TW201315473A - Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體 - Google Patents

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Abstract

本發明描述醫藥組合物，其包含：雙股核酸分子，該核酸分子包含有義股及反義股，其中該有義股及反義股係選自經描述為SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)及SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)之寡核苷酸；及藥物載劑，該載劑包含類視色素與脂囊泡之混合物。此等醫藥組合物適用於藉由siRNA加強調控HSP47表現。

Description

HSP47表現調控強化用類視色素脂質體
本文提供包含用於藉由siRNA強化hsp47表現調控之類視色素脂質體的醫藥組合物。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2011年6月15日申請之美國臨時申請案第61/497,447號及2011年6月8日申請之美國臨時申請案第61/494,832號的權益。該等臨時申請案據此以全文引用的方式併入本文中。
肝臟纖維化可能由活化肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)引起，導致複數種膠原蛋白分子及纖維結合蛋白沈積於間質組織上。此會導致肝硬化、肝衰竭及/或肝細胞癌。此外，慢性胰臟炎由於胰纖維化以與肝纖維化相同之機制而發生(Madro等人，2004；Med Sci Monit.10：RA166-70；Jaster,2004,Mol Cancer.6：26)。此外，星狀細胞存在於聲帶及喉之病症(諸如聲帶疤痕、聲帶黏膜纖維化及喉纖維化)中。為了預防或治療此等器官及身體其他位置之纖維化，希望開發藥物載劑及藥物載劑套組。(Sato,Y.等人，Nature Biotechnology，第26(4)卷，第431頁至第442頁(2008)；US 8,178,124；US 8,173,170；US 8,003,621)。
星狀細胞為治療纖維化之重要目標候選物之一(Fallowfield等人，2004,Expert Opin Ther Targets.8：423- 35；Pinzani等人，2004,Dig Liver Dis.36：231-42)。在纖維化期間，星狀細胞由附近細胞之細胞因子活化，產生多種因子，其導致肝纖維化。星狀細胞儲存維生素A，且屬於肌纖維母細胞家族。
預防或治療纖維化之治療方法嘗試控制膠原蛋白代謝、膠原蛋白降解系統之促進及星狀細胞活化之抑制。然而，在所有此等情況下，低作用特異性及/或低器官特異性、有限功效及不良副作用均引發問題。
抑制膠原蛋白合成尚未確定為治療方法。靶向膠原蛋白產生之分子之效能因可能導致副作用而受限。抑制膠原蛋白產生直接提供預防或治療纖維化之另一治療方法。該種方法需要控制膠原蛋白I型至IV型之各種類型中之一或多者。實現此之方法可為經由熱休克蛋白47(HSP47)(一種膠原蛋白特異性分子伴隨蛋白)達成，該蛋白對於為各種類型之膠原蛋白所需之胞內運輸及分子成熟為至關重要的。因此，若可特異性控制HSP47在星狀細胞中之功能，則可能抑制肝纖維化。
本說明書係關於使診斷及/或治療藥物可特異性輸送至星狀細胞的藥物載劑及藥物載劑套組。本說明書中之藥物載劑可選自聚合物微胞、脂質體、乳液、微球體及奈球體形式，且可特異性輸送至HSC之類視色素或類視色素結合物及治療藥物與其結合或包括於其中。類視色素包括維生素A、視黃醛、視黃酸、飽和維生素A、維甲酸、阿達帕 林(adapalene)或視黃醇棕櫚酸酯及芬維A胺(fenretinide)(4-HPR)。此外，藉由製備藥物載劑以包括選自以下之一種分子或複數種分子：TGFβ活性抑制劑，諸如截短型TGFβ II型受體及可溶TGFβ II型受體；生長因子製劑，諸如HGF；MMP產生啟動子，諸如含MMP基因之腺病毒載體；細胞活化抑制劑及/或生長抑制劑，包括PPARγ配體、血管緊張素-II I型受體拮抗劑、PDGF酪胺酸激酶抑制劑及鈉通道抑制劑(諸如胺氯吡脒)；及細胞凋亡誘導物，諸如化合物861及膠黴毒素(gliotoxin)；且藉由向具有纖維化或纖維化症狀之風險之患者或具有各種纖維化相關病症(諸如肝硬化、肝衰竭、肝癌或慢性胰臟炎)之患者例如經口、非經腸、經靜脈內或腹膜內投與其，可抑制星狀細胞之活化，且從而預防、抑制或改良該患者之纖維化及/或纖維化相關疾病病況。或者或另外，藉由使用其中包括特異性抑制HSP47或TIMP且為MMP抑制劑之核糖核酸酶、反義RNA或siRNA的藥物載劑，可同時抑制I型至IV型膠原蛋白之分泌，且因此可有效地抑制纖維發生。
本說明書之一實施例為一種醫藥組合物，其包含：雙股核酸分子，該核酸分子包含有義股及反義股，其中該有義股及反義股係選自經描述為SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)及SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)之寡核苷酸；及藥物載劑，該載劑包含脂囊泡與類視色素或類視色素結合物之混合物。類視色素可為以下一或多者：維生素A、視黃酸、飽和維 生素A、視黃醛、維甲酸、阿達帕林、視黃醇棕櫚酸酯或芬維A胺。類視色素較佳包含視黃酸之結合物，最佳為類視色素-PEG結合物。脂囊泡可包含雙層脂質分子，且可進一步包含類視色素。類視色素在藥物載劑中之濃度較佳為0.2重量%至20重量%。脂囊泡可包含包封脂囊泡內部之內表面及可為脂囊泡外部之水性介質接近之外表面。類視色素可與脂質雙層締合。雙股核酸可於脂囊泡之外表面上暴露。
在一些實施例中，雙股核酸分子包括反義股，其具有SEQ ID NO：127且包含經2'-O-甲基糖(2'OMe)修飾之核糖核苷酸；位置1、5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及與3'末端共價連接之3'末端非核苷酸部分；及有義股，其具有SEQ ID NO：60且包含至少一個2'5'-核糖核苷酸或經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。在較佳實施例中，反義股為SEQ ID NO：127且包含位置3、5、9、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸(5'>3')；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；且有義股為SEQ ID NO：60且包含3'末端位置15、16、17、18及19處之五個連續2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。在一些實施例中，雙股核酸分子在反義股之位置1處進一步包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸或2'5'-核糖核苷酸。
在各實施例中，有義股為SEQ ID NO：98且包含3'末端位置處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分；且反義股為SEQ ID NO：165且包含經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。在較佳實施例中，有義股為SEQ ID NO：98且包含位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH 3'部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：165且包含位置4、6、8、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。在一些實施例中，雙股核酸在位置2處進一步包含經2'OMe修飾之核糖核苷酸。
在各實施例中，有義股為SEQ ID NO：101且包含經2'OMe修飾之核糖核苷酸；視情況存在之在位置9或10中之一處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分；且反義股為SEQ ID NO：168且包含經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。在較佳實施例中，有義股為SEQ ID NO：101且包含位置4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸(5'>3')；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5' 末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：168且包含位置1、4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。在某些實施例中，雙股核酸分子在反義股之位置13處及/或在有義股之位置2處進一步包含經2'OMe修飾之核糖核苷酸。
另一態樣為包含雙股核酸分子及包含類視色素與脂質之混合物之藥物載劑的醫藥組合物，其中該雙股寡核苷酸化合物包含以下結構(A1)： 其中N及N'各為可未經修飾或經修飾之核苷酸或為非習知部分；其中(N)x及(N')y各為寡核苷酸，其中各連續N或N'藉由共價鍵連接至下一N或N'；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地包括1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於(N')y之5'末端處之封端部分；其中x及y各自獨立地為18與40之間的整數；其中(N')y之序列與(N)x之序列互補；且其中(N)x包括由SEQ ID NO：1例示之人類hsp47之mRNA編碼序列的反義序列，其展示如下。
本文提供用於調控目標基因表現之組合物、方法及套組。在各態樣及實施例中，本文中所提供之組合物、方法及套組調控亦稱為SERPINH1(SEQ ID NO：1)之熱休克蛋白47(hsp47)表現。組合物、方法及套組可涉及結合編碼hsp47之核苷酸序列(諸如mRNA序列)SEQ ID NO：1的核酸分子(例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短髮夾RNA(shRNA))之使用。在某些較佳實施例中，本文中所揭示之組合物、方法及套組抑制hsp47表現。舉例而言，提供減少或抑制hsp47表現之siNA分子(例如RNA誘導型沉默複合體(RNA-induced silencing complex，RISC)長度dsNA分子或Dicer長度dsNA分子)。亦提供用於治療及/或預防與hsp47相關之 疾病、病況或病症之組合物、方法及套組，該等疾病、病況或病症諸如為肝纖維化、肝硬化、包括肺纖維化(lung fibrosis)(包括間質性肺纖維化(ILF))之肺部纖維化(pulmonary fibrosis)、由任何病況(例如慢性腎病(CKD)，包括末期腎病(ESRD))導致之腎纖維化、腹膜纖維化、慢性肝損傷、原纖維形成、其他器官之纖維變性病、與所有可能類型之意外性及醫源性(手術)皮膚損傷相關之異常疤痕(瘢痕瘤)、硬皮病、心臟纖維化、青光眼濾過手術(glaucoma filtering operation)失敗及腸黏連。
在一個態樣中，提供如上所述之醫藥組合物，其包含核酸分子(例如siNA分子)作為醫藥調配物之組分，其中核酸分子包括有義股及反義股；核酸分子之各股獨立地為15至49個核苷酸長；反義股之15至49個核苷酸序列與編碼人類hsp47之mRNA序列(例如SEQ ID NO：1)互補；且有義股之15至49個核苷酸序列與反義股之序列互補且包括編碼人類hsp47之mRNA(例如SEQ ID NO：1)之15至49個核苷酸序列。
在某些實施例中，反義股之與編碼人類hsp47之mRNA序列互補的序列包括與SEQ ID NO：1之核苷酸600至800；或801至899；或900至1000；或1001至1300之間或SEQ ID NO：1之核苷酸650至730；或900至975之間的序列互補之序列。在一些實施例中，反義股包括與編碼人類hsp47之mRNA序列互補的序列，該mRNA序列對應於SEQ ID NO：1之核苷酸674至693或其部分；或SEQ ID NQ：1之核苷酸698 至716或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸698至722或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸701至720或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸920至939或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸963至982或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸947至972或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸948至966或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸945至969或其部分；或SEQ ID NO：1之核苷酸945至963或其部分。
在某些實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)之反義股包括對應於SEQ ID NO：4或其部分；或SEQ ID NO：6或其部分；或SEQ ID NO：8或其部分；或SEQ ID NO：10或其部分；或SEQ ID NO：12或其部分；或SEQ ID NO：14或其部分；或SEQ ID NO：16或其部分；或SEQ ID NO：18或其部分；或SEQ ID NO：20或其部分；或SEQ ID NO：22或其部分；或SEQ ID NO：24或其部分；或SEQ ID NO：26或其部分；或SEQ ID NO：28或其部分；或SEQ ID NO：30或其部分；或SEQ ID NO：32或其部分；或SEQ ID NO：34或其部分；或SEQ ID NO：36或其部分；或SEQ ID NO：38或其部分；或SEQ ID NO：40或其部分；或SEQ ID NO：42或其部分；或SEQ ID NO：44或其部分；或SEQ ID NO：46或其部分；或SEQ ID NO：48或其部分；或SEQ ID NO：50或其部分；或SEQ ID NO：52或其部分；或SEQ ID NO：54或其部分；或SEQ ID NO：56或其部分；或SEQ ID NO：58或其部分的序列。在某些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子) 之有義股包括對應於SEQ ID NO：3或其部分；或SEQ ID NO：5或其部分；或SEQ ID NO：7或其部分；或SEQ ID NO：9或其部分；或SEQ ID NO：11或其部分；或SEQ ID NO：13或其部分；或SEQ ID NO：15或其部分；或SEQ ID NO：17或其部分；或SEQ ID NO：19或其部分；或SEQ ID NO：21或其部分；或SEQ ID NO：23或其部分；或SEQ ID NO：25或其部分；或SEQ ID NO：27或其部分；或SEQ ID NO：29或其部分；或SEQ ID NO：31或其部分；或SEQ ID NO：33或其部分；或SEQ ID NO：35或其部分；或SEQ ID NO：37或其部分；或SEQ ID NO：39或其部分；或SEQ ID NO：41或其部分；或SEQ ID NO：43或其部分；或SEQ ID NO：45或其部分；或SEQ ID NO：47或其部分；或SEQ ID NO：49或其部分；或SEQ ID NO：51或其部分；或SEQ ID NO：53或其部分；或SEQ ID NO：55或其部分；或SEQ ID NO：57或其部分的序列。
在某些較佳實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)之反義股包括對應於表4中所示之反義序列中之任一者的序列。在某些較佳實施例中，反義股及有義股係選自表4中所示之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58及SERPINH1_88中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_4(SEQ ID NOS：195及220)、SERPINH1_12(SEQ ID NOS：196及221)、SERPINH1_30 (SEQ ID NOS：199及224)及SERPINH1_58(SEQ ID NOS：208及233)中所列之序列對。
在一些實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)之反義股及有義股包括SERPINH1_4(SEQ ID NOS：195及220)中所列之序列對。在一些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)的反義股及有義股包括SERPINH1_12(SEQ ID NOS：196及221)中所列之序列對。在一些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之反義股及有義股包括SERPINH1_30(SEQ ID NOS：199及224)中所列之序列對。在一些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)的反義股及有義股包括SERPINH1_58(SEQ ID NOS：208及233)中所列之序列對。
在某些實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)之反義股包括對應於表B或表C中任一者所示之反義序列中任一者的序列。
在某些較佳實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)之反義股包括對應於表5中所示之反義序列中之任一者的序列。在某些較佳實施例中，反義股及有義股係選自表5中所示之序列對。在一些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)包括選自以下中所列之序列對的反義股及有義股：˙SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、˙SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)、 ˙SERPINH1_11(SEQ ID NOS：68及135)、˙SERPINH1_13(SEQ ID NOS：69及136)、˙SERPINH1_45(SEQ ID NOS：97及164)、˙SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)、˙SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)、˙SERPINH1_52(SEQ ID NOS：102及169)或˙SERPINH1_86(SEQ ID NOS：123及190)。
在一些較佳實施例中，反義股及有義股係選自以下中所列之序列對：˙SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、˙SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)、˙SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)及˙SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)。
在一些較佳實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)包括選自SERPINH1_2SEQ ID NOS：60及127)中所列之序列對的反義股及有義股。在一些實施例中，反義股及有義股包括SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)中所列之序列對。在一些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)包括SERPINH1_11(SEQ ID NOS：68及135)中所列之序列對的反義股及有義股。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_13(SEQ ID NOS：69及136)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_45 EQ ID NOS：97及164)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股 及有義股為SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)中所列之序列對。
在某些實施例中，如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分的核酸分子(例如siNA分子)之反義股包括對應於表D或表E中任一者所示之反義序列中任一者的序列。
在如本文中所揭示作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)的各實施例中，反義股可為15至49個核苷酸長(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸長)；或17至35個核苷酸長；或17至30個核苷酸長；或15至25個核苷酸長；或18至25個核苷酸長；或18至23個核苷酸長；或19至21個核苷酸長；或25至30個核苷酸長；或26至28個核苷酸長。在如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之一些實施例中，反義股可為19個核苷酸長。同樣，如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之有義股可為15至49個核苷酸長(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸長)；或17至35個核苷酸長；或17至30個核苷酸長；或15至25個核苷酸長；或18至25個核苷酸長；或18至23個核苷酸長；或19至21個核苷酸長；或25至30個核苷酸長；或26至28個核苷酸長。 在如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之一些實施例中，有義股可為19個核苷酸長。在如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之一些實施例中，反義股及有義股可為19個核苷酸長。如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之雙螺旋體區可為15至49個核苷酸長(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸長)；15至35個核苷酸長；或15至30個核苷酸長；或約15至25個核苷酸長；或17至25個核苷酸長；或17至23個核苷酸長；或17至21個核苷酸長；或25至30個核苷酸長；或25至28個核苷酸長。在如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之各實施例中，雙螺旋體區可為19個核苷酸長。
在某些實施例中，如本文中所提供作為醫藥調配物之組分的核酸(例如siNA核酸分子)之有義股及反義股為各別聚核苷酸股。在一些實施例中，各別反義股及有義股經由氫鍵結(例如華特生-克里克(Watson-Crick)鹼基配對)形成雙股結構。在一些實施例中，有義股及反義股為彼此共價連接之兩個各別股。在其他實施例中，有義股及反義股為兼具有義區及反義區之單一聚核苷酸股之一部分；在一些較佳實施例中，聚核苷酸股具有髮夾結構。
在某些實施例中，核酸分子(例如siNA分子)為雙股核酸(dsNA)分子，其關於突出物對稱，且在兩個末端上均為鈍 端。在其他實施例中，核酸分子(例如siNA分子)為dsNA分子，其關於突出物對稱，且在該dsNA分子之兩個末端上均具有突出物；該分子較佳具有1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸突出物；該分子較佳具有2個核苷酸突出物。在一些實施例中，突出物為5'突出物；在替代性實施例中，突出物為3'突出物。在某些實施例中，突出核苷酸經如本文中所揭示之修飾而修飾。在一些實施例中，突出核苷酸為2'-脫氧核苷酸。
在某些較佳實施例中，作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)為dsNA分子，其關於突出物不對稱，且在分子之一個末端上具有鈍端且在分子之另一末端上具有突出物。在某些實施例中，突出物為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸；突出物較佳為2個核苷酸。在一些較佳實施例中，不對稱dsNA分子在雙螺旋體之一側有3'突出物(例如兩個核苷酸3'突出物)存在於有義股上；且在分子之另一側具有鈍端。在一些較佳實施例中，不對稱dsNA分子在雙螺旋體之一側有5'突出物(例如兩個核苷酸5'突出物)存在於有義股上；且在分子之另一側具有鈍端。在其他較佳實施例中，不對稱dsNA分子在雙螺旋體之一側有3'突出物(例如兩個核苷酸3'突出物)存在於反義股上；且在分子之另一側具有鈍端。在一些較佳實施例中，不對稱dsNA分子在雙螺旋體之一側有5'突出物(例如兩個核苷酸5'突出物)存在於反義股上；且在分子之另一側具有鈍端。在某些較佳實施例中，突出物為2'-脫氧核苷酸。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)具有髮夾結構(有義股及反義股在一個聚核苷酸上)，在一個末端上具有環結構且在另一末端上具有鈍端。在一些實施例中，核酸分子具有髮夾結構，在一個末端上具有環結構且在另一末端上具有突出端(例如1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸突出物)；在某些實施例中，突出物為3'突出物；在某些實施例中，突出物為5'突出物；在某些實施例中，突出物在有義股上；在某些實施例中，突出物在反義股上。
在一些較佳實施例中，核酸分子係選自表3中所示之核酸分子。
本文中所揭示作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可包括一或多個諸如本文中所描述之修飾或經修飾之核苷酸。舉例而言，如本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可包括具有經修飾之糖的經修飾之核苷酸；具有經修飾之核鹼基的經修飾之核苷酸；或具有經修飾之磷酸基的經修飾之核苷酸。同樣，如本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可包括經修飾之磷酸二酯骨架且/或可包括經修飾之末端磷酸基。
如所提供作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可具有一或多個核苷酸，其包括經修飾之糖部分，例如如本文中所描述。在一些較佳實施例中，經修飾之糖部分係選自由以下組成之群：2'OMe、2'-甲氧基乙氧基、2'-脫氧、2'-氟基、2'-烯丙基、2'-O-(2-(甲基胺基)-2-側氧 基乙基)、4'-硫基、4'-(CH2)2-O-2'-橋鍵、2'-LNA及2'-O-(N-甲基胺基甲酸酯)。
如所提供作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可具有一或多個例如如本文中所描述的經修飾之核鹼基，其較佳可為選自由以下組成之群中的一者：黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、胺基、硫醇、硫基烷基、羥基及其他8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-三氟甲基及其他5-經取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；及非環狀核苷酸。
如所提供作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可具有一或多個例如如本文中所描述的對磷酸二酯骨架之修飾。在一些較佳實施例中，磷酸二酯鍵係藉由用硫代磷酸酯、3'-(或5'-)脫氧-3'-(或5'-)硫基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3'-(或5'-)脫氧亞膦酸酯、硼烷磷酸酯(borano phosphate)、3'-(或5'-)脫氧-3'-(或5'-)胺基胺基磷酸酯、膦酸氫酯、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、胺基磷酸酯、膦酸烷基或芳基酯及磷酸三酯或磷鍵取代磷酸二酯鍵而修飾。
在各實施例中，所提供的作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可在有義股而非反義股中包括一或多 個修飾。在一些實施例中，所提供之核酸分子(例如siNA分子)在反義股而非有義股中包括一或多個修飾。在一些實施例中，所提供之核酸分子(例如siNA分子)在有義股及反義股兩者中均包括一或多個修飾。
在所提供的作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)具有修飾的一些實施例中，有義股包括交替經修飾及未經修飾之核苷酸的模式，且/或反義股包括交替經修飾及未經修飾之核苷酸的模式；在該等實施例之一些較佳型式中，修飾為2'OMe部分。交替經修飾及未經修飾之核苷酸之模式可在一個股之5'末端或3'末端處自經修飾之核苷酸開始；例如交替經修飾及未經修飾之核苷酸之模式可在有義股之5'末端或3'末端處自經修飾之核苷酸開始，且/或交替經修飾及未經修飾之核苷酸之模式可在反義股之5'末端或3'末端處自經修飾之核苷酸開始。當反義股及有義股兩者均包括交替修飾之核苷酸之模式時，經修飾之核苷酸之模式可經構形以使得有義股中之經修飾之核苷酸為反義股中之相對經修飾之核苷酸；或在模式中可能存在相移以使得有義股之經修飾之核苷酸為反義股中之相對未經修飾之核苷酸，反之亦然。
如本文中所提供作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可在有義及/或反義股之3'末端處包括一至三個(亦即1、2或3個)脫氧核苷酸。
如本文中所提供作為醫藥調配物之組分之核酸分子(例如siNA分子)可在有義及/或反義股之5'末端處包括磷酸基 (phosphate group)。
在一個態樣中，提供具有以下結構(A1)之雙股核酸分子作為醫藥調配物之組分： 其中N及N'各為可未經修飾或經修飾之核苷酸或為非習知部分；其中(N)x及(N')y各為寡核苷酸，其中各連續N或N'藉由共價鍵連接至下一N或N'；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地包括1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；其中z"可存在或不存在，但若存在，則為在(N')y之共價連接於5'末端處之封端部分；其中x及y各自獨立地為18與40之間的整數；其中(N')y之序列與(N)x之序列互補；且其中(N)x包括SEQ ID NO：1之反義序列。
在一些實施例中，(N)x包括存在於表4中之反義寡核苷酸。在其他實施例中，(N)x係選自存在於表B或表C中之反義寡核苷酸。
在一些實施例中，連接各連續N或N'之共價鍵為磷酸二酯鍵。
在一些實施例中，x=y且x及y各為19、20、21、22或23。在各實施例中，x=y=19。
在如本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)之一些實施例中，雙股核酸分子為siRNA、siNA或miRNA。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自以下中所列之序列對：˙SERPINH1_4(SEQ ID NOS：195及220)、˙SERPINH1_12(SEQ ID NOS：196及221)、˙SERPINH1_30(SEQ ID NOS：199及224)及˙SERPINH1_58(SEQ ID NOS：208及233)。
在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_4(SEQ ID NOS：195及220)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_12(SEQ ID NOS：196及221)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_30(SEQ ID NOS：199及224)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_58(SEQ ID NOS：208及233)中所列之序列對。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之雙股核酸分子在反義股之位置1(5'末端)處包含DNA部分或目標之錯配。該種結構描述於本文中。根據一個實施例，提供具有以下所列之結構(A2)的經修飾之核酸分子： 其中N2、N及N'各為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分；其中(N)x及(N')y各為寡核苷酸，其中各連續N或N'藉由共 價鍵連接至相鄰N或N'；其中x及y各自獨立地為17與39之間的整數；其中(N')y之序列與(N)x之序列具有互補性，且(N)x與目標RNA中之連續序列具有互補性；其中N1與(N)x共價結合且與目標RNA不匹配或為目標RNA之互補DNA部分；其中N1為選自由以下組成之群之部分：天然或經修飾之尿苷、脫氧尿苷(deoxyribouridine)、核糖胸苷、脫氧核糖胸苷、腺苷或脫氧腺苷；其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分；且其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸、連續非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處。
在一些實施例中，(N')y之序列與(N)x之序列完全互補。在各實施例中，N2-(N')y之序列與N1-(N)x之序列互補。在一些實施例中，(N)x包含與目標RNA中之約17至約39個連續核苷酸完全互補之反義序列。在其他實施例中，(N)x包含與目標RNA中之約17至約39個連續核苷酸實質上互補之反義序列。
在一些實施例中，N1及N2形成華特生-克里克鹼基對。在一些實施例中，N1及N2形成非華特生-克里克鹼基對。在一些實施例中，鹼基對在核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸之間形成。
在一些實施例中，x=y=18、x=y=19或x=y=20。在較佳實施例中，x=y=18。當N1-(N)x中之x=18時，N1係指位置1且位置2至19包括於(N)18中。當N2-(N')y中之y=18時，N2係指位置19且位置1至18包括於(N')18中。
在一些實施例中，N1與(N)x共價結合且與目標RNA不匹配。在各實施例中，N1與(N)x共價結合且為與目標RNA互補之DNA部分。
在一些實施例中，反義股之位置1之尿苷經選自以下之N1取代：腺苷、脫氧腺苷、脫氧尿苷(dU)、核糖胸苷或脫氧胸苷。在各實施例中，N1選自腺苷、脫氧腺苷或脫氧尿苷。
在一些實施例中，反義股之位置1之鳥苷經選自以下之N1取代：腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷。在各實施例中，N1係選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷或脫氧尿苷。
在一些實施例中，反義股之位置1之胞苷經選自以下之N1取代：腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷。在各實施例中，N1係選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷或脫氧尿苷。
在一些實施例中，反義股之位置1之腺苷經選自以下之N1取代：脫氧腺苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷。在各實施例中，N1選自脫氧腺苷或脫氧尿苷。
在一些實施例中，N1及N2在尿苷或脫氧尿苷與腺苷或脫氧腺苷之間形成鹼基對。在其他實施例中，N1及N2在脫氧 尿苷與腺苷之間形成鹼基對。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之雙股核酸分子為siRNA、siNA或miRNA。如本文中所提供之雙股核酸分子亦稱為「雙螺旋體」。
在一些實施例中，(N)x包括存在於表5中之反義寡核苷酸。在一些實施例中，x=y=18且N1-(N)x包括存在於表4中之反義寡核苷酸。在一些實施例中，x=y=19或x=y=20。在某些較佳實施例中，x=y=18。在一些實施例中，x=y-18且N1-(N)x及N2-(N')y之序列係選自陳列於表4中之寡核苷酸對。在一些實施例中，x=y-18且N1-(N)x及N2-(N')y之序列係選自陳列於表D及表E中之寡核苷酸對。在一些實施例中，反義股及有義股係選自以下中所列之序列對：˙SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、˙SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)、˙SERPINH1_11(SEQ ID NOS：68及135)、˙SERPINH1_13(SEQ ID NOS：69及136),˙SERPINH1_45(SEQ ID NOS：97及164)、˙SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)、˙SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)、˙SERPINH1_51a(SEQ ID NOS：105及172)、˙SERPINH1_52(SEQ ID NOS：102及169)及˙SERPINH1_86(SEQ ID NOS：123及190)。
在一些較佳實施例中，反義股及有義股係選自以下中所列之序列對： ˙SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、˙SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)、˙SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)、˙SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)及˙SERPINH1_51a(SEQ ID NOS：105及172)。
在一些較佳實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_11(SEQ ID NOS：68及135)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_13(SEQ ID NOS：69及136)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_45(SEQ ID NOS：97及164)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_51a(SEQ ID NOS：105及172)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為SERPINH1_52(SEQ ID NOS：102及169)中所列之序列對。在一些實施例中，反義股及有義股為(SEQ ID NOS：123及190)中所列之序列對。在一些較佳實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)、SERPINH1_45a (SEQ ID NOS：98及165)、SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)及SERPINH1_51a(SEQ ID NOS：105及172)中所列之序列對。
在一些實施例中，N1及N2形成華特生-克里克鹼基對。在其他實施例中，N1及N2形成非華特生-克里克鹼基對。在一些實施例中，N1為經修飾之核糖腺苷或經修飾之尿苷(ribouridine)。
在一些實施例中，N1及N2形成華特生-克里克鹼基對。在其他實施例中，N1及N2形成非華特生-克里克鹼基對。在某些實施例中，N1係選自由以下組成之群：核糖腺苷、經修飾之核糖腺苷、脫氧核糖腺苷、經修飾之脫氧核糖腺苷。在其他實施例中，N1係選自由以下組成之群：尿苷、脫氧尿苷、經修飾之尿苷及經修飾之脫氧尿苷。
在某些實施例中，反義股之位置1(5'末端)包括脫氧尿苷(dU)或腺苷。在一些實施例中，N1係選自由以下組成之群：核糖腺苷、經修飾之核糖腺苷、脫氧核糖腺苷、經修飾之脫氧核糖腺苷，且N2係選自由以下組成之群：尿苷、脫氧尿苷、經修飾之尿苷及經修飾之脫氧尿苷。在某些實施例中，N1係選自由以下組成之群：核糖腺苷及經修飾之核糖腺苷，且N2係選自由以下組成之群：尿苷及經修飾之尿苷。
在某些實施例中，N1係選自由以下組成之群：尿苷、脫氧尿苷、經修飾之尿苷及經修飾之脫氧尿苷，且N2係選自由以下組成之群：核糖腺苷、經修飾之核糖腺苷、脫氧核 糖腺苷及經修飾之脫氧核糖腺苷。在某些實施例中，N1係選自由以下組成之群：尿苷及脫氧尿苷，且N2係選自由以下組成之群：核糖腺苷及經修飾之核糖腺苷。在某些實施例中，N1為尿苷，且N2為核糖腺苷。在某些實施例中，N1為脫氧尿苷，且N2為核糖腺苷。
在結構(A2)之一些實施例中，N1包括經2'OMe修飾之核糖尿嘧啶或經2'OMe修飾之核糖腺苷。在結構(A2)之某些實施例中，N2包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。
在結構(A2)之一些實施例中，N1包括經2'OMe修飾之核糖尿嘧啶或經2'OMe修飾之核糖胞嘧啶。在結構(A2)之某些實施例中，N2包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。
在一些實施例中，N及N'各為未經修飾之核苷酸。在一些實施例中，N或N'中之至少一者包括經化學修飾之核苷酸或非習知部分。在一些實施例中，非習知部分係選自鏡像核苷酸、無鹼基核糖部分及無鹼基脫氧核糖部分。在一些實施例中，非習知部分為鏡像核苷酸，較佳為L-DNA部分。在一些實施例中，N或N'中之至少一者包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。
在一些實施例中，(N')y之序列與(N)x之序列完全互補。在其他實施例中，(N')y之序列與(N)x之序列實質上互補。
在一些實施例中，(N)x包括與目標mRNA中之約17至約39個連續核苷酸完全互補之反義序列。在其他實施例中，(N)x包括與目標mRNA中之約17至約39個連續核苷酸實質 上互補之反義序列。
在結構A1及結構A2之一些實施例中，化合物為鈍端，例如其中Z及Z'兩者均不存在。在替代性實施例中，存在Z或Z'中之至少一者。Z及Z'獨立地包括一或多個共價連接之經修飾及/或未經修飾之核苷酸，包括脫氧核糖核苷酸及核糖核苷酸，或非習知部分，例如反向無鹼基脫氧核糖部分或無鹼基核糖部分；非核苷酸C3、C4或C5部分、胺基-6部分、鏡像核苷酸及其類似物。在一些實施例中，Z及Z'各自獨立地包括C3部分或胺基-C6部分。在一些實施例中，Z'不存在，且Z存在且包括非核苷酸C3部分。在一些實施例中，Z不存在，且Z'存在且包括非核苷酸C3部分。
在結構A1及結構A2之一些實施例中，各N由未經修飾之核糖核苷酸組成。在結構A1及結構A2之一些實施例中，各N'由未經修飾之核苷酸組成。在較佳實施例中，N及N'中之至少一者為經修飾之核糖核苷酸或非習知部分。
在其他實施例中，結構A1或結構A2之化合物包括至少一個在糖殘基中經修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，化合物在糖殘基之2'位置處包括修飾。在一些實施例中，2'位置之修飾包括存在胺基、氟基、烷氧基或烷基部分。在某些實施例中，2'修飾包括烷氧基部分。在較佳實施例中，烷氧基部分為甲氧基部分(2'OMe)。在一些實施例中，核酸化合物在反義股及有義股之一者或兩者中包括經2'OMe修飾之交替核糖核苷酸。在其他實施例中，化合物 僅在反義股(N)x或N1-(N)x中包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在某些實施例中，反義股之中間核糖核苷酸(例如19聚體股之位置10之核糖核苷酸)未經修飾。在各實施例中，核酸化合物包括至少5個交替經2'OMe修飾及未經修飾之核糖核苷酸。在其他實施例中，結構A1或結構A2之化合物在交替位置包括經修飾之核糖核苷酸，其中(N)x或N1-(N)x之5'及3'末端處之各核糖核苷酸的糖殘基經修飾，且(N')y或N2-(N)y之5'及3'末端處之各核糖核苷酸的糖殘基未經修飾。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之雙股分子包括以下修飾中之一或多者：˙反義股之5'末端的位置5、6、7、8或9中之至少一者之N係選自2'5'-核苷酸或鏡像核苷酸；˙有義股之5'末端的位置9或10中之至少一者之N'係選自2'5'-核苷酸及假尿苷；及˙(N')y之3'末端位置處的4、5或6相鄰位置之N'包含2'5'-核苷酸。在一些實施例中，雙股分子包括以下修飾之組合：˙反義股在5'末端之位置5、6、7、8或9中之至少一處包括2'5'-核苷酸或鏡像核苷酸；及˙有義股在5'末端之位置9或10處包括2'5'-核苷酸及假尿苷中之至少一者。
在一些實施例中，雙股分子包括以下修飾之組合：˙反義股在5'末端之位置5、6、7、8或9中之至少一處 包括2'5'-核苷酸或鏡像核苷酸；及˙有義股在3'次末端或3'末端位置處包括4、5或6個連續2'5'-核苷酸。
在一些實施例中，有義股((N)x或N1-(N)x)包括1、2、3、4、5、6、7、8或9個經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，反義股在位置2、4、6、8、11、13、15、17及19處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在其他實施例中，反義股在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17及19處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在其他實施例中，反義股在位置3、5、7、9、11、13、15、17及19處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，反義股包括一或多個經2'OMe修飾之嘧啶。在一些實施例中，反義股中之所有嘧啶核苷酸均經2'OMe修飾。在一些實施例中，有義股包括經2'OMe修飾之嘧啶。
在結構A1及結構A2之一些實施例中，有義股及反義股在3'及5'末端處均未被磷酸化。在其他實施例中，有義股或反義股中之一者或兩者在3'末端處被磷酸化。
在結構A1及結構A2之一些實施例中，(N)y包括至少一個選自鏡像核苷酸、2'5'-核苷酸及TNA之非習知部分。在一些實施例中，非習知部分為鏡像核苷酸。在各實施例中，鏡像核苷酸係選自L-核糖核苷酸(L-RNA)及L-脫氧核糖核苷酸(L-DNA)。在較佳實施例中，鏡像核苷酸為L-DNA。在某些實施例中，有義股在位置9或10(5'末端)包含非習知部分。在較佳實施例中，有義股在位置9(5'末端)包括非習 知部分。在一些實施例中，有義股為19個核苷酸長且在位置15(5'末端)包含4、5或6個連續非習知部分。在一些實施例中，有義股在位置15、16、17及18包括4個連續2'5'-核糖核苷酸。在一些實施例中，有義股在位置15、16、17、18及19包括5個連續2'5'-核糖核苷酸。在各實施例中，有義股進一步包含Z'。在一些實施例中，Z'包括C3OH部分或C3Pi部分。
在結構A1之一些實施例中，(N')y包括至少一個L-DNA部分。在一些實施例中，x=y=19，且(N')y由位置1至位置17及位置19處之未經修飾之核糖核苷酸及3'次末端位置(位置18)處之一個L-DNA組成。在其他實施例中，x=y=19，且(N')y由位置1至位置16及位置19處之未經修飾之核糖核苷酸及3'次末端位置(位置17及18)處之兩個連續L-DNA組成。在各實施例中，非習知部分為藉由2'-5'核苷酸間磷酸酯鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸。根據各種實施例，(N')y在3'末端處包括2、3、4、5或6個藉由2'-5'核苷酸間鍵連接的連續核糖核苷酸。在一個實施例中，(N')y之3'末端處之四個連續核苷酸係藉由三個2'-5'磷酸二酯鍵連接，其中形成2'-5'磷酸二酯鍵之2'-5'核苷酸中之一或多者進一步包括3'-O-甲基(3'OMe)糖修飾。(N')y之3'末端核苷酸較佳包括2'OMe修飾。在某些實施例中，x=y=19，且(N')y在位置15、16、17、18及19處包括兩個或兩個以上連續核苷酸，包括藉由2'-5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接之核苷酸(2'-5'核苷酸)。在各實施例中，形成2'-5'核苷酸間鍵之核苷酸包 括3'脫氧核糖核苷酸或3'甲氧基核苷酸(3'H或3'OMe，替代3'OH)。在一些實施例中，x=y=19，且(N')y在位置15、16及17處包括2'-5'核苷酸以使得在位置15至16、16至17及17至18之間相鄰核苷酸藉由2'-5'核苷酸間鍵連接；或在位置15、16、17、18及19處包括2'-5'核苷酸以使得在位置15至16、16至17、17至18及18至19之間相鄰核苷酸藉由2'-5'核苷酸間鍵連接且在3'末端核苷酸處可用3'OH；或在位置16、17及18處包括2'-5'核苷酸以使得在位置16至17、17至18及18至19之間相鄰核苷酸藉由2'-5'核苷酸間鍵連接。在一些實施例中，x=y=19，且(N')y在位置16及17處或在位置17及18處或在位置15及17處包括2'-5'-核苷酸，以使得分別在位置16至17及17至18之間或在位置17至18及18至19之間或在位置15至16及17至18之間相鄰核苷酸藉由2'-5'核苷酸間鍵連接。在其他實施例中，(N')y中之嘧啶核糖核苷酸(rU，rC)經藉由2'-5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接之核苷酸取代。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所列之序列對，且x=y=19，且(N')y在3'末端處包含五個藉由四個2'-5'鍵(特定言之在核苷酸位置15至16、16至17、17至18及18至19之間的鍵)連接之連續核苷酸。
在一些實施例中，鍵包括磷酸二酯鍵。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88 中所列之序列對，且x=y=19，且(N')y在3'末端處包含五個藉由四個2'-5'鍵連接之連續核苷酸且視情況進一步包括獨立地選自反向無鹼基部分及C3烷基[C3；1,3-丙二醇單(二氫磷酸酯)]端之Z'及z'。C3烷基端與3'或5'末端核苷酸共價連接。在一些實施例中，3' C3末端進一步包含3'磷酸酯。在一些實施例中，3' C3末端進一步包含3'末端羥基。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之反義股及有義股係選自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所列之序列對，且x=y=19，且(N')y在位置18處包括L-DNA；且(N')y視情況進一步包括獨立地選自反向無鹼基部分及C3烷基[C3；1,3-丙二醇單(二氫磷酸酯)]端之Z'及z'。
在一些實施例中，(N')y包括3'末端磷酸酯。在一些實施例中，(N')y包括3'末端羥基。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之反義股及有義股係選自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所列之序列對，且x=y=19，且(N)x在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19處或在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58及SERPINH1_88中所列之序列對，且x=y=19，且(N)x包括經2'OMe修飾之嘧啶。在一些實施例中，(N)x中之所有嘧啶均包括2'OMe 修飾。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N2為核糖腺苷部分。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N2-(N')y在3'末端處包括五個藉由四個2'-5'鍵(特定言之在核苷酸位置15至16、16至17、17至18及18至19之間的鍵)連接之連續核苷酸。在一些實施例中，鍵包括磷酸二酯鍵。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N2-(N')y在3'末端處包括五個藉由四個2'-5'鍵連接之連續核苷酸且視情況進一步包括獨立地選自反向無鹼基部分及C3烷基[C3；1,3-丙二醇單(二氫磷酸酯)]端之Z'及z'。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N2-(N')y 在位置18處包括L-DNA；且(N')y視情況進一步包括獨立地選自反向無鹼基部分及C3烷基[C3；1,3-丙二醇單(二氫磷酸酯)]端之Z'及z'。
在一些實施例中，N2-(N')y包含3'末端磷酸酯。在一些實施例中，N2-(N')y包含3'末端羥基。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N1-(N)x在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或在位置1、3、5、9、11、13、15、17、19或在位置3、5、9、11、13、15、17或在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N1-(N)x在位置11、13、15、17及19(5'末端)處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N1-(N)x在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或在位置3、5、7、9、11、13、15、17、19處包括 經2'OMe修飾之核糖核苷酸。在一些實施例中，反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N1-(N)x在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19處包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之反義股及有義股係選自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所列之序列對，且x=y=18，且N1-(N)x包括經2'OMe修飾之嘧啶。在一些實施例中，(N)x中之所有嘧啶均包括2'OMe修飾。在一些實施例中，反義股在位置5、6或7處進一步包括L-DNA或2'-5'核苷酸。在其他實施例中，反義股進一步包括在位置5至6或6至7之核糖核苷酸之間生成2'5'核苷酸間鍵的核糖核苷酸。
在其他實施例中，N1-(N)x進一步包括Z，其中Z包括非核苷酸突出物。在一些實施例中，非核苷酸突出物為C3-C3[1,3-丙二醇單(二氫磷酸酯)]2。
在結構A2之一些實施例中，(N)y包括至少一個L-DNA部分。在一些實施例中，x=y=18，且(N')y由位置1至位置16及位置18處之未經修飾之核糖核苷酸及3'次末端位置(位置17)處之一個L-DNA組成。在其他實施例中，x=y=18，且(N')y由位置1至位置15及位置18處之未經修飾之核糖核苷 酸及3'次末端位置(位置16及17)處之兩個連續L-DNA組成。在各實施例中，非習知部分為藉由2'-5'核苷酸間磷酸酯鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸。根據各種實施例，(N')y在3'末端處包括2、3、4、5或6個藉由2'-5'核苷酸間鍵連接的連續核糖核苷酸。在一個實施例中，(N')y之3'末端處之四個連續核苷酸係藉由三個2'-5'磷酸二酯鍵連接，其中形成2'-5'磷酸二酯鍵之2'-5'核苷酸中之一或多者進一步包括3'-O-甲基(3'OMe)糖修飾。(N')y之3'末端核苷酸較佳包括2'OMe修飾。在某些實施例中，x=y=18，且在(N')y中，位置14、15、16、17及18處之兩個或兩個以上連續核苷酸包括藉由2'-5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接之核苷酸。在各實施例中，形成2'-5'核苷酸間鍵之核苷酸包括3'脫氧核糖核苷酸或3'甲氧基核苷酸。在一些實施例中，x=y=18，且(N')y在位置15至16、16至17及17至18之間或在位置16至17及17至18之間包括藉由2'-5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接之核苷酸。在一些實施例中，x=y=18，且(N')y在位置14至15、15至16、16至17及17至18之間或在位置15至16、16至17及17至18之間或在位置16至17及17至18之間或在位置17至18之間或在位置15至16及17至18之間包括藉由2'-5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接之核苷酸。在其他實施例中，(N')y中之嘧啶核糖核苷酸(rU，rC)經藉由2'-5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接之核苷酸取代。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自陳列於表5中且在本文中標識為SERPINH1_2(SEQ ID NOS：60及127)、 SERPINH1_6(SEQ ID NOS：63及130)、SERPINH1_45a(SEQ ID NOS：98及165)、SERPINH1_51(SEQ ID NOS：101及168)及SERPINH1_51a(SEQ ID NOS：105及172)的寡核苷酸對。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之雙股核酸分子包括SEQ ID NO：127中所列之反義股及SEQ ID NO：60中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_2。在一些實施例中，雙股核酸分子具有以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括一或多個經2'OMe修飾之嘧啶及/或嘌呤、位置5、6、7或8之2'5'-核糖核苷酸及3'末端核苷酸或非核苷酸突出物。在一些實施例中，有義股(SEQ ID NO：60)包括3'末端或次末端位置處之4或5個連續2'5'-核苷酸、共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分及共價連接於5'末端處之封端部分。在其他實施例中，有義股(SEQ ID NO：60)包括一或多個2'OMe嘧啶、共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分及共價連接於5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：60)係選自包括以下之有義股：˙位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；C3OH 3'末端非核苷酸突出物；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或˙位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；3'末端磷酸酯；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或˙位置(5'>3')5、7、13及16處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置18處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或˙位置(5'>3')7、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或˙位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-Pi部分；及共價連接於5'末端處 之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：60)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；C33'末端突出物；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及C3Pi-C3OH 3'末端突出物；且有義股(SEQ ID NO：60)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；3'末端磷酸酯；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：60)包括位置(5'>3')5、7、13及16處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置18處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127) 包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：60)包括位置(5'>3')7、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：60)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-Pi部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：127)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及C3-C33'末端突出物；且有義股(SEQ ID NO：60)包括位置(5'>3')7、9、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：60)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；3'末端磷酸酯；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：127) 包括選自以下中之一者之反義股：˙位置(5'>3')1、3、5、7、9、11、13、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或˙位置(5'>3')1、3、6、8、10、12、14、17、18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，本文提供作為醫藥調配物之組分之雙股核酸分子，其包括SEQ ID NO：130中所列之反義股及SEQ ID NO：63中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_6。在一些實施例中，雙螺旋體包含以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：63)包括一或多個經2'OMe修飾之嘧啶；3'末 端核苷酸或非核苷酸突出物；及共價連接於5'末端處之封端部分。在一些實施例中，反義股(SEQ ID NO：130)包括一或多個經2'OMe修飾之嘧啶；共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：63)包括位置(5'>3')2、14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH或C3Pi部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：130)係選自包括以下之反義股：˙位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或˙位置(5'>3')1、3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或˙位置(5'>3')3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或˙位置(5'>3')3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置1之dU；位置7之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股 (SEQ ID NO：63)包括位置(5'>3')2、14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：130)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，本文提供雙螺旋體寡核苷酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：63)包括位置(5'>3')14及18處及視情況在位置2處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：130)包括位置(5'>3')1、3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，本文提供雙螺旋體寡核苷酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：63)包括位置(5'>3')14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：130)係選自包括以下之反義股：˙位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH部 分；或˙位置(5'>3')1、3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：63)包括位置(5'>3')14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：130)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：63)包括位置(5'>3')14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：130)包括位置(5'>3')1、3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及C3Pi-C3OH 3'末端突出物。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之雙螺旋體包括SEQ ID NO：165中所列之反義股及SEQ ID NO：98中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_45a。在一些實施例中，雙螺旋體包含以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，有義股(SEQ ID NO：98)包括位置(5'>3')15、16、17及18或15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分。在一些實施例中，反義股(SEQ ID NO：165)包括經2'OMe修飾之嘧啶及/或嘌呤；位置5、6、7或8(5'>3')處之2'-5'核苷酸；及共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分。
在一些實施例中，有義股(SEQ ID NO：98)包括位置(5'>3')15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；C3Pi或C3-OH 3'末端非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：165)包括選自以下中之一者之反義股：˙位置(5'>3')2、4、6、8、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3'末端突出物；或˙位置(5'>3')2、4、6、8、11、13、15、17及19處之經 2'OMe修飾之核糖核苷酸；及C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3'末端突出物；˙位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3'末端突出物；或˙位置(5'>3')1、3、5、7、9、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3'末端突出物。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：98)包括位置(5'>3')15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；C3-OH 3'末端部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：165)包括位置(5'>3')2、4、6、8、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及C3Pi-C3OH 3'末端突出物。
在一些實施例中，作為醫藥調配物之組分之雙股核酸分子包括SEQ ID NO：168中所列之反義股及SEQ ID NO：101中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_51。在一些實施例中，雙螺旋體包含以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分； 其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：101)包括經2'OMe修飾之嘧啶；視情況在位置9或10處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分；及視情況存在之共價連接於5'末端處之封端部分。在一些實施例中，反義股(SEQ ID NO：168)包括經2'OMe修飾之嘧啶及/或嘌呤；位置5、6、7或8(5'>3')處之2'-5'核苷酸；及共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：101)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之嘧啶；視情況在位置9或10處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi或C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：168)係選自包括以下之反義股：a)位置(5'>3')1、8及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6或7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH突出物；或b)位置(5'>3')1、4、8、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6或7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於 3'末端處之C3Pi-C3OH突出物；或c)位置(5'>3')1、4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH突出物；或d)位置(5'>3')1、3、8、12、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：101)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；視情況在位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：168)包括位置(5'>3')1、8及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：101)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；視情況在位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：168)包括位置(5'>3')1、4、8、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：101) 包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：168)包括位置(5'>3')1、4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：101)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：168)包括位置(5'>3')1、3、8、12、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，雙股核酸分子為醫藥調配物之組分，包括SEQ ID NO：168中所列之反義股及SEQ ID NO：101中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_51a。在一些實施例中，雙螺旋體包含以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分； 其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：105)包括經2'OMe修飾之嘧啶；視情況在位置9或10處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分；及視情況共價連接於5'末端處之封端部分。在一些實施例中，反義股(SEQ ID NO：172)包括經2'OMe修飾之嘧啶及/或嘌呤；位置5、6、7或8(5'>3')處之2'-5'核苷酸；及共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：105)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之嘧啶；視情況在位置9或10處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi或C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：172)係選自包括以下之反義股：a)位置(5'>3')8及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6或7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分；或b)位置(5'>3')4、8、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6或7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3' 末端處之C3Pi-C3OH部分；或c)位置(5'>3')4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分；或d)位置(5'>3')3、8、12、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：105)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；視情況在位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：172)包括位置(5'>3')8及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：105)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；視情況在位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：172)包括位置(5'>3')4、8、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：105) 包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：172)包括位置(5'>3')4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：105)包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：172)包括位置(5'>3')3、8、12、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，反義股及有義股係選自陳列於表5中且在本文中標識為SERPINH1_4(SEQ ID NOS：195及220)及SERPINH1_12(SEQ ID NOS：196及221)的寡核苷酸對。
在一些實施例中，雙股核酸分子為醫藥調配物之組分，其包括SEQ ID NO：220中所列之反義股及SEQ ID NO：195中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_4。在一些實施例中，雙股核酸分子具有以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')3、5、9、11、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195)係選自包括以下之有義股：a)位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接至3'末端之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或b)位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；3'末端磷酸酯；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或c)位置(5'>3')5、7、13及16處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置18處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或d)位置(5'>3')7、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖核 苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；或e)位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接至3'末端之C3部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；3'末端磷酸酯；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195) 包括位置(5'>3')5、7、13及16處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置18處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195)包括位置(5'>3')7、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')3、5、9、11、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；且有義股(SEQ ID NO：195)包括位置(5'>3')7、9、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖 核苷酸；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分。
在一些實施例中，本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：195)包括位置15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；3'末端磷酸酯；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：220)包括選自以下中之一者之反義股：a)位置(5'>3')3、5、7、9、11、13、15、17、19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或b)位置(5'>3')1、3、6、8、10、12、14、17、18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，本文提供作為醫藥調配物之組分之雙股核酸分子，其包括SEQ ID NO：130中所列之反義股及SEQ ID NO：63中所列之有義股；在本文中標識為SERPINH1_12。在一些實施例中，雙螺旋體包含以下結構： 其中各「|」表示核糖核苷酸之間的鹼基配對；其中A、C、G、U各自獨立地為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或為非習知部分；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立 地為1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；且其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於N2-(N')y之5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括一或多個經2'OMe修飾之嘧啶；3'末端核苷酸或非核苷酸突出物；及共價連接於5'末端處之封端部分。在一些實施例中，反義股(SEQ ID NO：221)包括一或多個經2'OMe修飾之嘧啶；共價連接於3'末端處之核苷酸或非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分。
在一些實施例中，提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括位置(5'>3')2、14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：221)係選自包括以下之反義股：a)位置(5'>3')3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或b)位置(5'>3')3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括位置(5'>3')2、14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價 連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：221)包括位置(5'>3')3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，提供雙螺旋體寡核苷酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括位置(5'>3')14及18處及視情況在位置2處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：221)包括位置(5'>3')3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在一些實施例中，提供雙螺旋體寡核苷酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括位置(5'>3')14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：221)係選自包括以下之反義股：a)位置(5'>3')3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分；或b)位置(5'>3')3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括位置(5'>3')14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、13、15及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
本文提供雙股核酸分子，其中有義股(SEQ ID NO：196)包括位置(5'>3')14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股(SEQ ID NO：220)包括位置(5'>3')1、3、5、7、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之C3Pi-C3OH部分。
在結構A1及A2之其他實施例中，(N')y包括1至8個經修飾之核糖核苷酸，其中經修飾之核糖核苷酸為DNA核苷酸。在某些實施例中，(N')y包括1、2、3、4、5、6、7或多達8個DNA部分。
在一些實施例中，任一Z或Z'存在且獨立地包括兩個非核苷酸部分。
在其他實施例中，Z及Z'存在且各獨立地包括兩個非核苷酸部分。
在一些實施例中，Z及Z'各自包括無鹼基部分，例如脫氧核糖無鹼基部分(在本文中稱為「dAb」)或核糖無鹼基 部分(在本文中稱為「rAb」)。在一些實施例中，Z及/或Z'各自包括兩個共價連接之無鹼基部分且為例如dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb，其中各部分較佳經由基於磷酸之鍵與相鄰部分共價連接。在一些實施例中，基於磷酸之鍵包括硫代磷酸酯、膦醯基乙酸酯或磷酸二酯鍵。在較佳實施例中，基於磷酸之鍵包括磷酸二酯鍵。
在一些實施例中，Z及/或Z'各自獨立地包括烷基部分，視情況為丙烷((CH2)3)部分(C3)或其衍生物，包括丙醇(C3OH)及丙二醇之磷酸衍生物(「C3Pi」)。在一些實施例中，Z及/或Z'各自包括兩個經由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵共價連接至反義股或有義股之3'末端且經由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵共價連接至彼此的烷基部分，且在一些實例中為C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH。反義股之3'末端及/或有義股之3'末端經由基於磷酸之鍵與C3部分共價連接，且C3部分為經由基於磷酸之鍵共價結合之C3OH部分。在一些實施例中，基於磷酸之鍵包括硫代磷酸酯、膦醯基乙酸酯或磷酸二酯鍵。在較佳實施例中，基於磷酸之鍵包括磷酸二酯鍵。
在結構A1或結構A2之各實施例中，Z及Z'不存在。在其他實施例中，Z或Z'存在。在一些實施例中，Z及/或Z'各自獨立地包括C2、C3、C4、C5或C6烷基部分，視情況為C3部分或其衍生物，包括丙醇(C3OH/C3OH)、丙二醇及丙二醇之磷酸二酯衍生物(C3Pi)。在較佳實施例中，Z及/或Z'各自包括兩個烴部分，且在一些實例中為C3Pi-C3OH或 C3Pi-C3Pi。各C3經由共價鍵、較佳為基於磷酸之鍵與相鄰C3共價結合。在一些實施例中，基於磷酸之鍵為硫代磷酸酯、膦醯基乙酸酯或磷酸二酯鍵。
在特定實施例中，x=y=19，且Z包含至少一個C3烷基突出物。在一些實施例中，C3-C3突出物經由共價鍵、較佳為磷酸二酯鍵與(N)x或(N')y之3'末端共價連接。在一些實施例中，第一C3與第二C3之間的鍵為磷酸二酯鍵。在一些實施例中，3'非核苷酸突出物為C3Pi-C3Pi。在一些實施例中，3'非核苷酸突出物為C3Pi-C3Pi。在一些實施例中，3'非核苷酸突出物為C3Pi-C3OH。
在各實施例中，烷基部分包含烷基衍生物，其包括包含末端羥基、末端胺基或末端磷酸基之C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基部分。在一些實施例中，烷基部分為C3烷基或C3烷基衍生物部分。在一些實施例中，C3烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其組合。C3烷基部分經由磷酸二酯鍵與(N')y之3'末端及/或(N)x之3'末端共價連接。在一些實施例中，烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯或硫代磷酸丙酯。在一些實施例中，Z及Z'各自係獨立地選自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其組合或其複合體，尤其為2或3個共價連接之丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其組合。在一些實施例中，Z及Z'各自係獨立地選自磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-丙醇、丙基磷酸-硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-磷酸丙酯、(磷酸丙酯)3、(磷酸丙酯)2-丙醇、(磷酸丙酯)2-硫代磷酸丙酯。任何丙烷或丙 醇結合部分可包括於Z或Z'中。
例示性3'末端非核苷酸部分之結構如下：
在一些實施例中，Z及Z'各自係獨立地選自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其組合或其複合體。
在一些實施例中，Z及Z'各自係獨立地選自磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-丙醇、丙基磷酸-硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-磷酸丙酯、(磷酸丙酯)3、(磷酸丙酯)2-丙醇、(磷酸丙酯)2-硫代磷酸丙酯。任何丙烷或丙醇結合部分可包括於Z或Z'中。
在其他實施例中，Z及/或Z'各自包括無鹼基部分與未經修飾之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之組合；或烴部分與未經修飾之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之組合；或無鹼基部分(脫氧核糖或核糖)與烴部分之組合。在該等實施例中，Z及/或Z'各自包括C3-rAb或C3-dAb，其中各部分經由基於磷酸之鍵(較佳為磷酸二酯、硫代磷酸酯或膦醯基乙酸酯鍵)與相鄰部分共價結合。
在某些實施例中，如本文中所揭示之核酸分子包括選自以下表4及表5中所示之寡核苷酸(SEQ ID NOS：60至126及194至218)中之任一者的有義寡核苷酸序列。
在某些較佳實施例中，所提供之化合物包括如下所述之化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8及化合物9。
在一些實施例中，(諸如化合物1、化合物5及化合物6)提供19聚體雙股核酸分子，其中反義股為SEQ ID NO：127且有義股為SEQ ID NO：60。在某些實施例中，提供19聚體雙股核酸分子，其中反義股為SEQ ID NO：127且包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置1、5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接至3'末端之3'末端非核苷酸部分；且有義股為SEQ ID NO：60且包括至少一個2'5'-核糖核苷酸或經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分。在一些實施例中，提供19聚體雙股核酸分子，其中反義股為SEQ ID NO：127；且包括位置3、5、9、11、13、 15、17及19(5'>3')處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之3'末端C3OH非核苷酸部分；且有義股為SEQ ID NO：60且包括3'末端位置15、16、17、18及19(5'>3')處之五個連續2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。
在一個實施例中，提供化合物1，其為19聚體雙股核酸分子，其中反義股為SEQ ID NO：127且包括位置3、5、9、11、13、15、17及19(5'>3')處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有義股為SEQ ID NO：60且包括3'末端位置15、16、17、18及19(5'>3')處之五個連續2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分；且其在反義股之位置1處進一步包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸。
在一個實施例中，提供化合物6，其為19聚體雙股核酸分子，其中反義股為SEQ ID NO：127且包括位置3、5、9、11、13、15、17及19(5'>3')處之經2'OMe至之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有義股為SEQ ID NO：60且包括3'末端位置15、16、17、18及19(5'>3')處之五個連續2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分；且其在反義股之位置1處進一步包括2'5'-核糖核苷酸。
在一個實施例中，提供化合物5，其為19聚體雙股核酸分子，其中反義股為SEQ ID NO：127且包括位置1、3、5、9、11、13、15、17及19(5'>3')之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有義股為SEQ ID NO：60且包括位置(5'>3')7、13、16及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。
在一些實施例中，(諸如以下所述之化合物2及化合物7)提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：63且反義股為SEQ ID NO：130。在一些實施例中，提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：63且包括經2'OMe修飾之嘧啶核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分；且反義股為SEQ ID NO：130且包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。在一些實施例中，提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：63且包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分；且反義股為SEQ ID NO：130且包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。
在一個實施例中，提供化合物2，其為19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：63且包括位置(5'>3')2、14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：130且包括位置(5'>3')1、3、5、9、12、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分。
在一個實施例中，提供化合物7，其為19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：63且包括位置(5'>3')2、14及18處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：130且包括位置(5'>3')1、3、5、9、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分。
在一些實施例中，(諸如以下所述之化合物3)提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：98且反義股為SEQ ID NO：165。在一些實施例中，提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：98且包括3'末端處之位置之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分；且反義股為SEQ ID NO：165且包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處 之非核苷酸部分。在一個實施例中，提供化合物3，其為19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：98且包括位置(5'>3')15、16、17、18及19處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH 3'部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：165且包括位置(5'>3')2、4、6、8、11、13、15、17及19處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH。
在一些實施例中，(諸如以下所述之化合物4、化合物8及化合物9)提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：101且反義股為SEQ ID NO：168。在一些實施例中，提供19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：101且包括經2'OMe修飾之嘧啶核糖核苷酸；視情況存在之在位置9或10中之一處之2'5-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分；且反義股為SEQ ID NO：168且包括經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'5-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。
在一個實施例中，提供化合物4，其為19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：101且包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：168且包括位置(5'>3')1、 4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之3' C3Pi-C3OH突出物。
在一個實施例中，提供化合物8，其為19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：101且包括位置(5'>3')4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：168且包括位置(5'>3')1、4、8、13及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之3' C3Pi-C3OH突出物。
在一個實施例中，提供化合物9，其為19聚體雙股核酸分子，其中有義股為SEQ ID NO：101且包括位置(5'>3')2、4、11、13及17處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且反義股為SEQ ID NO：168且包括位置(5'>3')1、4、8、11及15處之經2'OMe修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之3' C3Pi-C3OH非核苷酸部分。
在另一態樣中，提供藉由以足以減少hsp47表現之量向細胞中引入如本文中所提供之核酸分子來減少細胞中之hsp47表現的方法。在一個實施例中，細胞為肝細胞星狀細胞。在另一實施例中，細胞為腎或肺組織中之星狀細胞。在某些實施例中，方法係活體外進行。在另一實施例 中，方法係活體內進行。
在另一態樣中，提供治療罹患與hsp47相關之疾病之個體的方法。該方法包括以足以減少hsp47表現之量向個體投與諸如本文中所提供之核酸分子。在某些實施例中，與hsp47相關之疾病為選自由以下組成之群之疾病：肝纖維化、肝硬化、包括肺纖維化(lung fibrosis)(包括ILF)之肺部纖維化(pulmonary fibrosis)、由任何病況(例如CKD，包括ESRD)所致之腎纖維化、腹膜纖維化、慢性肝損傷、原纖維形成、其他器官之纖維變性病、與所有可能類型之意外性及醫源性(手術)皮膚損傷相關之異常疤痕(瘢痕瘤)、硬皮病、心臟纖維化、青光眼濾過手術失敗及腸黏連。在一些實施例中，化合物可用於治療器官特異性適應症，例如包括以下列出器官及各別適應症的表1中所示者之適應症：
本說明書之另一實施例為一種治療星狀細胞相關病症之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之以下所述的醫藥組合物。該病症包括肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌、胰臟炎、胰纖維化、胰臟癌、聲帶疤痕、聲帶黏膜纖維化及喉纖維化。在一些實施例中，較佳之適應症包括因肝移植後C型肝炎所致之肝硬化；因非酒精性脂肪性肝炎(NASH)所致之肝硬化；特發性肺纖維化；導致肺纖維化之放射性肺炎；糖尿病性腎病；與連續性可攜帶式腹膜透析(CAPD)相關之腹膜硬化症及眼瘢痕性類天疱瘡。
纖維變性肝適應症包括酒精性肝硬化、B型肝炎肝硬化、C型肝炎肝硬化、正位肝移植(OLTX)後C型肝炎(Hep C)肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎/非酒精性脂肪肝病(NASH/NAFLD)、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、膽道閉鎖、α-1抗胰蛋白酶缺乏症(A1AD)、銅儲積疾病(威爾森氏症(Wilson's disease))、果糖血症、半乳糖血症、肝醣儲積疾病(尤其III、IV、VI、IX及X型)、鐵超載症候群(血色素沈著症)、脂質異常(例如高歇氏病(Gaucher's disease))、過氧化物酶體病症(例如澤爾韋格症候群(Zellweger syndrome))、酪胺酸血症、先天性肝纖維化、細菌感染(例如布氏桿菌病(brucellosis))、寄 生蟲病(例如包蟲病(echinococcosis))、布-加症候群(Budd-Chiari syndrome)(肝靜脈閉塞疾病)。
肺適應症包括特發性肺纖維化、矽粉沈著病、肺塵埃沈著病、新生兒呼吸窘迫症候群後之新生兒支氣管肺發育不良、博萊黴素(bleomycin)/化學性肺損傷(chemolung injury)、肺移植後阻塞性細支氣管炎(BOS)、慢性阻塞性肺部病症(COPD)、囊腫性纖維化及哮喘。
心臟適應症包括心肌症、動脈粥樣硬化(伯格氏病(Bergers disease)等)、心內膜心肌纖維化、心房纖維性顫動、心肌梗塞(MI)後疤痕。
其他胸部適應症包括毛面(textured)乳房植入物周圍之輻射誘導之囊組織反應及口腔黏膜下纖維化。
腎適應症包括體染色體顯性多囊性腎病(ADPKD)、糖尿病性腎病(糖尿病性腎小球硬化症)、局部區段性腎小球硬化(FSGS)(塌陷(collapsing)與其他組織變化)、IgA腎病(伯格氏病)、狼瘡腎炎、韋格納氏病(Wegner's)、硬皮病、古巴士德氏症候群(Goodpasture Syndrome)、腎小管間質纖維化、藥物誘導之(保護性)青黴素(pencillins)、頭孢菌素(cephalosporins)、止痛藥腎病變、膜增生性絲球體腎炎(MPGN)、亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、先天性腎病：髓質囊性病、指甲-髕骨症候群(Nail-Patella Syndrome)及奧爾波特症候群(Alport Syndrome)。
骨髓適應症包括淋巴管平滑肌瘤(LAM)、慢性移植物抗 宿主病、真性紅血球增多症、原發性血小板增多症及骨髓纖維化。
眼部適應症包括早產兒視網膜病(RoP)、眼瘢痕性類天疱瘡、淚腺纖維化、視網膜附著手術、角膜渾濁、疱疹性角膜炎、翼狀胬肉、青光眼、年齡相關之黃斑部變性(AMD/ARMD)、視網膜纖維化相關之糖尿病(DM)性視網膜病變。
婦科適應症包括子宮內膜異位症附加預防STD纖維化/輸卵管炎後疤痕形成的激素療法。
全身性適應症包括杜普宜特朗氏病(Dupuytren's disease)、掌纖維瘤病、佩羅尼氏病(Peyronie's disease)、萊德爾霍斯病(Ledderhose disease)、瘢痕瘤、多灶纖維硬化、腎源性全身性纖維化及骨髓纖維化(貧血)。
損傷相關之纖維變性病包括灼傷(包括化學品)誘導之皮膚及軟組織疤痕及攣縮、輻射誘導之皮膚及器官疤痕、癌症後治療性放射治療、瘢痕瘤(皮膚)。
手術適應症包括腹膜透析導管後之腹膜纖維化、角膜植入物、耳蝸植入物、其他植入物、乳房中之聚矽氧植入物、慢性竇炎；黏連、透析移植物之假性內膜增生。
其他適應症包括慢性胰臟炎。
在一些實施例中，提供治療罹患肝纖維化之個體之方法，該方法包含向個體投與有效量之本文所揭示之核酸分子，從而治療肝纖維化。在一些實施例中，個體罹患因肝炎所致之肝硬化。在一些實施例中，個體罹患因NASH所 致之肝硬化。
在一些實施例中，提供本文中所揭示之核酸分子之用途，其用於製造治療肝纖維化之藥劑。在一些實施例中，肝纖維化係由於肝炎所致。在一些實施例中，肝纖維化係由於NASH所致。
在一些實施例中，提供重塑疤痕組織之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之本文中所揭示之核酸分子，從而實現疤痕組織重塑。在一些實施例中，疤痕組織在肝中。在一些實施例中，個體罹患因肝炎所致之肝硬化。在一些實施例中，個體罹患因NASH所致之肝硬化。
在一些實施例中，提供調控纖維化消退之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之本文中所揭示之核酸分子，從而實現纖維化消退。
在一些實施例中，提供減少個體之疤痕組織之方法，該方法包含向個體投與有效量之本文中所揭示之核酸分子以減少疤痕組織的步驟。在一些實施例中，提供減少個體之疤痕組織之方法，該方法包含向疤痕組織局部施加有效量之本文中所揭示之核酸分子以減少疤痕組織的步驟。
在一些實施例中，提供改良疤痕組織之外觀之方法，該方法包含向疤痕組織局部施加有效量之本文中所揭示之核酸分子以改良疤痕組織之外觀的步驟。
在一些實施例中，提供治療罹患肺纖維化之個體之方法，該方法包含向個體投與有效量之本文中所揭示之核酸分子，從而治療肺纖維化。在一些實施例中，個體罹患間 質性肺纖維化(ILF)。在一些實施例中，個體罹患導致肺纖維化之放射性肺炎。在一些實施例中，個體罹患藥物誘導之肺纖維化。
在一些實施例中，提供本文中所揭示之核酸分子之用途，其用於製造治療肺纖維化之藥劑。在一些實施例中，肺纖維化為ILF。在一些實施例中，肺纖維化為藥物或輻射誘導之肺纖維化。
在一個態樣中，提供醫藥組合物，其於醫藥學上可接受之載劑中包括如本文中所描述之核酸分子(例如siNA分子)。在某些實施例中，醫藥調配物包括或涉及適用於向個體(諸如患者)傳遞核酸分子(例如siNA分子)之傳遞系統；例如下文更詳細描述之傳遞系統。
在一相關態樣中，提供組合物或套組，其包括經包裝適於供患者使用之核酸分子(例如siNA分子)。包裝可貼上標籤或包括指示包裝之內容物且提供某些關於患者應或可如何使用核酸分子(例如siNA分子)之資訊的包裝標籤或插入物，例如標籤可包括給藥資訊及/或使用說明。在某些實施例中，標籤之內容將帶有呈由政府機構(例如美國食品藥物管理局(FDA))指定之形式的注意事項。在某些實施例中，標籤可指示核酸分子(例如siNA分子)適用於治療罹患與hsp47相關之疾病之患者；例如，標籤可指示核酸分子(例如siNA分子)適用於治療纖維瘤；或例如標籤可指示核酸分子(例如siNA分子)適用於治療選自由以下組成之群之疾病：纖維化、肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、腎纖維 化、腹膜纖維化、慢性肝損傷及原纖維形成。
如本文中所用，術語「熱休克蛋白47」或「hsp47」或「HSP47」可互換使用且係指具有任何hsp47蛋白活性之任何熱休克蛋白47、肽或多肽。熱休克蛋白47為絲胺酸蛋白酶抑制劑(serpin)，亦稱為例如serpin肽酶抑制劑進化枝(clade)H成員1(SERPINH1)、SERPINH2、膠原結合蛋白1(CBP1)、CBP2、gp46；砷轉活化蛋白3(AsTP3)；HSP47；增殖誘導基因14(PIG14)；PPROM；類風濕性關節炎抗原A-47(RA-A47)；膠原結合蛋白(colligin)-1；及膠原結合蛋白-2。在某些較佳實施例中，「hsp47」係指人類hsp47。熱休克蛋白47(或更特定言之為人類hsp47)可具有與SEQ ID NO.2相同或實質上相同之胺基酸序列。
如本文中所用，術語「編碼hsp47之核苷酸序列」意謂編碼hsp47蛋白或其部分之核苷酸序列。術語「編碼hsp47之核苷酸序列」亦欲包括hsp47編碼序列，諸如hsp47同功異型物、突變hsp47基因、hsp47基因之剪接變異體及hsp47基因多形現象。編碼hsp47之核酸序列包括編碼hsp47之mRNA序列，其亦可稱為「hsp47 mRNA」。人類hsp47 mRNA之例示性序列為SEQ ID.NO.1。
如本文中所用，術語「核酸分子」或「核酸」可互換使用且係指寡核苷酸、核苷酸或聚核苷酸。「核酸分子」之變異在本文中有更詳細的描述。核酸分子涵蓋如本文中所描述之經修飾之核酸分子及未經修飾之核酸分子兩者。核酸分子可包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核 苷酸或核苷酸類似物，呈任何組合形式。
如本文中所用，術語「核苷酸」係指具有糖(或其類似物或經修飾之糖)、核苷酸鹼基(或其類似物或經修飾之鹼基)及磷酸基(或其類似物或經修飾之磷酸基)之化學部分。核苷酸涵蓋如本文中所描述之經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸。如本文中所用，核苷酸可包括脫氧核糖核苷酸(例如未經修飾之脫氧核糖核苷酸)、核糖核苷酸(例如未經修飾之核糖核苷酸)及經修飾之核苷酸類似物，尤其包括LNA及UNA、肽核酸、L-核苷酸(亦稱為鏡像核苷酸)、乙烯橋接核酸(ENA)、阿拉伯糖苷、PACE、具有6碳糖之核苷酸以及通常視為非核苷酸之核苷酸類似物(包括無鹼基核苷酸)。在一些實施例中，核苷酸可在糖、核苷酸鹼基中及/或在磷酸基中用此項技術中已知之任何修飾(諸如本文中所描述之修飾)來進行修飾。如本文中所用之「聚核苷酸」或「寡核苷酸」係指一連串連接之核苷酸；如此項技術中所熟知及/或本文中所揭示，聚核苷酸及寡核苷酸可同樣地在核苷酸糖、核苷酸鹼基及磷酸酯骨架中具有修飾。
如本文中所用，術語「短干擾核酸」、「siNA」或「短干擾核酸分子」係指能夠調控基因表現或病毒複製的任何核酸分子。siNA較佳抑制或下調基因表現或病毒複製。siNA包括(但不限於)能夠介導序列特異性RNAi之核酸分子，例如短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、短干擾寡核苷酸、 短干擾核酸、短干擾經修飾之寡核苷酸、經化學修飾之siRNA、轉錄後基因沉默RNA(ptgsRNA)等等。如本文中所用，「短干擾核酸」、「siNA」或「短干擾核酸分子」具有本文中其他位置處更詳細描述之含義。
如本文中所用，術語「互補」意謂核酸可藉由傳統華特生-克里克或其他非傳統類型與另一核酸序列形成氫鍵。關於本文中所揭示之核酸分子，核酸分子與其互補序列之結合自由能足以使核酸之相關功能(例如RNAi活性)得以進行。核酸分子之結合自由能之測定為此項技術中所熟知(參見例如Turner等人，1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII第123頁至第133頁；Frier等人，1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9373-9377；Turner等人，1987,J.Am.Chem.Soc.109：3783-3785)。互補性百分比指示可與第二核酸序列形成氫鍵(例如華特生-克里克鹼基配對)之核酸分子中之鄰近殘基的百分比(例如第一寡核苷酸中總共10個核苷酸中有5、6、7、8、9或10個核苷酸與具有10個核苷酸之第二核酸序列鹼基配對分別表示50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。「完全互補」意謂核酸序列之所有鄰近殘基均與第二核酸序列中相同數目之鄰近殘基氫鍵結。在一個實施例中，本文中所揭示之核酸分子包括約15至約35或多於35(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或多於35)個與一或多個目標核酸分子或其部分互補的核苷酸。
如本文中所用，術語「有義區」係指siNA分子的與siNA分子之反義區互補(部分或完全)之核苷酸序列。siNA分子之有義股可包括與目標核酸序列具有同源性之核酸序列。如本文中所用，「有義股」係指包括有義區之核酸分子且亦可包括其他核苷酸。
如本文中所用，術語「反義區」係指siNA分子之與目標核酸序列互補(部分或完全)之核苷酸序列。siNA分子之反義股可視情況包括與siNA分子之有義區互補之核酸序列。如本文中所用，「反義股」係指包括反義區之核酸分子且亦可包括其他核苷酸。
如本文中所用，術語「RNA」係指包括至少一個核糖核苷酸殘基之分子。
如本文中所用，術語「雙螺旋體區」係指藉由華特生-克里克鹼基配對或使互補或實質上互補的寡核苷酸股之間形成雙螺旋體之任何其他方式與彼此形成鹼基對之兩個互補或實質上互補的寡核苷酸中的區域。舉例而言，具有21個核苷酸單元之寡核苷酸股可與具有21個核苷酸單元之另一寡核苷酸形成鹼基配對，然而各股上僅19個鹼基為互補或實質上互補，使得「雙螺旋體區」由19個鹼基對組成。剩餘鹼基對可例如以5'及3'突出物形式存在。此外，在雙螺旋體區內，不需要100%互補性；在雙螺旋體區內可允許實質上的互補性。實質上的互補性係指各股之間使得其能夠在生物條件下黏接的互補性。憑經驗測定兩股是否能夠在生物條件下黏接的技術為此項技術中所熟知。或者， 可在生物條件下合成兩股且加在一起來測定其是否與彼此黏接。
如本文中所用，術語「非配對核苷酸類似物」意謂包括非鹼基配對部分之核苷酸類似物，包括(但不限於)：6脫胺基腺苷(6 des amino adenosine)(水粉蕈素(Nebularine))、4-Me-吲哚、3-硝基吲哚、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些實施例中，非鹼基配對核苷酸類似物為核糖核苷酸。在其他實施例中，其為脫氧核糖核苷酸。
如本文中所用，術語「末端官能基」包括(但不限於)鹵素、醇、胺、羧基、酯、醯胺、醛、酮、醚基團。
如本文中所用之「無鹼基核苷酸」或「無鹼基核苷酸類似物」通常在本文中及在此項技術中亦可稱為假核苷酸或非習知部分。當核苷酸為核酸之單體單元，通常由核糖或脫氧核糖糖、磷酸酯及鹼基(DNA中之腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；RNA中之腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)組成時，無鹼基或假核苷酸缺乏鹼基，且因此嚴格地說不為如通常用於此項技術中之術語的核苷酸。無鹼基脫氧核糖部分包括例如無鹼基脫氧核糖-3'-磷酸酯；1,2-雙脫氧-D-呋喃核糖-3-磷酸酯；1,4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇-3-磷酸酯。反向無鹼基脫氧核糖部分包括反向脫氧核糖無鹼基；3',5'反向脫氧無鹼基5'-磷酸酯。
如本文中所用之術語「封端部分」(z")包括可與(N')y之 5'末端共價連接之部分，且包括無鹼基核糖部分、無鹼基脫氧核糖部分、修飾無鹼基核糖及無鹼基脫氧核糖部分(包括2'O烷基修飾)；反向無鹼基核糖及無鹼基脫氧核糖部分及其修飾；C6-亞胺基-Pi；鏡像核苷酸(包括L-DNA及L-RNA)；5'OMe核苷酸；及核苷酸類似物(包括4',5'-亞甲基核苷酸)；1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸；4'-硫基核苷酸、碳環核苷酸；5'-胺基-烷基磷酸酯；磷酸1,3-二胺基-2-丙酯、磷酸3-胺基丙酯；磷酸6-胺基己酯；磷酸12-胺基十二烷酯；磷酸羥丙酯；1,5-無水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；蘇-戊呋喃醣基核苷酸；非環狀3',4'-斷核苷酸；3,4-二羥基丁基核苷酸；3,5-二羥基戊基核苷酸、5'-5'反向無鹼基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-胺基；及橋接或非橋接膦酸甲酯及5'-巰基部分。
某些封端部分可為無鹼基核糖或無鹼基脫氧核糖部分；反向無鹼基核糖或無鹼基脫氧核糖部分；C6-胺基-Pi；鏡像核苷酸(包括L-DNA及L-RNA)。如本文中所揭示之核酸分子可使用一或多種反向核苷酸(例如反向胸苷或反向腺嘌呤)來合成(例如參見Takei等人，2002.JBC 277(26)：23800-06)。
如本文中所用之術語「非習知部分」係指非核苷酸部分，包括無鹼基部分、反向無鹼基部分、烴(烷基)部分及其衍生物，且進一步包括脫氧核糖核苷酸、經修飾之脫氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、非鹼基配對核苷酸類似物及藉由2'-5'核苷酸間磷酸鍵與相鄰核苷酸連 接之核苷酸；橋接核酸(包括LNA及乙烯橋接核酸)、經鍵修飾(例如PACE)及經鹼基修飾之核苷酸，以及本文中明確地揭示為非習知部分的其他部分。
如本文中所用，術語「抑制」、「下調」或「減少」就基因表現而言意謂使基因表現、或編碼一或多種蛋白或蛋白次單元之RNA分子或等效RNA分子(例如mRNA)之含量、或一或多種蛋白或蛋白次單元之活性降低至低於在不存在抑制因子(諸如(例如)具有如本文中所描述之結構特徵之核酸分子，例如siNA)之情況下所觀測者；例如可使表現降低至在不存在抑制劑之情況下所觀測者的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更小。
RNA干擾及siNA核酸分子
RNA干擾係指動物中藉由短干擾RNA(siRNA)所介導之序列特異性轉錄後基因沉默的過程(Zamore等人，2000,Cell,101,25-33；Fire等人，1998,Nature,391,806；Hamilton等人，1999,Science,286,950-951；Lin等人，1999,Nature,402,128-129；Sharp,1999,Genes & Dev.,13：139-141；及Strauss,1999,Science,286,886)。細胞中dsRNA之存在經由有待充分表徵之機制觸發RNAi反應。
Dicer與將dsRNA加工為稱為短干擾RNA(siRNA)之dsRNA短片段有關(Zamore等人，2000,Cell,101,25-33；Bass,2000,Cell,101,235；Berstein等人，2001,Nature,409,363)。自Dicer活性獲得之siRNA可為約21至約23個核 苷酸長且包括約19個鹼基對雙螺旋體(Zamore等人，2000,Cell,101,25-33；Elbashir等人，2001,Genes Dev.,15,188)。Dicer亦與自保守結構之前驅RNA切除21-及22-核苷酸小時序RNA(stRNA)有關，該等小時序RNA與轉譯控制有關(Hutvagner等人，2001,Science,293,834)。RNAi反應之特徵亦為通常稱為RNA誘導型沉默複合體(RISC)之核酸內切酶複合體，其介導具有與siRNA雙螺旋體之反義股互補之序列的單股RNA之裂解。目標RNA之裂解發生於與siRNA雙螺旋體之反義股互補之區中間(Elbashir等人，2001,Genes Dev.,15,188)。
已在多種系統中研究了RNAi。Fire等人，1998,Nature,391,806最先觀測了秀麗隱桿線蟲(C.elegans)之RNAi。Bahramian及Zarbl,1999,Molecular and Cellular Biology,19,274-283及Wianny及Goetz,1999,Nature Cell Biol.,2,70描述了哺乳動物系統中由dsRNA所介導之RNAi。Elbashir等人，2001,Nature,411,494及Tuschl等人，WO 0175164描述了經培養之哺乳動物細胞(包括人類胚腎及海拉細胞(HeLa cell))中藉由引入合成21-核苷酸RNA之雙螺旋體所誘導的RNAi。最近研究(Elbashir等人，2001,EMBO J.,20,6877及Tuschl等人，WO 0175164)已揭示有關介導有效RNAi活性所必需之siRNA長度、結構、化學組成及序列的某些要求。
核酸分子(例如包含如本文中所揭示之結構特徵)可藉由以序列特異性方式介導RNA干擾「RNAi」或基因沉默來 抑制或下調基因表現或病毒複製。(參見例如Zamore等人，2000,Cell,101,25-33；Bass,2001,Nature,411,428-429；Elbashir等人，2001,Nature,411,494-498；及Kreutzer等人，WO 0044895；Zernicka-Goetz等人，WO 0136646；Fire,WO 9932619；Plaetinck等人，WO 0001846；Mello及Fire,WO 0129058；Deschamps-Depaillette,WO 9907409；及Li等人，WO 0044914；Allshire,2002,Science,297,1818-1819；Volpe等人，2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,science,297,2215-2218；及Hall等人，2002,Science,297,2232-2237；Hutvagner及Zamore,2002,Science,297,2056-60；McManus等人，2002,RNA,8,842-850；Reinhart等人，2002,Gene & Dev.,16,1616-1626；及Reinhart & Bartel,2002,Science,297,1831)。
siNA核酸分子可自兩個各別聚核苷酸股組裝而成，其中一個股為有義股且另一股為反義股，其中反義股及有義股自身互補(亦即各股包括與另一股中之核苷酸序列互補之核苷酸序列)；諸如其中反義股及有義股形成具有如本文中關於如所提供之核酸分子所描述之任何長度及結構的雙螺旋體或雙股結構，例如其中雙股區(雙螺旋體區)為約15至約49(例如約17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個鹼基對)；反義股包括與目標核酸分子(亦即hsp47 mRNA)或 其部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列，且有義股包括對應於目標核酸序列或其部分之核苷酸序列(例如本文之核酸分子的約17至約49個或49個以上核苷酸與目標核酸或其部分互補)。
在某些態樣及實施例中，本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可為「RISC長度」分子或可為如下文更詳細描述之Dicer受質。
siNA核酸分子可包括各別有義及反義序列或區，其中有義區及反義區係如此項技術中所已知藉由核苷酸或非核苷酸連接子分子共價連接，或係藉由離子相互作用、氫鍵結、凡得瓦爾(van der Waals)相互作用、疏水性相互作用及/或堆疊相互作用交替地非共價連接。核酸分子可包括與目標基因之核苷酸序列互補之核苷酸序列。核酸分子可以導致抑制目標基因表現的方式與目標基因之核苷酸序列相互作用。
或者，siNA核酸分子係自單聚核苷酸組裝而成，其中核酸分子之自身互補有義區及反義區係藉助於基於核酸或基於非核酸之連接子連接，亦即反義股及有義股為具有反義區及有義區之一個單聚核苷酸之一部分，反義區及有義區摺疊形成雙螺旋體區(例如形成如此項技術中所熟知之「髮夾」結構)。該等siNA核酸分子可為具有雙螺旋體、不對稱雙螺旋體、髮夾或不對稱髮夾二級結構、具有自身互補有義區及反義區之聚核苷酸，其中反義區包括與各別目標核酸分子或其部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序 列，且有義區具有對應於目標核酸序列(例如hsp47 mRNA之序列)之核苷酸序列。該等siNA核酸分子可為具有兩個或兩個以上環結構及莖(stem)的環形單股聚核苷酸，其包含自身互補有義區及反義區，其中反義區包括與目標核酸分子或其部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列，且有義區具有對應於目標核酸序列或其部分之核苷酸序列，且其中環形聚核苷酸可經活體內或活體外加工以產生能夠介導RNAi之活性核酸分子。
以下命名通常在此項技術中用來描述siNA分子之長度及突出物且可用於說明書及實例各處。在本文寡核苷酸之所有描述中，一序列中核苷酸之標識就有義股及反義股而言均係以自5'至3'之方向給出。給予雙螺旋體之名稱指示寡聚物之長度及存在或不存在突出物。舉例而言，「21+2」雙螺旋體含有兩個均為21個核苷酸長之核酸股，亦稱為21聚體siRNA雙螺旋體或21聚體核酸，且具有2個核苷酸之3'-突出物。「21-2」設計係指具有2個核苷酸之5'-突出物之21聚體核酸雙螺旋體。21-0設計為無突出物(鈍端)之21聚體核酸雙螺旋體。「21+2UU」為具有2個核苷酸之3'-突出物的21聚體雙螺旋體且3'末端處之2個末端核苷酸均為U殘基(其可導致與目標序列錯配)。上述命名可應用於具有各種長度之股、雙螺旋體及突出物的siNA分子(諸如19-0、21+2、27+2及其類似者)。在替代性但類似的命名中，「25/27」為具有25鹼基有義股及27鹼基反義股、具有2個核苷酸之3'-突出物之不對稱雙螺旋體。「27/25」為具有27 鹼基有義股及25鹼基反義股之不對稱雙螺旋體。
化學修飾
在某些態樣及實施例中，如本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)包括一或多個修飾(或化學修飾)。在某些實施例中，該等修飾包括可使分子不同於標準核糖核苷酸或RNA分子(亦即包括標準腺苷、胞嘧啶、尿嘧啶或鳥苷部分者)的核酸分子或聚核苷酸之任何變化；該等標準核糖核苷酸或RNA分子可稱為「未經修飾之」核糖核苷酸或未經修飾之核糖核酸。由腺苷、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鳥苷部分表示的具有2'-脫氧糖之傳統DNA鹼基及聚核苷酸可稱為「未經修飾之脫氧核糖核苷酸」或「未經修飾之脫氧核糖核酸」；因此，除非有相反明確指示，否則如本文中所用之術語「未經修飾之核苷酸」或「未經修飾之核酸」係指「未經修飾之核糖核苷酸」或「未經修飾之核糖核酸」。該等修飾可在聚核苷酸之核苷酸糖、核苷酸鹼基、核苷酸磷酸基及/或磷酸酯骨架中。
在某些實施例中，如本文中所揭示之修飾可用來增加分子之RNAi活性，及/或增加分子之活體內穩定性、尤其於血清中之穩定性，及/或增加分子之生物可用性。修飾之非限制性實例包括核苷酸間或核苷間鍵；核酸分子之任何位置及股處之脫氧核苷酸或雙脫氧核糖核苷酸；在2'位置處具有較佳選自胺基、氟基、甲氧基、烷氧基及烷基之修飾之核酸(例如核糖核酸)；2'-脫氧核糖核苷酸、2'OMe核糖核苷酸、2'-脫氧-2'-氟基核糖核苷酸、「通用鹼基」核苷 酸、「非環狀」核苷酸、5-C-甲基核苷酸、生物素基及末端甘油基及/或反向脫氧無鹼基殘基併入、位阻分子(諸如螢光分子)及其類似物。其他核苷酸修飾劑可包括3'-脫氧腺苷(蛹蟲草菌素(cordycepin))、3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2',3'-雙脫氧肌苷(ddI)、2',3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)、2',3'-雙脫氫-2',3'-雙脫氧胸苷(d4T)及3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2',3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)及2',3'-雙脫氫-2',3'-雙脫氧胸苷(d4T)之單磷酸酯核苷酸。關於各種修飾之更多細節在下文中予以更詳細的描述。
經修飾之核苷酸包括具有北方(Northern)構形(例如北方假旋轉循環，參見例如Sanger,Principles of Nucleic Acid Structure,Springer-Verlag編，1984)之核苷酸。具有北方構形之核苷酸之非限制性實例包括LNA核苷酸(例如2'-O、4'-C-亞甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2'-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2'-甲基-硫基-乙基、2'-脫氧-2'-氟基核苷酸、2'-脫氧-2'-氯基核苷酸、2'-疊氮基核苷酸及2'OMe核苷酸。LNA描述於例如Elman等人，2005；Kurreck等人，2002；Crinelli等人，2002；Braasch及Corey,2001；Bondensgaard等人，2000；Wahlestedt等人，2000；及WO 0047599、WO 9914226、WO 9839352及WO 04083430中。在一個實施例中，LNA係併入於有義股之5'末端處。
化學修飾亦包括UNA，其為非核苷酸非環狀類似物，其中不存在C2'-C3'鍵(雖然UNA並非真為核苷酸，但其明確地包括於如本文中涵蓋之「經修飾之」核苷酸或經修飾之 核酸的範疇內)。在特定實施例中，具有突出物之核酸分子可經修飾以在突出物位置(亦即2個核苷酸之突出物)處具有UNA。在其他實施例中，UNA係包括於3'或5'末端處。UNA可位於沿著核酸股之任何位置，亦即在位置7處。核酸分子可含有一或多種UNA。例示性UNA揭示於Nucleic Acids Symposium第52期第133頁至第134頁(2008)中。在某些實施例中，如本文中所描述之核酸分子(例如siNA分子)包括一或多種UNA；或一種UNA。在一些實施例中，如本文中所描述具有3'突出物之核酸分子(例如siNA分子)在3'突出物中包括一或兩種UNA。在一些實施例中，如本文中所描述之核酸分子(例如siNA分子)在反義股中；例如在反義股之位置6或位置7處包括UNA(例如一種UNA)。化學修飾亦包括例如如本文中所揭示之非配對核苷酸類似物。化學修飾進一步包括如本文中所揭示之非習知部分。
化學修飾亦包括寡核苷酸之5'及/或3'部分上之末端修飾且亦稱為封端部分。該等末端修飾係選自核苷酸、經修飾之核苷酸、脂質、肽及糖。
化學修飾亦包括六員「六員環核苷酸類似物」。六員環核苷酸類似物之實例揭示於Allart等人(Nucleosides & Nucleotides,1998,17：1523-1526)；及Perez-Perez等人(1996,Bioorg.and Medicinal Chem Letters 6：1457-1460)中。包括6員環核苷酸類似物(包括己醣醇及阿卓糖醇(altritol)核苷酸單體)之寡核苷酸揭示於WO2006047842中。
化學修飾亦包括與正常天然存在之核苷酸相比具有逆對掌性的「鏡像」核苷酸；亦即，鏡像核苷酸可為天然存在之D-核苷酸之「L-核苷酸」類似物(參見US 6602858)。鏡像核苷酸可進一步包括至少一個例如如本文中所描述之糖或鹼基修飾及/或骨架修飾，諸如硫代磷酸酯或膦酸酯部分。US 6602858揭示包括至少一個L-核苷酸取代之核酸催化劑。鏡像核苷酸包括例如L-DNA(L-脫氧核糖腺苷-3'-磷酸酯(鏡像dA)；L-脫氧核糖胞苷-3'-磷酸酯(鏡像dC)；L-脫氧核糖鳥苷-3'-磷酸酯(鏡像dG)；L-脫氧核糖胸苷-3'-磷酸酯(鏡像dT))及L-RNA(L-核糖腺苷-3'-磷酸酯(鏡像rA)；L-核糖胞苷-3'-磷酸酯(鏡像rC)；L-核糖鳥苷-3'-磷酸酯(鏡像rG)；L-核糖尿嘧啶-3'-磷酸酯(鏡像dU))。
在一些實施例中，經修飾之核糖核苷酸包括經修飾之脫氧核糖核苷酸，例如5'OMe DNA(5-甲基-脫氧核糖鳥苷-3'-磷酸酯)，其適用作5'末端位置(位置編號1)之核苷酸；PACE(脫氧核糖腺苷3'膦醯基乙酸酯、脫氧核糖胞苷3'膦醯基乙酸酯、脫氧核糖鳥苷3'膦醯基乙酸酯、脫氧核糖胸苷3'膦醯基乙酸酯)。
修飾可存在於本文中所揭示之核酸分子之一或多個股中，例如存在於有義股、反義股或兩股中。在某些實施例中，反義股可包括修飾且有義股可僅包括未經修飾之RNA。
核鹼基
本文中所揭示之核酸之核鹼基可包括未經修飾之核糖核 苷酸(嘌呤及嘧啶)，諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶。一或兩股中之核鹼基可經天然及合成核鹼基修飾，該等核鹼基諸如為胸腺嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；肌苷；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；任何「通用鹼基」核苷酸；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、胺基、硫醇、硫基烷基、羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；氮雜嘌呤；嘌呤及嘧啶之雜環經取代之類似物(例如胺基乙氧基啡噁嗪)；嘌呤及嘧啶之衍生物(例如1-烷基-、1-烯基-、雜芳族-及1-炔基衍生物)及其互變異構體；8-側氧基-N6-甲基腺嘌呤；7-二氮雜黃嘌呤；5-甲基胞嘧啶；5-甲基尿嘧啶；5-(1-丙炔基)尿嘧啶；5-(1-丙炔基)胞嘧啶；及4,4-乙橋胞嘧啶。適合鹼基之其他實例包括非嘌呤基及非嘧啶基鹼基，諸如2-胺基吡啶及三嗪。
糖部分
本文中所揭示之核酸中之糖部分可包括不具有任何修飾之2'-羥基-戊呋喃醣基糖部分。或者，糖部分可經修飾，諸如為2'-脫氧-戊呋喃醣基糖部分、D-核糖、己醣、戊呋喃醣基糖部分之2'位置處之修飾，諸如2'-O-烷基(包括2'OMe及2'-O-乙基)(亦即2'-烷氧基)；2'-胺基；2'-O-烯丙基；2'-S-烷基；2'-鹵素(包括2'-氟基、氯基及溴基)；2'-甲 氧基乙氧基、2'-O-甲氧基乙基；2'-O-2-甲氧基乙基；2'-烯丙氧基(-OCH2CH=CH2)；2'-炔丙基；2'-丙基；乙炔基；乙烯基；丙烯基；CF；氰基；咪唑；甲酸酯；硫代酯(thioate)；C1至C10低碳烷基；經取代之低碳烷基、烷芳基或芳烷基；OCF3；OCN；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；雜環烷基；雜環烷芳基；胺基烷基胺基；聚烷基胺基；或經取代之矽烷基，如例如尤其如歐洲專利EP0586520或EP0618925中所述。
烷基包括飽和脂族基，包括直鏈烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、分支鏈烷基(異丙基、第三丁基、異丁基等)、環烷基(脂環)基(環丙基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基)、經烷基取代之環烷基及經環烷基取代之烷基。在某些實施例中，直鏈或分支鏈烷基在其主鏈中具有六個或更少碳原子(例如在直鏈中C1-C6、在分支鏈中C3-C6)，且更佳具有四個或更少碳原子。同樣，較佳之環烷基可在其環結構中具有三至八個碳原子，且更佳在環結構中具有五或六個碳。術語C1-C6包括含有一至六個碳原子之烷基。烷基可為經取代之烷基，諸如已由取代基置換烴主鏈之一或多個碳上之氫的烷基部分。該等取代基可包括例如烯基、炔基、鹵素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、烷基胺基羰基、二烷基胺基羰基、烷 基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亞膦酸基、氰基、胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基及烷基芳基胺基)、醯胺基(包括烷基羰基胺基、芳基羰基胺基、胺甲醯基及脲基)、甲脒基、亞胺基、硫氫基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亞磺醯基、磺酸酯基、胺磺醯基、磺醯胺基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環基、烷基芳基、或芳族或雜芳族部分。
烷氧基包括與氧原子共價連接的經取代及未經取代之烷基、烯基及炔基。烷氧基之實例包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基、丙氧基、丁氧基及戊氧基。經取代之烷氧基之實例包括鹵化烷氧基。烷氧基可經諸如以下之基團取代：烯基、炔基、鹵素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、烷基胺基羰基、二烷基胺基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亞膦酸基、氰基、胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基及烷基芳基胺基)、醯胺基(包括烷基羰基胺基、芳基羰基胺基、胺甲醯基及脲基)、甲脒基、亞胺基、硫氫基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亞磺醯基、磺酸酯基、胺磺醯基、磺醯胺基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環基、烷基芳基、或芳族或雜芳族部分。經鹵素取代之烷氧基之實例包括(但不限於)氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、 二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
在一些實施例中，戊呋喃醣基環可經不具有戊呋喃醣基環之C2'-C3'鍵的非環狀衍生物置換。舉例而言，非環狀核苷酸可用2-羥基乙氧基甲基取代通常存在於dNMP中之2'-脫氧呋喃核糖基糖。
鹵素包括氟、溴、氯、碘。
骨架
本文中所揭示之核酸之核苷次單元可藉由磷酸二酯鍵與彼此連接。磷酸二酯鍵可視情況經其他鍵取代。舉例而言，硫代磷酸酯、硫代磷酸酯-D-核糖實體、三酯、硫代酯、2'-5'橋接骨架(亦可稱為5'-2'或2'5'-核苷酸或2'5'-核糖核苷酸)、PACE、3'(或5')-脫氧-3'(或5')-硫基-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3'(或5')-脫氧亞膦酸酯、硼烷磷酸酯、3'(或5')-脫氧-3'(或5')-胺基胺基磷酸酯、膦酸氫酯、膦酸酯、硼烷磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸烷基或芳基酯及磷酸三酯修飾(諸如烷基磷酸三酯、磷酸三酯磷鍵、5'-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸三酯、膦酸甲酯)及非含磷鍵(例如碳酸酯、胺基甲酸酯、矽烷基、硫、磺酸酯、磺醯胺、甲縮醛、硫代甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基亞胺基鍵)。
本文中所揭示之核酸分子可包括肽核酸(PNA)骨架。PNA骨架包括由肽鍵連接之重複N-(2-胺基乙基)-甘胺酸單元。各種鹼基(諸如嘌呤、嘧啶、天然及合成鹼基)藉由亞
甲基羰基鍵與骨架連接。
末端磷酸酯
可在末端磷酸基處作修飾。可用來例如穩定化核酸序列之3'末端之不同穩定化學物質的非限制性實例包括(3'-3')-反向脫氧核糖；脫氧核糖核苷酸；(5'-3')-3'-脫氧核糖核苷酸；(5'-3')-核糖核苷酸；(5'-3')-3'-O-甲基核糖核苷酸；3'-甘油基；(3'-5')-3'-脫氧核糖核苷酸；(3'-3')-脫氧核糖核苷酸；(5'-2')-脫氧核糖核苷酸；及(5-3')-雙脫氧核糖核苷酸。此外，未經修飾之骨架化學物質可與本文中所描述之一或多個不同骨架修飾組合。
例示性經化學修飾之末端磷酸基包括如下所示者：
結合物
如本文中所提供之經修飾之核苷酸及核酸分子(例如siNA分子)可包括結合物，例如與經化學修飾之核酸分子共價連接之結合物。結合物之非限制性實例包括Vargeese等人，美國第10/427,160號中所述之結合物及配體。結合 物可經由生物可降解連接子與核酸分子(諸如siNA分子)共價連接。結合物分子可連接於經化學修飾之核酸分子的有義股、反義股任一者或兩股之3'末端處。結合物分子可連接於經化學修飾之核酸分子之有義股、反義股任一者或兩股之5'末端處。結合物分子可連接經化學修飾之核酸分子的有義股、反義股任一者或兩股之3'末端及5'末端兩者，或其任何組合。在一個實施例中，結合物分子可包括有助於將經化學修飾之核酸分子傳遞至生物系統(諸如細胞)中的分子。在另一實施例中，與經化學修飾之核酸分子連接的結合物分子為聚乙二醇、人血清白蛋白或可介導細胞吸收的細胞受體之配體。本說明書涵蓋可與經化學修飾之核酸分子連接的特異性結合物分子之實例描述於Vargeese等人，美國第10201394號中。
連接子
本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可包括連接核酸之有義區與核酸之反義區的核苷酸、非核苷酸或混合核苷酸/非核苷酸連接子。核苷酸連接子可為2個核苷酸長(例如約3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長)的連接子。核苷酸連接子可為核酸適體。如本文中所用之「適體」或「核酸適體」係指與目標分子特異性結合之核酸分子，其中核酸分子具有包括由目標分子在其天然環境中識別之序列的序列。另一方面，適體可為與目標分子(諸如hsp47 mRNA)結合之核酸分子，其中目標分子並非天然地與核酸結合。舉例而言，適體可用於與蛋白之配體結合域結合， 從而預防天然存在之配體與蛋白相互作用。此為非限制性實例，且此項技術者將認識到其他實施例可使用在此項技術中通常已知之技術來容易地產生。參見例如Gold等人；1995,Annu.Rev.Biochem.,64,763；Brody及Gold,2000,J.Biotechnol.,74,5；Sun,2000,Curr.Opin.Mol.Ther.,2,100；Kusser,2000,J.Biotechnol.,74,27；Hermann及Patel,2000,Science,287,820；及Jayasena,1999,Clinical Chemistry,45,1628。
非核苷酸連接子可包括無鹼基核苷酸、聚醚、多元胺、聚醯胺、肽、碳水化合物、脂質、聚烴或其他聚合化合物(例如聚乙二醇，諸如具有2與100個之間的乙二醇單元之聚乙二醇)。特定實例包括由以下所描述者：Seela及Kaiser,Nucleic Acids Res.1990,18：6353及Nucleic Acids Res.1987,15：3113；Cload及Schepartz,J.Am.Chem.Soc.1991,113：6324；Richardson及Schepartz,J.Am.Chem.Soc.1991,113：5109；Ma等人，Nucleic Acids Res.1993,21：2585及Biochemistry 1993,32：1751；Durand等人，Nucleic Acids Res.1990,18：6353；McCurdy等人，Nucleosides & Nucleotides 1991,10：287；Jschke等人，Tetrahedron Lett.1993,34：301；Ono等人，Biochemistry 1991,30：9914；Arnold等人，WO8902439；Usman等人，WO 9506731；Dudycz等人，WO 9511910；及Ferentz及Verdine,J.Am.Chem.Soc.1991,113：4000。
5'末端、3'末端及突出物
本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)可在兩側均為鈍端，在兩側均具有突出物，或為鈍端與突出物末端之組合。突出物可存在於有義股或反義股之5'或3'末端上。
雙股核酸分子(例如siNA)之5'及/或3'末端可為鈍端或具有突出物。在有義股或反義股中，5'末端可為鈍端且3'末端具有突出物。在其他實施例中，在有義股或反義股中，3'末端可為鈍端且5'末端具有突出物。在其他實施例中，5'及3'末端均為鈍端，或5'及3'末端均具有突出物。
核酸之一或兩股之5'及/或3'末端可包括游離羥基。任何核酸分子股之5'及/或3'末端可經修飾以包括化學修飾。該等修飾可穩定化核酸分子，例如3'末端穩定性可因存在核酸分子修飾而增加。末端修飾(例如末端(terminal cap))之實例包括(但不限於)無鹼基；脫氧無鹼基；反向(脫氧)無鹼基；甘油基；二核苷酸；非環狀核苷酸；胺基；氟基、氯基、溴基；CN；CF；甲氧基；咪唑；羧酸酯；硫代酯；C1至C10低碳烷基；經取代之低碳烷基、烷芳基或芳烷基；OCF3；OCN；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；雜環烷基；雜環烷芳基；胺基烷基胺基；聚烷基胺基；或經取代之矽烷基，如尤其歐洲專利EP586520及EP618925中所述；及本文中所揭示之其他修飾。
核酸分子包括具有鈍端(亦即不包括任何突出核苷酸之末端)之核酸分子。核酸分子可包括一或多個鈍端。鈍端核酸分子具有等於存在於核酸分子之各股中之核苷酸數目 的許多鹼基對。核酸分子可包括一個鈍端，例如其中反義股之5'末端及有義股之3'末端不具有任何突出核苷酸。核酸分子可包括一個鈍端，例如其中反義股之3'末端及有義股之5'末端不具有任何突出核苷酸。核酸分子可包括兩個鈍端，例如其中反義股之3'末端及有義股之5'末端以及反義股之5'末端及有義股之3'末端不具有任何突出核苷酸。存在於鈍端核酸分子中之其他核苷酸可包括例如錯配、凸起、環或搖擺鹼基對以調控核酸分子之活性從而介導RNA干擾。
在本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)之某些實施例中，分子之至少一個末端具有至少一個核苷酸(例如一至八個突出核苷酸)之突出物。舉例而言，本文中所揭示之雙股核酸分子之一或兩股可在5'末端或3'末端或兩者處具有突出物。突出物可存在於核酸分子之有義股及反義股任一者或兩者處。突出物之長度可為僅僅一個核苷酸及長達一至八個或八個以上核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸)；在一些較佳實施例中，突出物為2、3、4、5、6、7或8個核苷酸；例如突出物可為2個核苷酸。形成突出物之核苷酸可包括脫氧核糖核苷酸；核糖核苷酸；天然及非天然核鹼基；或諸如本文中所揭示在糖、鹼基或磷酸基中修飾之任何核苷酸。雙股核酸分子可具有5'及3'突出物兩者。5'及3'末端處之突出物可具有不同長度。突出物可包括至少一個核酸修飾，其可為脫氧核糖核苷酸。 一或多個脫氧核糖核苷酸可在5'末端處。核酸分子之各別 相對股之3'末端可能不具有突出物，更佳不具有脫氧核糖核苷酸突出物。一或多個脫氧核糖核苷酸可在3'末端處。dsRNA之各別相對股之5'末端可能不具有突出物，更佳不具有脫氧核糖核苷酸突出物。一股之5'或3'末端之突出物可為一至八(例如約1、2、3、4、5、6、7或8)個非配對核苷酸，突出物較佳為兩至三個非配對核苷酸；更佳為兩個非配對核苷酸。核酸分子可包括具有約1至約20(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個；較佳為一至八(例如約1、2、3、4、5、6、7或8)個核苷酸之突出末端的雙螺旋體核酸分子，例如具有約19個鹼基對及3'末端單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出物之約21個核苷酸之雙螺旋體。本文中之核酸分子可包括具有鈍端之雙螺旋體核酸分子，其中兩個末端均為鈍端，或者其中一個末端為鈍端。本文中所揭示之核酸分子可包括一或多個鈍端，亦即其中鈍端不具有任何突出核苷酸。在一個實施例中，鈍端核酸分子具有等於存在於核酸分子之各股中之核苷酸數目的許多鹼基對。核酸分子可包括一個鈍端，例如其中反義股之5'末端及有義股之3'末端不具有任何突出核苷酸。核酸分子可包括一個鈍端，例如其中反義股之3'末端及有義股之5'末端不具有任何突出核苷酸。核酸分子可包括兩個鈍端，例如其中反義股之3'末端及有義股之5'末端以及反義股之5'末端及有義股之3'末端不具有任何突出核苷酸。在某些較佳實施例中，核酸化合物具有鈍端。存在於鈍端siNA分子中之 其他核苷酸可包括例如錯配、凸起、環或搖擺鹼基對以調控核酸分子之活性從而介導RNA干擾。
在多種實施例中，如本文中所描述之核酸分子(例如siNA分子)的一或多個或所有突出核苷酸係諸如本文中所描述經修飾；例如一或多個或所有核苷酸可為2'-脫氧核苷酸。
修飾之數量、位置及模式
本文中所揭示之核酸分子(例如siNA分子)可包括經修飾之核苷酸，其含量以佔存在於核酸分子中之核苷酸總數之百分比表示。因此，核酸分子可包括約5%至約100%經修飾之核苷酸(例如約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%經修飾之核苷酸)。存在於既定核酸分子中之經修飾之核苷酸的實際百分比將視存在於核酸中之核苷酸之總數而定。若核酸分子為單股的，則修飾百分比可基於存在於單股核酸分子中之核苷酸之總數。同樣，若核酸分子為雙股的，則修飾百分比可基於存在於有義股、反義股或有義股及反義股兩者中之核苷酸的總數。
本文中所揭示之核酸分子可包括未經修飾之RNA，其含量以佔核酸分子中之總核苷酸數之百分比表示。因此，核酸分子可包括約5%至約100%未經修飾之核苷酸(例如存在於核酸分子中之總核苷酸數的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
核酸分子(例如siNA分子)可包括有義股，其包括約一至約五個、特定言之為約1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5個或5個以上)2'-脫氧、2'OMe、2'-脫氧-2'-氟基及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5個或5個以上)通用鹼基修飾之核苷酸，且視情況在有義股之3'末端、5'末端或3'及5'末端兩者處包括末端分子；且其中反義股包括約一至約五個或五個以上、特定言之為約1、2、3、4、5個或5個以上硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上)2'-脫氧、2'OMe、2'-脫氧-2'-氟基及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上)通用鹼基修飾之核苷酸，且視情況在反義股之3'末端、5'末端或3'及5'末端兩者處包括末端分子。核酸分子可包括有義及/或反義核酸股之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上經2'-脫氧、2'OMe及/或2'-脫氧-2'-氟基核苷酸化學修飾之嘧啶核苷酸，具有或不具有約一至約五個或五個以上、例如約1、2、3、4、5個或5個以上硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或在3'末端、5'末端或3'及5'末端兩者處具有或不具有末端分子(其存在於相同或不同股中)。
核酸分子可在核酸分子之各股中包括約一至約五個或五個以上(特定言之為約1、2、3、4、5個或5個以上)硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
核酸分子可例如在一或兩個核酸序列股之3'末端、5'末端或3'及5'末端兩者處包括2'-5'核苷酸間鍵。此外，2'-5'核苷酸間鍵可存在於一或兩種核酸序列股內之各個其他位置處，例如包括siNA分子之一或兩股中的嘧啶核苷酸之每個核苷酸間鍵中的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上可包括2'-5'核苷酸間鍵，或包括siNA分子之一或兩股中的嘌呤核苷酸之每個核苷酸間鍵中的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上可包括2'-5'核苷酸間鍵。
經化學修飾之短干擾核酸(siNA)分子可包括反義區，其中任何(例如一或多個或所有)存在於反義區中之嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸(例如其中所有嘧啶核苷酸均為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸，或者複數個嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸)，且其中任何(例如一或多個或所有)存在於反義區中之嘌呤核苷酸為2'-脫氧嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'-脫氧嘌呤核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸為2'-脫氧嘌呤核苷酸)。
經化學修飾之短干擾核酸(siNA)分子可包括反義區，其中任何(例如一或多個或所有)存在於反義區中之嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸(例如其中所有嘧啶核苷酸均為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸，或者複數個嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸)，且其中任何(例如一或多個或所有)存在於反義區中之嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'OMe嘌呤核苷酸，或者 複數個嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸)。
細胞或復原活體外系統內能夠介導針對hsp47之RNA干擾(RNAi)的經化學修飾之siNA分子可包括有義區，其中一或多個存在於有義區中之嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸(例如其中所有嘧啶核苷酸均為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸，或者複數個嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸)，且一或多個存在於有義區中之嘌呤核苷酸為2'-脫氧嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'-脫氧嘌呤核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸為2'-脫氧嘌呤核苷酸)；及反義區，其中一或多個存在於反義區中之嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸(例如其中所有嘧啶核苷酸均為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸，或者複數個嘧啶核苷酸為2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸)，且一或多個存在於反義區中之嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'OMe嘌呤核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸)。有義區及/或反義區可具有末端修飾，諸如任何視情況存在於有義及/或反義序列之3'末端、5'末端或3'及5'末端兩者處之修飾。有義及/或反義區可視情況進一步包括具有約1至約4(例如約1、2、3或4)個2'-脫氧核苷酸之3'末端核苷酸突出物。突出核苷酸可進一步包括一或多個(例如約1、2、3、4個或4個以上)硫代磷酸酯、膦醯基乙酸酯及/或硫代膦醯基乙酸酯核苷酸間鍵。有義區中之嘌呤核苷酸可替代性地為2'OMe嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'OMe嘌呤核苷酸，或者複數個嘌 呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸)，且一或多個存在於反義區中之嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'OMe嘌呤核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸)。有義區中之一或多個嘌呤核苷酸可替代性地為嘌呤核糖核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為嘌呤核糖核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸為嘌呤核糖核苷酸)，且任何存在於反義區中之嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均為2'OMe嘌呤核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸為2'OMe嘌呤核苷酸)。有義區及/或存在於反義區中之一或多個嘌呤核苷酸可替代性地選自由以下組成之群：2'-脫氧核苷酸、LNA核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、4'-硫代核苷酸及2'OMe核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸均係選自由以下組成之群：2'-脫氧核苷酸、LNA核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、4'-硫代核苷酸及2'OMe核苷酸，或者複數個嘌呤核苷酸係選自由以下組成之群：2'-脫氧核苷酸、LNA核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、4'-硫代核苷酸及2'OMe核苷酸)。
在一些實施例中，如本文中所描述之核酸分子(例如siNA分子)在反義股中；例如在反義股之位置6或位置7處包括經修飾之核苷酸(例如一個經修飾之核苷酸)。
修飾模式及交替修飾
本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可具有經修飾及未經修飾之核酸的模式。一段連續的核苷酸中之核苷酸之修飾模式可為含於單核苷酸或經由標準磷酸二酯鍵或至 少部分經由硫代磷酸酯鍵與彼此共價連接之核苷酸組內的修飾。因此，如本文中所涵蓋之「模式」並非必需包括重複單元，不過亦可如此。可與本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)結合使用之修飾模式的實例包括揭示於Giese,US7452987中之修飾模式。舉例而言，本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)包括具有諸如與圖示於US7452987圖2中之模式類似或相同之修飾模式的核酸分子。
經修飾之核苷酸或經修飾之核苷酸組可在有義股或反義股之5'末端或3'末端處，側接核苷酸或核苷酸組排列於經修飾之核苷酸或組之兩側，其中側接核苷酸或組未經修飾或不具有與先前核苷酸或核苷酸組相同之修飾。然而，側接核苷酸或核苷酸組可具有不同修飾。可分別重複經修飾之核苷酸或經修飾之核苷酸組及未經修飾或經不同修飾之核苷酸或未經修飾或經不同修飾之核苷酸組之此序列一或多次。
在一些模式中，一股之5'末端核苷酸為經修飾之核苷酸，而在其他模式中，一股之5'末端核苷酸為未經修飾之核苷酸。在一些模式中，一股之5'末端自經修飾之核苷酸組開始，而在其他模式中，5'末端為未經修飾之核苷酸組。此模式可在核酸分子之第一段或第二段上或在兩者上。
核酸分子之一股之經修飾之核苷酸可在適當位置與另一股之經修飾或未經修飾之核苷酸或核苷酸組互補。
在一個股上之修飾或修飾模式相對於另一股之修飾模式之間可能存在相移，以使得修飾組不重疊。在一個情況下，該移位使得有義股之經修飾之核苷酸組對應於反義股之未經修飾之核苷酸組，反之亦然。
可能存在修飾模式之部分移位以使得經修飾之組重疊。任何既定股中之經修飾之核苷酸組可視情況具有相同長度，但可具有不同長度。同樣，任何既定股中之未經修飾之核苷酸組可視情況具有相同長度，或具有不同長度。
在一些模式中，股束末端處之第二(次末端)核苷酸為未經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸組之開頭部分。此未經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸組較佳位於有義股及反義股任一者或兩者之5'末端處，且甚至更佳位於有義股之末端處。未經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸組可位於有義股之5'末端處。在一較佳實施例中，模式由交替單一經修飾及未經修飾之核苷酸組成。
在一些雙股核酸分子中，經2'OMe修飾之核苷酸及未經修飾之核苷酸、較佳為未經2'OMe修飾之核苷酸係以交替方式併入於兩股上，產生交替經2'OMe修飾之核苷酸及未經修飾或至少不包括2'OMe修飾之核苷酸的模式。在某些實施例中，2'OMe修飾及非修飾之相同序列存在於第二股上；在其他實施例中，交替經2'OMe修飾之核苷酸僅存在於有義股中且不存在於反義股中；且在其他實施例中，交替經2'OMe修飾之核苷酸僅存在於反義股中且不存在於有義股中。在某些實施例中，兩股之間存在相移以使得第一 股上經2'OMe修飾之核苷酸與第二股上未經修飾之核苷酸鹼基配對，反之亦然。此特定排列(亦即兩股上經2'OMe修飾及未經修飾之核苷酸之鹼基配對)在某些實施例中尤其較佳。在某些實施例中，交替經2'OMe修飾之核苷酸之模式存在於整個核酸分子或整個雙螺旋體區各處。在其他實施例中，交替經2'OMe修飾之核苷酸之模式僅存在於一部分核酸或整個雙螺旋體區中。
在「相移」模式中，若反義股自5'末端處經2'OMe修飾之核苷酸開始，藉此因此第二核苷酸未經修飾，第三、第五、第七等等核苷酸因此又經2'OMe修飾，而第二、第四、第六、第八及其類似核苷酸為未經修飾之核苷酸，則較佳。
例示性修飾位置及模式
雖然下文更詳細地提供例示性模式，但涵蓋具有本文中所揭示之核酸分子及此項技術中已知者之所有可能特徵之模式的所有置換(例如特徵包括(但不限於)有義股之長度、反義股之長度、雙螺旋體區之長度、突出之長度、雙股核酸分子之一或兩個末端為鈍端抑或具有突出物、經修飾之核酸之位置、經修飾之核酸之數目、修飾之類型、雙突出核酸分子在每側突出物上具有相同抑或不同數目之核苷酸、一個抑或一個以上類型之修飾用於核酸分子中、及連續經修飾/未經修飾之核苷酸之數目)。就下文提供之所有詳述實例而言，雖然展示雙螺旋體區具有19個核苷酸，但本文中所提供之核酸分子可具有1至49個核苷酸長之雙螺 旋體區，如雙螺旋體區之各股可獨立地為17至49個核苷酸長。例示性模式提供於本文中。
核酸分子可在包括單一經修飾之核酸或一組連續的經修飾之核酸的兩個末端上均具有鈍端(當n為0時)。經修飾之核酸可位於沿著有義股或反義股之任何位置處。核酸分子可包括具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個連續經修飾之核苷酸之組。經修飾之核酸可構成1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或100%的核酸股。以下緊接之實例的經修飾之核酸可僅在有義股中、僅在反義股中或在有義股及反義股兩者中。
通用核酸模式展示如下，其中X=雙螺旋體區中之有義股核苷酸；Xa=有義股中之5'突出核苷酸；Xb=有義股中之3'突出核苷酸；Y=雙螺旋體區中之反義股核苷酸；Ya=反義股中之3'突出核苷酸；Yb=反義股中之5'突出核苷酸；且M=雙螺旋體區中之經修飾之核苷酸。各a及b獨立地為0至8(例如0、1、2、3、4、5、6、7或8)。各X、Y、a及b獨立地經修飾或未經修飾。有義股及反義股可各自獨立地為17至49個核苷酸長。下文提供之實例具有19個核苷酸之雙螺旋體區；然而，本文中所揭示之核酸分子可在17至49個核 苷酸之間任何位置處具有雙螺旋體區且其中各股獨立地為17至49個核苷酸長。
其他例示性核酸分子模式展示如下，其中X=未經修飾之有義股核苷酸；x=有義股中之未經修飾之突出核苷酸；Y=未經修飾之反義股核苷酸；y=反義股中之未經修飾之突出核苷酸；且M=經修飾之核苷酸。有義股及反義股可各自獨立地為17至49個核苷酸長。下文提供之實例具有19個核苷酸之雙螺旋體區；然而，本文中所揭示之核酸分子可在17至49個核苷酸之間任何位置處具有雙螺旋體區且其中各股獨立地為17至49個核苷酸長。
核酸分子可在兩個末端上均具有鈍端，其具有交替經修飾之核酸。經修飾之核酸可位於沿著有義股或反義股之任何位置處。
具有5'鈍端及3'末端突出物之核酸分子終止於單一經修飾之核酸。
具有5'末端突出物及3'鈍端之核酸分子終止於單一經修飾之核酸。
核酸分子在兩個末端上均具有突出物，且所有突出物均為經修飾之核酸。在以下緊接之模式中，M為n數目之經修飾之核酸，其中n為0至8(亦即0、1、2、3、4、5、6、7及8)之整數。
核酸分子在兩個末端上均具有突出物，且一些突出核苷酸為經修飾之核苷酸。在以下緊接之模式中，M為n數目之經修飾之核苷酸，x為有義股中n數目之未經修飾之突出核苷酸，y為反義股中n數目之未經修飾之突出核苷酸，其中各n獨立地為0至8(亦即0、1、2、3、4、5、6、7及8)之整數，且其中各突出物具有最多20個核苷酸；較佳為最多8個核苷酸(經修飾及/或未經修飾)。
有義區之3'末端處之經修飾之核苷酸。
有義區之5'末端處之突出物。
反義區之3'末端處之突出物。
有義區內經修飾之核苷酸
例示性核酸分子連同符合以上所用符號之等效通式結構一起提供如下：
人類及大鼠hsp47之siHSP47-C siRNA，其具有19個核苷酸(亦即19聚體)雙螺旋體區且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類及大鼠hsp47之siHSP47-Cd siRNA，其具有25聚體雙螺旋體區，在反義股之3'末端處具有2個核苷酸之突出物，且在有義股之5'末端及次末端位置處具有2個經修飾之核苷酸。
人類及大鼠hsp47 cDNA 719-737之siHSP47-1siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類hsp47 cDNA 719至743之siHSP47-1d siRNA，其具 有25聚體，在有義股之3'末端處具有鈍端且在反義股之3'末端處具有2個核苷酸之突出物，且在有義股之5'末端及次末端位置處具有2個經修飾之核苷酸。
人類hsp47 cDNA 469至487之siHSP47-2 siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類hsp47 cDNA 469至493之siHSP47-2d siRNA，其具有25聚體雙螺旋體區，在有義股之3'末端處具有鈍端且在反義股之3'末端處具有2個核苷酸之突出物，且在有義股之5'末端及次末端位置處具有2個經修飾之核苷酸。
大鼠Gp46 cDNA 466-490之siHSP47-2d大鼠siRNA，其具有25聚體雙螺旋體區，在有義股之3'末端處具有鈍端且在反義股之3'末端處具有2個核苷酸之突出物，且在有義股之 5'末端及次末端位置處具有2個經修飾之核苷酸。
人類hsp47 cDNA 980至998之siHSP47-3 siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類hsp47 cDNA 980至1004之siHSP47-3d siRNA，其具有25聚體雙螺旋體區，在有義股之3'末端處具有鈍端且在反義股之3'末端處具有2個核苷酸之突出物，且在有義股之5'末端及次末端位置處具有2個經修飾之核苷酸。
人類hsp47 cDNA 735至753之siHSP47-4 siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類hsp47 cDNA 735至759之siHSP47-4d siRNA，其具有25聚體雙螺旋體區，在有義股之3'末端處具有鈍端且在反義股之3'末端處具有2個核苷酸之突出物，且在有義股之5'末端及次末端位置處具有2個經修飾之核苷酸。
人類hsp47 cDNA 621至639之siHSP47-5 siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類hsp47 cDNA 446至464之siHSP47-6 siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
人類hsp47 cDNA 692至710之siHSP47-7 siRNA，其具有19聚體雙螺旋體區，且在有義股及反義股之3'末端處具有經修飾之2個核苷酸(亦即脫氧核苷酸)之突出物。
核酸股中之切口及缺口
本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可具有帶切口或缺口之股、較佳為有義股。因此，核酸分子可具有三個或三個以上股，諸如揭示於PCT/US07/081836中之局部雙螺旋體(meroduplex)RNA(mdRNA)。具有帶切口或缺口之股之核酸分子可為約1至49個核苷酸長，或可為諸如本文中所揭示之RISC長度(例如約15至25個核苷酸)或Dicer受質長度(例如約25至30個核苷酸)。
具有三個或三個以上股之核酸分子包括例如『A』(反義)股、『S1』(第二)股及『S2』(第三)股，其中『S1』及『S2』股與『A』股互補且與『A』股之非重疊區形成鹼基對(例如mdRNA可具有A：S1S2之形式)。S1、S2或更多股一起形成實質上類似於相對於『A』反義股之有義股的股。藉由黏接『S1』與『A』股所形成之雙股區不同於藉由黏接『S2』與『A』股所形成之雙股區且與藉由黏接『S2』與『A』股所形成之雙股區不相重疊。核酸分子(例如siNA分子)可為「帶缺口之」分子，意謂0個核苷酸直至 約10個核苷酸(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)範圍內之「缺口」。有義股較佳帶缺口。在一些實施例中，A：S1雙螺旋體係由由『A』股中之至少一個非配對核苷酸(至多約10個非配對核苷酸)產生之缺口與A：S2雙螺旋體隔開，該至少一個非配對核苷酸位於A：S1雙螺旋體與A：S2雙螺旋體之間且不同於『A』、『S1』或『S2』股中之一或多者之3'末端處之非配對核苷酸中的任一或多者。A：S1雙螺旋體可由A：S1雙螺旋體與A：S2雙螺旋體之間的零個核苷酸之缺口(亦即其中在聚核苷酸分子中僅兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂或缺少之切口)與A：B2雙螺旋體隔開-其亦可稱為帶切口之dsRNA(ndsRNA)。舉例而言，A：S1S2可包括具有至少兩個雙股區之dsRNA，該等雙股區組合總共約14個鹼基對至約40個鹼基對，且雙股區係由約0至約10個核苷酸之缺口分隔，其視情況具有鈍端；或A：S1S2可包括具有至少兩個由至多十個核苷酸之缺口分隔之雙股區的dsRNA，其中雙股區中之至少一者包括約五與十三個之間的鹼基對。
Dicer受質
在某些實施例中，本文中所提供之核酸分子(例如siNA分子)可為可經活體內加工而產生活性核酸分子的前驅「Dicer受質」分子(例如雙股核酸)，例如如Rossi,US 20050244858中所述。在某些條件及情況下，已發現例如具有約25至約30個核苷酸之此等相對較長的dsRNA siNA物質就作用效能及持續時間而言可得到出乎意料地有效之結 果。在不希望受任何特定理論限制的情況下，咸信較長dsRNA物質充當細胞之細胞質中之酶Dicer的受質。除使雙股核酸裂解為較短片段之外，Dicer可有助於將源自裂解之dsRNA之單股裂解產物併入RNA誘導型沉默複合體(RISC複合體)中，其造成由目標基因獲得之細胞質RNA破裂。
Dicer受質可具有某些強化其藉由Dicer進行之加工的性質。Dicer受質具有足以使其可藉由Dicer加工而產生活性核酸分子的長度，且可進一步包括一或多種以下性質：(i)dsRNA為不對稱的，例如在第一股(反義股)上具有3'突出物；及(ii)dsRNA在反義股(有義股)上具有經修飾之3'末端，從而導引Dicer結合及加工dsRNA而形成活性siRNA之定向。在某些實施例中，Dicer受質中之最長股可為24至30個核苷酸。
Dicer受質可為對稱或不對稱的。Dicer受質可具有包括22至28個核苷酸之有義股且反義股可包括24至30個核苷酸；因此，在一些實施例中，所得Dicer受質可在反義股之3'末端上具有突出物。Dicer受質可具有25個核苷酸長之有義股及27個核苷酸長之反義股，反義股具有2個鹼基之3'突出物。突出物可為1至3個核苷酸，例如2個核苷酸。有義股亦可具有5'磷酸酯。
不對稱Dicer受質可進一步在有義股之3'末端處含有兩個脫氧核苷酸替代兩個核糖核苷酸。一些例示性Dicer受質長度及結構為21+0、21+2、21-2、22+0、22+1、22-1、 23+0、23+2、23-2、24+0、24+2、24-2、25+0、25+2、25-2、26+0、26+2、26-2、27+0、27+2及27-2。
Dicer受質之有義股可為約22至約30(例如約22、23、24、25、26、27、28、29或30)；約22至約28；約24至約30；約25至約30；約26至約30；約26至29；或約27至約28個核苷酸長。在某些較佳實施例中，Dicer受質含有有義股及反義股，其為至少約25個核苷酸長且不長於約30個核苷酸；在約26與29個核苷酸之間；或為27個核苷酸長。有義股及反義股可具有相同長度(鈍端)、不同長度(具有突出物)或組合。有義股及反義股可存在於同一聚核苷酸或不同聚核苷酸上。Dicer受質可具有約19、20、21、22、23、24、25或27個核苷酸之雙螺旋體區。
如同本文中所提供之其他siNA分子，Dicer受質之反義股可具有在生物條件下(諸如在真核細胞之細胞質內)與反義股黏接的任何序列。
Dicer受質可具有如此項技術中已知及/或如本文中關於其他核酸分子(諸如siNA分子)所描述的針對核苷酸鹼基、糖或磷酸酯骨架之任何修飾。在某些實施例中，Dicer受質可具有已藉由位於有義股3'末端處之適合修飾劑修飾以便進行Dicer加工的有義股，亦即dsRNA經設計以導引Dicer結合及加工之定向。適合修飾劑包括核苷酸，諸如脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、非環狀核苷酸及其類似物；及位阻分子，諸如螢光分子及其類似物。非環狀核苷酸用2-羥基乙氧基甲基取代通常存在於dNMP中之2'- 脫氧呋喃核糖基糖。可用於Dicer受質siNA分子之其他核苷酸修飾劑包括3'-脫氧腺苷(蛹蟲草菌素)、3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2',3'-雙脫氧肌苷(ddI)、2',3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)、2',3'-雙脫氫-2',3'-雙脫氧胸苷(d4T)及3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2',3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)及2',3'-雙脫氫-2',3'-雙脫氧胸苷(d4T)之單磷酸酯核苷酸。在一個實施例中，使用脫氧核苷酸作為修飾劑。當使用核苷酸修飾劑時，其可置換核糖核苷酸(例如由1至3個核苷酸之修飾劑或2個核苷酸之修飾劑取代有義股之3'末端上之核糖核苷酸)，以使得Dicer受質之長度不變化。當使用位阻分子時，其可與反義股之3'末端處之核糖核苷酸連接。因此，在某些實施例中，股之長度不因併入修飾劑而變化。在某些實施例中，dsRNA中之兩個DNA鹼基經取代以導引Dicer加工反義股之定向。在另一實施例中，由兩個末端DNA鹼基取代有義股之3'末端上之兩個核糖核苷酸，在有義股之3'末端及反義股之5'末端上形成雙螺旋體之鈍端，且2個核苷酸之RNA突出物位於反義股之3'末端上。此為不對稱組成，DNA在鈍端上且RNA鹼基在突出末端上。
在某些實施例中，修飾包括於Dicer受質中，以便修飾不會防止核酸分子充當Dicer之受質。在一個實施例中，進行一或多個可強化Dicer加工Dicer受質的修飾。可進行一或多個可使得更有效地產生RNAi之修飾。可進行一或多個可支持較大RNAi效應之修飾。進行一或多個可使得欲遞送至細胞之每一Dicer受質之效能更大的修飾。修飾 可併入3'末端區、5'末端區、3'末端及5'末端區兩者中或於序列內之各個位置處。任何數目及組合之修飾均可併入Dicer受質中，只要修飾不會防止核酸分子充當Dicer之受質即可。在存在多個修飾時，其可為相同或不同。涵蓋鹼基、糖部分、磷酸酯骨架之修飾及其組合。任一5'末端可被磷酸化。
Dicer受質磷酸酯骨架修飾之實例包括膦酸酯(包括膦酸甲酯)、硫代磷酸酯及磷酸三酯修飾(諸如烷基磷酸三酯)及其類似者。Dicer受質糖部分修飾之實例包括2'烷基嘧啶(諸如2'OMe)、2'-氟基、胺基及脫氧修飾及其類似者(參見例如Amarzguioui等人，2003)。Dicer受質鹼基修飾之實例包括無鹼基糖、經2-O-烷基修飾之嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶及5-(3-胺基烯丙基)-尿嘧啶及其類似者。亦可合併LNA。
有義股可藉由位於有義股3'末端處之適合修飾劑修飾以便進行Dicer加工，亦即Dicer受質經設計以導引Dicer結合及加工之定向。適合修飾劑包括核苷酸，諸如脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、非環狀核苷酸及其類似物；及位阻分子，諸如螢光分子及其類似物。非環狀核苷酸用2-羥基乙氧基甲基取代通常存在於dNMP中之2'-脫氧呋喃核糖基糖。其他核苷酸修飾劑可包括蛹蟲草菌素、AZT、ddI、3TC、d4T及AZT、3TC及d4T之單磷酸酯核苷酸。在一個實施例中，使用脫氧核苷酸作為修飾劑。當使用核苷酸修飾劑時，由1至3個核苷酸之修飾劑或2個核苷酸之修 飾劑取代有義股之3'末端上之核糖核苷酸。當使用位阻分子時，其與反義股之3'末端處之核糖核苷酸連接。因此，股之長度不因併入修飾劑而變化。在另一實施例中，本說明書涵蓋取代Dicer受質中之兩個DNA鹼基以導引Dicer加工反義股之定向。在本說明書之另一實施例中，由兩個末端DNA鹼基取代有義股之3'末端上之兩個核糖核苷酸，在有義股之3'末端及反義股之5'末端上形成雙螺旋體之鈍端，且2個核苷酸之RNA突出物位於反義股之3'末端上。此為不對稱組成，DNA在鈍端上且RNA鹼基在突出末端上。
反義股可藉由位於反義股3'末端處之適合修飾劑修飾以便進行Dicer加工，亦即dsRNA經設計以導引Dicer結合及加工之定向。適合修飾劑包括核苷酸，諸如脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、非環狀核苷酸及其類似物；及位阻分子，諸如螢光分子及其類似物。非環狀核苷酸用2-羥基乙氧基甲基取代通常存在於dNMP中之2'-脫氧呋喃核糖基糖。其他核苷酸修飾劑可包括蛹蟲草菌素、AZT、ddI、3TC、d4T及AZT、3TC及d4T之單磷酸酯核苷酸。在一個實施例中，使用脫氧核苷酸作為修飾劑。當使用核苷酸修飾劑時，由1至3個核苷酸之修飾劑或2個核苷酸之修飾劑取代反義股之3'末端上之核糖核苷酸。當使用位阻分子時，其與反義股之3'末端處之核糖核苷酸連接。因此，股之長度不因併入修飾劑而變化。在另一實施例中，本說明書涵蓋取代dsRNA中之兩個DNA鹼基以導引Dicer加工之定向。在其他描述中，兩個末端DNA鹼基替代兩個核糖核苷 酸位於反義股之3'末端上，在有義股之5'末端及反義股之3'末端上形成雙螺旋體之鈍端，且2個核苷酸之RNA突出物位於有義股之3'末端上。此為不對稱組成，DNA在鈍端上且RNA鹼基在突出末端上。
具有有義股及反義股之Dicer受質可藉由第三結構連接。第三結構不會阻斷Dicer對Dicer受質之活性且不會干擾自目標基因轉錄之RNA的定向破壞。第三結構可為化學鍵聯基團。適合化學鍵聯基團為此項技術中所知且可被使用。或者，第三結構可為寡核苷酸，其以使得一旦黏接構成Dicer受質之兩個寡核苷酸時即產生髮夾結構的方式連接dsRNA之兩個寡核苷酸。髮夾結構較佳不會阻斷Dicer對Dicer受質之活性或干擾自目標基因轉錄之RNA的定向破壞。
Dicer受質之有義股及反義股不需要完全互補。其僅需要實質上互補，從而在生物條件下黏接且提供可產生與目標序列充分互補之siRNA的Dicer之受質。
Dicer受質可具有某些強化其藉由Dicer進行之加工的性質。Dicer受質可具有足以使其藉由Dicer加工而產生活性核酸分子(例如siRNA)之長度且可具有一或多種以下性質：Dicer受質為不對稱的，例如在第一股(反義股)上具有3'突出物；及/或Dicer受質在第二股(有義股)上具有經修飾之3'末端，從而導引Dicer結合及加工Dicer受質而形成活性siRNA之定向。Dicer受質可為不對稱的，以至於有義股包括22至28個核苷酸且反義股包括24至30個核苷酸。因 此，所得Dicer受質在反義股之3'末端上具有突出物。突出物為1至3個核苷酸，例如2個核苷酸。有義股亦可具有5'磷酸酯。
Dicer受質可在反義股之3'末端上具有突出物且有義股經修飾以便進行Dicer加工。有義股之5'末端可具有磷酸酯。有義股及反義股可在生物條件(諸如見於細胞細胞質中之條件)下黏接。Dicer受質之股中之一者、尤其反義股之區可具有至少19個核苷酸之序列長度，其中此等核苷酸在鄰近於反義股之3'末端的21個核苷酸之區中且與自目標基因產生之RNA之核苷酸序列充分互補。Dicer受質亦可具有一或多種以下其他性質：反義股自相應21聚體有右移現象(亦即反義股當與相應21聚體相比時在分子右側上包括核苷酸)；該等股可能不完全互補，亦即該等股可能含有簡單的錯配配對；且鹼基修飾(諸如LNA)可包括於有義股之5'末端中。
Dicer受質核酸分子之反義股可經修飾以在5'末端上包括1至9個核糖核苷酸，從而得到22至28個核苷酸之長度。當反義股具有21個核苷酸之長度時，則可於3'末端上添加1至7個核糖核苷酸或2至5個核糖核苷酸及/或4個核糖核苷酸。所添加之核糖核苷酸可具有任何序列。雖然所添加之核糖核苷酸可與目標基因序列互補，但不需要目標序列與反義股之間完全互補。亦即，所得反義股與目標序列充分互補。有義股則可具有24至30個核苷酸。有義股可與反義股實質上互補以在生物條件下與反義股黏接。在一個實施 例中，反義股可經合成以含有經修飾之3'末端，從而導引Dicer加工。有義股可具有3'突出物。反義股可經合成以含有經修飾之3'末端以便進行Dicer結合及加工且有義股具有3'突出物。
熱休克蛋白47
熱休克蛋白47(HSP47)為膠原蛋白特異性分子伴隨蛋白且存在於內質網中。其在自內質網摺疊、組裝及轉運之過程期間與原膠原相互作用(Nagata Trends Biochem Sci 1996；21：22-6；Razzaque等人2005；Contrib Nephrol 2005；148：57-69；Koide等人2006 J.Biol.Chem.；281：3432-38；Leivo等人Dev.Biol.1980；76：100-114；Masuda等人J.Clin.Invest.1994；94：2481-2488；Masuda等人Cell Stress Chaperones 1998；3：256-264)。已報導HSP47在各種組織纖維化中具有上調之表現(Koide等人，J Biol Chem 1999；274：34523-26)，該等組織纖維化諸如為肝硬化(Masuda等人，J Clin Invest 1994；94：2481-8)、肺纖維化(Razzaque等人，Virchows Arch 1998；432：455-60；Kakugawa等人，Eur Respir J 2004；24：57-65)及腎小球硬化(Moriyama等人，Kidney Int 1998；54：110-19)。目標人類hsp47 cDNA之例示性核酸序列揭示於GenBank寄存編號：NM_001235及例如如列為SEQ ID NO：1之相應mRNA序列中。一般熟習此項技術者應瞭解，既定序列可隨時間變化且因此包括本文核酸分子中所需之任何變化。
HSP47與各種不同膠原蛋白類型之特異性締合使HSP47 成為治療纖維化之潛在目標。抑制hsp47表現可防止細胞外膠原蛋白I分泌。Sato等人(Nat Biotechnol 2008；26：431-442)藉由使用siRNA在大鼠中抑制hsp47表現且防止肝纖維化進展，從而探究此可能性。同樣，Chen等人(Br J Dermatol 2007；156：1188-1195)及Wang等人(Plast.Reconstr Surg 2003；111：1980-7)研究藉由RNA干擾技術抑制hsp47表現。
抑制hsp47之方法及組合物
提供藉由使用能夠介導或介導針對hsp47基因表現之RNA干擾之小核酸分子(諸如短干擾核酸(siNA)、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA)分子)抑制hsp47表現的組合物及方法。本文中所揭示之組合物及方法亦適用於治療各種纖維化，諸如肝纖維化、肺纖維化及腎纖維化。
使用本說明書之核酸分子及/或方法來下調編碼例如以Genbank寄存NM_001235所提及之RNA之基因的表現。
本文中所提供之組合物、方法及套組可包括一或多種獨立地或以組合形式調控(例如下調)hsp47蛋白及/或編碼hsp47蛋白之基因、編碼hsp47之蛋白及/或基因(例如編碼包含以GenBank寄存第NM_001235號所提及之彼等序列之序列的基因)或hsp47基因家族成員之表現的核酸分子(例如siNA)及方法，其中基因或基因家族序列共享同與hsp47相關之疾病、病況或病症(諸如肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、腎纖維化、腹膜纖維化、慢性肝損傷及原纖維形成) 之維持及/或發展有關的序列同源性。參照例示性基因hsp47提供各種態樣及實施例之描述。然而，各種態樣及實施例亦係關於其他相關hsp47基因，諸如同系物基因及轉錄物變異體及與某些hsp47基因相關之多形現象(例如單核苷酸多形現象(SNP))。因此，各種態樣及實施例亦係關於與hsp47介導之信號轉導或基因表現之路徑有關的其他基因，該等路徑例如與本文中所描述之疾病、性狀或病況之維持或發展有關。可使用本文中關於hsp47基因所描述之方法分析此等其他基因之目標位點。因此，可如本文中所描述執行、測定及量測其他基因之調控及其他基因之該調控之效應。
在一個實施例中，本文中所提供之組合物及方法包括下調hsp47基因(例如由SEQ ID NO：1例示之人類hsp47)之表現的雙股短干擾核酸(siNA)分子，其中核酸分子包括約15至約49個鹼基對。
在一個實施例中，所揭示之核酸可用於抑制hsp47基因或hsp47基因家族之表現，其中基因或基因家族序列共享序列同源性。該等同源序列可如此項技術中所知，例如使用序列比對來識別。核酸分子可經設計，例如使用完全互補序列或藉由併入可提供其他目標序列之非規範鹼基對(例如錯配及/或搖擺鹼基對)來進行，以靶向該等同源序列。在識別錯配之情況下，非規範鹼基對(例如錯配及/或搖擺鹼基)可用於產生靶向一種以上基因序列之核酸分子。在非限制性實例中，使用非規範鹼基對(諸如UU及CC 鹼基對)來產生能夠靶向共享序列同源性之不同hsp47目標之序列的核酸分子。因此，使用本文中所揭示之siNA之一個優勢在於，單一核酸可經設計以包括與在同源基因之間保守的核苷酸序列互補之核酸序列。以此方法，可使用單一核酸來抑制一種以上基因之表現而非使用一種以上核酸分子來靶向不同基因。
核酸分子可用於靶向對應於一或多個基因家族(諸如hsp47家族基因)之保守序列。因此，靶向多個hsp47目標之核酸分子可使治療效應增強。此外，核酸可用於表徵多種應用中之基因功能之路徑。舉例而言，核酸分子可用於抑制目標基因在路徑中之活性以測定未經表徵之基因在基因功能分析、mRNA功能分析或轉譯分析中之功能。核酸分子可用於朝著醫藥發展方向測定與各種疾病及病況有關之潛在目標基因路徑。核酸分子可用於瞭解與例如纖維化(諸如肝、腎或肺纖維化)及/或發炎性及增生性性狀、疾病、病症及/或病況有關之基因表現的路徑。
在一個實施例中，本文中所提供之組合物及方法包括具有針對hsp47 RNA之RNAi活性之核酸分子，其中核酸分子包括與具有hsp47編碼序列(諸如具有如表3中所示之序列之彼等序列)之任何RNA互補之序列。在另一實施例中，核酸分子可具有針對hsp47 RNA之RNAi活性，其中核酸分子包括與具有變異hsp47編碼序列(例如表3中未展示但在此項技術中已知與纖維化之維持及/或發展有關之其他突變hsp47基因)之RNA互補之序列。表3中所示或本文中所 描述之化學修飾可應用於本文中所揭示之任何核酸構築體。在另一實施例中，本文中所揭示之核酸分子包括可與hsp47基因之核苷酸序列相互作用且從而介導hsp47基因表現沉默之核苷酸序列，例如其中核酸分子藉由調控hsp47基因之染色質結構或甲基化模式且防止hsp47基因轉錄之細胞過程來介導hsp47基因表現之調節。
本文中所揭示之核酸分子可具有針對hsp47 RNA之RNAi活性，其中核酸分子包括與具有hsp47編碼序列(諸如具有GenBank寄存第NM_001235號之彼等序列)之任何RNA互補之序列。核酸分子可具有針對hsp47 RNA之RNAi活性，其中核酸分子包括與具有變異hsp47編碼序列(例如此項技術中已知與纖維化之維持及/或發展有關之其他突變hsp47基因)之RNA互補之序列。
本文中所揭示之核酸分子包括可與hsp47基因之核苷酸序列相互作用且從而介導hsp47基因表現沉默之核苷酸序列，例如其中核酸分子藉由調控hsp47基因之染色質結構或甲基化模式且防止hsp47基因轉錄之細胞過程來介導hsp47基因表現之調節。
治療方法
HSP47與各種不同膠原蛋白類型之特異性締合使hsp47成為治療纖維化之目標。抑制hsp47表現可防止細胞外膠原蛋白I分泌。Sato等人(Nat Biotechnol 2008；26：431-442)藉由使用siRNA在大鼠中抑制hsp47表現且防止肝纖維化之進展，從而探究此可能性。同樣，Chen等人(Br J Dermatol 2007；156：1188-1195)及Wang等人(Plast Reconstr Surg 2003；111：1980-7)研究藉由RNA干擾技術來抑制hsp47表現。
在一個實施例中，核酸分子可用於下調或抑制自與疾病或病況(例如纖維化)相關之hsp47及/或hsp47單純型多形現象出現之hsp47及/或hsp47蛋白之表現。分析hsp47及/或hsp47基因或hsp47及/或hsp47蛋白或RNA含量可用於識別具有該等多形現象之個體或處於出現本文中所描述之性狀、病況或疾病風險中之彼等個體。此等個體接受治療，例如用本文中所揭示之核酸分子及適用於治療與hsp47及/或hsp47基因表現相關之疾病之任何其他組合物之治療。因此，分析hsp47及/或hsp47蛋白或RNA含量可用於在治療個體中確定治療類型及治療過程。監測hsp47及/或hsp47蛋白或RNA含量可用於預測治療結果且測定調控某些與性狀、病況或疾病相關之hsp47及/或hsp47蛋白之含量及/或活性之化合物及組合物的功效。
提供藉由使用如本文中所提供的能夠介導或介導針對hsp47基因表現之RNA干擾之小核酸分子(諸如siNA、RNAi、siRNA、雙股RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA)分子)抑制hsp47表現的組合物及方法。本文中所揭示之組合物及方法亦適用於治療各種纖維化，諸如肝纖維化、肺纖維化及腎纖維化。
本文中所揭示之核酸分子可單獨或與其他藥物組合或結合用於預防或治療與hsp47相關之疾病、性狀、病況及/或 病症，諸如肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、腎纖維化、腹膜纖維化、慢性肝損傷及原纖維形成。
本文中所揭示之核酸分子能夠以序列特異性方式抑制hsp47之表現。核酸分子可包括有義股及反義股，其包括與hsp47 mRNA至少部分互補(反義)之連續核苷酸。
在一些實施例中，對hsp47具有特異性之dsRNA可與對有助於新合成之蛋白(諸如鈣聯蛋白(calnexin)、鈣網蛋白(calreticulin)及/或BiP)摺疊之其他分子伴隨蛋白具有特異性之其他dsRNA結合使用(Bergeron等人，Trends Biochem.Sci.1994；19：124-128；Herbert等人，1995；Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.60：405-415)。
纖維化可使用如本文中所揭示之核酸分子藉由RNA干擾來治療。例示性纖維化包括肝纖維化、腹膜纖維化、肺纖維化、腎纖維化。本文中所揭示之核酸分子可以序列特異性方式抑制hsp47之表現。
纖維化之治療可藉由使用此項技術中已知之適合技術(諸如使用抗膠原蛋白I抗體)測定細胞外膠原蛋白之含量來監測。治療亦可藉由測定受感染組織之細胞中的hsp47 mRNA之含量或HSP47蛋白之含量來監測。治療亦可藉由非侵襲性掃描受感染器官或組織(諸如藉由電腦輔助斷層攝影掃描、磁共振彈性成像掃描)來監測。
治療或預防個體或生物之hsp47相關疾病或病況之方法可包括在適於調控個體或生物中之hsp47基因表現之條件下使個體或生物與如本文中所提供之核酸分子接觸。
治療或預防個體或生物之纖維化之方法可包括在適於調控個體或生物中之hsp47基因表現之條件下使個體或生物與核酸分子接觸。
治療或預防個體或生物之一或多種選自由肝纖維化、腎纖維化及肺纖維化組成之群之纖維化的方法可包括在適於調控個體或生物中之hsp47基因表現之條件下使個體或生物與核酸分子接觸。
纖維變性疾病
纖維變性疾病通常特徵在於在細胞外基質內纖維物質過量沈積，造成組織構架異常變化且干擾正常器官功能。
所有因創傷損傷之組織的回應為創口癒合過程之開始。纖維化(一種以過量疤痕為特徵之病症)在創口癒合反應之正常自限制性過程受干擾時發生，且導致膠原蛋白過量產生且沈積。因此，正常器官組織經替代為疤痕組織，其最終導致器官功能衰竭。
纖維化可由各種原因引發且發生於各種器官中。肝硬化、肺纖維化、肉狀瘤病、瘢痕瘤及腎纖維化均為與進行性纖維化相關之慢性病況，從而導致正常組織功能不斷失去。
急性纖維化(通常突然發作及重度發作且持續時間短)作為對各種形式之創傷(包括意外損傷(尤其脊柱及中樞神經系統之損傷)、感染、手術、缺血性病(例如心臟病發作後之心臟疤痕)、灼傷、環境污染物、酒精及其他類型之毒素、急性呼吸窘迫症候群、輻射及化學療法治療)之常見 反應發生。
纖維化、纖維化相關病變或與細胞蛋白之異常交聯相關之病變均可藉由本文中所揭示之siRNA來治療。纖維變性疾病或其中明顯纖維化之疾病(纖維化相關病變)包括急性及慢性形式之器官纖維化兩者，其包括以下之所有病因學變化形式：肺纖維化，包括間質性肺病及纖維變性肺病；肝纖維化；心臟纖維化，包括心肌纖維化；腎纖維化，包括慢性腎衰竭；皮膚纖維化，包括硬皮病、瘢痕瘤及肥厚性疤痕；骨髓纖維化(myelofibrosis)(骨髓纖維化(bone marrow fibrosis))；所有類型之眼部疤痕，包括增生性玻璃體視網膜病變(PVR)及由治療白內障或青光眼之手術產生之疤痕；可變病因之發炎性腸病；黃斑變性；格氏眼病(Grave's ophthalmopathy)；藥物誘導之麥角中毒；瘢痕瘤疤痕；硬皮病；牛皮癬；李-佛美尼症候群(Li-Fraumeni syndrome)中之神經膠母細胞瘤；偶發性神經膠母細胞瘤；骨髓白血病；急性骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；骨髓增生性症候群；婦科癌症；卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；漢森氏病(Hansen's disease)；及膠原性結腸炎。
在各實施例中，如本文中所揭示之化合物(核酸分子)可用於治療例如如本文中所揭示之纖維變性疾病以及諸如本文中所揭示之除纖維變性疾病以外之多種其他疾病及病況。可治療之其他病況包括其他器官之纖維變性疾病-任何原因(CKD，包括ESRD)所致之腎纖維化；肺纖維化(包 括ILF)；骨髓纖維化；與所有可能類型之意外及醫源性(手術)皮膚損傷相關之異常疤痕(瘢痕瘤)；硬皮病；心臟纖維化；青光眼濾過手術失敗；腸黏連。
眼部手術及纖維變性併發症
由眼睛手術產生之疤痕組織之攣縮可能經常發生。建立新引流(drainage)通道之青光眼手術經常因組織之疤痕及攣縮而失敗，且所產生之引流系統可能被阻斷，需要其他手術介入。當前抗疤痕方案(絲裂黴素C(Mitomycin C)或5FU)因涉及併發症(例如失明)而具有限制性，例如參見Cordeiro MF等人，Human anti-transforming growth factor-beta2 antibody：a new glaucoma anti-scarring agent Invest Ophthalmol Vis Sci.19999月；40(10)：2225-34。在角膜創傷或角膜手術(例如用於近視或屈光不正之雷射或手術治療)之後亦可形成疤痕組織之攣縮，其中組織之攣縮可能會導致不準確結果。疤痕組織可能形成於例如玻璃狀液或視網膜上/中，且最終會導致一些糖尿病患者失明，且可能在剝離手術之後形成，稱為增生性玻璃體視網膜病變(PVR)。PVR為視網膜脫落後之最常見併發症且與視網膜裂孔或撕裂有關。PVR係指玻璃狀腔內及含有視網膜色素上皮(RPE)細胞之視網膜前及後表面上的細胞膜之生長。基本上為疤痕組織之此等膜對視網膜施加牽引作用且會導致視網膜脫落即使在最初成功之視網膜脫落程序之後亦會復發。
疤痕組織可能在斜視、眼眶或眼瞼手術或甲狀腺眼病之 後形成於眼眶中或於眼睛及眼瞼肌肉上，且其中結膜疤痕可能在青光眼手術之後或在瘢痕性疾病、發炎性疾病(例如類天疱瘡)或傳染性疾病(例如沙眼)中發生。與包括膠原蛋白之組織之攣縮相關之另一眼睛問題為白內障摘出術後之晶狀體囊渾濁化及攣縮。已認識到MMP在眼部疾病(包括創口癒合、眼睛乾燥、無菌角膜潰瘍作用、復發性上皮糜爛、角膜新血管生成、翼狀胬肉、結膜鬆弛症、青光眼、PVR及眼部纖維化)中之重要作用。
肝纖維化
肝纖維化(LF)為數種病因之肝損傷之通常不可逆結果。在西方世界，主要病因學類別為：酒精性肝疾病(30%至50%)、病毒性肝炎(30%)、膽道疾病(5%至10%)、原發性血色素沈著症(5%)、及未知病因之藥物相關及隱源性肝硬化(10%至15%)。威爾森氏症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症及其他罕見疾病亦有肝纖維化為一種症狀。肝硬化(肝纖維化之最終階段)經常需要肝移植且在西方世界為死亡之前十大原因之一。
腎纖維化及相關病況 慢性腎衰竭(CRF)
慢性腎衰竭為腎排泄廢物、集中尿液及保存電解質之能力的逐漸及進行性損失。CRF為緩慢進行性的。其最經常由導致腎功能逐漸損失之任何疾病產生，且纖維化為引起CRF之主要病變。
糖尿病性腎病
特點為腎小球硬化及腎小管間質纖維化之糖尿病性腎病為現代世界中末期腎病之最普遍起因，且糖尿病患者為透析之最大群體。該治療具有高成本且決非最佳。移植提供更佳結果但受捐贈者嚴重不足影響。
慢性腎病
慢性腎病(CKD)為世界性公共衛生問題且被認為是與心血管疾病及慢性腎衰竭(CRF)之風險增加相關的常見病況。
國家腎臟基金會(National Kidney Foundation，NKF)之腎病結果品質倡議(Kidney Disease Outcomes Quality Initiative，K/DOQI)將慢性腎病定義為持續三個或三個月以上之腎損傷或腎小球濾過率(GFR)減少。CKD之其他標示亦已知且用於診斷。一般而言，伴有不可逆硬化及腎元損失之腎團塊破裂導致GFR進行性降低。近來，K/DOQI公開了CKD之階段之分類，如下：
階段1：腎損傷伴有正常或增加之GFR(>90 mL/min/1.73 m2)
階段2：輕度之GFR減少(60至89 mL/分鐘/1.73 m2)
階段3：中度之GFR減少(30至59 mL/分鐘/1.73 m2)
階段4：重度之GFR減少(15至29 mL/分鐘/1.73 m2)
階段5：腎衰竭(GFR<15 mL/分鐘/1.73 m2或透析)
在階段1及2 CKD中，單獨GFR無法確認診斷。可信賴於腎損傷之其他標示，包括血液或尿液之組成異常或成像測試異常。
CKD之病理生理學
約有1百萬個腎元存在於各腎中，每一者均有助於總GFR。無關於腎損傷之病因，在腎元進行性破壞之情況下，腎臟能夠藉由剩餘健康腎元之超微過濾及代償性肥大來維持GFR。此腎元適應性使血漿溶質之正常清除持續，以致諸如尿素及肌酸酐之物質僅在總GFR減少至50%之後、當腎儲備已排空時即開始展示在血漿含量中顯著增加。血漿肌酸酐值在GFR減少50%之情況下將大致加倍。因此，患者之血漿肌酸酐自0.6 mg/dL之基線值至1.2 mg/dL之加倍實際上表示功能腎元團塊損失50%。
殘餘腎元超微過濾及肥大雖然出於所示原因有益，但咸信其表示進行性腎功能障礙的主要起因。咸信此係因增加之腎小球毛細管壓力而發生，增加之腎小球毛細管壓力損傷毛細管且最初導致局部及區段性腎小球硬化且最終導致全面腎小球硬化。此假設基於對六分之五之腎切除大鼠的研究，該等大鼠發生與具有CKD之人類中觀測到之病變相同的病變。
慢性腎病之兩種最常見起因為糖尿病及高血壓。其他因子包括來自腎毒素(包括造影劑)或減少灌注之急性損傷；蛋白尿；增加之腎產氨作用伴間質損傷；高脂質血症；出現磷酸鈣沈積之高磷酸鹽血症；氧化亞氮含量降低；及吸菸。
在美國，CKD之發病率及患病率日漸升高，給衛生系統帶來不良結果及高成本。在美國腎病為第九大主要死亡原 因。高死亡率已導致US Surgeon General's mandate for America's citizenry,Healthy People 2010含有集中於CKD之章節。此章節之目標為明白表示目標且提供降低慢性腎病在美國之發病率、罹病率、死亡率及健康成本的策略。
自1989年以來末期腎病(ESRD)之發病率在國際上亦已與日俱增。美國之ESRD發病率最高，日本次之。日本之每百萬人口之患病率最高，美國次之。
與血液透析相關之死亡率為驚人的且表明參加血液透析之患者之預期壽命顯著地縮短。在每一年齡，患有ESRD、進行透析之患者當與不具有腎病之不透析患者及個體相比時具有顯著增加之死亡率。在60歲時，健康人可預期活超過20年，而開始血液透析之60歲患者之預期壽命為將近4年。
肺纖維化
間質肺纖維化(IPF)為由多種吸入劑(包括礦物粒子、有機灰塵及氧化性氣體)或由未知原因(特發性肺纖維化)所引起之肺疤痕。該疾病在世界範圍內折磨數百萬個體，且不存在有效治療方法。缺乏適用治療之主要原因在於，疾病幾乎沒有分子機制經充分定義可設計治療之適當目標(Lasky等人，2000,Environ Health Perspect；108：751-62)。
心臟纖維化
心臟衰竭在主要心血管病症之中為獨特的，這是由於當其他病況驚人地減少時其患病率獨自地增加。此一部分可歸結於美國及歐洲之人口老齡化。因為此等患者可能因心 臟之有害重塑而出現左心室功能障礙之進程，所以搶救患有心肌損傷之患者之能力亦為主要因子。
正常心肌由多種細胞、心臟肌細胞及非心肌細胞構成，非心肌細胞包括內皮及血管平滑肌細胞及纖維母細胞。
結構重塑心室壁為心臟病之臨床結果的關鍵決定子。該重塑涉及細胞外基質蛋白之產生及破壞、細胞增殖及移動、及細胞凋亡及壞死細胞死亡。心臟纖維母細胞與此等過程決定性相關，產生充當自分泌及旁分泌因子之生長因子及細胞因子以及細胞外基質蛋白及蛋白酶。近期研究顯示，心臟纖維母細胞與心肌細胞之間的交互作用對心臟重塑之進程必不可少，心臟重塑之淨效應為心臟功能退化及心臟衰竭發作(Manabe等人，2002,Circ Res.13：1103-13)。
灼傷及疤痕
尤其在纖維變性疾病中可能出現之特定問題為組織之攣縮，例如疤痕之攣縮。包括細胞外基質組分之組織、尤其包括膠原蛋白之組織的攣縮可能連同多種不同病理性病況及手術或美容程序一起出現。例如疤痕之攣縮可能導致身體的問題，其可能導致需要醫療或其可能導致純粹美容性質之問題。膠原蛋白為疤痕及其他攣縮組織之主要組分且因此被視為最重要的結構組分。然而，疤痕及其他攣縮組織亦包括亦可促進組織之攣縮之其他結構組分、尤其其他細胞外基質組分(例如彈性蛋白)。
包括膠原蛋白之組織(其亦可包括其他細胞外基質組分) 之攣縮經常發生於灼傷之癒合中。灼傷可為化學、熱或輻射灼傷且可在眼睛、皮膚表面或皮膚及底層組織中。亦可為例如由輻射治療所引起的體內組織上之灼傷之情況。灼傷組織之攣縮經常為問題所在且會導致身體及/或美容問題，例如運動能力喪失(loss of movement)及/或毀容。
皮移植片可出於各種原因而應用且經常會經歷應用後之攣縮。如同灼傷組織之癒合一樣，攣縮會導致身體及美容問題。在需要許多皮移植片時、如例如在嚴重燒傷情況下，攣縮為尤其嚴重問題。
攣縮亦為製造人造皮膚之一問題。為了製造真實人造皮膚，必須具有由上皮細胞(角質細胞)製造之表皮及由填有纖維母細胞之膠原蛋白製造之真皮。兼具有兩種類型之細胞至關重要，這是因為其使用生長因子信號傳導且刺激彼此。人造皮膚之膠原蛋白組分在由纖維母細胞填充時通常攣縮為小於其起始面積的十分之一。
瘢痕攣縮、因疤痕之纖維組織之收縮所致之攣縮較為常見。在一些情況下，疤痕會變為惡性瘢痕，即攣縮導致嚴重變形的疤痕。患者之胃可藉由在胃潰瘍癒合時所形成之疤痕組織之攣縮在沙漏狀(hour-glass)攣縮中有效地分成兩個獨立腔室。通道及導管之阻塞、瘢痕性狹窄會因疤痕組織之攣縮而出現。血管之攣縮可能因原發性阻塞或手術創傷所致，例如在手術或血管成形術後出現。亦會出現其他空腔臟器(hollow visci)(例如輸尿管)之狹窄。問題會在無論由意外創傷抑或手術產生之任何形式之疤痕出現時出 現。涉及包括膠原蛋白之組織之攣縮的皮膚及腱之病況包括：由手術或意外事故(例如手或腳腱損傷)產生之創傷後病況；移植後病況；及病理性病況，諸如硬皮病、杜普宜特朗氏攣縮(Dupuytren's contracture)及大皰性表皮鬆解。眼睛中之組織之疤痕及攣縮會出現於各種病況(例如視網膜脫落或糖尿病性眼病(如上所述)之後遺症)中。若存在創傷或發炎性損傷，則會出現就眼球及相關結構(包括眼外肌肉及眼瞼)而言之顱骨中可見之窩(socket)之攣縮。組織在窩內攣縮，導致多種問題，包括複視及難看的外觀。
關於不同類型之纖維化的其他資訊，請參見：Molina V等人，2002,Harefuah,141：973-8,1009；Yu等人，2002,Curr Opin Pharmacol.2(2)：177-81；Keane等人，2003,Am J Kidney Dis.41：S22-5；Bohle等人，1989,Pathol Res Pract.185：421-40；Kikkawa等人，1997,Kidney Int Suppl.62：S39-40；Bataller等人，2001,Semin Liver Dis.21：437-51；Gross等人，2001 N Engl J Med.345：517-25；Frohlich,2001,Am J Hypertens；14：194S-199S；Friedman,2003,J Hepatol.38：S38-53；Albanis等人，2003,Curr Gastroenterol Rep.5：48-56；Weber,2000,Curr Opin Cardiol.15：264-72)。
遞送核酸分子及醫藥調配物
適用於遞送核酸之類視色素或類視色素結合物處於其中其溶解於可溶解或保持其之介質中或與可溶解或保留其之介質混合的情形下。
任何類視色素或類視色素結合物可用於本說明書中，只要其藉由星狀細胞積極地聚集即可；類視色素之實例包括(但不限於)維甲酸、阿達帕林、視黃醇棕櫚酸酯，且尤其為維生素A、飽和維生素A、視黃酸及視網膜。類視色素結合物之實例包括PEG-類視色素結合物。本說明書利用星狀細胞積極地結合類視色素及/或類視色素結合物之性質，且藉由使用類視色素及/或類視色素結合物作為藥物載劑或藉由與另一藥物載劑組分結合或包括於另一藥物載劑組分中，將所要物質或物體(body)特異性輸送至星狀細胞。類視色素為具有其中四個類異戊二烯單元以頭對尾方式鍵結之骨架(skeleton)之一類化合物的成員。參見G.P.Moss,「Biochemical Nomenclature and Related Documents」，第2版本，Portland Press，第247頁至第251頁(1992)。維生素A為定性展示視黃醇之生物活性之類視色素的通用描述詞。本說明書中之類視色素促進特異性物質遞送至癌細胞及CAF(亦即，在此等細胞處靶向該物質)。該種類視色素不受特別限制，且其實例包括視黃醇、維生素A、飽和維生素A、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸之酯、脂族醇與視黃酸之酯、依曲替酯(etretinate)、維甲酸、異維甲酸、阿達帕林、阿曲汀(acitretine)、他紮羅汀(tazarotene)、及視黃醇棕櫚酸酯、及維生素A類似物(諸如芬維A胺(fenretinide)及貝瑟羅汀(bexarotene))。類視色素結合物包括PEG-結合物，例如以下結構中所示之diVA-PEG-diVA。
因此，本說明書之藥物載劑可含有除類視色素及/或類視色素結合物以外之藥物載劑組分。該種組分不受特別限制，且醫學及製藥領域已知之任何組分均可使用，但其較佳能夠包括類視色素及/或類視色素結合物。該種組分之實例包括脂質，例如磷脂，諸如甘油磷脂；鞘脂，諸如鞘磷脂；固醇，諸如膽固醇；植物油，諸如大豆油或罌粟子油；礦物油；及卵磷脂，諸如蛋黃卵磷脂，但實例不限於其。其中，可形成脂質體之組分較佳，例如為天然磷脂，諸如卵磷脂；半合成磷脂，諸如二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)及二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)；及膽固醇。
此外，本說明書之藥物載劑可含有改良於星狀細胞之併入之物質，例如視黃醇結合蛋白(RBP)。
類視色素及/或類視色素結合物與本說明書之藥物載劑之結合或包括亦可藉由以化學及/或物理方法使類視色素及/或類視色素結合物與藥物載劑之另一組分結合或包括來進行。或者，類視色素及/或類視色素結合物與本說明書之藥物載劑之結合或包括亦可藉由在製備藥物載劑期間將具有形成親和力之類視色素及/或類視色素結合物及藥物載劑之基本組分混合至藥物載劑組分中來進行。結合至 本說明書之藥物載劑或包括於本說明書之藥物載劑中之類視色素及/或類視色素結合物之量以相對於藥物載劑組分之重量比形式可為0.01%至100%，較佳為0.2%至20%，且更佳為1%至5%。
核酸遞送系統可包括例如水性及非水性凝膠、乳膏、複合型乳劑(multiple emulsions)、微乳劑、脂質體、軟膏、水性及非水性溶液、洗劑、氣霧劑、烴基劑及粉末；且可含有賦形劑，諸如增溶劑、增滲劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇及胺基酸)及親水聚合物(例如聚卡波非(polycarbophil)及聚乙烯吡咯啶酮(polyvinylpyrolidone))。
在一個實施例中，醫藥學上可接受之載劑為脂質體或經皮增強劑。可用於本說明書中之脂質體之實例包括以下：˙CellFectin，陽離子脂質N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四棕櫚基-精胺及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1：1.5(M/M)脂質體調配物(GIBCO BRL)；˙Cytofectin GSV，陽離子脂質及DOPE之2：1(M/M)脂質體調配物(Glen Research)；˙DOTAP(N-[1-2,3-二油醯基氧基)-N,N,N-三-甲基-甲基硫酸銨)(Boehringer Manheim)；˙脂染胺(Lipofectamine)，聚陽離子脂質DOSPA、中性脂質DOPE(GIBCO BRL)及二-烷基化胺基酸(DiLA2)之3：1(M/M)脂質體調配物；˙Lipotrust，O,O'-二-十四醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)、膽固醇及二油醯基磷 脂醯乙醇胺之4：3：3(M/M)脂質體調配物(Hokkaido System Science)。DC-6-14由以下結構構成。
其他脂質可適用：永久陽離子脂質及可離子化之陽離子脂質，包括： 及PEG-脂質，包括：˙1,2-二肉豆蔻烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DMPE)、˙1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DPPE)、˙1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DSPE)或˙1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DOPE)及/或 ˙PEG-神經醯胺。
遞送系統可包括貼片、錠劑、栓劑、子宮托、凝膠劑及乳膏；且可含有賦形劑，諸如增溶劑及增強劑(例如丙二醇、膽汁鹽及胺基酸)；及其他媒劑(例如聚乙二醇、脂肪酸酯及衍生物、及親水聚合物(諸如羥丙基甲基纖維素及玻尿酸))。
本說明書之藥物載劑可呈任何形式，只要所要物質或物體可輸送至目標星狀細胞即可，且形式之實例包括(但不限於)聚合物微胞、脂質體、乳液、微球體及奈球體。此外，本說明書之藥物載劑可包括欲輸送之物質於其內部、附於欲輸送之物質之外部或與欲輸送之物質混合，只要包括於其中之類視色素及/或類視色素結合物在其最終到達星狀細胞之前至少部分暴露於製劑之外部即可。
本說明書之藥物載劑特異性靶向星狀細胞且使所要效應實現，諸如藉由向星狀細胞有效地輸送所要物質或物體(諸如用於控制星狀細胞之活性或生長之藥物)來最大效應及最小副效應地展現對纖維化之抑制或預防。本發明之藥物載劑遞送之物質或物體不受特別限制，但其尺寸較佳可使得在生物體中自投與部位物理移動至存在星狀細胞之肝、胰臟等。因此，本說明書之藥物載劑不僅可輸送物質，諸如原子、分子、化合物、蛋白或核酸；而且可輸送物體，諸如載體、病毒粒子、細胞、由一或多種成分組成之藥物釋放系統或微機器。物質或物體較佳具有施加一些對星狀細胞之效應的性質，且其實例包括標記星狀細胞者 及控制星狀細胞之活性或生長者。
因此，在本說明書之一個實施例中，其為藥物載劑遞送的用於控制星狀細胞之活性或生長之藥物。此可為直接或間接抑制與促進纖維化有關之星狀細胞之物理化學作用的任何藥物，且其實例包括(但不限於)TGFβ活性抑制劑，諸如截短型TGFβ II型受體及可溶TGFβ II型受體；生長因子製劑，諸如HGF及其表現載體；MMP產生啟動子，諸如含MMP基因腺病毒載體；TIMP產生抑制劑，諸如反義TIMP核酸；PPARγ配體、細胞活化抑制劑及/或細胞生長抑制劑，諸如血管緊張素活性抑制劑、PDGF活性抑制劑及鈉通道抑制劑；以及細胞凋亡誘導物，諸如化合物861及膠黴毒素；脂聯素(adiponectin)；及具有ρ激酶抑制活性之化合物，諸如(+)-反-4-(1-胺基乙基)-1-(4-吡啶胺甲醯基)環己烷。此外，在本說明書中，『用於控制星狀細胞之活性或生長之藥物』可為直接或間接促進與抑制纖維化直接或間接有關之星狀細胞之物理化學作用的任何藥物，且其實例包括(但不限於)用於促進膠原蛋白降解系統之藥物，例如MMP產生啟動子，諸如MMP表現載體；HGF、及具有HGF樣活性之藥物(諸如HGF類似物)、及其表現載體。
在本說明書中用於控制星狀細胞之活性或生長之藥物的其他實例包括用於控制細胞外基質(諸如膠原蛋白)之代謝之藥物，例如為具有抑制目標分子(諸如siRNA、核糖核酸酶及反義核酸(包括RNA、DNA、PNA及其複合物))之表現方面之效應之物質；具有顯著負效應之物質；及表現相同 之載體，其靶向例如由星狀細胞產生之細胞外基質成分分子或靶向一或多種具有產生或分泌細胞外基質成分分子之功能之分子。
本說明書亦係關於用於治療星狀細胞相關病症之醫藥，該醫藥含有藥物載劑及用於控制星狀細胞之活性或生長之藥物；且係關於藥物載劑之用途，其用於製造用於治療星狀細胞相關病症之醫藥組合物中。此處提及之星狀細胞相關病症意謂其中星狀細胞與病症之病程(亦即病症之發作、惡化、改良、減輕、治癒等)直接或間接有關的病症，且其實例包括肝病症，諸如肝炎(尤其慢性肝炎)、肝纖維化、肝硬化及肝癌；及胰臟病症，諸如胰臟炎(尤其慢性胰臟炎)、胰纖維化及胰臟癌。
在本說明書之醫藥中，藥物載劑可包括藥物於其內部、附於含藥物之物質之外部或與藥物混合，只要包括於藥物載劑中之類視色素及/或類視色素結合物在其最終到達星狀細胞之前至少部分暴露於製劑之外部即可。因此，視投與途徑或釋放藥物之方式而定，醫藥可以適當物質(諸如腸溶衣或隨時間崩解之物質)包覆或可併入適當藥物釋放系統中。
因此，本說明書包括藥物載劑或醫藥製劑套組，其含有一或多種含有藥物載劑成分、類視色素及/或類視色素結合物及/或藥物中之一或多者的容器，且亦包括以該種套組之形式提供的藥物載劑或醫藥之必需組分。除上述者之外，本說明書之套組可含有描述用於本說明書之藥物載劑 及醫藥之製備方法或投與方法的說明書等。此外，本說明書之套組可含有所有用於使本說明書之藥物載劑或醫藥完整之組分，但不必含有全部組分。因此，本說明書之套組不必含有可通常於醫療處、實驗設施等處購得之試劑或溶劑，諸如無菌水、鹽水或葡萄糖溶液。
本說明書此外係關於治療星狀細胞相關病症之方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之醫藥。此處提及之有效量為抑制目標病症發作、減少其症狀或預防其進展之量，且較佳為預防目標病症發作或治癒目標病症之量。其較佳亦為不導致超過投與之益處之反效應的量。該種量可按需要藉由使用培養細胞等活體外測試或藉由在模型動物(諸如小鼠、大鼠、狗或豬)中測試來測定，且該等測試方法為熟習此項技術者所熟知。
在本說明書之方法中，術語'個體'意謂任何活個體，較佳為動物，更佳為哺乳動物，且更佳為人類個體。在本說明書中，個體可為健康或受一些病症感染，且在治療預期病症之情況下，個體通常意謂受病症感染或具有受感染風險之個體。
此外，術語『治療』包括所有類型之出於對病症進行治癒、暫時性減輕、預防等目的的醫學上可接受之預防性及/或治療性干預。舉例而言，當病症為肝纖維化時，術語『治療』包括出於各種目的(包括延遲或中斷纖維化進展、使病變消退或消失、預防纖維化發作或預防復發)的醫學上可接受之干預。
本說明書亦係關於使用藥物載劑向星狀細胞遞送藥物之方法。此方法包括(但不限於)維持欲遞送之物質於藥物載劑上之步驟，及向含星狀細胞生物體或介質(諸如培養介質)投與或添加攜有欲遞送之物質之藥物載劑之步驟。此等步驟可按需要根據任何已知方法、本說明書中所述之方法等來達成。此遞送方法可與另一遞送方法(例如其中存在星狀細胞之器官為目標的另一遞送方法等)組合。
核酸分子可適用於單獨或與其他治療組合預防或治療纖維化(例如肝、腎、腹膜及肺部)疾病、性狀、病況及/或病症；及/或與細胞或組織中之hsp47之含量相關或對細胞或組織中之hsp47之含量起反應的任何其他性狀、疾病、病症或病況。核酸分子可包括遞送媒劑(包括脂質體)用於向個體投與載劑及稀釋劑及其鹽，且/或可存在於醫藥學上可接受之調配物中。
本說明書之核酸分子可包括表3中所示之序列。該等核酸分子之實例基本上由提供於表3中之序列組成。
核酸分子可經由肺部遞送(諸如藉由吸入藉由吸入裝置或噴霧器投與之氣霧劑或噴霧劑乾燥調配物)投與，使得可將核酸分子快速局部吸收至相關肺部組織中。含有微米尺寸化核酸組合物之可呼吸乾燥粒子之固體微粒組合物可藉由研磨乾燥或凍乾核酸組合物，且隨後使微米尺寸化組合物通過例如400網篩以分裂或分離出較大聚結物來製備。包含本說明書之核酸組合物之固體微粒組合物可視情況含有用來促進氣霧劑形成之分散劑以及其他治療性化合 物。適合分散劑為乳糖，其可以任何適合比率(諸如1比1重量比)與核酸化合物摻合。
液體粒子之氣霧劑可包括本文中所揭示之核酸分子，且可藉由任何適合設備(諸如用噴霧器)製備(參見例如美國專利第4,501,729號)。噴霧器為藉助於經由窄文托利(venturi)孔口加速壓縮氣體(通常空氣或氧氣)或藉助於超音波攪拌將活性成分之溶液或懸浮液轉化為治療性氣霧劑霧狀物的市售裝置。適用於噴霧器之適合調配物包括於液體載劑中之活性成分，其量為調配物之至多40% w/w，較佳小於20% w/w。載劑通常為水或稀酒精水溶液，較佳藉由添加例如氯化鈉或其他適合鹽使其與體液等張。若調配物並非製備為無菌，則視情況選用之添加劑包括防腐劑(例如羥基苯甲酸甲酯)、抗氧化劑、調味劑、揮發性油、緩衝劑及乳化劑及其他調配物界面活性劑。包括活性組合物及界面活性劑之固體粒子之氣霧劑可用任何固體微粒氣霧劑產生器同樣地製備。用於向個體投與固體微粒治療劑之氣霧劑產生器如以上所說明製備可呼吸粒子，且以適用於人類投與之速率產生大量含有預定劑量之治療性組合物的氣霧劑。固體微粒氣霧劑產生器之一種說明性類型為吹入器。用於藉由吹入投與之適合調配物包括可藉助於吹入器遞送之細碎粉末。在吹入器中，粉末(例如其有效實施本文中所描述之治療之定劑量)含於通常由明膠或塑膠製成、可當場刺穿或打開之膠囊或藥筒中，且粉末可藉由在吸入時流經裝置之空氣或藉助於人工操作泵遞送。用於吹入器中 之粉末可僅由活性成分組成，或由包含活性成分、適合粉末稀釋劑(諸如乳糖)及視情況選用之界面活性劑之粉末摻合物組成。活性成分通常包括調配物之0.1 w/w至100 w/w。第二類型之說明性氣霧劑產生器包括定劑量吸入器。定劑量吸入器為通常含有活性成分於液化推進劑中之懸浮液或溶液調配物的加壓氣霧劑分配器。在使用期間，此等裝置經由適合於遞送定體積之閥門排出調配物，產生含有活性成分之細粒噴霧劑。適合推進劑包括某些氯氟碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。調配物可另外含有一或多種共溶劑(例如乙醇)、乳化劑及其他調配物界面活性劑(諸如油酸或脫水山梨糖醇三油酸酯)、抗氧化劑及適合調味劑。其他用於肺部遞送之方法描述於例如US 20040037780、US 6592904、US 6582728及US 6565885中。WO 08132723係關於以氣霧劑形式向呼吸系統一般遞送寡核苷酸及尤其為遞送siRNA。
核酸分子可向中樞神經系統(CNS)或周邊神經系統(PNS)投與。實驗已表明，神經元可有效活體內吸收核酸。參見例如Sommer等人，1998,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,8：75；Epa等人，2000,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,10：469；Broaddus等人，1998,J.Neurosurg.,88：734；Karle等人，1997,Eur.J.Pharmocol.,340：153；Bannai等人，1998,Brain Research,784：304；Rajakumar等人，1997,Synapse,26：199；Wu-pong等人，1999,BioPharm, 12：32；Bannai等人，1998,Brain Res.Protoc.,3：83；及Simantov等人，1996,Neuroscience,74：39。因此，核酸分子可經遞送至CNS及/或PNS且由CNS及/或PNS中之細胞吸收。
遞送核酸分子至CNS係藉由多種不同策略提供。可使用之CNS遞送之傳統方法包括(但不限於)鞘內及腦室內投與；植入導管及泵；於損傷或病變部位處直接注射或灌注；注射至腦動脈系統中；或藉由化學或滲透開放血腦障壁。其他方法可包括使用各種輸送及載劑系統，例如經由使用結合物及生物可降解聚合物。此外，基因治療方法(例如如Kaplitt等人，美國專利第6,180,613號及Davidson,WO 04/013280中所述)可用於於CNS中表現核酸分子。
核酸分子可與聚伸乙基亞胺(例如直鏈或分支鏈PEI)及/或聚伸乙基亞胺衍生物(包括例如接枝PEI，諸如半乳糖PEI、膽固醇PEI、抗體衍生化PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物)調配或複合(參見例如Ogris等人，2001,AAPA PharmSci,3,1-11；Furgeson等人，2003,Bioconjugate Chem.,14,840-847；Kunath等人，2002,Pharm Res 19：810-17；Choi等人，2001,Bull.Korean Chem.Soc.,22：46-52；Bettinger等人，1999,Bioconjugate Chem.,10：558-561；Peterson等人，2002,Bioconjugate Chem.13：845-54；Erbacher等人，1999,J Gene Med 1：1-18；Godbey等人，1999.,PNAS,96：5177-81；Godbey等人，1999,J Controlled Release,60：149-60；Diebold等人， 1999,J Biol Chem,274：19087-94；Thomas等人，2002,PNAS,99,14640-45；及Sagara，美國專利第6,586,524號)。
核酸分子可包括生物結合物，例如如Vargeese等人，美國序號10/427,160；美國專利第6,528,631號；美國專利第6,335,434號；美國專利第6,235,886號；美國專利第6,153,737號；美國專利第5,214,136號；美國專利第5,138,045號中所述之核酸結合物。
本文中所揭示之組合物、方法及套組可包括表現載體，其包括以使得核酸分子可表現之方式編碼本說明書之至少一個核酸分子之核酸序列。引入核酸分子或一或多個能夠表現dsRNA之股之載體至細胞之環境中的方法將視細胞之類型及其環境之構成而定。核酸分子或載體構築體可直接引入細胞中(亦即胞內)；或胞外引入腔、間質間隙中、至生物之循環中；經口引入；或可藉由將生物或細胞浸浴於含有dsRNA之溶液中來引入。細胞較佳為哺乳動物細胞；更佳為人類細胞。表現載體之核酸分子可包括有義區及反義區。反義區可包括與編碼hsp47之RNA或DNA序列互補之序列，且有義區可包括與反義區互補之序列。核酸分子可包括具有互補有義區及反義區之兩個不同股。核酸分子可包括具有互補有義區及反義區之單股。
與目標RNA分子相互作用且下調編碼目標RNA分子(例如由本文中Genbank寄存編號提及之目標RNA分子)之基因的核酸分子可自插入DNA或RNA載體中之轉錄單元表現。 重組載體可為DNA質體或病毒載體。核酸分子表現病毒載體可基於(但不限於)腺相關病毒、反轉錄病毒、腺病毒或α病毒構築。能夠表現核酸分子之重組載體可如本文中所描述進行遞送且繼續存在於目標細胞中。或者，可使用提供核酸分子之短暫表現的病毒載體。該等載體可視需要重複投與。一旦經表現，則核酸分子經由RNA干擾(RNAi)限制且下調基因功能或表現。核酸分子表現載體之遞送可為全身性的，諸如藉由靜脈內或肌肉內投與；藉由向自個體外植之目標細胞投與，隨後再引入個體中；或藉由可允許引入所要目標細胞中之任何其他方法來實現。
表現載體可包括以使得核酸分子可表現之方式編碼本文中所揭示之至少一個核酸分子的核酸序列。舉例而言，載體可含有編碼包括雙螺旋體之核酸分子之兩股的序列。載體亦可含有編碼單一核酸分子之序列，其為自身互補的且因此形成核酸分子。該等表現載體之非限制性實例描述於Paul等人，2002,Nature Biotech 19,505；Miyagishi等人，2002,Nature Biotech 19,497；Lee等人，2002,Nature Biotech 19,500；及Novina等人，2002,Nature Med：10.1038/nm725中。表現載體亦可包括於哺乳動物(例如人類)細胞中。
表現載體可包括編碼兩個或兩個以上可為相同或不同之核酸分子之核酸序列。表現載體可包括與Genbank寄存編號NM_001235所提及之核酸分子互補之核酸分子的序列，例如表2中所示者。
表現載體可編碼核酸雙螺旋體之一或兩股或可自身雜交為核酸雙螺旋體之單一自身互補股。編碼核酸分子之核酸序列可以使得核酸分子可表現之方式可操作地連接(參見例如Paul等人，2002,Nature Biotech,19：505；Miyagishi及Taira,2002,Nature Biotech 19：497；Lee等人，2002,Nature Biotech 19：500；及Novina等人，2002,Nature Med,10.1038/nm725)。
表現載體可包括以下一或多者：a)轉錄起始區(例如真核pol I、II或III起始區)；b)轉錄終止區(例如真核pol I、II或III終止區)；c)內含子；及d)編碼至少一個核酸分子之核酸序列，其中該序列係以使得核酸分子可表現及/或遞送之方式可操作地連接於起始區及終止區。載體可視情況包括可操作地連接於編碼核酸分子之序列之5'側或3'側的蛋白之開放閱讀框架(ORF)；及/或內含子(介入序列)。
核酸分子序列之轉錄可由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)之啟動子驅動。來自pol II或pol III啟動子之轉錄物在所有細胞中均以高含量表現；既定細胞類型中之既定pol II啟動子之含量視附近存在之基因調節序列(增強子、靜止子等)之性質而定。倘若原核RNA聚合酶表現於適當細胞中，則亦使用原核RNA聚合酶啟動子(Elroy等人，1990,PNAS,87：6743-47；Gao等人，1993,Nucleic Acids Res 21：2867-72；Lieber等人，1993,Methods Enzymol.,217：47-66；Zhou等人，1990,Mol.Cell.Biol.10：4529-37)。數名研究者已證實， 自該等啟動子表現之核酸分子可在哺乳動物細胞中起作用(例如Kashani-Sabet等人，1992,Antisense Res.Dev.,2：3-15；Ojwang等人，1992,PNAS 89：10802-06；Chen等人，1992,Nucleic Acids Res.,20：4581-89；Yu等人，1993,PNAS,90：6340-44；L'Huillier等人，1992,EMBO J.,11：4411-18；Lisziewicz等人，1993,PNAS 90：8000-04；Thompson等人，1995,Nucleic Acids Res.,23：2259；Sullenger等人，1993,Science,262：1566)。更特定言之，轉錄單元(諸如自編碼U6小核(snRNA)、轉移RNA(tRNA)及腺病毒VA RNA之基因獲得者)適用於在細胞中產生高濃度之所要RNA分子(諸如siNA)(Thompson等人，前述；Couture及Stinchcomb,1996，前述；Noonberg等人，1994,Nucleic Acid Res.22：2830；Noonberg等人，美國專利第5,624,803號；Good等人，1997,Gene Ther.,4：45；Beigelman等人，國際PCT公開案第WO 96/18736號。上述核酸轉錄單元可併入多種用於引入哺乳動物細胞中之載體中，包括但不限於質體DNA載體、病毒DNA載體(諸如腺病毒或腺相關病毒載體)或病毒RNA載體(諸如反轉錄病毒或α病毒載體)(參見Couture及Stinchcomb,1996前述)。
核酸分子可由真核啟動子表現於細胞內(例如Izant及Weintraub,1985,Science,229,345；McGarry及Lindquist,1986,PNAS 83,399；Scanlon等人，1991,PNAS 88：10591-95；Kashani-Sabet等人，1992,Antisense Res.Dev.,2：3-15；Dropulic等人，1992,J.Virol.,66：1432-41； Weerasinghe等人，1991,J.Virol.,65：5531-34；Ojwang等人，1992,PNAS,89：10802-06；Chen等人，1992,Nucleic Acids Res.,20：4581-89；Sarver等人，1990 Science,247：1222-25；Thompson等人，1995,Nucleic Acids Res.,23：2259；Good等人，1997,Gene Therapy,4：45。熟習此項技術者認識到，任何核酸均可由適當DNA/RNA載體表現於真核細胞中。該等核酸之活性可藉由其自酶核酸之初級轉錄物釋放而增加(Draper等人，PCT WO 93/23569，及Sullivan等人，PCT WO 94/02595；Ohkawa等人，1992,Nucleic Acids Symp.Ser.,27：15-6；Taira等人，1991,Nucleic Acids Res.,19：5125-30；Ventura等人，1993,Nucleic Acids Res.,21：3249-55；Chowrira等人，1994,J.Biol.Chem.,269：25856。
包裝至病毒粒子中之病毒構築體既實現將表現構築體有效引入細胞中，又實現轉錄由表現構築體編碼之dsRNA構築體。
經口引入之方法包括將RNA與生物之食物直接混合；以及工程改造方法，其中用作食物之物質經工程改造以表現RNA，隨後喂給欲影響之生物。物理方法可用以將核酸分子溶液引入細胞中。引入核酸之物理方法包括注射含有核酸分子之溶液；藉由以核酸分子包覆之粒子轟擊；將細胞或生物浸泡於RNA之溶液中；或在核酸分子存在下電致孔細胞膜。
可使用此項技術中已知之將核酸引入至細胞的其他方 法，諸如脂質介導之載劑輸送、化學介導之輸送(諸如磷酸鈣)及其類似方法。因此，核酸分子可連同執行一或多個以下活動之組分一起引入：藉由細胞強化RNA吸收；促進雙螺旋體股之黏接；穩定化黏接之股；或者增強抑制目標基因。
劑量
如熟習此項技術者顯而易知，欲投與之適用劑量及特定投與模式將視如以下之該等因子而改變：細胞類型；或在活體內使用中，年齡、體重及欲治療之特定動物及其部位、所用特定核酸及遞送方法、所預期之治療性或診斷用途、及調配物之形式(例如懸浮液、乳液、微胞或脂質體)。一般而言，劑量係以較低量投與且加以增加直至達成所要效應。
當使用脂質來遞送核酸時，所投與之脂質化合物之量可變化且通常視所投與之核酸之量而定。舉例而言，脂質化合物與核酸之重量比較佳為約1：1至約30：1，約5：1至約10：1之重量比更佳。
核酸分子之適合劑量單位可在每日每公斤接受者體重0.001毫克至0.25毫克範圍內，或在每日每公斤體重0.01微克至20微克範圍內，或在每日每公斤體重0.01微克至10微克範圍內，或在每日每公斤體重0.10微克至5微克範圍內，或在每日每公斤體重0.1微克至2.5微克範圍內。
可引入適合量之核酸分子且此等量可使用標準方法憑經驗測定。在細胞環境中個別核酸分子物質之有效濃度可為 約1飛莫耳、約50飛莫耳、100飛莫耳、1皮莫耳、1.5皮莫耳、2.5皮莫耳、5皮莫耳、10皮莫耳、25皮莫耳、50皮莫耳、100皮莫耳、500皮莫耳、1奈莫耳、2.5奈莫耳、5奈莫耳、10奈莫耳、25奈莫耳、50奈莫耳、100奈莫耳、500奈莫耳、1微莫耳、2.5微莫耳、5微莫耳、10微莫耳、100微莫耳或100微莫耳以上。
每日每公斤體重約0.1 mg至約140 mg左右的劑量含量適用於治療以上指定之病況(每日每個體約0.5 mg至約7 g)。可與載劑物質組合產生單一劑型之活性成分之量視治療之主體及特定投與模式而改變。單位劑型通常含有約1 mg至約500 mg之間的活性成分。
應瞭解，用於任何特定個體之特定劑量視多種因素而定，包括所用特定化合物之活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與時間、投與途徑及排泄率、藥物組合及進行治療之特定疾病的嚴重程度。
包括本文中所揭示之核酸分子的醫藥組合物可每日一次、每日四次、每日三次、每日兩次、每日一次或以任何間隔時間投與且持續醫學上適當之任何持續時間。然而，治療劑亦可以含有兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上在一天期間依適當時間間隔投與之子劑量的劑量單位形式給藥。在彼情況下，含於各子劑量中之核酸分子可相應地較小以便達成總日劑量單位。劑量單位亦可經混配為用於數天內之單次劑量，例如可使用在數天時間內提供dsRNA之持續及一致釋放的習知持續釋放調配物。持續釋 放調配物為此項技術中所熟知。劑量單位可含有相應多個日劑量。組合物可以使得多個單位之核酸之總量一起含有足夠劑量的方式混配。
醫藥組合物、套組及容器
亦提供包括如本文中所提供的用於減少hsp47表現之核酸分子(例如siNA分子)之組合物、套組、容器及調配物，其用來向患者投與或分配該核酸分子。套組可包括至少一個容器及至少一個標籤。適合容器包括例如瓶、小瓶、注射器及試管。容器可由多種材料(諸如玻璃、金屬或塑膠)形成。容器可容納胺基酸序列、小分子、核酸序列、細胞群體及/或抗體。在一個實施例中，容器容納用於檢驗細胞之mRNA表現圖譜的聚核苷酸以及用於此目的之試劑。在另一實施例中，容器包括在評估hsp47蛋白表現細胞及組織中、或出於相關實驗室、預後、診斷、預防性及治療性目的使用之抗體、其結合片段或特異性結合蛋白；該等用途之指示及/或說明可包括於該等容器上或與該等容器一起包括在內，出於此等目的使用之試劑及其他組合物或工具亦如此。套組可進一步包括相關指示及/或說明；出於該等目的使用之試劑及其他組合物或工具亦可包括在內。
容器可替代性地容納可有效治療、診斷、預後或預防病況之組合物且可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之活性劑可為能夠特異性結合hsp47且/或調控hsp47之功 能的核酸分子。
套組可進一步包括第二容器，其包括醫藥學上可接受之緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及/或右旋糖溶液)。其可進一步包括自商業及使用者立.場出發所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、攪拌器、針、注射器及/或具有使用指示及/或說明之包裝插入物。
在使用之前包裝核酸分子之單位劑量安瓿或多劑量容器可包括封入一定量之聚核苷酸或含有聚核苷酸之溶液的密封容器，該量適用於其醫藥學上有效劑量或多個有效劑量。聚核苷酸係以無菌調配物形式包裝，且密封容器經設計以保持調配物之無菌狀態直至使用。
其中聚核苷酸包括編碼細胞免疫反應元件或其片段之序列的容器可包括貼有標籤之包裝，且標籤可帶有呈由政府機構(例如食品藥物管理局)指定之形式的注意事項，該注意事項反映該機構根據聯邦法對製造、使用或銷售其中用於人類投與之聚核苷酸物質的批准。
聯邦法要求，使用醫藥組合物治療人類需經聯邦政府之機構批准。在美國，實踐為食品藥物管理局的職責，其頒佈保護該批准之適當法規，詳述於21 U.S.C.§ 301-392中。生物物質(包括由動物之組織製成之產品)之法規係根據42 U.S.C.§ 262提供。類似批准為大多數外國所需。法規在各國間不同，但個別程序為此項技術者所熟知，且因此本文中所提供之組合物及方法較佳應遵守。
欲投與之劑量在較大程度上視治療之個體之病況及大小以及治療頻率及投與途徑而定。延續治療之方案(包括劑量及頻率)可由初始反應及臨床判斷指導。注射至組織之間質間隙中之非經腸途徑較佳，但其他非經腸途徑(諸如吸入氣霧劑調配物)可為諸如向鼻、咽喉、支氣管組織或肺之黏膜之特定投與所需。
因此，本文中提供一種醫藥產品，其可包括呈於醫藥學上可接受之可注射載劑中之溶液形式的聚核苷酸，該聚核苷酸包括編碼細胞免疫反應元件或其片段之序列且適用於間質性引入組織中以導致組織之細胞表現細胞免疫反應元件或其片段；封入溶液之容器；及與容器相關、呈由政府機構指定來規定製造、使用或銷售醫藥品之形式的注意事項，該注意事項反映該機構對製造、使用或銷售用於人類投與之聚核苷酸溶液的批准。
適應症
本文中所揭示之核酸分子可用於單獨或與其他治療組合治療與hsp47相關之疾病、病況或病症，諸如肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、腎纖維化、腹膜纖維化、慢性肝損傷及原纖維形成及與細胞或組織中之hsp47含量相關或將對細胞或組織中之hsp47含量起反應的任何其他疾病或病況。因此，本文中所揭示之組合物、套組及方法可包括包裝本文中所揭示之核酸分子，其包括標籤或包裝插入物。標籤可包括使用核酸分子之適應症，諸如用於單獨或與其他治療組合治療或預防肝纖維化、腹膜纖維化、腎纖維化 及肺纖維化及與細胞或組織中之hsp47含量相關或將對細胞或組織中之hsp47含量起反應的任何其他疾病或病況。標籤可包括適用於減少hsp47表現之適應症。「包裝插入物」係用於指通常包括於治療產品之商業包裝中含有關於適應症、用法、劑量、投與、禁忌、與包裝產品組合之其他治療產品及/或關於該等治療產品之使用之警告等之資訊的說明。
熟習此項技術者應認識到，此項技術中已知之其他抗纖維化治療、藥物及療法可與本文中之核酸分子(例如siNA分子)容易地組合且因此涵蓋於本文中。
現將參考以下非限制性實例更詳細地描述本文中所提供之方法及組合物。
實例1 製備用於gp46之siRNA
在用於靶向HSP47(即膠原蛋白(I型至IV型)之常見分子伴隨蛋白)之鹼基序列的siRNA識別之最佳序列之中，序列A及序列B係由iGENE Therapeutics,Inc.根據siRNA寡核苷酸設計程式(siRNA oligo design program)製備；序列C係使用Ambion,Inc.之siRNA Target Finder藉由在網際網路上搜尋且選擇將成為大鼠gp46(人類HSP47同系物，GenBank寄存編號M69246)之目標的19個鹼基序列而製備。當進行設計時，注意以下：自起始密碼子下游75至100個鹼基處開始，安置第一AA二聚體，且確保GC含量為30%至70%。在此實例中，製備具有如下序列之siRNA。
A：GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAAC
B：CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGC
C：GAAACCUGUAGAGGCCGCA
實例2 藉由所製備之siRNA抑制gp46表現
以0.1 nM至50 nM siRNA轉染正常大鼠腎細胞(NRK細胞)(其具有大鼠gp46且為產生膠原蛋白之纖維母細胞)且培養12至48小時(圖1)。藉由西方墨點法檢查gp46之表現之量(圖2至圖4，上帶對應於gp46，下帶對應於肌動蛋白對照物)。與媒劑相比，所有siRNA均顯著地抑制gp46蛋白之表現(圖2)。在以下實驗中，使用展示強效應之siRNA序列A。siRNA之抑制為濃度相關的(圖3)；gp46之蛋白表現在48小時由50 nM siRNA抑制約90%(圖4)。
實例3 藉由所製備之siRNA抑制膠原蛋白合成
為了檢驗合成之膠原蛋白之量，在上述條件(siRNA濃度50 nM，時間48小時)下添加3H-脯胺酸至大鼠纖維母細胞(NRK細胞)之培養物上清液，且在轉染之後檢驗所分泌蛋白中之3H之量(圖5)。根據Peterkofsky等人，1971 Biochemistry 10：988-94，當在3H-脯胺酸存在下培養gp46siRNA轉染之纖維母細胞時，自上清液中之所分泌蛋白與由膠原蛋白酶降解之蛋白之比率計算合成之膠原蛋白之量。
膠原蛋白合成率=膠原蛋白酶-敏感分值×100(5.4×膠原蛋白酶-不敏感分值+膠原蛋白酶-敏感分值)
大鼠纖維母細胞中之膠原蛋白合成率與對照組相比降低約40%(圖6)。
實例4 將核酸特異性轉染為HSC
藉由混合GFP表現質體及藉由混合10%維生素A(VA)及脂質體所形成之包封脂質體之VA來製備乳液(VA-Lip-GFP)。將含有4：3：3莫耳比之作為陽離子脂質之O,O'-二-十四醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)、膽固醇及二油醯基磷脂醯乙醇胺的陽離子脂質體溶解於氯仿-甲醇混合物(4：1，v：v)中，且藉由在真空下蒸發移除溶劑。將脂質與9%蔗糖水溶液混合且在60℃下水合且均質化至均一。經由具有0.22 μm微孔尺寸之聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluroide)膜過濾器擠壓分散液兩次。將分散液等分試樣至玻璃小瓶中且冷凍且隨後凍乾。在使用之前，在渦動下用蒸餾水以1 mM DC-6-14之濃度復原經乾燥脂質體。特定言之，首先將25 mg維生素A溶解於87 μL DMSO中，因此得到100 mM儲備溶液。為製備偶合VA之脂質體，在室溫下藉由渦動將200 nmol溶解於DMSO中之VA與100 nmole DC-6-14混合。向大鼠門靜脈內投與VA-siRNA-脂質體，收集肝組織且固定。藉由假定200 g大鼠之血漿之量為約10 mL且設定門靜脈血液中之VA及GFP之濃度為10 μM製備乳液。將1 μL此VA儲備溶液與10 μL VA-脂質體及179 μL PBS混合，進一步向其添加10 μg GFP表現質體，得到總共200 μL，且渦動混合物三分鐘，得到VA-Lip-GFP。打開SD大鼠之腹部，且將VA-Lip-GFP緩慢注射至周邊門靜脈中。在注射四十八個小時之後，收集肝組織。因為與其他肝細胞相比，中間絲結蛋白特異性表現 於HSC中，所以當固定時，以Alexa Fluor 568標記之抗結蛋白抗體將肝組織染色，且檢驗具有GFP之螢光雙像，證實GFP表現於HSC內(圖7)。在未處理對照組及接受投與單獨GFP表現質體載體之組中，未觀測到大鼠HSC之表現，但在接受投與VA-Lip-GFP之組中，觀測到GFP特異性表現於星狀細胞中。
實例5 定量分析核酸轉染率
以與實例4相同之方式，但使用FITC標記之gp46siRNA替代GFP表現質體，製備含有包封VA之脂質體及FITC標記之gp46siRNA的乳液(VA-Lip-gp46siRNA(FITC))。在室溫下在攪拌下添加siRNAgp46(580 pmole/μl於蒸餾水中)之溶液至實例4之偶合VA之脂質體溶液。siRNA與DC-6-14之比率為1：11.5(mol/mol)且siRNA與脂質體比率(wt/wt)為1：1。藉由使用VIVASPIN濃縮器，30K MWCO微分配藉由三個通道(pass)來移除游離VA或siRNA。以PBS復原薄膜上所截獲之物質且向SD大鼠門靜脈內投與(10 μg siRNA之量/200 μL)。在投與四十八個小時之後，收集肝組織，以Alexa Fluor 568標記之抗αSMA抗體將αSMA(平滑肌肌動蛋白)(其與其他肝細胞相比特異性表現於HSC中)染色，以DAPI將細胞核染色，且藉由共焦雷射掃描顯微鏡(LSM)檢驗螢光圖像。如圖8之左手邊所示，在接受投與VA-Lip-gp46siRNA(FITC)之組中，觀測到大量既因FITC而發射綠色螢光又因Alexa Fluor 568而發射紅色螢光的細胞，且當藉由NIH Image進行定量分析(藉由自X1000螢光顯微鏡相片選擇任 何10個視野來計數細胞之數目)時，轉染效率為77.6%(10個視野之平均值)。相反，在接受投與不含有VA之Lip-gp46siRNA(FITC)之組中，轉染效率為14.0%之低值，且此外觀測到至除星狀細胞以外之細胞的轉染為3.0%(圖8之右手邊)。由以上結果發現，轉染至星狀細胞中之效率因包括VA而顯著增加。
實例6 藉由VA-Lip-gp46siRNA抑制gp46之表現
對於實例5中收集之另一部分組織，以Alexa Fluor 568標記之抗HSP47抗體將gp46染色且以DAPI將細胞核染色，且藉由共焦雷射掃描顯微鏡檢驗螢光圖像。如圖9中所示，觀測到，在接受投與VA-Lip-gp46siRNA之組中，gp46表現(其可以紅色螢光形式被觀測到(圖中之右手邊))與接受投與含有隨機siRNA之VA-Lip-隨機siRNA之對照組(其對gp46不具特異性)(圖中之左手邊)相比顯著減少。當以與實例7相同之方式使用NIH Image藉由自X1000螢光顯微鏡相片選擇任何十個視野來檢驗gp46陰性細胞之數目時，關於對照組之六個視野之平均值的表現抑制率為75%，極高。
實例7 治療LC大鼠(門靜脈內投與1)
根據Jezequel等人(Jezequel等人，1987,J Hepatol.5：174-81)之報導，使用二甲基亞硝胺(DMN)預備LC模型大鼠(圖10)。特定言之，每週連續三天向五週大之SD大鼠(雄性)投與1 mL/kg劑量之1% DMN(腹膜內投與)。如已報導，在第2週觀測到纖維增加，且在第4週此伴隨有觀測到顯著纖維化、肝小葉結構破裂及形成再生瘤的發現(圖 11)。隨後，藉由與實例4及實例5相同之方法，藉由調配gp46siRNA為脂質體且與10% VA混合來製備乳液(VA-Lip-gp46siRNA)，且投與。在第3週開始投與VA-Lip-gp46siRNA，到此時觀測到充分纖維化，且在第4週及第5週進行評估。因為實例2證實活體外可觀測到效應持續至多48小時，所以每週兩次進行投與(圖11)。根據其中直接注射siRNA之報導(McCaffery等人，2002,Nature 418：38-39)測定所投與之量，且以siRNA總量形式為40 μg。投與siRNA後對肝臟偶氮卡紅(azan)染色後第4週時，接受投與鹽水之組、接受投與siRNA(隨機)之組及接受投與siRNA(gp46)之組之間不存在表觀差異，但在第5週，觀測到投與gp46siRNA之組中纖維數目減少(圖12)。為了定量分析纖維之量，使用NIH Image提取未染色部分，量測其面積(圖13)，且觀測到投與gp46siRNA之組中膠原蛋白面積顯著減小(圖14)。此外，為了使用另一量測評估纖維化程度，藉由標準方法定量量測為纖維化之指示劑之羥基脯胺酸之量。特定言之，在以HCl水解20 mg冷凍乾燥肝組織24小時之後，離心反應液體，且以諸如艾利希氏溶液(Ehrlich's solution)之試劑處理上清液且離心。回收上清液，且藉由量測560 nm下之吸光度量測肝組織中之羥基脯胺酸之量(Hepatology 1998,28：1247-52)。如圖15中所示，在接受投與gp46siRNA之組中，羥基脯胺酸之量變得極小。
實例8 治療LC大鼠(門靜脈內投與2)
此外，為了檢驗藉由投與本說明書之醫藥之存活率之變化，根據Qi Z等人(PNAS 1999；96：2345-49)之方法，使用比正常量增加20%之量之DMN來預備LC模型大鼠。在此模型中，在第一週及第二週進行總共四個門靜脈內投與。投與細節為：PBS、Lip-gp46siRNA、VA-Lip-隨機siRNA及VA-Lip-gp46siRNA(各組n=7)。在第三週後，所有對照組(接受投與PBS之組、接受投與VA-Lip-隨機siRNA之組及接受投與Lip-gp46siRNA之組)均死亡，但接受投與VA-Lip-gp46siRNA之組中7隻中有6隻存活下來(圖16)。此外，在對肝臟偶氮卡紅染色後第21天，觀測到投與gp46siRNA之組中纖維之數目表觀減少(圖17)。
實例9 治療LC大鼠(門靜脈內投與3)
在另一實驗中，如以下表2中所示，自第3週對根據Qi等人之方法及Ueki等人，1999,Nat Med.5：226-30之方法預備之LC模型大鼠(一週3次腹膜內投與之1% DMN 1 mg/kg)進行門靜脈內投與(各組n=6)。添加PBS至欲投與之各物質以使總體積為200 μL，且投與頻率為一週一次。
由結果可知，在除了接受投與本說明書之醫藥之組(治療組9-4)以外的組中，所有6隻大鼠到開始投與DMN後第45天均死亡，但在接受投與本說明書之醫藥之組中，除一個在第36天死亡之個例以外的所有個體在開始投與DMN之後均存活超過70天(圖18)。就死亡個體而言，以與實例7相同之方式基於膠原蛋白之面積定量分析肝纖維之量，且肝纖維之數目之增加藉由投與VA-Lip-gp46siRNA得到顯著抑制(圖19)。
實例10 治療LC大鼠(靜脈內投與)
如以下表中所示，自第3週起對以與實例9相同之方式預備之LC模型大鼠(一週3次腹膜內投與之1% DMN 1 μg/BW(g))進行靜脈內投與(各組n=6)。添加PBS至欲投與之各物質，以使總體積為200 μL。投與時間期長達至死亡，但就組10-4而言，長達至第7週且就組10-10而言長達至第6週。
由結果可知，在除了接受投與本說明書之醫藥之組(治療組10-4及治療組10-10)以外的組中，所有6隻大鼠在開始投與DMN後第45天均死亡，但在接受投與本說明書之醫藥 之組中，除一個其中在第45天治療組10-4中有兩隻大鼠死亡之個例以外，所有其他個體在開始投與DMN之後均存活超過70天(圖20及圖21)。就死亡個體而言，以與實例7相同之方式定量分析肝纖維之量，且肝纖維之數目之增加已藉由投與VA-Lip-gp46siRNA得到顯著抑制(圖22)。
上述結果顯示，本說明書之醫藥在預防及治療涉及星狀細胞之纖維化中極有效。
實例11 RBP(視黃醇結合蛋白)之改善結果
使用LI90(其為由人類HSC獲得之細胞株)檢驗RBP對VA-Lip-gp46siRNA轉染效率之影響。在培養期間將實例5中製備之100 nM VA-Lip-gp46siRNA(FITC)與各種濃度(亦即0%、0.1%、0.5%、1%、2%、4%或10%)之FBS(胎牛血清)一起添加至LI90且培育48小時，藉由LSM觀測螢光圖像，且藉由FACS定量分析併入個別細胞中之siRNA之量。FBS含有約0.7 mg/dL之RBP。如圖23中所示，FBS(RBP)造成siRNA轉染之量隨濃度變化而增加。隨後，在培養期間將100 nM VA-Lip-gp46siRNA(FITC)及4% FBS與10 μg(21.476 nmol)抗RBP抗體一起添加至LI90，且以同樣方式評估siRNA轉染效率。如圖24中所示，藉由RBP增加之轉染量會因添加抗RBP抗體而顯著減少。上述結果顯示，RBP可有效進一步強化本說明書之醫藥之轉染。
實例12 選擇hsp47核酸分子序列
使用數個電腦程式設計針對Hsp47之核酸分子(例如25個核苷酸之siNA)，該等電腦程式包括Whitehead Institute for Biomedical Research之siRNA、siRNA Design(Integrated DNA Technologies)、BLOCK-iT RNAi Designer(Invitrogen)、siDESIGN Center(Dharmacon)及BIOPREDsi(Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research,Novartis Research Foundation分部)。基於演算法以及人類與大鼠之間的序列同源性比較且選擇(參見表3)此等程式中之高計分siRNA之序列。藉由活體外阻斷分析來驗證候選序列。
考量數個參數來選擇核酸分子(例如21聚體siRNA)序列。例示性參數包括：˙熱力學穩定性(RISC偏向具有不太穩定的5'末端之股)˙30%至52% GC含量˙位置核苷酸偏好：(C/G)1NNNNNNNN(A/U)10NNNNNNNN(A/U)19其中N為任何核苷酸˙無推定之免疫刺激基元˙2-核苷酸3'突出物˙轉錄物內之siRNA之位置(較佳在cDNA區內)˙序列特異性(藉由使用BLAST檢查)˙藉由檢查SNP資料庫獲悉的單核苷酸之變化
基於前述方法設計具有25個核苷酸之iRNA序列。基於較小序列設計相應Dicer受質siRNA(例如26個核苷酸)，且藉由添加四個鹼基至有義股之3'末端及6個鹼基至反義股之5'末端來延伸25個核苷酸之siNA之目標位點。製得之Dicer受質通常具有25鹼基之有義股、具有不對稱鈍端及3' 突出物分子的27鹼基之反義股。不具有鹼基修飾(基礎序列(base sequence))及具有修飾(實驗序列)之有義股及反義股之序列提供於表3中。
實例13
為了篩檢針對人類及大鼠hsp47基因之各種siNA分子之效能，藉由慢病毒(lenti-viral)誘導人類HSP47 cDNA-綠色螢光蛋白(GFP)或大鼠GP46 cDNA-GFP構築體至293、HT1080、人類HSC株hTERT或NRK細胞株中來建立各種報導體細胞株。藉由針對GFP之siRNA進一步評估此等細胞株。量測剩餘螢光信號且針對零亂siRNA(Ambion)進行校正，隨後針對細胞活力進行校正。結果顯示針對GFP之siRNA在不同細胞株中不同程度上阻斷螢光(圖25)。293_HSP47-GFP及293_GP46-GFP細胞株因其轉染簡單且對螢光阻斷具敏感性而被選用於siHsp47篩檢。
在96孔組織培養盤中使用脂染胺RNAiMAX(Invitrogen) 以每孔1.5 pmol針對GFP之siNA以反向轉染方式轉染細胞。以每孔6,000個細胞接種細胞且與siNA複合物混合。在72小時培育之後在Synergy 2多功能微量盤讀取器(Multi-Mode Microplate Reader)(BioTek)上獲取螢光讀數。
在72小時培育之後根據指南使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析套組(Luminescent Cell Viability Assay Kit)(Promega)量測以siNA處理或不以siNA處理之細胞的生存力。針對以零亂siNA分子處理之樣品校正讀數。
實例14 評估siHsp47在報導體細胞株中對hsp47表現之抑制效率
藉由評估來自報導體GFP之螢光信號之變化，評估針對hsp47之siNA在293_HSP47-GFP及293_GP46-GFP細胞株中之抑制效率。如實例2中所述進行實驗。針對以零亂siRNA(Ambion)處理之細胞的螢光信號校正螢光信號，該零亂siRNA充當對照物。結果表明，所測試hsp47 siNA分子在兩種細胞株中均對抑制hsp47 mRNA有效。然而，針對GP46 mRNA之siNA(如2008 Sato等人論文中所公開)僅在293_GP46-GFP細胞株中有效。結果展示於圖26A至圖26B中。
使用實例2中所述之方法評估以針對hsp47及gp46之siRNA處理之293_HSP47-GFP及293_GP46-GFP細胞株的生存力。針對以零亂siRNA(Ambion)處理之細胞校正細胞活力。結果表明，細胞活力不因以siNA分子處理而受顯著影響。然而，以不同hsp47 siNA分子處理之293_HSP47-GFP 細胞株之細胞活力視所用siNA分子而改變，且293_GP46-GFP細胞株之生存力類似。293_HSP47-GFP細胞之生存力在經siHsp47-6及Hsp47-7處理之細胞中比其餘者低。結果展示於圖26 C-D中。
實例15 藉由TaqMan® qPCR評估siHsp47對hsp47 mRNA之抑制效應
在實例14中，藉由螢光信號之變化評估siHsp47在報導體細胞株中之阻斷效率。為了在mRNA含量下驗證結果，如實例13中所述使用脂染胺RNAiMAX(Invitrogen)將靶向內源性hsp47之siRNA以反向轉染方式轉染至人類HSC細胞株hTERT之細胞中。
評估hsp47 mRNA含量對各種所測試siHsp47 siNA分子之阻斷效率的影響。簡言之，在轉染72小時之後使用RNeasy微型套組(Qiagen)自hTERT細胞分離mRNA。使用TaqMan®探針藉由反轉錄聯同定量PCR來測定hsp47 mRNA之含量。簡言之，根據製造商說明使用大容量cDNA反轉錄套組(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)(ABI)進行cDNA合成，且經TaqMan基因表現分析(Gene Expression Assay)(ABI，hsp47分析ID Hs01060395_g1)。根據製造商說明書(ABI)，針對GAPDH mRNA之含量校正hsp47 mRNA之含量。結果表明，siHsp47-C在所有hsp47 siRNA之中最有效，siHsp47-2及siHsp47-2d其次最有效。siHsp47-1與siHsp47-2或siHsp47-1與siHsp47-2d之組合比單獨siHsp47-1更有效。結果展示於圖27中。
實例16 以蛋白質含量驗證siHsp47阻斷效應
藉由量測以不同siHsp47轉染之hTERT細胞中之HSP47，以蛋白質含量驗證不同Hsp47 siNA分子(siHsp47)對hsp47 mRNA表現之抑制效應。如實例13中所述進行以不同siHsp47對hTERT細胞之轉染。溶解經轉染之hTERT細胞且藉由離心澄清細胞溶解物。藉由SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分解經澄清細胞溶解物中之蛋白。使用抗HSP47抗體(Assay Designs)作為初級抗體、與HRP結合之山羊抗小鼠IgG(Millipore)作為二級抗體測定細胞溶解物中之HSP47蛋白之含量，且隨後藉由Supersignal West Pico化學發光套組(Chemiluminescence kit)(Pierce)偵測。使用抗肌動蛋白抗體(Abcam)作為蛋白內參考物。結果顯示，以單獨siHsp47-C、siHsp47-2d或siHsp47-1與sihsp47-2d之組合處理之細胞中之Hsp47蛋白之含量顯著減少。
實例17 藉由hsp47 siRNA下調膠原蛋白I表現
為測定siHsp47對膠原蛋白I表現程度之影響，量測以不同針對hsp47之siRNA處理之hTERT細胞中之膠原蛋白I mRNA含量。簡言之，如實例13中所述以不同siHsp47轉染hTERT細胞。溶解細胞，且72小時之後根據指南使用RNeasy微型套組(Qiagen)分離mRNA。使用TaqMan®探針藉由反轉錄聯同定量PCR來測定膠原蛋白1 mRNA之含量。簡言之，根據指南使用大容量cDNA反轉錄套組(ABI)進行cDNA合成，且經TaqMan基因表現分析(ABI，COL1A1分析ID Hs01076780_g1)。根據製造商說明書 (ABI)，針對GAPDH mRNA之含量校正膠原蛋白I mRNA之含量。針對由以零亂siNA轉染之細胞獲得之信號校正信號。結果顯示，膠原蛋白I mRNA含量在以一些候選物(siHsp47-2、siHsp47-2d及其與siHsp47-1之組合)處理之細胞中顯著減少，且展示於圖28中。
實例18 經hsp47 siRNA處理之hTERT細胞的免疫螢光染色
為使以siHsp47轉染或不以siHsp47轉染之hTERT細胞中的兩種纖維化標記(膠原蛋白I及α-平滑肌肌動蛋白(SMA))之表現可見，以兔抗膠原蛋白I抗體(Abcam)及小鼠抗α-SMA抗體(Sigma)將細胞染色。使用Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG及Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(Invitrogen (Molecular Probes))作為二級抗體以使膠原蛋白I(綠色)及α-SMA(紅色)可見。使用Hoescht以使細胞核(藍色)可見。結果指示siRNA阻斷一些目標基因與膠原蛋白/SMA表現之間的關係。
實例19 在肝纖維化之動物模型中活體內測試siHSP47
HSP47之siRNA雙螺旋體序列(siHSP47C)如下所列。
有義(5'->3') ggacaggccucuacaacuaTT
反義(5'->3') uaguuguagaggccuguccTT
藉由溶解於無核酸酶水(Ambion)中來製備10 mg/ml siRNA儲備溶液。如Sato等人(Sato Y.等人2008 Nature Biotech.26：431)所述，在治療肝硬化之大鼠中，將siRNA與偶合維生素A之脂質體一起調配，以便靶向產生膠原蛋 白之活化HSC。維生素A(VA)-脂質體-siRNA調配物由0.33 μmol/ml VA、0.33 μmol/ml脂質體(Coatsome EL,NOF Corporation)及0.5 μg/μl siRNA於5%葡萄糖溶液中構成。
以於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之0.5%二甲基亞硝胺(DMN)(Wako Chemicals,Japan)誘導四週大的雄性SD大鼠使其具有肝硬化。每週連續3天在第0、2、4、7、9、11、14、16、18、21、23、25、28、30、32、34、36、38及40天腹膜內投與每kg體重2 ml之劑量。
siRNA治療：自第32天進行siRNA治療且持續5個靜脈內注射。詳言之，在第32、34、36、38及40天以siRNA治療大鼠。隨後在第42天或第43天殺死大鼠。測試3個不同siRNA劑量(每kg體重1.5 mg siRNA、每kg體重2.25 mg siRNA、每kg體重3.0 mg siRNA)。
測試組之細節及各組中之動物數目如下：
1)藉由DMN注射誘導肝硬化，隨後注射5%葡萄糖替代siRNA(n=10)
2)VA-Lip-siHSP47C 1.5 mg/kg(n=10)
3)VA-Lip-siHSP47C 2.25 mg/kg(n=10)
4)VA-Lip-siHSP47C 3.0 mg/Kg(n=10)
5)假性(注射PBS替代DMN。注射5%葡萄糖替代siRNA)(n=6)
6)未處理對照組(完整)(n=6)
VA-Lip係指維生素A-脂質體複合物。
評估治療功效：在第43天，「患病大鼠」組中10個動物 中之2個及「VA-Lip-siHSP47C siRNA 1.5 mg/kg」中10個動物中之1個因肝硬化之發展而死亡。動物中剩餘者存活下來。在殺死大鼠之後，將肝組織固定於10%福馬林(formalin)中。隨後，將各肝之左小葉嵌入石蠟中供組織學用。以天狼星紅(Sirius red)及蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin，HE)將組織切片染色。採用天狼星紅染色以使膠原蛋白沈積物可見且測定肝硬化之程度。HE染色係用於細胞核及細胞質作為對比染色(counter-staining)。在顯微鏡(BZ-8000,Keyence Corp.Japan)下觀測各切片且藉由連接於顯微鏡之影像分析軟體測定每切片之天狼星紅染色面積之百分比。每肝至少製取4個切片用於影像分析，且藉由攝影機擷取各切片之整個面積(肝切片)且分析。藉由學生t測試(Student's t-test)進行統計分析。
結果：圖29展示纖維化面積。「患病大鼠」中之纖維化之面積大於「假性」或「未處理對照」組。因此，DMN處理誘導肝中之膠原蛋白沈積，其為肝纖維化之典型觀測結果。然而，與「患病大鼠」組相比，纖維化之面積因靶向HSP47基因之siRNA之治療而顯著減少(圖29)。此結果表明，如本文中所揭示之siRNA在實際疾病中具有治療功效。
在肝纖維化動物模型中測試其他siRNA化合物，且顯示可減少肝中之纖維化面積。
實例20 產生HSP47/SERPINH1之活性雙股RNA化合物之序列及製造表4、5、B、C、D及E中所示之siRNA
藉由黏接互補單股寡核苷酸產生雙螺旋體。在層流罩中，藉由稀釋於WFI(注射用水，Norbrook)中製備約500 μM單股寡核苷酸之儲備溶液。藉由使用WFI 1：200稀釋各500 μM ssRNA且使用Nano Drop量測OD來測定實際ssRNA濃度。重複該程序3次且計算平均濃度。隨後將儲備溶液稀釋至250 μM之最終濃度。藉由加熱至85℃且在至少45分鐘內使其冷卻至室溫來黏接互補單股。藉由在20%聚丙烯醯胺凝膠上測試5 μl且染色來測試雙螺旋體之完全黏接。樣品儲存於-80℃下。
表4、表5、表B、表C、表D及表E提供HSP47/SERPINH1之siRNA。對於各基因，存在一列各別的19聚體之siRNA序列，其係基於其在專有演算法中作為靶向人類基因表現之最佳序列的計分依優先次序排列。
以下縮寫用於本文表4、表5、表B、表C、表D及表E中：「其他物種(other spec或other Sp.)」係指其他動物情況下之交叉物種種類：D-狗，Rt-大鼠，Rb-兔，Rh-恆河猴(rhesus monkey)，P-豬，M-小鼠；ORF：開放閱讀框架。19聚體(表5、表B、表C)及18+1聚體(表4、表D、表E)分別係指19及18+1(U於反義股之位置1處，A於有義股之位置19處)個核糖核酸長的寡聚物。
適用於產生雙股RNA分子之siRNA寡核苷酸揭示於以下表4、表5、表B、表C、表D及表E中。
由進一步分析選擇最具活性之序列。自表4選擇siRNA化合物SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52及SERPINH1_86作為較佳之化合物(表6-A及表6B)。
自表5選擇siRNA化合物SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58及SERPINH1_88作為較佳之化合物(表7)。
實例21：纖維變性病況之動物模型系統
可在預測性動物模型中進行測試本說明書之活性siRNA。腎纖維化之大鼠糖尿病及衰老模型包括Zucker糖尿病肥脒(ZDF)大鼠、衰老fa/fa(肥脒Zucker)大鼠、衰老 史-道二氏(Sprague-Dawley，SD)大鼠及Goto Kakizaki(GK)大鼠；GK大鼠為自韋斯大鼠(Wistar rat)衍生之近親品系，選擇用於NIDDM(II型糖尿病)之自發性發展。腎纖維化之誘導模型包括永久單側輸尿管阻塞(UUO)模型，其為在健康非糖尿病性動物中出現之急性間質性纖維化模型；腎纖維化在阻塞之後數天內發生。腎纖維化之另一誘導模型為5/6腎切除術。
如以下參考文獻中所述，將兩個大鼠肝纖維化之模型膽管結紮(BDL)，假性手術作為對照；且CCl4毒化，橄欖油餵食動物作為對照：Lotersztajn S等人，Hepatic Fibrosis：Molecular Mechanisms and Drug Targets.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2004年10月07日；Uchio K等人，Down-regulation of connective tissue growth factor and type I collagen mRNA expression by connective tissue growth factor antisense oligonucleotide during experimental liver fibrosis.Wound Repair Regen.2004年1月至2月；12(1)：60-6；Xu XQ等人，Molecular classification of liver cirrhosis in a rat model by proteomics and bioinformatics Proteomics.2004年10月；4(10)：3235-45。
眼部疤痕之模型在此項技術中為熟知的，例如Sherwood MB等人，J Glaucoma.2004年10月；13(5)：407-12.A new model of glaucoma filtering surgery in the rat；Miller MH等人，Ophthalmic Surg.1989年5月；20(5)：350-7.Wound healing in an animal model of glaucoma fistulizing surgery in the Rb；vanBockxmeer FM等人，Retina.1985年秋至冬；5(4)：239-52.Models for assessing scar tissue inhibitors；WiedemannP等人，J Pharmacol Methods.1984年8月；12(1)：69-78.Proliferative vitreoretinopathy：the Rb cell injection model for screening of antiproliferative drugs。
白內障之模型描述於以下出版物中：Zhou等人，2002.Invest Ophthalmol Vis Sci.43：2293-300；Wang等人，2004 Curr Eye Res.29：51-58。
在此等纖維變性病況之模型中測試表5及表4之化合物，其中發現其在治療肝纖維化及其他纖維變性病況中有效。
青光眼之模型系統
在例如以下中所述之視神經擠壓之大鼠動物模型中進行測試本說明書之活性siRNA用於治療或預防青光眼：Maeda等人，2004 Investigative Ophthalmology and visual Science(IOVS),45：851。特定言之，就視神經橫切面而言，經由眶上方法暴露經麻醉大鼠之眼眶視神經(ON)，切斷腦膜且藉由用鉗子擠壓10秒，自篩板2 mm橫切ON中之所有軸突。
在此動物模型中測試如本文中所揭示之核酸分子且結果顯示此等siRNA化合物適用於治療及/或預防青光眼。
大鼠視神經擠壓(ONC)模型：玻璃體內siRNA遞送及滴眼劑遞送
就視神經橫切面而言，經由眶上方法暴露經麻醉大鼠之眼眶視神經(ON)，切斷腦膜且藉由用鉗子擠壓10秒，自篩 板2 mm橫切ON中之所有軸突。
單獨或以於5 μL體積(10 μg/μL)中之組合以滴眼劑形式遞送siRNA化合物。緊接著視神經擠壓(ONC)之後，向成年韋斯大鼠之一或兩個眼睛投與20 μg/10 μl測試siRNA或10 μl PBS，且測定注射後5小時及1天時及後來2天、4天、7天、14天及21天時吸收至切開及瞬間冷凍全視網膜中的siRNA之含量。進行類似實驗以便測試經由滴眼劑投與之siRNA之活性及功效。
大鼠肺移植後之缺血再灌注損傷之模型系統
如Mizobuchi等人，2004 J Heart Lung Transplantation,23及Kazuhiro等人，2001 Am.J.Respir.Cell Mol Biol,25：26-34中所述，在大鼠動物模型中達成肺局部缺血/再灌注損傷。
特定言之，在用異氟醚誘導麻醉之後，用14口徑鐵氟龍(Teflon)導管裝插管於氣管且使用100%氧氣用齧齒動物通風機以每分鐘70次呼吸之速率及2 cm H2O之正端呼吸壓力使大鼠機械換氣。用Castaneda夾鉗封閉左肺動脈、靜脈及主幹支氣管。在手術期間，用鹽水保持肺濕潤且覆蓋切口以將蒸發損失減至最小。局部缺血時期為60分鐘長。在缺血性時期結束時，移除夾鉗且在誘導肺局部缺血後另外4小時、24小時及5天時使肺換氣且再灌注。在實驗結束時，輕緩地收集肺，且將其冷凍用於RNA提取或固定於戊二醛混合液中用於後續組織學分析。
博萊黴素動物模型作為特發性肺纖維化(IPF)之模型
測試向健康小鼠及博萊黴素處理小鼠肺及肝遞送藉由靜脈內注射投與之以維生素A-Coatsome調配之siRNA及氣管內投與siRNA-維生素A-Coatsome複合物的可行性
目標：測試向正常及纖維變性小鼠肺遞送以維生素A-Coatsome調配之siRNA之兩種投與途徑的可行性。當前研究中欲測試之主要假設為全身性投與以維生素A-Coatsome調配之經修飾siRNA在纖維變性及正常小鼠肺中是否提供有效吸收及細胞特異性分佈。將同時測試以維生素A-Coatsome調配之經修飾siRNA之氣管內途徑。藉由原位雜交(ISH)進行肺及肝中之siRNA偵測及細胞特異性分佈。
在最近三十年內肺纖維化之博萊黴素模型已經良好發展且表徵(Moeller等人，2008 Int J Biochem Cell Biol,40：362-82；Chua等人，2005 Am J Respir Cell Mol Biol 33：9-13)。組織學特點(諸如肺泡內芽、膠原蛋白之壁併入及肺泡腔之閉塞)存在於類似於IPF患者的BLM處理動物中。早期研究表明，C57/Bl小鼠一貫有BLM誘導肺纖維化之傾向，而Balb/C小鼠為遺傳抵抗性。視投與途徑而定，不同纖維變性模式出現。氣管內滴注BLM導致細支氣管中心著重纖維化，而靜脈內或腹膜內投與誘導類似於人類疾病的胸膜下疤痕(Chua等人同上)。使用普通型間質性肺炎(UIP)之小鼠模型。此模型展示主要胸膜下分佈之纖維增殖的非均質分佈，形成類似於患有特發性肺纖維化(IPF)之患者之肺中所觀測到之病變的病變(Onuma等人，2001 J Exp Med 194：147-56，及Yamaguchi等人，1988 Nature 336：244-46)。藉由每隔一天持續7天腹膜內注射博萊黴素以在小鼠肺中產生恆定組成之胸膜下纖維增殖，從而誘導UIP(Swiderski等人，1998 Am J Pathol 152：821-28，及Shimizukawa等人，2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284：L526-32)。
含有siRNA的負載維生素A之脂質體經由RBP受體與視黃醇結合蛋白(RBP)相互作用且提供向HSC之有效遞送。此等脂質體由博萊黴素處理小鼠之肺中之RBP受體表現活化肌纖維母細胞有效吸收。
研究設計
小鼠-C57 Bl雄性
起始數目(BLM I.P.)-40(6個用於第一試驗組，34個用於研究，考慮到預期25%死亡率)
起始數目(總)-60
測試siRNA：本文中所揭示之SERPINHI化合物。
博萊黴素誘導之肺纖維化。藉由腹膜內滴注氯酸博萊黴素來誘導12週大雌性C57BL/6小鼠之肺纖維化：每隔一天持續7天，在第0、2、4及6天將每kg體重0.75 mg溶解於0.1 ml鹽水中。
纖維化之確定之試驗性評估。小鼠(N=30)成群地經BLM處理，使第一處理組(N=5)與其餘動物之間有一週時間間隔。在第14天，殺死第一組中之兩個小鼠且收集肺用於快速HE染色及快速組織病理學評估纖維化。在第一BLM處理後第14天，當肺纖維化得到證實時，將剩餘大鼠分組且以siRNA治療。萬一到第14天時在肺中未出現充分纖維化，則在第21天殺死第一處理組中之剩餘小鼠，隨後快速組織病理學評估纖維化。自BLM處理後第21天開始以測試siRNA複合物治療其餘動物。
siRNA投與。在第一BLM投與後第14天或第21天(TBD在研究期間，基於纖維化之確定之試驗性評估)，根據BW，將動物分組。向組1及組2中之動物以4.5 mg/kg BW之siRNA濃度經靜脈內投與(尾靜脈注射)siRNA/vitA/Coatsome複合物。以同樣方式治療同樣年齡之完整動物(組5及組6)。BLM處理動物(組9)將用作vitA-coatsome媒劑對照組。在24小時中，如上對所有動物重複注射。
以異氟醚使組3及組4中之BLM動物及組7及組8中之完整小鼠麻醉且使其經氣管內滴注調配於vitA負載之脂質體中的2.25 mg/kg BW siRNA。向BLM組10中之小鼠僅投與vitA/Coatsome媒劑。在24小時之後重複氣管內滴注。
研究終點。在第二siRNA複合物注射或滴注後2小時時殺死組1、組3、組5、組7、組9中之動物。在第二siRNA複合物注射或滴注後24小時時殺死組2、組4、組6、組8、組10中之動物。
一旦殺死動物後，則向小鼠經賁門灌注10%中性緩衝福馬林。以0.8 ml至1.0 ml 10% NBF使肺膨脹，且結紮氣管。切下肺且於10% NBF中固定24小時。自各動物收集肝且固定於10% NBF中24小時。
切片及評估。自肺及肝製取連續切片。首先以蘇木精及伊紅將第一連續切片染色用於評估肺及肝形態，以天狼星紅(三色染色法)將第二切片染色以識別膠原蛋白。使第三連續切片經原位雜交(ISH)來偵測siRNA。
實例22：含siRNA之VA結合脂質體的活體內抗肺纖維化活性
(1)誘導肺纖維化及投與藥物
在麻醉下藉由氣管內套管插入術(MicroSprayer,Penn-Century,Inc.)向雄性S-D大鼠(8個大鼠/組，8週大，Charles River Laboratories Japan,Inc.)肺中投與溶解於0.1 mL鹽水中之0.45 mg博萊黴素(BLM)一次，產生博萊黴素肺纖維化模型。以此方法，顯著纖維化通常在約2週之後出現於肺中。自博萊黴素投與2週後開始，經由尾靜脈向大鼠投與脂質體調配物(以siRNA之量形式1.5 mg/kg，以體積計1 ml/kg，亦即就200 g大鼠而言200 μl)或PBS(以體積計1 ml/kg)，持續總計十次(每隔一天)。在最後處理後兩天時 殺死大鼠，進行肺組織之組織學研究(參見圖30)。使用單因子ANOVA及Bonferroni多比較測試來評估統計上顯著差異。
(2)組織學研究
根據常規方法福馬林固定一部分移除之肺，且使其經偶氮卡紅染色(偶氮胭脂紅，苯胺藍橙G液)。如圖31中之偶氮卡紅染色之結果所示，在PBS投與組(疾病)中，觀測到以因大量藍漬膠原纖維所致之間隙擴大為特徵的顯著纖維變性圖像；而在調配物投與組(治療)中，纖維化顯然得以抑制。
如圖32中之組織學計分(T.Ashcroft計分)之結果所示，在調配物投與組(治療)中，纖維化計分顯著減少。
實例23：活體內減少HSP47 mRNA(DMN模型)
在短期肝損傷模型(稱為快速模型(Quick Model))中評估ND-L02-0101之活體內活性。在此模型中，由以肝毒劑(諸如二甲基亞硝胺(DMN))處理誘導之短期肝損傷伴隨有HSP47 mRNA含量升高。為誘導此等變化，以DMN腹膜內注射雄性史-道二氏大鼠連續六天。在DMN處理時期結束時，基於個別動物體重將動物隨機分組。在最後注射DMN一小時後以單IV劑量(0.375 mg/kg或0.75 mg/kg，反映siRNA劑量)形式投與ND-L02-0101。二十四小時後，切下肝葉且藉由定量RT-PCR(TaqMan)分析測定HSP47及GAPDH mRNA含量兩者。針對GAPDH含量校正HSP47 mRNA含量。如圖33中所示，偵測肝中之HSP47之穩固及 劑量依賴性mRNA減少。在單次劑量之0.75 mg/kg ND-L02-0101之後，觀測到HSP47 mRNA減少80%。即使在0.375 mg/kg之較低劑量下，亦可觀測到40%之顯著阻斷。
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本文中所提及或引用之論文、專利及專利申請案及所有其他文件及可電子獲得之資訊之內容均據此以全文引用的方式併入本文中，其引用程度就如同特定且各別地指示各個別公開案以引用的方式併入一般。
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熟習此項技術者顯而易知，可在不悖離本說明書之範疇及精神的情況下，對本文中所揭示之本說明書作出不同替代及修改。因此，該等其他實施例在本說明書及下列申請專利範圍之範疇之內。本說明書教示熟習此項技術者測試本文中所描述之化學修飾之各種組合及/或取代，從而產生具有介導RNAi活性之改良活性的核酸構築體。該改良活性可包括細胞反應介導RNAi之細胞反應的改良穩定性、改良生物可用性及/或改良型活化。因此，本文中所描述之特定實施例不具限制性，且熟習此項技術者易於瞭解，可不經過度實驗來測試本文中所描述之修飾之特定組合，從而識別具有改良RNAi活性之核酸分子。
適宜在不存在未在本文中特定揭示之任何要素、限制的情況下實踐本文中說明性描述之本說明書。因此，例如， 在描述本說明書之情形下(尤其在以下申請專利範圍之情形下)，除非本文中另外說明或明顯與上下文矛盾，否則術語「一個/種(a)」及「一個/種(an)」及「該(the)」及類似指示用詞應視為涵蓋單數及複數兩者。術語「包含」、「具有」、「包括」、「含有」等應以開放性含義來理解且不具限制性(例如意謂「包括(但不限於)」)。除非本文中另外說明，否則本文列舉之數值範圍僅意欲用作個別地指示屬於該範圍內之各各別值的速記方法，且各各別值如同其在本文中被個別列舉一般併入本說明書中。除非本文中另外說明或明顯與上下文矛盾，否則本文中所描述之所有方法均可以任何適合次序進行。除非另外主張，否則本文中所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅意欲更好地說明本說明書而非限制本說明書之範疇。說明書中之任何語言皆不應視為指示實踐本說明書所必需的任何未主張之要素。另外，本文中所用之術語及表述用作說明書之術語且不具限制性，且在使用該等術語及表述時不欲排除所示及所述特徵之任何等效形式或其部分，但應認識到可在所主張之本說明書之範疇內進行各種修改。因此，應瞭解，雖然本說明書已藉由較佳實施例及可選特徵加以特定揭示，但本文中所揭示之本說明書中所實施之修改及變化可由熟習此項技術者實施，且該等修改及變化視為屬於本說明書之範疇內。
本文中已廣泛及大體地描述了本說明書。屬於屬類揭示內容之較窄物種及亞屬分群每一者亦形成本說明書之一部 分。此包括本說明書之屬類描述，限制條件或否定限制為自屬類除去任何標的，無論切下之材料是否在本文中被明確列舉皆然。其他實施例屬於隨附申請專利範圍內。此外，在就馬庫西(Markush)群組而言描述本說明書之特徵及態樣時，熟習此項技術者將認識到亦藉此就馬庫西群組成員之任何個別成員或子群而言描述本說明書。
圖1為展示關於活體外使用NRK細胞評估gp46-siRNA之效應且測定最佳序列、時序及濃度之方案的圖。
圖2為展示gp46及肌動蛋白(24小時培養，檢驗最佳序列)之西方墨點分析結果的攝影圖。
圖3為展示gp46及肌動蛋白(24小時培養，檢驗最佳濃度)之西方墨點分析結果的攝影圖。
圖4為展示gp46及肌動蛋白(濃度50 nM，檢驗最佳培養時間)之西方墨點分析結果的攝影圖。
圖5為展示評估藉由NRK細胞中之gp46-siRNA抑制膠原蛋白表現之作用的方案之圖。
圖6為展示藉由siRNA抑制膠原蛋白合成之圖。
圖7為展示HSC特異性siRNA轉染之攝影圖。
圖8為評估HSC特異性siRNA轉染百分比之攝影圖。
圖9為評估藉由siRNA抑制gp46表現之攝影圖。
圖10為展示投與DMN之大鼠肝之偶氮卡紅染色的攝影圖。
圖11為展示LC大鼠治療方案之圖。
圖12為展示投與VA-Lip-gp46siRNA之LC大鼠肝之偶氮卡紅染色的攝影圖。
圖13為展示藉助於NIH Image提取染色部分之方法的圖(6個位置隨機取自偶氮卡紅染色圖像)。
圖14為展示肝組織學中之纖維變性部分所佔據面積之比率(膠原蛋白面積比率，%)的圖。
圖15為展示肝組織中之羥基脯胺酸之量的圖。
圖16為展示經門靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠之存活曲線的圖。
圖17為展示經門靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠的肝組織之偶氮卡紅染色的攝影圖。
圖18為展示經門靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠之存活曲線的圖。
圖19為展示經門靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠的肝組織之偶氮卡紅染色的攝影圖。
圖20為展示經靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠之存活曲線的圖。
圖21為展示經靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠之存活曲線的圖。
圖22為展示經靜脈內投與VA-Lip-gp46siRNA之肝硬化大鼠的肝組織之偶氮卡紅染色的攝影圖。
圖23為展示藉由RBP改良VA-Lip-gp46siRNA轉染效率之圖。
圖24為展示藉由抗RBP抗體抑制VA-Lip-gp46siRNA轉染 之圖。
圖25為展示GFP siNA對各種報導體細胞株之效應的條形圖。藉由在HEK293、人類纖維肉瘤細胞株HT1080、人類HSC株hTERT或NRK細胞株中慢病毒誘生人類HSP47 cDNA-GFP或大鼠GP46 cDNA-GFP構築體來建立細胞株。 將針對GFP之陰性對照siNA或siNA引入細胞中且量測GFP螢光。結果顯示，針對GFP之siNA在不同細胞株中於不同程度上阻斷螢光。293_HSP47-GFP及293_GP46-GFP細胞株因其容易轉染且對螢光阻斷具敏感性而被選用於siHsp47篩檢。
圖26A、26B、26C及26D為一系列展示293_HSP47-GFP及293_GP46-GFP細胞株中之各種siHsp47之細胞毒性及阻斷效率的條形圖。結果顯示，siHsp47-C、siHsp47-2及siHsp47-2d有效阻斷人類HSP47及大鼠GP46(人類hsp47同系物)兩者而實質上無細胞毒性。針對GP46之siGp46A不阻斷人類HSP47。另外，新設計之siHsp47在阻斷大鼠GP46方面優於siGp46A。
圖27為展示使用人類HSC細胞株hTERT藉由TaqMan® qPCR量測之各種siHsp47對hsp47 mRNA之阻斷效應的條形圖。Y軸表示hsp47之剩餘mRNA含量。HSP47-C在所測試之所有hsp47 siNA中最為有效。
圖28為展示不同hsp47 siNA對hTERT細胞中之膠原蛋白I表現之影響的條形圖。使用TaqMan®探針藉由即時定量PCR量測膠原蛋白I mRNA含量程度。Y軸表示膠原蛋白I之 剩餘mRNA表現度。結果顯示，膠原蛋白I mRNA含量在以一些候選物(siHsp47-2、siHsp47-2d及其與siHsp47-1之組合)處理之細胞中顯著減少。
圖29為展示以siHSP47處理之動物的肝之纖維化面積減小的圖。
圖30為實例22中所用之處理時程及評估方法的示意圖。
圖31展示在肺視野中之偶氮卡紅組織染色之結果。影像展示80X放大率下各組之偶氮卡紅染色部分之代表性肺視野。(a)預處理組(BLM IT-2W)；(b)患病大鼠(BLM IT-5W+PBS i.v.)；及(c)處理組(BLM IT+siRNA i.v.)；(d)假性組(鹽水-IT+PBS i.v.)。
圖32展示纖維化計分，展示在80X放大率下評估各大鼠之二十個隨機選擇之肺視野的結果。條形圖概括各組之偶氮卡紅染色部分之纖維化計分。用單因子ANOVA、Bonferroni多比較測試使用Prism5軟體進行統計分析。

Claims (47)

  1. 一種包含藥物載劑及雙股核酸分子之醫藥組合物，其中該藥物載劑包含星狀細胞特異性量之類視色素，且其中該雙股核酸分子包含以下結構： 其中N及N'各為可未經修飾或經修飾之核苷酸或為非習知部分；其中(N)x及(N')y各為寡核苷酸，其中各連續N或N'藉由共價鍵連接至下一N或N'；其中Z及Z'各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地包括1至5個連續核苷酸或非核苷酸部分或其組合，其共價連接於其所存在之股之3'末端處；其中z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於(N')y之5'末端處之封端部分；其中x及y各自獨立地為18與40之間的整數；其中(N')y之序列與(N)x之序列互補；且其中(N)x包括由SEQ ID NO：1例示之人類hsp47之mRNA編碼序列的反義序列。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中siRNA包含選自由以下組成之群之寡核苷酸序列：序列SEQ ID NOS：60及127(SERPINH1_2)、SEQ ID NOS：98及165(SERPINH1_45a)及SEQ ID NOS：101及168(SERPINH1_51)。
  3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該類視色素由選自由以 下組成之群之分子組成：維生素A、視黃酸、視黃醛、維甲酸、阿達帕林(adapalene)、視黃醇棕櫚酸酯及芬維A胺(fenretinide)(4-HPR)。
  4. 如請求項1之醫藥組合物，其中該藥物載劑進一步包含結合聚乙二醇分子之類視色素分子。
  5. 如請求項4之醫藥組合物，其中該結合聚乙二醇分子之類視色素分子為diVA-PEG-diVA。
  6. 如請求項1之醫藥組合物，其中該類視色素在該藥物載劑到達該星狀細胞之前至少部分暴露於該藥物載劑之外部。
  7. 如請求項1之醫藥組合物，其中該藥物載劑呈選自由以下組成之群之形式：聚合物微胞、脂質體、乳液、微球體及奈球體。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中該藥物載劑呈包含雙層脂質分子之脂囊泡形式。
  9. 如請求項8之醫藥組合物，其中該類視色素為該等脂質分子之0.2重量%至20重量%。
  10. 如請求項8之醫藥組合物，其中該等脂質分子包含HEDC。
  11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該等脂質分子包含S104。
  12. 如請求項1之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子暴露於該脂囊泡之外表面上。
  13. 如請求項1之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子係由該 脂囊泡包封。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子對核酸酶具有抗性。
  15. 如請求項1至14中任一項之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子之一個股包含SEQ ID NO：127且其第二股包含SEQ ID NO：60。
  16. 如請求項15之醫藥組合物，其中該反義股包含SEQ ID NO：127，且該有義股包含SEQ ID NO：60。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其中該反義股進一步包含經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置1、5、6或7中之至少一處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端之3'末端非核苷酸部分；且其中該有義股進一步包含至少一個2'-5'-核糖核苷酸或經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分。
  18. 如請求項16之醫藥組合物，其中該反義股進一步包含位置3、5、9、11、13、15、17及19處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；且其中該有義股進一步包含3'末端位置15、16、17、18及19處之五個連續2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。
  19. 如請求項16之醫藥組合物，其中該反義股進一步包含位置1、3、5、9、11、13、15、17及19處之經2'-O-甲基修 飾之核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3C3非核苷酸部分；且其中該有義股進一步包含共價連接於3'末端處之C3Pi非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。
  20. 如請求項16之醫藥組合物，其中該反義股進一步包含位置1、3、5、9、11、13、15、17及19處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且其中該有義股進一步包含3'末端位置15、16、17、18及19處之五個連續2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3Pi非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。
  21. 如請求項16之醫藥組合物，其中該反義股進一步包含位置1、3、5、9、11、13、15、17及19處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且其中該有義股進一步包含位置7、13、16及18處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基部分。
  22. 如請求項1至14中任一項之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子之一個股包含SEQ ID NO：98且其第二股包含SEQ ID NO：165。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其中該有義股包含SEQ ID NO：98且該反義股包含SEQ ID NO：165。
  24. 如請求項23之醫藥組合物，其中該有義股進一步包含3'末端處或3'末端附近位置之2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分；且該反義股進一步包含經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置5、6或7中之至少一處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。
  25. 如請求項23之醫藥組合物，其中該有義股進一步包含位置15、16、17、18及19處之2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3-OH 3'部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且該反義股進一步包含位置2、4、6、8、11、13、15、17及19處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置7處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
  26. 如請求項1至14中任一項之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子之一個股包含SEQ ID NO：101且其第二股包含SEQ ID NO：168。
  27. 如請求項1之醫藥組合物，其中該有義股包含SEQ ID NO：101且該反義股包含SEQ ID NO：168。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其中該有義股進一步包含經2'-O-甲基修飾之嘧啶核糖核苷酸；位置9或10中之一處視情況存在之2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之封端部分；且其中該反義股進一步包含經2'-O-甲基修飾之核糖核苷 酸；位置5、6或7中之至少一處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之非核苷酸部分。
  29. 如請求項27之醫藥組合物，其中該有義股進一步包含位置4、11、13及17處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置9處之2'-5'-核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且其中該反義股進一步包含位置1、4、8、11及15處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
  30. 如請求項27之醫藥組合物，其中該有義股進一步包含位置4、11、13及17處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且其中該反義股進一步包含位置1、4、8、13及15處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH部分。
  31. 如請求項27之醫藥組合物，其中該有義股進一步包含位置2、4、11、13及17處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；共價連接於3'末端處之C3OH非核苷酸部分；及共價連接於5'末端處之反向無鹼基脫氧核糖核苷酸部分；且其中該反義股進一步包含位置1、4、8、11及15處之經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸；位置6處之2'-5'-核糖核苷酸；及共價連接於3'末端處之C3Pi-C3OH非核苷酸部 分。
  32. 如請求項1之醫藥組合物，其中該雙股核酸分子減少該星狀細胞中之hsp47表現。
  33. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療與hsp47相關之疾病。
  34. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療選自由以下組成之群之疾病：器官及組織(包括肝臟、肺臟、腎臟、胰臟、皮膚、心臟、腦、腸、結腸、聲帶、腹膜、眼睛、肌肉、骨髓、骨、卵巢、輸尿管、子宮)之纖維化及肝硬化及癌症相關纖維變性組織及癌症。
  35. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醫藥組合物預防或治療肝纖維化。
  36. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醫藥組合物預防或治療肺纖維化。
  37. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醫藥組合物預防或治療腎纖維化。
  38. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療腹膜纖維化。
  39. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療慢性肝損傷。
  40. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療原纖維形成。
  41. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療因肝移植後C型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)所致之 肝硬化；特發性肺纖維化；導致肺纖維化之放射性肺炎；糖尿病性腎病；與連續性可攜帶式腹膜透析(CAPD)相關之腹膜硬化症；或眼瘢痕性類天疱瘡。
  42. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療因肝移植後C型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)所致之肝硬化。
  43. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療特發性肺纖維化。
  44. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療導致肺纖維化之放射性肺炎。
  45. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療糖尿病性腎病。
  46. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療與連續性可攜帶式腹膜透析(CAPD)相關之腹膜硬化症。
  47. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物預防或治療眼瘢痕性類天疱瘡。
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