CN113215104A - 一种含有CD10-dm蛋白的外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种含有CD10‑dm蛋白并且能靶向到脑组织的外泌体及其制备方法和应用。本发明的外泌体装载有酶活性及特异性增强的CD10蛋白，并且外泌体表面展示能靶向结合脑神经细胞乙酰胆碱受体的RVG短肽。该外泌体经静脉给药后，可以穿过血脑屏障，与乙酰胆碱受体阳性的神经细胞特异结合，从而将CD10‑dm蛋白运送至神经细胞内，高效并特异的降解引起阿兹海默病的Aβ蛋白，增强抗炎基因的表达，同时抑制促炎基因的表达。此外，该外泌体与受体细胞的相容性好，不会引起受体的免疫反应和炎症反应，能显著降低基因治疗的毒副作用；对阿兹海默病的治疗具有积极作用。

Description

一种含有CD10-dm蛋白的外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种装载CD10-dm蛋白并且能靶向到脑组织的外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
阿兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是严重威胁人类健康的神经退行性病变，探索安全高效的治疗方案是医学研究的热点。脑啡肽酶(CD10)属于锌依赖的金属蛋白酶，广泛表达于各种细胞。CD10可以在疏水氨基酸氨基端切割蛋白质，从而使多种肽类激素失活。CD10也可以切割引起阿兹海默病的Aβ蛋白。CD10经基因工程引入G399V/G714K双突变(CD10-dm)后可以使其活性增加20倍，切割肽类激素的活性降低3200倍，从而大大提高了CD10切割Aβ蛋白的活性及特异性，因此对阿兹海默病具有巨大的治疗潜能。
外泌体(exosome)是几乎所有细胞分泌的，直径约40-150nm的含脂质双层膜的纳米颗粒。外泌体也存在于所有体液中，是细胞-细胞通讯和物质交换的重要方式。外泌体是由细胞膜连续两次内陷形成的：细胞膜内陷形成内含体，内含体的膜内陷形成多囊泡体，多囊泡体与细胞膜融合释放外泌体。在内含体的膜内陷时，选择性地包裹胞浆中的蛋白质，脂质，及miRNA、mRNA、DNA、lncRNA等核酸。当外泌体与受体细胞结合后，将其内容物运送到受体细胞，进而影响受体细胞生理及病理过程。此外，由于外泌体的膜来源于细胞膜的两次连续内陷，因此外泌体膜蛋白的空间构象与细胞膜蛋白一致，籍此可以通过基因工程修饰细胞膜蛋白从而将归巢肽(配体)展示在外泌体的表面，赋予外泌体靶向性。研究发现，外泌体具有良好的生物分布和组织相容性，天然，稳定，保护所包裹分子不被降解，可穿透生物屏障，低免疫源性/毒性，还可以同时携带多种治疗制剂，是理想的药物运送载体。
虽然，生理条件下机体分泌的CD10可以降解脑神经细胞中及分泌到胞外的Aβ蛋白，但是在阿兹海默病时，神经细胞内大量的Aβ蛋白堆积及聚集。另外自然生成的CD10降解Aβ蛋白的特异性不强。因此，提高CD10的活性同时降低其水解肽类激素的活性，将提高其对阿兹海默病的治疗作用。但外源性重组CD10经静脉给药后不能穿透血脑屏障，而且容易被降解，因此需要借助于药物运送载体。传统的药物运送载体(如脂质体)可以运送重组蛋白类药物，但其制备成本高、半衰期短、漏药、脂质体融合、磷脂的氧化、及可溶性低等缺陷，因此需要寻找一种更加安全、高效的药物运送载体。由于外泌体具有天然稳定、纳米尺寸、低免疫原性、无细胞毒性、且能穿过生物屏障等优良特性，外泌体作为药物运送载体将具有巨大的应用价值。
天然形成的外泌体在形成过程中选择性富集胞浆中的信号分子，但其选择机制尚待进一步了解。因此，治疗药物的包裹仍是外泌体药物运送技术的难点之一。目前，将外源药物装载主要有以下方法：(1)电转染：将药物与外泌体混合，通过电穿孔的方式将其导入外泌体；(2)反复冻融法：将外泌体与药物混合后反复冻融将其包装到外泌体；(3)超声法：将外泌体与药物混合后通过超声将其包装到外泌体；(4)借助化学药物(Saponin)穿孔法：将外泌体、治疗药物、及Saponin混合后，利用Saponin的膜穿孔作用将药物包入外泌体中；(5)采用基因工程细胞：将编码治疗蛋白的基因克隆到表达载体中，将该载体在外泌体“发生细胞”中过表达，胞浆中过量表达的目的蛋白在外泌体的形成过程中就被包装到外泌体中。
前四种方法主要借助一定的理化刺激改变外泌体膜的结构完整性，从而将外源药物被动装载到外泌体内。这些方法在某种程度上改变外泌体的膜结构或者引入了化学物质(如Saponin)，而且包装效率有限。而第(5)种方法因不同的重组蛋白在不同细胞中的表达、载体的种类，及细胞的转染方法等因素的限制，需要根据载体的种类、“发生细胞”的种类及培养方法、培养环境等进行针对性选择，才可能得到装载容量大、稳定性及相容性好的外泌体。此外，方法(5)还可以对外泌体进行靶向修饰。
天然来源的外泌体具有一定的靶向性，但是其靶向的机理尚未了解，因此无法选择性的利用。由于外泌体的膜来源于细胞膜连续两次内陷，因此外泌体膜蛋白的空间构象与细胞膜蛋白一致，籍此可以通过基因工程修饰细胞膜蛋白从而将归巢肽(配体)展示在外泌体的表面，赋予外泌体靶向性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种装载有大量CD10-dm蛋白、并能够靶向脑神经细胞的外泌体，同时提供了该外泌体的制备方法和在用于制备治疗阿兹海默病的药物上的相关应用。
为达到上述发明目的，本发明提供了一种外泌体，所述外泌体装载有过表达CD10-dm基因的细胞生成的CD10-dm蛋白，所述外泌体表面展示RVG短肽。
所述外泌体能够以乙酰胆碱受体依赖的方式在脑组织靶向富集。
本发明外泌体装载了大量的CD10-dm蛋白，并且外泌体表面展示了RVG短肽。RVG短肽可以将该外泌体靶向到乙酰胆碱受体阳性的受体细胞，从而能显著提高受体细胞中CD10-dm水平，进而降解引起阿兹海默病的Aβ蛋白及其聚合体，抑制炎症反应相关基因的表达，促进抗炎基因的表达。同时，由于该外泌体具有良好的组织相容性，不会引起受体的免疫反应和炎症反应，克服了传统脂质体载体运送的毒副作用，对阿兹海默病有良好的治疗作用。
优选的，所述外泌体中含有大量的CD10-dm蛋白，而常规外泌体中不含有CD10和CD10-dm蛋白。
所述外泌体中，过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞为CD10-dm和RVG-LAMP2b基因被大量的转录和翻译，因此CD10-dm和RVG-LAMP2b均高水平表达。上述外泌体中CD10-dm的含量越高，则对受体细胞中Aβ的降解作用越强，对阿兹海默病的治疗效果越好；上述外泌体中RVG-LAMP2b的含量越高，则靶向乙酰胆碱受体阳性脑神经细胞的靶向能力越强，对CD10-dm靶向运送的效果越好；所述常规外泌体是指未过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的正常细胞分泌的外泌体。
优选的，所述外泌体通过过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞分泌而形成。为了提高CD10-dm蛋白在RVG修饰的外泌体中的装载量，用RVG-LAMP2b与CD10-dm共转染工具细胞，从此分离的外泌体将在其表面展示RVG，同时富集CD10-dm蛋白。
优选的，所述外泌体来源于HeLa细胞。所述HeLa细胞经瞬时转染后过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b，从而分泌表面展示RVG短肽内包大量CD10-dm的外泌体。
所述外泌体通过过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞分泌而形成。
优选的，所述HeLa细胞，是通过以下制备方法制备得到的：
A.pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒构建：人工合成RVG短肽的DNA编码序列；将所述RVG短肽的DNA编码序列同框架融合在LAMP2b cDNA信号肽序列与成熟LAMP2b蛋白之间，得到RVG-LAMP2b融合基因序列；将所述RVG-LAMP2b融合基因序克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒；
B.pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒构建：利用重叠PCR技术将G399V/G714K双引入CD10 cDNA中，得到CD10-dm cDNA；将所述CD10-dm cDNA克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒；
C.HeLa细胞的建立：用pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒和pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒共转染常规HeLa细胞，得到所述过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞。
共转染8-12小时后，更换成无血清培养基，再继续培养36-48小时。收集培养基，进行外泌体的分离及纯化。通过上述方法制备得到的HeLa细胞能高效的过表达pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b和pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm，从而提供含有大量CD10-dm且能靶向乙酰胆碱受体阳性脑神经细胞的外泌体。
优选的，步骤C中，pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒和pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒的比例为1:1。
优选的，步骤A中，
RVG短肽的蛋白质序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG，对应的cDNA序列(SEQID NO.1)为
5’-TATACCATTTGGATGCCGGAAAACCCGCGCCCGGGCACCCCGTGC
GATATTTTTACCAACAGCCGCGGCAAACGCGCGAGCAACGGC-3’。
重叠PCR时的模版为Human LAMP2b cDNA(NCBI Reference Sequence:NM_013995.2)。
采用重叠PCR技术将RVG cDNA克隆到LAMP2b蛋白第31-32位氨基酸之间，形成RVG-LAMP2b融合基因，所用引物如表1所示。
优选的，步骤A中使用的Human LAMP2b cDNA来自于HEK293细胞。
培养HEK293细胞，用Trizol法提取总RNA，然后经反转录酶反转录成LAMP2b cDNA。
其中，优选的，步骤A中使用的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1是包含有ZsGreen编码基因的双顺反子载体。所述外泌体中含有大量的ZsGreen蛋白，常规外泌体中不含有ZsGreen蛋白。
过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞生成的外泌体中含有大量的ZsGreen蛋白，而常规外泌体中不含有ZsGreen蛋白。
其中，优选的，步骤A中，将RVG-LAMP2b融合基因载入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的方法为：将RVG-LAMP2b融合基因及pLVX-IRES-ZsGreen1载体都用XhoI和BamHI进行双酶切后，用T4 DNA连接酶进行连接。
其中，优选的，步骤A中，用细菌转化的方法对pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒进行增殖。具体的方法为：将pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性的单克隆菌落进行扩大培养，从而提取得到大量pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒。
优选的，步骤B中，人CD10 cDNA(NCBI Reference Sequence:NM_000902.5)作为重叠PCR的模版。所用引物如表1所示。经过连续两次重叠PCR后，得到含有双突变的CD10cDNA，即CD10-G399V/G714K cDNA，也即CD10-dm cDNA。
表1 重叠PCR引物序列
Figure BDA0003064219340000061
其中，优选的，步骤B中使用的CD10 cDNA来自于HEK293细胞。培养HEK293细胞，用Trizol法提取总RNA，然后经反转录酶反转录合成CD10 cDNA。
其中，优选的，步骤B中使用的载体pLVX-IRES-ZsGreen1是包含有ZsGreen编码基因的双顺反子载体。
ZsGreen是第三代绿色荧光蛋白，是亮度最高的荧光蛋白，便于细胞转染效率的监测和流式分选阳性细胞。ZsGreen荧光蛋白的表达可作为目的基因表达的间接“指示剂”，并且ZsGreen荧光蛋白不与目的蛋白融合，不影响目的蛋白的正常结构和功能。将pLVX-IRES-ZsGreen1质粒转染到受体细胞后，受体细胞将高表达ZsGreen绿色荧光蛋白。随后，ZsGreen荧光蛋白将伴随着外泌体形成过程中包含体膜内陷，被装载到受体细胞形成的外泌体中。随着外泌体与受体细胞的融合，ZsGreen绿色荧光蛋白被运送到受体细胞。因此外泌体中装载的ZsGreen绿色荧光蛋白可作为研究外泌体在细胞间转运以及在动物体内示踪研究的有力工具。
其中，优选的，步骤B中，将CD10-dm cDNA载入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的方法为：将CD10-dm cDNA及pLVX-IRES-ZsGreen1载体都用NheI和BamHI进行双酶切后，用T4DNA连接酶进行连接。
其中，优选的，步骤B中，用细菌转化的方法对pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒进行增殖；具体的方法为：将pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性的单克隆菌落进行扩大培养，从而提取得到大量pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒。
优选的，步骤C中，在对HeLa细胞进行转染前2h，换成无抗生素的DMEM培养基对HeLa细胞进行培养，能使细胞处于更好的生长状态，从而提高转染效果。所述无抗生素的DMEM培养基含10％FBS。
为达到上述发明目的，进一步的，本发明还提供了一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞；
(2)将过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞在无血清的DMEM中进行培养，培养完成后，收集培养液；
(3)将步骤(2)收集到的培养液进行分离提纯，得到含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
上述外泌体的制作方法具体为制作含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体的方法，利用过表达CD10-dm和RVG的细胞能在细胞内转录生成大量CD10-dm和RVG-LAMP2bmRNA，这些mRNA经翻译生成大量的CD10-dm蛋白和RVG-LAMP2b融合蛋白。CD10-dm蛋白存在于胞浆，并在外泌体的形成过程中被包入外泌体中。RVG-LAMP2b融合蛋白被转运到细胞膜，在细胞膜内陷形成外泌体时便将RVG展示在外泌体的表面。通过对过表达CD10-dm和RVG的细胞的培养，使细胞在生长和增殖过程中大量分泌含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体到培养基中；再经分离提纯，得到装载有大量CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体；该制备方法操作简单、稳定可靠，适合大规模，标准化生产。
上述含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体的制备方法，
其中，优选的，步骤(2)中过表达含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的细胞转染后10h，用PBS洗一次，更换成无血清培养基，继续培养36-48h；优选的操作可去除残留的培养基血清中的外泌体，提高细胞分泌的外泌体的纯度。
其中，优选的，步骤(2)中，对转染后的HeLa细胞进行培养，培养方法为：将转染后的HeLa细胞培养8-12h后，换用DMEM无血清培养基进行培养，继续培养36-48h完成培养。
其中，优选的，步骤(2)中，将过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞在无血清的DMEM培养基中培养时间为36-48h；最优选的，培养时间为48h；培养时间过短，细胞生成的外泌体数量少，分离产量低，培养时间过长，细胞活力会明显降低，细胞死亡增加，会有更多的细胞碎片以及细胞死亡相关的小分子结构分泌到培养基中，使外泌体的质量和纯度下降。
上述含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体的制备方法，其中，优选的，步骤(3)中，对培养液的分离提纯方法包括如下步骤：
a、将培养液在4℃，200g的条件下离心10min，取上清液备用；
b、将a中得到的上清液在4℃，3000g离心10min，取上清液备用；
c、将b中得到的上清液在4℃，10000g离心30min，取上清液备用；
d、将c中得到的上清液在4℃，100000-160000g离心70-120min，沉淀备用；
e、在d中得到的沉淀中加入PBS重悬沉淀，并在4℃，100000-160000g的条件下离心70-120min，沉淀为含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
其中，最优选的，步骤d、步骤e中离心速度均为120000g，离心时间为90min；通过优选，可去除细胞培养基中的死细胞、细胞碎片和大分子蛋白颗粒，得到的外泌体纯度更高。
上述含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体的制备方法，其中，优选的，步骤(2)、步骤(3)中细胞的培养条件均为：温度37℃，CO2浓度为5％，通过优选，细胞在培养过程中能保持正常稳定的生长速度和生理状态。
其中，步骤(2)、步骤(3)中所述的培养液是指将细胞培养完成后，除去细胞后剩下的液体。
本发明还提供了一种含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体的应用。
本发明还提供所述外泌体在制备作为治疗阿兹海默病药物的应用。
含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体可用于治疗阿兹海默病。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明外泌体由过表达CD10-dm和RVG4-LAMP2b基因的细胞分泌而成，外泌体表面展示RVG短肽，其内装载有常规外泌体中不含有的CD10-dm蛋白和ZsGreen，并能将装载的大量CD10-dm靶向运送到乙酰胆碱受体阳性的脑神经细胞，能显著提高受体细胞中CD10-dm的含量。
2、本发明制备得到的外泌体表面展示RVG短肽，RVG短肽可以靶向结合乙酰胆碱受体阳性的神经细胞，因此本发明制备的外泌体可以在高表达乙酰胆碱受体的脑神经细胞中大量富集，并将装载的CD10-dm靶向运送到脑神经细胞。
3、本发明制备得到的外泌体中含有大量的CD10-dm，在体外其降解N2a细胞中Aβ的能力优于脂肪干细胞来源的外泌体，同时优于含有大量CD10-wt的外泌体。
4、本发明制备得到的外泌体中含有大量的ZsGreen绿色荧光蛋白，可以不需要荧光探针标记，直接用于外泌体在细胞间转运及在动物体内示踪研究。
5、本发明外泌体可用与阿兹海默病的治疗，本发明的外泌体能够应用于制备用于治疗阿兹海默病的药物。
附图说明
图1是本发明表面展示RVG靶向肽的外泌体的性能鉴定结果。
(A)pLVX-IRES-ZsGreen1-Lamp2b-RVG质粒结构图，RVG短肽插入到LAMP2b第31-32位氨基酸之间；(B)过表达pLVX-IRES-ZsGreen1的HEK293细胞来源的对照外泌体的纳米追踪分析图；(C)过表达RVG-hLAMP2b融合蛋白的HEK293细胞来源的外泌体的纳米追踪仪分析图，插图是该外泌体的电镜照片；(D)Western blot显示该外泌体表达外泌体特异性蛋白CD9和CD63，而不表达内质网特异蛋白GPR94和Calnexin。
图2是本发明的外泌体在细胞水平靶向效果验证结果。
表面展示RVG的外泌体进入PC12,HEK293,HeLa和PC3细胞的量与a7-乙酰胆碱受体基因(CHRNA7)表达水平成正比。
(A)CM-DiL荧光标记的表面展示RVG的外泌体进入PC12、HEK293、HeLa和PC3细胞的量与a7-乙酰胆碱受体基因(CHRNA7)表达水平成正比；(B)PC12、HEK293、HeLa和PC3细胞CHRNA7基因表达水平的相对定量检测结果；(C)荧光标记的表面展示RVG的外泌体进入PC12、HEK293、HeLa和PC3细胞的定量统计结果；(D)荧光标记的表面展示RVG的外泌体进入PC12、HEK293、HeLa和PC3细胞的流式细胞术检测结果；(E)荧光标记的表面展示RVG的外泌体进入PC12、HEK293、HeLa和PC3细胞的流式细胞定量统计图。
图3是对比例1中小鼠脂肪间充质干细胞(mADSC)的特征鉴定结果；(A)第0代2-3天小鼠脂肪干细胞集落显微镜图，第1代9天和第2代12天小鼠脂肪干细胞在光镜下呈典型的成纤维细胞状、或纺锤形；(B-C)小鼠脂肪干细胞表达CD29和Sca-1,而不表达CD45和CD11b的流式细胞分析图及定量图；(D)小鼠脂肪干细胞可以分化成脂肪细胞(D上)、骨(D中)、和软骨(D下)；(E)Western blot显示小鼠脂肪干细胞(#1，#2，and#3)表达CD10蛋白；(F)小鼠脂肪间充质干细胞来源的外泌体含有CD10；(G)小鼠脂肪干细胞的纳米追踪仪分析图。
图4是本发明的实施例1中的富含有CD10-dm和对比例2富含有CD10-wt的外泌体的对比结果；
(A)pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒结构图，CD10-dm cDNA中包含了CD10-G399V(左)、CD10-G714K(右)两个位点突变；(B)CD10-dm、CD10的基因测序验证结果，CD10-dm引入了G399V(上)、G714K(下)两个位点突变；(C)Western blot显示转染CD10、CD10-dm质粒的HeLa细胞过表达CD10和CD10-dm；(D)Western blot显示过表达野生型CD10和CD10-dm的HeLa细胞产生的外泌体含高丰度的CD10wt和CD10dm。
图5是本发明实施例1获得的外泌体装载CD10、ZsGreen蛋白的检测结果；
(A)Western blot显示转染pLVX-IRES-ZsGreen1及共转染pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm、pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG质粒的HeLa细胞过表达CD10-dm；(B)Western blot显示过表达pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm、pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG质粒的HeLa细胞产生的外泌体含高丰度的CD10dm；(C)EXO-RVG-CD10dm外泌体将ZsGreen蛋白转运到N2a细胞，荧光检测显示，加入EXO-RVG-CD10dm外泌体的N2a细胞ZsGreen蛋白质含量明显高于加入等量EXO-pLVX对照外泌体的N2a细胞。
图6是本发明实施例1、对比例1和对比例2获得的外泌体治疗效果比较；
(A)EXO-RVG-CD10dm外泌体将CD10-dm蛋白转运到N2a细胞，免疫荧光检测显示，加入EXO-RVG-CD10dm外泌体的N2a细胞CD10蛋白质含量明显高于加入等量EXO-Control对照外泌体的N2a细胞；(B)EXO-RVG-CD10dm和EXO-mADSCs外泌体颗粒大小无差异(n＝3，p>0.05)；(C)EXO-RVG-CD10dm和EXO-mADSCs外泌体颗粒浓度无差异(n＝3，p>0.05)；(D)EXO-RVG-CD10dm外泌体与对照外泌体(EXO-Control)(n＝3，*p<0.05)和EXO-mADSC(n＝3，#p<0.05)相比，显著降低了N2a细胞内的Aβ蛋白合成；(E)EXO-RVG-CD10dm外泌体与对照外泌体(EXO-Control)(n＝3，**p<0.01)和EXO-mADSC(n＝3，##p<0.01)相比，显著降低了N2a细胞Aβ蛋白的分泌。
图7是本发明的实施例1与对比例2的治疗效果验证结果；
EXO-RVG-CD10dm外泌体经静脉给药后优先分布于大脑的海马区域，并发挥抗炎作用(A)给予EXO-RVG-CD10dm外泌体的小鼠其海马区的绿色明显强于给予EXO-Control外泌体(B)与EXO-Control外泌体相比，EXO-RVG-CD10dm外泌体显著抑制了炎性基因IL1α(n＝3，p<0.05)，TNFα(n＝3，p<0.01)和NF-kB(n＝3，p<0.05)的表达，同时增加了抗炎因子IL10(n＝3,p<0.05)的表达，而对IL1β,IL6,BCL2和BACE1的表达无影响。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的实施和检测方法
(1)外泌体靶向效果检测
利用表达神经细胞靶向肽的质粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-LAMP2b-RVG)瞬时转染HeLa细胞，超速离心提取细胞培养基中的外泌体(RVG-EXO)；利用CM-DiL染料标记外泌体，并与高表达α7-nAChR及低表达α7-nAChR的细胞共孵育，通过流式细胞分析及荧光显微镜验证RVG-EXO的靶向性；
CM-DiL标记外泌体的具体方式为，用一种红色荧光亲脂染料CM-DiL标记外泌体。用DPBS稀释母液至工作浓度为2μM，与外泌体进行孵育，37℃，5min，4℃，15min，PBS洗脱，100000g，80min获取外泌体沉淀，以无血清培养基重悬后孵育目的细胞。24小时后于倒置荧光显微镜下观察并拍摄图片。实验细胞，HEK293细胞、HeLa细胞、PC3细胞、PC12细胞、N2a细胞均购于上海细胞库。
(2)EXO-RVG-CD10dm外泌体的提取及鉴定
构建表达野生型及含双位点突变的CD10质粒，通过基因测序验证表达质粒；将质粒瞬时转染HeLa细胞，通过Western blot验证CD10的表达；利用超速离心法提取细胞培养基中的外泌体，通过纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体的物理特性，通过Western blot验证外泌体中CD10的富集。
(3)EXO-mADSC外泌体的提取及鉴定
分离培养小鼠脂肪干细胞(mADSC)，通过Western blot验证mADSC内源性CD10的表达。
(4)EXO-RVG-CD10dm抑制N2a细胞合成Aβ40肽的实验检测。
用pLVX-IRES-ZsGreen1-LAMP2b-RVG分别和CD10野生型或双突变质粒共转染HeLa细胞，将提取的外泌体及小鼠脂肪干细胞外泌体(mADSC-EXO)与阿尔茨海默病体外模型N2a细胞共孵育，通过ELISA检测细胞外及细胞内的Aβ肽水平。
具体方式为，将基因修饰的外泌体或mADSC-EXO(工作浓度30μg/mL)加入到过量产生Aβ的N2a细胞中孵育24小时，ELISA试验分别检测细胞外和细胞内的Aβ水平。
(5)EXO-RVG-CD10dm在小鼠脑组织中的定位及功能检测
EXO-RVG-CD10dm外泌体和EXO-Control(150μg溶解在150μlPBS中)通过尾静脉注射C57BL/6小鼠(20周龄)，6小时后，小鼠经戊巴比妥钠麻醉(50mg/kgi.p.)，取脑组织分成2份，其中1份提取RNA，用实时定量PCR检测炎症相关基因的表达，另1份制作冰冻切片。
脑组织切片置于4％多聚甲醛中固定10min；PBS冲洗3次，5min/次；切片上滴加DAPI染液(1μg/ml)，室温避光孵育10min；PBS避光冲洗3次，5min/次，封片；用荧光显微镜检测GFP绿色荧光和DAPI。实验动物，C57BL/6小鼠，年龄20周，购于成都达硕实验动物有限公司(中国，四川)。
脑组织置于液氮中冷冻研磨，用Trizol提取总RNA，用TOYOBO试剂盒进行逆转录合成cDNA。逆转录体系包括：RNA 1μg、5×RT Master 2μL、DEPC水补足至10μL。逆转录步骤：①逆转录体系配制操作在冰上进行，PCR管中加入1μg RNA，瞬时离心，放入PCR仪，65℃，5min变性后立即放在冰上，静置5min，瞬时离心；②RNA中加入用DEPC水配好的5×RT Master逆转体系，瞬时离心后上PCR仪；③逆转条件：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，保存。逆转结束后，用DEPC水对cDNA进行稀释，稀释比例1:3。
取1μlcDNA，用iQ CyberGreen Mix(BioRad)试剂盒进行实时定量PCR检测。PCR条件为：95℃5min；94℃20sec,60℃20sec,72℃30sec，45个循环。基因相对表达量用2-ΔΔCt进行计算。PCR引物序列如下表2。
表2 qRT-PCR引物序列表
Figure BDA0003064219340000141
Figure BDA0003064219340000151
采用GraphPad Prism7.0进行统计分析。数据结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组数据之间使用unpaired，two-tailed Student t test检验，*表示p<0.05，而**表示p<0.01。所有实验至少重复三次。
实施例1
(1)制备过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞；
A.pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒构建：
A1，人工合成RVG短肽的DNA编码序列；RVG短肽的蛋白质序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG，
对应的cDNA序列(SEQ ID NO.1)为：
TATACCATTTGGATGCCGGAAAACCCGCGCCCGGGCACCCCGTGCGATATTTTTACCAACAGCCGCGGCAAACGCGCGAGCAACGGC。
重叠PCR时的模版为Human LAMP2b cDNA(NCBI Reference Sequence:NM_013995.2)
A2，将所述RVG短肽的DNA编码序列同框架融合在LAMP2b cDNA信号肽序列末端，得到RVG-LAMP2b融合基因序列；
采用重叠PCR技术将RVG cDNA克隆到LAMP2b第31-32位氨基酸之间,形成RVG-LAMP2b融合基因。所用引物为：上游外引物UpXho、下游外引物DnBam、上游重叠引物RVGup、下游重叠引物RVGdn，引物序列如表1所示。
使用的Human LAMP2b cDNA来自于HEK293细胞。
培养HEK293细胞，用Trizol法提取总RNA，然后经反转录酶反转录成LAMP2b cDNA。
A3，将所述RVG-LAMP2b融合基因序列克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1是包含ZsGreen编码基因的双顺反子载体。将RVG-LAMP2b融合基因载入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体的方法为：将RVG-LAMP2b融合基因及pLVX-IRES-ZsGreen1载体都用XhoI和BamHI进行双酶切，用T4 DNA连接酶进行连接。得到pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒；
用细菌转化的方法对pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒进行增殖。具体的方法为：将pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性的单克隆菌落进行扩大培养，从而提取得到大量
pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒。
B.pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒构建：
B1，利用重叠PCR技术将G399V/G714K双突变引入野生型CD10 cDNA中，得到CD10-dm cDNA；
人CD10 cDNA(NCBI Reference Sequence:NM_000902.5)作为重叠PCR的模版。所用引物为：CD10FB、CD10RN、399VF、399VR、714KF、714KR，引物序列如表1所示。
人CD10 cDNA来自于HEK293细胞。培养HEK293细胞，用Trizol法提取总RNA，然后经反转录酶反转录成CD10 cDNA。
B2，将所述CD10-dm cDNA克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，步骤B中使用的载体pLVX-IRES-ZsGreen1是包含有ZsGreen编码基因的双顺反子载体。将CD10-dm cDNA载入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的方法为：将CD10-dm cDNA及pLVX-IRES-ZsGreen1载体都用NheI和BamHI进行双酶切后，用T4DNA连接酶进行连接。
得到pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒；用细菌转化的方法对pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒进行增殖；具体的方法为：将pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性的单克隆菌落进行扩大培养，从而提取得到大量pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒。
C.HeLa细胞的建立：用pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒和pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒共转染HeLa细胞。pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒和pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒的比例为1:1。
在对HeLa细胞进行转染前2h，换成无抗生素的DMEM培养基对HeLa细胞进行培养，能使细胞处于更好的生长状态，从而提高转染效果。所述无抗生素的DMEM培养基含10％FBS。
(2)将过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞在无血清的DMEM中进行培养，培养完成后，收集培养液；
将步骤C得到的转染后的HeLa细胞培养8-12h后，换用DMEM无血清培养基进行培养，继续培养48h完成培养。
(3)将步骤(2)收集到的培养液进行分离提纯，得到含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
a、将培养液在4℃，200g的条件下离心10min，取上清液备用；
b、将a中得到的上清液在4℃，3000g离心10min，取上清液备用；
c、将b中得到的上清液在4℃，10000g离心30min，取上清液备用；
d、将c中得到的上清液在4℃，120000g离心90min，取沉淀备用；
e、在d中得到的沉淀中加入PBS重悬沉淀，并在4℃，120000g的条件下离心90min，沉淀为含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
其中，步骤(2)、步骤(3)中所述的培养液是指将细胞培养完成后，除去细胞后剩下的液体。得到的外泌体编号为EXO-RVG-CD10-dm。
其中，优选的，步骤(2)、步骤(3)中细胞的培养条件均为：温度37℃，CO2浓度为5％，通过优选，细胞在培养过程中能保持正常稳定的生长速度和生理状态。
实施例2
(1)制备过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞，同实施例1；
(2)将过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞在无血清的DMEM中进行培养，培养完成后，收集培养液；
将步骤C得到的转染后的HeLa细胞培养10h后，换用DMEM无血清培养基进行培养，继续培养36h完成培养。
(3)将步骤(2)收集到的培养液进行分离提纯，得到含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
a、将培养液在4℃，200g的条件下离心10min，取上清液备用；
b、将a中得到的上清液在4℃，3000g离心10min，取上清液备用；
c、将b中得到的上清液在4℃，10000g离心30min，取上清液备用；
d、将c中得到的上清液在4℃，160000g离心120min，取沉淀备用；
e、在d中得到的沉淀中加入PBS重悬沉淀，并在4℃，160000g的条件下离心120min，沉淀为含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
其中，步骤(2)、步骤(3)中所述的培养液是指将细胞培养完成后，除去细胞后剩下的液体。
相对于实施例1，在步骤(2)中，对Hela细胞培养时间较短，细胞生成的外泌体数量少，分离产量低。
实施例1步骤d、步骤e的离心条件是120000g离心90min，这样的离心条件已经足够使培养基中的外泌体充分沉淀。相对于实施例1，实施例2中步骤d、步骤e中离心速度均为160000g，离心时间为120min。更高的离心力和更长的离心时间，并不能增加外泌体沉淀的产量，反而会增加外泌体形态受损的风险。
对比例1
含CD10-wt的小鼠脂肪间充质干细胞外泌体(EXO-mADSC)的制备。
取C57BL/6小鼠的腹股沟脂肪，分离培养小鼠脂肪间充质干细胞(mADSC)。mADSC在一周内增殖至汇合度90％，倒置显微镜下可见原代脂肪间充质干细胞分离后呈克隆样生长，散在细胞具有间充质干细胞的典型细长放射状形态(图3A)；经传代培养后，这些细胞显示了强大的自我更新能力。图3中，流式分析结果显示这些细胞能够表达间充质干细胞的特定表面标志蛋白如CD29和Scal-1，不表达CD45和CD11b，说明实验中使用的mADSC纯度较高。
为验证脂肪间充质干细胞表达CD10膜蛋白，mADSC经Western blot分析显示其表达内源性的CD10(CD10-wt)。由mADSC来源的外泌体经纳米颗粒追踪仪分析显示：该外泌体呈球形，直径在120nm左右，每10ml细胞培养基所得外泌体颗粒数浓度约1.8×108个/ml(图3G)。
对比例2
含有CD10-wt的Hela细胞对照外泌体(EXO-Control)的制备。
(1)制备过表达CD10-wt的HeLa细胞；
A.pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒构建：
人CD10 cDNA来自于HEK293细胞。培养HEK293细胞，用Trizol法提取总RNA，然后经反转录酶反转录成CD10 cDNA。所用引物如下。
CD10FB：5’-AGATGGATCCATGGGCAAGTCAGAAAGTCA-3’；
CD10RN：5’-TATTGCTAGCTCACCAAACCCGGCACTTCT-3’；
将所述CD10-wt cDNA克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上。将CD10-wt cDNA载入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的方法为：将CD10-wt cDNA及pLVX-IRES-ZsGreen1载体都用NheI和BamHI进行双酶切后，用T4 DNA连接酶进行连接。
得到pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒；用细菌转化的方法对pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒进行增殖；具体的方法为：将pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性的单克隆菌落进行扩大培养，从而提取得到大量pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒。
B.HeLa细胞的建立：用pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒转染HeLa细胞。
在对HeLa细胞进行转染前2h，换成无抗生素的DMEM培养基对HeLa细胞进行培养，能使细胞处于更好的生长状态，从而提高转染效果。所述无抗生素的DMEM培养基含10％FBS。
(2)将过表达CD10-wt的HeLa细胞在无血清的DMEM中进行培养，培养完成后，收集培养液,提取外泌体，具体操作与实施例1中步骤(2)、步骤(3)相同。
试验例1
实施例1的EXO-RVG-CD10-dm外泌体和对比例2的EXO-Control外泌体的鉴定。
EXO-RVG-CD10-dm外泌体由过表达pLVX-IRES-ZsGreen1-Lamp2b-RVG和pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒的HeLa细胞产生。EXO-Control外泌体由过表达pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-wt质粒的HeLa细胞产生。
如图1(A)所示，pLVX-IRES-ZsGreen1-Lamp2b-RVG质粒结构图显示RVG短肽插入到LAMP2b第31-32位氨基酸之间。如图4(A)所示，pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒显示，CD10-dm cDNA中包含了CD10-G399V(左)、CD10-G714K(右)两个位点突变，其相应的基因测序验证结果如图4(B)所示，CD10-dm引入了G399V(上)、G714K(下)两个位点突变。
纳米颗粒跟踪分析检测结果如图1(B)，(C)所示，EXO-RVG-CD10-dm和EXO-Control两种外泌体粒径主要集中在100nm。Western blot结果如图1(D)所示，EXO-RVG-CD10-dm表达外泌体特异性蛋白CD9和CD63,而不表达内质网特异蛋白GPR94和Calnexin。图4(D)显示，过表达野生型CD10和CD10-dm的HeLa细胞产生的外泌体含高丰度的CD10wt和CD10dm。
实验结果显示，EXO-RVG-CD10-dm和EXO-Control两种外泌体粒径无差异，均具有外泌体的典型特征。EXO-RVG-CD10-dm外泌体含有高丰度的CD10-dm蛋白，EXO-Control外泌体含有高丰度的CD10-wt蛋白。
试验例2
外泌体靶向效果检测
利用表达神经细胞靶向肽的质粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-LAMP2b-RVG)瞬时转染HeLa细胞，超速离心提取细胞培养基中的外泌体(RVG-EXO)；利用CM-DiL染料标记外泌体，并与高表达α7-nAChR及低表达α7-nAChR的细胞共孵育，通过流式细胞分析及荧光显微镜验证RVG-EXO的靶向性；
如图2所示，流式细胞术及荧光显微镜检测均验证RVG-EXO外泌体进入PC12,HEK293,HeLa和PC3细胞的量与a7-乙酰胆碱受体基因(CHRNA7)表达水平成正比。所述RVG-EXO外泌体能够以乙酰胆碱受体依赖的方式在乙酰胆碱受体阳性的神经细胞富集。
试验例3
对比例1的小鼠脂肪间充质干细胞外泌体(EXO-mADSC)的特征鉴定
对比例1的含CD10-wt的EXO-mADSC外泌体由小鼠脂肪间充质干细胞产生，如图3(A)所示，第0代2-3天小鼠脂肪干细胞呈集落状态，第1代9天和第2代12天小鼠脂肪干细胞在光镜下呈典型的成纤维细胞状、或纺锤形；图3(B-C)显示，小鼠脂肪干细胞表达CD29和Sca-1,而不表达CD45和CD11b；图3(D)显示，小鼠脂肪干细胞可以分化成脂肪细胞(D上)、骨(D中)、和软骨(D下)；Western blot检测如图3(E-F)所示，小鼠脂肪间充质干细胞(#1,#2,and#3)表达CD10蛋白，EXO-mADSC外泌体含有CD10蛋白；图3(G)显示，EXO-mADSC外泌体粒径主要集中在100nm。
实验结果显示，EXO-mADSC外泌体粒径主要集中在100nm，符合外泌体的经典特征，并且外泌体含有CD10蛋白。
试验例4
实施例1获得的外泌体装载并转运CD10、ZsGreen蛋白的检测
为了验证实施例1获得的EXO-RVG-CD10-dm外泌体中CD10-dm的装载效率，本研究将EXO-RVG-CD10-dm与两种常规外泌体(HeLa细胞产生的外泌体EXO-HeLa；转染pLVX-IRES-ZsGreen1的HeLa细胞产生的外泌体EXO-pLVX)进行对比，结果如图5(A-B)所示，HeLa细胞和转染pLVX-IRES-ZsGreen1的HeLa细胞不表达CD10和CD10-dm蛋白，由此产生的两种常规外泌体中也不表达CD10和CD10-dm蛋白，过表达RVG和CD10-dm的HeLa细胞中高表达CD10-dm蛋白，由此产生的EXO-RVG-CD10-dm外泌体中装载了大量的CD10-dm蛋白。
pLVX-IRES-ZsGreen1、pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm、pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG均为含有ZsGreen的双顺反子质粒。因此，过表达含有ZsGreen的双顺反子质粒的HeLa细胞及其外泌体中都含有大量的ZsGreen蛋白。因此，如图5(C)所示，加入EXO-pLVX和EXO-RVG-CD10dm外泌体的N2a细胞均能检测到ZsGreen蛋白，而加入EXO-HeLa的N2a细胞检测不到ZsGreen蛋白。EXO-RVG-CD10dm外泌体表面含有RVG靶向肽，因此，加入EXO-RVG-CD10dm的N2a细胞ZsGreen蛋白质含量明显高于加入等量EXO-pLVX的N2a细胞。这一结果进一步证明EXO-RVG-CD10dm能够靶向到N2a细胞。
实验结果证明，EXO-RVG-CD10-dm外泌体中装载了大量的CD10-dm蛋白，而常规外泌体中不含有CD10-dm蛋白。EXO-RVG-CD10-dm外泌体中含有大量的ZsGreen蛋白，常规外泌体EXO-HeLa不含ZsGreen蛋白。外泌体中装载的ZsGreen绿色荧光蛋白可作为研究外泌体在细胞间转运以及在动物体内示踪研究的有力工具。
试验例5
实施例1、对比例1和对比例2获得的外泌体治疗效果比较；
试验例1已证实EXO-RVG-CD10dm含有大量的CD10-dm蛋白，EXO-Control含有大量的CD10-wt蛋白。图6(A)免疫荧光结果显示，两种外泌体分别加入N2a细胞后，均可将携带的CD10蛋白转运到N2a细胞。由于EXO-RVG-CD10dm外泌体表面带有RVG靶向肽，因此加入EXO-RVG-CD10dm外泌体的N2a细胞CD10蛋白质含量明显高于加入等量EXO-Control对照外泌体的N2a细胞。试验例3已证实EXO-mADSCs含有大量的CD10-wt蛋白，并且如图6(B-C)所示，EXO-RVG-CD10dm和EXO-mADSCs外泌体颗粒大小无差异(n＝3,p>0.05)，外泌体颗粒浓度无差异(n＝3,p>0.05)。
三种外泌体分别加入到N2a细胞后，图6(D-E)ELISA结果显示，与对照外泌体(EXO-Control)(n＝3,*p<0.05)和EXO-mADSC(n＝3,#p<0.05)相比，EXO-RVG-CD10dm外泌体显著降低了N2a细胞内的Aβ蛋白合成。图6(E)显示，与对照外泌体(EXO-Control)(n＝3,**p<0.01)和EXO-mADSC(n＝3,##p<0.01)相比，EXO-RVG-CD10dm外泌体显著降低了N2a细胞Aβ蛋白的分泌。
实验结果证明，EXO-RVG-CD10dm向N2a细胞转运CD10蛋白的效率比EXO-Control更加出色，EXO-RVG-CD10dm抑制N2a细胞Aβ蛋白合成及分泌的作用显著优于EXO-Control和EXO-mADSC。
试验例6
实施例1与对比例2的外泌体在整体动物水平的靶向及治疗效果对比；
为了验证外泌体在整体动物水平的靶向作用及治疗效果，EXO-RVG-CD10dm和EXO-Control外泌体分别经尾静脉注射到小鼠体内。试验例4已证实EXO-RVG-CD10dm和EXO-Control外泌体都含有ZsGreen，可直接用于外泌体在细胞间的转运研究。如图7(A)所示，ZsGreen荧光蛋白优先分布于大脑的海马区域，并且给予EXO-RVG-CD10dm外泌体的小鼠其海马区的绿色荧光明显强于给予EXO-Control外泌体的小鼠海马区。如图7(B)显示，与EXO-Control外泌体相比，EXO-RVG-CD10dm外泌体显著抑制了小鼠脑组织中炎性基因IL1α(n＝3,p<0.05),TNFα(n＝3,p<0.01)和NF-kB(n＝3,p<0.05)的表达,同时增加了抗炎因子IL10(n＝3,p<0.05)的表达，对IL1β,IL6,BCL2和BACE1的表达无影响。
实验结果证明，EXO-RVG-CD10dm经尾静脉注射给药后，能够穿过血脑屏障，在小鼠大脑海马区大量富集并且发挥抗炎作用，进一步在整体动物水平证实实施例1的外泌体具有更加出色的靶向效果和抗炎作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南医科大学
<120> 一种含有CD10-dm蛋白的外泌体及其制备方法和应用
<141> 2021-05-13
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 87
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tataccattt ggatgccgga aaacccgcgc ccgggcaccc cgtgcgatat ttttaccaac 60
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
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tataccattt ggatgccgga aaacccgcgc ccgggcaccc cgtgcgatat ttttaccaac 60
agccgcggca aacgcgcgag caacggcctt aatttgacag attcaga 107
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<212> DNA/RNA
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cgggttttcc ggcatccaaa tggtatattc caatgcataa gaccgca 107
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aggatgttga gcgtctgtgg 20
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tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims (10)

1.一种外泌体，其特征在于：所述外泌体装载有过表达CD10-dm基因的细胞生成的CD10-dm蛋白，所述外泌体表面展示RVG短肽。
2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于：所述外泌体中含有CD10-dm蛋白。
3.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体通过同时过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞分泌而形成。
4.根据权利要求3所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体来源于过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞。
5.根据权利要求4所述的外泌体，其特征在于：所述过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞是通过以下制备方法得到的：
A.pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒构建：人工合成RVG短肽的DNA编码序列；将所述RVG短肽的DNA编码序列融合在LAMP2b cDNA信号肽与成熟蛋白之间，得到RVG-LAMP2b融合基因序列；将所述RVG-LAMP2b融合基因序列克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒；
B.pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒构建：利用重叠PCR技术将G399V/G714K双突变引入CD10 cDNA中，得到CD10-dm cDNA；将所述CD10-dm cDNA克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒；
C.HeLa细胞的建立：用pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒和pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒共转染常规HeLa细胞，得到所述过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞。
6.根据权利要求5所述的外泌体，其特征在于，步骤C中，pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒和pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒的比例为1:1。
7.根据权利要求5所述的外泌体，其特征在于：步骤A和/或步骤B中使用的载体pLVX-IRES-ZsGreen1是包含有ZsGreen编码基因的双顺反子载体；所述外泌体中含有ZsGreen蛋白。
8.一种如权利要求1-7任一项所述外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞；
(2)将过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞在无血清的DMEM中进行培养，培养完成后，收集培养液；
(3)将步骤(2)收集到的培养液进行分离提纯，得到含有CD10-dm、表面展示RVG短肽的外泌体。
9.根据权利要求8所述的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞在无血清的DMEM培养基中培养时间为36-48h。
10.一种如权利要求1-7任一项所述外泌体在制备用于治疗阿兹海默病的药物中的应用。
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