CN111690612A - 通过调控Wnt信号和/或Notch信号扩增人神经前体细胞的方法 - Google Patents

通过调控Wnt信号和/或Notch信号扩增人神经前体细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种通过调控Wnt信号和/或Notch信号扩增人神经前体细胞的方法。本发明提供一种人神经前体细胞的培养方法，包括：在合适条件下培养Wnt信号和/或Notch信号被外源性调控的人神经前体细胞。本发明发明人在人神经定向分化的细胞培养体系中，通过外源性的激活、抑制或过表达Wnt信号和/或Notch信号，从而外源性地干扰了神经前体细胞的发育过程，增强了神经前体细胞的增殖能力，促进神经前体细胞大量且长时间增殖，同时保持其正常的分化为各种特定类型神经元的潜能，从而提供了一种可以体外大规模获得具有不断增殖能力和正常神经分化潜能的神经前体细胞的方法。

Description

通过调控Wnt信号和/或Notch信号扩增人神经前体细胞的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种通过调控Wnt信号和/或Notch信号扩增人神经前体细胞的方法。
背景技术
作为临床上最常见的神经系统重症疾病，阿尔兹海默症和癫痫症发病后致残率高、监护成本昂贵。虽然目前对于这类疾病有一些常规的治疗手段，包括抗胆碱酯酶抑制剂或抗癫痫等药物治疗、手术治疗和护理康复治疗，但是这些手段只能在发病早期起到有限的治疗效果，并不能从根本上解决问题，对病情的发展作用有限。从疾病的病理角度看，阿尔兹海默症的起因则是β淀粉样蛋白首先损伤基底前脑胆碱能神经元，而癫痫症主要是由于GABA能中间神经元功能不全导致兴奋-抑制平衡破坏而产生。科学报道已经证实，人胚胎干细胞(hESC)在特定条件下能够靶向分化为各种神经前体细胞，并且更进一步分化为各种类型的特定神经细胞，包括基底前脑胆碱能神经元和前脑腹侧GABA能抑制性中间神经元。在小鼠疾病模型中，在脑部病灶部位移植相应的神经前体细胞或是神经细胞已被确认可以纠正阿尔兹海默症和癫痫症的疾病表型。在这些科学实验的基础上，因为只有纠正了疾病的致病因素才能从根本上治疗和治愈疾病，所以在患者病灶部位移植外源神经前体细胞，使其在体内分化为那些受损的或丢失的神经细胞，重新建立或修复神经环路，恢复神经功能，是治疗阿尔兹海默症和癫痫症最具有潜力的治疗手段之一。
从神经发育的角度出发，在外胚层神经上皮细胞分化发育和区域化的过程中，前脑腹侧(Nkx2.1+)MGE神经前体细胞向下游将最终分化为前脑胆碱能神经元(BFCN)和前脑腹侧GABA抑制性中间神经元。在这些分化细胞中，BFCN参与人类学习和记忆，是阿尔茨海默病发病过程中首先发生变性的神经细胞，而GABA抑制性神经元的功能退化会引发癫痫症。
基于上述的细胞替代治疗在阿尔兹海默症和癫痫症中的重要作用，在体外大规模获得具有生理活性和神经分化潜能的人前脑腹侧神经前体细胞成为当下治疗阿尔兹海默症和癫痫症的当务之急。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种通过调控Wnt信号和/或Notch信号扩增人神经前体细胞的方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种人神经前体细胞的培养方法，包括：在合适条件下培养Wnt/Notch信号被外源性调控的人神经前体细胞。
在本发明一些实施方式中，所述外源性调控包括外源性激活和/或外源性抑制和/或外源性过表达。
在本发明一些实施方式中，通过Wnt信号激动剂外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Wnt信号，优选为在Wnt信号激动剂存在的条件下培养人神经前体细胞。
在本发明一些实施方式中，通过外源性Wnt蛋白外源性激活人神经前体细胞的Wnt信号，优选为在外源性Wnt蛋白存在的条件下培养人神经前体细胞。
在本发明一些实施方式中，通过基因编辑外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Wnt信号，优选为利用过表达β-catenin、Wnt配体蛋白、激活的Wnt受体蛋白激活和/或过表达人神经前体细胞的Wnt信号。
在本发明一些实施方式中，通过Wnt信号抑制剂外源性抑制人神经前体细胞的Wnt信号，优选为在Wnt信号抑制剂存在的条件下培养人神经前体细胞。
在本发明一些实施方式中，通过基因编辑外源性抑制人神经前体细胞的Wnt信号，优选为利用抑制β-catenin、Wnt配体蛋白、Wnt受体蛋白、TCF/LEF的表达抑制人神经前体细胞的Wnt信号。
在本发明一些实施方式中，通过Notch信号激动剂外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Notch信号，优选为在Notch信号激动剂存在的条件下培养人神经前体细胞；
在本发明一些实施方式中，通过Notch信号抑制剂外源性抑制人神经前体细胞的Notch信号，优选为在Notch信号抑制剂存在的条件下培养人神经前体细胞。
在本发明一些实施方式中，所述Wnt信号激动剂选自CHIR99021、SKL2001、Wntagonist1中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述所述外源性Wnt蛋白选自Wnt3a、Wnt1中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，Wnt信号抑制剂选自DKK-1、XAV-939、IWP-2、IWR-1-endo中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述Notch激活剂选自重组人源nuclear factor-κB(rhNF-κB)、JAG1重组蛋白、JAG2重组蛋白中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述Notch抑制剂选自DAPT、MK-0752、RO4929097、IMR-1、FLI-06、LY450139中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，被调控的Wnt信号包括Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt7A、Wnt7B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt16、FZD9、LRP5、LRP6中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，被调控的Notch信号包括JAG1、NOTCH2、HEY1、HEY2、HES1、HES2、HES3中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述人神经前体细胞为人前脑皮层前体细胞和/或人前脑腹侧MGE前体细胞，所述人前脑腹侧MGE前体细胞为被诱导因子腹侧化的MGE前体细胞。
本发明另一方面提供一种人神经前体细胞，由所述的人神经前体细胞的培养方法培养获得。
本发明另一方面提供所述的人神经前体细胞在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述神经退行性疾病选自急性神经退行性疾病和/或慢性神经退行性疾病。
在本发明一些实施方式中，所述神经退行性疾病选自脑缺血、脑损伤、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓小脑共济失调、Pick病。
附图说明
图1显示为本发明人前脑腹侧MGE前体细胞在形成过程中激活Wnt信号示意图。
图2显示为本发明Wnt信号调控MGE前体细胞的细胞命运示意图。
图3显示为本发明Wnt信号调控MGE前体细胞的增殖和神经分化示意图。
图4显示为本发明Wnt信号通过激活Notch信号调控MGE前体细胞的细胞命运示意图。
图5显示为本发明抑制Notch信号可阻断Wnt信号对MGE前体细胞增殖的调控示意图。
图6显示为本发明化学性激活Wnt信号通过激活Notch信号调控MGE前体细胞的增殖和神经分化示意图。
图7显示为持续化学性激活Wnt信号可大规模扩增具有正常生理功能的MGE神经前体细胞示意图。
具体实施方式
本发明发明人通过大量探索性研究，提供了一种新的人神经前体细胞的培养方法，所述培养方法可以通过激活Wnt信号和/或Notch信号，促进神经前体细胞大量且长时间增殖，同时保持其原有的神经分化潜能，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种人神经前体细胞的培养方法，包括：在合适条件下培养Wnt信号和/或Notch信号被外源性调控的人神经前体细胞。人神经前体细胞又被称为神经干细胞(neural stem cell)，通常具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等潜能，获取人神经前体细胞的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，通常来说，可以通过培养人多能干细胞(hPSC)，并进一步分化为EB、NE，从而获得人神经前体细胞。在本发明一具体实施例中，所使用的培养基可以是包括但不限于hPSCM、NIM等培养基；在本发明另一具体实施例中，培养基(例如，hPSCM等)中还可以包括但不限于bFGF等因子。培养人神经前体细胞的合适条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，通常来说，可以在合适的培养基中和生长因子或诱导因子存在的条件下，维持或提升人神经前体细胞的生理活性(例如，提升人神经前体细胞的增殖能力)和分化潜能(例如，抑制人神经前体细胞的分化能力)，在本发明一具体实施例中，所使用的培养基可以是包括但不限于NIM等培养基；在本发明另一具体实施例中，培养基(例如，NIM等)中还可以包括但不限于Shh、Purmorphamine等因子。所述人神经前体细胞还可以被进一步分化为神经元，将人神经前体细胞分化为神经元的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所使用的培养基可以是包括但不限于NDM等培养基；在本发明另一具体实施例中，培养基(例如，NDM等)中还可以包括但不限于BDNF、GDNF、IGF等因子。
本发明所提供的人神经前体细胞的培养方法中，所述外源性调控通常相对于人神经前体细胞内源性地产生Wnt信号和/或Notch信号而言，所述外源性调控通常指通过人为干预，使人神经前体细胞内Wnt信号和/或Notch信号(例如，Wnt信号通路和/或Notch信号通路)发生变化，例如，激活、抑制、过表达等。所述激活或过表达可以是指Wnt信号和/或Notch信号在基因水平和/或蛋白水平发生变化，例如，可以是Wnt信号和/或Notch信号下游蛋白中的一个或多个的基因水平的表达量(例如，mRNA表达量)和/或蛋白水平的表达量各自独立地被提升至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少3000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％，参照对象可以是被调控前对应的Wnt信号和/或Notch信号的蛋白表达量。所述抑制可以是指Wnt信号和/或Notch信号在基因水平和/或蛋白水平发生变化，例如，可以是Wnt信号和/或Notch信号下游蛋白中的一个或多个的基因水平的表达量(例如，mRNA表达量)和/或蛋白水平的表达量各自独立被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，参照对象可以是被调控前对应Wnt信号和/或Notch信号的蛋白表达量。如上所述，本发明中所述的Wnt信号和/或Notch信号被激活、抑制、过表达等可以通过Wnt信号和/或Notch信号下游蛋白的基因水平的表达量和/或蛋白水平的表达量体现，所述Wnt信号下游蛋白可以是Wnt家族中所包括的各种Wnt配体、Wnt受体或Wnt效应器分子，例如，所述被调控的Wnt信号配体蛋白可以是包括但不限于Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt7A、Wnt7B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt16等中的一种或多种的组合，再例如，所述被调控的Wnt信号受体蛋白可以是包括但不限于FZD9、LRP5、LRP6等中的一种或多种的组合，再例如，所述被调控的Wnt信号下游效应器分子可以是包括但不限于β-catenin、TCF/LEF等中的一种或多种的组合；所述Notch信号下游蛋白可以是包括但不限于JAG1、NOTCH2、HEY1、HEY2、HES1、HES2、HES3等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的人神经前体细胞的培养方法中，对人神经前体细胞进行外源性干预以调控Wnt信号的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，所述外源性调控可以是包括但不限于外源性激活和/或外源性抑制和/或外源性过表达。例如，可以通过Wnt信号激动剂外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Wnt信号，本领域技术人员可选择合适的Wnt信号激动剂，以外源性激活和/或外源性过表达Wnt信号，例如，可以在Wnt信号激动剂存在的条件下培养人神经前体细胞，从而外源性激活和/或外源性过表达Wnt信号，在本发明一具体实施例中，所述Wnt信号激动剂可以是包括但不限于CHIR99021、SKL2001、Wntagonist1等中的一种或多种的组合，激动剂在培养基中的浓度可以为5μM-0.5μM左右。再例如，可以通过外源性Wnt蛋白(Wnt配体)外源性激活人神经前体细胞的Wnt信号，具体可以在外源性Wnt蛋白存在的条件下培养人神经前体细胞，所述外源性Wnt蛋白可以是包括但不限于Wnt3a、Wnt1等中的一种或多种的组合。再例如，可以通过基因编辑外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Wnt信号，通过基因编辑方法以激活Wnt信号的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过激活和/或过表达Wnt信号通路的上游基因，从而外源性激活和/或外源性过表达Wnt信号，在本发明一具体实施例中，可以利用过表达β-catenin、Wnt配体蛋白、激活的Wnt受体蛋白等激活和/或过表达人神经前体细胞的Wnt信号。再例如，可以通过Wnt信号抑制剂外源性抑制人神经前体细胞的Wnt信号，本领域技术人员可选择合适的Wnt信号抑制剂，以外源性抑制Wnt信号，例如，可以在Wnt信号抑制剂存在的条件下培养人神经前体细胞，从而外源性抑制Wnt信号，在本发明一具体实施例中，所述Wnt信号抑制剂可以是包括但不限于DKK-1、XAV-939、IWP-2、IWR-1-endo等中的一种或多种的组合。再例如，可以通过基因编辑外源性抑制人神经前体细胞的Wnt信号，通过基因编辑方法以抑制Wnt信号的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过抑制Wnt信号通路的上游基因，从而外源性抑制Wnt信号，在本发明一具体实施例中，可以利用抑制β-catenin、Wnt配体蛋白、Wnt受体蛋白、TCF/LEF等的表达从而抑制人神经前体细胞的Wnt信号。
本发明所提供的人神经前体细胞的培养方法中，对人神经前体细胞进行外源性干预以调控Notch信号的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，所述外源性调控可以是包括但不限于外源性激活和/或外源性抑制和/或外源性过表达。例如，可以通过Notch信号激动剂外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Notch信号，本领域技术人员可选择合适的Notch信号激动剂，以外源性激活和/或外源性过表达Notch信号，例如，可以在Notch信号激动剂存在的条件下培养人神经前体细胞，从而外源性激活和/或外源性过表达Notch信号，在本发明一具体实施例中，所述Notch信号激动剂可以是包括但不限于nuclearfactor-κB(rhNF-κB)、JAG1重组蛋白、JAG2重组蛋白等中的一种或多种的组合。再例如，可以通过Notch信号抑制剂外源性抑制人神经前体细胞的Notch信号，本领域技术人员可选择合适的Notch信号抑制剂，以外源性抑制Notch信号，例如，可以在Notch信号抑制剂存在的条件下培养人神经前体细胞，从而外源性抑制Notch信号，在本发明一具体实施例中，所述Notch信号抑制剂可以是包括但不限于DAPT、MK-0752、RO4929097、IMR-1、FLI-06、LY450139等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的人神经前体细胞的培养方法中，所述人神经前体细胞可以为人前脑皮层前体细胞和/或人前脑腹侧MGE前体细胞(前脑腹侧神经前体细胞)。在人神经前体细胞培养过程中，所述人前脑腹侧MGE前体细胞可以是通过诱导因子腹侧化获得的人前脑腹侧MGE前体细胞，人前脑腹侧MGE前体细胞可以进一步向下游分化，最终分化为前脑胆碱能神经元(BFCN)和前脑腹侧GABA抑制性中间神经元。在本发明一具体实施例中，所述诱导因子可以是包括但不限于Shh和Purmorphamine等中的一种或多种的组合。
本发明第二方面提供一种人神经前体细胞，由本发明第一方面所提供的人神经前体细胞的培养方法培养获得。
本发明第三方面提供本发明第二方面所提供的人神经前体细胞在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。所述神经退行性疾病可以是包括但不限于急性神经退行性疾病和/或慢性神经退行性疾病等，更具体的，所述急性神经退行性疾病可以是包括但不限于脑缺血(CI)、脑损伤(BI)、癫痫等，所述慢性神经退行性疾病可以是包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、不同类型脊髓小脑共济失调(SCA)、Pick病(Pick’s disease)等。
本发明发明人在神经定向分化的细胞培养体系中，通过外源性的激活、抑制或过表达Wnt信号，从而外源性地干扰了神经前体细胞的发育过程，增强了神经前体细胞的增殖能力，促进神经前体细胞大量且长时间增殖，同时保持其正常的神经分化潜能，从而提供了一种可以体外大规模获得具有不断增殖能力和正常分化潜能的神经前体细胞的方法。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
1、人胚胎干细胞的复苏与培养：
(1)将DMEM/F12培养基、人胚胎干细胞(hES)培养基在37℃的水浴锅中预热。
(2)取铺好MEF的6孔板，吸走MEF培养基，每孔加入2ml DMEM/F12培养基，轻轻摇晃后吸掉DMEM/F12培养基，向每孔中加入含有的hES培养基2ml，放回37℃培养箱。
(3)从液氮罐中取出冻存的hES细胞，在37℃水浴中轻轻晃动使其快速解冻。
(4)将解冻的hES细胞加入到含有6ml hES培养基的15ml离心管中，轻轻混匀，1100rpm离心1min。
(5)吸掉上清，取出加入hES培养基的MEF板，用0.5ml hES培液重悬细胞，将细胞加入到6孔板内，十字混匀，放入37℃培养箱中培养。
(6)12-15小时后吸掉培液，再加入2.5ml的新鲜的含有bFGF的hES培养基，放入37℃继续培养，此后每天更换含有bFGF的新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液0.5ml，加入新鲜培液2ml，根据细胞生长的状态，一般5天左右待细胞长到合适大小时传代。
2、人胚胎干细胞的传代：
(1)将DMEM/F12、Dispase、hES培养基在37℃的水浴锅中预热。
(2)处理MEF平板，取出铺有MEF的6孔板，吸走MEF培养基，每孔加入2mlDMEM/F12，轻轻摇晃后吸掉DMEM/F12，向每孔中加入含有bFGF的hES培养基2.5ml，放回37℃培养箱。
(3)取需要传代的hES细胞，吸掉培液，每孔加入2ml DMEM/F12，轻轻摇晃后吸掉DMEM/F12，加入1ml预热的Dispase，放入37℃培养箱中消化3min，显微镜下观察至细胞边缘微微卷起可终止消化。
(4)吸掉Dispase，沿着六孔板的壁缓慢加入2ml DMEM/F12，轻轻摇晃一下，用泵吸掉DMEM/F12。
(5)向每孔加入1ml hES培养基，用10ml移液管取4ml hES培养基在细胞表面划线，横竖各四次，将细胞划开，避免大块脱落。
(6)用10ml移液管将细胞收集，移至50ml离心管中，观察细胞大小，吸取较大的团块，抵着管底吹打，直至将细胞团块大小吹成合适大小约100μm。
(7)将细胞转移至15ml离心管中，1100rpm离心1min，按照1：6进行传代，即一个孔的细胞传至6个孔中。
(8)弃上清，将细胞均匀的加入含有hES培液的MEF板中，放入细胞培养箱，十字混匀。
3、人胚胎干细胞的神经分化
(1)取3-6个孔的hES细胞，消化步骤参照传代，此步不用在细胞表面划线，用10ml的hES培养基收集所有的细胞，最后吹的细胞团块大小约200μm。
(2)将细胞团块转移至15ml离心管中，1100rpm离心1min，弃上清，用10ml hES培养基重悬细胞沉淀，转移至T75培养瓶中，再补加30ml hES培养基，培养瓶平放入37℃细胞培养箱中，标记为分化的第0天。
(3)分化的第1天，此时为早期的拟胚体(EB球)，将T75培养瓶中的EB球转移至50ml离心管中，细胞自然沉降后弃上清，用新鲜的hES培养基重悬细胞，将细胞转移至新的T75培养瓶中，于细胞培养箱中继续培养。
(4)分化的第2天和第3天，每天半换液，即将T75倾斜使细胞自然沉降至底部，用泵吸掉一半的上清液，并加入新鲜的培养基。
(5)细胞分化至第4天，将细胞转移至50ml离心管中，自然沉降后丢弃上清，加入5ml左右的DMEM/F12培养基清洗细胞沉淀，再次沉降后弃上清。
(6)用NIM重悬细胞，转移至新的T75培养瓶中，放入细胞培养箱中继续培养。
(7)细胞继续分化至第6-7天(中间无需换液)，将EB球转移至50ml离心管中，自然沉降后弃上清，用加入10％的FBS的NIM重悬EB球，然后均匀的放入6孔板中，每个六孔板中的孔内的1.5ml的培养基中含有40-50个EB球，用200μl枪头挑出过大或分化不好的EB球，放入细胞培养箱，十字交叉摇匀。
(8)12-16个小时之后，吸掉六孔板内的液体，在每个孔中贴壁缓慢加入2ml的DMEM/F12培养基清洗残留的FBS，稍微摇晃后吸掉培液，每个孔中加入2ml NIM，放入细胞培养箱中。
(9)分化的第8至第17天，每两天换一次液体，去掉没贴壁的和分化不好的细胞，换液时将六孔板中的液体全部吸掉，加入新鲜的NIM。细胞分化到第10天，已经分化形成早期的神经上皮细胞(Neuroepithelial cell，NE)，开始出现玫瑰花环状结构(rosette)，若分化过程中需要对细胞进行区域化的诱导，需要在第10天左右加入相关的可塑性因子，如加入Shh和Purmorphamine促进向腹侧分化。
(10)细胞分化至第17天，吸掉培液，每个孔重新加入2ml NIM，用1ml的移液枪沿着Rosette边缘吹打细胞团块，控制力度使其尽量完整的被吹下。将所有的细胞团块转移至15ml离心管中，1100rpm离心1min，弃上清，用200μl的移液枪将沉淀转移至1.5ml的EP管中，吹打为合适大小的团块，转移至低吸附的10cm dish中，加入10ml的NIM培养液并按照1：50的比例加入B27，混匀，放于培养箱中培养。Wnt信号的激活可以在细胞分化的第17天进行，激活方法可以是在培养液中加入Wnt激活剂CHIR99021，加入终浓度为2μM，若使用的是可诱导的过表达β-catenin的细胞，可以在培养液中加入Dox诱导β-catenin表达，加入终浓度为0.1μg/ml。
(11)第二天，将细胞转移至15ml的离心管中，自然沉降，去上清，将细胞在新的低吸附的10cm dish中重新悬浮，加入同样浓度的CHIR99021或Dox，每两天半换液。
(12)重悬后的细胞培养至第25天，形成早期的神经前体细胞球体，根据细胞状态可进行神经元的分化。
4、人胚胎干细胞由来的神经元的形成
(1)将DMEM/F12，Acctuase，NDM溶液放置于37℃的水浴锅中预热。
(2)Metrigel按照1：50的比例用NDM稀释，每个孔300μl加入6孔板中，至6板中的中间。
(3)将sphere球转移至1.5ml的EP管中，自然沉降，弃上清，加入1ml的DMEM/F12洗掉残余的NIM培液，洗净上清，加入300μl的acctuase消化酶，于37℃的培养箱中消化3min。
(4)弃去上清，用DMEM/F12洗两遍，1100rpm 1min，弃上清。
(5)每个EP管中加入200μl的NDM培养基，用200μl的黄枪头抵着管底吹打，将sphere吹打成单细胞或小团块。
(6)将BDNF,GDNF,IGF按照终浓度10ng/ml加入预热好的NDM中，用其重悬上述的单细胞或者小团块。
(7)将细胞悬浊液加入处理好的六孔板中(需要染色时，将100μl的细胞悬浊液加入处理好的CoverSlip上)，用黄枪头吹打均匀，置于细胞培养箱中培养。
(8)两个小时后取出六孔板，观察细胞，可以看到大部分的细胞已经开始突触的生长，为成熟中的神经元细胞。沿着孔壁缓慢的将NDM培养基添加至2.5ml，于培养箱中继续培养。
(9)观察细胞，每2-3天半换液。
5、β-catenin-RE细胞系或HA-β-catenin-RE细胞系的构建
(1)rtTA细胞系的构建：
在hES(H9)细胞中，以同源重组的方式在EEF1A1基因启动子的上游插入一段CAG-rtTA-IRES-BSD DNA序列。(这个细胞系的构建方法已发表，具体见：Chi L,Fan B,Feng D,Chen Z,Liu Z,Hui Y,Xu X,Ma L,Fang Y,Zhang Q,Jin G,Liu L,Guan F,Zhang X.TheDorsoventral Patterning of Human Forebrain Follows an Activation/Transformation Model.Cereb Cortex.2017May 1；27(5):2941-2954.)
(2)在rtTA细胞系中敲除β-catenin
A.设计靶向β-catenin的双gRNA(gRNA1：TGGACTCTGGAATCCATTCTGG(SEQ IDNO.1)；gRNA 2：TCCCACTCATACAGGACTTGGG(SEQ ID NO.2))。
B.根据gRNA引物设计原则，合成引物：
gRNA1-F：GGACGAAACACCGTGGACTCTGGAATCCATTCGTTTTAGAGCTA(SEQ ID NO.3)
gRNA1-R：TTTCTAGCTCTAAAACCCAGAATGGATTCCAGAGTCCACGGTGTTTC(SEQ ID NO.4)
gRNA2-F：GGACGAAACACCGTCCCACTCATACAGGACTTGTTTTAGAGCTA(SEQ ID NO.5)
gRNA2-R：TTTCTAGCTCTAAAACAAGTCCTGTATGAGTGGGACGGTGTTTC(SEQ ID NO.6)
C.gRNA引物退火：将引物稀释成100μM，退火体系为：
Figure BDA0001981501480000111
混合均匀后，在PCR仪中：95℃变性5min，然后每分钟降温1℃，直至12℃，即得到退火产物。
D.获得gRNA载体酶切片段，酶切的反应体系为：
Figure BDA0001981501480000112
Figure BDA0001981501480000121
37℃水浴酶切3h，琼脂糖凝胶跑胶后回收酶切片段，-20℃储存。(gRNA载体质粒已发表，具体见Liu Z,Hui Y,Shi L,Chen Z,Xu X,Chi L,Fan B,Fang Y,Liu Y,Ma L,WangY,Xiao L,Zhang Q,Jin G,Liu L,Zhang X.Efficient CRISPR/Cas9-MediatedVersatile,Predictable,and Donor-Free Gene Knockout in Human Pluripotent StemCells.Stem Cell Reports.2016Sep13；7(3):496-507.)
E.gRNA退火产物与载体片段连接，连接体系为：
Figure BDA0001981501480000122
16℃连接过夜。
F.转化连接产物，挑选单克隆，菌落PCR鉴定阳性克隆，鉴定引物为
5'gRNA verify primer:GAAAGTATTTCGATTTCTTGGC(SEQ ID NO.7)
3'gRNA verify primer:CTAGCCTTATTTTAACTTG(SEQ ID NO.8)质粒抽提，-20℃储存备用。
G.准备电转rtTA细胞系。电转前，将培养到第4天的rtTA人胚胎干细胞换新鲜的含有10μM的Y27632人胚胎干细胞培养基处理至少3h。在37℃水浴锅中预热0.05％胰酶、DMEM/F12和PBS。
H.电转时，去除hESCs的培养基，并用2ml胰酶洗一遍，再加入2ml胰酶，然后放入37℃细胞培养箱中消化3min后吸掉胰酶。将细胞再放入培养箱中消化3min，观察细胞明显分散为单细胞。
I.消化细胞时准备电转质粒混合物：基因敲除时，取200μl电转液至1.5ml离心管中，加入5μg gRNA1质粒、5μg gRNA2质粒、5ug含puromycin抗性的质粒和5μgCAG-hCas9-2A-GFP质粒；混匀后置于冰上备用。
J.用10ml DMEM/F12将大部分克隆悬浮吹起，转移至15ml离心管中，吹打成单细胞，800rpm离心1min，此时大的细胞团块离心至管底，将上清小心的转移至新的15ml离心管中。
K.细胞2500rpm离心2min，吸掉上清，用10ml PBS重悬细胞，再次离心2500rpm，2min，重复用PBS洗一遍，最后将PBS尽量吸尽。
L.用电转混合物将细胞沉淀重悬至电转杯中，冰上放置3min。
M.将细胞悬浊液轻轻混匀，250V，500μF的条件下电转。
N.将电转的细胞转移至含有bFGF和Y27632的hESC培养基中，均匀的接种到处理好的MEF板中的3个孔中，细胞十字摇匀，放于37℃细胞培养箱中培养。
O.第2天，细胞全换液，48h后用puromycin进行药物筛选。
P.将长大的克隆取一部分抽基因组DNA，并利用5’test-F：TCAATGGGTCATATCACAG(SEQ ID NO.9)和3’test-R：GACTTTCAGTAAGGCAATGAA(SEQ ID NO.10)进行PCR鉴定。只有350bp条带的为野生型hESC，只有273bp条带的为纯合敲除，两者都有的为杂合敲除，挑选纯合敲除的hESC细胞系保留并冻存。
(3)在β-Catenin敲除的rtta细胞系中建立可诱导的β-Catenin-RE细胞
a)慢病毒载体的构建：β-Catenin的点突变S33Y通过融合PCR构建。然后将其连接到慢病毒载体pLVX-Tight-Puro上。(这个构建方法已发表，具体见：Chi L,Fan B,Feng D,Chen Z,Liu Z,Hui Y,Xu X,Ma L,Fang Y,Zhang Q,Jin G,Liu L,Guan F,Zhang X.TheDorsoventral Patterning of Human Forebrain Follows an Activation/Transformation Model.Cereb Cortex.2017May 1；27(5):2941-2954.)
pLVX-Tight-Puro是Tet-On系统的应答载体，Dox不存在时，β-Catenin(S33Y)不表达；当Dox存在时，rtTA构象改变，β-Catenin(S33Y)开始表达。
对于HA-β-catenin-RE细胞系，将N端带HA标签的β-Catenin(S33Y)序列通过BamHI和MluI位点连接到载体pLVX-Tight-Puro上。其余的细胞构建方法与β-catenin-RE的构建方法相同。
b)病毒包装与浓缩：通过病毒包装与浓缩的方法，将构建好的载体包病毒，收集3-5个10cm dish的病毒液，进行超速离心浓缩假病毒颗粒。
病毒包装与浓缩的方法：
(1)包装慢病毒的工具细胞为HEK293FT，首先准备细胞：一个长满细胞的T75按照1：4.5的比例接种到10cm细胞培养皿中，每种病毒的包装需要5个细胞培养皿，24h后，待细胞长到80％-90％时可进行转染。
(2)细胞转染前需要预热去离子水、CaCl2和2×Hepes。配制转染混合物：在15ml离心管中依次加入5ml去离子水、37.5μg△8.9质粒，25μg VSVG，50μg目的质粒，再加入735μl2M CaCl2，吹打混匀。
(3)转染细胞：从细胞培养箱中拿出培养皿中培养的待转染的细胞，一字摆开，吸取5.8ml预热的2×Hepes加入到上述质粒混合物中，吹打混匀，静置1min，然后均匀温和地滴入细胞培养皿中，30min后显微镜下观察磷酸钙沉淀复合物的浓度和大小，12-16h后，每个培养皿中加8ml新鲜的HEK293FT培养基放回培箱继续培养。
(4)48h后，收集并浓缩病毒：收集上清到50ml离心管中，4400rpm离心5min用以去除大部分上清中的细胞，将上清用0.45μl的滤膜过滤至新的离心管中，用以去除残余的细胞和细胞碎片，将上清转移至超速离心管中，55000g，16℃，离心3h。离心后，倒掉上清，用200μl培养基(为要感染的细胞的培养基)刮下离心管底部的沉淀，转移至1.5ml的离心管中，4℃溶解。病毒在4℃可保存1周，-80℃可长时间保存。
(5)用浓缩的病毒感染hESCs时，将hESCs消化成直径为50μm的细胞团块，1100rpm离心1min后，去除上清，将200μl浓缩的病毒加入到细胞中，摇匀37℃细胞培养箱中放置30min，期间每隔10min混匀一下以悬起细胞团块。取出含有MEF的六孔板，用DMEM/F12洗一遍，加入2ml含有bFGF的hESC培养基。感染结束后，将细胞加入到六孔板中，摇匀后放于细胞培养箱中培养，12-16h后全换液，48h后可进行抗生素筛选。
c)将浓缩好的慢病毒感染β-Catenin敲除的rtTA细胞系，两天后，开始用嘌呤霉素杀死阴性细胞，直到细胞不再死亡，撤掉嘌呤霉素，克隆开始生长，将长好的克隆一分为二，一部分保种，一部分加dox。加dox组5天后染β-catenin鉴定，挑选克隆中β-catenin高表达且均匀分布的克隆保种。
6、免疫荧光染色
(1)若细胞样品在Coverslip上，则沿着Coverslip的边缘缓慢的加入100μl的4％PFA，室温固定10min，之后吸掉PFA；若细胞样品不在Coverslip上，是组织团块，则将样品浸泡在4％PFA中，室温固定10-15min。之后吸掉PFA换20％蔗糖，4℃过夜后，再次更换30％蔗糖，4℃过夜。将脱水后的样品包埋并冷冻切片。
(2)加入PBS，静置5min，吸掉PBS，重复3次。
(3)用PBS配制封闭液包含10％的驴血清和0.2％的Triton-X 100，室温封闭1.5小时。
(4)用PBS与封闭液1：1的比例配制抗体稀释液，按照抗体的使用浓度将抗体加入到抗体稀释液中，每个样品加入稀释好的抗体，4℃冰箱孵化过夜。
(5)第二天，吸掉抗体，加入PBS，室温静置5min，吸掉PBS，重复3次，彻底洗掉未与细胞结合的抗体。
(6)根据抗体的来源属性，选择合适的二抗，用PBS按照抗体的使用比例稀释，每个样品加入稀释好的二抗，室温避光孵育1.5小时，此后所有的步骤都要避光操作。
(7)重复步骤5。
(8)用PBS按照1：1000的比例稀释染细胞核的抗体Hoechest，室温染色3min。
(9)重复步骤5。
(10)用封闭凝胶封片，待封闭凝胶彻底凝固后，荧光显微镜下观察拍照。
(11)若是Brdu染色，将10μM Brdu与前体细胞孵育2h(OE或CHIR99021处理的细胞)或4h(KO或RE细胞)。之后染色步骤同上。
7、蛋白免疫印迹
(1)裂解细胞：贴壁细胞，将细胞培养皿放于冰上，吸净培养基，加入冷的PBS洗一次，加入适量体积的RIPA细胞裂解液(使用前按比例加入100×PICT(ProteinaseInhibitor Cocktail)和100×100mM PMSF)，P1000移液器收取细胞，转移到离心管中，不能裂解的细胞团用胰岛素针抽打裂解，冰上放置20min；悬浮的细胞，将细胞收集到离心管中，放于冰上，用冷的PBS洗一次，加入适量体积的PIRA，用胰岛素针抽打裂解细胞，冰上放置20min。12000g低温4℃离心10min，小心转移上清至新的离心管中。
(2)BCA蛋白定量：实验中使用Thermo PierceTM BCA Protein Assay Kit对蛋白进行定量。配置不同浓度的标准品样品以绘制标准曲线：标准曲线要求蛋白量为0μg、1μg、2μg、4μg、8μg、16μg，蛋白标准品BSA的浓度为2λ。8联管中的第一个管中加入20μl的蛋白标准品，取出10μl加入第二个管中，再第二个管中加入10μl的水，混匀，取出10μl加入第三个管中再加水10μl，依次梯度稀释4次，依次得到浓度为2λ，1λ，0.5λ，0.25λ，0.125λ的BSA蛋白标准品。加样：在96孔板中，标准曲线组分别加入8μl不同浓度的蛋白标准品和4μl的RAPI裂解液；样品检测组分别加入4μl的裂解的蛋白样品和8μl的水；每组3个重复。配制BCA蛋白定量试剂盒中的工作液：A液和B液按照1：50的比例混合，备用。蛋白显色：向96孔板的每个孔中加入100μl的工作液，轻晃，37℃下静置30min。测OD值：将96孔板放入酶标仪中，测定每个孔在562nm的OD值，根据吸光度画出标准曲线，算出每个样品的蛋白浓度。蛋白变性：根据计算出来的蛋白浓度，用RIPA和SDS Loading buffer将蛋白样品稀释成1λ，98℃变性蛋白10min，备用。
(3)聚丙烯酰胺凝胶配制。首先7.5ml的配置分离胶：以10％为例，在50ml离心管中依次加入3.596ml离子水，1.875ml 40％Acrylamide/Bis(37.5:1)，，1.875ml 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，75μl 10％SDS，75μl 10％APS，4μl TEMED(不同浓度的分离胶离子水、40％Acrylamide/Bis和TEMED有些许不同)。混匀后倒入已经装配好的玻璃板夹层中。沿着玻璃板的上层小心的加入离子水压平分离胶。室温静置30min，待分离胶凝固。配置3ml浓缩胶：倾去离子水，用滤纸吸干残留的水。在15ml离心管中依次加入2.36ml去离子水，0.3ml 40％Acrylamide/Bis(37.5:1)，0.375ml 1.5M Tris-HCl(pH 6.8)，30μl 10％SDS，30μl 10％APS，4μl TEMED。混匀后加在分离胶上方，插上需要的梳子，静置15min后，即可开始上样。
(4)蛋白电泳和免疫印迹。把配好的胶放入Bio-Rad蛋白跑胶仪中，夹紧玻璃板，避免电泳过程中漏液，电泳槽中导入蛋白电泳跑胶液，双手用力均匀缓慢的提起梳子，用50μl微量移液器将变性过后的蛋白样品加入泳道孔中，在两边的泳道加入蛋白Marker，未上样的孔用1×SDS Loading Buffer补齐。接通电源，先用80V的电压让蛋白跑入分离胶，再换成120V继续电泳。在蛋白电泳完成前的30min时进行转膜准备工作：将转膜需要的4张滤纸、NC膜、2块海绵浸泡在转膜液中。转膜：凝胶放入转膜液中浸泡10min，将转膜用滤纸等叠加成三明治依次为：黑色电源负极板、海绵、2层滤纸、凝胶、NC膜、2层滤纸、海绵、透明电源正极板，注意不要产生气泡。夹紧后放入装满转膜液的电泳槽中，检查电源正负极，切勿放反方向。为保证低温，电泳槽中放入冰袋，并将电泳槽放入冰盒中。根据蛋白大小不同在300mA恒流转膜60-120min不等。转膜完成后，取出NC膜，在右上角切角标记正反面，TBST洗膜，用蛋白电泳封闭液(5％-10％的脱脂牛奶溶解在TBST中)室温摇床封闭1h，室温摇床中TBST洗膜，一抗4℃孵育过夜，洗去一抗(摇床中，TBST洗膜三次，每次5min)，二抗室温孵育1h，洗去二抗。配制ECL显影液，在暗室用胶片爆光显影。
8、RNA的提取
(1)收集前体细胞，加入PBS洗一次，加入Trizol试剂，一般细胞体积不超过试剂的1/10。收集好的细胞涡旋震荡混匀，充分裂解，室温放置5min。
(2)在1ml的Trizol裂解液中加入200μl氯仿，剧烈震荡十五秒左右，冰上静置10min。
(3)提前预冷离心机至4℃，12000g高速离心15min，在冰上将上清液用无RNAase的枪头转移至新的离心管中，约500μl左右，注意不要吸取中间的蛋白层。
(4)向上清液中加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，然后-80℃放置20min。
(5)将上述溶液在4℃离心机中，12000g高速离心15min，弃去上清，此时在离心管的底部能观察到RNA的沉淀。
(6)向离心管中加入1ml预冷过的DEPC水配置的75％乙醇，上下颠倒，洗涤沉淀，4℃离心机，12000g离心10min，去掉上清，重复一次，去除残余的异丙醇。
(7)在室温中晾干残余的乙醇，根据沉淀的大小，加入适量的DEPC水溶解。
(8)待充分溶解后，测RNA的浓度，于-80℃冰箱中储存备用。
9、cDNA反转
(1)在冰上溶解RNA，根据浓度计算逆转录1ug RNA所需要的体积，在无RNAase的PCR管中配制以下反应体系：
Figure BDA0001981501480000171
充分混匀后瞬时离心，放在PCR仪中65℃孵育5min，以打开RNA的二级结构。
(2)配制cDNA合成混合体系，注意冰上操作，无RNAase的条件下操作，具体成分如下：
Figure BDA0001981501480000172
体系配好后，混匀放置在冰上，待用。
(3)步骤1结束后，将配置好的反转混合体系加入PCR管中，每管10μl，在冰上操作。充分混匀，离心，然后放入PCR仪中，运行程序：
42℃60min，85℃10min，4℃∞
(4)将逆转录后的cDNA样品从PCR仪取出，将PCR产物用ddH2O稀释至400μl，置于4℃冰箱中，待用。
10、RT-PCR反应
(1)把目标实验样品从RNA反转得到的cDNA样品，作为模板待用。
(2)使用Bio-RAD的SYBR Green Supermix进行实时定量PCR，反应体系如下：
Figure BDA0001981501480000181
引物序列见下表1：
表1
Figure BDA0001981501480000182
Figure BDA0001981501480000191
(3)加样完后，用离心机2000rpm离心2min，放在Bio-RAD qPCR仪中，启动程序运行，具体程序如下：
Step I：95℃2min；
Step II：95℃20s；
Step III：57℃30s；
Step IV：72℃30s，plate read，back to Step II，40cycles；
Step V：95℃15s；
Step VI：65℃30s；
Step VII：65℃to 95℃，increment 0.5℃for 5s and plate read；
Step VIII：end。
(4)样品实验数据分析，采用2-ΔΔCt法：
ΔΔCt＝(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照组。
11、RNA-seq测序文库建立
实验中使用NEBNext Ultra RNA Library Prep kit建立测序文库，具体步骤如下：
(1)1μg RNA用无RNA酶的水稀释到50μl置于单个PCR管中，冰中待用。
(2)取15μl NEBNext Oligo d(T)25beads于竖条PCR管中，放磁力架2min，吸去上清。Beads使用前在室温平衡并充分混匀，加入时观察没有颗粒状。
(3)加75μlRNA binding buffer清洗beads，上下pipette至少6遍混匀，放磁力架2min，吸去上清。吸上清时注意不能碰到beads，也不能让beads太干。移开磁力架。重复一遍。
(4)用50μl RNA Binding Buffer重悬beads，并加入50μl步骤1准备好的totalRNA。反复吹打，混匀。
(5)将上述样品放于PCR仪中，65℃反应5min，然后室温孵育5min，使RNA与beads充分结合，将样品放磁力架2min，吸去上清。
(6)移去磁力架，加200μl wash buffer，上下pipette至少6遍混匀，磁力架2min，吸去上清。重复一遍，洗去未结合的RNA。
(7)加50μl Tris Buffer，上下pipette至少6遍混匀。PCR仪中反应，80℃2min，降温到25℃，使RNA从beads上解离下来。
(8)向样品中加50μl RNA Binding buffer，上下pipette至少6遍混匀，室温静置5min，mRNA重新吸附到beads上。放磁力架2min，吸去上清。移去磁力架。
(9)加200μl wash buffer，上下pipette至少6遍混匀，放磁力架2min，吸去上清，移去磁力架。
(10)加200μl Tris buffer，上下pipette至少6遍混匀，放磁力架2min，彻底吸去上清后移去磁力架。
(11)配制First Strand Reaction Buffer and Random primer Mix(2×)，体系如下：
Figure BDA0001981501480000211
(12)取15μl First Strand Reaction Buffer and Random primer Mix(2×)加入上步的beads中，充分混匀后，PCR仪中反应，94℃15min降温到25℃。
(13)将样品放磁力架，收集10μl上清(纯化的mRNA)至PCR管中，冰中待用。
(14)配制First Strand cDNA Synthesis mix，体系如下：
Figure BDA0001981501480000212
混合均匀后放于PCR仪中反应：25℃10min，42℃20min，70℃15min，降温至4℃。
(15)配制Second Strand cDNA Synthesis mix，体系如下：
Figure BDA0001981501480000213
PCR仪中反应：16℃60min。
(16)充分混匀AMPure XP beads(室温提前平衡1h)，加144μl(1.8X)重悬的AMPureXPbeads到80μl Second Strand cDNA Synthesis中，上下pipette至少10遍混匀。室温孵育10min，孵育时远离磁力架，放磁力架5min，在静置过程中可用枪吹打使吸附更完全，吸去上清。
(17)样品放磁力架上，从beads相反的一侧加入200μl新配的80％乙醇，不能吹散样品，室温1min，吸去上清，重复洗一遍。
(18)样品开盖仍放磁力架上，室温5min晾干beads，观察beads表面没有明显的酒精且没有开裂状态。
(19)移开磁力架，加32.5μl nuclease-free水，上下pipette混匀充分溶解5-10min，然后放磁力架5min，转移30μl上清至新的PCR管中。此时样品可放于-20℃保存，也可直接进行后续实验操作。
(20)配制End repair/dA-tail Mix，体系如下：
Figure BDA0001981501480000221
混匀后放于PCR仪中，20℃30min，65℃30min，降温到4℃。
(21)配制Adaptor Ligation反应体系，先将NEBNext Adaptor for Illumina(15uM)稀释10倍到1.5uM，体系如下：
Figure BDA0001981501480000222
混合均匀后，PCR仪中反应，20℃15min。
(22)向上述样品中加入3μl USER Enzyme，混匀后，PCR仪中，37℃反应15min，加入13.5μl Nuclease free water，补齐到100μl。
(23)向样品中加入100μl(1.0X)重悬的AMPure XP beads，上下pipette至少10遍混匀。室温孵育10min，孵育时远离磁力架，放磁力架5min，在静置过程中可用枪吹打使吸附更完全，吸去上清。
(24)样品放磁力架上，从beads相反的一侧加入200μl新配的80％乙醇，室温放置1min，吸去上清。重复用乙醇洗一遍。
(25)样品放磁力架上开盖，室温5min晾干beads，观察beads表面没有明显的酒精且没有开裂状态。
(26)移开磁力架，加52μl nuclease-free水上下pipette混匀，室温充分溶解5-10min，放磁力架5min。
(27)转移50μl上清至新的PCR管中，加入50μl(1.0X)重悬的AMPure XP beads，上下pipette至少10遍混匀，室温孵育10min，孵育时远离磁力架，放磁力架5min，在静置过程中可用枪吹打使吸附更完全，吸去上清。
(28)样品放磁力架上，从beads相反的一侧加入200μl新配的80％乙醇，不能吹散样品，室温放置1min，吸去上清。用乙醇重复洗一遍。
(29)样品放磁力架上开盖，室温5min晾干beads，观察beads表面没有明显的酒精且没有开裂状态。
(30)移开磁力架，加22μl nuclease-free水(室温)充分溶解5-10min，放磁力架5min，转移20μl上清至新的竖条PCR管中，进行PCR扩增反应。
(31)反应体系如下：
Figure BDA0001981501480000231
混匀后，PCR仪中反应，条件为，98℃30s，98℃10s 65℃75s，循环13个cycle，65℃5min，12℃∞。
(32)向样品中加入45μl(0.9X)重悬的AMPure XP beads，上下pipette至少10遍混匀，室温孵育10min，孵育时远离磁力架，放磁力架5min，吸去上清。
(33)样品放磁力架上，从beads相反的一侧加入200μl新配的80％乙醇，室温放置1min，吸去上清。用乙醇重复洗一遍。
(34)样品放磁力架上开盖，室温5min晾干beads，观察beads表面没有明显的酒精且没有开裂状态。移开磁力架，加23μl nuclease-free水(室温)充分溶解5-10min，放磁力架5min。
(35)转移20μl上清至新的PCR管中，-20℃保存。
(36)Qubit测cDNA的浓度，1％琼脂糖凝胶鉴定cDNA片段的大小，在300bp左右有模糊的条带。
(37)cDNA样品送去RNA-seq测序公司测序。
12、染色质免疫沉淀(ChIP)与ChIP-PCR
(1)细胞交联：hESCs分化到第25天的神经前体细胞，吹打成小球，收集到15ml离心管中，加入37％甲醛(终浓度为1％)，培养基的颜色会发生变化，混匀，室温交联10min，期间不停上下颠倒，使蛋白与DNA充分交联。加入2.5M甘氨酸溶液(终浓度125mM)混匀，培养液的颜色再次改变，室温上下颠倒孵育5min，终止交联。2500rpm离心2min，弃去上清，加入10mlPBS洗2遍，将细胞转移至1.5ml EP管中，细胞沉淀-80℃保存也可直接进行后续实验。
(2)细胞膜裂解：若细胞从-80℃取出，在冰上解冻。用1ml冷的细胞裂解液重悬交联好的细胞沉淀(～1×107细胞数)，吹打混匀，置于冰上10min，期间不停弹匀细胞，以免细胞聚集。3000rpm 4℃离心10min，弃上清，管底的沉淀为细胞核。
(3)细胞核裂解：加入165μl核裂解液重悬沉淀，4℃摇床低速旋转裂解10-20min，充分裂解细胞核。
(4)基因组超声剪切：加入2倍体积的IP稀释液，混匀，冰上静置10min，用超声仪超声4-6次(每次20s，间隔30s)尽量保证把基因组剪切成500-1000bp的大小(此步骤需要做预实验确定超声体系和超声次数)。13000rpm 4℃离心10min，上清转移至新的1.5ml EP管中，即为超声打断的基因组样品。
(5)解交联检验基因组片段大小：取10μl打断的基因组样品，加入90μl水和4μl 5MNaCl，向样品中加入2μl 10mg/ml RNaseA混匀，37℃消化30min以除去RNA，加入2μl 20mg/ml蛋白酶K，65℃水浴至少2h，以除去蛋白质。用酚氯仿的方法提取染色质，样品中加入100μl酚氯仿，涡旋震荡充分混匀，12000rpm室温离心10min，小心吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入两倍体积的无水乙醇，总体积1/20的pH5.3 3M醋酸钠，2μl 20mg/ml糖原，混匀后-80℃放置20min，12000rpm 4℃离心15min，弃去上清，沉淀用75％乙醇洗2遍，倒掉酒精，晾干后加入适量去离子水溶解，测定基因组DNA的浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA片段大小。
(6)抗体孵育：取15-20μg打断的基因组，加入1X蛋白酶抑制剂混合物和1X ChIP缓冲液配成500μl的反应体系，混匀，取出10μl至新的1.5ml EP管中，作为2％样品输入对照组(input)，可以先冻存在-20℃，进一步解交联提取DNA。将剩余的样品分为实验组和对照组，向实验组加入相应的ChIP级抗体，对照组加入IgG抗体(抗体的剂量参考抗体使用手册，一般为3-5μg)，在4℃旋转摇床上低速旋转孵育4h以上或者过夜，然后向每个体系中加入30μlChIP级Protein G磁珠，继续在4℃旋转摇床上低速孵育2h。
(7)免疫沉淀的染色质漂洗：将EP管放于磁分离架上(在冰上操作)，约1-2min后，磁珠被吸附，溶液澄清，在磁力架上小新移除上清液，加入1ml低盐漂洗液，4℃旋转摇床清洗5min，放于磁力架上移除上清，重复低盐漂洗3次。用高盐漂洗液洗涤一次，再用LiCl溶液和TE溶液洗一次。
(8)染色质从抗体/磁珠上洗脱下来并解交联提取DNA：向EP管中的沉淀中加入150μlChIP洗脱液，在65℃混合振荡器上洗脱50min，将EP管放于磁力架上，将上清转移至新的1.5mlEP管中，重复洗脱一次。按步骤5解交联提取DNA，并进行荧光定量PCR。
荧光定量PCR时，用2％input组，实验组和对照组的DNA为模板，实验操作按照方法10中的方法，计算方法为：
1)ΔCt[Normalized IP]＝Ct[IP]-(Ct[Input]-Log2(Input稀释倍数))，Input稀释倍数为2％。
2)％Input＝(2(-ΔCt[Normalized IP]))×100％
3)％Input Enrichment＝％Input[Ab]-％Input[Con]
4)ΔΔCt[IP]＝ΔCt[normalized Ab]-ΔCt[normalized Con]
5)Fold Enrichment＝2(-ΔΔCt[IP])
荧光定量PCR实验中所用到的引物见下表2：
表2
Figure BDA0001981501480000251
13、电生理实验
在22～25℃的温度下，采用Axon MuLtiClamp 700B在全细胞记录的模式下进行电生理记录。利用Axon MuLtiClamp 700B(MolecuLar Devices)在3kHz(低通)下进行扩增和过滤，并使用DigiData 1550A(MolecuLar Devices)以20kHz采样频率，并由pClamp10(MolecuLar Devices)获得数据，最后由Clampfit软件进行分析来获得相应的数据。
(1)打开所有相关仪器开关并设置好相应的程序，将细胞外液(134mM NaCl,2.9mMKCl,2.1mM CaCl2,1.2mM MgCl2,10mM HEPES,10mM glucose,pH7.8，渗透压290mOsm)转移至烧杯中并通入CO2(5％)和O2(95％)的混合气体15min；
(2)将培养有神经元的玻片放入连续不断的通灌流液(3mL/min)的记录槽中，并用Nikon Eclipse FN-1显微镜的40倍水镜在IR-DIC条件下找到细胞；
(3)拉制电极(外直径1.5mm,内直径0.87mm,Sutter)，电极的电阻为5-8Ω，加入电极内液(120mM potassium gluconate,5mM KCl,10mM HEPES,0.0001mM CaCl2,5mM EGTA,4mM Mg2ATP,0.3mM Na4GTP,10mM sodium phosphocreatine,pH 7.4，渗透压，275mOsm)之后钳制细胞；
(4)首先是在电流钳模式下进行记录神经元，并检测神经元在1秒内给予正电流和负电流刺激后神经元所给出的反应以至于能够确定神经元本身的电生理特性，并且获得的静息膜电位(RMP)；
(5)在自发兴奋性突触后电流(sEPSC)和自发抑制性突触后电流(sIPSC)的记录中，电压钳分别钳在-65mV和0mV；
(6)在记录mIPSC之后，用Bicuculline进行阻断，来验证获得的结果；
(7)收集到的数据主要是采用Clampfit10软件进行处理。
实施例2
人胚胎干细胞可以定向分化为人前脑皮层前体细胞和MGE前体细胞，具体示意图参见图1A。人ES细胞的资源来自国际常用的人类胚胎干细胞细胞系H9。人ES细胞培养在被放射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)上(培养液的配方：392.5ml DMEM/F12，100ml Knockout serum replacer，5ml MEM nonessential aminoacids solution，2.5ml200mM L-glutamine solution，3.5ml 14.3Mβ-Mercaptoethanol)。通过机械和化学相结合的方法传代，细胞克隆每5天传代一次。人胚胎干细胞的神经分化的方法具体参照实施例1的第三部分，培养基中含有bFGF因子，在其向神经外胚层细胞定向分化时，我们先将ES细胞聚集成拟胚体(Embroynic Body,EB)悬浮培养在不含bFGF的培养基中，4天后，悬浮EB的培养基更换成含有N2的神经诱导培养基(NIM培养基)，继续悬浮2天；随后，在神经分化的第6-7天，我们把这些EB贴壁生长在含有N2的神经诱导培养基中10天；最后，神经分化的第17天，我们把这些贴壁的EB球吹小变成神经球即皮层前体细胞悬浮培养一周后分化成神经元。在没有加入任何信号分子的情况下，神经球主动获得前脑皮层前体细胞的命运；如果在分化第10-17天加入Shh和smoothened激活剂purmorphamine，则前体细胞被腹侧化，形成MGE前体细胞。这一方法模拟了体内胚胎的神经发育，在神经分化的第8-10天，产生神经上皮细胞；在第2-3周出现神经前体细胞，而在一个月左右形成神经元。具体方法可参照实施例1中的第1、2、3、4部分。
在分化过程中形成的人皮层前体细胞和MGE前体细胞，分别只表达Pax6和Nkx2.1(图1B，免疫荧光染色的具体方法参照实施例1中的第6部分)，它们是皮层和MGE前体细胞中重要的转录因子，同时也验证了整个实验流程的准确性和特异性。
为了监测细胞中内源的Wnt信号的激活情况，我们在人胚胎干细胞中转染7×Tcf-eGFP/SV40-mCherry(7TGC)的慢病毒质粒(购买于addgene，编号24304)，转染方法参照实施例1的第5部分中的病毒包装与浓缩的方法，免疫荧光染色的具体方法参照实施例1中的第6部分)。在被这个慢病毒质粒感染的细胞中，如Wnt信号(Tcf)被激活，GFP将被激活并表达，而持续性开放的SV40启动子将激活mCherry的表达，这表现为被7TGC感染的细胞都能表达mCherry(红色荧光)。在实验中，不加入Wnt信号，细胞只表达mCherry的红色荧光，而不表达GFP的绿色荧光，证明细胞都被转染，但并无Wnt信号激活；当加入Wnt激活剂CHIR99021两天之后，细胞显著表达GFP，证明内源性Wnt信号被激活，证明了7TGC的有效性(图1C)。在MGE神经前体细胞的分化过程中，从第12天开始，GFP开始表达，并且在第24天表达非常强烈，证明MGE神经前体细胞的分化可以激活内源性的Wnt信号(图1D)。另外，与分化第10天比较，在分化的第25天，很多Wnt配体分子的mRNA水平升高，尤其是Wnt7a(图1E)。Wnt信号的受体，包括Fzd9,Lrp5和Lrp6，mRNA水平也显著升高(图1F)，这些也从另一方面证明了Wnt信号的激活，mRNA的检测方法参照实施例1的第8至第11部分。
实施例3
为了理清Wnt信号的作用，我们在人胚胎干细胞中敲除了Wnt信号通路中重要的效应器β-catenin(KO细胞，此细胞系已发表；Liu,Z.,Hui,Y.,Shi,L.,Chen,Z.,Xu,X.,Chi,L.,Fan,B.,Fang,Y.,Liu,Y.,Ma,L.,et al.(2016).Efficient CRISPR/Cas9-MediatedVersatile,Predictable,and Donor-Free Gene Knockout in Human Pluripotent StemCells.Stem Cell Reports 7,496-507.)，并且Western blot实验验证了β-catenin蛋白的缺失(图2A)，实验方法具体参见实施例1第7部分。我们将由正常的(WT，即实施例2中的人类胚胎干细胞细胞系H9)和基因敲除(KO)的胚胎干细胞分化得到的MGE前体细胞进行了转录组测序(RNA-seq)，具体方法参见实施例1的第8至第11部分。我们发现，与WT细胞相比，KO-MGE前体细胞共具有960个差异基因，包括400个上调基因和560个下调基因(图2B)。通过生物信息学Gene ontology(GO)分析，上调基因主要与神经生成、突触信号、神经元投射以及轴突发育相关(图2C)，而下调基因主要与细胞迁移、细胞粘附、胚胎发生、细胞增殖和Wnt信号相关(图2D)。这个结果说明Wnt信号的敲除导致MGE前体细胞提前向神经方向分化。除此之外，我们还制作了β-catenin诱导过表达的细胞系(OE细胞，已发表；Chi,L.,Fan,B.,Feng,D.,Chen,Z.,Liu,Z.,Hui,Y.,Xu,X.,Ma,L.,Fang,Y.,Zhang,Q.,et al.(2017).TheDorsoventral Patterning of Human Forebrain Follows an Activation/Transformation Model.Cerebral Cortex 27,2941-2954.)。不加任何处理的OE细胞不表达外源性的β-catenin，在OE细胞中加入Dox后，OE细胞开始过表达β-catenin。具体培养方法参见实施例1第3部分，实验对象为培养获得的神经前体细胞，Western blot实验证明了在加入Dox之后，β-catenin蛋白大量表达，验证了细胞系的效率(图2E)。在MGE前体细胞的分化体系中，我们在第17-25天加入Dox，并且我们对不加Dox和加Dox的MGE前体细胞进行了RNA-seq分析，具体方法参照实施例1的第8至第11部分。我们发现，相对于不加Dox的样品，加Dox的细胞具有996个上调基因和925个下调基因(图2F)。GO分析证明上调基因与细胞粘附和细胞增殖相关(图2G)，而下调基因和神经生成和神经投射相关(图2H)。这些结果提示，过表达Wnt信号可增强MGE前体细胞的增殖能力，而削弱其向神经分化的能力。
实施例4
神经前体细胞具有维持自我更新使其持续增殖的能力，和能够向神经方向分化，产生部位特异性神经元的能力。为了进一步证实Wnt信号对MGE前体细胞的作用，我们在Wnt信号被抑制和激活的状态下，考察了相关的荧光染色实验，具体方法参照实施例1第6部分。细胞培养方法参见实施例1第3部分，在第25天，将WT-MGE和KO-MGE(未添加CHIR99021和Dox，添加了Shh和Purmorphamine促进向腹侧分化)与Brdu分别孵育4个小时，KO细胞显示了显著减少的Brdu标记的细胞，提示细胞周期中，进入S期的细胞变少(图3A和图3B)。Ki67和pH3也是代表细胞增殖的标记物，同样，KO-MGE显示了显著减少的Ki67和pH3信号，提示细胞增殖减弱(图3A和图3B)。DCX是neuroblast的标志物，荧光染色显示KO-MGE具有显著增加的DCX表达，提示KO-MGE有向神经方向提前分化的趋势(图3C和图3D)。另外，我们又对第25天的WT-MGE和KO-MGE进行了RNA水平的检测，具体方法参照实施例1第8至第10部分，RT-PCR实验显示KO-MGE具有显著增加的Tuj1(神经元的标志物)，GAD67(GABA神经元的标志物)和SST(GABA神经元亚型的标志物)(图3E)。确认了KO-MGE向神经方向提前分化的趋势。
为了确认Wnt信号对MGE的发育确实起着重要的作用，而不是神经分化过程中区域化所产生的影响，我们制作了一个在β-catenin-KO的细胞中诱导过表达β-catenin的细胞系(RE细胞的构建方法可参照方法5)。Western blot实验显示，未分化且未加入Dox的RE细胞不表达或表达微弱的β-catenin，而加入Dox诱导5天之后，RE细胞重新大量表达β-catenin，验证了该细胞系的效率(图3F)。对于分化的RE细胞，在分化的第17-25天加Dox，第25天的免疫染色结果显示KO诱导的增殖标志物下降和神经分化标志物上升都被修复了(图3G～图3J)，这也确定了Wnt信号的重要作用。另外，我们又对不加Dox或加Dox的OE细胞进行了类似的免疫染色，实验结果显示加Dox的OE-MGE(添加Dox，添加了SHH和Purmorphamine促进向腹侧分化)的增殖标志物上升，而神经分化标志物下降(图3K～图3N)。这部分结果确认了前面RNA-seq得到的结论。另外，免疫染色实验还确认无论加或不加Dox的OE细胞，在分化的第25天，几乎全部表达前脑的标志物Foxg1，而不表达后脑的标志物Hoxb4(图3O)。同时，绝大部分的OE细胞在加或不加Dox的情况下，都表达MGE的标志物Nkx2.1(图3P)。这个结果确认了OE分化到第25天的细胞属性，是前脑腹侧的MGE前体细胞。
实施例5
为了寻找Wnt信号调控MGE前体细胞细胞命运的潜在机制，根据上述的RNA-seq数据，将KO细胞中上调的差异基因和OE细胞中下调的差异基因进行了交叉比对，共有228个基因作为两方面的共同基因被提炼出来(图4A)。同样地，将KO细胞中下调的差异基因和OE细胞中上调的差异基因进行了比对，共有207个基因作为两方面的共同基因被提炼出来(图4B)。通过对这些共同基因中的关键功能基因和β-catenin做PPI分析(protein-proteininteraction networkanalysis；图4C)，发现β-catenin作为网络中最中心和最重要的基因关联着其他KO细胞中的下调基因和OE细胞中的上调基因。其中，有11个下调基因与β-catenin直接相联系，包括属于Notch信号的Notch2、Jag1，属于细胞粘附和EMT通路的Cdh7、Cdh8、Fat4、Vim和Fn1。这提示Wnt信号可能是通过对一系列下游基因的转录调控来维持MGE前体细胞的细胞命运的，这些下游基因可能属于构成细胞间微环境的Notch信号、细胞粘附和EMT通路。另外，GSEA分析(Gene Set Enrichment Analysis)显示，Wnt和Notch信号的相关基因都在KO细胞中明显下调(图4D，图4E)，而在OE细胞中显著富集(图4F，图4G)。这些生物信息学的分析提示我们Notch信号可能作为Wnt信号的下游参与MGE前体细胞的命运调控。
为了进一步证实Notch信号的作用，对分化第25天的WT、KO、不加Dox处理与加Dox处理的OE细胞进行了相关Notch基因的mRNA水平的检测。结果显示，Notch信号的配体Jag1和受体Notch2的基因表达在KO细胞中显著下调，相应地，在OE细胞中明显上升(图5A)。而且，Jag1和Notch2的mRNA表达确实随着MGE的分化进程在不断增加(图5B)，这与在图1中显示的Wnt信号随着MGE的分化而激活的结论相一致。另外，为了确认β-catenin与Notch信号的结合，我们构建了HA-β-catenin-RE细胞系去进行ChIP-qPCR实验。在HA-β-catenin-RE细胞的分化过程中，第17-25天加入Dox诱导HA-β-catenin表达，第25天时将前体细胞富集进行ChIP-qPCR实验。实验结果显示，第25天时，HA-β-catenin确实与Jag1和Notch2在特定的DNA序列上结合(图5C)。这进一步证实了在MGE前体细胞中，Jag1和Notch2是Wnt信号的下游。除此之外，我们在MGE分化的第17到25天，在加Dox处理的OE细胞中加入一种Notch抑制剂，DAPT，β-catenin过表达引发的增殖信号的增强均被DAPT修复(图5D，图5E)。同时，DAPT还能修复β-catenin过表达导致的神经分化的削弱(图5F)。这些结果都有力地证明，Notch信号作为Wnt信号的下游参与了对MGE前体细胞的调控。
除了过表达β-catenin以外，还利用Wnt信号的激活剂CHIR99021来激活Wnt信号，以验证前面的实验结论。细胞培养方法参照实施例1第3部分，在分化的第17-25天将DMSO(CHIR99021的溶剂)和CHIR99021加入至细胞培液中，在第25天对两种不同处理的细胞进行荧光染色。结果显示，与加入DMSO的细胞相比，加入CHIR99021的细胞显示了显著增加的Brdu、Ki67、pH3信号，而Dcx的表达显著变弱，这提示CHIR99021激活Wnt信号后，可促进MGE前体细胞的增殖，并减弱其向神经分化的能力(图6A，图6B)。另外，无论加或不加CHIR99021处理，WT细胞都全部或显著表达前脑的标志物Foxg1和MGE的标志物Nkx2.1(图6C，图6D)，说明了分化第25天的WT细胞的细胞属性，是前脑腹侧MGE前体细胞。但是，一旦在第17-25天同时加入DAPT，CHIR99021引起的增殖增强、分化减弱的这些作用都能被DAPT有效修复(图6E-图6G)。这个结果证实了Wnt信号促进MGE前体细胞增殖的结果，也确认了Notch信号在这个过程中的介导调控作用。
实施例6
基于上述的实验结果，我们想进一步确定长期激活Wnt信号对MGE前体细胞的作用。我们在之前神经分化流程的基础上(参照实施例1第3部分)，在第25天后持续加入DMSO或CHIR99021，直至第55天(图7A)。在第55天，我们通过荧光显微镜的观察，发现在明视野下，加入CHIR99021的神经球数量更多，神经球体积也更大。通过荧光染色，我们发现，持续加入CHIR99021的细胞显示了显著增加的Ki67和pH3信号(图7B和图7C)，提示加入CHIR99021的细胞具有更强的增殖能力。另外，我们还将CHIR99021持续加入到第115天，在第115天通过荧光染色实验，我们发现了相似的实验结果，即持续加入CHIR99021可促进细胞的增殖能力(图7D和图7E)。在第55天，我们将MGE前体细胞贴壁分化为神经元，在第56天，明视野观察显示加入DMSO的细胞分化出的神经元数量较少，且神经元的突触生长较为简单，而加入CHIR99021的细胞分化得到的神经分则数量更多，且神经突触的生长更为复杂。荧光染色实验提示了相同的结果，即加入CHIR99021的细胞具有更稳定的神经分化能力(Tuj1是神经元的标志物)(图7F)。分化神经元的第30天，荧光染色实验显示加入CHIR99021的细胞可分化为人前脑腹侧GABA抑制性中间神经元，其中大部分神经元为SST亚型(图7G)。在我们的结果中，DMSO组的细胞验证了随着前体细胞的不断传代，细胞的增殖能力和分化能力都会逐渐下降，而CHIR99021则显示了强大的维持细胞增殖的能力，且能保持细胞正常的神经分化能力。为了验证通过CHIR99021分化得到GABA能神经元的生理功能，我们对70天的神经元进行了电生理的实验(图7H)(参照实施例1第12部分)。+30pA到+40pA的电流可引起正常的动作电位(图7I)。mIPSC的电流可被一种GABA受体抑制剂bicuculline阻断(图7J)，提示为产生的电流为mIPSC，证明产生的神经元为人前脑腹侧GABA抑制性中间神经元。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggactctgg aatccattct gg 22
<210> 2
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcccactcat acaggacttg gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggacgaaaca ccgtggactc tggaatccat tcgttttaga gcta 44
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttctagctc taaaacccag aatggattcc agagtccacg gtgtttc 47
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggacgaaaca ccgtcccact catacaggac ttgttttaga gcta 44
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<211> 44
<212> DNA
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tttctagctc taaaacaagt cctgtatgag tgggacggtg tttc 44
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<211> 22
<212> DNA
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gaaagtattt cgatttcttg gc 22
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ctagccttat tttaacttg 19
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tcaatgggtc atatcacag 19
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gactttcagt aaggcaatga a 21
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atgacatcaa gaaggtggtg 20
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cataccagga aatgagcttg 20
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cgatggtggg gtattgtgaa c 21
<210> 14
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<212> DNA
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<400> 14
ccggattttg gcgtatcaga c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
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ccgaggtcaa ctcttcatgg t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctggcacat tatcgcacat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggggcacgag tgatctgtg 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcatgatgtc tgggtaacgc t 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
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ctcgctggct acccaatttg 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggctgtcat ctatggtggt g 21
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<211> 20
<212> DNA
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aggaggagac gtgcgagaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
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cgagtccatg acttccaggt 20
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<212> DNA
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attcttggtg gtcgctaggt a 21
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<212> DNA
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cgccttctcc gatgtactgc 20
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gcttctgaca gacgccaact 20
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<212> DNA
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caccgatgat aaacatctcg gg 22
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagtcggcc ttcgtgtatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcttcttgt ccggctgtta ca 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgccatcct atctcagcta ca 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgcatgtct accaagtacg tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttcatgggg catataggtg g 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctgctgtct gttggtcata a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcggctac aacgtgacc 19
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atggcctaca acatgacgtt t 21
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gtttacgaca aggtggaacc a 21
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gtgccaacgg cctgatgta 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggtgagaac ggtaaagagc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcggctaca actacaccta ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtacatgctg cacaggaaga a 21
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tgcgagaacc ccgagaagt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggaccagaa cacctcgac 19
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agccatccag ttgcacgag 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtcgggcc acttgaagtt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcaggcgca tgtgtagaa 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttatgcaaa cagacgggac tt 22
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gagcggatca gcgtctacta caa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatactcctc acgcaccttg ct 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggaagtggt ggacatactc c 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagtacttgt agcgagcagc c 21
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cccagactcc gtcagtttct 20
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tcgctgaaga cttggaggat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtccatgcag aacgtgaacg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaccgcaat ggaggctatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgaaggcac aatcatcaat gtt 23
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tcccggatga atgggttgc 19
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gcgtacacaa tccccttgaa gta 23
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gggcgcgtca taaaaagcac 20
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tgaacggggt gtagtggatg t 21
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cctcccggct ttctttcctt c 21
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cacgcgtcat tgtgttacct g 21
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tgttaggacc tgaaaggtgg tg 22
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gatttgcaca tcaggactgc tac 23
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agaagtgcac ctgggaatgc 20
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<400> 82
cgacatccct gaaggttcca 20
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ccctcctcct gcttcaaagg 20
<210> 84
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ttcgttgcac acccgagaaa 20
<210> 85
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtggtgatg aattccctca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
aatccccatc agactaacag c 21

Claims (10)

1.一种人神经前体细胞的培养方法，包括：在合适条件下培养Wnt信号和/或Notch信号被外源性调控的人神经前体细胞。
2.如权利要求1所述的人神经前体细胞的培养方法，其特征在于，所述外源性调控包括外源性激活和/或外源性抑制和/或外源性过表达。
3.如权利要求2所述的人神经前体细胞的培养方法，其特征在于，通过Wnt信号激动剂外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Wnt信号，优选为在Wnt信号激动剂存在的条件下培养人神经前体细胞；
和/或，通过外源性Wnt蛋白外源性激活人神经前体细胞的Wnt信号，优选为在外源性Wnt蛋白存在的条件下培养人神经前体细胞；
和/或，通过基因编辑外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Wnt信号，优选为利用过表达β-catenin、Wnt配体蛋白、激活的Wnt受体蛋白激活和/或过表达人神经前体细胞的Wnt信号；
和/或，通过Wnt信号抑制剂外源性抑制人神经前体细胞的Wnt信号，优选为在Wnt信号抑制剂存在的条件下培养人神经前体细胞；
和/或，通过基因编辑外源性抑制人神经前体细胞的Wnt信号，优选为利用抑制β-catenin、Wnt配体蛋白、Wnt受体蛋白、TCF/LEF的表达抑制人神经前体细胞的Wnt信号；
和/或，通过Notch信号激动剂外源性激活和/或外源性过表达人神经前体细胞的Notch信号，优选为在Notch信号激动剂存在的条件下培养人神经前体细胞；
和/或，通过Notch信号抑制剂外源性抑制人神经前体细胞的Notch信号，优选为在Notch信号抑制剂存在的条件下培养人神经前体细胞。
4.如权利要求3所述的人神经前体细胞的培养方法，其特征在于，所述Wnt信号激动剂选自CHIR99021、SKL2001、Wnt agonist 1等中的一种或多种的组合；
所述外源性Wnt蛋白选自Wnt3a、Wnt1中的一种或多种的组合；
Wnt信号抑制剂选自DKK-1、XAV-939、IWP-2、IWR-1-endo中的一种或多种的组合；
所述Notch激活剂选自重组人源nuclear factor-κB、JAG1重组蛋白、JAG2重组蛋白中的一种或多种的组合；
所述Notch抑制剂选自DAPT、MK-0752、RO4929097、IMR-1、FLI-06、LY450139中的一种或多种的组合。
5.如权利要求1所述的人神经前体细胞的培养方法，其特征在于，被调控的Wnt信号包括Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt7A、Wnt7B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt16、FZD9、LRP5、LRP6中的一种或多种的组合；
被调控的Notch信号包括JAG1、NOTCH2、HEY1、HEY2、HES1、HES2、HES3中的一种或多种的组合。
6.如权利要求1所述的人神经前体细胞的培养方法，其特征在于，所述人神经前体细胞为人前脑皮层前体细胞和/或人前脑腹侧MGE前体细胞，所述人前脑腹侧MGE前体细胞为被诱导因子腹侧化的MGE前体细胞。
7.一种人神经前体细胞，由权利要求1～6任一权利要求所述的人神经前体细胞的培养方法培养获得。
8.如权利要求7所述的人神经前体细胞在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病选自急性神经退行性疾病和/或慢性神经退行性疾病。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病选自脑缺血、脑损伤、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓小脑共济失调、Pick病。
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