CN114457112A - 一种特异性神经靶向mr分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种特异性神经靶向MR分子探针及其制备方法和应用。该神经靶向分子探针的制备方法包括：构建RVG‑Lamp2b质粒，并将RVG‑Lamp2b质粒转染入细胞，培养细胞并分离纯化获得外泌体；将外泌体与超顺磁性氧化铁纳米颗粒混合置于缓冲液中进行电穿孔，离心收集沉淀，即为该特异性神经靶向MR分子探针。本发明构建的特异性神经靶向MR分子探针(RVG‑Exo‑SPION)实现了针对神经细胞的特异性主动靶向MR成像，为神经系统疾病的精准诊疗提供了一个新的方法；尤其针对用于Neuro‑2A和异位神经母细胞瘤异种移植的MR成像，具有广泛的应用价值和应用前景。

Description

一种特异性神经靶向MR分子探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种特异性神经靶向MR分子探针及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，分子影像学因其高度的敏感性和特异性成为神经系统疾病诊断的潜在影像学技术。在众多的成像方式中，磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)具有成像参数多、成像序列多、软组织分辨率高、空间分辨率高、无电离辐射等优点。在众多传统的MRI造影剂中，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)具有一定的优势，包括相对较低的毒性、较高的磁信号强度和较长的对比度增强，MR成像使用SPIONs有助于区分病理组织与周围健康组织。

由于血脑屏障的存在，98％的可能改善中枢神经系统疾病的药物无法跨越血脑屏障而不能应用于临床。近年来，研究人员开发了许多可以跨越血脑屏障的递送平台，但是，制约这些纳米颗粒的广泛应用主要有两个原因：单核吞噬细胞系统的快速清除和纳米探针的毒性。许多研究发现外泌体具有免疫原性低，可生物降解，无毒，载物能力强，货物保护能力强，和穿越血脑屏障能力强等特点。因此，外泌体有成为各种疾病，特别是脑部疾病的运载工具的潜力。

然而，由于膜表面缺乏修饰，外泌体没有天然的靶向性。与其他纳米颗粒类似，未修饰的外泌体在动物体内系统地递送，主要积聚在肝、肾和脾，并通过胆汁排泄、肾脏滤过和网状内皮系统的吞噬作用快速清除出体外。

目前用于神经递送的分子探针普遍缺乏特异的神经靶向能力，因此，亟待开发一种具有神经元特异性靶向能力分子探针。

发明内容

基于现有技术存在的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种特异性神经靶向MR分子探针的制备方法，主要利用狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)修饰的外泌体(exosomes,Exos)与超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxidenanoparticles,SPIONs)合成特异性神经靶向MR分子探针(RVG-Exo-SPION)；本发明的第二目的在于提供该制备方法制备得到的特异性神经靶向MR分子探针；本发明的第三目的在于提供该特异性神经靶向MR分子探针在活体磁共振成像中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种特异性神经靶向MR分子探针的制备方法，其包括以下步骤：

构建RVG-Lamp2b质粒，并将RVG-Lamp2b质粒转染入细胞，培养细胞并分离纯化获得外泌体；

将外泌体与超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)混合置于缓冲液中进行电穿孔，离心收集沉淀，即为该特异性神经靶向MR分子探针(即：RVG-Exo-SPION)。

研究发现狂犬病毒糖蛋白(RVG)能与乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR)特异性结合而达到神经靶向的能力。为此，本发明建立了一种基于RVG修饰外泌体的靶向MR分子探针RVG-Exo-SPION，并将其用于Neuro-2A和异位神经母细胞瘤异种移植的MR成像，研究其作为特异性神经靶向分子探针的应用价值和应用前景。

上述的方法中，优选地，所述RVG-Lamp2b质粒的构建方法包括：

使用重叠延伸PCR扩增反应获得Lamp2b-RVG基因片段；该Lamp2b-RVG基因片段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGATACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAGGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTTTGGAACTTAATTTGACAGATTCAGAAAATGCCACTTGCCTTTATGCAAAATGGCAGATGAATTTCACAGTTCGCTATGAAACTACAAATAAAACTTATAAAACTGTAACCATTTCAGACCATGGCACTGTGACATATAATGGAAGCATTTGTGGGGATGATCAGAATGGTCCCAAAATAGCAGTGCAGTTCGGACCTGGCTTTTCCTGGATTGCGAATTTTACCAAGGCAGCATCTACTTATTCAATTGACAGCGTCTCATTTTCCTACAACACTGGTGATAACACAACATTTCCTGATGCTGAAGATAAAGGAATTCTTACTGTTGATGAACTTTTGGCCATCAGAATTCCATTGAATGACCTTTTTAGATGCAATAGTTTATCAACTTTGGAAAAGAATGATGTTGTCCAACACTACTGGGATGTTCTTGTACAAGCTTTTGTCCAAAATGGCACAGTGAGCACAAATGAGTTCCTGTGTGATAAAGACAAAACTTCAACAGTGGCACCCACCATACACACCACTGTGCCATCTCCTACTACAACACCTACTCCAAAGGAAAAACCAGAAGCTGGAACCTATTCAGTTAATAATGGCAATGATACTTGCCTGCTGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGAACATCACTCAGGATAAGGTTGCTTCAGTTATTAACATCAACCCCAATACAACTCACTCCACAGGCAGCTGCCGTTCTCACACTGCTCTACTTAGACTCAATAGCAGCACTATTAAGTATCTAGACTTTGTCTTTGCTGTGAAAAATGAAAACCGATTTTATCTGAAGGAAGTGAACATCAGCATGTATTTGGTTAATGGCTCCGTTTTCAGCATTGCAAATAACAATCTCAGCTACTGGGATGCCCCCCTGGGAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCATTTCAGATAAATACCTTTGATCTAAGGGTTCAGCCTTTCAATGTGACACAAGGAAAGTATTCTACAGCCCAAGAGTGTTCGCTGGATGATGACACCATTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAAGAAAAAGTTATGCTGGATATCAGACTCTGTAA。

采用NheI和HindIII对Lamp2b-RVG基因片段进行酶切；采用NheI和HindIII对载体pcDNA3.1(+)进行酶切；

电泳回收酶切获得的Lamp2b-RVG片段和线性化载体pcDNA3.1(+)；用T4 DNA连接酶将二者进行连接；构建得到的连接产物转化为感受态细胞，从平板上挑取克隆菌落，抽取质粒鉴定为阳性克隆，即构建获得RVG-Lamp2b质粒。

上述的方法中，优选地，重叠延伸PCR扩增反应的上游引物序列为：5’-AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGTGCTTCCGCCTCT TCCCGG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物序列为：

5’-ATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTTTA-3’(SEQ ID NO：2)。

上述的方法中，优选地，所述RVG-Lamp2b质粒转染入细胞并培养细胞并分离纯化获得外泌体的方法包括：

采用脂质体将RVG-Lamp2b质粒转染HEK293细胞，培养细胞并采用G418进行筛选，获得稳转质粒的HEK293细胞；

将稳转质粒的HEK293细胞接种培养，培养过程中离心除去死掉细胞及细胞碎片；

接着向上清液中加入细胞染色剂，离心分离提取细胞染色剂标记的沉淀物外泌体。

上述的方法中，优选地，采用G418进行筛选的方法包括：

在转染细胞培养2-3天后，然后按0ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml的浓度梯度在细胞培养液中加入相对应浓度的G418，对照组为未转染细胞，同样加入相同梯度浓度G418；细胞培养2-4天换培养基和G418；使对照组细胞刚好死完，转染组仍存活的G418浓度即为筛选浓度，挑取孔板中单个细胞单克隆扩增；扩增出的细胞即为稳转质粒细胞。

上述的方法中，优选地，所述细胞染色剂包括CM-Dil试剂；所述细胞染色剂在培养液中的浓度为1.0μM。

上述的方法中，优选地，所述顺磁性氧化铁纳米颗粒包括DMSA@Fe₃O₄，所述DMSA@Fe₃O₄的平均粒径为10nm。

上述的方法中，优选地，所述外泌体与所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行等比例混合。

上述的方法中，优选地，所述电穿孔的方法包括：

将所述外泌体和所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒混合于PBS缓冲液的电击杯中，将电击杯置于电穿孔仪中，电穿孔的条件设置为电压400V，电容150μF，放电时间1ms，施加脉冲。

另一方面，本发明还提供上述的方法制备得到的特异性神经靶向MR分子探针。

再一方面，本发明还提供上述的特异性神经靶向MR分子探针在活体磁共振成像中的应用。

所述应用包括蛋白质免疫印迹、透射电镜观察、粒径追踪实验、体外毒性分析、激光共聚焦成像、普鲁士染色、体外磁共振成像或组织学检查等。

本发明的有益效果：

(1)通过RVG修饰外泌体构建的RVG-Exo-SPION探针具有良好的主动神经靶向能力，可通过抗体识别、受体识别或免疫识别等特异性的靶向目标区。

(2)SPION作为一种优良的超顺磁性造影剂，具有独特的磁性，将其与外泌体结合构建的分子探针，可作为可视化载体应用于神经系统多种疾病的靶向MR成像。

(3)本发明构建的特异性神经靶向MR分子探针(RVG-Exo-SPION)实现了针对神经细胞的特异性主动靶向MR成像，为神经系统疾病的精准诊疗提供了一个新的方法；尤其针对用于Neuro-2A和异位神经母细胞瘤异种移植的MR成像，具有广泛的应用价值和应用前景。

附图说明：

为了更清楚的说明本发明实施例或现有的技术中的技术方案，下面将对实施例或者现有技术描述中有关于本发明需要图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中NheI和HindIII双酶切法获得的目的基因的电泳图。

图2为本发明实施例1中质粒转染HEK293细胞的电泳图。

图3为本发明实施例1中外泌体电转前后的电镜图。

图4为本发明实施例2中不同浓度梯度的RVG-Exo-SPION与Neuro-2A孵育后MR图像。

图5为本发明实施例3中肿瘤感兴趣在注射前和注射RVG-Exo-SPION或blank-Exo-SPION后1h、2h、1d、2d的MR图像。

图6为本发明实施例3中肿瘤感兴趣的灰阶值在注射前和注射RVG-Exo-SPION或blank-Exo-SPION后1h、2h、1d、2d的点线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本发明各权利要求所要求保护的技术方案。本发明下述实施例中所采用的原料若无特殊说明，均为常规市售获得，所采用的实验操作若无特殊说明，均为本领域常规操作。

实施例1：

本实施例提供本发明特异性神经靶向MR分子探针(RVG-Exo-SPION)及其构建过程，该RVG-Exo-SPION的构建过程如下：

(1)RVG-Lamp2b质粒的构建与验证：

①oligo设计，Lamp2b(homo)-RVG基因上下游引物分别加上NheI和HindIII及保护碱基，用于载体的亚克隆；

②将oligo溶解成50μM，将oligo分别取相同体积至1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix；

③用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR反应体系包括：oligo mix 2μl，10×Pfu Buffer(+Mg²⁺)3μl，dNTP 0.6μl，DMSO 1.2μl，ddH₂O 23μl，Pfu DNA polymerase0.2μl；

④用oligo-1(重叠延伸PCR扩增反应的上游引物，SEQ ID NO:1)和oligo-34(重叠延伸PCR扩增反应的下游引物，SEQ ID NO:2)进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物；PCR反应完成后，利用Agarose电泳并切胶回收基因片段；

⑤用NheI和HindIII对Lamp2b(homo)-RVG基因片段进行酶切，37℃酶切2h；用NheI和HindIII对载体pcDNA3.1(+)进行酶切，37℃酶切2h；

⑥电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段Lamp2b(homo)-RVG和载体pcDNA3.1(+)；用T4 DNA ligase连接酶切得到的Lamp2b(homo)-RVG片段和线性化的载体pcDNA3.1(+)，22℃连接2h，获得连接产物；电泳结果如图1所示，由图1可以看出：双酶切法得到两个条带，一条大小约1300bp的目的条带(图1中的b)，一条大小约5400bp的pcDNA3.1质粒(图1中的a)；目的条带的大小与RVG-Lamp2b的大小相符，证明了目的基因重组到质粒中。

⑦将连接产物转化为感受态细胞，从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆，即为RVG-Lamp2b质粒。

(2)RVG-Lamp2b质粒转染细胞及筛选稳转质粒的细胞：

①用脂质体将RVG-Lamp2b质粒转染HEK293细胞。

②在转染细胞培养2-3天后，然后按0ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml的浓度梯度在细胞培养液中加入相对应浓度的G418，对照组为未转染细胞，同样加入相同梯度浓度G418。

③细胞培养2-4天换培养基和G418，使对照组细胞刚好死完，转染组仍存活的G418浓度即为筛选浓度。

④挑取孔板中单个细胞单克隆扩增，扩增出的细胞即为稳转质粒的HEK293细胞，部分冻存备用。

实验结果如图2所示，图2中的(a)显示质粒转染HEK293细胞后，western blotting分析对照组及转染组Lamp2b蛋白含量，转染组明显高于对照组；图2中的(b)显示westernblotting分析HEK293细胞和外泌体的外泌体膜标记物CD9和CD63，外泌体中CD9和CD63含量明显高于HEK293细胞，同时GAPDH在外泌体中的含量明显低于细胞组。

(3)外泌体分离和纯化和染色标记：

①将稳转质粒的HEK293细胞接种到10cm培养皿中，使用无外泌体DMEM培养基培养。72h后，当细胞汇合度达到90％-100％时，吸取细胞培养基。

②在4℃下，300×g离心10min，弃掉细胞沉淀，取上清液。

③2000×g离心10min，弃掉死细胞和细胞碎片，取上清液。

④10000×g超速离心机(Optima MAX-XP，USA)离心30min，去除细胞碎片，取上清。

⑤将提取的部分上清液加入CM-Dil试剂，控制CM-Dil浓度为1.0μM，将存在或不存在CM-Dil的上清液在4℃、100000×g条件下，离心90min；去除上清液，将沉淀物用PBS重悬，在4℃、100000×g条件下，离心90min，弃上清液，提取沉淀物外泌体。100ml上清液约提取150ug外泌体，将外泌体按150ug:100uLPBS和PBS重悬，置于-80℃备用，CM-Dil标记的外泌体留作荧光标记使用。

(4)特异性神经靶向MR分子探针(RVG-Exo-SPION)的构建：

①将500μg CM-Dil标记的外泌体和500μg SPIONs(10nm DMSA@Fe₃O₄，南京东纳生物科技有限公司)混合在有1ml PBS的电击杯中。

②将电击杯置于Bio-Rad电穿孔仪中，电穿孔的条件设置为电压400V，电容150μF，放电时间1ms。在上述条件下，对每个Exos样品施加一个脉冲。

③然后悬液在100000×g离心力4℃条件下离心90min，去除含多余的外泌体和SPIONs的悬液，沉淀物即为RVG-Exo-SPION。

外泌体电转前后的电镜图如图3所示，由图3可以看出：外泌体电转前(a)和电转后(b)的电镜图，外泌体均保持正常形状及膜结构；(b)图显示外泌体经电转后可见SPIONs的存在。

实施例2：分子探针体外Neuro-2A孵育实验

(1)细胞准备：

将RVG-Exo-SPION样品以5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的浓度加入含1×10⁵个Neuro-2A细胞24孔板中，孵育24h。冲洗多余游离铁和外泌体。

(2)体外磁共振成像：

成像机器：3T磁共振(uMR780，上海联影)；线圈：腕线圈；成像参数：重复时间(TR)＝2744ms，回波时间(TE)＝68.6ms，视场(FOV)＝120×120mm，矩阵＝256×256，切片厚度＝2mm，扫描时间＝5min 27s。

实验结果如图4所示，由图4可以看出：不同浓度梯度的RVG-Exo-SPION与Neuro-2A孵育后MR图像，灰阶值在不同铁浓度之间有显著差异，且在大于或等于25μg Fe/ml的浓度下易于识别。

实施例3：载瘤裸鼠模型建立及分子探针体外磁共振成像实验

(1)载瘤裸鼠模型建立：

小鼠神经瘤细胞(Neuro-2A，1×10⁶个/100μl PBS)种植于裸鼠右侧腹股沟区，2周成瘤。

(2)体内磁共振成像：

将小鼠置于50ml离心管制成的简易装置中成像，参数较前一致；尾静脉注射法，注射前、注射后1h、2h、1d、2d分别对两组小鼠进行扫描，采集图像。

实验结果如图5和图6所示。

由图5可以看出：肿瘤感兴趣在注射前和注射RVG-Exo-SPION或blank-Exo-SPION后1h、2h、1d、2d的MR图像，上行：blank-Exo-SPION.下行：RVG-Exo-SPION。与注射前比较，磁共振T2加权图像显示两组对应肿瘤区域信号1h～24h均变暗。同时注射blank-Exo-SPION和RVG-Exo-SPION的小鼠在肿瘤部位的铁积累量也有显著差异。

由图6可以看出：肿瘤感兴趣的灰阶值在注射前和注射RVG-Exo-SPION或blank-Exo-SPION后1h、2h、1d、2d的点线图。RVG-Exo-SPION组感兴趣区(红圈标记)的灰阶值在1h内达到最小值约166，对照组在2h内缓慢达到最小值约185。两组感兴趣区灰阶值均在48h内恢复到注射前的水平。磁共振图像的结果表现RVG-Exo-SPION通过高通透性和滞留效应以及肿瘤靶向性，对肿瘤部位有强烈积聚和渗透效果，证明RVG-Exo-SPION具有很强的潜力成为靶向造影剂。

最后，需要说明的是，本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

序列表

<110> 苏州市立医院

<120> 一种特异性神经靶向MR分子探针及其制备方法和应用

<130> LH220090.1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

agggagaccc aagctggcta gcgccaccat ggtgtgcttc cgcctcttcc cgg 53

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

atccgagctc ggtaccaagc tttta 25

<210> 3

<211> 1374

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60

ctgggagctg tgcggtctta tgcaggtaac tcgactatgg gcagtggata caccatttgg 120

atgcccgaga atccgagacc agggacacct tgtgacattt ttaccaatag cagagggaag 180

agagcatcca acgggggcag tggatctgga tccggtggct cgagtttgga acttaatttg 240

acagattcag aaaatgccac ttgcctttat gcaaaatggc agatgaattt cacagttcgc 300

tatgaaacta caaataaaac ttataaaact gtaaccattt cagaccatgg cactgtgaca 360

tataatggaa gcatttgtgg ggatgatcag aatggtccca aaatagcagt gcagttcgga 420

cctggctttt cctggattgc gaattttacc aaggcagcat ctacttattc aattgacagc 480

gtctcatttt cctacaacac tggtgataac acaacatttc ctgatgctga agataaagga 540

attcttactg ttgatgaact tttggccatc agaattccat tgaatgacct ttttagatgc 600

aatagtttat caactttgga aaagaatgat gttgtccaac actactggga tgttcttgta 660

caagcttttg tccaaaatgg cacagtgagc acaaatgagt tcctgtgtga taaagacaaa 720

acttcaacag tggcacccac catacacacc actgtgccat ctcctactac aacacctact 780

ccaaaggaaa aaccagaagc tggaacctat tcagttaata atggcaatga tacttgcctg 840

ctggctacca tggggctgca gctgaacatc actcaggata aggttgcttc agttattaac 900

atcaacccca atacaactca ctccacaggc agctgccgtt ctcacactgc tctacttaga 960

ctcaatagca gcactattaa gtatctagac tttgtctttg ctgtgaaaaa tgaaaaccga 1020

ttttatctga aggaagtgaa catcagcatg tatttggtta atggctccgt tttcagcatt 1080

gcaaataaca atctcagcta ctgggatgcc cccctgggaa gttcttatat gtgcaacaaa 1140

gagcagactg tttcagtgtc tggagcattt cagataaata cctttgatct aagggttcag 1200

cctttcaatg tgacacaagg aaagtattct acagcccaag agtgttcgct ggatgatgac 1260

accattctaa tcccaattat agttggtgct ggtctttcag gcttgattat cgttatagtg 1320

attgcttacg taattggcag aagaaaaagt tatgctggat atcagactct gtaa 1374

Claims (10)

1.一种特异性神经靶向MR分子探针的制备方法，其包括以下步骤：

构建RVG-Lamp2b质粒，并将RVG-Lamp2b质粒转染入细胞，培养细胞并分离纯化获得外泌体；

将外泌体与超顺磁性氧化铁纳米颗粒混合置于缓冲液中进行电穿孔，离心收集沉淀，即为该特异性神经靶向MR分子探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RVG-Lamp2b质粒的构建方法包括：

使用重叠延伸PCR扩增反应获得Lamp2b-RVG基因片段；

采用NheI和HindIII对Lamp2b-RVG基因片段进行酶切；采用NheI和HindIII对载体pcDNA3.1(+)进行酶切；

电泳回收酶切获得的Lamp2b-RVG片段和线性化载体pcDNA3.1(+)；用T4 DNA连接酶将二者进行连接；构建得到的连接产物转化为感受态细胞，从平板上挑取克隆菌落，抽取质粒鉴定为阳性克隆，即构建获得RVG-Lamp2b质粒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：重叠延伸PCR扩增反应的上游引物序列为：

5’-AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物序列为：

5’-ATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTTTA-3’(SEQ ID NO:2)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RVG-Lamp2b质粒转染入细胞并培养细胞并分离纯化获得外泌体的方法包括：

采用脂质体将RVG-Lamp2b质粒转染HEK293细胞，培养细胞并采用G418进行筛选，获得稳转质粒的HEK293细胞；

将稳转质粒的HEK293细胞接种培养，培养过程中离心除去死掉细胞及细胞碎片；

接着向上清液中加入细胞染色剂，离心分离提取细胞染色剂标记的沉淀物外泌体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：采用G418进行筛选的方法包括：

在转染细胞培养2-3天后，然后按0ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml的浓度梯度在细胞培养液中加入相对应浓度的G418，对照组为未转染细胞，同样加入相同梯度浓度G418；细胞培养2-4天换培养基和G418；使对照组细胞刚好死完，转染组仍存活的G418浓度即为筛选浓度，挑取孔板中单个细胞单克隆扩增；扩增出的细胞即为稳转质粒细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述细胞染色剂包括CM-Dil试剂；所述细胞染色剂在培养液中的浓度为1.0μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述顺磁性氧化铁纳米颗粒包括DMSA@Fe₃O₄，所述DMSA@Fe₃O₄的平均粒径为10nm；

优选地，所述外泌体与所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行等比例混合。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电穿孔的方法包括：

将所述外泌体和所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒混合于PBS缓冲液的电击杯中，将电击杯置于电穿孔仪中，电穿孔的条件设置为电压400V，电容150μF，放电时间1ms，施加脉冲。

9.权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的特异性神经靶向MR分子探针。

10.权利要求9所述的特异性神经靶向MR分子探针在活体磁共振成像中的应用；

优选地，所述应用包括蛋白质免疫印迹、透射电镜观察、粒径追踪实验、体外毒性分析、激光共聚焦成像、普鲁士染色、体外磁共振成像或组织学检查。

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