JP2022545516A - オルガノイド中胚葉系統多様化 - Google Patents

オルガノイド中胚葉系統多様化 Download PDF

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Abstract

多能性細胞から臓側中胚葉細胞型およびそのサブタイプを作製するインビトロの方法が、本明細書に開示される。これらの方法は、インビトロ培養およびインビボ移植の両方で、オルガノイドの生存率、成長、および成熟を促進する、濃縮された間葉を含有する改良された前腸および後腸由来のオルガノイドを産生するために使用することができる。【選択図】図７Ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８９２，７８１号の優先権の利益を主張するものであり、これにより、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
連邦政府が後援する研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＰ０１ＨＤ０９３３６３およびＰ３０ ＤＫ０７８３９２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、発明に対して一定の権利を有する。
本開示の態様は、一般に、臓側中胚葉およびそのサブタイプを多能性幹細胞から分化させるための新しく改善された方法に関する。
ヒトの妊娠１７～２３日に相当するマウスの胎生期（Ｅ）８．５～Ｅ９．５の初期の胎児発生において、胚体内胚葉（ＤＥ）とそれを取り巻く臓側中胚葉（ＳＭ）との間の一連の誘導組織相互作用は、ナイーブな前腸管を異なる前駆ドメインに徐々にパターン化する。これらのドメインはさらに、気管、肺、食道、胃、肝臓、膵臓、近位小腸を含む別個の内臓に発達する。ＤＥは、呼吸器および消化器の上皮内層ならびに実質を生じさせ、ＳＭは、内臓を取り巻く平滑筋、線維芽細胞、および腸間膜などの間葉組織を生じさせる。この前腸のパターン化は、胸腔と腹腔の状況（ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を定義し、様々な臓器の相対的な位置を設定する。このプロセスの混乱は、生命を脅かす先天性出生時欠損につながる可能性がある。例えば、遺伝学、薬物スクリーニング、個別改良、および移植への応用で、胚形成中の中胚葉分化のより深い理解および患者由来のＰＳＣなどの多能性幹細胞（ＰＳＣ）を使用してインビトロで中胚葉を分化させる改善された方法が現在必要とされている。
臓側中胚葉細胞を産生する方法が、本明細書で開示される。この方法は、側板中胚葉細胞をＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、およびレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子と接触させ、それによって側板中胚葉細胞を臓側中胚葉細胞に分化させることを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ヒト臓側中胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、中間原始ストリーム細胞（ｍｉｄｄｌｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｍ ｃｅｌｌ）から分化している。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、中間原始ストリーク細胞をＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させることによって、中間原始ストリーク細胞から分化している。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、多能性幹細胞から分化している。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、多能性幹細胞をＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質と接触させることによって、多能性幹細胞から分化している。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、Ａ８３０１、ＢＭＰ４、Ｃ５９、ＦＧＦ２、ＲＡ、またはそれらの任意の組み合わせと接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、側板中胚葉細胞を臓側中胚葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、４８時間であるか、または約４８時間である時間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、心臓中胚葉細胞と比較して、ＦＯＸＦ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加、およびＮＫＸ２－５、ＩＳＬ１、もしくはＴＢＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、中間原始ストリーク細胞と比較して、ＰＡＸ３もしくはＰＲＲＸ１、またはそれらの両方の発現の減少、および／あるいは心臓中胚葉細胞と比較して、ＣＤ３１の発現の減少を示す。
横中隔細胞を産生する方法も本明細書に開示される。この方法は、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に開示される臓側中胚葉細胞のいずれかである。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＢＭＰ４、またはそれらの両方と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである期間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、心臓中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、ＵＰＫ３Ｂ、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、心臓中胚葉細胞もしくは線維芽細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、臓側中胚葉細胞と比較して、ＨＯＸＡ１もしくはＴＢＸ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、臓側中胚葉細胞から分化した全細胞の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を占める。
線維芽細胞を産生する方法も本明細書に開示されている。この方法は、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に開示される臓側中胚葉細胞のいずれかである。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１、またはそれらの任意の組み合わせと接触される。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、肝臓線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである期間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、臓側中胚葉細胞もしくは横中隔細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、横中隔細胞と比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１、ＨＯＸＡ５、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。
呼吸間葉細胞を産生する方法も本明細書に開示される。この方法は、ａ）臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである期間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、工程ａ）は第２の工程であり、第２の工程の前に臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである期間、あるいは第１の工程の前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、第１の工程の４８時間であるか、または約４８時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、または約それらである期間、あるいは第２の工程の前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、第２の工程の２４時間であるか、または約２４時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に開示される臓側中胚葉細胞のいずれかである。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＰＭＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、またはそれらの任意の組み合わせと接触される。いくつかの実施形態では、呼吸間葉細胞は、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは食道／胃間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＮＫＸ６－１、ＴＢＸ５、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、ＦＯＸＦ１、ＬＨＸ２、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、呼吸間葉細胞は、横中隔細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、呼吸間葉細胞は、線維芽細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＭＳＸ１、もしくはＭＳＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。
食道／胃間葉細胞を産生する方法も本明細書に開示される。この方法は、ａ）臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである期間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、工程ａ）は第２の工程であり、第２の工程の前に臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである期間、あるいは第１の工程の前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、第１の工程の４８時間であるか、または約４８時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、または約それらである期間、あるいは第２の工程の前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、第２の工程の２４時間であるか、または約２４時間である期間接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に開示される臓側中胚葉細胞のいずれかである。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ＰＭＡ、またはそれらの任意の組み合わせと接触される。いくつかの実施形態では、食道／胃間葉細胞は、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、ＨＯＸＡ１、ＦＯＸＦ１、もしくはＮＫＸ３－２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、食道／胃間葉細胞は、横中隔細胞、線維芽細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＮＴ２、ＴＢＸ５、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。
実施形態のいずれにおいても、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１である。実施形態のいずれにおいても、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、１μＭまたは約１μＭの濃度で接触される。
実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９、ＰＮＵ７４６５４、ＫＹ－０２１１１、ＰＲＩ－７２４、ＦＨ－５３５、ＤＩＦ－１、およびＸＡＶ９３９からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９である。実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、１μＭまたは約１μＭの濃度で接触される。
実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。実施形態のいずれかにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬ、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、３０ｎｇ／ｍＬまたは約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される。
実施形態のいずれにおいても、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ２である。実施形態のいずれかにおいて、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬ、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、２０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される
実施形態のいずれにおいても、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡである。実施形態のいずれにおいても、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．９、もしくは３μＭ、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．９、もしくは３μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、２μＭまたは約２μＭの濃度で接触される。
実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭ、または約０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。
実施形態のいずれにおいても、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、ＰＭＡ、ＧＳＡ１０、およびＳＡＧからなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＰＭＡである。実施形態のいずれにおいても、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭ、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、２μＭまたは約２μＭの濃度で接触される。
実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される。実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギンである。実施形態のいずれかにおいて、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎｇ／ｍＬ、または約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎｇ／ｍＬ、あるいは前述の濃度のいずれか２つで定義された範囲内の任意の濃度で接触される。実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、１００ｎｇ／ｍＬまたは約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される。
また、本明細書に開示される方法のいずれかによって産生される臓側中胚葉細胞、横中隔細胞、線維芽細胞、呼吸間葉細胞、および食道／胃間葉細胞も本明細書に開示される。
本明細書で提供される本開示の実施形態は、以下の番号が付けられた代替案によって説明される。
１．臓側中胚葉細胞を産生する方法であって、
側板中胚葉細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、およびレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
２．臓側中胚葉細胞が、ヒト臓側中胚葉細胞である、代替案１に記載の方法。
３．側板中胚葉細胞が、中間原始ストリーム細胞（ｍｉｄｄｌｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｍ ｃｅｌｌ）から分化している、代替案１～２に記載の方法。
４．側板中胚葉細胞が、中間原始ストリーク細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させることによって、中間原始ストリーク細胞から分化している、代替案３に記載の方法。
５．中間原始ストリーク細胞が、多能性幹細胞から分化している、代替案３または４に記載の方法。
６．中間原始ストリーク細胞が、多能性幹細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質と接触させることによって、多能性幹細胞から分化している、代替案５に記載の方法。
７．側板中胚葉細胞が、Ａ８３０１、ＢＭＰ４、Ｃ５９、ＦＧＦ２、ＲＡ、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、代替案１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．側板中胚葉細胞が、側板中胚葉細胞を臓側中胚葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間接触される、代替案１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．側板中胚葉細胞が、４８時間であるか、または約４８時間である時間接触される、代替案１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．臓側中胚葉細胞が、心臓中胚葉細胞と比較して、ＦＯＸＦ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加、およびＮＫＸ２－５、ＩＳＬ１、もしくはＴＢＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．臓側中胚葉細胞が、中間原始ストリーク細胞と比較して、ＰＡＸ３もしくはＰＲＲＸ１、またはそれらの両方の発現の減少、および／あるいは心臓中胚葉細胞と比較して、ＣＤ３１の発現の減少を示す、代替案１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．横中隔細胞を産生する方法であって、臓側中胚葉細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
１３．臓側中胚葉細胞が、代替案１～１１のいずれか１つに記載の臓側中胚葉細胞である、代替案１２に記載の方法。
１４．臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ＢＭＰ４、またはそれらの両方と接触される、代替案１２または１３に記載の方法。
１５．臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を横中隔細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案１２～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、代替案１２～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．横中隔細胞が、心臓中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、ＵＰＫ３Ｂ、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、代替案１２～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．横中隔細胞が、心臓中胚葉細胞もしくは線維芽細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案１２～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．横中隔細胞が、臓側中胚葉細胞と比較して、ＨＯＸＡ１もしくはＴＢＸ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す、代替案１２～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．横中隔細胞が、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す、代替案１２～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．横中隔細胞が、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案１２～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．横中隔細胞が、臓側中胚葉細胞から分化した全細胞の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を占める、代替案１２～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．線維芽細胞を産生する方法であって、臓側中胚葉細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
２４．臓側中胚葉細胞が、代替案１～１１のいずれか１つに記載の臓側中胚葉細胞である、代替案２３に記載の方法。
２５．臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、代替案２３または２４に記載の方法。
２６．線維芽細胞が、肝臓線維芽細胞である、代替案２３～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を線維芽細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案２３～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、代替案２３～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．線維芽細胞が、臓側中胚葉細胞もしくは横中隔細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、代替案２３～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．線維芽細胞が、横中隔細胞と比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案２３～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．線維芽細胞が、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１、ＨＯＸＡ５、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案２３～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．線維芽細胞が、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案２３～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．呼吸間葉細胞を産生する方法であって、ａ）臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
３４．臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案３３に記載の方法。
３５．臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、代替案３３または３４に記載の方法。
３６．工程ａ）が第２の工程であり、第２の工程の前に臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程をさらに含む、代替案３３に記載の方法。
３７．臓側中胚葉細胞が、第１の工程について、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案３６に記載の方法。
３８．臓側中胚葉細胞が、第１の工程について４８時間であるか、または約４８時間である期間接触される、代替案３６または３７に記載の方法。
３９．臓側中胚葉細胞が、第２の工程について、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．臓側中胚葉細胞が、第２の工程について２４時間であるか、または約２４時間である期間接触される、代替案３６～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．臓側中胚葉細胞が、代替案１～１１のいずれか１つに記載の臓側中胚葉細胞である、代替案３３～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＰＭＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、代替案３３～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．呼吸間葉細胞が、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは食道／胃間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＮＫＸ６－１、ＴＢＸ５、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、ＦＯＸＦ１、ＬＨＸ２、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、代替案３３～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．呼吸間葉細胞が、横中隔細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案３３～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．呼吸間葉細胞が、線維芽細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＭＳＸ１、もしくはＭＳＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案３３～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．食道／胃間葉細胞を産生する方法であって、ａ）臓側中胚葉細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
４７．臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案４６に記載の方法。
４８．臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、代替案４６または４７に記載の方法。
４９．工程ａ）が第２の工程であり、第２の工程の前に臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程をさらに含む、代替案４６に記載の方法。
５０．臓側中胚葉細胞が、第１の工程について、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案４９に記載の方法。
５１．臓側中胚葉細胞が、第１の工程について４８時間であるか、または約４８時間である期間接触される、代替案４９または５０に記載の方法。
５２．臓側中胚葉細胞が、第２の工程について、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、代替案４９～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．臓側中胚葉細胞が、第２の工程について２４時間であるか、または約２４時間である期間接触される、代替案４９～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．臓側中胚葉細胞が、代替案１～１１のいずれか１つに記載の臓側中胚葉細胞である、代替案４６～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ノギン、ＰＭＡ、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、代替案４６～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．食道／胃間葉細胞が、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、ＨＯＸＡ１、ＦＯＸＦ１、もしくはＮＫＸ３－２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、代替案４６～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．食道／胃間葉細胞が、横中隔細胞、線維芽細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＮＴ２、ＴＢＸ５、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、代替案４６～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、Ａ８３０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される、代替案１～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、Ａ８３０１である、代替案１～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、１μＭまたは約１μＭの濃度で接触される、代替案１～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、Ｃ５９、ＰＮＵ７４６５４、ＫＹ－０２１１１、ＰＲＩ－７２４、ＦＨ－５３５、ＤＩＦ－１、およびＸＡＶ９３９からなる群から選択される、代替案１～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、Ｃ５９である、代替案１～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、１μＭまたは約１μＭの濃度で接触される、代替案１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される、代替案１～６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、ＢＭＰ４である、代替案１～６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬ、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、３０ｎｇ／ｍＬまたは約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される、代替案１～６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される、代替案１～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、ＦＧＦ２である、代替案１～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬ、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、２０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される、代替案１～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される、代替案１～７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、ＲＡである、代替案１～７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３，２．４，２．５，２．６，２．７，２．９、もしくは３μＭ、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３，２．４，２．５，２．６，２．７，２．９、もしくは３μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、２μＭまたは約２μＭの濃度で接触される、代替案１～７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される、代替案１～７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１である、代替案１～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭ、または約０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、ＰＭＡ、ＧＳＡ１０、およびＳＡＧからなる群から選択される、代替案１～８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、ＰＭＡである、代替案１～８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭ、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～８３のいずれか１つに記載の方法。
８５．ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、２μＭまたは約２μＭの濃度で接触される、代替案１～８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される、代替案１～８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、ノギンである、代替案１～８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎｇ／ｍＬ、または約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎｇ／ｍＬ、あるいは前述の濃度のいずれか２つで定義された範囲内の任意の濃度で接触される、代替案１～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、１００ｎｇ／ｍＬまたは約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される、代替案１～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．代替案１～１１のいずれか１つに記載の方法によって産生された、臓側中胚葉細胞。
９１．代替案１２～２２のいずれか１つに記載の方法によって産生された、横中隔細胞。
９２．代替案２３～３２のいずれか１つに記載の方法によって産生された、線維芽細胞。
９３．代替案３３～４５のいずれか１つに記載の方法によって産生された呼吸間葉細胞。
９４．代替案４６～５７のいずれか１つに記載の方法によって産生された、食道／胃間葉細胞。
本明細書に記載の特徴に加えて、追加の特徴および変形例は、以下の図面および例示的な実施形態の説明から容易に明らかになるであろう。これらの図面は実施形態を描写しており、範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
マウス前腸内胚葉および中胚葉系統の単一細胞解析の実施形態を示している。図１Ａは、単一細胞を生成するために顕微鏡で切開された（挿入図）前腸領域（破線）を示す３つの発生段階での代表的なマウス胚画像を示している。Ｅ９．５では、前方前腸（ａ．ｆｇ）と後方前腸（ｐ．ｆｇ）とが別々に分離されていた。Ｅ、胚生期；ｓ、体節数；ｎ、細胞数。スケールバーは１ｍｍである。図１Ｂは、ＲＮＡ－ｓｅｑワークフローの概略図を示している。図１Ｃは、すべての３つの段階のプールされた試料から分離された３１，２６８個の細胞のＵＭＡＰ可視化を示している。細胞は、主要な細胞系統に基づいて影が付けられている。図１Ｄは、Ｅ９．５マウス前腸のホールマウント（ｗｈｏｌｅ－ｍｏｕｎｔ）免疫染色を示しており、Ｃｄｈ１＋内胚葉および周囲のＦｏｘｆ１＋臓側中胚葉を示している。図１Ｅおよび１Ｆは、インシリコで単離されたＥ９．５内胚葉細胞（１Ｅ）および臓側中胚葉（１Ｆ）細胞のｔ－ＳＮＥプロットを示している。図１Ｇおよび１Ｈは、前後（ＡＰ）軸に沿ったＥ９．５内胚葉（１Ｇ）および中胚葉（１Ｈ）細胞の疑似空間順序付けを示している。図１Ｉおよび１Ｊは、胚性マウス前腸内胚葉（１Ｉ）および中胚葉（１Ｊ）にマッピングされたＥ９．５細胞型の予測位置の概略図を示している。ｄｅｆ、胚体；ｍｅｓｏ、中胚葉；ｌｇ、肺；ｅｓｏ、食道；ｌｖ、肝臓；ｓｐｌａｎｃｈ、内臓；ｓｔｍ、横中隔間葉；ｓｔｏ、胃；ｐｈａ、咽頭。 主要な細胞系統の定義の一実施形態を示している。既知のマーカー遺伝子によってアノテートされた主要な系統を有するすべての段階からの単一細胞のＵＭＡＰ（パネルＡ）。トランスクリプトームの類似性に基づいて計算により割り当てられたクラスターを有するすべての段階からのすべての細胞のＵＭＡＰ（パネルＢ）。段階および領域によって影が付けられたすべての段階からのすべての細胞のＵＭＡＰ（パネルＣ）。Ｅ８．５（パネルＤ）、Ｅ９．０（パネルＥ）、およびＥ９．５（パネルＦ）の主要な系統によってアノテートされた各段階からの単一細胞のｔ－ＳＮＥマップ。異なる系統および段階に対する個々の細胞における選択されたマーカーの遺伝子発現ヒートマップ（パネルＧ）。 Ｅ８．５およびＥ９．０のＤＥおよびＳＭ系統のアノテーションの実施形態を示している。Ｅ８．５のＤＥ（パネルＡ）、Ｅ８．５のＳＭ（パネルＢ）、Ｅ９．０のＤＥ（パネルＣ）、およびＥ９．０のＳＭ細胞（パネルＤ）のアノテーションのｔ－ＳＮＥプロット。Ｅ８．５クラスターは「ａ」、Ｅ９．０は「ｂ」、Ｅ９．５は「ｃ」と表示される。腸管の前後（Ａ－Ｐ）軸に沿ったＥ８．５のＤＥ（パネルＥ）、Ｅ８．５のＳＭ（パネルＦ）、Ｅ９．０のＤＥ（パネルＧ）、およびＥ９．０のＳＭ細胞（パネルＨ）の疑似空間順序付け。内肺葉および中胚葉上へマッピングされたＥ８．５のＤＥ（パネルＩ）、Ｅ８．５のＳＭ（パネルＪ）、Ｅ９．０のＤＥ（パネルＫ）、およびＥ９．０のＳＭ（パネルＬ）細胞型の予測位置を示すマウス胚性前腸の概略図。Ｅ８．５のＤＥ（パネルＭ）、Ｅ８．５のＳＭ（パネルＮ）、Ｅ９．０のＤＥ（パネルＯ）、およびＥ９．０のＳＭ（パネルＰ）の異なるクラスターに対する個々の細胞における選択されたマーカー遺伝子発現のヒートマップ。 ＤＥおよびＳＭ細胞の統合解析の実施形態を示している。主要な系統（パネルＡ、Ｂ）およびステージ（パネルＣ、Ｄ）によって注釈が付けられたすべてのステージからのすべてのＳＭ細胞のｔ－ＳＮＥおよびＵＭＡＰ視覚化。主要な系統（パネルＥ、Ｆ）およびステージ（パネルＧ、Ｈ）によってアノテートされたすべての段階からのすべてのＤＥ細胞のｔ－ＳＮＥおよびＵＭＡＰ可視化。各統合クラスターに大きく貢献する段階に特異的なアノテーションは、括弧内に示されている。Ｅ８．５の細胞＝ａ＿クラスター、Ｅ９．０の細胞＝ｂ＿クラスター、およびＥ９．５の細胞＝ｃ＿クラスター。 異なるＳＭ細胞型における系統限定遺伝子発現の実施形態を示す。図２Ａは、切片のレベルを示すＥ９．５の前腸の概略図を示している。図２Ｂは、様々なＥ９．５ ＳＭ細胞クラスターにおけるマーカー遺伝子のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ発現を示すドットプロットを示している。図２Ｃは、切開されたＥ９．５の前腸組織のホールマウント免疫染色を示している。図２Ｄ～Ｇは、切開されたＥ９．５の前腸組織のインサイチューハイブリダイゼーションを示している。スケールバーは１００μｍである。図２Ｈ～２Ｑは、横断Ｅ９．５のマウス胚切片でのＲＮＡスコープインサイチュー検出を示している（ｉ－ｉｖは図２Ａの切片のＡ－Ｐレベルを表示している）。スケールバーは５０μｍである。ｄｕｏ、十二指腸；ｄｐ、背側膵；ｅｓｏ、食道；ｈｔ、心臓；ｌｇ、胚；ｌｉｖ、肝臓、ｏｆｔ、流出路；ｐｈａ、咽頭；ｒｅｓ、呼吸器；ｓｔｍ、横中隔間葉；ｓｔｏ、胃；ｓｖ、静脈洞、ｖｐ、腹側膵。 肝臓間葉サブタイプの検証の実施形態を示している。Ｅ９．５でのマウス胚性前腸の概略図（パネルＡ）。Ｅ９．５のマウス胚からの固定凍結矢状切片における中胚葉マーカーのＲＮＡスコープインサイチュー検出（パネルＢ～Ｆ）。スケールバーは５０μｍである。挿入図は、マージチャネルおよび個別チャネルを示している。 同軸Ｈｏｘ遺伝子発現および転写因子コードの実施形態を示している。ＡＰ軸に沿って配置された様々なＤＥおよびＳＭクラスターに対する平均Ｈｏｘ遺伝子発現のヒートマップ。アノテーションは次のとおりである：Ｅ８．５＝ａ＿クラスター、Ｅ９．０＝ｂ＿クラスター、およびＥ９．５＝ｃ＿クラスター（パネルＡ）。前腸内胚葉および中胚葉における細胞クラスターの推定位置（パネルＢ）。Ｅ９．５のＤＥおよびＳＭ集団に対する上位５つの異なる転写因子の差次的発現の平均発現を示す転写因子コードヒートマップ（パネルＣ）。ａ、前方；ｆｇ、前腸、ｐｏｓｔ、後方；ｖ、腹側；ｓｔｍ、横中隔間葉。 内胚葉と中胚葉の協調した細胞分化経路（ｃｅｌｌ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ）の実施形態を示している。図３Ａおよび３Ｂは、臓側中胚葉（３Ａ；ｎ＝１０，０９７）および胚体内胚葉（３Ｂ；ｎ＝４，４４８）の細胞分化経路の力指向ＳＰＲＩＮＧの可視化を示している。細胞は発生段階によって影が付けられている。白い矢印は細胞系統の進行を表示している。図３Ｃおよび３Ｄは、細胞状態ツリーの構築に使用されるＳＭ（３Ｃ）およびＤＥ（３Ｄ）細胞に対する「親子」単一細胞投票を要約した混同行列を示している。トランスクリプトーム類似性（ＫＮＮ）に基づいて、後の時点（ｙ軸）の各細胞が前の時点（ｘ軸）の最も類似した細胞に投票した。所定のクラスターのすべての投票を表にして、クラスターサイズに対して正規化し、ヒートマップ内の決定の割合として表される。Ｅ８．５、Ｅ９．０、およびＲ９．５クラスターは、それぞれ「ａ」、「ｂ」、および「ｃ」と表示される。図３Ｅおよび３Ｆは、単一細胞投票によって予測されたＳＭ（３Ｅ）およびＤＥ（３Ｆ）系統の細胞状態ツリーを示している。連続する時点の細胞状態をリンクする一番上の選択肢は実線で、目立つ２番目の選択肢は破線である。ノードは段階ごとに影が付けられ、クラスター番号でアノテートされる。 ＤＥおよびＳＭ細胞分化経路のＳＰＲＩＮＧプロットの実施形態を示している。段階特異的系統アノテーション（パネルＡ）および重要なマーカー遺伝子の発現（パネルＢ）によって影が付けられたすべてのＳＭ細胞（ｎ＝１０，０９７）のＳＰＲＩＮＧプロット。段階特異的系統アノテーション（パネルＣ）および重要なマーカー遺伝子の発現（パネルＤ）によって影が付けられたすべてのＤＥ細胞（ｎ＝４，４４８）のＳＰＲＩＮＧプロット。 肝内胚葉発生の実施形態を示している。各細胞状態で示される重要なマーカー遺伝子を含む肝内胚葉系統の細胞状態ツリー（パネルＡ）。Ｍｏｎｏｃｌｅ＿ｖ３を使用した肝ＤＥ系統の擬時系列解析（ｐｓｅｕｄｏｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Ｅ９．０では、ｅ＿ｂ２クラスター（初期肝芽細胞）がｅ＿ｂ５（後期肝芽細胞）およびｅ＿ｂ７（肝膵管前駆細胞（パネルＢ）の共通の前駆細胞であることを示唆している。段階特異的系統アノテーション（パネルＣ）および重要なマーカー遺伝子の発現（パネルＤ～Ｉ）によって影が付けられた肝内胚葉性クラスターによるＳＰＲＩＮＧプロット。 図４Ａ－Ｉ、４Ｋ－Ｌ。多能性前駆細胞の協調的発生の実施形態を示している。図４Ａ、４Ｂは、重要なマーカー遺伝子を用いたＳＭ（４Ａ）およびＤＥ（４Ｂ）の食道－呼吸－胃の細胞状態の分化経路を図解したものである。これは、Ｏｓｒ１＋多系統前駆細胞の協調的発生を示唆している。図４Ｃおよび４Ｄは、重要な遺伝子の発現を投影するＳＭ（４Ｃ）およびＤＥ（４Ｅ）のＳＰＲＩＮＧプロットを示している。図４Ｅは、切開された前腸におけるＯｓｒ１のインサイチューハイブリダイゼーションを示しており、Ｏｓｒ１が呼吸器、食道、および胃の領域で発現していることを示している。図４Ｆおよび４Ｇは、前腸内の呼吸器および胃領域にわたる切片におけるＯｓｒ１のインサイチューハイブリダイゼーションを示しており、Ｏｓｒ１が内胚葉細胞と間葉細胞の両方で発現していることを示している。図４Ｈは、ＤＥの食道－呼吸器系統のＳＰＲＩＮＧプロットを示している。図４Ｉは、ＳＰＲＩＮＧプロットに投影されたＮｋｘ２－１とＳｏｘ２の発現を示しており、食道と気管の境界での共発現を示している。図４Ｋは、Ｅ９．５のマウス前腸のＳｏｘ２およびＮｋｘ２－１ホールマウント免疫染色を示している。図４Ｌは、横方向のＥ９．５前腸切片のＳｏｘ２、Ｎｋｘ２－１、およびＦｏｘｆ１免疫染色を示しており、Ｓｏｘ２／Ｎｋｘ２－１を共発現する細胞のまれな集団を確認している。Ｌ’は、図４Ｌのボックスの高倍率を示している。 前腸器官形成のシグナル伝達ロードマップを予測する、計算により推測される受容体－リガンド相互作用の実施形態を示す。図５Ａ、５Ｂは、ホールマウント（５Ａ；１Ｄと同じ画像）および切片（５Ｂ）でのＣｄｈ１（上皮）およびＦｏｘｆ１（間葉）のＥ９．５の前腸免疫染色を示し、上皮間葉組織の微小環境（破線の円）を示している。図５Ｃは、隣接する前腸細胞集団間の予測される受容体－リガンド相互作用を示している。概略図は、６つの主要な経路についてのＤＥとＳＭ間のパラクリンシグナル伝達を示している。Ｅ９．５のＤＥおよびＳＭ細胞クラスターは、インビボでの位置に基づいて前軸から後軸に沿って順序付けられ、空間的に隣接するＤＥおよびＳＭ細胞型が互いに向かい合っている。影付きの円は、相対的な経路応答－メタ遺伝子発現レベルを示し、所与の細胞集団が成長因子シグナルに応答している可能性を予測している。クラスターの横にある細い垂直線は、特定のシグナル経路にすべて応答している、空間的に近接した様々な細胞集団を示している。矢印は、予測されるパラクリンおよびオートクリン受容体－リガンド相互作用を表している。図５Ｄは、ＤＥおよびＳＭのＳＰＲＩＮＧプロットに投影されたＢＭＰ応答－メタ遺伝子発現レベルを示している。図５Ｅは、前腸横断面におけるＢｍｐ４のインサイチューハイブリダイゼーションを示しており、呼吸間葉およびｓｔｍでの発現を示している。図５Ｆおよび５Ｇは、前腸横断面におけるｐＳｍａｄ１免疫染色を示しており、呼吸器および肝臓のＤＥおよびＳＭにおけるＢＭＰシグナル応答を示している。図５Ｈおよび５Ｉは、ＤＥ（５Ｈ）およびＳＭ（５Ｉ）細胞状態ツリーに投影された６つの経路すべての推定シグナル伝達状態を要約したシグナル伝達ロードマップを示し、系統の多様化を制御すると予測される組み合わせシグナルを示唆している。文字は各工程での推定信号を示し、フォントが大きいほど信号応答が強いことを示す。ａ、前方；ｐ、後方；ｈｐ、肝膵臓；ｓｔｍ、横中隔間葉。 すべてのリガンド、受容体、および状況に依存しない応答遺伝子のメタ遺伝子発現の実施形態を示している。各ＤＥおよびＳＭクラスター（Ｙ軸）におけるメタ遺伝子（Ｘ軸）の平均スケーリングされた発言（２～－２）を示すドットプロット。各細胞シグナル伝達経路（ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＨＨ、Ｎｏｔｃｈ、ＲＡ、および古典的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ）について、「リガンドメタ遺伝子」、「受容体メタ遺伝子」、および「応答メタ遺伝子」を、欠く細胞およびクラスターにおいて、各個々の遺伝子の正規化した発現を各経路について平均することによって計算した（（例えば、Ｗｎｔ－リガンドメタ遺伝子＝ΣＷｎｔ１＋Ｗｎｔ２＋Ｗｎｔ２ｂ＋Ｗｎｔ３・・・Ｗｎｔ１０ｂの発現／ｎ）。各ドットの影付きおよびサイズは、各クラスターのメタ遺伝子発現レベルを表す。 異なる前腸細胞集団間の計算により予測された受容体－リガンド相互作用の実施形態を示している。概略図は、６つの主要な経路についてのＤＥとＳＭ間のパラクリンシグナル伝達を示している。概略図の下に、各段階のＤＥおよびＳＭ細胞クラスターが、インビボでのそれらの一と一致して、ＡＰ軸に沿って並べられている。空間的に隣接するＤＥおよびＳＭ細胞型は、互いに向かい合っている。各クラスターの影付きの円は、経路応答メタ遺伝子発現レベルに基づいて、細胞集団がシグナルに応答している可能性を示している。矢印は、メタ遺伝子発現プロファイルから推測されるパラクリンおよびオートクリン受容体－リガンドペアを示すリガンドの予測される発生源を表している。受容体とリガンドとのペアリング（矢印）は、空間的に近接した細胞集団に限定されていた。クラスターのグループの横にある細い垂直線は、すべて同じように応答している、空間的に近接した様々な細胞集団を示している。 シグナル伝達応答の予測された時間的および空間的ダイナミクスの実施形態を示している。ＤＥおよびＳＭのＳＰＲＩＮＧプロット状に投影された経路応答－メタ遺伝子の発現レベルおよびＢＭＰ（パネルＡ～Ｂ）、ＦＧＦ（パネルＣ～Ｄ）、ＨＨ（パネルＥ～Ｆ）、Ｎｏｔｃｈ（パネルＧ～Ｈ）、ＲＡ（パネルＩ～Ｊ）、ならびに古典的なＷｎｔ（パネルＫ～Ｌ）経路についての細胞状態ツリー。これは、細胞系統に対応するシグナル伝達活動の調整された空間ドメインが、Ｅ８．５からＥ９．５まで２４時間にわたってどのように変化すると予測されるかを示している。 ＨＨが肝臓間葉と対比して腸管を促進することを明らかにするシグナル伝達ロードマップの遺伝子試験の実施形態を示している。図６Ａ、６Ｂは、ＤＥ細胞でのＨＨリガンド－メタ遺伝子発現（６Ａ）およびＳＭ細胞でのＨＨ応答－メタ遺伝子発現（６Ｂ）のＳＰＲＩＮＧ可視化を示している。図６Ｃは、ＳＭ細胞状態ツリーに投影されたＨＨ応答－メタ遺伝子の発現を示しており、これは、肝臓および咽頭のＳＭではＨＨ活性が低いが、腸管間葉では活性が高いことを示している。図６Ｄは、Ｓｈｈが腸管上皮で発現しているが、肝上皮（輪郭が描かれた）では発現していないことを示している。ＨＨ応答導入遺伝子であるＧｌｉ１－ｌａｃＺは、腸管間葉では活性であるが、肝臓のｓｔｍでは活性ではない。図６Ｅは、バルクＲＮＡシーケンシング（ｌｏｇ２ ＦＣ>１、ＦＤＲ<５％）によるＧｌｉ２－／－Ｇｌｉ３－／－とＧｌｉ２＋／－Ｇｌｉ３＋／－マウスのＥ９．５の前腸の間で差次的に発現する遺伝子を示している。図６Ｆは、Ｅ９．５のＤＥおよびＳＭの単一細胞クラスターにおけるＨＨ／Ｇｌｉ調節遺伝子（図６Ｅから）の平均発現を示すヒートマップを示している。図６Ｇは、ＨＨ／Ｇｌｉ調節遺伝子の特定の細胞型濃縮を明らかにする遺伝子セットエンリッチメント解析分析（ＧＳＥＡ）を示している。図６Ｈは、前腸におけるＨＨ活性の概略図を示している。 ヒトＰＳＣから臓側中胚葉様前駆細胞を生成する一実施形態を示す。図７Ａは、ｈＰＳＣをＳＭサブタイプに分化させるためのプロトコルの概略図を示している。計数は、マウスの単一細胞シグナル伝達ロードマップから予測された。図７Ｂは、マウスの単一細胞データ：心臓（ＮＫＸ２－５）、初期ＳＭ（ＦＯＸＦ１、ＨＯＸＡ１）、肝臓－ｓｔｍ／中皮（ＷＴ１、ＵＫＰ１Ｂ）、肝臓線維芽細胞（ＭＳＸ１）、呼吸器ＳＭ（ＮＫＸ６－１＋、ＭＳＣ－）、食道／胃（ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１）に基づいて、特定のＳＭサブタイプで発現が濃縮されたマーカーのＲＴ－ＰＣＲを示している。縦列は、平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。テューキーの検定＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．００５、＊＊＊ｐ<０．０００５。図７Ｃは、７日目の細胞培養物の免疫染色を示している。スケールバーは、５０μｍ（上部パネル）、１０μｍである。（下部パネル）である。図７Ｄは、表示された免疫染色またはＲＮＡスコープインサイチューハイブリダイゼーションに陽性の細胞の割合の定量化を示している。縦列は、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を示す。テューキーの検定、＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．００５、＊＊＊ｐ<０．０００５。 ＲＡが心臓中胚葉を抑制し、臓側中胚葉前駆細胞を促進することを示すデータの実施形態を示す。ＲＡＲＥ－ｌａｃＺトランスジェニックマウス胚の染色は、ＲＡ活性がＥ８．５での心臓間葉よりも臓側間葉で高いという単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ予測を確認している（パネルＡ）。ＲＡＲＥ－ｌａｃＺトランスジェニックマウス胚の横断切片の免疫染色（パネルＢ）。沿軸中胚葉（ＰＡＸ３）、肢芽（ＰＲＲＸ１）、心臓中胚葉（ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１）、内皮（ＣＤ３１）、およびＳＭ（ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、ＷＮＴ２）マーカーについてＲＴ－ＰＣＲによってアッセイされた４日目のＰＳＣ由来ＳＭ培養物；スケールバーは５０μｍである（パネルＣ）。ＮＫＸ２－５＋細胞の定量化（パネルＤ）。ｆｇ、前腸；ｈｇ、後腸；ｈｔ、心臓；ＳＣ、幹細胞；ＭＰＳ、中間原始ストリーク；ＣＭ、心臓中胚葉；ＳＭ臓側中胚葉。縦列は、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を示す。テューキーの検定、＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．００５、＊＊＊ｐ<０．０００５。 ７日目のＳＭ様ＰＳＣ培養物の追加の分析の実施形態を示す。様々なｄ７ＳＭ様培養物のＲＮＡスコープインサイチュー分析。スケールバーは、上部パネルでは５０μｍであり、下部パネルでは１０μｍである。定量化は図７Ｄ（パネルＡ～Ｃ）にある。マウスｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータ；心臓（ＡＣＴＣ１、ＴＢＸ２０、ＴＮＮＴ２）、初期ＳＭ（ＰＤＥ５Ａ、ＨＯＸＡ５）；肝臓－ｓｔｍ／中皮（ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、ＵＰＫ３Ｂ）、肝臓－線維芽細胞（ＭＳＸ２、ＨＡＮＤ１）、食道／胃（ＷＮＴ４、ＮＫＸ３－２）（パネルＤ）に基づく中胚葉サブタイプマーカーのＲＴ－ＰＣＲ分析。ＳＣ、幹細胞；ＭＰＳ、中間原始ストリーク；ＣＭ、心臓中胚葉；ＳＭ、臓側中胚葉；ＳＴＭ、横中隔間葉；ＬＦ、肝臓線維芽細胞；ＲＭ、呼吸間葉；ＥＭ／ＧＭ、食道／胃間葉。縦列は、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を意味する。テューキーの検定、＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．００５、＊＊＊ｐ<０．０００５。
肺、胃、肝臓、膵臓などの内臓は、胚体内胚葉（ＤＥ）と周囲の臓側中胚葉（ＳＭ）との間の一連の誘導相互作用を通じて、胎児の前腸に由来する。ＤＥ系統のパターン化はかなりよく研究されているが、ＳＭの領域形成（ｒｅｇｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を制御するパラクリンシグナル伝達、およびこれが器官形成中の上皮の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とどのように協調しているかは不明である。胚性マウス前腸の高解像度細胞状態マップを生成するための単一細胞トランスクリプトミクスが、本明細書に開示される。これにより、臓器特異的上皮と密接に一致して発生したＳＭ細胞の予想外の多様性が明らかになった。これらのデータから、前腸の器官形成を調整するコンビナトリアル内胚葉－中胚葉相互作用の時空間シグナル伝達ロードマップが推測された。重要な予測は、マウスの遺伝学で検証され、中胚葉のパターン化における内胚葉由来のシグナルの重要性を示している。シグナル伝達ロードマップを活用して、以前ははっきりと分からなかったヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から様々なＳＭサブタイプが生成された。
腸管器官形成における間葉の重要な誘導的役割は、１９６０年代に初めて確立され、この時、胚の異なる前後（ＡＰ）領域から移植されたＳＭが隣接する上皮に、元のＳＭ位置と一致する器官同一性を採用するように命令することができることが示された。それ以来、内胚葉器官形成における中胚葉由来のパラクリンシグナルが調べられてきたが、これらの研究のほとんどは、個々の器官系統または個々のシグナル伝達経路に焦点を合わせており、したがって、器官形成を調整する前腸微小環境における時間的に動的な組み合わせシグナル伝達の包括的な理解を欠いている。さらに、中胚葉に関するいくつかの基本的な疑問は、何十年にもわたって依然として回答されていない。ＳＭには何種類あるのか、また、各胎児器官の原基には固有の間葉あるのか？ＳＭ系統およびＤＥ系統は、器官形成中にどのように調整されるか？中胚葉の領域形成において内胚葉はどのような役割を果たすのか、である。
胚性中胚葉および内胚葉の初期の特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ならびにパターン化は、マウスではＥ６．２５からＥ８．０まで、原腸形成中に発生し、これらの胚葉は原始ストリークから徐々に出現する。側板中胚葉は、胚体外中胚葉の後にストリークから出現し、その後に中間、沿軸および軸中胚葉が続く。付随して、ＤＥ細胞はまた、ストリークから層間剥離し、中胚葉の外面に沿って移動し、最終的には重なっている臓側内胚葉に挿入される。Ｅ８．０までに、前腸憩室を形成するために前方ＤＥが折りたたまれ、心臓前駆細胞を含有する隣接する側板中胚葉が腹側正中線に向かって移動するにつれて、形態形成プロセスが内胚葉と中胚葉の２層シートを管構造に変換し始める。側板中胚葉はさらに、四肢および体壁を生じさせる外胚葉の隣の外側体細胞中胚葉層と、上皮腸管を取り囲む内側臓側中胚葉層に分割する。ＳＭにおける領域同一性の最初の分子的兆候は、胚のＡＰ軸に沿ったＨｏｘ遺伝子の差次的発現である。しかしながら、細胞の多様化が十分に研究されている心臓の発生とは対照的に、前腸のＳＭの領域形成を支配する分子メカニズムは、特に前腸のＤＥが別個の器官の原基に細分化される重要な２４時間の間は不明である。
最近、単一細胞トランスクリプトミクスは、前例のない解像度で器官形成を調べ始めた。しかし、発生中の腸での研究は、主に上皮成分またはそれらが特定された後の胎児器官のいずれかを調べている。本明細書に記載されるように、マウス胚性前腸の単一細胞トランスクリプトミクスを使用して、ＤＥおよびＳＭ系統の包括的な「細胞状態」個体発生を推測し、器官特異的上皮と密接に一致して発達するＳＭ前駆細胞サブタイプの予想外の多様性を発見した。パラクリンシグナル伝達経路の転写プロファイルをこれらの系統に投影すると、器官形成と協調する相互内胚葉－中胚葉誘導的相互作用のロードマップが推測される。重要な予測が、上皮からの異なるヘッジホッグシグナル伝達がＳＭを肝臓の間葉に対比して腸管間葉にパターン化することを示すマウス遺伝学で検証された。シグナル伝達ロードマップを活用して、以前は分からなかったｈＰＳＣからヒトＳＭの様々なサブタイプが生成された。
本明細書に開示されるように、単一細胞トランスクリプトミクスを使用して、原始腸管が別個の器官ドメインに細分されるとき、器官形成の最初の２４時間にわたる胚性マウス前腸におけるＤＥおよびＳＭの細胞型の複雑さを定義した。本明細書では、新しいマーカー遺伝子と転写因子とのコンビナトリアルコードによって定義される前腸間葉の異なる細胞型の予想外の多様性が明らかにされている。細胞分化経路は、器官特異的なＤＥおよびＳＭに発生が密接に協調されていることを示しており、厳密に制御されたシグナル伝達ネットワークを我々に示唆している。２つの組織区画の系統の特異化に協調する可能性が高い相互上皮－間葉相互作用の推定リガンド－受容体シグナル伝達ロードマップが計算で予測された。本明細書での開示は、前腸の器官形成のさらなる実験的検討のための貴重なリソースを表しており、データは、ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／ＺｏｒｎＬａｂ－ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌで、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにて検索することができる。
初期胚におけるＳＭの領域同一性に関する以前の研究は、限られたものである。Ｈｏｘ遺伝子発現のよく知られている領域形成のほかには、ほとんどの研究は主に胃や肺の間葉などの個々の器官に焦点を当てている。前腸全体にわたる単一細胞トランスクリプトームを比較することにより、初期のＳＭが異なる器官特異的間葉サブタイプに広範囲に領域形成することが明らかになった。初期のＳＭ細胞型の多様な転写シグネチャーは、胎児の器官形成中に位置および分子プログラムを定義するために一時的にのみ利用される可能性がある。器官の運命が決定された後、様々なＳＭ細胞型が、すべての内臓に共通する平滑筋または線維芽細胞などの同様の分化プログラムに収束する可能性がある。しかしながら、ここでの胎児ＳＭ多様化の結果は、肝対膵臓星状細胞や肺特異的線維芽細胞など、成人の器官特異的間質細胞の新たなアイデアに照らして興味深いものである。例えば、Ｔｂｘ４は胚性呼吸器ＳＭで発現し、その後、成人の肺線維芽細胞で特異的に維持されるが、他の器官の線維芽細胞では維持されない。後の胎児および成人の器官からの他の単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）データセットを使用した本明細書のデータの将来的な統合解析は、細胞分化、恒常性および発病機序の間に転写プログラムがどのように進化するかを解決するはずである。
予想外の観察の１つは、肝芽が、横中隔間葉（ｓｔｍ）、静脈洞、２つの中皮、および線維芽細胞集団を伴う他のいかなる器官原基よりも明確なＳＭ細胞状態を含んでいることであった。これは、上皮の膨出によって形成される他のＧＩ器官とは異なり、肝内胚葉が層間剥離して隣接するｓｔｍに侵入するという事実に起因する可能性があり、このプロセスでは、細胞外マトリックスとのより複雑な上皮－間葉相互作用が必要になり得る。本発明者らのトランスクリプトーム解析は、初期のｓｔｍが中皮、肝星細胞、間質線維芽細胞、および血管周囲平滑筋を生じさせることを示す系統追跡実験と一致している。他の器官の芽が分化するのと同様の細胞型の精緻化（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）を有しているかどうかを決定することが重要となるであろう。あるいは、肝臓に由来する中皮および線維芽細胞は、他の器官芽に移動する可能性がある。実際に、間葉系細胞の動きは本発明者らの研究の交絡制限の１つであり、心外膜全区細胞（ｐｒｏｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ）としても知られる肝芽の中皮が心臓と肺を取り囲むように移動するという十分な証拠がある。
前腸ＳＭと心臓中胚葉とは密接に関連しており、どちらも前方側板中胚葉から生じる。本明細書で提供されたデータと初期心臓の最近の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ研究との予備的な相互比較は、この共通の起源がトランスクリプトームに反映されていることを示唆している。発生中の心臓管は腹側前腸ＳＭ（二次心臓領域［ＳＨＦ］としても知られている）と隣接しており、動脈極は咽頭ＳＭに連結し、静脈極は肺／肝臓ＳＭに連結している。細胞運命マッピング研究は、二次心臓領域が、心臓組織、ならびに咽頭ＳＭ、呼吸ＳＭ、および肺血管系を生じさせることを示している。実際、本明細書で提供されるＧｌｉ変異体の単一細胞トランスクリプトミクスおよび遺伝子解析は、上皮由来のＨＨシグナルがこれらの心－肺前駆細胞の発生に重要であることを示している。
本明細書で開発されたシグナル伝達ロードマップは、ｈＰＳＣの発生を様々なＳＭ様細胞型に向けるために使用された。本明細書に記載のシステムは、ヒト胎児間葉の発生をモデル化し、コンビナトリアルシグナル伝達経路が平行した間葉運命の選択をどのように向けるかを問い合わせるためのユニークな機会を提供する。本明細書で産生されたｈＰＳＣ由来のＳＭ様組織は、組織工学、薬物スクリーニング、および個別化医療に使用することができる。現在まで、ほとんどのｈＰＳＣ由来の前腸オルガノイド（例えば、胃、食道、肺）は、後腸由来の腸オルガノイドとは異なり、間葉を欠く傾向がある。これは、前腸上皮を作るために必要な従来の分化プロトコルが間葉の発生と互換性がないためである。したがって、本明細書に開示されるプロトコルは、再生医療のための複雑な前腸組織を操作するための重要な工程である、ＤＥおよびＳＭオルガノイドの組換えを可能にする。
臓側中胚葉細胞をインビトロで産生する方法が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞から分化している。これらの多能性幹細胞は、対象または患者に由来してもよく、その結果、臓側中胚葉細胞および産生される任意の下流の細胞型を、個別化された医療の様々な側面に使用することができる。これらの臓側中胚葉細胞は、胚形成中の初期前駆細胞であり、肝臓、呼吸器、食道、および／または胃の系統などの下流の細胞型にさらに分化することができる。臓側中胚葉細胞および下流の細胞型は、ＰＳＣ由来のオルガノイドの産生にも影響を及ぼし、これは、本明細書に記載されているように、オルガノイドの成長および成熟が妨げられるほど十分な間葉系細胞を欠いている可能性がある。臓側中胚葉細胞およびそれを作製する方法は、本明細書に記載されているか、あるいは別途当技術分野において既知の任意のオルガノイドおよび／またはエンテロイド（上皮組織に由来し、間葉を欠くオルガノイド様構造）に適用することができる。例えば、オルガノイドまたはエンテロイドを産生する方法は、米国特許第９，７１９，０６８号および同第１０，１７４，２８９号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１４０４１１号、第ＷＯ２０１５／１８３９２０号、第ＷＯ２０１６／０６１４６４号、第ＷＯ２０１７／１９２９９７号、第ＷＯ２０１８／１０６６２８号、第ＷＯ２０１８／２００４８１号、第ＷＯ２０１８／０８５６１５号、第ＷＯ２０１８／０８５６２２号、第ＷＯ２０１８／０８５６２３号、第ＷＯ２０１８／２２６２６７号、第ＷＯ２０２０／０２３２４５号で見出すことができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、典型的には、類似の記号は類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般に記載され、図に示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、結合、分離、および設計することができ、それらはすべて、本明細書に明示的に企図されることが容易に理解されよう。
別段の定めがない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者による本開示に照らして読まれたときに一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の目的のために、次の用語を以下に説明する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
「約」は、参照する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対し１０％と同程度に変動する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを意味する。
この明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと」という言葉は、記載された工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループを包含することを意味するが、いかなる他の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループも排除しないことを意味することが離解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、語句「からなる」が続くすべてを含むことを意味する。そのため、語句「からなる」は、列挙された要素が必要であり（ｒｅｑｕｉｒｅｄ）、または必須（ｍａｎｄａｔｏｒｙ）であり、その他の要素が存在し得ないことを示す。「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、この語句の前に列挙されたあらゆる要素の包含を意味しており、他の要素は、この列挙された要素に関して本開示で明示される活性もしくは作用を妨げないまたはこの活性もしくは作用に寄与しないものに限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列挙された要素が必要であり（ｒｅｑｕｉｒｅｄ）、または必須（ｍａｎｄａｔｏｒｙ）であるが、その他の要素は任意選択的であり、列挙された要素の活性もしくは作用に実質的な影響を及ぼすか否かに応じて存在してもよいし存在しなくてもよいことを示す。
本明細書で使用される「個体」、「対象」、または「患者」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類、または鳥、例えば、ニワトリ、ならびに他の脊椎動物または無脊椎動物を意味する。「哺乳動物」という用語は、通常の生物学的意味で使用される。したがって、これには、具体的には、サル（チンパンジー、類人猿、サル）およびヒトを含む霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「有効量」または「有効用量」という用語は、明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、観察可能な効果をもたらす記載された組成物または化合物のその量を指す。現在開示されている主題の活性組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象および／または用途に対して所望の応答を達成するのに有効な量の活性組成物または化合物を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、組成物の活性、配合物、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、および治療される対象の身体的状態ならびに病歴が挙げられるが、これらに限定されない様々な因子に依存するであろう。いくつかの実施形態では、最小用量が投与され、用量制限毒性がない場合、用量は最小有効量に増量される。本明細書では、有効用量の決定および調整、ならびにそのような調整をいつどのように行うかの評価が企図されている。
本明細書で使用される「機能」および「機能的」という用語は、本明細書に照らして理解されるような明白で通常の意味を有し、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
本明細書で使用される「阻害する」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、生物学的活性の減少または防止を指すことができる。減少は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるパーセンテージ、あるいは前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある量によるものであり得る。本明細書で使用される場合、「遅延」という用語は、明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、生物学的事象の、そうでない場合に予想されるよりも遅い時間への遅れ、延期、または延期を指す。遅延は、約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、もしくは約それ以下であるパーセンテージ、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある量の遅延であり得る。阻害および遅延という用語は、必ずしも１００％の阻害または遅延を示すとは限らない。部分的な阻害または遅延が実現され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、（１）最初に産生されたとき（自然界および／または実験環境で）に、それが関連付けられた構成成分の少なくともいくつかから分離された、および／または（２）人間の手によって産生、調製、および／または製造されたときにそれが関連付けられた成分の少なくともいくつかから分離された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連していた他の成分の１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、もしくは１００％と等しい、約前述の値である、少なくとも前述の値である、少なくとも約前述の値である、前述の値以下である、または約前述の値以下であるもの（または前述の値を含むおよび／またはまたがる範囲）から分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％純粋と等しい、約前述の値である、少なくとも前述の値である、少なくとも約前述の値である、前述の値以下である、または約前述の値以下（または前述の値を含むおよび／またはまたがる範囲）である。本明細書で使用される場合、「単離された」物質は、「純粋」であり得る（例えば、他の成分を実質的に含まない）。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物または組織に含まれない細胞を指してもよい。
本明細書で使用される場合、「インビボ」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、組織抽出物または死んだ生物とは対照的に、生きている生物、通常は動物、ヒトを含む哺乳動物、および植物内での方法の実施を指す。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、自然条件のほとんど変化のない生体外での方法の実行を指す。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、生物学的条件の外、例えばペトリ皿または試験管内での方法の実施を指す。
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、自然に細胞内に現れるもの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用によって生成されたフラグメントを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）であるモノマー、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー形態）、または両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有することができる。糖修飾には、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による置換が含まれるか、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的ならびに電子的に類似した構造に置き換えることができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって結合することができる。ホスホジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、またはホスホルアミデートが挙げられる。「核酸分子」という用語はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、これは、ポリアミド骨格に結合した天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含む。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。「オリゴヌクレオチド」は、核酸と互換的に使用することができ、二本鎖もしくは一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを指すことができる。核酸（単数または複数）は、様々な生物学的システムにおける核酸（単数または複数）の増幅および／もしくは発現に使用することができる核酸ベクターまたは核酸構築物（例えば、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、フォスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはヒト人工染色体（ＨＡＣ））中に含まれ得る。典型的には、ベクターまたは構築物はまた、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インデューサー、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、複製起点、クローニング部位、多重クローニング部位、制限酵素部位、エピトープ、レポーター遺伝子、選択マーカー、抗生物質選択マーカー、標的化配列、ペプチド精製タグ、もしくはアクセサリー遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないエレメントも含有するであろう。
核酸または核酸分子は、異なるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする１つ以上の配列を含むことができる。これらの１つ以上の配列は、同じ核酸もしくは核酸分子内で隣接して、あるいは、例えばリンカー、リピートもしくは制限酵素部位間の余分な核酸、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、もしくは３００の塩基長、または前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、あるいは約それ以下である、任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用される核酸に関する「下流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の前の配列の３’末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「上流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の後続の配列の５’末端の前にある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「グループ化」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、直接もしくは、例えばリンカー、リピートもしくは制限酵素部位間の余分な核酸、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、もしくは３００の塩基長、あるいは、前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である、任意の他の配列と近接して生じるが、一般に、機能的もしくは触媒的ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインをコードする配列間とは生じない２つ以上の配列を指す。
本明細書に記載の核酸は、核酸塩基を含む。一次、標準、天然、または未修飾の塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルである。他の核酸塩基としては、プリン、ピリミジン、修飾核酸塩基、５－メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ブロモウラシル、イソグアニン、イソシトシン、アミノアリル塩基、色素ラベル付け塩基、蛍光塩基、またはビオチンラベル付け塩基が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される高分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の多くの機能は当技術分野において既知であり、酵素、構造、輸送、防御、ホルモン、またはシグナル伝達が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、常にではないが、多くの場合、核酸テンプレートを使用してリボソーム複合体によって生物学的に生成されるが、化学合成も利用できる。核酸テンプレートを操作することにより、２つ以上のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の置換、欠失、短縮、付加、複製、または融合などのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質変異を実行することができる。これらの２つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の融合は、同じ分子内で隣接して、あるいは、例えばリンカー、リピート、エピトープ、もしくはタグ間の余分なアミノ酸、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、もしくは３００の塩基長、または、前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、あるいは約それ以下である、任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「下流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、前の配列のＣ末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「上流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、後続の配列のＮ末端の前にある配列を指す。
本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、または材料の「純度」という用語は、仕様に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、または材料の実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物、または材料は、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％純粋であり、その間のすべての小数を含む。純度は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞破片、小分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクル、もしくは汚染物質、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない不必要な不純物の影響を受ける場合がある。いくつかの実施形態では、物質、化合物、または材料は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、プラスミドＤＮＡ、汚染ウイルス、プロテアソーム、宿主細胞培養成分、プロセス関連成分、マイコプラズマ、発熱物質、細菌内毒素、および外来性感染性因子を実質的に含まない。純度は、電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、分光法、ＵＶ－可視分光法、赤外線分光法、質量分析法、核磁気共鳴、重量測定、もしくは滴定、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない技法を使用して測定することができる。
本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、または材料の「収率」という用語は、仕様に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、または材料の実際の総量を指す。例えば、物質、化合物、または材料の収率は、予想される総量の８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であり、その間のすべての小数を含む。収率は、反応またはプロセスの効率、望ましくない副反応、分解、投入物質、化合物、もしくは材料の品質、または製造の任意の工程の中での所望の物質、化合物、もしくは材料の損失によって影響を受ける場合がある。
本明細書で使用される「ｗ／ｗ％」または「重量／重量％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、１００を掛けた組成物の全重量に対する成分または薬剤の重量に関して表されたパーセンテージを指す。本明細書で使用される「ｖ／ｖ％」または「体積／体積％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、組成物の全液体体積に対する化合物、物質、成分または薬剤の液体体積に関して表されたパーセンテージに１００を掛けたものを指す。
幹細胞
本明細書で使用される場合、「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）という用語は、胚性および胚外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子および精子細胞の融合から生産される。受精卵の最初の数分割によって生産される細胞も全能性である。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、一般にＥＳ細胞とも略され、本明細書で使用される場合、本明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、多能性であり、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本開示の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞を包含するために広義で使用される場合がある。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、体のほぼすべての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内部細胞塊細胞の子孫であり得るか、または特定の遺伝子の発現を強制することによって、非多能性幹細胞、例えば成体体細胞の誘導によって得られてもよい。多能性幹細胞は、任意の適切な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例は、ヒト、げっ歯類、ブタ、およびウシを含む哺乳動物の供給源を含む。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、一般にｉＰＳ細胞とも省略され、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することにより、成人の体細胞などの通常は非多能性細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞の一種を指し、ｈｉＰＳＣはヒトｉＰＳＣを指す。当技術分野で知られているいくつかの方法では、ｉＰＳＣは、特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞などの非多能性細胞へのトランスフェクションによって誘導され得る。トランスフェクションは、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスを使用したウイルス形質導入によって達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子も誘導の効率を向上させる。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的および生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用されるとき、ｉＰＳＣは、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト誘導多能性幹細胞を含む。いくつかの方法において、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを用いて多能性幹細胞にヒト線維芽細胞を形質転換するためにレトロウイルス系が使用される。他の方法において、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換するためにレンチウイルス系が使用される。ｉＰＳＣで発現が誘導される遺伝子としては、Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）；Ｋｌｆファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）；、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｆｔｈ１１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ－カドヘリン、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含し、それを通じて、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、１つ以上の専門化された細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）（または全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ））幹細胞、多能性幹細胞（誘導性または非誘導性）、複能性幹細胞、寡能性幹細胞、および単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、胚、乳児、小児、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。前駆細胞には、胚幹細胞（ＥＳＣ）、胚性がん腫細胞（ＥＣ）、および胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、１つのステップは、多能性であるかまたは多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は、当技術分野でよく知られている。本明細書に記載の方法および系は、任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解されるであろう。
本開示による実施形態で使用することができる追加の幹細胞には、限定されないが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のＨｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣ ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）のＴｅｃｈｎｉｏｎ、およびＰｒｉｎｃｅｔｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって主宰されるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅによって主宰されるデータベースによって得られる、データベースに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示による実施形態で使用することができる例示的な胚性幹細胞には、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣ０１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（ＨＩ）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト多能性細胞株には、７２＿３、ＴｋＤＡ３－４、１２３１Ａ３、３１７－Ｄ６、３１７－Ａ４、ＣＤＨ１、５－Ｔ－３、３－３４－１、ＮＡＦＬＤ２７、ＮＡＦＬＤ７７、ＮＡＦＬＤ１５０、ＷＤ９０、ＷＤ９１、ＷＤ９２、Ｌ２００１２、Ｃ２１３、１３８３Ｄ６、ＦＦ、または３１７－１２細胞が含まれるが、これらに限定されない。
発生生物学では、細胞分化は、より専門化されていない細胞がより専門化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、「有向分化」という用語は、より専門化されていない細胞が特定の専門化された標的細胞型になるプロセスを記載する。専門化された標的細胞型の特殊性を、最初の細胞の運命を定義または変更するために使用することができる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法には、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、および核酸処理が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子を輸送し、胚性幹細胞実質的に同一のｉＰＳＣをもたらすことができる。アデノウイルスは、それ自身の遺伝子を標的の宿主と組み合わせないため、腫瘍を創出する危険性が排除される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを生成するために非ウイルスベースの技術が用いられる。いくつかの実施形態において、非常に低い効率ではあるが、いずれのウイルストランスフェクション系も全く使用せずに、プラスミドを介して再プログラミングを達成することができる。他の実施形態において、タンパク質の直接送達を用いてｉＰＳＣを生成し、そのようにしてウイルスまたは遺伝子修飾の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である。ポリアルギニンアンカーを介して細胞に運ばれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態において、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによって多能性誘導遺伝子の発現を増加させることもできる。
本明細書で使用される「フィーダー細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、成長因子を培地に分泌するか、または細胞表面に表示することなどによって、多能性幹細胞の増殖をサポートする細胞を指す。フィーダー細胞は一般に付着細胞であり、増殖が停止する場合もある。例えば、フィーダー細胞は、照射（例えば、ガンマ線）、マイトマイシン－Ｃ処理、電気パルス、または穏やかな化学固定（例えば、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）によって増殖が停止される。ただし、フィーダー細胞は必ずしも増殖を停止するとは限らない。フィーダー細胞は、成長因子の分泌、細胞表面への成長因子の表示、培養培地の無害化、または細胞外マトリックスタンパク質の合成などの目的に役立ち得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、支持された標的幹細胞に対して同種または異種であり、これは、下流の用途に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、マウス線維芽細胞、マウス胚性線維芽細胞、マウスＳＴＯ細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＳＮＬ ７６／７細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト前皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト脂肪間葉細胞、ヒト骨髄間葉細胞、ヒト羊膜間葉細胞、ヒト羊膜上皮細胞、ヒト臍帯間葉細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、またはヒト成人ファロピウス管上皮細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞から調製された馴化培地は、フィーダー細胞共培養の代わりに、またはフィーダー細胞共培養と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、標的幹細胞の増殖中には使用されない。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の細胞組成物の有効量と、薬学的に許容される担体、賦形剤、またはそれらの組み合わせを含む、本質的になる、またはそれらからなる医薬組成物に関する。本明細書に記載の医薬組成物は、ヒトおよび／または獣医学の用途に適している。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、使用される投与量および濃度で細胞または哺乳動物に曝露されている細胞または哺乳動物に対して無毒であるか、または許容可能なレベルの毒性を有する担体、賦形剤、および／または安定剤を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される」「希釈剤」、「賦形剤」、および／または「担体」は、本明細書に照らして理解されるようなそれらの明白かつ通常の意味を有し、ヒト、ネコ、イヌ、または他の脊椎動物宿主への投与と適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図している。典型的には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、ヒトならびにネコやイヌなどの非ヒト哺乳動物を含む動物で使用するために、連邦政府、州政府、または他の規制当局の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されている。希釈剤、賦形剤、および／または「担体」という用語は、医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指すことができる。そのような医薬希釈剤、賦形剤、および／または担体は、石油、動物、植物または合成由来のものを含む、水および油などの無菌液体であり得る。水、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液は、特に注射可能な溶液のために、液体希釈剤、賦形剤、および／または担体として使用することができる。適切な医薬希釈剤および／または賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。生理学的に許容される担体の非限定的な例は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体はまた、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、アミノ酸、グルコース、マンノース、デキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対抗剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）のうちの１つ以上を含み得る。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤などの形態をとることができる。製剤は、典型的には、投与方法に適合している。
抗凍結剤は、大きな氷の結晶の形成を防ぐことにより、低温凍結保存の効率と収率を向上させるための細胞組成添加剤である。抗凍結剤には、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、トレハロース、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、グリセロール３－リン酸、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、スクロース、トリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、グリコール、またはヒドロキシエチルスターチが含まれるが、これらに限定されない。抗凍結剤は、細胞の解凍後の生存率を高めるための栄養素（例えば、アルブミン、血清、ウシ血清、ウシ胎児血清［ＦＣＳ］）などの他の成分を含む凍結保存培地の一部として使用できる。これらの凍結保存培地において、少なくとも１つの抗凍結剤は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され得る。
望ましい特性を有する追加の賦形剤には、保存剤、アジュバント、安定剤、溶媒、緩衝液、希釈剤、可溶化剤、洗浄剤、界面活性剤、キレート剤、抗酸化剤、アルコール、ケトン、アルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、塩、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム糖、デキストロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、ソルビトール、セルロース、血清、アミノ酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、オクチルフェノールエトキシレート、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、ゼラチン、エステル、エーテル、２－フェノキシエタノール、尿素、またはビタミン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一部の賦形剤は、血清、アルブミン、オボアルブミン、抗生物質、不活性化剤、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、β－プロピオラクトン、ゼラチン、細胞破片、核酸、ペプチド、アミノ酸、または増殖培地成分またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、製造プロセスからの残留量または汚染物質であり得る。賦形剤の量は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、もしくは約それ以下であるパーセンテージ、または前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の重量パーセンテージで、組成物中に見出され得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に照らして理解されるように、その平易で通常の意味を有し、鎮痛剤、治療剤、他の材料などを含むがこれらに限定されない、組成物または賦形剤の比較的非毒性の無機および有機酸または塩基付加塩を含む。薬学的に許容される塩の例には、塩酸および硫酸などの鉱酸に由来するもの、およびエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩の形成のために適した無機塩基の例には、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛などの水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩が含まれる。塩はまた、毒性がなく、そのような塩を形成するのに十分強いものを含む、適切な有機塩基で形成され得る。例えば、そのような有機塩基のクラスは、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミンを含む、モノ、ジ、およびトリアルキルアミン；モノ－、ジ－、およびトリエタノールアミンを含むモノ、ジ、またはトリヒドロキシアルキルアミン；グリシン、アルギニン、リジンを含むアミノ酸；グアニジン；Ｎ－メチルグルコサミン；Ｎ－メチルグルカミン；Ｌ－グルタミン；Ｎ－メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ－ベンジルフェネチルアミン；トリヒドロキシメチルアミノエタンを含み得るが、これらに限定されない。
適切な製剤は、選択した投与経路によって異なる。本明細書に記載の化合物の製剤および投与のための技術は、当業者に知られている。化合物を投与する複数の技術が、経腸、経口、直腸、局所、舌下、頬、耳内、硬膜外、皮内、エアロゾル、非経口送達（筋肉内、皮下、動脈内、静脈内を含む）、門脈内、関節内、皮内、腹膜、髄内注射、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射を含む当技術分野に存在し、これらに限定されない。医薬組成物は、一般に、特定の意図された投与経路に合わせて調整されるであろう。
本明細書で使用される場合、「担体」は、本明細書に照らして理解されるようなその平易で通常の意味を有し、細胞、組織および／または身体器官への化合物の通過、送達、および／または取り込みを容易にする化合物、粒子、固体、半固体、液体、または希釈剤を指す。
本明細書で使用される場合、「希釈剤」は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、薬理学的活性を欠くが薬学的に必要または望ましい場合がある医薬組成物中の成分を指す。例えば、希釈剤を使用して、その質量が製造および／または投与するには小さすぎる強力な薬物のバルクを増加させることができる。それはまた、注射、摂取または吸入によって投与される薬物の溶解のための液体であり得る。当技術分野における希釈剤の一般的な形態は、ヒトの血液の組成を模倣するリン酸緩衝生理食塩水などであるが、これに限定されない緩衝水溶液である。
本明細書の開示は、多くの実施形態を説明するために肯定的な言葉を使用している。本開示はまた、物質または材料、方法の工程および条件、プロトコル、または手順などの主題が完全にもしくは部分的に除外される実施形態を含む。
ＰＳＣの中胚葉への分化
胚発生の間、中胚葉は３つの主要な胚葉の１つであり、筋肉、結合組織、骨、軟骨、皮膚、内皮、間葉、および血液細胞を含む広範囲の組織を生じさせる。中胚葉に由来する間葉は、適切な成長および発生のために上皮組織を含む関連組織を支援する上で重要な役割を果たす。中胚葉は、沿軸中胚葉、中間中胚葉、および側板中胚葉で構成されている。側板中胚葉はさらに、体細胞中胚葉層と臓側中胚葉層とに細分化される。臓側中胚葉は、内胚葉と密接に発生し、血管、心筋、および胃腸系の結合組織と筋肉などの多くの下流組織型を生じさせる。本明細書に開示されるように、レチノイン酸シグナル伝達経路は、側板中胚葉を臓側中胚葉に分化させるために重要である。
多能性幹細胞から任意の胚性細胞型（例えば、中胚葉、内胚葉、または外胚葉）を産生するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、桑実胚に由来する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。胚性幹細胞を、胚の内部細胞塊または胚の性腺隆起から派生することができる。胚性幹細胞または人工多能性幹細胞は、マウス、ラット、サル、ネコ、イヌ、ハムスター、またはヒトが挙げられるが、これらに限定されない様々な動物種に由来することができる。いくつかの実施形態では、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞はヒトである。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、下流の細胞型に分化する前に、外因性の核酸またはタンパク質を発現するように、遺伝子改変される。
いくつかの実施形態では、ＥＳＣおよびｉＰＳＣなどのＰＳＣは、胚性胚葉細胞、器官組織前駆細胞への、次いで胃腸組織または他の任意の生物学的組織などの組織への有向分化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を受ける。いくつかの実施形態では、分化が進行するにつれて分子（成長因子、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト）が順次添加される、分化した細胞型のそれぞれを得るために、有向分化が段階的に行われる。いくつかの実施形態では、有向分化は、分子（成長因子、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト）が同時に添加される非段階的な方法で行われる。いくつかの実施形態において、有向分化は、ＰＳＣまたは任意の下流の細胞における特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することによって達成される。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路としては、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｗｎｔ／ＡＰＣシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ＬＫＢシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、レチノイン酸シグナル伝達経路、アスコルビン酸シグナル伝達経路、もしくはＰａｒ極性シグナル伝達経路、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるシグナル伝達経路のうちのいずれか１つの濃度、発現または機能を変更することにより、本開示に従って分化を促進することができることが当業者によって理解されるであろう。いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路に関連する細胞成分、例えば、経路の天然の阻害剤、アンタゴニスト、活性化因子、またはアゴニストを使用して、シグナル伝達経路の阻害または活性化をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的にするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを使用して、これらの経路を阻害または活性化する。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子またはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔタンパク質は、組換えＷｎｔタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＧＳＫ３シグナル伝達経路阻害物質を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、もしくはＴＷＳ１１９、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９、ＰＮＵ７４６５４、ＫＹ－０２１１１、ＰＲＩ－７２４、ＦＨ－５３５、ＤＩＦ－１、もしくはＸＡＶ９３９、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子またはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子またはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関与する成長因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用がＦＧＦシグナル伝達に不可欠であることが示されている。ＦＧＦは、多種多様な細胞および組織の増殖ならびに分化の過程で重要な役割を果たす。ヒトでは、ＦＧＦファミリーの２２のメンバーが同定されており、そのすべてが構造的に関連するシグナル伝達分子である。メンバーＦＧＦ１～ＦＧＦ１０はすべて、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する。ＦＧＦ１は酸性線維芽細胞成長因子としても知られており、ＦＧＦ２は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）としても知られている。ＦＧＦ相同因子１～４（ＦＨＦ１～ＦＨＦ４）としても既知であるメンバーＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、およびＦＧＦ１４は、ＦＧＦと比較して明確な機能的差異を有することが示されている。これらの因子は著しく類似した配列相同性を有しているが、それらはＦＧＦＲに結合せず、ＦＧＦとは無関係の細胞内プロセスに関与する。このグループは「ｉＦＧＦ」としても既知である。メンバーＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３はより新しく、あまり特徴付けられていない。ＦＧＦ１５は、ヒトＦＧＦ１９のマウスオルソログである（したがって、ヒトＦＧＦ１５はない）。ヒトＦＧＦ２０は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＦＧＦ－２０（ＸＦＧＦ－２０）との相同性に基づいて同定された。他のＦＧＦの局所活性とは対照的に、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３は、より全身的な効果を有する。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦタンパク質は、組換えＦＧＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５（ＦＧＦ１９、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９）、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、またはＦＧＦ２３のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞はＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子で処理されない。本明細書で提供されるＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、ＴＧＴ－βシグナル伝達経路活性化因子またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βファミリーは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー－管ホルモン、アクチビン、および結節経路を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達経路アクチベーターは、ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ノード、ＢＭＰ、ＩＤＥ１、ＩＤＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、ＳＢ４３１５４２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰタンパク質は、組換えＢＭＰタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、もしくはＩＤＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化因子またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化因子は、Ｎｏｔｃｈタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈタンパク質は、組換えＮｏｔｃｈタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、もしくはＮｏｔｃｈ４、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路阻害物質は、化合物Ｅ、ＬＹ４１１５７５、ＤＢＺ、もしくはＤＡＰＴ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化因子またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるＮｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化因子またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路活性化因子またはＨＨシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＨＨタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＨＨタンパク質は、組換えＨＨタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、プルモルファミン（ＰＭＡ）、ＧＳＡ１０、ＳＡＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路阻害物質は、ＨＰＩ－１、シクロパミン、ＧＡＮＴ５８、もしくはＧＡＮＴ６１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子またはＨＨシグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるＨＨシグナル伝達経路活性化因子またはＨＨシグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性化因子またはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性化因子は、７４０Ｙ－Ｐ、もしくはエルカ酸、またはそれらの両方を含む。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質は、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ハイビスコンＣ、ＰＩ－１０３、ＩＣ－８７１１４、ＺＳＴＫ４７４、ＡＳ－６０５２４０、ＰＩＫ－７５、ＰＩＫ－９０、ＰＩＫ－２９４、ＰＩＫ－２９３、ＡＺＤ６４８２、ＰＦ－０４６９１５０２、ＧＳＫ１０５９６１５、ケルセチン、プルリポチン、フルルビプロフェン、ＧＤＣ－０９４１、ダクトリシブ、ピクチリシブ、イデラリシブ、ブパルリシブ、リゴサチブ、コパンリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性化因子またはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性化因子またはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子またはレチノイン酸シグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、もしくはＡＭ５８０、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害物質は、ググルステロンを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子またはレチノイン酸シグナル伝達経路阻害物質で処理されない。本明細書で提供されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子またはレチノイン酸シグナル伝達経路阻害物質は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞は、アスコルビン酸シグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達経路活性化因子は、アスコルビン酸もしくは２－ホスホ－アスコルビン酸、またはそれらの両方を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、アスコルビン酸シグナル伝達経路活性化因子で処理されない。本明細書で提供されるアスコルビン酸シグナル伝達経路活性化因子は、本明細書で提供される他の成長因子、シグナル伝達経路活性化因子、またはシグナル伝達経路阻害物質のうちのいずれかと組み合わせて使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、小分子化合物、シグナル伝達経路活性化因子、シグナル伝達経路阻害剤または成長因子のうちのいずれかに対して、細胞は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間、例えば、１時間～３００時間、２４時間～１２０時間、４８時間～９６時間、６時間～７２時間、もしくは２４時間～３００時間、接触する。いくつかの実施形態において、１を超える小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または成長因子が添加される。これらの場合、複数の小分子化合物、活性剤、阻害剤、または成長因子を同時にまたは別々に加えることができる。
いくつかの実施形態において小分子化合物、シグナル伝達経路活性化因子、シグナル伝達経路阻害剤、または成長因子のうちのいずれかに対して、細胞（例えば、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞）は、小分子化合物、シグナル伝達経路活性化因子、シグナル伝達経路阻害剤、または成長因子のうちのいずれかの濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、もしくは１５０００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ～１５０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ、または１０００ｎｇ／ｍＬ～１５０００ｎｇ／ｍＬにあるように、培養において接触する。いくつかの実施形態では、小分子化合物、シグナル伝達経路活性化因子、シグナル伝達経路阻害物質、または成長因子のうちのいずれかに対して、細胞（例えば、多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞）は、小分子化合物、シグナル伝達経路活性化因子、シグナル伝達経路阻害剤、または成長因子のうちのいずれかの濃度が、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭであるように、培養において接触される。いくつかの実施形態において、小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または成長因子の濃度は、治療を通して一定レベルに維持される。いくつかの実施形態において、小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または成長因子の濃度は、治療の過程の中で変化する。いくつかの実施形態において、１を超える小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または成長因子が添加される。これらの場合、複数の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または成長因子の濃度が異なる可能性がある。
いくつかの実施形態では、細胞（多能性幹細胞、側板中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、またはそれらの任意の分化した細胞）は、幹細胞およびその分化した細胞の増殖を支持する増殖培地で培養される。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ｍＴｅＳＲ１、またはｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態において、増殖培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば、０％～２０％、０．２％～１０％、２％～５％、０％～５％、または２％～２０％でＦＢＳを含む。いくつかの実施形態において、増殖培地は、異種成分を含有しない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または成長因子を含む。
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞から調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、生検から得られた生物学的組織から調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、ＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、ヒトＰＳＣは、ヒトＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、凍結保存されたＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、ウイルス形質導入によってＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、センダイウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス、あるいはそれらの任意の組み合わせで形質導入される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、またはＬ－Ｍｙｃ、またはそれらの任意の組み合わせのための発現ベクターを含むセンダイウイルスで形質導入される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、ＭＯＩが、０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０ＭＯＩであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるＭＯＩ、あるいは前述のＭＯＩのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のＭＯＩ、例えば、０～５．０、１．０～４．０、２．０～３．０、０～３．０、または１．０～５．０で、１つ以上のウイルスで形質導入される。いくつかの実施形態において、形質導入後、ＰＢＭＣは、幹細胞再プログラミング因子を発現する。いくつかの実施形態において、形質導入後、ＰＢＭＣは、ｉＰＳＣに再プログラムされる。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、フィーダー細胞基質上で増殖する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＭＥＦフィーダー細胞基質上で増殖する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、照射されたＭＥＦフィーダー細胞基質上で増殖する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ｍＴｅＳＲ１、またはｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地で増殖される。
いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、細胞培養において拡張される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、細胞外マトリックス、またはその模倣物もしくは誘導体において拡張される。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス、またはその模倣物もしくは誘導体は、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、核酸、糖、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、ヘパラン硫酸、エンタクチン、ニドゲン、オステオポンチン、基底膜、マトリゲル、ゲルトレックス、ヒドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、もしくはヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせ含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、マトリゲル、ゲルトレックス、もしくは１％ゼラチン、またはそれらの任意の組み合わせにおいて拡張される。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を含む細胞培養培地中で拡張される。
側板中胚葉への分化
本明細書に開示されるか、または他の方法で当技術分野において既知である多能性幹細胞から側板中胚葉細胞を産生するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、最初に、中間原始ストリーク細胞に分化される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣを中間原始ストリーク細胞に分化させるために、多能性幹細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、もしくはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質、またはそれらの任意の組み合わせと接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質は、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ハイビスコンＣ、ＰＩ－１０３、ＩＣ－８７１１４、ＺＳＴＫ４７４、ＡＳ－６０５２４０、ＰＩＫ－７５、ＰＩＫ－９０、ＰＩＫ－２９４、ＰＩＫ－２９３、ＡＺＤ６４８２、ＰＦ－０４６９１５０２、ＧＳＫ１０５９６１５、ケルセチン、プルリポチン、フルルビプロフェン、ＧＤＣ－０９４１、ダクトリシブ、ピクチリシブ、イデラリシブ、ブパルリシブ、リゴサチブ、コパンリシブ、デュベリシブ、およびアルペリシブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、またはＰＩＫ９０、または５つすべてを含むそれらの任意の組み合わせと接触されて、ＰＳＣを中間原始ストリーク細胞に分化させる。
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子は、アクチビンＡであるか、またはアクチビンＡを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１５～４５ｎｇ／ｍＬ、２０～４０ｎｇ／ｍＬ、１５～３０ｎｇ／ｍＬ、または３０～４５ｎｇ／ｍＬで、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子（例えば、アクチビンＡ）と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、３０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下の濃度で、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子（例えば、アクチビンＡ）と接触される。
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１であるか、またはＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、１、２、３、４、５、５．１、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、８、９、もしくは１０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度である濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、６μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ２であるか、またはＦＧＦ２を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ２）と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、２０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ２）と接触される。
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４であるか、またはＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、４０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質は、ＰＩＫ９０であるか、またはＰＩＫ９０を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＩＫ９０）と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、１００ｎＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ＰＩＫ９０）と接触される。
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質と、ＰＳＣを中間原始ストリーク細胞に分化させるのに十分な時間接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間接触される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、２４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間接触される。
いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞を側板中胚葉細胞に分化させるために、本明細書に開示されるいずれかの方法、または当技術分野において既知である別の方法が適用可能である。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、多能性幹細胞から分化している。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞を側板中胚葉細胞に分化させるために、中間原始ストリーク細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、もしくはＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、またはそれらの任意の組み合わせと接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される。くつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９、ＰＮＵ７４６５４、ＫＹ－０２１１１、ＰＲＩ－７２４、ＦＨ－５３５、ＤＩＦ－１、およびＸＡＶ９３９からなる群から選択される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞を側板中胚葉細胞に分化させるために、中間原始ストリーク細胞は、Ａ８３０１、Ｃ５９、ＢＭＰ４、または３つすべてを含むそれらの任意の組み合わせと接触される。
いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１であるか、またはＡ８３０１を含む。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ａ８３０１）と接触される。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、１μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ａ８３０１）と接触される。
いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９であるか、またはＣ５９を含む。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ｃ５９）と接触される。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、１μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ｃ５９）と接触される。
いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４であるか、またはＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、３０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。
いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、中間原始ストリーク細胞を側板中胚葉細胞に分化させるのに十分な時間接触される。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間接触される。いくつかの実施形態では、中間原始ストリーク細胞は、２４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間接触される。
いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、側板中胚葉細胞を分化させる目的で、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる、Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．"Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｃｈｏｉｃｅｓ Ｌｅａｄｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ，Ｈｅａｒｔ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｅｓｏｄｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅｓ"Ｃｅｌｌ．（２０１６）１６６（２）：４５１－４６７に見出される方法に従って、多能性幹細胞から産生される。
臓側中胚葉への分化
臓側中胚葉細胞を側板中胚葉細胞から産生する方法が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、本明細書に開示される方法、または当技術分野において既知である別の方法のいずれか１つに従って産生される。臓側中胚葉細胞を産生する方法は、側板中胚葉細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、もしくはレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、またはそれぞれの少なくとも１つを含むそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、およびＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される。くつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９、ＰＮＵ７４６５４、ＫＹ－０２１１１、ＰＲＩ－７２４、ＦＨ－５３５、ＤＩＦ－１、およびＸＡＶ９３９からなる群から選択される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ２である。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡである。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、Ａ８３０１、ＢＭＰ４、Ｃ５９、ＦＧＦ２、およびＲＡと接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、側板中胚葉細胞を臓側中胚葉に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の因子、例えば、Ａ８３０１、ＢＭＰ４、Ｃ５９、ＦＧＦ２、およびＲＡと接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内、例えば、１～７２時間、１２～３６時間、１～４８時間、または２４～７２時間、接触する。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間、例えば、３６～６０時間、４０～５４時間、３６～４８時間、または４８～６０時間、接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、４８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である時間接触される。
いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質は、Ａ８３０１であるか、またはＡ８３０１を含む。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ａ８３０１）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、例えば、０．１～２μＭ、０．５～１．５μＭ、０．１～１μＭ、または１～２μＭで、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ａ８３０１）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、１μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ａ８３０１）と接触される。
いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｃ５９であるか、またはＣ５９を含む。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ｃ５９）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、例えば、０．１～２μＭ、０．５～１．５μＭ、０．１～１μＭ、または１～２ｕＭで、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ｃ５９）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、１μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Ｃ５９）と接触される。
いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４であるか、またはＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１００ｎｇ／ｍＬ、５～４０ｎｇ／ｍＬ、１０～８０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～１００ｎｇ／ｍＬで、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それら以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１５～４５ｎｇ／ｍＬ、２０～４０ｎｇ／ｍＬ、１５～３０ｎｇ／ｍＬ、または３０～４５ｎｇ／ｍＬで、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、３０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。
いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、ＦＧＦ２であるか、またはＦＧＦ２を含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１００ｎｇ／ｍＬ、５～４０ｎｇ／ｍＬ、１０～８０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～１００ｎｇ／ｍＬで、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ２）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それら以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、５～３５ｎｇ／ｍＬ、１０～３０ｎｇ／ｍＬ、５～２０ｎｇ／ｍＬ、または２０～３５ｎｇ／ｍＬでＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ２）と接触する。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、２０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ２）と接触される。
いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡであるか、またはＲＡを含む。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、例えば、１～３μＭ、１．５～２．５μＭ、１～２μＭ、または２～３ｕＭで、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触される。いくつかの実施形態では、側板中胚葉細胞は、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触される。
いくつかの実施形態では、側方板中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質と、０．０１～２０の濃度でＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子と、および０．０１～２０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、側方板中胚葉細胞は、０．１～２μＭの濃度でＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質と、０．１～２μＭの濃度でＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と、１５～４５ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、５～３５ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子と、および１～３μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、側方板中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＡ８３０１と、０．０１～２０の濃度でＣ５９と、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦ２と、および０．０１～２０μＭの濃度でＲＡと接触される。いくつかの実施形態では、側方板中胚葉細胞は、０．１～２μＭの濃度でＡ８３０１と、０．１～２μＭの濃度でＣ５９と、１５～４５ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、５～３５ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦ２と、および１～３μＭの濃度でＲＡと接触される。いくつかの実施形態では、側方板中胚葉細胞は１μＭの濃度でＡ８３０１と、１μＭの濃度でＣ５９と、３０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、２０ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦ２と、および２μＭの濃度でＲＡと接触される。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法のいずれかに従って産生される臓側中胚葉細胞は、心臓中胚葉細胞と比較して、ＦＯＸＦ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、心臓中胚葉細胞と比較して、ＮＫＸ２－５、ＩＳＬ１、もしくはＴＢＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、中間原始ストリーク細胞と比較して、ＰＡＸ３、もしくはＰＲＲＸ１、またはそれらの両方の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、心臓中胚葉細胞と比較して、ＣＤ３１の発現の減少を示す。
本明細書で提供される実施形態のいずれにおいても、臓側中胚葉細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ヒト臓側中胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、対象に由来する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患を有するか、または疾患にかかるリスクがある。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、対象に由来するＰＳＣに由来する。
臓側中胚葉細胞型への分化
本明細書に開示されるように、本明細書の方法のいずれかによって産生された臓側中胚葉細胞は、臓側中胚葉サブタイプにさらに分化することができる。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉サブタイプは、横中隔細胞、線維芽細胞、呼吸間葉細胞、もしくは食道／胃間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、肝臓横中隔細胞を含む。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、肝臓線維芽細胞を含む。臓側中胚葉細胞の臓側中胚葉サブタイプへの分化の実施形態は、図７Ａに開示されている。
横中隔細胞の産生
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、もしくはＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、またはそれらの両方と接触させることを含む方法である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される臓側中胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、この接触は、臓側中胚葉細胞を横中隔細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡである。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＢＭＰ４、またはそれらの両方と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、かつ１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１００ｎｇ／ｍＬ、５～４０ｎｇ／ｍＬ、１０～８０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～１００ｎｇ／ｍＬで、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度でレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、かつ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、もしくは８０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１．８、１．９、２、２．１、もしくは２．２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度でレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、かつ２０、３０、４０、５０、もしくは６０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度でレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、かつ４０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触され、かつ１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触され、かつ１０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＲＡと接触され、かつ１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度でＲＡと接触され、かつ１０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭの濃度でＲＡと接触され、かつ４０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と接触される。
いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、もしくはＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、またはそれらの両方は、臓側中胚葉細胞を横中隔細胞に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の濃度で接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載される因子、例えば、ＲＡおよびＢＭＰ４と、臓側中胚葉細胞を横中隔細胞に分化させるのに十分な期間接触される。いくつかの実施形態では、接触は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、７２時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間である。
いくつかの実施形態では、得られる横中隔細胞は、心臓中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、ＵＰＫ３Ｂ、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、心臓中胚葉細胞または線維芽細胞、もしくはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、またはＨＡＮＤ１、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、臓側中胚葉細胞と比較して、ＨＯＸＡ１もしくはＴＢＸ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１またはＨＯＸＡ５、もしくはそれらの両方の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、またはＨＯＸＡ５、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、横中隔細胞は、臓側中胚葉細胞から分離した総細胞の６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは１００％であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である臓側中胚葉細胞から分化した総細胞の割合、あるいは前述の割合のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の割合、例えば、６０％～１００％、７０％～９０％、または７５％～８５％を占める。
線維芽細胞の産生
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、もしくはＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む方法である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される臓側中胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、この接触は、臓側中胚葉細胞を線維芽細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡである。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１、またはすべて３つを含むそれらの任意の組み合わせと接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１００ｎｇ／ｍＬ、５～４０ｎｇ／ｍＬ、１０～８０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～１００ｎｇ／ｍＬで、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触され、かつ０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、もしくは８０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触され、かつ１、２、３、４、５、５．１、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、８、９、もしくは１０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、４０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触され、かつ６μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、かつ０．０１～２０μＭの濃度でＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と、１０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、かつ５～７μＭの濃度でＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＲＡと、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、かつ０．０１～２０μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度でＲＡと、１０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、かつ５～７μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭの濃度でＲＡと、４０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、かつ６μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１と接触される。
いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）は、臓側中胚葉細胞を線維芽細胞に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の濃度で接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載される因子、例えば、ＲＡ、ＢＭＰ４、およびＣＨＩＲ９９０２１と、臓側中胚葉細胞を線維芽細胞に分化させるのに十分な期間接触される。いくつかの実施形態では、接触は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、７２時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間である。
いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、臓側中胚葉細胞もしくは横中隔細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、横中隔細胞と比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、またはＵＰＫ１Ｂ、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１、ＨＯＸＡ５、またはＬＨＸ２、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、またはＨＯＸＡ５、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。
呼吸間葉細胞の産生
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、もしくはＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む方法である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される臓側中胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、この接触は、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、方法は、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前に、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この２段階のプロセスは、臓側中胚葉細胞の呼吸間葉細胞への分化を増強する。
いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、ＰＭＡ、ＧＳＡ１０、およびＳＡＧからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡである。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＰＭＡである。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＰＭＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、またはすべて４つを含むそれらの任意の組み合わせと接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１００ｎｇ／ｍＬ、５～４０ｎｇ／ｍＬ、１０～８０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～１００ｎｇ／ｍＬで、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触され、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と接触され、かつ任意に、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、もしくは８０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触され、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と接触され、かつ任意に、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、０．１～２μＭ、０．５～１．５μＭ、０．１～１μＭ、または１～２μＭで、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、４０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）と接触され、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と接触され、かつ任意に、１μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、０．０１～２０μＭの濃度でＨＨシグナル伝達経路活性化因子と、かつ任意に０．０１～２０μＭの濃度でＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子と、１０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と、１～３μＭの濃度でＨＨシグナル伝達経路活性化因子と、かつ任意に０．１～２μＭの濃度でＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度でＲＡと、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、０．０１～２０μＭの濃度でＰＭＡと、かつ任意に０．０１～２０μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度でＲＡと、１０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、１～３μＭの濃度でＰＭＡと、かつ任意に０．１～２μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭの濃度でＲＡと、４０ｎｇ／ｍＬの濃度でＢＭＰ４と、２μＭの濃度でＰＭＡと、かつ任意に１μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１段階プロセスで呼吸間葉細胞に分化する。これらの実施形態では、方法は、臓側中胚葉細胞を、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、１段階プロセスのＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の濃度で接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の因子、例えば、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＰＭＡ、およびＣＨＩＲ９９０２１と、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な期間接触される。いくつかの実施形態では、接触は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、７２時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間である。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２段階プロセスで呼吸間葉細胞に分化する。いくつかの実施形態では、方法は、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と接触させる第２の工程の前に、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程を含む。いくつかの実施形態では、第１の工程および第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は同じである。いくつかの実施形態では、第１の工程および第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子は異なる。いくつかの実施形態では、２段階のプロセスの第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と、２段階のプロセスの第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路アクチベーター、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子とは、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の濃度で接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の因子、例えば、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＰＭＡ、およびＣＨＩＲ９９０２１と、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な期間接触される。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は、４８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間接触される。いくつかの実施形態では、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＢＭＰ４）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）は、２４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間接触される。
いくつかの実施形態では、呼吸間葉細胞は、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、または食道／胃間葉細胞、もしくはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＮＫＸ６－１、ＴＢＸ５、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、ＦＯＸＦ１、ＬＨＸ２、またはＷＮＴ２、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、呼吸間葉細胞は、横中隔細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、またはＵＰＫ１Ｂ、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、呼吸間葉細胞は、線維芽細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＭＳＸ１、またはＭＳＸ２、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。
食道／胃間葉細胞の産生
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、もしくはＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む方法である。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される臓側中胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、この接触は、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、方法は、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前に、臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この２段階のプロセスは、臓側中胚葉細胞の食道／胃間葉細胞への分化を増強する。
いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、ＰＭＡ、ＧＳＡ１０、およびＳＡＧからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡである。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＰＭＡである。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギンである。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡ、ＰＭＡ、ノギン、またはすべて３つを含むそれらの任意の組み合わせと接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、かつ０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭでＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と接触され、かつ任意に１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２５０ｎｇ／ｍＬ、５～１５０ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１～１５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～２５０ｎｇ／ｍＬで、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度でＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と接触され、かつ任意に５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下であるか、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）と接触され、２μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と接触され、かつ任意に１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）と接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度で、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子と、０．０１～２０μＭ濃度で、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子と、かつ任意に１～２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度で、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子と、１～３μＭ濃度で、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子と、かつ任意に５０～１５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１～２０μＭの濃度のＲＡと、０．０１～２０μＭの濃度のＰＭＡと、かつ任意に１～２５０ｎｇ／ｍＬの濃度のノギンと接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１～３μＭの濃度のＲＡと、１～３μＭの濃度のＰＭＡと、かつ任意に５０～１５０ｎｇ／ｍＬの濃度のノギンと接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２μＭの濃度のＲＡと、２μＭの濃度のＰＭＡと、かつ任意に１００ｎｇ／ｍＬの濃度のノギンと接触される。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１段階プロセスで食道／胃間葉細胞に分化する。これらの実施形態では、方法は、臓側中胚葉細胞を、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、１段階プロセスのＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の濃度で接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の因子、例えば、ＲＡ、ＰＭＡ、およびノギンと、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な期間接触される。いくつかの実施形態では、接触は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間である。いくつかの実施形態では、接触は、７２時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間である。
いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、２段階プロセスで食道／胃間葉細胞に分化する。いくつかの実施形態では、方法は、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）と接触させる第２の工程の前に第２の工程の前に、臓側中胚葉細胞をＲＡシグナル伝達経路活性化因子およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程を含む。いくつかの実施形態では、第１の工程および第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は同じである。いくつかの実施形態では、第１の工程および第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子は異なる。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）と、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）とは、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な期間、本明細書に記載の濃度で接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、本明細書に記載の因子、例えば、ＲＡ、ＰＭＡ、およびノギンと、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な期間接触される。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第１の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）は、４８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間接触される。いくつかの実施形態では、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される。いくつかの実施形態では、第２の工程のＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＲＡ）、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＰＭＡ）、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例えば、ノギン）は、２４時間であるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間接触される。
いくつかの実施形態では、食道／胃間葉細胞は、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、または呼吸間葉細胞、もしくはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、ＨＯＸＡ１、ＦＯＸＦ１、またはＮＫＸ３－２、もしくはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、食道／胃間葉細胞は、臓側中胚葉細胞、横中隔細胞、線維芽細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＮＴ２、ＴＢＸ５、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す。
臓側中胚葉を分化させるための因子
本明細書で提供される実施形態のいずれかでは、臓側中胚葉細胞は、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、またはＡＭ５８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡであるか、またはＲＡを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触されない。
本明細書で提供される実施形態のいずれかにおいて、臓側中胚葉細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子は、ＢＭＰ４であるか、またはＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～１００ｎｇ／ｍＬ、５～４０ｎｇ／ｍＬ、１０～８０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～１００ｎｇ／ｍＬでＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触する。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触されない。
本明細書で提供される実施形態のいずれかでは、臓側中胚葉細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１であるか、またはＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触されない。
本明細書で提供される実施形態のいずれかでは、臓側中胚葉細胞は、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、ＰＭＡ、ＧＳＡ１０、およびＳＡＧからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子は、ＰＭＡであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．０１～２０μＭ、０．０１～１０μＭ、１～１５μＭ、または１０～２０μＭで、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触される。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触されない。
本明細書で提供される実施形態のいずれかでは、臓側中胚葉細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質と接触される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ノギンであるか、またはノギンを含む。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、もしくは２５０ｎｇ／ｍＬであるか、約それであるか、少なくともそれであるか、少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である濃度、あるいは前述の濃度のうちの任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２５０ｎｇ／ｍＬ、５～１５０ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１～１５０ｎｇ／ｍＬ、または５０～２５０ｎｇ／ｍＬでＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触する。いくつかの実施形態では、臓側中胚葉細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触されない。
本明細書で提供される実施形態のうちのいずれかでは、臓側中胚葉細胞は、１つ以上のシグナル伝達経路活性化因子またはシグナル伝達経路阻害剤と接触して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８時間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０日であるか、約それであるか、少なくともそれであるか。少なくとも約それであるか、それ以下であるか、または約それ以下である期間、臓側中胚葉細胞を臓側中胚葉サブタイプに分化させる。
本明細書に提供される方法のいずれか１つによって産生される臓側中胚葉細胞のいずれか１つも本明細書に開示される。本明細書に提供される方法のいずれか１つによって産生される横中隔細胞のいずれかも本明細書に開示される。本明細書に提供される方法のいずれか１つによって産生される線維芽細胞のいずれかも本明細書に開示される。本明細書に提供される方法のいずれか１つによって産生される呼吸間葉細胞のいずれかも本明細書に開示される。本明細書に提供される方法のいずれかによって産生される食道／胃間葉細胞のいずれかも本明細書に開示される。
本明細書で論じられる実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例でさらに詳細に開示されており、これらは、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。当業者は、本明細書および特許請求の範囲に記載されているように、他の多くの実施形態も本開示の範囲内にあることを理解するであろう。
実施例１．単一細胞トランスクリプトームは、発生中の前腸における前駆細胞の多様性を定義する。
前腸器官形成中の系統多様化を包括的に定義するために、マウス胚性前腸の単一細胞ＲＮＡ配列（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を、初期のパターン化および系統誘導の時間にまたがる３つの時点：Ｅ８．５（５～１０中胚葉節［ｓ］）、Ｅ９．０（１２～１５ｓ）およびＥ９．５（２５～３０ｓ）で実行した（図１Ａ～Ｂ）。前腸を咽頭後部と中腸との間で顕微鏡で切開し、各時点で１５～２０個の胚から組織をプールした。Ｅ９．５では、肺／食道および肝臓／膵臓の原基をそれぞれ含む前方および後方領域が単離された。合計３１，２６８の単一細胞トランスクリプトームが品質管理基準に合格し、平均リード深度（ｄｅｐｔｈ）は３，１７８の転写物／細胞であった。細胞は、集団全体の非常に可変的な遺伝子の発現に基づいてクラスター化され、均一多様体近似投影（ＵＭＡＰ）およびｔ－分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を使用して可視化した（図１Ｃ、１Ｋ）。これにより、周知のマーカー遺伝子に基づいて９つの主要な細胞系統にグループ化できる２４の細胞クラスターを特定した：ＤＥ、ＳＭ、心臓、その他の中胚葉（壁側および傍軸）、内皮、血液、外胚葉、神経堤、胚体外（図１Ｋ）。ＤＥクラスター（４，４４８個の細胞）は、Ｆｏｘａ１／２、Ｃｄｈ１および／またはＥｐｃａｍの共発現によって特徴付けられたが、一方ＳＭ（１０，０９７個の細胞）は、Ｆｏｘｆ１（図１Ｄ）、Ｖｉｍおよび／またはＰｄｇｆｒａの共発現、ならびに心臓および他の中胚葉特異的転写物に対して陰性であることによって画定された。
ＤＥおよびＳＭにおける系統の多様化を正確に示すために、これらの細胞をさらに分析するためにインシリコで選択した。２６の段階特異的なサブクラスター（Ｅ９．５、１２クラスター、Ｅ９．０、８クラスター、Ｅ８．５、６クラスター）からなる１１の主要なＤＥクラスター、および３６の段階特異的なサブクラスターで構成される１３の主要なＳＭ群（Ｅ９．５、１７クラスター、Ｅ９．０、１２クラスター、Ｅ８．５、７クラスター）を特定した（図１Ｅ～Ｆ、１Ｌ～Ｍ）。クラスターは、それらの識別遺伝子を、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＭＧＩ）データベースで公開されている１６０を超える遺伝子の発現パターンと比較することによってアノテートした。これらのデータは、初期の前腸器官形成の包括的な単一細胞解像度ビューを提供し、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／ＺｏｒｎＬａｂ－ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌで検索することができる。
アノテーションは、Ｔｂｘ１＋咽頭、２つのＮｋｘ２－１／Ｆｏｘａ２＋呼吸クラスター、２つのＳｏｘ２＋食道クラスター、２つのＳｏｘ２／Ｏｓｒ１＋胃クラスター、２つのＡｌｂ／Ｐｒｏｘ１／Ａｆｐ＋肝クラスター（より高いＡｌｂ／ＨＮＦ４ａ発現を有するｃ１＿肝細胞およびｃ１０＿初期肝細胞）、Ｓｏｘ１７／Ｐｄｘ１＋肝膵管、Ｐｄｘ１／Ｍｎｘ１＋膵臓、およびＣｄｘ２＋十二指腸（図１Ｅ）を含む、Ｅ９．５でのすべての主要なＤＥ器官系統を特定した。切開部と一致して、Ｎｋｘ２－１＋／Ｈｈｅｘ＋甲状腺前駆細胞は検出されなかった。Ｅ８．７５腸上皮の最近のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析と同様に、Ｅ８．５とＥ９．０の間の半ダースの異なるＤＥ前駆体状態も、Ｏｔｘ２＋前腸、Ｓｏｘ２／Ｓｐ５に富む背側前腸、Ｏｓｒ１／Ｉｒｘ１に富む前腸、Ｈｈｅｘ＋肝内胚葉、心臓に隣接するＮｋｘ２－３＋腹側ＤＥ、およびＣｄｘ２＋中腸細胞の小さな集団を含む、転写因子（ＴＦ）を指定する系統の制限された発現に基づいてアノテートした（図１Ｌ）。
実施例２．新規間葉サブタイプの検証
すべての段階で、前腸のＳＭ細胞型の多様性は、以前に認識されていたよりもはるかに複雑であった（図１Ｆ、１Ｌ）。しかしながら、ＤＥとは異なり、ＳＭ集団は典型的には、１つまたは２つのマーカーだけでなく、複数の転写物の組み合わせによって画定された（図２Ａ～Ｂ）。Ｅ９．５の前腸および胚切片のインサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫染色は、共発現された転写物の組み合わせが異なる器官特異的ＳＭサブタイプを画定することを確認した（図２Ｃ～Ｑ）。Ｅ９．５での１７のＳＭ細胞集団には、５つのＴｂｘ１／Ｐｒｒｘ１＋咽頭クラスター、Ｉｓｌ１／Ｍｔｕｓ２＋心臓流出路細胞、Ｎｋｘ６－１／Ｇａｔａ４／Ｗｎｔ２＋呼吸器、およびＮｋｘ６－１／Ｓｆｒｐ２／Ｗｎｔ４＋食道間葉を含んでいた（図２Ｂ～Ｊ）。３つのＢａｒｘ１／Ｈｌｘ＋胃間葉集団に注釈付けられ（１つはＧａｔａ４発現に基づき腹側である可能性が高い）、１つのＨａｎｄ１／Ｈｏｘｃ８＋十二指腸間葉にアノテートした。器官特異的間葉は特定されておらず、胃または十二指腸クラスターにあると疑われた（図２Ｐ～Ｑ）。
予期せぬことに、肝芽は５つの異なる間葉集団を有していた。ＭＧＩのデータマイニングおよびインサイチュー検証により、Ａｌｃａｍ／Ｗｎｔ２／Ｇａｔａ４に富むｓｔｍ、Ｔｂｘ５／Ｗｎｔ２／Ｇａｔａ４／Ｖｓｎｌ１＋静脈洞、Ｍｓｘ１／Ｗｎｔ２／Ｈａｎｄ１／Ｃｏｌ１ａ１＋線維芽細胞集団、および２つのＷｔ１／Ｇａｔａ４／ウロプラキン（Ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）＋中皮集団のアノテーションを可能にした（図２Ｋ～Ｎ、２Ｒ）。興味深いことに、前方肝芽に対比して後方肝臓芽におけるＨａｎｄ１とＨａｎｄ２の制限された発現（図２Ｒ、パネルｂ）およびＷｎｔ２およびＷｔ１からのＭｓｘ１の相互に排他的な発現観察された（図２Ｒパネルｅ～ｆ）。
実施例３．前腸細胞の疑似的時間空間順序付け
腸の前後（ＡＰ）軸に沿った正確な位置に様々な器官が形成される。これが単一細胞の転写プロファイルに反映されているかどうかを評価するために、胚組織の連続フィールド内の細胞の位置情報を調べるために使用されてきた疑似的時間解析を採用した。この目的のために、ＤＥおよびＳＭ細胞は、発生分化経路を再構築するための次元削減法である拡散マップを使用して、各段階で解析された。最も前方の咽頭クラスターを根として固定し、各クラスターの疑似的時間密度分布を、根細胞からグラフ内の他のすべての細胞への遷移確率に基づいてプロットした。注目すべきことに、これは、胚における適切なＡＰ位置に従って、ＤＥ細胞集団とＳＭ細胞集団との両方を順序付けし、解析が疑似空間の偏りのないプロキシを表すことを示している（図１Ｇ～Ｊ、１Ｌ）。データはまた、発生のこの時点で、胚性腸管内の細胞が、離れた細胞型よりも類似した発現プロファイルを有する空間的に隣接する細胞型の転写シグネチャーの連続体を呈することを示した。確かに、前方切開部からのＥ９．５クラスターは、後部組織と比較して、疑似的空間連続体の前半分に位置しており、計算順序付けのロバスト性を確認している。最後に、ＡＰ軸に沿って同一直線上に発現することが知られているＨｏｘ遺伝子を調べ、特にＳＭ内のより後方のクラスターにおける後方Ｈｏｘパラログ発現の漸進的な増加を観察した（図２Ｓ）。
疑似的空間解析、ＭＧＩキュレーション、およびインサイチュー検証を組み合わせて、各ＤＥおよびＳＭ集団を、腸管内のおおよその位置にマッピングした（図１Ｉ－Ｊ、１Ｌ）。これは、ＳＭの多様性がＤＥ系統を反映していることを明らかにし、器官形成の最初から密接に協調された発生を示している。
実施例４．前腸内胚葉および間葉の転写因子コード
ＤＥ器官系統は、歴史的に、いくつかの転写因子（ＴＦ）の重複する発現ドメインによって定義されてきた。いくつかの領域的に発現されたＴＦがＳＭで報告されているが、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータにより、異なるＳＭおよびＤＥサブタイプを区別する差次的に発現されたＴＦの包括的なコンビナトリアルコードを定義できる（図２Ｓ）。これにより、ホメオドメインＴＦＮｋｘ６－１などの新しい系統制限マーカーが明らかになった。膵臓内胚葉での発現でよく知られている（図２Ｐ）、Ｎｋｘ６－１はＥ９．５の呼吸器および食道中胚葉でも特異的に発現していた（図２Ｂ～Ｃ、Ｈ～Ｊ）。このＴＦコードは、間葉系分化におけるそれらの役割を試験する系統追跡実験および研究を容易する。
実施例５．同期した内胚葉および間葉系統の分化経路
ＤＥとＳＥとの転写細胞状態の複雑さは、Ｅ８．５とＥ９．５の間でわずか２４時間で倍増し、これは、前駆細胞がより特殊な細胞型を形成していることを反映している。系統多様化の時間的ダイナミクスを調べるために、力指向グラフ（ｆｏｒｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｒａｐｈ）でｋ最近傍（ｋ－ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）を表すアルゴリズムであるＳＰＲＩＮＧ（図３Ａ～Ｂ）を使用して単一細胞データを可視化し、発生分化経路の解析を容易にした。ＤＥとＳＭの両方の分化経路は、Ｅ８．５での密接に関連する細胞状態の連続から、Ｅ９．５での転写的に異なる細胞集団へと進行し（図３Ａ～Ｂ、３Ｇ）、多能性前駆細胞から器官特異的系統への移行と一致した。重要なことに、ｔＳＮＥによって画定された細胞クラスターはＳＰＲＩＮＧでよく保存されており（図３Ｇ）、クラスタリングのロバスト性を裏付けている。ＳＰＲＩＮＧプロットの構造で明らかな１つの印象的な観察は、２４時間にわたるＳＭとＤＥ系統の多様化の明らかな協調であった。
系統の多様化に関連する発生分化経路をより明確に可視化するために、単一細胞投票法を使用したコンセンサス細胞状態ツリーが生成され、このツリーでは、後の時点の各細胞が、遺伝子発現の類似性に基づいて前の時点の最も可能性の高い親に投票する。次に、すべての細胞投票がクラスターごとに表にされ（図３Ｃ～Ｄ）、これは単純なツリー多様体で表される（図３Ｅ～Ｆ）。離れた細胞型を特定の臓器にもたらすＳＭ移動を除外することはできないが、データは、一般的な前駆細胞集団の細分化から生じる転写的に関連する細胞状態の概念を裏付けていた。わずかに異なる年齢のプールされた胚から時点が生成されたことを考えると、親子関係が特定の時点内に存在する可能性があった。これに対処し、単一細胞の投票結果を確認するために、各分化経路は、細胞集団の前駆細胞の状態を計算で予測する疑似時間分析で評価された（Ｍｏｎｏｃｌｅ；Ｃａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６６，４９６－５０２（２０１９））．一般に、疑似的時間解析は、単一細胞投票と一致した。しかし、肝臓内胚葉の場合、Ｍｏｎｏｃｌｅは、Ｅ９．０内の親子関係を予測し、ここで、Ｈｈｅｘ＋後腸内胚葉（クラスターｅ＿ｂ２）は、Ｐｒｏｘ１／Ａｆｐ＋肝芽細胞（ｅ＿ｂ５）とＰｒｏｘ１／Ｓｏｘ１７／Ｐｄｘ１＋肝膵臓胆管前駆細胞（ｅ＿ｂ７）（図３Ｈ）の両方を生じ、インビトロでの系統追跡実験と一致する。
全体として、単一細胞トランスクリプトームによって推測されるＤＥ軌道は、実験的に決定された予定運命図と一致しており、本明細書での分析のロバスト性を示し、以前は十分に画定されていなかったＳＭ分化経路もまた、系統関係を表し得ることを示唆している。そうは言っても、この類似のトランスクリプトームを有する細胞は必ずしも系統に関連しているとは限らないことに注意されたい。実際、腹側膵臓および背側膵臓などの異なる系統の細胞が、同様の転写プロファイルに収束する場合がある。したがって、ここで提供される結果は、前腸間葉発生ｐの将来の実験的分析のための理論的枠組みを確立する。
実施例６．多能性前駆細胞の協調的発生
ＤＥとＳＭとの分化経路を詳しく調べると、隣接する内胚葉および中胚葉の組織層内の多能性前駆細胞からの協調的な発生が示唆される。例えば、Ｅ８．５では、ＤＥ外側前腸細胞（ｅ＿ａ２）および空間的に隣接するＳＭ細胞（ｍ＿ａ０）の両方がＴＦ Ｏｓｒ１を発現し、軌跡は、これら２つの細胞集団が多能性前駆細胞であり、それぞれ、呼吸器、食道、および胃の上皮と間葉とを生じさせることを予測している（図４Ａ～Ｂ）。発生が進むにつれて、異なる細胞集団は、ＴＦと成長因子を調節する別個の系統を徐々に発現するため、隔離されているように見える（図４Ａ～Ｄ）。インサイチュー検証により、Ｏｓｒ１がＥ９．５で推定食道、肺、および胃の上皮と間葉との両方で発現していることを確認した（図４Ｅ～Ｇ）。
さらに、ＤＥ気管クラスターを詳しく調べると、前腸が背腹軸に沿ってパターン化されているときに、Ｅ９．５で呼吸マーカーＮｋｘ２－１と食道マーカーＳｏｘ２とを共発現する移行上皮細胞集団が示唆された（図４Ｈ～Ｉ）。免疫染色は、これが、最近の研究で気管食道の形態形成に重要であることを実証している、気管食道の前向き境界で実際に稀少なＮｋｘ２－１／Ｓｏｘ２＋細胞集団であることが確認した（図４Ｋ～Ｌ）。要約すると、単一細胞トランスクリプトームから予測された前腸系統の分化経路は、さらなる研究のための貴重なリソースを表している。
実施例７器官誘導のシグナル伝達ロードマップの予測
細胞の運命決定を制御する前腸のパラクリンシグナル伝達微小環境を、計算によって予測した（図５Ａ～Ｂ）。器官形成に関与する６つの主要なシグナル伝達経路：ＢＭＰ、ＦＧＦ、ヘッジホッグ（ＨＨ）、Ｎｏｔｃｈ、レチノイン酸（ＲＡ）、および古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔについて、メタ遺伝子発現プロファイルを、各ＤＥおよびＳＭクラスターのすべてのリガンド、受容体、および状況独立（ｃｏｎｔｅｘｔ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）応答遺伝子に関して計算した（図５Ｊ）。前腸の各細胞集団の空間マップを利用して（図１Ｉ～Ｊ）、Ａ－Ｐ軸に沿った細胞集団は、シグナル伝達図で直接接触する可能性が最も高いＤＥおよびＳＭ細胞タイプが互いに反対になるように順序付けた（図５Ｃ）。次いで、メタ遺伝子発現レベルを使用して、潜在的なリガンド－受容体ペアと、特定の細胞集団が局所的なパラクリンまたはオートクリンシグナルに応答している可能性を予測した（図５Ａ～Ｃ、５Ｋ）。メタ遺伝子発現の閾値は、文献で実験的に検証された相互作用に対してベンチマークにかけた。また、潜在的なリガンド－受容体のペアリングは、これらの経路が比較的短い範囲で作用するという一般的に受け入れられている見解と一致して、近くの細胞クラスターに限定されていた。総合的に、この解析は、仮想のコンビナトリアルシグナリングネットワークを明らかにした（図５Ａ～Ｃ、５Ｋ）。
全体として、計算による予測は、リガンドと受容体の既知の発現パターンで構成され、ＤＥ系統の仕様を制御する最も既知のシグナル伝達相互作用を画定した。これには、ＤＥ肝臓および肺の運命を促進する中胚葉由来のＢＭＰ、ＦＧＦおよびＷｎｔ、およびＤＥ内分泌膵臓におけるオートクリンノッチシグナル伝達を含まれる。これは、以前は定義されていなかったＳＭシグナリング予測も正確である可能性が高いことを示唆している。これを試験するために、例としてＢＭＰシグナル伝達を検討した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと一致して、その場でのハイブリダイゼーションによりｓｔｍおよび呼吸間葉における高レベルのＢｍｐ４リガンド発現が確認されたが、ＢＭＰシグナル伝達の細胞エフェクターであるホスホ－Ｓｍａｄ１／５／８の免疫染色では、予測どおり、発生中の肝臓と呼吸間葉および上皮でそれぞれオートクリンおよびパラクリンシグナル伝達が確認された（図５Ｅ～Ｇ）。
シグナル伝達応答－メタ遺伝子発現レベルは、ＳＰＲＩＮＧプロットと細胞状態ツリーに投影され、これが細胞系統と相関する時空間的に動的なシグナル伝達ドメインが明らかにした（図５Ｄ、５Ｌ）。一般に、トランスクリプトームデータは、ＳＭがＢＭＰ、ＦＧＦ、ＲＡ、およびＷｎｔリガンドの主要な供給源であり、隣接するＤＥとＳＭ自体の両方にシグナル伝達する局所的に制限された相互作用を予測する（図５Ｃ）。これとは対照的に、ＨＨリガンドはＤＥおよび腸管ＳＭへの信号によって産生されるが、ＤＥでのオートクリン活性の証拠はない（図５Ｃ）。６つのシグナル伝達経路すべてのデータを細胞状態ツリーに組み合わせることで、各ＤＥおよびＳＭ系統の時間的および空間的発達を調整すると予測されるコンビナトリアルシグナルの包括的なロードマップを生成した（図５Ｈ～Ｉ）。この解析は、多くのこれまで認められていなかったシグナル伝達の相互作用を予測し、さらなる実験的検証のための仮説を生み出すリソースを表している。
実施例８．前腸間葉パターン化における上皮ヘッジホッグシグナル伝達の役割の試験
シグナル伝達ロードマップの予測値を遺伝子的に試験するために、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって、腸管ＳＭ（食道、呼吸器、胃、十二指腸）では高いが咽頭と肝臓のＳＭでは低いことが示唆されているＨＨ活性を検討した（図６Ａ～Ｃ）。ＨＨリガンドは、Ｇｌｉ２およびＧｌｉ３ ＴＦの活性化を刺激し、Ｇｌｉ２およびＧｌｉ３ ＴＦは、ＨＨ標的遺伝子（例えば、Ｇｌｉ１）の転写を促進する。マウス胚切片は、Ｓｈｈリガンドが腸管ＤＥで発現され、隣接するＳＭで高レベルのＧｌｉ１－ＬａｃＺが発現されていることを確認した。対照的に、肝内胚葉はＳｈｈを発現せず、肝ＳＭにはＧｌｉ１－ＬａｃＺ陽性細胞があったとしてもごくわずかに過ぎなかった（図６Ｄ）。ＳＭパターン形成におけるＨＨの機能を定義するために、バルクＲＮＡ－ｓｅｑを、すべてのＨＨ活性を欠き、呼吸運命を特定できないＧｌｉ２－／－；Ｇｌｉ３－／－二重変異胚の前腸で実施した。ホモ接合変異体をヘテロ接合同腹子と比較することで、１５６個のＨＨ／Ｇｌｉ調節転写物を特定した（図６Ｅ）。このバルクＲＮＡ配列は内胚葉と中胚葉の両方で実行されるという警告を考慮して、これらのＨＨ制御転写物の濃縮をＤＥおよびＳＭ単一細胞クラスターのトランスクリプトームで調べた。これは、ほとんどの転写物がＤＥと比較してＳＭで発現されたことを明らかにした。Ｇｌｉ２／３－変異体でダウンレギュレーションされた転写物（ｎ＝８０）は通常腸管ＳＭで濃縮されたのに対し、アップレギュレーションされた転写物（ｎ＝７６）は通常、肝臓または咽頭ＳＭで濃縮された（図６Ｅ～Ｇ）。興味深いことに、ダウンレギュレーションされたＴＦ（Ｏｓｒ１、Ｔｂｘ４／５、Ｆｏｘｆ１／２）とアップレギュレーションされたＴＦ（Ｔｂｘ１８、Ｌｈｘ２、Ｗｔ１）を含むＨＨ／Ｇｌｉ調節された転写産物は、それぞれ呼吸器および肝臓の発生に関係している（図６Ｅ）。この遺伝子解析は、一部には、ＴＦおよびシグナル伝達タンパク質を特異化する他の系統を調節することにより、差次的なＨＨ活性が肝臓および咽頭ＳＭと対比して腸管ＳＭを促進する、シグナル伝達ロードマップの予測値を確認した（図５Ｉ）。
本明細書で提供されるデータは、相互上皮間葉シグナル伝達ネットワークが器官形成中にＤＥおよびＳＭ系統を協調させるモデルを示唆した。このモデルでは、ＳＭ由来のＲＡは、ＳＭにシグナルを送り返し、広い咽頭、腸管、肝臓のドメインを確立する、Ｅ９．０までにＤＥでＳｈｈの領域的に制限された発現を誘導する。これら３つの広いドメインでの局所的発現の明確な組み合わせを有する、他のＳＭリガンド（ＢＭＰ、ＦＧＦ、Ｎｏｔｃｈ、ＲＡ、およびＷｎｔ）は、次いで協調的な問題でＤＥおよびＳＭ前駆細胞を徐々に細分化する。このモデルは、細胞特異的な遺伝子操作ｐによってテスト試験され得る。
実施例９．ヒトＰＳＣからの臓側間葉様系統の分化。
次いで、本明細書に開示された新しいＳＭマーカーおよびシグナル伝達ロードマップを使用して、これまで分かりにくかったヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの別個のＳＭサブタイプの分化に指向させた。以前の研究では、ｈＰＳＣを側板中胚葉（ｌｐｍ）と心臓組織とに分化させるためのプロトコルが確立されている。ＳＭと心臓の両方がｌｐｍに由来するが、単一細胞データは、マウスでは、初期のＳＭが初期の心臓中胚葉よりも多くのＲＡシグナル伝達を経験することを示唆していた。これは、Ｅ８．５胚におけるＲＡ応答性のＲＡＲＥ：ｌａｃＺ導入遺伝子の発現によって確認された（図７Ｅ）。（ｄ）２～４日目にＬＰＭ分化培地にＲＡを添加すると、心臓マーカーＮＫＸ２－５、ＩＳＬ１、およびＴＢＸ２０をダウンレギュレーションし、ＳＭマーカーＦＯＸＦ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、およびＷＮＴ２を促進しれた（図７Ｂ、７Ｅ）。これは、Ｅ８．５のＳＭが心臓中胚葉よりも低いレベルでＮｋｘ２－５、Ｉｓｌ１、およびＴｂｘ２０を発現することを示すマウスｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと一致している。ＰＡＸ３、ＰＲＲＸ１、およびＣＤ３１の検査は、ｄ４ ＳＭ培養物が有意なレベルの内皮、体細胞、または四肢の間葉マーカーを発現していないことを確認した（図７Ｅ）。
次に、ロードマップに基づいて器官特異的ＳＭ様系統を駆動するために、ｄ４からｄ７までのＨＨ、ＲＡ、Ｗｎｔ、およびＢＭＰアゴニストもしくはアンタゴニストの様々な組み合わせで原始的なＳＭを処理した（図７Ａ）。予測したように、ＨＨアゴニストは腸管同一性を促進し、肝運命を効率的にブロックした。ＨＨ処理培養物では、ｄ６からｄ７までにＲＡおよびＢＭＰ４（ＲＡ／ＢＭＰ４）続いてＷＮＴを添加すると、食道、胃、または肝臓のマーカーの低いレベルで、呼吸間葉（ＮＫＸ６－１、ＴＢＸ５、およびＷＮＴ２）と一致する遺伝子発現を促進した。対照的に、ｄ６からｄ７までにＲＡおよびＢＭＰ４アンタゴニストを添加すると、食道／胃様同一性（ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、およびＮＫＸ３－２）を促進した（図７Ｂ～Ｃ、７Ｆ）。ＨＨアゴニストの非存在下ではＲＡ／ＢＭＰで処理された細胞は、肝臓ｓｔｍおよび中皮（ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２ならびにＵＰＫ１Ｂ）と同様の遺伝子発現プロファイルを有したが、一方ＲＡ／ＢＭＰ４／ＷＮＴ処理細胞は、肝臓－線維芽細胞マーカー（ＭＳＸ１／２およびＨＡＮＤ１）を発現した。免疫染色およびＲＮＡスコープは、ＲＴ－ＰＣＲ分析（図７Ｃ～Ｄ、７Ｆ）が、肝臓ｓｔｍ／中皮様培養物中の約７０～８０％の細胞がＷＴ１＋、ＭＳＸ１－、ＮＫＸ６－１－であったのに対し、他の集団はほぼ３０～４０％であるように見えることが示していることを確認した。残りの細胞は、選択的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）系統ではなく未分化であるように見えた。これらのデータは、マウスｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから推測されるシグナル伝達ロードマップが、ｈＰＳＣｓからの様々な器官特異的ＳＭサブタイプの分化を指向させるために使用できるという証拠を提供する。
実施例１０．材料および方法
胚の収集および単一細胞解離
すべてのマウス実験は、シンシナティ小児病院医療センターの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って実施した。実験前に統計的サンプルサイズの推定は行われず、実験に必要な材料を生成するのに十分な胚が使用された。異なる群で特定の処置が行われなかったため、無作為化は利用されなかった。時限交配をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス間で設定し、膣栓（ｐｌｕｇ）が検出された日を胎生０．５日目とみなした。体節数Ｅ８．５（５～１０の体節［ｓ］）、Ｅ９．０（１２～１５ｓ）、およびＥ９．５（２５～３０ｓ）を数えることにより、段階分類を検証した（図１Ａ～Ｂ）。後方咽頭および中腸の間の前腸を顕微鏡で切開し、心臓と近軸組織の大部分を取り除き、甲状腺を除外した。Ｅ９．５では、肺／食道および肝臓／膵臓の原基をそれぞれ含む前方および後方領域が別々に単離された。切開された前腸組織は、２～３の同腹子から単離された、それぞれＥ８．５、Ｅ９．０、Ｅ９．５の前方、およびＥ９．５後方からの１６、２０、１８、および１５個の胚からプールされた。
冷活性プロテアーゼプロトコルによる単一細胞解離を、当技術分野において既知であるように実施した。迅速に切開したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚組織をピペットで混合しながら氷上で５ｍＭのＣａＣｌ２を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（Ｓｉｇｍａ）および１２５Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を１０ｍｇ／ｍｌの氷冷ＰＢＳに移し、インキュベートした。７分後、顕微鏡で単一細胞解離を確認した。次いで、細胞を１５ｍＬコニカルチューブに移し、１０％のＦＢＳ（ＦＢＳ／ＰＢＳ）を含む３ｍＬの氷冷ＰＢＳを添加した。細胞をペレット化し（１２００Ｇで５分間）、２ｍＬのＰＢＳ／ＦＢＳに再懸濁した。細胞を５ｍＬのＰＢＳ／０．０１％のＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で３回洗浄し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのために最終細胞濃度１００，０００細胞／ｍＬに再懸濁した。各ステージの単細胞懸濁液をＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ装置（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に装填して、エマルジョン中の単細胞ゲルビーズを生成した。ハイスループット配列決定用の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ＬｉｂｒａｒｙとＧｅｌ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。すべての試料は一緒に多重化され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００でシーケンシングした。ＲＮＡ抽出、ライブラリー調製、およびシーケンシングの工程を実行する個人は盲検化された。
免疫蛍光染色、インサイチューハイブリダイゼーションおよびＲＮＡスコープ
示された段階でマウス胚を採取し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃にて一晩固定した。固定された試料をＰＢＳで１０分間、３回洗浄し、必要であれば、前腸を顕微鏡で切開した。次いで、胚または切開された前腸を、抗体染色によって以前に記載されたように処理するか、またはインサイチューハイブリダイゼーション用に処理した。
マウス組織のＲＮＡスコープの場合、固定した胚を３０％のスクロース／ＰＢＳに一晩浸漬し、ＯＣＴ中に包埋し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で凍結切片（１２μｍ）にして、－８０℃で一晩保存した。付着性ｈＰＳＣ培養のＲＮＡスコープの場合、細胞をＧｅｌｔｒｅｘでコーティングしたｕ－Ｓｌｉｄｅ ８ウェル（同書）で分化させ、４％のＰＦＡで室温で３０分間固定した。細胞をエタノール勾配で脱水し、－２０℃で１００％エタノール中で保存した。ＲＮＡスコープ蛍光インサイチューハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｖ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）およびＯｐａｌフルオロフォア（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造元の指示に従って実施した。
１０×ゲノミクス生ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの前処理
生ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（ｖ２．０．０、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ／ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒで入手可能）を使用して処理した。リードをマウスゲノムｍｍ１０］に対してアラインメントさせて、バーコード全体の遺伝子数を算出した。約５ｋ未満のＵＭＩカウンターを有するバーコードは、下流分析には含まれなかった。トランスクリプトームにマッピングされたリードの割合は、各試料で約７０％であった。結果として得られたデータは、Ｅ８．５で９７４８個の細胞、Ｅ９．０で９２６５個の細胞、Ｅ９．５の前方試料で７２０８個の細胞、およびＥ９．５の後方試料で５０８５個の細胞で構成された。
品質管理、次元削減、クラスタリング、およびマーカー予測
その後のＱＣおよびクラスタリングを、ＲのＳｅｕｒａｔ［ｖ２．３．４］パッケージを使用して実行した。基本的なフィルタリングは、すべての遺伝子が３つ以上の細胞を発現し、少なくとも１００個の検出された遺伝子を有するすべての細胞が含まれる場合に実行した。ＱＣは、ミトコンドリア遺伝子発現の高い多胎および細胞を除去するために、ｎＧｅｎｅおよびｐｅｒｃｅｎｔ．ｍｉｔｏパラメーターに基づいていた。フィルタリング後、９７４８、９２６５、および１２２５５個の細胞が、それぞれＥ８．５、Ｅ９．０およびＥ９．５の試料に保持された。グローバルスケーリングを使用して、各試料のすべての細胞のカウントを正規化し［スケール係数：１００００］、デフォルトのパラメーターを使用して正規化されたデータからＳ期とＧ２Ｍ期の差を回帰することにより、細胞周期の影響を取り除いた。まず、主要な細胞系統を特定するために、各発生達段階を別々にクラスター化した。分散対ａｖｇＥｘｐプロットからの外れ値をマークすることにより、各母集団全体で約１５００個の高変動遺伝子群（ｈｉｇｈｌｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ）（ＨＶＧ）を選択した。ＨＶＧを用いてＰＣＡを実行し、最初の２０個の主成分を、細胞クラスタリングに使用し、次いで、これを、ｔ－分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ｔＳＮＥ）を使用して可視化した－。各クラスターを定義するマーカー遺伝子は、Ｓｅｕｒａｔの「ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ」関数（ウィルコクソンの順位和検定）を使用して特定し、これらは、よく知られている細胞型特異的遺伝子に基づいてクラスターにアノテートするために使用した。
３つの時点すべての細胞は、対角化正準相関分析（ＣＣＡ）を使用してＳｅｕｒａｔ（ｖ３．０）と統合され、データセットの次元数を減少させた後、正準相関ベクトル（ＣＣＶ）のＬ２正規化を行った。最後に、細胞を統合するための統合アンカー（細胞ペア）とも称される、相互近傍（ＭＮＮ）を取得した。まず、３０個のＣＣ（正準相関成分）をクラスタリングに使用し、非線形次元削減アプローチ（ＵＭＡＰおよびｔＳＮＥ）を使用して、次元を削減し、細胞を２次元で可視化した。
胚体内胚葉および臓側間葉のためのインシリコ選択およびクラスタリング
胚体内胚葉（ＤＥ）クラスター（４，４４８個の細胞）は、Ｆｏｘａ１／２、Ｃｄｈ１および／またはＥｐｃａｍの共発現によって画定されたが、一方臓側ＳＭ（１０，０９７個の細胞）は、Ｆｏｘｆ１、Ｖｉｍおよび／またはＰｄｇｆｒａの共発現、ならびに心臓、体性および金軸の中胚葉特異的転写物に対して陰性であることによって画定された。ＤＥおよびＳＭクラスターからの細胞を各時点から抽出し、Ｓｅｕｒａｔ［ｖ２．３．４］を使用して再クラスター化して系統サブタイプを画定した。血液を再クラスター化する前に、ミトコンドリア、リボソーム、および株依存性の非コードＲＮＡ遺伝子をデータから回帰させた。次元削減、クラスタリング、およびマーカー予測の工程は、各段階で上記のように実行した。ＤＥおよびＳＭ細胞サブタイプは、クラスターマーカー遺伝子をＭＧＩデータベースに公開されている３００以上の発現プロファイルと比較する手動キュレーション、および独自の遺伝子発現検証によってアノテートされた。上記で説明したＳｅｕｒａｔ（ｖ３．０）統合アプローチを使用して、３つの時点すべてのＤＥクラスターおよびＳＭクラスターを一緒に解析した。
ＤＥおよびＳＭ系統からの転写因子コード
様々なＤＥおよびＳＭ細胞タイプに特異的な発現が豊富なＴＦを特定するために、Ｓｅｕｒａｔ［ｖ３．０］の「ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ」関数を、マウスゲノム［ＡｎｉｍａｌＴＦＤＢ］で発現する１６２３ＴＦのセットで利用した。ＴＦの未加工のカウントを、Ｓｅｕｒａｔ［ｖ３．０］で正規化およびスケーリングした。クラスター内の細胞は、各系統のマーカーＴＦを見つける際の複製として機能した。マーカーＴＦの特定には、ウィルコクソン順位和検定を使用した。次に、Ｓｅｕｒａｔ（ｖ３．０）のＤｉｍＨｅａｔｍａｐ関数を使用して、上位５つのマーカーＴＦを可視化した。
細胞集団の空間的組織化の疑似時間解析
疑似時間解析が組織ＤＥまたはＳＭ組織の連続シート内の細胞の空間構成に情報を与えることができるかどうかを調べるために、ＵＲＤ［ｖ１．０］を使用して疑似時間解析を実行した。まず、疑似時間を計算するために、拡散マップを使用して、各段階でＤＥ細胞とＳＭ細胞の遷移確率を計算した。次に、ｃａｌｃＤＭ関数を使用して拡散マップ成分を生成し、最初の８つの成分を使用して、細胞間の遷移確率を計算した。次に、疑似時間を計算するために、手動アノテーションに基づいて根細胞を最も前方のクラスターに固定した。根細胞から開始して、グラフ内のすべての細胞にアクセスするまで、遷移確率を使用した確率的幅優先グラフ探索（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｂｒｅａｄｔｈ－ｆｉｒｓｔ ｇｒａｐｈ ｓｅａｒｃｈ）を実行した。複数のシミュレーションを実行し、疑似時間は、根細胞からグラフの各細胞にアクセスした平均反復に等しくなった。ＵＲＤの次の関数を使用して、疑似時間を計算した（「ｆｌｏｏｄＰｓｅｕｄｏｔｉｍｅ」および「ｆｌｏｏｄＰｓｕｅｄｏｔｉｍｅＰｒｏｃｅｓｓ」）。最後に、ｐｌｏｔＤｉｓｔｓ関数を使用して、クラスター／細胞型ごとに疑似時間の密度分布をプロットした。ＡＰ軸に沿った細胞型の手動でキュレートされた順序と同様に、疑似時間の順序付けられたクラスターの密度分布。
細胞分化経路のＳＰＲＩＮＧ分析
３つの時点にわたる細胞分化経路を調べるために、ｋ近傍（ＫＮＮ）グラフ（５つの近傍）を使用するＳＰＲＩＮＧ［ｖ１．０］を実行して、細胞およびそれらの近傍の力指向（ｆｏｒｃｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）レイアウトを取得した。細胞状態（系統）全体の転写変化を理解するために、最初の４０個の主成分（ＰＣ）が最新の時点Ｅ９．５から学習され、このＰＣスペースを使用してデータセット全体（Ｅ８．５、Ｅ９．０、およびＥ９．５）を返還した。この変換されたデータは、距離行列を生成するために使用され、次に、デフォルトのパラメーターを使用してＫＮＮグラフを取得した。
親子単一細胞投票による細胞状態ツリーの推測
単純な転写細胞状態ツリーで分化経路を視覚化するために、ＫＮＮ分類アルゴリズムに基づく親子単一細胞投票アプローチを使用した。最初に、すべてのＤＥまたはＳＭクラスターからの識別マーカー遺伝子を各段階の特徴として使用して、正規化されたカウントマトリックスを生成した。マーカー遺伝子は、ＫＮＮをトレーニングするための特徴として使用され、その間、ＫＮＮは、特徴の表現に基づいてトレーニングセット内の細胞間の距離を学習する。各細胞を、Ｓｅｕｒａｔクラスターの割り当てに基づいて分類した。後の時点の細胞は、次のように前の時点で最も可能性の高い親細胞に投票し、Ｅ８．５細胞を使用してＫＮＮをトレーニングし、Ｅ８．５細胞に投票するＥ９．０細胞で試験する。ＫＮＮは、Ｅ８．５の各クラスターに対するＥ９．０の各細胞の投票確率をもたらし、その後、Ｅ８．５の各クラスターに対するＥ９．０の各クラスターの投票確率を平均化した。このアプローチを、Ｅ９．５の細胞がＥ９．０の親に投票することで繰り返した。特定のクラスターの平均投票確率を表にして、クラスターサイズに対して正規化され、混同行列の総投票数の割合として表した。後の時点を前の時点にリンクする最高得票数は、ツリー上に実線で表示された。得票数の>６０％の傑出した２番目の選択は、破線としてツリーに報告された。この投票確率は、転写細胞状態ツリーを評価するために、ＫＮＮから得られた混同行列とも比較した。９９％を超える場合、これら２つの方法では、最初と２番目の選択が同じになり、推定された親子関係が検証された。
疑似時間分析を使用して細胞状態ツリーアサーションを検証するために、Ｍｏｎｏｃｌｅ［ｖ３．０．０］を、個々の系統／細胞状態に対して展開させた。ｔＳＮＥを次元削減に使用し、原理グラフを、ＳｉｍｐｌｅＰＰＴを使用して学習した。他のすべてのパラメーターはデフォルトに設定された。
メタ遺伝子プロファイルの計算
前腸の器官形成に関係する６つの主要なパラクリンシグナル伝達経路（ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＨＨ、Ｎｏｔｃｈ、ＲＡ、および古典的Ｗｎｔ）について、マウスゲノムでコード化されたすべての確立されたリガンド、受容体、および状況非依存性経路応答遺伝子のリストを精選した。次に、「リガンド－メタ遺伝子」、「受容体－メタ遺伝子」、および「応答－メタ遺伝子」プロファイルを、下記のように、各細胞およびクラスターにおける各経路の個々の遺伝子の正規化された発現を合計することによって計算した（例えば、Ｗｎｔ－リガンドメタ遺伝子＝Σ（Ｗｎｔ１＋Ｗｎｔ２＋Ｗｎｔ２ｂ＋Ｗｎｔ３／／／Ｗｎｔ１０ｂ発現））。
遺伝子セット中にｘ個の遺伝子およびｎ個の細胞があると仮定する。Ｇｅｎｅ１は（ａ１、ａ２…ａｎ）カウントを有し、Ｇｅｎｅ２は（ｂ１、ｂ２…ｂｎ）カウントを有するなどである。
工程１：各遺伝子のカウントは、すべてのＤＥおよびＳＭ細胞（ｎ＝１４，５４５個の細胞）に対する遺伝子の最大カウントを使用して正規化された：Ｇｅｎｅ１＿ｎｏｒｍ＝（ａ１、ａ２・・・ａｎ）／ｍａｘ（ａ１、ａ２・・・ａｎ）。
工程２：正規化された遺伝子カウントを細胞ごとに合計して、細胞に対するカウントを含むメタ遺伝子＿ｖ１を生成した：メタ遺伝子＿ｖ１＝Ｇｅｎｅ１＿ｎｏｒｍ＋Ｇｅｎｅ２＿ｎｏｒｍ＋・・・＋Ｇｅｎｅｘ＿ｎｏｒｍ。推定される合計カウントは、ｍ１、ｍ２・・・ｍｎである。
工程３：メタ遺伝子＿ｖ１の合計カウントは、メタ遺伝子＿ｖ１の最大カウントによって正規化され、各細胞のメタ遺伝子プロファイルを作成した：ＭｅｔａＧｅｎｅ＝（ｍ１、ｍ２・・・ｍｎ）／ｍａｘ（ｍ１、ｍ２・・・ｍｎ）。次に、各ＤＥおよびＳＭクラスターのリガンド、受容体、および応答遺伝子の平均メタ遺伝子発現プロファイルを、「ＡｖｅｒａｇｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」関数を使用してＳｅｕｒａｔ［ｖ３．０］で計算した。すべてのＤＥおよびＳＭクラスターに対するメタ遺伝子の平均発現プロファイルは、Ｓｅｕｒａｔを使用してドットプロットとして可視化させた。メタ遺伝子発現プロファイルの平均発現は、ドットプロットの可視化のために－２から２にスケーリングされた。
受容体－リガンド相互作用の予測
所与の細胞型を、平均リガンド－メタ遺伝子または受容体－メタ遺伝子発現レベルが≧－１であり、細胞の≧２５％で発現される場合、シグナルを送るのに十分なリガンドまたはリガンドに応答するのに十分な受容体を発現するようにスコア付けした。（すべての細胞での全体的な発現が低いため、≧－１．５の発現閾値が使用されたＮｏｔｃｈリガンド－メタ遺伝子を除く）。これらの閾値は、経験的に保存的に設定され、ＤＥ肝臓、肺、膵臓で実験的に検証されたシグナル伝達相互作用に対してベンチマークされた。さらに、特定の細胞集団が、≧－１である状況非依存性経路応答－メタ遺伝子発現レベルに基づいて応答しており、細胞の≧２５％で発現している可能性を決定した。状況非依存性応答遺伝子は、リガンド－受容体活性化に応答しているほとんどの細胞型で直接転写されることが当技術分野で知られている遺伝子である。
各段階のＤＥおよびＳＭクラスターは、ＡＰ軸に沿って順序付けられており、図では空間的に隣接するＤＥおよびＳＭ細胞型を使用してインビボでの気管原基の位置と一致している。各細胞クラスターに受容体－リガンド相互作用を割り当てるために、特定のクラスターが応答メタ遺伝子および受容体メタ遺伝子レベルが≧－１の閾値を有していることに基づいて応答しているかどうかを判定した。応答するクラスターがリガンド－メタ遺伝子レベル≧－１も発現した場合、オートクリンシグナル伝達が確立された。パラクリンシグナル伝達については、同じ組織層内および閾値を超えるリガンド－メタ遺伝子を発現する隣接層からの隣接する細胞集団が同定され、受容体－リガンド相互作用が確立された。シグナル強度は、リガンド－メタ遺伝子と応答－メタ遺伝子の値の合計として計算した。この値が≧１の場合、シグナルは「強い」とみなされた。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑ対ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの比較
前腸組織を、Ｅ９．５の二重変異体Ｇｌｉ２－／－；Ｇｌｉ３－／－（ｎ＝３）およびＧｌｉ２＋／－；Ｇｌｉ３＋／－ヘテロ接合同腹子対照（ｎ＝３）から切開した。切開された各前腸を、ＲＮＡ抽出、ライブラリー調製、およびバルクＲＮＡ－ｓｅｑに別々に使用した。これらのマウスは混合系統であり、胚の性別は不明であった。ＣＳＢＢ［ｖ３．０］（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂでｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｓｂｂｃｏｍｐｂｉｏ／ＣＳＢＢ－ｖ３．０で入手可能）パイプラインを使用して、マウスゲノム［ｍｍ１１０］にアラインメントし、２つの遺伝子型間で差次的に発現する転写物を、ＲＵＶＳｅｑ（ＬｏｇＦＣ≧｜１｜およびＦＤＲ≦０．１）を使用して取得した。差次的に発現する遺伝子を、階層的クラスタリングを使用してクラスタリングし、試料に対してＭｏｒｐｈｅｕｓ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｍｏｒｐｈｅｕｓで入手可能）で可視化させた。
バルク分析をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑと比較するために、細胞に対して差次的に発現する遺伝子の発現をｓｃＣｌｕｓｔｅｒｓで可視化させた。Ｓｅｕｒａｔの「ＤｏＨｅａｔｍａｐ」関数を使用した。細胞は、それぞれのクラスターの前軸／後軸の位置に従って配置し、遺伝子は、上記で得られたクラスター化の順序から戻るように順序付けした。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）［ｖ３．０］もまた、腸管ＳＭ（呼吸器、食道、胃、十二指腸）、咽頭、および肝臓のＳＭクラスターで差次的に発現する遺伝子の統計的濃縮を調べるためにも実行した。ＧＳＥＡ解析を実行するためのカスタム遺伝子セットとして、細胞に対する遺伝子の正規化されたカウントおよびバルクＲＮＡシーケンスからのアップ／ダウンレギュレーションされた遺伝子を使用した。
ＰＳＣの維持
この研究では、２つのｈＰＳＣ株；１）ＷｉＣｅｌｌから購入したＷＡ０１－Ｈ１ヒト胚性幹細胞（ＮＩＨ承認番号、ＮＩＨｈＥＳＣ－１０－００４３およびＮＩＨｈＥＳＣ－１０－００６２）と、２）ＣＣＨＭＣ多能性幹細胞施設によって生成されたヒトｉＰＳＣ７２＿３と、を使用した。両方の細胞株は次のように認証されている：ｉ）細胞同一性；Ｇｅｎｅｔｉｃａ ＤＮＡ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙによるＳＴＲプロファイリングによる、ｉｉ）遺伝的安定性；ＣＣＨＭＣ細胞遺伝学研究所における標準的分裂注記スプレッドおよびＧバンド核型分析による、およびｉｉｉ）機能的多能性；細胞が奇形腫アッセイによる機能的多能性の分析に供され、３つの胚葉のそれぞれに分化する能力を示す。両方の細胞株を、マイコプラズマ汚染について陰性であることを日常的に試験した。ｈＰＳＣ株を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた６－ウェルＮｕｎｃｌｏｎ表面板（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上のｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でフィーダーフリー条件で維持し、５％のＣＯ２で３７℃にてｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。細胞を毎日チェックし、分化した細胞を手動で除去した。ディスパーゼ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、４日ごとに細胞を継代させた。
ＰＳＣの間葉への分化
ｈＰＳＣの側板中胚葉への分化は、変更を加えた前述の方法を使用して誘導させた。簡単に説明すると、部分的にコンフルエントなｈＰＳＣをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で非常に細かい塊に分離し、免疫細胞化学用の新しいＧｅｌｔｒｅｘコーティング２４ウェルプレートと１μＭのチアゾビビン（Ｔｏｃｒｉｓ）を含むｍＴｅＳＲ１でのＲＮＡ調製用の１２ウェルプレートに１：１８で継代した（１日目）。翌日、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で簡単に洗浄した後、０日目の培地（３０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、４０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１００ｎＭのＰＩＫ９０（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で２４時間洗浄した。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、Ｂ２７、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタチオン、ペニシリン－ストレプトマイシンから構成される基本培地を、この０日目の培地とその後のすべての分化に使用した。１日目に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で簡単に洗浄した後、１日目の培地（１μＭのＡ８３０１（Ｔｏｃｒｉｓ）、３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１μＭのＣ５９（Ｃｅｌｌａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））で２４時間洗浄した。心臓中胚葉生成のために、細胞を１μＭのＡ８３０１、３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１μＭのＣ５９、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２で、２日目から４日目まで培養した（培地は毎日交換）。４日目から、細胞を２００μｇ／ｍＬの２－ホスホ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、１μＭのＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ）、３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４で３日間培養した。臓側中胚葉生成のために、細胞を１μＭのＡ８３０１、３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１μＭのＣ５９、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、２μＭのＲＡ（Ｓｉｇｍａ）で、２日目から４日目まで培養した（培地は毎日交換）。局所臓側中胚葉をさらに指向させるために、次のいずれかを行う：（１）２μＭのＲＡ、４０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を使用してＳＴＭ運命を３日間促進させる、（２）２μＭのＲＡ、２μＭのプルモルファミン（ＰＭＡ）（Ｔｏｃｒｉｓ）を２日間使用し、最後の１日で２μＭのＲＡ、２μＭのＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して食道／胃間葉運命を促進させる、（３）２μＭのＲＡ、４０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、２μＭのＰＭＡを２日間使用し、次いで最後の１日で２μＭのＲＡ、４０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、２μＭのＰＭＡ、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１を使用して呼吸間葉運命を促進させる。培地は、毎日交換した。ＷＡ－０１ｈＥＳ細胞およびヒトｉＰＳＣ ７２＿３でも同様の結果が得られた。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎキットを製造元のプロトコルに従って使用して、分化中のヒトＥＳ細胞から総ＲＮＡを調製した。逆転写ＰＣＲを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットによって実行した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５および６を、ｑＰＣＲ分析に使用した。統計を、ＰＲＩＳＭ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実行した。有意性を、一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの検定によって決定した。
免疫細胞化学
細胞を４％のＰＦＡ／ＰＢＳで室温で３０分間固定した。０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで１０分間穿孔した後、細胞を５％の正常ロバ血清で２時間インキュベートした。細胞を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄した後、二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。
データおよびコードの可用性
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ｂａｍ、ｒａｗカウント、細胞アノテーションを含む）は、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）：ＧＳＥ１３６６８９およびＧＳＥ１３６６８７で入手可能である。すべてのコード（スクリプト、Ｒパッケージ、およびソフトウェア）とそれらドキュメントは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＺｏｒｎＬａｂ／Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ－ｒｅｖｅａｌｓ－ａ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ－ｒｏａｄｍａｐ－ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ－ｅｎｄｏｄｅｒｍ－ａｎｄ－ｍｅｓｏｄｅｒｍ－ｌｉｎｅａｇｅにアップロードされている。寄託されたすべてのコードは、ＧＰＬｖ３．０で使用できる。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／ＺｏｒｎＬａｂ－ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ．ｐで調べることができる。
前述の実施形態の少なくともいくつかでは、実施形態で使用される１つ以上の要素は、そのような置き換えが技術的に実現可能でない場合を除いて、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者は、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および構造に対して、他の様々な省略、付加、および改変を行うことができることを理解されよう。そのようなすべての改変および変更は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、主題の範囲内に含まれることが意図されている。
本明細書における実質的にすべての複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切であるように、複数から単数へと、および／または単数から複数へと言い換えることができる。明確にするために、様々な単数／複数の置き換えを本明細書において明確に説明することができる。
「例えば（ｅ．ｇ．）」の使用に関して、それは「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」を意味すると理解され、したがって非限定的な例である。
通常、本明細書および特に添付された特許請求の範囲（例えば、添付された特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、一般に「オープンな」用語として意図されている（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、典型的には「含むがこれに限定されない」と解釈され、用語「有する」は、典型的には「少なくとも有する」と解釈され、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、典型的には「含むがこれに限定されない」と解釈されるなど）ことを当業者は理解するであろう。導入される請求項の詳述の具体的な数が意図されている場合には、そのような意図は、この請求項で明示的に詳述され、そのような詳述が存在しない場合にはそのような意図は存在しないことを当業者はさらに理解するであろう。例えば、理解の補助として、下記の添付された特許請求の範囲は、請求項の詳述を導入するために、導入的語句「少なくとも１つ」および「１つ以上」の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような語句の使用は、典型的には、同じ請求項が導入的語句「１つ以上」または「少なくとも１つ」および「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による請求項の詳述の導入が、そのように導入される請求項の詳述を含む任意の特定の請求項を、ただ１つのそのような詳述を含む実施形態に限定することを意味すると解釈され（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきであり）、同じことが、請求項の詳述を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、導入される請求項の詳述の具体的な数が明示的に詳述されている場合、そのような詳述は、典型的には、少なくとも詳述された数を意味する（例えば、その他の修飾語句なしでの「２つの詳述」という単なる詳述は、少なくとも２つの詳述または２つ以上の詳述を意味する）と解釈されることを当業者は認識するであろう。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つなど」に類似する慣習が使用される場合では、通常、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステムなどが含まれるがこれらに限定されないであろう）。Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つなど」に類似する慣習が使用されている場合では、通常、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステムなどが含まれるがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語および／または離接語句も、典型的には、用語のうちの１つ、用語のいずれかまたは両方の用語を含む可能性を企図すると理解されることを当業者はさらに理解するであろう。例えば、語句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループによって説明されている場合、これにより、本開示は、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても説明されることを当業者は認識するであろう。
当業者に理解され得るように、文書として記述するという観点などのあらゆる目的のために、本明細書で開示されているすべての範囲は、あらゆる可能な部分範囲およびこれらの部分範囲の組み合わせも包含する。列挙されているあらゆる範囲を、少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分解される同じ範囲を十分に説明して可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じる各範囲を、下３分の１、中３分の１および上３分の１などに容易に分解することができる。当業者にも理解され得るように、「最大」、「少なくとも」、「超」、「未満」などのすべての言葉は、詳述される数を含み、上記で論じたように後に部分的範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解され得るように、範囲は個々の各メンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の物品を有するグループは、１個、２個、または３個の物品を有するグループを指す。同様に、１～５個の物品を有するグループは、１個、２個、３個、４個、または５個などの物品を有するグループを指し、以下同様である。
本明細書では様々な態様および実施形態が開示されているが、当業者にはその他の態様および実施形態が明らかであるだろう。本明細書で開示されている様々な態様および実施形態は説明を目的としており、限定していることを意図されておらず、真の範囲および趣旨は下記の特許請求の範囲で示される。
公開および未公開の出願、特許、および文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用されるすべての参考文献は、本明細書で参照される任意の特定の開示およびそれらの全体の参照により本明細書に組み込まれ、これにより、本明細書の一部となる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、明細書は、そのような矛盾する資料に優先する、および／または優先することを意図している。
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Ｃａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６６，４９６－５０２（２０１９）．
Ｉｂａｒｒａ－Ｓｏｒｉａ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｍｕｒｉｎｅ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，１２７－１３４（２０１８）．
Ｐｉｊｕａｎ－Ｓａｌａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｐ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６６，４９０－４９５（２０１９）．
Ｂａｒｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ Ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｉｎｔｅｒ－ａｎｄ Ｉｎｔｒａ－ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ３，３４６－３６０ ｅ３４４（２０１６）．
Ｌｉ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｏｒｓａｌ／ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｓ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ １９（２０１８）．
Ｎｏｗｏｔｓｃｈｉｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５６９，３６１－３６７（２０１９）．
Ｂｕｌｔ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＧＤ）２０１９．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ８０１－Ｄ８０６（２０１９）．
Ｓｃｉａｌｄｏｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５３５，２８９－２９３（２０１６）．
Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０（２０１８）．
Ｍｏｉｇｎａｒｄ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｂｌｏｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，２６９－２７６（２０１５）．
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｙ．&Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３８，２９－４２（２００９）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ Ｎｋｘ６．１ ｌｉｅｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｎｋｘ２．２ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７，５５３３－５５４０（２０００）．
Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｋｘ６ ｇｅｎｅｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｎ Ｐｄｘ１．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２８８，４８７－５０１（２００５）．
Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｃ．，Ｗｏｌｏｃｋ，Ｓ．&Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｍ．ＳＰＲＩＮＧ：ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｈｉｇｈ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３４，１２４６－１２４８（２０１８）．
Ｅｌ Ｓｅｂａｅ，Ｇ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｍｕｒｉｎｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｆａｔｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｍｕｌｔｉ－ｏｒｇａｎ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５（２０１８）．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｘ１７ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｏｒｇａｎ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｔｒａｌ ｆｏｒｅｇｕｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７，６２－７４（２００９）．
Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｉｏｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｐｏｒｔａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １２５，５８７－６００（２００８）．
Ｋｉｍ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｌ１ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｋｘ２．１ ｉｎ ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｆｏｒｅｇｕｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｒａｃｈｅａ－Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｌｏｂａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ５１，６７５－６８３ ｅ６７４（２０１９）．
Ｎａｓｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｓｏｍｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ－Ｇｌｉ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｒａｃｈｅｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ５１，６６５－６７４ ｅ６６６（２０１９）．
Ｚａｒｅｔ，Ｋ．Ｓ．Ｆｒｏｍ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｔｏ Ｌｉｖｅｒ Ｂｕｄ：Ｐａｒａｄｉｇｍｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １１７，６４７－６６９（２０１６）．
Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ－Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｃａｓｃａｄｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ Ｍｅｓｏｄｅｒｍ－Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｌｕｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６，６６－７８（２０１６）．
Ｒｕｂｉｎ，Ｌ．Ｌ．&ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ５，１０２６－１０３３（２００６）．
Ｂｏｒｔ，Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｂａｒｂｅｒａ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．&Ｚａｒｅｔ，Ｋ．Ｓ．Ｈｅｘ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，７９７－８０６（２００４）．
Ａｂｅ，Ｔ．&Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ｔ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｕｓｅ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ５５，３９０－４０５（２０１３）．
Ｌｏｈ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｃｈｏｉｃｅｓ Ｌｅａｄｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ，Ｈｅａｒｔ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｅｓｏｄｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅｓ．Ｃｅｌｌ １６６，４５１－４６７（２０１６）．
Ｋｉｍ，Ｂ．Ｍ．，Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｌｅｔｉｃｈ，Ｉ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｐ．Ｔ．&Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｒ．Ａ．Ｔｈｅ ｓｔｏｍａｃｈ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｂａｒｘ１ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ８，６１１－６２２（２００５）．
Ａｒｏｒａ，Ｒ．，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｒ．Ｊ．&Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，Ｖ．Ｅ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｂｘ４ ａｎｄ Ｔｂｘ５ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ８，ｅ１００２８６６（２０１２）．
Ｅｒｋａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇａｎ－，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ－ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９，８８（２０１０）．
Ｈｏｒｉｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＴＢＸ４ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｄｒｉｖｅｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１４，Ｌ１７７－Ｌ１９１（２０１８）．
Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｌｕｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｂａｓｏｐｈｉｌ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １７５，１０３１－１０４４ ｅ１０１８（２０１８）．
Ｘｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２，３６２５－３６４０（２０１８）．
Ａｓａｈｉｎａ，Ｋ．，Ｚｈｏｕ，Ｂ．，Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．&Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｓｅｐｔｕｍ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｕｍ ｇｉｖｅｓ ｒｉｓｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３，９８３－９９５（２０１１）．
Ｑｕｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｕｍ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ ｄｕｒｉｎｇ ｌｕｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，１６６２６－１６６３０（２００８）．
Ｓｉｍｏｅｓ，Ｆ．Ｃ．&Ｒｉｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．Ｔｈｅ ｏｎｔｏｇｅｎｙ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｃａｒｄｉｕｍ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｒｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５（２０１８）．
Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｅ．&Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｌｉｎｅａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ ｍｅｅｔｓ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｏｍｉｃｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ（２０２０）．
Ｐｅｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃｏ－ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５００，５８９－５９２（２０１３）．
Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ａ．Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ－Ｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．&Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．Ｐ．ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｆｏｒ ａｔｒｉａｌ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６，１７６１ １７７０（２００９）．
Ａｄａｍ，Ｍ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ａ．Ｓ．&Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓ．Ｓ．Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｓｉｎｇｌｅ－ ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｒｔｉｆａｃｔｓ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｔｌａｓ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４，３６２５－ ３６３２（２０１７）．
Ｈａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｏｓｒ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆｏｒｅｇｕｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１７）．
Ｂｕｔｌｅｒ，Ａ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｐ．，Ｓｍｉｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｐａｐａｌｅｘｉ，Ｅ．&Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｄａｔａ ａｃｒｏｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，４１１－４２０（２０１８）．
Ｓｔｕａｒｔ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｄａｔａ．Ｃｅｌｌ １７７，１８８８－１９０２ ｅ１８２１（２０１９）．
Ｈｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＡｎｉｍａｌＴＦＤＢ ３．０：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ３３－Ｄ３８（２０１９）．
Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＰＧＣ－１ａｌｐｈａ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｒｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３４，２６７－２７３（２００３）．

Claims (94)

  1. 臓側中胚葉細胞を産生する方法であって、
    側板中胚葉細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、およびレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
  2. 前記臓側中胚葉細胞が、ヒト臓側中胚葉細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記側板中胚葉細胞が、中間原始ストリーム細胞（ｍｉｄｄｌｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｍ ｃｅｌｌ）から分化している、請求項１～２に記載の方法。
  4. 前記側板中胚葉細胞が、中間原始ストリーク細胞（ｍｉｄｄｌｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ ｃｅｌｌ）を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させることによって、中間原始ストリーク細胞から分化している、請求項３に記載の方法。
  5. 前記中間原始ストリーク細胞が、多能性幹細胞から分化している、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記中間原始ストリーク細胞が、前記多能性幹細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害物質と接触させることによって、多能性幹細胞から分化している、請求項５に記載の方法。
  7. 前記側板中胚葉細胞が、Ａ８３０１、ＢＭＰ４、Ｃ５９、ＦＧＦ２、ＲＡ、またはそれらの任意の組み合わせと接触する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記側板中胚葉細胞が、側板中胚葉細胞を臓側中胚葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間接触される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記側板中胚葉細胞が、４８時間であるか、または約４８時間である時間接触される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記臓側中胚葉細胞が、心臓中胚葉細胞と比較して、ＦＯＸＦ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加、およびＮＫＸ２－５、ＩＳＬ１、もしくはＴＢＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記臓側中胚葉細胞が、中間原始ストリーク細胞と比較して、ＰＡＸ３もしくはＰＲＲＸ１、またはそれらの両方の発現の減少、および／あるいは心臓中胚葉細胞と比較して、ＣＤ３１の発現の減少を示す、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 横中隔細胞を産生する方法であって、臓側中胚葉細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
  13. 前記臓側中胚葉細胞が、請求項１～１１のいずれか一項に記載の臓側中胚葉細胞である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ＢＭＰ４、またはそれらの両方と接触される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を横中隔細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記横中隔細胞が、心臓中胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは線維芽細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、ＵＰＫ３Ｂ、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記横中隔細胞が、心臓中胚葉細胞もしくは線維芽細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記横中隔細胞が、臓側中胚葉細胞と比較して、ＨＯＸＡ１もしくはＴＢＸ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記横中隔細胞が、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの両方の発現の減少を示す、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記横中隔細胞が、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記横中隔細胞が、前記臓側中胚葉細胞から分化した全細胞の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を占める、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 線維芽細胞を産生する方法であって、臓側中胚葉細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
  24. 前記臓側中胚葉細胞が、請求項１～１１のいずれか一項に記載の臓側中胚葉細胞である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記線維芽細胞が、肝臓線維芽細胞である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を線維芽細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記線維芽細胞が、臓側中胚葉細胞もしくは横中隔細胞、またはそれらの両方と比較して、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＨＡＮＤ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記線維芽細胞が、横中隔細胞と比較して、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記線維芽細胞が、呼吸間葉細胞と比較して、ＮＫＸ６．１、ＨＯＸＡ５、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記線維芽細胞が、食道／胃間葉細胞と比較して、ＮＫＸ３．２、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、もしくはＨＯＸＡ５、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 呼吸間葉細胞を産生する方法であって、ａ）臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路活性化因子、およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
  34. 前記臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 工程ａ）が第２の工程であり、前記第２の工程の前に前記臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第１の工程について、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第１の工程について４８時間であるか、または約４８時間である期間接触される、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第２の工程について、臓側中胚葉細胞を呼吸間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第２の工程について２４時間であるか、または約２４時間である期間接触される、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記臓側中胚葉細胞が、請求項１～１１のいずれか一項に記載の臓側中胚葉細胞である、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ＢＭＰ４、ＰＭＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記呼吸間葉細胞が、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは食道／胃間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＮＫＸ６－１、ＴＢＸ５、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、ＦＯＸＦ１、ＬＨＸ２、もしくはＷＮＴ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記呼吸間葉細胞が、横中隔細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＷＴ１、ＴＢＸ１８、ＬＨＸ２、もしくはＵＰＫ１Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記呼吸間葉細胞が、線維芽細胞と比較して、ＷＮＴ２、ＭＳＸ１、もしくはＭＳＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 食道／胃間葉細胞を産生する方法であって、ａ）臓側中胚葉細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子、およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させることを含む、方法。
  47. 前記臓側中胚葉細胞が、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記臓側中胚葉細胞が、７２時間であるか、または約７２時間である期間接触される、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 工程ａ）が第２の工程であり、前記第２の工程の前に臓側中胚葉細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子およびＨＨシグナル伝達経路活性化因子と接触させる第１の工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第１の工程について、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第１の工程について４８時間であるか、または約４８時間である期間接触される、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第２の工程について、臓側中胚葉細胞を食道／胃間葉細胞に分化させるのに十分な時間、および／あるいは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６時間であるか、または約それらである時間、あるいは前述の時間のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の期間接触される、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記臓側中胚葉細胞が、前記第２の工程について２４時間であるか、または約２４時間である期間接触される、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記臓側中胚葉細胞が、請求項１～１１のいずれか一項に記載の臓側中胚葉細胞である、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記臓側中胚葉細胞が、ＲＡ、ノギン、ＰＭＡ、またはそれらの任意の組み合わせと接触される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記食道／胃間葉細胞が、心臓内胚葉細胞、臓側中胚葉細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＭＳＣ、ＢＡＲＸ１、ＷＮＴ４、ＨＯＸＡ１、ＦＯＸＦ１、もしくはＮＫＸ３－２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の増加を示す、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記食道／胃間葉細胞が、横中隔細胞、線維芽細胞、もしくは呼吸間葉細胞、またはそれらの任意の組み合わせと比較して、ＷＮＴ２、ＴＢＸ５、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、もしくはＬＨＸ２、またはそれらの任意の組み合わせの発現の減少を示す、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、Ａ８３０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６５９４７、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、Ａ８３０１である、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質が、１μＭまたは約１μＭの濃度で接触される、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、Ｃ５９、ＰＮＵ７４６５４、ＫＹ－０２１１１、ＰＲＩ－７２４、ＦＨ－５３５、ＤＩＦ－１、およびＸＡＶ９３９からなる群から選択される、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、Ｃ５９である、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、１μＭまたは約１μＭの濃度で接触される、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、ＩＤＥ１、およびＩＤＥ２からなる群から選択される、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、ＢＭＰ４である、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬ、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路活性化因子が、３０ｎｇ／ｍＬまたは約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、ＦＧＦ２である、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬ、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｇ／ｍＬの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、２０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される、請求項１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＣＤ４３７、ＥＣ２３、ＢＳ４９３、ＴＴＮＰＢ、およびＡＭ５８０からなる群から選択される、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、ＲＡである、請求項１～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３，２．４，２．５，２．６，２．７，２．９、もしくは３μＭ、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３，２．４，２．５，２．６，２．７，２．９、もしくは３μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＲＡシグナル伝達経路活性化因子が、２μＭまたは約２μＭの濃度で接触される、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＢＭＬ２８４、ＩＱ－１、ＷＡＹ２６２６１１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＢＩＯ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、アロイシン、インジルビン、アルスターパウロン、ケンパウロン、塩化リチウム、ＴＤＺＤ８、およびＴＷＳ１１９からなる群から選択される、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭ、または約０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、ＳＨＨ、ＩＨＨ、ＤＨＨ、ＰＭＡ、ＧＳＡ１０、およびＳＡＧからなる群から選択される、請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、ＰＭＡである、請求項１～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭ、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、もしくは３μＭの濃度で、あるいは前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＨＨシグナル伝達経路活性化因子が、２μＭまたは約２μＭの濃度で接触される、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、ノギン、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、ＬＤＮ１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、ノギンである、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎｇ／ｍＬ、または約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０ｎｇ／ｍＬ、あるいは前述の濃度のいずれか２つで定義された範囲内の任意の濃度で接触される、請求項１～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、１００ｎｇ／ｍＬまたは約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で接触される、請求項１～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、臓側中胚葉細胞。
  91. 請求項１２～２２のいずれか一項に記載の方法によって産生された、横中隔細胞。
  92. 請求項２３～３２のいずれか一項に記載の方法によって産生された、線維芽細胞。
  93. 請求項３３～４５のいずれか一項に記載の方法によって産生された、呼吸間葉細胞。
  94. 請求項４６～５７のいずれか一項に記載の方法によって産生された、食道／胃間葉細胞。
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