JP6617310B2 - ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内側神経節隆起前駆細胞の作製 - Google Patents

Description

相互参照
本願は２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８３，５９４号の
利益を主張するものであり、前述出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦支援による研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＭＨ０８１８８０号の下、
政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。本発明は、助成金番
号ＲＣ１−００３４６号及び同ＲＢ２−０１６０２号の下、カリフォルニア再生医療研究
所の支援を受けてなされた。

緒言
大脳皮質のニューロンの約２０％は抑制性介在ニューロンが占めている。介在ニューロ
ンの欠損がいくつかの神経障害に関与している。皮質介在ニューロンのほとんどが、発生
中の腹側終脳領域の内側神経節隆起（ＭＧＥ）で生じる。

マウスＭＧＥ移植片が多数のげっ歯類神経障害モデルを改善することが示されており、
ヒトＭＧＥ細胞が独特の治療候補となり得ることが示唆される。

しかし、ＭＧＥの細胞の特徴を有する細胞を効率的に生成するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法
はない。

したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＧＥ前駆細胞を効率的に生成する方法及びＭＧＥ前
駆細胞が富化された細胞集団が必要とされている。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＧＥ前駆細胞を生成する方法及びシステムならびに富化されたＭ
ＧＥ前駆細胞の組成物が提供される。この方法及びシステムにより、機能的なＧＡＢＡ作
動性介在ニューロンに分化する機能的なＭＧＥ前駆体が効率的に作製される。

霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ）前駆細胞を作製する方法
が提供される。

ある特定の実施形態では、この方法は、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘
導サプリメントとを含有する無血清培地でｐＰＳ細胞を培養してＭＧＥ前駆細胞を生成す
ることを含む。ｐＰＳ細胞は接着培養または浮遊培養で培養し得る。

ある特定の実施形態では、この方法は、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘
導サプリメントをと含有する無血清培地でｐＰＳ細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を生成す
ることを含み、ここでは、ＥＢはＭＧＥ前駆細胞を含む。

ある特定の場合には、神経誘導サプリメントはＢ２７であり得る。ある特定の場合には
、神経誘導サプリメントはＮＳ２１であり得る。

ある特定の実施形態では、ｐＰＳ細胞はヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞であり得る。ｈＰ
Ｓ細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり得る。

ある特定の実施形態では、ｐＰＳ細胞をソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘
導サプリメントとを含む無血清培地で培養する前に、ｐＰＳ細胞の分化を誘導し得る。例
えば、ｐＰＳ細胞培養物の過剰増殖によって、または低接着性の基質を有する培養容器で
ｐＰＳ細胞を浮遊させて培養することによって、フィーダー層の非存在下でｐＰＳを培養
することによって、あるいはソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメン
トとを含む無血清培地で培養する前にＦＧＦなどの分化因子を添加することによって、ｐ
ＰＳ細胞の分化を誘導し得る。

ある特定の実施形態では、この方法は、ＥＢを単離すること；単離したＥＢを接着基質
に播種して接着ＥＢを得ること；及び接着ＥＢを培養することを含み得る。

ある特定の実施形態では、この方法は、ＥＢを単離すること；ＥＢを機械的または酵素
的に分離して単一細胞または細胞塊にすること；分離した細胞を接着基質に播種して接着
単層を得ること；及び接着単層を培養することを含み得る。

ある特定の実施形態では、この方法は、ＥＢを単離すること；ＥＢを機械的または酵素
的に分離して単一細胞または細胞塊にすること；分離した細胞をフィーダー細胞層に播種
して接着共培養物を得ること；及び接着共培養物を培養することを含み得る。

ある特定の実施形態では、この方法は、ＥＢ、接着ＥＢ、単層または共培養物を単離す
ること；ＥＢ、接着ＥＢ、単層または共培養物を機械的または酵素的に分離して単一細胞
にすること；単一細胞をＭＧＥ前駆細胞の細胞表面マーカーに対する抗体とインキュベー
トすること；及び前駆細胞を単離することを含み得る。

ある特定の実施形態では、この方法は、ＥＢ、接着ＥＢ、単層、共培養物、分離した培
養物または単離した前駆細胞を単離すること；及び不凍化合物などの凍結保護物質、例え
ば、グリコール（グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール）、ジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはスクロースなどを添加することを含み得る。

ある特定の場合には、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ）前
駆細胞を作製する方法は、無血清培地でｐＰＳ細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を生成する
ことを含み得、ここでは、ＥＢはＭＧＥ前駆細胞を含み、無血清培地はニックヘッジホッ
グ経路活性化因子と、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ）と、ＳＭＡＤ阻害剤と、Ｗ
ｎｔ阻害剤と、Ｂ２７とを含む。

上記ｐＰＳ細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であ
り得るヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞である。

ある特定の場合には、この方法は、ＥＢを単離すること；単離したＥＢを接着基質に播
種して接着ＥＢを得ること；及び接着ＥＢを培養することをさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と、ＳＭＡＤ阻害剤と
、Ｗｎｔ阻害剤と、Ｂ２７とを含む無血清培地で接着ＥＢを培養する。

ある特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない無血清培地で接着ＥＢを培養す
る。

抑制性介在ニューロンを作製する方法が提供され、この方法は、上記のように作製した
ＥＢ、接着ＥＢ、単層、共培養物、分離した培養物または選別した細胞を単離すること；
単離した細胞の細胞浮遊液を作製し、細胞浮遊液を霊長類の神経系に移植することを含み
得る。

（パネルＡ〜Ｂ）ＭＧＥ様前駆細胞の生成を示す図である。

（パネルＡ〜Ｆ）ＶＺ及びＳＶＺ放射状グリア幹細胞様の分裂を示すｈＥＳＣ−ＭＧＥ様前駆体を示す図である。

（パネルＡ〜Ｅ）ｈＥＳＣ−ＭＧＥ様前駆体が終脳ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの特性を有するニューロンに分化することを示す図である。

（パネルＡ〜Ｈ）ｈＥＳＣ−ＭＧＥ様ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞集団のマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングを示す図である。

（パネルＡ〜Ｊ）ｈＥＳＣ−ＭＧＥ様細胞由来ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの成熟及び発火特性を示す図である。

（パネルＡ〜Ｊ）ｈＥＳＣ由来介在ニューロンのＧＡＢＡ作動性シナプス特性を示す図である。

（パネルＡ〜Ｈ）マウス脳におけるｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様介在ニューロン前駆細胞の成熟及び機能的統合を示す図である。

（パネルＡ〜Ｆ）分化プロトコル及び分化したｈＥＳＣのＦＡＣＳ解析を示す図である。

ｈＥＳＣ由来細胞が終脳ＭＧＥ様アイデンティティ及びＧＡＢＡ作動性ニューロン運命を有することを示す図である。

（パネルＡ〜Ｆ）ｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の転写産物発現プロファイリングを示す図である。

ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンサブタイプへの成熟を示す図である。

（パネルＡ〜Ｃ）ヒト胎児皮質及びＭＧＥならびにヒト胎児ＭＧＥ由来の培養物における介在ニューロンサブタイプの発生を示す図である。

（パネルＡ〜Ｆ）ｈＥＳＣ由来介在ニューロンの発火特性の成熟を示す図である。

（パネルＡ〜Ｇ）マウス脳におけるｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様介在ニューロン及びサブタイプの発火特性の成熟を示す図である。

ｈＥＳＣからの分化過程におけるマーカー発現のまとめを示す図である。

ｈＥＳＣ分化プロトコル最適化、動物移植及び腫瘍発生率のまとめを示す図である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＥＳＣ系ＥＳＩ１７からＭＧＥ前駆細胞が分化したことを示す図である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＥＳＣ系ＥＳＩ３５からＭＧＥ前駆細胞が分化したことを示す図である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＥＳＣ系ＥＳＩ５１からＭＧＥ前駆細胞が分化したことを示す図である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＥＳＣ系Ｈ９からＭＧＥ前駆細胞が分化したことを示す図である。

ナイーブ型ヒト多能性幹細胞の分化によるＭＧＥ前駆細胞の生成を示す図である。

（パネルＡ〜Ｎ）ｈＰＳＣの分化によって生成したＭＧＥ前駆細胞に由来する介在ニューロンの選択及び精製へのＭＧＥ富化エンハンサー配列の利用を示す図である。

（Ａ列〜Ｄ列）長期浮遊培養を用いたＭＧＥ由来介在ニューロンの生成を示す図である。

（パネルＡ〜Ｅ）多数のＢＭＰ及びＷＮＴシグナル伝達経路の小分子阻害剤がｈＥＳＣからＭＧＥ前駆細胞への分化誘導に効果的であることを示す図である。

定義
本明細書で使用される「胚様体」、「ＥＢ」または「ＥＢ細胞」は通常、分化を経た多
能性幹細胞（例えば、霊長類多能性幹細胞（ｐＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性
幹（ｉＰＳ）細胞）に由来する未分化細胞と分化細胞の集団からなる形態学的構造体、三
次元構造体またはオルガノイド型構造体を指す。ＥＢ形成に適した培養条件下では、ＥＳ
細胞が増殖して小型の細胞塊を形成し、分化し始める。分化の第一段階は通常、ヒト細胞
の分化の約１日〜４日に相当し、この段階では、小型の細胞塊が外側の層に内胚葉細胞層
を形成し、「単純な胚様体」と呼ばれる。第二段階は通常、ヒト細胞の分化後約３日〜２
０日に相当し、この段階では、外胚葉細胞及び中胚葉細胞の旺盛な分化ならびに誘導体組
織を特徴とする「複雑な胚様体」が形成される。本明細書で使用される「胚様体」または
「ＥＢ」という用語は、文脈により別の解釈が必要とされない限り、単純な胚様体と複雑
な胚様体の両方を包含する。ＥＳ／ｉＰＳ細胞の培養物中に胚様体が形成されたかどうか
は、当業者が例えば、形態の目視検査、細胞マーカーの検出によって日常的な方法で判定
できる。細胞（例えば、ＥＳ／ｉＰＳ細胞）が約２０個以上浮遊していれば浮遊胚様体（
ｓＥＢ）であると見なされる（例えば、Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｒ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．５：７２８−７４０；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．Ｃ．ら（１９８５）Ｊ．Ｅ
ｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７：２７−４５を参照されたい）。浮遊ＥＢを接
着基質上に播種して接着ＥＢ（ａＥＢ）を生成することができる。

本明細書で使用される「内側神経節隆起（ＭＧＥ）前駆細胞（１つまたは複数）」また
は「ＭＧＥ神経前駆細胞」は、発生中の脳のＭＧＥ領域内の細胞によって発現されるマー
カーを発現する分裂細胞と分裂終了細胞の集団を指す。ＭＧＥ前駆細胞は一般に、ホメオ
ボックス遺伝子Ｎｋｘ２．１、ＬＩＭ−ホメオボックス遺伝子Ｌｈｘ６、Ｌｈｘ７または
Ｌｈｘ８などのマーカーを発現する。ＭＧＥ前駆細胞は、適切な分化条件下で介在ニュー
ロンに分化することができる。

「多能性幹細胞」または「多能性細胞」は、しかるべき条件下で３つの胚葉（内胚葉、
中胚葉及び外胚葉）すべての誘導体である複数の異なる細胞型の子孫を生じさせる能力を
有する細胞を意味する。多能性幹細胞は奇形腫を形成することができる。多能性幹細胞の
例には、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖幹（ＥＧ）細胞、胚性癌幹（ＥＣ）細胞及び人工
多能性幹（ｉＰＳ）細胞がある。ＰＳ細胞は、例えば、ヒト；霊長類；非ヒト霊長類；イ
ヌ；ネコ；マウス；ウマ；ブタ；トリ；ラクダ；ウシ；ヒツジなどを含めた目的とする任
意の生物体に由来するものであり得る。

「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」は、ａ）自己複製が可能であり、ｂ）分化して生物
体のあらゆる種類の細胞を生じることが可能であり、かつｃ）発生中の生物体に由来する
ものであるか、発生中の生物体に由来する樹立されたＥＳ細胞系である細胞を意味する。
ＥＳ細胞は、発生中の生物の胞胚の内部細胞塊または胚盤葉上層に由来し得る。ＥＳ細胞
は、発生中の生物体から単一の割球を取り出す単一割球生検（ＳＢＢ）によって生じた割
球に由来し得る。ＳＢＢは一般に、内部細胞塊の単離に代わる非破壊的な方法である。Ｓ
ＢＢ及び生検割球からのｈＥＳ細胞生成については、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２
００８ Ｆｅｂ ７；２（２）：１１３−７に記載されている。ＥＳ細胞は、生物体のあ
らゆる種類の細胞に分化する能力を維持させながら長期間にわたって培養することが可能
である。培養時のＥＳ細胞は通常、核・細胞質比が大きく、境界が明瞭で、核小体が著明
な平坦なコロニーとして増殖する。さらに、ｈＥＳ細胞はＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、
ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及びアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥ
Ａ−１は発現しない。ＥＳ細胞を生成し特徴付ける方法の例が、例えば、米国特許第７，
０２９，９１３号、同第５，８４３，７８０号及び同第６，２００，８０６号にみられ、
これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＥＳ細胞の例としては、ナイーブＥ
Ｓ細胞が挙げられる。

「胚性生殖幹細胞」、「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」は、ａ）自己複製が可能で
あり、ｂ）分化して生物体のあらゆる種類の細胞を生じることが可能であり、かつｃ）生
殖細胞及び生殖細胞前駆細胞、例えば始原生殖細胞、すなわち精子及び卵子になる細胞に
由来する細胞を意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上に記載したような胚性幹細胞
とほぼ同じ特性を有すると考えられている。ＥＧ細胞を生成し特徴付ける方法の例が、例
えば、米国特許第７，１５３，６８４号；Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ
７０：８４１；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１３；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３７２６；及びＫｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｕ
．ら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：１２３５にみられ、これらの開示は
参照により本明細書に組み込まれる。

「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」は、ａ）自己複製が可能であり、ｂ）分化
して生物体のあらゆる種類の細胞を生じることが可能であり、かつｃ）体細胞に由来する
細胞を意味する。ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞様の形態の細胞であり、核・細胞質比が大きく、
境界が明瞭で、核小体が著明な平坦なコロニーとして増殖する。さらに、ｉＰＳ細胞は、
特に限定されないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏ
ｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｆ
ｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ及びｚｆｐ４２を含めた当業者に公知の
鍵となる多能性マーカーを１つまたは複数発現する。ｉＰＳ細胞は、細胞に「初期化因子
」、すなわち、１つまたは複数の例えば、細胞に作用し転写を変化させて細胞を多能性に
初期化する生物学的に活性な因子のカクテルを与えることによって生成し得る。ｉＰＳ細
胞を生成し特徴付ける方法の例が、例えば、米国特許出願公開第２００９００４７２６３
号、同第２００９００６８７４２号、同第２００９０１９１１５９号、同第２００９０２
２７０３２号、同第２００９０２４６８７５号及び同第２００９０３０４６４６号にみら
れ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

「体細胞」は、実験的操作を加えなければ通常は生物体のあらゆる種類の細胞を生じる
ことのない、生物体の任意の細胞を意味する。換言すれば、体細胞とは、十分に分化し、
身体の３つの胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉のすべての細胞を自然に生じる
ことのない細胞のことである。例えば、体細胞にはニューロン及び神経前駆細胞の両方が
含まれ、後者は自己複製し、かつ中枢神経系の全部または一部の細胞型を自然に生じるこ
とが可能であり得るが、中胚葉系または内胚葉系の細胞を生じることはできない。

「細胞系」という用語は、通常、単一の祖先細胞、あるいは定義されかつ／または実質
的に同一な祖先細胞集団に由来し、大部分または実質的に同一な細胞の集団を指す。細胞
系は長期間（例えば、数か月、数年、無制限の期間）にわたって培養で維持されてきたか
、維持することが可能なものであり得る。

「内胚葉」は、動物の胚形成期に形成され、消化管、気道、内分泌腺及び器官、聴覚系
の特定の構造ならびに尿路系の特定の構造を生じる胚葉を意味する。

「中胚葉」は、動物の胚形成期に形成され、筋肉、軟骨、骨、真皮、生殖器系、脂肪組
織、消化管の結合組織、腹膜、尿路系の特定の構造、中皮、脊索及び脾臓を生じる胚葉を
意味する。

「外胚葉」は、動物の胚形成期に形成され、神経系、歯のエナメル質、表皮、毛、爪及
び粘膜組織の内層を生じる胚葉を意味する。

「骨形成タンパク質」または「ＢＭＰ」は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ
β）スーパーファミリーのサブファミリーである増殖因子のファミリーを意味する。ＢＭ
Ｐ（例えば、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７
、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９／ＧＤＦ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１／ＧＤＦ１１、
ＢＭＰ１２／ＧＤＦ７、ＢＭＰ１３／ＧＤＦ６、ＢＭＰ１４／ＧＤＦ５、ＢＭＰ１５／Ｇ
ＤＦ９Ｂ）は、骨及び軟骨の形成を誘導する能力があることによって最初に発見された。
ＢＭＰは、細胞表面にある骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）と呼ばれる特異的受容体
相互作用する。ＢＭＰＲを介したシグナル伝達によりタンパク質のＳＭＡＤファミリーの
メンバーが動員され、次いで標的遺伝子の転写が調節される。ＢＭＰシグナル伝達の阻害
剤は、当該技術分野で公知のように、当業者が多数の方法、例えば、ＢＭＰまたはＢＭＰ
受容体との結合に関する競合結合アッセイ、機能アッセイ、例えば、下流シグナル伝達タ
ンパク質の活性増強、例えばＢＲ−ＳｍａｄなどのＳＭＡＤの核への再局在化及び下流遺
伝子標的の転写活性化などの測定によって容易に同定することができる。

「トランスフォーミング増殖因子ベータ」、「ＴＧＦ−β」及び「ＴＧＦＢ」は、トラ
ンスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのサブファミリーに属する
ＴＧＦＢ分泌タンパク質を意味する。ＴＧＦＢ（ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３）
は、多くの細胞型の増殖、分化、接着及び遊走を調節する多機能性ペプチドである。成熟
ペプチドは、ホモ二量体または他のＴＧＦＢファミリーメンバーとのヘテロ二量体として
存在し得る。ＴＧＦＢは細胞表面のトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦ
−βＲまたはＴＧＦＢＲ）と相互作用し、両者が結合すると、ＭＡＰキナーゼ、Ａｋｔ、
Ｒｈｏ及びＲａｃ／ｃｄｃ４２誘導性シグナル伝達経路、細胞構造の再構築及びＳＭＡＤ
タンパク質の核局在化ならびに標的遺伝子転写の調節が活性化される。ＴＧＦＢシグナル
伝達の阻害剤は、当該技術分野で周知のように、当業者が多数の方法、例えば、ＴＧＦＢ
もしくはＴＧＦＢ受容体との結合に関する競合結合アッセイまたは機能アッセイ、例えば
、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ及びＳＭＡＤ、例えばＡＲ−Ｓｍａｄなどの下流シ
グナル伝達タンパク質の活性抑制の測定によって容易に同定することができる。

「Ｗｎｔ」は、胚形成及び成熟組織の両方で重要な役割を果たす、高度に保存された分
泌シグナル伝達分子ファミリーを意味する。ヒトＷｎｔ遺伝子ファミリーには少なくとも
１９のメンバー（Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ−２Ｂ／Ｗｎｔ−１３、Ｗｎｔ−３、
Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５Ａ、Ｗｎｔ−５Ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７Ａ、Ｗ
ｎｔ−７Ｂ、Ｗｎｔ−８Ａ、Ｗｎｔ−８Ｂ、Ｗｎｔ−９Ａ／Ｗｎｔ−１４、Ｗｎｔ−９Ｂ
／Ｗｎｔ−１５、Ｗｎｔ−１０Ａ、Ｗｎｔ−１０Ｂ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６）が存
在する。Ｗｎｔタンパク質は、タンパク質のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）ファミリーのポリ
ペプチド及びタンパク質の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質（Ｌ
ＲＰ）ファミリーのポリペプチドを含むＷｎｔ受容体複合体と結合することによって細胞
活性を調節する。Ｗｎｔ受容体複合体はＷｎｔ結合によって活性化されると、１つまたは
複数の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。このようなカスケードには、古典的
Ｗｎｔシグナル伝達経路；Ｗｎｔ／平面内細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）経路；及びＷｎｔ
−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋）経路が含まれる。

「非接着条件」下での培養は、細胞がその培養容器、例えば、組織培養プレートまたは
フラスコの底面に接着するのを抑制する条件下での培養を意味する。いくつかの場合には
、細胞は本来非接着性である、すなわち、マトリックス組成物、例えば、フィブロネクチ
ン、ラミニン、ポリ−オルニチン、ポリ−リジン、コラーゲンＩＶ、マトリゲル及びポリ
カーボネート膜でコーティングしなければ表面に接着しない。いくつかの場合には、培養
物を攪拌することによって細胞を非接着状態に維持し得る。

「接着条件」下での培養は、細胞がその培養容器、例えば、組織培養プレートまたはフ
ラスコの底面に接着するのを促進する条件下での培養を意味する。いくつかの場合には、
単に培養物を静置状態に維持することによって、細胞が容器に接着するのを誘導し得る。
いくつかの場合には、接着を促進するのが望ましい容器の壁面を、細胞が接着し得る組成
物、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ−オルニチン、ポリ−リジン、コラーゲ
ンＩＶ、マトリゲル及びポリカルボネート膜でコーティングし得る。

「治療」、「治療すること」などの用語は、明細書では所望の薬理効果及び／または生
理学的効果を得ることを一般的に意味するのに用いられる。効果は、疾患またはその症状
の全般的または部分的な予防という意味で予防的なものであり得、かつ／あるいは疾患及
び／または疾患に起因する有害作用の部分的または全面的治癒という意味で治療的なもの
であり得る。本明細書で使用される「治療」は哺乳動物の疾患のあらゆる治療を包含し、
（ａ）疾患に罹患しやすいと思われるが未だその疾患を有すると診断されていない対象に
その疾患が発症するのを予防すること；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発
現を停止させること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の消退を引き起
こすことがこれに含まれる。疾患または損傷の発症前、発症時または発症後に治療剤を投
与し得る。患者の望ましくない臨床徴候が安定化または軽減される、進行中の疾患の治療
については、特に関心が持たれる。このような治療は罹患組織の機能が完全に喪失する前
に実施するのが望ましい。対象となる治療法は、疾患の症候段階において、そしていくつ
かの場合には疾患の症候的段階の後に、実施するのが望ましい。

「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」という用語は本明細書では互換的に使用さ
れ、診断、治療または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。

細胞培養と関連する「培地」という用語または「細胞培養培地」もしくは「細胞培地」
という語句は、目的とする細胞集団の培養に適した細胞増殖培地を指す。細胞培養培地の
例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２
（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、Ｆ１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ハムＦ１０ Ｎｕ
ｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘ、ハムＦ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｍｅｄｉｕｍ
１９９，ＲＰＭＩ、ＲＰＭＩ１６４０、低血清培地、基本培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｆ
１２（１：１）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地など及びその組合せが挙げられる。サプリメ
ント、分化因子、抗アポトーシス剤などの因子を１つまたは複数添加することによって、
培地または細胞培養培地を改変してもよい。

細胞または細胞集団と関連する「単離（した）」という用語は、生物体の組織から切り
離されている状態など、細胞の本来の環境以外の環境にある細胞を指す。

本明細書で使用される「分化因子（１つまたは複数）」という語句は、本開示の細胞を
培養するために培地に含ませる薬剤（１つまたは複数）を指し、この薬剤（１つまたは複
数）は第一の細胞型から第二の細胞型への分化を促進し、この第二の細胞型は第一の細胞
型と比較して分化している。

細胞発生との関連において、「分化した」という形容詞は相対的な用語である。「分化
した細胞」とは、比較する細胞よりも発生経路をさらに進んだ細胞のことである。したが
って、多能性胚性幹細胞は系列が制限された前駆細胞に分化することができる。次いで、
これらの細胞は経路をさらに進んだ細胞または最終段階の分化した細胞、例えばＧＡＢＡ
作動性介在ニューロンなどにさらに分化することができる。

「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、別の種類の細胞と共培養することでその
細胞が増殖できる環境がもたらされるある種の細胞を表すために用いられる用語である。
ｐＰＳ細胞集団を分割した後、ｐＰＳ細胞の増殖を補助するために新たなフィーダー細胞
を加えずに細胞を少なくとも１ラウンド増殖させた場合、そのｐＰＳ細胞集団はフィーダ
ー細胞を「実質的に含まない」ことになる。

本明細書で使用される「発現」及びその文法的等価物は、マーカーと関連する場合、マ
ーカーの産生及びマーカーのレベルまたは量を指す。例えば、細胞にマーカーの発現もし
くはマーカーの存在が認められるか、細胞がマーカー陽性である場合、これはマーカーの
発現が陽性対照のレベルと同様のレベルであることを表す。陽性対照のレベルは、そのマ
ーカーが関連する細胞運命を有することが知られる細胞によって発現されるマーカーのレ
ベルによって決定され得る。同様に、マーカーの発現が認められないか、細胞がマーカー
陰性である場合、これはマーカーの発現が陰性対照のレベルと同様のレベルであることを
表す。陰性対照のレベルは、そのマーカーが関連する細胞運命を有さないことが知られる
細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。したがって、マーカー
が存在しないことは、単にマーカーの発現レベルが検出不可能なレベルであることを示す
のではなく、ある特定の場合には、細胞がそのマーカーを発現し得るが、その発現が陽性
対照に比して低いか、陰性対照のレベルと同様のレベルであることも考えられる。

本明細書で使用される「マーカー」は、測定または検出することができる任意の分子を
指す。例えば、マーカーとしては、特に限定されないが、遺伝子転写物などの核酸、遺伝
子のポリペプチド産物、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質、炭水
化物または小分子（例えば、分子量が１０，０００ａｍｕ（Ｄａ）未満の分子）などが挙
げられる。

「変異体」ポリペプチドは、天然配列のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、生物学的に
活性な、以下で定義されるポリペプチドを意味する。このような変異体としては、天然配
列のＮ末端もしくはＣ末端または天然配列内に１つまたは複数のアミノ酸残基が付加され
たポリペプチド；約１〜４０個のアミノ酸残基が欠失し、任意選択で１つまたは複数のア
ミノ酸残基で置換されたポリペプチド；生じる生成物が非天然アミノ酸を有するようアミ
ノ酸残基が二重結合により修飾された上記ポリペプチドの誘導体が挙げられる。生物学的
に活性な変異体は通常、アミノ酸配列が天然配列のポリペプチドと少なくとも約９０％、
少なくとも約９５％または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体ポ
リペプチドは天然にまたは非天然にグリコシル化されたものであり得る、すなわち、ポリ
ペプチドは、対応する天然のタンパク質にみられるグリコシル化パターンとは異なるグリ
コシル化パターンを有する。変異体ポリペプチドは、天然のポリペプチドにはみられない
翻訳後修飾を有し得る。

「富化する」または「富化された」という用語は本明細書では互換的に使用され、ある
種類の細胞の収率（割合）が、開始時の培養物または調製物中のその種類の細胞の割合よ
りも少なくとも１０％増加していることを意味する。

「増殖環境」とは、目的とする細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖、分化または成熟する環
境のことである。環境の特徴には、細胞を培養する培地、存在し得る任意の増殖因子また
は分化誘導因子及び存在する場合は支持構造体（固体表面の基質）が含まれる。

詳細な説明
上述の通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＧＥ前駆細胞を生成する方法及びシステムならびに
富化されたＭＧＥ前駆細胞の組成物が提供される。この方法及びシステムにより、機能的
なＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに分化する機能的なＭＧＥ前駆体が効率的に作製される
。

本発明をさらに説明する前に、本発明が、記載される特定の実施形態に限定されるわけ
ではなく、したがって当然のことながら、様々なものであり得ることを理解するべきであ
る。このほか、本発明の範囲が添付の「特許請求の範囲」によってのみ限定されることか
ら、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することを目的とし、限定するこ
とを意図するものではないことを理解するべきである。

数値の範囲が記載される場合、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除いて、その
範囲の上限と下限の間に介在する下限の１０分の１の単位までの各介在数値及びその記載
される範囲内にある他の記載される数値または介在する数値は、いずれも本発明の範囲に
包含されることが理解される。このようなより狭い範囲の上限及び下限は、独立してその
より狭い範囲に含まれ得るものであり、同じく本発明に包含され、任意の具体的に除外さ
れる限界に従う。記載される範囲に上限及び下限の一方または両方が含まれる場合、その
含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。

特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明
が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書
に記載されるものと同様ないし同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または検討に用
いることができるが、好ましい方法及び材料をこれより記載する。本明細書で言及される
刊行物はすべて、関連してその刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明
するために参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔ
ｈｅ」には、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除いて、複数形の指示対象が含ま
れることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ＳＭＡＤ阻害剤（ａ ＳＭ
ＡＤ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」に言及する場合、複数のこのような阻害剤がこれに含まれ
、「ＲＯＣＫ阻害剤（ｔｈｅ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」に言及する場合、１つ
または複数のＲＯＣＫ阻害剤及び当業者に公知のその等価物への言及がこれに含まれる、
などである。さらに、「特許請求の範囲」は、任意選択の要素がいずれも排除されるよう
起草され得ることに留意される。したがって、この記述は、請求項の要素への言及に関連
した「単に」、「〜のみ」などのような排他的用語の使用または「消極的」限定の使用の
先行記載としての役割を果たすことが意図される。

本明細書で述べられる刊行物は、本願の出願日より前に開示されたため記載されるもの
である。本明細書に記載されるいかなる事項も、本発明にはこのような刊行物に対して、
それが先行発明であるという理由で先行する権利がないことを認めるものとして解釈され
るべきではない。さらに、記載される刊行日が実際の出願日と異なる可能性があり、これ
に関して個別に確認を必要する場合もある。

ＭＧＥ前駆細胞を生成する方法
ある特定の実施形態では、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ
）前駆細胞を作製する方法が提供される。

一般に、ＭＧＥ前駆細胞の作製方法を開始するまでｐＰＳを未分化の状態で維持する。

この方法は、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無
血清培地でｐＰＳ細胞を培養してＭＧＥ前駆細胞を生成することを含み得る。ｐＰＳ細胞
は接着培養または浮遊培養で培養し得る。

ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞の作製方法を開始する時点で、ｐＰＳは、ｐ
ＰＳ細胞の付着を促進する接着基質を有する細胞培養容器中に播種した細胞であり、この
細胞と、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清培
地とを接触させてＭＧＥ前駆細胞を生成する。

ある特定の実施形態では、この方法は、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘
導サプリメントとを含む無血清培地でｐＰＳ細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を生成するこ
とを含み、ここでは、ＥＢはＭＧＥ前駆細胞を含む。

ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞の作製方法を開始する時点で、ｐＰＳは、浮
遊胚様体の形成を可能にする低接着性の基質を有する培養容器に浮遊状態で播種した細胞
であり得る。例示的な方法では、ｐＰＳ細胞のコンフルエントな単層培養物を回収し、次
いで、非接着性細胞培養プレートに播種して細胞を浮遊状態で維持する。

ある特定の場合には、ｐＰＳコロニーを優先的に選択するためにコラゲナーゼＩＶ／デ
ィスパーゼを使用し得る。コロニーをトリプシン処理して単一の細胞にしてから低付着性
の丸底プレートに播種して、浮遊ＥＢを形成させ得る。

ある特定の場合には、例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養物の過剰増殖によって、または胚
様体の形成を可能にする低接着性の基質を有する培養容器でｐＰＳ細胞を浮遊培養するこ
とによって、またはフィーダー層の非存在下でｐＰＳを培養することによってｐＰＳ細胞
を分化させて、例えば、胚様体または集合体を形成させることによって、分化の過程を誘
導することができる。例示的な方法では、ｐＰＳ細胞のコンフルエントな単層培養物を回
収し、次いで、非接着性細胞培養プレートに播種して細胞を浮遊状態で維持し、定期的に
栄養培地で栄養を補給する。

上記のものに代えてまたは加えて、細胞が未分化の表現型を維持できないようにする特
定の因子を加えて培養することによって分化過程を開始させることができる。最初の分化
因子はＭＧＥ前駆細胞系列への分化に制限するものである必要はないが、分化した集団の
細胞型の範囲内にＭＧＥ前駆細胞またはその前駆体を含むものであるべきである。

ある段階で培養物をより特異的にＭＧＥ前駆細胞系列に方向付けることができる。これ
は、より特異的にＭＧＥ前駆細胞の生成及び増殖を促進する因子を培地に含ませることに
よって行うことができる。ＭＧＥ前駆細胞の形成及び／または増殖を促進する例示的な因
子としては、本明細書に記載される神経誘導サプリメント、ｓｈｈシグナル伝達活性化因
子、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤及び抗ア
ポトーシス剤が挙げられ、いくつかの場合には、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子（１つま
たは複数）がこれに含まれ得る。

ＭＧＥ前駆細胞を生成するための例示的な方法を以下に記載する。

いくつかの場合には、この方法は、ｓＥＢを生成する段階及びそれに続くａＥＢを生成
する段階を含み得る。他の場合には、ｓＥＢを生成する段階を接着培養に置き換え得る。

浮遊胚様体（ｓＥＢ）の生成
例示的な方法では、浮遊胚様体の形成を可能にする低接着性の基質を有する培養容器中
でのｐＰＳ細胞の浮遊培養を、ｓｈｈ活性化因子とＢ２７またはＮＳ２１などの神経誘導
サプリメントとの存在下で実施し得る。培地にｓｈｈ活性化因子及び／または神経誘導サ
プリメントを添加する前にｐＰＳ細胞をフィーダー層の非存在下で０〜９日間、浮遊培養
してもよく、例えば、培地にｓｈｈ活性化因子及び／または神経誘導サプリメントを添加
する前にｐＰＳ細胞を少なくとも０時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、１８時間
、２４時間、３６時間、４８時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、
８日間または９日間、浮遊培養してもよい。このようにして、本明細書に記載の神経誘導
サプリメント及びｓｈｈシグナル伝達活性化因子の存在下で、ｐＰＳにｓＥＢの形成を誘
導する。

ｐＰＳ細胞を本明細書に記載の神経誘導サプリメント及びｓｈｈシグナル伝達活性化因
子の存在下で少なくとも１日、例えば、１〜１００日、１〜６０日、１〜５０日、２〜１
００日、２〜５０日、３〜１００日、４〜１００日、５〜１０日、７〜１０日または２５
〜１００日の期間浮遊培養してｓＥＢを形成させ得る。ｐＰＳ細胞を９日未満の期間浮遊
培養してｓＥＢを形成させ得る場合、ｐＰＳ細胞の培養開始から０〜８日以内にｓｈｈ活
性化因子及び／または神経誘導サプリメントを培地に添加してｓＥＢを形成させ得る。

ある特定の実施形態では、低接着性の基質を有する培養容器で本明細書に記載の神経誘
導サプリメントとｓｈｈシグナル伝達活性化因子とを含む細胞培養培地中、ｐＰＳを浮遊
培養する。

ｐＰＳ細胞を浮遊培養してｓＥＢを形成させる培地は、本明細書に記載の神経誘導サプ
リメント及びｓｈｈシグナル伝達活性化因子に加えて、抗アポトーシス剤、ＳＭＡＤ阻害
剤（例えば、ＴＧＦ−β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、アクチビン阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤ま
たは増殖分化因子（ＧＤＦ）シグナル伝達経路阻害剤）及びＷｎｔ阻害剤のうちの１つま
たは複数を含有し得る。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を作製する方法は、抗アポトーシ
ス剤、例えばＲＯＣＫ阻害剤を含む培地でｐＰＳ細胞を約１時間〜３５日間、例えば、少
なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも１０時間、少なくとも２４時間、少なく
とも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも２日、少なくとも３日、例えば４日、５
日、６日、７日、８日、９日、１５日、２０日、２５日または３５日などの間培養するこ
とを含み得る。例示的な方法は、抗アポトーシス剤を含有する培地にｐＰＳ細胞を浮遊状
態で播種し、ｐＰＳ細胞を抗アポトーシス剤の存在下で１時間〜３５日の期間培養するこ
とを含み得る。ある特定の場合には、抗アポトーシス剤はｐＰＳ細胞の培養開始時から存
在してもよく、また１時間〜３５日後、例えば１日〜７日後、例えば、１日後、２日後、
３日後、４日後、５日後、６日後または７日後などに除去してもよい。

ある特定の場合には、抗アポトーシス剤はｐＰＳがＭＧＥ細胞に分化する間、一時的に
存在してもよく、例えば、抗アポトーシス剤は、ｐＰＳ細胞を本明細書に記載の神経誘導
サプリメント及びｓｈｈシグナル伝達活性化因子に曝露する第１日に培地中に存在してい
てもよい。ｐＰＳ細胞の分化は、本明細書に記載の神経誘導サプリメント、ｓｈｈシグナ
ル伝達活性化因子及び抗アポトーシス剤の存在下、上記のように１時間〜３５日間実施し
てもよく、その後、抗アポトーシス剤の非存在下で培養してもよい。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を作製する方法は、１つまたは複
数のｗｎｔ阻害剤を含む培地でｐＰＳ細胞を培養することを含み得る。Ｗｎｔシグナル阻
害剤はｐＰＳ細胞の培養開始時に既に培地に添加してもよいが、数日間培養した後（例え
ば、培養から１０日以内の時点）に培地に添加してもよい。ある特定の場合には、Ｗｎｔ
シグナル阻害剤をｐＰＳ細胞の浮遊培養開始から５日以内、例えば０日以内、１日以内ま
たは３日以内などの時点で培地に添加する。ｗｎｔ阻害剤はｓＥＢの生成段階全体を通じ
て存在しても、あるいは５〜１０日、例えば、５日、６日、７日、８日、９日または１０
日の期間存在してもよく、その後、ｗｎｔ阻害剤（１つまたは複数）の非存在下で培養を
継続してもよい。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を作製する方法は、１つまたは複
数のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地でｐＰＳ細胞を培養することを含み得る。ＳＭＡＤシグナ
ル阻害剤はｐＰＳ細胞の培養開始時に既に培地に添加してもよいが、数日間培養した後（
例えば、培養から１０日以内の時点）に培地に添加してもよい。ある特定の場合には、１
つまたは複数のＳＭＡＤシグナル阻害剤をｐＰＳ細胞の浮遊培養開始から５日以内、例え
ば０日以内、１日以内または３日以内などの時点で培地に添加する。ｗｎｔ阻害剤はｓＥ
Ｂの生成段階全体を通じて存在しても、あるいは５〜１０日の期間存在してもよい。

ある特定の場合には、ｐＰＳをｓｈｈ活性化因子、本明細書に記載の神経誘導サプリメ
ント及びＳＭＡＤ阻害剤の存在下で５〜１５日（例えば、５〜１０日、例えば５日、６日
、７日、８日、９日、１０日、１２日など）の期間分化させ、その後、ＳＭＡＤ阻害剤（
１つまたは複数）の非存在下で分化を継続させ得る。

ある特定の実施形態では、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ
）前駆細胞を作製する方法は、無血清培地でｐＰＳ細胞を培養してｓＥＢを生成すること
を含み得、ここでは、ｓＥＢはＭＧＥ前駆細胞を含み、無血清培地はソニックヘッジホッ
グ経路活性化因子と、抗アポトーシス剤と、ＳＭＡＤ阻害剤と、Ｗｎｔ阻害剤と、Ｂ２７
とを含む。本明細書に記載される方法によって作製されるｓＥＢは、ＭＧＥ前駆細胞の集
団を含む。

ある特定の実施形態では、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ
）前駆細胞を作製する方法は、ｐＰＳ細胞を無血清培地中、浮遊培養で培養してＭＧＥ前
駆細胞を生成することを含み得、ここでは、無血清培地はソニックヘッジホッグ経路活性
化因子と、抗アポトーシス剤と、ＳＭＡＤ阻害剤と、Ｗｎｔ阻害剤と、Ｂ２７とを含む。
ある特定の場合には、ｓＥＢを分離し単層として播種し、ＭＧＥ前駆細胞を含む単層を生
成し得る。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞の分化開始から約５日後にｓＥＢを分離し単層として
播種し得る。例えば、ｓＥＢの形成後１〜１００日以内、例えば、１〜７５日以内、１〜
５０日以内、１〜３０日以内、１〜１０日以内にｓＥＢを分離し単層として播種し得る。
例示的な場合には、ｓＥＢの形成から約１０日後、例えば、１０〜５０日後、１０〜４０
日後、１０〜３０日後、１０〜２０日後、１０日後、１２日後などにｓＥＢを分離し単層
として播種し得る。使用する分化因子及び添加剤、サプリメントまたは因子ならびにその
添加／除去のタイミングは上に開示した通りのものであり得る。

ある特定の実施形態では、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ
）前駆細胞を作製する方法は、ｐＰＳ細胞を無血清培地中、接着培養で培養してＭＧＥ前
駆細胞を生成することを含み得、ここでは、無血清培地はソニックヘッジホッグ経路活性
化因子と、抗アポトーシス剤と、ＳＭＡＤ阻害剤と、Ｗｎｔ阻害剤と、Ｂ２７とを含む。

一般に、本明細書に記載される方法によって作製されるＭＧＥ前駆細胞は、ＮＫＸ２．
１などのＭＧＥ前駆細胞のマーカーを発現する。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞を生成する培養を開始した時点のＰＳ細胞は、１
０^３〜１０^７細胞／ｍｌの細胞密度で存在する。

浮遊培養に使用する培地は、任意の基本培地を用いて調製することができる。培地はＢ
ＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、グラスゴーＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、
イーグルＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、フィッシャー培
地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地及びその混合培地などであり得る。本明細書に開示される
ように、添加剤、サプリメントまたは因子の添加によって培地を改変してもよい。

ｐＰＳを接着培養で培養する方法には接着基質を有する細胞培養容器を使用し得る。使
用する分化因子及び添加剤、サプリメントまたは因子ならびにその添加／除去のタイミン
グは上に開示した通りのものであり得る。

接着胚様体（ａＥＢ）の生成
ある特定の場合には、上記の方法によって生成したｓＥＢを、ｓＥＢの付着を促進する
接着基質を有する細胞培養容器に播種して接着ＥＢを形成させ得る。一般に、本明細書に
記載の神経誘導サプリメントとｓｈｈシグナル伝達活性化因子とを含有する培地中、接着
基質を有する細胞培養容器にｓＥＢを播種し得る。

ｐＰＳ細胞を上記のように接着培養で培養する実施形態では、この方法は、ソニックヘ
ッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清培地でｐＰＳ細胞を培
養してａＥＢを生成することをさらに含み得、このａＥＢはＭＧＥ前駆細胞を含む。

接着培養に再播種し培養してａＥＢを形成させるｓＥＢは、１〜１００日の期間培養し
得る。例示的な方法では、ｓＥＢの再播種は、ＥＢを機械的または酵素的に分離して単一
細胞または細胞塊にする段階、分離した細胞を接着基質に播種して接着単層を得る段階；
及び接着単層を培養してａＥＢを生成する段階を含み得る。ある特定の方法では、ｓＥＢ
を接着条件でさらに培養する前に分離しない。

ある特定の実施形態では、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を生成する方法は、ソニック
ヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清培地でｐＰＳ細胞を
培養してｓＥＢを生成すること、接着基質を有する細胞培養容器にｓＥＢを播種すること
、及び接着基質に播種したｓＥＢをソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプ
リメントとを含む無血清培地で培養してａＥＢを生成することを含み得、このａＥＢはＭ
ＧＥ前駆細胞を含む。

ある特定の場合には、ａＥＢを分離し単層として再播種し、この単層をソニックヘッジ
ホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清培地で培養してＭＧＥ前駆
細胞を生成し得る。

接着培養物を培養してｓＥＢからａＥＢを生成するための細胞培養培地はほかにも、抗
アポトーシス剤、ＳＭＡＤ阻害剤及びＷｎｔ阻害剤などの因子のうちの１つまたは複数を
含み得る。この因子は、接着培養開始時に存在してもよく、また接着培養開始から５日以
内、例えば接着培養開始から０時間以内、１時間以内、３時間以内、１０時間以内、１日
以内、２日以内または３日以内に添加してもよい。この因子は１〜２０日間培養した後に
接着培養物から除去してもよい。

ある特定の実施形態では、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を生成する方法は、本明細書
に記載される方法によって得られたｓＥＢの細胞を、ソニックヘッジホッグ経路活性化因
子と、神経誘導サプリメントと、Ｗｎｔ阻害剤と、ＳＭＡＤ阻害剤とを含む培地中、接着
培養で４〜２０日の期間培養した後、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サ
プリメントとを含むが、Ｗｎｔ阻害剤とＳＭＡＤ阻害剤は含まない培地で接着培養物を８
〜２０日間培養することを含み得る。

本明細書に記載される方法によって生成したａＥＢは、ＭＧＥ前駆細胞の集団を含む。
一般に、本明細書に記載される方法によって作製されたａＥＢ中に存在するＭＧＥ前駆細
胞は、ＮＫＸ２．１及びＦＯＸＧ１を発現する。ある特定の場合には、本明細書に開示さ
れる方法によって作製されたＭＧＥ前駆細胞は、ＮＫＸ２．１、ＬＨＸ６、ＬＨＸ７／８
、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＤＬＸ１／２及びＡＳＣＬ１などのＭＧＥ前駆細胞のマーカ
ーを１つまたは複数発現し得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製されたＭＧＥ前駆細
胞はほかにも、ＭＧＥ前駆細胞から分化した細胞、例えば介在ニューロン、例えばＧＡＢ
Ａ作動性介在ニューロンなどの集団を含み得る。

一般に、本明細書に記載される方法により、ＭＧＥ前駆細胞が高効率で生成し、細胞培
養物中の細胞の少なくとも５０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％または９５％）がＭＧＥ前駆細胞である細胞培養物が生じる。

したがって、この方法は、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメン
トとを含む無血清培地でｐＰＳ細胞を１０〜１００日間（例えば、５〜５０日間）培養し
てＭＧＥ前駆細胞を生成することを含み得、ここでは、ｐＰＳ細胞を接着培養または浮遊
培養で培養し、ｐＰＳ細胞をソニックヘッジホッグ経路活性化因子及び神経誘導サプリメ
ントの存在下で培養する前にその分化を誘導する。したがって、ｐＰＳ細胞は、ソニック
ヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清培地で培養する前に
、ＥＢなどの分化した細胞を含み得る。ある特定の場合には、無血清培地は抗アポトーシ
ス剤、ＳＭＡＤ阻害剤及びＷｎｔ阻害剤をさらに含み得る。

ある特定の場合には、ＥＢから得られたａＥＢを浮遊培養で再播種してｓＥＢを形成さ
せるか、分離し接着培養で単層として再播種し得る。

ＭＧＥ前駆細胞を生成する方法を用いてｐＰＳ細胞を接着培養で培養することについて
、以下でさらに説明する。

ＭＧＥ前駆細胞生成のための接着培養
上記のように、ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞を作製する方法を開始する時
点で、ｐＰＳは、ｐＰＳ細胞の付着を促進する接着基質を有する細胞培養容器中に播種し
た細胞であり、この細胞と、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメン
トとを含む無血清培地とを接触させてＭＧＥ前駆細胞を生成する。

ある特定の場合には、接着培養で生成したＭＧＥ前駆細胞はａＥＢ中に存在する。

いくつかの場合には、本発明の培養方法によって作製されたａＥＢを分離し単層として
再播種し、ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清
培地で培養してＭＧＥ前駆細胞を生成し得る。ａＥＢは、本明細書に記載されるサプリメ
ント及び因子中で１〜１００日の期間維持した後、浮遊培養で再播種しｓＥＢとしてさら
に培養するか、分離し接着培養で単層として再播種してもよい。ある特定の場合には、期
間は１〜７５日、１〜５０日、１〜３０日、１〜１０日、例えば、１０〜５０日、１０〜
４０日、１０〜３０日、１０〜２０日、５日、１０日、２０日または３０日であり得る。

ＭＧＥ前駆細胞を生成する方法を用いてｐＰＳを接着培養で培養するのに当該技術分野
で公知の接着基質及び本明細書に記載の接着基質を使用し得る。

ｐＰＳ細胞をソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無
血清培地と接触させる前に、これを一定期間、接着培養で増殖させ得る。ある特定の場合
には、ドナーｐＰＳ細胞培養の過剰増殖、フィーダー層の非存在下でｐＰＳを培養するこ
と、またはＦＧＦの存在下でｐＰＳ細胞を培養することなどによって、ｐＰＳ細胞の分化
を誘導し得る。上記のものに代えてまたは加えて、細胞が未分化の表現型を維持できない
ようにする特定の因子を加えて培養することによって分化過程を開始させることができる
。最初の分化因子はＭＧＥ前駆細胞系列への分化に制限するものである必要はないが、分
化した集団の細胞型の範囲内にＭＧＥ前駆細胞またはその前駆体を含むものであるべきで
ある。

ある段階で培養物をより特異的にＭＧＥ前駆細胞系列に方向付けることができる。これ
は、より特異的にＭＧＥ前駆細胞の生成及び増殖を促進する因子を培地に含ませることに
よって行うことができる。ＭＧＥ前駆細胞の形成及び／または増殖を促進する例示的な因
子としては、本明細書に記載される神経誘導サプリメント、ｓｈｈシグナル伝達活性化因
子、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤及び抗ア
ポトーシス剤が挙げられ、いくつかの場合には、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子（１つま
たは複数）がこれに含まれ得る。

ＭＧＥ前駆細胞を生成するための例示的な方法を以下に記載する。

培地にｓｈｈ活性化因子及び／または神経誘導サプリメントを添加する前にｐＰＳ細胞
を接着条件で０〜９日間培養してよく、例えば、培地にｓｈｈ活性化因子及び／または神
経誘導サプリメントを添加する前にｐＰＳ細胞を接着条件で少なくとも０時間、１時間、
３時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、２日間、３日間
、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間または９日間培養してよい。ある特定の実施
形態では、ｐＰＳをフィーダー細胞層の非存在下で分化させる。

いくつかの場合には、ｐＰＳ細胞を培養開始から１〜１００日の期間、ｓｈｈ活性化因
子及び／または神経誘導サプリメントを含有する培地中、接着条件で培養してＭＧＥ前駆
細胞を形成させ得る。

ｐＰＳ細胞を接着条件で培養する培地は、本明細書に記載の神経誘導サプリメント及び
ｓｈｈシグナル伝達活性化因子に加えて、抗アポトーシス剤、ＳＭＡＤ阻害剤（例えば、
ＴＧＦ−β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、アクチビン阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤またはＧＤＦシ
グナル伝達経路阻害剤）及びＷｎｔ阻害剤のうちの１つまたは複数を含有し得る。

分化因子の添加及び除去のタイミングは、ａＥＢ形成について上に記載した通りのもの
であり得る。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を作製する方法は、抗アポトーシ
ス剤、例えばＲＯＣＫ阻害剤を含む培地でｐＰＳ細胞を約１時間〜３５日間、例えば、少
なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも１０時間、少なくとも２４時間、少なく
とも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、例えば４日
間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１５日間、２０日間、２５日間または３
５日間などの間培養することを含み得る。例示的な方法は、ｐＰＳ細胞を抗アポトーシス
剤を含有する培地中、接着培養で播種し、ｐＰＳ細胞を抗アポトーシス剤の存在下で１時
間〜３５日の期間培養することを含み得る。ある特定の場合には、抗アポトーシス剤は、
ＭＧＥ前駆細胞を生成するためにｐＰＳ細胞の培養を開始する時点から存在してよく、１
時間〜３５日後、例えば１〜７日後などに除去してよい。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を作製する方法は、１つまたは複
数のｗｎｔ阻害剤を含む培地でｐＰＳ細胞を培養することを含み得る。Ｗｎｔシグナル阻
害剤はｐＰＳ細胞の培養開始時に既に培地に添加してもよいが、数日間培養した後（例え
ば、培養から１０日以内の時点）に培地に添加してもよい。ある特定の場合には、接着条
件でｐＰＳ細胞の培養を開始してから５日以内、例えば０日以内、１日以内または３日以
内などの時点でＷｎｔシグナル阻害剤を培地に添加する。ｗｎｔ阻害剤は培養全体を通じ
て存在しても、あるいは５〜１０日の期間存在してもよい。

ある特定の場合には、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を作製する方法は、１つまたは複
数のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地でｐＰＳ細胞を培養することを含み得る。ＳＭＡＤシグナ
ル阻害剤はｐＰＳ細胞の培養開始時に既に培地に添加してもよいが、ＭＧＥ前駆細胞を生
成するために数日間培養した後（例えば、培養から１０日以内の時点）に培地に添加して
もよい。ある特定の場合には、接着条件でｐＰＳ細胞の培養を開始してから５日以内、例
えば０日以内、１日以内または３日以内などの時点で１つまたは複数のＳＭＡＤシグナル
阻害剤を培地に添加する。ｗｎｔ阻害剤はＭＧＥ前駆細胞を生成する培養全体を通じて存
在しても、あるいは５〜１０日の期間存在してもよい。

ある特定の実施形態では、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から内側神経節隆起（ＭＧＥ
）前駆細胞を作製する方法は、ｐＰＳ細胞を接着条件で培養してＭＧＥ前駆細胞を生成す
ることを含み得、ここでは、培地はソニックヘッジホッグ経路活性化因子と、抗アポトー
シス剤と、ＳＭＡＤ阻害剤と、Ｗｎｔ阻害剤と、Ｂ２７とを含む。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞を生成する培養を開始した時点のＰＳ細胞は、１
０^３〜１０^７細胞／ｍｌの細胞密度で存在する。

上記のように、ｐＰＳ細胞からＭＧＥ前駆細胞を生成する方法に無血清培地を使用し得
る。無血清培地は、未調整または未精製の血清、例えばウシ胎仔血清などを含有しない培
地を意味する。無血清培地は、血清代替物、例えば本明細書に記載されるもの、例えばＢ
２７またはＮＳ２１などを含み得る。

ＭＧＥ前駆細胞の培養
本明細書に記載される方法によって生成したｓＥＢ及びａＥＢを酵素的または機械的に
分離し、接着基質を有する細胞培養容器で単層として培養し得る。したがって、ｓＥＢ及
びａＥＢ中に存在するＭＧＥ前駆細胞は、単層として培養され得る。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞の単層培養を１〜１００日、例えば１０〜１５日
の期間実施する。

ＭＧＥ前駆細胞の単層培養は、本明細書に記載の神経誘導サプリメントとｓｈｈシグナ
ル伝達活性化因子とを含有する培地で実施してよい。

ある特定の場合には、本明細書に記載される方法によって生成したＭＧＥ前駆細胞をニ
ューロン、例えば抑制性介在ニューロン、例えばＧＡＢＡ作動性介在ニューロンなどの生
成を促進する培地で培養し得る。したがって、本明細書に記載される方法によって生成さ
れＭＧＥ前駆細胞を含むｓＥＢ、ａＥＢならびにｓＥＢ及びａＥＢを分離して得られた単
層と、ＭＧＥ前駆細胞から分裂終了ニューロンへの分化を促進する培地とを接触させ得る
。ある特定の場合には、この培地はＳＭＡＤ阻害剤を含まないものであり得る。さらに、
ある特定の場合には、この培地はＳＭＡＤ活性化因子を含み得る。したがって、培地は、
本明細書に記載されるプロトコルによって生成したＭＧＥ前駆細胞中に存在する介在ニュ
ーロンの集団を増加させるためＳＭＡＤ活性化因子を含み得る。例示的なＳＭＡＤ活性化
因子としては、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ３）、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、
ＢＭＰ８）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ及びＩＤＥ１が挙げられる。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞から介在ニューロンへの分化を促進する培地は、
ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ｃａｍｐ、ビタミンＣ、血清
、マトリゲル、インスリン、ＩＧＦ、ＳＤＦ１ａ、ニューレグリン１、ＴＧＦβを含み得
る。

ＭＧＥ前駆細胞の単層培養により、ＭＧＥ前駆細胞の増殖及び／またはＭＧＥ前駆細胞
から神経細胞の運命をもつ細胞への分化が生じ得る。ある特定の場合には、神経細胞の運
命をもつ細胞に分化するＭＧＥ前駆細胞は、ＤＬＸ１／２、ＴＵＪ、ＭＡＰ２、ＧＡＤ１
／２及びＧＡＢＡを発現し、またＮＫＸ２．１、ＡＳＣＬ１、ＬＨＸ６、ＬＨＸ７／８、
ＤＣＸ、ＮＥＵＮ及びＶＧＡＴのうちの１つまたは複数を発現し、サブタイプマーカーの
カルビンジン、カルレチニン、ソマトスタチン及びパルブアルブミンを発現し得る。

ある特定の場合には、本明細書に記載される方法によって生成したＭＧＥ前駆細胞を支
持細胞集団と共培養して、ＭＧＥ前駆細胞からＧＡＢＡ作動性介在ニューロンなどの介在
ニューロンへの分化を誘導し得る。

未分化状態でのｐＰＳ細胞の繁殖
分化を促進せずに増殖を促進する培養条件を用いて、ｐＰＳ細胞を培養により継続的に
繁殖させることができる。例示的なＥＳ培地は、ＤＭＥＭ（ノックアウトＤＭＥＭ、「Ｋ
Ｏ ＤＭＥＭ」）８０％、規定のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代
替物（例えば、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ））２０％、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ
）１％、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−グルタミン（１ｍＭ Ｌ−グルタミン）１％、β−メルカ
プトエタノール０．０００８％及びＦＧＦ−ベーシック（ｂＦＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌで作
製される。

ｐＰＳ細胞を分化を阻害する環境で培養することによって、未分化の状態で拡大するこ
とができる。ｐＰＳ細胞を従来の方法で、マウスの胚組織または胎児組織に由来するフィ
ーダー細胞層上で培養する。培養プレートに放射線照射したマウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ
）（照射により増殖は阻害されるが、ｐＰＳ細胞を補助する因子の合成は可能である）を
１ウェル当たり３７５，０００個播種し、これを播種後５時間〜１０日間使用する。ある
特定の実施形態では、このほかヒトフィーダー細胞を用いてもよい。

フィーダー細胞がなくてもｐＰＳ細胞を未分化の状態で維持することができる。無フィ
ーダー培養の環境には、適切な培養基質、具体的にはマトリゲル（登録商標）またはラミ
ニンなどの細胞外マトリックスが含まれる。１ｃｍ^２当たりの細胞数が１５，０００個を
超えるように（９０，０００個／ｃｍ^２〜１７０，０００個／ｃｍ^２が最適である）ｐＰ
Ｓ細胞を播種する。分化しない細胞増殖を補助する因子を含有する栄養培地によって無フ
ィーダー培養を補助する。このような因子を分泌する細胞、例えば放射線照射した（約４
，０００ｒａｄ）初代マウス胚線維芽細胞、テロマー化したマウス線維芽細胞またはｐＰ
Ｓ細胞に由来するヒトフィーダー細胞などと培地を培養することによって、このような因
子を培地に導入し得る。血清代替物２０％及びｂＦＧＦ ４〜８ｎｇ／ｍＬを添加したＫ
Ｏ ＤＭＥＭなどの無血清培地にフィーダーを約５〜６×１０^４個／ｃｍ^２の密度で播種
することによって、培地を調整することができる。１〜２日間調整した培地にｂＦＧＦを
さら添加し、１〜２日間、ｐＰＳ細胞培養を補助するのに使用する。無フィーダー培養法
の特徴については、国際公開第９９／２０７４1号及び同第０１／５１６１６号；ならび
にＸｕら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９７１，２００１でさらに論じられて
おり、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

因子
本開示の方法及び組成物は、様々な因子、例えば神経誘導サプリメント、抗アポトーシ
ス剤、分化因子などの使用を含む。本開示の方法及び組成物で使用される神経誘導サプリ
メント、抗アポトーシス剤、分化因子の例を以下に記載する。

神経誘導サプリメント
例示的な神経誘導サプリメントとしては、Ｂ２７、ＮＳ２１またはこれと同等のサプリ
メントが挙げられる。

ある特定の実施形態では、神経誘導サプリメントはＢ２７であり得る。Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からＢ−２７（登録商標）無血清サプリメントを入手することが
できる。Ｂ２７サプリメントは、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、インスリン、
プロゲステロン、コルチコステロン、トリヨード−ｌ−チロニン、酢酸レチノール、ＤＬ
トコフェロール、ＤＬ酢酸トコフェロール、ビオチン、リノール酸、リノレン酸、エタノ
ールアミン、亜セレン酸Ｎａ、Ｌ−カルニチン、還元グルタチオン、カタラーゼ、スーパ
ーオキシドジスムターゼ、Ｄ−ガラクトース及びプトレシンを含有する。ある特定の場合
には、Ｂ２７−ビタミンＡを使用し得る。

ある特定の場合には、神経誘導サプリメンはＮＳ２１であり得る。ＮＳ２１については
Ｙ．Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１７１：２３９，２００８
に記載されている。Ｙ．Ｃｈｅｎらは、ＮＳ２１が神経培養の面でＢ２７サプリメントと
同等であることを示した。ＮＳ２１の配合表がＹ．Ｃｈｅｎらの文献に記載されており、
これを下の表１に再現する。

ある特定の場合には、神経誘導サプリメントは、ｐＰＳ細胞を培養するための無血清培
地中に０．５〜１０％、例えば０．５〜５％などの範囲、例えば０．５％、１％、２％ま
たは３％の濃度で存在しうる。

ある特定の実施形態では、ｓｈｈ活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む、ｐＰＳ
を培養してＥＢ生成するための無血清培地は、ＫＳＲサプリメントもＮ２サプリメントも
含まない。ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞を生成する方法は、ｂＦＧＦまたは
ＦＧＦ−２を含む無血清培地でｐＰＳ細胞を培養することを含まない。ある特定の場合に
は、ｓＥＢまたはａＥＢを生成するのに十分な期間、ｓｈｈ活性化因子と神経誘導サプリ
メントを含み、ＫＳＲサプリメントもＮ２サプリメントもｂＦＧＦもＦＧＦ−２も含有し
ない無血清培地でｐＰＳ細胞を培養する。

ある特定の場合には、ａＥＢを生成するのに十分な期間、ｓｈｈ活性化因子と神経誘導
サプリメントとを含み、さらにＫＳＲサプリメント、Ｎ２サプリメント、ｂＦＧＦ及びＦ
ＧＦ−２のうちの１つまたは複数を含有する無血清培地でｓＥＢをさらに培養し得る。

ある特定の場合には、ｓＥＢを生成するのに十分な期間、ｓｈｈ活性化因子と神経誘導
サプリメントとを含み、さらにＫＳＲサプリメント、Ｎ２サプリメント、ｂＦＧＦ及びＦ
ＧＦ−２のうちの１つまたは複数を含有する無血清培地でｐＰＳ細胞を培養し得る。本明
細書に記載されるようにｓｈｈ活性化因子及び神経誘導サプリメントと同時に、または本
明細書に記載されるようにｐＰＳ細胞をｓｈｈ活性化因子及び神経誘導サプリメントに曝
露してからのちの時点、例えば５日〜２週間後など、例えば１〜２週間後などに追加のサ
プリメントを添加し得る。ある特定の場合には、ＫＳＲサプリメント及び／またはＮ２サ
プリメントは、分化第０日または本明細書に記載されるようにｐＰＳ細胞とｓｈｈ活性化
因子及び神経誘導サプリメントとを接触させたのち、例えば第５日、第７日、第１０日、
第１４日、第２１日などに添加されて存在し得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される細胞培養培地は、Ｋ
ＳＲまたはＮ２などの血清代替物を含まない。

抗アポトーシス剤
本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態では、ＰＳ培養細胞の培地中に
抗アポトーシス剤が含まれ得る。

ある特定の場合には、抗アポトーシス剤はＲｈｏ結合タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）
阻害剤であり得る。ある特定の場合には、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ＨＡ−１０
０、Ｈ−１１５２、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（ピリジン−４
−イルアミノカルボニル）シクロヘキサンジヒドロクロリド一水和物（ＷＯ０００７８３
５１、ＷＯ０００５７９１３に記載されている）、イミダゾピリジン誘導体（米国特許第
７，３４８，３３９号に記載されている）、置換ピリミジン及びピリジン誘導体（米国特
許第６，９４３，１７２号に記載されている）ならびに置換イソキノリン−スルホニル化
合物（ＥＰ００１８７３７１に記載されている）またはＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＯＣＫ
ＩＩ阻害剤またはチアゾビビンまたはその類似体もしくは誘導体であり得る。

抗アポトーシス剤は、０．１μＭ、０．３μＭ、０．５μＭ、１μＭ、少なくとも約１
．３μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少
なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３
．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なく
とも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ
または少なくとも約５０μＭ、例えば０．５μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜２５μＭまたは２
．５μＭ〜２０μＭなどの濃度で存在し得る。

ＳＭＡＤ阻害剤
本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態では、細胞を培養するための培
地中にＳＭＡＤ阻害剤が存在し得る。いくつかの実施形態では、細胞培養に使用する培地
中にＳＭＡＤ阻害剤が１０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎ
ｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５
μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌの濃度、例えば５００ｎｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌ、例えば
１μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。

ＳＭＡＤ阻害剤は、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０３μＭ、少なくと
も約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．２５μＭ、少なくとも約０
．３μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少
なくとも約２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２
．８μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なく
とも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ
、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭまたは少なくとも約５０μＭ、例えば０
．５μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜２５μＭまたは５μＭ〜２０μＭの濃度で存在し得る。

ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤はＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤であり得る
。例えば、ＳＭＡＤ阻害剤は、ＡＬＫ阻害剤あるいはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧ
Ｆ−β３、ＴＧＦ−β受容体Ｉ及び／またはＴＧＦ−β受容体ＩＩと結合する抗体または
そのフラグメントであり得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤
は小分子阻害剤であり得る。ある特定の場合には、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤は、Ｌ
Ｙ３６４９４７（ＳＤ２０８）、ＳＭ１６、ＳＢ−５０５１２４、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、
ＳＢ−４３１５４２、ＬＹ２１５７２９９、ＬＤＮ−１９３１８９、Ａ８３−０１、（＋
）−ＩＴＤ−１、ＩＴＤ−１（エチル４−（［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２
，７，７−トリメチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−
３−カルボキシラート）またはＩＴＤｔであり得る。

ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤は、ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ、ノギンまたはその
誘導体であり得る。

ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤はドルソモルフィンなどのＢＭＰ経路阻害剤
であり得る。

ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤は、アクチビン阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤ま
たはＧＤＦシグナル伝達経路阻害剤であり得る。例示的なアクチビン阻害剤としては、Ｓ
Ｂ４３１５４２、フォリスタチン、Ａ８３０１、ＤＭＨ１、ドルソモルフィン、Ｋ０２２
８８及びＳＢ５０５１２４が挙げられる。ある特定の場合には、ＳＢ４３１５４２、Ｌｅ
ｆｔｙまたはＣｅｒｅｂｒｕｓなどのＮｏｄａｌ阻害剤（製剤化されている）を使用し得
る。ある特定の場合には、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６
４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８を用いてＧＤＦシグナル伝達経
路を阻害し得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に使用される細胞培養培地中に２つ以
上のＳＭＡＤ阻害剤が含まれ得る。

ソニックヘッジホッグシグナル伝達活性化因子
本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態では、細胞を培養するための培
地中にソニックヘッジホッグシグナル伝達活性化因子が存在し得る。ソニックヘッジホッ
グシグナル伝達活性化因子は、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０３μＭ、
少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．２５μＭ、少なく
とも約０．３μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．５
μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なく
とも約２．８μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ
、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約
２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭまたは少なくとも約５０μＭ、
例えば０．０５μＭ〜５μＭ、０．０１μＭ〜２．５μＭ、０．０５μＭ〜２μＭまたは
０．１μＭ〜２μＭの濃度で存在し得る。

ある特定の場合には、ソニックヘッジホッグシグナル伝達活性化因子はｓｈｈまたはそ
の誘導体であり得る。ある特定の場合には、ソニックヘッジホッグシグナル伝達活性化因
子は、プルモルファミン、ＳＡＧ ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト、Ｈｈ−Ａｇ１．５
またはその誘導体及び類似体などの小分子であり得る。

Ｗｎｔ阻害剤
本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態では、細胞を培養するための培
地中にＷｎｔシグナル伝達阻害剤が存在し得る。

Ｗｎｔ阻害剤はｗｎｔの発現または活性をダウンレギュレートする薬剤である。対象と
する薬剤はｗｎｔと直接相互作用し得るもの、例えば薬物、すなわち、小分子、遮断抗体
などであっても、ｗｎｔ関連タンパク質、例えば、Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰ５／６及び膜貫
通タンパク質Ｋｒｅｍｅｎと相互作用するものであってもよい。これまで多数のｗｎｔ阻
害剤が記載されており、当該技術分野で公知である。

対象とするＷｎｔ阻害剤は、可溶性の細胞外Ｗｎｔタンパク質と正常細胞の表面に存在
するｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体との間の相互作用を阻害するものである。このような薬剤と
しては、特に限定されないが、ｗｎｔ阻害ドメインを含む可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペ
プチド；可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド；ｗｎｔ特異的抗体；ｆｒｉｚｚｌｅ
ｄ特異的抗体；及び細胞外ｗｎｔシグナル伝達を遮断することができるその他の分子が挙
げられる。

既知のｗｎｔ阻害剤には、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）遺伝子ファミリーのメンバー（
Ｋｒｕｐｎｉｋら（１９９９）Ｇｅｎｅ ２３８（２）：３０１−１３を参照されたい）
が含まれる。ヒトＤｋｋ遺伝子ファミリーのメンバーとしては、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２
、Ｄｋｋ−３及びＤｋｋ−４ならびにＤｋｋ−３関連タンパク質Ｓｏｇｇｙ（Ｓｇｙ）が
挙げられる。

その他のｗｎｔ阻害剤としては、分泌タンパク質のＷｉｓｅ（Ｉｔａｓａｋｉら（２０
０３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３０（１８）：４２９５−３０）が挙げられる。Ｗｉ
ｓｅタンパク質はＷｎｔ共受容体、リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）
と物理的に相互作用し、ＬＲＰ６との結合に関してＷｎｔ８と競合することができる。

阻害剤には、元来の阻害剤の誘導体、変異体及び生物学的に活性なフラグメントも含ま
れる。

ある特定の場合には、Ｗｎｔ阻害剤は、ＣＫＩ−７、ＩＷＰ類似体、ＩＷＲ類似体、Ｘ
ＡＶ９３９、５３ＡＨ、Ｗｎｔ−Ｃ５９などの小分子であり得る。

ある特定の場合には、Ｗｎｔ阻害剤は、１０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎ
ｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２
μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌの濃度、例えば５００ｎｇ／ｍｌ〜３
μｇ／ｍｌ、例えば１μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在し得る。

細胞集団生成の評価
ある特定の場合には、産生された細胞集団を特徴付けるため、本明細書に開示される方
法に従って培養する細胞集団をモニターし、培養によって得られた細胞の変化（例えば、
本明細書に開示される培養方法の１つまたは複数の時点における）を評価し得る。ある特
定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞（分裂ＭＧＥ前駆細胞及び／または分裂終了介在ニュ
ーロン）に特徴的なマーカーの発現を判定することによって、これらの細胞集団の産生を
評価し得る。

ある特定の場合には、マーカー転写産物またはタンパク質発現の有無を検出することに
よって特定のマーカー発現を判定する。あるいは、マーカーが細胞培養物または細胞集団
の細胞中に存在するレベルを測定することによって、特定のマーカーの発現を判定するこ
とができる。このような工程では、マーカー発現の測定は定性的なものであっても定量的
なものであってもよい。マーカー遺伝子によって産生されるマーカーの発現を定量化する
方法の１つに、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いるものがある。Ｑ−ＰＣＲを実施する
方法は当該技術分野で周知である。このほか、当該技術分野で公知の他の方法を用いてマ
ーカー遺伝子発現を定量化することができる。例えば、目的とするマーカー遺伝子産物に
特異的な抗体を使用することによって、マーカー遺伝子産物の発現を検出することができ
る。ある特定の工程では、目的とする細胞集団に特徴的なマーカー遺伝子の発現に加え、
ＰＳ細胞をはじめとする細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如を判定し得
る。

ＭＧＥ前駆細胞生成のモニタリングはＮＫＸ２．１遺伝子の発現を判定することによる
ものであり得る。したがって、本明細書に記載される工程によって作製されたＭＧＥ前駆
細胞はＮＫＸ２．１マーカー遺伝子を発現し、これによりＮＫＸ２．１遺伝子産物を産生
する。本明細書に記載される方法によって作製されたＭＧＥ前駆細胞はほかにも、ＦＯＸ
Ｇ１を発現し、またＬＨＸ６、ＬＨＸ７／８、ＯＬＩＧ２、ＡＳＣＬ１及びＤＬＸ２を発
現し得る。さらに、本明細書に記載される方法によって作製されたＭＧＥ前駆細胞はＰＡ
Ｘ６を発現しない。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞におけるＮＫＸ２．１
マーカー及び／またはＦＯＸＧ１マーカーの発現は、非ＭＧＥ前駆細胞、例えば多能性幹
細胞におけるＮＫＸ２．１マーカー及び／またはＦＯＸＧ１マーカーの発現よりも少なく
とも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞にお
けるＮＫＸ２．１マーカー及び／またはＦＯＸＧ１マーカーの発現は、非ＭＧＥ前駆細胞
、例えば多能性幹細胞におけるＮＫＸ２．１マーカー及び／またはＦＯＸＧ１マーカーの
発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０
倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０
倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも
約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍
、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍または少なくとも約１０，０００倍
高い。

いくつかの場合には、目的とする細胞の機能分析を実施することによって、ＭＧＥ前駆
細胞（分裂ＭＧＥ前駆細胞及び／または分裂終了介在ニューロン）生成のモニタリングを
行う。例えば、本明細書に記載される方法によって生成したＭＧＥ前駆細胞は、ｉｎ ｖ
ｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで介在ニューロンを生成し得る。ある特定の場合には、本
明細書に開示される方法によって作製されたＭＧＥ前駆細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで遊走し
ニューロンと機能的に統合され得る抑制性ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに分化する、介
在ニューロンを生成し得る。

ある特定の場合には、この方法はＭＧＥ前駆細胞生成のモニタリングを含まない。

細胞集団の富化、単離及び／または精製
上記工程のいずれかによって作製されるＭＧＥ前駆細胞（分裂ＭＧＥ前駆細胞及び／ま
たは分裂終了介在ニューロン）などの目的とする細胞集団を、このような細胞に特異的な
アフィニティータグを用いて富化、単離及び／または精製することができる。目的とする
細胞または細胞集団に特異的なアフィニティータグの例としては、目的とする細胞の表面
には存在するが、本明細書に記載される方法によって作製される細胞培養物中にみられ得
る他の細胞型には実質的に存在しないポリペプチドなどのマーカー分子に特異的な抗体、
リガンドをはじめとする結合物質が挙げられる。

抗体を作製しこれを細胞の単離に用いる方法は当該技術分野で公知であり、このような
方法は、本明細書に記載される抗体及び細胞での使用に実施することができる。ある工程
では、目的とする細胞集団が発現するマーカーと結合する抗体を磁気ビーズに付着させた
後、酵素処理して細胞間及び基質接着を弱めた細胞培養物中の目的とする細胞に結合させ
る。次いで細胞／抗体／ビーズ複合体を、ビーズが結合した胚体内胚葉細胞と未結合細胞
とを分離するために使用する磁場に曝露する。目的とする細胞が培養物中の他の細胞と物
理的に分離された後、抗体の結合を分断し、細胞をしかるべき組織培養培地に再播種する
。

このほか、富化、単離または精製された目的とする細胞集団を得るためのまた別の方法
を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、目的とする細胞が発現するマ
ーカーに対する抗体を、細胞間及び基質接着を弱める処理をした目的とする細胞を含む細
胞培養物とインキュベートする。次いで細胞を洗浄し、遠心分離し、再懸濁させる。次い
で、細胞浮遊液を二次抗体、例えば一次抗体と結合することができるＦＩＴＣコンジュゲ
ート抗体などとインキュベートする。次いで細胞を洗浄し、遠心分離し、緩衝液に再懸濁
させる。次いで、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて細胞浮遊液を解析し分取す
る。抗体結合細胞をマーカー特異的抗体と結合してない細胞から分離して収集することに
より、目的とする細胞が単離される。必要に応じて、また別の親和性に基づく方法を用い
ることによって、あるいは目的とする細胞に特異的な同じまたは異なるマーカーを用いて
分取をさらに数ラウンド実施することによって、単離した細胞組成物をさらに精製するこ
とができる。ある特定の場合には、大きさに基づいて細胞を分取することによってＭＧＥ
前駆細胞を富化し得る。

ある特定の場合には、ＰＳ細胞培養物にＭＧＥ前駆細胞系列への分化を誘導した後、Ｍ
ＧＥ前駆細胞などの目的とする細胞を富化し、他の種類の細胞から単離及び／または精製
する。上に記載した富化、単離及び精製方法は、任意の分化段階にあるこのような培養物
に用い得ることが理解されよう。

上記方法に加えて、他の細胞単離技術によってＭＧＥ前駆細胞などの目的とする細胞を
単離してもよい。さらに、目的とする細胞の選択的生存または選択的拡大を促進する増殖
条件での連続継代培養法によって、ＭＧＥ前駆細胞などの目的とする細胞を富化または単
離してもよい。

本明細書に記載される方法を用いて、富化していない細胞集団に比してＭＧＥ前駆細胞
などの目的とする細胞が少なくとも約２〜約１０００倍富化された細胞集団または細胞培
養物を作製する。いくつかの実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞が未処理の細胞集団または細
胞培養物に比して少なくとも約５〜約５００倍富化され得る。他の実施形態では、ＭＧＥ
前駆細胞が未分化の細胞集団または細胞培養物に比して少なくとも約１０〜約２００倍、
少なくとも約２０〜約１００倍、少なくとも約４０〜約８０倍または少なくとも約２〜約
２０倍富化され得る。

本開示の細胞集団の遺伝子型の特性
本開示の細胞集団が単離ＰＳ細胞または確立されたＰＳ細胞系から誘導されたものであ
れば、これを元の細胞または細胞系の子孫と見なすことができる。したがって、この細胞
集団はそれが由来する細胞と同じゲノムを持つことになる。これは、何らかの核型変化に
加えて、ＰＳ細胞とそこから生成した細胞集団との間で染色体ＤＮＡが９０％超一致する
ことを意味する。組換え法によって処理して導入遺伝子が導入されるか、内在遺伝子がノ
ックアウトされた本開示の細胞集団では、操作されていない遺伝要素がすべて保存される
ことから、依然としてそれが由来する細胞系と同じゲノムを持つと考えられる。標準的な
遺伝的技術によって、本開示の細胞集団及びＰＳ細胞が同じゲノムを持つことを確認する
ことができる。ほかにも、細胞集団が未分化の細胞系から正常な有糸分裂の過程を経て得
られるものであれば、同じゲノムを持つと推測することができる。

ある特定の産業上の利用では、この特徴は本開示の細胞集団の価値ある特性となる。特
に、起点となるＰＳ細胞が入手できれば、そのＰＳ細胞を必要に応じてさらに多くの細胞
集団に増殖及び分化させることができるため、遺伝的に適合性のある分化細胞集団をさら
に供給できる。さらに、ＰＳ細胞を他の治療上重要な細胞系列に分化させることができる
。

本願に記載されている技術は、分化の前後に細胞を拡大することによって、同じゲノム
を共有する大きい細胞集団の作製を可能にするものである。１０^８個、１０^１０個または
１０^１２個の細胞からなる集団が理論的に可能である。このような大きい集団は通常、さ
らなる培養、薬剤スクリーニングまたは治療的投与に適した別々の容器に分けられる。

本開示のある特定の実施形態は、起点となる細胞（未分化ＰＳ細胞系または中間の集団
）を、ＭＧＥ前駆細胞の特徴を有する１つまたは複数の分化細胞集団とを組み合わせて含
む。この集団は同じ容器内にあっても、同じ設備の別々の容器内にあっても、２つの異な
る場所にあってもよい。未分化の細胞と分化した細胞は同時に存在してもよく、また本明
細書に記載される通りに未分化細胞の培養物をＭＧＥ前駆細胞に分化させる場合などのよ
うに、異なる時間に存在してもよい。

本開示の細胞集団を含む組成物
上記方法によって作製される細胞組成物は、単離ＭＧＥ前駆細胞と単離ＭＧＥ前駆細胞
が富化された細胞集団とを含有する、細胞培養物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞を含み、培養物中の細胞の少なくとも約５０〜
８０％が目的とする細胞である、細胞組成物を作製することができる。本明細書に記載さ
れる分化方法により、多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、
約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、
約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９５％超を目的
とする細胞に変換させることができる。

目的とする細胞の単離を用いる実施形態では、例えば、目的とする細胞に結合する親和
性試薬を使用することによって、実質的に純粋な目的とする細胞集団を回収することがで
きる。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、目的とする細胞を少なくとも約５％〜少
なくとも約９５％含む細胞組成物に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物または
細胞集団は哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団はヒ
ト細胞を含む。例えば、ある特定の具体的な実施形態は、ヒト細胞を含み、ヒト細胞の少
なくとも約５％〜少なくとも約９５％がＭＧＥ前駆細胞である、細胞組成物に関する。他
の実施形態は、ヒト細胞を含み、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少
なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少
なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少
なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少
なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％また
は９０％超がＭＧＥ前駆細胞である、細胞組成物に関する。

特定の実施形態では、ヒト細胞を含み、ヒト細胞の少なくとも７０％がヒトＭＧＥ前駆
細胞である、組成物が提供される。

別の実施形態では、ヒト細胞を含み、ヒト細胞の少なくとも８０％がヒトＭＧＥ前駆細
胞である、組成物が提供される。

ある特定の実施形態では、組成物は多能性幹細胞及び／または抑制性介在ニューロンを
含み得る。

本開示の細胞集団、例えばＭＧＥ前駆細胞を含むｓＥＢ、ＭＧＥ前駆細胞を含むａＥＢ
、ＭＧＥ前駆細胞またはＭＧＥ前駆細胞から生成したニューロンなどは、これらの細胞集
団を１つまたは複数含む組成物中に存在し得る。

本開示の細胞集団は、新鮮なまま使用してもよく、また凍結保存などの当該技術分野で
認められている方法で１日〜１０年の期間保管したのちに解凍して使用してもよい。

本明細書に記載されるマーカー及び方法ならびに当該技術分野で公知のマーカー及び方
法を用いることによって、上記の方法及びその組成物によって作製された細胞組成物を評
価し得る。

本明細書に記載される方法及び当該技術分野で公知の方法を用いることによって、上記
の方法及びその組成物によって作製された細胞組成物を富化、単離または精製し得る。

本開示の細胞集団の使用
スクリーニングのための細胞集団
本開示の細胞を用いて、ＭＧＥ前駆細胞及び／またはそれから生成する介在ニューロン
などの細胞の特徴に影響を及ぼす薬剤（小分子、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）また
は環境条件（培養条件または操作など）をスクリーニングすることができる。

１つの例では、ＭＧＥ前駆細胞を用いて、介在ニューロンへの成熟を促進する因子また
は長期培養でＭＧＥ前駆細胞増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば
、候補となる分化因子または増殖因子を異なるウェルの細胞に加え、次いで生じた表現型
の変化を、細胞をさらに培養するか使用するのに望ましい基準に従って判定することによ
り、これらの因子を試験する。これにより、ＭＧＥ前駆細胞及び／またはそれから生成す
る細胞を生成及び／または維持するための誘導及び培養方法の改善をもたらすことができ
る。

本開示の他のスクリーニング方法は、医薬化合物がＭＧＥ前駆細胞及び／またはそれか
ら生成する細胞に有害作用を及ぼす可能性を試験することに関する。このタイプのスクリ
ーニングは、化合物がＭＧＥ前駆細胞自体に何らかの薬理効果を及ぼすよう設計されてい
る場合のみならず、別の部位に主要な薬理効果を発揮するよう設計された化合物によるＭ
ＧＥ前駆細胞に関連した副作用を試験するのにも適切なものである。

その他のスクリーニング方法は、ＭＧＥ前駆細胞を用いて、ＭＧＥ前駆細胞に影響を及
ぼす可能性のある小分子薬物の効果を測定することに関する。この目的に向けては、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで細胞と被験化合物とを一緒にし、その化合物のＭＧＥ前駆細胞に対する効
果を判定する。

薬剤スクリーニングの一般的原理については、米国特許第５，０３０，０１５号及びテ
キスト「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）に記載されている。候補
医薬化合物の活性の評価では一般に、本発明の分化した細胞と、単独または他の薬物と組
み合わせた候補化合物とを一緒にする。研究者は、（未処置細胞または陰性対照化合物で
処置した細胞と比較して）細胞の形態、マーカーまたは機能活性に化合物に帰せられる何
らかの変化を判定した後、化合物の効果と観察された変化との相関を明らかにする。

臨床治療でのＭＧＥ前駆細胞
ＭＧＥ前駆細胞を含む細胞集団、例えばＭＧＥ前駆細胞が富化された細胞集団などのほ
か、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＭＧＥ前駆細胞を多数の臨床応用
に使用し得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて作製されたＭＧＥ前駆細
胞を、ＭＧＥ前駆細胞での治療を必要とする対象の治療に使用し得る。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞での治療を必要とする対象は、抑制性介在ニュー
ロンの活性低下を特徴とする神経障害を有するか、その発症リスクのある患者であり得る
。ある特定の場合には、患者は抑制性ニューロンの機能低下及び／または興奮性ニューロ
ンの機能亢進を有し得る。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞がＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンなどの介
在ニューロンに分化するのに適した分化条件をもたらす対象の標的部位にＭＧＥ前駆細胞
を移植し得る。細胞を組織に送達するための当該技術分野の多数の標準的な方法のいずれ
かによって、例えば、細胞を適切な溶液または固体もしくは半固体担体などの担体中の懸
濁物として注入することによって、細胞を移植し得る。適切な溶液としては、生理食塩水
、ＰＢＳ、Ｌ１５、ＤＭＥＭ、イスコフ培地などが挙げられる。適切な固体担体としては
、ビーズ、メッシュフィルターなどのフィルター、膜などが挙げられる。

ある特定の場合には、ＭＧＥ前駆細胞を対象の神経系に投与し得る。ある特定の場合に
は、ＭＧＥ前駆細胞を対象の神経系の１つまたは複数の部位に移植することによって投与
を実施し得る。

ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞を対象の神経系の１つまたは複数の部位、例
えば中枢神経系、例えば脳、例えば、小脳、大脳皮質、海馬、線条体（例えば、大脳基底
核）、視床、視床下部，視床下核など；及び脊髄などに投与し得る。

ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞の投与によって抑制性ニューロンの機能が回
復する。ある特定の場合には、投与は、ＭＧＥ前駆細胞を対象の脳の第一の部分に投与し
、脳の第一の部分から離れた第二の部分の抑制性ニューロンの機能を回復させることを含
み得る。

ある特定の実施形態では、ＭＧＥ前駆細胞を神経障害、例えば発作性障害、例えば、癲癇、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＬＳ、統合失調症、アルツハイマー病、自閉症、ジスキネジア、慢性疼痛、痙攣、神経因性疼痛、多発性硬化症、外傷性脳損傷、髄鞘形成不全疾患、双極性障害、うつ病及び癌などを有するか、その発症リスクのある対象に投与し得る。
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞からの内側神経節隆起（ＭＧＥ）前駆細胞の作製方法であって、
ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と神経誘導サプリメントとを含む無血清培地で前記ｐＰＳ細胞を培養して前記ＭＧＥ前駆細胞を生成すること
を含む、方法。
［２］
前記ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と前記神経誘導サプリメントとを含む前記無血清培地で前記ｐＰＳ細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を生成することを含み、前記ＥＢが前記ＭＧＥ前駆細胞を含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記神経誘導サプリメントがＢ２７を含む、［１］〜［２］のいずれかに記載の方法。
［４］
前記神経誘導サプリメントがＮＳ２１を含む、［１］〜［２］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記ｐＰＳ細胞がヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記ｈＰＳ細胞がヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である、［５］に記載の方法。
［７］
前記ｈＰＳ細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［５］に記載の方法。
［８］
前記ｐＰＳ細胞を接着培養で培養する、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
前記ｐＰＳ細胞を浮遊培養で培養する、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
前記ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と前記神経誘導サプリメントとを含む前記無血清培地で前記ｐＰＳ細胞を培養する前に、前記ｐＰＳ細胞の分化を誘導する、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
前記ソニックヘッジホッグ経路活性化因子と前記神経誘導サプリメントとを含む前記無血清培地で前記ｐＰＳ細胞を培養する前に、フィーダー層の非存在下で培養することによって前記ｐＰＳ細胞の分化を誘導する、［１０］に記載の方法。
［１２］
前記ＥＢを単離することと、
前記単離したＥＢを接着基質に播種して接着ＥＢを得ることと、
前記接着ＥＢを培養することと
を含む、
［２］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
前記ＥＢを単離することと、
前記ＥＢを機械的または酵素的に分離して単一細胞または細胞塊にすることと、
前記分離した細胞を接着基質に播種して接着単層を得ることと、
前記接着単層を培養することと
を含む、
［２］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４］
前記ＥＢを単離することと、
前記ＥＢを機械的または酵素的に分離して単一細胞または細胞塊にすることと、
前記分離した細胞をフィーダー細胞層上に播種して接着共培養物を得ることと、
前記接着共培養物を培養することと
を含む、
［２］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１５］
前記ＥＢ、接着ＥＢ、単層または共培養物を単離することと、
前記ＥＢ、接着ＥＢ、単層または共培養物を機械的または酵素的に分離して単一細胞にすることと、
単一細胞を、ＭＧＥ前駆細胞の細胞表面マーカーに対する抗体とインキュベートすることと、
前記前駆細胞を単離することと
を含む、
［２］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］
前記ＥＢ、接着ＥＢ、単層、共培養物、分離した培養物または分取した細胞を単離することと、
凍結保護物質を添加することと
を含む、［２］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］
前記ＥＢ、接着ＥＢ、単層、共培養物、分離した培養物または分取した細胞を単離することと、
霊長類神経系に細胞懸濁物を移植することと
を含む、［２］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。

以下の実施例は、本発明を作製し使用する方法を当業者に十全に開示し説明するために
記載されるものであり、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意
図するものでもなければ、以下の実験が実施されるすべての実験または唯一の実験である
のを示すことを意図するものでもない。用いる数値（例えば、量、温度など）に関しては
正確を期するよう努めたが、実験による誤差及び偏差がある程度みられることを明らかに
しておかなければならない。特に明示されない限り、一部とは重量部のことであり、分子
量とは平均重量分子量のことであり、温度はセ氏温度で表され、圧力は大気圧またはその
付近の圧力である。標準的な略号、例えば、ｂｐ、塩基対（１つまたは複数）；ｋｂ、キ
ロベース（１つまたは複数）；ｐｌ、ピコリットル（１つまたは複数）；ｓまたはｓｅｃ
、秒（１つまたは複数）；ｍｉｎ、分（１つまたは複数）；ｈまたはｈｒ、時間（１つま
たは複数）；ａａ、アミノ酸（１つまたは複数）；ｋｂ、キロベース（１つまたは複数）
；ｂｐ、塩基対（１つまたは複数）；ｎｔ、ヌクレオチド（１つまたは複数）；ｉ．ｍ．
、筋肉内の（筋肉内に）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（腹腔内に）；ｓ．ｃ．、皮下の（皮下に
）；などが使用され得る。

本発明はその特定の実施形態を参照しながら説明されているが、当業者は、本発明の真
の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更を施し得ること、また均等物に置き換え
得ることを理解するべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、工程、１つま
たは複数の工程段階に適合させるため、本発明の目的、趣旨及び範囲に修正を施し得る。
このような修正はいずれも、本明細書に添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが
意図される。

材料及び方法：
細胞培養及びＦＡＣＳによる分取
ＨＥＳ−３ ｈＥＳＣを、ノックアウト血清代替物２０％、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ
）１％、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−グルタミン１％、２−メルカプトエタノール０．０００８
％及びＦＧＦ−ベーシック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｎｇ／ｍＬを添加したノックア
ウトＤＭＥＭ中、放射線照射したマウス胚線維芽細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で維持した
。ｈＥＳＣコロニーを優先的に選択するコラゲナーゼＩＶ／ディスパーゼ（それぞれ１ｍ
ｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分化を開始させた。コロニーをトリプシン処
理して単一の細胞とし、記載されている通りに（Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ．ら（２００８）．Ｃ
ｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３，５１９−５３２）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、Ｂ２
７−ビタミンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２％及びＦＧＦを含まないこと以外は同じサプ
リメントをｈＥＳＣ培地に加えたものからなる最適化Ｂ２７＋５Ｆ分化培地＃１を入れた
低付着性の丸底９６ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇまたはＮＯＦ）に、１ウェル当たり
１つのｓＥＢを形成するよう１ウェル当たり約１０，０００個の細胞を播種した。ほかに
も、Ｙ２７６３２（１０μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、プルモルファミン（１
〜２μＭ）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍＬ）及びＤＫＫ
１（１μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。

第７日、Ｙ２７６３２を除去し、培地＃１を入れたマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）コートプレートにｓＥＢをまとめて接着播種した。第１４日、培地からプルモ
ルファミン以外の因子を除去した。第２５日、ａＥＢをトリプシン処理し、分離単層とし
てマトリゲルまたはポリオルニチン／ラミニンコートプレートに再播種した。第２７日〜
第３０日にＤＡＰＴ（１０μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ）を添加した。第３５日、ＦＡＣＳ分取
の後、培地＃１の皮質グリア細胞上にＧＦＰ＋細胞を再播種することができた（１０〜２
５，０００細胞／ｃｍ２）。グリア細胞は新生仔マウス大脳皮質から調製し、血清を加え
て少なくとも３回継代してマウスニューロンを取り除き、コンフルエントの状態でＡｒａ
−Ｃ（５μＭ）（Ｓｉｇｍａ）で前処置したものである。３〜４日毎に、培地の半分を培
地＃２：培地＃１にＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、Ｂ２７＋ビタミンＡ２％（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）ならびにＮＥＡＡ及びプルモルファミンを除去した以外同じサプリメントを加
え因子を含まないものと交換し、ＢＤＮＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を添加した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ）。培地を３〜４日毎に交換した。

ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳによる解析及
び分取を実施した。細胞に生細胞のＤＡＰＩ排除、小さい散乱サイズ、単一細胞、ＮＫＸ
２．１−ＧＦＰシグナル及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ−ＡＰＣまたは−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）シグナル強度のゲートをかけた。ＧＦＰ陰性細胞及びアイソタイプ抗
体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の対照を用いた。Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）ソフト
ウェアでデータを分析した。生細胞の撮像では、分化は上記のものとほぼ同じであったが
、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ−８００プレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）に１ウェル当たり５，０００個の細胞を播種し、第４〜７日にｓＥＢをまとめて播種
した。温度（３７℃）及びガス（５％Ｏ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２）制御付きのタイム
ラプス共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ５）により撮像を実施した。

妊娠第二期のヒト胎児大脳皮質またはＭＧＥ組織を切り出し、パパイン（Ｗｏｒｔｈｉ
ｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で単一細胞に分離し、分化培２を入れたマトリゲ
ルコートプレートに播種し（約１００，０００細胞／ｃｍ^２）、コンフルエントの状態で
Ａｒａ−Ｃで処理した。１週間培養したＭＧＥ細胞または第３５日に分取したｈＥＳＣを
大脳皮質培養物に再播種した（約１０〜２０，０００細胞／ｃｍ^２）。

ｈＥＳＣ及びヒト胎児組織で実施した実験はいずれも、承認されたＵＣＳＦ幹細胞研究
監視委員会（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ ｃｏｍｍｉ
ｔｔｅｅ）及びヒト研究委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ）のプロトコルを順守したものである。

移植及び移植片増殖
分取した細胞ペレットから余分な培地を除去して、１０００細胞／ｎｌの濃縮細胞懸濁
物を作製した。定位油圧インジェクターに載せた勾配付きのガラスマイクロピペット（Ｗ
ｉｒｅｔｒｏｌ ５μｌ、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）
に細胞を充填した。Ｐ２ ＣＢ．１７−ＳＣＩＤの仔イヌ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ
）を低体温法により麻酔し、インジェクター台の頭型に位置に合わせて置いた。正中線（
矢状洞）から０．９ｍｍ、人字縫合から２．６ｍｍの座標を用いて、右大脳皮質に１つの
注入部位当たり１０〜１００，０００個の細胞を経頭蓋送達した。注入の深さを皮膚表面
から０．４５ｍｍとした。移植実験はいずれも、ＵＣＳＦ動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）
のプロトコルを順守したものである。

最初に第３５日の単層培養物を、ＰＳＡＮＣＡＭによる選別をせずにＮＫＸ２．１−Ｇ
ＦＰ＋に関して分取し、新生仔ＳＣＩＤマウス大脳皮質に注入した。しかし、４か月以内
に、注入したマウス脳（１２匹中１２匹のマウス）の注入部位及び／または注入路付近の
軟膜表面に腫瘍様の過剰増殖が認められた（データ不掲載）。これらは多能性細胞に由来
する奇形腫ではなく、ＯＣＴ４＋細胞も極性化した神経上皮のロゼットもみられなかった
。増殖物には主としてＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋神経細胞が含まれていた。腫瘍は注入後（
ＭＰＩ）４か月以上生存し続けるヒト特異的核抗原（ＨＮＡ）陽性細胞及びＫＩ６７＋ヒ
ト細胞の核として定義した。最初、第３５日の培養物にはＫＩ６７、ＧＦＡＰまたはＯＬ
ＩＧ２を発現する神経前駆細胞はほとんど含まれていないように思われたため（図３Ｅ）
、腫瘍の発生は驚きであった。しかし、延長した共培養物にはｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍形成
と一致する病巣増殖（播種細胞２５００個当たり約１個の病巣、ｎ＝３）が時折検出され
た。したがって、本発明者らは、このような増殖を阻害するべくプロトコルの最適化を実
施した。低密度の単層培養にしたところ、ニューロン分化が促進され、腫瘍発生率が５０
％（１２匹中６匹のマウス）に低下した。注入前にＮｏｔｃｈシグナル伝達のγセクレタ
ーゼ阻害剤、ＤＡＰＴを短期間添加してニューロン分化を誘導することによって、腫瘍発
生率がさらに３３％（９匹中３匹のマウス）に低下した。共培養または移植の前に第３５
日の培養物をＤＡＰＴで前処置し、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋
細胞両方についてＦＡＣＳ分取を実施したところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの病巣増殖（ｎ＝３
）及びｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍発生がみられなくなった（６匹中０匹のマウス）のに対して
、ＧＦＰ＋細胞及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ陰性細胞は病巣及び腫瘍を形成し続けた（４匹中３
匹のマウス）。注入した個体に関するまとめを記載する（図１６）。

免疫染色
培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０〜２０分間固定した。経心灌流後、マウス
の脳を−４℃で一晩固定し、ビブラトームまたは滑走式ミクロトームによって薄切した（
５０μｍ）。ＥＢ及びヒト組織はクリオスタットによって薄切した（２５μｍ）。細胞及
び切片を次のように染色した：煮沸した０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）で５〜１
０分間の抗原回復、ＰＢＳ中５％の血清及び０．１％のｔｒｉｔｏｎＸ１００で１時間の
ブロッキング、一次抗体をブロッキング緩衝液（ただし、ＧＡＢＡ抗体にはｔｒｉｔｏｎ
を含まない緩衝液を使用した）で希釈し−４℃で一晩、ＰＢＳ＋ｔｒｉｔｏｎＸ１００で
３回洗浄、二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２時間、ＰＢＳ＋ｔｒｉｔｏｎＸ１００
で４回洗浄。一次抗体を表２に記載する。

転写産物発現
ＲＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞ペレットからＲＮＡを調製した。Ｓ
ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ−ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）にＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用いて定量的ＲＴ
ＰＣＲを実施した。逆転写酵素陰性対照を用いた。ゲル電気泳動及び融解曲線分析により
アンプリコン特異性を判定した。プライマー配列を表３に記載する。

マイクロアレイ解析には、ＲＮＡをＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｇｅｎ
ｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに委託しＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ−
１２ ｖ４．０発現ビーズチップとのハイブリダイゼーションを実施した。ｈＥＳＣ＝試
料１つ及び技術的反復３つ。第２０日＝独立した試料３つ。第３５日＝試料１つ及び技術
的反復２つ。第５５日＝試料１つ及び技術的反復１つ。ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌ
ｌｕｍｉｎａ）ソフトウェアでデータを分析した。対照のヒト脳参照ＲＮＡ及び／または
ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓに保管されている試料とのハイブリダイゼーションを確認する
ことによって、シグナルを含まないプローブの妥当性を確認した。

電気生理学的及び光学的方法
ホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｂ−１２０−６９−１５、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ）で抵抗が５〜７ＭΩの範囲のパッチ電極を作製した。ピペットの先端に１
２５ｍＭ Ｋ−グルコン酸、１５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、４ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ、０．３ｍＭ Ｎａ_３ＧＴＰ、１０ｍＭトリス−クレアチン
リン酸、０．２ｍＭ ＥＧＴＡを含有する内液を充填した。

培養ニューロンでは、バスに常時、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ
ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８ｍＭグルコースを含有する
新鮮な記録用培養液を潅流させた。組織チョッパー（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１２００Ｓ）で横
断スライス（３００μｍ）を作成し、インキュベーションチャンバで１１０ｍＭコリンＣ
ｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．３ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭグルコースを含有するａＣＳＦ中で
維持した。スライス記録用培養液は、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ Ｎ
ａＨＣＯ３、１０ｍＭグルコースを含有するものであった。Ａｘｏｎ ７００Ｂパッチク
ランプ増幅器及び１３２０Ａインターフェース（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を
用いて記録した。増幅回路を用いてシグナルに２ｋＨｚのフィルターをかけ、１０ｋＨｚ
でサンプリングし、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．２（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を
用いて分析した。

ＧＦＰ励起帯域通過フィルターを備えた水銀ランプ（７５ｍＷ）により光刺激を与え、
Ｍａｓｔｅ−８（Ａ．Ｍ．Ｐ．Ｉ．）により高速シャッター（ＵＮＩＢＬＩＴＺ）を介し
て光パルスを発生させ、青色光の出力密度（Ｂｏｙｄｅｎ，Ｅ．Ｓ．ら（２００５）．Ｎ
ａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８，１２６３−１２６８）（Ｎａｇｅｌ，Ｇ．ら（２００３）
．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００，１３９４０−１３９４５）
は電力計（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）による測定で８〜１２ｍＷ／ｍ
ｍ２であった。

統計分析
データを平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。図３Ｅのデータは同時発現／ＧＦＰ＋細胞の平均％
で表されている。図４Ｃ〜４Ｈのデータは平均ビーズシグナル強度で表されている。図５
ＣのデータはＵｂＣ−ＲＦＰ＋、ＣｈＲ２−ＹＦＰ＋またはＴＵＪ＋ニューロンの平均％
で表されている。図７Ｄ〜７ＥのデータはＨＮＡ＋またはＵｂＣ−ＲＦＰ＋ヒト細胞の平
均％で表されている。統計学的比較では、電気生理学的データに一元配置ＡＮＯＶＡ及び
事後ボンフェローニ検定を用い、免疫染色データに両側２試料不等分散スチューデントｔ
検定を用いた。Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）ソフトウェアにＭＡＴＬＡＢプラグイ
ンを用いて細胞数を計算した。各実験及びマーカーの標本数及び細胞数のまとめを表４に
記載する。

Ｂ２７＋５Ｆ法の開発
本発明者らは、３つの公開されているプロトコル（方法＃１、＃２及び＃３）を、ｈＥ
ＳＣからＮＫＸ２．１＋ＭＧＥ前駆細胞を誘導する能力について比較した。第一の方法（
＃１）ではｈＥＳＣ由来のＮＫＸ２．１＋及びＦＯＸＧ１＋ＭＧＥ前駆細胞が約１３％の
効率で報告されている（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ら（２００７）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ ２５，６８１−６８６）。この３５日間のプロトコルでは、無血清（ノックア
ウト血清代替物（ＫＳＲ）−初期／Ｂ２７−後期）添加培地ならびにＢＭＰ（ＢＭＰＲＩ
Ａ−Ｆｃを介する）及びアクチビン／ｎｏｄａｌ（ＳＢ４３１５４２を介する）シグナル
伝達経路の二重ＳＭＡＤ阻害を用いて神経外胚葉様分化を方向付けるとともに、ＷＮＴ経
路阻害（ＤＫＫ１を介する）を用いて胚様体（ＥＢ）の前部前脳様のアイデンティティが
特定された。第２４日〜３５日、阻害剤を除去し、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を添
加して腹側前部前脳様細胞を特定された。第二の方法（＃２）では無血清（ＫＳＲ／Ｎ２
）添加培地で２８日後のＮＫＸ２．１＋及びＦＯＸＧ１＋ＭＧＥ前駆細胞が約８４％の効
率で報告されている（Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．ら（２００９）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６
，４０５５−４０６３）。二重ＳＭＡＤ阻害は用いていないが、分化の初期（第１０日〜
第２８日）に、同時にＷＮＴを阻害する、またはＷＮＴを阻害しないＳＨＨ処置を開始し
ている。これらのプロトコルではＦＯＸＧ１＋及びＮＫＸ２．１＋細胞が生成することが
報告されているが、腹側終脳ＭＧＥ様対ＰＯＡ／中隔様のアイデンティティは検討されて
いない。

本発明者らが実施したところ、方法＃１（図８Ｂ）、方法＃２（不掲載）及び最適化し
た方法＃１（図９Ａ）ではＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋ＭＧＥ前駆体様細胞を生成することが
できなかった。プルモルファミンの代わりにＳＨＨを用いた場合も同じであった。しかし
、本発明者らは、ハイブリッド法を用いると、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋ＭＧＥ前駆体様細
胞が蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）による定量化で１２％の効率で生成することが可
能であることを発見した（図８Ｃ）。この２５日間のハイブリッド法では、無血清（ＫＳ
Ｒ／Ｂ２７）添加培地中、プロトコル全体を通じて二重ＳＭＡＤ（ＳＢ４３１５４２及び
ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃを介する）阻害及びＷＮＴ（ＤＫＫ１を介する）阻害を実施し、第１
０日〜第２５日にＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストのプルモルファミンによる同時処置を
実施した。Ｂ２７／Ｂ２７添加培地でもほぼ同じ効率が達成された（不掲載）。本発明者
らは、ＧＦＰ＋細胞誘導が方法＃１の後期（第２４日）のＳＨＨとは対照的な初期（第１
０日）のＳＨＨ経路活性化に起因すると考え、プルモルファミンをさらに早い時期（第０
日〜第２５日）に添加すればＮＫＸ２．１＋ＭＧＥ前駆細胞の百分率が増大するのではな
いかという仮説を立てた。しかし、このような修正によりＫＳＲ／Ｂ２７培地での効率が
低下した（１．９％）（図８Ｄ）。

しかし、２５日間のプロトコル全体を通じてＫＳＲをＢ２７に置き換えて培地に添加す
るとともに、初期に５つの因子［Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Ｙ
２７６３２）、二重ＳＭＡＤ阻害剤（ＳＢ４３１５４２及びＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ）、ＷＮ
Ｔ阻害剤（ＤＫＫ１）及びＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（プルモルファミン）］を添
加したところ、驚くべきことにほとんどの細胞（７０．２％）がＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋
ＭＧＥ前駆細胞になった（図８Ｅ）。さらに、分化の２週間後に阻害剤を除去し、プロト
コルを第３５日まで延長したところ、ＦＡＣＳ解析で最大９０．８％のＮＫＸ２．１−Ｇ
ＦＰ＋への分化効率が達成された（図８Ｆ）。このようにして、ＳＨＨ経路の初期活性化
と、Ｂ２７培地、すなわちＫＳＲを含まない培地とを組み合わせること（Ｂ２７＋５Ｆ法
）により、効率的にｈＥＳＣからの腹側前脳様分化が方向付けられた。

この研究の期間中、３つ目の方法（方法＃３）によりＦＧＦ２及びレチノイン酸の存在
下でＨＥＳ−３ ＮＫＸ２．１ＧＦＰ／ｗ ｈＥＳＣからの視床下部前脳様分化が１２〜
１４％の効率で方向付けられたことが報告されている（Ｇｏｕｌｂｕｒｎ，Ａ．Ｌ．ら（
２０１１）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９，４６２−４７３）。ＳＨＨは使用していない
が、培地が培養物中でＳＨＨ及びＷＮＴ阻害剤の発現を誘導したと思われ、また尾方化因
子として作用し得るレチノイン酸を使用したにもかかわらず腹側前部の神経運命を促進し
た。５０日後、一部の細胞がＦＯＸＧ１を発現したが、その細胞の効率及び運命は明らか
にされなかった。本発明者らが実施したところ、方法＃３によりＮｋｘ２．１−ＧＦＰ＋
細胞が約７％の効率で生成した。視床下部様のアイデンティティと同じように、方法＃３
では、第２４日のＮＫＸ２．１＋発現細胞の生成がＢ２７＋５Ｆ法より少なく、ＮＫＸ２
．２＋細胞の生成がＢ２７＋５Ｆ法より多かった（データ不掲載）。

ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の誘導にはＳＨＨ経路活性化が必要であった。この研究で
は、本発明者らは１〜２μＭのプルモルファミンまたは５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨを使用
した。２〜６μＭのプルモルファミンでもＥＢ培養物のＧＦＰ＋分化効率がわずかに上昇
したが、このような高濃度では後期段階の単層培養物の生存率が低下した（不掲載）。本
発明者らはほかにも、ＷＮＴ阻害が、これまでに示唆されているようにｈＥＳＣ−終脳様
アイデンティティに不必要であるかどうかを検討した（Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．ら（２００９）．
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６，４０５５−４０６３）。ＤＫＫ１ ＷＮＴ阻害剤が存
在しない場合、ＧＦＰ＋細胞分化効率は同程度であったが、終脳ＦＯＸＧ１を発現する細
胞の数が７０％から４５％に減少した（不掲載）。ＷＮＴに加えて、ＦＧＦが神経発生段
階で吻側尾側のパターンを決定する重要な因子として作用し（Ｂｏｒｅｌｌｏ，Ｕ．ら（
２００８）．Ｎｅｕｒａｌ Ｄｅｖ ３，１７）（Ｍａｓｏｎ，Ｉ．（２００７）．Ｎａ
ｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８，５８３−５９６）（Ｙｅ，Ｗ．ら（１９９８）．Ｃ
ｅｌｌ ９３，７５５−７６６）、またＦＧＦ８がマウスＥＳＣからＭＧＥ終脳様への発
生に関与することがわかっている（Ｄａｎｊｏ，Ｔ．ら（２０１１）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ ３１，１９１９−１９３３）。本発明者らはわれわれの培養物にＦＧＦ８は添加し
なかったが、ＦＧＦ８転写産物の発現を検出し、ＳＨＨ下流でのその役割との一致が確認
された（Ｇｕｔｉｎ，Ｇ．ら（２００６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３３，２９３７
−２９４６）（Ｏｈｋｕｂｏ，Ｙ．ら（２００２）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１１
，１−１７）。分化開始時から（第０日〜２５）ＦＧＦ阻害剤（ＰＤ１７３０７４）を添
加するとＦＯＸＧ１発現細胞が減少したが（５５％）、同阻害剤を第１４日に添加（第１
４日〜２５）するとＦＯＸＧ１レベルに何ら影響はみられなかった（不掲載）。したがっ
て、胎児前脳発生の場合と同じように、初期のＳＨＨ活性化とともにＷＮＴ阻害及びＦＧ
Ｆシグナル伝達経路活性化が、ｈＥＳＣ由来培養物の腹側終脳様アイデンティティのパタ
ーン形成に重要な役割を果たしている。

費用対効果の高い細胞作製方法があれば、長期間にわたるプロトコル及び高価な組換え
タンパク質ベースの試薬よりも好ましいものとなり、細胞を凍結保存できれば、今後の作
業が容易になる。本発明者らはここでは、３種類の小分子（Ｙ２７６３２、ＳＢ４３１５
４２及びプルモルファミン）と２種類の組換えタンパク質（ＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ及びＤＫ
Ｋ１）を使用した。現時点で、ＢＭＰ経路及びＷＮＴ経路の阻害には数種類の小分子代替
物質が存在する。本発明者らは、ドルソモルフィン（ＢＭＰ経路阻害剤）及びＣＫＩ−７
（ＷＮＴ経路阻害剤）がＢ２７＋５Ｆ法のタンパク質の代わりになり得ることを発見した
（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．ら（２０１０）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ６，２７０−２８１
０）（Ｏｓａｋａｄａ，Ｆ．ら（２００９）．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２２，３１６９
−３１７９）。細胞生存率が約５０％低下したが、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋効率は同程度
であった（不掲載）。さらに、ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞の約２５％が凍結保存及び解凍
後も生存し、解凍した細胞は、電気生理学的方法によって確認される機能的特性を有する
ニューロンに成熟した。

臨床使用には、ＧＭＰグレードのｈＰＳＣ系が必要とされ得る。したがって、本発明者
らは、ｃＧＭＰに適合するｈＥＳＣ系（ＥＳＩ１７、ＥＳＩ３５、ＥＳＩ５１及びＥＳＩ
５３（Ｂｉｏｔｉｍｅ））がＮＫＸ２．１＋ＭＧＥ様細胞を生成する能力を検討した。い
ずれの細胞系もＢ２７＋５Ｆ法を用いたときのＮＫＸ２．１＋分化効率がＨＥＳ−３と同
程度であった（実施例８を参照されたい）。この臨床グレードの細胞系にはＮＫＸ２．１
ノックインレポーターがないため、許容可能な純度閾値を決定するのになおも作業を必要
とし得る。特に残りの不純物が非ＭＧＥ型ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンである場合、ｈ
ＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１＋細胞の純度が７５％あれば十分であると考えられる。この可能
性を示唆するように、本発明者らは、ＨＥＳ３ ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ陰性ニューロンの
ほとんどＧＡＢＡを発現し、一部がＴＨを発現するが、ＴＢＲ１またはＣＨＡＴ興奮性ニ
ューロンマーカーは全く発現しないことを観察した。さらに精製されたＮＫＸ２．１＋Ｍ
ＧＥ様細胞の組成物を得るためには、ＭＧＥ細胞もしくは介在ニューロンを選択するため
のＭＧＥ特異的細胞マーカーに対する抗体、導入遺伝子（選択マーカー、蛍光、抗生物質
耐性、遺伝子過剰発現／阻害）を送達するＤＮＡプラスミド、ＲＮＡもしくはウイルス（
Ｐｏｔｔｅｒ，Ｇ．Ｂ．ら（２００９）．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ４０，
１６７−１８６）、ＦＡＣＳ／磁気ＭＡＣＳに基づく精製または有糸分裂阻害化合物（Ａ
ｒａＣまたはＭｉｔｏＣなど）を使用し得る。

レンチウイルスの調製
デルタ８．９及びＶＳＶＧプラスミドを用いて、自己不活性化レンチウイルスプラスミ
ド、ＦＵＧＷ−ＵｂＣ−ＲＦＰ（ＲＦＰ二量体２）またはｐレンチ−シナプシン−ｈＣｈ
Ｒ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥ（Ｋａｒｌ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ氏の好意に
よる寄贈）を２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に共形質導入した。レンチウイルス粒子の上清を
収集し、超遠心分離によって濃縮し、一晩、８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）とともに用いて細胞に形質導入した。

実施例１：ｈＥＳＣ由来終脳ＭＧＥ様アイデンティティ
ｈＰＳＣ由来ＮＫＸ２．１＋ＭＧＥ前駆細胞の同定を容易にするため、ＮＫＸ２．１の
第二のエキソンに挿入されたＧＦＰノックイン構築物を有するＨＥＳ−３ ｈＥＳＣ系（
ＨＥＳ−３ ＮＫＸ２．１^{ＧＦＰ／ｗ}）を用いた（Ｇｏｕｌｂｕｒｎ，Ａ．Ｌ．ら（２０
１１）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９，４６２−４７３）。ＮＫＸ２．１発現は、発生中
の終脳ＭＧＥ、視索前野（ＰＯＡ）、中隔及び間脳視床下部を含めた神経系において腹側
前脳に特異的なアイデンティティを示すものである。本発明者らは、二重ＳＭＡＤ（ＳＢ
４３１５４２及びＢＭＰＲＩＡ−Ｆｃ）とＷＮＴ阻害（ＤＫＫ１）とを組み合わせて、初
期のＳＨＨ経路活性化（プルモルファミン）及びＢ−２７添加により、効率が高く再現可
能なｈＥＳＣからの腹側前脳様分化が可能になることを発見した。分化後第２０日〜第３
０日の平均ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋効率は７４．９±２．１％であった（ｎ＝２５の独立
した分化実験）。本発明者らはこのほか、ほかのｈＰＳＣ系、研究グレードのｃＧＭＰに
適合するＥＳＩ−１７、３５、５１及び５３（Ｂｉｏｔｉｍｅ）、Ｈ９（ＷｉＣｅｌｌ）
、ｈＥＳＣ系ならびにヒト成人メラノサイト由来ｈｉＰＳＣ系が同程度の効率でＮＫＸ２
．１＋ＭＧＥ前駆細胞に分化することを発見した。最適化したＢ２７＋５因子（Ｂ２７＋
５Ｆ）法については図１Ａ、図８に概要を示す。ＭＧＥ前駆細胞はＭＧＥ様前駆体とも呼
ばれる。

ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の局所的アイデンティティを明らかにするため、本発明者
らは、５０日間にわたる経時的な浮遊胚様体（ｓＥＢ）分化及び前脳発生マーカーの免疫
染色分析を実施した（図１Ｂ及び９）。分化第１０日までに時間経過全体を通じてＮＫＸ
２．１タンパク質と共局在し発現する旺盛なＮＫＸ２．１−ＧＦＰ発現が検出された。こ
れに対して、背側終脳神経前駆細胞のマーカー、ＰＡＸ６は検出されなかった。終脳マー
カー、ＦＯＸＧ１は第２０日までにほとんどの細胞にみられ、高い発現が維持された。こ
の傾向とは逆に、視床下部及びさらに腹尾側の領域のマーカー、ＮＫＸ２．２の発現は主
として第１０日から第２０日の間に限られた。ほかの腹側終脳前駆体マーカー、ＯＬＩＧ
２及びＡＳＣＬ１（ＭＡＳＨ１）が第２０日〜第３０日までに誘導された（図９）。ＩＳ
ＬＥＴ１は外側ＧＥ（ＬＧＥ）及びＰＯＡに強く発現し、ＭＧＥ内に散在する細胞に発現
するが、これは後期（第３０日〜第４０日）の時点で誘導された。細胞は第３０日までに
、移動ニューロンマーカーのダブルコルチン（ＤＣＸ）及び神経伝達物質のＧＡＢＡを発
現した。時間経過中、視床下部マーカーのＲＡＸもコリン作動性ニューロンマーカーのＣ
ＨＡＴも検出されなかった。したがって、ｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞は終
脳ＭＧＥ様前駆体及びＧＡＢＡ作動性ニューロン系列であると考えられた。ｓＥＢ培養中
のマーカー発現のまとめを記載する（図１５）。

図１．ｈＥＳＣ由来終脳ＭＧＥ様介在ニューロン前駆細胞（ＭＧＥ前駆細胞とも呼ばれ
る）。（Ａ）ＭＧＥ前駆細胞及びこれに由来するＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを生成す
るために用いたＢ２７＋５Ｆ法ならびに対応する図の概要。略号：ｓＥＢ＝浮遊胚様体；
ａＥＢ＝接着胚様体；ＭＬ＝単層；ＦＡＣＳ＝蛍光標示式細胞分取法；Ｙ２７６３２＝Ｒ
ｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤；ＳＢ４３１５４２＝ＴＧＦβ１アクチビン受容体
様キナーゼ阻害剤；ＢＭＰＲＩＡ＝骨形成タンパク質受容体１ａ Ｆｃキメラ；ＤＫＫ１
＝Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１；ＰＭ＝プルモルファミン；ＢＤＮＦ＝脳由来神経栄養因
子；ＤＡＰＴ＝γ−セクレターゼ阻害剤。このほか、図８を参照されたい。（Ｂ）ｓＥＢ
の切片及びＮＫＸ２．１−ＧＦＰ、ＰＡＸ６、ＦＯＸＧ１及びＮＫＸ２．２の発現を示す
代表的な免疫蛍光分析。青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：１００μｍ。このほか、図９及
び図１５を参照されたい。

図８．図１に関連して既に公開されているプロトコルの修正及びＢ２７培地添加と組み
合わせた初期のＳＨＨ経路活性化によるＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の誘導を示す、分化
ｈＥＳＣのＦＡＣＳ解析。（Ａ）方法＃１ａ：ＫＳＲ−Ｎ２−Ｂ２７添加培地と後期（第
２５日）ＰＭ。（Ｂ）方法＃１ｂ：ＫＳＲ−Ｂ２７培地と後期（第２５日）ＰＭ処置。（
Ｃ）方法＃１／２ハイブリッド：ＫＳＲ−Ｂ２７培地と中期（第１０日）ＰＭ処置。（Ｄ
）初期（第０日）にＰＭ処置を実施した以外は（Ｃ）と同じ方法。（Ｅ）Ｂ２７−Ｂ２７
培地を用いて７０％のＧＦＰ＋効率を導いた以外は（Ｄ）と同じ方法。（Ｆ）第１４日に
阻害剤を除去し、第３５日までＰＭ処置を実施して、最大９０％のＧＦＰ＋効率を導いた
以外は（Ｅ）：Ｂ２７−Ｂ２７培地と初期（第０日）ＰＭ添加と同じ方法。薄く着色した
ヒストグラム＝分化した培養物。着色していないヒストグラム＝未分化の対照培養物。

図９．図１及び図１５に関連したｈＥＳＣ由来終脳ＭＧＥ様のアイデンティティ及びＧ
ＡＢＡ作動性ニューロン運命。ｓＥＢ切片をさらに免疫染色で分析したところ、腹側終脳
マーカーＯＬＩＧ２及びＡＳＣＬ１（初期）、ＩＳＬＥＴ１（後期）ならびに有糸分裂マ
ーカーＫＩ６７（全期間）の誘導がみられた。移動ニューロンマーカー、ＤＣＸ及びＧＡ
ＢＡは経時的に誘導された。これに対して、視床下部マーカーのＲＡＸ及びコリン作動性
ニューロンマーカーのＣＨＡＴは分化から５０日後には検出されなかった。青＝ＤＡＰＩ
。

図１５．図１及び９に関連したｈＥＳＣからの浮遊胚様体分化時のマーカー発現のまと
め。

実施例２：ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ前駆細胞はＶＺ及びＳＶＺ放射状グリア様幹細胞の挙動
を示した
胚神経発生の決定的な特徴には頂底極性の獲得及び放射状グリア神経幹細胞の発生があ
る（Ｋｒｉｅｇｓｔｅｉｎ及びＧｏｔｚ，２００３）。ｈＥＳＣ由来神経ロゼット中の神
経上皮前駆体が頂底様極性を示す証拠がある（Ｅｌｋａｂｅｔｚ，Ｙ．ら（２００８）．
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２２，１５２−１６５）。第４日〜第７日にｓＥＢをまとめて播種
したところ、接着ＥＢ（ａＥＢ）が平らになり、ロゼット構造中にＮＫＸ２．１−ＧＦＰ
＋細胞の組織化がみられた（図２Ａ及び２Ｂ）。Ｎ−カドヘリン発現がロゼットの管腔表
面に限定されていることから極性が確認され、胚脳の頂端側脳室表面の放射状グリアエン
ドフィートへの局在と一致していた。ＫＩ６７が多くの細胞、特にロゼット管腔付近の細
胞に発現した。これに対して、ニューロンマーカーのＡＳＣＬ１及びＤＣＸは管腔から離
れたところで検出された（図２Ｂ）。

ロゼットをＲＦＰ［ユビキチンＣプロモーター−ＲＦＰ（ＵｂＣ−ＲＦＰ）ウイルス］
で標識し、ライブタイムラプス撮像によってモニターした。分裂前に脳室帯（ＶＺ）放射
状グリア（ｖＲＧ）様の分裂間期の核移動（ＩＮＭ）挙動を示すロゼット構造中のＮＫＸ
２．１−ＧＦＰ＋及びＵｂＣ−ＲＦＰ＋細胞が検出された（図２Ｃ及び２Ｅ）。ＶＲＧ様
細胞体がロゼット管腔に向かって移動し、鉛直切断面で（線維と並行に）分裂した。娘細
胞が放射状線維を伸長し、鉛直切断面で分裂する胚ｖＲＧに起因する対称的な分裂に類似
しているように見えたのは興味深い。

次に本発明者らは、われわれの培養物中に近年記載された（Ｆｉｅｔｚ，Ｓ．Ａ．ら（
２０１０）．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３，６９０−６９９）（Ｈａｎｓｅｎ，Ｄ．
Ｖ．ら（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，５５４−５６１）ヒト富化外側サブＶＺ（
ＳＶＺ）放射状グリア（ｏＲＧ）様細胞が存在するかどうかを検討した。本発明者らは、
ロゼット塊から離れた位置にあり単極性線維を有するＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞に焦点
を当てた（図２Ｄ及び２Ｆ）。本発明者らは、ＧＦＰ＋ｏＲＧ様細胞が分裂前に有糸分裂
細胞体移動（ＭＳＴ）を示すことを発見した。この細胞体は単極性線維に向かって移動し
、水平切断面で（線維と垂直に）分裂した。以上をまとめると、ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様前
駆体（ＭＧＥ前駆細胞とも呼ばれる）はＶＺ及びヒト富化ＳＶＺ放射状グリア様幹細胞の
挙動を再現することができた。

図２．ｈＥＳＣ−ＭＧＥ様前駆体（ＭＧＥ前駆細胞とも呼ばれる）はＶＺ及びＳＶＺ放
射状グリア幹細胞様の分裂を示した。（Ａ）第４日〜第７日にｓＥＢをまとめて播種し、
第１４日にａＥＢを分析のために固定した；あるいはａＥＢにＵｂＣ−ＲＦＰウイルスを
感染させ、ライブ培養タイムラプス撮像を実施した。（Ｂ）第１４日のＮＫＸ２．１−Ｇ
ＦＰ発現と一連のマーカー、Ｎ−カドヘリン、ＫＩ６７、ＡＳＣＬ１及びＤＣＸをマージ
して、また別々に赤色で示した画像。青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ）
ＲＦＰ蛍光単独のまたはＮＫＸ２．１−ＧＦＰとマージしたロゼット塊。（Ｄ）塊の外側
のＮＫＸ２．１−ＧＦＰ発現細胞。Ｃ、Ｄのスケールバー：１００μｍ。（Ｅ）ｖＲＧ様
のＩＮＭ挙動：ロゼット管腔方向への移動及び鉛直切断面での分裂（星印）を示した３種
類のＲＦＰ＋細胞（青色、オレンジ色、及び緑色の矢頭）を示す、（Ｃ）の囲まれた領域
の連続タイムラプス撮像。時間：時間。スケールバー：２０μｍ。（Ｆ）（Ｄ）の囲まれ
た領域の連続タイムラプス。特徴的な単極性の形態を有するＧＦＰ＋細胞（白の矢頭及び
小さい矢頭で線維を示している）がｏＲＧ様のＭＳＴ挙動：線維方向への移動（４６μｍ
）及び水平切断面での分裂（星印）を示した。時間：時間。スケールバー：５０μｍ。

実施例３：ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様前駆体からＧＡＢＡ作動性介在ニューロンが生成した
本発明者らは、ｈＥＳＣ由来培養物のアイデンティティ及び運命をさらに検討した。第
２５日のａＥＢに免疫染色分析を実施した（図３Ａ及び３Ｂ）。このほか、第２５日のａ
ＥＢを分離し、単層（ＭＬ）として培養し、第３５日に免疫染色分析を実施し定量化した
（図３Ｃ〜３Ｅ）。第２５日の段階及び第３５日の段階とも、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ発現
は内因性ＮＫＸ２．１タンパク質を発現する細胞に特異的であった（９１．３±１．７％
）（図３Ｅ）。第２５日、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞のほとんどにＦＯＸＧ１及びＯＬ
ＩＧが発現し、腹側終脳様アイデンティティのさらなる証拠が得られた（図３Ｂ）。第３
５日までにほとんどのＧＦＰ＋細胞がＦＯＸＧ１を発現し続けた（８１．５±３．６％）
が、ＯＬＩＧ２はダウンレギュレートされた（６．８±３％）。ＧＦＰ＋細胞の大部分が
、第３５日までにほかにもＡＳＣＬ１（７９．９±６．５％）及びＤＬＸ２（７９．８±
３．７％）を発現した。ＯＬＩＧ２はＧＥ前駆体を示し、ＤＬＸ２はＧＡＢＡ作動性ニュ
ーロン系列を示すことから、これらの結果により、第２５日のｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様前駆
体（本明細書ではＭＧＥ前駆細胞とも呼ばれる）が第３５日までにＧＡＢＡ作動性ニュー
ロンへの分化を開始することが示唆された。実際、ＴＵＪ１（９２±２．４％）染色によ
ってニューロンアイデンティティが確認された（図３Ｄ及び３Ｅ）。ＧＦＰ＋／ＴＵＪ１
＋細胞のほとんどがＧＡＢＡ（７５．８±２．３％）を同時発現した。このほか、第３５
日までに介在ニューロンサブタイプのマーカー、カルビンジン（ＣＡＬＢ１またはＣＡＬ
Ｂ）が発現した（３１．１±５．４％）が、その他の介在ニューロンサブタイプのマーカ
ー、カルレチニン（ＣＡＬＢ２またはＣＡＬＲ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）及びパルブ
アルブミン（ＰＶＡＬＢまたはＰＶ）については、ＳＳＴまたはＣＡＬＲがまれに検出さ
れた以外は検出されなかった。

少数のＧＦＰ＋細胞が間脳／オリゴデンドロサイトマーカーのＮＫＸ２．２（１３．６
±４．７％）、神経前駆細胞／グリア細胞マーカーのＧＦＡＰ（３．９±３．９％）及び
ＫＩ６７（２．８±１．５％）、ＬＧＥ／ＰＯＡ富化マーカーのＩＳＬＥＴ１（７．６±
３．３％）またはドーパミン作動性ニューロンマーカーのＴＨ（４．４±１．３％）を発
現した（図３Ｅ）。新皮質マーカーのＰＡＸ６、尾側ＧＥ（ＣＧＥ）／背側ＭＧＥマーカ
ーのＣＯＵＰＴＦＩＩ、線条体中型有棘ニューロンマーカーのＤＡＲＰＰ３２、淡蒼球投
射ニューロンマーカーのＥＲ８１／ＥＴＶ１、コリン作動性ニューロンマーカーのＣＨＡ
Ｔまたはグルタミン酸作動性新皮質投射ニューロンサブタイプマーカーのＴＢＲ１を発現
したＧＦＰ＋細胞はほとんどみられなかった（図３Ｅ）。以上の結果を踏まえると、ｈＥ
ＳＣ由来ＭＧＥ様前駆体はほとんどが分裂終了ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに分化した
と考えられる。

図３．ｈＥＳＣ−ＭＧＥ様前駆体は終脳ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの特性を有する
ニューロンに分化した。（Ａ）第２５日に免疫蛍光染色用に固定したａＥＢ。（Ｂ）第２
５日のＭＧＥ様前駆細胞がＮＫＸ２．１−ＧＦＰ、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ
２、ＡＳＣＬ１及びＤＬＸ２を発現した。青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：５０μｍ。（
Ｃ）分離し、ＭＬとして再播種し、第３５日の免疫蛍光法のために固定したａＥＢ。（Ｄ
）第３５日の分離細胞がＮＫＸ２．１−ＧＦＰ、ＴＵＪ１、ＡＳＣＬ１、ＧＡＢＡ及びＣ
ＡＬＢを発現した。青色：ＤＡＰＩ、スケールバー：５０μｍ。（Ｅ）第３５日の免疫染
色の定量化。ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の大部分がＮＫＸ２．１、ＦＯＸＧ１、ＡＳＣ
Ｌ１、ＴＵＪ、ＧＡＢＡ及びＤＬＸ２を発現した。データは平均±ＳＥＭで表されている
。

実施例４：ｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋のマイクロアレイプロファイリング
第２０日のａＥＢ（青色のバー）もしくは第３５日の接着単層（オレンジ色のバー）ま
たは予めＵｂＣ−ＲＦＰウイルスで標識し、第３５日にＧＦＰについて分取し、グリア細
胞と共培養した第５５日の培養物（緑色のバー）から、５５日間の分化経過中の未分化ｈ
ＥＳＣとＦＡＣＳ分取ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋集団との間のトランスクリプトームの網羅
的比較を得るため、本発明者らはマイクロアレイプロファイリングを実施した（図４Ａ）
。ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の百分率は、分離した単層培養物（第３５日で約８１％）
または共培養物（第５５日で約９４％のＲＦＰ＋細胞）では高いレベルで維持された（図
４Ｂ）。樹状図によるクラスター分析から、分化したＧＦＰ＋集団が未分化ｈＥＳＣより
も互い近縁であることがわかった（図１０Ａ）。ｈＥＳＣ由来ＧＦＰ＋集団のアイデンテ
ィティをさらに詳細に調べるため、本発明者らは系列特異的マーカーのパネルを選択し、
転写産物のハイブリダイゼーション強度を経時的に評価した（図４Ｃ〜４Ｈ及び図１０Ｃ
〜１０Ｆ）。一部のマーカーについては定量的ＲＴＰＣＲを実施し、アレイのデータを確
認した（図１０Ｂ）。多能性のマーカーが未分化ｈＥＳＣにのみ検出されたのに対して、
神経系列のマーカー（ＨＥＳ５、ＤＣＸ、ＳＹＰ、ＳＹＮ１）は分化ＧＦＰ＋細胞で誘導
された。グリア細胞、神経堤、ミクログリアのマーカーはいずれも検出されなかった。こ
れとは対照的に、ＧＦＰ＋細胞にはニューロンマーカー（ＴＵＢＢ３、ＤＣＸ、ＳＹＰ、
ＳＹＮ１）が発現し、転写産物レベルが経時的に上昇した。次に本発明者らは、中枢神経
系（ＣＮＳ）の前後方向のパターン形成を調べ、前部ＣＮＳのマーカー（ＦＯＸＧ１、Ｓ
ＩＸ３、ＯＴＸ２）の発現を検出した。これまでの結果と同じように、間脳（及びそれよ
りも尾側の部分）ＮＫＸ２．２が一過性に発現した後、ダウンレギュレートされた。ＣＮ
Ｓ底板のマーカー、ＦＯＸＡ２が第２０日の前駆体に発現したが、その後の時点では検出
されなかったのは予想外であった。

次に本発明者らは、前脳の小領域を同定するマーカーを検討した。ＮＫＸ２．２の一過
性発現を除けば、間脳視床下部のマーカーが旺盛に発現することはなかった（図１０Ｃ）
。このほか、背側興奮性ニューロン系列のマーカーも検出されなかった（図１０Ｄ）。代
わりに、腹側終脳ＧＡＢＡ作動性ニューロン系列マーカー（ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ１、ＤＬ
Ｘ５）がＭＧＥマーカー（ＮＫＸ２．１、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＣＸＣＲ７）とともに発
現し、その発現強度は全般的には経時的に増大した（図４Ｆ及び４Ｈ）。非ＭＧＥ腹側終
脳のマーカーは検出されず、ＮＫＸ２．１＋ＰＯＡ／中隔または淡蒼球のマーカーも検出
されなかった（図１０Ｅ）。ＧＡＢＡ作動性のマーカー（ＧＡＤ１、ＳＬＣ３２Ａ１、Ｓ
ＬＣ６Ａ１）は確認されたが、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン
のマーカーはいずれも発現しなかった（図４Ｇ）。ドーパミン作動性ニューロン転写産物
（ＴＨ）が検出されたが、ＴＨタンパク質を発現する多くのニューロンが同定されなかっ
た（図３Ｅ）。以上の結果から、ＧＦＰ＋細胞が主としてＭＧＥ様ＧＡＢＡ作動性ニュー
ロン系列のものであることが示唆された。

ＭＧＥは、皮質ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに加えて線条体ＧＡＢＡ作動性介在ニュ
ーロン及びＧＡＢＡ作動性淡蒼球投射ニューロンを生成する。ＧＦＰ＋細胞が淡蒼球マー
カーの転写産物もタンパク質も発現しなかったため、本発明者らは、皮質／線条体介在ニ
ューロン系列のマーカーをさらに評価した。

線条体介在ニューロンがＮＫＸ２．１及びＬＨＸ８の発現を維持するのに対して、移動
皮質介在ニューロンではこれらのマーカーが消失し、ＺＥＢ２、ＭＡＦ、ＡＲＸ、ＣＸＣ
Ｒ７及びＣＸＣＲ４が発現する。皮質様介在ニューロン系列であることを裏付けるように
、ＧＦＰ＋細胞に旺盛なＣＸＣＲ７発現が検出された。後期にＺＥＢ２、ＡＲＸ及びＣＸ
ＣＲ４転写産物のシグナル増大がみられたが、全体的なレベルは低く、またＮＫＸ２．１
及びＬＨＸ８の発現が継続し、未成熟段階の線条体介在ニューロン様系列及び／または皮
質様系列であることが示唆された（図４Ｆ及び４Ｈ）。最後に、介在ニューロンのサブタ
イプを示す神経ペプチド及びカルシウム結合タンパク質のうち、ＳＳＴ転写産物のみが第
５５日に強く検出された（図４Ｈ）。以上をまとめると、ｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−Ｇ
ＦＰ＋集団はＭＧＥ様神経前駆細胞ならびにＧＡＢＡ作動性皮質様及び／または線条体様
介在ニューロンであった。

図４．ｈＥＳＣ−ＭＧＥ様ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞集団のマイクロアレイによる遺
伝子発現プロファイリング。（Ａ）マイクロアレイデータの概略図及び説明。未分化ｈＥ
ＳＣ（黒色）；ならびに第２０日のａＥＢからＦＡＣＳ分取したＧＦＰ＋細胞（青色）、
第３５日のＭＬ培養物（オレンジ色）及び第５５日まで共培養した第３５日のＧＦＰ＋細
胞（緑色）。（Ｂ）各分化段階及び未分化ｈＥＳＣ対照（黒色）の代表的なＦＡＣＳヒス
トグラム分析。（Ｃ〜Ｈ）マーカーパネルの転写産物ハイブリダイゼーションの平均シグ
ナル強度。ＩＮ＝介在ニューロン、ＤＡ＝ドーパミン作動性、ＡＣｈ＝コリン作動性、Ｇ
ｌｕ＝グルタミン酸作動性。データは平均±ＳＥＭで表されている。このほか図１０を参
照されたい。

図１０．図４に関連したｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の転写産物発現プロ
ファイリング。
（Ａ）マイクロアレイデータの樹状図によるクラスター分析によって、第２０日、第３５
日及び第５５日のＧＦＰ＋集団が未分化ｈＥＳＣよりも互いに近縁であることが確認され
た。
（Ｂ）未分化ｈＥＳＣ（黒色のバー）及び第３週のＧＦＰ＋細胞（青色のバー）のＧＡＰ
ＤＨ発現に対する定量的ＲＴＰＣＲ分析。データは平均±ＳＤで表されている。
（Ｃ〜Ｆ）マイクロアレイ解析のほかのマーカー。説明：未分化ｈＥＳＣ（黒色）の試料
、第２０日のＧＦＰ＋（青色）の試料、第３５日のＧＦＰ＋（オレンジ色）の試料及び第
５５日のＧＦＰ＋（緑色）の試料。パネルは、視床下部（Ｃ）、皮質興奮性ニューロン系
列（Ｄ）、腹側終脳（Ｅ）及び全般的な胎児発生マーカー（Ｆ）。ＧＰ＝淡蒼球、ＰＯＡ
＝視索前野、Ｓｅｐ＝中隔、ＰＮ＝投射ニューロン。視床下部及び皮質興奮性ニューロン
マーカーは検出されなかった。ほかにも、ＰＯＡ／Ｓｅｐ、ＧＰ及びＭＧＥ由来ＰＮマー
カー、ＥＴＶ１ならびにＧＢＸ２が検出されなかった。背側ＭＧＥ及びＣＧＥマーカーの
ＮＲ２Ｆ２（ＣＯＵＰＴＦＩＩ）が低レベルで検出され、ＧＦＰ＋細胞がまれにＣＯＵＰ
ＴＦＩＩタンパク質を発現したことと一致し（図３Ｅ）、またＮＫＸ６−２も第２０日に
わずかに検出された。ヒト多能性幹細胞に由来する神経細胞の発生段階を推定するのに初
期胎児マーカーのＤＰＰＡ４、ＬＩＮ２８及びＬＩＮ２８Ｂが用いられてきた（Ｐａｔｔ
ｅｒｓｏｎ，Ｍ．ら（２０１２）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２２，１７８−１９３）。ヒト胎
児脊髄では、ＬＩＮ２８発現が７ｇｗまでにダウンレギュレートされるのに対して、ＤＰ
ＰＡ４及びＬＩＮ２８Ｂは１３ｇｗまで減少しない。本発明者らの培養物では、ＤＰＰＡ
４及びＬＩＮ２８は第３５日までに検出されず、ＬＩＮ２８Ｂ発現は第５５日まで持続し
た。以上の結果から、第３５日〜５５のＧＦＰ＋細胞が７〜１３ｇｗの胎児発生段階ほぼ
同じであり得ることが示唆される。データは平均±ＳＥＭで表されている。

実施例５：ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンサブタイプへの
成熟遅延
次に本発明者らは、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋ＭＧＥ前駆体様細胞によって生成するニュ
ーロンサブタイプ及びサブタイプ成熟の発生時系列の両方をより説得力をもって決定する
ことを目指した。第３５日のＦＡＣＳ分取ＧＦＰ＋細胞の成熟を検討するため、これを皮
質グリア細胞と共培養し（図５Ａ）、一部の細胞を共培養の前にＵｂＣ−ＲＦＰウイルス
で標識した。分化後第５週、第１０週、第２０週及び第３０週（ＷＰＤ）、培養物を分析
用に固定し、ニューロンサブタイプマーカー発現を定量化した（図５Ｃ）。３０ＷＰＤ後
、ＲＦＰ＋ｈＥＳＣ由来ニューロンは細胞体の大きさが顕著に大きくなり、ＧＡＢＡ作動
性ニューロン−特異的マーカーのＶＧＡＴならびに介在ニューロンサブタイプマーカーの
ＳＳＴ、ＣＡＬＢ及びＣＡＬＲを発現した（図５Ｂ）。１０〜２０−ＷＰＤの培養物の画
像を図１１に示す。５ＷＰＤのほぼすべてのニューロンがＮＫＸ２．１−ＧＦＰを発現し
たが、皮質介在ニューロンと同じく、３０ＷＰＤまでにＮＫＸ２．１＋ニューロンの百分
率が有意に低下した（６６．７±６．１％；ｐ＝０．０３）。５〜３０ＷＰＤでほとんど
のニューロンがＧＡＢＡ（７５〜８６％）及びＶＧＡＴ（５３〜７８％）を発現した。興
奮性ニューロンマーカーＴＢＲ１は、まれな細胞（ニューロン３，１１０個中１１個）を
除いて発現しなかった。ＣＡＬＢは経過時間全体を通じてニューロンに発現した（２４〜
３６％）。これに対して、ＳＳＴ＋ニューロン及びＣＡＬＲ＋ニューロンの百分率は経時
的に増大し、１０〜２０ＷＰＤでは有意に誘導された（ＳＳＴ：２．８±１％〜１２．８
±９％；ｐ＝０．０３及びＣＡＬＲ：８．８±４．９％〜５２．６±６．２％；ｐ＝０．
００４）。３０ＷＰＤまでにＳＳＴ＋ニューロンの百分率が４０．６±８．６％に増大し
、ＣＡＬＲ＋ニューロンの百分率が７７．７±１４．９％に増大した。これとは逆に、Ｐ
Ｖ＋ニューロンは３０ＷＰＤまでに検出されず（ニューロン１，１４６個中０個）、ＮＰ
Ｙ＋ニューロンはまれであった（ニューロン８１９個中６個、不掲載）。したがって、Ｎ
ＫＸ２．１−ＧＦＰ＋ＭＧＥ様細胞はＣＡＬＢ、ＣＡＬＲ及び／またはＳＳＴサブタイプ
マーカーを発現するＮＫＸ２．１＋及びＮＫＸ２．１陰性ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン
に成熟し、１０〜２０ＷＰＤの間に顕著なＳＳＴ及びＣＡＬＲサブタイプ成熟がみられた
。

本発明者らのｈＥＳＣ由来ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンがＳＳＴ及びＣＡＬＲの実質
的な発現を示すのに２０〜３０週間を要したのは驚くべきことであった。しかし、このよ
うな分化時系列の遅延はヒト胎児及び乳児の介在ニューロンサブタイプ発生に類似してい
る（Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓ，Ｓ．ら（２００９）．Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ １９，
２１９６−２２０７）。本発明者らは、自ら発生段階のヒト皮質及びＭＧＥの組織学的分
析を実施してこれらの観察結果を確認した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。ヒト胎児ＭＧＥ由来
の運命をさらに検討するため、本発明者らは、妊娠１８週（ｇｗ）のヒト胎児ＭＧＥ細胞
を切り出し、ＵｂＣ−ＲＦＰウイルスで標識し、共培養した。培養第１２週までにＲＦＰ
＋ヒト胎児ＭＧＥ細胞がＣＡＬＢ＋、ＣＡＬＲ＋、ＳＳＴ＋及びＧＡＢＡ＋ニューロンに
成熟し、ＴＢＲ１を発現しなかった（図１２Ｃ）。したがって、ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細
胞成熟は内因性のヒト胎児ＭＧＥ発生と培養したヒト胎児ＭＧＥ発生の両方に類似してい
た。すなわち、同等の介在ニューロンサブタイプがほぼ同じ順序及び時間枠で生成した。

図５．ｈＥＳＣ−ＭＧＥ前駆体様細胞由来ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの成熟及び発
火特性。
（Ａ）ＭＬ培養物を分離し、ＵｂＣ−ＲＦＰレンチウイルスで標識し、第３５日にＧＦＰ
＋細胞をＦＡＣＳ分取し、共培養した。
（Ｂ）ＶＧＡＴ、ＳＳＴ、ＣＡＬＢ及びＣＡＬＲを発現する高度に分岐したＲＦＰ＋ヒト
ニューロンを示す第３０週の培養物の免疫染色。スケールバー：５０μｍ。
（Ｃ）５週間、１０週間、２０週間及び３０週間にわたる免疫染色分析の定量化。データ
は平均±ＳＥＭで表されている。このほか図１１及び１２を参照されたい。
（Ｄ）１２ＷＰＤ及び３０ＷＰＤのｈＥＳＣ由来ニューロンのＤＩＣ画像であり、挿入画
像は記録ニューロンのＲＦＰ発現を示している。スケールバー：２０μｍ。
（Ｅ）膜抵抗（Ｒｍ）、静止膜電位（ＲＭＰ）、膜容量（Ｃｍ）及び活動電位（ＡＰ）１
／２幅を示す統計結果。
（Ｆ）各段階の閾値付近（上）及び閾値超（下）の電流注入時の代表的なＡＰ発火パター
ン。スケールバー：５０ｍＶ及び１００ｍｓ。このほか図１３を参照されたい。
（Ｇ）閾値電流注入時の最初のＡＰトレースの平均。スケールバー：２５ｍＶ及び２５ｍ
ｓ。
（Ｈ）各段階のＡＨＰを示す統計結果（破線＝ベースライン）。
（Ｉ〜Ｊ）段階的電圧（持続時間５００ｍｓ）の下で測定した各段階のＮａ^＋電流（Ｉ）
及びＫ^＋電流（Ｊ）のＩ−Ｖ曲線。Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｊ：データは平均±ＳＥＭで表されてい
る。＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

図１１．図５に関連したｈＥＳＣ由来ＭＧＥ前駆体様細胞のＧＡＢＡ作動性介在ニュー
ロンサブタイプへの成熟。
ＵｂＣ−ＲＦＰウイルスで予め標識し、第３５日にＧＦＰについてＦＡＣＳ分取し、分化
後１０週間及び２０週間（ＷＰＤ）共培養したＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞の免疫染色分
析。１０ＷＰＤまでにｈＥＳＣ由来ニューロンがＶＧＡＴ及びカルビンジン（ＣＡＬＢ１
）を発現し、まれな細胞がカルレチニン（ＣＡＬＢ２）またはＳＳＴを発現した。２０Ｗ
ＰＤまでにヒトニューロンがＶＧＡＴ、ＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２及びＳＳＴを発現した。
パルブアルブミン（ＰＶＡＬＢ）はいずれの時点でも検出されなかった。青色＝ＤＡＰＩ
。

図１２．図５に関連したヒト胎児皮質及びＭＧＥならびにヒト胎児ＭＧＥ由来の培養物
における介在ニューロンサブタイプの発生。
（Ａ）１４〜１５ｇｗ、２４ｇｗ及び生後（ｐｎ）８か月（ｍｏ）のヒト胎児皮質切片に
おける介在ニューロンサブタイプマーカーの発現。ＣＡＬＢ及びＣＡＬＲは全試料に発現
したが、ＳＳＴ及びＰＶはそれぞれ２４ｇｗと８ｍｏの試料及び８ｍｏの試料にのみ発現
した。青色＝ＤＡＰＩ。
（Ｂ）１５ｇｗヒト胎児ＭＧＥ切片におけるサブタイプマーカーの発現。ＣＡＬＢ及びＣ
ＡＬＲともに発現し、ＮＫＸ２．１と共局在していた。青色＝ＤＡＰＩ。
（Ｃ）ヒト胎児ＭＧＥを分離し、ＵｂＣ−ＲＦＰで標識し、ＲＦＰ＋細胞をＦＡＣＳ分取
し、分離したヒト胎児皮質細胞と共培養した。ＲＦＰ＋細胞はＣＡＬＢ、ＣＡＬＲ、ＳＳ
Ｔ及びＧＡＢＡを発現したが、ＴＢＲ１は発現しなかった。青色＝ＤＡＰＩ。

実施例６：ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞の機能的成熟：介在ニューロン様発火特性、シナ
プス形成及びＧＡＢＡ作動性出力
ｈＥＳＣ由来細胞が機能的なニューロンであるかどうかを試験するため、本発明者らは
、様々なＷＰＤ（第８週、ｎ＝２１；第１２週、ｎ＝３５；第１５週、ｎ＝３１；第３０
週、ｎ＝１８）に全細胞パッチ記録を実施して、その電気生理学的特性を検討した。本発
明者らは、最初のＡＰのＡＰ１／２幅が広いこと、後過分極（ＡＨＰ）が小さいこと及び
高電流を注入すると反復して発火できないことから判断して、８ＷＰＤではｈＥＳＣ由来
ニューロンの活動電位（ＡＰ）発火パターンが全く未成熟であることを発見した（図５Ｅ
〜５Ｈ）。ピーク電位依存性Ｎａ＋及びＫ＋チャネル電流は８ＷＰＤから１２ＷＰＤの間
に有意に増大し（図５Ｉ及び５Ｊ）、同時に膜抵抗（Ｒｍ）が有意に減少した（図５Ｅ）
。１２ＷＰＤ及び１５ＷＰＤでは、閾値付近の電流注入時に多くのニューロンがより成熟
した反復性ＡＰ発火を示した（図５Ｆ、１３Ｂ及び１３Ｃ）。３０ＷＰＤまでには、閾値
超の電流注入時にｈＥＳＣ由来ニューロンが高頻度の反復性ＡＰ発火（図５Ｆ及び１３Ｄ
）とともに、これに対応する膜容量（Ｃｍ）の増大及びより過分極した静止膜電位（ＲＭ
Ｐ）を示した（図５Ｅ）。さらに、３０ＷＰＤのニューロンではＡＰ１／２幅が小さくな
り（図５Ｅ）、ＡＨＰが大きくなった（図５Ｇ及び５Ｈ）。ほかにも、ここに挙げたより
成熟した生物物理学的特性と同じように、３０ＷＰＤでは、ｈＥＳＣ由来ニューロンの形
態が前段階の１２ＷＰＤよりも成熟した多数の長い突起を有するものであることがわかっ
た（図５Ｄ）。

次に本発明者らは、ＭＧＥ様細胞をマウスグリア細胞と共培養し、そのシナプス特性を
調べることによって、同細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロンであるかどうかを検討した。ｈ
ＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋ニューロン突起と点状のシナプス前ＶＧＡＴ発現が共
局在し、ＧＡＢＡ作動性シナプスの形成が示唆された（図６Ａ）。分化後第８週までに自
発的シナプス後電流（ｓＰＳＣ）が検出され、ＧＡＢＡＡ受容体阻害剤のビククリンメチ
オジド（ＢＭＩ、２０μＭ）によって完全に遮断されたことから、機能的なＧＡＢＡ作動
性特異的シナプス形成が示された（図６Ｂ）。ｓＰＳＣを受け取ったニューロンの百分率
は、８ＷＰＤに３３．３％（ｎ＝１２）であったのが１２ＷＰＤに８２．１％に増大した
（ｎ＝２８、図６Ｃ）。ＧＡＢＡ作動性ニューロンが隣接ニューロンに出力を送ることが
可能であることを確認するため、本発明者らは、半数のニューロンにシナプシンプロモー
ターのチャネルロドプシン２−ＥＹＦＰ（ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ）をレンチウイルス感染に
よって形質導入した。青色光で刺激したところ、ＥＹＦＰ陽性ニューロンに活動電位発火
が確実に誘起され（図１３Ｆ）（Ｗｅｉｃｋ，Ｊ．Ｐ．ら（２０１１）．Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８，２０１８９−２０１９４）、隣接ニューロン
に強いシナプス後電流（ＰＳＣ）が誘発された（図６Ｄ及び６Ｅ）。さらに、ＰＳＣは、
ＧＡＢＡ作動性ＰＳＣの特徴である長い減衰時間を示した（３１．４±１．９ｍｓ、ｎ＝
２６）。ＢＭＩによる光誘発ＰＳＣの可逆的遮断によってこのことをさらに検証した（図
６Ｄ及び６Ｅ）。光誘発ＰＳＣの逆転電位は、本発明者らの記録条件下で予想されるＣｌ
−逆転電位［−３７．３ｍＶ＝−５３．４ｍＶ（ネルンストの式による）＋１６．１ｍＶ
（接合部電位）］に近い−３２．７ｍＶであった（図６Ｆ及び６Ｇ）。以上の結果から、
ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様介在ニューロンがＧＡＢＡ作動性シナプス出力のみを生じることが
示唆された。

ｈＥＳＣ由来介在ニューロンが初代ヒトニューロンにシナプスを形成することができる
かどうかを検討するため、４ＷＰＤにＭＧＥ様細胞をＣｈＲ２−ＹＦＰ及びＵｂＣ−ＲＦ
Ｐウイルスで標識し、ＲＦＰ＋ＦＡＣＳ分取細胞を２０ｇｗの分離ヒト胎児皮質細胞と７
週間共培養した。共培養後、ＲＦＰ陰性初代皮質ニューロンから全細胞記録を得た（図６
Ｈ）。ｈＥＳＣ由来ニューロンの青色光刺激によって、記録した初代ニューロンにＧＡＢ
Ａ作動性特異的ＰＳＣが誘起され、ＢＭＩによって完全に遮断された（図６Ｉ及び６Ｊ）
。さらに、光刺激時に多シナプス応答がみられ（図６Ｉ）、これも同じくＢＭＩによって
遮断されたことから、ｈＥＳＣ由来ニューロンが培養ヒト胎児ニューロン回路に堅固にシ
ナプス統合されたことが示された。したがって、ｈＥＳＣ由来ニューロンが機能的ニュー
ロンの特性を有し、シナプス出力がＧＡＢＡ作動性に限られ、サブタイプマーカー発現の
ペースが遅いのと同じよう介在ニューロン発火特性の成熟が遅く３０週間かかることが示
された。

図６．ｈＥＳＣ由来介在ニューロンのＧＡＢＡ作動性シナプス特性。
（Ａ）１２ＷＰＤのｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋ニューロンにおけるＶＧＡＴ発
現を示す画像。右：破線の長方形で囲った部分を拡大した画像。スケールバー：左、５０
μｍ；右、１０μｍ。
（Ｂ）ｈＥＳＣ由来ニューロンの自発的シナプス後電流（ＰＳＣ）を示すトレース。下段
：ＰＳＣがＢＭＩによって完全に遮断された。スケールバー：１００ｐＡ、５秒及び中段
のトレースは０．２５秒（破線）。
（Ｃ）様々な段階の自発的ＰＳＣを示すニューロンの百分率。
（Ｄ）ｈＥＳＣ由来ニューロンにＣｈＲ２−ＥＹＦＰで形質導入した。トレースは、青色
光のパルス（青色のバー）が隣接細胞にＰＳＣを誘発し、これがＢＭＩによって可逆的に
遮断されたことを示している。スケールバー：５０ｐＡ及び５０ｍｓ。このほか図１３を
参照されたい。
（Ｅ）光誘発ＧＡＢＡ作動性ＰＳＣ及びＢＭＩ適用の平均振幅。
（Ｆ〜Ｇ）様々な保持電位での光誘発（青色のバー）ＰＳＣを示すトレース。光誘発ＧＡ
ＢＡ作動性ＰＳＣのＩ−Ｖ曲線を示す結果のまとめ（ｎ＝７）（Ｇ）。
（Ｈ）分取したＵｂＣ−ＲＦＰ＋及びＣｈＲ２形質導入ｈＥＳＣ由来ニューロンと共培養
したヒト胎児皮質細胞のＤＩＣを示すマージ画像。スケールバー：２０μｍ。
（Ｉ）記録したＲＦＰ陰性ヒト胎児皮質ニューロンにおけるｈＥＳＣ由来ニューロンの青
色（青色のバー）刺激によって誘発されたＰＳＣを示すトレース。上のパネルはＰＳＣ単
シナプス応答を示し、下のパネルは多シナプス応答のみられるＰＳＣを示し、ともにＢＭ
Ｉによって完全に遮断された。スケールバー：５０ｐＡ及び５０ｍｓ。
（Ｊ）光誘発ＰＳＣ及びＢＭＩ適用の平均振幅。Ｅ、Ｊ：データは平均±ＳＥＭで表され
ている。

図１３．図５及び６に関連したｈＥＳＣ由来介在ニューロンの発火特性の成熟。
（Ａ〜Ｄ）分化後の様々な段階における活動電位（ＡＰ）のトレースの例。様々な段階に
おいて、段階的電流を−６０ｍＶ〜−７０ｍＶのＶ_ｈｏｌｄで記録ニューロンに注入した
：（Ａ）８ＷＰＤ（Ｂ）１２ＷＰＤ（Ｃ）１５ＷＰＤ（Ｄ）３０ＷＰＤ。赤色のトレース
は閾値電流を注入したときのＡＰを示していた。黒色のトレースは閾値の２倍または３倍
の電流を注入したときのＡＰを示していた。スケールバー：５０ｍＶ及び２００ｍｓ。
（Ｅ〜Ｆ）ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ陽性ｈＥＳＣ由来ニューロンにおいて青色光により誘起さ
れたＡＰ。１０ＷＰＤにおけるＥＹＦＰ蛍光とＤＩＣのマージ画像（Ｅ）。スケールバー
：２０μｍ。青色光のパルス（青色のトレース）によりＣｈＲ２発現ニューロンに確実に
ＡＰが誘起された（黒色のトレース）（Ｆ）。

実施例７：マウス脳におけるｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様介在ニューロンの成熟及び機能的統
合
細胞の運命及び機能を厳密に評価するため、ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞をマウス脳内に
移植した。本発明者らは、未分化ＮＫＸ２．１＋神経幹細胞の注入が回避されるようわれ
われのプロトコルを修正した（図１６）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のγセクレターゼ
阻害剤、ＤＡＰＴによる処置を用いて、ニューロン分化を組み合わせたニューロン前駆体
のＰＳＡ−ＮＣＡＭ精製を誘導した（Ｓｃｈｍａｎｄｔ，Ｔ．ら（２００５）．Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １４，５５−６４）。平均７５．７±５．２％（ｎ＝１２）のＮ
ＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞がＦＡＣＳにより高ＰＳＡ−ＮＣＡＭ発現に陽性を示し（図１
４Ａ）、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体を富化した第３５日のＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋
及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞（図３Ｅ）を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）新生仔マウスの
皮質に注入した（図７Ａ）。ヒト特異的核抗原（ＨＮＡ）陽性ヒト細胞が注入後７か月間
（ＭＰＩ）（最も長い時点）生存し、一部のヒト細胞が注入部位から１ｍｍ超移動した（
図７Ｂ、１４Ｂ及び１４Ｃ）。２ＭＰＩ、４ＭＰＩ及び７ＭＰＩ後のヒト細胞の生存率（
注入した細胞の％）はそれぞれ５．６±２．６％、３．１±１．５％及び８．６±３．１
％であった。２ＭＰＩ後、ＨＮＡ及びＮＫＸ２．１−ＧＦＰ（６７．８±１．６％）、Ｋ
Ｉ６７（２５．５±１．７％）またはＤＣＸ（７９．８±３．８％）を発現するヒト細胞
はほとんどが依然として注入部位に存在していた（図７Ｂ及び１４Ｂ）。しかし、４ＭＰ
ＩまでにはＫＩ６７発現が有意に減少し（１．７±０．２７％；ｐ＝０．０４）、ＤＣＸ
発現も同様に経時的に減少した（７ＭＰＩまでに５．９±４．９％；ｐ＝０．００８）。
このほか、７ＭＰＩ後にはＮＫＸ２．１−ＧＦＰがヒト細胞の３５．６±１４％にのみ検
出され、この百分率は３０ＷＰＤの共培養物よりも低い値であった。分裂終了ニューロン
マーカーのＮＥＵＮには逆の傾向がみられ、７ＭＰＩまでにヒト細胞の６８．４±８．３
％に増大した。これに対して、グリア細胞マーカーのＧＦＡＰ及びＯＬＩＧ２は、７ＭＰ
Ｉではこれよりも低い百分率のヒト細胞に発現した（それぞれ１１．２±４．３％及び１
０．７±４．４％）。一部のｈＥＳＣ由来培養物を注入前にＵｂＣ−ＲＦＰウイルスで標
識した。７ＭＰＩ後のマウス脳では、ニューロンの形態を有するＲＦＰ＋ヒト細胞がＧＡ
ＢＡ、ＳＳＴ、ＣＡＬＢ及びＣＡＬＲを発現していることが明らかになった（図７Ｃ及び
７Ｅ）。ＰＶ＋ヒト細胞については、弱いシグナルを有するまれな細胞（細胞１，８２９
個中４個）を除いて、検出されなかった。以上をまとめると、マウス皮質に注入したＭＧ
Ｅ様ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体は主として、介在ニューロンサブタイプマーカーの
ＳＳＴ、ＣＡＬＲ及びＣＡＬＢを発現するニューロンに成熟した。

ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞がｉｎ ｖｉｖｏでシナプスによって統合される機能的介在
ニューロンになることができるかどうかを検討するため、本発明者らは、７ＭＰＩのマウ
ス脳スライスでＲＦＰ＋ヒト細胞の全細胞記録を実施した。ニューロビオチンの細胞内注
入及び後染色により、記録ＲＦＰ＋ニューロンの旺盛な突起分岐が明らかになった（図７
Ｆ）。３個体からパッチした計１７個のヒト細胞のうち、１６個のニューロンが平均−６
４．８±４．０ｍＶのＲＭＰで活動電位を発火する能力を示した。さらに、膜特性及び発
火パターンが異なるＩ型及びＩＩ型の２つのグループの介在ニューロンが確認された。Ｉ
型介在ニューロンは平均ＲＭＰが−６７．３±２．９ｍＶ、Ｒｍが２５７±７８ＭΩ、Ｃ
ｍが６９．４±０．６ｐＦであった。Ｉ型介在ニューロンの発火パターンは閾値でのスパ
イクに大幅な遅延を示し、閾値超の電流注入時にほとんど順応を示さなかった（図７Ｇ及
び１４Ｄ）。ＩＩ型介在ニューロンはＩ型よりも過分極ＲＭＰが大きく（−８０．１±３
．４ｍＶ）、Ｒｍが小さく（９１±２８ＭΩ）、Ｃｍが小さかった（２７．７５±４．６
ｐＦ）。ＩＩ型介在ニューロンの発火パターンは、閾値超の電流注入時に迅速に最初のス
パイクの順応を示した（図７Ｇ及び１４Ｅ）。さらに、移植したｈＥＳＣ由来介在ニュー
ロンは、ＢＭＩ感受性ＧＡＢＡ作動性の成分及び６−シアノ−２，３−ジヒドロキシ−７
−ニトロ−キノキサリン（ＣＮＱＸ）感受性グルタミン酸作動性の成分の両方を含むシナ
プス入力を受け取った（１６個中１６個）（図７Ｈ）ことから、宿主皮質内への機能的統
合が示唆された。

図７．マウス脳におけるｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様介在ニューロン前駆細胞の成熟及び機能
的統合。
（Ａ）ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ及びＰＳＡ−ＮＣＡＭについてＦＡＣＳ分取し、新生仔マウ
ス皮質に注入した第３５日のＭＬ培養物。このほか図１６を参照されたい。
（Ｂ）ヒト特異的ｈＮＡ、ＧＦＰ、及びＫＩ６７について染色した２ＭＰＩ及び７ＭＰＩ
のマウス脳組織切片。青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：２００μｍ。このほか図１４を参
照されたい。
（Ｃ）７ＭＰＩにＮＥＵＮ、ＧＡＢＡ、ＳＳＴ、ＣＡＬＢ及びＣＡＬＲを同時発現したＵ
ｂＣ−ＲＦＰ標識ヒト細胞（矢印）の組織学的分析。青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：５
０μｍ。
（Ｄ〜Ｅ）２ＭＰＩ（黒色）、４ＭＰＩ（オレンジ色）及び７ＭＰＩ（青色）の組織学的
分析ならびにＳＳＴ、ＣＡＬＢ及びＣＡＬＲ（Ｅ）の定量化。データは平均±ＳＥＭで表
されている。
（Ｆ）ニューロビオチン（ＮＢ、緑色）の細胞内注入によって標識したｈＥＳＣ由来ニュ
ーロン。挿入画像：注入ニューロン７ＭＰＩのＲＦＰ蛍光。スケールバー：２０μｍ；挿
入画像、５μｍ。
（Ｇ）７ＭＰＩにおける閾値付近（上）及び閾値超（下）の電流注入時のＩ型（左）及び
ＩＩ型（右）ｈＥＳＣ由来ニューロンのＡＰ発火パターンのトレース。スケールバー：５
０ｍＶ及び１００ｍｓ。
（Ｈ）左のパネル：注入後にｈＥＳＣ由来ニューロンで記録された自発的ＰＳＣのトレー
ス；右上：ＢＭＩにより遅い減衰時間（矢印）を示すＰＳＣが遮断され、速い減衰時間（
矢頭）を示す残りのＰＳＣはのちのＣＮＱＸ適用によって遮断された（右下のパネル）。
スケールバー：５０ｐＡ、２．５秒及び拡大したトレースでは０．２秒（破線）。このほ
か図１４を参照されたい。

図１４．図７及び図１６に関連したマウス脳におけるｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様介在ニュー
ロン及びサブタイプの発火特性の成熟。
（Ａ）アイソタイプ抗体対照（灰色）と比較した、ほとんどのＧＦＰ＋細胞（赤色）によ
るＰＳＡ−ＮＣＡＭの高い発現を示す第３５日のＦＡＣＳ解析のヒストグラム。
（Ｂ）注入後２か月、４か月及び７か月（ＭＰＩ）のＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋及びＰＳＡ
ＮＣＡＭ＋ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞の移動及び成熟に関する免疫染色分析。７ＭＰＩま
でにヒト特異的核抗原（ＨＮＡ）＋ヒト細胞が移動し、ＧＦＰ及びＤＣＸを下方制御し、
神経成熟のマーカー、ＮＥＵＮを上方制御することができた。青色＝ＤＡＰＩ。
（Ｃ）６匹のマウスにおけるｈＥＳＣ由来ＭＧＥ様細胞遊走。２ＭＰＩ、４ＭＰＩ及び７
ＭＰＩに単一の注入部位に隣接する吻側及び尾側皮質の切片のヒト細胞を計数した。７Ｍ
ＰＩまでにいくらかの移動が検出された。注入細胞の百分率としてプロットした。
（Ｄ〜Ｇ）７ＭＰＩのＩ型及びＩＩ型ｈＥＳＣ由来介在ニューロンの発火特性。閾値付近
（上）及び閾値超（４００〜５００ｐＡ、下）の電流注入時のＩ型（Ｄ）及びＩＩ型（Ｅ
）ニューロンのＡＰ発火特性。各段（上のトレース及び下のトレース）は１個のニューロ
ンのＡＰ発火パターンを表す。上のパネル：赤色のトレースは閾値のＡＰ発火パターンを
表し；黒色のトレースは閾値の２倍のＡＰ発火パターンを表す。スケールバー：５０ｍＶ
及び２００ｍｓ。（Ｆ）Ｉ型ニューロンとＩＩ型ニューロンとの間にＡＰの特徴の差があ
ることを示す統計結果。データは平均±ＳＥＭで表されており、統計学的比較にはスチュ
ーデントのｔ検定を用いた。＊はｐ＜０．０５を表す。（Ｇ）閾値超の電流注時のＡＰ発
火頻度の分析。ＩＩ型ニューロンは迅速な順応発火特性を示した。

図１６．図７及び１４に関連したｈＥＳＣ分化プロトコル最適化、動物移植及び腫瘍発
生率のまとめ。

実施例８：ｈＥＳＣ由来ＭＧＥ前駆体様細胞
臨床グレードのＧＭＰ適合ｈＥＳＣ系列ＥＳＩ１７（図１７）、ＥＳＩ３５（図１８）
、ＥＳＩ５１（図１９）及びＨ９（図２０）がＭＧＥ前駆体様細胞に分化し（上の列）、
さらに介在ニューロンに分化した（下の列）。

図１７〜２０の上の列：第７日まで浮遊胚様体（ｓＥＢ）として培養したのち、第２８
日まで接着ＥＢ（ａＥＢ）として培養するＢ２７＋５Ｆ法によりｈＥＳＣ系列を分化させ
た。培養物を免疫蛍光染色用に固定した。接着ＥＢの細胞のほとんどがマーカーＭＧＥ（
ＮＫＸ２．１）、終脳（ＦＯＸＧ１）及びニューロン特定（ＡＳＣＬ１）のマーカーの高
い発現を示した。少数の細胞が腹側視床下部（ＮＫＸ２．２）及びオリゴデンドロサイト
前駆細胞（ＯＬＩＧ２）のマーカーを発現した。

図１７〜２０、下の列：第２８日のａＥＢ培養物を分離して単一の細胞にし、単層とし
て再播種し、Ｂ２７サプリメントを加えたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地にＢＤＮＦ、ＤＡＰ
Ｔ、ＳＨＨを添加して、または添加せずにさらに２週間培養し、同分析用に固定した。こ
の第４２日の単層培養物はＮＫＸ２．１、ニューロンマーカー（ＴＵＪ）を発現し、抑制
性ニューロンマーカー（ＧＡＢＡ）を発現し始めた。ＯＬＩＧ２発現は検出されず、ＮＫ
Ｘ２．２はまれな細胞にのみ認められた。

実施例９：ナイーブ型ヒト多能性幹細胞からのＭＧＥ前駆細胞の誘導
典型的なプライム型ＨＥＳ３（ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ）ｈＥＳＣには核内に均一なＯＣ
Ｔ４が発現するが、ナイーブ型幹細胞マーカーのＴＦＥ３は均一に発現しない（図２１、
上の列）。公開されている方法を用いて、プライム型ＨＥＳ３（ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ）
ｈＥＳＣをナイーブ型ＨＥＳ３幹細胞に変換した（Ｇａｆｎｉ及びＨａｎｎａら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２０１３）。ナイーブ型ｈＥＳＣでは、ほとんどすべての細胞の核内にＴＦＥ３
が発現した（図２１、中央の列）。Ｂ２７＋５Ｆ法を用いてナイーブ型幹細胞を分化させ
たところ、２〜６週間の接着ＥＢ培養によってＨＥＳ３ ｈＥＳＣがＭＧＥマーカーのＮ
ＫＸ２．１−ＧＦＰ、ＮＫＸ２．１及びＬＨＸ６を発現する細胞に分化した（図２１、下
の列）。

ナイーブ型ＥＳ細胞は、ｂＦＧＦのみを含む典型的な培地で増殖させた従来のヒトＥＳ
／ｉＰＳ細胞よりも未分化の状態にある。従来のｈＰＳＣの方がマウスｍＰＳＣよりも後
期段階の移植後胚盤葉上層に等価であり、マウスｍＰＳＣは初期段階の移植前内部細胞塊
の方に類似している。したがって、ナイーブ型ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の方がマウス
ＥＳ細胞に類似している。その特性（遺伝子発現及びエピジェネティクス）は移植前の胚
と同等である。これらは転写因子ＴＦＥ３の発現及び核局在及びコロニー形態によって確
認することができる。これらの特性によってナイーブ型細胞と従来のプライム型ｈＰＳＣ
が識別される。

実施例１０：ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＰＳＣから分化させたＭＧＥ前駆細胞に由来する介
在ニューロンの選択及び精製へのＭＧＥ富化エンハンサー配列の利用
様々なエンハンサー−レポーター導入遺伝子を持つトランスジェニックマウスが利用可
能である。このようなマウスでは、レポーター遺伝子がエンハンサーのＤＮＡ配列に応じ
て様々なパターン及び系列特異性で前脳に発現する（図２２Ａ〜２２Ｄ）。

ＭＧＥ富化エンハンサー配列を、トランスジェニックマウスの前脳におけるその発現パ
ターンに基づいてウイルスベクターにクローン化し、ＭＧＥを選択するように蛍光レポー
ター遺伝子及び／または抗生物質耐性遺伝子の発現を駆動させた。この構築物にはほかに
も、安定なトランスジェニックｈＰＳＣの選択及び拡大を可能にするＲｅｘ１−抗生物質
耐性カセットが含まれていた（図２２、Ｅ）。

レンチウイルスを用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ ＲＦＰレポーター遺伝子（ｉ１２ｂ−ＲＦ
Ｐ）を駆動する遺伝子間ＤＬＸ１／２ｉ１２ｂ（４２２）エンハンサーをＨＥＳ３ ＮＫ
Ｘ２．１−ＧＦＰ ｈＥＳＣ系に送達し、ｍＣｈｅｒｒｙに関するゲノムＤＮＡ ＰＣＲ
によって確認される２つの安定な細胞系（＃５及び＃１０）を生成した（図２２、Ｆ）。

この改変した細胞系をＢ２７＋５Ｆ法を用いて分化させ、分化３週間後にｉ１２ｂ−Ｒ
ＦＰ発現がＮＫＸ２．１とともに検出された（図２２、Ｇ）。ＥＢ中のｉ１２ｂ−ＲＦＰ
＋細胞はＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカーのＤＬＸ２及びニューロンマーカーのＴＵＪ
１を同時発現した（図２２、Ｈ及びＩ）。

フローサイトメトリー分析により、Ｂ２７＋５Ｆ法によって誘導した多くの細胞がＮＫ
Ｘ２．１−ＧＦＰ及びｉ１２ｂ−ＲＦＰを同時発現することが確認された（図２２、Ｊ）
。これらの培養物をＮＯＴＣＨ経路阻害剤のＤＡＰＴで処置したところ、この二重陽性を
示すＭＧＥ由来介在ニューロンの集団が著明に増加した（図２２、Ｋ）。

二重陽性（ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋及びｉ１２ｂ−ＲＦＰ＋）ＭＧＥ前駆細胞をＦＡＣ
Ｓによって精製し、ＳＣＩＤマウスの皮質に移植した。注入から数か月後、ＮＫＸ２．１
−ＧＦＰ及びｉ１２ｂ−ＲＦＰの両方を発現するヒト細胞が注入部位から拡散し、げっ歯
類灰白質周囲に統合されていることが明らかになり、これはＭＧＥ由来介在ニューロンへ
の分化を示す顕著な特徴と一致するものであった（図２２、Ｌ）。

このほか、培養ｈＰＳＣ由来ＭＧＥに由来しｉ１２ｂ−ＲＦＰを発現する介在ニューロ
ン（図２２、Ｍ）を電気生理学的方法を用いて分析した。記録ＲＦＰ＋介在ニューロンが
一連の反復性活動電位を発火したことから、そのニューロン運命が確認された（図２２、
Ｎ）。

実施例１１：長期浮遊培養を用いたＭＧＥ由来介在ニューロンの生成
正常酸素圧ガス（酸素圧２０％）中、Ｂ２７＋５Ｆ条件を用いてｓＥＢとして分化させ
たＨＥＳ３ ｈＥＳＣからＮＫＸ２．１−ＧＦＰ及びＬＨＸ６を発現するＭＧＥ介在ニュ
ーロンが生じた。この細胞を培養第３５日に分析した（図２３、Ａ列）。

正常酸素圧ガス中Ｂ２７＋５Ｆ条件を用いてｓＥＢとして分化させたＨＥＳ３ ｈＥＳ
ＣからＮＫＸ２．１−ＧＦＰ及びＬＨＸ６を発現するＭＧＥ介在ニューロンが生じた。こ
の分化プロトコルでは、（培養期間全体を通じてＳＨＨアゴニスト（プルモルファミン）
が存在した上の図２３、Ａ列とは対照的に）第２１日にＳＨＨアゴニスト（プルモルファ
ミン）を除去した。培養第３５日に細胞を分析した（図２３、Ｂ列）。

ＨＥＳ３ ｈＥＳＣを高酸素圧ガス（酸素圧４０％）中、ＫＳＲ、Ｎ２及びＢ２７サプ
リメント（逐次的に添加）ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤及び
ＳＨＨアゴニストを含むＧＭＥＭ及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。培養第３５日に
細胞を分析した（図２３、Ｃ列）。

ＫＳＲ、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（逐次的に添加）ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮ
Ｔ阻害剤、ＳＭＡＤ阻害剤及びＳＨＨアゴニスト含みマトリゲル（１〜２％）を添加した
ＧＭＥＭ及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でＨＥＳ３ ｈＥＳＣを培養した。高酸素圧ガスで培
養するとｓＥＢが５０日間超維持された。培養第６０日に細胞を分析した（図２３、Ｄ列
）。

実施例１２：ＢＭＰ及びＷＮＴシグナル伝達経路の小分子阻害剤を用いたＭＧＥ前駆細
胞の生成
以下に記載するのは、ＭＧＥ前駆細胞の生成に有用なＢＭＰ及びＷＮＴシグナル伝達経
路の小分子阻害剤のさらなる例である。分化プロトコルは実施例１に記載されている通り
である。

図２４、Ａ：ＢＭＰシグナル伝達経路及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤としてそれ
ぞれＢＭＰＲ１Ａ及びＤＫＫ１を用いたＢ２７＋５Ｆ分化プロトコルによって、ｈＥＳＣ
からＮＫＸ２．１ＧＦＰ（上）及びＦＯＸＧ１（下）を同時発現するＭＧＥ前駆細胞への
分化が誘導された（詳細に関してこのほか実施例１を参照されたい）。

図２４、Ｂ：ＢＭＰシグナル伝達経路及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤としてそれ
ぞれＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ
））及びＸＡＶ９３９（２μＭ、カタログ番号３７４８（Ｔｏｃｒｉｓ））を用いたＢ２
７＋５Ｆ分化プロトコルによって、ｈＥＳＣからＮＫＸ２．１ＧＦＰ（上）及びＦＯＸＧ
１（下）を同時発現するＭＧＥ前駆細胞への分化が誘導された。

図２４、Ｃ：ＢＭＰシグナル伝達経路及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤としてそれ
ぞれＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ
））及びＩＷＲ１ｅ（３μＭ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号１３６５
９）を用いたＢ２７＋５Ｆ分化プロトコルによって、ｈＥＳＣからＮＫＸ２．１ＧＦＰ（
上）及びＦＯＸＧ１（下）を同時発現するＭＧＥ前駆細胞への分化が誘導された。

図２４、Ｄ：ＢＭＰシグナル伝達経路及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤としてそれ
ぞれＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ、カタログ番号０４−００１９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ
））及びＩＷＰ２（５μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カタログ番号０４−００３４）を用いた
Ｂ２７＋５Ｆ分化プロトコルによって、ｈＥＳＣからＮＫＸ２．１ＧＦＰ（上）及びＬＨ
Ｘ６（下）を同時発現するＭＧＥ前駆細胞への分化が誘導された。

図２４、Ｅ：ＢＭＰシグナル伝達経路及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤としてそれ
ぞれドルサモルフィン（Ｄｏｒｓａｍｏｒｐｈｉｎ）（１μＭ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番
号Ｐ５４９９）及び（ＣＫＩ）−７（１μＭ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ０７４２）を
用いたＢ２７＋５Ｆ分化プロトコルによって、ｈＥＳＣからＮＫＸ２．１ＧＦＰ及びＮＫ
Ｘ２．１を同時発現するＭＧＥ前駆細胞への分化が誘導された。

ＢＭＰ及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤の添加のタイミングは図１Ａに図示される
通りであった。

図２４、下のパネル：フローサイトメトリーを用いて、小分子阻害剤を使用した場合の
ＮＫＸ２．１ＧＦＰ＋ＭＧＥ前駆細胞の生成効率を求めた。ＮＫＸ２．１ＧＦＰ＋ＭＧＥ
前駆細胞の生成効率は、分析した細胞のうちＮＫＸ２．１ＧＦＰ＋ＭＧＥ前駆細胞である
細胞のパーセントとして求めた。

ＢＭＰシグナル伝達経路及びＷＮＴシグナル伝達経路の阻害剤としてそれぞれＢＭＰＲ
１Ａ及びＤＫＫ１を用いたＢ２７＋５Ｆ分化プロトコルでは生成効率が８１．６％であっ
た。ＢＭＰＲ１Ａ及びＤＫＫ１の代わりにＬＤＮ１９３１８９及びＸＡＶ９３９を用いた
場合、ＮＫＸ２．１ＧＦＰ＋ＭＧＥの生成効率は８６．９％であった。ＢＭＰＲ１Ａ及び
ＤＫＫ１の代わりにＬＤＮ１９３１８９及びＩＷＲを用いたところ、８９．３％の効率で
ＮＫＸ２．１ＧＦＰ＋ＭＧＥが生成した（図２４、下のパネル）。３０，０００〜１００
，０００個の細胞を分析した。

Claims (15)

1. 霊長類内側神経節隆起（ＭＧＥ）前駆細胞が富化された細胞培養物を提供する方法であって、
   無血清培地中に霊長類多能性幹細胞を提供すること、および
   前記培地に、
   ａ）ソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）経路活性化因子と
   ｂ）ＳＭＡＤ阻害剤と
   ｃ）ｗｎｔ経路阻害剤と
   ｄ）神経誘導サプリメントと
   を含む複数の因子を導入すること
   を含み、
   前記無血清培地はノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含まず、
   ａ）〜ｄ）の前記導入が、この因子の組合せで処理されない細胞培養物に比してＭＧＥ前駆細胞が富化された細胞培養物を提供し、
   前記ＭＧＥ前駆細胞は、ＮＫＸ２．１を発現し、ＰＡＸ６を検出可能に発現しない、
   方法。
2. 前記霊長類多能性幹細胞はヒト人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記霊長類多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記霊長類多能性幹細胞はフィーダー層の非存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
5. 前記霊長類多能性幹細胞は浮遊培養で培養される、請求項１に記載の方法。
6. 前記培地は２つ以上のＳＭＡＤ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記培地はアポトーシス阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記アポトーシス阻害剤はＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である、請求項７に記載の方法。
9. ＭＧＥ前駆細胞が富化された前記細胞培養物に凍結保護物質を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 提供される前記霊長類多能性幹細胞の培養物は遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
11. 提供される前記霊長類多能性幹細胞の培養物は蛍光タンパク質を発現する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記細胞培養物から前記ＭＧＥ前駆細胞を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記単離することは、機械的手段を使用することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記単離することは、前記ＭＧＥ前駆細胞に結合する親和性試薬を使用することを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記単離することは、酵素的手段を使用することを含む、請求項１２に記載の方法。