CN114807046A - 一种膜蛋白工程化外泌体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种膜蛋白工程化外泌体及其制备方法，所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体能将外源基因高效的表达到外泌体的膜上，所述方法为：将所需表达至外泌体膜上的基因与外泌体膜蛋白LAMP2B的信号肽(SP)和跨膜区(TMD)序列融合，组成LAMP2B_SP‑转基因序列‑LAMP2B_TMD融合序列，随后将所述序列克隆至慢病毒表达载体，感染细胞系，分离纯化得到膜蛋白工程化外泌体。经实验验证，本方法成功将可溶性蛋白VEGF和细胞膜蛋白CD24高效表达至外泌体膜上，本方案优化了基因工程化外泌体的改造方法，提高了外泌体表面的修饰效率，对于外泌体作为药物载体的靶向性研究和应用具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别是涉及一种膜蛋白工程化外泌体及其制备方法。
背景技术
细胞外囊泡(EVs)是由细胞衍生的微小的、纳米尺度的囊泡，存在于生物体液中，包括血液、唾液、母乳、唾液和脑脊液，起到细胞间通讯的作用。根据生物起源、特性和尺寸，EVs主要分为：外泌体(EVssomes)直径为30-150nm，起源于内吞途径；微囊泡(microvesicles)直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体(apoptoticbody)直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生。其中，由于外泌体具有天然来源、高生物相容性和纳米尺寸等优点，它在药物传递和肿瘤治疗方面表现出极大的潜力。当外泌体在1980年首次被发现后，其被认为是细胞排泄废物的一种方式，如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。
近年来研究发现，外泌体在作为药物体内运输载体上展现出极大的优势。外泌体相比于现有的人工合成材料，在递呈药物上具有多种优点。虽然研究表明，由于外泌体膜表面受体和细胞外基质结合蛋白等作用，不同来源的外泌体，在体内显示不同的归巢能力。在肿瘤治疗过程中，如何通过外泌体将包封药物准确递送至肿瘤部位，从而提高药物利用率、降低副作用仍是亟需解决的问题之一。
基于外泌体的分子运输能力以及靶向特性，研究人员开发出了基于工程化外泌体的特定细胞靶向递送工具。外泌体的表面修饰策略包括化学修饰和基因工程。化学修饰通过缀合反应或脂质组装展示各种天然和合成配体，但外泌体表面的复杂性可能会降低反应效率，甚至危及载体的结构和功能。基因工程将引导蛋白或多肽的基因序列与选定的外泌体膜蛋白的基因序列融合，能够有效地在外泌体表面展示特异引导性肽和蛋白质。目前常用于融合的外泌体膜蛋白包括CD9、CD63和LAMP2B等。CD9和CD63为四次跨膜蛋白，N端和C端均在胞内区，仅适用于胞外区改造，展示一些短的靶向肽。对于LAMP2B等单次跨膜蛋白，常用的方法是将靶向肽或目的基因序列与LAMP2B完整蛋白序列融合，对于一些短肽此方法较为适用，但若是融合一些较长的蛋白序列，则会导致质粒过大，降低转染效率，不利于通过基因工程质粒转染进行大规模稳转细胞系制备。因此，开发一种高效的外泌体表面修饰方法，对于外泌体作为特定细胞靶向递送工具的研究具有非常重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种膜蛋白工程化外泌体及其制备方法，构建具有外泌体膜定向表达功能序列的慢病毒载体，克隆目的蛋白序列并插入至上述载体中，形成外泌体膜蛋白慢病毒表达载体，稳转细胞后，分离获得膜蛋白工程化外泌体。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种膜蛋白工程化外泌体及其制备方法，所述膜蛋白工程化外泌体是由外泌体膜蛋白慢病毒表达载体稳转细胞后，分离获得的；
所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体是由具有外泌体膜定向表达功能序列的慢病毒载体以及目的蛋白构建而成；
所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的骨架载体为plvx-IRES-Puro；
所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的功能序列结构，其从N端起，依次是外泌体膜蛋白的信号肽序列、外源基因插入区、铰链区、外泌体膜蛋白的跨膜区序列和胞内序列。
进一步地说，所述外泌体膜蛋白的信号肽序列和所述外泌体膜蛋白的跨膜区序列皆来源于LAMP2B。
进一步地说，所述外源基因插入区为XhoⅠ-XbaⅠ限制性内切酶酶切位点。
进一步地说，所述铰链区序列来源于CD8。
进一步地说，所述LAMP2B N端信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地说，所述LAMP2B跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地说，所述XhoⅠ-XbaⅠ限制性内切酶酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地说，所述CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
一种如所述的膜蛋白工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建含有外泌体膜蛋白基因的慢病毒表达载体；
(2)所述慢病毒表达载体感染HEK293T细胞，嘌呤霉素筛选稳转细胞系；
(3)所述稳转HEK293T细胞分泌膜蛋白工程化外泌体。
本发明的有益效果至少具有以下几点：
(1)本发明仅通过与外泌体膜蛋白LAMP2B的信号肽和跨膜区序列融合即可将目的蛋白表达至外泌体膜上，而不需要与LAMP2B全长序列融合，有效优化表达载体的序列；
(2)本发明提供了外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的构建方法，通过本方法构建出空载体后，仅需扩增两侧带有酶切位点的目的蛋白序列插入空载体后，即可完成表达载体的构建，简化了构建表达载体的操作步骤；
(3)本发明的膜蛋白工程化外泌体的制备方法，可简便高效的将目的蛋白表达至外泌体膜上，或可用于特定细胞靶向外泌体递送工具的开发。
附图说明
图1为外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的结构图；
图2为RT-qPCR检测VEGF mRNA在hMSC和exoVEGF-MSC细胞中的表达水平的结果图；
图3为Western blot检测VEGF蛋白在hMSC和exoVEGF-MSC细胞中的表达水平的结果图；
图4为NTA分析hMSC和exoVEGF-MSC细胞外泌体粒径及电位的结果图；
图5为Dot blot检测VEGF蛋白在hMSC和exoVEGF-MSC细胞外泌体上的表达水平的结果图；
图6为RT-qPCR检测CD24 mRNA在hMSC和exoCD24-MSC细胞中的表达水平的结果图；
图7为Western blot检测CD24蛋白在hMSC和exoCD24-MSC细胞中的表达水平的结果图；
图8为NTA分析hMSC和exoCD24-MSC细胞外泌体粒径及电位的结果图；
图9为Dot blot检测CD24蛋白在hMSC和exoCD24-MSC细胞外泌体上的表达水平的结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的构建
1.合成含有LAMP2B信号肽，XhoⅠ-XbaⅠ酶切位点，CD8铰链区，LAMP2B跨膜区和胞内区的重组DNA序列，
LAMP2B N端信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
LAMP2B跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
XhoⅠ-XbaⅠ限制性内切酶酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.上述合成的重组DNA序列和pLVX-IRES-Puro质粒(购至丰晖生物)均用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶(购至NEB公司)37℃进行双酶切2-5h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察切割回收目的DNA条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收重组DNA片段和pLVX-IRES-Puro线性化质粒。
3.通过T4 DNA连接酶(购至诺唯赞公司)连接重组DNA片段和pLVX-IRES-Puro线性化质粒，连接体系如下：1μl T4 DNA Ligase，1μl 10×Ligase Buffer，80ng pLVX-IRES-Puro线性化质粒，10ng重组DNA片段，灭菌蒸馏水补充至10μl。22℃连接30min，随后转化至DH5α化学感受态细胞(购至诺唯赞公司)，通过含有氨苄青霉素的LB平板过夜培养筛选出菌落，PCR法鉴定阳性菌落，并通过Sanger测序(测序引物CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’)验证DNA序列一致性。
4.选取序列正确的阳性菌落，摇菌提取质粒，即为外泌体膜蛋白慢病毒表达载体pLVX-exo-IRES-Puro。
实施例2
以分泌型蛋白VEGF为例，通过所述的外泌体膜蛋白慢病毒表达载体制备VEGF膜蛋白工程化外泌体。
1.克隆VEGF编码区的基因片段
通过Trizol法提取HEK293细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，用如下引物对cDNA进行PCR扩增：
正向引物F1：5’-GCTCGAGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3’
反向引物R1：5’-GCTCTAGAGCCCGCCTCGGCTTGTCA-3’
通过DNA纯化试剂盒回收PCR产物。
2.上述回收的PCR产物和pLVX-exo-IRES-Puro质粒均用XhoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶37℃进行双酶切2-5h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察切割回收目的DNA条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收酶切PCR产物和pLVX-exo-IRES-Puro线性化质粒。
3.通过T4 DNA连接酶连接酶切PCR产物和pLVX-exo-IRES-Puro线性化质粒，连接体系如下：1μl T4 DNA Ligase，1μl 10×Ligase Buffer，80ng pLVX-exo-IRES-Puro线性化质粒，16ng酶切PCR产物，灭菌蒸馏水补充至10μl。22℃连接30min，随后转化至DH5α化学感受态细胞，通过含有氨苄青霉素的LB平板过夜培养筛选出菌落，PCR法鉴定阳性菌落，并通过Sanger测序(测序引物CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’)验证序列一致性。
4.选取序列正确的阳性菌落，摇菌提取质粒，即为VEGF外泌体膜蛋白慢病毒表达载体pLVX-exoVEGF-IRES-Puro。
5.慢病毒包装，取5μg pLVX-exoVEGF-IRES-Puro质粒和5μg慢病毒包装质粒(3μgdelta R8.2和2μg VSVG)(购至Addgene公司)加至400μl无血清的DMEM培养基中，向其中滴入400μl含20μl ExFect Transfection Reagent(购至诺唯赞公司)的无血清的DMEM培养基，混匀静置20min后，加至细胞数为2×106的HEK293T细胞中，轻轻混匀，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱。转染6h后，更换为含10％FBS的DMEM完全培养基，48h后收取细胞上清，1000g离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤，备用。
6.慢病毒感染细胞，取200μl步骤1的上清液加至细胞数为2×106的人间充质干细胞(hMSC)中，混匀，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱，12h后，更换为含10％FBS的DMEM完全培养基。慢病毒感染72h后，加入终浓度为0.5μg/ml的嘌呤霉素，筛选具有抗性的细胞。
7.提取正常hMSC细胞和慢病毒感染后的hMSC细胞(exoVEGF-hMSC)的RNA，逆转录获得cDNA后，通过实时荧光定量PCR法检测VEGF mRNA水平的变化，以GAPDH为内参。
荧光定量PCR检测VEGF的PCR引物序列为：
正向引物F2：5’-CTTGCCTTGCTGCTCTACCT-3’
反向引物R2：5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3’
荧光定量PCR检测内参GAPDH的PCR引物序列为：
正向引物F3：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’
反向引物R3：5’-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3’
实验结果如图2所示，exoVEGF-hMSC中VEGF mRNA的水平显著高于正常hMSC细胞。
8.利用Western blot法检测hMSC和exoVEGF-hMSC细胞膜蛋白中VEGF蛋白表达情况。首先细胞刮刀收取hMSC和exoVEGF-hMSC细胞，通过细胞膜蛋白抽提试剂盒提取hMSC和exoVEGF-hMSC细胞膜蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒检测膜蛋白浓度。取适量膜蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转印至NC膜。5％脱脂奶粉封闭膜2h，分别用VEGF和GAPDH抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜三次，每次10min，随后用对应二抗室温孵育1h。TBST洗膜三次，每次10min，膜上滴加新鲜配置的ECL发光液，随后进行化学发光检测。结果如图3所示，在正常hMSC膜蛋白中检测不到VEGF，而在exoVEGF-hMSC细胞膜蛋白中能检测到高丰度的VEGF蛋白表达。
9.分离纯化hMSC和exoVEGF-hMSC细胞外泌体。将细胞用含5％FBS的DMEM完全培养培养至80％的密度后，更换为1％血清培养基，继续培养48h后，收获细胞培养基。4℃，500g离心10min，取上清液。随后，4℃，2000g离心15min，取上清液。用0.22μm滤膜过滤培养基，加入终浓度为12.5％的PEG和0.125M NaCl。充分混匀，4℃过夜沉淀。在水平转子离心机上，最大转速，4℃，离心30min，用适量PBS重悬沉淀。取
Ultra-2超滤管(100kDa)，加入PBS平衡，4000g离心10min。从超滤管中吸去PBS，将外泌体重悬液加至超滤管。在水平转子离心机上，4000g，4℃，离心30min。移去下部收集管，在新的收集管中，将超滤管倒转，4000g，4℃，离心30min收集外泌体。
10.用ZetaView粒径分析仪检测外泌体的粒径和Zeta电位。用PBS将2μl HEK293和exoVEGF-hMSC细胞外泌体稀释至2ml。ZetaView粒径分析仪用100nm标准品校准后，用注射器将2ml外泌体样本上样至ZetaView粒径分析仪检测池中，对外泌体粒子数、粒径和Zeta电位进行检测分析。结果如图4所示，从hMSC和exoVEGF-hMSC细胞中分离纯化的外泌体粒径主要集中于140nm左右，Zeta电位值在-10mV～-30mV左右，符合外泌体的特征。
11.Dot bot法检测外泌体膜上VEGF及外泌体标志蛋白CD63的表达。Bradford法检测外泌体蛋白浓度，根据蛋白浓度将适量的hMSC和exoVEGF-hMSC细胞外泌体直接滴加于NC膜上，风干。5％脱脂奶室温封闭NC膜2h，用VEGF和CD63抗体室温孵育膜2h，TBST清洗3次，用对应的二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，ECL发光液孵育，检测化学发光。结果如图5所示，hMSC和exoVEGF-hMSC细胞外泌体膜上均表达高丰度的CD63。hMSC细胞外泌体膜上检测不到VEGF表达，而exoVEGF-hMSC细胞外泌体膜上具有高丰度的VEGF蛋白表达。结果证实，成功制备VEGF膜蛋白工程化外泌体。
实施例3
以膜蛋白CD24为例，通过所述的外泌体膜蛋白慢病毒表达载体制备CD24膜蛋白工程化外泌体。
1.克隆CD24胞外区的基因片段
通过Trizol法提取人MSC细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，用如下引物对cDNA进行PCR扩增：
正向引物F4：5’-GCTCGAGAGTGAAACAACAACTGGAACTTC-3’
反向引物R4：5’-GCTCTAGAGCACCAGCCGCCTTGGTGGT-3’
通过DNA纯化试剂盒回收PCR产物。
2.上述回收的PCR产物和pLVX-exo-IRES-Puro质粒均用XhoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶37℃进行双酶切2-5h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察切割回收目的DNA条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收酶切PCR产物和pLVX-exo-IRES-Puro线性化质粒。
3.通过T4 DNA连接酶连接酶切PCR产物和pLVX-exo-IRES-Puro线性化质粒，连接体系如下：1μl T4 DNA Ligase，1μl 10×Ligase Buffer，80ng pLVX-exo-IRES-Puro线性化质粒，16ng酶切PCR产物，灭菌蒸馏水补充至10μl。22℃连接30min，随后转化至DH5α化学感受态细胞，通过含有氨苄青霉素的LB平板过夜培养筛选出菌落，PCR法鉴定阳性菌落，并通过Sanger测序(CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID NO.2))验证序列一致性。
4.选取序列正确的阳性菌落，摇菌提取质粒，即为CD24外泌体膜蛋白慢病毒表达载体pLVX-exoCD24-IRES-Puro。
5.慢病毒包装，取5μg pLVX-exoCD24-IRES-Puro质粒和5μg慢病毒包装质粒(3μgdelta R8.2和2μg VSVG)加至400μl无血清的DMEM培养基中，向其中滴入400μl含20μlExFect Transfection Reagent的无血清的DMEM培养基，混匀静置20min后，加至细胞数为2×106的HEK293T细胞中，轻轻混匀，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱。转染6h后，更换为含10％FBS的DMEM完全培养基，48h后收取细胞上清，1000g离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤，备用。
6.慢病毒感染细胞，取200μl步骤1的上清液加至细胞数为2×106的hMSC细胞中，混匀，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱，12h后，更换为含10％FBS的DMEM完全培养基。慢病毒感染72h后，加入终浓度为0.5μg/ml的嘌呤霉素，筛选具有抗性的细胞。
7.提取正常hMSC细胞和慢病毒感染后的hMSC细胞(exoCD24-hMSC)的RNA，逆转录获得cDNA后，通过实时荧光定量PCR法检测CD24 mRNA水平的变化，以GAPDH为内参。
荧光定量PCR检测CD24的PCR引物序列为：
正向引物F5：5’-TGGAACTTCAAGTAACTCCTCCC-3’
反向引物R5：5’-GCCTTGGTGGTGGCATTAGT-3’
荧光定量PCR检测内参GAPDH的PCR引物序列为：
正向引物F3：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’
反向引物R3：5’-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3’
实验结果如图6所示，exoCD24-hMSC中CD24 mRNA的水平显著高于正常hMSC细胞。
8.利用Western blot法检测hMSC和exoCD24-hMSC细胞膜蛋白中CD24蛋白表达情况。首先细胞刮刀收取hMSC和exoCD24-hMSC细胞，通过细胞膜蛋白抽提试剂盒提取hMSC和exoCD24-hMSC细胞膜蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒检测膜蛋白浓度。取适量膜蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转印至NC膜。5％脱脂奶粉封闭膜2h，分别用CD24和GAPDH抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜三次，每次10min，随后用对应二抗室温孵育1h。TBST洗膜三次，每次10min，膜上滴加新鲜配置的ECL发光液，随后进行化学发光检测。结果如图7所示，CD24在exoCD24-hMSC细胞膜蛋白中蛋白中表达水平显著高于正常hMSC。
9.分离纯化hMSC和exoCD24-hMSC细胞外泌体。将细胞用含5％FBS的DMEM完全培养培养至80％的密度后，更换为1％血清培养基，继续培养48h后，收获细胞培养基。4℃，500g离心10min，取上清液。随后，4℃，2000g离心15min，取上清液。用0.22μm滤膜过滤培养基，加入终浓度为12.5％的PEG和0.125M NaCl。充分混匀，4℃过夜沉淀。在水平转子离心机上，最大转速，4℃，离心30min，用适量PBS重悬沉淀。取
Ultra-2超滤管(100kDa)，加入PBS平衡，4000g离心10min。从超滤管中吸去PBS，将外泌体重悬液加至超滤管。在水平转子离心机上，4000g，4℃，离心30min。移去下部收集管，在新的收集管中，将超滤管倒转，4000g，4℃，离心30min收集外泌体。
10.用ZetaView粒径分析仪检测外泌体的粒径和Zeta电位。用PBS将2μl hMSC和exoCD24-hMSC细胞外泌体稀释至2ml。ZetaView粒径分析仪用100nm标准品校准后，用注射器将2ml外泌体样本上样至ZetaView粒径分析仪检测池中，对外泌体粒子数、粒径和Zeta电位进行检测分析。结果如图8所示，从hMSC和exoCD24-hMSC细胞中分离纯化的外泌体粒径主要集中于140nm左右，Zeta电位值在-10mV～-30mV左右，符合外泌体的特征。
11.Dot bot法检测外泌体膜上CD24及外泌体标志蛋白CD63的表达。Bradford法检测外泌体蛋白浓度，根据蛋白浓度将适量的hMSC和exoCD24-hMSC细胞外泌体直接滴加于NC膜上，风干。5％脱脂奶室温封闭NC膜2h，用CD24和CD63抗体室温孵育膜2h，TBST清洗3次，用对应的二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，ECL发光液孵育，检测化学发光。结果如图9所示，hMSC和exoCD24-hMSC细胞外泌体膜上均表达高丰度的CD63。CD24在exoCD24-hMSC细胞外泌体中蛋白中水平显著高于正常hMSC细胞外泌体。结果证实，成功制备CD24膜蛋白工程化外泌体。
综上所述，本发明提供了一种膜蛋白工程化外泌体的制备方法，并成功将分泌型蛋白VEGF和细胞膜蛋白CD24过表达至外泌体膜上。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 江苏易诺维生物医学研究院有限公司
<120> 一种膜蛋白工程化外泌体及其制备方法
<130> 2022
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> LAMP2B N端信号肽的核苷酸序列(人工序列)
<400> 1
atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60
ctgggagctg tgcggtctta tgca 84
<210> 2
<211> 114
<212> DNA
<213> LAMP2B跨膜区的核苷酸序列(人工序列)
<400> 2
accattctaa tcccaattat agttggtgct ggtctttcag gcttgattat cgttatagtg 60
attgcttacg taattggcag aagaaaaagt tatgctggat atcagactct gtag 114
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> XhoⅠ-XbaⅠ 限制性内切酶酶切位点的核苷酸序列(人工序列)
<400> 3
ggctcgagac tagttctaga c 21
<210> 4
<211> 135
<212> DNA
<213> CD8铰链区的核苷酸序列(人工序列)
<400> 4
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
Claims (9)
1.一种膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述膜蛋白工程化外泌体是由外泌体膜蛋白慢病毒表达载体稳转细胞后，分离获得的；
所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体是由具有外泌体膜定向表达功能序列的慢病毒载体以及目的蛋白构建而成；
所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的骨架载体为plvx-IRES-Puro；
所述外泌体膜蛋白慢病毒表达载体的功能序列结构，其从N端起，依次是外泌体膜蛋白的信号肽序列、外源基因插入区、铰链区、外泌体膜蛋白的跨膜区序列和胞内序列。
2.根据权利要求1所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述外泌体膜蛋白的信号肽序列和所述外泌体膜蛋白的跨膜区序列皆来源于LAMP2B。
3.根据权利要求1所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述外源基因插入区为XhoⅠ-XbaⅠ限制性内切酶酶切位点。
4.根据权利要求1所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述铰链区序列来源于CD8。
5.根据权利要求2所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述LAMP2B N端信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求2所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述LAMP2B跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求3所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述XhoⅠ-XbaⅠ限制性内切酶酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求4所述的膜蛋白工程化外泌体，其特征在于：所述CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的膜蛋白工程化外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)构建含有外泌体膜蛋白基因的慢病毒表达载体；
(2)所述慢病毒表达载体感染HEK293T细胞，嘌呤霉素筛选稳转细胞系；
(3)所述稳转HEK293T细胞分泌膜蛋白工程化外泌体。
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|---|---|---|---|---|
| CN117442585A (zh) * | 2023-12-25 | 2024-01-26 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 一种靶向胰腺癌的雷公藤红素递送体及其制备方法 |
| CN117442585B (zh) * | 2023-12-25 | 2024-03-19 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 一种靶向胰腺癌的雷公藤红素递送体及其制备方法 |
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