CN115869284A - 一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其改造方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，该所述转运载体为带有RVG‑Lamp2b的工程化改造的外泌体，负载药物分子后，经鼻给药后靶向受损神经元，通过将包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白的质粒转染进细胞中形成分泌细胞，分泌目标外泌体，经提取后得到外泌体，作为转运载体应用于神经退行性疾病的诊断、治疗和预测。该外泌体对神经元的靶向性好，选择性高，低毒性、低免疫原性和高可工程性，并通过鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，提高药物穿脑效率，降低治疗所需的药物浓度。
Description
技术领域
本发明涉及神经退行性疾病治疗领域，具体涉及一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其改造方法及应用。
背景技术
神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)是以发作迟缓和选择性神经元的功能障碍为特征表现，由于大脑和脊髓的神经元细胞丧失而引起的一类不可逆转的神经系统疾病,主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease,PD)和亨廷顿氏病(Huntington’s disease,HD)等。这些疾病临床表现均为认知功能下降,虽然其具有不同的组织病理学特征,但可能具有共同的细胞和分子机制。开发靶向受损神经元的治疗方式，成为治疗神经退行性疾病有效的手段，对提高老年人的生命质量和寿命具有重要的理论和实际意义。
尽管已经开发出能够优先靶向受损神经元细胞而不伤害正常组织的药物，但由于难以穿透血脑屏障，将这些药物运送到大脑仍然是一个重大挑战且由于难以在大脑中维持有效的药物剂量，许多治疗药物的进一步开发受到阻碍。此外，利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)等可以在基因水平上抑制神经退行性疾病理性损伤蛋白的异常表达，然而由于非编码RNA在体循环中易于降解以及缺乏合适的传输提呈系统，以RNA干扰为基础的临床治疗受到阻碍。
在针对神经退行性疾病的外泌体治疗方法中，使用外泌体作为转运载体是一个最新的发展。外泌体具有在细胞间穿梭的能力，具有成为治疗多种疾病工具的潜能，但是缺乏靶向性，其临床应用受到一定阻碍。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其工程化改造方法及应用，对神经元的靶向性好，选择性高，低毒性、低免疫原性和高可工程性，并通过鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，提高药物穿脑效率，降低治疗所需的药物浓度。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，研究发现通过工程化技术使外泌体表面表达某些分子，可使外泌体具有组织特异性趋向，装载各种分子(药物或siRNA)后可靶向特定组织/器官。其中，改良的狂犬病毒糖蛋白(RVG)配体本身与神经特异性乙酰胆碱受体相互作用，带有RVG-Lamp2b的工程化外泌体能使siRNA或者药物转运到神经元细胞质内，治疗疾病。
通过配受体之间的相互作用，我们发现RVG-Lamp2b工程化外泌体也可以在鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，避免了内容物受体内核酶以及氧化还原酶的影响，并提高药物穿脑效率，降低治疗所需的药物浓度。目前，利用外泌体治疗神经疾病的给药方法绝大部分为普通静脉注射，但是，鼻腔内给药普遍认为到达脑部的距离更短；此外，鼻腔给药是一种非侵入式的、允许重复给药、患者接受度较高的方法。
具体技术方案如下：一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，所述转运载体为带有RVG-Lamp2b的工程化改造的外泌体，负载药物分子后，经鼻给药后靶向受损神经元。
本发明的第二个目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞，所述分泌细胞由质粒转染细胞中制成，该质粒碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白，在RVG-Lamp2b重组蛋白的羧基末端区域添加了HA标签并带有氨苄青霉素抗性基因。
本发明的第三个目的是提供一种上述分泌细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:转染前，细胞接种于含10％FBS的DMEM-高糖培养基；
S2:转染时，细胞汇合度为50-60％，吸去旧的培养基，用PBS洗涤，然后加入13-17ml无双抗无血清的培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中；
S3:在离心管中分别加入无双抗无血清的DMEM和质粒轻柔混合制成DNA稀释液，其体积质量比为1：15～20(ml/ug),室温下静置；
S4:在另一个离心管里分别加入无双抗无血清的DMEM和Reliable TransfectinReagent,轻柔混匀，制成Reliable Transfectin Reagent稀释液，其体积比为20～25:1室温下静置；
S5:复合步骤S3和步骤S4中的稀释液，制成DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，室温下静置；
S6:培养皿中加入DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，晃动培养皿稍加混匀；
S7:在5％CO2、37℃培养箱中孵育4～6h用新鲜的完全培养基替换含有转染复合物的培养基，形成产生目标外泌体的分泌细胞。
进一步地，所述分泌细胞中外泌体的提取方法，包括以下步骤：
S1:收集细胞培养液，于4℃下300g离心10～15min除去培养液中残留的细胞，3000g离心10～15min除去培养液中残留的死细胞，10000g离心30～40min除去培养液中的细胞碎片；
S2:将上述步骤S1收集的培养液进行超速冷冻离心，4℃下160000～170000g离心60～70min，弃去上清，用预冷的PBS重悬贴壁沉淀即可获得外泌体。
进一步地，将步骤S2获得的外泌体过0.22um的滤头获得纯度更高且分散的外泌体；多个离心柱沉淀合管，重新离心后外泌体浓度提高。
本发明的第四个目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体在制备神经退行性疾病诊断、治疗和预测药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞在制备神经退行性诊断、治疗和预测药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.靶向性好，选择性高。对外泌体表面分子的靶向修饰改造赋予其细胞和组织特异性，利用工程化改造的外泌体向神经元细胞递送药物分子；本发明提供的外泌体相比一般外泌体靶向性好，与神经组织内细胞的融合情况好，且本发明的外泌体对神经元有特异性，对脑组织中其他小胶质细胞和星形胶质细胞没有特异性；
2.本发明通过工程化外泌体介导的药物递送具有低毒性、低免疫原性和高可工程性，并有望用于多种疾病的无细胞疗法；
3.本发明工程化外泌体在鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，避免了内容物受体内核酶以及氧化还原酶的影响，并提高药物穿脑效率，降低治疗所需的药物浓度；外泌体鼻腔给药方式是一种非侵入式的、允许重复给药、患者接受度较高的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1提供的RVG-Lamp2b质粒结构图；
图2为实施例1工程化改造方法实验模式图；
图3为普通外泌体和靶向外泌体在嗅球、运动皮层、海马以及黑质与神经元融合情况；
图4为普通外泌体和靶向外泌体在嗅球、运动皮层、海马以及黑质与小胶质细胞融合情况；
图5为普通外泌体和靶向外泌体在嗅球、运动皮层、海马以及黑质与星形胶质细胞融合情况。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的发明方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
(一)细胞系和细胞培养
HEK293T细胞购系购自上海生命科学院细胞所，HEK293T细胞系培养于含有10％胎牛血清(FBS)，1％双抗的高糖培养基液中，其培养条件为37℃，5％二氧化碳的环境。经两天传代一次，按照贴壁细胞的传代方式传代。
(二)RVG-Lamp2b质粒构建
RVG-Lamp2b质粒(pcDNA GASTM-3-RVG-10-Lamp2b-HA，Plasmid#71295)购买自北京中源合聚生物科技有限公司，该质粒包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白。在RVG-Lamp2b重组蛋白的羧基末端区域添加了HA标签并带有氨苄青霉素抗性基因，如图1及序列表所示。
(三)分泌细胞的构建
(1)转染前，细胞接种于含10％FBS的DMEM-高糖培养基；
(2)转染时，细胞汇合度为50-60％，吸去旧的培养基，用PBS洗涤两次，然后每孔加入15ml无双抗无血清的DMEM(凯基)培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中；
(3)在eppendorf管里分别加入1.5ml无双抗无血清的DMEM和24ug质粒轻柔混合制成DNA稀释液，室温下静置5min；
(4)在另一个eppendorf管里分别加入1.5ml无双抗无血清的DMEM和60ulReliable Transfectin Reagent,注意用前轻柔混匀，制成Reliable TransfectinReagent稀释液，室温下静置5min；
(5)复合(3)和(4)中的稀释液，制成DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，室温下静置20min；
(6)培养皿中加入DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，晃动培养皿稍加混匀；
(7)在5％CO2、37℃培养箱中孵育5h，用新鲜的完全培养基(含血清和双抗)替换含有转染复合物的培养基。
注：所用Tip头已做去Rnase处理。
(四)外泌体分离
质粒细胞转染后，HEK293T细胞培养基中分离的普通外泌体以及RVG-Lamp2bHEK293T细胞培养基分离的RVG-Lamp2b外泌体，具体步骤如下：
(1)收集细胞培养液，于4℃下300g离心10分钟除去培养液中残留的细胞，3000g离心10分钟除去培养液中残留的死细胞，10000g离心30分钟除去培养液中的细胞碎片；
(2)将上述收集的培养液上超速冷冻离心机(贝克曼)，4℃下170000g离心70分钟，弃去上清，用预冷的PBS重悬贴壁沉淀即可获得外泌体，将该外泌体过0.22um(BIOFIL)的滤头可获得纯度更高且分散的外泌体，如需提高外泌体的浓度可多个离心柱沉淀合管，重新离心；
(3)将收集好的外泌体用于实验或者-80℃保存。
(五)外泌体标记
外泌体用红色亲脂染料DIL标记。DIL染料稀释成4mM,将分离得到的外泌体与DIL染料按照1：1的比例混合5分钟，将标记上亲脂染料的外泌体再次在超速冷冻离心机(贝克曼)，4℃下170000g离心70分钟即可获得带有荧光标记的外泌体。为防止外泌体聚集，在外泌体使用前用0.22um的过滤器过滤。
(六)外泌体鼻腔滴注
外泌体用PBS配成浓度200ug/ml并储存在-80℃。小鼠分为普通外泌体组(Exo)和靶向外泌体组(RVG-Lamp2b-Exo)，小鼠按照体重计算1％戊巴比妥钠(0.01ml/g)用量麻醉后每个鼻孔先用5ul的透明质酸酶处理(100U；Solarbio)提高鼻粘膜的通透性。30分钟后，每只小鼠每个鼻孔每隔5分钟滴加10ul Exo或者RVG-Lamp2b-Exo。每只老鼠共计滴注80ul外泌体量。6小时后小鼠处死分离脑组织。
(七)组织分离，固定，沉糖，切片，保存
小鼠分别称重，根据体重计算1％戊巴比妥钠(0.01ml/g)用量，然后腹腔注射进行麻醉。打开胸腹充分暴露心脏、肝脏，用镊子将心包膜打开，将灌注针插入左心室并固定，打开灌注泵开关，同时剪开右心耳。先灌注4℃预冷的0.9％NaCl，至肝脏逐渐变白色、右心耳流出清亮液体为止，再灌注4℃预冷的多聚甲醛固定液。固定液进入血管后，小鼠的四肢、尾巴开始抽搐，表明灌注液入脑，待抽动停止，全身组织器官变硬后即可停止灌注。小鼠断头取脑，将脑组织仔细完整分离，分组标记，放入4％多聚甲醛固定液后固定，4℃冰箱过夜。将鼠脑从后固定液取出，用滤纸吸去表面残液，转移入20％蔗糖溶液，4℃过夜。第二日移入30％蔗糖溶液，4℃沉糖，待脑组织沉底后移入新30％蔗糖溶液待用。将脑组织从蔗糖取出，用滤纸吸干表面液体，OCT包埋后，用冰冻切片机进行连续冠状位切片，疏水性粘附载玻片贴片，按照贴片顺序放入切片盒内，于20℃保存，制得冷冻切片。
(八)免疫荧光染色
冰冻切片37℃复温30min，PBS清洗。PBS稀释山羊血清原液，并加入TritonX 100，混匀后覆盖脑片，室温封闭1h，甩掉多余液体。稀释一抗，混匀后覆盖脑片，4℃孵育过夜。将一抗孵育后切片于37℃复温30min，PBS清洗。稀释荧光二抗，混匀后覆盖脑片，室温孵育2h后，PBS清洗。孵育DAPI染色液，室温15min，PBS清洗。抗荧光淬灭剂封片，使用共聚焦显微镜观察、拍照。
(九)实验结果分析
如图3～图5所示，鼻腔滴注外泌体在嗅球、运动皮层、海马以及黑质部位分别与神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞融合情况，普通外泌体组(Exo)和靶向外泌体组(RVG-Lamp2b-Exo)与神经组织内细胞的融合情况有较大差异。由图3可知，靶向外泌体组含有外泌体的神经元百分比远高于普通外泌体组，说明靶向外泌体组与神经元的融合情况远好于普通外泌体组，由图4可知，可以看出，靶向外泌体组含有外泌体的小胶质细胞百分比与普通外泌体组相当，由图5可知，靶向外泌体组含有外泌体的星形胶质细胞百分比与普通外泌体组无明显差异，因此可以得知，本发明的靶向外泌体对神经元有特异性，对小胶质细胞和星形胶质细胞没有特异性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，其特征在于，所述转运载体为带有RVG-Lamp2b的工程化改造的外泌体，外泌体具有组织特异性趋向，装载药物分子后，经鼻给药后靶向受损神经元。
2.一种权利要求1所述的经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞，其特征在于，所述分泌细胞由质粒转染细胞中制成，该质粒碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白，在RVG-Lamp2b重组蛋白的羧基末端区域添加了HA标签并带有氨苄青霉素抗性基因。
3.一种权利要求2所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:转染前，细胞接种于含10％FBS的DMEM-高糖培养基；
S2:转染时，细胞汇合度为50-60％，吸去旧的培养基，用PBS洗涤，然后加入13-17ml无双抗无血清的培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中；
S3:在离心管中分别加入无双抗无血清的DMEM和质粒轻柔混合制成DNA稀释液，其体积质量比为1：15～20(ml/ug),室温下静置；
S4:在另一个离心管里分别加入无双抗无血清的DMEM和Reliable TransfectinReagent，轻柔混匀，制成Reliable Transfectin Reagent稀释液，其体积比为20～25:1室温下静置；
S5:复合步骤S3和步骤S4中的稀释液，制成DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，室温下静置；
S6:培养皿中加入DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，晃动培养皿稍加混匀；
S7:在5％CO2、37℃培养箱中孵育4～6h用新鲜的完全培养基替换含有转染复合物的培养基，形成产生目标外泌体的分泌细胞。
4.根据权利要求3所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，其外泌体提取方法包括以下步骤：
S1:收集细胞培养液，于4℃下300g离心10～15min除去培养液中残留的细胞，3000g离心10～15min除去培养液中残留的死细胞，10000g离心30～40min除去培养液中的细胞碎片；
S2:将上述步骤S1收集的培养液进行超速冷冻离心，4℃下160000～170000g离心60～70min，弃去上清，用预冷的PBS重悬贴壁沉淀即可获得外泌体。
5.根据权利要求4所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，将步骤S2获得的外泌体过0.22um的滤头获得纯度更高且分散的外泌体；多个离心柱沉淀合管，重新离心后外泌体浓度提高。
6.权利要求1所述的一种经鼻给药靶向神经元的转运载体在制备神经退行性疾病诊断、治疗和预测药物中的应用。
7.权利要求2所述的一种经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞在制备神经退行性诊断、治疗和预测药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN114836386A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-08-02 | 电子科技大学 | 一种负载Wnt1蛋白且靶向脑组织的工程化外泌体及其制备方法和应用 |
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