ）と接触させる。いくつかの実施形態では、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又は他の成長補助剤を使用して、前方前腸細胞の培養中に神経前駆細胞の成長を阻害する。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、神経前駆体阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、神経前駆体阻害剤は、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンであるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、製造者の推奨濃度に従って、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、少なくとも０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、少なくとも約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍以下であるか、又は約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍以下である神経前駆体阻害剤の濃度で、神経前駆体阻害剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ又はシタラビン）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１倍であるか、約１倍であるか、少なくとも１倍であるか、少なくとも約１倍であるか、１倍以下であるか、又は約１倍以下である濃度で神経前駆体阻害剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ又はシタラビン）と接触させる。いくつかの実施形態では、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤、シタラビン、又は他の神経前駆体阻害剤を使用して、多能性幹細胞、胚体内胚葉、及び／又は前方前腸細胞の培養中に神経前駆体細胞の成長を阻害する。
いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、あるいは約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１２時間～８日間、１～８日間、又は２～６日間、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又は成長補助剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、あるはｉ約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内である、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１２時間～８日間、１～８日間、又は２～６日間、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又は神経前駆体阻害剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）と接触させる。
食道前駆細胞の形成
本明細書に開示されるか又はさもなければ当該技術分野において既知である背側前方前腸細胞を産生するための方法は、本明細書に開示される方法に適用可能である。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を拡大し、食道前駆細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、単一細胞懸濁液中に解離される。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、解離酵素を使用して解離される。いくつかの実施形態では、解離酵素は、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、若しくはＡｃｃｕｔａｓｅのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）、又はそれらの任意の組み合わせであるか又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞の単一細胞懸濁液は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物でコーティングされた組織培養容器（例えば、組織培養プレート）又はその一部分（特に、細胞が接触する表面）上にプレーティングされる。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物は、背側前方前腸細胞に対して同種である。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞はヒト由来であり、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物はヒト由来である。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物は、コラーゲンＩＶ型である。いくつかの実施形態では、コラージュＩＶ型はヒトコラーゲンＩＶ型である。いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ型はヒト胎盤に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物は、ラットコラーゲンＩ型マトリックス若しくはマトリゲル、又は両方を含まない。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、組織培養容器内の成長培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成長培地は、ＥＧＦ経路活性化剤、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）、若しくはＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ（３つ全てを含む）を含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＰＥ、若しくはＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ（３つ全てを含む）と接触させる。いくつかの実施形態では、成長培地は無血清培地である。いくつかの実施形態では、成長培地はケラチノサイトＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）である。いくつかの実施形態では、成長培地は、ＥＧＦ、ＢＰＥ、若しくはＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、Ｙ－３０１４１、Ｙ－３９９８３、Ｋｉ－２３０９５、ＳＬｘ－２１１９、チアゾビビン、アザインドール１、ファスジル、リパスジル、ネタルスジル、ＲＫＩ－１４４７、若しくはＧＳＫ４２９２８６Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、成長培地は、ＥＧＦ、ＢＰＥ、若しくはＹ－２７６３２、又はそれらの任意の組み合わせ（３つ全てを含む）を含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ＢＰＥ、若しくはＹ－２７６３２、又はそれらの任意の組み合わせ（３つ全てを含む）と接触させる。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞をＥＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦであるか、又はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１０ｎｇ／ｍＬ、１０～２０ｎｇ／ｍＬ、５～１５ｎｇ／ｍＬ、又は８～１２ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、１０ｎｇ／ｍＬであるか、約１０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬであるか、１０ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞をＢＰＥと接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬであるか、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬであるか、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬであるか、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬであるか、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬ以下であるか、又は約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、５～５０μｇ／ｍＬ、２０～１００μｇ／ｍＬ、２０～６０μｇ／ｍＬ、又は１０～５０μｇ／ｍＬの濃度で、ＢＰＥと接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、３０μｇ／ｍＬであるか、約３０μｇ／ｍＬであるか、少なくとも３０μｇ／ｍＬであるか、少なくとも約３０μｇ／ｍＬであるか、３０μｇ／ｍＬ以下であるか、又は約３０μｇ／ｍＬ以下である濃度で、ＢＰＥと接触させる。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２０μＭ、１～１５μＭ、又は５～２０μＭの濃度で、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、１０μＭであるか、約１０μＭであるか、少なくとも１０μＭであるか、少なくとも約１０μＭであるか、１０μＭ以下であるか、又は約１０μＭ以下である濃度でＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、コーティングされた組織培養容器上で、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内である日数、あるは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１～８、２～６、４～８、又は１～４日間の日数にわたって培養して、食道前駆細胞に分化させる。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を拡大し、食道前駆細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、単一細胞懸濁液中に解離される。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞の単一細胞懸濁液は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物でコーティングされた組織培養容器（例えば、組織培養プレート）又はその一部分（特に、細胞が接触する表面）上にプレーティングされる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、組織培養容器内の成長培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成長培地は、ＥＧＦ経路活性化剤、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）、若しくはＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ（１つ、２つ、又は３つ全てを含む）を含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＰＥ、若しくはＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ（１つ、２つ、又は３つ全てを含む）と接触させる。いくつかの実施形態では、成長培地は無血清培地である。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ＢＰＥ、若しくはＹ－２７６３２、又はそれらの任意の組み合わせ（１つ、２つ、又は３つ全てを含む）と接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞をＥＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦであるか、又はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、１０ｎｇ／ｍＬであるか、約１０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬであるか、１０ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞をＢＰＥと接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、３０μｇ／ｍＬであるか、約３０μｇ／ｍＬであるか、少なくとも３０μｇ／ｍＬであるか、少なくとも約３０μｇ／ｍＬであるか、３０μｇ／ｍＬ以下であるか、又は約３０μｇ／ｍＬ以下である濃度で、ＢＰＥと接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、１０μＭであるか、約１０μＭであるか、少なくとも１０μＭであるか、少なくとも約１０μＭであるか、１０μＭ以下であるか、又は約１０μＭ以下である濃度でＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞を、コーティングされた組織培養容器上で、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内である日数、あるは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１～８、２～６、４～８、又は１～４日間の日数にわたって培養して、食道前駆細胞に分化させる。
いくつかの実施形態では、得られた食道前駆細胞は、ＳＯＸ２、Ｐ６３、又はＨＮＦ１β、又はそれらの任意の組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、得られた食道前駆細胞は、背側前方前腸細胞と比較してより高いレベルでＳＯＸ２を発現する。
食道ラフト細胞の形成
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞から分化し、コーティングされた組織培養容器上で拡大させた食道前駆細胞は、単一細胞懸濁液中に解離される。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞は、解離酵素を使用して解離される。いくつかの実施形態では、解離酵素は、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、若しくはＡｃｃｕｔａｓｅのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）、又はそれらの任意の組み合わせであるか又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞の単一細胞懸濁液は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物でコーティングされたインサート部材（例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ又は細胞インサート）又はその一部分（特に、細胞が接触する部分又はインサート部材の透過性表面）上にプレーティングされる。いくつかの実施形態では、インサート部材は、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含む。いくつかの実施形態では、インサート部材の透過性である表面は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下である細孔サイズ、又は前述のサイズのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細孔サイズ、例えば、０．１～１０μｍ、０．１～５μｍ、１～５μｍ、２～８μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、インサート部材の透過性である表面は、３μｍ又は約３μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物は、食道前駆細胞に対して同種である。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞はヒト由来であり、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物はヒト由来である。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物は、コラーゲンＩＶ型である。いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ型はヒトコラーゲンＩＶ型である。いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ型はヒト胎盤に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物は、ラットコラーゲンＩ型マトリックス若しくはマトリゲル、又は両方を含まない。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞は成長培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成長培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。いくつかの実施形態では、インサート部材は、組織培養容器内に配置される。
いくつかの実施形態では、インサート部材内に収容される成長培地は、ＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＳＭＡＤ経路阻害剤のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、Ｙ－３０１４１、Ｙ－３９９８３、Ｋｉ－２３０９５、ＳＬｘ－２１１９、チアゾビビン、アザインドール１、ファスジル、リパスジル、ネタルスジル、ＲＫＩ－１４４７、若しくはＧＳＫ４２９２８６Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ経路阻害剤は、Ａ－８３－０１、ＤＭＨ１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２５、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ヘスペレチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、インサート部材内に収容される成長培地は、ＥＧＦ、Ｙ－２７６３２、Ａ－８３－０１、若しくはＤＭＨ１、又はそれらの任意の組み合わせ（４つ全てを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、食道前駆細胞をＥＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦであるか、又はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１００～２００ｎｇ／ｍＬ、５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、又は８０～１２０ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１００ｎｇ／ｍＬであるか、約１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬであるか、１００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。
いくつかの実施形態では、食道前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２０μＭ、１～１０μＭ、１０～２０μＭ、５～１５μＭ、又は８～１２μＭの濃度で、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１０μＭであるか、約１０μＭであるか、少なくとも１０μＭであるか、少なくとも約１０μＭであるか、１０μＭ以下であるか、又は約１０μＭ以下である濃度でＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。
いくつかの実施形態では、食道前駆細胞をＳＭＡＤ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ経路阻害剤は、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１であるか又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭ、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．１～１０μＭ、０．５～２μＭ、０．１～２μＭ、又は０．５～５μＭの濃度で、ＳＭＡＤ経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１μＭ（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１の各々について１μＭ）であるか、約１μＭであるか、少なくとも１μＭであるか、少なくとも約１μＭであるか、１μＭ以下であるか、又は約１μＭ以下である濃度でＳＭＡＤ経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１）と接触させる。
いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞を、インサート部材中のＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＳＭＡＤ経路阻害剤のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ）と接触させる。いくつかの実施形態では、組織培養容器はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞を、インサート部材内で、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内である日数、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１～８、２～６、４～８、又は１～４日間の日数にわたって培養する。
いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させる。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞をインサート部材中のＥＧＦ、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＳＭＡＤ阻害剤のうちの１つ以上と接触させた後、インサート部材中の成長培地が除去され、組織培養容器は、食道ラフト培養物が気液界面にあるように、食道ラフト培養物が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容する。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、気液界面において培養される。いくつかの実施形態では、組織培養容器はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、気液界面において、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間以内であるか、又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間以内である日数、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、５～３０日間、５～２０日間、１０～２５日間、１０～３０日間、又は２０～３０日間の日数にわたって培養される。いくつかの実施形態では、気液界面において食道ラフト培養物を培養することは、食道ラフト培養物を成熟させる。
いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞から分化し、コーティングされた組織培養容器上で拡大させた食道前駆細胞は、単一細胞懸濁液中に解離される。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞の単一細胞懸濁液は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物でコーティングされたインサート部材（例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ又は細胞インサート）又はその一部分（特に、細胞が接触する部分又はインサート部材の透過性表面）上にプレーティングされる。いくつかの実施形態では、インサート部材は、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含む。いくつかの実施形態では、インサート部材の透過性である表面は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下である細孔サイズ、又は前述のサイズのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細孔サイズ、例えば、０．１～１０μｍ、０．１～５μｍ、１～５μｍ、２～８μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、インサート部材の透過性である表面は、３μｍ又は約３μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、インサート部材は、組織培養容器内に配置される。いくつかの実施形態では、インサート部材内に収容される成長培地は、ＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＳＭＡＤ経路阻害剤のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ）を含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞をＥＧＦ経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路活性化剤は、ＥＧＦであるか、又はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１００ｎｇ／ｍＬであるか、約１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬであるか、１００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度でＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１０μＭであるか、約１０μＭであるか、少なくとも１０μＭであるか、少なくとも約１０μＭであるか、１０μＭ以下であるか、又は約１０μＭ以下である濃度でＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞をＳＭＡＤ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ経路阻害剤は、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１であるか又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１μＭ（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１の各々について１μＭ）であるか、約１μＭであるか、少なくとも１μＭであるか、少なくとも約１μＭであるか、１μＭ以下であるか、又は約１μＭ以下である濃度でＳＭＡＤ経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１）と接触させる。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞を、インサート部材中のＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＳＭＡＤ経路阻害剤のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ）と接触させる。いくつかの実施形態では、組織培養容器はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞を、インサート部材内で、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間であるか、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８日間以内である日数、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、１～８、２～６、４～８、又は１～４日間の日数にわたって培養する。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させる。いくつかの実施形態では、拡大された食道前駆細胞をインサート部材中のＥＧＦ、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＳＭＡＤ阻害剤のうちの１つ以上と接触させた後、インサート部材中の成長培地が除去され、組織培養容器は、食道ラフト培養物が気液界面にあるように、食道ラフト培養物が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容する。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、気液界面において培養される。いくつかの実施形態では、組織培養容器はＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、気液界面において、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間であるか、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間以内であるか、又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日間以内である日数、あるいは前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲、例えば、５～３０日間、５～２０日間、１０～２５日間、１０～３０日間、又は２０～３０日間の日数にわたって培養される。いくつかの実施形態では、気液界面において食道ラフト培養物を培養することは、食道ラフト培養物を成熟させる。
いくつかの実施形態では、解離された食道前駆細胞を、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）と組み合わせ、組み合わせた食道前駆細胞及びＥＮＣＣを培養して、神経支配された食道ラフト培養物を形成する。いくつかの実施形態では、神経支配された食道ラフト培養は、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞、及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、神経前駆細胞はＳＯＸ１０＋である。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞及びＥＮＣＣは、低速遠心分離、又は過剰な破壊なしに細胞を凝集させる他の方法によって組み合わされる。いくつかの実施形態では、ＥＮＣＣは、多能性幹細胞に由来し得るニューロスフェアに由来する単一細胞として単離される。ＥＮＣＣを産生するための方法は、当該技術分野において一般的に知られており、それらをオルガノイドと組み合わせるための方法は、国際公開第２０１６／０６１４６４号（参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）におい探究されている。
食道ラフト培養のための例示的な方法
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、前方前腸細胞から調製される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物及び前方前腸細胞は、もとはｉＰＳＣから調製される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣはｈｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は、本明細書に開示される方法のうちの１つ以上によりｉＰＳＣから分化される。いくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣを胚体内胚葉細胞に分化させる条件下でｉＰＳＣを培養することと、胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させる条件下で胚体内胚葉細胞を培養することとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＴＧＦ－βスーパーファミリー成長因子とともにｉＰＳＣを培養して、ｉＰＳＣを胚体内胚葉細胞に分化させることと、Ｗｎｔタンパク質若しくは経路活性化剤、ＦＧＦタンパク質若しくは活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、又はレチノイン酸経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに胚体内胚葉細胞を培養して、胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させることとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをアクチビンＡ若しくはＢＭＰ４、又は両方とともに培養して、ｉＰＳＣを胚体内胚葉細胞に分化させることと、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、又はレチノイン酸のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに培養して、胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させることとを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９であるか０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度のアクチビンＡ、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１００～２００ｎｇ／ｍＬ、又は５０～１５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと培養する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度のＢＭＰ４、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２００ｎｇ／ｍＬ、１～１００ｎｇ／ｍＬ、２５～２００ｎｇ／ｍＬ、１～８０ｎｇ／ｍＬ、又は２５～１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４とともに培養する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを、５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４とともに培養する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを、アクチビンＡ若しくはＢＭＰ４、又は両方とともに、１、２、３、４、又は５日間培養する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはレチノイン酸、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに、各々胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させるのに十分な濃度で培養する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、約０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬであるか、０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、若しくは６００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０～６００ｎｇ／ｍＬ、０～２００ｎｇ／ｍＬ、２００～５００ｎｇ／ｍＬ、又は２００～６００ｎｇ／ｍＬの濃度で、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはレチノイン酸、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに培養する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、少なくとも０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、少なくとも約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭであるか、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭ以下であるか、又は約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０μＭである濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０～３．０μＭ、１．０～３．０μＭ、０～２．０μＭ、又は１．５～３．０μＭの濃度で、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはレチノイン酸のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、又はそれらの任意の組み合わせとともに培養する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、５００ｎｇ／ｍＬ又は約５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、５００ｎｇ／ｍＬ又は約５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４、２００ｎｇ／ｍＬ又は約２００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び２μＭ又は約２μＭのレチノイン酸ととに培養する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、又はレチノイン酸のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに、１、２、３、４、又は５日間培養する。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、本明細書に開示される方法のうちの１つ以上によって産生される前方前腸細胞から調製される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させる条件下で前方前腸細胞を培養し、背側前方前腸細胞を食道前駆細胞に分化させる条件下で背側前方前腸細胞を培養し、食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させる条件下で食道前駆細胞を培養することによって調製される。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は単層として培養される。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞はスフェロイドとして培養されない。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させる条件下で食道前駆細胞を培養する前に、食道前駆細胞を拡大するために培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させるための条件は、気液界面において食道前駆細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、本明細書に開示される方法のうちの１つ以上によって産生される前方前腸細胞から調製される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、若しくは成長補助剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに培養することによって、あるいは前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、若しくはＦＧＦ経路活性化剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）、任意選択で、神経前駆体阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせとともに培養して、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させ、背側前方前腸細胞を単一細胞に解離して、背側前方前腸細胞を食道前駆細胞に分化させるためにＲＯＣＫ阻害剤を含む第１の組織培養容器内で背側前方前腸細胞を培養し、食道前駆細胞を単一細胞に解離して、第２の組織培養容器内に配置されたインサート部材（例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）内及び／又はその表面上で食道前駆細胞を培養し（インサート部材は、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含み、インサート部材及び第２の組織培養容器は、食道前駆細胞が成長培地に完全に浸漬されるような量の成長培地を含む）、食道前駆細胞を気液界面で培養して、食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させることによって調製される。いくつかの実施形態では、第２の組織培養容器は、第１の組織培養容器と同じである。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ノギン、及びＦＧＦ１０と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ノギン、ＦＧＦ１０、及びＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤、又はいくつかの他の神経前駆体阻害剤（例えば、シタラビン）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１５０ｎｇ／ｍＬ、又は５０～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１００～３００ｎｇ／ｍＬ、１００～２５０ｎｇ／ｍＬ、又は１５０～３００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＢＭＰ経路阻害剤（例えば、ノギン）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、５～１００ｎｇ／ｍＬ、５～７５ｎｇ／ｍＬ、又は２５～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＦＧＦ経路活性化剤（例えば、ＦＧＦ１０）と接触させる。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、製造者の推奨濃度に従って、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、少なくとも０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、少なくとも約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍であるか、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍以下であるか、又は約０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、若しくは２倍以下である濃縮補助剤で、成長補助剤（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ）又は別の神経前駆体阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、成長補助剤又は神経前駆体阻害剤は、１倍で提供される。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は単層として培養される。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞はスフェロイドとして培養されない。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物上で第１の組織培養容器内で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物上のインサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、ＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、若しくはＳＭＡＤ阻害剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ）、又はそれらの任意の組み合わせとともに、及び第２の組織培養容器内のＥＧＦとともに、インサート部材内で培養される。いくつかの実施形態では、気液界面は、第２の組織培養容器及び／又はインサート部材が、食道前駆細胞が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容するように、インサート部材から成長培地を除去することを含む。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、ＥＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＤＭＨ１、及びＡ－８３－０１と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１００～２００ｎｇ／ｍＬ、５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、又は８０～１２０ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ経路活性化剤（例えば、ＥＧＦ）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２０μＭ、１～１０μＭ、１０～２０μＭ、５～１５μＭ、又は８～１２μＭの濃度で、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）と接触させる。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞を、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭ以下
である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．１～１０μＭ、０．５～２μＭ、０．１～２μＭ、若しくは０．５～５μＭの濃度で濃度で（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１の各々に対して）、ＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１）と接触させる。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、本明細書に開示される方法のうちの１つ以上によって産生される前方前腸細胞から調製される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、前方前腸細胞を、ＥＧＦ、ノギン、ＦＧＦ１０、若しくはＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに培養して、前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させ、背側前方前腸細胞を単一細胞に解離して、背側前方前腸細胞を食道前駆細胞に分化させるためにＹ－２７６３２を含む第１の組織培養容器内で背側前方前腸細胞を培養し、食道前駆細胞を単一細胞に解離して、第２の組織培養容器内に配置されたインサート部材（例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）内及び／又はその表面上で食道前駆細胞を培養し（インサート部材は、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含み、インサート部材及び第２の組織培養容器は、食道前駆細胞が成長培地に完全に浸漬されるような量の成長培地を含む）、食道前駆細胞を気液界面で培養して、食道前駆細胞を食道ラフト培養物に分化させることによって調製される。いくつかの実施形態では、第２の組織培養容器は、第１の組織培養容器と同じである。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞は単層として培養される。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞はスフェロイドとして培養されない。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、第１の組織培養容器内でコラーゲンＩＶ型上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、インサート部材内及び／又はその表面上でコラーゲンＩＶ型上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、ＥＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＤＭＨ１、又はＡ－８３－０１のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに、及び第２の組織培養容器内のＥＧＦとともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、気液界面は、第２の組織培養容器及び／又はインサート部材が、食道前駆細胞が成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容するように、インサート部材から成長培地を除去することを含む。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～３００ｎｇ／ｍＬ、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１００～２００ｎｇ／ｍＬ、又は５０～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ、ノギン、又はＦＧＦ１０のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ）とともに培養する。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦとともに培養する。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、２００ｎｇ／ｍＬ又は約２００ｎｇ／ｍＬのノギンとともに培養する。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ又は約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０とともに培養する。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１倍のＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤とともに培養する。いくつかの実施形態では、前方前腸細胞を、１、２、３、４、又は５日間培養する。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて解離される。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２０μＭ、５～１５μＭ、又は８～１２μＭの濃度で、Ｙ－２７６３２を含む第１の組織培養容器内で培養される。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、１０μＭ又は約１０μＭのＹ－２７６３２とともに第１の組織培養容器内で培養される。いくつかの実施形態では、背側前方前腸細胞は、第１の組織培養容器内で、１．５μｇコラーゲンＩＶ型／ｃｍ２培養表面積で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含むインサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、インサート部材の透過性である表面は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下である細孔サイズ、又は前述のサイズのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細孔サイズ、例えば、０．１～１０μｍ、０．１～５μｍ、５～１０μｍ、若しくは１～５μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、インサート部材の透過性である表面は、３μｍであるか、約３μｍであるか、少なくとも３μｍであるか、少なくとも約３μｍであるか、３μｍ以下であるか、又は約３μｍ以下のである細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～３００ｎｇ／ｍＬ、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１００～２００ｎｇ／ｍＬ、又は５０～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＥＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＤＭＨ１、又はＡ－８３－０１のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．１～２０μＭ、５～１５μＭ、０．１～４μＭ、又は８～１２μＭの濃度で、ＥＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＤＭＨ１、又はＡ－８３－０１のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦとともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、１０μＭ又は約１０μＭのＹ－２７６３２とともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、１μＭ又は約１μＭのＤＭＨ１とともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態で
は、食道前駆細胞は、１μＭ又は約１μＭのＡ－８３－０１とともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、１、２、３、４、５、６、７、又は８日間、ＥＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＤＭＨ１、又はＡ－８３－０１のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）とともに、インサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、１．５μｇコラーゲンＩＶ型／ｃｍ２の培養表面積でインサート部材内及び／又はその表面上で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、第２の組織培養容器内で、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦとともに気液界面で培養される。いくつかの実施形態では、食道前駆細胞は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日間、気液界面で培養される。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、本明細書に記載の方法のうちの１つ以上によって産生される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物はヒト食道ラフト培養物である。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物はヒト細胞に由来する。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物はヒトｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、スフェロイド又はオルガノイドに由来しない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、細胞外マトリックス又はその構成要素若しくは模倣物上で培養されない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、ラットコラーゲンＩ型マトリックス若しくはマトリゲル、又は両方上で培養されない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、異種構成要素とともに培養されない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、ヒトコラーゲンＩＶ型上で培養される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、フィーダー細胞基質上で培養されない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、マウス線維芽細胞上で培養されない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、照射されたマウス線維芽細胞上で培養されない。
食道ラフト培養物の特性
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、本明細書に記載の方法のうちの１つ以上によって産生される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、重層扁平上皮細胞層を含む。いくつかの実施形態では、重層扁平上皮細胞層は、基底上層及び基底層を含む。いくつかの実施形態では、重層扁平上皮細胞層は、Ｅ－カドヘリン（Ｅｃａｄ）に対して陽性である。いくつかの実施形態では、基底上層は、ケラチン１３（keratin13、ＫＲＴ１３）若しくはケラチン８（keratin8、ＫＲＴ８）、又は両方に対して陽性である。いくつかの実施形態では、基底層は、性決定領域Ｙ－ボックス２（sex determining region Y-box2、ＳＯＸ２）、腫瘍タンパク質Ｐ６３（ｐ６３）、若しくはケラチン５（keratin5、ＫＲＴ５）、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ）に対して陽性である。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は間葉層を含む。いくつかの実施形態では、間葉層は筋線維を含む。いくつかの実施形態では、間葉層は、フォークヘッドボックスタンパク質Ｆ１（forkhead box protein F1、ＦＯＸＦ１）、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－６．１（ＮＫＸ６－１）、若しくはビメンチン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ）に対して陽性である。いくつかの実施形態では、筋線維は、デスミンに対して陽性である。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、固有層を欠くか、又は食道ラフト培養物と同じ種の成体動物の食道組織と比較して、固有層が低減若しくは実質的に低減している（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上低減している）。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上含まない。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養は、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）を更に含む。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物が神経支配されたラフト培養物であるように、食道ラフト培養物は、ＥＮＣＣ、神経前駆細胞、及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を更に含む。いくつかの実施形態では、神経前駆細胞はＳＯＸ１０＋である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生されたる食道ラフト培養物は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下であるか、又は約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１～５００μｍ、１０～３００μｍ、５０～１００μｍ、１～１００μｍ、又は１００～５００μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物は、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍであるか、約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍであるか、少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍであるか、少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍであるか、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍ以下であるか、又は約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１５０～５００μｍ、１５０～３５０μｍ、又は２５０～５００μｍの厚さを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２であるか、約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２であるか、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２であるか、少なくとも約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２であるか、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２以下であるか、又は約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２以下である表面積、あるいは前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積、例えば、０．１～１００ｃｍ２、１０～８０ｃｍ２、２０～４０ｃｍ２、０．１～３０ｃｍ２、又は５０～１００ｃｍ２の表面積を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物は、０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２であるか、約０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２であるか、少なくとも０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２であるか、少なくとも約０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２であるか、０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２以下であるか、又は約０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２以下である表面積、あるいは前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積、例えば、０．１～２ｃｍ２、０．１～１ｃｍ２、又は０．５～２ｃｍ２の表面積を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物は、１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３であるか、約１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３であるか、少なくとも１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３であるか、少なくとも約１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３であるか、１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３以下であるか、又は約１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３以下である体積、あるいは前述の体積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の体積、例えば、１０－５～１０ｃｍ３、１０－２～１ｃｍ３、又は１～１０ｃｍ３の体積を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の重層扁平上皮層は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下であるか、又は約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１～５００μｍ、２０～２００μｍ、５０～１００μｍ、１～１００μｍ、又は１００～５００μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の重層扁平上皮細胞層は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍであるか、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍであるか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍであるか、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍであるか、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍ以下であるか、又は約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍ以下である厚さ、あるいは前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、５０～２５０μｍ、５０～１５０μｍ、又は１００～２５０μｍの厚さを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の基底上層は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下であるか、又は約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１～５００μｍ、２０～２００μｍ、５０～１００μｍ、１～１００μｍ、又は１００～５００μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の基底上層は、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、１９０、若しくは２００μｍであるか、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、１９０、若しくは２００μｍであるか、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、１９０、若しくは２００μｍであるか、少なくとも約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、１９０、若しくは２００μｍであるか、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、１９０、若しくは２００μｍ以下であるか、又は約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、１９０、若しくは２００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、８０～２００μｍ、８０～１５０μｍ、又は１００～２００μｍの厚さを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の基底層は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下であるか、又は約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１～５００μｍ、２０～２００μｍ、５０～１００μｍ、１～１００μｍ、又は１００～５００μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の基底層は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍであるか、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍであるか、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍであるか、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍであるか、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍ以下であるか、又は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１０～１００μｍ、１０～５０μｍ、又は５０～１００μｍの厚さを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の間葉層は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍであるか、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下であるか、又は約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の長さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１～５００μｍ、２０～２００μｍ、５０～１００μｍ、１～１００μｍ、又は１００～５００μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される食道ラフト培養物の間葉層は、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍであるか、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍであるか、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍであるか、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍであるか、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍ以下であるか、又は約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍ以下である厚さ、あるいは前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さ、例えば、１００～４００μｍ、１００～２００μｍ、又は２００～４００μｍの厚さを有する。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、本明細書に記載の方法のうちの１つ以上によって産生される。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は神経構造を含む。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、ＳＯＸ２又はβＩＩＩ－チューブリンなどの神経マーカーを発現する細胞を含む。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物は、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を含まない。
移植及び治療方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の食道ラフト培養物又は食道ラフト細胞組成物は、例えば、治療又は実験モデルとして、宿主生物に移植又はグラフトされる。いくつかの実施形態では、移植は、ラフト培養物を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間であるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間以内であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間以内である日数、あるいは前述の日数のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の培養日数、例えば、１～５０日、１０～４０日、２０～３０日、１～３０日、若しくは２０～５０日間培養した後に行われる。いくつかの実施形態では、ラフト培養物は、当該技術分野において既知の他の方法によって調製された食道オルガノイドが同じ又は同様の成熟状態になる日数前に、移植及び／又は研究のために十分に成熟しており、日数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日であるか、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日であるか、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日であるか、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日以内であるか、又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日以内である、あるいは前述の日数のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、５～４０日、１０～４０日、２０～３０日、又は５～３０日である。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物は免疫不全哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物は免疫不全マウスである。いくつかの実施形態では、宿主生物は、サル、ネコ、イヌ、ハムスター、又はラットである。いくつかの実施形態では、宿主生物は、免疫無防備状態のサル、ネコ、イヌ、ハムスター、又はラットである。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。いくつかの実施形態では、宿主生物は免疫不全のヒトである。いくつかの実施形態では、宿主生物は免疫適格性のヒトである。いくつかの実施形態では、宿主生物は、免疫抑制剤で治療された免疫適格性のヒトである。いくつかの実施形態では、ラフト培養物は、宿主生物に対して自家である。いくつかの実施形態では、ラフト培養物は、宿主生物に対して同種である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、食道移植又はグラフトを必要とする哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、食道移植又はグラフトを必要とするヒトである。
いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物又は食道ラフト細胞組成物は、アカラシア、バレット食道、食道がん、胃食道逆流症（gastroesophageal reflux disease、ＧＥＲＤ）、嚥下障害、胸やけ、好酸球性食道炎、傍食道型（paraoesophageal）ヘルニア、又は食道穿孔を含むがこれらに限定されない様々な異なる病態を研究又は治療するために使用することができる臨床的に有益な組織として機能する。いくつかの実施形態では、食道ラフト培養物又は食道ラフト細胞組成物は、薬理学的挙動、細胞シグナル伝達、蠕動、がんの形成及び遊走、若しくは移植／グラフト、又はそれらの任意の組み合わせを評価するために使用される。
本明細書において論じられる実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例において更に詳細に開示され、これらの実施例は、本開示の範囲を限定することを決して意図しない。本明細書及び特許請求の範囲に記載されるように、多くの他の実施形態も本開示の範囲内に含まれることが当業者には理解されよう。
実施例１．上皮及び間葉を含む食道ラフト培養物の生成
食道ラフト培養物を、図１に示される例示的な概略図に従って産生した。
ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）を、ｈＥＳＣ適格マトリゲルコーティング１０ｃｍプレート上で培養し、食道単層に分化させた（９日目）。０～６日目まで、提供された補助剤を含む成長培地を毎日交換した。０～１日目まで、ｈＰＳＣを、５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。１～２日目まで、ｈＰＳＣを、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び０．２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２～３日目まで、ｈＰＳＣを、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び２％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。３日目の終わりに、ｈＰＳＣを胚体内胚葉細胞に分化させた。
次に、胚体内胚葉細胞を、以下に従って前方前腸単層細胞に分化させた。３～５日目まで、胚体内胚葉細胞を、５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、２００ｎｇ／ｍＬのノギン（ＢＭＰ阻害剤、Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び２％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。５日目～６日目まで、胚体内胚葉細胞を、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４、２００ｎｇ／ｍＬのノギン、２μＭレチノイン酸（retinoic acid、ＲＡ、Ｓｉｇｍａ）、及び２％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。６日目の終わりに、胚体内胚葉細胞を前方前腸単層細胞に分化させた。
次いで、前方前腸単層細胞を、背側前方前腸細胞及び食道前駆細胞に分化させた。６日目～９日目まで、前方前腸単層細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養して、背側前方前腸細胞にパターン化した。
任意選択で、本明細書で提供されるように毎日添加される他の成長因子に加えて、１倍ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤（Ｃｕｌｔ１）（ＧＩＢＣＯ）を６～９日目に添加することができる（図１に示される）。代替的に、図３Ａは、０日目から開始して９日目まで任意選択で添加される１倍ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅを示す。９日目以降、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅを培養物から除去した。ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅを添加して神経夾雑を低減することができ、より早くに添加することにより、ラフト培養物の間葉層における神経夾雑が更に低減される。シタラビン（ａｒａ－Ｃ）などの代替の神経前駆体阻害剤が想定される。他の実施形態では、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤は培養条件に含まれない。
９日目に、分化した背側前方前腸単層を、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して単一細胞懸濁液に解離させ、１０μＭのＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を補充したケラチノサイト無血清培地（serum free medium、ＳＦＭ）（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中のコラーゲンＩＶ型（ヒト胎盤由来）コーティングプレート（１．５μｇのコラーゲン／ｃｍ２）上で約１．８×１０４細胞／ｃｍ２で、食道前駆細胞に分化させるために成長培地を１日おきに交換しながらコンフルエントになるまで（５～６日間）培養した。
食道前駆細胞がコンフルエントに達したら、それらを、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して単一細胞懸濁液に解離させ、コラーゲンＩＶ型コーティング（１．５μｇのコラーゲン／ｃｍ２）３μｍ細孔サイズのポリカーボネート膜セルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。セルインサート上での培養の最初の５日間、細胞を上部（インサート）及び下部（プレート）区画において毎日新しい培地で培養した。上部区画には、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０μＭのＹ－２７６３２、１μＭのＤＭＨ１、及び１μＭのＡ８３－０１（ＳＭＡＤ阻害剤）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給した。下部区画には、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給した。５日後、細胞を気液界面に移動し、底部区画においてのみ毎日新しい培地で培養した。このようにして、より頂端の層であるラフト培養物の上皮が空気に曝露される。
全段階の細胞を、標準的な３７℃、５％ＣＯ２インキュベーション条件で培養した。
実施例２．食道ラフト培養物の観察
本明細書に記載の方法によって産生された食道ラフト培養物は、２４ウェルプレート形式ではなく１０ｃｍプレート形式で分化及び培養することができた。ラフト培養物への分化の前にスフェロイド／オルガノイド段階はなかった。その代わりに、細胞を単層で培養し、次いでセルインサート中で培養した。ラフト培養物を培養するために、フィーダー細胞基質（例えば、照射されたマウス線維芽細胞を有するラットコラーゲンＩ型マトリックス）は必要なかった。代わりに、プレート及びインサート、特に細胞が接触する表面又はインサートの透過性表面を、ヒト由来コラーゲンＩＶ型でコーティングした。マトリゲル及び他の基底膜マトリックスも必要としなかった。これは、より大きな培養物及びｃＧＭＰ産生へのスケーリングに対する重要な考慮事項である。気液界面は、食道分化の開始から約２週間後に開始した。比較すると、以前の食道ラフト培養物及びオルガノイドのプロトコルは、分化開始の約４０日後の気液界面開始を伴った。
重要なことに、本明細書に記載の食道ラフト培養物は、上皮及び間葉の両方を含むが、以前のラフト培養物及びオルガノイドは間葉を欠く。６～９日目の単層に間葉前駆細胞の小集団が存在したが、間葉集団は、９～１４日目に（実施例１に記載されるように）、補充ケラチノサイトＳＦＭ培地中のコラーゲンＩＶ型コーティングプレート上での培養中に拡大した。以前のプロトコルのように自然発生的に出現するスフェロイドのみを収集する代わりに、単層全体を使用することにより、そうでなければ失われる小さな前駆体集団を拡大することができた。図２は、食道ラフト培養物の形態を示す。Ｅ－カドヘリンによって示される重層扁平上皮は、ケラチン１３（ＫＲＴ１３）及びケラチン８（ＫＲＴ８）によって示される基底上層と、ＳＯＸ２、Ｐ６３、及びケラチン５（ＫＲＴ５）によって示される基底層とに細分される。上皮の下で、間葉細胞マーカーＦＯＸＦ１、ＮＫＸ６－１、及びビメンチンによって示される間葉は、分化した筋細胞（デスミン）を含む。
図３Ｂは、培養の０～９日目又は６～９日目のいずれかにＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤を使用した場合の食道ラフト培養物を比較する免疫蛍光画像を示す。望ましくない可能性がある神経細胞型の存在は、Ｅｃａｄ陰性間葉層内のＳＯＸ２（矢印）又はβＩＩＩ－チューブリン（矢印）の発現によって示される。ＳＯＸ２は、通常、Ｅｃａｄ＋食道上皮において発現される。
実施例３．腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）の食道ラフト培養物への分化及び共培養
食道ラフト培養物は、培養及び分化中に腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）と組み合わせることによって神経支配され得る（図４Ａ）。
ｈＰＳＣをｈＥＳＣ適格マトリゲルコーティングプレート上で培養し、ｍＴｅＳＲ１中のコラゲナーゼＩＶ（５００Ｕ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ）で３７℃で６０～９０分間処理して、コロニーを剥離した。次いで、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、１５ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞がチューブの底でペレット化したら、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２を除去し、細胞を穏やかに粉砕し、神経誘導培地に再懸濁した。神経誘導培地は、１：１比のＤＭＥＭ／Ｆ１２－ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補助剤（０．５倍、Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２補助剤（０．５倍、Ｇｉｂｃｏ）、ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（１倍、Ｇｉｂｃｏ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）とからなる。細胞を、非組織培養処理した６０ｍｍペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）上で培養した。神経誘導培地を５日間毎日交換し、４日目及び５日目に２μＭのレチノイン酸（retinoic acid、ＲＡ）を培地に添加して後進（posteriorizing）した。６日目に、浮遊ニューロスフェアを収集し、培地を毎日交換しながら更に４日間、神経誘導培地（ＲＡを含まない）中のヒトフィブロネクチン（human fibronectin、ＨＦＮ）コーティングプレート（ＰＢＳに希釈された３μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。次いで、コンフルエントな細胞を、２～３分の短時間のＡｃｃｕｔａｓｅ処理によって収集し、ＲＡを含まない神経誘導培地中で更に４日間、ＨＦＮコーティングプレート上で再度培養した。この段階で、細胞を、短時間のＡｃｃｕｔａｓｅ処理によって再度収集し、カウントし、食道前駆細胞と再度組み合わせ（本明細書で開示される食道ラフト培養分化プロセスの１３日目）、セルインサート上で培養した。ＥＮＣＣ－食道前駆細胞播種比は約２：１である。共培養を、ＥＮＣＣを欠く食道培養と同じ条件で維持した。上部区画には、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０μＭのＹ－２７６３２、１μＭのＤＭＨ１、及び１μＭのＡ８３－０１（ＳＭＡＤ阻害剤）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給する。下部区画には、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給する。５日後、細胞を気液界面に移動し、底部区画においてのみ毎日新しい培地で培養する。
図４Ｂは、神経支配された食道ラフト培養物の代表的なマーカーを示す。ラフト培養物は、典型的な食道上皮マーカー（ＳＯＸ２、Ｐ６３、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１３、及びＫＲＴ８）、及び一般的な上皮マーカーＥ－カドヘリン（Ｅｃａｄ）を発現する。矢印で示される組み込まれたＧＦＰ発現ＥＮＣＣは、ビメンチン及び神経マーカーβＩＩＩ－チューブリンの発現によって示される食道ラフト培養間葉を神経支配する。βＩＩＩ－チューブリン発現は、ＧＦＰ発現と共局在され、経支配神経が、食道ラフト分化中の神経夾雑からではなく、ＥＮＣＣに直接分化したｈＰＳＣ－ＧＦＰから生じたことを示す。
前述の実施形態の少なくともいくつかにおいて、実施形態で使用される１つ以上の要素は、そのような置き換えが技術的に実現可能でない限り、別の実施形態で交換可能に使用され得る。特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び構造に対して様々な他の省略、追加、及び修正が行われ得ることが当業者によって理解されるであろう。全てのそのような修正及び変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される主題の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書における実質的に任意の複数形及び／又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数形から単数形に、及び／又は単数形から複数形に変換することができる。様々な単数形／複数形の置換は、明確にするために本明細書に明示的に記載され得る。
「例えば（ｅ．ｇ．）」の使用に関して、「例えば（for example）」を意味すると理解され、したがって非限定的な例である。
一般に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、一般に「非限定」用語として意図される（例えば、「含む」という用語は、「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む」という用語は、「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきであるなど）ことが当業者によって理解されるであろう。導入される請求の記載の特定の数が意図される場合、そのような意図は請求項において明示的に記載され、そのような記載がない場合、そのような意図は存在しないことが当業者によって更に理解されるであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求の記載を導入するために、導入句「少なくとも１つ」及び「１つ以上」の使用を含み得る。しかしながら、そのような句の使用は、同じ請求が導入句「１つ以上」又は「少なくとも１つ」及び「ａ」又は「ａｎ」などの不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求の記載の導入が、そのような導入された請求の記載を含む任意の特定の請求を、１つのみのそのような記載を含む実施形態に限定することを暗示するように解釈されるべきではない（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味するように解釈されるべきである）。請求の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同じことが当てはまる。加えて、導入される請求の記載の特定の数が明示的に記載されている場合であっても、当業者は、そのような記載が少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを認識するであろう（例えば、他の修飾語句を伴わない「２つの記載」という明白な記載は、少なくとも２つの記載、又は２つ以上の記載を意味する）。更に、「Ａ、Ｂ、及びＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似する規則が使用される場合、一般に、そのような構成は、当業者が規則を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢをともに、Ａ及びＣをともに、Ｂ及びＣをともに、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣをともに有する系などを含むが、それらに限定されない）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似する規則が使用されるこれらの場合、一般に、そのような構成は、当業者が規則を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢをともに、Ａ及びＣをともに、Ｂ及びＣをともに、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣをともに有する系などを含むが、それらに限定されない）。２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の選言的単語及び／又は句は、説明、特許請求の範囲、又は図面にかかわらず、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によって更に理解されるであろう。例えば、句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」若しくは「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解される。
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本開示が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても記載されることを認識するであろう。
当業者によって理解されるように、書面による説明を提供することに関してなど、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示される全ての範囲は、ありとあらゆる可能な部分範囲及びそれらの部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に説明し、可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などに容易に分解することができる。当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「を超える」、「未満」などの言葉は、記載される数を含み、後に本明細書で論じられる部分範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３つの項目を有する群は、１つ、２つ、又は３つの項目を有する群を指す。同様に、１～５つの項目を有する群は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの項目を有する群などを指す。
様々な態様及び実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様及び実施形態が当業者には明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様及び実施形態は、例示を目的としており、限定することを意図しておらず、真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
公開及び未公開の出願、特許、及び参考文献を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、本明細書の任意の特定の開示について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書において本明細書の一部とされる。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、本明細書は、任意のそのような矛盾する材料に取って代わり、かつ／又は優先することが意図される。

Claims (106)

  1. インビトロ食道ラフト培養物であって、
    基底上層及び基底層を含む、重層扁平上皮層と、
    筋線維を含む、間葉層と、を含み、
    前記重層扁平上皮がＥ－カドヘリン＋であり、前記基底上層がＫＲＴ１３＋及びＫＲＴ８＋であり、前記基底層が、ＳＯＸ２＋、Ｐ６３＋、及びＫＲＴ５＋であり、
    前記間葉層が、ＦＯＸＦ１＋、ＮＫＸ６－１＋、及びビメンチン＋であり、前記筋線維がデスミン＋である、インビトロ食道ラフト培養物。
  2. 前記食道ラフト培養物が、固有層を欠くか、又は前記ラフト培養物と同じ種の成体動物由来の食道組織と比較して固有層が低減している、請求項１に記載の食道ラフト培養物。
  3. 成長培地、任意選択でＤＭＥＭ／Ｆ１２を更に含む、請求項１又は２に記載の食道ラフト培養物。
  4. 前記食道ラフト培養物が、前記成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含むインサート部材の中及び／又はその表面上に位置し、前記インサート部材が、組織培養容器内に配置され、
    任意選択で、前記食道ラフト培養物が、前記成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない前記表面上に配置されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  5. 前記インサート部材の少なくとも一部分、任意選択で前記成長培地に透過性であるが前記細胞には透過性でない前記表面が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、請求項４に記載の食道ラフト培養物。
  6. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、請求項５に記載の食道ラフト培養物。
  7. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、請求項５又は６に記載の食道ラフト培養物。
  8. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラージュＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、請求項５～７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  9. 前記インサート部材及び／又は組織培養容器が、前記食道ラフト培養物が前記成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を収容する、請求項４～８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  10. 前記インサート部材内に収容される前記成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせを更に含み、前記組織培養容器内に収容される前記成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤を含む、請求項９に記載の食道ラフト培養物。
  11. 前記組織培養容器及び／又はインサート部材が、前記食道ラフト培養物が前記成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容し、
    前記重層扁平上皮が、前記成長培地中に部分的にのみ浸漬されるか、又は浸漬されておらず、気液界面を形成し、かつ／又は気液界面に位置する、請求項４～８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  12. 前記組織培養容器内に収容される前記成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤を含む、請求項１１に記載の食道ラフト培養物。
  13. 前記インサート部材の透過性である前記表面が、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍであるか、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下であるか、又は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μｍ以下である細孔サイズ、あるいは前述のサイズのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の細孔サイズを有する、請求項４～１２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  14. 前記インサート部材の透過性である前記表面が、３μｍの細孔サイズを有する、請求項４～１３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  15. 前記食道ラフト培養物が、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上含まない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  16. 前記食道ラフト培養物が神経支配された食道ラフト培養物であるように、前記食道ラフト培養物が腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞、及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を更に含み、任意選択で、前記神経前駆細胞がＳＯＸ１０＋である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養。
  17. 前記食道ラフト培養物が、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を有しない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物。
  18. インビトロ細胞培養物であって、
    ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された背側前方前腸細胞に由来する食道前駆細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養物。
  19. 前記背側前方前腸細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンでも処理されている、請求項１８に記載の細胞培養物。
  20. 成長培地、任意選択で無血清培地、任意選択で、ケラチノサイトＳＦＭを更に含む、請求項１８又は１９に記載の細胞培養物。
  21. 前記成長培地が、ＥＧＦ経路活性化剤若しくはウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）、又は両方を含む、請求項２０に記載の細胞培養物。
  22. 前記ＥＧＦ経路活性化剤が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度にあるか、あるいは
    前記ＢＰＥが、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度にあるか、あるいは両方である、請求項２１に記載の細胞培養物。
  23. 前記細胞培養物が、組織培養容器内及び／又はその表面上に位置する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  24. 前記組織培養容器の少なくとも一部分が、細胞外マトリックス又はその旺盛要素でコーティングされ、前記食道前駆細胞の集団が、前記一部分上にあるか、又はそれと接触している、請求項２３に記載の細胞培養物。
  25. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、請求項２４に記載の細胞培養物。
  26. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、請求項２４又は２５に記載の細胞培養物。
  27. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラージュＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  28. ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  29. 腸内神経堤細胞を更に含む、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  30. インビトロ細胞培養物であって、
    ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養物。
  31. 前記前方前腸細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、請求項３０に記載の細胞培養物。
  32. 成長培地、任意選択で、ＲＰＭＩ、任意選択で、ＦＢＳ、任意選択で、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、若しくは２．５％のＦＢＳ、又は前述のパーセンテージのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージのＦＢＳを更に含む、請求項３０又は３１に記載の細胞培養物。
  33. 前記細胞培養物が、組織培養容器内及び／又はその表面上に位置する、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  34. 前記食道ラフト培養物又は細胞培養物が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８日間成長している、請求項１～１７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物又は請求項１８～３３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  35. 前記食道ラフト培養物又は前記細胞培養物が、ヒト人工多能性幹細胞に由来する、請求項３４に記載の食道ラフト培養物又は細胞培養物。
  36. 前記食道ラフト培養物又は前記細胞培養物が、スフェロイド又はオルガノイドに由来しない、請求項３４又は３５に記載の食道ラフト培養物又は細胞培養物。
  37. 食道ラフト培養物を産生する方法であって、
    （ａ）前方前腸細胞を背側前方前腸細胞に分化させるために、前記前方前腸細胞を、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせと接触させる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）からの前記背側前方前腸細胞を単一細胞に解離させる工程と、
    （ｃ）前記背側前方前腸細胞を食道前駆細胞に分化させるために、前記背側前方前腸細胞を第１の組織培養容器内で培養する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）からの前記食道前駆細胞を単一細胞に解離させる工程と、
    （ｅ）前記食道前駆細胞を、インサート部材内及び／又はその表面上で培養する工程とであって、
    前記インサート部材が、第２の組織培養容器内に配置され、
    前記インサート部材が、成長培地に透過性であるが細胞には透過性でない表面を含み、
    前記インサート部材及び第２の組織培養容器が各々、前記食道前駆細胞が前記成長培地中に完全に浸漬されるような量の成長培地を収容する、培養する工程と、
    （ｆ）前記食道前駆細胞を前記インサート部材内で培養する工程であって、前記第２の組織培養容器及び／又はインサート部材が、前記食道前駆細胞が前記成長培地中に部分的にのみ浸漬されるような量の成長培地を収容する、培養する工程と、を含む、方法。
  38. 前記前方前腸細胞は、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンと更に接触されるものである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記食道前駆細胞が、解離酵素、任意選択で、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、又はＡｃｃｕｔａｓｅを使用して解離される、請求項３７又は３８に記載の方法。
  40. 前記第１の組織培養容器及び／又は前記第２の組織培養容器の少なくとも一部分が、細胞外マトリックス又はその構成要素でコーティングされている、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトに由来する、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素がヒトコラーゲンＩＶ型を含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記細胞外マトリックス又はその構成要素が、ラットコラーゲンＩ型マトリックス又はマトリゲルを含まない、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記（ａ）の接触させる工程が、少なくとも１、２、３、４、又は５日間にわたって行われる、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記（ｃ）の培養する工程が、少なくとも１、２、３、４、又は５日間にわたって行われる、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記（ｅ）の培養する工程が、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８日間にわたって行われる、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記（ｆ）の培養する工程が、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間にわたって行われる、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記工程（ｃ）の背側前方前腸細胞が、ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＰＥ、ＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせとともに培養される、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記工程（ｅ）の食道前駆細胞が、前記インサート部材の前記成長培地中のＥＧＦ経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ、及び前記第２の組織培養容器の前記成長培地中のＥＧＦとともに培養される、請求項３７～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記工程（ｆ）の食道前駆細胞が、前記第２の組織培養容器の前記成長培地中でＥＧＦ経路活性化剤とともに培養される、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記前方前腸細胞がヒト人工多能性幹細胞に由来する、請求項３７～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記前方前腸細胞が胚体内胚葉細胞に由来し、前記胚体内胚葉細胞がヒト人工多能性幹細胞に由来する、請求項３７～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記胚体内胚葉細胞が、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせで処理されて、前記胚体内胚葉細胞を前方前腸細胞に分化させる、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記胚体内胚葉細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記胚体内胚葉細胞が、１、２、３、４、又は５日間処理されている、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ヒト人工多能性幹細胞が、前記ヒト人工多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためにＢＭＰ４及び／又はアクチビンＡで処理されている、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ヒト人工多能性幹細胞が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ヒト人工多能性幹細胞が、１、２、３、４、又は５日間処理されている、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. ヒト人工多能性幹細胞をＢＭＰ４及び／又はアクチビンＡと接触させて、前記ヒト人工多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることと、
    前記胚体内胚葉細胞を、Ｗｎｔ、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせと接触させて、前記胚体内胚葉細胞を工程（ａ）の前方前腸細胞に分化させることと、を更に含む、請求項３７～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記ヒト人工多能性幹細胞及び／又は前記胚体内胚葉細胞は、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンと更に接触させる、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ヒト人工多能性幹細胞を、１、２、３、４、又は５日間接触させる、請求項５９又は６０に記載の方法。
  62. 前記胚体内胚葉細胞を、１、２、３、４、又は５日間接触させる、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記食道ラフト培養物が、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上含まない、請求項３７～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記工程（ｄ）の解離された食道前駆細胞を、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）と組み合わせる工程と、前記工程（ｅ）及び（ｆ）に従って前記組み合わされた食道前駆細胞及びＥＮＣＣを培養して、神経支配された食道ラフト培養物を産生する工程と、を更に含む、請求項３７～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記神経支配された食道ラフト培養物が、腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を含み、任意選択で、前記神経前駆細胞がＳＯＸ１０＋である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記食道ラフト培養物が、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を含まない、請求項３７～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. インビトロ細胞組成物であって、
    ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞に由来する背側前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
  68. インビトロ細胞組成物であって、
    ＥＧＦ経路活性化剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＦＧＦ経路活性化剤、又はそれらの任意の組み合わせで処理された前方前腸細胞の集団を含む、インビトロ細胞組成物。
  69. 前記前方前腸細胞の集団が、神経前駆体阻害剤、任意選択で、ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ補助剤又はシタラビンで更に処理されている、請求項６８に記載の細胞組成物。
  70. インビトロ食道ラフト組成物であって、
    基底上層及び基底層を含む、重層扁平上皮層と、
    筋線維を含む、間葉層と、を含み、
    前記重層扁平上皮がＥ－カドヘリン＋であり、前記基底上層がＫＲＴ１３＋及びＫＲＴ８＋であり、前記基底層が、ＳＯＸ２＋、Ｐ６３＋、及びＫＲＴ５＋であり、
    前記間葉層が、ＦＯＸＦ１＋、ＮＫＸ６－１＋、及びビメンチン＋であり、前記筋線維がデスミン＋である、インビトロ食道ラフト組成物。
  71. 前記食道ラフト細胞組成物が、神経前駆細胞及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を事実上含まない、請求項７０に記載の食道ラフト細胞組成物。
  72. 前記食道ラフト培養物が神経支配された食道ラフト培養物であるように、前記食道ラフト細胞組成物が腸内神経堤細胞（ＥＮＣＣ）、神経前駆細胞、及び／又はβＩＩＩ－チューブリン＋神経細胞を更に含み、任意選択で、前記神経前駆細胞がＳＯＸ１０＋である、請求項７０に記載の食道ラフト細胞組成物。
  73. 前記食道ラフト細胞組成物が、血管新生、血管、及び／又は内皮細胞を含まない、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養細胞組成物。
  74. 前記食道ラフト細胞組成物が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～７３のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  75. 前記食道ラフト細胞組成物が、約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～７４のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  76. 前記食道ラフト組成物が、約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｃｍ２の表面積、又は前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積を有する、請求項１～７５のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  77. 前記食道ラフト組成物が、約０．１、０．５、１、１．５、若しくは２ｃｍ２の表面積、又は前述の表面積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の表面積を有する、請求項１～７６のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  78. 前記食道ラフト組成物が、約１０－５、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１、５、若しくは１０ｃｍ３の体積、又は前述の体積のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の体積を有する、請求項１～７７のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  79. 前記重層扁平上皮細胞層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～７８のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  80. 前記重層扁平上皮細胞層が、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、若しくは２５０μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～７９のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  81. 前記基底上層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～８０のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  82. 前記基底上層が、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～８１のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  83. 前記基底層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～８２のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  84. 前記基底層が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～８３のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  85. 前記間葉層が、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、若しくは５００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～８４のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  86. 前記間葉層が、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、若しくは４００μｍの厚さ、又は前述の厚さのうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の厚さを有する、請求項１～８５のいずれか一項に記載の食道ラフト細胞組成物。
  87. 前記ＥＧＦ経路活性化剤が、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＰＲ、トモレグリン、ＮＲＧ－１、ＮＲＧ－２、ＮＲＧ－３、若しくはＮＲＧ－４、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～８６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  88. 前記ＥＧＦ経路活性化剤がＥＧＦである、請求項１～８７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  89. 前記ＥＧＦ経路活性化剤が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、請求項１～８８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  90. 前記ＥＧＦ経路活性化剤が、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１～８９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  91. 前記ＢＭＰ経路阻害剤が、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～９０のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  92. 前記ＢＭＰ経路阻害剤がノギンである、請求項１～９１のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  93. 前記ＢＭＰ経路阻害剤が、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、若しくは３００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、請求項１～９２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  94. 前記ＢＭＰ経路阻害剤が、２００ｎｇ／ｍＬ又は約２００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１～９３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  95. 前記ＦＧＦ経路活性化剤が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、若しくはＦＧＦ２３、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～９４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  96. 前記ＦＧＦ経路活性化剤がＦＧＦ１０である、請求項１～９５のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  97. 前記ＦＧＦ経路活性化剤が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、請求項１～９６のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  98. 前記ＦＧＦ経路活性化剤が、５０ｎｇ／ｍＬ又は約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１～９７のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  99. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｙ－３０１４１、Ｙ－３９９８３、Ｋｉ－２３０９５、ＳＬｘ－２１１９、チアゾビビン、アザインドール１、ファスジル、リパスジル、ネタルスジル、ＲＫＩ－１４４７、若しくはＧＳＫ４２９２８６Ａ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～９８のいずれか一項に記載の食道ラフト培養、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  100. 前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、請求項１～９９のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  101. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、請求項１～１００のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  102. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、１０μＭ又は約１０μＭの濃度で提供される、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  103. 前記ＳＭＡＤ阻害剤が、Ａ－８３－０１、ＤＭＨ１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２５、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ヘスペレチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１０２のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  104. 前記ＳＭＡＤ阻害剤が、ＤＭＨ１及びＡ－８３－０１である、請求項１～１０３のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  105. 前記ＳＭＡＤ阻害剤が、約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０μＭの濃度、又は前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で提供される、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
  106. 前記ＳＭＡＤ阻害剤が、１μＭ又は約１μＭの濃度で提供される、請求項１～１０５のいずれか一項に記載の食道ラフト培養物、細胞培養物、方法、又は食道ラフト細胞組成物。
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