CN112280780A - 一种抑制MOR基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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CN112280780A CN202011208376.3A CN202011208376A CN112280780A CN 112280780 A CN112280780 A CN 112280780A CN 202011208376 A CN202011208376 A CN 202011208376A CN 112280780 A CN112280780 A CN 112280780A
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Abstract

本发明公开了一种抑制MOR基因表达的siRNA及其应用。MOR基因的siRNA，其正义链序列选自SEQ ID NO：2～4中任意一条所示序列；优选SEQ ID NO：2所示的序列。MOR基因的siRNA前体序列，选自SEQ ID NO：6～8中任意一条所示序列，优选SEQ ID NO：7所示的序列。本发明首次开发了针对MOR特异性设计的siRNA序列，可有效抑制脑组织中MOR的表达，可有效治疗阿片类药物成瘾，且不会造成宿主抑郁。本发明通过开发设计特定蛋白标签(RVG‑Lamp2b),使得在其下游与其串联表达的siRNA，能够顺利、高效穿过血脑屏障，到达脑组织并发挥功能。

Description

一种抑制MOR基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抑制MOR基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
阿片类药物成瘾的流行，是一种影响所有医学领域公共卫生危机的，必须要治疗，不可选择的疾病。这种疾病从未依赖药物，非依赖状态到依赖和退缩状态的过渡性转换代表了与阿片奖赏记忆形成相关的不同神经元和分子底物之间的关键边界，确定与奖赏效应密切联系。目前用于治疗阿片类药物成瘾疾病的药物中，反义寡核苷酸类药物最为优越。siRNA药物是从翻译水平上降低蛋白的表达，不会改变基因序列，特异性强，且具有生物降解性，基本不存在药物积累产生毒性的问题。但如何建立一个安全高效的载体递送系统帮助siRNA逃避先天免疫系统的识别，还需要进一步的开发研究。
阿片受体是介导内源性阿片肽和阿片药物起作用的受体，主要有μ受体、κ受体和δ三种。其中参与药物依赖成瘾过程最密切的就是μ受体。目前用于治疗成瘾的药物也大多是以μ受体(MOR)为靶标。
外泌体(exosomes)被认为是用于siRNA递送的强有力的载体。因为外泌体是机体自身细胞可以产生的，基本没有免疫原性，且可以被生物体自然降解。这些内源性产生的细胞外囊泡可以通过在细胞间转移脂质，利用蛋白质和RNA来介导细胞间通讯，理论上是一种趋近完美的纳米颗粒。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种抑制MOR基因表达的siRNA，及其前体序列。
本发明的另一目的是提供表达上述siRNA的表达载体。
本发明的又一目的是提供上述siRNA、其前体序列及表达载体的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
MOR基因的siRNA，其正义链序列选自SEQ ID NO：2～4中任意一条所示序列；优选SEQ ID NO：2所示的序列：
Oligo-2F:TGACCAGGAAGTTTCCAAAGA(SEQ ID NO：2)
Oligo-3F:TGCAGAGGATGTTTCCAAAGG(SEQ ID NO：3)
Oligo-4F:TAAGGCATCTGCCAGAGCAAG(SEQ ID NO：4)。
一种MOR基因的siRNA前体序列，如Seq正向-X-Seq反向所示；其中，Seq正向为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括权利要求1所述的MOR基因的siRNA的正义链序列；Seq反向为与Seq正向基本互补或完全互补的序列，且B2与X不互补；X为茎环结构序列。
作为本发明的一种优选，所述的MOR基因的siRNA前体序列，选自SEQ ID NO：6～8中任意一条所示序列，优选SEQ ID NO：6所示的序列：
12MR0155-2F:5’-TGCTGTGACCAGGAAGTTTCCAAAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTTTGGACTTCCTGGTCA-3’(SEQ ID NO：6)；
12MR0155-3F:5’-TGCTGTGCAGAGGATGTTTCCAAAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTTTGGACATCCTCTGCA-3’(SEQ ID NO：7)；
12MR0155-4F:5’-TGCTGTAAGGCATCTGCCAGAGCAAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTTGCTCTCAGATGCCTTA-3’(SEQ ID NO：8).
本发明首次制备了一种能够高效表达MOR siRNA的前体siRNA。本发明前体siRNA经过宿主细胞的加工后，能够高效地表达MOR siRNA,从而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明，本发明前体siRNA能够在体内有效表达MOR siRNA序列，并对阿片类药物成瘾症状具有更有效的治疗作用。
一种多核苷酸构建物，所述的多核苷酸构建物被人细胞转录成本发明所述的前体siRNA，其含有一个或多个所述的Seq正向-X-Seq反向结构单元。
一种表达本发明所述的siRNA的表达载体，含有本发明所述的siRNA前体序列。
作为本发明的一种优选，所述的表达载体以～～～为出发载体，含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽：RVG肽以及标签蛋白：Lamp2b的多核苷酸。
作为本发明的一种优选，所述的表达载体含有CMV启动子-attB1-任选RVG-标签蛋白Lamp2b-5’siRNA侧翼区序列-权利要求2所述的siRNA前体序列-3siRNA侧翼区序列-attB2。
RVG-5’TACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAGGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGG(SEQ ID NO：9)
Lamp2b-5’TCCGGAGGTGCAGAATGGGAGATGAATTTCACAATAACATATGAAACTACAAACCAAACCAATAAAACTATAACCATTGCAGTACCTGACAAGGCGACACACGATGGAAGCAGTTGTGGGGATGACCGGAATAGTGCCAAAATAATGATACAATTTGGATTCGCTGTCTCTTGGGCTGTGAATTTTACCAAGGAAGCATCTCATTATTCAATTCATGACATCGTGCTTTCCTACAACACTAGTGATAGCACAGTATTTCCTGGTGCTGTAGCTAAAGGAGTTCATACTGTTAAAAATCCTGAGAATTTCAAAGTTCCATTGGATGTCATCTTTAAGTGCAATAGTGTTTTAACTTACAACCTGACTCCTGTCGTTCAGAAATATTGGGGTATTCACCTGCAAGCTTTTGTCCAAAATGGTACAGTGAGTAAAAATGAACAAGTGTGTGAAGAAGACCAAACTCCCACCACTGTGGCACCCATCATTCACACCACTGCCCCGTCGACTACAACTACACTCACTCCAACTTCAACACCCACTCCAACTCCAACTCCAACTCCAACCGTTGGAAACTACAGCATTAGAAATGGCAATACTACCTGTCTGCTGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGAACATCACTGAGGAGAAGGTGCCTTTCATTTTTAACATCAACCCTGCCACAACCAACTTCACCGGCAGCTGTCAACCTCAAAGTGCTCAACTTAGGCTGAACAACAGCCAAATTAAGTATCTTGACTTTATCTTTGCTGTGAAAAATGAAAAACGGTTCTATCTGAAGGAAGTGAATGTCTACATGTATTTGGCTAATGGCTCAGCTTTCAACATTTCCAACAAGAACCTTAGCTTCTGGGATGCCCCTCTGGGAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGGTGCTTTCTGTGTCTAGAGCGTTTCAGATCAACACCTTTAACCTAAAGGTGCAACCTTTTAATGTGACAAAAGGACAGTATTCTACAGCCCAGGAGTGTTCGCTGGATGATGACACCATTCTAATACCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACCTAATTGGCAGAAGAAAGACCTATGCTGGATATCAGACTCTGTAACACTAA(SEQ ID NO：10)
5’siRNA侧翼-5’-CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT(SEQ ID NO：11)
3’siRNA侧翼-5’-CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC(SEQ IDNO：12)
本发明所述的siRNA、所述的siRNA前体序列、所述的多核苷酸构建物、所述的表达载体在制备治疗阿片类药物成瘾的药物中的应用。
一种治疗阿片类药物成瘾的药物组合物，含有所述的siRNA、所述的siRNA前体序列、所述的多核苷酸构建物、所述的表达载体。
本发明中涉及的术语及定义如下：
siRNA及其前体
如本文所用，所述的“siRNA”是指一类RNA分子，从可形成siRNA前体的转录物加工而来。成熟的siRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的siRNA分子。
siRNA一般可以通过模拟miRNA产生机制来产生，这样的siRNA就可从前体RNA(Precursor RNA，Pre-RNA)加工而来。所述的前体RNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体RNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体RNA可以是天然的或是人工合成的。
在本发明中，形成MOR siRNA的前体miRNA可被剪切生成调节MOR基因的siRNA，即MOR siRNA(例如，Oligo-2F、Oligo-3F、Oligo-4F)。
所述的siRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸。
本发明中，“茎环结构”可存在于式I所示前体siRNA的末端，例如Seq正向-X-Seq反向中由于Seq正向和Seq反向形成基本互补后，X会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体siRNA内部，例如由于Seq正向和Seq反向之间并非完全互补，造成未互补结合的Seq正向或Seq反向的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的siRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的siRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的siRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体RNA，所述的前体RNA可被人细胞剪切且表达成所述的siRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有一个或多个式I所示的结构单元：
式I：Seq正向-X-Seq反向
式I中，Seq正向为可在细胞中表达成所述的抑制MOR的siRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的siRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
其中，各结构单元可表达相同或不同的siRNA；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II：
Figure BDA0002757883430000051
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的siRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。所述的表达载体为双链质粒，并且具有以下结构：CMV启动子-attB1-任选的RVG-标签蛋白Lamp2b-5’siRNA侧翼区序列-式I所示的序列-3siRNA侧翼区序列-attB2。
药物组合物及施用方法
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)、微泡(micro vesicle)、外泌体(exosomes)、脱落囊泡(sheddingvesicle)、纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(β-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗阿片类药物成瘾的方法，即将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象，从而治疗阿片类药物成瘾。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次开发了针对MOR特异性设计的siRNA序列，可有效抑制脑组织中MOR的表达，可有效治疗阿片类药物成瘾，且不会造成宿主抑郁。
(b)本发明前体siRNA能够有效的避免在过表达目的序列得同时也过表达目的序列得反向互补序列，从而有效避免了目的序列得反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。
(c)本发明通过开发设计特定蛋白标签(RVG-Lamp2b),使得在其下游与其串联表达的siRNA，能够顺利、高效穿过血脑屏障，到达脑组织并发挥功能。
(d)本发明通过静脉注射的方式给药，与鞘内注射、颅内注射给药方式相比，侵入性小，更为安全。
附图说明
图1是本发明的质粒骨架图。
图2是质粒分子表达的siRNA在细胞水平及对MOR的抑制效果。其中图2A是将四种质粒分别转染N2A细胞，24-30小时后收集蛋白，利用western检测的MOR蛋白表达水平，图2B对应的western定量图。
图3是MOR siRNA/RVG质粒分子对野生型C57小鼠脑组织中MOR蛋白水平及mRNA水平的干扰作用。按照5mg/kg的剂量，以尾静脉给药的方法将空载质粒(对照组)和MORsiRNA/RVG质粒(实验组)分别注射进入小鼠体内。连续注射7次，每次间隔一天。7次注射之后，收集小鼠完整脑区并切取伏隔膜附近脑区组织，检测MOR蛋白及RNA的表达水平。图3A是蛋白表达水平，图3B是图3A对应的western定量图，图3C是利用qpcr检测脑组织中MOR的mRNA水平。
图4是MOR siRNA/RVG质粒分子对野生型C57小鼠的疾病治疗效果。其中，图4A是建造吗啡成瘾模型的流程简述图。图4B是CPP模型建立后的得分情况，示意小鼠在黑白箱子的停留时间比较。图4C是MOR siRNA/RVG质粒分子对野生型C57小鼠吗啡成瘾的治疗及预防复吸效果。
图5是MOR siRNA/RVG质粒分子对野生型C57小鼠吗啡成瘾治疗后的抑郁情绪检测。其中，图5A是糖水偏好实验的结果。图5B是矿场实验检测的结果。图5C是强迫游泳的结果。
图6是吗啡成瘾治疗后，小鼠脑组织蛋白变化量检测结果。图6A是脑组织MOR蛋白表达水平，图6B是对应的western定量图。
具体实施方式
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。
一、生化分子检测
1、主要实验材料与方法
细胞系：本发明所用到的细胞系Neuro2A(N2A)系小鼠神经元细胞，购自中国科学院上海细胞库。
实验动物：SPF级6周龄C57小鼠，购自南京大学模式动物中心，之后饲养于南京大学动物饲养中心。
实验药品：实验造模所用的盐酸吗啡注射液均由南京军区总医院提供。
主要仪器名称：电泳仪(美国Bio-Rad公司)、化学发光成像仪(美国GE公司)、水平旋转摇床(美国Labnet公司)、低温离心机(德国Eppendorf公司)、超声裂解仪(日本SANYO公司)、组织研磨机(德国Qiagen公司)、酶标仪(美国Thermo公司)、PCR仪(德国BIOMETRA公司)。
主要试剂：RIPA蛋白裂解液(碧云天)、Phostop磷酸酶抑制剂(生工生物工程股份有限公司)、PMSF(碧云天)、BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)、4X SDS Loading Buffer(BIOCAM)、SDS-PAGE配胶试剂盒(碧云天)、小鼠抗MOR抗体(Santa Cruz)、HRP标记羊抗小鼠抗体(Santa Cruz)、HRP标记羊抗兔抗体(Santa Cruz)、GAPDH抗体(谷歌生物)、化学发光液(Millipore)、Endo-free plasmid mini kit II(OMEGA)、壮观霉素(生工生物工程股份有限公司)、AMV逆转录(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、Oligo(dT)(TaKaRa)等。
2、主要实验方法及步骤
2.1小鼠脑组织Western Blot蛋白定量
2.1.1小鼠脑组织取材
(1)小鼠戊巴比妥钠过量麻醉并固定妥当，用手术器械暴露胸腔。
(2)将灌流针插入小鼠左心室，随后用眼科剪剪开右心房。
(3)灌入100mL 0.1M PBS(4℃预冷)。
(4)灌流完毕后断头，快速取出脑组织。
(5)于冰上手术分离两侧脑组织皮层、纹状体。
2.1.2小鼠脑组织蛋白的提取
(1)灌注完成后，迅速取出脑组织，置于冰上，用显微镊分离皮层及纹状体，装于1.5mL EP管内，置于液氮中速冻。
(2)按试剂说明书，向RIPA组织裂解液中，加入Phostop磷酸酶抑制剂，按100:1的比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。
(3)称量待抽提脑组织，按照100mg/100μL的比例，加入组织裂解液。
(4)冰浴状态下超声裂解仪裂解5s，重复3-5次，至裂解液中无可见组织块。
(5)冰上静置30min，14000rpm4℃离心15min，转移上清至新EP管中待测。
(6)用BCA法测定抽提蛋白样品浓度，配平样品蛋白浓度至5μg/μL，并分装成20μL/管，-80℃保存备用。
2.1.3SDS-PAGE蛋白凝胶电泳(Western blot)
(1)将配胶玻璃板清洗干净，37℃烤箱烘干。随后将玻璃板底边对齐后放入配胶装置中夹紧，再将玻璃板卡在架子上，使其底边紧压于密封橡胶条中，防止漏胶。
(2)配置6％分离胶，吹打混匀后沿玻璃板一侧缓慢将分离胶加入两玻璃板之间，随后加入异丙醇压胶，左右摇晃2-3次后室温静置30min，待分离胶凝固。
(3)分离胶凝固后，倒掉异丙醇并用滤纸吸干多余的液体,配制5％浓缩胶，吹打混匀后沿玻璃板一侧缓慢加入两玻璃板之间，随后将预先洗净晾干的梳子快速插入两玻璃板之间，注意避免气泡产生，室温静置30min。
(4)从-80℃冰箱中取出待测样本，冰浴化冻，按3:1的比例加入4X SDS LoadingBuffer，吹打混匀，100℃煮沸10min，随后冰上静置待用。
(5)将玻璃板放入电泳夹中夹紧，将梳子拔出，倒入1×电泳液。
(6)上待检测的蛋白样品8μL(30μg)，marker 8μL。
(7)80V电泳至Loading Buffer的溴芬蓝跑过浓缩胶并压缩成一条线后，恒压120V电泳至目的蛋白分离充分。
(8)转膜：剪取7cm X 6cm PVDF膜，甲醇彻底浸泡20s后，置1X转膜液中平衡5min。分离玻璃板，弃置浓缩胶，将分离胶置于铺放好的滤纸上。于1X转膜液水浴中，从正极到负极，按下列顺序依次放置夹子透明面、海绵、两层滤纸、PVDF膜、分离胶、两层滤纸、海绵，夹子黑面制作转膜三文治结构。
(9)然后将夹子放入转膜槽，夹子黑面对槽的黑面，夹子的透明面对槽的红面，加入1×转膜液，冰上湿转，300mA恒流180min。
(10)取出PVDF膜，1X TBST漂洗1min，5％BSA室温摇床封闭1h。
(11)封闭后，根据蛋白Marker条带显示的位置将目的蛋白及内参蛋白所在PVDF膜剪出放置于抗体孵育盒中，加入用5％BSA稀释后的一抗，4℃摇床孵育过夜。
(12)过夜孵育后，将膜放在1X TBST中常温摇床漂洗3次，每次5min。
(13)随后加入1％BSA稀释后的二抗，室温摇床孵育1h。
(14)1X TBST中常温摇床漂洗3次，每次5min。
(15)按照说明书配置化学发光液。
(16)将PVDF膜置于化学发光液中浸泡均匀，取出放于化学发光仪样品托板上，用滤纸印干多余发光液，进行化学发光成像。
2.2小鼠脑组织qRT-PCR检测
2.2.1普通蛋白基因mRNA的逆转，以oligo(dT)为引物，对RNA进行反转录，反转录前将RNA浓度调至调至0.5μg/μL左右。
Figure BDA0002757883430000101
反应体系：16℃30min；42℃30min；85℃5min，4℃∞。
逆转结束后，使用基因特异性正反向引物，结合SYBR染料进行qPCR，其体系见下表，每个样品设置三个重复。
Figure BDA0002757883430000102
将程序设置为：变性：95℃-5min；扩增：95℃–30s，60℃–30s，72℃–30s(信号收集)，扩增体系为40个循环。
数据分析(根据溶解曲线)：qPCR结束后，设定阈值，得到相应CT值，则每个mRNA相对于内参的表达量可以用2-ΔCT表示，其中ΔCT＝C样品-C参。内参为GAPDH。
二、行为学检测：
1.建造吗啡成瘾模型(CPP)
正式建造吗啡成瘾模型之前，要先根据非条件偏好性筛查小鼠：将小鼠置于CPP装置的中间室中，同时打开两侧挡板，允许小鼠在三室间自由探测，时长为30min。根据统计结果，排除在一个箱室停留时间低于300s或者穿梭次数少于20次的小鼠，剩余的合格小鼠用于后续的吗啡依赖及治疗实验。
具体流程如下(如图4a)：
a.预测试：第1天，将小鼠放置于黑白盒中自由行走30min，观察并记录它们的位置偏好，帮助小鼠熟悉装置，减少新鲜感和应激反应。
b.第一阶段测试：偶数天(2，4，6，8，10)，关闭黑箱挡板，对小鼠腹腔注射吗啡(10mg/kg)，放置于白盒中行走30min；奇数天(3，5，7，9，11)，关闭白箱挡板，对小鼠腹腔注射生理盐水(10ml/kg)，放置于黑盒中行走30min；第12天，拿走两侧挡板，小鼠允许放置于黑白盒中自由行走30min，观察并记录它们的位置偏好。
c.第二阶段测试：第26天，将小鼠放置于黑白盒里自由行走30min，观察并记录它们的位置偏好；
d.第三阶段测试：第26，28，30，32天，将小鼠随机均分成四组，分别尾静脉注射生理盐水、MOR siRNA质粒、NC siRNA/RVG质粒以及anti-siRNA/RVG质粒；第32天，将小鼠放置于黑白盒中自由行走30min，观察并记录它们的位置偏好；
e.第四阶段测试：第33天，重新对小鼠腹腔注射吗啡(10mg/kg)；第34天，将小鼠放置在黑白盒里自由行走30min，观察并记录它们的位置偏好。
2.糖水偏好实验
一个鼠笼仅饲养一只小鼠，使用两个饮水瓶，分别装入等量的蒸馏水和1％蔗糖水，固定在鼠笼上方左右两侧；24h后，交换两种饮水瓶的相对位置；第二天同一时刻，分别称量并记录两种饮水瓶的重量。再次交换固定蔗糖水和蒸馏水的相对位置；再过24h后，第二次称量糖水与蒸馏水瓶的重量，与第一次的重量比较做差，得出小鼠一天之内分别对糖水和蒸馏水的摄入情况。
3.强迫游泳
对强迫游泳装置进行清洗处理，以排除其他不必要因素的干扰。完成之后，向透明泳池加入30cm深的水(水温保证在24℃左右)。将小鼠轻缓放入圆柱形透明泳池水中，进行15min的“前游泳”，“前游泳”对小鼠是一种无法逃避的刺激，从而模拟“抑郁”反应。将小鼠从泳池中取出，烘干，放回笼中。24h后，将小鼠再次置于水池中，并进行5min“测试游泳”，同时用摄录软件录像，测评小鼠游泳与漂浮行为时间。
4.旷场实验
将旷场箱擦拭清洗干净，去除之前实验动物的任何遗留气味、粪便等，充分晾干后，将小鼠放入箱内底面中心处，封闭盖子，在安静的环境下，同时进行摄像和计时；观察30min后停止摄像，得出小鼠行进路线与停留位置。然后清洗旷场内壁及底面，以免上次动物的信息影响下一只鼠的测试结果。换入下一只小鼠，继续实验。收集小鼠在旷场内总运动路程，轨迹数据，并记录小鼠在各个区域内的总运动路程、中央区域停留时间以及小鼠在每个5min间隔时间段内的运动路程。
实施例1：MOR siRNA/RVG质粒的构建以及干扰效率检测
设计的MOR siRNA正义链的核苷酸序列选自下列四组为：
Oligo-1F:TTAACACTCTGAAAGGGCAGC(SEQ ID NO：1)
Oligo-2F:TGACCAGGAAGTTTCCAAAGA(SEQ ID NO：2)
Oligo-3F:TGCAGAGGATGTTTCCAAAGG(SEQ ID NO：3)
Oligo-4F:TAAGGCATCTGCCAGAGCAAG(SEQ ID NO：4)
上述siRNA成熟体一次对应的siRNA前体序列如下：
12MR0155-1F:5’-TGCTGTTAACACTCTGAAAGGGCAGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCTGCCCTCAGAGTGTTAA-3’(SEQ ID NO：5)
12MR0155-2F:5’-TGCTGTGACCAGGAAGTTTCCAAAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTTTGGACTTCCTGGTCA-3’(SEQ ID NO：6)
12MR0155-3F:5’-TGCTGTGCAGAGGATGTTTCCAAAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTTTGGACATCCTCTGCA-3’(SEQ ID NO：7)
12MR0155-4F:5’-TGCTGTAAGGCATCTGCCAGAGCAAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTTGCTCTCAGATGCCTTA-3’.(SEQ ID NO：8)
体外合成siRNA前体序列正义链和反义链,退火后插入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体的ECOR1和AGE1位点间得到质粒CMV-MOR siRNA；体外合成RVG-lamp2b序列,利用限制性内切酶对质粒CMV-MOR siRNA进行处理，回收线性载体后，利用T4连接酶将RVG-lamp2b片段插入载体CMV-MOR siRNA的Dra1位点,得到的连接产物进行转化实验并涂布于抗性平板；第二天挑取单克隆，测序确定质粒序列的正确性。按照这种方法，获得上述4个siRNA的表达载体,分别命名为MOR si-1、MOR si-2、MOR si-3、MOR si-4(如图1所示)。
将四种质粒分子分别转染汇合度60-70％的小鼠神经元细胞Neuro2A(N2A)系，30小时后利用western实验检测细胞中MOR的蛋白表达水平。结果表明，设计的四种siRNA，除了MOR si-1没有抑制效果，剩下三种都可以在一定程度上抑制MOR的表达水平，其中，MORsi-2对MOR蛋白的干扰效率最高(如图2所示)。
实施例2：质粒表达的siRNA在体内对MOR的抑制效果
使用MOR si-2进行后续的实验，按照5mg/kg的剂量，以尾静脉给药的方法将空载质粒(对照组)和MOR siRNA/RVG质粒(实验组)分别注射进入小鼠体内。连续注射7次，每次间隔一天。7次注射之后，收集小鼠完整脑区并切取伏隔膜附近脑区组织，检测MOR蛋白及RNA的表达水平。结果表明，连续两周对小鼠进行尾静脉注射质粒后，相较于对照组，注射MOR siRNA/RVG的小鼠，其伏隔膜区MOR不仅蛋白表达量减少，mRNA的表达量也明显降低，这表明带有融合蛋白RVG-Lamp 2b靶标的siRNA质粒能够在小鼠体内成功表达，将siRNA输送进脑，并干扰靶基因的表达水平(如图3，A-C所示)。
一般情况下，小鼠天生偏爱黑暗的环境。反复几次吗啡给药，会让小鼠将吗啡带来的兴奋感与给药环境联系在一起，即使在不给药的情况下，也会表现出对给药环境的偏爱。将小鼠随机分成对照组和治疗组，建造吗啡成瘾模型(CPP)。结果显示(图4-B)：5次吗啡腹腔给药(即第一阶段完成)之后，小鼠CPP得分相较于自然状态明显降低，表明小鼠在黑箱中停留的时间减少，在白箱中停留的时间显著增加(CPP得分计算方式为：黑箱停留时间-白箱停留时间)，表明小鼠已将吗啡引起的奖赏效应与白箱联系在一起。图4-C结果显示，第二阶段完成之后，小鼠能够在短时间内先天性自发脱毒。此时，对小鼠尾静脉注射生理盐水，或者其它三种质粒在条件偏好上并没有显著差异。再次对小鼠腹腔注射一次吗啡，模拟复吸，检测的结果显示，尾静脉注射MOR siRNA/RVG质粒的小鼠，停留在白箱的时间相较其它三组有所降低，暗示MOR siRNA/RVG质粒能够在一定程度上减少小鼠复吸的概率。
实施例3：MOR siRNA/RVG质粒对治疗小鼠成瘾后抑郁情绪检测
由于吗啡的成瘾及戒断过程往往伴随着抑郁等负面情绪的出现，故而本发明将继续对小鼠分别尾静脉注射生理盐水、nc siRNA/RVG质粒、MOR siRNA质粒和MOR siRNA/RVG质粒，10ml/kg，每隔一天注射一次，共5次。然后利用糖水偏好、旷场、强迫游泳三种经典的动物抑郁模型进行验证。糖水偏好实验结果显示(图5A)，四个组别的小鼠对糖水的摄入水平基本一致，没有显示出抑郁倾向。旷场实验结果(图5B)中，无论是小鼠在中央区域的停留时间、各个区域内的总运动路程，还是小鼠在每个5min间隔时间段内的运动路程，四组没有表现出差别。另外，四组小鼠在强迫游泳的状态下，其漂浮时间的长短也接近(图5C)。综合三组抑郁模型实验，可以得出：注射MOR siRNA/RVG质粒的小鼠并没有展现出抑郁倾向。
动物行为学实验完成当天处死所有小鼠，提取伏隔膜区附近脑组织蛋白质再次检测MOR蛋白的表达水平。Western结果显示(图6)，与注射生理盐水的小鼠相比，注射ncsiRNA/RVG质粒、MOR siRNA质粒的小鼠伏隔膜区MOR蛋白水平没有降低，注射MOR siRNA/RVG质粒的小鼠有显著性差异(p<0.05)，再次证明表明MOR siRNA/RVG质粒发挥了干扰作用。
序列表
<110> 南京大学
<120> 一种抑制 MOR基因表达的siRNA及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaacactct gaaagggcag c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaccaggaa gtttccaaag a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagaggat gtttccaaag g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taaggcatct gccagagcaa g 21
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctgttaac actctgaaag ggcagcgttt tggccactga ctgacgctgc cctcagagtg 60
ttaa 64
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctgtgacc aggaagtttc caaagagttt tggccactga ctgactcttt ggacttcctg 60
gtca 64
<210> 7
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgctgtgcag aggatgtttc caaagggttt tggccactga ctgacccttt ggacatcctc 60
tgca 64
<210> 8
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctgtaagg catctgccag agcaaggttt tggccactga ctgaccttgc tctcagatgc 60
ctta 64
<210> 9
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tacaccattt ggatgcccga gaatccgaga ccagggacac cttgtgacat ttttaccaat 60
agcagaggga agagagcatc caacggg 87
<210> 10
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tccggaggtg cagaatggga gatgaatttc acaataacat atgaaactac aaaccaaacc 60
aataaaacta taaccattgc agtacctgac aaggcgacac acgatggaag cagttgtggg 120
gatgaccgga atagtgccaa aataatgata caatttggat tcgctgtctc ttgggctgtg 180
aattttacca aggaagcatc tcattattca attcatgaca tcgtgctttc ctacaacact 240
agtgatagca cagtatttcc tggtgctgta gctaaaggag ttcatactgt taaaaatcct 300
gagaatttca aagttccatt ggatgtcatc tttaagtgca atagtgtttt aacttacaac 360
ctgactcctg tcgttcagaa atattggggt attcacctgc aagcttttgt ccaaaatggt 420
acagtgagta aaaatgaaca agtgtgtgaa gaagaccaaa ctcccaccac tgtggcaccc 480
atcattcaca ccactgcccc gtcgactaca actacactca ctccaacttc aacacccact 540
ccaactccaa ctccaactcc aaccgttgga aactacagca ttagaaatgg caatactacc 600
tgtctgctgg ctaccatggg gctgcagctg aacatcactg aggagaaggt gcctttcatt 660
tttaacatca accctgccac aaccaacttc accggcagct gtcaacctca aagtgctcaa 720
cttaggctga acaacagcca aattaagtat cttgacttta tctttgctgt gaaaaatgaa 780
aaacggttct atctgaagga agtgaatgtc tacatgtatt tggctaatgg ctcagctttc 840
aacatttcca acaagaacct tagcttctgg gatgcccctc tgggaagttc ttatatgtgc 900
aacaaagagc aggtgctttc tgtgtctaga gcgtttcaga tcaacacctt taacctaaag 960
gtgcaacctt ttaatgtgac aaaaggacag tattctacag cccaggagtg ttcgctggat 1020
gatgacacca ttctaatacc aattatagtt ggtgctggtc tttcaggctt gattatcgtt 1080
atagtgattg cttacctaat tggcagaaga aagacctatg ctggatatca gactctgtaa 1140
cactaa 1146
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctggaggctt gctgaaggct gtatgct 27
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcc 45

Claims (10)

1.MOR基因的siRNA，其特征在于其正义链序列选自SEQ ID NO：2～4中任意一条所示序列；优选SEQ ID NO：2所示的序列。
2.一种MOR基因的前体siRNA，其特征在于，如：Seq正向-X-Seq反向所示；其中，Seq正向为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括权利要求1所述的MOR基因的siRNA的正义链序列；Seq反向为与Seq正向基本互补或完全互补的序列，且B2与X不互补；X为茎环结构序列。
3.根据权利要求2所述的MOR基因的前体siRNA，其特征在于选自SEQ ID NO：6～8中任意一条所示序列；优选SEQ ID NO：6所示的序列。
4.一种多核苷酸构建物，其特征在于，所述的多核苷酸构建物被人细胞转录成权利要求2或3所述的前体siRNA，其含有一个或多个权利要求2中所述的Seq正向-X-Seq反向结构单元。
5.一种表达权利要求1所述的siRNA的表达载体，其特征在于含有权利要求2中所述的siRNA前体序列。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体以pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR为出发载体，含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽：RVG肽以及标签蛋白：Lamp2b的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体含有CMV启动子-attB1-任选RVG-标签蛋白Lamp2b-5’siRNA侧翼区序列-权利要求2所述的siRNA前体序列-3siRNA侧翼区序列-attB2。
8.权利要求1所述的siRNA、权利要求2或3所述的siRNA前体序列、权利要求4所述的多核苷酸构建物、权利要求5～7中任一项所述的表达载体在制备治疗阿片类药物成瘾的药物中的应用。
9.一种治疗阿片类药物成瘾的药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的siRNA、权利要求2或3所述的siRNA前体序列、权利要求4所述的多核苷酸构建物、权利要求5～7中任一项所述的表达载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体，包括但不限于：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子、微泡、外泌体、脱落囊泡、纳米胶囊、β环糊精胶囊蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
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