CN114836386A - 一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，属于生物医学工程技术领域，所述工程化外泌体为转染过表达Wnt1的转座子质粒的星形胶质细胞来源的外泌体，所述工程化外泌体表面负载有Wnt1蛋白和神经干细胞靶向肽，所述神经干细胞靶向肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该工程化外泌体可有效延长Wnt1蛋白的半衰期并增强其靶向性，更有效地促进神经干细胞的增殖及分化，并具有调节内源性神经干细胞增殖的作用，从而为神经退行性疾病临床治疗策略的探索和新型给药方式的遴选提供理论及实验基础。本发明还提供了一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法及应用。

Description

一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，特别涉及一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
神经退行性疾病是由神经元和/或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，出现功能障碍。MPTP性帕金森综合征是指由于MPTP中毒而引发的帕金森综合症，此症出现神经细胞的退行性变，主要病变部位在黑质和纹状体，是发生于中年以上成人黑质和黑质纹状体通路变性疾病。目前针对MPTP性帕金森综合征的治疗药物中，蛋白质成分和miRNA等游离的生物活性分子半衰期短，作为药物在体内运输时容易发生降解，且靶向性不佳，导致此类药物难以有效应用于神经退行性疾病的治疗中。
发明内容
为了解决神经退行性疾病药物半衰期短和靶向性不加的问题，本发明提供了一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，该工程化外泌体可有效延长Wnt1蛋白的半衰期并增强其靶向性，更有效地促进神经干细胞的增殖及分化，并具有调节内源性神经干细胞增殖的作用，从而为神经退行性疾病临床治疗策略的探索和新型给药方式的遴选提供理论及实验基础。
本发明还提供了一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法及应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本申请提供一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，所述工程化外泌体为转染过表达Wnt1的转座子质粒和PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒的星形胶质细胞来源的外泌体，所述工程化外泌体表面负载有Wnt1蛋白和神经干细胞靶向肽，所述神经干细胞靶向肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述过表达Wnt1的转座子质粒为PB4-CMV-Wnt1质粒，质粒图谱如附图9所示；
所述PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒包含所述神经干细胞靶向肽的编码基因，质粒图谱如附图8所示。
基于同一发明构思，本申请还提供一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，所述制备方法包括：
构建携带Wnt1基因的转座子系统，获得过表达Wnt1的转座子质粒；
构建携带神经干细胞靶向肽的编码基因的转座子系统，获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒；
将所述过表达Wnt1的转座子质粒和所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒转染至星形胶质细胞系中，筛选出转染成功的单个细胞并培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系；
裂解所述稳定表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，分离获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体。
进一步的，所述构建携带Wnt1基因的转座子系统，获得过表达Wnt1的转座子质粒，具体包括：
将Wnt1基因插入到PB4转座子系统中，后进行转化、单菌落培养和测序验证，抽提获得过表达Wnt1的转座子质粒。
进一步的，所述构建携带神经干细胞靶向肽的编码基因的转座子系统，获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒，具体包括：
将神经干细胞靶向肽的编码基因插入到PB4转座子系统中，后进行转化、单菌落培养和测序验证，抽提获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒。
进一步的，所述将所述过表达Wnt1的转座子质粒和所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒转染至星形胶质细胞系中，筛选出转染成功的单个细胞并培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，具体包括：
通过脂质体转染的方法，将所述过表达Wnt1的转座子质粒和所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒转染至星形胶质细胞系中，在转座子酶的作用下，将Wnt1基因和神经干细胞靶向肽编码基因剪切后整合至星形胶质细胞染色体上；
在抗生素的作用下，筛选出转染成功的单个细胞并培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系。
进一步的，所述裂解所述稳定表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，分离获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，具体包括：
裂解所述稳定表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，收集上清液，通过超速离心的方法进行分离提取，获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体。
进一步的，所述过表达Wnt1的转座子质粒为PB4-CMV-Wnt1质粒；所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒包含所述神经干细胞靶向肽的编码基因，质粒图谱如附图8所示，所述神经干细胞靶向肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
基于同一发明构思，本申请还提供一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。
进一步的，所述神经退行性疾病包括MPTP性帕金森综合征。所述神经退行性疾病的测试包括使用MPTP诱导的帕金森疾病的小鼠模型。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，以Wnt1基因和神经干细胞靶向肽的编码基因为目的基因，构建过表达Wnt1的转座子质粒和PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒，转染星形胶质细胞，分离获得的工程化外泌体表面负载有Wnt1蛋白和神经干细胞靶向肽，该工程化外泌体可有效延长Wnt1蛋白的半衰期，减少Wnt1蛋白在体内运输时发生的降解，神经干细胞靶向肽能够增强药物靶向性，使Wnt1蛋白能够更加高效地促进β-catenin蛋白的转核作用，进而促进神经干细胞的增殖及分化，并更有效地促进内源性神经干细胞的增殖，该工程化外泌体可为神经退行性疾病临床治疗策略的探索和新型给药方式的遴选提供理论及实验基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明wnt1过表达RNA水平验证和Lamp2b的表达RNA水平验证图。
图2为本发明EV-Wnt1的电镜图。
图3为本发明EV-Wnt1的粒径检测图。
图4为本发明EV-Wnt1处理神经干细胞后的细胞活力检测图。
图5为本发明EV-Wnt1处理神经干细胞后β-catenin的变化图。
图6为本发明EV-Wnt1对mpp+诱导的PD细胞模型的治疗效果图。
图7为本发明EV-Wnt1对MPTP诱导的PD小鼠模型内源性神经再生的作用图。
图8为本发明过表达Wnt1的转座子质粒的质粒图谱。
图9为本发明PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒的质粒图谱。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体进行详细说明。
实施例1
本实施例构建负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，包括以下步骤：
(1)构建携带神经干细胞靶向肽的编码基因的转座子系统，获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒：
利用PB4转座子系统，包含转座子和转座子酶，将目的基因(神经干细胞靶向肽编码基因)插入到PB4转座子系统中；再通过转化、单菌落培养和测序验证，最后抽提获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒，PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒的图谱如图8所示。
具体的，获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒的方法如下：
(1.1)PCR获取目的片段(Lamp2b)
以人源cDNA为模板，利用引物获取含有HA标签的Lamp2b目的片段，引物如下：
XhoI_LAMP2_F(SEQ ID NO.2):CCGCTCGAGTTTGGAACTTAATTTGACAGAT
AgeI_HA_LAMP2_R(SEQ ID NO.3):GATGACCGGTTCAAGCGTAATCTGGCACATCGTATGGGTACCGCTTCCCAGAGTCTGATATCCAGC
Template:人源cDNA Tm＝52.5℃L＝1.1kb
PCR体系如下：20ul
Figure BDA0003606618400000041
反应条件如下：
Figure BDA0003606618400000042
Figure BDA0003606618400000051
配制1.2％的琼脂糖凝胶，电泳后切胶回收。
(1.2)DNA剪切：以PCR获得的目的DNA为模板进行剪切，反应体系如下：10ul
Figure BDA0003606618400000052
在PCR仪上，37℃，反应≥4h,反应结束后，于PCR仪上，60℃，反应30min，灭活酶,于-20℃保存。
(1.3)质粒剪切：以PB4-CAGGS::XhoI/AgeI质粒为载体模板进行剪切，反应体系如下：50ul
Figure BDA0003606618400000053
在PCR仪上，37℃，反应≥4h，配制1.2％的琼脂糖凝胶，电泳后切胶回收，于-20℃保存。
(1.4)目的基因与质粒连接：反应体系如下：10ul
Figure BDA0003606618400000054
在PCR仪上，16℃，反应过夜，于-20℃保存。
(1.5)PB4-CAGGs-Lamp2b质粒的转化：
配制LB培养基，灭菌后加入氨苄抗生素，从-80℃冰箱中取出感受态，向感受态中加入5ul的连接好的质粒(50～100ng/ul)，混匀并42℃水浴热激90s；
热激结束后冷却，加入1ml不含抗生素的LB培养基，于37℃摇床中，180rpm，摇1h，再将菌液接种至含抗生素的固体培养基中，37℃过夜培养。
(1.6)测序
挑取8-10个菌落至10ul的ddH2O混匀，进行菌落PCR，反应体系如下：20ul
Figure BDA0003606618400000061
反应条件如下：
Figure BDA0003606618400000062
配制1.2％的琼脂糖凝胶，进行电泳，选择与阳性对照相同位置有明显条带的菌液，将其加至含有抗生素的LB液体培养基中。混匀后，放于37℃摇床中，180rpm，过夜，取1ml菌液送样测序：
测序引物：CAG-F(SEQ ID NO.4)：GTGACCGGCGGCTCTAGA
bGH-R(SEQ ID NO.5)：CAGAATAGAATGACACCTACTC
同时，取500ul菌液与50％的甘油1:1混合为保种液，混匀后冻存于-80℃冰箱中，测序结束后，选择测序正确的菌液抽提PB4-CAGGs-Lamp2b质粒，检测浓度，并保留测序正确的保种液。
(1.7)PB4-CAGGs-Lamp2b质粒与NFL肽(神经干细胞靶向肽)编码基因连接：
利用NheI酶、XhoI酶和HindIII酶酶切PB4-CAGGs-Lamp2b质粒和NFL肽段，反应体系同(1.1)、(1.2)和(1.3)，将切好的肽段和质粒连接，反应体系和条件同(1.4)，按照(1.5)和(1.6)转化质粒并测序，抽提后获得PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒。
其中，神经干细胞靶向肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
GCTAGCGCCACCATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCTCCGGATACTCCAGCTACTCCGCGCCGGTCTCCTCCTCGCTGTCCGTGCGCCGCAGCTACTCGTCCAGCTCTGGCTCTGGCAGTGGATCTGGCTCCGGTGGCTCGAGTACTGGGATGTGCTAGCGCCACCATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCTCCGGATCCCTGTCCTCCGGCCGCTCTAGCTCGGTGTACAGCTCCGCGTCCAGCTCGCGCGTCTCCTACGTCTCTTACGGCAGTGGATCTGGCTCCGGTGGCTCGAG。
上述神经干细胞靶向肽的编码基因编码的神经干细胞靶向肽能够靶向脑组织中的神经干细胞。
(2)构建携带Wnt1基因的转座子系统，获得过表达Wnt1的转座子质粒；
利用PB4转座子系统，包含转座子和转座子酶，将目的基因(Wnt1基因)插入到PB4转座子系统中；再通过转化、单菌落培养和测序验证，最后抽提获得过表达Wnt1的转座子质粒。具体的，获得过表达Wnt1的转座子质粒的方法如下：
(2.1)获取目的片段(Wnt1)
以我们现有的携带Wnt1的质粒(或以鼠源cDNA)为模板，利用引物获取目的片段。
引物如下：
EcoRI_CMV_F(SEQ ID NO.6):TGTTATAGATATCCCGAATTCCATTGATTATTGACTAGTTATTA
NheI_SV40-PA_R(SEQ ID NO.7):CACTTAGATTCAGCTGCTAGCAACTTGTTTATTGCAGCTT
Tm＝56℃L＝2.1kb
PCR体系如下：20ul
Figure BDA0003606618400000071
反应条件如下：
Figure BDA0003606618400000072
配置1.2％的琼脂糖凝胶，电泳后切胶回收
(2.2)DNA剪切：以PCR获得的目的DNA为模板进行剪切。
反应体系如下：10ul
Figure BDA0003606618400000073
Figure BDA0003606618400000081
在PCR仪上，37℃，反应≥4h，反应结束后，于PCR仪上，60℃，反应30min，灭活酶于-20℃保存。
(2.3)质粒剪切
以PB-TRE-RFP::EcoRI/NheI质粒为载体模板进行剪切。
反应体系如下：50ul
Figure BDA0003606618400000082
在PCR仪上，37℃，反应≥4h，配置1.2％的琼脂糖凝胶，电泳后切胶回收，于-20℃保存。
(2.4)目的基因与质粒连接
反应体系如下：10ul
剪切好的质粒 1.5ul
剪切好的DNA 4.5ul
Infusion酶 1.5ul
在PCR仪上，50℃，反应15min，加入30ul的TE Buffer稀释，于-20℃保存
(2.5)PB4-CMV-3XFLAG-mWnt1质粒的转化
配置LB培养基，灭菌后加入氨苄抗生素，其工作浓度为200mg/ml，从-80℃冰箱中取出感受态，向感受态中加入5ul的连接好的质粒(50～100ng/ul)，混匀并42℃水浴热激90s；
热激结束后冷却，加入1ml不含抗生素的LB培养基，于37℃摇床中，180rpm，摇1h，再将菌液接种至含抗生素的固体培养基中，37℃过夜培养。
(2.6)测序：挑取8-10个菌落至10ul的ddH2O混匀，进行菌落PCR
反应体系如下：20ul
Figure BDA0003606618400000083
Figure BDA0003606618400000091
反应条件如下：
Figure BDA0003606618400000092
配置1.2％的琼脂糖凝胶，进行电泳，选择与阳性对照相同位置有明显条带的菌液，将其加至含有抗生素的LB液体培养基中，混匀后，放于37℃摇床中，180rpm，过夜。
取1ml菌液送样测序
测序引物(SEQ ID NO.8)：CMV-F：ATGGGCGGTAGGCGTG
同时，取500ul菌液与50％的甘油1:1混合为保种液，混匀后冻存于-80℃冰箱中，测序结束后，选择测序正确的菌液抽提PB4-CMV-3XFLAG-mWnt1质粒，检测浓度，并保留测序正确的保种液。
(2.7)PB4-CMV-mWnt1质粒的构建
将如下引物各取10ul(10uM)混匀，涡旋15s，室温静置5min。
Spacer_F(SEQ ID NO.9):ccggtaaggttacaagacaggttta
Spacer_R(SEQ ID NO.10):agcttaaacctgtcttgtaacctta
利用AgeI和HindIII酶切PB4-CMV-3XFLAG-mWnt1质粒，连接反应反应体系如下：10ul
Figure BDA0003606618400000093
16℃，反应过夜，于-20℃保存
按照(2.5)、(2.6)转化质粒并测序，抽提后获得PB4-CMV-mWnt1质粒。
(3)构建高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系：
通过脂质体(lipo2000)转染的方法，将过表达Wnt1的转座子质粒PB4-CMV-Wnt1和PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒转染至星形胶质细胞系中，并在转座子酶(PBase)的作用下，将目的基因剪切下来整合至宿主细胞染色体上。
由于两种过表达Wnt1的转座子质粒具有抗性，因此在抗生素的作用下，可以杀死未转染成功的细胞。本实施例利用100ug/ul的Zeocin(博来霉素)和10mg/ml的Blasticidin(杀稻瘟菌素)筛选出具有抗性和靶向性的单个细胞并扩大培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系。
收集高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系并将其裂解，通过实时荧光定量PCR等技术检测转染前后细胞中Wnt1蛋白的表达情况，结果如图1所示。
具体的，将过表达Wnt1的转座子质粒PB4-CMV-Wnt1和PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒转染星形胶质细胞的具体步骤为：
(3.1)细胞系：星形胶质细胞系IMA2.1细胞；细胞铺板条件：12孔板，密度为4.8x104，待细胞生长成型(隔夜生长)后，转染质粒。
(3.2)转染条件如下：
质粒：PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b、PB4-CMV-Wnt1、PBase共转染
条件：三种质粒各1ug+100ul的Opti-MEM
2ul的Lipo2000+100ul的Opti-MEM
另取一带绿色荧光的质粒进行转染，作为效率检测，方法同。
转染前，弃掉原有含血清的培养基，更换为300ul的的Opti-MEM培养基。
(3.3)将(质粒+Opti)混匀后转移至混匀的(Lipo2000+Opti)中，混匀静置后，将混合液加入孔板中，转染6h后将培养基弃掉，更换为含有血清的培养基培养24h。
(4)分离工程化外泌体，检测外泌体中标记蛋白及Wnt1蛋白的表达情况：
收集高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系的裂解上清液，通过超速离心的方法提取获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体(ExtracellularVesicle-Wnt1，简称EV-Wnt1)，并通过电镜检测外泌体(粒径30-100nm)，结果如图2所示，通过Western Blot等方法检测所提取的外泌体上外泌体标记蛋白及Wnt1蛋白的表达情况，结果如图3。
其中，工程化外泌体的分离提取具体步骤如下：
(4.1)显微镜下观察细胞生长情况，细胞密度达到70％-90％后，则进行饥饿处理48h或用超离后的血清配的培养基培养48h后可开始进行外泌体提取；
(4.2)收集培养瓶中的培养基至50ml离心管中，每两瓶装一管(每管约30ml)，第一次离心，离心参数：1000g，10min，4℃，离心完毕后取上清液至新的50ml离心管；
(4.3)第二次离心，离心参数：10000g，30min，4℃，离心完毕后，此时离心管底部肉眼无法看见明显沉淀，用50ml注射器将上清液吸出，通过0.22μm的过滤器过滤，过滤液收集至超速离心机专用离心管中，过滤完毕后，将专用离心管及其内所装液体总质量配至37.7g～37.8g之间；
(4.4)第三次离心，超速离心机，离心参数：100,000g，70min，4℃，离心完毕后，此时外泌体沉淀于离心管底部，弃上清重悬外泌体后，转移至1.5ml EP管，于-80℃保存。
实施例2
本实施例在离体水平上检测星型胶质细胞来源的Ex-Wnt1对神经干细胞增殖的影响以及对Wnt下游信号通路的调控作用。
1.原代神经干细胞的培养。
从孕16-17天的孕鼠腹中获取胎鼠大脑皮层组织，提取神经干细胞进行培养。
2.探究转染过表达Wnt1的转座子质粒的星形胶质细胞分泌的EV-Wnt1对胎鼠来源的神经干细胞的影响：
利用收集的外泌体EV-Wnt1刺激培养的胎鼠皮层原代神经干细胞，通过CCK8检测神经干细胞的活力变化，结果如图4所示；利用细胞计数等方法检测EV-Wnt1处理前后细胞的增殖情况，并通过western blot及免疫组化等技术对Ev-Wnt1介导的Wnt/β-catenin信号通路进行检测，结果如图5。
3.活化的星形胶质细胞来源的EV-Wnt1中的Wnt1蛋白对PD(帕金森疾病)模型细胞的影响:
借助药理学和细胞生物学手段，利用神经毒素MPP+原代神经干细胞(小鼠胚胎皮层)上建立体外的PD细胞模型。
利用收集的外泌体EV-Wnt1刺激经过神经毒素MPP+处理的胎鼠皮层原代神经干细胞，并通过western blot等技术对Ev-Wnt1介导的Wnt/β-catenin信号通路进行检测，验证Ev-Wnt1对PD模型神经干细胞的治疗作用，结果如图6所示。
实施例3
本实施例对Ex-Wnt1在小鼠脑内的靶向及调控能力进行体内检验，探索具有靶向性的工程化外泌体对内源性神经再生的作用：
(1)首先采用MPTP对小鼠进行腹腔注射，构建PD模型小鼠；
(2)将收集的到的外泌体EV-Wnt1，通过鼻腔给药的方式，对PD模型小鼠进行治疗；通过BrdU标记和免疫组化的方法验证工程化外泌体对内源性神经再生的影响。
本实施例利用构建的外泌体EV-Wnt1，对帕金森疾病模型小鼠进行了治疗，并通过免疫荧光的方法对小鼠脑组织切片进行分析，结果如图7所示(其中Ctrl表示正常组小鼠，PD-PBS表示帕金森疾病模型小鼠空白对照组，PD-EV表示帕金森疾病模型小鼠普通外泌体治疗组，该治疗组的外泌体表面负载Wnt1蛋白但不负载神经干细胞靶向肽，PCD-EV-Wnt1表示帕金森疾病模型小鼠工程化外泌体治疗组；Merge表示合成图，Ki67表示神经细胞增殖情况，Nestin表示神经干细胞，DAPI表示细胞核)。
从图7可知，造模后，PD-PBS组Ki67的荧光减少，且较弱，经外泌体治疗后，这一现象得到逆转，并且PCD-EV-Wnt1组的逆转效果最为明显，细胞增殖明显增加，这表明EV-Wnt1促进了细胞的增殖，有效促进帕金森疾病模型小鼠的内源性神经再生。
附图1-7的详细说明：
附图1中，IMA2.1表示星形胶质细胞系，IMAP7WP表示过表达Wnt1蛋白且能表达靶向肽的星形胶质细胞系,从附图1可知，转染后Wnt1含量较对照组细胞相比明显升高(左)，且Lamp2B的含量也是升高的，表明成功将Lamp2B导入细胞系(右，原有细胞系不含有该基因或低表达)。
附图2为通过透射电镜检测到的外泌体的形态。
附图3为通过马尔文粒度仪检测倒外泌体的大小。
附图4中，经过100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml的EV-Wnt1处理后的神经干细胞活力增加，并且呈现剂量依赖，这表明EV-Wnt1可以增强神经干细胞的活力。
附图5中，经过EV-Wnt1处理后的神经干细胞，胞浆和胞核的β-catenin的含量都得到有效提高，这表明EV-Wnt1可以激活神经干细胞的Wnt信号通路并促进神经干细胞β-catenin的转核，并进一步促进增殖，β-catinin作为细胞增殖的指标，它的增加可以促进细胞的增殖；LaminB作为细胞核的内参。
附图6为经过mpp+处理后的神经干细胞在EV-Wnt1的治疗下，可以逆转由于mpp+(1-甲基-4-苯基吡啶碘化物，可通过抑制纹状体突触体中的线粒体氧化还原功能而诱发神经毒性而诱导帕金森疾病)引起的神经毒性造成的β-catenin、P-AKT和P-GSK-3β的含量下降，这表明EV-Wnt1可以有效抵抗神经毒性。
附图7为通过MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐)构建PD小鼠模型后，在EV-Wnt1的治疗下，经带红色荧光的Ki67标记的的细胞明显增多，这表明EV-Wnt1可以促进大脑侧脑室下区神经干细胞的再生。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 电子科技大学
<120> 一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体及其制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 453
<212> DNA
<213> 1(人工序列)
<400> 1
gctagcgcca ccatggtgtg cttccgcctc ttcccggttc cgggctcagg gctcgttctg 60
gtctgcctag tcctgggagc tgtgcggtct tatgcaggta actcgactat gggctccgga 120
tactccagct actccgcgcc ggtctcctcc tcgctgtccg tgcgccgcag ctactcgtcc 180
agctctggct ctggcagtgg atctggctcc ggtggctcga gtactgggat gtgctagcgc 240
caccatggtg tgcttccgcc tcttcccggt tccgggctca gggctcgttc tggtctgcct 300
agtcctggga gctgtgcggt cttatgcagg taactcgact atgggctccg gatccctgtc 360
ctccggccgc tctagctcgg tgtacagctc cgcgtccagc tcgcgcgtct cctacgtctc 420
ttacggcagt ggatctggct ccggtggctc gag 453
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 2(人工序列)
<400> 2
ccgctcgagt ttggaactta atttgacaga t 31
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 3(人工序列)
<400> 3
gatgaccggt tcaagcgtaa tctggcacat cgtatgggta ccgcttccca gagtctgata 60
tccagc 66
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 4(人工序列)
<400> 4
gtgaccggcg gctctaga 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 5(人工序列)
<400> 5
cagaatagaa tgacacctac tc 22
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 6(人工序列)
<400> 6
tgttatagat atcccgaatt ccattgatta ttgactagtt atta 44
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 7(人工序列)
<400> 7
cacttagatt cagctgctag caacttgttt attgcagctt 40
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 8(人工序列)
<400> 8
atgggcggta ggcgtg 16
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 9(人工序列)
<400> 9
ccggtaaggt tacaagacag gttta 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 10(人工序列)
<400> 10
agcttaaacc tgtcttgtaa cctta 25

Claims (10)

1.一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体为转染过表达Wnt1的转座子质粒和PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒的星形胶质细胞来源的外泌体，所述工程化外泌体表面负载有Wnt1蛋白和神经干细胞靶向肽，所述神经干细胞靶向肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，其特征在于，所述过表达Wnt1的转座子质粒为PB4-CMV-Wnt1质粒，质粒图谱如附图9所示；
所述PB4-CAGGs-NFL-TBS.40-63-LAMP2b质粒包含所述神经干细胞靶向肽的编码基因，质粒图谱如附图8所示。
3.一种如权利要求1或2所述的负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
构建携带Wnt1基因的转座子系统，获得过表达Wnt1的转座子质粒；
构建携带神经干细胞靶向肽的编码基因的转座子系统，获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒；
将所述过表达Wnt1的转座子质粒和所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒转染至星形胶质细胞系中，筛选出转染成功的单个细胞并培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系；
裂解所述稳定表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，分离获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体。
4.根据权利要求3所述的一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述构建携带Wnt1基因的转座子系统，获得过表达Wnt1的转座子质粒，具体包括：
将Wnt1基因插入到PB4转座子系统中，后进行转化、单菌落培养和测序验证，抽提获得过表达Wnt1的转座子质粒。
5.根据权利要求3所述的一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述构建携带神经干细胞靶向肽的编码基因的转座子系统，获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒，具体包括：
将神经干细胞靶向肽的编码基因插入到PB4转座子系统中，后进行转化、单菌落培养和测序验证，抽提获得PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒。
6.根据权利要求3所述的一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述将所述过表达Wnt1的转座子质粒和所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒转染至星形胶质细胞系中，筛选出转染成功的单个细胞并培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，具体包括：
通过脂质体转染的方法，将所述过表达Wnt1的转座子质粒和所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒转染至星形胶质细胞系中，在转座子酶的作用下，将Wnt1基因和神经干细胞靶向肽编码基因剪切后整合至星形胶质细胞染色体上；
在抗生素的作用下，筛选出转染成功的单个细胞并培养，获得高表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系。
7.根据权利要求3所述的一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述裂解所述稳定表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，分离获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体，具体包括：
裂解所述稳定表达Wnt1蛋白且稳定表达神经干细胞靶向肽的细胞系，收集上清液，通过超速离心的方法进行分离提取，获得负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体。
8.根据权利要求3所述的一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述过表达Wnt1的转座子质粒为PB4-CMV-Wnt1质粒；所述PB4-CAGGS-NFL-TBS.40-63-LAMP2B质粒包含所述神经干细胞靶向肽的编码基因，质粒图谱如附图8所示，所述神经干细胞靶向肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.一种如权利要求1所述的负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括MPTP性帕金森综合征。
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