CN117487754B - 一种内侧神经节隆起细胞的制备及给药前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具备多重分化潜能的MGE细胞的制备与给药前处理方法，属于细胞工程领域。MGE细胞的制备方法为使用制备MGE细胞的培养基对MGE细胞进行培养，所述制备MGE细胞的培养基包含基础培养基和以下成分：N2、GlutaMAX、Purmorphamine、EGF、bFGF、Dorsomorphin、SHH、CHIR99021。MGE细胞的给药前处理方法为在AggreWellTM中培养MGE细胞使其成微球。本发明通过在培养基中加入Dorsomorphin、CHIR99021、EGF、bFGF缩短了MGE细胞扩增培养时间且使其长时间传代而不丢失本身NKX2‑1表型；同时，给药前对MGE细胞进行成微球处理，可以极大提高移植细胞在宿主体内的存活率。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种内侧神经节隆起（MGE）细胞的制备方法与给药前处理方法。
背景技术
神经退行性疾病是长期存在的疾病，会导致神经细胞的持续退化或死亡。其中，多种疾病与大脑内神经兴奋和抑制失衡相关，具体表现为大脑内部的兴奋性神经元过度激活，抑制性神经元（如GABA能中间神经元）被抑制。
MGE又称之为内侧神经节突起，其于胚胎期产生于端脑腹侧，会逐渐迁移到发育中的新皮层、海马和嗅球，并在那里生成如胆碱能神经元、多种GABA 能中间神经元，如小清蛋白中间神经元（Parvalbumin, PV）、生长抑制素中间神经元（Somatostatin, SST）等。
进行MGE细胞移植可以修复这类大脑内部的兴奋性神经元被过度激活，抑制性神经元（如GABA能中间神经元）被抑制的病人大脑的神经回路，移植的细胞进一步分化成抑制性中间神经元，进而可以治疗神经元异常过度兴奋导致的疾病，如唐氏综合症、孤独症、精神分裂症、癫痫。
传统制备MGE细胞多是从流产胎儿的脑组织中提取制备，这会带来伦理上的巨大挑战；此外，本类细胞一直无法有效解决体外扩增的难题，在体外扩增时，会很容易失去分化潜能，同时也会丧失其表型。而多能干细胞（PSC）具有很强的自我更新和分化能力，是一种有前途的干细胞替代来源。人诱导多能干细胞（iPSC）是从成人体细胞人工诱导的多能干细胞，具备与胚胎干细胞同等的分化潜能，可以在体外诱导成多种不同的目标细胞，克服了与使用胚胎干细胞相关的伦理问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种内侧神经节隆起（MGE）细胞的制备方法，以及一种用于制备MGE细胞的培养基及其应用；本发明的目的还在于提供一种MGE细胞的给药前处理方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供了一种用于制备MGE细胞的培养基，其包含基础培养基和以下成分：N2添加剂、GlutaMAX添加剂、Purmorphamine、EGF（表皮生长因子）、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、Dorsomorphin、Sonic Hedgehog（SHH）、CHIR99021。所述的基础培养基优选为商业化神经元培养基中的一种或多种的混合；或所述的基础培养基优选为商业化神经元培养基中的一种或多种与DMEM/F12混合的培养基；所述的商业化神经元培养基包括ThermoFisher、BrainPhys等公司的神经元培养基，如NeurobasalA培养基、Neurobasal培养基、BrainPhys™培养基等。
优选的，所述的制备MGE细胞的培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1-20μM的Purmorphamine，1-100ng/mL的EGF，1-100ng/mL的bFGF，0.2-100μM的Dorsomorphin，2-500ng/mL的SHH，0.2-20μM的CHIR99021。
优选的，所述的制备MGE细胞的培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1-5μM的Purmorphamine，1-20ng/mL的EGF，1-20ng/mL的bFGF，0.2-10μM的Dorsomorphin，10-500ng/mL的SHH，0.2-6μM的CHIR99021。
优选的，所述的制备MGE细胞的培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，2μM的Purmorphamine，5ng/mL的EGF， 10ng/mL的bFGF，2μM的Dorsomorphin，100ng/mL的SHH，3μM的CHIR99021。
本发明还提供了上述制备MGE细胞的培养基在对MGE细胞培养中的应用。
本发明还提供了一种MGE细胞的制备方法，其包括如下步骤：使用上述制备MGE细胞的培养基对MGE细胞进行扩增培养。
所述的MGE细胞的制备方法中，MGE细胞的来源不受限制，可为通过人多能干细胞iPSC诱导分化得到，也可为胚胎多能干细胞ESC诱导分化得到。
在一些实施方案中，所述的MGE细胞通过包括如下步骤的方法获得：
（1）第0-1天，使用含Y27632的iPSC培养基对iPSC进行培养。
（2）第2-11天，使用神经诱导培养基进行培养。所述的神经诱导培养基包含以下成分：含KnockOut血清替代物（KnockOut Serum Replacement, KOSR）、GlutaMAX添加剂、Dorsomorphin、SB431542、XAV939、Purmorphamine。
（3）第12-18天，使用MGE形成培养基进行培养，得到MGE细胞。所述的MGE形成培养基包含以下成分：B27添加剂（不含VA）、GlutaMAX添加剂、Purmorphamine。
步骤（1）中，所述的Y27632的浓度优选为5-15μM，进一步优选为10μM；所述的iPSC培养基优选为mTeSR1、E8等商业化的iPSC培养基。
步骤（2）中，所述的神经诱导培养基优选为以DMEM/F12为基础培养基，包含以下浓度的成分：5-20%（体积百分含量）的KOSR，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1-10μM的Dorsomorphin，5-15μM的SB431542，1-3μM的XAV939，0.5-5μM的Purmorphamine。进一步地，所述的神经诱导培养基以DMEM/F12为基础培养基，包含以下浓度的成分：15%的KOSR，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，5μM的Dorsomorphin，10μM的SB431542，2μM的XAV939，1μM的Purmorphamine。
步骤（3）中，所述的MGE形成培养基优选以上述制备MGE细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的B27添加剂（不含VA），终浓度1×的GlutaMAX添加剂，0.5-5μM的Purmorphamine。进一步地，所述的MGE形成培养基以上述制备MGE细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的B27添加剂（不含VA），终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1μM的Purmorphamine。
本发明中所涉及的各培养基中还可加入终浓度1×的P/S（双抗），以避免污染。
本发明还提供了一种MGE细胞的给药前处理方法，其包括如下步骤：将通过上述制备方法扩增得到的MGE细胞接入到给药前处理培养基中在AggreWell™培养板中培养24h-72h，使MGE细胞成微球。所述的给药前处理培养基包含以下成分：N2添加剂、DAPT和神经营养因子，用于增强宿主海马体中移植来源细胞的存活和分化。所述的神经营养因子包括BDNF（脑源性神经营养因子）、NGF（神经生长因子）、GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）、NT3（神经营养素3）等神经营养因子中的一种或多种。
优选的，所述的给药前处理培养基优选以上述制备MGE细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，0.5-50μM的DAPT，2-200ng/mL的BDNF，2-200g/mL的NGF。
优选的，所述的给药前处理培养基优选以上述制备MGE细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，1-5μM的DAPT，10-30ng/mL的BDNF，10-30ng/mL的NGF。
优选的，所述的给药前处理培养基以上述制备MGE细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，2μM的DAPT，20ng/mL的BDNF，20ng/mL的NGF。
本发明中所涉及的细胞培养的培养条件均优选为37℃、5% CO2。
本发明的优点和有益效果：
（1）本发明的制备MGE细胞的培养基中，加入Dorsomorphin能够使MGE细胞长时间传代而不丢失NKX2-1表型，加入CHIR99021、EGF、bFGF能够大幅缩短MGE细胞传代培养的时间。使用本发明的制备MGE细胞的培养基对MGE细胞进行扩增培养，能够使其快速扩增（每4天可传1代）、且NKX2-1表型在传至10代时仍维持在90%以上。
（2）将扩增得到的MGE细胞经给药前处理使MGE细胞形成3D微球，再将3D微球球细胞移植到小鼠体内，可大大提高MGE细胞在小鼠体内的存活率。
附图说明
图1为原代MGE细胞的鉴定结果，DAPI为细胞和标记物，SOX2为神经干细胞的标记物，NKX2-1为MGE的标记物。
图2为联合应用CHIR99021和bFGF对MGE细胞增殖的影响。
图3为联合应用CHIR99021、bFGF与Dorsomorphin对于MGE表型维持的影响。
图4为移植前微球处理对移植MGE细胞长期存活的影响。左侧为移植前没有成微球处理的MGE细胞，右侧为微球处理的MGE细胞。可见以微球形式移植的MGE细胞在移植后15天存活率显著提高。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
本文中所使用的术语应理解为本领域中通常所使用的含义，除非另有定义。若存在矛盾，本说明书优先。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例13D转2D的MGE细胞制备过程和鉴定
（1）D0-D1：按照9000cells/孔将iPSC接种到96孔板中培养，每个孔培养基总量为150μL，所用培养基为mTeSR1，加入10μM的Y27632。
（2）D2-D11：D2、D4、D6、D8、D10均进行2/3换液，即吸出原培养基100μL，补充新的神经诱导培养基100μL。其中，所述的神经诱导培养基以DMEM/F12为基础培养基，包含以下浓度的成分：15%的KOSR，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，5μM的Dorsomorphin，10μM的SB431542，2μM的XAV939，1μM的Purmorphamine。
（3）D12-D18：D12进行Matrigel包被已形成的拟胚体（EB）。加入15μL Matrigel 37℃孵育30min后，用MGE形成培养基冲洗EB至新的六孔板中培养，期间3-4d换液一次，D14（即Matrigel包被48h后）将孔板放在摇床上继续培养。其中，所述的MGE形成培养基以Neurobasal A为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的B27添加剂（不含VA），终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1μM的Purmorphamine。
上述EB生长成为类脑球，继续培养到D18进行消化。消化过程中，用直刀把MGE类脑球切碎，然后加入消化试剂TryPLE。37℃消化25min左右，中间每5-10min吹打一次，同时用台盼蓝测定细胞活率（细胞活率为80-95%）；观察到无明显沉淀物后，加入PBS+10% FBS终止，离心，用培养基重悬，计数。
对上述第18天获得的细胞进行免疫荧光染色鉴定，结果（图1）显示成功获得MGE细胞。免疫荧光染色的具体操作步骤为：用PBS清洗细胞，用4%多聚甲醛固定30分钟；用含5%正常驴或山羊血清、0.1% Triton X-100的PBS封闭1h；一抗在4℃孵育过夜，二抗在室温孵育1小时，都用含0.3% Triton X-100和5%正常驴或山羊血清PBS稀释；洗涤细胞，用含DAPI的Vectashield装载样品（封片剂封片）；用共焦激光扫描显微镜分析样品。其中，使用的第一种抗体是NKX2.1，稀释度为1:50，货号为12373S，品牌为CST。第二种抗体是MKI67，稀释度为1:400，货号为9449S，品牌为CST。第三种抗体是SOX2，稀释度为1:400，货号为4900S，品牌为CST。
（4）D18-D60：将步骤（3）消化得到的MGE细胞（P0代细胞）按照5×10^5cells/孔接种到包被有Matrigel（Corning#354277）的六孔板上培养，每孔培养基总量为2mL，所用培养基为制备MGE细胞的培养基。使用制备MGE细胞的培养基对MGE细胞进行传代培养，每3-4天传代一次，传至第10代时NKX2-1表型仍维持在90%以上。其中，所述的制备MGE细胞的培养基以Neurobasal A为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，2μM的Purmorphamine，5ng/mL的EGF， 10ng/mL的bFGF，2μM的Dorsomorphin，100ng/mL的SHH，3μM的CHIR99021。
实施例2联合应用不同浓度CHIR99021和bFGF对MGE细胞扩增的影响
1、CHIR99021（CHIR）、bFGF共同作用对于Ki67增殖效率的维持作用
按照实施例1中的方法制备MGE细胞，区别在于所用的制备MGE细胞的培养基中的CHIR99021（CHIR）、bFGF的含量不同，具体见下表1，第60天时进行免疫荧光染色，统计Ki67（细胞增殖相关蛋白标记物）阳性细胞比例，筛选合适的条件，以提高MGE细胞扩增率，保证制备足够细胞量。
免疫荧光染色的方法具体为：用1×PBS清洗细胞，然后用4%多聚甲醛室温避光固定30分钟。用PBS清洗2次后，用含有5%正常驴血清或山羊血清、0.3% Triton X-100的PBS封闭非特异性结合位点1h。一抗在4℃孵育过夜，然后用PBS清洗5次（2min/次）。二抗在室温下孵育1小时。一抗和二抗都用含0.3% Triton X-100和5%正常驴或山羊血清的PBS稀释。随后，洗涤细胞（用PBS，5次，每次2min）。最后，用含DAPI的Vectashield将样本装载到载玻片上。样品在分析前保存在4℃黑暗处。使用共焦激光扫描显微镜（Leica TCS-SP8 STED 3X，莱卡）扫描成片。
表1
结果见图2，只使用CHIR或只使用bFGF进行扩增，效率均一般，与对照组无明显的差异；CHIR和bFGF混用，能显著提高扩增效率，尤其是bFGF在较高浓度下，扩增速度较快；CHIR在3μM效率较高，6μM效率较低；3μM CHIR+10ng/mL bFGF的组合用于扩增效率最高。
2、CHIR99021（CHIR）&bFGF与Dorsomorphin（Dorso）共同作用对于NKX2-1的维持作用
按照实施例1中的方法制备MGE细胞，区别在于所用的制备MGE细胞的培养基中的CHIR99021（CHIR）、bFGF、Dorsomorphin（Dorso）的含量不同，具体见下表2，第60天时进行免疫荧光染色，统计NKX2-1（MGE细胞身份标记物）阳性细胞比例。
表2
结果见图3，针对CHIR+bFGF组合，虽然能够提高KI67增殖效率，但是不管是单独使用CHIR还是CHIR与bFGF进行组合，均导致了连续传代后，NKX2-1表型的逐渐消失；在体系中添加Dorso后，NKX2-1的表型明显得到了保持，即使在与CHIR和bFGF进行组合后，NKX2-1表型有轻微下降，但是也依旧保持在一个较高的比例；对Dorso浓度进行调整，发现2μM和5μM无明显差异。
通过上述结果选定制备MGE细胞的培养基中CHIR 3μM、bFGF 10ng/mL、Dorso 2μM为最佳条件。
实施例3MGE细胞给药前处理对移植存活的影响
按照实施例1中的方法，制备MGE细胞的培养基中的CHIR、bFGF、Dorso浓度选择实施例2中的最佳条件，扩增培养MGE细胞，在第60天时收取MGE细胞。
将MGE细胞用给药前处理培养基重悬，接种在AggreWell™培养板（24孔板规格）中，每孔约3000个细胞，培养48h使MGE细胞成微球。同时设普通的24孔板作为对照。所述的给药前处理培养基以Neurobasal A为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，2μM的DAPT，20ng/mL的BDNF，20ng/mL的NGF。
收取经给药前处理培养基培养的MGE细胞，DIR活细胞染料染色细胞，染色条件为：1.25mg/mL，37℃处理15min。染色后的MGE细胞通过显微注射于小鼠双侧海马给药，立体定向注射到小鼠海马内，一只小鼠单侧海马给药细胞数为20万，用2μL PBS重悬后给药。给药后15天使用活体荧光成像仪（PerkinElmer, IVIS Spectrum）在754/788nm波长下进行呈现拍摄。给药15天后给药细胞活体成像结果见图4，MGE细胞经成微球处理后移植存活率得到大大提升。
Claims (7)
1.一种用于制备MGE细胞的培养基，其特征在于：由基础培养基和以下浓度的成分组成：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1-5μM的Purmorphamine，1-20ng/mL的EGF，1-20ng/mL的bFGF，0.2-10μM的Dorsomorphin，10-500ng/mL的SHH，0.2-6μM的CHIR99021。
2.根据权利要求1所述的用于制备MGE细胞的培养基，其特征在于：所述的基础培养基为商业化神经元培养基中的一种或多种的混合，或所述的基础培养基为商业化神经元培养基中的一种或多种与DMEM/F12混合的培养基；所述的商业化神经元培养基包括NeurobasalA培养基、Neurobasal培养基、BrainPhys™培养基。
3.根据权利要求1所述的用于制备MGE细胞的培养基，其特征在于：由基础培养基和以下浓度的成分组成：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，2μM的Purmorphamine，5ng/mL的EGF，10ng/mL的bFGF，2μM的Dorsomorphin，100ng/mL的SHH，3μM的CHIR99021。
4.权利要求1-3任一项所述的用于制备MGE细胞的培养基在MGE细胞培养中的应用。
5.一种MGE细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：使用权利要求1-3任一项所述的用于制备MGE细胞的培养基对MGE细胞进行扩增培养；
所述的MGE细胞的来源包括：iPSC诱导而来的MGE细胞、ESC诱导而来的MGE细胞。
6.根据权利要求5所述的MGE细胞的制备方法，其特征在于：所述的MGE细胞通过包括如下步骤的方法获得：
（1）第0-1天，使用含Y27632的iPSC培养基对iPSC进行培养；
（2）第2-11天，使用神经诱导培养基进行培养；所述的神经诱导培养基包含以下成分：KOSR、GlutaMAX添加剂、Dorsomorphin、SB431542、XAV939、Purmorphamine；
（3）第12-18天，使用MGE形成培养基进行培养，得到MGE细胞；所述的MGE形成培养基包含以下成分：B27添加剂、GlutaMAX添加剂、Purmorphamine；
步骤（1）中，所述的Y27632的浓度为5-15μM；所述的iPSC培养基包括mTeSR1、E8；
步骤（2）中，所述的神经诱导培养基以DMEM/F12为基础培养基，包含以下浓度的成分：5-20%的KOSR，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1-10μM的Dorsomorphin，5-15μM的SB431542，1-3μM的XAV939，0.5-5μM的Purmorphamine；
步骤（3）中，所述的MGE形成培养基以权利要求2中所述的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的B27添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，0.5-5μM的Purmorphamine。
7.一种MGE细胞的给药前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：将通过权利要求5或6所述的制备方法扩增得到的MGE细胞接入到给药前处理培养基中在AggreWellTM培养板中培养，使MGE细胞成微球；
所述的给药前处理培养基由权利要求2中所述的基础培养基和以下浓度的成分组成：终浓度1×的N2添加剂，1-5μM的DAPT，10-30ng/mL的BDNF，10-30ng/mL的NGF。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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