CN117957309A - 血管化类器官 - Google Patents

Abstract

本文公开了包含中胚层血管网络和定形内胚层衍生物的类器官组合物。本文还公开了利用人多能干细胞来分化具有适当组织的多个胚层谱系的细胞的方法。这些类器官表现出脉管系统并且可用作研究内胚层衍生的器官发生和血管相互作用的模型。

Description

血管化类器官

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月19日提交的美国临时专利申请号63,235,032和2022年6月14日提交的美国临时专利申请号63,366,386的优先权权益。

技术领域

本公开的各方面总体上涉及包含分化的血管网络的类器官组合物、其制备方法和用途。

背景技术

血管内皮细胞(EC)的器官特异性特征早已被认识到。取决于驻留器官的物理和生物化学特性，人体中估计的6×10¹¹个EC在形态、功能和分子标记方面发展出显著的异质性。虽然动脉和静脉的EC形成通过紧密结合部连接的连续层，但是毛细管EC可以是连续的、有孔的或不连续的，推测是为了满足每个组织的不同生理需要。例如，血脑屏障(BBB)由紧密连接的EC组成以限制细胞旁扩散，而肝窦EC中的可渗透的开窗促进溶质的交换。最近的单细胞分析增强了人和小鼠中EC异质性的概念，并且进一步在转录和功能上鉴定了不同的EC亚群，甚至在同一血管床内。在大多数脊椎动物中，细胞特化响应于驱动独特特征的获得的内在(例如，细胞个体发育)和外在(例如，周围微环境)因素的组合而发生。然而，仍然不清楚在器官发生期间什么因素在驱动EC命运决定。

发明内容

本文公开了产生包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括：a)使多能干细胞与TGF-b通路活化剂、BMP通路活化剂和Wnt通路活化剂接触约24小时至约48小时；b)使步骤a)的细胞与TGF-b通路活化剂和BMP通路活化剂接触约24小时至约72小时，而不与Wnt通路活化剂接触，从而使多能干细胞分化成包含FOXFA2+定形内胚层和HAND1+侧板中胚层两者的中内胚层球状体。在一些实施方案中，使步骤a)和/或b)的细胞进一步与血清补充剂，任选地胎牛血清接触。

本文还公开了从本文公开的中内胚层球状体产生前肠球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括使中内胚层球状体与BMP通路抑制剂、TGF-b通路抑制剂和任选地Hedgehog通路活化剂接触足以使中内胚层球状体分化成包含SOX2+/FOXA2+前肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的前肠球状体的时间段。

本文还公开了从本文公开的中内胚层球状体产生中肠/后肠球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括使中内胚层球状体与Wnt通路活化剂和FGF通路活化剂接触足以使中内胚层球状体分化成包含CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的中肠/后肠球状体的时间段。

本文还公开了产生腹前前肠球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文公开的前肠球状体中的任何一种前肠球状体与视黄酸接触足以使前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段。

本文还公开了产生血管化肺类器官(vLuO)的方法。在一些实施方案中，该方法包括使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF以及任选地视黄酸通路活化剂接触足以使腹前前肠球状体分化成vLuO的时间段，其中该vLuO包含TTF1/NKX2-1+远端肺上皮祖细胞，对SOX9呈阳性，表现出分支形态发生，并且接收由源自FOXF1+脏壁中胚层的远端间充质分泌的FGF10信号传导。

本文还公开了产生血管化近端肺类器官的方法。在一些实施方案中，该方法包括a)使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF以及任选地视黄酸通路活化剂接触足以使腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，和b)使肺祖细胞与包含一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的近端肺特化培养基接触足以使肺祖细胞分化成血管化近端肺类器官的时间段；其中一种或多种FGF通路活化剂以大于用于产生远端肺类器官的浓度提供。

本文还公开了产生血管化小肠类器官(vHIO)的方法。在一些实施方案中，该方法包括使中肠/后肠球状体与以下物质接触：1)BMP通路抑制剂和VEGF，以及任选地R-脊椎蛋白和EGF，持续第一时间段；以及2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段，从而使中肠/后肠球状体分化成vHIO，其中该vHIO表达CDX2、GATA4和CDH17，对SOX2呈阴性，并且包含CD31+血管床。

本文还公开了产生血管化结肠类器官(vHCO)的方法。在一些实施方案中，该方法包括使中肠/后肠球状体与以下物质接触：1)BMP通路活化剂和VEGF，以及任选地EGF，持续第一时间段；2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段，从而使中肠/后肠球状体分化成vHCO，其中该vHCO表达SATB2和CDH17，并且包含CD31+血管床。

本文还公开了根据本文公开的方法中的任一种方法产生的中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、vLuO、血管化近端肺类器官、vHIO和vHCO。在一些实施方案中，本文公开的前肠球状体、中肠/后肠球状体和腹前前肠球状体包含内皮祖细胞。

在以下编号的实施方式中提供了本公开的示例性实施方式：

1.一种产生包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体的方法，所述方法包括：

a)使多能干细胞与TGF-b通路活化剂、BMP通路活化剂和Wnt通路活化剂接触约24小时至约48小时；以及

b)使步骤a)的细胞与TGF-b通路活化剂和BMP通路活化剂接触约24小时至约72小时，而不与Wnt通路活化剂接触；

从而使所述多能干细胞分化成包含FOXA2+定形内胚层和HAND1+侧板中胚层两者的中内胚层球状体；

其中使步骤a)和/或b)的细胞进一步与血清补充剂，任选胎牛血清接触。

2.根据实施方案1所述的方法，其中所述侧板中胚层围绕所述中内胚层球状体中的所述定形内胚层。

3.根据实施方案1或2所述的方法，其中步骤a)进行约26小时、27小时、28小时、29小时或30小时，任选地约28小时。

4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中步骤b)进行约42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时或60小时，任选地约44小时。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的TGF-b通路活化剂是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、活化素(Activin)A、活化素B、Nodal、BMP、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地活化素A。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的TGF-b通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL或150ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP4。

8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的BMP通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新(aloisine)、靛玉红(indirubin)、阿特波龙(alsterpaullone)、肯帕罗酮(kenpaullone)、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。

10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、21μM、22μM、23μM或24μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地9μM、10μM、11μM或12μM。

11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中在步骤a)的所述接触之前，所述多能干细胞呈球状体的形式。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多能干细胞通过聚集形成球状体，任选地在聚集孔中，任选地其中聚集的细胞数目为或为约200个至4000个、300个至3000个、500个至2000个、600个至1500个或750个至1250个细胞。

13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中在步骤a)和b)的持续时间内，所述多能干细胞保持悬浮，任选地伴随振荡，和/或不作为单层。

14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述FOXA2+定形内胚层和所述HAND1+侧板中胚层处于约1:1的比率。

15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法制备的中内胚层球状体。

16.一种从中内胚层球状体产生前肠球状体的方法，所述方法包括使中内胚层球状体与BMP通路抑制剂、TGF-b通路抑制剂和任选地Hedgehog通路活化剂接触足以使所述中内胚层球状体分化成包含SOX2+/FOXA2+前肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的前肠球状体的时间段。

17.根据实施方案16所述的方法，其中足以使所述中内胚层球状体分化成前肠球状体的所述时间段为约2天至6天，诸如约2天、3天、4天、5天或6天。

18.根据实施方案16或17所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂是头发生素(Noggin)、多索吗啡(Dorsomorphin)、RepSox、LY364947、LDN193189、卵泡抑素(follistatin)、脊索发生素(chordin)或它们的任何组合，任选地头发生素。

19.根据实施方案16至18中任一项所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂以一定浓度提供，所述浓度为约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

20.根据实施方案16至19中任一项所述的方法，其中所述TGF-b通路抑制剂是A8301、RepSox、LY365947、SB431542或它们的任何组合，任选地SB431542。

21.根据实施方案16至20中任一项所述的方法，其中所述TGF-b通路抑制剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地10μM。

22.根据实施方案16至21中任一项所述的方法，其中所述Hedgehog通路活化剂为平滑激动剂(Smoothened agonist，SAG)。

23.根据实施方案16至22中任一项所述的方法，其中所述Hedgehog通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM或5μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地1μM。

24.根据实施方案16至23中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述中内胚层球状体与血管内皮生长因子(VEGF)接触，以产生围绕所述SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。

25.根据实施方案16至24中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述中内胚层球状体与视黄酸通路活化剂接触，任选地其中所述视黄酸通路活化剂是视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB、AM580或它们的任何组合。

26.根据实施方案16至25中任一项所述的方法，其中所述中内胚层球状体不与Wnt通路活化剂和/或FGF通路活化剂接触。

27.一种从中内胚层球状体产生中肠/后肠球状体的方法，所述方法包括使中内胚层球状体与Wnt通路活化剂和FGF通路活化剂接触足以使所述中内胚层球状体分化成包含CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的中肠/后肠球状体的时间段。

28.根据实施方案27所述的方法，其中足以使所述中内胚层球状体分化成中肠/后肠球状体的所述时间段为约2天至6天。

29.根据实施方案27或28所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。

30.根据实施方案27至29中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

31.根据实施方案27至30中任一项所述的方法，其中所述FGF通路活化剂是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF4。

32.根据实施方案27至31中任一项所述的方法，其中所述FGF通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

33.根据实施方案27至32中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述中内胚层球状体与血管内皮生长因子(VEGF)接触，以产生围绕所述CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。

34.根据实施方案16至33中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

35.根据实施方案16至34中任一项所述的方法，其中所述中内胚层球状体是根据实施方案15所述的中内胚层球状体。

36.根据实施方案16至26、34至35中任一项所述的方法产生的前肠球状体。

37.根据实施方案27至35中任一项所述的方法产生的中肠/后肠球状体。

38.一种产生腹前前肠球状体的方法，所述方法包括使根据实施方案16至26、34至35中任一项所述的方法产生的前肠球状体与视黄酸接触足以使所述前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段。

39.根据实施方案38所述的方法，其中足以使所述前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段为约1天。

40.一种产生血管化远端肺类器官(vLuO)的方法，所述方法包括：

a)使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF以及任选地视黄酸通路活化剂接触足以使所述腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，以及

b)使所述肺祖细胞与包含Wnt通路活化剂、一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的远端肺特化培养基接触足以使所述肺祖细胞分化成vLuO的时间段；

其中所述vLuO包含TTF1/NKX2-1+远端肺上皮祖细胞，对SOX9呈阳性，表现出分支形态发生，并且接收由源自FOXF1+脏壁中胚层的远端间充质分泌的FGF10信号传导。

41.根据实施方案40所述的方法，其中所述腹前前肠球状体包含围绕所述SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。

42.根据实施方案40或41所述的方法，其中所述腹前前肠球状体是通过根据实施方案38或39所述的方法产生的所述腹前前肠球状体。

43.根据实施方案40至42中任一项所述的方法，其中将步骤a)的所述腹前前肠球状体包埋在基底膜基质中，并且在静置培养物中接触第一时间段，并且在振荡培养物中接触第二时间段，其中所述第二时间段的所述振荡促进营养循环并促进血管形成。

44.根据实施方案43所述的方法，其中所述第一时间段为1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天，并且/或者所述第二时间段为5天、6天、7天、8天、9天或10天，任选地7天。

45.根据实施方案40至44中任一项所述的方法，其中所述远端肺特化培养基还包含地塞米松(dexamethasone)、cAMP和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。

46.根据实施方案40至45中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或步骤b)的所述Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。

47.根据实施方案40至46中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或步骤b)的所述Wnt通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地3μM。

48.根据实施方案40至47中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF通路活化剂选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF7和FGF10。

49.根据实施方案40至48中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF通路活化剂各自以一定浓度提供，所述浓度为约5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL或15ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地10ng/mL。

50.根据实施方案40至49中任一项所述的方法，其中所述BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP4。

51.根据实施方案40至50中任一项所述的方法，其中所述BMP通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

52.根据实施方案40至51中任一项所述的方法，其中所述视黄酸通路活化剂是视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB、AM580或它们的任何组合，任选地全反式视黄酸(ATRA)。

53.根据实施方案40至52中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

54.根据权利要求40至53中任一项所述的方法产生的vLuO，任选地其中所述vLuO对选自由FENDRR、NCKAP5、HPGD、KIT和PDE3B组成的组的一种或多种人肺EC标记物呈阳性。

55.根据实施方案54所述的vLuO，其包含FOXF1突变，任选地用作肺泡毛细管发育不良(ACD)、肺静脉错位(MPV)和/或肺淋巴管扩张的疾病模型。

56.一种产生血管化近端肺类器官的方法，所述方法包括：

a)使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF接触足以使所述腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，以及

b)使所述肺祖细胞与包含一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的近端肺特化培养基接触足以使所述肺祖细胞分化成血管化近端肺类器官的时间段；

其中所述一种或多种FGF通路活化剂以大于用于产生远端肺类器官的浓度提供。

57.根据实施方案56所述的方法，其中所述腹前前肠球状体包含围绕所述SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。

58.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述腹前前肠球状体是通过根据实施方案36或37所述的方法产生的所述腹前前肠球状体。

59.根据实施方案56至58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF通路活化剂选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF2和FGF10。

60.根据实施方案56至59中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF通路活化剂各自以一定浓度提供，所述浓度为约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

61.根据实施方案56至60中任一项所述的方法，其中所述近端肺特化培养基还包含地塞米松、cAMP和IMBX。

62.根据实施方案56至61中任一项所述的方法，其中所述腹前前肠球状体不与Wnt通路活化剂接触。

63.通过根据实施方案56至62中任一项所述的方法产生的血管化近端肺类器官。

64.根据实施方案40至53或56至62中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤期间将所述腹前前肠细胞包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中所述肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。

65.根据实施方案54或55所述的vLuO，或根据实施方案63所述的血管化近端肺类器官，其中将所述vLuO或所述血管化近端肺类器官包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中所述肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。

66.根据实施方案40至53或56至62中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述腹前前肠球状体与中期因子(MDK)、脑信号蛋白-3C(SEMA3C)、生长/分化因子-15(GDF15)或它们的任何组合接触。

67.一种方法，所述方法包括使根据实施方案54或55所述的vLuO或根据实施方案63所述的血管化近端肺类器官与灌注系统接触。

68.一种产生血管化小肠类器官(vHIO)的方法，所述方法包括使中肠/后肠球状体与以下物质接触：

1)BMP通路抑制剂和VEGF，以及任选地R-脊椎蛋白和EGF，持续第一时间段；以及

2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段；

从而使所述中肠/后肠球状体分化成vHIO，其中所述vHIO表达CDX2、GATA4和CDH17，对SOX2呈阴性，并且包含CD31+血管床。

69.根据实施方案68所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂是头发生素、多索吗啡、RepSox、LY364947、LDN193189、卵泡抑素、脊索发生素或它们的任何组合，任选地头发生素。

70.根据实施方案68或69所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂以一定浓度提供，所述浓度为约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

71.根据实施方案68至70中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

72.根据实施方案68至71中任一项所述的方法，其中将所述中肠/后肠球状体包埋在基底膜基质中，步骤1)在静置培养物中进行，并且步骤2)在振荡培养物中进行。

73.根据实施方案68至72中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天，并且/或者所述第二时间段为至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。

74.根据实施方案68至73中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体包含围绕所述CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。

75.根据实施方案68至74中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体是根据实施方案37所述的中肠/后肠球状体。

76.一种产生血管化结肠类器官(vHCO)的方法，所述方法包括使中肠/后肠球状体与以下物质接触：

1)BMP通路活化剂和VEGF，以及任选地EGF，持续第一时间段；以及

2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段；

从而使所述中肠/后肠球状体分化成vHCO，其中所述vHCO表达SATB2和CDH17，并且包含CD31+血管床。

77.根据实施方案76所述的方法，其中所述BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP2。

78.根据实施方案76或77所述的方法，其中所述BMP通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL或150ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地100ng/mL。

79.根据实施方案68至78中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

80.根据实施方案68至79中任一项所述的方法，其中将所述中肠/后肠球状体包埋在基底膜基质中，步骤1)在静置培养物中进行，并且步骤2)在振荡培养物中进行。

81.根据实施方案68至80中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天，并且/或者所述第二时间段为至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。

82.根据实施方案68至81中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体包含围绕所述CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。

83.根据实施方案68至82中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体是根据实施方案37所述的中肠/后肠球状体。

84.通过根据实施方案68至75中任一项所述的方法产生的vHIO，任选地包含FOXF1突变。

85.通过根据实施方案76至83中任一项所述的方法产生的vHCO，任选地包含FOXF1突变。

86.根据任何前述实施方案，其中所述方法是实施例8中公开的方法。

附图说明

除了本文所描述的特征之外，另外的特征和变化将通过以下对附图和示例性实施方案的描述而变得显而易见。应当理解，这些附图描绘实施方案并且不旨在限制范围。

图1A至图1B示出了来自15个人胎儿器官的EC的单细胞RNA-seq分析的实施方案。图1A示出了来自不同器官的EC的UMAP投影。首先基于每个器官中的CDH5表达选择EC(总共89,897个细胞)。图1B示出了来自每个器官的EC中的高度富集的基因的热图。

图2A至图2B示出了平衡来自人iPSC的内胚层和中胚层共分化的实施方案。图2A示出了内胚层-中胚层共发育的分化方案的示意图。图2B示出了在第3天球状体的免疫荧光染色。CHIR99021：12μM。比例尺：50μm。

图3A至图3C示出了肠管的血管形成和前部-后部(A-P)模式化的实施方案。图3A示出了脉管系统和肠管的共发育的分化方案的示意图。图3B示出了在第7天前肠(左图)与中肠/后肠(右图)球状体的免疫染色。图3C示出了前肠(左图)和中肠/后肠(右图)球状体中的脉管系统(CD31)的免疫染色。

图4A至图4D示出了远端肺类器官的血管形成的实施方案。图4A示出了脉管系统和远端肺上皮祖细胞的共发育的分化方案的示意图。图4B示出了在第17天远端肺上皮祖细胞的标记物的免疫染色。图4C示出了在第17天血管化远端肺类器官的免疫染色，显示CD31脉管系统的存在。图4D示出了在第20天人血管化远端肺类器官的明场视图。比例尺：200μm。

图5A至图5B示出了近端肺和远端肺的特性和发育的差异的实施方案。图5A示出了分支肺的示意图，其示出了关键的近端远端模式化标记物和调节剂。图5B示出了对远端肺组织和近端肺组织具有特异性的成熟标记物。

图6A至图6B示出了在人肺实施方案期间细胞-细胞相互作用的实施方案。基于人胎儿肺图谱进行CellChat分析。图6A示出了在发育的人胎儿肺中推测的细胞-细胞通信的全局视图。节大小与细胞的数量成比例。边缘厚度与推断的相互作用的数量成比例。图6B示出了从不同肺细胞到血管EC的配体-受体信号传导。节大小与发送方-接收方细胞对中的配体-受体相互作用的统计显著性成比例。显示了统计学显著性p<0.05的相互作用。

图7示出了体外灌注系统的示意图的实施方案。

图8示出了对照相比于FOXF1突变型iPSC衍生的EC或血管类器官(VO)中的EC标记物基因的qPCR结果的实施方案。N＝3次技术重复。

图9A至图9J示出了小肠和结肠类器官的血管形成的实施方案。图9A示出了脉管系统和小肠类器官的共发育的分化方案的示意图。在第30天后肠管(图9B)、肠类器官(图9C)和血管EC(图9D)的标记物的免疫染色。使用人结肠类器官(HCO)作为GATA4染色的阴性对照。图9F示出了脉管系统和结肠类器官的共发育的分化方案的示意图。在第30天后肠管(图9G)、结肠类器官(图9H)和血管EC(图9I)的标记物的免疫染色。人肠类器官(HIO)用作SATB2染色的阴性对照。比例尺：50μm。

图10示出了用于分化各种血管化类器官的示意图的实施方案。

图11示出了可用于本文所述的方法的示例性生长和分化培养基的实施方案。

图12示出了将人多能干细胞(hPSC)分化成血管化远端肺类器官、血管化人肠类器官和血管化结肠类器官的方法的概述的实施方案。

图13示出了从前肠衍生物产生血管化肺类器官的实施方案和从中肠/后肠衍生物产生血管化肠类器官和血管化结肠类器官的实施方案。

图14A至图14C示出了CHIR99201和BMP4对中胚层/内胚层比率的影响的实施方案。

图15A至图15C示出了表达人肺EC特异性标记物的血管化肺类器官的实施方案。图15A示出了来自人细胞图谱图的人肺特异性标记物。图15B示出了用包括人肺胚胎细胞标记物HPGD(绿色)的标记物免疫染色的人胎儿组织。图15C示出了免疫染色的血管化肺类器官和肠类器官，并且显示人肺胚胎细胞标记物HPGD(绿色)仅由血管化肺类器官而不是肠类器官表达。

图16A至图16E示出了通过单细胞RNA-seq表征第3天中胚层/内胚层类器官的实施方案。图16A示出了接受不同持续时间的BMP4刺激(0天、1天、2天和3天)的胚状体(EB)在第3天经受单细胞RNA-seq。图16B示出了在不同的BMP4处理持续时间下的细胞分布的特征图。图16C示出了基于标记物基因的d3中胚层/内胚层的簇集。图16D示出了d3中胚层/内胚层与CS7原肠胚形成人胚胎(AM：晚期中胚层；EM：新生中胚层；PS：原肠胚(Primitive Streak))的参考图比较。图16E示出了第3天中胚层/内胚层类器官对小鼠早期原肠胚形成胚胎的簇投影。i.小鼠E6.5至E8.5胚胎的UMAP。ii.第3天类器官对小鼠胚胎图的反向投影。BMP4的累积刺激增加了间充质细胞群体，同时减少了神经谱系(e.ii)。

图17A至图17D示出了通过单细胞RNA-seq表征第7天血管化前肠和中肠/后肠类器官的实施方案。图17A示出了前肠类器官(从第1天至第3天开始的1天BMP4处理)和中肠/后肠类器官(从第1天至第3天开始的3天BMP4处理)的代表性UMAP投影。图17B至图17D示出了人血管化肠管类器官对小鼠E8.75肠管图谱的反向投影。图17B示出了含有前部(A)和后部(P)部分的小鼠E8.75胚胎肠管。肠管(内胚层)、间充质和内皮细胞群体被分离成A-P亚簇。图17C示出了第7天前肠类器官对小鼠E8.75肠管的反向投影。与没有BMP4相比，用一天BMP4处理产生更纯的前肠管内胚层和更多的前内皮。图17D示出了第7天中肠/后肠类器官对小鼠E8.75管的反向投影。在第一个三天分化期间更长时间的BMP4处理诱导更多的后肠管内胚层、间充质和内皮。

图18A至图18B示出了通过免疫荧光染色获得的来自FOXF1突变型iPSC株系的vHLuO和vHIO的异常表型的实施方案。图18A示出了与正常对照(n＝2)相比，来自FOXF1突变型iPSC(n＝2)的D31远端vHLuO在上皮结构(FOXA2+)中显示混合的肺(TTF1+)和后肠管(CDX2+)。此外，FOXF1远端vHLuO丢失远端肺部标记物SOX9表达。图18B示出与正常对照(n＝2)相比，来自FOXF1突变型iPSC(n＝2)的D31 vHIO丢失后肠管标记物(CDX2)以及混合的前肠管群体(SOX2)。间充质标记物FOXF1也被显著抑制。肠标记物GATA4或内皮(CD31)没有明显的表达差异。结肠标记物SATB2在FOXF1突变型vHIO中略微升高。

具体实施方式

人器官发生是高度协调的过程，其需要源自不同胚层的细胞之间的协调。侧板中胚层(LPM)衍生的脏壁中胚层(SM)形成原肠管的外层。脏壁中胚层的适当排列为胚胎肠管及其衍生物的正常发育提供了关键的适当信号。一前一后，脉管系统与脏壁中胚层共发育并缠结以支持肠管发育，同时相互接收分子线索以采用器官特异性指纹。这种早期发育过程对于在早期妊娠阶段的人样品中捕获是具有挑战性的。

内胚层和中胚层细胞之间的谱系间串扰对于在早期发育期间维持适当的形态发生是重要的。然而，迄今为止，还没有以可靠方式含有两种谱系的实验易处理系统来研究它们在人器官发生期间的相互作用。尽管先前的工作主要集中于单个胚层分化，但注意到内胚层和中胚层特化共享类似的调节网络：两个胚层的形成通过抑制胰岛素和磷酸肌醇3-激酶信号传导来促进，并且可通过类似的一组生长因子(包括Wnt、BMP和TGF-b)来诱导，尽管这些信号传导通路的定量组合对于内胚层和中胚层多样化而言不同。基于这些发育线索，本文在一些实施方案中公开了使用多能干细胞通过平衡Wnt、BMP和TGF-b活化在单个3D类器官系统内同时诱导中胚层衍生的EC/间充质和内胚层衍生的肺或肠上皮两者的新方法。不同于用于分化由单个胚层产生的细胞的现有方案，本文公开的新方法的建立涉及用于维持两个胚层的小分子的各种组合的广泛测试，假定由中胚层衍生的细胞提供额外的内在信号。EC-上皮-间充质的密切共发育允许研究在整个发育过程中以器官特异性方式在多种细胞类型之间的直接信号转导。

先前已经建立了不同类型的iPSC衍生的类器官模型来以显著的细节重建它们的体内对应物的结构和生理学。在产生内胚层类器官方面的最新进展已经朝着改善上皮细胞的成熟和模式化的方向进行。尽管认识到人脉管系统在类器官形成期间与其他细胞类型共发育以提供关键的生长因子并改善区域模式化，但迄今为止，不存在含有从干细胞阶段与其他器官特异性细胞类型共发育的血管网络的类器官模型。为了使类器官血管化，最近的努力集中于从将终末分化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)掺入类器官、用VEGF扩增内源内皮祖细胞、体内移植、“芯片上器官(organ-on-a-chip)”工程化方法和引入机械刺激或可诱导的遗传回路的技术。尽管已经在脑、肝和肾类器官方面实现了各种水平的成功，但是这些方法对于使大多数内胚层器官(特别是在肺中)血管化不是有效的，并且没有概括细胞类型多样性、空间组织和使干细胞生长到组织中的生理学相关微环境。如本文所公开，提供了通过使用iPSC(例如，人iPSC)的共分化策略使这些类器官血管化的新方法，而不是以人工方式组装不同的细胞类型和类器官，这使得能够从器官发生的一开始就进行紧密的细胞-细胞通信。在本文中，我们设计了一种优化的方法(参见例如实施例8)，其中将胚胎体暴露于Nodal信号的连续刺激和几种其他形态发生素(如Wnt、FGF2和BMP4)的脉动诱导，从而基本上模拟早期原肠胚形成阶段。在随后的器官发生阶段期间，通过操作原始发育时期中的胚层组成和来自适当血管和间充质区室的支持来完成原肠管向不同器官的区域化。具有功能性脉管系统的类器官可以在培养皿中表现出更成熟的结构组织和功能性，并且可以用作细胞替代疗法和器官再生的更好来源。这种创新的共分化策略对广泛的科学界具有非凡的影响，因为它可以作为人iPSC衍生的平台来研究各种器官系统(包括但不限于本文提供的那些)中的早期发育事件。

在本文中，我们证明在本文提供的血管化肺类器官(vLuO)的实施方案中，与肺部上皮共发育的EC采用肺EC遗传标记。有趣的是，除了环境因素之外，器官的不同部分处的EC也可能具有不同的来源。例如，多能心肺祖细胞仅产生聚集在近端肺而不是远端肺的EC。由于在人类发育期间缺乏建模系统，不清楚EC特化是如何响应于驱动其独特特征的获得的内在和外在因素而发生的。在本文中，EC从iPSC阶段分化并与类器官中的其他细胞类型直接相互作用以随时间获得器官特异性特征。

考虑到在一些实施方案中，本文提供的内胚层类器官包含与其他细胞类型共发育的血管网络，它们可用作研究血管缺陷在例如肺和胃肠异常中的作用的有力工具。例如，在一些实施方案中，iPSC可以从具有FOXF1突变的患者获得，FOXF1是特异性标记脏壁中胚层并且在中胚层衍生的EC中保持高度表达的基因。由于FOXF1突变型患者在肺脉管系统和肠中均表现出异常，因此评估了FOXF1突变对血管发育本身的影响以及FOXF1突变型EC影响肺和肠类器官的形成和功能的机制。

超越了具有单细胞类型的二维(2D)培养或具有有限高通量生产能力的“芯片上器官”模型的限制，本文公开的三维(3D)血管化类器官的实施方案允许针对血管网络的异常生长的个性化药物筛选以及细胞替代疗法的大规模扩展和制造。

与集中于通过在后期发育阶段掺入终末分化的EC或“重置”EC来制备血管化类器官的现有模型相反，本文公开的方法(例如，实施例8)捕获内胚层和中胚层共发育期间的早期事件，以及单个球状体中血管祖细胞和原肠管之间的密切串扰，这精确地概括了人器官发生的整个过程，因为血管谱系在发育期间早期出现。本文公开的共发育方法提供了生理学相关的微环境，以在整个分化过程中驱动脉管系统、间充质和上皮层的模式化。使用这种方法，在本文公开的一些实施方案中可以克服产生肺类器官的两个主要障碍：缺乏脉管系统，并且缺乏AT1细胞，其形成95％的肺气体交换表面。使用现有的类器官模型不能实现这些目的，因为脉管系统不是人特异性的(通过体内移植在小鼠中血管化)或不是与类器官中的其他细胞类型共发育以在发育过程中捕获早期事件。

术语

在以下详细描述中，参考了附图，这些附图构成了本说明书的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号通常标识类似组件。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不旨在是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可做出其他改变。容易理解的是，如本文总体描述的和在附图中示出的，本公开的各方面可以按各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，在本文中明确考虑了所有这些配置。

除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员根据本公开阅读时通常理解的含义相同的含义。出于本公开的目的，以下术语解释如下。

本文的公开内容使用肯定性语言描述多个实施方案。本公开还包含其中全部或部分地将主题排除在外的实施方案，该主题如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。

在本文中使用的冠词“一个和一种(a/an)”指代该冠词的语法宾语中的一个或多于一个(例如，至少一个)。例如，“要素”意指一个/种要素或多于一个/种要素。

“约”意指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达10％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise、comprises和comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素组。“由...组成”意指包括但不限于，无论在短语“由...组成”之后是什么。因此，短语“由…组成”表示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其他要素。“基本上由…组成”意指包含在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中对所列要素指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由…组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其他要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列要素的活动或动作。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”或“患者”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指人或非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物，或鸟，例如鸡，以及任何其他脊椎动物或无脊椎动物。术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，哺乳动物具体包括但不限于灵长类动物，包含猿猴(黑猩猩、猿、猴子)和人、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿类动物、大鼠、小鼠、豚鼠等。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指导致可观察的效果的所述组合物或化合物的量。本发明所公开的主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定受试者和/或应用的期望反应的量的活性组合物或化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于组合物的活性、调配物、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病状的严重程度，以及所治疗受试者的身体状况和之前病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量逐步增加至最小有效量。本文考虑了对有效剂量的确定和调整，以及对何时和如何进行这种调整的评估。

如本文所用，术语“功能(function)”和“功能性(functional)”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指生物功能、酶促功能或治疗功能。

如本文所用，术语“抑制”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且可以指生物活性的降低或防止。减少可以是为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比，或是由前述值中的任何两个所限定的范围内的量。如本文所用，术语“延迟”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指将生物事件减慢、延缓或推迟到比以其他方式所预期的更晚的时间。延迟可以是一定百分比的延迟，该百分比为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或是由前述值中的任何两个所限定的范围内的量。术语抑制和延迟不一定表示100％的抑制或延迟。可以实现部分抑制或延迟。

如本文所用，术语“分离的”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指物质和/或实体已经(1)与最初产生时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其相关联的至少一些组分分离，和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与等于、约、至少、至少约、不超过或不超过约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％的最初与其相关的其他组分分离(或包含和/或跨越前述值的范围)。在一些实施方案中，分离的试剂为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％纯(或包含和/或跨越前述值的范围)。如本文所用，“分离的”物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其他组分)。如本文所用，术语“分离的细胞”可以指不包含在多细胞生物体或组织中的细胞。

如本文所用，“体内”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在活生物体(通常是动物、哺乳动物，包含人和植物)而不是组织提取物或死生物体内部执行方法。

如本文所用，“离体”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在自然条件几乎没有改变的情况下在活生物体外部执行方法。

如本文所用，“体外”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在生物条件外部例如在培养皿或试管中执行方法。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、自然出现在细胞中的那些、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及通过任何连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由是天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)的单体或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映异构形式)或两者的组合构成。经修饰的核苷酸可以在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包含例如用卤素、烷基、胺和叠氮基置换一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子类似的结构(如氮杂糖和碳环糖类似物)置换。碱基部分中的修饰的示例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其他熟知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)。术语“核酸分子”还包含所谓的“肽核酸”，其包括附着到聚酰胺主链的天然存在或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。“寡核苷酸”可以与核酸互换使用并且可以指双链或单链DNA或RNA。一种或多种核酸可以包含在可以用于在各种生物系统中扩增和/或表达一种或多种核酸的核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、逆转录病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、养粒(fosmid)、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)，或人类人工染色体(HAC))中。通常，载体或构建体还将含有包括但不限于以下的元件：启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多克隆位点、限制酶位点、表位、报告基因、选择标志物、抗生素选择标志物、靶向序列、肽纯化标签或附属基因，或它们的任何组合。

核酸或核酸分子可以包括一个或多个编码不同的肽、多肽或蛋白质的序列。这一个或多个序列可以相邻地接合在相同的核酸或核酸分子中，或在它们之间具有额外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个或300个碱基或是由前述长度中的任何两个所限定的范围内的任何长度的任何其他序列。如本文所用，术语核酸上的“下游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于先前序列的3'端之后。如本文所用，术语核酸上的“上游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于后续序列的5'端之前。如本文所用，术语“分组”在核酸上具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指两个或更多个直接在附近发生或在其之间具有额外核酸(例如接头、重复序列或限制酶位点)的序列，或任何其他序列，其长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个或300个碱基长的序列，或由前述长度中的任何两个所限定的范围内的任何长度，但通常其间不具有可编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列。

本文所描述的核酸包括核碱基。主要的、规范的、天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其他核碱基包括但不限于嘌呤、嘧啶、经修饰的核碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨基烯丙基碱基、染料标记碱基、荧光碱基或生物素标记碱基。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”具有其根据本说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指包括通过肽键连接的氨基酸的大分子。肽、多肽和蛋白质的许多功能是本领域已知的，并且包括但不限于酶、结构、转运、防御、激素或信号传导。尽管化学合成也是可用的，但是肽、多肽和蛋白质通常(但不总是)由核糖体复合物通过使用核酸模板以生物学方式产生。通过使用核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，例如一种以上肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、复制或融合。多于一种肽、多肽或蛋白质的这些融合可以在同一分子中相邻结合，或者在其间具有额外的氨基酸(例如接头、重复序列、表位或标签)，或者任何其他序列，其长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长，或由前述长度中的任何两个所限定的范围内的任何长度。如本文所用，术语“下游”在多肽上具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指在先前序列的C末端之后的序列。如本文所用，术语“上游”在多肽上具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指在后续序列的N末端之前的序列。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”具有其根据本说明书理解的普通而惯用的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期丰度的实际丰度。例如，物质、化合物或材料的纯度可以为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包含其间的所有小数。纯度可能会受到多余杂质的影响，包括但不限于核酸、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、载体、媒剂或污染物，或它们的任何组合。在一些实施方案中，物质、化合物或材料基本上不含宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、质粒DNA、污染性病毒、蛋白酶体、宿主细胞培养物组分、过程相关组分、支原体、热原、细菌内毒素和外来物质。可以使用包括但不限于以下的技术来测量纯度：电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、PCR、rtPCR、qPCR、色谱法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光谱法、UV-可见光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振、重量法或滴定，或它们的任何组合。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“产量”具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期总量的实际总量。例如，物质、化合物或材料的产量占预期总量的比例为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包含其间的所有小数。在任何生产步骤中，产率可能会受到以下因素的影响：反应或过程的效率、多余的副反应、降解、输入物质、化合物或材料的质量或所需物质、化合物或材料的损失。

如本文所用，“药学上可接受的”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且是指在所使用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒或者具有可接受的毒性水平的载体、赋形剂和/或稳定剂。如本文所用，“药学上可接受的”“稀释剂”、“赋形剂”和/或“载体”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且旨在包含任何和所有与对人类、猫、狗或其他脊椎动物宿主的施用兼容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是由联邦、州政府的监管机构或其他监管机构批准的，或在美国药典或其他公认的用于动物(包含人类以及非人类哺乳动物，如猫和狗)中的药典中列出的稀释剂、赋形剂和/或载体。术语稀释剂、赋形剂和/或“载体”可以指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类药物稀释剂、赋形剂和/或载体可以是无菌液体，如水和油，包含石油、动物油、植物油或合成来源的那些油。水、盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液可以用作液体稀释剂、赋形剂和/或载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。生理上可接受的载体的非限制性示例是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体还可以包括以下中的一种或多种：抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白；明胶；免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；以及非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)和如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂、膨胀剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释调配物等形式。调配物应适合施用方式。

冷冻保护剂是细胞组合物添加剂，其通过防止形成大冰晶来提高低温冷冻保存的效率和产量。冷冻保护剂包括但不限于DMSO、乙二醇、甘油、丙二醇、海藻糖、甲酰胺、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺、3-磷酸甘油酯、脯氨酸、山梨糖醇、二甘醇、蔗糖、三甘醇、聚乙烯醇、聚乙二醇或羟乙基淀粉。冷冻保护剂可以用作冷冻保存培养基的一部分，该冷冻保存培养基包含其他组分，如营养物(例如白蛋白、血清、牛血清、胎牛血清[FCS])，以提高细胞的解冻后可存活性。在这些冷冻保存培养基中，可以以以下浓度发现至少一种冷冻保护剂，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或是由前述数字中的任何两个所限定的范围内的任何百分比。

具有期望性质的其他赋形剂包括但不限于防腐剂、佐剂、稳定剂、溶剂、缓冲剂、稀释剂、增溶剂、去污剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨糖醇、纤维素、血清、氨基酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、硬脂酸镁、辛基苯酚乙氧基化物、苄索氯铵、硫柳汞、明胶、酯、醚、2-苯氧乙醇、尿素或维生素，或它们的任何组合。一些赋形剂可能是制造过程中的残留量或污染物，包括但不限于血清、白蛋白、卵清蛋白、抗生素、灭活剂、甲醛、戊二醛、β-丙内酯、明胶、细胞碎片、核酸、肽、氨基酸、或生长培养基成分或它们的任何组合。赋形剂的量可以以如下百分比存在于组合物中，该百分比为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％w/w或由上述数字中的任何两个所限定的范围内的任何重量百分比。

术语“药学上可接受的盐”具有根据本说明书理解的普通且惯用的含义，并且包含组合物或赋形剂的相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐，包括但不限于镇痛剂、治疗剂、其他材料等。药学上可接受的盐的示例包括衍生自无机酸如盐酸和硫酸的那些，以及衍生自有机酸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的那些。用于形成盐的合适无机碱的示例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐也可以与合适的有机碱形成，包含无毒且强度足以形成此类盐的那些。例如，该类别的此类有机碱可以包括但不限于单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，包含甲胺、二甲胺和三乙胺；单羟基烷基胺、二羟基烷基胺或三羟基烷基胺，包含单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，包含甘氨酸、精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；三羟甲基氨基乙烷。

适当的调配物取决于所选择的施用途径。本领域技术人员已知用于调配和施用本文所描述的化合物的技术。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于肠内、口服、直肠、局部、舌下、口腔、耳内、硬膜外、皮外、气雾剂、肠胃外递送，包含肌肉内、皮下、动脉内、静脉内、门静脉内、关节内、皮内、腹膜内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。药物组合物通常会根据具体的预期施用途径进行调整。

如本文所用，“载体”具有其根据说明书理解普通而惯用含义，并且是指促进化合物通过、递送和/或掺入至细胞、组织和/或身体器官的化合物、颗粒、固体、半固体、液体或稀释剂。

如本文所用，“稀释剂”具有其根据说明书所理解的普通而惯用的含义，并且是指药物组合物中缺乏药理活性但可能是药学上必需或期望的成分。例如，稀释剂可以用于增加质量太小而无法制造和/或施用的强效药物的体积。稀释剂也可以是用于溶解药物以通过注射、摄入或吸入来施用的液体。本领域中稀释剂的常见形式是缓冲水溶液，例如但不限于模拟人血组成的磷酸盐缓冲盐水。

如本文所用，术语“w/w％”或“wt/wt％”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且指以成分或试剂的重量占组合物总重量的百分比乘以100表示。如本文所用，术语“v/v％”或“vol/vol％”具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指以化合物、物质、成分或药剂的液体体积占组合物总液体体积的百分比乘以100表示。

干细胞

如本文所用，术语“全能干细胞”(也称为万能干细胞)具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是可以分化成胚胎细胞和胚胎外细胞类型的干细胞。这种细胞可以构建完整的、有活力的生物体。这些细胞是由卵子和精子细胞融合而成。由受精卵的前几个分裂产生的细胞也是全能的。

如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”，通常也缩写为ES细胞，具有根据说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且是指为多能的并且衍生自胚泡(即早期胚胎)的内细胞团的细胞。出于本公开的目的，术语“ESC”有时也广泛用于涵盖胚胎生殖细胞。

如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且涵盖可以分化成身体的几乎所有细胞类型的任何细胞，即衍生自三个胚层(生发上皮)中的任何一个的细胞，包含内胚层(内部胃壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是植入前胚泡的内细胞团细胞的后代，或通过诱导非多能细胞，如成体体细胞，通过强迫某些基因表达而获得。多能干细胞可以衍生自任何合适的来源。多能干细胞来源的示例包括哺乳动物来源，包含人、啮齿动物、猪和牛。

如本文所用，术语“诱导的多能干细胞(iPSC)”，通常也缩写为iPS细胞，具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指通过诱导某些基因的“强迫”表达而人工衍生自通常非多能细胞如成体体细胞的多能干细胞类型。hiPSC是指人iPSC。在本领域已知的一些方法中，通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞中来获得iPSC。转染可以通过使用病毒(如逆转录病毒或慢病毒)进行病毒转导来实现。经转染的基因可以包含主转录调节因子Oct-3/4(POU5F1)和Sox2，但是其他基因也可以增强诱导效率。3周到4周之后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上类似于多能干细胞，并且通常通过形态学选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择分离。如本文所用，iPSC包含小鼠中的第一代iPSC、第二代iPSC，以及人类诱导的多能干细胞。在一些方法中，逆转录病毒系统用于使用四种关键基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将人成纤维细胞转化为多能干细胞。在其他方法中，慢病毒系统用于用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。表达在iPSC中诱导的基因包括但不限于Oct-3/4(POU5F1)；Sox基因家族的某些成员(例如，Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如，Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如，C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、LIN28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2、或E-钙粘蛋白，或它们的任何组合。还设想了本领域常规已知的产生诱导性多能干细胞的其他方法。

如本文所用，术语“前体细胞”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且涵盖可以用于本文所描述的方法中的任何细胞，通过该细胞，一种或多种前体细胞获得自我更新或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些实施方案中，前体细胞是多能的或具有变成多能的能力。在一些实施方案中，对前体细胞进行外部因子(例如，生长因子)的处理以获得多能性。在一些实施方案中，前体细胞可以是全能(或全能)干细胞；多能干细胞(诱导或非诱导)；多能干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些实施方案中，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些实施方案中，前体细胞可以是经受处理的体细胞，使得通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予多能性。前体细胞包含胚胎干细胞(ESC)、胚胎癌细胞(EC)、外胚层干细胞(EpiSC)以及诱导性多能干细胞。

在发育生物学中，细胞分化是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“分化”或“定向分化”描述了一种过程，通过该过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶向细胞类型。特化靶细胞类型的特殊性可以通过可以用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包括但不限于遗传操作、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。

如本文所用，术语“饲养细胞”具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指支持多能干细胞生长的细胞，如通过将生长因子分泌到培养基中或展示在细胞表面上来支持多能干细胞生长的细胞。饲养细胞通常是贴壁细胞并且可能生长停滞。例如，饲养细胞因辐照(例如γ射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲或温和的化学固定(例如用甲醛或戊二醛)而生长停滞。然而，饲养细胞不一定必须生长停滞。饲养细胞可以用于如分泌生长因子、在细胞表面展示生长因子、使培养基解毒或合成胞外基质蛋白等目的。在一些实施方案中，饲养细胞与所支持的靶干细胞是同种异体的或异种异体的，这可能对下游应用有影响。在一些实施方案中，饲养细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是人细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠STO细胞、小鼠3T3细胞、小鼠SNL 76/7细胞、人成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人真皮成纤维细胞、人脂肪间充质细胞、人骨髓间充质细胞、人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞、人脐带间充质细胞、人胎儿肌细胞、人胎儿成纤维细胞或人成体输卵管上皮细胞。在一些实施方案中，使用由饲养细胞制备的条件培养基代替饲养细胞共培养物或与饲养细胞共培养物组合。在一些实施方案中，在靶干细胞增殖期间不使用饲养细胞。

细胞分化

在一些实施方案中，用于从多能细胞(例如，iPSCs或ESC)产生下游细胞类型的已知方法适用于本文所述的方法。在一些实施方案中，多能细胞衍生自桑椹胚。在一些实施方案中，多能干细胞是干细胞。在这些方法中使用的干细胞可以包括但不限于胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。胚胎干细胞可以衍生自胚胎内细胞团或衍生自胚胎性腺脊。胚胎干细胞或生殖细胞可以源自多种动物物种，包括但不限于包含人的各种哺乳动物物种。

在一些实施方案中，人胚胎干细胞用于产生定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合。在一些实施方案中，iPSC用于产生定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合。在一些实施方案中，使用人iPSC(hiPSC)来产生定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合。

在一些实施方案中，多能干细胞用一种或多种小分子化合物活化剂、抑制剂或生长因子处理一段时间，该一段时间为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、120小时、150小时、180小时、240小时、300小时，或是由前述时间中的任何两个所限定的范围(例如6小时至300小时、24小时至120小时、48小时至96小时、6小时至72小时或24小时至300小时)内的任何时间。在一些实施方案中，添加多于一种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，可以同时或分别添加多于一种的小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施方案中，多能干细胞在支持干细胞生长的生长培养基中培养。在一些实施方案中，多能干细胞在干细胞生长培养基中培养。在一些实施方案中，干细胞生长培养基是RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12或高级DMEM/F12。在一些实施方案中，干细胞生长培养基包括胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，干细胞生长培养基包括FBS，其浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如0％至20％、0.2％至10％、2％至5％、0％至5％或2％至20％)内的任何百分比。在一些实施方案中，干细胞生长培养基不含有异种异体组分。在一些实施方案中，生长培养基包括一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施方案中，多能干细胞由体细胞制备。在一些实施方案中，多能干细胞是由活检获得的生物组织制备的。在一些实施方案中，多能干细胞被冷冻保存。在一些实施方案中，体细胞被冷冻保存。在一些实施方案中，多能干细胞是由PBMC制备的。在一些实施方案中，人PSC是由人PBMC制备的。在一些实施方案中，多能干细胞是由冷冻保存的PBMC制备的。在一些实施方案中，PBMC在饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在经辐照的MEF饲养细胞基底上生长。

在一些实施方案中，iPSC在细胞培养物中扩增。在一些实施方案中，iPSC在基质胶(Matrigel)中扩增。在一些实施方案中，iPSC在包含ROCK抑制剂(例如，Y-27632)的细胞培养物中扩增。

在一些实施方案中，FGF、Wnt、BMP、TGF-b或视黄酸(RA)通路或它们的任何组合的蛋白质、活化剂或抑制剂用于模拟培养物中的发育，以获得本文所用的从多能干细胞分化的各种细胞类型。在一些实施方案中，与FGF、Wnt、BMP、TGF-b或RA信号传导通路相关的细胞成分，例如，这些通路的天然抑制剂、拮抗剂、活化剂或激动剂可以用于导致FGF、Wnt、BMP、TGF-b或RA信号传导通路的抑制或活化。在一些实施方案中，靶向与FGF、Wnt、BMP、TGF-b或视黄酸信号传导通路相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA用于抑制或活化这些通路。此外，本文公开的方法还可以涉及使用EGF通路活化剂作为促细胞分裂剂，其促进期望的细胞群体的增殖和生长。

在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合与Wnt通路活化剂或Wnt通路抑制剂接触。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括Wnt蛋白。在一些实施方案中，Wnt蛋白包括重组Wnt蛋白。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611或它们的任何组合。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括GSK3通路抑制剂。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括CHIR99021、CHIR98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8或TWS119或它们的任何组合。在一些实施方案中，Wnt通路抑制剂包括C59、PNU 74654、KY-02111、PRI-724、FH-535、DIF-1或XAV939，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用Wnt通路活化剂或Wnt通路抑制剂处理。本文所提供的Wnt通路活化剂或Wnt通路抑制剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。

在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合与FGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，FGF通路活化剂包括FGF蛋白。在一些实施方案中，FGF蛋白包括重组FGF蛋白。在一些实施方案中，FGF通路活化剂包括以下中的一种或多种：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15(FGF19、FGF15/FGF19)、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23。在一些实施方案中，细胞没有用FGF通路活化剂处理。本文所提供的FGF通路活化剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。

在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合与BMP通路活化剂或BMP通路抑制剂接触。在一些实施方案中，BMP通路活化剂包括BMP蛋白。在一些实施方案中，BMP蛋白是重组BMP蛋白。在一些实施方案中，BMP通路活化剂包括BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1或IDE2，或它们的任何组合。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂包括头发生素、多索吗啡、RepSox、LY364947、LDN193189、SB431542或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用BMP通路活化剂或BMP通路抑制剂处理。本文所提供的BMP通路活化剂或BMP通路抑制剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。

在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合与视黄酸通路活化剂接触。在一些实施方案中，视黄酸通路活化剂包括视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB或AM580，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用视黄酸通路活化剂处理。本文所提供的视黄酸通路活化剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。

在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合与EGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂是EGF。在一些实施方案中，细胞没有用EGF通路活化剂处理。本文所提供的EGF通路活化剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。

在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层、侧板中胚层、中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前前肠球状体、血管化远端肺类器官、血管化近端肺类器官、血管化小肠类器官、血管化结肠类器官或它们的任何组合与TGF-β(TGF-b)通路活化剂或TGF-b通路抑制剂接触。在一些实施方案中，TGF-b家族包括骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone)、活化素和Nodal通路。在一些实施方案中，TGF-b通路活化剂包括TGF-b 1、TGF-b 2、TGF-b 3、活化素A、活化素B、Nodal、BMP、IDE1、IDE2或它们的任何组合。在一些实施方案中，TGF-b通路抑制剂包括A8301、RepSox、LY365947、SB431542或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用TGF-b通路活化剂或TGF-b通路抑制剂处理。本文所提供的TGF-b通路活化剂或TGF-b通路抑制剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。

在一些实施方案中，对于任何小分子化合物、通路活化剂、通路抑制剂或生长因子，接触细胞持续的时间为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、120小时、150小时、180小时、240小时、300小时或在由上述时间中的任何两个所限定的范围例如1小时到300小时、24小时到120小时、48小时到96小时、6小时到72小时或24小时到300小时内的任何时间。在一些实施方案中，添加多于一种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，可以同时或分别添加多于一种的小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施方案中，PSC分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，PSC分化成侧板中胚层。在一些实施方案中，PSC分化成中内胚层球状体。在一些实施方案中，PSC分化成前肠球状体。在一些实施方案中，PSC分化成中肠/后肠球状体。在一些实施方案中，PSC分化成腹前前肠球状体。在一些实施方案中，PSC分化成血管化远端肺类器官。在一些实施方案中，PSC分化成血管化近端肺类器官。在一些实施方案中，PSC分化成血管化小肠类器官。在一些实施方案中，PSC分化成血管化结肠类器官。

在一些实施方案中，本文公开的任何细胞都可以冷冻保存以供以后使用。在一些实施方案中，根据本领域通常已知的方法冷冻保存细胞。

制备中内胚层和血管化肺类器官的方法

从多能干细胞及其前体(诸如定形内胚层、肠内胚层、前肠内胚层或中肠/后肠内胚层)产生各种类型的类器官通常是本领域已知的。示例性方法可以见于PCT公开WO 2011/140441、WO 2015/183920、WO 2016/061464、WO 2017/192997、WO 2018/106628、WO 2018/200481、WO 2019/074793、WO 2020/160371、WO 2021/030373和WO 2020/243633中，其中的每一个特此通过引用整体明确地并入。

从多能干细胞产生中胚层(例如，侧板中胚层)的方法可以见于PCT公开WO 2021/041443中，其特此通过引用整体明确地并入。

肺类器官可通过本领域通常已知的一些方法产生。从多能干细胞产生的肺类器官的实例可以见于PCT公开WO 2019/074793、美国公开2016/0312191、2018/0344901和2020/0149004以及Gotoh等人“Generation of Alveolar Epithelial Spheroids via IsolatedProgenitor Cells from Human Pluripotent Stem cells”Stem Cell Reports(2014)3(3):394-403；Dye等人“In vitro generation of human pluripotent stem cellderived lung organoids”eLife4:e05098；Hawkins等人“Prospective isolation ofNKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells”J.Clin.Invest.(2017)127(6):2277-2294；McCauley等人“Efficient Derivation ofFunctional Human Airway Epithelium from Pluripotent Stem Cells via TemporalRegulation of Wnt Signaling”Cell Stem Cell(2017)20(6):844-857；Chen等人“Three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stemcells”Nature Cell Biology(2017)19:542-549；以及Miller等人“Generation of lungorganoids from human pluripotent stem cells in vitro”Nat.Protoc.(2019)14(2):518-540中，其中的每一个特此通过引用整体明确地并入。

在一些实施方案中，根据本领域的这些方法中的一些方法产生的类器官(例如肺类器官)可受益于从本文公开的包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体进行，例如以增强类器官的血管形成而不需要异位移植。

小肠(肠)类器官可通过本领域通常已知的一些方法产生。从多能干细胞产生的肠类器官的实例可以见于PCT公开WO 2011/140441、WO 2016/061464、WO 2018/200481、WO2020/160371和WO 2021/030373中，其中的每一个特此通过引用整体明确地并入。在一些实施方案中，根据本领域的这些方法中的一些方法产生的肠类器官可受益于从本文公开的包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体进行，例如以增强类器官的血管形成而不需要异位移植。

大肠(结肠)类器官可通过本领域通常已知的一些方法产生。从多能干细胞产生的结肠类器官的实例可以见于PCT公开WO 2018/106628中，其特此通过引用整体明确地并入。在一些实施方案中，根据本领域的这些方法中的一些方法产生的结肠类器官可受益于从本文公开的包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体进行，例如以增强类器官的血管形成而不需要异位移植。

本文所述的一些实施方案是使用中内胚层群体(例如中内胚层球状体)制备类器官的方法。这些中内胚层群体或中内胚层球状体包含定形内胚层和侧板中胚层两者。从这些中内胚层球状体分化的类器官具有大量的上皮和间充质，并且还表现出血管形成，这是通过正常分化过程在以前的类器官中未看到的特征，并且仅通过外源性混合或异位移植到动物中来实现。本文还公开了从多能干细胞产生这些中内胚层球状体的方法。

本文所述的一些实施方案是产生包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括a)使多能干细胞与TGF-b通路活化剂、BMP通路活化剂和Wnt通路活化剂接触；b)使步骤a)的细胞与TGF-b通路活化剂和BMP通路活化剂接触，而不与Wnt通路活化剂接触，从而使多能干细胞分化成包含FOXF2+定形内胚层和HAND1+侧板中胚层两者的中内胚层球状体。在一些实施方案中，FOXA2+定形内胚层和HAND1+侧板中胚层处于约1:2、1:1.5、1:1、1.5:1或2:1的比率。在一些实施方案中，FOXA2+定形内胚层和HAND1+侧板中胚层处于约1:1的比率。在一些实施方案中，步骤a)和b)的TGF-b通路活化剂和/或BMP通路活化剂不必相同。在一些实施方案中，步骤a)和b)的TGF-b通路活化剂和/或BMP通路活化剂是相同的。在一些实施方案中，使步骤a)和/或b)的细胞进一步与血清补充剂(如胎牛血清(FBS)或FBS取代物)接触。在一些实施方案中，血清补充剂的浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，或由前述值中的任何两个所限定的范围。在一些实施方案中，使步骤a)和/或b)的细胞与血清补充剂接触，使得在步骤b)期间血清补充剂的浓度高于在步骤a)期间的浓度。在一些实施方案中，侧板中胚层围绕中内胚层球状体中的定形内胚层。在一些实施方案中，步骤a)进行的时间量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约24小时至约48小时，例如24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时或48小时，或由前述值中的任何两个所限定的范围。在一些实施方案中，步骤a)进行约26小时、27小时、28小时、29小时或30小时。在一些实施方案中，步骤a)进行约28小时。在一些实施方案中，步骤b)进行的时间量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约24小时至约72小时，例如24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时或72小时，或由前述值中的任何两个所限定的范围。在一些实施方案中，步骤b)进行不超过72小时。在一些实施方案中，步骤b)进行约42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时或60小时，或由前述值中的任何两个所限定的范围。在一些实施方案中，步骤b)进行约44小时。在一些实施方案中，步骤a)和/或b)的TGF-b通路活化剂是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、活化素A、活化素B、Nodal、BMP、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地活化素A。在一些实施方案中，步骤a)和/或b)的TGF-b通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL或150ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，TGF-b通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL。在一些实施方案中，步骤a)和/或b)的BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP4。在一些实施方案中，步骤a)和/或b)的BMP通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、21μM、22μM、23μM或24μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地9μM、10μM、11μM或12μM。在一些实施方案中，在步骤a)的接触之前，多能干细胞呈球状体的形式。在一些实施方案中，通过聚集使多能干细胞形成为球状体。在一些实施方案中，使用Aggrewell板(StemCellTechnologies)或形成细胞群体的规则大小的聚集体的其他合适取代物将多能干细胞形成为球状体。在一些实施方案中，在步骤a)和b)的持续时间内，使多能干细胞保持悬浮，任选地伴随振荡，和/或不作为单层。

本文还公开了通过本文公开的任何方法产生的中内胚层球状体。

本文还公开了从本文公开的中内胚层球状体产生前肠球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括使中内胚层球状体与BMP通路抑制剂、TGF-b通路抑制剂和任选地Hedgehog通路活化剂接触足以使中内胚层球状体分化成包含SOX2+/FOXA2+前肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的前肠球状体的时间段。在一些实施方案中，足以使中内胚层球状体分化成前肠球状体的时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约2天至6天，例如约2天、3天、4天、5天或6天，或由前述值中的任何两个所限定的范围。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂是头发生素、多索吗啡、RepSox、LY364947、LDN193189、卵泡抑素、脊索发生素或它们的任何组合，任选地头发生素。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，TGF-b通路抑制剂是A8301、RepSox、LY365947、SB431542或它们的任何组合，任选地SB431542。在一些实施方案中，TGF-b通路抑制剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地10μM。在一些实施方案中，Hedgehog通路活化剂是Smoothened激动剂(SAG)。在一些实施方案中，Hedgehog通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为约0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM或5μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地1μM。在一些实施方案中，该方法还包括使中内胚层球状体与血管内皮生长因子(VEGF)接触以产生围绕SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。在一些实施方案中，VEGF以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165。在一些实施方案中，该方法还包括使中内胚层球状体与视黄酸通路活化剂接触，任选地其中该视黄酸通路活化剂是视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB、AM580或它们的任何组合。在一些实施方案中，中内胚层球状体不与Wnt通路活化剂和/或FGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，中内胚层球状体不与FGF2接触。在一些实施方案中，中内胚层球状体是通过本文公开的任何一种方法产生的中内胚层球状体。

本文还公开了通过本文公开的任何方法产生的前肠球状体。

本文还公开了从本文公开的中内胚层球状体产生中肠/后肠球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括使中内胚层球状体与Wnt通路活化剂和FGF通路活化剂接触足以使中内胚层球状体分化成包含CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的中肠/后肠球状体的时间段。在一些实施方案中，足以使中内胚层球状体分化成中肠/后肠球状体的时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约2天至6天。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，FGF通路活化剂是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF4。在一些实施方案中，FGF通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，该方法还包括使中内胚层球状体与血管内皮生长因子(VEGF)接触以产生围绕CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。在一些实施方案中，VEGF以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165。在一些实施方案中，中内胚层球状体是通过本文公开的任何一种方法产生的中内胚层球状体。

本文还公开了通过本文公开的任何方法产生的中肠/后肠球状体。

本文还公开了产生腹前前肠球状体的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文公开的前肠球状体中的任何一种前肠球状体与视黄酸接触足以使前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段。在一些实施方案中，足以使前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天。

本文还公开了通过本文公开的任何方法生产的腹前前肠球状体。

本文还公开了产生血管化远端肺类器官(vLuO)的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括a)使本文公开的腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF以及任选地视黄酸通路活化剂接触足以使腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，和b)使肺祖细胞与包含Wnt通路活化剂、一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的远端肺特化培养基接触足以使肺祖细胞分化成vLuO的时间段，其中该vLuO包含TTF1/NKX2-1+远端肺上皮祖细胞，对SOX9呈阳性，表现出分支形态发生，并且接收由源自FOXF1+脏壁中胚层的远端间充质分泌的FGF10信号传导。在一些实施方案中，腹前前肠球状体包含围绕SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。在一些实施方案中，腹前前肠球状体是通过本文公开的任何方法产生的腹前前肠球状体。在一些实施方案中，将步骤a)的腹前前肠球状体包埋在基底膜基质中，并且在静置培养物中接触第一时间段，并且在振荡培养物中接触第二时间段。在一些实施方案中，第二时间段的振荡促进营养循环并促进血管形成。在一些实施方案中，第一时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天。在一些实施方案中，第一时间段为至少3天、4天或5天，任选地至少3天。在一些实施方案中，第二时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5天、6天、7天、8天、9天或10天，任选地7天。在一些实施方案中，第二时间段为至少5天、6天、7天、8天、9天或10天，任选地至少5天。在一些实施方案中，远端肺特化培养基还包含地塞米松、cAMP和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。在一些实施方案中，步骤a)和/或步骤b)的Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。在一些实施方案中，步骤a)和/或步骤b)的Wnt通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地3μM。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂包括FGF7和FGF10。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂由FGF7和FGF10组成。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂各自以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL或15ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地10ng/mL。在一些实施方案中，BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP4。在一些实施方案中，BMP通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，视黄酸通路活化剂是视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB、AM580或它们的任何组合，任选地全反式视黄酸(ATRA)。在一些实施方案中，VEGF以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165。在一些实施方案中，地塞米松以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地50nM。在一些实施方案中，cAMP以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地100μM。在一些实施方案中，IBMX以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地100μM。在一些实施方案中，将vLuO包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。在一些实施方案中，该方法还包括使腹前前肠球状体与中期因子(MDK)、脑信号蛋白-3C(SEMA3C)、生长/分化因子-15(GDF15)或它们的任何组合接触。

本文还公开了通过本文公开的任何方法产生的vLuO。在一些实施方案中，vLuO对于一种或多种人肺内皮细胞(EC)标记物呈阳性。在一些实施方案中，人肺部EC标记物选自由以下组成的组：FENDRR、NCKAP5、HPGD、KIT和PDE3B。在一些实施方案中，vLuO包含FOXF1突变。在一些实施方案中，FOXF1突变存在于vLuO所来源的干细胞、中内胚层球状体、前肠球状体和/或腹前前肠球状体中。在一些实施方案中，包含FOXF1突变的vLuO可用作肺泡毛细管发育不良(ACD)、肺静脉错位(MPV)和/或肺淋巴管扩张的疾病模型。在一些实施方案中，将vLuO包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。

本文还公开了产生血管化近端肺类器官的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括a)使本文公开的腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF以及任选地视黄酸通路活化剂接触足以使腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，和b)使肺祖细胞与包含一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的近端肺特化培养基接触足以使肺祖细胞分化成血管化近端肺类器官的时间段。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂以大于用于产生远端肺类器官的浓度提供。在一些实施方案中，腹前前肠球状体包含围绕SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。在一些实施方案中，腹前前肠球状体是通过本文公开的任何方法产生的腹前前肠球状体。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂包含FGF2和FGF10。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂由FGF2和FGF10组成。在一些实施方案中，一种或多种FGF通路活化剂各自以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，近端肺特化培养基还包含地塞米松、cAMP和IBMX。在一些实施方案中，VEGF以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165。在一些实施方案中，地塞米松以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地50nM。在一些实施方案中，cAMP以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地100μM。在一些实施方案中，IBMX以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地约100μM。在一些实施方案中，使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂接触。在一些实施方案中，在接触步骤期间将腹前前肠球状体包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中所述肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。在一些实施方案中，该方法还包括使腹前前肠球状体与中期因子(MDK)、脑信号蛋白-3C(SEMA3C)、生长/分化因子-15(GDF15)或它们的任何组合接触。

本文还公开了通过本文公开的方法产生的血管化近端肺类器官。在一些实施方案中，将血管化近端肺类器官包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。

本文还公开了使本文公开的任何vLuO或血管化近端肺类器官与灌注系统接触的方法。

血管化肠类器官的方法

本文还公开了产生血管化小肠类器官(vHIO)的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文公开的中肠/后肠球状体与以下物质接触：1)BMP通路抑制剂和VEGF，以及任选地R-脊椎蛋白和EGF，持续第一时间段；以及2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段，从而使中肠/后肠球状体分化成vHIO。在一些实施方案中，vHIO表达CDX2、GATA4和CDH17，对SOX2呈阴性，并且包含CD31+血管床。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂是头发生素、多索吗啡、RepSox、LY364947、LDN193189、卵泡抑素、脊索发生素或它们的任何组合，任选地头发生素。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165。在一些实施方案中，将中肠/后肠球状体包埋在基底膜基质中，步骤1)在静置培养物中进行，并且步骤2)在振荡培养物中进行。在一些实施方案中，第一时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天。在一些实施方案中，第一时间段为至少3天。在一些实施方案中，第二时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。在一些实施方案中，第二时间段为至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。在一些实施方案中，中肠/后肠球状体包含围绕CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。在一些实施方案中，中肠/后肠球状体是通过本文公开的任何方法产生的中肠/后肠球状体。

本文还公开了通过本文公开的任何方法产生的vHIO。

本文还公开了产生血管化结肠类器官(vHCO)的方法。在一些实施方案中，该方法包括实施例8中公开的一种或多种方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文公开的中肠/后肠球状体与以下物质接触：1)BMP通路活化剂和VEGF，以及任选地EGF，持续第一时间段；2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段，从而使中肠/后肠球状体分化成vHCO。在一些实施方案中，vHCO表达SATB2和CDH17，并且包含CD31+血管床。在一些实施方案中，BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP2。在一些实施方案中，BMP通路活化剂以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL或150ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度，任选地100ng/mL。在一些实施方案中，VEGF以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围内的任何浓度。在一些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165。在一些实施方案中，将中肠/后肠球状体包埋在基底膜基质中，步骤1)在静置培养物中进行，并且步骤2)在振荡培养物中进行。在一些实施方案中，第一时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天。在一些实施方案中，第一时间段为至少3天。在一些实施方案中，第二时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。在一些实施方案中，第二时间段为至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。在一些实施方案中，中肠/后肠球状体包含围绕CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。在一些实施方案中，中肠/后肠球状体是通过本文公开的任何方法产生的中肠/后肠球状体。

本文还公开了通过本文公开的任何方法生产的vHCO。

使用方法

在一些实施方案中，将本文公开的类器官移植到哺乳动物，如小鼠，如免疫受损的小鼠中。在一些实施方案中，将类器官移植到哺乳动物的肾囊中。在一些实施方案中，移植的类器官体积增长约50x、150x、200x、250x、300x、400x、500x、600x、700x、800x、900x、1000x、1100x、1200x、1300x、1400x或1500x，或至少50x、150x、200x、250x、300x、400x、500x、600x、700x、800x、900x、1000x、1100x、1200x、1300x、1400x或1500x。然而，本文所公开的类器官的一些实施方案的明显优点是它们在不需要移植到动物中的情况下进行血管形成。

本文还公开了筛选方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文公开的中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前肠球状体、vLuO、血管化近端肺类器官、vHIO和/或vHCO中的任一种与感兴趣的化合物接触，并且评估细胞群体或组织中的表型的变化。在一些实施方案中，本文公开的中内胚层球状体、前肠球状体、中肠/后肠球状体、腹前肠球状体、vLuO、血管化近端肺类器官、vHIO和/或vHCO源自获自受试者的干细胞。在一些实施方案中，受试者包括疾病，并且响应于感兴趣的化合物的表型的变化与疾病的改善相关。

实施例

实施例1.人胎儿图谱揭示了发育期间的器官特异性EC基因标记

为了确定EC中的器官特异性基因表达模式，分析了从妊娠第72天至第129天收集的15个人胎儿器官的91个单细胞RNA-seq数据集。首先，基于与其他细胞类型相比的高CDH5表达来选择来自每个器官的EC，然后鉴定不同器官中显著富集的基因(图1A至图1B)。EC在脑中显示最多的组织特异性，其含有高度选择性的毛细管网络，即血脑屏障。人的肺和肠还显示了一组器官特异性基因，如肺的FENDRR和HPGD以及肠的NKX2-3和LTBP1。

实施例2.从人iPSC共分化内胚层和中胚层

为了概括体外肠管器官发生，建立了从人iPSC同时分化内胚层和中胚层的3D悬浮培养系统。通过微调Wnt、Nodal(或TGF-b)和BMP活化的剂量和时机，产生含有定形内胚层(DE、FOXA2+)和侧板中胚层(LPM、HAND1+)群体的中内胚层球状体(图2A)。还确定约28小时的Wnt活化是用于从iPSC产生合适量的DE和LPM群体(约1:1)的良好持续时间(图2B)。LPM衍生的脏壁中胚层(SM、FOXF1+)进一步产生围绕原肠管的间充质。然后，SM将分化成结缔组织、平滑肌细胞(SMC)和内胚层器官的血管。

实施例3.脉管系统、SM和肠管的共发育

为了适当地形成各种器官，内胚层转变成原肠管，然后在各种信号传导通路的控制下沿着背部-腹部(D-V)和前部-后部(A-P)轴区域化成前肠、中肠和后肠：BMP和TGF-b抑制促进前肠形成，而Wnt和FGF活化促进中肠/后肠发育。这里，在第3天产生中内胚层球状体后施加这些信号(图3A)，并且对被SM(FOXF1+)紧密包围的前肠(SOX2+)或中肠/后肠(CDX2+)进行成功地模式化(图3B)。另外，通过从第3天至第7天将血管内皮生长因子(VEGF，50ng/mL)(一种血管生成因子)引入到分化系统中，成功地产生了围绕FOXA2+上皮层的大量血管网络(CD31+)(图3C)。

实施例4.远端肺类器官的血管形成

腹前前肠(vAFG)产生呼吸谱系(TTF1+，也称为NKX2.1+)，并且指定为远端肺尖(SOX9+)或近端气道(SOX2+)。考虑到肺泡-毛细管界面在气体交换中的功能重要性，开发了血管化远端肺类器官的方案。在分化第7天，将前肠球状体包埋在胶原-基质胶混合物中以用于进一步特化。在超低附着板中静置培养三天后，将包埋的球状体置于定轨振荡器上并与肺祖细胞混合物(例如但不一定：CHIR99021、FGF7、FGF10、全反式视黄酸(ATRA)、BMP4)和VEGF一起孵育，以促进作为血管化肺类器官(vLuO)的肺上皮和内皮生长(图4A)。在七天后，观察到表达TTF1(NKX2-1)的肺上皮祖细胞，并且对远端肺标记物SOX9染色阳性(图4B)。有趣的是，肺上皮层被脉管系统包围(图4C)，这类似于人远端肺中的肺泡-毛细管相互作用的模式化。值得注意的是，有可能由于周围间充质分泌的高FGF10，远端vLuO也显示分支形态发生(图4D)。与以前的肺类器官产生方案相比，这个表型出现得早得多，以前的肺类器官产生方案需要约1.5个月或2个月的培养。

实施例5.改善iPSC衍生的vLuO的模式化、肺特异性和灌注

vLuO的近端-远端(气道-肺泡)模式化：如本文所述，产生具有远端肺祖细胞(SOX9+)的vLuO。TTF1+肺祖细胞谱系将被进一步纯化，并且近端肺(气道)类器官将通过呼吸系统的近端-远端模式化血管化。将评估在早期肺特化阶段期间添加外源性BMP、FGF、Wnt和/或视黄酸调节剂的必要性或副作用，以进一步改善肺上皮祖细胞的纯度，同时维持具有肺特异性基因标记和相关功能性的良好组织的血管床。Wnt活化(例如，由肺间充质分泌的Wnt2和Wnt2b)促进快速远端肺模式化，而FGF2和FGF10指定近端肺谱系(图5A)。将遵循这些发育线索以进一步指定本文提供的系统以类似于近端(气道)vLuO。还认识到，与先前报道的用于产生近端相比于远端肺上皮的方案相反，本文公开的共发育系统可能已经具有由中胚层衍生的间充质和EC产生的内在生长因子，如VEGF、FGF和TGF-b。因此，对类器官进行染色以确定内在表达的生长因子的类型，然后通过减少或消除3D共分化系统中的小分子来调整方案。另外，考虑到毛细管内皮和肺泡1型(AT1)细胞在气体交换表面的薄区域内的紧密关联，以及Yap/Taz信号传导在驱动和维持AT1同一性中的关键作用，测试了远端vLuO中的内皮谱系和/或Yap/Taz活化是否产生具有扁平形态的AT1细胞。AT1细胞覆盖95％的肺泡系统，但在其他肺类器官系统中仍然缺失。

使用肺特异性细胞外基质(ECM)产生vLuO：ECM组合物是组织特异性的，并且源自不同组织的ECM可提供驱动器官形成和维持组织稳态的重要过程的物理和生化线索。将vLuO包埋在从脱细胞化的人肺部组织提取的ECM中，并且与通常使用的胶原和基质胶细胞外基质相比，检查类器官在EC和上皮细胞中的形态变化、成熟标记物基因的表达(图5B)和肺特异性基因。从成人肺组织提取的ECM的硬度也将通过生物化学方法在发育早期被调节以类似于胎儿肺ECM。另外，使用来自多个人胎儿器官的scRNA-seq数据集，确定不同发育阶段的肺/肠管特异性ECM的组成和关键组分。

引入另外的生长因子以进一步指定肺EC谱系：为了确定在发育期间通过人肺EC特异性信号传导的关键生长因子，利用CellChat(可在万维网cellchat.org上获得)基于公开的scRNA-seq数据集分析EC与周围细胞类型之间的配体-受体相互作用。在人胎儿肺的发育期间发现广泛的细胞-细胞通信(图6A至图6B)。VEGFA-VEGFR相互作用与先前的发现一致，从而指示本文提供的方法的稳健性。值得注意的是，血管EC接受来自肺内的不同类型的中期因子(MDK，一种血管生成因子)，以及来自远端肺上皮的SEMA3C(脑信号蛋白-3C)和GDF15(生长/分化因子-15)。测试了这些外源性生长因子在本文提供的共分化系统中的作用，并且评估了EC的肺特异性(例如，FENDRR和HPGD的表达)以及vLuO的成熟和模式化。

通过体外血管灌注系统改善vLuO的生长、模式化和长期维持：到目前为止，类器官内的可灌注脉管系统仅通过移植到宿主动物中得到证实，其中天然脉管系统穿透异位植入物。然而，对动物宿主的依赖限制了基于类器官的方法的可扩展性和转化，特别是对于体外应用而言。因此，我们将循环和灌流引入vLuO系统中。如来自ibidi的剪切应力灌注系统的装置(其已经用于在3D类器官中应用流动)结合了从人脂肪组织分离的真正的天然微血管，以在3D组织空间中建立灌注的、动态的微血管系统(图7)。在灌注后，评估成熟标记物(图5B)、上皮-内皮模式化、肺泡屏障功能和vLuO的长期维持。另外，将这些体外灌注的vLuO与在小鼠肾囊下体内移植的vLuO进行比较。

实施例6.使用vLuO作为研究FOXF1突变的新平台

具有FOXF1突变的患者通常表现出伴有呼吸窘迫和肺动脉高压的多种先天性畸形。常见的临床表型包括肺泡毛细管发育不良(ACD)、肺静脉错位(MPV)和肺淋巴管扩张。大多数患者还在心血管、胃肠和泌尿生殖系统的器官中呈现非肺部异常。使用小鼠模型的先前研究显示，在早期胎儿发育期间(E8.5-E9.5)，Foxf1表达限于围绕整个原肠管的脏壁中胚层。在E11.5时，在肺EC和间充质中观察到Foxf1表达。在E12.5时，还在围绕食管、气管、支气管、胃和肠的内脏平滑肌细胞(SMC)和间充质中观察到Foxf1表达。考虑到FOXF1在中胚层发育中的显著作用，令人感兴趣的是，FOXF1突变仅影响某些器官(如肺、心脏和肠)中的血管，而不影响来自肠管的其他器官。因此，为了进一步理解FOXF1突变型EC、SMC和间充质在以器官特异性方式引起血管异常中的作用，将使用FOXF1突变型iPSC株系。例如，可从患有ACD和MPV的患者中分离FOXF1突变型iPSC株系。考虑到FOXF1在EC中的高表达水平，年龄/性别匹配的对照iPSC和FOXF1突变型iPSC在2D中分化成EC，以及在3D中分化成普通血管类器官(VO)。制造VO的方法可以见于PCT公开WO 2018/229251中，其特此通过引用整体明确地并入。发现与对照相比，大部分EC标记物基因在FOXF1突变型株系中下调(图8)。在功能上，将基于先前报道的FOXF1下游的基因检查细胞分裂、增殖和ECM产生。本文公开的方法用于在肺特异性微环境中共分化EC，并且确定在肺发育期间EC缺乏如何影响周围细胞。在vLuO中测试上述基因和功能，并且通过与普通VO比较，评估当多种类型(SMC、间充质等)受FOXF1突变影响时在vLuO中更深远受损的基因和通路。因为FOXF1通过STAT3起作用以诱导新生儿肺血管生成并且Foxf1突变型小鼠(S52F)显示破坏的STAT3-FOXF1相互作用导致Stat3转录的抑制，所以检查EC中的STAT3通路的活化，并且评估来自vLuO的EC中是否有任何下游基因特异性失调，但在普通VO中没有失调。另外，FOXF1 ChIP-Seq数据显示FOXF1直接结合Wnt2、Wnt11和Wnt5a的启动子和内含子。考虑到Wnt通路在肺上皮生长和特化中的显著作用，还研究了vLuO中的FOXF1突变型EC和上皮细胞的潜在受损的相互作用。

实施例7.转化共发育系统以血管化其他内胚层类器官

除了产生vLuO之外，本文公开的共发育系统可被转化以用脉管系统填充中肠和后肠衍生的器官(如小肠和大肠)。基于先前用于产生小肠类器官(HIO)的方案，将中肠/后肠球状体包埋到胶原和基质胶中，并且与BMP通路抑制剂一起培养三天，以向中肠/后肠的近端区域分化(图9A)。在二十天后，类器官保持它们的中肠/后肠同一性(图9B，SOX2-CDX2+)并表达被SM(图9C)和血管床(图9D)包围的近端小肠标记物GATA4，以及一般肠标记物CDH17(图9E)。值得注意的是，先前公开的方案仅在体内移植后显示持续的GATA4表达，从而指示本文的共分化系统可提供相关细胞类型和微环境以加速体外成熟过程。

与HIO相反，中肠/后肠球状体也与BMP通路活化剂一起培养三天以血管化人结肠类器官(HCO)(图9F)。二十天分化将血管床(图9G)引入SATB2/CDH17阳性结肠类器官中(图9G至图9H、图9J)。通过微调小肠类器官的BMP抑制的时间点，测试肠特异性ECM(如藻酸盐)并掺入相关细胞类型(如免疫细胞和淋巴细胞)来使系统进一步成熟。表征肠细胞类型的成熟标记物，并且测定肠特异性标记物在EC中的表达，如NKX2-3和LTBP1。所得到的血管化HIO(vHIO)和血管化HCO(vHCO)用于研究这些器官系统中的EC命运测定，并且当在vLuO中表征EC的肺特异性特征时也用作阴性对照。有趣的是，在一些具有FOXF1突变的患者中也观察到肠旋转不良，并且因此，vHIO和vHCO也用于研究FOXF1在引起肠异常中的作用。

实施例8.在3D悬浮培养系统中产生血管化肠管衍生的类器官

本文所用的示例性培养基组合物示于图11中。

1.定形内胚层和中胚层的伴随产生(第1天至第2天)

a)在第-1天，将人iPSC或人ESC解离成单个细胞。

b)使用Aggrewell板(StemCell)或其他相容的细胞收集板，产生多能细胞的球状体。注意：每个微孔中的细胞数目应在500个至2000个细胞之间。因此，球状体直径范围应为50μm至200μm。

c)在稳定条件下(37℃细胞孵育箱)培养细胞过夜。注意：通常，球状体将在第0天形成。如果球状体形态仍然松散，则再培养一天。

d)在第0天，重新悬浮所形成的球状体并将它们转移到5mL管中。

e)使球状体在室温下沉降5分钟并用2mL普通N2B27培养基洗涤。

f)用D0 DE/中胚层分化培养基重新悬浮球状体并将它们均匀地分配到超低附着6孔板中，每个孔中有3mL培养基。将板放在细胞培养孵育箱中90rpm至110rpm速度的定轨振荡器上并培养24小时至32小时。注意：

1)如果使用Aggrewell 400板，则可将一个微孔的球状体(约400个球体)分配到超低附着6孔板的3个孔中，使得球状体不会在高于90rpm的旋转速度下融合。

2)取决于每个hESC/iPSC株系，如果中胚层诱导速率低(HAND1阳性百分比)，则培养时间可从24小时增加至28小时至32小时。

g)在第1天，将第0天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加D1 DE/中胚层分化培养基A以产生肺DE/中胚层球状体，或添加D1 DE/中胚层分化培养基B以产生肠/结肠球状体。在振荡器上培养24小时。

h)在第2天，将第1天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。将D2 DE/中胚层分化培养基A添加到肺DE/中胚层球状体中。将D2 DE/中胚层分化培养基B添加到肠/结肠球状体中。在振荡器上孵育24小时。

2.用内皮细胞(EC)祖细胞产生前肠(FG)或中肠/后肠(M/HG)(第3天至第6天)

(1)具有内皮细胞祖细胞的前肠：

a)在第3天，将第2天的肺DE/中胚层球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加FG分化培养基并在振荡器上培养24小时。

b)在第4天，将第3天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加FG分化培养基并在振荡器上培养24小时。

c)在第5天，将第4天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加FG分化培养基并在振荡器上培养24小时。

d)在第6天，将第5天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加FG分化培养基并在振荡器上培养24小时。然后，针对肺谱系进行步骤3。

(2)具有内皮细胞祖细胞的中肠/后肠：

a)在第3天，将第2天的肠/结肠球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加M/HG分化培养基并在振荡器上培养24小时。

b)在第4天，将第3天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加M/HG分化培养基并在振荡器上培养24小时。

c)在第5天，将第4天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加M/HG分化培养基并在振荡器上培养24小时。

d)在第6天，将第5天的球状体转移到5mL管中并吸取上清液。添加M/HG分化培养基并在振荡器上培养24小时。然后，针对肠谱系进行步骤5。

3.来自前肠的肺祖细胞下的EC祖细胞的产生(第7天至第21天)

(1).基于液滴的方法

a)在第7天，通过在20μL大小的尖端的空尖端托盘上层叠正方形的石蜡膜来制备用于产生基质胶/胶原液滴的带凹坑的石蜡膜基底。

b)制作4×4或3×8凹坑的网格并用无菌剪刀将石蜡膜修剪成含有这个网格的小正方形。将正方形的石蜡膜置于60mm组织培养皿中。

c)使用切割的200μL尖端，将来自步骤2(1)的FG球状体一个接一个地转移到石蜡膜中的每个凹坑中。

d)通过用未切割的200μL尖端小心地吸出流体从每个组织去除过量的介质。

e)通过将约30μL滴到每个组织上，立即将基质胶/胶原微滴添加到每个聚集体中，使得微滴填充石蜡膜凹坑。

f)使用注射器针头将每个聚集体定位在液滴的中心以移动液滴内的组织。

g)将在石蜡膜上含有液滴的60mm皿放回到37℃孵育箱中并孵育1小时以使基质胶/胶原聚合。

h)通过首先使用无菌镊子将石蜡膜片材翻转并搅拌直至液滴从片材落至6孔超低附着板中来从石蜡膜去除基质胶液滴。可以通过用介质冲洗来去除任何剩余的液滴。对于6孔板，每孔保持11滴至14滴。

i)继续在孵育箱中静置培养类器官微滴3天(第7天至第9天)。添加3mL肺特化培养基-1并每隔一天更换培养基。

j)在3天后，将板置于90rpm至110rpm速度的定轨振荡器上以供进一步培养(第10天至第21天)。更换为肺特化培养基-2并每隔一天更新培养基。然后，针对远端或近端肺分化进行步骤4。

(2).基于Transwell的方法

a)在1.5ml管中收集7个至10个前肠类器官并快速离心沉降。

b)用20ul至50ul基质胶/胶原溶液重新悬前肠类器官并将它们添加到24孔transwell板的插入物上。

c)将板放回37℃孵育箱中并孵育1小时以使基质胶/胶原聚合。

d)从第7天至第9天将肺特化培养基-1添加到transwell板中。孔中添加600ul，并且插入物中添加150ul。

e)更换为肺特化培养基-2并每隔一天更新一次(第10天至第21天)。然后，针对远端或近端肺分化进行步骤4。

注意：

1)基于液滴和transwell的方法在标记物表达方面产生相似的肺祖细胞类器官。基于Transwell的方法给予肺类器官更多的生长空间，其发挥不同的形态。

4.血管化远端或近端肺类器官的产生(第21天至第60天)

(1)血管化远端肺类器官(第21天至第60天)

a)在第21天，对于从步骤3产生的肺祖细胞类器官，从肺特化培养基切换到远端肺特化培养基。每隔一天更换远端肺特化培养基。

b)在第32天，将培养基更换为远端肺成熟培养基。每隔一天更换培养基。

c)在第40天，将培养基更换为远端肺扩增培养基，并且每隔一天更换培养基直至第45天至第60天。

(2)血管化近端肺类器官(第17天至第40天)

a)在第21天，对于从步骤3产生的肺祖细胞类器官，从肺特化培养基切换到近端肺特化培养基。每隔一天更换近端肺特化培养基。

b)在第35天，继续培养或将培养基更换为基底细胞培养基再培养10天。

5.血管化小肠类器官的产生(第7天至第30天)

a)在第7天，产生含有来自步骤2(2)的中肠/后肠球状体的基于基质胶/胶原微滴或transwell的方法。使用与步骤3A(a-j)或步骤3B(a-d)中所述相同的方法。

b)添加小肠特化培养基，并且从第7天至第9天每隔一天更换培养基。

c)从第10天开始，每隔一天更换肠成熟培养基直至第30天。

6.血管化大肠(结肠)类器官的产生(第7天至第30天)

a)在第7天，产生含有来自步骤2(2)的中肠/后肠球状体的基于基质胶/胶原微滴或transwell的方法。使用与步骤3A(a-j)或步骤3B(a-d)中所述相同的方法。

b)添加结肠特化培养基，并且从第7天至第9天每隔一天更换结肠特化培养基。

c)从第10天开始，每隔一天更换肠成熟培养基直至第30天。

实施例9：血管化远端肺类器官、血管化人肠类器官和血管化人结肠类器官的产生

首先使用Aggrewell将人多能干细胞聚集成胚胎体，并且在前三天内以连续或脉动方式暴露于Nodal、BMP和Wnt刺激物(图12)。中胚层和内胚层的诱导通过FACS、免疫染色和单细胞RNA-seq来表征。将含有中胚层和内胚层两者的球状体分别区域化至前肠或中肠/后肠，直至第7天。在这个阶段出现适当的脏壁中胚层和血管祖细胞。将不同的肠管缩微模型包埋在ECM-transwell插入物中并分化成血管化肺、肠和结肠类器官。

实施例10：使用共发育策略产生血管化肠管

中胚层(HAND1+)和内胚层(FOXA2+)通过在原肠胚形成阶段调节Wnt和BMP信号传导而共同出现(图13)。随着内源内皮祖细胞(CD31+)的发育，将中胚层/内胚层球状体指定为朝向前肠(SOX2+)或中肠/后肠(CDX2+)。前肠缩微模型保留了在肺分化混合物下产生肺祖细胞和远端肺类器官的潜力。肺芽上皮被FOXF1+脏壁中胚层和脉管系统包裹。在合适的分化条件下，中肠/后肠类器官能够形成血管化肠(CDX2+/GATA4+)或结肠(CDX2+/SATB2+)类器官。

实施例11：Wnt和BMP信号是中胚层相比于内胚层诱导的决定因素

CHIR99201在不同持续时间下对Wnt的活化在前三天期间彻底改变了中胚层/内胚层比率(图14A)。用BMP4延长的处理增加了中胚层/内胚层比率(图14B)。图14C示出了在前三天中，在活化素A、CHIR99201(上图)或活化素A、CHIR99201和BMP4(下图)的存在下，中胚层/内胚层比率的变化。绿色的FOXA2染色是定形内胚层(DE)的标记物；红色的HAND1染色是侧板中胚层的标记物；A：活化素A；C：CHIR99201。

实施例12：在血管化肺类器官中获得器官特异性EC基因标记

从人细胞图谱图鉴定人肺EC特异性标记物(图15A)。几个人胎儿组织中人肺EC标记物HPGD的验证(图15B)。HPGD仅在来自血管化肺类器官而不是肠类器官的EC中表达(图15C)。染色：RNA-scope。

实施例13：通过单细胞RNA-seq表征第3天的中胚层/内胚层类器官

接受不同持续时间的BMP4刺激(0天、1天、2天和3天)的胚状体(EB)在第3天接受单细胞RNA-seq(图16A)。它们含有中胚层和内胚层群体。图16B示出了在不同的BMP4处理持续时间下的细胞分布的特征图。图16C示出了基于标记物基因的d3中胚层/内胚层的簇集。图16D示出了d3中胚层/内胚层与CS7原肠胚形成人胚胎的参考图比较。AM：晚期中胚层；EM：新生中胚层；PS：原肠胚。图16E示出了第3天中胚层/内胚层类器官对小鼠早期原肠胚形成胚胎的簇投影。i.小鼠E6.5至E8.5胚胎的UMAP。ii.第3天类器官对小鼠胚胎图的反向投影。BMP4的累积刺激增加了间充质细胞群体，同时减少了神经谱系(e.ii)。

实施例14：通过单细胞RNA-seq表征第7天血管化前肠和中肠/后肠类器官

图17A示出了前肠类器官(从第1天至第3天开始的1天BMP4处理)和中肠/后肠类器官(从第1天至第3天开始的3天BMP4处理)的代表性UMAP投影。图17B至图17D示出了人血管化肠管类器官对小鼠E8.75肠管图谱的反向投影。图17B示出了含有前部(A)和后部(P)部分的小鼠E8.75胚胎肠管。肠管(内胚层)、间充质和内皮细胞群体被分离成A-P亚簇。图17C示出了第7天前肠类器官对小鼠E8.75肠管的反向投影。与没有BMP4相比，用一天BMP4处理产生更纯的前肠管内胚层和更多的前内皮。图17D示出了第7天中肠/后肠类器官对小鼠E8.75管的反向投影。在第一个三天分化期间更长时间的BMP4处理诱导更多的后肠管内胚层、间充质和内皮。

实施例15：通过免疫荧光染色获得的来自FOXF1突变型iPSC株系的vHLuO和vHIO的 异常表型。

与正常对照(n＝2)相比，来自FOXF1突变型iPSC(n＝2)的D31远端vHLuO在上皮结构(FOXA2+)中显示混合的肺(TTF1+)和后肠管(CDX2+)。此外，FOXF1远端vHLuO丢失远端肺部标记物SOX9表达。(图18A)与正常对照(n＝2)相比，来自FOXF1突变型iPSC(n＝2)的D31vHIO丢失后肠管标记物(CDX2)以及混合的前肠管群体(SOX2)。间充质标记物FOXF1也被显著抑制。肠标记物GATA4或内皮(CD31)没有明显的表达差异。结肠标记物SATB2在FOXF1突变型vHIO中略微升高。(图18B)

在至少一些前述实施方案中，一个实施方案中使用的一个或多个要素可以在另一个实施方案中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将认识到，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对本文所描述的方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求定义的主题的范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以在适于上下文和/或应用的情况下将复数转换成单数和/或将单数转换成复数。为了清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，尤其是在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中使用的术语，通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包含(including)”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有(having)”应被解释为“至少具有”，术语“包括(include)”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域内的人员将进一步理解，如果所引入的权利要求叙述的特定数字是有意图的，那么将在权利要求中明确地叙述此意图，并且在不存在此叙述的情况下，不存在此意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包括使用引入性短语“至少一个”和“一个或多个”来引入权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应当解释为暗示由不定冠词“一个”或“一种”引入的权利要求陈述将含有此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅含有一个此类陈述的实施方案，即使当相同的权利要求包含引入性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词如“一个”或“一种”时亦是如此(例如，“一个”和/或“一种”应当被解释为意指“至少一个”或“一个或多个”)；对于用于引入权利要求陈述的定冠词的使用也是如此。另外，即使明确地陈述了特定数目的所引入的权利要求陈述，本领域的技术人员也应认识到，此类陈述应被解释为意指至少所陈述的数目(例如，没有其他修饰语的“两个陈述”的无修饰陈述意指至少两个陈述，或者两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B、C等中的至少一个”的惯例的情况下，一般来说，这种结构旨在对本领域技术人员将理解该惯例而言(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B一起、具有A和C一起、具有B和C一起和/或具有A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C中的至少一项等等”的惯例的情况中，通常，这种构造旨在本领域技术人员应当理解该惯例的意义上(例如，“一个系统具有A、B或C中的至少一项”将包括但是不限于系统单独具有单独的A、单独的B、单独的C、A与B一起、A与C一起、B与C一起、和/或A、B和C三者一起等)。本领域的技术人员将进一步理解的是，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个另选术语的几乎任何分隔性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包含这些术语中的一者、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包含“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在按照马库什(Markush)组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此按照马库什组中的任何单独成员或成员子组进行描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分描述了并且实现了相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含所叙述的数字并且是指可以被随后分解为如本文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1个至3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1个至5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，依此类推。

尽管本文已经公开了各个方面和实施方案，但是其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所公开的各个方面和实施方案是出于说明的目的，而不是旨在进行限制，并且真实的范围和精神由所附权利要求书指示。

本文引用的所有参考文献，包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和参考文献，均通过引用整体并入本文，并且特此成为本说明书的一部分。在通过引用的方式并入的公开和专利或专利申请与本说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何这类矛盾材料。

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Claims (85)

1.一种产生包含定形内胚层和侧板中胚层两者的中内胚层球状体的方法，所述方法包括：

a)使多能干细胞与TGF-b通路活化剂、BMP通路活化剂和Wnt通路活化剂接触约24小时至约48小时；以及

b)使步骤a)的所述细胞与TGF-b通路活化剂和BMP通路活化剂接触约24小时至约72小时，而不与Wnt通路活化剂接触；

从而使所述多能干细胞分化成包含FOXA2+定形内胚层和HAND1+侧板中胚层两者的中内胚层球状体；

其中使步骤a)和/或b)的所述细胞进一步与血清补充剂，任选胎牛血清接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述侧板中胚层围绕所述中内胚层球状体中的所述定形内胚层。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a)进行约26小时、27小时、28小时、29小时或30小时，任选地约28小时。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤b)进行约42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时或60小时，任选地约44小时。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的所述TGF-b通路活化剂是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、活化素A、活化素B、Nodal、BMP、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地活化素A。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的所述TGF-b通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约50ng/mL、

60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、

120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL或150ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的所述BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP4。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的所述BMP通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、

20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、

80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、

15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、21μM、22μM、

23μM或24μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地9μM、10μM、11μM或12μM。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤a)的所述接触之前，所述多能干细胞呈球状体的形式。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多能干细胞通过聚集形成球状体，任选地在聚集孔中，任选地其中聚集的细胞数目为或为约200个至4000个、300个至3000个、500个至2000个、600个至1500个或750个至1250个细胞。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在步骤a)和b)的持续时间内，所述多能干细胞保持悬浮，任选地伴随振荡，和/或不作为单层。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述FOXA2+定形内胚层和所述HAND1+侧板中胚层处于约1:1的比率。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的中内胚层球状体。

16.一种从中内胚层球状体产生前肠球状体的方法，所述方法包括使中内胚层球状体与BMP通路抑制剂、TGF-b通路抑制剂和任选地Hedgehog通路活化剂接触足以使所述中内胚层球状体分化成包含SOX2+/FOXA2+前肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的前肠球状体的时间段。

17.根据权利要求16所述的方法，其中足以使所述中内胚层球状体分化成前肠球状体的所述时间段为约2天至6天，诸如约2天、3天、4天、5天或6天。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂是头发生素、多索吗啡、RepSox、LY364947、LDN193189、卵泡抑素、脊索发生素或它们的任何组合，任选地头发生素。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂以一定浓度提供，所述浓度为约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、

80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、

140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述TGF-b通路抑制剂是A8301、RepSox、LY365947、SB431542或它们的任何组合，任选地SB431542。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述TGF-b通路抑制剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、

5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、

14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地10μM。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述Hedgehog通路活化剂为平滑激动剂(SAG)。

23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述Hedgehog通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约0.5μM、1μM、2μM、

3μM、4μM或5μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地1μM。

24.根据权利要求16至23中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述中内胚层球状体与血管内皮生长因子(VEGF)接触，以产生围绕所述SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。

25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述中内胚层球状体与视黄酸通路活化剂接触，任选地其中所述视黄酸通路活化剂是视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB、AM580或它们的任何组合。

26.根据权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述中内胚层球状体不与Wnt通路活化剂和/或FGF通路活化剂接触。

27.一种从中内胚层球状体产生中肠/后肠球状体的方法，所述方法包括使中内胚层球状体与Wnt通路活化剂和FGF通路活化剂接触足以使所述中内胚层球状体分化成包含CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮和FOXF1+脏壁中胚层的中肠/后肠球状体的时间段。

28.根据权利要求27所述的方法，其中足以使所述中内胚层球状体分化成中肠/后肠球状体的所述时间段为约2天至6天。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、2μM、3μM、4μM、

5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述FGF通路活化剂是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF4。

32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述FGF通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述中内胚层球状体与血管内皮生长因子(VEGF)接触，以产生围绕所述CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。

34.根据权利要求16至33中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

35.根据权利要求16至34中任一项所述的方法，其中所述中内胚层球状体是根据权利要求15所述的中内胚层球状体。

36.根据权利要求16至26、34至35中任一项所述的方法产生的前肠球状体。

37.根据权利要求27至35中任一项所述的方法产生的中肠/后肠球状体。

38.一种产生腹前前肠球状体的方法，所述方法包括使根据权利要求16至26、34至35中任一项所述的方法产生的前肠球状体与视黄酸接触足以使所述前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段。

39.根据权利要求38所述的方法，其中足以使所述前肠球状体分化成腹前前肠球状体的时间段为约1天。

40.一种产生血管化远端肺类器官(vLuO)的方法，所述方法包括：

a)使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF以及任选地视黄酸通路活化剂接触足以使所述腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，以及

b)使所述肺祖细胞与包含Wnt通路活化剂、一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的远端肺特化培养基接触足以使所述肺祖细胞分化成vLuO的时间段；

其中所述vLuO包含TTF1/NKX2-1+远端肺上皮祖细胞，对SOX9呈阳性，表现出分支形态发生，并且接收由源自FOXF1+脏壁中胚层的远端间充质分泌的FGF10信号传导。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述腹前前肠球状体包含围绕所述SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述腹前前肠球状体是通过根据权利要求38或39所述的方法产生的所述腹前前肠球状体。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中将步骤a)的所述腹前前肠球状体包埋在基底膜基质中，并且在静置培养物中接触第一时间段，并且在振荡培养物中接触第二时间段，其中所述第二时间段的所述振荡促进营养循环并促进血管形成。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第一时间段为1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天，并且/或者所述第二时间段为5天、6天、7天、8天、9天或10天，任选地7天。

45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述远端肺特化培养基还包含地塞米松、cAMP和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。

46.根据权利要求40至45中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或步骤b)的所述Wnt通路活化剂是Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY 262611、CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、阿洛新、靛玉红、阿特波龙、肯帕罗酮、氯化锂、TDZD 8、TWS119或它们的任何组合，任选地CHIR99021。

47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或步骤b)的所述Wnt通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约1μM、

2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地3μM。

48.根据权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF通路活化剂选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF7和FGF10。

49.根据权利要求40至48中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF通路活化剂各自以一定浓度提供，所述浓度为约5ng/mL、

6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、

12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL或15ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地10ng/mL。

50.根据权利要求40至49中任一项所述的方法，其中所述BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP4。

51.根据权利要求40至50中任一项所述的方法，其中所述BMP通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

52.根据权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述视黄酸通路活化剂是视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB、AM580或它们的任何组合，任选地全反式视黄酸(ATRA)。

53.根据权利要求40至52中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

54.根据权利要求40至53中任一项所述的方法产生的vLuO，任选地其中所述vLuO对选自由FENDRR、NCKAP5、HPGD、KIT和PDE3B组成的组的一种或多种人肺EC标记物呈阳性。

55.根据权利要求54所述的vLuO，其包含FOXF1突变，任选地用作肺泡毛细管发育不良(ACD)、肺静脉错位(MPV)和/或肺淋巴管扩张的疾病模型。

56.一种产生血管化近端肺类器官的方法，所述方法包括：

a)使腹前前肠球状体与Wnt通路活化剂、BMP通路活化剂和VEGF接触足以使所述腹前前肠球状体分化成肺祖细胞的时间段，以及

b)使所述肺祖细胞与包含一种或多种FGF通路活化剂和VEGF的近端肺特化培养基接触足以使所述肺祖细胞分化成血管化近端肺类器官的时间段；

其中所述一种或多种FGF通路活化剂以大于用于产生远端肺类器官的浓度提供。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述腹前前肠球状体包含围绕所述SOX2+/FOXA2+前肠上皮的CD31+血管网络。

58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述腹前前肠球状体是通过根据权利要求36或37所述的方法产生的所述腹前前肠球状体。

59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种

FGF通路活化剂选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23或它们的任何组合，任选地FGF2和FGF10。

60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述一种或多种

FGF通路活化剂各自以一定浓度提供，所述浓度为约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

61.根据权利要求56至60中任一项所述的方法，其中所述近端肺特化培养基还包含地塞米松、cAMP和IMBX。

62.根据权利要求56至61中任一项所述的方法，其中所述腹前前肠球状体不与Wnt通路活化剂接触。

63.通过根据权利要求56至62中任一项所述的方法产生的血管化近端肺类器官。

64.根据权利要求40至53或56至62中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤期间将所述腹前前肠细胞包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中所述肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。

65.根据权利要求54或55所述的vLuO，或根据权利要求63所述的血管化近端肺类器官，其中将所述vLuO或所述血管化近端肺类器官包埋在肺特异性细胞外基质中，任选地其中所述肺特异性细胞外基质从人肺组织中分离。

66.根据权利要求40至53或56至62中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述腹前前肠球状体与中期因子(MDK)、脑信号蛋白-3C(SEMA3C)、生长/分化因子-15(GDF15)或它们的任何组合接触。

67.一种方法，所述方法包括使根据权利要求54或55所述的vLuO或根据权利要求63所述的血管化近端肺类器官与灌注系统接触。

68.一种产生血管化小肠类器官(vHIO)的方法，所述方法包括使中肠/后肠球状体与以下物质接触：

1)BMP通路抑制剂和VEGF，以及任选地R-脊椎蛋白和EGF，持续第一时间段；以及

2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段；

从而使所述中肠/后肠球状体分化成vHIO，其中所述vHIO表达CDX2、GATA4和CDH17，对SOX2呈阴性，并且包含CD31+血管床。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂是头发生素、多索吗啡、RepSox、LY364947、LDN193189、卵泡抑素、脊索发生素或它们的任何组合，任选地头发生素。

70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述BMP通路抑制剂以一定浓度提供，所述浓度为约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中将所述中肠/后肠球状体包埋在基底膜基质中，步骤1)在静置培养物中进行，并且步骤2)在振荡培养物中进行。

73.根据权利要求68至72中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天，并且/或者所述第二时间段为至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、

17天、18天、19天或20天。

74.根据权利要求68至73中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体包含围绕所述CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。

75.根据权利要求68至74中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体是根据权利要求37所述的中肠/后肠球状体。

76.一种产生血管化结肠类器官(vHCO)的方法，所述方法包括使中肠/后肠球状体与以下物质接触：

1)BMP通路活化剂和VEGF，以及任选地EGF，持续第一时间段；以及

2)VEGF和任选地EGF，持续第二时间段；

从而使所述中肠/后肠球状体分化成vHCO，其中所述vHCO表达SATB2和CDH17，并且包含CD31+血管床。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述BMP通路活化剂是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1、IDE2或它们的任何组合，任选地BMP2。

78.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述BMP通路活化剂以一定浓度提供，所述浓度为约50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、

80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL或150ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，任选地100ng/mL。

79.根据权利要求68至78中任一项所述的方法，其中所述VEGF以一定浓度提供，所述浓度为约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度。

80.根据权利要求68至79中任一项所述的方法，其中将所述中肠/后肠球状体包埋在基底膜基质中，步骤1)在静置培养物中进行，并且步骤2)在振荡培养物中进行。

81.根据权利要求68至80中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为1天、2天、3天、4天或5天，任选地3天，并且/或者所述第二时间段为至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。

82.根据权利要求68至81中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体包含围绕所述CDX2+/FOXA2+中肠/后肠上皮的CD31+血管网络。

83.根据权利要求68至82中任一项所述的方法，其中所述中肠/后肠球状体是根据权利要求37所述的中肠/后肠球状体。

84.通过根据权利要求68至75中任一项所述的方法产生的vHIO，任选地包含FOXF1突变。

85.通过根据权利要求76至83中任一项所述的方法产生的vHCO，任选地包含FOXF1突变。