CN103781909B - 用于增强对hsp47 表达的调节的类视黄醇‑脂质体 - Google Patents

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Abstract

描述了包含双链核酸分子的药物组合物，所述双链核酸分子包含有义链和反义链，其中所述有义链和反义链选自描述于SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)、SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)、和SERPINH1_51(SEQ ID NO:101和168)的寡核苷酸，以及描述了包含类视黄醇和脂质媒介物的药物载体，和使用这些药物组合物来治疗hsp47相关疾病(包括纤维化)的方法。

Description

用于增强对HSP47表达的调节的类视黄醇-脂质体
相关申请交叉引用
本申请要求2011年6月15日提交的美国临时申请No.61/497,447和2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,832的权益。其各自以其整体通过引用并入本文。
技术领域
本文提供的是药物组合物，其包含用于增强siRNA对hsp47表达的调节的类视黄醇-脂质体。
背景技术
肝的纤维化可以由于激活的肝星状细胞(HSC)造成，导致多种类型的胶原分子和纤连蛋白沉积在间质组织上。这可能导致肝硬化、肝功能衰竭和/或肝细胞癌。此外，通过与肝纤维化相同的机制，胰囊性纤维化的结果发展成慢性胰腺炎(Madro,et al.,2004；MedSci Monit.10:RA166-70；Jaster,2004,Mol Cancer.6:26)。此外，星状细胞存在于声带和喉部疾病中，例如声带瘢痕、声带粘膜纤维化和喉部纤维化。为了预防或治疗这些器官和身体其他地方的纤维化，需要开发药物载体和药物载体试剂盒。
星状细胞是治疗纤维化的重要的靶候选物之一(Fallowfield et al.,2004,Expert Opin Ther Targets.8:423-35；Pinzani,et al.,2004,Dig Liver Dis.36:231-42)。在纤维化期间，星状细胞被来自附近细胞的细胞因子激活产生许多导致肝纤维化的因子。星状细胞储存维生素A，并属于成肌纤维细胞家族。
预防或治疗纤维化的治疗方法尝试控制胶原蛋白代谢、加速胶原蛋白降解系统和抑制星状细胞的激活。然而，在所有这些情况中，作用的低特异性和/或低的器官特异性限制了效力且不良副作用产生问题。
还没有将胶原蛋白合成的抑制建立为治疗方法。由于导致副作用的可能性，靶向胶原蛋白产生的分子的潜力是有限的。抑制胶原蛋白产生直接地提供另一种预防或治疗纤维化的治疗方法。这样的方法需要控制胶原蛋白I-IV型中的一或多种不同类型。实现这的方法可以是通过热休克蛋白47(HSP47)，其是细胞内运输必需的和多种类型的胶原蛋白的分子成熟必要的胶原蛋白特异性分子伴侣。因此，如果可以特异性地在星状细胞中控制HSP47的功能，则有可能抑制肝纤维化。
发明概述
本申请涉及药物载体和药物载体试剂盒，其使得诊断和/或治疗药物被特异性地运输至星状细胞。本申请中的药物载体可以选自聚合物微团(micelle)、脂质体、乳剂、微球体、和纳米球形式，并通过向其结合或包括在其中，类视黄醇或类视黄醇缀合物和治疗药物可以被特异性地运输至HSC。类视黄醇包括维生素A、视黄醛、视黄酸、饱和维生素A、维甲酸、阿达帕林或视黄醇棕榈酸酯、以及芬维A铵(4-HPR)。此外，通过制备所述药物载体来包括选自TGFβ活性抑制剂如截短的TGFβII型受体和可溶的TGFβII型受体，生长因子制备物如HGF，产MMP启动子如含MMP基因的腺病毒载体，细胞激活抑制剂和/或生长抑制剂包括PPARγ-配体、血管紧张素I-II型受体拮抗剂、PDGF酪氨酸激酶抑制剂、和钠通道阻滞剂如阿米洛利，和细胞凋亡诱导物如化合物861及胶霉毒素的一种分子或多种分子；以及通过将其口服、胃肠外、静脉内或腹膜内施用至具有纤维化风险或纤维化症状的患者或患有不同纤维化相关疾病如肝硬化、肝功能衰竭、肝癌或慢性胰腺炎的患者，星状细胞的激活能够被抑制，由此预防、抑制或改善所述患者中的纤维化和/或纤维化相关疾病病症。或者，或另外地，通过使用其中包装有特异性抑制HSP47或TIMP(MMP抑制剂)的核酶、反义RNA、或siRNA，I-IV型胶原蛋白的分泌可以同时被抑制，结果是可以有效地抑制纤维发生。
本申请的一个实施方案是包含双链核酸分子和药物载体的药物组合物，所述双链核酸分子包含有义链和反义链，其中所述有义和反义链选自如下表4中的描述为SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)、SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)和SERPINH1_51(SEQ ID NOS:101和168)的寡核苷酸，并且所述药物载体包含脂质囊泡(vesicle)和类视黄醇或类视黄醇缀合物的混合物。类视黄醇可以是以下的一或多种：维生素A、视黄酸、饱和维生素A、视黄醛、维甲酸、阿达帕林、视黄醇棕榈酸酯、或芬维A铵。优选地，所述类视黄醇包含视黄酸的缀合物，最优选地包含类视黄醇-PEG缀合物。所述脂质囊泡可以由脂质分子双层构成，并可以进一步包含类视黄醇。类视黄醇优选地以0.2wt％-20wt％的浓度存在于所述药物载体中。所述脂质囊泡可以包含内表面和外表面，所述内表面包囊化所述脂质囊泡的内部，所述外表面能够接近所述脂质囊泡外部的水性介质。所述类视黄醇可以与所述脂质双层相连。所述双链核酸可以被暴露于所述脂质囊泡的外表面上。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包括反义链和有义链，所述反义链具有SEQID NO:127并包含2’-O-甲基(2’OMe)-修饰的核糖核苷酸，在位置1、5、6或7至少一个处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的3’端非核苷酸部分；而所述有义链具有SEQ IDNO:60并包含至少一个2’-5’-核糖核苷酸或2’OMe修饰的核糖核苷酸，与3’-端共价连接的3’端非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分。在优选的实施方案中，所述反义链是SEQ ID NO:127并包含在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分；且所述有义链是SEQ ID NO:60并包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分。在一些实施方案中，所述双链核酸分子还包括在反义链位置1的2’OMe修饰的核糖核苷酸或2’-5’-核糖核苷酸。(本文提及核苷酸位置，对于双链核酸分子的有义和反义链两者，均是基于寡核苷酸的5’>3’方向。)
在多种实施方案中，有义链是SEQ ID NO:98并包含3’端位置中的2’-5’-核糖核酸，与3’-端共价连接的非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分；且反义链是SEQ ID NO:165并包含2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7中至少一个的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分。在优选的实施方案中，有义链是SEQ ID NO:98并包含在位置15、16、17、18、和19处的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3-OH3’部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且反义链是SEQ ID NO:165并包含在位置4、6、8、11、13、15、17、和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置7的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH部分。在一些实施方案中，所述双链核酸还包含在位置2的2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在多种实施方案中，有义链是SEQ ID NO:101并包含2’OMe修饰的核糖核苷酸，任选存在的在位置9或10之一的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的非核苷酸部分，与5’-端共价连接的反向的脱碱基部分；且反义链是SEQ ID NO:168并包含2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7至少一个处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分。在优选的实施方案中，有义链是SEQ ID NO:101并包含在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置9的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3OH非核苷酸部分，与5’-端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且反义链是SEQ ID NO:168并包含在位置1、4、8、11和15的2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH部分。在某些实施方案中，所述双链核酸分子还包括反义链中位置13和或在有义链中位置2的2’OMe修饰的核糖核苷酸。
另一方面是药物组合物，其包含双链核酸分子和药物载体，所述药物载体包含类视黄醇和脂质的混合物，其中所述双链寡核苷酸化合物包括结构(A1):
(A1)5’(N)x–Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y–z"5’(有义链)
其中N和N’各自为可未经修饰或经修饰的核苷酸，或非常规部分；其中(N)x和(N’)y各自为其中每个连续N或N’通过共价键与下一个N或N’连接的寡核苷酸；其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在则独立地包括在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；其中x和y各自独立地为18至40之间的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x包括SEQ ID NO:1所示例的人hsp47的mRNA编码序列的反义序列，SEQ ID NO:1如下所示。
本文提供了用于调节靶基因表达的组合物、方法和试剂盒。在多个方面和实施方案中，本文提供的组合物、方法和试剂盒调节热休克蛋白47(hsp47)的表达，热休克蛋白47也已知为SERPINH1(SEQ ID NO:1)。所述组合物、方法和试剂盒可以包括使用结合编码hsp47，SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子(例如，端干扰核酸(siNA)，短干扰RNA(siRNA)，双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、或短发夹RNA(shRNA))。在某些优选实施方案中，本文公开的组合物、方法和试剂盒抑制hsp47的表达。例如，提供了降低或抑制hsp47表达的siNA分子(如，RNA-诱导沉默复合物(RISC)长度dsNA分子或Dicer长度dsNA分子)。还提供了用于治疗和/或预防与hsp47相关的疾病、病症或紊乱的组合物、方法和试剂盒，所述疾病、病症或紊乱例如肝纤维化、肝硬化、肺纤维化包括肺纤维化(包括间质肺纤维化(ILF))、由任何情况造成的肾纤维化(如，慢性肾病(CKD)包括晚期肾病(ESRD))、腹膜纤维化、慢性肝损伤、原纤维生成、在其它器官的纤维化疾病、与所有可能类型的意外及医原性(手术)皮肤损伤相关的异常瘢痕形成(瘢痕瘤)、硬皮病、心肌纤维化、青光眼滤过手术失败、和肠粘连。
一方面，提供了上述的药物组合物，其包含核酸分子(例如，siNA分子)作为药物制剂的组分，其中所述核酸分子包括有义链和反义链；所述核酸分子的每条链长度独立地为15-49个核苷酸；反义链的15-49核苷酸序列与编码人hsp47的mRNA的序列(例如，SEQ IDNO:1)互补；并且有义链的15-49核苷酸序列与反义链的序列互补并包括编码人hsp47的mRNA的15-49核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:1)
在某些实施方案中，与编码人hsp47的mRNA的序列互补的反义链的序列包括与SEQID NO:1的核苷酸600-800或801-899或900-1000或1001-1300之间，或SEQ ID NO:1的核苷酸650-730或900-975之间的序列互补的序列。在一些实施方案中，反义链包括与对应于以下的编码人hsp47的mRNA的序列互补的序列：SEQ ID NO:1的核苷酸674-693或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸698-716或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸698-722或其一部分，或SEQID NO:1的核苷酸701-720或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸920-939或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸963-982或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸947-972或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸948-966或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸945-969或其一部分，或SEQ ID NO:1的核苷酸945-963或其一部分。
在某些实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链包括对应于以下的序列：SEQ ID NO:4或其一部分；或SEQ IDNO:6或其一部分；或SEQ ID NO:8或其一部分；或SEQ ID NO:10或其一部分；或SEQ ID NO:12或其一部分；或SEQ ID NO:14或其一部分；或SEQ ID NO:16或其一部分；或SEQ ID NO:18或其一部分；或SEQ ID NO:20或其一部分；或SEQ ID NO:22或其一部分；或SEQ ID NO:24或其一部分；或SEQ ID NO:26或其一部分；或SEQID NO:28或其一部分；或SEQ ID NO:30或其一部分；或SEQID NO:32或其一部分；或SEQ ID NO:34或其一部分；或SEQ ID NO:36或其一部分；或SEQ IDNO:38或其一部分；或SEQ ID NO:40或其一部分；或SEQ ID NO:42或其一部分；或SEQ IDNO:44或其一部分；或SEQ ID NO:46或其一部分；或SEQ ID NO:48或其一部分；或SEQ IDNO:50或其一部分；或SEQ ID NO:52或其一部分；或SEQID NO:54或其一部分；或SEQ ID NO:56或其一部分和SEQ ID NO:58或其一部分。在某些实施方案中，本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的有义链包括对应于以下的序列：SEQ ID NO:3或其一部分；或SEQ ID NO:5或其一部分；或SEQ ID NO:7或其一部分；或SEQID NO:9或其一部分；或SEQ ID NO:11或其一部分；或SEQ ID NO:13或其一部分；或SEQ ID NO:15或其一部分；或SEQ ID NO:17或其一部分；或SEQ ID NO:19或其一部分；或SEQ ID NO:21或其一部分；或SEQ ID NO:23或其一部分；或SEQ ID NO:25或其一部分；或SEQ ID NO:27或其一部分；或SEQ ID NO:29或其一部分；或SEQ ID NO:31或其一部分；或SEQ ID NO:33或其一部分；或SEQID NO:35或其一部分；或SEQ ID NO:37或其一部分；或SEQ ID NO:39或其一部分；或SEQ ID NO:41或其一部分；或SEQ ID NO:43或其一部分；或SEQ ID NO:45或其一部分；或SEQ ID NO:47或其一部分；或SEQ ID NO:49或其一部分；或SEQ ID NO:51或其一部分；或SEQ ID NO:53或其一部分；或SEQ ID NO:55或其一部分和SEQ ID NO:57或其一部分。
在某些优选的实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链包括与表4所示任一反义序列相对应的序列。在某些优选的实施方案中，反义链和有义链选自表4中所示序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58和SERPINH1_88中所示序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_4(SEQ ID NO:195和220)、SERPINH1_12(SEQ ID NO:196和221)、SERPINH1_30(SEQ ID NO:199和224)和SERPINH1_58(SEQ ID NO:208和233)中所示序列对。
在一些实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链和有义链包括SERPINH1_4(SEQ ID NO:195和220)中所示的序列对。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链和有义链包括SERPINH1_12(SEQID NO:196和221)中所示的序列对。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链和有义链包括SERPINH1_30(SEQ ID NO:199和224)中所示的序列对。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链和有义链包括SERPINH1_58(SEQID NO:208和233)中所示的序列对。
在某些实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链包括与表B或C的任一个所示的任一反义序列相对应的序列。
在某些优选的实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链包括与表5所示任一反义序列相对应的序列。在某些优选的实施方案中，反义链和有义链选自表5中所示的序列对。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)包括选自以下所示序列对的反义链和有义链：
·SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)，
·SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)，
·SERPINH1_11(SEQ ID NO:68和135)，
·SERPINH1_13(SEQID NO:69和136)，
·SERPINH1_45(SEQ ID NO:97和164)，
·SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)，
·SERPINH1_51(SEQ ID NO:101和168)，
·SERPINH1_52(SEQ ID NO:102和169)，或
·SERPINH1_86(SEQ ID NO:123和190)。
在一些优选的实施方案中，反义链和有义链选自以下所示的序列对：
·SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)，
·SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)，
·SERPINH1_45a(SEQ ID NOS:98和165)，和
·SERPINH1_51(SEQ ID NO:101和168)。
在一些实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)包括选自SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)中所示序列对的反义链和有义链。在一些实施方案中，反义链和有义链包括SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)中所示的序列对。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)包括SERPINH1_11(SEQ ID NO:68和135)中所示序列对的反义链和有义链。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_13(SEQ ID NO:69和136)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_45(SEQ ID NO:97和164)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_51(SEQ ID NO:101和168)中所示的序列对。
在某些实施方案中，本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的反义链包括与表D或E的任一个所示的任一反义序列相对应的序列。
在本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的多个实施方案中，反义链长度可为15-49个核苷酸(例如，长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸)；或长度为17-30个核苷酸；或长度为15-25个核苷酸；或长度为18-25个核苷酸；或长度为18-23个核苷酸；或长度为19-21个核苷酸；或长度为25-30个核苷酸；或长度为26-28个核苷酸。在本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的一些实施方案中，反义链长度可为19个核苷酸。类似地，在本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的有义链长度可为15-49个核苷酸(例如，长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸)；或长度为17-35个核苷酸；或长度为17-30个核苷酸；或长度为15-25个核苷酸；或长度为18-25个核苷酸；或长度为18-23个核苷酸；或长度为19-21个核苷酸；或长度为25-30个核苷酸；或长度为26-28个核苷酸。在本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的一些实施方案中，有义链长度可为19个核苷酸。在本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的一些实施方案中，反义链和有义链长度可为19个核苷酸。本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的双链体区长度可为15-49个核苷酸(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸)；或长度为15-35个核苷酸；或长度为15-30个核苷酸；或长度为15-25个核苷酸；或长度为17-25个核苷酸；或长度为17-23个核苷酸；或长度为17-21个核苷酸；或长度为25-30个核苷酸；或长度为25-28个核苷酸。在本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)的多个实施方案中，双链体区长度可为19个核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA核酸分子)的有义链和反义链为单独的多核苷酸链。在一些实施方案中，单独的反义链和有义链通过氢键合，例如沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)来形成双链结构。在一些实施方案中，有义链和反义链为两个相互共价连接的单独链。在其它实施方案中，有义链和反义链为具有有义和反义区的多核苷酸单链的一部分；在一些优选的实施方案中多核苷酸链具有发夹结构。
在某些实施方案中，核酸分子(例如，siNA分子)为关于突出端对称并且在两端均具有平端的双链核酸(dsNA)分子。在其它实施方案中，核酸分子(例如，siNA分子)为关于突出端对称并且在dsNA分子两端均有突出端的dsNA分子；优选地，分子具有1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸的突出端；优选地，分子具有2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中突出端为5’突出端；在替代性实施方案中突出端为3’突出端。在某些实施方案中，突出核苷酸经本文公开的修饰所修饰。在一些实施方案中，突出核苷酸为2’-脱氧核苷酸。
在某些实施方案中，作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)为关于突出端不对称并且在所述分子的一端具有平端而在分子的另一端具有突出端的dsNA分子。在某些实施方案中，突出端为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸；优选地，突出端为2个核苷酸。在一些优选的实施方案中，不对称dsNA分子在有义链上出现的双链体的一侧具有3’-突出端(例如2个核苷酸的3’-突出端)；而在分子的另一侧具有平端。在一些优选的实施方案中，不对称dsNA分子在有义链上出现的双链体的一侧具有5’-突出端(例如2个核苷酸的5’-突出端)；而在分子的另一侧具有平端。在其它优选的实施方案中，不对称dsNA分子在反义链上出现的双链体的一侧具有3’-突出端(例如2个核苷酸的3’-突出端)；而在分子的另一侧具有平端。在一些优选的实施方案中，不对称dsNA分子在反义链上出现的双链体的一侧具有5’-突出端(例如2个核苷酸的5’-突出端)；而在分子的另一侧具有平端。在某些优选的实施方案中，突出端为2’-脱氧核苷酸。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)具有发夹结构(在一个多核苷酸上具有有义链和反义链)，其中一端具有环结构而另一端具有平端。在一些实施方案中，核酸分子具有发夹结构，其中一端具有环结构而另一端具有突出端(例如1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸突出端)；在某些实施方案中，突出端为3’-突出端；在某些实施方案中突出端为5’-突出端；在某些实施方案中，突出端在有义链上；在某些实施方案中，突出端在反义链上。
在一些优选的实施方案中，核酸分子选自表3所示核酸分子。
本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)可包括例如本文所述的一个或多个修饰或经修饰的核苷酸。例如，本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可包括具有经修饰糖的经修饰的核苷酸；具有经修饰核碱基的经修饰的核苷酸；或具有经修饰磷酸基团的经修饰的核苷酸。类似地，本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可包括经修饰的磷酸二酯主链和/或可包括经修饰的末端磷酸基团。
所提供的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)可具有一个或多个包括例如本文所述经修饰糖部分的核苷酸。在一些优选的实施方案中，经修饰糖部分选自2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-脱氧基、2’-氟、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-(CH2)2-O-2’-桥、2’-LNA(LNA核苷酸的核糖部分用连接2’氧和4’碳的额外的桥修饰)和2’-O-(N-甲基氨基甲酸酯基)。
所提供的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)可具有一个或多个例如本文所述经修饰的核碱基，所述经修饰的核碱基可优选为选自黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和无环核苷酸中的一个。
所提供的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)可具有一个或多个例如本文所述针对磷酸二酯主链的修饰。在一些优选的实施方案中，通过用硫代磷酸酯键、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、硒代磷酸酯键、3’-(或-5’)脱氧亚膦酸酯键、硼代磷酸酯键、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或5’-)氨基氨基磷酸酯键、氢膦酸酯键、硼代磷酸酯键、氨基磷酸酯键、烷基或芳基膦酸酯键和磷酸三酯键或磷键取代磷酸二酯键来修饰磷酸二酯键。
在多个实施方案中，提供的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)可在有义链而非反义链中包括一个或多个修饰。在一些实施方案中，提供的核酸分子(例如，siNA分子)在反义链而非有义链中包括一个或多个修饰。在一些实施方案中，提供的核酸分子(例如，siNA分子)在有义链和反义链中包括一个或多个修饰。
在提供的核酸分子(例如，siNA分子)具有修饰的一些实施方案中，有义链包括经修饰和未经修饰的核苷酸交替的模式，和/或反义链包括经修饰和未经修饰的核苷酸交替的模式；在这些实施方案的一些优选形式中，所述修饰为2’OMe部分。经修饰和未经修饰的核苷酸交替的模式可从其中一条链的5’端或3’端处的经修饰的核苷酸开始；例如经修饰和未经修饰的核苷酸交替的模式可从有义链5’端或3’端的经修饰的核苷酸开始和/或经修饰和未经修饰的核苷酸交替的模式可从反义链5’端或3’端的经修饰的核苷酸开始。当反义链和有义链包括经修饰和未经修饰的核苷酸交替的模式时，经修饰的核苷酸模式可经构型为使得有义链上的经修饰的核苷酸与反义链上的经修饰的核苷酸相对；或在所述模式中可存在相移，使得有义链的经修饰的核苷酸与反义链上的未经修饰的核苷酸相对并且反之亦然。
本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可包括有义链和/或反义链的3’端处的1-3个(即，1、2或3个)脱氧核苷酸。
本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可包括有义链和/或反义链的5’端处的磷酸基团。
在一方面，提供了具有结构(A1)的双链核酸分子：
(A1)5’(N)x–Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y–z”5’(有义链)
其中N和N’各自为可未经修饰或经修饰的核苷酸，或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y各自为其中每个连续N或N’通过共价键与下一个N或N’连接的寡核苷酸；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在则独立地包括在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；
其中x和y各自独立地为18至40之间的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x包括SEQ ID NO:1的反义序列。
在一些实施方案中，(N)x包括表4中存在的反义寡核苷酸。在其它实施方案中，(N)x选自表B或C中存在的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中连接每个连续N或N’的共价键为磷酸二酯键。
在一些实施方案中，x＝y并且x和y各自为19、20、21、22或23。在多个实施方案中，x＝y＝19。
在本文公开的作为药物制剂的组分的核酸分子(例如，siNA分子)的一些实施方案中，双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自以下所示的序列对：
·SERPINH1_4(SEQ ID NO:195和220)，
·SERPINH1_12(SEQ ID NO:196和221)，
·SERPINH1_30(SEQ ID NO:199和224)，和
·SERPINH1_58(SEQ ID NO:208和233)。
在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_4(SEQ ID NO:195和220)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_12(SEQ ID NO:196和221)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_30(SEQ ID NO:199和224)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_58(SEQ ID NO:208和233)中所示的序列对。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链核酸分子包含处于反义链的位置1(5’末端)处的DNA部分或与靶标的错配物。本文描述了这种结构。根据一个实施方案，提供了具有以下所示结构(A2)的经修饰的核酸分子：
(A2)5’N1-(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)
其中N2、N和N’各自为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y各自为其中每个连续N或N’通过共价键与相邻N或N’连接的寡核苷酸；
其中x和y各自独立地为17至39之间的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且(N)x与靶RNA中的连续序列互补；
其中N1与(N)x共价结合并且与靶RNA错配或为靶RNA的互补DNA部分；
其中N1选自天然或经修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷；
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；并且
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸、连续非核苷酸部分或其组合。
在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在多个实施方案中，N2-(N’)y的序列与N1-(N)x的序列互补。在一些实施方案中，(N)x包含与靶RNA中约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶RNA中约17至约39个连续核苷酸基本上互补的反义序列。
在一些实施方案中，N1和N2形成沃森-克里克碱基对。在一些实施方案中，N1和N2形成非沃森-克里克碱基对。在一些实施方案中，在核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸之间形成碱基对。
在一些实施方案中，x＝y＝18，x＝y＝19或x＝y＝20。在优选的实施方案中，x＝y＝18。当N1-(N)x中x＝18时，N1指位置1并且位置2-19包括在(N)18中。当N2-(N’)y中y＝18时，N2指位置19并且位置1-18包括在(N’)18中。
在一些实施方案中，N1与(N)x共价结合并且与靶RNA错配。在多个实施方案中，N1与(N)x共价结合并且为与靶RNA互补的DNA部分。
在一些实施方案中，反义链位置1处的尿苷经选自腺苷、脱氧腺苷、脱氧尿苷(dU)或脱氧胸苷的N1取代。在多个实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，反义链位置1处的鸟苷经选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多个实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，反义链位置1处的胞苷经选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多个实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，反义链位置1处的腺苷经选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多个实施方案中，N1选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，N1和N2在尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对。在其它实施方案中，N1和N2在脱氧尿苷和腺苷之间形成碱基对。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。本文提供的双链核酸分子也称为“双链体”。
在一些实施方案中，(N)x包括表4中存在的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x包括表4中存在的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝20。在某些优选的实施方案中，x＝y＝18。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x和N2-(N’)y的序列选自表4中所示的寡核苷酸对。在一些实施方案中，x＝y-18并且N1-(N)x和N2-(N’)y的序列选自表D和E中所示的寡核苷酸对。在一些实施方案中，反义链和有义链选自以下所示的序列对：
·SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)，
·SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)，
·SERPINH1_11(SEQ ID NO:68和135)，
·SERPINH1_13(SEQ ID NO:69和136)，
·SERPINH1_45(SEQ ID NO:97和164)，
·SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)，
·SERPINH1_51(SEQ ID NO:101和168)，
·SERPINH151a(SEQ ID NO:105和172)，
·SERPINH1_52(SEQ ID NO:102和169)，和
·SERPINH1_86(SEQ ID NO:123和190)。
在一些优选的实施方案中，反义链和有义链选自以下所示的序列对:
·SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)，
·SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)，
·SERPINH145a(SEQ ID NO:98和165)，
·SERPINH1_51(SEQ ID NOS:101和168)，和
·SERPINH1_51a(SEQ ID NO:105和172)。
在一些优选的实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_11(SEQ ID NO:68和135)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_13(SEQ ID NO:69和136)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_45(SEQ IDNO:97和164)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_45a(SEQID NO:98和165)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_51(SEQID NO:101和168)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_51a(SEQ ID NO:105和172)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为SERPINH1_52(SEQ ID NO:102和169)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链为(SEQ IDNO:123和190)中所示的序列对。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2(SEQID NO:60和127)、SERPINH1_6(SEQ ID NO:63和130)、SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)、SERPINH1_51(SEQ ID NOS:101和168)和SERPINH1_51a(SEQ ID NO:105和172)中所示的序列对。
在一些实施方案中，N1和N2形成沃森-克里克碱基对。在其它实施方案中，N1和N2形成非沃森-克里克碱基对。在一些实施方案中，N1为经修饰的核糖腺苷或经修饰的核糖尿苷。
在一些实施方案中，N1和N2形成沃森-克里克碱基对。在其它实施方案中，N1和N2形成非沃森-克里克碱基对。在某些实施方案中，N1选自核糖腺苷、经修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷和经修饰的脱氧核糖腺苷。在其它实施方案中，N1选自核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷和经修饰的脱氧尿苷。
在某些实施方案中，反义链中的位置1(5’末端)包括脱氧核糖尿苷(dU)或腺苷。在一些实施方案中，N1选自核糖腺苷、经修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷、经修饰的脱氧核糖腺苷并且N2选自核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷和经修饰的脱氧尿苷。在某些实施方案中，N1选自核糖腺苷和经修饰的核糖腺苷并且N2选自核糖尿苷和经修饰的核糖尿苷。
在某些实施方案中，N1选自核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷和经修饰的脱氧尿苷并且N2选自核糖腺苷、经修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷、经修饰的脱氧核糖腺苷。在某些实施方案中，N1选自核糖尿苷和脱氧尿苷并且N2选自核糖腺苷和经修饰的核糖腺苷。在某些实施方案中，N1为核糖尿苷并且N2为核糖腺苷。在某些实施方案中，N1为脱氧尿苷并且N2为核糖腺苷。
在结构(A2)的一些实施方案中，N1包括2’OMe修饰的核糖尿嘧啶或2’OMe修饰的核糖腺苷。在结构(A2)的某些实施方案中，N2包括2’OMe修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
在结构(A2)的一些实施方案中，N1包括2’OMe修饰的核糖尿嘧啶或2’OMe修饰的核糖胞嘧啶。在结构(A)的某些实施方案中，N2包括2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，N和N’各自为未经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，N或N’的至少一个包括经化学修饰的核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，非常规部分为镜像核苷酸，优选为L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’的至少一个包括2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在其它实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列基本上互补。
在一些实施方案中，(N)x包括与靶RNA中约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶RNA中约17至约39个连续核苷酸基本上互补的反义序列。
在结构A1和结构A2的一些实施方案中，化合物具有平端，例如其中Z和Z’均不存在。在替代性实施方案中，Z或Z’的至少一个存在。Z和Z’独立地包括一个或多个共价连接的经修饰或未经修饰的核苷酸，包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，或非常规部分，例如反向脱碱基脱氧核糖部分或脱碱基核糖部分；非核苷酸C3、C4或C5部分、氨基-6部分、镜像核苷酸等。在一些实施方案中，Z和Z’各自独立地包括C3部分或氨基-C6部分。在一些实施方案中，Z’不存在而Z存在并包括非核苷酸C3部分。在一些实施方案中，Z不存在而Z’存在并包括非核苷酸C3部分。
在结构A1和结构A2的一些实施方案中，每个N由未经修饰的核糖核苷酸组成。在结构A1和结构A2的一些实施方案中，每个N’由未经修饰的核苷酸组成。在优选的实施方案中，N和N’的至少一个为经修饰的核糖核苷酸或非常规部分。
在其它实施方案中，结构A1或结构A2的化合物包括至少一个在糖残基中经修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，化合物包括糖残基的2’位置处的修饰。在一些实施方案中，2’位置处的修饰包括氨基、氟、烷氧基或烷基部分的存在。在某些实施方案中，2’修饰包括烷氧基部分。在优选的实施方案中，烷氧基部分为甲氧基部分(2’OMe)。在一些实施方案中，核酸化合物包括位于反义链和有义链的其中一条或两条上的2’OMe修饰的交替核糖核苷酸。在其它实施方案中，化合物包括仅位于反义链(N)x或N1-(N)x上的2’OMe修饰核糖核苷酸。在某些实施方案中，反义链的中部核糖核苷酸；例如19聚体(19-mer)链位置10处的核糖核苷酸未经修饰。在多个实施方案中，核酸化合物包括至少5个交替的经2’OMe修饰和未经修饰的核糖核苷酸。在另外的实施方案中，结构A1或结构A2的化合物包括交替位置处的经修饰核糖核苷酸，其中(N)x或N1-(N)x的5’和3’末端的每个核糖核苷酸的糖残基被修饰，并且(N’)y或N2-(N)y的5’和3’末端的每个核糖核苷酸的糖残基未经修饰。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链分子包括以下修饰的一个或多个：
·反义链的位置5、6、7、8或9的至少一处的N选自2’-5’-核苷酸或镜像核苷酸；
·有义链位置9或10的至少一处的N’选自2’-5’-核苷酸和假尿苷；并且
·(N’)y的3’末端位置处4、5或6个连续位置中的N’包含2’-5’-核苷酸。
在一些实施方案中，双链分子包括以下修饰的组合
·反义链包括来自位置5、6、7、8或9的至少一处的2’-5’-核苷酸或镜像核苷酸；并且
·有义链包括位置9或10处的2’-5’-核苷酸和假尿苷。
在一些实施方案中，双链分子包括以下修饰的组合
·反义链包括位置5、6、7、8或9的至少一处的2’-5’-核苷酸或镜像核苷酸；并且
·有义链包括4、5或6个位于3’倒数第二个或3’末端位置处的连续2’-5’-核苷酸。
在一些实施方案中，有义链((N)x或N1-(N)x)包括1、2、3、4、5、6、7、8或9个2’OMe修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链包括在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在其它实施方案中，反义链包括在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在其它实施方案中，反义链包括在位置3、5、7、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链包括一个或多个2’OMe修饰的嘧啶。在一些实施方案中，有义链包括2’OMe修饰的嘧啶。
在结构A1和结构A2的一些实施方案中，有义链和反义链3’和5’末端均未磷酸化。在其它实施方案中，有义链和反义链中的一者或两者3’末端被磷酸化。
在结构A1和结构A2的一些实施方案中，(N)y包括至少一个选自镜像核苷酸、2’-5’-核苷酸和TNA的非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分为镜像核苷酸。在多个实施方案中，镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸(L-RNA)和L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。在优选的实施方案中，镜像核苷酸为L-DNA。在某些实施方案中，有义链包含在位置9或10(来自5’末端)处的非常规部分。在优选的实施方案中，有义链包括在位置9(来自5’末端)处的非常规部分。在一些实施方案中，有义链长度为19个核苷酸并且包含在位置15(来自5’末端)处的4、5或6个连续非常规部分。在一些实施方案中，有义链包括在位置15、16、17和18处的4个连续2’-5’-核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链包括在位置15、16、17和18处的5个连续2’-5’-核糖核苷酸。在多个实施方案中，有义链进一步包含Z’。在一些实施方案中，Z’包括C3OH部分或C3Pi部分。
在结构A1的一些实施方案中，(N’)y包括至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y由位置1-17和19处的未修饰核糖核苷酸和3’倒数第二个位置(位置18)处的一个L-DNA组成。在其它实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y由位置1-16和19处的未修饰核糖核苷酸和3’倒数第二个位置(位置17和18)处的两个连续L-DNA组成。在多个实施方案中，非常规部分为通过2’-5’核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸。根据多个实施方案，(N’)y包括3’末端处通过2’-5’核苷酸间连键连接的2、3、4、5或6个连续核糖核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的3’末端处的4个连续核苷酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接，其中形成2’-5’磷酸二酯键的一个或多个2’-5’核苷酸进一步包括3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包括2’OMe修饰。在某些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y包括在位置15、16、17、18和19处的两个或更多个连续核苷酸，其包括通过2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸(2’-5’核苷酸)。在多个实施方案中形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸(3’H或3’OMe代替3’OH)。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y包括在位置15、16和17处的2’-5’核苷酸，使得相邻核苷酸通过位置15-16、16-17和17-18之间的2’-5’核苷酸间键连接；或位置15、16、17、18和19处的2’-5’核苷酸，使得相邻核苷酸通过位置15-16、16-17、17-18和18-19之间的2’-5’核苷酸间键连接并且可在3’末端核苷酸处获得3’OH，或位置16、17和18处的2’-5’核苷酸，使得相邻核苷酸通过位置16-17、17-18和18-19之间的2’-5’核苷酸间键连接。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y包括在位置16和17或位置17和18或位置15和17处的2’-5’核苷酸，使得相邻核苷酸分别通过位置16-17和17-18之间或位置17-18和18-19之间或位置15-16和17-18之间的2’-5’核苷酸间键连接。在其它实施方案中，(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸(rU、rC)被通过2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸取代。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所示的序列对，x＝y＝19并且(N’)y包含在3’末端通过4个2’-5’连键，特别是核苷酸位置15-16、16-17、17-18和18-19之间的连键连接的5个连续核苷酸。
在一些实施方案中，所述连键包括磷酸二酯键。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所示的序列对并且x＝y＝19，并且(N’)y包含在3’末端通过4个2’-5’连键连接的5个连续核苷酸并任选进一步包括独立地选自反向脱碱基部分和C3烷基[C3；1,3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。C3烷基帽与3’或5’末端核苷酸共价连接。在一些实施方案中，3’C3末端帽进一步包含3’磷酸。在一些实施方案中，3’C3末端帽进一步包含3’末端羟基。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的反义链和有义链选自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所示的序列对，x＝y＝19并且(N’)y包括L-DNA位置18；并且(N’)y任选进一步包括独立地选自反向脱碱基部分和C3烷基[C3；1,3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。
在一些实施方案中，(N’)y包括3’末端磷酸。在一些实施方案中，(N’)y包括3’末端羟基。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58或SERPINH1_88中所示的序列对，x＝y＝19并且(N)x包括在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或位置2、4、6、8、11、13、15、17、19处的2’OMe修饰核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58和SERPINH1_88中所示的序列对，x＝y＝19并且(N)x包括2’OMe修饰的嘧啶。在一些实施方案中，(N)x中的所有嘧啶均包括2’OMe修饰。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对，x＝y＝18并且N2为核糖腺苷部分。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH_16、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH186中所示的序列对并且x＝y＝18，并且N2-(N’)y包括在3’末端通过4个2’-5’连键，特别是核苷酸位置15-16、16-17、17-18和18-19之间的连键连接的5个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述连键包括磷酸二酯键。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH186中所示的序列对并且x＝y＝18，并且N2-(N’)y包括在3’末端通过4个2’-5’连键连接的5个连续核苷酸并任选进一步包括独立地选自反向脱碱基部分和C3烷基[C3；1,3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对并且x＝y＝18，并且N2-(N’)y包括L-DNA位置18；并且(N’)y任选进一步包括独立地选自反向脱碱基部分和C3烷基[C3；1,3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。
在一些实施方案中，N2-(N’)y包含3’末端磷酸。在一些实施方案中，N2-(N’)y包含3’末端羟基。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对并且x＝y＝18，并且N1-(N)x包括在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或位置1、3、5、9、11、13、15、17、19或位置3、5、9、11、13、15、17或位置2、4、6、8、11、13、15、17、19处的2’OMe修饰核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对，x＝y＝18并且N1-(N)x包括在位置11、13、15、17和19(来自5’末端)处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH 1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对，x＝y＝18并且N1-(N)x包括在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或位置3、5、7、9、11、13、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对，x＝y＝18并且N1-(N)x包括在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的反义链和有义链选自SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_11、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPIN51a、SERPINH1_52或SERPINH1_86中所示的序列对，x＝y＝18并且N1-(N)x包括2’OMe修饰的嘧啶。在一些实施方案中，(N)x中的所有嘧啶均包括2’OMe修饰。在一些实施方案中，反义链进一步包括在位置5、6或7处的L-DNA或2’-5’核苷酸。在其它实施方案中，反义链进一步包括在位置5-6或6-7的核糖核苷酸之间生成2’-5’-核苷酸间连键的核糖核苷酸。
在另外的实施方案中，N1-(N)x进一步包括Z，其中Z包括非核苷酸突出端。在一些实施方案中，非核苷酸突出端为C3-C3[1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]2。
在结构A2的一些实施方案中，(N)y包括至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y由位置1-16和18处的未修饰核糖核苷酸和3’倒数第二个位置(位置17)处的一个L-DNA组成。在其它实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y由位置1-15和18处的未修饰核糖核苷酸和3’倒数第二个位置(位置16和17)处的两个连续L-DNA组成。在多个实施方案中，非常规部分为通过2’-5’核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸。根据多个实施方案，(N’)y包括3’末端处通过2’-5’核苷酸间连键连接的2、3、4、5或6个连续核糖核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的3’末端处的4个连续核苷酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接，其中形成2’-5’磷酸二酯键的一个或多个2’-5’核苷酸进一步包括3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包括2’OMe修饰。在某些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y中位置14、15、16、17和18处的两个或更多个连续核苷酸包括通过2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在多个实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y包括通过位置15-16、16-17和17-18之间或位置16-17和17-18之间的2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y包括通过位置14-15、15-16、16-17和17-18之间或位置15-16、16-17和17-18之间或位置16-17和17-18之间或位置17-18或位置15-16和17-18之间的2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在其它实施方案中，(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸(rU、rC)被通过2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸取代。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自表5中所示的寡核苷酸对并且本文鉴定为SERPINH1_2(SEQ ID NO:60和127)、SERPINH1_6(SEQ ID NOS:63和130)、SERPINH1_45a(SEQ ID NO:98和165)、SERPINH1_51(SEQ ID NO:101和168)和SERPINH1_51a(SEQ ID NO:105和172)。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链核酸分子包括SEQ ID NO:127中所示的反义链和SEQ ID NO:60中所示的有义链；本文鉴定为SERPINH1_2。在一些实施方案中，双链核酸分子具有结构
5'UAUAGCACCCAUGUGUCUC-Z 3'(反义SEQ ID NO:127)
│││││││││││││││││││
3'Z'-AUAUCGUGGGUACACAGAG–z"5'(有义SEQ ID NO:60)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括一个或多个2’OMe修饰的嘧啶和/或嘌呤嘌呤、在位置5、6、7或8处的2’-5’核糖核苷酸和3’末端核苷酸或非核苷酸突出端。在一些实施方案中，有义链(SEQ ID NO:60)包括3’末端或倒数第二个位置处的4或5个连续2’-5’-核苷酸、在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分。在其它实施方案中，有义链(SEQ ID NO:60)包括一个或多个2’OMe嘧啶、在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:60)选自包括以下的有义链：
·位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，C3OH 3’末端非核苷酸突出端；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
·位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，3’末端磷酸；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
·位置5、7、13和16处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置18处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
·位置7、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置9处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
·位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的C3-Pi部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：C33’末端突出端；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和C3Pi-C3OH 3’末端突出端；并且有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：3’末端磷酸；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置5、7、13和16处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置18处的2’-5’核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置7、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置9处的2’-5’核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的C3-Pi部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在一些实施方案中，本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:127)包括在位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和C3-C33’末端突出端；并且有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置7、9、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在一些实施方案中，本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:60)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：3’末端磷酸和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分，并且反义链(SEQ ID NO:127)包括选自下列之一的反义链：
·位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
·位置1、3、6、8、10、12、14、17、18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，本文提供了包括SEQ ID NO:130中所示反义链和SEQ ID NO:63中所示有义链的双链核酸分子；本文鉴定为SERPINH1_6。在一些实施方案中，双链体包含结构：
5'UACUCGUCUCGCAUCUUGU-Z 3'(反义SEQ ID NO:130)
|||||||||||||||||||
3'Z'-AUGAGCAGAGCGUAGAACA–z"5'(有义SEQ ID NO:63)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括一个或多个2’OMe修饰的嘧啶；3’末端核苷酸或非核苷酸突出端；和在5’末端共价连接的帽部分。在一些实施方案中，反义链(SEQ ID NO:130)包括一个或多个2’OMe修饰的嘧啶；在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括在位置2、14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3OH或C3Pi部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:130)选自包括以下的反义链：
·位置1、3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
·位置1、3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
·位置3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
·位置3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置1处的dU；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括在位置2、14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:130)包括在位置1、3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，提供了双链体寡核苷酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括在位置14和18处且任选在位置2处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:130)包括在位置1、3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，提供了双链体寡核苷酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括在位置14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:130)选自包括以下的反义链：
·位置1、3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH部分；或
·位置1、3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括在位置14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:130)包括在位置1、3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:63)包括在位置14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:130)包括在位置1、3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和C3Pi-C3OH 3’末端突出端。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链体包括SEQ ID NO:165中所示的反义链和SEQ ID NO:98中所示的有义链；本文鉴定为SERPINH1_45a。在一些实施方案中，双链体包括结构：
5'AGGAAGUUGAUCUUGGAGU-Z 3'(反义SEQ ID NO:165)
|||||||||||||||||||
3'Z'-UCCUUCAACUAGAACCUCA–z"5'(有义SEQ ID NO:98)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，有义链(SEQ ID NO:98)包括在位置15、16、17和18或15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分，和在5’末端共价连接的帽部分。在一些实施方案中，反义链(SEQ ID NO:165)包括在位置5、6、7或8处的2’OMe修饰的嘧啶和/或嘌呤；和在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分。
在一些实施方案中，有义链(SEQ ID NO:98)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：C3Pi或C3-OH 3’末端非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:165)包括选自下列之一的反义链：
·位置2、4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸和C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3’末端突出端；或
·位置2、4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3’末端突出端；
·位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸和C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3’末端突出端；或
·位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH 3’末端突出端。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:98)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：C3-OH 3’末端部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:165)包括在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸和C3Pi-C3OH 3’末端突出端。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链核酸分子包括SEQ ID NO:168中所示的反义链和SEQ ID NO:101中所示的有义链；本文鉴定为SERPINH1_51。在一些实施方案中，双链体包括结构：
5'UCACCCAUGUGUCUCAGGA-Z 3'(反义SEQ ID NO:168)
|||||||||||||||||||
3'Z'-AGUGGGUACACAGAGUCCU–z"5'(有义SEQ ID NO:101)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:101)包括2’OMe修饰的嘧啶、任选在位置9或10处的2’-5’核糖核苷酸；在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分和任选在5’末端共价连接的帽部分。在一些实施方案中，反义链(SEQ ID NO:168)包括2’OMe修饰的嘧啶和/或嘌呤、在位置5、6、7或8处的2’-5’核苷酸；和在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ IDNO:101)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的嘧啶、任选在位置9或10处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3Pi或C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:168)选自包括以下的反义链：
a)位置1、8和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6或7处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH突出端；或
b)位置1、4、8、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6或7处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH突出端；或
c)位置1、4、8、11和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH突出端；或
d)位置1、3、8、12、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:101)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3-OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:168)包括在位置1、8和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:101)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3-OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:168)包括在位置1、4、8、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:101)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:168)包括在位置1、4、8、11和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:101)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ IDNO:168)包括在位置1、3、8、12、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链核酸分子包括SEQ ID NO:172中所示的反义链和SEQ ID NO:105中所示的有义链；本文鉴定为SERPINH1_51a。在一些实施方案中，双链体包含结构
5'ACACCCAUGUGUCUCAGGA-Z 3'(反义SEQ ID NO:172)
|||||||||||||||||||
3'Z'-UGUGGGUACACAGAGUCCU–z"5'(有义SEQ ID NO:105)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:105)包括2’OMe修饰的嘧啶、任选在位置9或10处的2’-5’核糖核苷酸；在3’末端共价连接的核苷酸和非核苷酸部分和任选在5’末端共价连接的帽部分。在一些实施方案中，反义链(SEQ ID NO:172)包括2’OMe修饰的嘧啶和/或嘌呤，在位置5、6、7或8处的2’-5’核苷酸；和在3’末端共价连接的核苷酸和非核苷酸部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ IDNO:105)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的嘧啶、任选在位置9或10处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3Pi或C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:172)选自包括以下的反义链：
a)在位置8和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在位置6或7处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
b)在位置4、8、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在位置6或7处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
c)在位置4、8、11和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
d)在位置3、8、12、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:105)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3-OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:172)包括在位置8和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:105)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3-OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:172)包括在位置4、8、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:105)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3-OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:172)包括在位置4、8、11和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:105)包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，任选在位置9处的2’-5’核糖核苷酸，在3’末端共价连接的C3-OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:172)包括在位置3、8、12、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，反义链和有义链选自表5中所示的寡核苷酸对并且本文鉴定为SERPINH1_4(SEQ ID NO:195和220)和SERPINH1_12(SEQ ID NO:196和221)。
在一些实施方案中，作为药物制剂的组分的双链核酸分子包括SEQ ID NO:220中所示的反义链和SEQ ID NO:195中所示的有义链；本文鉴定为SERPINH1_4。在一些实施方案中，双链核酸分子具有结构：
5'AAUAGCACCCAUGUGUCUC-Z 3'(反义SEQ ID NO:220)
|||||||||||||||||||
3'Z'-UUAUCGUGGGUACACAGAG–z"5'(有义SEQ ID NO:195)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ IDNO:220)包括在位置3、5、9、11、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)选自包括以下的有义链：
a)位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，与3’末端共价连接的C3OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
b)位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，3’末端磷酸；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
c)位置5、7、13和16处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置18处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
d)位置7、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置9处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；或
e)位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的C3Pi部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:220)包括在位置3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：与3’末端共价连接的C3部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:220)包括在位置3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：3’末端磷酸；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:220)包括在位置3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)包括在位置5、7、13和16处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置18处的2’-5’核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:220)包括在位置3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)包括在位置7、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置9处的2’-5’核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO:220)包括在位置3、5、9、11、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的C3Pi部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在一些实施方案中，本文提供了双链核酸分子，其中反义链(SEQID NO:220)包括在位置1、3、5、9、11、13、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；并且有义链(SEQ ID NO:195)包括在位置7、9、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在一些实施方案中，本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQID NO:195)包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：3’末端磷酸和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分，并且反义链(SEQ ID NO:220)包括选自下列之一的反义链：
a)位置3、5、7、9、11、13、15、17、19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
b)位置1、3、6、8、10、12、14、17、18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，本文提供了作为药物制剂的组分的双链核酸分子，其包括SEQID NO:221中所示的反义链和SEQ ID NO:196中所示的有义链；本文鉴定为SERPINH1_12。在一些实施方案中，双链体包含结构：
5'AACUCGUCUCGCAUCUUGU-Z 3'(反义SEQ ID NO:221)
|||||||||||||||||||
3'Z'-UUGAGCAGAGCGUAGAACA–z"5'(有义SEQ ID NO:196)
其中每个“│”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U的每一个独立地为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在则独立地为在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可能存在或不存在，但如果存在则为在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:196)包括一个或多个2’OMe修饰的嘧啶；3’末端核苷酸或非核苷酸突出端；和在5’末端共价连接的帽部分。在一些实施方案中，反义链(SEQ ID NO:221)包括一个或多个2’OMe修饰的嘧啶；在3’末端共价连接的核苷酸或非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:196)包括在位置2、14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:221)包括选自包括以下的反义链：
a)位置3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
b)位置3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ IDNO:196)包括在位置2、14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:221)包括在位置3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，提供了双链体寡链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:196)包括在位置14和18以及任选在位置2处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:221)包括在位置3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，提供了双链体寡核苷酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:196)包括在位置14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:221)包括选自包括以下的反义链：
a)位置3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分；或
b)位置3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:196)包括在位置14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:221)包括在位置1、3、5、9、11、13、15和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
本文提供了双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO:196)包括在位置14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；在3’末端共价连接的C3-OH部分；和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链(SEQ ID NO:221)包括在位置1、3、5、7、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸；位置7处的2’-5’核糖核苷酸；和与3’末端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
在结构A1和A2的更多实施方案中，(N’)y包括1-8个经修饰的核糖核苷酸，其中经修饰的核糖核苷酸为DNA核苷酸。在某些实施方案中，(N’)y包括1、2、3、4、5、6、7或多达8个DNA部分。
在一些实施方案中，Z或Z’存在且独立地包括两个非核苷酸部分。
在另外的实施方案中，Z和Z′均存在且各自独立地包括两个非核苷酸部分。
在一些实施方案中，Z和Z’的每一个包括脱碱基部分，例如脱氧核糖脱碱基部分(本文称为“dAb”)或核糖脱碱基部分(本文称为“rAb”)。在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个包括两个共价连接的脱碱基部分并且为(例如)dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb，其中每个部分优选通过基于磷酸基的键与相邻部分连接。在一些实施方案中基于磷酸基的键包括硫代磷酸酯键、膦酰基乙酸酯键或磷酸二酯键。在一些实施方案中基于磷酸基的键包括磷酸二酯键。
在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个包括烷基部分、任选丙烷((CH2)3)部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH)和丙二醇的磷酸化衍生物(“C3-3’Pi”)。在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个包括通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与反义链或有义链的3’末端共价连接和通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与彼此共价连接的两个烷基部分，并且在一些实例中为C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH。反义链的3’末端和/或有义链的3’末端通过基于磷酸基的键与C3部分共价连接，并且C3部分通过基于磷酸基的键与C3-OH部分共价连接。在一些实施方案中，基于磷酸基的键包括硫代磷酸酯键、膦酰基乙酸酯键或磷酸二酯键。在优选的实施方案中基于磷酸基的键包括磷酸二酯键。
在结构A1或结构A2的多个实施方案中，Z和Z’不存在。在其它实施方案中，Z或Z’存在。在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个独立地包括C2、C3、C4、C5或C6烷基部分、任选C3部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH/C3OH)、丙二醇和丙二醇的磷酸二酯衍生物(“C3Pi”)。在优选的实施方案中，Z和/或Z’的每一个包括两个烃部分并且在一些实例中为C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。每个C3通过共价键，优选通过基于磷酸基的键与相邻C3共价轭合。在一些实施方案中基于磷酸基的键为硫代磷酸酯键、膦酰基乙酸酯键或磷酸二酯键。
在特定实施方案中，x＝y＝19并且Z包含至少一个C3烷基突出端。在一些实施方案中C3-C3突出端通过共价连键，优选通过磷酸二酯键与(N)x或(N’)y的3’末端共价连接。在一些实施方案中，第一个C3与第二个C3之间的键为磷酸二酯键。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端为C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端为C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端为C3Pi-C3OH。
在多个实施方案中，烷基部分包含烷基衍生物，包括包含末端羟基、末端氨基或末端磷酸基团的C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在一些实施方案中，烷基部分为C3烷基或C3烷基衍生物部分。在一些实施方案中，C3烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。C3烷基部分通过磷酸二酯键与(N’)y的3’末端和/或(N)x的3’末端共价连接。在一些实施方案中，烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯或硫代磷酸丙酯。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其组合或其多个，尤其是2或3个共价连接的丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-丙醇；丙基磷酸-硫代磷酸丙酯；丙基磷酸-磷酸丙酯；(磷酸丙酯)3、(磷酸丙酯)2-丙醇、(磷酸丙酯)2-硫代磷酸丙酯。Z或Z’中可包括任何丙烷或丙醇轭合部分。
示例性3’末端非核苷酸的结构如下：
在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其组合或其多个。
在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-丙醇；丙基磷酸-硫代磷酸丙酯；丙基磷酸-磷酸丙酯；(磷酸丙酯)3、(磷酸丙酯)2-丙醇、(磷酸丙酯)2-硫代磷酸丙酯。Z或Z’中可包括任何丙烷或丙醇缀合部分。
在另外的实施方案中，Z和/或Z’的每一个包括脱碱基部分和未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合、或烃部分和未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合、或脱碱基部分(脱氧核糖或核糖)和烃部分的组合。在这些实施方案中，Z和/或Z’的每一个包括C3-rAb或C3-dAb，其中每个部分通过基于磷酸基的键，优选通过磷酸二酯键、硫代磷酸酯键或膦酰基乙酸酯键与相邻部分共价结合。
在某些实施方案中，本文公开的核酸分子包括分别选自以下表4和5中所示(SEQID NO:60-126和194-218)任一个的有义寡核苷酸序列。
在某些实施方案中，所提供的化合物包括如本文所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物_7、化合物_8和化合物_9。
在一些实施方案中，(例如，如本文所述的化合物1、化合物5和化合物6)提供了19聚体双链核酸分子，其中反义链为SEQ ID NO:127而有义链为SEQ ID NO:60。在某些实施方案中，提供了19聚体双链核酸分子，其中反义链为SEQ ID NO:127并包括2’OMe修饰的核糖核苷酸、在位置1、5、6或7的至少一处的2’-5’核糖核苷酸和与3’末端共价连接的3’末端非核苷酸部分；并且有义链为SEQ ID NO:60并包括至少一个2’-5’-核糖核苷酸或2’OMe修饰的核糖核苷酸、在3’末端共价连接的非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分。在一些实施方案中，提供了19聚体双链核酸分子，其中反义链为SEQ ID NO:127并包括在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的3’末端C3OH非核苷酸部分；并且有义链为SEQ IDNO:60并包括于3’末端位置15、16、17、18和19处的5个连续2’-5’-核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3Pi非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基部分。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物1，其中反义链为SEQID NO:127并包括在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；并且有义链为SEQ IDNO:60并包括于3’末端位置15、16、17、18和19处的5个连续2’-5’-核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3Pi非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基部分；并且进一步包括反义链的位置1处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物6，其中反义链为SEQID NO:127并包括在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；并且有义链为SEQ IDNO:60并包括于3’末端位置15、16、17、18和19处的5个连续2’-5’-核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3Pi非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基部分；并且进一步包括反义链的位置1处的2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物5，其中反义链为SEQID NO:127并包括在位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；并且有义链为SEQ IDNO:60并包括于3’末端位置7、13、16和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置9处的2’-5’-核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基部分。
在一些实施方案(例如，如本文所述的化合物2和化合物7)中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ ID NO:63而反义链为SEQ ID NO:130。在一些实施方案中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ ID NO:63并包括2’OMe修饰的嘧啶核糖核苷酸、在3’末端共价连接的非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分；并且反义链为SEQID NO:130并包括2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的非核苷酸部分。在一些实施方案中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ IDNO:63并包括2’OMe修饰的核糖核苷酸，在3’末端共价连接的非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分；并且反义链为SEQ ID NO:130并包括2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置5、6或7至少一处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的非核苷酸部分。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物2，其中有义链为SEQID NO:63并包括在位置2、14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链为SEQID NO:130并包括在位置1、3、5、9、12、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7至少一处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物7，其中有义链为SEQID NO:63并包括在位置2、14和18处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链为SEQID NO:130并包括在位置1、3、5、9、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分。
在一些实施方案(例如，如本文所述的化合物3)中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ ID NO:98而反义链为SEQ ID NO:165。在一些实施方案中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ ID NO:98并包括3’末端位置处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分；并且反义链为SEQ ID NO:165并包括2’OMe修饰的核糖核苷酸，位置5、6或7至少一处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的非核苷酸部分。在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物3，其中有义链为SEQ ID NO:98并包括在位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸：在3’末端共价连接的C3-OH 3’部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链为SEQID NO:165并包括在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’核糖核苷酸和在3’末端共价连接的C3Pi-C3OH。
在一些实施方案(例如，如本文所述的化合物4、化合物8和化合物9)中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ ID NO:101而反义链为SEQ ID NO:168。在一些实施方案中，提供了19聚体双链核酸分子，其中有义链为SEQ ID NO:101并包括2’OMe修饰的嘧啶核糖核苷酸，位置9或10其中一处的任选2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的非核苷酸部分和在5’末端共价连接的帽部分；并且反义链为SEQ ID NO:168并包括2’OMe修饰的核糖核苷酸，位置5、6或7至少一处的2’-5’-核糖核苷酸和在3’末端共价连接的非核苷酸部分。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物4，其中有义链为SEQID NO:101并包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，位置9处的2’-5’核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链为SEQ ID NO:168并包括在位置1、4、8、11和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸；在3’末端共价连接的3’C3Pi-C3OH突出端。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物8，其中有义链为SEQID NO:101并包括在位置4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸，在3’末端共价连接的C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链为SEQ ID NO:168并包括在位置1、4、8、13和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸和在3’末端共价连接的3’C3Pi-C3OH突出端。
在一个实施方案中，提供了为19聚体双链核酸分子的化合物9，其中有义链为SEQID NO:101并包括在位置2、4、11、13和17处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、在3’末端共价连接的C3OH非核苷酸部分和在5’末端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；并且反义链为SEQ ID NO:168并包括在位置1、4、8、11和15处的2’OMe修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’-核糖核苷酸和在3’末端共价连接的3’C3Pi-C3OH非核苷酸部分。
在另一方面，提供了通过按足以降低hsp47表达的量将本文所提供的核酸分子引入细胞内以降低细胞中hsp47表达的方法。在一个实施方案中，细胞为肝细胞星状细胞。在另一实施方案中，细胞为肾脏或肺部组织中的星状细胞。在某些实施方案中，在体外进行所述方法，在其它实施方案中，在体内进行所述方法。
在又一方面，提供了治疗患有hsp47相关疾病的个体的方法。所述方法包括按足以降低hsp47表达的量向个体施用例如本文提供的核酸分子。在某些实施方案中，hsp47相关疾病为选自以下的疾病：肝纤维化、肝硬化、包括肺脏纤维化在内的肺纤维化(包括ILF)、引起肾纤维化的任何病状(例如，包括ESRD在内的CKD)、腹膜纤维化、慢性肝损伤、原纤维形成、其它器官的纤维化疾病、与所有可能类型的意外及医原性(手术)皮肤损伤相关的异常瘢痕形成(瘢痕瘤)；硬皮病；心肌纤维化、青光眼滤过手术失败；和肠粘连。在一些实施方案中，化合物可用于治疗器官特异性适应证，例如包括下表1中所示适应证在内的适应证：
表1
本文另外的实施方案是用于治疗星状细胞相关疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的下文描述的药物组合物。所述疾病包括肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胰腺炎、胰囊性纤维化、胰腺癌、声带疤痕、声带粘膜纤维化和喉部纤维化。在一些实施方案中，优选的适应证包括归因于肝脏移植后丙型肝炎的肝硬化；归因于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的肝硬化；特发性肺纤维化；导致肺纤维化的放射性肺炎；糖尿病性肾病；与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)相关的腹膜硬化和眼部瘢痕性类天庖疮。
纤维化肝适应证包括酒精性肝硬化、乙肝性肝硬化、丙型肝炎性肝硬化、原位肝移植(OLTX)后丙型肝炎性(Hep C)肝硬化、NASH/NAFLD、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、胆道闭锁、α-1抗胰蛋白酶缺乏综合征(A1AD)、铜贮积病(威尔森氏病(Wilson’s disease))、果糖血症、半乳糖症、糖原贮积疾病(尤其是III、IV、VI、IX和X型)、铁过载综合征(血色沉着病)、血脂异常(例如，高雪氏病(Gaucher’s disease))、过氧化物酶病(例如，泽韦格综合征(Zellweger syndrome))、酪氨酸血症、先天性肝纤维变性、细菌感染(例如，布鲁氏菌病(brucellosis))、寄生虫病(例如，包虫病)、布加氏综合征(Budd-Chiari syndrome)(肝静脉阻塞病)。
肺部适应证包括特发性肺纤维化、硅肺病、肺尘埃沉着病、新生儿新生儿呼吸窘迫综合征后的支气管肺发育不良、博来霉素/化疗致肺损伤、肺移植后闭塞性细支气管炎(BOS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维变性、哮喘。
心脏适应证包括心肌病、动脉粥样硬化(伯格氏病等)、心肌心内膜纤维变性、心房纤维性颤动、心肌梗塞(MI)后瘢痕形成。
其它胸部适应证包括织纹面乳房植入物周围放射诱导的囊体组织反应和口腔粘膜下层纤维变性。
肾脏适应证包括常染色体显性多囊肾病(ADPKD)、糖尿病性肾病(糖尿病肾小球硬化症)、FSGS(萎陷与其它组织学变体)、IgA肾病(伯格氏病)、狼疮性肾炎、韦格纳氏病(Wegner’s)、硬皮病、肺出血肾炎综合征(Goodpasture Syndrome)、肾小管间质纤维化：药物诱导的(预防性)青霉素、头孢菌素、镇痛药性肾病变、膜性增生性肾小球性肾炎(MPGN)、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein Purpura)、先天性肾病：髓质囊肿病、指甲髌骨综合征和奥尔波特综合征(Alport Syndrome)。
骨髓适应证包括淋巴管-平滑肌瘤(lympangiolyomyositosis，LAM)、慢性移植物抗宿主病、真性红细胞增多、原发性血小板增多症、骨髓纤维化。
眼部适应证包括早产儿视网膜病(RoP)、眼部瘢痕性类天庖疮、泪腺纤维化、视网膜连接术、角膜浑浊、疱疹性角膜炎、翼状胬肉、青光眼、年龄相关性黄斑变性(AMD/ARMD)、视网膜纤维化相关的糖尿病(DM)性视网膜病变。
妇产科适应证包括子宫内膜异位，其伴随预防STD纤维化/输卵管炎后瘢痕形成的激素疗法发生。
全身性适应证包括掌腱膜挛缩症(Dupuytren’s disease)、掌腱膜纤维瘤病、佩罗尼氏病(Peyronie’s disease)、Ledderhose病、瘢痕瘤、多灶性纤维硬化、肾原性系统纤维化、肾原性骨髓纤维化(贫血)。
损伤相关的纤维化病包括烧伤(包括化学药品)诱导的皮肤和软组织瘢痕形成和收缩、癌症治疗放疗后放射诱导的皮肤和器官瘢痕形成、瘢痕瘤(皮肤)。
手术适应证包括腹膜透析管、角膜移植、耳蜗移植、其它移植、乳房硅酮移植后腹膜纤维化、慢性窦炎；透析移植物的黏着、假性内膜增生。
其它适应证包括慢性胰腺炎。
在一些实施方案中，提供了治疗患有肝纤维化的对象的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本文公开的核酸分子，从而治疗肝纤维化。在一些实施方案中，对象患有归因于肝炎的肝硬化。在一些实施方案中，对象患有归因于NASH的肝硬化。
在一些实施方案中，提供了本文公开的核酸分子用于制备治疗肝纤维化的药物的用途。在一些实施方案中，肝纤维化归因于肝炎。在一些实施方案中肝纤维化归因于NASH。
在一些实施方案中，提供了重塑瘢痕组织的方法，所述方法包括向需要的对象施用有效量的本文公开的核酸分子，从而实现瘢痕组织重塑。在一些实施方案中，瘢痕组织在肝脏中。在一些实施方案中，对象患有归因于肝炎的肝硬化。在一些实施方案中，对象患有归因于NASH的肝硬化。
在一些实施方案中，提供了实现纤维化消退的方法，所述方法包括向需要的对象施用有效量的本文公开的核酸分子，从而实现纤维化消退。
在一些实施方案中，提供了减少对象瘢痕组织的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本文公开的核酸分子以减少瘢痕组织的步骤。在一些实施方案中，提供了减少对象瘢痕组织的方法，所述方法包括向瘢痕组织局部施用有效量的本文公开的核酸分子以减少瘢痕组织的步骤。
在一些实施方案中，提供了改善瘢痕组织外观的方法，所述方法包括向瘢痕组织局部施用有效量的本文公开的核酸分子以改善瘢痕组织外观的步骤。
在一些实施方案中，提供了治疗患有肺纤维化的对象的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本文公开的核酸分子，从而治疗肺纤维化。在一些实施方案中，对象患有间质性肺纤维化(ILF)。在一些实施方案中，对象患有导致肺纤维化的放射性肺炎。在一些实施方案中，对象患有药物诱导的肺纤维化。
在一些实施方案中，提供了本文公开的核酸分子用于制备治疗肺纤维化的药物的用途。在一些实施方案中，肺纤维化为ILF。在一些实施方案中，肺纤维化为药物或放射诱导的肺纤维化。
在一方面，提供了包括于药学上可接受的载体中的本文所述核酸分子(例如，siNA分子)的药物组合物。在某些实施方案中，药物制剂包括或包含适于将核酸分子(例如，siNA分子)递送至个体(例如患者)的递送系统，例如以下更加详细描述的递送系统。
在一有关方面，提供了包括经包装以供患者使用的核酸分子(例如，siNA分子)的组合物或试剂盒。包装可贴标签或包括指出包装的内含物并提供关于患者应或可如何使用核酸分子(例如，siNA分子)的某些信息的标签或药品说明书，例如标签可包括给药信息和/或使用指南。在某些实施方案中，标签的内容将具有政府机关(例如美国食品和药物管理局)规定形式的公告。在某些实施方案中，标签可指出核酸分子(例如，siNA分子)适合用于治疗患有hsp47相关疾病的患者；例如，标签可指出核酸分子(例如，siNA分子)适合用于治疗纤维瘤；或例如，标签可指出核酸分子(例如，siNA分子)适合用于治疗选自纤维化、肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、肾纤维化、腹膜纤维化、慢性肝损伤和原纤维形成的疾病。
如本文所使用的术语“热休克蛋白47”或“hsp47”或“HSP47”可互换使用并且指具有任何hsp4蛋白活性的任何热休克蛋白47、肽或多肽。热休克蛋白47为丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，也称为(例如)serpin肽酶抑制剂、进化枝H、成员1(SERPINH1)、SERPINH2、胶原结合蛋白1(CBP1)、CBP2、gp46；砷转化激活蛋白3(AsTP3)；HSP47；增殖诱导基因14(PIG14)；PPROM；风湿性关节炎抗原A-47(RA-A47)；胶原结合蛋白-1；和胶原结合蛋白-2。在某些优选的实施方案中，“hsp47”指人hsp47。热休克蛋白47(或更特别地人hsp47)可具有与SEQ IDNO.2(图7)相同或基本上相同的氨基酸序列。
如本文所使用的术语“编码hsp47的核苷酸序列”指编码hsp47蛋白或其部分的核苷酸序列。术语“编码hsp47的核苷酸序列”也旨在包括hsp47编码序列，例如hsp47同种型、突变hsp47基因、hsp47基因的剪接突变体和hsp47基因多态性。编码hsp47的核酸序列包括编码hsp47的mRNA序列，也称为“hsp47mRNA”。人hsp47mRNA的示例性序列为SEQ ID.NO.1。
如本文所使用术语“核酸分子”或“核酸”可互换使用并且指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸。本文更加详细地描述了“核酸子”的变型。核酸分子涵盖本文所述的经修饰核酸分子和未经修饰的核酸分子。核酸分子可包括呈任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。
如本文所使用术语“核苷酸”指具有糖(或其类似物或经修饰糖)、核苷酸碱基(或其类似物或经修饰碱基)和磷酸基团(或其类似物或经修饰磷酸基团)的化学部分。核苷酸涵盖如本文所述经修饰的核苷酸或未经修饰的核苷酸。如本文所使用，核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸(例如，未经修饰的脱氧核糖核苷酸)、核糖核苷酸(例如，未经修饰的核糖核苷酸)、经修饰的核苷酸类似物，尤其包括锁核酸和解锁核酸、肽核酸、L-核苷酸(也称为镜像核苷酸)、亚乙基桥接核酸(ENA)、阿拉伯糖苷、PACE、具有6碳糖的核苷酸以及常视为非核苷酸的核苷酸类似物(包括脱碱基核苷酸)。在一些实施方案中，核苷酸可在糖、核苷酸碱基和/或磷酸基团中经本领域中已知的任何修饰，例如本文所述的修饰所修饰。如本文所使用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”指连接的核苷酸链；同样多核苷酸和寡核苷酸可具有如本领域中众所周知和/或本文公开的核苷酸糖、核苷酸碱基和磷酸主链中的修饰。
如本文所使用，术语“短干扰核酸”、“siNA”或“短干扰核酸分子”指能够调节基因表达或病毒复制的任何核酸分子。优选地，siNA抑制或下调基因表达或病毒复制。siNA包括但不限于能够介导序列特异性RNAi的核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰经修饰寡核苷酸、经化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)和其它。如本文所使用，“短干扰核酸”、“siNA”或“短干扰核酸分子”具有本文它处更加详细描述的含义。
如本文所使用，术语“互补”指核酸可通过常规沃森-克里克或其它非常规类型与另一核酸序列形成氢键。关于本文公开的核酸分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以使核酸的相关功能进行，例如RNAi活性。核酸分子结合自由能的确定在本领域中众所周知(见，例如，Turner等，1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII第123-133页；Frier等，1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:9373-9377；Turner等，1987,J.Am.Chem.Soc.109:3783-3785)。百分比互补性指出了核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的邻近残基的百分比(例如第一个寡核苷酸中总计10个核苷酸中5、6、7、8、9或10的核苷酸与具有10个核苷酸的第二核酸序列碱基配对分别表示50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”指核酸分子的所有邻近残基将与第二核酸序列中相同数量的邻近残基氢键结合。在一个实施方案中，本文公开的核酸分子包括约15至约35个或更多个(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个或更多个)与一个或多个靶核酸分子或其部分互补的核苷酸。
如本文所使用，术语“有义区”指与siNA分子的反义区互补(部分或完全)的siNA分子的核苷酸序列。siNA分子的有义链可包括与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。如本文所使用，“有义链”指包括有义区并且也可包括另外的核苷酸的核酸分子。有义链的核苷酸位置本文按5’>3’编号。
如本文所使用，术语“反义区”指与靶核酸序列互补(部分或完全)的siNA分子的核苷酸序列。siNA分子的反义链可任选包括与siNA分子的有义区互补的核酸序列。如本文所使用，术语“反义链”指包括反义区并且也可包括另外的核苷酸的核酸分子。反义链的核苷酸位置本文按5’>3’编号。
如本文所使用，术语“RNA”指包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。
如本文所使用，术语“双链体区”指两个互补或基本上互补的寡核苷酸中通过沃森-克里克碱基配对或允许互补或基本上互补的寡核苷酸链之间的双链体的任何其它方式相互形成碱基对的区域。例如，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可与21个核苷酸单元的另一个寡核苷酸碱基配对，然而每条链上仅19个碱基互补或基本上互补，使得“双链体区”由19个碱基对组成。剩余碱基对可(例如)作为5’和3’突出端存在。进一步地，双链体区中，不需要100％互补性；双链体区中可允许基本上的互补性。基本上的互补性指链之间使其能够在生物条件下退火互补性。根据经验确定两条链是否能够在生物条件下退火的技术在本领域中众所周知。可选地，可在生物条件下合成两条链并加在一起以确定它们是否相互退火。
如本文所使用，术语“非配对核苷酸类似物”指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，包括但不限于：6消氨基腺苷(水粉蕈素(Nebularine))、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Meribo U、N3-Me riboT、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为核糖核苷酸。在其它实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为脱氧核糖核苷酸。
如本文所使用，术语“末端官能团”包括但不限于卤素、醇基、胺基、羧基、酯基、酰胺基、醛基、酮基、醚基。
如本文所使用的术语“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”在本文和本领域中通常也可能称为假核苷酸或非常规部分。虽然核苷酸为核酸的单体单元，通常由核糖或脱氧核糖、磷酸和碱基(DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。脱碱基或假核苷酸缺乏碱基，因此在严格意义上并非为本领域中通常所使用的术语核苷酸。脱碱基脱氧核糖部分包括(例如)脱碱基脱氧核糖-3’-磷酸；1,2-双脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸；1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸。反向脱碱基脱氧核糖部分包括反向脱碱基脱氧核糖；3’,5’反向脱氧脱碱基5’-磷酸。
如本文使用的术语“加帽部分”(z”)包括可与(N’)y的5’末端共价连接的部分并且包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、包括2’O烷基修饰的修饰脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分；反向脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及其修饰；C6-亚氨基-Pi；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸；5’OMe核苷酸；和核苷酸类似物，包括4’,5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃基)核苷酸；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5’-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1,5-脱水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3’,4’-开环核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸；5’-5’-反向脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；和桥接或非桥接甲基膦酸酯和5’-巯基部分。
某些加帽部分可为脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；反向脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸。可使用一种或多种反向核苷酸，例如反向胸苷或反向腺嘌呤合成本文公开的核酸分子(例如见Takei等，2002.JBC277(26):23800-06)。
如本文所使用的术语“非常规部分”指非核苷酸部分，包括脱碱基部分、反向脱碱基部分、烃(烷基)部分及其衍生物，并且进一步包括脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；包括LNA和亚乙基桥接核酸的桥接核酸，连键修饰(例如，PACE)和碱基修饰的核苷酸以及本文明确公开为非常规部分的另外的部分。
如本文所使用，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“降低”指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的RNA分子或等效RNA分子(例如，mRNA)的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性降低至低于在抑制因子(例如具有本文所述结构特征的核酸分子，例如siNA)缺乏时观察到的活性；例如表达可降低至90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或低于在抑制剂缺乏时观察到的表达。
附图简述
图1是显示使用NRK细胞体外评价gp46-siRNA的效果以及确定最佳序列、时间和浓度的方案图。
图2是显示gp46和肌动蛋白(培养24小时，检查最佳序列)的蛋白印迹结果的相片图像。
图3是显示gp46和肌动蛋白(培养24小时，检查最佳浓度)的蛋白印迹结果的相片图像。
图4是显示gp46和肌动蛋白(浓度50nM，检查最佳培养时间)的蛋白印迹结果的相片图像。
图5是显示用于评估NRK细胞中gp46-siRNA对胶原表达抑制的方案的示意图。
图6是显示siRNA抑制胶原合成的图。
图7是显示HSC-特异性siRNA转染的相片图像。
图8是用于评估HSC-特异性siRNA转染百分比的相片图像。
图9是用于评估siRNA对gp46表达抑制的相片图像。
图10是显示施用了DMN的大鼠肝脏的Azan染色的相片图像。
图11是显示LC大鼠治疗方案的示意图。
图12是显示施用了VA-Lip-gp46siRNA的LC大鼠肝脏的Azan染色的相片图像。
图13是显示通过NIH Image提取染色部分的方法(从Azan染色图像随机获取6个位置)的示意图。
图14是显示肝脏组织学中纤维化部分占据的面积比例(胶原面积比例，％)的图像。
图15是显示肝组织中羟脯氨酸的量的图像。
图16是显示门静脉施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠的存活曲线的图。
图17是显示门静脉施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠肝组织的Azan染色的相片图像。
图18是显示门静脉施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠的存活曲线的图。
图19是显示门静脉施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠肝组织的Azan染色的相片图像。
图20是显示静脉内施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠的存活曲线的图。
图21是显示静脉内施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠的存活曲线的图。
图22是显示静脉内施用了VA-Lip-gp46siRNA的肝硬化大鼠肝组织的Azan染色的相片图像。
图23是显示通过RBP改善VA-Lip-gp46siRNA转染效率的图像。
图24是显示通过抗-RBP抗体抑制VA-Lip-gp46siRNA转染的图像。
图25为示出GFP siNA对各个报告细胞系的影响的条形图。通过将人HSP47cDNA-GFP或大鼠GP46cDNA-GFP构建体经慢病毒诱导为HEK293、人纤维肉瘤细胞系HT1080、人HSC系hTERT或NRK细胞系创建细胞系。将阴性对照siNA或抗GFP的siNA引入细胞中并测量GFP荧光。结果显示，在不同细胞系中抗GFP的siNA将荧光敲低至不同程度。选择293_HSP47-GFP和293_GP46-GFP细胞系进行siHsp47筛选，因为它们易于转染并且对荧光敲低敏感。
图26A、26B、26C和26D为示出了293_HSP47-GFP和293_GP46-GFP细胞系中各siHsp47的细胞毒性和敲低效率的一系列条形图。结果显示siHsp47-C、siHsp47-2和siHsp47-2d有效敲低人HSP47和大鼠GP46(人hsp47同源物)，大体上无细胞毒性。抗GP46的siGp46A不敲低人HSP47。另外，新设计的siHsp47在敲低大鼠GP46方面优于siGp46A。
图27为示出了使用人HSC细胞系hTERT通过qPCR测量的各siHsp47对hsp47mRNA的敲低作用的条形图。Y轴表示hsp47的剩余mRNA水平。在试验的所有hsp47siNA中HSP47-C最有效。
图28为示出了hTERT细胞中不同hsp47siNA对胶原I表达的影响的条形图。通过使用探针进行实时定量PCR测量胶原ImRNA水平。Y轴表示胶原I的剩余mRNA表达。结果显示在用一些候选物(siHsp47-2、siHsp47-2d及其与siHsp47-1的组合)处理的细胞中胶原I mRNA水平显著降低。
图29显示在用siHSP47处理的动物体内肝脏的纤维化区域减少。
图30是实施例22使用的处理时间表和评估方法的示意图。
图31显示用Azan在肺野的组织学染色的结果。图片以80X放大率显示每组Azan染色切片的代表性肺野。(a)预处理(BLM IT-2W)；(b)患病大鼠(BLM IT-5W+PBS i.v.)；和(c)处理(BLM IT+siRNA i.v.)，(d)Sham(Saline-IT+PBS i.v.).
图32显示纤维化得分，示出了以80X放大率对每只大鼠评估20个随机选择的肺野的结果。条形图总结了每组Azan染色切片的纤维化得分。统计学分析使用Prism5软件利用One-way-ANOVA Bonferroni多重比较检验进行。
发明详述
RNA干扰和siNA核酸分子
RNA干扰指在动物体内受短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默过程(Zamore等，2000,Cell,101,25-33；Fire等，1998,Nature,391,806；Hamilton等，1999,Science,286,950-951；Lin等，1999,Nature,402,128-129；Sharp,1999,Genes&Dev.,13:139-141；和Strauss，1999,Science,286,886)。细胞中dsRNA的存在通过尚未完全表征的机制触发RNAi反应。
Dicer牵涉于将dsRNA加工为称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段(Zamore等，2000,Cell,101,25-33；Bass,2000,Cell,101,235；Berstein等，2001,Nature,409,363)。源于dicer活性的短干扰RNA通常长度为约21至约23个核苷酸并包括约19个碱基对的双链体(Zamore等，2000,Cell,101,25-33；Elbashir等，2001,Genes Dev.,15,188)。在从翻译控制中牵连的保守结构的前体RNA切除21和22-核苷酸小时序RNA(stRNA)中也牵连dicer(Hutvagner等，2001,Science,293,834)。RNAi反应也是内切核酸酶复合体的特征，通常称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部发生(Elbashir等，2001,Genes Dev.,15,188)。
已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等，1998,Nature,391,806首先在秀丽隐杆线虫中观察到了RNAi。Bahramian and Zarbl，1999,Molecular and Cellular Biology,19,274-283和Wianny and Goetz,1999,Nature Cell Biol.,2,70描述了哺乳动物系统中dsRNA介导的RNAi。Hammond等，2000,Nature,404,293描述了经dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等，2001,Nature,411,494和Tuschl等，国际PCT公布No.WO 01/75164描述了通过将引入培养的哺乳动物细胞(包括人胚肾和HeLa细胞)中合成21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi。最近对果蝇胚胎溶解产物的研究(Elbashir等，2001,EMBO J.,20,6877和Tuschl等，国际PCT公布No.WO 01/75164)已揭示对介导有效RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列的某些要求。
核酸分子(例如具有本文公开的结构特征)可通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默抑制或下调基因表达或病毒复制；见例如，Zamore等，2000,Cell,101,25-33；Bass，2001,Nature,411,428-429；Elbashir等，2001,Nature,411,494-498；和Kreutzer等，国际PCT公布No.WO 00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公布No.WO 01/36646；Fire，国际PCT公布No.WO 99/32619；Plaetinck等，国际PCT公布No.WO 00/01846；Mello和Fire,国际PCT公布No.WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公布No.WO99/07409；和Li等，国际PCT公布No.WO 00/44914；Allshire，2002,Science,297,1818-1819；Volpe等，2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein，2002,Science,297,2215-2218；和Hall等，2002,Science,297,2232-2237；Hutvagner和Zamore，2002,Science,297,2056-60；McManus等，2002,RNA,8,842-850；Reinhart等，2002,Gene&Dev.,16,1616-1626；和Reinhart&Bartel,2002,Science,297,1831)。
siNA核酸分子可由两条单独的多核苷酸链装配而成，其中一条链为有义链而另一条为反义链，其中反义链和有义链自互补(即，每条链包括与另一条链上的核苷酸序列互补的核苷酸序列)；例如其中反义链和有义链形成具有如本文关于如所提供的核酸分子所描述的任何长度及结构的双链体或双链结构，例如其中双链区(双链体区)为约15至约49个碱基对(例如，约17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个碱基对)；反义链包括与靶核酸分子(即，hsp47mRNA)或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包括与靶核酸序列或其一部分相对应的核苷酸序列(例如，本文核酸分子的约17至约49个或更多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补)。
在某些方面和实施方案中，本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可为“RISC长度”分子或可为以下更加详细描述的Dicer底物。
siNA核酸分子可包括单独的有义和反义序列或区域，其中有义和反义区通过如本文领域中已知的核苷酸或非核苷酸连接分子共价连接，或通过离子相互作用、氢键合、范德华相互作用、疏水相互作用和/或堆积相互作用交替地非共价连接。核酸分子可包括与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。核酸分子可以使靶基因表达受到抑制的方式与靶基因的核苷酸序列相互作用。
或者，siNA核酸分子可由单个多核苷酸装配而成，其中核酸分子的自补有义和反义区依靠基于核酸或非基于核酸的连接子连接，即反义链和有义链是单个多核苷酸具有折叠形成双链体区(例如形成本领域中众所周知的“发夹”结构)的反义区和有义区的一部分。这种siNA核酸分子可为具有双链体、非对称双链体、发夹或非对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自补有义和反义区，其中反义区包括与单独靶核酸分子的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列(例如，hsp47mRNA的序列)相对应的核苷酸序列。这种siNA核酸分子可为具有两个或更多个环的环状单链多核苷酸和包含自补有义和反义区的主干，其中反义区包括与靶核酸分子中的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分相对应的核苷酸序列，并且其中在体内或体外加工环状多核苷酸以生成能够介导RNAi的活性核酸分子。
在本领域中常用以下命名法描述siNA分子的长度和突出端并且可在整篇说明书和实施例中使用。在本文所有寡核苷酸的描述中，序列中核苷酸的标识对有义和反义链均以5’至3’方向给出。为双链体指定的名称指出了寡聚体的长度和突出端的存在或不存在。例如，“21+2”双链体含有两条长度均为21个核苷酸的核酸链，也称为21聚体siRNA双链体或21聚体核酸并且具有2个核苷酸的3’-突出端。“21-2”设计指具有2个核苷酸的5’-突出端的21聚体核酸双链体。21-0设计为没有突出端(平端)的21聚体核酸双链体。“21+2UU”为具有2-核苷酸3’-突出端的21聚体双链体并且3’端的2个末端核苷酸均为U残基(这可能导致与靶序列错配)。前述命名法可应用于具有各种长度的链、双链体和突出的siNA分子(例如19-0、21+2、27+2等)。在替代性但相似的命名法中，“25/27”为具有25碱基有义链和27碱基反义链，带有2-核苷酸的3’-突出端的非对称双链体。“27/25”为具有27碱基有义链和25碱基反义链的非对称双链体。
化学修饰
在某些方面和实施方案中，本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)包括一个或多个修饰(或化学修饰)。在某些实施方案中，这些修饰包括使得分子不同于标准核糖核苷酸或RNA分子(即，包括标准腺苷、胞嘧啶、尿嘧啶或鸟苷部分的核糖核苷酸或RNA分子)的核酸分子或多核苷酸的任何改变；标准核糖核苷酸可称为“未经修饰的”核糖核苷酸或未经修饰的核糖核酸。具有腺苷、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鸟苷部分表示的2’-脱氧糖的常规DNA碱基和多核苷酸可称为“未经修饰的脱氧核糖核苷酸”或“未经修饰的脱氧核糖核酸”；因此，除非有清楚的相反指示，如本文所使用的术语“未经修饰的核苷酸”或“未经修饰的核酸”指“未经修饰的核糖核苷酸”或“未经修饰的核糖核酸”。这种修饰可存在于核苷酸糖、核苷酸碱基、核苷酸磷酸基团和/或多核苷酸的磷酸主链中。
在某些实施方案中，本文公开的修饰可用于增强分子的RNAi活性和/或增强分子在体内的稳定性，尤其是在血清中的稳定性，和/或增强分子的生物利用率。修饰的非限制性实例包括但不限于核苷酸间或核苷间连键；在核酸分子的任何位置和链上的脱氧核苷酸和双脱氧核糖核苷酸；在2’-位置处具有优选选自氨基、氟、甲氧基、烷氧基和烷基的修饰的核酸(例如，核糖核酸)；2’-脱氧核糖核苷酸、2’-OMe核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、生物素基团和末端甘油基和/或反向脱氧脱碱基残基掺入、位阻分子，例如荧光分子等。其它核苷酸修饰因子可包括3’-脱氧腺苷(蛹虫草菌素(cordycepin))、3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧肌苷(ddI)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)、2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)和3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)和2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)的单磷酸核苷酸。以下更加详细地描述了有关各种修饰的更多详情。
经修饰的核苷酸包括具有Northern构象(例如，Northern假回转环，见例如Saenger,Principles of Nucleic Acid Structure,Springer-Verlag编，1984)的核苷酸。具有northern构型的核苷酸的非限制性实例包括LNA核苷酸(例如，2’-O、4’-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2’-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2’-甲基-硫代-乙基、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、2’-脱氧-2’-氯代核苷酸、2’-叠氮核苷酸和2’-OMe核苷酸。例如，在Elman等，2005；Kurreck等，2002；Crinelli等，2002；Braasch和Corey，2001；Bondensgaard等，2000；Wahlestedt等，2000；和WO 00/47599、WO 99/14226、WO 98/39352和WO 2004/083430中描述了LNA。在一个实施方案中，LNA在有义链的5’末端掺入。
化学修饰还包括为非核苷酸、无环类似物的UNA，其中C2’-C3’键不存在(虽然UNA并非真正的核苷酸，但是UNA显然包括在本文考虑到的“经修饰”核苷酸或经修饰核酸范围内)。在特定实施方案中，具有突出端的核酸分子可修饰为在突出端位置(即，2个核苷酸突出端)具有UNA。在其它实施方案中，在3’-或5’-端包括UNA。UNA可位于沿核酸链的任何地方，即位置7。核酸分子可能含有一个或多个UNA。Nucleic Acids Symposium SeriesNo.52p.133–134(2008)中公开了示例性UNA。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子(例如，siNA分子)包括一个或多个UNA；或一个UNA。在一些实施方案中，如本文所述具有3’-突出端的核酸分子(例如，siNA分子)包括一个或两个于3’突出中的UNA。在一些实施方案中如本文所述的核酸分子(例如，siNA分子)包括于反义链中的UNA(例如一个UNA)；例如在反义链的位置6或位置7处。化学修饰还包括例如本文所述的非配对核苷酸类似物。化学修饰进一步包括本文公开的非常规部分。
化学修饰还包括于寡核苷酸的5’和/或3’部分的末端修饰并且也称为加帽部分。这种末端修饰选自核苷酸、经修饰的核苷酸、脂质、肽和糖。
化学修饰还包括六元“六元环核苷酸类似物”。Allart等(Nucleosides&Nucleotides,1998,17:1523-1526；和Perez-Perez等，1996,Bioorg.and Medicinal ChemLetters 6:1457-1460)中公开了六元环核苷酸类似物的实例。国际专利公布No.WO 2006/047842中公开了包括六元环核苷酸类似物的寡核苷酸，包括阿卓糖醇核苷酸单体。
化学修饰还包括与正常的天然核苷酸相比具有反手性的“镜像”核苷酸；即可为天然存在的D-核苷酸的“L-核苷酸”类似物的镜像核苷酸(见美国专利No.6,602,858)。镜像核苷酸可进一步包括至少一个例如本文所述的糖或碱基修饰和/或主链修饰，例如硫代磷酸酯或膦酸酯部分。美国专利No.6,602,858公开了包括至少一个L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括(例如)L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸酯(镜像dT))和L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像rG)；L-核糖尿嘧啶-3’-磷酸酯(镜像dU)。
在一些实施方案中，经修饰的核糖核苷酸包括经修饰的脱氧核糖核苷酸，例如可用作5’末端位置(位置编号1)处的核苷酸的5’OMeDNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸酯)；PACE(脱氧核糖腺苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胞苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖鸟苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胸苷3’膦酰基乙酸酯。
修饰可能存在于本文公开的核酸分子的一条或多条链中，例如存在于有义链、反义链或两条链中。在某些实施方案中，反义链可包括修饰而有义链可能仅包括未经修饰的RNA。
核碱基
本文公开的核酸的核碱基可包括未经修饰的核糖核苷酸(嘌呤和嘧啶)例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶。可用天然和合成的核碱基修饰一条或两条链中的核碱基，例如胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、任何“通用碱基”核苷酸；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤、脱氮杂嘌呤，嘌呤和嘧啶的杂环取代类似物(例如氨基乙氧基吩噁嗪)、嘌呤和嘧啶的衍生物(例如，1-烷基-、1-烯基-、杂芳基和1-炔基衍生物)及其互变异构体，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤，7-二氮杂黄嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-甲基尿嘧啶，5-(1-丙炔基)尿嘧啶，5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4,4-乙醇胞嘧啶)。适合碱基的其它实例包括非嘌呤基和非嘧啶基例如2-氨基吡啶和三嗪。
糖部分
本文公开的核酸中的糖部分可包括无任何修饰的2’-羟基-戊呋喃糖基糖部分。或者，糖部分可经修饰，例如2’-脱氧-戊呋喃糖基糖部分、D-核糖、己糖，在戊呋喃糖基糖部分的2’位置处的修饰，例如2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-O-乙基)，即2’-烷氧基，2’-氨基、2’-O-烯丙基、2’-S-烷基、2’-卤素(包括2’-氟、氯和溴)、2’-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-2-甲氧基乙基、2’-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2’-炔丙基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基、CF、氰基、咪唑、羧酸酯基、硫代酸酯基(thioate)、C1-C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基；O-、S或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多聚烷基氨基或经取代的甲硅烷基，尤其例如欧洲专利EP 0586520或EP 0618925中所述。
烷基基团包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基基团(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基基团(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，对于直链而言为C1-C6，对于支链而言为C3-C6)，并且更优选为4个或更少。同样，优选的环烷基可能在其环结构中具有3-8个碳原子，并且更优选地在其环结构中具有5个或6个碳。术语C1-C6包括含有1-6个碳原子的烷基基团。烷基基团可为经取代的烷基基团，例如有取代基取代烃主链的一个或多个碳上的氢的烷基部分。这种取代基可包括(例如)烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳族部分。
烷氧基基团包括与氧原子共价连接的经取代和未经取代的烷基、烯基和炔基基团。烷氧基基团的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基基团。经取代的烷氧基基团的实例包括卤化烷氧基基团。烷氧基基团可用例如以下的基团取代：烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳族部分。卤素取代的烷氧基基团的实例包括但不限于氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
在一些实施方案，戊呋喃糖基环可被缺乏戊呋喃糖基环的C2′-C3′键的无环衍生物取代。例如，无环核苷酸可用2-羟基乙氧基甲基基团取代dNMP中通常存在的2’-脱氧呋喃核糖基糖。
卤素包括氟、溴、氯和碘。
主链
本文公开的核酸的核苷亚单位可通过磷酸二酯键相互连接。磷酸二酯键可任选用其它连键取代。例如，硫代磷酸酯、硫代磷酸酯-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’桥接主链(也可能称为5’-2’或2’-5’-核苷酸或2’-5’-核糖核苷酸)、PACE、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧亚膦酸酯、硼代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或5’-)氨基氨基磷酸酯、氢膦酸酯、膦酸酯、硼代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯修饰，例如烷基磷酸三酯、磷酸三酯磷键、5’-乙氧基磷酸二酯、对烷氧基磷酸三酯、甲基膦酸酯和非含磷键，例如碳酸酯键、氨甲酸酯键、甲硅烷基键、硫键、磺酸酯键、磺胺键、甲醛基键、硫代甲醛基键、肟键、亚甲基亚氨基键、亚甲基甲基亚氨基键、亚甲基亚肼基键、亚甲基二甲基亚肼基键和亚甲氧基甲基亚氨基键。
本文公开的核酸分子可包括肽核酸(PNA)主链。PNA主链包括通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元。各种碱基(例如)嘌呤、嘧啶、天然和合成的碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。
末端磷酸
可在末端磷酸基团处进行修饰。不同稳定化学的非限制性实例可用于(例如)稳定核酸序列的3’端，包括(1)[3-3’]-反向脱氧核糖；(2)脱氧核糖核苷酸；(3)[5’-3’]-3’-脱氧核糖核苷酸；(4)[5’-3’]-核糖核苷酸；(5)[5’-3’]-3’-OMe核糖核苷酸；(6)3’-甘油基；(7)[3’-5’]-3’-脱氧核糖核苷酸；(8)[3’-3’]-脱氧核糖核苷酸；(9)[5’-2’]-脱氧核糖核苷酸；和(10)[5-3’]-双脱氧核糖核苷酸。除未经修饰的主链外，化学处理可与本文所述的一种或多种不同主链修饰组合。
示例性化学修饰的末端磷酸基团包括以下所示的基团：
缀合物
本文提供的经修饰的核苷酸和核酸分子(例如，siNA分子)可包括缀合物，例如与化学修饰的核酸分子共价连接的缀合物。缀合物的非限制性实例包括Vargeese等，U.S.Ser.No.10/427,160中所述的缀合物和配体。缀合物可通过生物可降解连接子与核酸分子(例如siNA分子)共价连接。缀合物分子可在化学修饰的核酸分子的有义链、反义链或两条链的3’端连接。缀合物分子可在化学修饰的核酸分子的有义链、反义链或两条链的5’端连接。缀合物分子可在化学修饰的核酸分子的有义链、反义链或两条链的3’端和5’端或其任何组合处连接。在一个实施方案中，缀合物分子可包括利于化学修饰的核酸分子递送至生物系统(例如细胞)中的分子。在另一实施方案中，与化学修饰的核酸分子连接的缀合物分子为聚乙二醇、人血清白蛋白或可介导细胞摄取的细胞受体的配体。Vargeese等，U.S.Ser.No.10/201,394中描述了本发明考虑到的可与化学修饰的核酸分子连接的特异性缀合物分子的实例。
连接子
本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可包括连接核酸的有义区和核酸的反义区的核苷酸、非核苷酸或混合核苷酸/非核苷酸连接子。核苷酸连接子可为长度≥2个核苷酸，例如长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的连接子。核苷酸连接子可为核酸适配子。用本文所使用的“适配子”或“核酸适配子”指特异性结合靶分子的核酸分子，其中所述核酸分子包括在其自然环境中被靶分子识别的序列的序列。或者，适配子可为与靶分子(例如hsp47mRN)结合的核酸分子，其中靶分子并非自然与核酸结合。例如，适配子可用于与蛋白质的结合结构域结合，从而防止天然配体与蛋白质的相互作用。这是非限制性实例并且本领域中的人员将认识到使用本领域中通常已知的技术可易于产生其它实施方案。见，例如，Gold等，1995,Annu.Rev.Biochem.,64,763；Brody和Gold,2000,J.Biotechnol.,74,5；Sun，2000,Curr.Opin.Mol.Ther.,2,100；Kusser，2000,J.Biotechnol.,74,27；Hermann和Patel，2000,Science,287,820；和Jayasena，1999,ClinicalChemistry,45,1628。
非核苷酸连接子可包括脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化物、脂质、聚烃或其它聚合化合物(例如具有2-100个乙二醇单元的聚乙二醇)。特定实例包括Seela andKaiser,Nucleic Acids Res.1990,18:6353和Nucleic Acids Res.1987,15:3113；Cloadand Schepartz,J.Am.Chem.Soc.1991,113:6324；Richardson and Schepartz,J.Am.Chem.Soc.1991,113:5109；Ma等,Nucleic Acids Res.1993,21:2585和Biochemistry1993,32:1751；Durand等,NucleicAcids Res.1990,18:6353；McCurdy等,Nucleosides&Nucleotides 1991,10:287；Jschke等,Tetrahedron Lett.1993,34:301；Ono等,Biochemistry 1991,30:9914；Arnold等,国际公布No.WO 89/02439；Usman等,国际公布No.WO 95/06731；Dudycz等,国际公布No.WO 95/11910和Ferentz and Verdine，J.Am.Chem.Soc.1991,113:4000中描述的连接子。
5’端、3’端和突出端
本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)可在两侧均具有平端，两侧均有突出端或平端和突出端的组合。突出可在有义链或反义链的5’-或3’-端上出现。
双链核酸分子(例如，siNA)的5’-和/或3’-端可具有平端或具有突出端。在有义链或反义链中5’-端可具有平端而3’-端具有突出端。在其它实施方案中，在有义链或反义链中3’-端可具有平端而5’-端具有突出端。在更多其它实施方案中，5’-和3’-端均具有平端或5’-和3’-端均具有突出端。
核酸的一条或两条链的5’-和/或3’-端可包括游离羟基基团。任何核酸分子链的5’-和/或3’-端可修饰为包括化学修饰。这种修饰稳定核酸分子，例如在3’-端稳定性可由于核酸分子修饰的存在而具有增强的稳定性。端部修饰(例如，末端帽子)的实例包括但不限于脱碱基、脱氧脱碱基、反向(脱氧)脱碱基、甘油基、二核苷酸、无环核苷酸、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、硫代酯、C1-C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或经取代的甲硅烷基，其中如欧洲专利EP 586,520和EP 618,925中描述的修饰和本文公开的其它修饰。
核酸分子包括具有平端，即不包括任何突出核苷酸的端部的核酸分子。核酸分子可包括一个或多个平端。平端核酸分子的碱基对数量与核酸分子每条链中存在的核苷酸的数量相等。例如当反义链的5’-端和有义链的3’-端没有任何突出核苷酸时，核酸分子可包括一个平端。例如当反义链的3’-端和有义链的5-’端没有任何突出核苷酸时，核酸分子可包括一个平端。例如当反义链的3’-端和有义链的5-’端以及反义链的5’-端和有义链的3’-端没有任何突出核苷酸时，核酸分子可包括两个平端。平端核酸分子中存在的其它核苷酸可包括(例如)错配、凸起、环或摆动碱基对以调节核酸分子介导RNA干扰的活性。
在本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)的某些实施方案中，分子的至少一端具有至少一个核苷酸(例如1-8个突出核苷酸)的突出端。例如，本文公开的双链核酸分子的一条或两条链可在5’端或3’端或二者处具有突出端。突出端可存在于核酸分子的有义链和反义链的任一条或两条上。突出端的长度可短至1个核苷酸且长至1-8个或更多个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)；在一些优选的实施方案中，突出端为2、3、4、5、6、7或8个核苷酸；例如突出端可为2个核苷酸。形成突出端的核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、天然和非天然核碱基或例如本文公开的糖、碱基或磷酸基团中经修饰的任何核苷酸。双链核酸分子可具有5’-和3’-突出端。5’-和3’-端上的突出可具有不同长度。突出可包括至少一个可为脱氧核糖核苷酸的核酸修饰。一个或多个脱氧核糖核苷酸可处于5’-末端。核酸分子各对应链的3’-端可能没有突出端，更优选地没有脱氧核糖核苷酸突出端。所述一个或多个脱氧核糖核苷酸可能处于3’-末端。dsRNA各对应链的5’-端可能没有突出端，更优选地没有脱氧核糖核苷酸突出端。链5’或3’-端中的突出可端为1-8个(例如，约1、2、3、4、5、6、7或8个)未配对核苷酸，优选地，突出端为2-3个未配对核苷酸；更优选为2个未配对核苷酸。核酸分子可包括具有为约1至约20个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1、15、16、17、18、19或20个)，优选1-8个(例如，约1、2、3、4、5、6、7或8个)核苷酸的突出端的双链体核酸分子，例如具有约19个碱基对和3’-末端单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出端的约21-核苷酸双链体。本文的核酸分子可包括具有平端的双链体核酸分子，其中两端均为平端，或可选地，其中一端为平端。本文公开的核酸分子可包括一个或多个平端，即其中平端没有任何突出核苷酸。在一个实施方案中，平端核酸分子的碱基对数量与核酸分子每条链中存在的核苷酸数量相等。例如当反义链的5’-端和有义链的3’-端没有任何突出核苷酸时，核酸分子可包括一个平端。例如当反义链的3’-端和有义链的5-’端没有任何突出核苷酸时，核酸分子可包括一个平端。例如当反义链的3’-端和有义链的5-’端以及反义链的5’-端和有义链的3’-端没有任何突出核苷酸时，核酸分子可包括两个平端。在某些优选的实施方案中，核酸化合物具有平端。平端siNA分子中存在的其它核苷酸可包括(例如)错配、凸起、环或摆动碱基对以调节核酸分子介导RNA干扰的活性。
在许多实施方案中，本文所述核酸分子(例如，siNA分子)的突出核苷酸的一个或多个或全部经修饰，例如本文所述；例如一个或多个或全部核苷酸可为2’-脱氧核苷酸。
修饰的量、位置和模式
本文公开的核酸分子(例如，siNA分子)可包括占核酸分子中存在的核苷酸总数量一定百分比的经修饰的核苷酸。因此，核酸分子可包括约5％至约100％经修饰的核苷酸(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)。指定核酸分子中存在的经修饰的核苷酸的实际百分比将取决于核酸中存在的核苷酸总数量。如果核酸分子为单链，则修饰百分比可基于单链核酸分子中存在的核苷酸的总数量。同样，如果核酸分子为双链，修饰百分比可基于有义链、反义链或二者中存在的核苷酸的总数量。
本文公开的核酸分子可包括占核酸分子中总核苷酸一定百分比的未修饰RNA。因此，核酸分子可包括约5％至约100％经修饰的核苷酸(例如，核酸分子中存在的总核苷酸的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。
核酸分子(例如，siNA分子)可包括有义链，所述有义链包括约1至约5个，特别是约1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连键，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5个或更多个)2’-脱氧基、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3’-端、5’-端或其二者的末端帽分子；并且其中反义链包括约1至约5个或更多个，特别是约1、2、3、4或5个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连键，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧基、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，和任选于反义链的3-端、5’-端或其二者的末端帽分子。核酸分子的有义和/或反义核酸链可包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸，经2’-脱氧基、2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸化学修饰，具有或不具有约1至约5个或更多个(例如约1、2、3、4、5或更多个)硫代磷酸酯核苷酸间连键，和/或存在于相同或不同链中的3’-端、5’-端或其二者处的末端帽分子。
核酸分子可能在核酸分子的每条链中包括约1至约5个或更多个(特别是约1、2、3、4、5或更多个)硫代磷酸酯核苷酸间连键。
核酸分子可包括(例如)在一条或两条核酸序列链的3’-端、5’-端或其二者处的2’-5’核苷酸间连键。另外，2’-5’核苷酸间连键可存在于一条或两条核酸序列链中的各个其它位置，例如，包括siNA分子的一条或两条链中每个嘧啶核苷酸的核苷酸间连键在内的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个可包括2’-5’核苷酸间连键，或包括siNA分子的一条或两条链中每个嘌呤核苷酸的核苷酸间连键在内的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个可包括2’-5’核苷酸间连键。
化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子可包括反义区，其中反义区中存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸均为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸或多个嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸)，并且其中反义区中存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘌呤核苷酸为2’-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-脱氧嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-脱氧嘌呤核苷酸)。
化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子可包括反义区，其中反义区中存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸均为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸或多个嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸)，并且其中反义区中存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-OMe嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸)。
能够在细胞或重组体外系统内部介导对hsp47的RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子可包括有义区和反义区，其中有义区中存在的一个或多个嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸均为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸或多个嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸)，并且有义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸为2’-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-脱氧嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-脱氧嘌呤核苷酸)，其中反义区中存在的一个或多个嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸均为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸或多个嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸)，并且反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-OMe嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸)。有义区和反义区可具有末端帽子修饰，例如任选存在于有义和/或反义序列的3’-端、5’-端或其二者处的任何修饰。有义区和反义区可任选进一步包括具有约1至约4个(例如，约1、2、3或4个)2’-脱氧核苷酸的3’-末端核苷酸突出端。突出核苷酸可进一步包括一个或多个(例如，约1、2、3、4个或更多个)硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯和/或硫代膦酰基乙酸酯核苷酸间连键。或者有义区中的嘌呤核苷酸可为2’-OMe嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-OMe嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-OME嘌呤核苷酸)，并且反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸为2’-OME嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-OMe嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸)。或者有义区中的一个或多个嘌呤核苷酸可为嘌呤核糖核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为嘌呤核糖核苷酸或多个嘌呤核苷酸为嘌呤核糖核苷酸)，并且反义区中存在的任何嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均为2’-OMe嘌呤核苷酸或多个嘌呤核苷酸为2’-OMe嘌呤核苷酸)。或者有义区中和/或存在于反义区中的一个或多个嘌呤核苷酸选自2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸和2’-OMe核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸均选自2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸和2’-OMe核苷酸，或多个嘌呤核苷酸选自2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸和2’-OMe核苷酸)。
在一些实施方案中，如本文所述的核酸分子(例如，siNA分子)包括反义链中，例如在反义链的位置6或位置7处的经修饰的核苷酸(例如一个经修饰的核苷酸)。
修饰模式和交替修饰
本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可具有经修饰和未经修饰核酸模式。一段邻近核苷酸中核苷酸的修饰模式可为单个核苷酸或通过标准磷酸二酯键或至少部分通过硫代磷酸酯键相互共价连接的一组核苷酸中所含的修饰。因此，如本文考虑到的“模式”尽管可能但并非必须牵涉重复单元。可连同本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)使用的修饰模式的实例包括Giese，美国专利No.7,452,987中公开的修饰模式。例如，本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)包括具有例如与Giese，美国专利No.7,452,987的图2中图解所示模式相似或相同的修饰模式的核酸分子。
经修饰的核苷酸或经修饰的核苷酸的基团可处于有义链或反义链的5’-端或3’-端，侧翼核苷酸或核苷酸基团排列在经修饰的核苷酸或基团的两侧，其中侧翼核苷酸或基团未经修饰或不具有前述核苷酸或核苷酸基团的相同修饰。然而，侧翼核苷酸或核苷酸基团可具有不同修饰。分别地，经修饰的核苷酸的序列或经修饰的核苷酸的基团，和未经修饰或不同修饰的核苷酸的序列或未经修饰或不同修饰的核苷酸的基团可能重复一次或多次。
在一些模式中，链的5’-末端核苷酸为经修饰的核苷酸，而在其它模式中链的5’-末端核苷酸为未经修饰的核苷酸。在一些模式中，链的5’-端从一组经修饰的核苷酸开始，而在其它模式中5’-末端为核苷酸的未修饰基团。这种模式可能在第一段或第二段核酸分子或其二者上。
核酸分子其中一条链的经修饰的核苷酸可能在位置上与另一条链的经修饰或未经修饰的核苷酸或核苷酸基团互补。
一条链上的修饰或修饰模式之间相对于另一条链的修饰模式可能存在相移，使得修饰基团不重叠。在一种情况下，转移使得有义链核苷酸的经修饰基团与反义链核苷酸的未修饰基团相对应并且反之亦然。
可能存在修饰模式的部分转移，使得经修饰基团重叠。任何指定链中经修饰的核苷酸的基团可能任选地具有相同长度，但可具有不同长度。类似地，任何指定链中未修饰核苷酸的基团可能任选为相同长度或不同长度。
在一些模式中，链末端的第二个(倒数第二个)核苷酸为未修饰核苷酸，或未修饰核苷酸基团的开始。优选地，这种未修饰核苷酸或核苷酸的未修饰基团位于有义和反义链任一条或二者的5’端并且甚至更优选位于有义链的末端。未修饰核苷酸或核苷酸的未修饰基团可能位于有义链的5’端。在一个优选的实施方案中，模式由交替的单个经修饰和未修饰核苷酸组成。
在一些双链核酸分子中包括2’-OMe修饰的核苷酸和非修饰核苷酸，优选未经2’-OMe修饰的核苷酸，以交替方式掺入两条链上，产生交替的2’-OMe修饰的核苷酸和未经修饰或至少不包括2’-OMe修饰的核苷酸的模式。在某些实施方案中，2’-OMe修饰和非修饰的相同序列存在于第二条链上；在其它实施方案中，交替2’-OMe修饰的核苷酸仅存在于有义链中并不存在于反义链中；并且在更多其它实施方案中，交替2’-OMe修饰的核苷酸存在于有义链中并不存在于反义链中。在某些实施方案中，两条链之间存在相移，使得第一条链上的2’-OMe修饰的核苷酸与第二条链上的非修饰核苷酸碱基配对并且反之亦然。这种特殊排列，即两条链上2’-OMe修饰和非修饰核苷酸的碱基配对在某些实施方案中是特别优选的。在某些实施方案中，交替2’-OMe修饰的核苷酸模式存在于整个核酸分子中；或整个双链体区中。在其它实施方案中交替2’-OMe修饰的核苷酸模式仅存在于核酸的一部分中；或整个双链体区中。
在“相移”模式中，可能优选的是反义链5’端从2’-OMe修饰的核苷酸开始，从而使第二个核苷酸非修饰，因而第三个、第五个、第七个等核苷酸又为2’-OMe修饰的核苷酸，而第二个、第四个、第六个、第八个核苷酸等为非修饰核苷酸。
修饰位置和模式
虽然以下更详细地提供了示例性模式，但涵盖具有本文公开和本领域中已知核酸分子的所有可能特征的所有模式排列(例如，特征包括但不限于有义链长度、反义链长度、双链体区长度、突出端长度，双链核酸分子的一端还是两端为平端或具有突出端，经修饰核酸的位置、经修饰核酸的数量、修饰类型，双突出核酸分子在每侧突出端上是否具有相同或不同数量的核苷酸，是一种还是一种以上类型的修饰用于核酸分子和邻近修饰/未修饰核苷酸的数量)。至于以下提供的详细实例，虽然显示双链体区为19个核苷酸，但是本文提供的核酸分子可具有长度为1-49个核苷酸的双链体区，因为双链体区的每条链长度可独立地为17-49个核苷酸。本文提供了示例性模式。
核酸分子可能在包括单个或邻近经修饰核酸组的两端均具有平端(n为0时)。经修饰核酸可能位于沿有义链或反义链的任何位置。核酸分子可包括一组约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个邻近经修饰的核苷酸。经修饰核酸可能占核酸链的1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或100％。下文紧接着的的实例的经修饰核酸可能仅在有义链中，仅在反义链中，或在有义链和反义链两者中。
以下示出了一般核酸模式，其中X＝双链体区中的有义链核苷酸；Xa＝有义链中的5’-突出核苷酸；Xb＝有义链中的3’-突出核苷酸；Y＝双链体区中的反义链核苷酸；Ya＝有义链中的3’-突出核苷酸；Yb＝有义链中的5’-突出核苷酸；且M＝双链体区中的经修饰的核苷酸。每个a和b独立地为0-8(例如，0、1、2、3、4、5、6、7或8)。每个X、Y、a和b独立经修饰或未经修饰。有义链和反义链长度各自独立地为17-49个核苷酸。以下提供的实例具有19个核苷酸的双链体区；然而，本文公开的核酸分子可具有介于17个和49个核苷酸之间任何数量的双链体区并且其中每条链长度独立地为17-49个核苷酸。
5’XaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXb
3’YbYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYa
以下示出了其它示例性核酸分子模式，其中X＝未经修饰的有义链核苷酸；x＝有义链中未经修饰的突出核苷酸；Y＝未经修饰的反义链核苷酸；y＝反义链中未经修饰的突出核苷酸；且M＝经修饰的核苷酸。有义链和反义链长度可各自独立地为17-49个核苷酸。以下提供的实例具有19个核苷酸的双链体区；然而，本文公开的核酸分子可具有介于17个和49个核苷酸之间任何数量的双链体区并且其中每条链长度独立地为17-49个核苷酸。
5’MnXXXXXXXXXMXXXXXXXXXMn
3’MnYYYYYYYYYYYYYYYYYYYMn
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3’YYYYYYYYYMYYYYYYYYY
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3’YYYYYYYYYYYYYYYYYYY
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5’XXXXXXXXXMXXXXXXXXX
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3’YYYYYYYYYMYYYYYYYYY
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5’XXXXXXXXXMXXXXXXXX
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5’XXXXXXXMXXXXXXXXXX
3’YYYYYYYYYYYYYYYYYM
5’XXXXXXXXXXXXXMXXXX
3’MYYYYYYYYYYYYYYYYY
5’MMMMMMMMMMMMMMMMMM
3’MMMMMMMMMMMMMMMMMM
核酸分子可能在具有交替经修饰核酸的两端具有平端。经修饰核酸可位于沿有义链或反义链的任何位置。
5’MXMXMXMXMXMXMXMXMXM
3’YMYMYMYMYMYMYMYMYMY
5’XMXMXMXMXMXMXMXMXMX
3’MYMYMYMYMYMYMYMYMYM
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3’YMMMYMMMYMMMYMMMYMM
5’XMMMXMMMXMMMXMMMXMM
3’MMMYMMMYMMMYMMMYMMM
具有5’-平端和3’-端突出端的核酸分子以单个经修饰的核酸结束。
具有5’-端突出端和3’-平端的核酸分子以单个经修饰的核酸结束。
在两端均具有突出端的核酸分子以及所有突出端为经修饰核酸。在下文紧接着的模式中，M为经修饰核酸的数量n，其中n为0-8的整数(即，1、2、3、4、5、6、7和8)。
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM
3’MYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
在两端均具有突出端的核酸分子以及一些突出核苷酸为经修饰的核苷酸。在下文紧接着的模式中，M为经修饰核酸的数量n，x为有义链中未修饰突出核苷酸的数量n，y为反义链中未修饰突出核苷酸的数量n，其中每个n独立地为0-8的整数(即，1、2、3、4、5、6、7和8)，并且其中每个突出端最多为20个核苷酸；优选最多8个核苷酸(经修饰和/或未经修饰)。
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM
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5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMxM
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有义区3’端处的经修饰的核苷酸。
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM
3’YYYYYYYYYYYYYYYYYYY
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5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMM
3’YYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMMM
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5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMMMMMMM
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有义区5’端处的突出端
5’MXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
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5’MMXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
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反义区3’端处的突出端
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5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3’MMMMMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
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3’MMMMMMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
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5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
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有义区中的经修饰的核苷酸
5’XXXXXXXXXMXXXXXXXXX
3’YYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3’YYYYYYYYYMYYYYYYYYY
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
3’YYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
以下连同与以上所用符号一致的等效一般结构一起提供了示例性核酸分子。
人和大鼠hsp47的siHSP47-C siRNA，其具有19核苷酸(即，19聚体)的双链体区和在有义链和反义链的3’端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’GGACAGGCCUCUACAACUAdTdT 3’
3’dTdTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
人和大鼠hsp47的siHSP47-Cd siRNA，其具有25聚体双链体区、在反义链的3’-端的2个核苷酸突出端以及在有义链的5’-末端和倒数第二个位置处的2个经修饰的核苷酸。
5’GGACAGGCCUCUACAACUACUACdGdA 3’
3’UUCCUGUCCGGAGAUGUUGAUGAUGCU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人和大鼠hsp47cDNA 719-737的siHSP47-1siRNA，其具有19聚体双链体区以及在有义链和反义链的3’-端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’CAGGCCUCUACAACUACUAdTdT 3’
3’dTdTGUCCGGAGAUGUUGAUGAU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 719-743的siHSP47-1d siRNA，其具有25聚体，具有在有义链的3’-端的平端、和在反义链的3’-端的2核苷酸突出端以及在有义链的5’-末端和倒数第二个位置的2个经修饰的核苷酸。
5’CAGGCCUCUACAACUACUACGACdGdA 3’
3’UUGUCCGGAGAUGUUGAUGAUGCUGCU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 469-487的siHSP47-2siRNA，其具有19聚体双链体区和在有义链和反义链的3’端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’GAGCACUCCAAGAUCAACUdTdT 3’
3’dTdTCUCGUGAGGUUCUAGUUGA 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 469-493的siHSP47-2d siRNA，其具有25聚体双链体区，具有在有义链的3’-端的平端、和在反义链的3’-端的2个核苷酸突出端以及在有义链的5’-末端和倒数第二个位置的2个经修饰的核苷酸。
5’GAGCACUCCAAGAUCAACUUCCGdCdG 3’
3’UUCUCGUGAGGUUCUAGUUGAAGGCGC 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
大鼠Gp46cDNA 466-490的siHSP47-2d大鼠siRNA，其具有25聚体双链体区，具有在有义链的3’-端的平端、和在反义链的3’-端的2个核苷酸突出端以及在有义链的5’-末端和倒数第二个位置的2个经修饰的核苷酸。
5’GAACACUCCAAGAUCAACUUCCGdAdG 3’
3’UUCUUGUGAGGUUCUAGUUGAAGGCUC 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 980-998的siHSP47-3siRNA，其具有19聚体双链体区和在有义链和反义链的3’-端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’CUGAGGCCAUUGACAAGAAdTdT 3’
3’dTdTGACUCCGGUAACUGUUCUU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 980-1004的siHSP47-3d siRNA，其具有25聚体双链体区，具有在有义链的3’-端的平端、和在反义链的3’-端的2个核苷酸突出端以及在有义链的5’-末端和倒数第二个位置的2个经修饰的核苷酸。
5’CUGAGGCCAUUGACAAGAACAAGdGdC 3’
3’UUGACUCCGGUAACUGUUCUUGUUCCG 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 735-753的siHSP47-4siRNA，其具有19聚体双链体区和在有义链和反义链的3’-端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’CUACGACGACGAGAAGGAAdTdT 3’
3’dTdTGAUGCUGCUGCUCUUCCUU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 735-759的siHSP47-4d siRNA，其具有25聚体双链体区，具有在有义链的3’-端的平端、和在反义链的3’-端的2个核苷酸突出端以及在有义链的5’-末端和倒数第二个位置的2个经修饰的核苷酸。
5’CUACGACGACGAGAAGGAAAAGCdTdG 3’
3’UUGAUGCUGCUGCUCUUCCUUUUCGAC 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 621-639的siHSP47-5siRNA，其具有19聚体双链体区和在有义链和反义链的3’-端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’GCCACACUGGGAUGAGAAAdTdT 3’
3’dTdTCGGUGUGACCCUACUCUUU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 446-464的siHSP47-6siRNA，其具有19聚体双链体区和在有义链和反义链的3’-端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’GCAGCAAGCAGCACUACAAdTdT 3’
3’dTdTCGUCGUUCGUCGUGAUGUU 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
人hsp47cDNA 692-710的siHSP47-7siRNA，其具有19聚体双链体区、和在有义链和反义链的3’-端的2个经修饰的核苷酸(即，脱氧核苷酸)的突出端。
5’CCGUGGGUGUCAUGAUGAUdTdT 3’
3’dTdTGGCACCCACAGUACUACUA 5’
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3’
3’MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5’
核酸链中的切口和缺口
本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可具有带切口(nick)或缺口(gap)的链，优选有义链。因此，核酸分子可具有三条或更多条链，例如国际专利申请No.PCT/US07/081836中公开的局部双链体RNA(mdRNA)。具有带切口或缺口的链的核酸分子可为约1-49个核苷酸，或可具有RISC长度(例如，约15-25个核苷酸)或例如本文公开的Dicer底物长度(例如，约25-30个核苷酸)。
具有三条或更多条链的核酸分子，例如’A’(反义)链、’S1’(第二条)链和’S2’(第三条)链，其中’S1’和’S2’链与’A’链的非重叠区互补并形成碱基对(例如，mdRNA可具有A:S1S2形式)。S1、S2或多条链一起形成大体上类似于’A’反义链的有义链。通过’S1’和’A’链退火形成的双链区与通过’S2’和’A’链退火形成的双链区不同并且不重叠。核酸分子(例如，siNA分子)可为“带缺口的”分子，意味着“缺口”范围为0个核苷酸至多达约10个核苷酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)。优选地，有义链带缺口。在一些实施方案中，A:S1双链体与A:S2双链体被’A’链中置于A:S1双链体与A:S2双链体之间并且不同于’A’、’S1’或’S2’的其中一条或多条的3’端的任何一个或多个未配对核苷酸的至少一个未配对核苷酸(多达约10个未配对核苷酸)产生的缺口分开。A:S1双链体与A:B2双链体可能被A:S1双链体与A:S2双链体之间也可称为切口dsRNA(ndsRNA)的零核苷酸缺口(即，其中多核苷酸分子中仅两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂或缺失的切口)分开。例如，A:S1S2可包括具有至少两个合并总计约14个碱基对至约40个碱基对的双链区的dsRNA，并且双链区被约0至约10个核苷酸的缺口分开，任选具有平端，或A:S1S2可包括具有至少两个被多达10个核苷酸的缺口分开的双链区的dsRNA，其中至少一个双链区包括约5个碱基对至13个碱基对。
Dicer底物
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子(例如，siNA分子)可为前体“Dicer底物”分子(例如双链核酸)，其在体内加工以产生活性核酸分子，例如Rossi，美国专利申请No.20050244858中所述。在某些条件和情形下，已经发现这些相对较长的dsRNA siNA种类，例如约25至约30个核苷酸的dsRNA siNA种类，在作用效能和持续时间方面可产生出人意料的有效结果。不期望受任何特定理论限制，认为较长的dsRNA种类在细胞的细胞质中用作酶Dicer的底物。除将双链核酸裂解为较短片段外，Dicer可促进源自裂解dsRNA的单链裂解产物掺入负责破坏源自靶基因的细胞质RNA的RNA-诱导的沉默复合体(RISC复合体)中。
Dicer底物可具有某些增强其受Dicer加工的性质。Dicer底物具有足够长度，使得其受Dicer加工以产生活性核酸分子并且可能进一步包括以下一种或多种性质：(i)dsRNA不对称，例如在第一条链(反义链)上具有3’突出端和(ii)dsRNA在反义链(有义链)上具有经修饰的3’端以指引dsRNA的Dicer结合以及将dsRNA加工成活性siRNA的取向。在某些实施方案中，Dicer底物中的最长链可为24-30个核苷酸。
Dicer底物可对称或不对称。Dicer底物可具有包括22-28个核苷酸的有义链和可包括24-30个核苷酸的反义链；因此，在一些实施方案中，所得Dicer底物可在反义链的3’端具有突出端。Dicer底物可具有长度为25个核苷酸的有义链和长度为27个核苷酸且具有2个碱基3’-突出端的反义链。突出端可为1-3个核苷酸，例如2个核苷酸。有义链还可具有5’磷酸。
不对称Dicer底物可能进一步含有在有义链的3’-端代替两个核糖核苷酸的两个脱氧核苷酸。一些示例性Dicer底物长度和结构为21+0、21+2、21-2、22+0、22+1、22-1、23+0、23+2、23-2、24+0、24+2、24-2、25+0、25+2、25-2、26+0、26+2、26-2、27+0、27+2和27-2。
Dicer底物的有义链长度可为约22至约30个(例如，约22、23、24、25、26、27、28、29或30个)、约22至约28个、约24至约30个、约25至约30个、约26至约30个、约26至约29个或约27至约28个核苷酸。在某些优选的实施方案中，Dicer底物含有长度为至少约25个核苷酸且不长于约30个核苷酸、长度为约26至约29个核苷酸或为27个核苷酸的有义链和反义链。有义链和反义链可具有相同长度(平端)，不同长度(具有突出)或组合。有义链和反义链可能存在于相同多核苷酸或不同多核苷酸上。Dicer底物可具有约19、20、21、22、23、24、25或27个核苷酸的双链体区。
如同本文提供的其它siNA分子，Dicer底物的反义链可具有在生物条件下，例如在真核细胞的细胞质中退火至反义链的任何序列。
Dicer底物可具有本领域中已知和/或本文关于其它核酸分子(例如siNA分子)所述的对核苷酸碱基、糖或磷酸主链的任何修饰。在某些实施方案中，Dicer底物可具有受位于有义链3’端的适合修饰因子修饰以便Dicer加工的有义链，即dsRNA设计为指引Dicer结合和加工的取向。适合修饰因子包括核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等和位阻分子，例如荧光分子等。无环核苷酸用2-羟基乙氧基甲基基团取代dNMP中通常存在的2’-脱氧呋喃核糖基糖。可用于Dicer底物siNA分子的其它核苷酸修饰因子包括3’-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧肌苷(ddI)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)、2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧核糖胸苷(d4T)和3’-叠氮-3’-脱氧核糖胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)和2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)的单磷酸核苷酸。在一个实施方案中，脱氧核苷酸用作修饰因子。当利用核苷酸修饰因子时，它们可取代核糖核苷酸(例如，用1-3个核苷酸修饰因子或2个核苷酸修饰因子取代有义链3’端上的核糖核苷酸)，使得Dicer底物的长度不变。当利用位阻分子时，它们可与反义链3’端上的核糖核苷酸连接。因此，在某些实施方案中，链的长度不随修饰因子的掺入改变。在某些实施方案中，取代dsRNA中的两个DNA碱基以指引反义链Dicer加工的取向。在另一实施方案中，用两个末端DNA碱基取代有义链3’端上形成有义链3’端和反义链5’端上双链体的平端的两个核糖核苷酸，并且2-核苷酸RNA突出位于反义链的3’端。这是与平端上的DNA和突出端上的RNA碱基的不对称组合。
在某些实施方案中，Dicer底物中包括修饰，使得修饰不妨碍核酸分子充当Dicer的底物。在一个实施方案中，进行一个或多个修饰以增强Dicer底物的Dicer加工。可进行一个或多个修饰以引起更有效的RNAi产生。可进行一个或多个修饰以支持更强的RNAi作用。进行一个或多个修饰以使每个待递送至细胞的Dicer底物产生更强的效能。可将修饰掺入3’-末端区、5’-末端区、3’-末端区和5’-末端区或序列中的各个位置。可将任何数量和组合的修饰掺入Dicer底物，只要修饰不妨碍核酸分子作为Dicer的底物。存在多个修饰时，修饰可相同或不同。涵盖对碱基、糖部分、磷酸主链及其组合的修饰。任一5’-末端可被磷酸化。
Dicer底物磷酸主链修饰的实例包括膦酸酯，包括甲基膦酸酯、硫代磷酸酯和磷酸三酯修饰，例如烷基磷酸三酯等。Dicer底物糖部分修饰的实例包括2’-烷基嘧啶(例如2’-OMe)、2’-氟、氨基和脱氧修饰等(见，例如，Amarzguioui等，2003)。Dicer底物碱基修饰的实例包括脱碱基糖、2-O-烷基修饰的嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶等。也可掺入LNA。
有义链可能受位于有义链3’端的适合修饰因子修饰以便Dicer加工，即dsRNA设计为指引Dicer结合和加工的取向。适合修饰因子包括核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等，和位阻分子，例如荧光分子等。无环核苷酸用2-羟基乙氧基甲基基团取代dNMP中通常存在的2’-脱氧呋喃核糖基糖。其它核苷酸修饰因子包括3’-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、3’-叠氮-3’-脱氧核糖胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧肌苷(ddI)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)、2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)和3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)和2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)的单磷酸核苷酸。在一个实施方案中，脱氧核苷酸用作修饰因子。当利用核苷酸修饰因子时，用1-3个核苷酸修饰因子或2个核苷酸修饰因子取代有义链3’端上的核糖核苷酸。当利用位阻分子时，它们可与反义链3’端上的核糖核苷酸连接。因此，链的长度不随修饰因子的掺入改变。在另一实施方案中，本发明考虑了取代Dicer底物中的两个DNA碱基以指引反义链Dicer加工的取向。在本发明的另一实施方案中，用两个末端DNA碱基取代有义链3’端上形成有义链3’端和反义链5’端上双链体的平端的两个核糖核苷酸，并且2-核苷酸RNA突出端位于反义链的3’端。这是与平端上的DNA和突出端上的RNA碱基的不对称组合。
反义链可能受位于反义链3’端的适合修饰因子修饰以便Dicer加工，即dsRNA设计为指引Dicer结合和加工的取向。适合修饰因子包括核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等，和位阻分子，例如荧光分子等。无环核苷酸用2-羟基乙氧基甲基基团取代dNMP中通常存在的2’-脱氧呋喃核糖基糖。其它核苷酸修饰因子包括3’-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧肌苷(ddI)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)、2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)和3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-双脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)和2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧胸苷(d4T)的单磷酸核苷酸。在一个实施方案中，脱氧核苷酸用作修饰因子。当利用核苷酸修饰因子时，用1-3个核苷酸修饰因子或2个核苷酸修饰因子取代反义链3’端上的核糖核苷酸。当利用位阻分子时，它们可与反义链3’端上的核糖核苷酸连接。因此，链的长度不随修饰因子的掺入改变。在另一实施方案中，本发明考虑了取代Dicer底物中的两个DNA碱基以指引Dicer加工的取向。在另一发明中，两个末端DNA碱基位于反义链的3’端取代形成有义链5’端和反义链3’端上双链体的平端的两个核糖核苷酸，并且2-核苷酸RNA突出端位于有义链的3’端。这是与平端上的DNA和突出端上的RNA碱基的不对称组合。
具有有义链和反义链的Dicer底物可通过三级结构连接。三级结构不会阻断对Dicer底物的Dicer活性并且不会干扰由靶基因转录的RNA的定向破坏。三级结构可为化学连接基团。适合的化学连接基团在本领域中已知并且可用。可选地，三级结构可为以使得组成Dicer底物的两个寡核苷酸一旦退火就产生发夹结构的方式连接dsRNA的两个寡核苷酸的寡核苷酸。发夹结构优选不阻断对Dicer底物的Dicer活性并且不会干扰对由靶基因转录的RNA的定向破坏。
Dicer底物的有义链和反义链无需完全互补。它们仅需要基本上互补以在生物条件下退火并为产生与靶序列充分互补的siRNA的Dicer提供底物。
Dicer底物可具有增强其受Dicer加工的某些性质。Dicer底物可具有足以使其受Dicer加工以产生活性核酸分子(例如，siRNA)的长度并且可具有以下一种或多种性质：(i)Dicer底物不对称，例如第一条链(反义链)上具有3’突出端和(ii)Dicer底物在第二条链(有义链)上具有经修饰的3’端以指引Dicer结合并将Dicer底物加工成活性siRNA的取向。Dicer底物可为不对称，使得有义链包括22-28个核苷酸而反义链包括24-30个核苷酸。因此，所得的Dicer底物在反义链的3’端上具有突出端。突出端为1-3个核苷酸，例如2个核苷酸。有义链也可具有5’磷酸。
Dicer底物可能在反义链的3’端具有突出端，并且有义链经修饰以便Dicer加工。有义链的5’端可具有磷酸。有义链和反义链可在生物条件，例如细胞的细胞质中发现的条件下退火。Dicer底物其中一条链(尤其是反义链)的一个区域可具有至少19个核苷酸的序列长度，其中这些核苷酸在与反义链3’端相邻的21-核苷酸区中并且与由靶基因生成的RNA的核苷酸序列充分互补。Dicer底物还可具有以下一种或多种另外的性质：(a)反义链从相应21聚体右移(即，当与相应21聚体比较时反义链包括于分子右侧的核苷酸)，(b)链可不完全互补，即，链可能含有单个错配配对和(c)有义链的5’端中可包括碱基修饰，例如LNA。
Dicer底物核酸分子的反义链可被修饰为在5’端包括1-9个核苷酸以产生22-28个核苷酸的长度。当反义链具有21个核苷酸的长度时，则可在3’端上添加1-7个核糖核苷酸或2-5个核糖核苷酸和/或4个核糖核苷酸。添加的核糖核苷酸可具有任何序列。虽然添加的核糖核苷酸可能与靶基因序列互补，但不需要靶序列与反义链之间完全互补。即，所得的反义链与靶序列充分互补。则有义链可具有24-30个核苷酸。有义链可能与反义链充分互补以在生物条件下退火为反义链。在一个实施方案中，可将反义链合成为含有经修饰的3’端以指引Dicer加工。有义链可具有3’突出端。可将反义链合成为含有经修饰的3’端以便Dicer结合和加工并且有义链具有3’突出端。
热休克蛋白47
热休克蛋白47(HSP47)为胶原特异性分子伴侣并留在内质网中。在折叠、装配和从内质网转运的过程中热休克蛋白47与原胶原相互作用(Nagata Trends Biochem Sci1996；21:226；Razzaque等2005；Contrib Nephrol 2005；148:57-69；Koide等2006J.Biol.Chem.；281:3432-38；Leivo等Dev.Biol.1980；76:100-114；Masuda等J.Clin.Invest.1994；94:2481-2488；Masuda等Cell Stress Chaperones 1998；3:256-264)。已报道HSP47在各种组织纤维化，例如肝硬化(Masuda et al.J Clin Invest 1994；94:2481-8)、肺纤维化(Razzaque等VirchowsArch 1998；432:455-60；Kakugawa等EurRespir J 2004；24:57-65)和肾小球硬化症(Moriyama等Kidney Int 1998；54:110-19)中表达上调(Koide等J Biol Chem 1999；274:3452326)。基于基因库登录号：NM 001235和相应mRNA序列(例如，如SEQ ID NO:1所列)中公开了靶标人hsp47cDNA的示例性核酸序列。本领域中的普通技术人员将理解，指定序列可能随时间变化并因此在本文的核酸分子中并入需要的任何变化。
HSP47与不同种类的胶原特异性缔合使得HSP47成为纤维化治疗的潜在标靶。抑制hsp47表达可防止细胞外胶原I分泌。Sato等(NatBiotechnol 2008；26:431–442)通过使用siRNA用于抑制hsp47表达并防止大鼠肝纤维化进展探究这种可能性。类似地，Chen等(Br JDermatol 2007；156:1188-1195)和Wang等(Plast.Reconstr Surg 2003；111:1980-7)研究RNA干扰技术对hsp47表达的抑制。
抑制hsp47的方法和组合物
提供了通过使用能够介导或介导对hsp47基因表达的RNA干扰的小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子，抑制hsp47表达的组合物和方法。本文公开的组合物和方法也用于治疗各种纤维化，例如肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化。
本发明的核酸分子和/或方法用于下调编码(举例而言)基因库登录NM 001235所指的RNA的基因的表达。
本文提供的组合物、方法和试剂盒可包括一种或多种核酸分子(例如，siNA)和方法，其独立或联合调节(例如，下调)hsp47蛋白和/或编码hsp47蛋白的基因、蛋白质和/或编码与hsp47相关疾病、病状或病症的维持和/或发展相关的hsp47的基因(例如编码包含基因库登录号NM 001235所指的那些序列在内的序列的基因)或其中基因或基因家族序列共有序列同源性的hsp47基因家族成员的表达，所述hsp47相关疾病、病状或病症例如肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、肾纤维化、腹膜纤维化、慢性肝损伤和原纤维形成。关于示例性基因hsp47提供了各个方面和实施方案的描述。然而，各个方面和实施方案也针对其它有关hsp47基因(例如同源基因和转录变体)和与某些hsp47基因相关的多态性(例如，单核苷酸多态性)。因此，各个方面和实施方案也针对hsp47介导的信号转导途径中牵涉的其它基因或(例如)本文所述疾病、性状或病状的维持或发展中牵涉的基因表达。可使用本文对hsp47基因描述的方法分子这些另外的基因的靶位点。因此，其它基因的调节和这种其它基因调节的作用可如本文所述进行、确定和测量。
在一个实施方案中，本文提供的组合物和方法包括下调hsp47基因(例如，SEQ IDNO:1例示的人hsp47)的表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中核酸分子包括约15至约49个碱基对。
在一个实施方案中，公开的核酸可用于抑制hsp47基因或其中基因或基因家族序列共有序列同源性的hsp47基因家族的表达。可如本领域中已知，例如使用序列比对鉴定这种同源序列。核酸分子可经设计，以例如使用完美互补序列或通过掺入可提供另外的靶序列的非规范碱基对(例如错配和/或摆动碱基对)来靶向这种同源序列。在鉴定了错配的情况下，可使用非规范碱基对(例如，错配和/或摆动碱基)生成靶向一个以上基因序列的核酸分子。在非限制性实例中，使用非规范碱基对(例如UU和CC碱基对)生成能够靶向区分共有序列同源性的hsp47靶标的序列的核酸分子。因此，使用本文公开的siNA的一个优点是可将单个核酸设计为包括与在同源基因之间保守的核苷酸序列互补的核酸序列。在这种方法中，可使用单个核酸抑制一个以上基因的表达，而不使用一个以上核酸分子靶向不同基因。
可使用核酸分子靶向与基因家族(例如hsp47家族基因)相对应的保守序列。同样地，靶向多个hsp47靶标的核酸分子可提供治疗效果。另外，可使用核酸表征在各种应用中基因功能的途径。例如，在基因功能分析、mRNA功能分析或翻译分析中在确定未表征基因功能的途径中可使用核酸分子抑制靶基因的活性。可使用核酸分子确定各种疾病和病状中牵涉的对于制药研发的潜在靶基因途径。核酸分子可用于了解例如纤维化(例如肝、肾或肺纤维化)和/或炎症和增生性性状、疾病、病症和/或病状中牵涉的基因表达的途径。
在一个实施方案中，本文提供的组合物和方法包括对hsp47RNA具有RNAi活性的核酸分子，其中核酸分子包括与具有hsp47编码序列的任何RNA互补的序列，例如那些具有如表3所示序列的序列。在另一实施方案中，核酸分子可能对hsp47RNA具有RNAi活性，其中核酸分子包括与具有变体hsp47编码序列的RNA互补的序列，例如表3中未示出但本领域中已知与纤维化的维持和/或发展相关的其它突变hsp47基因。表3所示或本文所述的化学修饰可应用于本文公开的任何核酸构建体。在另一实施方案中，本文公开的核酸分子包括可与hsp47基因的核苷酸序列相互作用，从而介导hsp47基因表达的沉默的核苷酸序列，例如，其中核酸分子通过调节hsp47基因的染色质结构或甲基化模式并防止hsp47基因转录的细胞过程介导hsp47基因表达的调节。
本文公开的核酸分子可具有针对hsp47RNA的RNAi活性，其中核酸分子包括与具有hsp47编码序列(例如具有基因库登录号NM 001235的序列)的任何RNA互补的序列。核酸分子具有针对hsp47RNA的RNAi活性，其中核酸分子包括与具有变体hsp47编码序列的RNA互补的序列，例如本领域中已知与纤维化的维持和/或发展相关的其它突变hsp47基因。本文公开的核酸分子包括可与hsp47基因的核苷酸序列相互作用，从而介导hsp47基因表达的沉默的核苷酸序列，例如，其中核酸分子通过调节hsp47基因的染色质结构或甲基化模式并防止hsp47基因转录的细胞过程介导hsp47基因表达的调节。
治疗方法
HSP47与不同种类的胶原特异性缔合使得hsp47成为纤维化治疗的标靶。抑制hsp47表达可防止细胞外胶原I分泌。Sato等(Nat Biotechnol 2008；26:431–442)通过使用siRNA用于抑制hsp47表达并防止大鼠肝纤维化进展探究这种可能性。类似地，Chen等(Br JDermatol 2007；156:1188-1195)和Wang等(Plast.Reconstr Surg 2003；111:1980-7)研究RNA干扰技术对hsp47表达的抑制。
在一个实施方案中，核酸分子可用于下调或抑制与疾病或病状(例如，纤维化)相关的hsp47和/或由hsp47产生的hsp47蛋白质和/或hsp47单体型多态性的表达。hsp47和/或hsp47基因或hsp47和/或hsp47蛋白或RNA水平的分析可用于鉴定具有这种多态性的对象或那些处于发展本文所述性状、病状或疾病风险的对象。这些对象易于治疗，例如易于用本文公开的核酸分子和用于治疗hsp47和/或hsp47基因表达有关的疾病的任何其它组合物治疗。因此，对hsp47和/或hsp47蛋白或RNA水平的分析可用于在治疗对象时确定治疗类型和治疗过程。对hsp47和/或hsp47蛋白或RNA水平的监测可用于预测治疗结果并确定调节与性状、病状或疾病相关的某些hsp47和/或hsp47蛋白的水平和/或活性的化合物和组合物的效果。
提供了通过使用本文所提供的能够介导或介导对hsp47基因表达的RNA干扰的小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子来抑制hsp47表达的组合物和方法。本文公开的组合物和方法也用于治疗各种纤维化，例如肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化。
本文公开的核酸分子可单独或联合或连同其它药物用于预防或治疗hsp47相关的疾病、性状、病状或病症，例如肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、肾纤维化、腹膜纤维化、慢性肝损伤和原纤维形成。
本文公开的核酸分子能够以序列特异性方式抑制hsp47的表达。核酸分子可包括有义链和反义链，所述有义链和反义链包括与hsp47mRNA至少部分互补的邻接核苷酸。
在一些实施方案中，对hsp47有特异性的dsRNA可连同对帮助新合成的蛋白质(例如，钙联蛋白、钙网蛋白和/或BiP)折叠的其它分子伴侣有特异性的其它dsRNA一起使用(Bergeron等Trends Biochem.Sci.1994；19:124-128；Herbert等1995；Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.60:405-415)。
可使用本文公开的核酸分子进行RNA干扰来治疗纤维化。示例性纤维化包括肝纤维化、腹膜纤维化、肺纤维化、肾纤维化。本文公开的核酸分子可以序列特异性方式抑制hsp47的表达。
可通过使用本领域中已知的适合技术，例如使用抗胶原I抗体测定细胞外胶原的水平来监测纤维化的治疗。也可通过测定受影响组织细胞中hsp47mRNA的水平或HSP47蛋白的水平来监测治疗。也可通过非侵入性扫描受影响器官或组织，例如通过计算机辅助断层扫描、磁共振弹性成像扫描来监测治疗。
治疗或预防对象或生物体的hsp47相关疾病或病状的方法可包括在适于调节对象或生物体内hsp47基因表达的条件下使对象或生物体与本文提供的核酸分子接触。
治疗或预防对象或生物体纤维化的方法可包括在适于调节对象或生物体内hsp47基因表达的条件下使对象或生物体与核酸分子接触。
治疗或预防对象或生物体一种或多种选自肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化的纤维化的方法可包括在适于调节对象或生物体内hsp47基因表达的条件下使对象或生物体与核酸分子接触。
纤维化疾病
通常用细胞外基质中纤维物质的过度沉积表征纤维化疾病，这导致组织架构的异常变化和对正常器官功能的干扰。
受创伤损伤的所有组织以发起伤口愈合程序反应。当扰乱伤口愈合反应的正常自限性过程时，纤维化(由过度瘢痕形成表征的一类病症)发生并且引起胶原的过多生成和沉积。因此，正常器官组织被瘢痕组织代替，这最终导致器官的功能衰竭。
纤维化可能由多种原因在各种器官中引发。肝硬化、肺纤维化、结节病、瘢痕瘤和肾纤维化均为与进行性纤维化相关的慢性病状，从而引起正常组织功能不断丧失。
急性纤维化(通常伴有突然严重发作且持续时间短)作为对各种形式外伤的正常反应而发生，包括意外损伤(尤其是脊柱和中枢神经系统损伤)、感染、手术、局部缺血性疾病(例如，心脏病发作后心脏瘢痕形成)、烧伤、环境污染、酒精和其它类型的毒素、急性呼吸窘迫综合征、放疗和化疗。
纤维化，纤维化相关病理或与细胞蛋白的异常交联相关的病理均可通过本文公开的siRNA治疗。纤维化疾病或纤维化明显的疾病(纤维化相关病理)包括急性和慢性形式的器官纤维化，包括以下所有病源变体：肺纤维化(包括间质性肺病和纤维化肺病)、肝纤维化、心脏纤维化(包括心肌纤维化)、肾纤维化(包括慢性肾衰竭)、皮肤纤维化(包括硬皮病、瘢痕瘤和增生性瘢痕)；骨髓纤维化(骨髓纤维变性)；所有类型的眼部瘢痕形成，包括增生性玻璃体视网膜病变(PVR)和由治疗白内障或青光眼的手术引起的瘢痕形成；病源可变的炎症性肠病、黄斑变性、Grave眼病、药物诱导的麦角中毒、瘢瘤疤、硬皮病、牛皮癣、李弗劳明综合征(Li-Fraumeni syndrome)中的成胶质细胞瘤、偶发性成胶质细胞瘤、髓系白血病、急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生综合征、妇科癌、卡波西肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、麻疯病((Hansen’s disease))和胶原性结肠炎。
在多个实施方案中，本文公开的化合物(核酸分子)可用于治疗例如本文公开的纤维化疾病，以及除纤维化疾病外本文公开的许多其它疾病和病状。待治疗的其它病状包括其它器官的纤维化疾病—出于任何原因(包括ESRD在内的CKD)的肾纤维化；肺纤维化(包括ILF)；骨髓纤维化，与所有可能类型的意外及医原性(手术)皮肤损伤相关的异常瘢痕形成(瘢痕瘤)；硬皮病；心肌纤维化、青光眼滤过手术失败；肠粘连。
眼部手术和纤维化并发症
可能常常发生由眼部手术引起的瘢痕组织挛缩。由于组织的瘢痕形成和收缩，建立新的排泄通道的青光眼手术常常失败，可能阻断所建立的排泄系统，因此需要另外的手术干预。当前的抗瘢痕形成方案(丝裂霉素C或5FU)因牵涉并发症(例如失明)而受限，例如见Cordeiro MF等，Human anti-transforming growth factor-beta2antibody:a newglaucoma anti-scar ring agent Invest Ophthalmol Vis Sci.1999Sep；40(10):2225-34。角膜外伤或角膜手术后(例如激光或手术治疗近视或屈光不正)后形成的瘢痕组织也可能收缩，其中组织的收缩可能导致结果不准确。玻璃体液或视网膜上/中可能形成瘢痕组织，例如在一些糖尿病患者中可能最终引起失明，并且可能在脱离手术后形成瘢痕组织，称为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)。PVR是视网膜脱离后最常见的并发症并且与视网膜裂孔或破裂相关。PVR指玻璃体腔内和含有视网膜色素上皮(RPE)细胞的视网膜的前面和后面的细胞膜生长。这些基本上为瘢痕组织的膜对视网膜施加牵引并且甚至在最初成功的视网膜脱离手术后，可能引起视网膜脱离复发。
在斜视、眼窝或眼睑手术或甲状腺眼病后可能在眼窝中或眼部和眼睑肌肉上形成瘢痕组织，并且其中发生结膜瘢痕形成，正是在青光眼手术后或瘢痕疾病、炎症(例如，类天疱疮)、传染性疾病(例如，沙眼)中可能发生。与包括胶原的组织收缩相关的进一步眼疾为白内障摘出后晶状体囊浑浊和挛缩。已经公认了MMP在眼病中的重要作用，包括伤口愈合、眼干、无菌角膜溃疡、复发性上皮糜烂、角膜新生血管化、翼状胬肉、结膜松弛症、青光眼、PVR和眼部纤维化。
肝纤维化
肝纤维化(LF)通常为若干病因的肝损伤的不可逆后果。在西方社会，主要病因类别为：酒精性肝病(30-50％)、病毒性肝炎(30％)、胆道疾病(5-10％)、原发性血色素沉积症(5％)以及药物相关的肝硬化和病因不明的隐原性肝硬化(10-15％)。威尔森氏病、α1-抗胰蛋白酶缺乏和其它罕见疾病也具有肝纤维化作为症状之一。肝硬化、肝纤维化晚期通常需要肝脏移植并且为西方社会十大死因之一。
肾纤维化和相关病状
慢性肾衰竭(CRF)
慢性肾衰竭是肾脏排泄废物、浓缩尿液和保存电解液的能力渐进性丧失。CRF为缓慢进行性。其最常由引起肾功能逐渐丧失的任何疾病引起，并且纤维化是引起CRF的主要病理。
糖尿病性肾病
特点为肾小球硬化症和肾小管间质纤维化的糖尿病性肾病是现代社会晚期肾病的单个最普遍的原因，并且糖尿病患者构成透析的最大群体。这种治疗昂贵并且远不够理想。移植提供更好的结果，但是存在供体严重不足的问题。
慢性肾病
慢性肾病(CKD)是全世界的公共健康问题并且公认为与心血管疾病和慢性肾衰竭(CRF)风险升高相关的常见病状。
国家肾脏基金会(National Kidney Foundation，NKF)的肾脏病生存质量指导(Kidney Disease Outcomes Quality Initiative，K/DOQI)将慢性肾病定义为肾脏损伤或肾小球滤过率(GFR)降低3个月或更多个月。也已知CKD的其它标志并用于诊断。通常，具有不可逆硬化症的肾肿块的破坏和肾元损伤导致GFR渐进性下降。最近，K/DOQI公布了CKD阶段的分类，如下：
阶段1：GFR正常或升高的肾损伤(>90mL/min/1.73m2)
阶段2：GFR轻微下降(60-89mL/min/1.73m2)
阶段3：GFR中度下降(30-59mL/min/1.73m2)
阶段4：GFR严重下降(15-29mL/min/1.73m2)
阶段5：肾衰竭(GFR<15mL/min/1.73m2或透析)
在阶段1和2CKD中，单独的GFR不确认透析。可依赖肾损伤的其它标志，包括血或尿的组成异常或成像测试异常。
CKD的病理生理学
每个肾中存在大约一百万个肾元，每个均有助于总GFR。不管肾损伤的病因如何，随着肾元的逐渐破坏，肾脏能够通过剩余健康肾元的超滤和代偿性肥大维持GFR。这种肾元适应性允许继续正常地清除血浆溶质，使得仅在总GFR降至50％后，肾储备耗尽时，例如尿和肌酸酐等物质开始表现出血浆水平的显著升高。血浆肌酸酐值近乎加倍，GFR降低50％。因此，患者体内血浆肌酸酐从0.6mg/dL的基线值加倍至1.2mg/dL实际上表示功能肾元物质损失50％。
虽然对于提到的原因有利，但是认为残留肾元超滤和肥大代表进行性肾功能障碍的主要原因。据信这是由于肾小球毛细血管压升高发生的，这样损坏毛细管并且最初导致局灶节段性肾小球硬化症并最终导致球形肾小球硬化症。这种假设已基于5/6肾切除大鼠的研究，所述大鼠出现与患有CKD的人中观察到的一致的病变。
慢性肾病的两个最常见原因是糖尿病和高血压。其它因素包括肾毒素(包括造影剂)或灌注减少引起的急性创伤；蛋白尿；伴随间质损伤的肾产氨作用增强；高脂血；伴随磷酸钙沉积的高磷酸盐血症；氧化亚氮水平降低和抽烟。
在美国，CKD的发病率和患病率正在上升，带来不良后果且医疗卫生系统的成本高。在美国肾病是第九大致死原因。高死亡率使得US Surgeon General’s mandate forAmerica’s citizenry,Healthy People2010含有关注CKD的章节。本章节的目的是明确目标并提供降低美国慢性肾病的发病率、致病率、死亡率和健康成本的方案。
在国际上，自1989年以来晚期肾病(ESRD)的发病率也已稳定升高。美国的ESRD发病率最高，其次是日本。每一百万人口的患病率属日本最高，其次是美国。
与血液透析相关的死亡率是惊人的，并且指示进入血液透析的患者的预期寿命明显缩短。在每个年龄段，当与非透析患者和无肾病的个体相比时，进行透析的ESRD患者死亡率显著升高。在60岁时，健康的人可期望活20年以上，而开始血液透析的60岁患者的预期寿命更接近4年。
肺纤维化
间质肺纤维化(IPF)是由各种吸入剂或未知原因(特发性肺纤维化)引起的肺部瘢痕形成，吸入剂包括矿物颗粒、有机粉尘和氧化气体。全世界数百万个体罹患此疾病，且尚无有效的治疗方法。缺乏有用治疗的主要原因在于所确定的疾病分子机制不足以设计适当治疗标靶(Lasky JA.,Brody AR.(2000),Environ Health Perspect.；108增刊4:751-62)。
心脏纤维化
在主要心血管病中心脏衰竭是独特的，因为当其它病状显著减少的同时，唯有心脏衰竭患病率升高。其中一些心脏衰竭可归因于美国和欧洲人口的老龄化。拯救心肌损伤患者的能力也是主要因素，因为这些患者可能因有害的心脏重塑而发展左心室功能障碍。
正常心肌由各种细胞组成，心肌细胞和非心肌细胞(其包括内皮和血管平滑肌细胞和成纤维细胞)。
心室壁的结构重塑是心脏病临床结果的关键决定因素。这种重塑牵涉细胞外基质蛋白的生成和破坏、细胞增殖和迁移和凋亡和坏死细胞死亡。心脏成纤维细胞关键地牵涉于这些过程中，从而产生生长因子和作为自分泌和旁分泌因子的细胞因子以及细胞外基质蛋白和蛋白酶。最新研究已表明心脏成纤维细胞和心肌细胞之间的相互作用对于心脏重塑的进展必不可少，心脏重塑的净效应是心脏功能退化和心脏衰竭发作(Manabe I等，(2002),Circ Res.13；91(12):1103-13)。
烧伤和瘢痕
尤其在纤维化疾病中可能发生的特殊问题是组织收缩，例如瘢痕收缩。包括细胞外基质组分的组织，特别是包括胶原的组织的收缩可能连同许多不同病理情况和外科或整形手术发生。例如，瘢痕的挛缩可能引起生理问题，从而可能导致对医学治疗的需要，或可能导致纯美容性的问题。胶原是瘢痕和其它收缩组织的主要组分并且同样是要考虑的重要结构组分。然而，瘢痕和其它收缩组织还包括也可能促成组织收缩的其它结构组分，特别是其它细胞外基质组分，例如弹性蛋白。
包括胶原(也可包括其它细胞外基质组分)的组织的收缩经常在烧伤愈合中发生。烧伤可为化学、热或放射性烧伤并且可能在眼部、皮肤表面或皮肤和下层组织。也可能是内部组织上(例如)由放射治疗引起的烧伤。烧伤组织收缩常常是一个问题并且可能导致身体和/或美容问题，例如丧失活动和/或毁容。
出于各种原因，可应用皮肤移植片并且在应用后常常可能经受收缩。如同烧伤组织愈合一样，收缩可能导致身体和美容问题。例如严重烧伤情况下需要许多皮肤移植片是一个特别严重的问题。
在人造皮肤的生产中收缩也是一个问题。为生产真的人造皮肤，需要通过成纤维细胞来繁殖由上皮细胞(角化细胞)组成的表皮和由胶原组成的真皮。重要的是具有两种类型的细胞，因为它们使用生长因子进行信号传导且刺激彼此。当通过成纤维细胞填繁殖时，人造皮肤的胶原组分常常收缩至小于其原面积的1/10。
瘢痕收缩是常见的，其为瘢痕纤维组织皱缩而引起的收缩。在一些情况下，瘢痕可能变成恶性瘢痕，一种收缩引起严重畸形的瘢痕。胃溃疡治愈时形成的瘢痕组织的收缩引起的沙漏挛缩可能将患者的胃部有效分离为两个单独的腔。由于瘢痕组织收缩，可能发生通道和管道阻塞、瘢痕性狭窄。血管收缩可能是由于原发性阻塞或手术创伤，例如，外科手术或血管成形术后。也可能发生其它空心管(例如，输尿管)的狭窄。无论是由意外受伤还是手术引起，发生任何形式的瘢痕形成时，可能出现问题。牵涉包括胶原的组织收缩的皮肤和肌腱病状包括由手术或意外(例如，手或足部肌腱损伤)引起的创伤后病状、移植后病状和病理性病状，例如硬皮病、掌腱膜挛缩症和大疱性表皮松解症。眼部组织的瘢痕形成和收缩可能在各种病状中发生，例如视网膜脱离和糖尿病性眼疾病的后遗症(如上所述)。如果存在创伤或炎症性损伤，可能发生在眼球和相关结构(包括眼部外肌肉和眼睑)的颅骨中发现的眼窝收缩。眼窝内组织收缩，引起各种问题，包括复视和外观不好看。
有关不同类型的纤维化的更多信息，见：Molina V,et al.,2002,Harefuah,141:973-8,1009；Yu,et al.,2002,,Curr Opin Pharmacol.2(2):177-81；Keane,et al.,2003,Am J Kidney Dis.41:S22-5；Bohle,et al.,1989,Pathol Res Pract.185:421-40；Kikkawa,et al.,1997,Kidney Int Suppl.62:S39-40；Bataller et al.,2001,SeminLiver Dis.21:437-51；Gross,et al.,2001N Engl J Med.345:517-25；Frohlich,2001,AmJ Hypertens；14:194S-199S；Friedman,2003,J Hepatol.38:S38-53；Albanis,et al.,2003,Curr Gastroenterol Rep.5:48-56；Weber,2000,Curr Opin Cardiol.15:264-72)。
核酸分子和药物制剂的递送
可用于递送核酸的类视黄醇或类视黄醇缀合物处于这样的状态，即其溶解于能够溶解或保留其的介质中或与所述介质混合。
本申请中可以使用任何的类视黄醇或类视黄醇缀合物，只要其被星状细胞活性积累；类视黄醇的实例包括但不限于：维甲酸、阿达帕林、视黄醇棕榈酸酯，且尤其是维生素A、饱和维生素A、视黄酸和视黄醛。类视黄醇缀合物的实例包括PEG-类视黄醇缀合物。本发明利用星状细胞积极地摄入类视黄醇和/类视黄醇缀合物的特性，并通过使用所述类视黄醇和/或类视黄醇缀合物作为药物载体或通过结合于或被包括于另一药物载体组分，将期望的物质或主体特异性运输至星状细胞。类视黄醇是一类具有以头至尾方式结合的四个异戊二烯单元的骨架的化合物的成员。见G.P.Moss,“Biochemical Nomenclature and RelatedDocuments,”2nd Ed.Portland Press,pp.247-251(1992)。维生素A是定性显示视黄醇生物学活性的类视黄醇的下位描述。本申请中的类视黄醇促进特定物质至癌症细胞和CAF的递送(即，这些物质被靶向这些细胞)。这样的类视黄醇并没有具体限制，且其实例包括视黄醇、维生素A、饱和维生素A、视黄醛、视黄酸、视黄醇和脂肪酸的酯、脂肪族醇和视黄酸的酯、阿维A酯、维甲酸、异维甲酸、阿达帕林、阿西曲汀(acitretine)、他扎罗汀、和视黄醇棕榈酸酯、以及维生素A类似物如芬维A铵和贝沙罗汀。类视黄醇缀合物包括PEG-缀合物，例如diVA-PEG-diVA，示于以下结构。
本申请的药物载体因此可以包含除了类视黄醇和/或类视黄醇缀合物之外的药物载体组分。这样的组分并没有具体限制，医药领域的任何已知组分可以使用，但其优选能够包括类视黄醇和/或类视黄醇缀合物。这样的组分的实例包括脂质，例如，磷脂如甘油磷脂，鞘脂如鞘磷脂，固醇如胆固醇，植物油如大豆油或罂粟子油，矿物油，和卵磷脂如蛋黄卵磷脂，但所述实例并不限制于此。在这些中，优选那些能够形成脂质体的，例如，天然磷脂如卵磷脂，半合成磷脂如二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，和胆固醇。
此外，本申请的药物载体可以含有改善掺入星状细胞的物质，例如，视黄醇结合蛋白(RBP)。
将类视黄醇和/或类视黄醇缀合物结合或包括于本申请的药物载体还可以通过用化学和/或物理方法使所述类视黄醇和/或类视黄醇缀合物结合或包括于所述药物载体的另一组分进行。或者，将类视黄醇和/或类视黄醇缀合物结合或包括域本申请的药物载体还可以在所述药物载体制备期间通过将具有形成亲和力(formation-affinity)的类视黄醇和/或类视黄醇缀合物和所述药物载体的基本组分混合来进行。结合或包括于本申请的药物载体的类视黄醇和/或类视黄醇缀合物的量可以是相对于药物载体组分的重量比的0.01％-100％，优选0.2％-20％，以及更优选1％-5％。
核酸递送系统可以包括，例如,水和非水凝胶、霜剂、复合型乳剂、微型乳剂、脂质体、软膏、水和非水溶液、洗剂、气溶胶、烃类基质和粉剂，并且可含有赋形剂(例如增溶剂)、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)和亲水性聚合物(例如，聚卡波非(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药学上可接受的载体为脂质体或透皮促进剂。本申请中可用脂质体的实例包括以下：
·CellFectin，阳离子脂质N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四棕榈酰-y-精胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GIBCO BRL)的1:1.5(M/M)脂质体制剂；
·Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE(Glen Research)的2:1(M/M)脂质体制剂；
·DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)-N,N,N-三-甲基-甲基硫酸铵)(BoehringerManheim)；
·Lipofectamine，聚阳离子脂质DOSPA、中性脂质DOPE(GIBCO BRL)和二-烷基化氨基酸(DiLA2)的3:1(M/M)脂质体制剂；
·Lipotrust，O,O’-二肉豆蔻酰-N-(α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物的4:3:3(M/M)脂质体制剂(DC-6-14、胆固醇和二油酰磷脂酰乙醇胺(Hokkaido SystemScience))。DC-6-14由以下结构组成。
可以使用其它脂质：永久阳离子脂质和可离子化的阳离子脂质，包括
和PEG-脂质，包括
·1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DMPE)
·1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DPPE)
·1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DSPE)
·1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-PEG(PEG-DOPE)和/或
·PEG-神经酰胺。
递送系统可包括贴片、片剂、栓剂、子宫托、凝胶、霜剂，并且可含有诸如助溶剂和促进剂(例如，丙二醇、胆汁盐和氨基酸)的赋形剂和其它媒介物(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物以及亲水性聚合物，例如羟丙基甲基纤维素和透明质酸))。
本申请的药物载体可以是任何形式只要期望的物质或主体能够被运输至靶星状细胞，所述形式的实例包括但不限于聚合物微团、脂质体、乳剂、微球和纳米球。此外，本申请的药物载体可以在其内部包括待运输的物质、其外部与待运输的物质连接、或与待运输的物质混合，只要其中包括的类视黄醇和/或类视黄醇最迟在其到达星状细胞之前至少部分暴露于制备物的外部。
本申请的药物载体特异性地靶向星状细胞，并且通过将所需的物质或主体如用于控制星状细胞活性或生长的药物高效地运输至星状细胞，使得实现所需的效果，如抑制或防止纤维化，具有最大的效果和最小的副作用。本发明的药物载体递送的物质或主体没有特别限制，但其优选具有这样的大小，所述大小使得能够在活体中从施用部位运动至肝脏、胰脏等(其存在星状细胞)。因此本申请的药物载体不仅仅能够运输例如源自、分子、化合物、蛋白质、或核酸的物质，还能运输例如载体(vector)、病毒颗粒、细胞、由一或多种元件组成的药物释放系统或微型机器等主体。所述物质或主体优选具有执行对星状细胞的一些作用的特性，且其实例包括标记星状细胞以及控制星状细胞的活性或生长。
因此，在本申请的一个实施方案中，所述药物载体递送的是用于控制星状细胞活性或生长的药物。这可以是直接或间接抑制星状细胞涉及促进纤维化的理化作用的任何药物，其实例包括但不限于，TGFβ活性抑制剂如截短的TGFβII型受体和可溶的type IIreceptor TGFβII性受体，生长因子制备物如HGF及其表达载体，产MMP启动子如含MMP基因的腺病毒载体，产TIMP抑制剂如反义TIMP核酸，PPARγ配体，细胞激活抑制剂和/或细胞生长抑制剂如血管紧张素抑制剂，PDGF活性抑制剂，和钠通道抑制剂，以及还有细胞凋亡诱导物如化合物861和胶霉毒素，和具有Rho激酶抑制活性的化合物例如(+)-反式-4-(1-氨乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)环己烷。此外，本申请中用于控制星状细胞的活性或生长的药物可以是直接或间接抑制星状细胞直接或间接涉及纤维化抑制的理化作用的任何药物，且其实例包括但不限于，用于促进胶原降解系统的药物，如产MMP启动子例如MMP表达载体，HGF，和具有HGF样活性的药物如HGF类似物和其表达载体。
本申请中用于控制星状细胞活性或生长的药物的其它实例包括用于控制细胞外基质如胶原的代谢的药物，例如具有抑制靶分子表达的作用的物质，例如siRNA、核酶和反义核酸(包括RNA、DNA、PNA及其复合物)，具有显性失活作用的物质及其表达载体，其靶向例如星状细胞产生的细胞外基质组成分子或靶向具有产生或分泌所述细胞外基质组成分子的功能的一或多种分子。
本申请还涉及用于治疗星状细胞相关疾病的药剂，所述药剂含有所述药物载体和用于控制星状细胞活性或生长的药物，且涉及所述药物载体在生产用于治疗星状细胞相关疾病的药物组合物中的用途。本文提及的星状细胞相关疾病意指星状细胞直接或间接参与疾病过程(即疾病的出现、加剧、改善、缓和、治愈等)的疾病，且其实例包括肝疾病如肝炎，尤其是慢性肝炎，肝纤维化，肝硬化，和肝癌；和胰脏疾病如胰腺炎，尤其是慢性胰腺炎，胰纤维化，和胰脏癌症。
在本申请的药剂中，所述药物载体可以在其内部包括药物，其外部与含药物的物质连接，或与药物混合，只要所述药物载体中包括的类视黄醇和/或类视黄醇最迟在其到达星状细胞之前至少部分暴露于制备物的外部。因此，取决于施用途径或药物释放的方式，所述药剂可以用合适的材料覆盖，例如，肠溶包衣或随时间分解的材料，或可以被掺入到合适的药物释放系统中。
本申请因此包括药物载体或药剂制备试剂盒，其含有一或多个容器，所述容器含有一或多种的药物载体成分、类视黄醇和/或类视黄醇缀合物、和/或药物，且还包括以这样的试剂盒形式提供的药物载体或药剂的必要组分。本发明的试剂盒，除了上面描述的那些，可以含有说明书等，其中描述了本发明的药物载体和药剂的制备方法或施用方法。此外，本发明的试剂盒可以含有完成本发明所述药物载体或药剂的全部组分，不不一定需要含有全部所述组分。本发明的试剂盒因此不需要含有在医学治疗场所、实验机构等正常可获得的试剂或溶剂，例如，无菌水、盐水或葡萄糖溶液。
本申请还涉及用于治疗星状细胞相关疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的所述药剂。本文提及的有效量是抑制靶疾病发作、减少其症状或防止其进展的量，并且优选是预防靶疾病发作或治愈靶疾病的量。还优选的是施用不导致不良作用超过得益的量。这样的量可以合适地施用培养细胞等通过体外试验确定或通过在模型动物如小鼠、大鼠、犬或猪中的试验确定，这样的试验为本领域技术人员所熟知。
在本发明的方法中，术语“对象”指的是任何活的个体，优选动物，更优选哺乳动物，以及仍更优选人个体。在本申请中，所述对象可以是健康的或患有一些疾病，且如果打算治疗疾病，所述对象一般意味着患有疾病或具有患病的风险。
此外，术语“治疗”包括任何类型的医学可接受的预防性和/或治疗性介入，其出于治愈、暂时缓解、预防疾病等的目的。例如，当所述疾病是肝纤维化时，术语“治疗”包括多种目的的医学可接受的介入，所述目的例如延缓或中止纤维化的进展，病斑的消退或消失，预防纤维化的发作，或预防复发。
本申请还涉及使用所述药物载体将药物递送至星状细胞的方法。该方法包括但不限于，将待递送的物质支撑于所述药物载体上的步骤，和将携带待递送的物质的药物载体施用或添加至含星状细胞的活体或介质(例如，培养基)的步骤。这些步骤可以合适地根据任何已知的方法、本申请描述的方法等实现。该递送方法可以与另一递送方法组合，例如，其中存在星状细胞的器官是靶的另一递送方法，等等。
可使核酸分子适合单独或联合其它疗法用于预防或治疗纤维化(例如，肝脏、肾脏、腹膜和肺部)疾病、性状、病状和/或病症，和/或与细胞或组织中的hsp47水平有关或将对其响应的任何其它性状、疾病、病症或病状。核酸分子可包括用于向对象施用的递送媒介物(包括脂质体)、载体和稀释剂及其盐，并且/或可存在于药学上可接受的制剂中。
本发明的核酸分子可以包括表3所示的序列。这样的核酸分子的实例基本上由表3提供的序列组成。
所述核酸分子可以通过肺部递送，例如通过吸入经吸入装置或喷雾器施用的气溶胶或喷雾剂干燥制剂施用核酸分子，从而向相关肺部组织提供核酸分子的快速局部摄取。可通过研磨干燥或冻干核酸组合物，然后使微粒化组合物通过(例如)400目筛以破碎或分离出大团块制备含有微粒化核酸组合物的可呼吸干燥颗粒的固体颗粒组合物。包含本发明核酸组合物的固体颗粒组合物可任选含有用以促进气溶胶以及其它治疗性化合物的形成的分散剂。适合分散剂为可与核酸化合物以任何适合比例(例如按重量计1:1比例)混合的乳糖。
液体颗粒的气溶胶可包括本文公开的核酸分子并且可通过任何适合方式，例如用喷雾器产生(见例如美国专利No.4,501,729)。喷雾器是市场上出售的装置，其借助于通过狭窄文氏管孔口加速压缩气体(通常为空气或氧气)或借助于超声搅拌，将活性成分的溶液或悬浮液转化为气溶胶雾。用于喷雾器的适合制剂包括于液体载体中，量高达制剂的40％w/w，优选低于20％w/w的活性成分。载体通常为水或稀释含水醇溶液，优选通过添加(例如)氯化钠或其它适合盐类将载体制备为与体液等渗。如果制剂并非无菌制备，任选添加剂包括防腐剂，例如甲基羟基苯甲酸酯、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂和其它制剂表面活性剂。同样可用任何固体颗粒气溶胶发生器产生包括活性组合物和表面活性剂的固体颗粒的气溶胶。用于将固体颗粒治疗剂施用给受试者的气溶胶发生器产生如上所说明的可吸入颗粒并以适于人体施用的速率产生含有预定剂量的治疗性组合物的大量气溶胶。固体颗粒气溶胶发生器的一种说明性类型为吹入器。用于通过吹入施用的适合制剂包括可借助于吹入器递送的精细粉碎粉剂。在吹入器中，粉剂，例如进行本文所述治疗有效的定量，装在通常由凝胶或塑料制成的胶囊或盒中，原位刺穿或打开，并且通过在吸入时空气吸引通过装置或借助于手动操作泵递送粉剂。吹入器中采用的粉剂仅由活性成分组成或由包含活性成分、适合粉剂稀释剂(例如乳糖)和任选表面活性剂的粉剂混合物组成。活性成分通常包括0.1-100w/w的制剂。第二种类型的说明性气溶胶发生器包括定量吸入器。定量吸入器为加压气溶胶分配器，通常装有于液化推进剂中的活性成分的悬浮液或溶液制剂。使用期间这些装置通过适于递送定量体积的阀门排出制剂以产生含有活性成分的细颗粒喷雾。适合的推进剂包括某些氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制剂可另外含有一种或多种助溶剂(例如，乙醇)、乳化剂和其它制剂表面活性剂(例如油酸或山梨醇酐三油酸酯)、抗氧化剂和适合调味剂。例如，美国专利申请No.20040037780和美国专利No.6,592,904；6,582,728；6,565,885中描述了肺部递送的其它方法。PCT专利公布No.WO2008/132723通常涉及寡核苷酸，尤其是siRNA的气溶胶递送至呼吸系统。
可将核酸分子施用至中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)。实验已经证明神经元对核酸的有效体内摄取。见例如，Sommer et al.,1998,Antisense Nuc.Acid DrugDev.,8:75；Epaet al.,2000,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,10:469；Broaddus et al.,1998,J.Neurosurg.,88:734；Karle et al.,1997,Eur.J.Pharmocol.,340:153；Bannai etal.,1998,Brain Research,784:304；Rajakumar et al.,1997,Synapse,26:199；Wu-ponget al.,1999,BioPharm,12:32；Bannai et al.,1998,Brain Res.Protoc.,3:83；andSimantov et al.,1996,Neuroscience,74:39。因此核酸分子可经受递送至CNS和/或PNS中的细胞并为细胞所摄取。
通过各种不同方案提供了核酸分子向CNS的递送：可使用的传统CNS递送方法包括但不限于鞘内和脑室内施用、植入导管和泵、在损伤或损害部位直接注射或输注、注入脑动脉系统或通过化学或渗透开放血脑屏障。其它方法可包括使用各种转运和载体系统，例如虽然使用缀合物和生物可降解聚合物。而且，基因治疗方法，例如如Kaplitt等，美国专利No.6,180,613和Davidson，WO 04/013280中所述，可用于在CNS中表达核酸分子。
可用聚乙烯亚胺(例如，直链或支链PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物一起配制核酸分子或与之复合，聚乙烯亚胺衍生物包括例如接枝PEI，例如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生化PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(见例如Ogris et al.,2001,AAPA PharmSci,3,1-11；Furgeson et al.,2003,Bioconjugate Chem.,14,840-847；Kunath et al.,2002,Pharm Res 19:810-17；Choi et al.,2001,Bull.Korean Chem.Soc.,22:46-52；Bettingeret al.,1999,Bioconjugate Chem.,10:558-561；Peterson et al.,2002,BioconjugateChem.13:845-54；Erbacher et al.,1999,J Gene Med 1:1-18；Godbey et al.,1999.,PNAS,96:5177-81；Godbey et al.,1999,J Controlled Release,60:149-60；Diebold etal.,1999,J Biol Chem,274:19087-94；Thomas et al.,2002,PNAS,99,14640-45；和Sagara,U.S.Pat.No.6,586,524)。
核酸分子可包括生物缀合物，例如Vargeese et al.,U.S.Ser.No.10/427,160；U.S.Pat.No.6,528,631；U.S.Pat.No.6,335,434；U.S.Pat.No.6,235,886；U.S.Pat.No.6,153,737；U.S.Pat.No.5,214,136；U.S.Pat.No.5,138,045中所述的核酸缀合物。
本文公开的组合物、方法和试剂盒可包括表达载体，所述表达载体包括以允许核酸分子表达的方式编码本发明至少一种核酸分子的核酸序列。将核酸分子或一种或多种能够表达dsRNA链的载体引入细胞环境中的方法将取决于细胞的类型及其环境组成。核酸分子或载体构建体可直接引入细胞中(即，在细胞内)；或在细胞外引入腔、胞间隙内，经口腔引入生物体的循环中，或可通过将生物体或细胞置于含有dsRNA的溶液中引入。细胞优选为哺乳动物细胞；更优选为人细胞。表达载体的核酸分子可包括有义区和反义区。反义区可包括与编码hsp47的RNA或DNA序列互补的序列，并且有义区可包括与反义区互补的序列。核酸分子可包括两条具有互补有义区和反义区的不同链。核酸分子可包括具有互补有义区和反义区的单链。
可由插入DNA或RNA载体的转录单位表达与靶RNA分子相互作用并下调编码靶RNA分子(例如，本文基因库登录号所指的靶RNA分子)的基因的核酸分子。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。可基于但不限于腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或α病毒构建体表达核酸分子的病毒载体。可如本文所述递送能够表达核酸分子的重组载体，并且存留于靶细胞内。或者，可使用病毒载体以供核酸分子瞬时表达。必要时可重复施用这种载体。一旦表达，核酸分子即可经由RNA干扰(RNAi)结合并下调基因功能或表达。核酸分子表达载体的递送可为全身性的，例如通过静脉内或肌肉内施用，通过向从受试者外植的细胞施用，然后再引入受试者体内，或通过允许引入所需靶细胞中的任何其它方式。
表达载体可包括以允许核酸分子表达的方式编码本文公开的至少一种核酸分子的核酸序列。例如，载体可能含有编码核酸分子包括双链体的两条链的序列。载体也可含有编码自补并因此形成核酸分子的单个核酸分子的序列。Paul et al.,2002,NatureBiotech 19,505；Miyagishi et al.,2002,Nature Biotech 19,497；Lee et al.,2002,Nature Biotech 19,500；和Novina et al.,2002,Nature Med:10.1038/nm725中描述了这种表达载体的非限制性实例。哺乳动物(例如，人)细胞中也可包括表达载体。
表达载体可包括编码两种或更多种相同或不同核酸分子的核酸序列。表达载体可包括与Genebank登录号NM 001235所指的核酸分子互补的核酸分子的序列，例如表2所示的那些。
表达载体可编码核酸双链体的一条或两条链或自身杂交为核酸双链体的单条自补链。可以允许核酸分子表达的方式可操作地连接编码核酸分子的核酸序列(见例如Paulet al.,2002,Nature Biotech,19:505；Miyagishi and Taira,2002,Nature Biotech 19:497；Lee et al.,2002,Nature Biotech 19:500；和Novina et al.,2002,Nature Med,10.1038/nm725)。
表达载体可包括以下的其中一个或多个：a)转录起始区(例如，真核pol I、II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核pol I、II或III终止区)；c)内含子和d)编码至少一个核酸分子的核酸序列，其中所述序列以允许核酸分子表达和/或递送的方式可操作地与起始区和终止区连接。载体可任选包括编码核酸分子的序列的5’侧或3’侧上可操作连接的蛋白质开放阅读框(ORF)；和/或内含子(间插序列)。
可由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动核酸分子序列的转录。来自pol II或polIII启动子的转录产物在所有细胞中高水平表达；指定细胞类型中指定pol II启动子的水平取决于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默子等)的性质。也可使用原核RNA聚合酶启动子，只要原核RNA聚合酶在恰当细胞中表达(Elroyet al.,1990,PNAS,87:6743-47；Gao et al.,1993,Nucleic Acids Res21:2867-72；Lieber et al.,1993,Methods Enzymol.,217:47-66；Zhou et al.,1990,Mol.Cell.Biol.10:4529-37)。若干研究人员已经证明由这种启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中起作用(例如Kashani-Sabet et al.,1992,Antisense Res.Dev.,2:3-15；Ojwang et al.,1992,PNAS 89:10802-06；Chen et al.,1992,Nucleic Acids Res.,20:4581-89；Yu et al.,1993,PNAS,90:6340-44；L’Huillier et al.,1992,EMBO J.,11:4411-18；Lisziewicz et al.,1993,PNAS 90:8000-04；Thompson et al.,1995,NucleicAcids Res.,23:2259；Sullenger et al.,1993,Science,262:1566)。更特别地，转录单位，例如源自编码U6小核(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的转录单位用于在细胞中生成高浓度的所需RNA分子，例如siNA(Thompson et al.,supra；Couture andStinchcomb,1996,supra；Noonberg et al.,1994,Nucleic Acid Res.22:2830；Noonberget al.,U.S.Pat.No.5,624,803；Good et al.,1997,Gene Ther.,4:45；Beigelman etal.,Int’l PCT Publication No.WO 96/18736)。以上核酸转录单位可掺入多种载体中以引入哺乳动物细胞中，包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺伴随病毒载体)或病毒RNA载体(例如逆转录病毒或α病毒载体)(见Couture和Stinchcomb，1996如上)。
可在细胞内由真核启动子表达核酸分子(例如，Izant and Weintraub,1985,Science,229,345；McGarry and Lindquist,1986,PNAS 83,399；Scanlon et al.,1991,PNAS 88:10591-95；Kashani-Sabet et al.,1992,Antisense Res.Dev.,2:3-15；Dropulicet al.,1992,J.Virol.,66:1432-41；Weerasinghe et al.,1991,J.Virol.,65:5531-34；Ojwang et al.,1992,PNAS,89:10802-06；Chen et al.,1992,Nucleic Acids Res.,20:4581-89；Sarver et al.,1990Science,247:1222-25；Thompson et al.,1995,NucleicAcids Res.,23:2259；Good et al.,1997,Gene Therapy,4:45)。本领域的技术人员认识到可在真核细胞中由恰当DNA/RNA载体表达任何核酸。可通过用酶核酸从初级转录产物释放核酸来增强这种核酸的活性(Draper et al.,PCT WO 93/23569,and Sullivan et al.,PCT WO 94/02595；Ohkawa et al.,1992,Nucleic Acids Symp.Ser.,27:15-6；Taira etal.,1991,Nucleic Acids Res.,19:5125-30；Ventura et al.,1993,Nucleic AcidsRes.,21:3249-55；Chowrira et al.,1994,J.Biol.Chem.,269:25856)。
包装于病毒颗粒中的病毒构建体将实现表达构建体有效引入细胞内与表达构建体编码的dsRNA构建体的转录。
口服引入的方法包括直接混合RNA与生物体的食物，以及工程化用作食物的物种以表达RNA的工程化方法，然后饲喂给受影响的生物体。可采用物理方法将核酸分子溶液引入细胞内。引入核酸的物理方法包括注射含有核酸分子的溶液，用被核酸分子覆盖的颗粒轰击，将细胞或生物体浸入RNA溶液中，或在核酸分子存在下进行细胞膜的电穿孔。
可使用本领域中已知将核酸引入细胞的其它方法，例如脂质介导的载体转运、化学物质介导的转运，例如磷酸钙等。因此可随同实现以下一种或多种活性的组分一起引入核酸分子：增强细胞的RNA摄取，促进双链体链的退火，稳定退火链或增强靶基因的抑制。
剂量
正如本领域中的人员所显而易见，待施用的有用剂量和施用的特定模式将随以下因素改变：例如细胞类型或(对于体内使用而言)年龄、体重和特定动物及其待治疗部位、所用特定核酸和递送方法、所预期的治疗或诊断用途和制剂形式，例如悬浮剂、乳剂、微团或脂质体。通常，按较低水平施用剂量并且增加直至达到预期效果。
当使用脂质递送核酸时，施用的脂质化合物的量可改变并且通常取决于施用核酸的量。例如，脂质化合物与核酸的重量比优选为约1:1至约30:1，约5:1至约15:1的重量比更优选。
核酸分子的剂量单位可在约0.001-0.25mg/kg受体体重/天的范围内，或在约0.01-20mg/kg体重/天的范围内，或在约0.01-10mg/kg体重/天的范围内，或在约0.10-5mg/kg体重/天的范围内，或在约0.1-2.5mg/kg体重/天的范围内。
可引入适量的核酸分子并且可使用标准方法以经验为根据确定这些量。细胞环境中个别核酸分子物质的有效浓度可为约1fmol、约50fmol、100fmol、1pmol、1.5pmol、2.5pmol、5pmol、10pmol、25pmol、50pmol、100pmol、500pmol、1nmol、2.5nmol、5nmol、10nmol、25nmol、50nmol、100nmol、500nmol、1μmol、2.5μmol、5μmol、10μmol、100μmol或更高。
约0.1mg至约140mg/kg体重/天级别的剂量水平可用于治疗以上指出的病状(约0.5mg至约7g/位对象/天)。可与载体物质组合生成单剂量的活性成分的量随治疗宿主和施用的特殊模式而改变。单位剂型通常含有约1mg至约500mg的活性成分。
据了解，任何特定对象的特定剂量水平取决于各种因素，包括采用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物组合和受治疗的特定疾病的严重程度。
可施用包括本文公开的核酸分子的药物组合物每日一次、每日四次、每日三次、每日两次或每日一次或以任何间隔施用并且施用医学上恰当的任何持续时间。然而，也可按含有2、3、4、5、6或更多个按恰当间隔整天施用的亚剂量的剂量单位给予治疗剂。在这种情况下，每个亚剂量中所含的核酸分子可相应地较小以达到每日总剂量单位。例如，可使用提供持续稳定释放dsRNA若干天的常规持续释放制剂将剂量单位经若干天配混成单次剂量。持续释放制剂在本领域中众所周知。剂量单位可含有相应多个日剂量。以使得多个核酸单位的总和含有足够剂量的方式配混组合物。
药物组合物、试剂和容器
还提供了包括如本文提供的用于降低hsp47的表达的核酸分子(例如，siNA分子)的组合物、试剂盒、容器和制剂，其用于向患者施用或分配核酸分子。试剂盒可包括至少一个容器和至少一个标签。适合容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。可由各种材料，例如玻璃、金属或塑料形成容器。容器可容纳氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群体和/或抗体。在一个实施方案中，容器容纳用于检查细胞的mRNA表达概况的多核苷酸以及用于该目的的试剂。在另一实施方案中，容器包括用于评估hsp47蛋白表达细胞核组织或相关实验、预后、诊断、预防和治疗目的抗体、其结合片段或特异性结合蛋白；对于这种用途的指南和/或说明书可包括在这种容器上或与该容器一起，用于这些目的的试剂及其它组合物或工具也可如此。试剂盒可进一步包括相关指南和/或说明书；也可包括用于这些目的的试剂和其它组合物或工具。
容器可选择性地容纳治疗、诊断、预后或预防病状有效的组合物并且可具有无菌接入口(例如容器可为具有可通过皮下注射针头刺穿的塞子的静脉溶液包或小瓶)。组合物中的活性成分可为能够特异性结合hsp47和/或调节hsp47功能的核酸分子。
试剂盒进一步包括第二容器，其包括药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和/或葡萄糖溶液。第二容器可进一步包括从商业和用户角度来看需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、搅拌器、针头、注射器和/或具有使用指南和/或说明的药品说明书。
使用之前将核酸分子包装于其中的单位剂量安瓿或多剂量容器可包括装入一定量的多核苷酸或含有适于其药学上有效剂量或多份有效剂量的多核苷酸的溶液的密封容器。将多核苷酸包装为无菌制剂，并且将密封容器设计为保持制剂的无菌状态直至使用。
其中多核苷酸包括编码细胞免疫反应元件的序列或其片段的容器可包括经标记的包装，并且标签可载有政府机关，例如美国食品和药物管理局规定形式的公告，所述公告反映经机构根据联邦法律批准生产、使用或销售其中的多核苷酸物质供人类施用。
联邦法律要求药物组合物在人类治疗中的使用应经联邦政府机构批准。在美国，美国食品和药物管理局负责执行，发布获得这种批准的适当法规，21U.S.C.§301-392中有详述。42U.S.C.§262下提供了生物材料，包括由动物组织制成的产品的法规。大多数外国国家需要类似批准。虽然法规根据国家的不同而有所不同，但个别程序在本领域中众所周知并且本文提供的组合物和方法相应遵守。
待施用的剂量很大程度上取决于病状和治疗对象的体型以及治疗频率和施用途径。可通过初始反应和临床判断指导持续治疗方案，包括剂量和频率。虽然在特定施用中可能需要其它肠胃外途径，例如吸入气溶胶制剂，(例如)至鼻、喉、支气管组织或肺的黏膜，但优选经肠胃外注射至组织胞间隙的途径。
因此，本文提供了一种药用产品，其包括：多核苷酸，所述多核苷酸包括于药学上可接受的可注射载体中呈溶液的编码细胞免疫反应元件或其片段的序列，并且适于经间质引入组织内引起组织的细胞表达细胞免疫反应元件或其片段；装有溶液的容器和附于容器上政府机构规定形式的规范医药品的生产、使用或销售的公告，所述公告反映了经机构批准生产、使用或销售多核苷酸溶液供人类施用。
适应证
本文公开的核酸分子可单独或联合其它疗法用于治疗与hsp47相关的疾病、病状或病症，例如肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、肾纤维化、腹膜纤维化、慢性肝损伤和原纤维形成和与细胞或组织中的hsp47水平相关或将对其反应的任何其它疾病或病状。因此，本文公开的组合物、试剂盒和方法可包括包装本文公开的包括标签或药品说明书的核酸分子。标签可包括核酸分子的使用指南，例如单独或联合其它疗法用于治疗或预防肝纤维化、腹膜纤维化、肾纤维化和肺纤维化和与细胞或组织中的hsp47水平相关或将对其反应的任何其它疾病或病状。标签可包括用于降低hsp47表达的指南。“药品说明书”用于指治疗性产品的商业包装中通常所包括的含有关于适应证、用途、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其它治疗性产品和/或有关使用这种治疗性产品的警告的信息。
本领域的技术人员将认识到本领域中已知的其它抗纤维化治疗、药物和疗法可易于与本文的核酸分子(例如，siNA分子)组合并且因此涵盖于本文中。
现将参考以下非限制性实施例更详细地描述本文提供的方法和组合物。
实施例1制备针对gp46的siRNA
在用于在靶向HSP47(胶原(I型至IV型)的共同分子伴侣)碱基序列中的siRNA识别的最佳序列中，序列A和B使用iGENE Therapeutics,Inc.的siRNA寡核苷酸设计程序制备，序列C通过使用来自Ambion,Inc.的siRNA Target Finder在互联网搜索制备，并且选择会成为大鼠gp46(人HSP47同源物，GenBank登录号M69246)的靶的19个碱基的序列。在进行设计时，考虑开始于起始密码子下游75至100个碱基，定位第一个AA二聚体，并确保GC含量为30％至70％。在本实施例中，制备了具有如下序列的siRNA。
A:GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAAC
B:CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGC
C:GAAACCUGUAGAGGCCGCA
实施例2制备的siRNA抑制gp46表达
正常大鼠肾细胞(NRK细胞)，其具有大鼠gp46并且是产生胶原的成纤维细胞，用0.1nM至50nM siRNA转染并培养12-48小时(图1)。通过蛋白印迹方法检查gp46的表达量(图2-4，上部条带对应于gp46，下面条带对应于肌动蛋白对照)。与载体相比，全部的siRNA显著地抑制gp46蛋白的表达。在下面的实验中，使用显示最强作用的siRNA序列A。由siRNA的抑制是浓度依赖的(图3)；gp46的蛋白表达在48小时被50nM siRNA抑制大约90％(图4)。
实施例3制备的siRNA抑制胶原合成
为了检查胶原合成的量，将3H-脯氨酸在上述的条件下(siRNA浓度50nM，时间48小时)添加至大鼠成纤维细胞(NRK细胞)的培养物上清液，且在转染后见车分泌的蛋白中3H的量(图5)。根据Peterkofsky et al.,1971Biochemistry 10:988-94，合成的胶原的量由在3H–脯氨酸存在下培养gp46siRNA转染的成纤维细胞时分泌至上清中的蛋白和被胶原酶降解的蛋白的比例计算。
胶原合成比例＝胶原酶敏感的分数X100(5.4X胶原酶不敏感分数+胶原酶敏感的分数)
与对照组相比，大鼠成纤维细胞中的胶原合成比例降低了大约40％(图6)。
实施例4核酸至HSC的特异性转染
通过混合GFP表达质粒制备乳剂(VA-Lip-GFP)并且通过混合10％维生素A(VA)和脂质体形成脂质体包囊化的VA。含有摩尔比4:3:3的作为阳离子脂质的O,O’-二肉豆蔻酰-N-(α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)、胆固醇和二油酰磷脂酰乙醇胺的脂质体溶解于氯仿-甲醇混合物(4:1，v:v)，并且通过真空蒸发去除溶剂。脂质和水性9％蔗糖溶液混合并在60℃水合并均质化至均匀。将分散物挤压通过0.22μm孔径的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluroide)膜过滤器两次。将分散物等分入玻璃小瓶并冷冻然后冻干。干燥的脂质体在使用前用蒸馏水以1mM DC-6-14的浓度在涡旋下重建。具体地，首先将25mg的维生素A溶解于87μL DMSO由此给出100mM的原液。为了制备VA-偶联的脂质体，溶解于DMSO的200纳摩尔的VA与100纳摩尔的DC-6-14在室温涡旋混合。VA-siRNA-脂质体肝门内给大鼠使用，收集肝组织并固定。通过假设200g大鼠的血浆量为大约10ml，并设定门静脉血中的VA和GFP的浓度为10μM来准备乳剂。将1μL的该VA原液与10μL的VA-脂质体和179μL的PBS混合，进一步向其中加入10μg GFP表达质粒，给出总的200μL，且混合物涡旋3分钟以给出VA-Lip-GFP。打开SD大鼠的腹部，将VA-Lip-GFP缓慢注射入外周门静脉。注射48小时候，收获肝组织。由于与其它干细胞相比，中间丝结蛋白特异性地在HSC表达，当固定的肝组织用Alexa Fluor 568-标记的抗结蛋白抗体染色并检查GFP荧光双图像时，确认GFP在HSC内表达(图7)。对于未处理的对照和单独施用GFP表达质粒载体的组，未观察到大鼠HSC中的表达，但是在施用VA-Lip-GFP的组中，观察到GFP在星状细胞的特异性表达。
实施例5核酸转染率的定量分析
以实施例4相同的方式，除了用FITC-标记的gp46siRNA代替GFP表达质粒，制备含有VA包囊化VA的脂质体和FITC-标记的gp46siRNA的乳剂(VA-Lip-gp46siRNA(FITC))。室温搅拌下将siRNAgp46(蒸馏水中580皮摩尔/μl)溶液添加至实施例4的VA偶联的脂质体溶液。siRNA与DC-6-14的比例为1:11.5(mol/mol)而siRNA和脂质体的比例(wt/wt)为1:1。通过微分离(micropartition)去除游离VA或siRAN，使用VIVASPIN浓缩器，30K MWCO，三次通过。膜上捕获的材料用pBS重建并肝门内施用至SD大鼠(10μg siRNA的量/200μL)。施用48小时候收获肝组织，αSMA(平滑肌肌动蛋白，与其它干细胞相比在HSC中特异性表达)，用AlexaFluor 568-标记的抗-αSMA抗体染色，细胞核用DAPI染色，并且通过激光共聚焦扫描显微镜(LSM)检查荧光图像。如图8左手侧显示，施用VA-Lip-gp46siRNA(FITC)的组中，观察到大量的细胞发出FITC的绿色荧光和Alexa Fluor 568的红色荧光两者，且当通过NIH Image进行定量分析(通过选择X1000荧光显微镜图像中的任意10个视野计数细胞数目)时，转染效率为77.6％(10个视野的平均)。另一方面，在施用不含VA的Lip-gp46siRNA(FITC)的组中，转染效率是14.0％的低值，且此外，观察到3.0％转染至除星状细胞外的细胞(图8右手侧)。根据上述结果发现通过包括VA显著地增加了至星状细胞的转染效率。
实施例6通过VA-Lip-gp46siRNA抑制gp46的表达
对于实施例5收获的组织的另一切片，用Alexa Fluor 568-标记的抗-HSP47抗体对gp46染色并且用DAPI对细胞核染色，通过激光共聚焦扫描显微镜检查荧光图像。如图9所示，观察到施用VA-Lip-gp46siRNA的组中，与施用含有不特异于gp46的随机siRNA的VA-Lip-随机siRNA的组相比(图左手侧)，gp46的表达(可作为红色荧光被观察到，图右手侧)显著地降低。以实施例7相同的方式，使用NIH Image选择X1000荧光显微镜图像的任意10个视野检查gp46-阴性细胞的数目，相对于对照组6个视野的平均的表达抑制率为75％，这非常高。
实施例7治疗LC大鼠(门静脉施用1)
根据Jezequel et al.(Jezequel et al.,1987,J Hepatol.5:174-81)的报道，使用二甲基亚硝胺(DMN)制备LC模型大鼠(图10)。具体地，1mL/kg剂量的1％DMN(腹膜内施用)每周连续3天施用至5周龄SD大鼠。如已报道的，从第二周观察到纤维的增加，在第四周这伴随着发现显著的纤维化、肝叶结构的破坏以及观察到再生性小结的形成(图11)。然后，通过与实施例4和5相同的方法，乳剂(VA-Lip-gp46siRNA)通过将gp46siRNA配制为脂质体并和10％VA混合制备，并被施用。VA-Lip-gp46siRNA的施用在第三周开始，该时间观察到了充分的纤维化，评估在第四周和第五周进行。由于实施例2确认了体外在多达48小时观察到效果，施用每周进行两次(图11)。施用的量根据其中siRNA直接注射的报道(McCaffery etal.,2002,Nature 418:38-39)确定，siRNA的总量为40μg。施用siRNA后的肝Azan染色中，施用盐水的组、施用siRNA(随机)的组和使用siRNA(gp46)的组在第四周没有明显差异，但是在第五周对于使用gp46siRNA的组观察到纤维的量的减少(图12)。为了定量分析纤维的量，使用NIH Image提取未染色的部分，测量其面积(图13)，对于施用gp46siRNA的组观察到胶原面积的显著减少(图14)。
此外，为了使用另一量度评估纤维化程度，通过标准方法定量测定羟脯氨酸(纤维化的指示物)的量。
具体地，20mg的冰冻干燥肝组织用HCl水解24小时后，反应液离心，上清用试剂如Ehrlich’s溶液处理并离心。回收上清，肝组织中的羟脯氨酸的量通过测定560nm的吸光度来测定(Hepatology 1998,28:1247-52)。如图15所示，在使用gp46siRNA的组中，羟脯氨酸的量变得非常少。
实施例8治疗LC大鼠(门静脉施用2)
此外，为了检查使用本申请的药物存活率的改变，根据Qi Z et al.(PNAS 1999；96:2345-49)的方法，以超过正常量20％的量使用DMN制备LC模型大鼠在该模型中，在第一和第二周进行总共四次门静脉施用。施用细节为：PBS、Lip-gp46siRNA、VA-Lip-randomsiRNA、和VA-Lip-gp46siRNA(每组n＝7)。第三周后，对照(施用PBS的组、施用VA-Lip-随机siRNA的组、和施用Lip-gp46siRNA的组)全部死亡，但施用了VA-Lip-gp46siRNA的组中7只中6只存活(图16)。此外，在第21天的肝Azan染色中，对于施用gp46siRNA的组观察到明显的纤维的量的减少(图17)。
实施例9治疗LC大鼠(门静脉施用3)
在另一实验中，从第3周起对根据Qi et al.的方法和Ueki et al.,1999,NatMed.5:226-30的方法制备的LC模型大鼠(1％DMN 1mg/kg腹膜内施用每周3次)进行门静脉施用，如下表2所示(每组n＝6)。向待施用的每种物质添加PBS以制备总体积200μL，施用的频率为一周一次。
表2：
根据结果，在除了施用本申请的药物的组之外的组中(组9-4)，全部6只大鼠在开始施用DMN后的第45天前死亡，但在施用本申请的药物的组中，除了1个在第36天死亡的例子外，全部个体在开始施用DMN后存活超过70天(图18)。对于死亡的个体，以与实施例7相同的方式基于胶原的面积定量分析肝纤维的量，肝纤维的量的增加被VA-Lip-gp46siRNA的施用显著地抑制(图19)。
实施例10治疗LC大鼠(静脉内施用)
从第3周起对以与实施例9相同的方式制备的LC模型大鼠(1％DMN 1μg/BW(g)腹膜内施用每周3次)进行静脉内施用，如下表所示(每组n＝6)向待施用的每种物质添加PBS以制备总体积200μL。施用时期为直到死亡，除了组10-4为施用至第7周而组10-10为第6周。
根据结果，在除了施用本申请的药物的组之外的组中(治疗组10-4和10-10)，全部6只大鼠在开始施用DMN后的第45天前死亡，但在施用本申请的药物的组中，除了治疗组10-4中2只大鼠在第45天死亡的例子外，全部个体在开始施用DMN后存活超过70天(图20和21)。对于死亡的个体，以与实施例7相同的方式定量分析肝纤维的量，肝纤维的量的增加被VA-Lip-gp46siRNA的施用显著地抑制(图22)。
上述结果显示本申请的药物对于涉及星状细胞的纤维化的预防和治疗是非常有效的。
实施例11通过RBP(视黄醇结合蛋白)改善的结果
使用衍生自人HSC的细胞系LI90检查RBP对VA-Lip-gp46siRNA转染效率的影响。将100nM实施例5中制备的VA-Lip-gp46siRNA(FITC)和多种浓度(即0、0.1、0.5、1、2、4、或10％)的FBS(胎牛血清)一起在培养期间添加至LI90并孵育48小时，通过LSM观察荧光图像，并且通过FACS定量分析掺入个体细胞的siRNA的量。FBS含有大约0.7mg/dL的RBP。如图23所示，FBS(RBP)给出siRNA转染量的浓度依赖的增加。随后，将100nM的VA-Lip-gp46siRNA(FITC)和4％FBS，和10μg(21.476nmol)抗-RBP抗体一起在培养期间添加至LI90，以相同方式评估siRNA转染效率。如图24所示，通过RBP增加的转染量被抗-RBP抗体的添加显著降低。上述结果显示RBP在进一步增强本申请的药物的转染中是有效的。
实施例12
使用若干计算机程序，包括Whitehead Institute for Biomedical Research的siRNA、siRNA Design(Integrated DNA Technologies)、BLOCK-iT RNAi Designer(Invitrogen)、siDESIGN Center(Dharmacon)和IOPREDsi(Friedrich MiescherInstitute for Biomedical Research)，设计针对Hsp47的核酸分子(例如，siNA≤25个核苷酸)。基于算法以及人和大鼠之间的序列同源性对来自这些程序的高分siRNA的序列进行比较和选择(见表3)。可通过体外敲低测定验证候选序列。
对于选择核酸分子(例如，21聚体siRNA)序列，考虑了若干参数。示例性参数包括：
1)热力学稳定性(RISC偏好于具有较不稳定的5’端的链)
2)30-52％GC含量
3)核苷酸位置优先：(C/G)1NNNNNNNN(A/U)10NNNNNNNN(A/U)19，其中N为任何核苷酸
4)缺乏假定免疫刺激性基序
5)2-核苷酸3’突出端
6)转录物中(优选cDNA区中)siRNA的位置
7)序列特异性(用BLAST核对)
8)通过核对SNP数据库确定的单个核苷酸的变异
基于前述方法设计具有≤25个核苷酸的siRNA序列。基于较小序列设计相应Dicer底物siRNA(例如，≥26个核苷酸)并通过向有义链的3’-端添加4个碱基且向反义链的5’-端添加6个碱基来延伸siNA≤25个核苷酸的靶位点。制成的Dicer底物通常具有含25个碱基的有义链、含27个碱基的反义链以及含平端及3’-突出端的不对称分子。表3中提供了有义链和反义链无碱基修饰(碱基序列)和有修饰(实验序列)的序列。
表3
实施例13
为了筛选出各种siNA分子抗人和大鼠hsp47基因的潜能，通过慢病毒引入人HSP47cDNA-绿色荧光蛋白(GFP)或大鼠GP46cDNA-GFP构建体至293、HT1080、人HSC系hTERT或NRK细胞系中建立各种报告细胞系。用抗GFP的siRNA进一步评估这些细胞系。测量剩余荧光信号并标准化为混杂siRNA(Ambion)，随后标准化为细胞活力。结果显示，在不同细胞系中抗GFP的siRNA将荧光敲低至不同程度(图25)。选择293_HSP47-GFP和293_GP46-GFP细胞系进行siHsp47筛选，因为它们易于转染并且对荧光敲低敏感。
用96孔组织培养板中每孔1.5pmol抗GFP的siNA，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)以反向转染方式转染细胞。按6,000个细胞/孔接种细胞并与siNA复合物混合。培育72h后在Synergy 2Multi-Mode Microplate Reader(BioTek)上获得荧光读数。
培育72h后，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒，根据手册(Promega)测量用或未用siNA处理的细胞的活力。将读数标准化为用乱序siNA分子处理的样品。
实施例14评估siHsp47对报告细胞系中hsp47表达的抑制效率
通过评估来自报告GFP的荧光信号的变化来评估293HSP47-GFP和293GP46-GFP细胞系中抗hsp47的siNA的抑制效率。如实施例2中所述进行实验。将荧光信号标准化为来自用混杂siRNA(Ambion)处理用作对照的细胞的荧光信号。结果表明，试验hsp47siNA分子在抑制两种细胞系中hsp47mRNA均有效。然而，抗GP46mRNA的siNA(如2008年Sato等的论文中所公布)仅在293GP46-GFP细胞系中有效。结果示于图26A-B。
使用实施例2中所述的方法评估用抗hsp47和gp46的siRNA处理的293HSP47-GFP和293GP46-GFP细胞系的活力。将细胞活力标准化为用混杂siRNA(Ambion)处理的细胞。结果表明，用siNA分子处理不会显著影响细胞活力。然而，用不同hsp47siNA分子处理的293HSP47-GFP细胞系的细胞活力随所用siNA分子的不同而改变，而293GP46-GFP细胞系的活力相似。对于siHsp47-6和Hsp47-7处理细胞而言，293HSP47-GFP细胞的活力比其余细胞低。结果示于图26C-D。
实施例15通过 qPCR评估对hsp47mRNA的siHsp47抑制效果
实施例14中，用荧光信号的变化评估报告细胞系中siHsp47的敲低效率。为检定mRNA水平下的结果，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)以实施例13中描述的反向转染方式将靶向内源hsp47的siRNA转染至人HSC细胞系hTERT的细胞中。
针对各种试验siHsp47siNA分子的敲低效率评估hsp47mRNA水平。简言之，转染72h后，使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)从hTERT细胞分离mRNA。通过逆转录联合定量PCR，使用探针确定hsp47mRNA的水平。简言之，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI)根据生产商的说明进行cDNA合成，并进行TaqMan基因表达测定(ABI，hsp47测定ID Hs01060395_g1)。根据生产商的说明(ABI)将hsp47mRNA的水平标准化为GAPDH mRNA的水平。结果表明，在所有hsp47siRNA中siHsp47-C最有效，siHsp47-2和siHsp47-2d次之。siHsp47-1与siHsp47-2或siHsp47-1与siHsp47-2d的组合比单独的siHsp47-1更有效。结果示于图27。
实施例16在蛋白质水平检定siHsp47敲低效果
在蛋白质水平通过测量用不同siHsp47转染的hTERT细胞中的HSP47检定不同Hsp47siNA分子(siHsp47)对hsp47mRNA表达的抑制效果。如实施例13中所述，用不同siHsp47转染hTERT细胞。溶解转染的hTERT细胞并通过离心使细胞溶解产物澄清。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳溶解澄清的细胞溶解产物中的蛋白质。用抗HSP47抗体(AssayDesigns)作为一级抗体，与HRP(Millipore)共轭的山羊抗小鼠IgG作为二级抗体，确定细胞溶解产物中的HSP47蛋白水平，接着用Supersignal West Pico化学发光试剂盒(Pierce)进行检测。使用抗肌动蛋白抗体(Abcam)作为蛋白质上样对照。结果显示，用单独的siHsp47-C、siHsp47-2d或siHsp47-1与siHsp47-2d的组合处理的细胞中Hsp47蛋白质的水平显著降低。
实施例17 hsp47siRNA对胶原I表达的下调
为确定siHsp47对胶原I表达水平的影响，测量用抗hsp47的不同siRNA处理的hTERT细胞中的胶原I mRNA水平。简言之，如实施例13中所述，用不同siHsp47转染hTERT细胞。72h后，溶解细胞并且根据手册(Qiagen)使用RNeasy微型试剂盒分离mRNA。通过逆转录联合定量PCR，使用探针确定胶原1mRNA的水平。简言之，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI)根据手册进行cDNA合成，并进行TaqMan基因表达测定(ABI，COL1A1测定IDHs01076780_g1)。根据生产商的说明(ABI)将胶原I mRNA的水平标准化为GAPDH mRNA的水平。将信号标准化为从用乱序siNA转染的细胞获得的信号。结果表明，在用一些候选siHsp47-2、siHsp47-2d及其与siHsp47-1的组合处理的细胞中胶原I mRNA水平显著降低并且示于图28中。
实施例18 hsp47siRNA处理的hTERT细胞的免疫荧光染色
为显现用或未用siHsp47转染的hTERT细胞中两种纤维化标记物胶原I和α平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达，用兔抗胶原I抗体(Abcam)和小鼠抗α-SMA抗体(Sigma)使细胞染色。使用Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(Invitrogen(分子探针))作为二级抗体以使胶原I(绿色)和α-SMA(红色)显现。使用Hoescht使细胞核(蓝色)显现。结果表明，一些靶基因的siRNA敲低与胶原/SMA表达之间的相关性。
实施例19肝纤维化动物模型中siHSP47的体内试验
HSP47(siHSP47C)的siRNA双链体序列如以下所列。
有义(5’->3’)ggacaggccucuacaacuaTT
反义(5’->3’)uaguuguagaggccuguccTT
通过溶解于无核酸酶水(Ambion)中制备10mg/ml siRNA原液。对于肝硬化大鼠的治疗，如Sato等(Sato Y.等Nature Biotechnology 2008.第26卷，第431页)所述用微生物A偶联脂质体配制siRNA以靶向生成胶原的激活HSC。微生物A(VA)-脂质体-siRNA制剂由0.33μmol/ml的VA、0.33μmol/ml的脂质体(Coatsome EL-01-D,NOF Corporation)和于5％葡萄糖溶液中0.5μg/μl的siRNA组成。
Sato等(Sato Y.等Nature Biotechnology 2008.第26卷，第431页)报道了肝硬化动物模型。用于磷酸盐缓冲液(PBS)中的0.5％二甲基亚硝胺(DMN)(Wako Chemicals,Japan)诱导4周龄雄性SD大鼠的肝硬化。在第0、2、4、7、9、11、14、16、18、21、23、25、28、30、32、34、36、38和40天经腹膜内施用2ml/kg体重的剂量，每周连续3天，
siRNA治疗：从第32天开始进行siRNA治疗，静脉内注射5次。详细地，在第32、34、36、38和40天用siRNA治疗大鼠。然后在第42或43天处死大鼠。测试3种不同siRNA剂量(1.5mg siRNA/kg体重、2.25mg siRNA/kg体重、3.0mg siRNA/kg体重)。试验组的详情和每组中动物的数量如下：
1)通过DMN注射诱导硬变，然后注射5％葡萄糖，而非siRNA(n＝10)
2)VA-Lip-siHSP47C 1.5mg/kg(n＝10)
3)VA-Lip-siHSP47C 2.25mg/kg(n＝10)
4)VA-Lip-siHSP47C 3.0mg/Kg(n＝10)
5)假治疗组(注射PBS而非DMN。注射5％葡萄糖而非siRNA)(n＝6)
6)未处理对照(完好)(n＝6)
VA-Lip指维生素A-脂质体复合物。
治疗效果的评估：在第43天，“患病大鼠”组中10只动物中有2只和“VA-Lip-siHSP47C siRNA1.5mg/kg”中10只动物中有1只由于肝硬化发展死亡。剩余动物存活。处死大鼠之后，将肝脏组织固定于10％福尔马林中。然后，将每个肝脏的左小叶嵌入石蜡中以用于组织学研究。用天狼星红和苏木精伊红(HE)为组织载玻片染色。采用天狼星红染色使胶原沉淀显现并确定硬变水平。HE染色作为对比染色用于细胞核和细胞质。在显微镜(BZ-8000,Keyence Corp.Japan)下观察每张载玻片并且通过与显微镜连接的图象分析软件确定每张载玻片天狼星红染色面积的百分比。每个肝脏制备至少4张载玻片进行图像分析，并且用照相机捕获每张载玻片(肝脏切片)的所有区域并进行分析。通过斯氏t检验(Student’s t-test)进行统计分析。
结果：图29显示了纤维化面积。“患病大鼠”体内纤维化面积比“假治疗组”或“未处理对照”组大。因此，DMN处理诱导肝脏中胶原沉积，这是通常观察到的肝纤维化。然而，通过用靶向HSP47基因的siRNA治疗，与“患病大鼠”组(图29)相比，纤维化面积显著减少。该结果表明本文公开的siRNA在实际疾病中有治疗效果。
在肝纤维化动物模型中测试另外的siRNA化合物，并且显示减少了肝脏中的纤维化面积。
实施例20HSP47/SERPINH1的活性双链RNA化合物的序列的生成和表4、5、B、C、D和E 中所示siRNA的生成
通过退火互补单链寡核苷酸生成双链体。在层流净化罩中，通过稀释于WFI(注射用水,Norbrook)中制备500μM单链寡核苷酸原液。通过使用WFI以1:200稀释各500μMssRNA，并且使用Nano Drop测量OD来确定实际ssRNA浓度。重复该步骤3次并计算平均浓度。然后将原液稀释为250μM的最终浓度。通过加热至85℃并经至少45min使其冷却至室温，以使互补单链退火。通过在20％聚丙烯酰胺凝胶上测试5μl双链体并染色试验双链体的完全退火。将样品保存在-80℃下。
表4、5、B、C、D和E提供了HSP47/SERPINH1的siRNA。对于每个基因而言，存在19聚体siRNA序列的单独列表，基于专利算法中的得分按照靶向人基因表达的最佳顺序以优先顺序排列19聚体siRNA序列。
以下缩写用于本文的表4、5、B、C、D和E中：“其它物种”指其它动物的跨物种身份：D-狗、Rt-大鼠、Rb-兔、Rh-猕猴、P-猪、M-小鼠；ORF：开放阅读框。19聚体(表5、B、C)和18+1聚体(表4、D、E)分别指长度为19和18+1个(反义链位置1中的U，有义链位置19中的A)核糖核酸的寡聚体。
在生成双链RNA分子中有用的siRNA寡核苷酸在下表4、5、B、C、D和E中公开。
表4
表5:
表B：额外的活性19-聚体SERPINH1siRNA
表C：跨物种19-聚体SERPINH1siRNA
表D：SERPINH1活性18+1-聚体siRNA
表E：SERPINH1跨物种18+1-聚体siRNA
从进一步的测定选择最有活性的序列。从表4中选择siRNA化合物SERPINH1_2、SERPINH1_6、SERPINH1_13、SERPINH1_45、SERPINH1_45a、SERPINH1_51、SERPINH1_51a、SERPINH1_52和SERPINH1_86作为优选的化合物(表6-A和B)。
表6-A：选择siRNA
表6B
从表5选择siRNA缓和无SERPINH1_4、SERPINH1_12、SERPINH1_18、SERPINH1_30、SERPINH1_58和SERPINH1_88作为优选化合物(表7)。
表7：选择siRNA
实施例21：纤维化病状的动物模型系统
可在预测动物模型中进行试验本发明的活性siRNA。肾纤维化的大鼠糖尿病和老化模型包括Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠、老化fa/fa(肥胖Zucker)大鼠、老化Sprague-Dawley(SD)大鼠和GotoKakizaki(GK)大鼠；GK大鼠是源自Wistar大鼠的近亲品系，选择用于自然发展NIDDM(II型糖尿病)。肾纤维化的诱导模型包括永久性单侧输尿管梗阻(UUO)模型，这是在健康非糖尿病型动物中发生的急性间质纤维化模型；梗阻后几天内肾纤维化发展。肾纤维化的另一诱导模型为5/6肾切除术。
大鼠肝纤维化的两个模型为以假手术为对照的胆管结扎(BDL)和以橄榄油饲喂动物为对照的CCl4中毒，如以下参考文献中所述：Lotersztajn S,et al Hepatic Fibrosis:Molecular Mechanisms and Drug Targets.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2004Oct 07；Uchio K,et al.,Down-regulation of connective tissue growth factor and type Icollagen mRNA expression by connective tissue growth factor antisenseoligonucleotide during experimental liver fibrosis.Wound RepairRegen.2004Jan-Feb；12(1):60-6；Xu XQ,et al.,Molecular classification of livercirrhosis in a rat model by proteomics and bioinformatics Proteomics.2004Oct；4(10):3235-45。
眼部瘢痕形成的模型在本领域中众所周知，例如Sherwood MB et al.,JGlaucoma.2004Oct；13(5):407-12.A new model of glaucoma filtering surgery inthe rat；Miller MH et al.,Ophthalmic Surg.1989May；20(5):350-7.Wound healing inan animal model of glaucoma fistulizing surgery in the Rb；vanBockxmeer FM etal.,Retina.1985Fall-Winter；5(4):239-52.Models for assessing scar tissueinhibitors；Wiedemann P et al.,J Pharmacol Methods.1984Aug；12(1):69-78.Proliferative vitreoretinopathy:the Rb cell injection model for screeningof antiproliferative drugs。
以下出版物中描述了白内障模型：Zhou et al.,2002.Invest Ophthalmol VisSci.43:2293-300；Wang et al.2004Curr Eye Res.29:51-58。
在这些纤维化病状模型中试验表5和表4的化合物，其中发现所述化合物在治疗肝纤维化和其它纤维化病状中有效。
青光眼模型系统
例如以下所述在大鼠模型中对于视神经夹伤进行测试用于治疗或预防青光眼的本发明活性siRNA：Maeda et al.,2004Investigative Ophthalmology and visualScience(IOVS),45:851。特别地，对于视神经横切，通过眶上入路暴露麻醉大鼠的眼窝视神经(ON)，切断脑膜并且通过用镊子夹伤10s从筛状板横切ON中的所有轴突2mm。
在该动物模型中试验本文公开的核酸分子并且结果显示这些siRNA化合物在治疗和/或预防青光眼中有效。
大鼠视神经夹伤(ONC)模型：玻璃体内siRNA递送和滴眼剂递送
对于视神经横切，通过眶上入路暴露麻醉大鼠的眼窝视神经(ON)，切断脑膜并且通过用镊子夹伤10s从筛状板横切ON中的所有轴突2mm。
单独或于5μL体积中组合(10μg/μL)作为滴眼剂递送siRNA化合物。视神经夹伤(ONC)后立即向成年Wistar大鼠的一只或两只眼睛施用20μg/10μl测试siRNA或10μl PBS并确定注射后5h和第1天，和之后第2天、第4天、第7天、第14天和第21天整个解剖速冻视网膜中摄取的siRNA水平。进行类似实验以测试通过滴眼剂施用的siRNA的活性和功效。
大鼠肺移植后缺血再灌注损伤的模型系统
如Mizobuchi et al.,2004J Heart Lung Transplantation,23和Kazuhiro etal.,2001Am.J.Respir.Cell Mol Biol,25:26-34中所述在大鼠动物模型中获得肺缺血/再灌注损伤。
特别地，用异氟烷诱导麻醉后，将14号Teflon导管插入气管并且用啮齿动呼吸器，使用100％氧气，以70次呼吸/min的速率和2cmH2O的呼气末正压为大鼠机械换气。用Castaneda钳封闭左肺动脉、静脉和主支气管。手术期间，用盐水保持肺部湿润并且覆盖切口以最小化蒸发损失。缺血期长达60min。在缺血期结束时，去除钳并使肺部换气并且在诱导肺部缺血后再灌注4h、24h和5天。试验结束时，轻轻取下肺脏并冷冻用于RNA提取或固定于戊二醛混合物中用于后续组织学分析。
作为特发性肺纤维化(IPF)模型的博莱霉素动物模型
测试通过静脉内注射维生素A-Coatsome配制的siRNA和气管内施用siRNA-维生素A-Coatsome复合物至健康小鼠和博来霉素处理的小鼠体内的肺部和肝脏递送的可行性
目的：为了测试维生素A-Coatsome配制的siRNA递送至正常和纤维化小鼠肺部的两种施用途径的可行性。当前研究中测试的主要假设是全身性施用维生素A-Coatsome配制的经修饰siRNA在纤维化和正常小鼠肺部中是否提供有效摄取和细胞特异性分布。平行测试维生素A-Coatsome配制的经修饰siRNA的气管内途径。将通过原位杂交(ISH进行肺和肝脏中的siRNA检测和细胞特异性分布。
背景：在过去三十余年间，已经将肺纤维化的博来霉素模型研究和表征清楚(Moeller,et al.2008Int J Biochem Cell Biol,40:362-82；Chua et al.,2005Am JRespir Cell Mol Biol 33:9-13)。与IPF患者相似，在BLM处理的动物中存在组织学特点，例如肺泡内芽、腔壁并入胶原和肺泡腔消失。早期研究证明C57/Bl小鼠始终倾向于BLM诱导的肺纤维化，而Balb/C小鼠遗传有耐受性。根据施用途径的不同，发展成不同纤维化模式。BLM的气管内滴注引起支气管中心性加强型纤维化，而静脉内或腹膜内施用诱导与人类疾病相似的胸膜下瘢痕形成(Chua等，如上)。使用普通型间质性肺炎(UIP)的小鼠模型。这种模型显示纤维增生不均匀分布，主要分布于腹膜下，形成与在特发性肺纤维化(IPF)患者的肺部中观察到的相似损害(Onuma,et al.,2001J Exp Med 194:147-56，和Yamaguchi etal.,1988Nature336:244-46)。将通过每隔一天经腹膜内注射博来霉素7天来诱发UIP，使小鼠肺部中腹膜下纤维增生组成恒定(Swiderski et al.1998Am J Pathol 152:821-28，和Shimizukawa et al.,2003Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284:L526-32)。
正如先前证明的，含有siRNA的维生素A载脂质体与视黄醇结合蛋白(RBP)相互作用并且通过RBP受体向肝细胞星状细胞提供有效递送(Sato等Nat Biotechnol 26:431–442,2008)。这项研究经计划以测试维生素A-Coatsome-siRNA复合物是否被博来霉素处理的小鼠的肺部中表达RBP受体的激活肌成纤维细胞有效摄取。另外，将测试局部施用途径(气管内滴注)。
研究设计
小鼠-C57Bl雄性
起始数目(BLM I.P.)–40(第一试验组为6只，研究使用34只，考虑到预期25％死亡率)
起始数目(总计)–60
试验siRNA：本文公开的SERPINHI化合物
表8：组：
博来霉素诱导的肺纤维化。将通过腹膜内滴注博来霉素氯酸盐诱导12周龄雌性C57BL/6小鼠的肺纤维化：0.75mg/kg体重溶解于0.1ml盐水中，在第0、2、4和6天，每隔一天腹膜内滴注7天。
纤维化建立的初步评估。将小鼠(N＝30)分组进行BLM处理，以允许首次处理组(N＝5)和其余动物之间一周的时间间隔。在第14天，处死第1组的两只小鼠，并取出肺脏进行快速HE染色和纤维化的迅速组织病理学评估。当确认肺纤维化时，将剩余大鼠分组并且在首次BLM处理后第14天用siRNA处理。如果到第14天肺部中无足够纤维化发展，在第21天处死首次处理组的剩余小鼠，然后进行纤维化的迅速组织病理学评估。从BLM处理后第21天开始用试验siRNA复合物处理其余动物。
siRNA施用。在首次BLM施用后第14天或第21天(研究期间TBD，基于纤维化建立的初步评估)，根据BW将动物分组。为来自第1组和第2组的动物经静脉内(尾静脉注射)按4.5mg/kg BW的siRNA浓度施用siRNA/维生素A/Coatsome复合物。以相同方式处理同龄原样动物(第5组和第6组)。BLM处理的动物(第9组)将用作维生素A-coatsome媒介物对照。24h内，向以上所有动物重复注射。
用异氟烷麻醉来自第3组和第4组的BLM动物和来自第7组和第8组的原样小鼠并进行气管内滴注2.25mg/kg BW配制于维生素A载脂质体中的siRNA。仅为来自BLM组10的小鼠施用维生素A/Coatsome媒介物。24h后重复气管内滴注。
研究结束。在第二次注射或滴注siRNA复合物后2h处死来自第1、3、5、7、9组的动物。在第二次注射或滴注siRNA复合物后24h处死来自第2、4、6、8、10组的动物。
一旦处死动物，为小鼠心脏灌注10％中性缓冲福尔马林。用0.8-1.0ml的10％NBF为肺部充气，并且进行气管结扎。切除肺部并固定于10％NBF中24h。从每只动物取出肝脏并固定于10％NBF中24h。
切片和评估。由肺部和肝脏制备顺向切片。用苏木精和伊红为第一顺向切片染色以评价肺部和肝脏形态，用天狼星红(三色)为第二顺向切片染色以鉴定胶原。第三个顺向切片进行原位杂交(ISH)以检测siRNA。
实施例22：含siRNA的VA结合脂质体的体内抗肺纤维化活性
(1)诱导肺纤维化和药物施用
雄性S-D大鼠(8只大鼠/组，8周龄，Charles River Laboratories Japan,Inc.)在麻醉情况下通过气管内套管插入术(MicroSprayer,Penn-Century,Inc.)施用一次溶解于0.1mL盐水中的0.45mg博罗霉素，以产生博罗霉素肺纤维化模型。用该方法，通常在大约2周后在肺部出现显著的纤维化。将脂质体制剂(1.5mg/kg的siRNA的量，1ml/kg的体积，即，对200g的大鼠为200μl)或PBS(1ml/kg的体积)经由尾静脉施用至大鼠，在施用博罗霉素2周后开始，总共10次(每隔一天)。在最后一次治疗2天后处死大鼠，进行肺组织的组织学调查(见图30)。用One Way ANOVA和Bonferroni多重比较检验评估统计学显著的差异。
脂质体的组成为HEDC/S-104/DOPE/胆固醇/PEG-DMPE/diVA-PEG-diVA(20:20:30:25:5:2摩尔％。siRNA具体如下：
S链:5’-idAB-rG-rA-rG-rA-rC-rA-rC-rA-rU-rG-rG-rG-rU-rG-25rC-25rU-25rA-25rU-25rA-C3-P-3’
GS链:
5’-mU-rA-mU-rA-mG-rC-25rA-rC-mC-rC-mA-rU-mG-rU-mG-rU-mC-rU-mC-C3-C3-3’
其中：rX代表核糖核苷酸；mX代表2’-O-甲基核糖核苷酸；25rX代表具有2’-5’连键的核糖核苷酸；C3代表1,3-丙二醇间隔物；idAB代表反向1,2-双脱氧-D-核糖；P代表3’-端的磷酸基团。3’-端的C3通过支持物装载的1,3-丙二醇间隔物引入。3’-端的磷酸基团(P)通过支持物装载的二乙基璜酰基(Pi)间隔物引入。
(2)组织学调查
所移除的肺的一部分根据常规方法福尔马林固定，并进行Azan染色(偶氮卡红、苯胺蓝橙黄G溶液)。如图31中的Azan染色结果所示，在PBS施用组(疾病)中，观察到显著的纤维化图像，其特征为由于大量染成蓝色的胶原性纤维造成的间隙的扩大，而在制剂施用组(治疗)中，纤维化被明显抑制。
如图32中的组织学得分(T.Ashcroft得分)结果所示，在制剂施用组(治疗)中，纤维化得分被显著降低。
实施例23：HSP47 mRNA的体内降低(DMN模型)
在短期肝损伤模型(称作快速模型)中评估实施例22的HSP47脂质体的体内活性。在该模型中，通过用肝毒性剂例如二甲基亚硝胺(DMN)处理诱导短期肝损伤，并进行HSP47mRNA水平的评估。为了诱导这些损伤，雄性Sprague-Dawley大鼠在连续6天腹膜内注射DMN。在DMN处理时期的最后，将动物基于个体动物体重随机分组。在最后一次DMN注射1小时后，脂质体样品作为单一IV剂量(0.375或0.75mg/kg，反映siRNA剂量)施用。一天后，切下肝裂片，通过定量RT-PCR(TaqMan)测定确定HSP47和GAPDH两者的mRNA水平。将HSP47mRNA水平归一化至GAPDH水平。如图33所示，在肝中检测到强烈的和剂量依赖的mRNA减少。在单剂量的0.75mg/kg的ND-L02-0101后，观察到HSP47mRNA的80％降低。甚至在0.375mg/kg的较低剂量，也观察到40％的显著敲低。
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申请人保留将来自任何这种论文、专利、专利申请或其它实体和电子文件的任何全部材料和信息实体并入本申请中的权利。
本领域中的技术人员显而易见，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可对本文公开的发明进行不同替换和修改。因此，这些另外的实施方案在本发明和以下权利要求的范围内。本发明教本领域的技术人员试验本文所述化学修饰的各种组合和/或替换，以生成介导RNAi活性的活性增强的核酸构建体。这种活性增强可包括稳定性增强、生物利用率提高和/或介导RNAi的细胞反应的激活增强。因此，本文所述的特殊实施方案并非限制性并且本领域中的技术人员可易于意识到，无需过度实验就可测试本文所述修饰的特定组合，以鉴定RNAi活性增强的核酸分子。
本文说明性描述的发明可能适合在本文未特别公开的任何元素、限制缺乏下实施。因此，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，例如，术语“一个”、“一种”和“该”以及在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)的类似指示物要解释为包括单数和复数。术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”等应广义上理解并且不受限制(例如，含意“包括，但不限于”)。除非本文另外指出，本文中对值范围的叙述仅仅旨在用作单独提到每个落入范围内的单独值的简记方法，并且将每个单独值并入说明书中，犹如本文单独引用每个单独值。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，可按任何适合顺序进行本文所述的所有方法。本文提供的任何所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的用途仅仅旨在更好地阐明本发明，除非另外要求并未造成对本发明范围的限制。不得将说明书中的语言解释为指示任何非要求元素为本发明实践所必需。另外，本文采用的术语和表达式已用作描述而非限制性术语，并且不打算将这些术语和表达式用于将所示和所述特征的任何等价物或其一部分排除在外，但应认识到各种修改可能在要求的发明范围内。因此，应理解虽然已通过优选的实施方案和任选特征特别公开了本发明，但是本文公开的其中具体化的本发明的修改和变型为本领域中的技术人员所采取，并且认为这些修改和变型在本发明的范围内。
本文广泛且一般性地描述了本发明。属于类属公开的每个狭域物种和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的类属描述，有从属中除去任何受试物质的附带条款或负面限制，而不管本文是否特别引用切除材料。其它实施方案在以下权利要求中。另外，按照马库西群组描述本发明的特征或方面时，本领域中的技术人员将认识到由此还根据马库西群组的单独成员或成员亚组描述本发明。

Claims (50)

1.药物组合物，其包含药物载体和双链核酸分子，其中所述药物载体包含类视黄醇和脂质的混合物，且其中所述双链核酸分子由以下结构组成：
5’(N)x–Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y–z” 5’(有义链)
其中N和N’各自为可未经修饰或经修饰的核苷酸，或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y各自为其中每个连续N或N’通过共价键与下一个N或N’连接的寡核苷酸；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在则独立地包括在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；
其中z”可以存在或不存在，但如果存在则为在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；
其中x和y各自独立地为18至40之间的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且
其中(N)x包括SEQ ID NO:1所示人hsp47的mRNA编码序列的反义序列；且其中所述脂质包含下式的HEDC
2.权利要求1的药物组合物，其中所述双链核酸分子包含选自序列SEQ ID NO:60和127(SERPINH1_2)、SEQ ID NO:98和165(SERPINH1_45a)、和SEQ ID NO:101和168(SERPINH1_51)的寡核苷酸序列。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述类视黄醇由选自维生素A、视黄酸、视黄醛、维甲酸、阿达帕林、视黄醇棕榈酸酯和芬维A铵(4-HPR)的分子组成。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述类视黄醇由聚乙二醇分子缀合的类视黄醇分子组成。
5.权利要求1的药物组合物，其中在所述药物载体到达星状细胞之前所述类视黄醇至少部分地暴露于所述药物载体的外部。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述药物载体为选自聚合物微团、脂质体、乳剂、微球和纳米球的形式。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述药物载体是包含脂质分子双层的脂质囊泡的形式。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述类视黄醇是所述脂质分子的0.2wt％至20wt％。
9.权利要求1的药物组合物，其中所述脂质包含下式的S104
10.权利要求7的药物组合物，其中所述双链核酸分子暴露于所述脂质囊泡的外表面。
11.权利要求7的药物组合物，其中所述双链核酸分子被所述脂质囊泡包囊化。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述双链核酸分子对核酸酶有抗性。
13.权利要求1的药物组合物，其中所述双链核酸分子在星状细胞中降低hsp47表达。
14.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗与hsp47相关的疾病。
15.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗选自以下的疾病：包括肝、肺、肾、胰腺、皮肤、心脏、脑、肠、结肠、声带、腹膜、眼睛、肌肉、骨髓、骨、卵巢、输尿管和子宫的器官和组织的纤维化；癌症和癌症相关纤维化组织。
16.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗肝纤维化。
17.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗肺纤维化。
18.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗肾纤维化。
19.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗腹膜纤维化。
20.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗慢性肝损伤。
21.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗原纤维生成。
22.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗归因于肝移植后的丙型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的肝硬化；特发性肺纤维化；导致肺纤维化的放射性肺炎；糖尿病性肾病；与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)相关的腹膜硬化或眼部瘢痕性类天庖疮。
23.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗归因于肝移植后的丙型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的肝硬化。
24.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗特发性肺纤维化。
25.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗导致肺纤维化的放射性肺炎。
26.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗糖尿病性肾病。
27.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)相关的腹膜硬化。
28.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗眼部瘢痕性类天庖疮。
29.权利要求1-28中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子的一条链包含SEQID NO:127且第二条链包含SEQ ID NO:60。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述反义链包含SEQ ID NO:127，且所述有义链包含SEQ ID NO:60。
31.权利要求30的药物组合物，其中所述反义链还包含2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置1、5、6或7至少一处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含至少一个2’-5’-核糖核苷酸或2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’-端共价连接的非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的帽部分。
32.权利要求30的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’-5’-核糖核苷酸，在3’端共价连接的非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分。
33.权利要求30的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17、和19处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3C3非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含与3’-端共价连接的C3Pi非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分。
34.权利要求30的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3Pi非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分。
35.权利要求30的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在位置7、13、16、和18处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置9处的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基部分。
36.权利要求1-28中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子的一条链包含SEQID NO:98且第二条链包含SEQ ID NO:165。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述有义链包含SEQ ID NO:98，且所述反义链包含SEQ ID NO:165。
38.权利要求37的药物组合物，其中所述有义链还包含在3’端处或附近的位置的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的帽部分；且所述反义链还包含2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7至少一处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分。
39.权利要求37的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置15、16、17、18、和19处的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3-OH 3’部分，和与5’-端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还并包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17、和19处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
40.权利要求1-28中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子的一条链包含SEQID NO:101且第二条链包含SEQ ID NO:168。
41.权利要求40的药物组合物，其中所述有义链包含SEQ ID NO:101，且所述反义链包含SEQ ID NO:168。
42.权利要求41的药物组合物，其中所述有义链还包含2’-O-甲基修饰的嘧啶核糖核苷酸、在位置9、或10的2’-5’-核糖核苷酸、与3’-端共价连接的非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的帽部分；且其中所述反义链还包含2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸、在位置5、6或7至少一处的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的非核苷酸部分。
43.权利要求41的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置4、11、13和17处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置9的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3OH非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还包含在位置1、4、8、11和15的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
44.权利要求41的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置4、11、13和17处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3OH非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还包含在位置1、4、8、13和15的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
45.权利要求41的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置2、4、11、13和17处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3OH非核苷酸部分，和与5’-端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还包含在位置1、4、8、11和15的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’-5’-核糖核苷酸，和与3’-端共价连接的C3Pi-C3OH部分。
46.权利要求1-45任一项的药物组合物在制备用于在对象中治疗或预防hsp47相关疾病的药物中的用途。
47.权利要求46的用途，其中所述疾病选自肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胰腺炎、胰脏纤维化、胰腺癌、声带瘢痕、声带粘膜纤维化、和喉部纤维化。
48.权利要求46的用途，其中所述疾病是肝炎或肝纤维化。
49.权利要求46的用途，其中所述疾病与慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染相关。
50.权利要求46的用途，其中所述药物是用于胃肠外施用。
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