JP2023543890A - オルガノイド組換え - Google Patents

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Abstract

本明細書に開示されるのは、上皮成分と間葉成分との異種の組み合わせを有するオルガノイド組成物、並びに異なる供給源からの上皮成分及び間葉成分を解離及び組換えることによってそれを作製する方法である。これらの上皮成分及び間葉成分は、同じ又は異なる細胞型又はオルガノイド型に由来し得る。これらのオルガノイド組成物は、有利な特性、例えば、増強されたインビボ生着を呈し得る。【選択図】 図２Ａ

Description

連邦政府が後援する研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＤＫ１０３１１７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
発明の属する技術分野
本開示の態様は、概して、オルガノイドなどの細胞組成物の上皮成分及び間葉成分の解離及び組み合わせを含む、オルガノイド組成物及びそれを作製する方法に関する。
オルガノイド、特に多能性幹細胞に由来するものは、インビボ組織に酷似しており、薬物スクリーニング、移植、及び個別化医療などの多くの用途において大きな可能性を有することが示されている。しかしながら、既存の方法によって産生されたオルガノイドは、インビボ組織と比較して、ある特定の特性、例えば、分化したオルガノイドにおいて見られる上皮系統と間葉系統との比において依然として制限されている。本出願人の最初の研究は、多能性幹細胞が、インビボ生着を支持する胚体内胚葉と間葉とに分化することを可能にする方法を特定した。これらのパターン形成された構造は、近位小腸を反映し、ヒト腸オルガノイド（Human Intestinal Organoid、ＨＩＯ）と呼ばれる。前腸（例えば、ヒト胃オルガノイド［human gastric organoid、ＨＧＯ］）及び後腸（例えば、ヒト結腸オルガノイド［human colonic organoid、ＨＣＯ］）をインビトロでパターン形成するための最近の方法は、上皮対間葉比における異型遺伝子性をもたらす。改善された上皮／間葉比及び形態を有するオルガノイド、並びにそれを作製する方法が現在必要とされている。
本開示の一態様は、複合オルガノイドを産生する方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のオルガノイドから単離された単一解離（mono-dissociated）間葉細胞を得ることと、オルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造を得ることと、単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせることと、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造を培養して、複合オルガノイドを形成することと、を含む。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞、若しくは上皮構造、又は両方は、機械的解離及び濾過によって単離される。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞及び上皮構造は、遠心分離によって組み合わされる。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドにおける間葉細胞の数は、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの間葉細胞の元の数よりも多く、その結果、複合オルガノイドは、濃縮された間葉を有する。いくつかの実施形態において、１）単一解離した間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、及び２）上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドは各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、異なる。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とは異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成は起こらず、その結果、複合オルガノイドの上皮は、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、上皮構造が、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢であるオルガノイド、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるオルガノイドに由来する場合、上皮構造の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、上皮構造がエンテロイドに由来する場合、上皮構造の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、成体組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とは異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が起こり、その結果、複合オルガノイドの上皮は、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型の特性を呈する。いくつかの実施形態において、上皮構造が８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下であるオルガノイド、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢であるオルガノイドに由来する場合、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成は、起こり得る。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、明確なパターン形成を有する成体組織に由来し、エンテロイドに由来する上皮構造は、単一解離間葉細胞と組換えられた場合であっても、それらの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、同じである。いくつかの態様において、１つ以上のオルガノイド及びオルガノイド又はエンテロイドは各々、食道、胃、肝臓、腸、又は結腸組織型のうちの１つのみを含み、その結果、得られる複合オルガノイドは、１つの組織型を含む同種オルガノイドである。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイドは、第１の対象からの多能性幹細胞（pluripotent stem cell、ＰＳＣ）に由来し、オルガノイド又はエンテロイドは、第２の対象からのＰＳＣに由来するか、又は第２の対象からの胃腸組織から単離される。いくつかの実施形態において、第１の対象及び第２の対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、第１の対象及び第２の対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、第１の対象及び第２の対象は、同じ個体である。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかの実施形態において、方法は、複合オルガノイドをレシピエント対象に移植することを更に含む。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、第１の対象又は第２の対象である。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドと比較して、レシピエント対象においてより大きな生着及び成長を呈する。
複合オルガノイドも本明細書に開示される。複合オルガノイドは、第１のオルガノイドから単一解離細胞として単離された間葉細胞を含む間葉と、第２のオルガノイド又はエンテロイドから上皮構造として単離された上皮細胞を含む上皮と、を含む。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドにおける間葉細胞対上皮細胞の数の比は、第２のオルガノイド又はエンテロイドの比よりも大きい。いくつかの実施形態において、第１のオルガノイド及び第２のオルガノイド又はエンテロイドは各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む。いくつかの実施形態において、第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、同じである。いくつかの実施形態において、第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、異なる。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生されたオルガノイドである。
食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第１の組織型を含む間葉と、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第２の組織型を含む上皮と、を含む複合オルガノイドも本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、第１の組織型及び第２の組織型は、少なくとも１つの組織型の差異を有する。
胃腸疾患の治療を必要とする対象においてそれを行うための、本明細書に開示されるオルガノイドのうちのいずれか１つの使用も本明細書に開示される。
候補治療剤をスクリーニングする方法であって、本明細書に開示されるオルガノイドのうちのいずれか１つを、候補治療剤と接触させることと、オルガノイドに対する候補治療剤の効果を決定することと、を含む、方法も本明細書に開示される。
本明細書で提供される本開示の実施形態は、以下の番号が付けられた代替案によって説明される。
１．複合胃腸オルガノイドを産生する方法であって、
ａ）第１の組織型の１つ以上の胃腸オルガノイドから単一解離間葉細胞を単離することと、
ｂ）第２の組織型の胃腸オルガノイド又はエンテロイドから上皮構造を単離することと、
ｃ）単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせることと、
ｄ）組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造を培養して、複合胃腸オルガノイドを形成することと、を含み、
単一解離間葉細胞の数が、第２の型の胃腸オルガノイドの間葉細胞の元の数よりも多く、複合胃腸オルガノイドが、濃縮された間葉を有する、方法。
２．単一解離間葉細胞、若しくは上皮構造、又は両方が、機械的解離及び濾過によって単離される、代替案１に記載の方法。
３．単一解離間葉細胞及び上皮構造が、遠心分離によって組み合わされる、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
４．第１の組織型及び第２の組織型が、各々独立して、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸からなる組織型の群、又は前述のうちのいずれかの組み合わせである組織型から選択される、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
５．第１の組織型及び第２の組織型が、同じであり、結果として生じる複合胃腸オルガノイドの組織型が、同種オルガノイドである、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
６．第１の組織型及び第２の組織型が、異なり、結果として生じる複合胃腸オルガノイドの組織型が、異種オルガノイドである、代替案１～４のいずれか１つに記載の方法。
７．第１の型の１つ以上の胃腸オルガノイドが、第１の対象からの多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来し、胃腸オルガノイド又はエンテロイドが、第２の対象からのＰＳＣに由来するか、又は第２の対象からの胃腸組織から単離される、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
８．第１の対象及び第２の対象が、哺乳動物である、代替案７に記載の方法。
９．第１の対象及び第２の対象が、ヒトである、代替案７又は８に記載の方法。
１０．第１の対象及び第２の対象が、同じ個体である、代替案７～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．複合胃腸オルガノイドをレシピエント対象に移植することを更に含む、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
１２．レシピエント対象が、第１の対象又は第２の対象である、代替案１１に記載の方法。
１３．複合胃腸オルガノイドが、第１の型の１つ以上の胃腸オルガノイドの同等の非複合オルガノイド、又は第２の型の胃腸オルガノイド若しくはエンテロイドの同等の非複合オルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方と比較して、レシピエント対象においてより大きな生着及び成長を呈する、代替案１１又は１２に記載の方法。
１４．複合胃腸オルガノイドであって、
第１の供給源の胃腸オルガノイドからの細胞を含む間葉と、
第２の供給源の胃腸オルガノイド又はエンテロイドからの上皮と、を含み、
複合胃腸オルガノイドにおける間葉細胞対上皮細胞の数の比が、第２の型のオルガノイド若しくはエンテロイドの比よりも大きく、かつ／又は第１の供給源の組織型が、第２の供給源の組織型と異なる、方法。
１５．第１の胃腸型及び第２の胃腸型が、各々、食道型、胃型、肝臓型、腸型、若しくは結腸型、又はそれらの任意の組み合わせを含む、代替案１４に記載の胃腸オルガノイド。
１６．第１の胃腸型及び第２の胃腸型が、同じであり、複合胃腸オルガノイドが、同種オルガノイドである、代替案１４又は１５に記載の胃腸オルガノイド。
１７．第１の胃腸型及び第２の胃腸型が、異なり、複合胃腸オルガノイドが、異種オルガノイドである、代替案１４又は１５に記載の胃腸オルガノイド。
１８．代替案１～１３のいずれか１つに記載の方法によって産生された、複合胃腸オルガノイド。
１９．胃腸疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための、代替案１４～１８のいずれか１つに記載の胃腸オルガノイド。
２０．複合オルガノイドを産生する方法であって、
ａ）１つ以上のオルガノイドから単一解離間葉細胞を単離することと、
ｂ）オルガノイド又はエンテロイドから上皮構造を単離することと、
ｃ）単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせることと、
ｄ）組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造を培養して、複合オルガノイドを形成することと、を含む、方法。
２１．単一解離間葉細胞、若しくは上皮構造、又は両方が、機械的解離及び濾過によって単離される、代替案２０に記載の方法。
２２．単一解離間葉細胞及び上皮構造が、遠心分離によって組み合わされる、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
２３．複合オルガノイドにおける間葉細胞の数が、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの元の数よりも多く、その結果、複合オルガノイドが、濃縮された間葉を有する、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
２４．単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、及び上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
２５．１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型が、異なる、代替案２４に記載の方法。
２６．１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型が、同じである、代替案２４に記載の方法。
２７．１つ以上のオルガノイド及びオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、又は結腸組織型のうちの１つのみを含み、その結果、得られる複合オルガノイドが、１つの組織型を含む同種オルガノイドである、代替案２６に記載の方法。
２８．１つ以上のオルガノイドが、第１の対象からの多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来し、オルガノイド又はエンテロイドが、第２の対象からのＰＳＣに由来するか、又は第２の対象からの胃腸組織から単離される、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
２９．第１の対象及び第２の対象が、哺乳動物である、代替案２８に記載の方法。
３０．第１の対象及び第２の対象が、ヒトである、代替案２８又は２９に記載の方法。
３１．第１の対象及び第２の対象が、同じ個体である、代替案２８～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．複合オルガノイドをレシピエント対象に移植することを更に含む、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
３３．レシピエント対象が、第１の対象又は第２の対象である、代替案３２に記載の方法。
３４．複合オルガノイドが、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドと比較して、レシピエント対象においてより大きな生着及び成長を呈する、代替案３２又は３３に記載の方法。
３５．複合オルガノイドであって、
第１のオルガノイドから単離された単一解離間葉細胞を含む間葉と、
第２のオルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造を含む上皮と、を含む、複合オルガノイド。
３６．複合オルガノイドにおける単一解離間葉細胞対上皮細胞の数の比が、第２のオルガノイド又はエンテロイドの比よりも大きい、代替案３５に記載のオルガノイド。
３７．第１のオルガノイド、及び第２のオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、代替案３５又は３６に記載のオルガノイド。
３８．第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型が、同じである、代替案３７に記載のオルガノイド。
３９．第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型が、異なる、代替案３７に記載のオルガノイド。
４０．代替案２０～３４のいずれか１つに記載の方法によって産生された、オルガノイド。
４１．胃腸疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための、代替案３５～４０のいずれか１つに記載のオルガノイド。
本明細書で提供される本開示の追加の実施形態が、以下の追加の番号が付けられた代替案によって説明される。
複合オルガノイドを産生する方法であって、
ａ）１つ以上のオルガノイドから単離された単一解離間葉細胞を得ることと、
ｂ）オルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造を得ることと、
ｃ）単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせることと、
ｄ）組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造を培養して、複合オルガノイドを形成することと、を含む、方法。
単一解離間葉細胞を得ることが、１つ以上のオルガノイドから単一解離間葉細胞を単離することを含む、代替案１に記載の方法。
上皮構造を得ることが、オルガノイド又はエンテロイドから上皮構造を単離することを含む、代替案１又は２に記載の方法。
単一解離間葉細胞、若しくは上皮構造、又は両方が、機械的解離及び濾過によって単離される、代替案１～３のいずれか１つに記載の方法。
単一解離間葉細胞及び上皮構造が、遠心分離によって組み合わされる、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
複合オルガノイドにおける間葉細胞の数が、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの元の数よりも多く、その結果、複合オルガノイドが、濃縮された間葉を有する、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
１）単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、及び２）上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
１）単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドが、腸組織型を含み、２）上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドが、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドが、小腸オルガノイド、任意選択で、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）である、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とが、異なる、実施形態７～９のいずれか１つに記載の方法。
単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とが、異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が、起こらず、その結果、複合オルガノイドの上皮が、オルガノイド又はエンテロイドの組織型を維持し、
任意選択で、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドが、オルガノイドであり、上皮構造が単離されるオルガノイドが、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるか、
あるいは任意選択で、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドが、エンテロイドであり、エンテロイドが、成体組織に由来する、代替案１０に記載の方法。
上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドが、オルガノイドであり、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイドの組織型とが、異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が、起こり、その結果、複合オルガノイドの上皮が、１つ以上のオルガノイドの組織型の特性を呈し、任意選択で、上皮構造が単離されるオルガノイドが、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢である、代替案１０に記載の方法。
単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とが、同じである、代替案７～９のいずれか１つに記載の方法。
１つ以上のオルガノイド、及びオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、又は結腸組織型のうちの１つのみを含み、その結果、得られる複合オルガノイドが、１つの組織型を含む同種オルガノイドである、代替案１３に記載の方法。
１つ以上のオルガノイドが、第１の対象からの多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来し、オルガノイド又はエンテロイドが、第２の対象からのＰＳＣに由来するか、又は第２の対象からの胃腸組織から単離される、前述の代替案のいずれかに記載の方法。
第１の対象及び第２の対象が、哺乳動物である、代替案１５に記載の方法。
第１の対象及び第２の対象が、ヒトである、代替案１５又は１６に記載の方法。
第１の対象及び第２の対象が、同じ個体である、代替案１５～１７のいずれか１つに記載の方法。
複合オルガノイドをレシピエント対象に移植することを更に含む、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
レシピエント対象が、第１の対象又は第２の対象である、代替案１９に記載の方法。
複合オルガノイドが、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドと比較して、レシピエント対象においてより大きな生着及び成長を呈する、代替案１９又は２０に記載の方法。
１）単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、又は２）上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方が、１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含むように操作される、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
１）単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、又は２）上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方が、遺伝子変異を含み、任意選択で、遺伝子変異が、疾患状態又は疾患状態のモデルに関連する、前述の代替案のいずれか１つに記載の方法。
複合オルガノイドであって、
第１のオルガノイドから単一解離細胞として単離された間葉細胞を含む間葉と、
第２のオルガノイド又はエンテロイドから上皮構造として単離された上皮細胞を含む上皮と、を含む、複合オルガノイド。
複合オルガノイドにおける間葉細胞対上皮細胞の数の比が、第２のオルガノイド又はエンテロイドの比よりも大きい、代替案２４に記載の複合オルガノイド。
第１のオルガノイド、及び第２のオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、代替案２４又は２５に記載の複合オルガノイド。
第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型が、同じである、代替案２６に記載の複合オルガノイド。
第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型が、異なる、代替案２６に記載の複合オルガノイド。
間葉細胞が単離される第１のオルガノイドの組織型と、上皮細胞が単離される第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型とが、異なり、間葉細胞による上皮細胞の再パターン形成が、起こらず、その結果、複合オルガノイドの上皮が、上皮細胞が単離される第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型を維持し、
任意選択で、第２のオルガノイド又はエンテロイドが、第２のオルガノイドであり、第２のオルガノイドが、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるか、あるいは
任意選択で、第２のオルガノイド又はエンテロイドが、第２のエンテロイドであり、第２のエンテロイドが、成体組織に由来する、代替案２８に記載の複合オルガノイド。
第２のオルガノイド又はエンテロイドが、第２のオルガノイドであり、間葉細胞が単離される第１のオルガノイドの組織型と、上皮細胞が単離される第２のオルガノイドの組織型とが、異なり、間葉細胞による上皮細胞の再パターン形成が、起こり、その結果、複合オルガノイドの上皮が、間葉細胞が単離される第１のオルガノイドの組織型の特性を呈し、任意選択で、第２のオルガノイドが、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下であるか、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢である、代替案２８に記載の複合オルガノイド。
複合オルガノイドであって、
食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第１の組織型を含む間葉と、
食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第２の組織型を含む上皮と、を含み、
第１の組織型及び第２の組織型が、少なくとも１つの組織型の差異を有する、複合オルガノイド。
１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含む、代替案２４～３１のいずれか１つに記載の複合オルガノイド。
複合オルガノイドが、遺伝子変異を有するか、又は遺伝子変異を含むように操作されており、任意選択で、遺伝子変異が、疾患状態又は疾患状態のモデルに関連する、代替案２４～３２のいずれか１つに記載の複合オルガノイド。
代替案１～２３のいずれか１つに記載の方法によって産生された、オルガノイド。
胃腸疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための、代替案２４～３４のいずれか１つに記載のオルガノイド。
候補治療剤をスクリーニングするための方法であって、代替案２４～３４のいずれか１つに記載のオルガノイドを、候補治療剤と接触させることと、オルガノイドに対する候補治療剤の効果を決定することと、を含む、方法。
オルガノイドが、遺伝子修飾され、任意選択で、疾患又はそのモデルを呈するように遺伝子修飾される、代替案３６に記載の方法。
オルガノイドの間葉及び／又は上皮が、遺伝子修飾され、任意選択で、疾患又はそのモデルを呈するように遺伝子修飾される、代替案３６又は３７に記載の方法。
本明細書に記載の特徴に加えて、追加の特徴及び変形例は、以下の図面及び例示的な実施形態の説明から容易に明らかになるであろう。これらの図面は実施形態を描写しており、範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
解離／組換えプロトコルの重要なステップの代表的な図の実施形態を示す。１４日目のＨＩＯからの手動解離の前（上）及び後（下）のインビトロオルガノイドの代表的な写真（パネルＡ）。遠心分離後の単一解離間葉及び１つの上皮構造を含有する９６ウェルプレートウェルの画像（パネルＢ）。マトリゲル中にプレーティングする前の組換えの２４時間後の複合オルガノイドの画像（パネルＣ）。 ＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮異種オルガノイドの形成の実施形態を示す。画像は、組換えの４８時間後及び９日後の異種オルガノイドの組織化を示す。ＨＣＯ上皮は、ＧＦＰ蛍光に対して陽性である。 マウスモデルの腎被膜組織へのＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮異種オルガノイドの生着の実施形態を示す。異種オルガノイドは、ＨＩＯオルガノイドと同等であり、ＨＣＯオルガノイドよりも大きい確実な成熟及び生着を呈する。 １８日目の供給源オルガノイドに由来するＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮異種オルガノイドが、大腸特異的特殊ＡＴリッチ配列結合タンパク質２（special AT-rich sequence binding protein 2、ＳＡＴＢ２）に対して陽性であり、小腸特異的スクラーゼ－イソマルターゼ（sucrase-isomaltase、ＳＩ）に対して陰性であることを示す免疫蛍光画像の実施形態を示し、この年齢でのＨＣＯに由来する上皮構造がその大腸同一性を維持していることを示す。 １１日目の供給源オルガノイドに由来するＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮異種オルガノイドが、（１８日目の供給源オルガノイドと比較して）小腸特異的ＧＡＴＡ結合タンパク質４（GATA binding protein 4、ＧＡＴＡ４）に対して陽性であり、結腸特異的ＳＡＴＢ２に対して陰性であることを示す免疫蛍光画像の実施形態を示し、この年齢でのＨＣＯに由来する上皮構造が周囲の間葉によって再プログラミングされ得る（例えば、大腸上皮を小腸同一性に変化させる）ことを示す。 ＨＩＯ－間葉／ＨＧＯ－上皮異種オルガノイドの形成の実施形態を示す。画像は、組換えの４日後及び１１日後の異種オルガノイドの組織化を示す。免疫蛍光染色により、ＧＦＰ陽性腸間葉及びＣＤＨ１陽性胃上皮の成熟が確認される。 ＨＩＯ－間葉／エンテロイドオルガノイドの形成の実施形態を示す。画像は、組換えの１０日後、２１日後、及び３１日後の異種オルガノイドの組織化を示す。エンテロイドは、ＧＦＰ蛍光に対して陽性である。 異なるタイプの異種オルガノイドの形成、及びマウスモデルの腎被膜への生着を示す画像の実施形態を示す。ＨＩＯ－間葉／ＨＩＯ－上皮（パネルＡ）、ＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮（パネルＢ）、及びＨＩＯ－間葉／ＨＡＧＯ－上皮（パネルＣ）異種オルガノイドを試験した。ＨＩＯ－間葉－エンテロイド（パネルＤ）、ＨＡＧＯ－間葉／ＨＡＧＯ－上皮（パネルＥ）、及びＨＣＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮（パネルＦ）オルガノイドも形成される。ＨＡＧＯ及びＨＣＯ同種オルガノイドは、多数の供給源オルガノイドからのＨＡＧＯ又はＨＣＯ間葉細胞を濃縮し、これらの間葉細胞を上皮構造と組換えることによって調製した。 ＧＦＰ陽性ＨＩＯ間葉とＧＦＰ陰性ＨＥＯ上皮との間のインビトロでの組換え４８時間後に撮影された画像の実施形態を示す。 ＮＳＧマウスの腎被膜下への移植の８週間後の組換えＨＩＯ／ＨＥＯ移植片の画像の実施形態を示す。 移植されたＨＩＯ／ＨＥＯ組織のＨ&Ｅ染色の実施形態を示す。 生着後の組換えの純度を示すＧＦＰ及びＣＤＨ１染色の実施形態を示す。 基底層（ＫＲＴ５及びＫＲＴ１４）、基底上層（ＫＲＴ１３及びＩＶＬ）を含む食道上皮の発達及び成熟、並びに食道特異的転写因子ｐ６３に対する陽性を明らかにする、移植されたＨＩＯ／ＨＥＯ組織の免疫染色の実施形態を示す。
前腸（例えば、ヒト胃オルガノイド［ＨＧＯ］）及び後腸（例えば、ヒト結腸オルガノイド［ＨＣＯ］）をインビトロでパターン形成するための最近の方法は、これらの構造のインビボでの生着能を防止又は制限する、上皮対間葉比における異型遺伝子性をもたらす。本明細書において、出願人は、頑強な間葉の欠如が動物モデルにおける生着の成功率を低下させることを示し、従来のオルガノイドの限界のうちの１つ以上に対処するための改善された間葉を有する方法及び組成物を開示する。
本明細書に開示されるのは、複合オルガノイド及びその組成物、並びに上皮成分及び間葉成分を解離及び再会合（組換え）させて、改善された上皮と間葉との比、及び形態を有するオルガノイドを形成することを含む、それを作製する方法である。これらのオルガノイドは、薬物スクリーニング又は個別化医療などの目的に使用することができ、例えば、ヒト若しくは他の哺乳動物などの対象への自家移植若しくは同種異系移植、又は免疫無防備状態の動物への異種移植に好適である。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、複合胃腸オルガノイドである。他の実施形態において、複合オルガノイドは、他の組織型の複合オルガノイド、例えば、脳、神経、筋肉、甲状腺、心臓、肺、腎臓、又は膵臓オルガノイドである。いくつかの実施形態において、上皮成分及び間葉成分は、胚性腸発達を模倣する段階的アプローチを用いて多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来するドナーオルガノイドに由来するか、又はＰＳＣに由来するか、若しくはドナー対象からの胃腸組織から単離されたエンテロイドに由来する。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、支持間葉細胞によって取り囲まれた分極上皮を含む三次元構造を有する。いくつかの実施形態において、複合オルガノイド若しくはドナーオルガノイド、又は両方は、腸オルガノイド、結腸オルガノイド、胃オルガノイド、前庭胃（antral gastric）オルガノイド、胃底オルガノイド、肝臓オルガノイド、若しくは膵臓オルガノイド、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上皮成分は、患者由来のエンテロイドに由来する。いくつかの実施形態において、複合オルガノイド若しくはドナーオルガノイド、又は両方は、ヒトである。オルガノイド又はエンテロイドを産生する方法は、米国特許第９，７１９，０６８号及び同第１０，１７４，２８９号、並びにＰＣＴ国際公開第２０１６／０６１４６４号、同第２０１７／１９２９９７号、同第２０１８／１０６６２８号、同第２０１８／２００４８１号、同第２０１８／０８５６１５号、同第２０１８／０８５６２２号、同第２０１８／０８５６２３号、同第２０１８／２２６２６７号、同第２０１９／０７４７９３号、同第２０２０／０２３２４５号で見ることができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、典型的には、類似の記号は類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般に記載され、図に示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、結合、分離、及び設計することができ、それらは全て、本明細書に明示的に企図されることが容易に理解されよう。
用語
別段の定めがない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者による本開示に照らして読まれたときに一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の目的のために、次の用語を以下に説明する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
「約」は、参照する量（quantity）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（amount）、重量又は長さに対し１０％と同程度に変動する量（quantity）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（amount）、重量又は長さを意味する。
この明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと」という言葉は、記載されたステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素のグループを包含することを意味するが、いかなる他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素のグループも排除しないことを意味することが理解されよう。「からなる（consisting of）」とは、「からなる（consisting of）」という語句に続くものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。「本質的にからなる（consisting essentially of）」とは、この語句の前に列挙されたあらゆる要素の包含を意味しており、他の要素は、この列挙された要素に関して本開示で明示される活性若しくは作用を妨げない又はこの活性若しくは作用に寄与しないものに限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列挙された要素が必要であり（required）、又は必須（mandatory）であるが、その他の要素は任意選択的であり、列挙された要素の活性若しくは作用に実質的な影響を及ぼすか否かに応じて存在してもよく、又は存在しなくてもよいことを示す。
本明細書で使用される「個体」、「対象」、又は「患者」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類、又はトリ、例えば、ニワトリ、並びに他の脊椎動物又は無脊椎動物を意味する。「哺乳動物」という用語は、通常の生物学的意味で使用される。したがって、これには、具体的には、サル（チンパンジー、類人猿、サル）及びヒトを含む霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモット等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「有効量」又は「有効用量」という用語は、明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、観察可能な効果をもたらす記載された組成物又は化合物のその量を指す。現在開示されている主題の活性組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象及び／又は用途に対して所望の応答を達成するのに有効である活性組成物又は化合物の量を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、組成物の活性、配合物、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、及び治療される対象の身体的状態並びに病歴が挙げられるが、これらに限定されない様々な因子に依存するであろう。いくつかの実施形態において、最小用量が投与され、用量制限毒性がない場合、用量は最小有効量に増量される。本明細書では、有効用量の決定及び調整、並びにそのような調整をいつどのように行うかの評価が企図されている。
本明細書で使用される「機能」及び「機能的」という用語は、本明細書に照らして理解されるような明白で通常の意味を有し、生物学的、酵素的、又は治療的機能を指す。
本明細書で使用される「阻害する」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、生物学的活性の減少又は防止を指すことができる。減少は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるパーセンテージ、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある量であり得る。本明細書で使用される場合、「遅延」という用語は、明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、生物学的事象の、そうでない場合に予想されるよりも遅い時間への遅れ、延期、又は延期を指す。遅延は、約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるパーセンテージ、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある量の遅延であり得る。阻害及び遅延という用語は、必ずしも１００％の阻害又は遅延を示すとは限らない。部分的な阻害又は遅延が実現され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、（１）最初に産生されたとき（自然界及び／又は実験環境で）に、それが関連付けられた構成成分の少なくともいくつかから分離されている、かつ／又は（２）人間の手によって産生、調製、及び／若しくは製造されたときにそれが関連付けられた成分の少なくともいくつかから分離されている、物質及び／又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、それらが最初に関連していた他の成分の１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、若しくは１００％と等しい、約前述の値である、少なくとも前述の値である、少なくとも約前述の値である、前述の値以下である、又は約前述の値以下であるもの（又は前述の値を含む及び／又はまたがる範囲）から分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、又は１００％純粋と等しい、約前述の値である、少なくとも前述の値である、少なくとも約前述の値である、前述の値以下である、又は約前述の値以下（又は前述の値を含む及び／又はまたがる範囲）である。本明細書で使用される場合、「単離された」物質は、「純粋」であり得る（例えば、他の成分を実質的に含まない）。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物又は組織に含まれない細胞を指してもよい。
本明細書で使用される場合、「インビボ」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、組織抽出物又は死んだ生物とは対照的に、生きている生物、通常は動物、ヒトを含む哺乳動物、及び植物内での方法の実施を指す。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、自然条件のほとんど変化のない生体外での方法の実行を指す。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、生物学的条件の外、例えばペトリ皿又は試験管内での方法の実施を指す。
本明細書で使用される「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）又はリボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）等のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、自然に細胞内に現れるもの、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、及びライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のうちのいずれかによって産生されたフラグメントを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ等）であるモノマー、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー形態）、又は両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有することができる。糖修飾には、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による置換が含まれるか、又は糖をエーテル若しくはエステルとして官能化することができる。更に、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環式糖類似体等の立体的並びに電子的に類似した構造に置き換えることができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体によって結合することができる。ホスホジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、又はホスホルアミデートが挙げられる。「核酸分子」という用語はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、これは、ポリアミド骨格に結合した天然に存在する又は修飾された核酸塩基を含む。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。「オリゴヌクレオチド」は、核酸と互換的に使用することができ、二本鎖若しくは一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを指すことができる。核酸（複数可）は、様々な生物学的システムにおける核酸（複数可）の増幅及び／又は発現に使用することができる核酸ベクター又は核酸構築物（例えば、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、フォスミド、ファージミド、細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome、ＢＡＣ）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome、ＹＡＣ）、又はヒト人工染色体（human artificial chromosome、ＨＡＣ））中に含有され得る。典型的には、ベクター又は構築物はまた、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インデューサー、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、複製起点、クローニング部位、多重クローニング部位、制限酵素部位、エピトープ、レポーター遺伝子、選択マーカー、抗生物質選択マーカー、標的化配列、ペプチド精製タグ、若しくはアクセサリー遺伝子、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないエレメントも含有するであろう。
核酸又は核酸分子は、異なるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする１つ以上の配列を含むことができる。これらの１つ以上の配列は、同じ核酸若しくは核酸分子内で隣接して、あるいは例えばリンカー、リピート、若しくは制限酵素部位間の余分な核酸と、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００個の塩基長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さである任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用される核酸に関する「下流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の前の配列の３’末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「上流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の後続の配列の５’末端の前にある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「グループ化」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、直接、あるいは例えばリンカー、リピート、若しくは制限酵素部位間の余分な核酸、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００個の塩基長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さである任意の他の配列とのいずれかで近接して生じるが、一般に、機能的若しくは触媒的ポリペプチド、タンパク質、又はタンパク質ドメインをコードする、間にある配列とは生じない２つ以上の配列を指す。
本明細書に記載の核酸は、核酸塩基を含む。一次、標準、天然、又は未修飾の塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルである。他の核酸塩基としては、プリン、ピリミジン、修飾核酸塩基、５－メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ブロモウラシル、イソグアニン、イソシトシン、アミノアリル塩基、色素ラベル付け塩基、蛍光塩基、又はビオチンラベル付け塩基が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される高分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質の多くの機能は当技術分野で知られており、酵素、構造、輸送、防御、ホルモン、又はシグナル伝達が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、常にではないが、多くの場合、核酸テンプレートを使用してリボソーム複合体によって生物学的に産生されるが、化学合成も利用できる。核酸テンプレートを操作することにより、２つ以上のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質の置換、欠失、短縮、付加、複製、又は融合等のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質変異を実行することができる。２つ以上のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のこれらの融合は、同じ分子内で隣接して、あるいは、例えばリンカー、リピート、エピトープ、若しくはタグ間の余分なアミノ酸、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、若しくは３００個の塩基長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さである任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「下流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、前の配列のＣ末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「上流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、後続の配列のＮ末端の前にある配列を指す。
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の、有効量の細胞組成物、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又はそれらの組み合わせを含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物に関する。本明細書に記載の医薬組成物は、ヒト及び／又は獣医学の用途に好適である。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、用いられる投与量及び濃度で細胞又は哺乳動物に曝露されている細胞又は哺乳動物に対して無毒であるか、又は許容可能なレベルの毒性を有する担体、賦形剤、及び／又は安定剤を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される」「希釈剤」、「賦形剤」、及び／又は「担体」は、本明細書に照らして理解されるようなそれらの明白かつ通常の意味を有し、ヒト、ネコ、イヌ、又は他の脊椎動物宿主への投与と適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことを意図している。典型的には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、ヒト並びにネコ及びイヌなどの非ヒト哺乳動物を含む動物で使用するために、連邦政府、州政府の規制当局、若しくは他の規制当局によって承認されるか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に列挙されている。希釈剤、賦形剤、及び／又は「担体」という用語は、医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指すことができる。そのような医薬希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、石油、動物、植物又は合成由来のものを含む、水及び油等の無菌液体であり得る。水、生理食塩水、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液は、特に注射可能な溶液のために、液体希釈剤、賦形剤、及び／又は担体として用いることができる。好適な医薬希釈剤及び／又は賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。生理学的に許容される担体の非限定的な例は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体はまた、アスコルビン酸等の抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、アミノ酸、グルコース、マンノース、デキストリン等の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、ナトリウム等の塩形成対抗剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）のうちの１つ以上を含み得る。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤等の形態をとることができる。製剤は、典型的には、投与方法に適合している。
抗凍結剤は、大きな氷の結晶の形成を防ぐことにより、低温凍結保存の効率及び収率を向上させるための細胞組成添加剤である。抗凍結剤には、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、トレハロース、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、グリセロール３－リン酸、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、スクロース、トリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、又はヒドロキシエチルスターチが含まれるが、これらに限定されない。抗凍結剤は、細胞の解凍後の生存率を高めるための栄養素（例えば、アルブミン、血清、ウシ血清、ウシ胎児血清［ＦＣＳ］）などの他の成分を含む凍結保存培地の一部として使用され得る。これらの凍結保存培地において、少なくとも１つの抗凍結剤は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下である濃度、あるいは前述の数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージで見出され得る。
望ましい特性を有する追加の賦形剤には、保存剤、アジュバント、安定剤、溶媒、緩衝液、希釈剤、可溶化剤、洗浄剤、界面活性剤、キレート剤、抗酸化剤、アルコール、ケトン、アルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）、クエン酸、塩、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム糖、デキストロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、ソルビトール、セルロース、血清、アミノ酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、オクチルフェノールエトキシレート、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、ゼラチン、エステル、エーテル、２－フェノキシエタノール、尿素、又はビタミン、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの賦形剤は、血清、アルブミン、オボアルブミン、抗生物質、不活性化剤、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、β－プロピオラクトン、ゼラチン、細胞破片、核酸、ペプチド、アミノ酸、又は成長培地成分又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、製造プロセスからの残留量又は汚染物質であり得る。賦形剤の量は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％ｗ／ｗであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるパーセンテージ、又は前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の重量パーセンテージで組成物中に見られ得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に照らして理解されるように、その平易で通常の意味を有し、鎮痛剤、治療剤、他の材料等を含むがこれらに限定されない、組成物又は賦形剤の比較的非毒性の無機及び有機酸又は塩基付加塩を含む。薬学的に許容される塩の例には、塩酸及び硫酸等の鉱酸に由来するもの、及びエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機酸に由来するものが含まれる。塩の形成のために好適な無機塩基の例には、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛等の水酸化物、炭酸塩、及び重炭酸塩が含まれる。塩はまた、毒性がなく、そのような塩を形成するのに十分強いものを含む、好適な有機塩基で形成され得る。例えば、そのような有機塩基のクラスには、メチルアミン、ジメチルアミン、及びトリエチルアミンを含む、モノ－、ジ－、及びトリアルキルアミン、モノ－、ジ－、及びトリエタノールアミンを含む、モノ－、ジ－、又はトリヒドロキシアルキルアミン、グリシン、アルギニン、及びリジンを含む、アミノ酸、グアニジン、Ｎ－メチルグルコサミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｌ－グルタミン、Ｎ－メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、トリヒドロキシメチルアミノエタンが含まれ得るが、これらに限定されない。
適切な製剤は、選択した投与経路によって異なる。本明細書に記載の化合物の製剤及び投与のための技術は、当業者に知られている。化合物を投与する複数の技術が、経腸、経口、直腸、局所、舌下、口腔、耳内、硬膜外、皮内、エアロゾル、非経口送達（筋肉内、皮下、動脈内、静脈内を含む）、門脈内、関節内、皮内、腹膜、髄内注射、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注射を含む当技術分野に存在し、これらに限定されない。医薬組成物は、一般に、特定の意図された投与経路に合わせて調整されるであろう。
本明細書で使用される場合、「担体」は、本明細書に照らして理解されるようなその平易で通常の意味を有し、細胞、組織及び／又は身体器官への化合物の通過、送達、及び／又は取り込みを容易にする化合物、粒子、固体、半固体、液体、又は希釈剤を指す。
本明細書で使用される場合、「希釈剤」は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、薬理学的活性を欠くが薬学的に必要又は望ましい場合がある医薬組成物中の成分を指す。例えば、希釈剤を使用して、その質量が製造及び／又は投与するには小さすぎる強力な薬物のバルクを増加させることができる。それはまた、注射、摂取又は吸入によって投与される薬物の溶解のための液体であり得る。当技術分野における希釈剤の一般的な形態は、ヒトの血液の組成を模倣するリン酸緩衝生理食塩水等であるが、これに限定されない緩衝水溶液である。
本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、又は材料の「純度」という用語は、仕様に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、又は材料の実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物、又は材料は、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％純粋であり、その間の全ての小数を含む。純度は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞破片、小分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクル、若しくは汚染物質、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない不必要な不純物の影響を受ける場合がある。いくつかの実施形態において、物質、化合物、又は材料は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、プラスミドＤＮＡ、汚染ウイルス、プロテアソーム、宿主細胞培養成分、プロセス関連成分、マイコプラズマ、発熱物質、細菌内毒素、及び外来性感染性因子を実質的に含まない。純度は、電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、分光法、ＵＶ－可視分光法、赤外線分光法、質量分析法、核磁気共鳴、重量測定、若しくは滴定、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない技法を使用して測定することができる。
本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、又は材料の「収率」という用語は、仕様に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、又は材料の実際の総量を指す。例えば、物質、化合物、又は材料の収率は、予想される総量の８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下であり、その間の全ての小数を含む。収率は、反応又はプロセスの効率、望ましくない副反応、分解、投入物質、化合物、若しくは材料の品質、又は産生の任意のステップ中での所望の物質、化合物、若しくは材料の損失によって影響を受ける場合がある。
本明細書で使用される「単一解離」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、単一細胞の懸濁液の調製物を指す。単一細胞のこれらの懸濁液は、例えば、従来の機械的及び／又は化学的（例えば、酵素的）手段によって、多細胞組織又は構造を処理することによって調製することができる。本明細書に開示される方法及び組成物に使用される場合、単一解離は、オルガノイドなどの多細胞組織又は構造から単一細胞の懸濁液へと処理された間葉細胞に適用され得る。「単一解離」は、単一細胞の集団を指すが、単一解離細胞の調製物は、必ずしも単一細胞のみを含有する必要はなく、単一解離細胞の調製物は、非解離細胞構造、細胞凝集塊、凝集細胞、細胞片などの集団を含み得ることを理解されたい。同様に、いくつかの実施形態において、特定のタイプ（例えば、間葉）の単一解離細胞の組成物は、別のタイプ（例えば、上皮）の細胞を含有してもよい。
本明細書で使用される「上皮構造」という用語は、本明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、例えば、分化したオルガノイド又はエンテロイド由来のインタクトな上皮細胞から構成される多細胞組織又はそのフラグメントを指す（ただし、上皮細胞の他の供給源も想定される）。本明細書中に開示される方法において使用される場合、これらの上皮構造は、例えば、単一細胞を通過させるがこれらのより大きな上皮構造を保持するであろう適切な細胞濾過器を使用して単離され得る上皮細胞の凝集塊である。
本明細書で使用される「複合オルガノイド」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、間葉と上皮の両方を含む細胞オルガノイドを指し、間葉及び上皮は、本明細書に記載されるように組み合わされて、複合オルガノイドを形成する。本明細書において想定されるように、これらの２つの細胞集団は、同じタイプのオルガノイド若しくは同じ組織型を有するオルガノイド（例えば、間葉及び上皮が両方とも胃オルガノイドに由来するが、間葉を単離するために使用される胃オルガノイド、及び上皮を単離するために使用される胃オルガノイドの少なくともいくつかは、同じオルガノイドではない）に由来してもよいか、又は異なるタイプのオルガノイド若しくは異なる組織型を有するオルガノイド（例えば、間葉が腸オルガノイドに由来し、上皮が胃オルガノイドに由来する）に由来してもよい。いくつかの実施形態において、間葉及び上皮が由来するオルガノイドは、組織型が同じであっても、遺伝子修飾又は疾患表現型を呈するなど、組織型以外のいくつかの差異を有し得る。複合オルガノイドを形成するための間葉と上皮との組み合わせは、これらのオルガノイドの間葉及び上皮が、例えば、胃腸オルガノイドについては、多能性幹細胞から胚体内胚葉、腸内胚葉への細胞分化のプロセスを通して、相前後して生じるため、以前に開示されたような多能性幹細胞から産生されたオルガノイドとは明らかに異なる。
本明細書で使用される「ｗ／ｗ％」又は「重量／重量％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、１００を掛けた組成物の全重量に対する成分又は薬剤の重量に関して表されたパーセンテージを指す。本明細書で使用される「ｖ／ｖ％」又は「体積／体積％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、組成物の全液体体積に対する化合物、物質、成分又は薬剤の液体体積に関して表されたパーセンテージに１００を掛けたものを指す。
本明細書の開示は、多くの実施形態を説明するために肯定的な言葉を使用している。本開示はまた、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコル、又は手順等の主題が完全に若しくは部分的に除外される実施形態を含む。
幹細胞
本明細書で使用される場合、「全能性（totipotent）幹細胞」（全能性（omnipotent）幹細胞としても知られている）という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、胚性及び胚外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子及び精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数分割によって産生される細胞も全能性である。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳＣ）」という用語は、一般にＥＳ細胞とも略され、本明細書で使用される場合、本明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、多能性であり、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本開示の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞を包含するために広義で使用される場合がある。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のうちのいずれかに由来する細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内部細胞塊細胞の子孫であり得るか、又は特定の遺伝子の発現を強制することによって、非多能性幹細胞、例えば成体体細胞の誘導によって得られてもよい。多能性幹細胞は、任意の好適な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例は、ヒト、げっ歯類、ブタ、及びウシを含む哺乳動物の供給源を含む。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）」という用語は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、一般にｉＰＳ細胞とも省略され、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することにより、成人の体細胞等の通常は非多能性細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞の一種を指す。ｈｉＰＳＣはヒトｉＰＳＣを指す。当技術分野で知られているいくつかの方法では、ｉＰＳＣは、特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞等の非多能性細胞へのトランスフェクションによって誘導され得る。トランスフェクションは、レトロウイルス又はレンチウイルス等のウイルスを使用してウイルス形質導入によって達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）及びＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子も誘導の効率を向上させる。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的及び生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間、又はレポーター遺伝子及び抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用されるとき、ｉＰＳＣは、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、及びヒト人工多能性幹細胞を含む。いくつかの方法において、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃを使用して多能性幹細胞にヒト線維芽細胞を形質転換するためにレトロウイルス系が使用される。他の方法において、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８で形質転換するためにレンチウイルス系が使用される。ｉＰＳＣにおいて発現が誘導される遺伝子としては、Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、及びＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｆｔｈ１１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、若しくはＥ－カドヘリン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、明細書に照らして理解されるようなその明白で通常の意味を有し、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含し、それを通じて、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、１つ以上の専門化された細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性であるか、又は多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、全能性（totipotent）（又は全能性（omnipotent））幹細胞、多能性幹細胞（人工又は非人工）、多分化能性（multipotent）幹細胞、少能性（oligopotent）幹細胞、及び単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、胚、乳児、小児、又は成人由来であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、遺伝子操作又はタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。前駆細胞には、胚幹細胞（ＥＳＣ）、胚性がん腫細胞（embryonic carcinoma cell、ＥＣ）、及び胚盤葉上層幹細胞（epiblast stem cell、ＥｐｉＳＣ）が含まれる。
いくつかの実施形態において、１つのステップは、多能性であるか又は多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無限の未分化成長が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は、当技術分野で周知である。ヒト胚性幹細胞（例えば、Ｈ１、Ｈ７、又はＨ９ ＥＳＣ株）は、本出願に記載の例示的な実施形態で使用されるが、本明細書に記載の方法及びシステムは、任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解されるであろう。
本開示による実施形態において使用され得る追加の幹細胞としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のＨｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣセルバンク、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのテクニオン（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）、及びＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによってホストされるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅによって提供されるか、又はそれらのデータベースに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示による実施形態において使用することができる例示的な胚性幹細胞としては、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣＯ１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト多能性細胞株には、ＴｋＤＡ３－４、１２３１Ａ３、３１７－Ｄ６、３１７－Ａ４、ＣＤＨ１、５－Ｔ－３、３－３４－１、ＮＡＦＬＤ２７、ＮＡＦＬＤ７７、ＮＡＦＬＤ１５０、ＷＤ９０、ＷＤ９１、ＷＤ９２、Ｌ２００１２、Ｃ２１３、１３８３Ｄ６、ＦＦ、又は３１７－１２細胞が含まれるが、これらに限定されない。
発生生物学では、細胞分化は、より専門化されていない細胞がより専門化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、「有向分化」という用語は、より専門化されていない細胞が特定の専門化された標的細胞型になるプロセスを記載する。専門化された標的細胞型の特殊性を、最初の細胞の運命を定義又は変更するために使用することができる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法には、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、及び核酸処理が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子を輸送し、胚性幹細胞と実質的に同一のｉＰＳＣをもたらすことができる。アデノウイルスは、それ自体の遺伝子を標的の宿主のうちのいずれとも組み合わせないため、腫瘍を創出する危険性が排除される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを生成するために非ウイルスベースの技術が用いられる。いくつかの実施形態において、非常に低い効率ではあるが、いずれのウイルストランスフェクション系も全く使用せずに、プラスミドを介して再プログラミングを達成することができる。他の実施形態において、タンパク質の直接送達を使用してｉＰＳＣを生成し、そのようにしてウイルス又は遺伝子修飾の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である。ポリアルギニンアンカーを介して細胞に運ばれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態において、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによって多能性誘導遺伝子の発現を増加させることもできる。
本明細書で使用される「フィーダー細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、成長因子を培地に分泌するか、又は細胞表面に表示すること等によって、多能性幹細胞の成長をサポートする細胞を指す。フィーダー細胞は一般に付着細胞であり、成長が停止する場合もある。例えば、フィーダー細胞は、照射（例えば、ガンマ線）、マイトマイシン－Ｃ処理、電気パルス、又は穏やかな化学固定（例えば、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドによる）によって成長が停止される。ただし、フィーダー細胞は必ずしも成長を停止するとは限らない。フィーダー細胞は、成長因子の分泌、細胞表面への成長因子の表示、培養培地の無害化、又は細胞外マトリックスタンパク質の合成等の目的に役立ち得る。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、支持された標的幹細胞に対して同種又は異種であり、これは、下流の用途に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、マウス線維芽細胞、マウス胚性線維芽細胞、マウスＳＴＯ細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＳＮＬ ７６／７細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト前皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト脂肪間葉細胞、ヒト骨髄間葉細胞、ヒト羊膜間葉細胞、ヒト羊膜上皮細胞、ヒト臍帯間葉細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、又はヒト成人ファロピウス管上皮細胞である。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞から調製された馴化培地は、フィーダー細胞共培養の代わりに、又はフィーダー細胞共培養と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、標的幹細胞の成長中には使用されない。
ＰＳＣの分化
いくつかの実施形態において、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣは、最初に胚体内胚葉（definitive endoderm、ＤＥ）に、次いで前腸又は後腸系統に、及び胃腸組織又は任意の他の生物学的組織などの組織に、段階的な有向分化を受ける。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、ＤＥ形成を促進するための分子（例えば、成長因子、リガンド）及びその後の組織形成のための分子が同時に添加される、非段階的な有向分化を受ける。いくつかの実施形態において、有向分化は、ｉＰＳＣ及び／又はＤＥ細胞における特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することによって達成される。いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路には、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｗｎｔ／ＡＰＣシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ＬＫＢシグナル伝達経路、及びＰａｒ極性シグナル伝達経路が含まれるが、これに限定されない。
胚体内胚葉は腸管を生じさせる。前側ＤＥは、前腸、並びに食道、肺、胃、肝臓、及び膵臓を含むそれに関連した臓器を形成し、後側ＤＥは、中腸並びに後腸を形成し、これは、小腸及び大腸、並びに泌尿生殖器系の一部を形成する。マウス、ニワトリ、及びカエルの胚を使用した研究では、原腸期にＤＥで前側－後側パターンを確立することが、その後の前腸及び後腸の発達の前提条件であることが示唆されている。Ｗｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路は、後側内胚葉／後腸又は前側内胚葉／前腸のいずれかの最終的な結果を促進するために重要である。後腸では、単層立方体状の上皮は、最初に偽重層円柱上皮に発達し、次に分極した円柱上皮と、推定前駆領域に対応する絨毛の基部に成長ゾーンとを含む絨毛に発達する。
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ又はＥＳＣ）から胚体内胚葉を産生するための任意の方法が本明細書に記載の方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、多能性細胞は桑実胚に由来する。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞には、胚性幹細胞を含むが、これに限定されない。胚性幹細胞は、胚の内部細胞塊又は胚の性腺隆起に由来し得る。胚性幹細胞又は生殖細胞は、ヒトを含む種々な哺乳動物種を含むがこれらに限定されない様々な動物種から生じ得る。いくつかの実施形態において、ヒト胚性幹細胞を使用して胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態において、ヒト胚性生殖細胞を使用して胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを使用して胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態において、ヒトｉＰＳＣ（human iPSC、ｈｉＰＳＣ）を使用して胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、胚体内胚葉に分化する前に、最初に修飾される。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、胚体内胚葉に分化する前に、例えば、外因性の核酸又はタンパク質を発現するように遺伝子修飾される。
いくつかの実施形態において、胚性幹細胞又は生殖細胞又はｉＰＳＣは、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２４０時間、３００時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である時間、又は前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間、例えば、６時間～３００時間、２４時間～１２０時間、４８時間～９６時間、６時間～７２時間、若しくは２４時間～３００時間にわたって、１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子で処理される。いくつかの実施形態において、２つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子が添加される。これらの場合、２つ以上の小分子化合物、活性剤、阻害剤、又は成長因子は、同時に又は別々に添加することができる。
いくつかの実施形態において、胚性幹細胞又は生殖細胞又はｉＰＳＣは、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１５０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である濃度、又は前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある任意の濃度、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ～１５０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１０００ｎｇ／ｍＬ～１５０００ｎｇ／ｍＬの１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子で処理される。いくつかの実施形態において、１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子の濃度は、治療を通して一定レベルに維持される。いくつかの実施形態において、１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子の濃度は、治療の過程で変化する。いくつかの実施形態において、２つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子が添加される。これらの場合、２つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子の濃度が異なる可能性がある。
いくつかの実施形態において、ＥＳＣ、生殖細胞、又はｉＰＳＣは、幹細胞の成長をサポートする成長培地で培養される。いくつかの実施形態において、ＥＳＣ、生殖細胞、又はｉＰＳＣは、幹細胞成長培地で培養される。いくつかの実施形態において、幹細胞成長培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ミニ腸培地、ｍＴｅＳＲ １、又はｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地である。いくつかの実施形態において、幹細胞成長培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態において、幹細胞成長培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である濃度、又は前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の割合、例えば、０％～２０％、０．２％～１０％、２％～５％、０％～５％、又は２％～２０％でＦＢＳを含む。いくつかの実施形態において、幹細胞成長培地は、異種成分を含有しない。いくつかの実施形態において、成長培地は、１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、又は成長因子を含む。
いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞が濃縮された細胞の集団が使用される。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、単離されるか、又は実質的に精製される。いくつかの実施形態において、単離された又は実質的に精製された胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、又はＣＸＲＣ４マーカーのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ）を、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、又はＳＯＸ７マーカーのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ、５つ）よりも多く発現する。
いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞及びｈＥＳＣは、１つ以上の成長因子で処理される。そのような成長因子は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の成長因子は、成長因子のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのＮｏｄａｌ／アクチビン及び／又はＢＭＰサブグループを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔタンパク質、又はこれらの成長因子のうちのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。例えば、ヒトにおいて、Ｗｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、アクチビン誘導性の胚体内胚葉（ＤＥ）は、ＦＧＦ／Ｗｎｔ誘導性の前側又は後側内胚葉パターン形成、前腸又は後腸の特定及び形態形成、並びに最終的には胃腸成長、形態形成、及び機能的な胃腸細胞型への細胞分化を更に受け得る。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、分泌細胞型、内分泌細胞型、及び吸収性細胞型を含む胃腸上皮又は間葉へとインビトロで分化するように効率的に方向付けられる。成長因子などの分子は、特定の種類の腸管組織形成を促進するために何らかの発達期に添加され得ることが理解されるであろう。
インビトロでのヒト胃腸発達は、胎児の腸の発達、内胚葉形成、前側又は後側内胚葉パターン形成、前腸又は後腸形態形成、胎児の腸の発達、上皮形態形成、推定前駆ドメインの形成、及び機能的細胞型への分化に近い段階で起こる。
１つ以上のＦＧＦタンパク質の濃度、発現、又は機能を変更することと組み合わせて、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達タンパク質の濃度、発現、又は機能を変更することは、本開示による有向分化を生じさせることができることが、当業者によって理解されるであろう。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分、例えば、経路の天然の阻害剤、アンタゴニスト、活性化因子、又はアゴニストを使用して、Ｗｎｔ及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路の阻害又は活性化をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的にするｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを使用して、これらの経路を阻害又は活性化する。
線維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor、ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、及び胚発生に関与する成長因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用がＦＧＦシグナル伝達に不可欠であることが示されている。ＦＧＦは、多種多様な細胞及び組織の成長及び分化の過程で重要な役割を果たす。ヒトでは、ＦＧＦファミリーの２２のメンバーが同定されており、その全てが構造的に関連するシグナル伝達分子である。メンバーＦＧＦ１～ＦＧＦ１０は全て、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する。ＦＧＦ１は酸性線維芽細胞成長因子としても知られており、ＦＧＦ２は塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor、ｂＦＧＦ）としても知られている。ＦＧＦ相同因子１～４（ＦＨＦ１～ＦＨＦ４）としても知られているメンバーＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、及びＦＧＦ１４は、ＦＧＦと比較して、明らかに異なる機能的差異を有することが示されている。これらの因子は著しく類似した配列相同性を有しているが、それらはＦＧＦＲに結合せず、ＦＧＦとは無関係の細胞内プロセスに関与する。このグループは、「ｉＦＧＦ」としても知られている。メンバーＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３は、より新しく、あまり特徴付けられていない。ＦＧＦ１５は、ヒトＦＧＦ１９のマウスオルソログである（したがって、ヒトＦＧＦ１５はない）。ヒトＦＧＦ２０は、アフリカツメガエル（Xenopus）ＦＧＦ－２０（ＸＦＧＦ－２０）との相同性に基づいて同定された。他のＦＧＦの局所活性とは対照的に、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、及びＦＧＦ２３は、より全身的な効果を有する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦのうちのいずれかをＷｎｔシグナル伝達経路からのタンパク質と組み合わせて使用することができることが、当業者によって理解されるであろう。いくつかの実施形態において、使用されるＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５（ＦＧＦ１９、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９）、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３のうちの１つ以上である。
ＰＳＣのＤＥ培養への、及びその後の様々な中間体成熟胃腸細胞型への分化は、段階特異的細胞マーカーの存在によって決定することができる。いくつかの実施形態において、代表的な細胞成分の発現は、ＤＥ形成を決定するために使用される。代表的な細胞成分には、ＣＭＫＯＲ１、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ３７、ＲＴＮ４ＲＬ１、ＳＬＣ５Ａ９、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＲＰＡ１、ＡＧＰＡＴ３、ＡＰＯＡ２、Ｃ２０ｏｒｆ５６、Ｃ２１ｏｒｆ１２９、ＣＡＬＣＲ、ＣＣＬ２、ＣＥＲ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、ＣＸＣＲ４、ＣＸｏｒｆ１、ＤＩＯ３、ＤＩＯ３０Ｓ、ＥＢ－１、ＥＨＨＡＤＨ、ＥＬＯＶＬ２、ＥＰＳＴＩ１、ＦＧＦ１７、ＦＬＪ１０９７０、ＦＬＪ２１１９５、ＦＬＪ２２４７１、ＦＬＪ２３５１４、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＱ１、ＧＡＴＡ４、ＧＰＲ３７、ＧＳＣ、ＬＯＣ２８３５３７、ＭＹＬ７、ＮＰＰＢ、ＮＴＮ４、ＰＲＳＳ２、ＲＴＮ４ＲＬ１、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＩＡＴ８Ｄ、ＳＬＣ５Ａ９、ＳＬＣ４０Ａ１、ＳＯＸ１７、ＳＰＯＣＫ３、ＴＭＯＤ１、ＴＲＰＡ１、ＴＴＮ、ＡＷ１６６７２７、ＡＩ８２１５８６、ＢＦ９４１６０９、ＡＩ９１６５３２、ＢＣ０３４４０７、Ｎ６３７０６、若しくはＡＷ７７２１９２、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前腸マーカーＰｄｘ１及びアルブミンなどの細胞成分の不在は、有向後腸形成を明らかにするために使用され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ）の腸転写因子ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、又はＳＯＸ９を使用して、腸の発達を表すことができる。いくつかの実施形態において、ＧＡＴＡ４又はＧＡＴＡ６タンパク質発現のうちの１つ以上を使用して、腸の発達を表すことができる。
いくつかの実施形態において、形態学的変化を使用して、有向分化の進行を表すことができる。いくつかの実施形態において、スフェロイド（例えば、後腸中部、後腸、前側前腸、又は後側前腸スフェロイド）は、成熟のために三次元培養条件に供される。いくつかの実施形態において、胃腸オルガノイドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の日数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～４０日、２０～３０日、３０～４０日、若しくは１～２０日で成熟する。いくつかの実施形態において、間葉細胞に囲まれた高度に複雑な上皮が、スフェロイド形成に続いて観察され得る。いくつかの実施形態において、胃腸オルガノイド、上皮、分極した円柱上皮、間葉、神経細胞、又は平滑筋細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の日数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～４０日、２０～３０日、３０～４０日、又は１～２０日で観察され得る。
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、「１つのステップ」プロセスによって胃腸細胞型に変換される。例えば、多能性幹細胞をＤＥ培養に分化させることができる１つ以上の分子（例えば、アクチビンＡ）は、多能性幹細胞を直接処理するために、ＤＥ培養の有向分化を促進することができる追加の分子（例えば、Ｗｎｔ３ａ及びＦＧＦ４）と組み合わされる。
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞から調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、生検から得られた生物学的組織から調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から調製される。いくつかの実施形態において、ヒトＰＳＣは、ヒトＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、凍結保存されたＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、フィーダー細胞基質上で成長する。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）フィーダー細胞基質上で成長する。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、照射されたＭＥＦフィーダー細胞基質上で成長する。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、０．１％ゼラチン上で成長する。
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、ウイルス形質導入によってＰＢＭＣから調製される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、センダイウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、若しくはアデノ随伴ウイルス、又はそれらの任意の組み合わせで形質導入される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、又はＬ－Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせのための発現ベクターを含むセンダイウイルスで形質導入される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、若しくは５．０ＭＯＩであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるＭＯＩ、又は前述のＭＯＩのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のＭＯＩ、例えば、０～５．０、１．０～４．０、２．０～３．０、０～３．０、又は１．０～５．０のＭＯＩの１つ以上のウイルスで形質導入される。いくつかの実施形態において、形質導入後、ＰＢＭＣは、幹細胞再プログラミング因子を発現する。いくつかの実施形態において、形質導入後、ＰＢＭＣは、ｉＰＳＣに再プログラムされる。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、フィーダー細胞基質上で成長する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＭＥＦフィーダー細胞基質上で成長する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、照射されたＭＥＦフィーダー細胞基質上で成長する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、０．１％ゼラチン上で成長する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ミニ腸培地、ｍＴｅＳＲ１、又はｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地で成長する。
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、細胞培養において拡大される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、細胞外マトリックス、又はその模倣物若しくは誘導体において拡大される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、マトリゲルにおいて拡大される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を含む細胞培養培地において拡大される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、８０～９５％のコンフルエンスまで拡大される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、胚体内胚葉細胞に分化する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣをアクチビンＡと接触させることによって、胚体内胚葉細胞に分化する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＢＭＰ４と更に接触する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４である、約それらである、少なくともそれらである、少なくとも約それらである、それら以下である、又は約それらである濃度のＢＭＰ４と接触する。
いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、前腸又は後腸スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞をＧＳＫ３阻害剤又はＦＧＦ４のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ又は２つ）と接触させることによって前腸又は後腸スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ４は、組換えＦＧＦ４である。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞をＧＳＫ３阻害剤又はＦＧＦ４のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ又は２つ）と接触させることなく、前腸又は後腸スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉をＣＨＩＲ９９０２１若しくはＦＧＦ４、又は両方と接触させることなく、前腸又は後腸スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞を上皮成長因子（epidermal growth factor、ＥＧＦ）と接触させることによって、前腸又は後腸スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞をＢＭＰ阻害剤と接触させることによって、前腸又は後腸スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、ノギンである。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞をレチノイン酸と接触させることによって、前腸又は後腸スフェロイドに分化する。
いくつかの実施形態において、前腸又は後腸スフェロイドは、基底膜又は基底膜模倣物に埋め込まれている。いくつかの実施形態において、前腸又は後腸スフェロイドは、マトリゲルに埋め込まれている。いくつかの実施形態において、前腸又は後腸スフェロイドは、基礎腸培地（例えば、ミニ腸培地）で培養される。いくつかの実施形態において、前腸又は後腸スフェロイドは、前腸又は後腸スフェロイドを胃腸オルガノイドに分化させるために、基礎腸培地中で培養される。いくつかの実施形態において、基礎腸培地は、高度なＤＭＥＭ－Ｆ１２、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、若しくはＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、基礎腸培地は、ＥＧＦを含む。
いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞をＧＳＫ３阻害剤、ＦＧＦ、ＢＭＰ阻害剤、又はレチノイン酸（retinoic acid、ＲＡ）のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）と接触させることによってスフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ４である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ４は、組換えＦＧＦ４である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、ノギンである。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞をＧＳＫ３阻害剤、ＦＧＦ４、ＢＭＰ阻害剤、又はＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ）と接触させることなく、スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉をＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ４、ノギン、若しくはＲＡ、又はそれらの任意の組み合わせと接触させることなく、スフェロイドに分化する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞を上皮成長因子（ＥＧＦ）と接触させることによって、スフェロイドに分化する。
複合オルガノイドの調製
本明細書に開示されるのは、複合オルガノイド及びその産生する方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のオルガノイドから単離された単一解離間葉細胞を得ることと、オルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造を得ることと、単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせることと、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造を培養して、複合オルガノイドを形成することと、を含む。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞を得ることは、１つ以上のオルガノイドから単一解離間葉細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態において、上皮構造を得ることは、オルガノイド又はエンテロイドから上皮構造を単離することを含む。２つ以上のオルガノイド（又はエンテロイド）からの単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせるプロセスは、当技術分野で知られている従来のオルガノイド分化方法を使用して典型的に達成可能な数よりも多い数の間葉細胞を含むオルガノイドの形成を可能にする。これらの方法を実施することによって、間葉を欠く、所望のオルガノイド、例えば患者由来オルガノイド、又はエンテロイドを産生し、より酷似している生物学的組織に培養することができる。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞は、同じ組織型のオルガノイドから単離され、同じ型のオルガノイドから単離された上皮構造と組み合わせて、オルガノイドの間葉集団を濃縮することができる。いくつかの実施形態において、間葉細胞の数の増加は、成長及び成熟能力を、インビトロ及び生着した場合インビボの両方で改善し、それによって、伝統的に産生されたオルガノイドで一般的に遭遇する問題を克服する。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、異なる器官組織型の細胞型を含むハイブリッドオルガノイド（例えば、胃細胞及び結腸細胞の両方を呈するオルガノイド）の形成を可能にする。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞は、異なる組織型のオルガノイドから単離されるが、上皮構造は、間葉細胞単離に使用されるオルガノイドのうちの１つと同じ組織型のオルガノイドから、又は他のオルガノイドの全てとは異なる組織型から単離することができる。これらのハイブリッドオルガノイドは、ハイスループット研究を含む、個別化医療、薬物スクリーニング、又は発生生物学における研究において使用することができる。正常細胞型及び悪性細胞型の両方を含むハイブリッドオルガノイドを用いた、遊走、転移、血管新生、及び免疫回避などのがんの異なる態様の研究も想定される。
また、本明細書に開示されるのは、複合オルガノイド及びその組成物、例えば、本明細書に開示される方法によって産生されるものである。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、間葉及び上皮を含む。いくつかの実施形態において、間葉は、第１のオルガノイドから単離された単一解離間葉細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮は、第２のオルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造を含む。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、第１のオルガノイド、又は第２のオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方の間葉細胞の数よりも多い数の間葉細胞を含む。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドにおける単一解離間葉細胞対上皮細胞の数の比は、第１のオルガノイド、又は第２のオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方の比よりも大きい。いくつかの実施形態において、第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、同じである。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、１つの組織型を含む同種オルガノイドである。いくつかの実施形態において、第１のオルガノイドの組織型及び第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、異なる。いくつかの実施形態において、間葉細胞が単離される第１のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離される第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型とは異なり、間葉細胞による上皮細胞の再パターン形成は起こらず、その結果、複合オルガノイドの上皮は、上皮構造が単離される第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、上皮構造が、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢であるオルガノイド、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるオルガノイドに由来する場合、上皮細胞の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、上皮構造がエンテロイドに由来する場合、上皮細胞の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、成体組織に由来する。いくつかの実施形態において、間葉細胞が単離される第１のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離される第２のオルガノイド又はエンテロイドの組織型とは異なり、間葉細胞による上皮細胞の再パターン形成が起こり、その結果、複合オルガノイドの上皮は、間葉細胞が単離される第１のオルガノイドの組織型の特性を呈する。いくつかの実施形態において、上皮構造が８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下であるオルガノイド、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢であるオルガノイドに由来する場合間葉細胞による上皮細胞の再パターン形成は、起こり得る。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、明確なパターン形成を有する成体組織に由来し、エンテロイドに由来する上皮構造は、間葉細胞と組換えられた場合であっても、それらの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、２つ以上の組織型を含む異種オルガノイドである。いくつかの実施形態において、肝臓オルガノイドは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生された複合オルガノイドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される複合オルガノイドは、１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含んでもよい。例えば、これらの１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質は、レポーター又はマーカーとして使用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される複合オルガノイドは、遺伝子変異を含んでもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、所望の臓器機能又はレポーター機能に関連し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、疾患状態又は疾患状態のモデルに関連し得る。いくつかの実施形態において、疾患状態又は疾患状態のモデルは、他の方法、例えば疾患状態又は疾患状態のモデルを誘導する組成物による治療によって、本明細書に開示される複合オルガノイドにおいて誘導され得る。
以下は、複合オルガノイドの調製物に典型的に含まれるが、必ずしも含まれない様々な態様を記載する。
間葉及び上皮細胞の供給源
本明細書に開示される方法のうちのいずれかについて、１）単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、及び２）上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドは、任意の組織型のオルガノイド、例えば、脳、神経、筋、甲状腺、心臓、肺、腎、膀胱、精巣、膵臓、胃腸、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸のオルガノイド又は組織型、あるいは腸又は結腸（コロノイドとも呼ばれ得る）上皮組織から産生されるエンテロイドであり得る。任意の組織型のこれらのドナーオルガノイド、又はエンテロイドは、当技術分野で知られている任意の適用可能な方法に従って産生することができる。従来の方法によって産生される場合、これらのオルガノイドは、生物学的組織と比較して間葉をほとんど呈さないか、又は間葉が減少している可能性があり、これは、長期組織培養及び／又は対象への生着に対して逆効果であり、対応する臓器がどのように機能するかを表さない可能性もある。エンテロイドの場合、これらは、いかなる間葉をも欠いており、培養に適していない。したがって、本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、これらのオルガノイド又はエンテロイドのうちのいずれかを間葉について濃縮して、これらの特徴を改善することができる。オルガノイドの「組織型」とは、オルガノイド中に存在する細胞の表現型（例えば、遺伝子発現、タンパク質発現、形態など）などの考慮事項に基づいて、オルガノイドが酷似している組織の型であることを理解されたい。オルガノイドは、その「組織型」のオルガノイドを構成するために、対応する組織と全ての態様において同一である必要はない。
これらのドナーオルガノイド又はエンテロイドを産生する方法は、例えば、米国特許第９，７１９，０６８号及び同第１０，１７４，２８９号、並びにＰＣＴ国際公開第２０１１／１４０４１１号、同第２０１５／１８３９２０号、同第２０１６／０６１４６４号、同第２０１７／１９２９９７号、同第２０１８／１０６６２８号、同第２０１８／２００４８１号、同第２０１８／０８５６１５号、同第２０１８／０８５６２２号、同第２０１８／０８５６２３号、同第２０１８／２２６２６７号、同第２０１９／０７４７９３号、同第２０２０／０２３２４５号で見ることができ、これらの各々は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるか、又は当技術分野で知られているドナーオルガノイド又はエンテロイドを産生するための方法のいくつかにおいて、ドナーオルガノイド又はエンテロイドは、定義された供給源に由来する。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドは、第１の対象からのＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態において、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドは、第１の対象からのＰＳＣに由来するか、若しくは第１の対象から単離されるか、又は第１の対象ではない第２の対象、例えば、胃腸組織から単離される。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態において、ＰＳＣは、第１の対象及び／又は第２の対象から単離された体細胞又は成体幹細胞を再プログラムすることによって、第１の対象及び／又は第２の対象から得られる。いくつかの実施形態において、体細胞又は成体幹細胞は、骨髄細胞、末梢細胞、動員末梢細胞、又は任意の他の体細胞を含む。体細胞又は成体幹細胞は、当技術分野で従来知られている任意の適用可能な方法に従って、ＰＳＣに再プログラムされ得る。いくつかの実施形態において、第１の対象及び第２の対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、第１の対象及び第２の対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、第１の対象及び第２の対象は、同じ個体である。いくつかの実施形態において、第１の対象及び／又は第２の対象は、疾患を有するか、以前に疾患を有したか、又は疾患に罹患するリスクがある。
いくつかの実施形態において、ドナーオルガノイド又はエンテロイドは、最初に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の日数のうちのいずれか２つで定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～５０日間、１０～３０日間、２０～４０日間、１～３０日間、若しくは２０～５０日間にわたって培養される。
いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドは、１、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、若しくは１０９個のオルガノイドであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述のオルガノイドの数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のオルガノイドの数、例えば、１～１０９個のオルガノイド、１０２～１０７個のオルガノイド、１０４～１０６個のオルガノイド、１～１０４個のオルガノイド、若しくは１０４～１０９個のオルガノイドを含む。
いくつかの実施形態において、オルガノイド又はエンテロイドは、細胞外マトリックス、又はその模倣物若しくは誘導体において調製される。細胞外マトリックス、又はその模倣体若しくは誘導体のいくつかの例としては、細胞ベースのフィーダー層、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、核酸、糖、脂質、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、テネイシン、硫酸ヘパラン、エンタクチン、ニドゲン、オステオポンチン、基底膜、マトリゲル、ヒドロゲル、ＰＥＩ、ＷＧＡ、若しくはヒアルロン酸、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞外マトリックス、又はその模倣体若しくは誘導体は、マトリゲルであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態において、オルガノイド又はエンテロイドは、使用する準備ができたときに、細胞外マトリックス、又はその模倣体若しくは誘導体から放出される。いくつかの実施形態において、オルガノイド又はエンテロイドは、細胞外マトリックス、又はその模倣体若しくは誘導体を脱重合することによって放出される。いくつかの実施形態において、オルガノイド又はエンテロイドは、セルリカバリーソリューション（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて放出される。いくつかの実施形態において、異なる組織型のオルガノイド又はエンテロイドが使用される場合、異なる組織型のオルガノイド又はエンテロイドが同時に処理される。いくつかの実施形態において、オルガノイド又はエンテロイドは、事前に凍結保存されている。オルガノイド又はエンテロイドを凍結保存することは、例えば、オルガノイド又はエンテロイドが異なる速度で成長するか、又は異なる時間に単離及び／若しくは分化される場合、同時処理を可能にする。
いくつかの実施形態において、オルガノイド又はエンテロイドは、２つ以上の組織型のものである。いくつかの実施形態において、各組織型のオルガノイド又はエンテロイドは、例えば、各組織型に最適化された条件下で別々に培養されてもよい。他の実施形態において、各組織型のオルガノイド又はエンテロイドは、一緒に培養されてもよい。いくつかの実施形態において、２つ以上の組織型のオルガノイド又はエンテロイドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の組織型であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下である組織型の数を含む。
いくつかの実施形態において、ドナーオルガノイド若しくはエンテロイド、又は前駆細胞のうちのいずれかは、１つ以上の外因性の核酸若しくはタンパク質、又は両方を含むように操作される。いくつかの実施形態において、１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質は、蛍光若しくは発光タンパク質、又は蛍光若しくは発光タンパク質をコードする核酸などの、所望の臓器機能又はレポーター機能を有する核酸又はタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ドナーオルガノイド又はエンテロイドは、１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含むように直接操作される。いくつかの実施形態において、ドナーオルガノイド又はエンテロイドを誘導するために使用されるＰＳＣ又は胃腸組織は、オルガノイド又はエンテロイドを形成する前に、１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含むように操作される。
いくつかの実施形態において、ドナーオルガノイド若しくはエンテロイド、又は前駆細胞のうちのいずれかは、遺伝子変異を有するか、又は遺伝子変異を含むように操作される。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、所望の臓器機能又はレポーター機能に関連し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、疾患状態又は疾患状態のモデルに関連し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法又は複合オルガノイド組成物におけるこれらのドナーオルガノイド又はエンテロイドのうちのいずれか１つ以上の使用は、疾患状態若しくは疾患状態のモデル、又はその症状の全て若しくはいくつかを呈する複合オルガノイドをもたらし得る。ドナーオルガノイド又はエンテロイドにおける遺伝子変異の存在はまた、一般に、間葉細胞集団及び上皮細胞集団を含む、ドナーオルガノイド又はエンテロイドを構成する別々の細胞成分に適用される。いくつかの実施形態において、遺伝子変異を有するドナーオルガノイド又はエンテロイドは、患者、例えば、疾患を有するか、又は疾患に罹りやすい患者に由来し得る。いくつかの実施形態において、疾患状態又は疾患状態のモデルは、疾患状態又は疾患状態のモデルを誘導する組成物による処置などの他の方法を介して、ドナーオルガノイド又はエンテロイドにおいて誘導され得る。
オルガノイドの間葉細胞及び上皮構造への解離
任意の適用可能な方法に従って産生されるドナーオルガノイド又はエンテロイドは、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド及び／又は上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドに対応する。ドナーオルガノイド又はエンテロイドの各々を破壊又は解離させて、単一解離間葉細胞又は上皮構造を遊離させるが、これは、単一細胞に完全に解離していないが、上皮細胞のインタクトな群として調製されるオルガノイド又はエンテロイド上皮のフラグメントを指す。いくつかの実施形態において、上皮構造は、追加の細胞型（例えば、間葉細胞）を含有し得る。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかについて、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、及び上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドは、各々、組織型（脳、神経、筋肉、甲状腺、心臓、肺、腎臓、膀胱、精巣、膵臓、胃腸、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、オルガノイド又はエンテロイドの組織型とは、異なる。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、同じである。
オルガノイド又はエンテロイドは、機械的解離又は酵素的解離などの当技術分野で従来知られている任意の適用可能な方法を用いて破壊又は解離することができる。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞、若しくは上皮構造、又は両方は、機械的解離及び濾過によって単離される。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、ピペット、マイクロチャネル、又は個々の細胞を破壊することなく細胞群を機械的に剪断するための適切なサイズの穴若しくはチャネルを有する他の装置を使用して機械的に解離される。いくつかの実施形態において、ピペットは、従来の５ｍＬピペットである。いくつかの実施形態において、適切なサイズの穴又はチャネルは、直径を含む。いくつかの実施形態において、直径は、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５ｍｍであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の直径のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の直径である。いくつかの実施形態において、間葉成分及び上皮成分は、細胞濾過器を使用して更に分離される。いくつかの実施形態において、細胞濾過器は、約４０μｍ、約７０μｍ、若しくは約１００μｍであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるメッシュサイズ、又は前述のメッシュサイズのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のメッシュサイズを有する。いくつかの実施形態において、細胞濾過器は、上皮構造を保持する一方で、単一解離間葉細胞を通過させる。次いで、分離された上皮構造及び単一解離間葉細胞は、更なる使用のために収集され得る。
いくつかの実施形態において、解離後、収集された単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方は、成長培地中で培養される。いくつかの実施形態において、成長培地は、間葉細胞若しくは上皮細胞、又は両方を支持するための、本明細書に開示されるか、又はそうでなければ当技術分野で知られている任意の培地である。いくつかの実施形態において、成長培地は、ＥＧＦ、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）、又は両方を含む。いくつかの実施形態において、成長培地は、ｈＥＧＦ若しくはＹ－２７６３２、又は両方で補充されたミニ腸培地である。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方の培養は、より多数の細胞を得るために、それぞれの細胞の成長及び／又は拡大を可能にする。他の実施形態において、単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方は、解離の直後に使用される。
いくつかの実施形態において、単離された単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方は、解離後に凍結保存される。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０日、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、若しくは１２０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～１２０日、１～６０日、１０～１２０日、１０～９０日、１０～６０日、１０～５０日、２０～３０日、３０～６０日、６０～１２０日、１～３０日、又は２０～６０日間にわたって凍結保存される。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方の凍結保存は、後の時点での複合オルガノイドの形成を可能にする。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、複数のオルガノイドからの間葉細胞、及び／又は単一解離間葉細胞の少なくとも一部が単離されたオルガノイドと同じではないオルガノイドからの上皮構造を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書における方法のうちのいずれかによって単離された単一解離間葉細胞又は上皮構造は、各々、１つ以上の組織型のオルガノイド又はエンテロイドに由来する。いくつかの実施形態において、２つ以上の組織型のオルガノイド又はエンテロイドに由来する単一解離間葉細胞又は上皮構造は、別々に培養された後に、各組織型のオルガノイド又はエンテロイドの各々から単離されてもよい。いくつかの実施形態において、次に、各組織型の別々のオルガノイドから単離された単一解離間葉細胞をプールして、２つ以上の組織型の単一解離間葉細胞の集団を提供することができる。いくつかの実施形態において、次いで、各組織型の別々のオルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造をプールして、２つ以上の組織型の上皮構造の集団を提供することができる。他の実施形態において、各組織型のオルガノイド又はエンテロイドが一緒に培養される場合、オルガノイド又はエンテロイドの解離は、２つ以上の組織型から既に構成されている単一解離間葉細胞及び上皮構造の集団をもたらす。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞又は上皮構造は、凍結保存され、組み合わされるオルガノイドの別々の集団から解離され得る。いくつかの実施形態において、ある組織型の単一解離間葉細胞又は上皮構造は、凍結保存され得、後に、それぞれ、１つ以上の他の、任意選択で、凍結保存された単一解離間葉細胞又は上皮構造の集団とともにプールするために使用され得る。他の実施形態において、複数の組織型の単一解離間葉細胞又は上皮構造は、凍結保存前にプールされ得る。いくつかの実施形態において、プールされた単一解離間葉細胞又は上皮構造の各々は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の組織型であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、又は約それら以下である組織型の数を含む。
本明細書で提供される解離ステップは、典型的には、ドナーオルガノイド又はエンテロイドから、単一解離間葉細胞若しくは上皮構造、又は両方を単離するために行われる。しかしながら、インタクトなドナーオルガノイド及び／又はエンテロイドをその後のプロセスに使用することもできる。いくつかの実施形態において、間葉及び上皮の両方を含むオルガノイド、並びに／又は間葉を欠くエンテロイドを、上皮構造の代わりに使用することができる。
間葉及び上皮細胞の組換え
ドナーオルガノイド又はエンテロイドからの単一解離間葉細胞及び上皮構造の単離、並びに任意選択のプーリング及び／又は凍結保存の後、単一解離間葉細胞及び上皮構造（又は適切な代替物、例えば間葉及び上皮を有するインタクトなオルガノイド）が組み合わされる。
１つの使用において、間葉（すなわち、間葉細胞の数）は、任意のオルガノイドについて濃縮することができる。従来のインビトロ方法から分化させた場合に多くの間葉を産生しない（又はインビボ組織と比較してより少ない間葉を産生する）オルガノイド型については、そのようなオルガノイドを培養及び成長させることは比較的困難であり得る。本明細書で提供される方法を実施することによって、確実な量の間葉を有するオルガノイドが産生され得る。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドにおける間葉細胞の数は、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、又は上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方の間葉細胞の元の数よりも多い。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞の数は、１つ以上のオルガノイド、又はオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方の間葉細胞の元の数の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００倍であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の多重度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の数、例えば、１～５００倍、１０～４００倍、５０～２００倍、１～１００倍、若しくは１００～５００倍である。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドにおける単一解離間葉細胞対上皮細胞の数の比は、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、又は上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方の比よりも大きい。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドにおける単一解離間葉細胞対上皮細胞の数の比は、１、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、若しくは１０９個の間葉細胞対上皮細胞であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の間葉細胞対上皮細胞の数の任意の比である。いくつかの実施形態において、複合オルガノイド１つ当たりの単一解離間葉細胞の総数は、１０４、１０５、１０６、若しくは１０７個の単一解離間葉細胞であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の複合オルガノイド１つ当たりの単一解離間葉細胞数のうちの任意の２つによって定義される範囲内の細胞の任意の数である。その結果、得られる複合オルガノイドは、濃縮された間葉を有する。
いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞と上皮構造との組み合わせは、同種複合オルガノイド又は異種複合オルガノイドのいずれかをもたらすことができる。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞は、１つの組織型のみを含み、かつ／又は単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドは、１つの組織型のみを含む。いくつかの実施形態において、上皮構造は、１つの組織型のみを含み、かつ／又は上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイドは、１つの組織型のみを含む。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞及び上皮構造の１つの組織型は、同じであり、その結果、得られる複合オルガノイドは、１つの組織型を含む同種オルガノイドである。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞は、１つ以上の組織型を含み、かつ／又は単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドは、１つ以上の組織型を含む。いくつかの実施形態において、上皮構造は、１つ以上の組織型を含み、かつ／又は上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイドは、１つ以上の組織型を含む。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞及び上皮構造の１つ以上の組織型は、異なる。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞の組織型及び上皮構造の組織型は異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成は起こらず、その結果、複合オルガノイドの上皮は、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、上皮構造が、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢であるオルガノイド、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるオルガノイドに由来する場合、上皮構造の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、上皮構造がエンテロイドに由来する場合、上皮構造の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、成体組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞の組織型及び上皮構造の組織型は異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が起こり、その結果、複合オルガノイドの上皮は、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型の特性を呈する。いくつかの実施形態において、上皮構造が、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下であるオルガノイド、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢の間であるオルガノイド若しくはエンテロイドに由来する場合、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が起こり得る。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、明確なパターン形成を有する成体組織に由来し、エンテロイドに由来する上皮構造は、単一解離間葉細胞と組換えられた場合であっても、それらの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、得られる複合オルガノイドは、２つ以上組織型を含む異種オルガノイドである。様々な臓器タイプの特性を呈する同種又は異種複合オルガノイドは、薬物スクリーニング、並びに異なる臓器組織の生物学的に関連する機能及び相互作用の研究において使用することができる。
いくつかの実施形態において、間葉及び上皮の両方を含むインタクトなオルガノイドが、上皮構造の代わりに使用される。ある組織型を含むインタクトなオルガノイドと、１つ以上の組織型を含む単一解離間葉細胞とを組み合わせて、インタクトなオルガノイドと単一解離間葉細胞の両方の組織型を含む複合オルガノイドを産生する。したがって、インタクトなオルガノイドを用いて産生された複合オルガノイドは、同種オルガノイド又は異種オルガノイドのいずれかであり得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞のみを含み、間葉細胞を含まないか、又はほとんど含まないエンテロイドが、上皮構造の代わりに、又は単離された上皮構造の供給源として使用される。いくつかの実施形態において、エンテロイド又はそれに由来する上皮構造が単一解離間葉細胞と組み合わされる。いくつかの実施形態において、エンテロイド及び単一解離間葉細胞の組織型は、両方とも、腸組織若しくは結腸組織のいずれか、又は両方である。他の実施形態において、単一解離間葉細胞の組織型は、腸又は結腸組織以外の他の組織型を含み、それによって、他の組織型の特性を有するエンテロイドから複合オルガノイドを形成する。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、対象からの腸又は結腸組織に由来し得る。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、生検から得られた腸又は結腸組織に由来する。腸又は結腸組織に由来するエンテロイドを使用する本明細書のプロセスからの複合オルガノイドの形成は、対象由来のＰＳＣから産生された類似のオルガノイドと比較して、より速いか、より容易か、より費用効率が高いか、又は対象に対してより破壊的でない（例えば、生検が既に行われている場合）可能性があることが想定される。
本明細書で提供される使用及び／又は実施形態のいずれかを、任意の他の使用及び／又は実施形態と組み合わせて使用して、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造、並びに得られる複合オルガノイドを産生してもよい。
単一解離間葉細胞と上皮構造との組み合わせ
いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞と上皮構造（又は適切な代替物）は、遠心分離によって組み合わされる。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせるのに好適な遠心分離のパラメータ（例えば、速度及び持続時間）は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、若しくは６００×ｇであるか、約それらであるか、それら以下であるか、約それら以下であるか、少なくともそれらであるか、若しくは少なくとも約それらであるか、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲、例えば、５０～６００ｘｇ、１００～３００ｘｇ、１５０～５００ｘｇ、２００～４００ｘｇ、５０～３００ｘｇ、５０～３５０ｘｇ、若しくは２５０～６００ｘｇである速度、及び／あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０であるか、約それらであるか、それら以下であるか、約それら以下であるか、少なくともそれらであるか、若しくは少なくとも約それらであるか、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲、例えば、１～３０分、１～５分、１～１０分、１０～２０分、２０～３０分、又は５～１５分である遠心分離の持続時間から選択される。他の実施形態において、単一解離間葉細胞及び上皮構造は、重力によって細胞を沈降させることを含む、細胞を凝集させるための任意の他の適切な従来の方法によって組み合わされる。
複合オルガノイドの成熟
単一解離間葉細胞及び上皮構造（又は本明細書で論じられる任意の適切な代替物若しくは変異体）を組み合わせた後、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造を培養して、複合オルガノイドを形成し、成長させ、成熟させる。組み合わされた細胞は、インビトロで培養されるか、又は適合性生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、又は任意の他の哺乳動物であって、任意選択で免疫無防備状態であり得るもの）に移植されて、成熟し得る。
いくつかの実施形態において、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造は、得られる複合オルガノイドを支持するのに適切な成長条件下で培養される。いくつかの実施形態において、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造は、本明細書に記載される条件下、又はそうでなければ当技術分野で知られている条件下で培養される。これらの条件は、組み合わされた細胞を、１つ以上のシグナル伝達経路活性化因子、シグナル伝達経路阻害剤、又は任意の他の成長因子と接触させることを含み得る。例えば、組み合わされた細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触させて、細胞生存を改善する。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である濃度、又は前述の濃度のうちのいずれかの２つで定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２０μＭ、１～１０μＭ、５～１５μＭ、又は１０～２０μＭである。複合オルガノイドが２つ以上の組織型を含むいくつかの実施形態において、組み合わされた細胞を培養するための条件は、組織型のうちの１つについて最適化されてもよいか、又は２つ以上の組織型について最適化された条件の組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、更なる培養及び成長のために、細胞外マトリックス又はその模倣体若しくは誘導体に包埋される。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、所望の時間、培養される。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日間、又は前述の日数のいずれかの２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～４０日間、１～１０日間、１０～２０日間、２０～３０日間、３０～４０日間、１～２日間、１～３０日間、若しくは１０～４０日間、培養される。
いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、レシピエント対象における適切な領域に移植される。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、ドナーオルガノイド又はエンテロイド（したがって、単一解離間葉細胞及び／又は上皮構造）が由来する対象のうちのいずれか１つである。他の実施形態において、レシピエント対象は、ドナーオルガノイド又はエンテロイドが由来する対象ではない。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、複合オルガノイドを一定時間培養した後にか、又は単一解離間葉細胞と上皮構造とを組み合わせた直後に移植されてもよい。
いくつかの実施形態において、移植は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の日数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～５０日、１０～４０日、２０～３０日、１～３０日、若しくは２０～５０日間にわたって複合オルガノイドを培養した後に行われる。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、当技術分野で知られている他の方法によって調製されたオルガノイドが同じ又は類似の成熟状態になる数日前に移植及び／又は研究のために十分成熟しており、その日数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の日数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば１～２０日、５～１５日、１０～１５日、１～１５日、若しくは１０～２０日である。
いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、レシピエント対象において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、若しくは１２０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である日数、又は前述の日数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～１２０日、１～６０日、１０～１２０日、１０～９０日、１０～６０日、１０～３０日、３０～６０日、若しくは６０～１２０日間にわたって成長する。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、レシピエント対象組織との統合を呈する。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、構成要素である単一解離間葉細胞及び上皮構造の組織型の細胞系統を含む。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、生着後に自発的に細胞系統を発達させる。
いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドと比較して、レシピエント対象においてより大きな生着及び成長を呈する。いくつかの実施形態において、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドは、レシピエント対象において生着及び／又は成長することができないが、複合オルガノイドでは、レシピエント対象における生着及び／又は成長は成功する。これは、同等の非複合オルガノイドに欠けている、複合オルガノイドにおける間葉細胞の濃縮に使用することができる。いくつかの実施形態において、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドは、当技術分野で知られている又は本明細書に記載の適用可能な従来の方法に従ってインビトロで培養されたオルガノイドであり（例えば、ドナーオルガノイド又はエンテロイドに使用される）、同じ又は類似のレシピエント対象に移植される。いくつかの実施形態において、より大きな生着及び成長は、生着後の完全な成熟にかかる時間に関して測定することができる。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、適用可能な従来のオルガノイド又はエンテロイドが生着後に成熟するのにかかる時間の長さの、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述の時間のパーセンテージのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間のパーセンテージ、例えば、５％～１００％、１０％～５０％、５０％～９０％、若しくは３０％～５０％である時間の長さを要する。いくつかの実施形態において、より大きな生着及び成長は、複合オルガノイドの相対的サイズに関して測定することができる。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、適用可能な従来のオルガノイドと比較して、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、若しくは５００％のサイズ（長さ、幅、深さ、半径、直径、外周、体積、若しくは表面積を含むがこれらに限定されない任意の寸法に関して）であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下であるか、又は前述のパーセンテージのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージのサイズ、例えば、１００％～５００％、１００～２００％、２００％～５００％、若しくは３００％～５００％である。
胃腸オルガノイド
本明細書に開示される複合オルガノイドの１つの用途は、胃腸器官に関連する使用のためである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される複合オルガノイドは、胃腸オルガノイドである。いくつかの実施形態において、胃腸オルガノイドは、食道オルガノイド、胃オルガノイド、胃底オルガノイド、前庭胃オルガノイド、肝オルガノイド、腸オルガノイド、若しくは結腸オルガノイド、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて（例えば、単一解離間葉細胞及び／又は上皮構造を単離するために）使用される胃腸オルガノイドは、本明細書に記載される方法又はそうでなければ当技術分野で知られている方法に従って産生される。
いくつかの実施形態において、１）単一解離した間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、及び２）上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドは各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイド、又はオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方は、ヒトオルガノイド又はエンテロイドである。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイド、又はオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方は、ヒト食道オルガノイド（human esophageal organoid、ＨＥＯ）、ヒト胃オルガノイド（ＨＧＯ）、ヒト胃底オルガノイド（human fundic gastric organoid、ＨＦＧＯ）、ヒト前庭胃オルガノイド（human antral gastric organoid、ＨＡＧＯ）、ヒト肝オルガノイド（human hepatic organoid、ＨＨＯ）、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）、若しくはヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、１）単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドは、腸組織型を含み、２）上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドは、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドは、小腸オルガノイド、任意選択でＨＩＯである。腸オルガノイドから単離された単一解離間葉細胞の使用は、腸オルガノイドを多能性幹細胞から分化させるための現在知られているプロセスが、他の組織型のオルガノイドのための分化プロトコルと比較して、かなりの量の間葉細胞を産生し、これが間葉細胞の数の減少をもたらし得るので、いくつかの明らかに異なる利点を提供し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される複合オルガノイドを産生する方法は、他のオルガノイドプロトコルにおける間葉細胞の分化のこの低減を補うことが意図される。いくつかの実施形態において、腸オルガノイド分化から産生された多数の間葉細胞を使用して、他の組織型のオルガノイドを増補することができる。しかしながら、本明細書に開示される方法は、単一解離間葉細胞の供給源として腸オルガノイドのみを使用することに限定されないことに留意すべきである。更に、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるような単一解離間葉細胞の使用は、１つの組織型の複合オルガノイドを産生するなど、追加の／他の利点を有する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、異なる。いくつかの実施形態において、結果として生じる胃腸オルガノイドは、異種オルガノイドである。本明細書に開示される複合オルガノイドに適用される場合、複合オルガノイドは、食道、胃、肝臓、腸若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第１の組織型を含む間葉と、食道、胃、肝臓、腸若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第２の組織型を含む上皮と、を含み得る。いくつかの実施形態において、第１の組織型及び第２の組織型は、少なくとも１つの組織型の差異を有する。いくつかの実施形態において、複合胃腸オルガノイドのいくつかの非限定的な例は、腸間葉／腸上皮オルガノイド、腸間葉／結腸上皮オルガノイド、腸間葉／胃上皮オルガノイド、腸間葉／エンテロイド上皮オルガノイド、胃間葉／胃上皮オルガノイド、及び結腸間葉／結腸上皮オルガノイドである。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とは異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成は起こらず、その結果、複合オルガノイドの上皮は、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型を維持する。いくつかの実施形態において、上皮構造が、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢であるオルガノイド、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるオルガノイドに由来する場合、上皮構造の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、上皮構造がエンテロイドに由来する場合、上皮構造の再パターン形成は、起こらない。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、成体組織に由来する。いくつかの実施形態において、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型と、上皮構造が単離されるオルガノイド又はエンテロイドの組織型とは異なり、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が起こり、その結果、複合オルガノイドの上皮は、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイドの組織型の特性を呈する。いくつかの実施形態において、上皮構造が８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下であるオルガノイド、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢であるオルガノイドに由来する場合、単一解離間葉細胞による上皮構造の再パターン形成が起こり得る。いくつかの実施形態において、エンテロイドは、明確なパターン形成を有する成体組織に由来し、エンテロイドに由来する上皮構造は、単一解離間葉細胞と組換えられた場合であっても、それらの組織型を維持する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイドの組織型及びオルガノイド又はエンテロイドの組織型は、同じである。いくつかの実施形態において、１つ以上のオルガノイド、及びオルガノイド又はエンテロイドは、各々、食道、胃、肝臓、腸、又は結腸組織型のうちの１つのみを含む。いくつかの実施形態において、得られる複合胃腸オルガノイドは、１つの組織型のみを含む同種オルガノイドである。
いくつかの実施形態において、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造は、食道、胃、肝臓、腸、又は結腸オルガノイド成長のために最適化された条件下で培養される。いくつかの実施形態において、組み合わされた単一解離間葉細胞及び上皮構造は、ミニ腸培地で培養される。いくつかの実施形態において、ミニ腸培地は、高度なＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、上皮成長因子（ＥＧＦ）、若しくはＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦは、ヒトＥＧＦ（human EGF、ｈＥＧＦ）である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｎｇ／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である濃度、又は前述の濃度のうちのいずれか２つで定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、８０～１２０ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、若しくは１００～２００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０μＭであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である濃度、又は前述の濃度のうちのいずれかの２つで定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１～２０μＭ、１～１０μＭ、５～１５μＭ、又は１０～２０μＭである。
いくつかの実施形態において、複合胃腸オルガノイドは、管腔を含む。いくつかの実施形態において、複合胃腸オルガノイドは、複合胃腸オルガノイドの総体積のパーセンテージを占める管腔を含む。いくつかの実施形態において、管腔は、複合胃腸オルガノイドの総体積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３８％、３９％、若しくは４０％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、若しくは約それら以下である複合胃腸オルガノイドの総体積のパーセンテージ、又は前述のパーセンテージのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のパーセンテージ、例えば１％～４０％、１０％～３０％、１５％～２０％、１％～２０％、若しくは１０％～４０％を占める。
ＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮異種オルガノイドの非限定的な例において、異種オルガノイドは、小腸の上皮に特異的であるスクラーゼ－イソマルターゼ（sucrase-isomaltase、ＳＩ）を発現し、大腸の上皮に特異的であるＳＡＴＢ２を発現しない。
ＨＩＯ間葉／ＨＥＯ上皮異種オルガノイドの非限定的な例において、異種オルガノイドは、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１３、ＩＶＬ、ｐ６３、及びＣＤＨ１を発現する。
複合オルガノイドの使用
本明細書に開示される、又は本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される複合オルガノイドは、移植のための組織の供給源の提供、薬物スクリーニング、臓器機能、神経機能、マイクロバイオーム相互作用の研究、又はそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な目的のために使用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載されるようなオルガノイドを成熟させるためだけでなく、それに加えて又は代替として、レシピエント対象における臓器機能を回復、修復、又は改善するために、本明細書に開示される複合オルガノイドのうちのいずれか１つをレシピエント対象に移植する追加のステップを含む。これらの方法は、臓器機能が低下している対象を治療するため、又は有害な臓器障害の改善、阻害、若しくは治療を必要とする対象においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、単一解離間葉細胞が単離される１つ以上のオルガノイド、又は上皮構造が単離されるオルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方が単離される対象である。いくつかの実施形態において、複合オルガノイド又はその成分は、レシピエント対象から単離されたＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫不全哺乳動物である。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫不全マウスである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、サル、ネコ、イヌ、ハムスター、又はラットである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫無防備状態のサル、ネコ、イヌ、ハムスター、又はラットである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫無防備状態のヒトである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫適格性のヒトである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫抑制剤で治療された免疫適格性のヒトである。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫適格性のヒトであり、複合オルガノイドは、レシピエント対象に対して自家性である。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、免疫適格性のヒトであり、複合オルガノイドは、レシピエント対象に対して同種異系である。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、臓器移植を必要としている哺乳動物である。いくつかの実施形態において、レシピエント対象は、臓器移植を必要としているヒトである。
病気の治療を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための複合オルガノイドも本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、本明細書に記載の複合オルガノイドである。いくつかの実施形態において、肝臓オルガノイドは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生された肝臓オルガノイドである。
本明細書で提供される治療方法又は使用のいずれか１つにおいて、複合オルガノイドは、複合胃腸オルガノイドであり得る。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、胃腸機能が低下している対象を治療すること、又は有害な胃腸障害の改善、阻害、若しくは治療を必要とする対象においてそれを行うことに適用される。いくつかの実施形態において、本方法は、複合胃腸オルガノイドを対象に移植又は生着させることを含む。いくつかの実施形態において、複合胃腸オルガノイドは、食道オルガノイド、胃オルガノイド、胃底オルガノイド、前庭胃オルガノイド、肝オルガノイド、小腸（腸）オルガノイド、又は大腸（結腸）オルガノイドである。いくつかの実施形態において、対象は、胃腸移植を必要としている。いくつかの実施形態において、胃腸オルガノイドは、胃腸オルガノイド全体として移植又は生着される。いくつかの実施形態において、移植部位は、胃腸組織である。複合胃腸オルガノイドは、胃腸の病気の治療を必要とする対象においてそれを行うために使用することもできる。
候補治療薬のスクリーニングのための方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に開示されるオルガノイドのいずれか１つを候補治療薬と接触させることと、オルガノイドに対する候補治療薬の効果を決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、疾患又はそのモデルを呈するように遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、オルガノイドの間葉及び／又は上皮は、遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、オルガノイドの間葉及び／又は上皮は、疾患又はそのモデルを呈するように遺伝子修飾される。
実施例
本明細書で論じられる実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例で更に詳細に開示されており、これらは、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。当業者は、本明細書及び特許請求の範囲に記載されているように、他の多くの実施形態も本開示の範囲内にあることを理解するであろう。
実施例１．複合オルガノイド組成物の産生
ヒト多能性幹細胞を培養し、胚体内胚葉細胞に分化するように誘導した。続いて、胚体内胚葉細胞を、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）、ヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）、又はヒト前庭胃オルガノイド（ＨＡＧＯ）に分化した。培養１０～３０日後のオルガノイドは、以下のステップに使用することができる。代替として、間葉を欠くエンテロイドは、対象からの腸組織又は結腸組織に由来し得る。これらのオルガノイド又はエンテロイドを産生する方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１１／１４０４４１号、同第２０１５／１８３９２０号、同第２０１６／０６１４６４号、同第２０１７／１９２９９７号、及び同第２０１８／１０６６２８号に見ることができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
オルガノイド又はエンテロイドを、細胞外マトリックス（例えば、マトリゲルグロースファクターリデュースト［Ｃｏｒｎｉｎｇ］）中で調製した。オルガノイド又はエンテロイドを適切な体積のダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ；例えば、２４ウェルプレートウェルに対して５００μＬ）で洗浄し、ＤＰＢＳを除去し、適切な体積の氷冷セルリカバリーソリューション（Ｃｏｒｎｉｎｇ；例えば、５００μＬ）を添加して、培養プレートから細胞外マトリックス液滴を離した。オルガノイド又はエンテロイド及び細胞外マトリックスを１５ｍＬチューブに移し、穏やかに撹拌しながら４℃で３０分間インキュベートして、細胞外マトリックスの解重合を誘導した。最大２４ウェルを同じ１５ｍＬチューブにプールすることができる。ヘテロ組換えの目的のために、異なるタイプのオルガノイド又はエンテロイドが、典型的には、別々のチューブ内で同時に処理される。チューブを３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、５ｍＬの新鮮な氷冷セルリカバリーソリューションを添加した。オルガノイドの間葉及び上皮（又はエンテロイドの上皮）を、５ｍＬの血清ピペットを使用して上下にピペッティングすることによって機械的に解離させた。解離プロセスを顕微鏡下で定期的に監視した。インタクトな上皮構造が周囲の間葉を有さない場合に、完全な解離が達成された（図１、パネルＡ）。上皮からの間葉の分離を容易にし、上皮構造がばらばらになるのを防ぐために、手動による解離を、穏やかに撹拌しながら４℃で１０分間インキュベートすることと交互に行うことができる。解離した溶液を、５０ｍＬのチューブの上部に逆さまに配置した４０μｍのメッシュサイズの細胞濾過器を用いて濾過して、上皮構造から単一解離間葉を分離した。細胞濾過器を５ｍＬの新鮮な冷ＤＰＢＳですすいだ。鉗子を使用して、上皮構造を保持する細胞濾過器を、５ｍＬのＤＰＢＳを含有する６ウェルプレートまで右側に移した。細胞濾過器を溶液中に数回浸漬して、上皮構造を細胞濾過器メッシュからウェル中に離した。上皮構造が細胞濾過器メッシュ上に残り、ウェルの底に付着するのを防ぐために、細胞濾過器を、使用前にウェル中の０．５％のＢＳＡのＰＢＳ溶液に３０分間浸漬することができる。単一解離間葉を含有する５０ｍＬのチューブを３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、１００ｎｇ／ｍＬのヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）及び１０μＭのＹ－２７６３２（又は同等のＲＯＣＫ阻害剤）を補充した２ｍＬのミニ腸培地（２ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１×Ｎ２サプリメント、１×Ｂ２７サプリメントを補充した高度なＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）。いかなる死細胞をも排除するために、トリパンブルーを使用して間葉細胞の数を計数する。上皮細胞汚染が間葉細胞溶液中に観察される場合、チューブ内の溶液をプレートに移し、室温で数分間インキュベートして、上皮細胞をプレートの底に付着させることができる。次いで、非接着間葉細胞をゆっくりと吸引し、その後のステップに使用することができる。
１つのウェル当たり１５０，０００個の間葉細胞を、超低接着丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する。水平層流フード下で、上皮構造をマイクロピペットで拾い上げる。間葉細胞を含有する各ウェルに、１つの上皮構造を加える。上皮構造は、実験の目的によって、間葉細胞と同じタイプのオルガノイド、間葉細胞と異なるタイプのオルガノイド、又はエンテロイドからのものであり得る。上皮構造がマイクロピペットチップの端部よりも大きい場合、チップの孔は、滅菌ハサミを使用して端部を切断することによって拡大され得る。プレートを３００×ｇで２分間遠心分離して、上皮構造及び間葉細胞を凝集させる（図１、パネルＢ）。プレートを３７℃で一晩インキュベートすると、組み合わされた細胞がオルガノイド形態を形成する（図１、パネルＣ）。各複合オルガノイドを、適切なサイズの穴を有するマイクロピペットを使用して収集し、２４ウェルプレート中の５０μＬのマトリゲル液滴中にプレーティングする。プレートに、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを補充した５００μＬのミニ腸培地を添加する。複合オルガノイドを、所望の時間、培養物中に維持する。いくつかの実施形態において、複合オルガノイドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日間、又は前述の日数のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の日数、例えば、１～４０日間、１～１０日間、１０～２０日間、２０～３０日間、３０～４０日間、１～２日間、１～３０日間、若しくは１０～４０日間にわたって培養される。
実施例２．異なる供給源からの上皮及び間葉の組換えは、機能的異種オルガノイドを確実に産生する
ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）及びヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）を別々に調製した。ＨＣＯを、ＧＦＰ発現ｉＰＳＣから分化した。ＨＩＯの単一解離間葉及びＨＣＯの上皮構造を調製し、実施例１に従って（１１日目又は１８日目のいずれかのオルガノイドを使用して）組換えて、ＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮異種オルガノイドを形成した。これらのオルガノイドは、組換えの４８時間後及び９日後に調べた場合、インビトロでの確実な組換え及び成長を呈し、腸間葉がＧＦＰ陽性結腸上皮を封入していた（図２Ａ）。免疫不全マウスの腎被膜上への生着後、１８日目の供給源オルガノイドから調製された異種オルガノイドは成熟し、管腔構造及び明らかに異なる微絨毛を形成した（図２Ｂ）。前駆結腸から生じる微絨毛は、ＧＦＰ及びＥ－カドヘリン（Ｅ－ＣＡＤ；ＣＤＨ１）に対して陽性であった。１８日目の供給源オルガノイドから調製された異種オルガノイドはまた、上皮層において特殊ＡＴリッチ配列結合タンパク質２（ＳＡＴＢ２）を発現したが、小腸特異的スクラーゼ－イソマルターゼ（ＳＩ）に対して陰性であり、このことは、これらのＨＣＯからの上皮構造がそれらの遠位特徴を維持したことを示唆している（図２Ｃ）。
１１日目の供給源オルガノイドから調製された異種オルガノイドは、小腸特異的ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）を発現したが、結腸特異的ＳＡＴＢ２に対して陰性であり、より若い上皮構造及びより未成熟な上皮構造が、周囲の間葉によって媒介される特性を呈するように再プログラムされ得るという興味深い特性を実証した（この場合、ＨＣＯ由来上皮は、小腸特性を呈する（図２Ｄ）。
ＨＩＯ及びヒト胃オルガノイド（ＨＧＯ）を別々に調製した。ＨＩＯの単一解離間葉及びＨＧＯの上皮構造を調製し、実施例１に従って組換えて、ＨＩＯ－間葉／ＨＧＯ－上皮異種オルガノイドを形成した。これらのオルガノイドは、組換え後４日目及び１１日目に確認した場合、インビトロでの確実な組換え及び成長を呈した（図２Ｅ）。
ＨＩＯ及びヒトエンテロイドを別々に調製した。エンテロイドは、間葉を欠くので、更なる処理は、必要なかった。ＨＩＯ及びエンテロイドの単一解離した間葉を実施例１に従って再結合して、ＨＩＯ－間葉／エンテロイド異種オルガノイドを形成した。これらのオルガノイドは、組換えの１０日後、２１日後、及び３１日後に確認した場合に、インビトロでの確実な組換え及び成長を呈した（図２Ｆ）。
実施例３．複合オルガノイドの生着
様々な異種オルガノイドを、免疫無防備状態のマウスモデルへの生着能について評価した。ｉＰＳＣから異なる臓器型に分化したヒトオルガノイドは、様々な量の間葉を有することが観察されている。例えば、知られている方法に従って産生されたＨＩＯは、上皮及びオルガノイド成熟を支持する豊富な間葉細胞を有するが、ＨＧＯ及びＨＣＯは、間葉細胞の数を著しく減少させ、エンテロイドは間葉を完全に欠き、これらのオルガノイド型の生着が困難になる。インビボ組織により酷似している間葉対上皮比で、別々のオルガノイド供給源からの間葉及び上皮成分を組換えるプロセスは、マウス腎臓被膜に移植された場合、オルガノイド生着及び成長のより大きな成功をもたらす（図３）。ＨＩＯ－間葉／ＨＩＯ－上皮、ＨＩＯ－間葉／ＨＣＯ－上皮、及びＨＩＯ－間葉／ＨＡＧＯ－上皮異種オルガノイドは全て、生着及び成熟の成功を呈した。ＨＩＯ－間葉／腸類オルガノイドもまた生着可能であった。更に、いくつかのｉＰＳＣ分化ＨＡＧＯ又はＨＣＯから間葉細胞を単離し、これらの間葉細胞をＨＡＧＯ又はＨＣＯ上皮構造と組換えることによって、ＨＡＧＯ間葉／ＨＡＧＯ上皮及びＨＣＯ間葉／ＨＣＯ上皮同種オルガノイドを調製し、それによって各オルガノイドにおいて利用可能な支持間葉細胞の数を濃縮した。生着後に成熟及び成長を示さないか、又は限定された成熟及び成長を示した対照ＨＡＧＯ及びＨＣＯオルガノイドと比較して、間葉濃縮ＨＡＧＯ及びＨＣＯオルガノイドは、レシピエント腎被膜組織上でより確実に成長した。
実施例４．複合食道オルガノイドの産生
ＨＧＯ及びＨＣＯと同様に、以前の方法によって産生されたヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）は、腸オルガノイドと比較して間葉細胞の数が減少している。食道オルガノイドを産生する方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１９／０７４７９３号に見ることができ、これは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
１２日目に、本明細書に記載のプロトコルを使用して、低接着９６ウェルプレート中で、単一解離ＨＩＯ間葉（約５０，０００個の細胞）及びインタクトなＨＥＯ上皮（１又は２つの構造）を組換えた。翌日、組換えＨＩＯ／ＨＥＯをマトリゲルに移し、２８日目にＮＳＧマウスの腎被膜下に移植するまでインビトロで培養した。移植組織を生着の８週間後に採取し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、処理し、画像化のためにパラフィン中に包埋した。図４Ａは、組換え手順の４８時間後のＨＩＯ間葉（ＧＦＰ陽性である）及びＨＥＯ上皮（ＧＦＰ陰性である）から構成される組み合わされたオルガノイド構造の画像を示す。図４Ｂは、マウス腎被膜への移植から８週間後のＨＩＯ－間葉／ＨＥＯ－上皮オルガノイドの画像を示す。図４Ｃは、移植されたＨＩＯ－間葉／ＨＥＯ－上皮オルガノイドのヘマトキシリン／エオシン染色を示す。図４Ｄは、ＧＦＰ（ＨＩＯ間葉を示す）及びＥ－カドヘリン（ＣＤＨ１；ＨＥＯ上皮を示す）の画像を示し、２つの層の明らかに異なる単離を示す。図４Ｅは、成熟食道上皮におけるケラチン５（keratin 5、ＫＲＴ５）、ケラチン１４（keratin 14、ＫＲＴ１４）、ケラチン１３（keratin 13、ＫＲＴ１３）、インボルクリン（involucrin、ＩＶＬ）、ｐ６３、及びＣＤＨ１の発現を示す免疫蛍光画像を示す。
前述の実施形態の少なくともいくつかでは、実施形態で使用される１つ以上の要素は、そのような置き換えが技術的に実現可能でない場合を除いて、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者は、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び構造に対して、他の様々な省略、付加、及び改変を行うことができることを理解されよう。そのような全ての改変及び変更は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、主題の範囲内に含まれることが意図されている。
本明細書における実質的に全ての複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数から単数へと、及び／又は単数から複数へと言い換えることができる。明確にするために、様々な単数／複数の置き換えを本明細書において明確に説明することができる。
一般的に、本明細書、及び特に添付された特許請求の範囲（例えば、添付された特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、一般に「オープンな」用語として意図されている（例えば、用語「含む（including）」は、典型的には「含むがこれに限定されない」と解釈され、用語「有する」は、典型的には「少なくとも有する」と解釈され、用語「含む（include）」は、典型的には「含むがこれに限定されない」と解釈されるなど）ことを当業者は理解するであろう。導入される請求項の詳述の具体的な数が意図されている場合には、そのような意図は、この請求項で明示的に詳述され、そのような詳述が存在しない場合にはそのような意図は存在しないことを当業者は更に理解するであろう。例えば、理解の補助として、下記の添付された特許請求の範囲は、請求項の詳述を導入するために、導入的語句「少なくとも１つ」及び「１つ以上」の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような語句の使用は、典型的には、同じ請求項が導入的語句「１つ以上」又は「少なくとも１つ」及び「ａ」又は「ａｎ」などの不定冠詞を含む場合であっても（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、典型的には「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味すると解釈される）、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の詳述の導入が、そのような導入された請求項の詳述を含有する任意の特定の請求項を、ただ１つのそのような詳述を含有する実施形態に限定することを意味すると解釈され、同じことが、請求項の詳述を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、導入された請求項の詳述の特定の数が明示的に詳述されている場合でも、そのような詳述が、典型的には、少なくとも詳述された数を意味する（例えば、他の修飾語句なしでの「２つの詳述」という単なる詳述は、少なくとも２つの詳述又は２つ以上の詳述を意味する）と解釈されることを当業者は認識するであろう。更に、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つ等」に類似する慣習が使用される場合では、通常、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒に有するシステム等が含まれるがこれらに限定されないであろう）。Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つ等」に類似する慣習が使用されている場合では、通常、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒に有するシステム等が含まれるがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語及び／又は離接語句も、典型的には、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図すると理解されることを当業者は更に理解するであろう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループによって説明されている場合、これにより、本開示は、マーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループによっても説明されることを当業者は認識するであろう。
当業者に理解され得るように、文書として記述するという観点等のあらゆる目的のために、本明細書で開示されている全ての範囲は、あらゆる可能な部分範囲及びこれらの部分範囲の組み合わせも包含する。列挙されているあらゆる範囲を、少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分等に分解される同じ範囲を十分に説明して可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲を、下３分の１、中３分の１及び上３分の１等に容易に分解することができる。当業者にも理解され得るように、「最大」、「少なくとも」、「超」、「未満」等の全ての言葉は、詳述される数を含み、本明細書で考察されるように後に部分的範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解され得るように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３つの項目を有するグループは、１、２、又は３つの項目を有するグループを指す。同様に、１～５つの項目を有するグループは、１、２、３、４、又は５つの項目を有するグループを指し、以下同様である。
本明細書では様々な態様及び実施形態が開示されているが、当業者にはその他の態様及び実施形態が明らかであるであろう。本明細書で開示されている様々な態様及び実施形態は説明を目的としており、限定していることを意図されておらず、真の範囲及び趣旨は下記の特許請求の範囲で示される。
公開及び未公開の出願、特許、及び文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、本明細書の一部となる。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が明細書に含まれる開示と矛盾する範囲まで、明細書は、そのような矛盾する資料に優先する、及び／又は優先することを意図している。
参考文献
Ｋ．Ｗ．ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｆｏｒｅｇｕｔ ｔｉｓｓｕｅｓ，ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，２０１４．
Ｊ．Ｏ．Ｍｕｎｅｒａ，Ｎ．Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｓ．Ａ．Ｒａｎｋｉｎ，Ｄ．Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｍａｈｅ，Ｊ．Ｅ．Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｋ．Ｌ．Ｓｉｎａｇｏｇａ，Ａ．Ｚａｒｚｏｓｏ－Ｌａｃｏｓｔｅ，Ｊ．Ｒ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．Ｈｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃｈａｔｕｖｅｄｉ，Ｊ．Ｒ．Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈａｎｎｏｎ，Ａ．Ｍ．Ｚｏｒｎ，Ｍ．Ａ．Ｈｅｌｍｒａｔｈ，Ｊ．Ｍ．Ｗｅｌｌｓ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＭＰ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２１（２０１７）５１－６４．ｅ６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．０５．０２０．
Ｃ．Ｌ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．Ｍａｈｅ，Ｊ．Ｍｕｎｅｒａ，Ｊ．Ｃ．Ｈｏｗｅｌｌ，Ｎ．Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｈ．Ｍ．Ｐｏｌｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｃ．Ｎ．Ｍａｙｈｅｗ，Ｙ．Ｓｕｎ，Ｇ．Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｓｐｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｗｅｌｌｓ，Ｍ．Ａ．Ｈｅｌｍｒａｔｈ，Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（２０１４）１３１０－１３１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍ．３７３７．
Ｍ．Ｍ．Ｍａｈｅ，Ｎ．Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｃ．Ｌ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｎ．Ｆ．Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｈｅｌｍｒａｔｈ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｂｉｏｐｓｙ，ＪｏＶＥ Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（２０１５）ｅ５２４８３．
Ｍ．Ｍ．Ｍａｈｅ，Ｎ．Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｍ．Ｐｏｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｈｅｌｍｒａｔｈ，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ｉｎ：Ｏｒｇａｎ Ｒｅｇｅｎ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１７：ｐｐ．２２９－２４５．

Claims (38)

  1. 複合オルガノイドを産生する方法であって、
    ａ）１つ以上のオルガノイドから単離された単一解離間葉細胞を得ることと、
    ｂ）オルガノイド又はエンテロイドから単離された上皮構造を得ることと、
    ｃ）前記単一解離間葉細胞と前記上皮構造とを組み合わせることと、
    ｄ）組み合わされた前記単一解離間葉細胞及び前記上皮構造を培養して、前記複合オルガノイドを形成することと、を含む、方法。
  2. 前記単一解離間葉細胞を得ることが、前記１つ以上のオルガノイドから前記単一解離間葉細胞を単離することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記上皮構造を得ることが、前記オルガノイド又はエンテロイドから前記上皮構造を単離することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記単一解離間葉細胞、若しくは前記上皮構造、又は両方が、機械的解離及び濾過によって単離される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記単一解離間葉細胞及び前記上皮構造が、遠心分離によって組み合わされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記複合オルガノイドにおける間葉細胞の数が、前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドの間葉細胞の元の数よりも多く、その結果、前記複合オルガノイドが、濃縮された間葉を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. １）前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイド、及び２）前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. １）前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイドが、腸組織型を含み、２）前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドが、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイドが、小腸オルガノイド、任意選択でヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイドの前記組織型と、前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドの前記組織型とが、異なる、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイドの前記組織型と、前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドの前記組織型とが、異なり、前記単一解離間葉細胞による前記上皮構造の再パターン形成が、起こらず、その結果、前記複合オルガノイドの上皮が、前記オルガノイド又はエンテロイドの前記組織型を維持し、
    任意選択で、前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドが、オルガノイドであり、前記上皮構造が単離される前記オルガノイドが、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるか、
    あるいは任意選択で、前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドが、エンテロイドであり、前記エンテロイドが、成体組織に由来する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドが、オルガノイドであり、前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイドの前記組織型と、前記上皮構造が単離される前記オルガノイドの前記組織型とが、異なり、前記単一解離間葉細胞による前記上皮構造の再パターン形成が、起こり、その結果、前記複合オルガノイドの上皮が、前記１つ以上のオルガノイドの前記組織型の特性を呈し、任意選択で、前記上皮構造が単離される前記オルガノイドが、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイドの前記組織型と、前記上皮構造が単離される前記オルガノイド又はエンテロイドの前記組織型とが、同じである、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記１つ以上のオルガノイド、及び前記オルガノイド又はエンテロイドが、各々、前記食道、胃、肝臓、腸、又は結腸組織型のうちの１つのみを含み、その結果、得られる複合オルガノイドが、１つの組織型を含む同種オルガノイドである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記１つ以上のオルガノイドが、第１の対象からの多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来し、前記オルガノイド又はエンテロイドが、第２の対象からのＰＳＣに由来するか、又は第２の対象からの胃腸組織から単離される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第１の対象及び前記第２の対象が、哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１の対象及び前記第２の対象が、ヒトである、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記第１の対象及び前記第２の対象が、同じ個体である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記複合オルガノイドをレシピエント対象に移植することを更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記レシピエント対象が、前記第１の対象又は前記第２の対象である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記複合オルガノイドが、同等の非複合オルガノイド又はエンテロイドと比較して、前記レシピエント対象においてより大きな生着及び成長を呈する、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. １）前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイド、又は２）前記上皮構造が単離される前記オルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方が、１つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含むように操作される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. １）前記単一解離間葉細胞が単離される前記１つ以上のオルガノイド、又は２）前記上皮構造が単離される前記オルガノイド若しくはエンテロイド、又は両方が、遺伝子変異を含み、任意選択で、前記遺伝子変異が、疾患状態又は疾患状態のモデルに関連する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 複合オルガノイドであって、
    第１のオルガノイドから単一解離細胞として単離された間葉細胞を含む間葉と、
    第２のオルガノイド又はエンテロイドから上皮構造として単離された上皮細胞を含む上皮と、を含む、複合オルガノイド。
  25. 前記複合オルガノイドにおける間葉細胞対上皮細胞の数の比が、前記第２のオルガノイド又はエンテロイドの比よりも大きい、請求項２４に記載の複合オルガノイド。
  26. 前記第１のオルガノイド及び第２のオルガノイド又はエンテロイドが、各々、食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される組織型を含む、請求項２４又は２５に記載の複合オルガノイド。
  27. 前記第１のオルガノイドの前記組織型及び前記第２のオルガノイド又はエンテロイドの前記組織型が、同じである、請求項２６に記載の複合オルガノイド。
  28. 前記第１のオルガノイドの前記組織型及び前記第２のオルガノイド又はエンテロイドの前記組織型が、異なる、請求項２６に記載の複合オルガノイド。
  29. 前記間葉細胞が単離される前記第１のオルガノイドの前記組織型と、前記上皮細胞が単離される前記第２のオルガノイド又はエンテロイドの前記組織型とが、異なり、前記間葉細胞による前記上皮細胞の再パターン形成が、起こらず、その結果、前記複合オルガノイドの上皮が、前記上皮細胞が単離される前記第２のオルガノイド又はエンテロイドの前記組織型を維持し、
    任意選択で、前記第２のオルガノイド又はエンテロイドが、第２のオルガノイドであり、前記第２のオルガノイドが、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日齢、又は１４～３０、１５～３０、１８～３０、１５～２０、若しくは１５～２５日齢であるか、あるいは
    任意選択で、前記第２のオルガノイド又はエンテロイドが、第２のエンテロイドであり、前記第２のエンテロイドが、成体組織に由来する、請求項２８に記載の複合オルガノイド。
  30. 前記第２のオルガノイド又はエンテロイドが、第２のオルガノイドであり、前記間葉細胞が単離される前記第１のオルガノイドの前記組織型と、前記上皮細胞が単離される前記第２のオルガノイドの前記組織型とが、異なり、前記間葉細胞による前記上皮細胞の再パターン形成が、起こり、その結果、前記複合オルガノイドの前記上皮が、前記間葉細胞が単離される前記第１のオルガノイドの前記組織型の特性を呈し、任意選択で、前記第２のオルガノイドが、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日齢以下、又は８～１３、８～１０、若しくは１０～１３日齢である、請求項２８に記載の複合オルガノイド。
  31. 複合オルガノイドであって、
    食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第１の組織型を含む間葉と、
    食道、胃、肝臓、腸、若しくは結腸組織型、又はそれらの任意の組み合わせから選択される第２の組織型を含む上皮と、を含み、
    前記第１の組織型及び第２の組織型が、少なくとも１つの組織型の差異を有する、複合オルガノイド。
  32. １つ以上の外因性の核酸又はタンパク質を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の複合オルガノイド。
  33. 前記複合オルガノイドが、遺伝子変異を有するか、又は遺伝子変異を含むように操作され、任意選択で、前記遺伝子変異が、疾患状態又は疾患状態のモデルに関連する、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の複合オルガノイド。
  34. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法によって産生された、オルガノイド。
  35. 胃腸疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための、請求項２４～３４のいずれか一項に記載のオルガノイド。
  36. 候補治療剤をスクリーニングするための方法であって、請求項２４～３４のいずれか一項に記載のオルガノイドを、前記候補治療剤と接触させることと、前記オルガノイドに対する前記候補治療剤の効果を決定することと、を含む、方法。
  37. 前記オルガノイドが、遺伝子修飾され、任意選択で、疾患又はそのモデルを呈するように遺伝子修飾される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記オルガノイドの間葉及び／又は上皮が、遺伝子修飾され、任意選択で、疾患又はそのモデルを呈するように遺伝子修飾される、請求項３６又は３７に記載の方法。
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