ES2586593T3 - Liposomas de retinoide para potenciar la modulación de la expresión de hsp47 - Google Patents

Liposomas de retinoide para potenciar la modulación de la expresión de hsp47 Download PDF

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Kenjiro Minomi
Yoshiro Niitsu
Joseph E. Payne
Victor Knopov
Richard P. WITTE
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Loren A. PERELMAN
Yasunobu Tanaka
Elena Feinstein
Sharon Avkin-Nahum
Hagar Kalinski
Igor Mett
Wenbin Ying
Yun Liu
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Abstract

Composición farmacéutica que comprende un portador de fármaco y una molécula de ácido nucleico bicatenario, en la que el portador de fármaco comprende una molécula de retinoide conjugada con molécula de polietilenglicol, y en la que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende la estructura: 5' (N)x - Z 3' (cadena antisentido) 3' Z'-(N')y -z" 5' (cadena sentido) en la que cada uno de N y N' es un nucleótido que puede no estar modificado o estar modificado, o un resto no convencional; en la que cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleótido en el que cada N o N' consecutivo está unido al siguiente N o N' mediante un enlace covalente; en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente incluye independientemente 1-5 nucleótidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que está presente; en la que z" puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal de (N')y; en la que cada uno de x e y es independientemente un número entero de entre 18 y 40; en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con respecto a la secuencia de (N)x; en la que el resto no convencional se selecciona del grupo que consiste en un resto abásico, un resto abásico invertido, un resto hidrocarbonado y derivados de los mismos, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un nucleótido especular, un análogo de nucleótido sin formación de pares de bases y un nucleótido unido a un nucleótido adyacente mediante un enlace de fosfato internucleotídico 2'-5'; ácidos nucleicos con unión en puente, nucleótidos con uniones modificadas y nucleótidos con bases modificadas; y en la que (N)x incluye una secuencia antisentido con respecto a la secuencia codificante de ARNm para hsp47 humana mostrada a modo de ejemplo mediante SEQ ID NO: 1.

Description

Liposomas de retinoide para potenciar la modulación de la expresión de hsp47
5 Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud proviSional estadounidense n.o 61/497.447 presentada el 15 de junio de 2011 y la solicitud provisional estadounidense n.o 61/494.832 presentada el8 de junio de 2011.
Campo técnico
En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas Que comprenden liposomas de retinoide para potenciar la modulación de la expresión de hsp47 mediante ARNip.
15 Antecedentes
la fibrosis del hígado puede estar producida por células estrelladas hepáticas (HSC) activadas, que dan como resultado que se deposite una pluralidad de tipos de moléculas de colágeno y fibronectina sobre el tejido intersticial. Esto puede conducir a cirrosis hepática, insuficiencia hepática y/o carcinoma hepatocelular. Además, se desarrolla
pancreatitis crónica como resultado de fibrosis pancreática mediante el mismo mecanismo que para la fibrosis hepática (Madro, et al., 2004; Med Sci Monil. 10:RA166-70; Jaster, 2004, Mol Cancer. 6:26). Además, están presentes células estrelladas en trastornos de las cuerdas vocales y la laringe tales como cicatrización de las cuerdas vocal. fibrosis de la mucosa de las cuerdas vocales y fibrosis de la laringe. Para prevenir o tratar la fibrosis en estos órganos y en otras partes en el organismo, existe el deseo de desarrollar un portador de fármaco y un kit de
25 portador de fármaco.
las células estrelladas son uno de los candidatos de diana importantes para tratar la fibrosis (Fallowfield et al., 2004, Expert Opin Ther Targets. 8:423-35; Pinzani, el al., 2004, Dig liver Dis.36:231-42). Durante la fibrosis, las células estrelladas se activan mediante citocinas a partir de células cercanas para producir muchos factores que provocan
fibrosis hepática. las células estrelladas almacenan vitamina A y pertenecen a la familia de los miofibroblastos.
los métodos terapéuticos para prevenir o tratar la fibrosis intentan controlar el metabolismo del colágeno, la estimulación del sistema de degradación del colágeno y la inhibición de la activación de células estrelladas. Sin embargo, en todos estos casos, la baja especificidad de acción y/o la baja especificidad de órgano, la eficacia
35 limitada y los efectos secundarios adversos crean problemas.
la inhibición de la síntesis de proteinas de colágeno no se ha establecido como método terapéutico. la potencia de moléculas que seleccionan como diana la producción de colágeno es limitada debido a la posibilidad de provocar efectos secundarios. Inhibir la producción de colágeno directamente proporciona otro método terapéutico para prevenir o tratar la fibrosis. Un método de este tipo requiere controlar uno o más de los diversos tipos de colágeno tipos I a IV. Un método para lograr esto puede ser a través de la proteina de choque térmico 47 (HSP47), una chaperona molecular especifica del colágeno que es esencial para el transporte intracelular y la maduración molecular necesaria para diversos tipos de colágeno. Por tanto, si la función de HSP47 puede controlarse específicamente en células estrelladas, existe una posibilidad de inhibir la fibrosis hepática.
El documento EPl842557 se refiere a un portador de fármaco y a un kit de portador de fármaco para inhibir la fibrosis.
Sato et al. (Nature Biotechnology: volumen 26, numero 4: abril de 2008: páginas 431 -442) se refiere a resolver la
cirrosis hepática usando liposomas acoplados a vitamina A para suministrar ARNip contra una chaperona especifica del colágeno.
Sumario
55 la presente invención se define, entre otras cosas, por los siguientes puntos:
1. Composición farmacéutica que comprende un portador de fármaco y una molécula de ácido nucleico bicatenario, en la que el portador de fármaco comprende una molécula de retinoide conjugada con molécula de polietilenglicol, y en la que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende la estructura:
5' (N),· Z 3' (cadena antisentido)
3' Z'·(N'), ·z· 5' (cadena sentido)
65 en la que cada uno de N y N' es un nucleótido que puede no estar modificado o estar modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de (Nh y (N'}y es un oligonucleólido en el que cada N o N' consecutivo está unido al siguiente N
o N' mediante un enlace covalente;
5 en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente incluye independientemente 1-5 nucle6tidos o restos distintos de nucle6tidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalentemente al extremo 3'·terminal de la cadena en la que esta presente;
en la que z puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupación de centros reactivos
10 unido covalentemente al extremo 5'-terminal de (N '}y;
en la Que cada uno de x e y es independientemente un número entero de entre 18 y 40;
en la que la secuencia de (N')y liene complementariedad con respecto a la secuencia de (N).;
15
en la que el resto no convencional se selecciona del grupo que consiste en un resto abásico, un resto abásico invertido, un resto hidrocarbonado y derivados de los mismos, un desoxirribonucleólido, un desoxirribonucleótido modificado, un nucle6tido especular, un análogo de nucleótido sin formación de pares de bases y un nucleótido unido a un nucle6tido adyacente mediante un enlace de fosfato internucleolídico 2'·5'; ácidos nucleicos con unión en
20 puente, nucleótidos con uniones modificadas y nucleótidos con bases modificadas; y
en la que (N). incluye una secuencia antisentido con respecto a la secuencia codificante de ARNm para hsp47 humana mostrada a modo de ejemplo mediante SEO ID NO: 1.
25 2. Composición farmacéutica segun el punto 1, en la que el portador de fármaco comprende una cantidad especifica de células estrelladas de la molécula de retinoide conjugada con molécula de polietilenglicol.
3. Composición farmacéutica segun el punto 1 o 2, en la que la molécula de écido nudeico bicalenario oomprende secuencias oligonucleotidicas seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias SEO ID NO: 60 y 127
30 (SERPINH1_2), SEO ID NO: 98 y 165 (SERPINH1_ 45a) y SEO ID NO: 101 y 168 (SERPINH1_51).
4. Composición farmacéutica segun uno cualquiera de los puntos 1·3, en la que el retinoide consiste en una molécula seleccionada del grupo que consiste en vitamina A, ácido retinoico, relinal, Iretinoína, adapaleno, palmilato de retinol y fenreti nida (4-HPR).
35
5.
Composición farmacéutica segun uno cualquiera de los puntos 1--4, en la que la molécula de retinoide conjugada 0011 molécula de polietilengliool es diVA·PEG·diVA.
6.
Composición farmacéutica segun uno cualquiera de los puntos 1·5, en la que el retinoide está al menos
parcialmente expuesto en el exterior del portador de fármaco antes de que el portador de fármaco alcance la célula estrellada.
7. Composición farmacéutica segun uno cualquiera de los puntos 1·6, en la que el portador de fármaco está en una forma seleccionada del grupo que consiste en una micela polimérica, un liposoma, una emulsión, una microesfera y
45 una nanoesfera.
8. Composición farmacéutica segun el punto 7, en la que el portad::>r de fármaco está en una forma de una vesícula lipídica.
50 9. Composición farmacéutica segun el punto 8, en la que las moléculas lipídicas comprenden HEDC de la siguiente estructura:
imagen1
55 y opcionalmente comprenden S104 de la siguiente estructura:
imagen1
10.
Composición farmacéutica según cualquiera de los puntos 1-9, en la que una cadena de la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende SEO ID NO: 127 y la segunda cadena comprende SEO ID NO: 60.
11.
Composición farmacéutica según el punlo 10, en la que la cadena antisentido comprende SEQ ID NO: 127 y la cadena sentido comprende SEO ID NO: 60.
12.
Composición farmacéutica según el punto 11, en la que la cadena anlisentido comprende además
5
10 ribonucleótidos modificados con 2'-O-melilo; un 2'-S'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones 1, 5, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covaenlemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además al menos un 2'-S'-ribonudeótido o ribonucleótido modificado con 2'-Q-metilo; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo S'-terminal.
15
13_ Composición farmacéutica según el punto 11, en la Que la cadena anlisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleólido unido covalenlemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además cinco 2'-S'-ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 Y
20 19; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal.
14, Composición farmacéutica según el punto 11, en la Que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; Y un resto distinto de
25 nucleótido C3C3 unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además un resto distinto de nucleótido C3Pi unido covaentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal.
15. ComJJ05ición farmacéutiGa 5egún el punto 11, en la que la Gauena anlisentido comprende además
30 ribonucleótidos modificados con 2' -O-metilo en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2' -S'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además cinco 2'-S'-ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto distinto de nucJeótido C3Pi unido CQvalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo 5·-terminal.
16, Composición farmacéutica según el punto 11, en la que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2' -O-metilo en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2' -S'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además rioonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 7, 13, 16 Y
40 18; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C3 unido covalentemente al extremo 3'terminal; y un resto abásico invertido unido co'Jalentemente al extremo S'-terminal.
17.
Composición farmacéutica según cualquiera de los puntos 1-9, en la que una cadena de la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende SEO ID NO: 98 y la segunda cadena comprende SEO ID NO: 165,
18.
Composición farmacéutica se9ún el punto 17, en la que la cadena sentido comprende SEO ID NO: 98 y la cadena antisentido comprende SEO ID NO: 165_
19.
Composición farmacéutica según el punto 18, en la que la cadena sentido comprende además 2'-5'
50 ribonucleótidos en las posiciones en o cerca del extremo 3'-terminal; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al
extremo S'-terminal; y la cadena antisentido comprende además un ribonucleótido modificado con 2'-O-metilo; un 2'S'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones S, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminaL
55
20. Composición farmacéutica según el punto 18, en la que la cadena sentido comprende además 2'-S'ribonucleótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un reslo C3-0H 3' unido covalentemenle at extremo 3'terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abasico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisenlido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11,
13, 15, 17 Y 19; un 2'·5'·ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'· terminal.
21, Composición farmacéutica según cualquiera de los puntos 1-9, en la Que una cadena de la molécula de ácido
5 nucleico bicatenario comprende SEO ID NO: 101 y la segunda cadena comprende SEO ID NO: 168.
22. Composición farmacéutica según el punto 21, en la que la cadena sentido comprende SEQ ID NO: 101 y la cadena antisenlido comprende SEO ID NO: 168.
10 23. Composición farmacéutica según el punto 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos de pirimidina modificados con 2'-Q-metilo; un 2'-S'-ribonucleólido opcional en una de la posición 9 o 10; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal; yen la que la cadena antisentido comprende además un ribonucleótido modificado con 2'-O-metilo: un 2'-5'-ribonucle6tido en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7; y un resto distinto de
nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
24. Composición farmacéutica según el punto 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico
20 invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y en la que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 1,4,8, 11 Y 15; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
25. Composición farmacéutica según el punto 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos
25 modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invenido unido covalentemente al extremo 5' -terminal; y en la que la cadena antisentido comprende además ribonucle6tidos modificados con 2'-0metilo en las posiciones 1, 4, 8, 13 Y 15; un 2'-5'-ribonUcle6tido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
26. Composición farmacéutica según el punto 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleólidos modificados con 2'-O-melilo en las posiciones 2, 4, 11, 13 Y 17; un resto distinto de nUcleólido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y en la que la cadena antisentido comprende además ribonucle6tidos modificados con 2'-0
35 metilo en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y 15; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 6; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminaL
27, Composición farmacéutica según cualquiera de los puntos 1-26, que se administra por via parenteral.
40 28. Composición farmacéutica según cualquiera de los puntos 1-27 para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad asociada con hSp47.
29. Composición farmacéutica según el punto 28 para su uso según el punto 28, en la Que la enfermedad asociada con hsp47 se selecciona del grupo que consiste en fibrosis de órganos y tejidos incluyendo hígado, pulmón, riñón,
45 páncreas, piel, corazón, cerebro, intestino, colon, cuerdas vocales, peritoneo, ojo, músculo, médula ósea, hueso, ovario, uréter y útero; y cáncer y tejidos fibróticos asociados con cáncer.
30. Composición farmacéutica según el punto 28 para su uso según el punto 28, en la que la enfermedad asociada con hsp47 se selecciona del grupo que consiste en fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis
SO peritoneal, daño hepático crónico y fibrilogénesis.
31. Composición farmacéutica según el punto 28 para su uso según el punto 28, en la que la enfermedad asociada con hsp47 se selecciona del grupo que consiste en cirrosis hepática debida a hepatitis e tras trasplante de hígado o esteatohepatitis no alcohólica (NASH); fibrosis pulmonar idiopática; neumonía por radiación que conduce a fibrosis
55 pulmonar; nefropatia diabética; esclerosis peritoneal asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD) o penfigoide cicatricial ocular.
La presente descripción se refiere a un portador de fármaco y un kit de portador de fármaco que permiten transportar específicamente un fármaco de diagnóstico y/o terapéutico a células estrelladas. El portador de fármaco en la
60 presente descripción puede seleccionarse de formas de micelas poliméricas, liposomas, emulsiones, microesferas y nanoesfera, y uniendo al mismo O incluyendo en el mismo un retinoide O conjugado de retinoide y un farmaco terapéutico que puede transportarse específicamente a HSC. Los retinoides incluyen vitamina A, retinal, ácido retinoico, vitamina A saturada, tretinoina, adapaleno o palmitato de retinol y fenretinida (4-HPR). Además, prepi:mmdo el portador de frnli:lco para induir una lIlo/cula o uni:l pluralidi:ld de molculi:l:;¡ :;¡elecciorli:lda:;¡ de
65 inhibidores de la actividad de TGF¡3tales como un receptor de TGFptipo 11 truncado y un receptor de TGFptipo 11 soluble, preparaciones de factores de crecimiento tales como HGF, promotores de la prodUCCión de MMP tales como un vector de adenovirus Que contiene gen de MMP, inhibidores de la activación celular y/o inhibidores del crecimiento incluyendo un ligando de PPARy, un antagonista de receptor de angiotensina-II lipo 1, un inhibidor de tirosina cinasa de PDGF y un inhibidor de los canales de sodio tal como amilorida, e inductores de la apoptosis tales como compuesto 861 y agliotoxina; y administrándolo, por ejemplo, por vía oral, parenleral, intravenosa o
5 intraperitoneal a un paciente que tiene riesgo de fibrosis o síntomas de fibrosis. o pacientes que tienen diversos trastornos relacionados con fibrosis tales como, por ejemplo, cirrosis hepática, insuficiencia hepática, cáncer de hígado o pancreatitis crónica, puede suprimirse la activación de células estrelladas, y de ese modo prevenir, inhibir o mejorar la fibrosis y/o los estados patológicos relacionados con fibrosis en dicho paciente. Alternativamente, o de manera adicional a lo mismo, usando el portador de fármaco que encierra en el mismo una ribozima, un ARN antisentido o un ARNip que inhibe específiCélmente HSP47 o TIMP, que es un inhibidor de MMP, puede inhibirse simultáneamente la secreción de colágenos de tipo I a IV, y como resultado puede inhibirse efiCélzmente la fibrogénesis.
Una realización de la descripción es una composición farmacéutiCél que comprende una molécula de ácido nucleico
15 bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido en la que las cadenas sentido y antisentido se seleccionan de los oligonucleótidos descritos como SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127), SERPINH1_ 4Sa (SEO ID NO: 98 y 16S) y SERPINH1_Sl (SEO ID NO: 101 y 168) en la tabla 4, a continuación, y un portador de fármaco que comprende una mezcla de una vesícula lipídica y un retinoide o un conjugado de retinoide. El retinoide puede ser uno o más de los siguientes: vitamina A, ácido retinoico, vitamina A saturada, retinal, tretinoína, adapaleno, palmitato de retinol o fenretinida. Preferiblemente, el retinoide comprende un conjugado de ácido retinoico, lo más preferiblemente un conjugado de retinoíde-PEG. La vesícula lipídica puede comprender una bícapa de moléculas lipídicas, y puede comprender además el retinoide. El retinoide está preferiblemente a una concentración del 0,2 al 20 % en peso en el portador de fármaco. La vesícula lipidica puede comprender una superfiCie interior que encapsula el interior de la vesícula lipídica, y una superficie exterior que es accesible para un medio acuoso fuera de
2S la vesícula lipídica. El retinoide puede estar asociado con la bicapa lipídica. El ácido nucleico bicatenario puede estar expuesto en la superficie exterior de la vesícula Iipídica.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico bicatenario incluye una cadena antisentido que tiene SEO ID NO: 127 y que comprende ribonucleótidos modificados con azúcar de 2'-O-metilo (2'OMe); un 2'-5'-ribonucleótido
en al menos una de las posiciones 1, S, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido 3'-terminal unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y una cadena sentido que tiene SEO ID NO: 60 y que comprende al menos un 2'·5'ribonucleótido o ribonucle6tido modificado con 2'OMe; un resto distinto de nucleólido unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal. En realizaciones preferidas, la cadena antisentido es SEO ID NO: 127 y comprende ribonucleótidos modifiCéldos con 2'OMe en las
35 posiciones 3, S, 9,11,13,15,17 Y 19; un 2'·S'·ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y la cadena sentido es SEO ID NO: 60 y comprende cinco 2··S·· ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'·terminales lS, 16, 17, 18 Y 19; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo S'·terminal. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico bicatenario incluye además un ribonucleótido modificado con 2'OOe o un 2'·5'·ríbonucleótído en la posíción 1 de la cadena antísentído. (Todas las referencias en el presente documento a posiciones de nucleótido se expresan basándose en el sentido 5'>3' del oligonucleótido para las cadenas tanto sentido como antisentido de la molécula de ácido nucleico bicatenario).
En diversas realizaciones, la cadena sentido es SEO ID NO: 98 y comprende 2'·S'·ribonucleótidos en las posiciones
45 en el extremo 3'·terminal; un resto distinto de nucleótido unido CQvalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo S'·terminal; yla cadena antisentido es SEO ID NO: 165 y comprende ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un 2'·S'·ribonucleótido en al menos una de las pOSiciones S, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'·terminal. En realizaciones preferidas, la cadena sentido es SEO ID NO: 98 y comprende 2'·S'·ribonucleótidos en las posiciones lS, 16, 17, 18 Y 19; un resto C3-0H 3' unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEO ID NO: 165 '1 comprende ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 '119; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi·C30H unido covalentemente al extremo 3'·terminal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico bicatenario comprende además un ribonucleótido modificado con 2'OMe en la posición 2.
En diversas realizaciones, la cadena sentido es SEO ID NO: 101 y comprende ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un 2'·S'·ribonucleótido opcional en una de la posición 9 o 10; un resto distinto de nucle6tido unido covolentemente 01 extremo 3'·terminol; y un resto obósico invertido unido covolentemente 01 extremo S'·terminol; y lo cadena antisentido es SEO ID NO: 168 y comprende ribonUcleótidos modificados con 2'OMe; un 2'-S'·ribonucle6tido
en al menos una de las posiCiones S, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'· terminal. En realizaciones preferidas, la cadena sentido es SEO ID NO: 101 y comprende ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 4,11, 13 Y 17; un 2'·S'·ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-termlnal; y la cadena antlsentldo es SEO 10 NO: 168 y comprende
6S ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y lS; un 2'·S'·ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi·C30H unido covalentemente al extremo 3'·tefminal. En determinadas realizaciones, la molécula de
imagen2
imagen3
una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias antisentido mostradas en la tabla 4. En determinadas realizaciones preferidas, la cadena anlisenlido y la cadena sentido se seleccionan de los pares de secuencias mostrados en la labia 4. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se
seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 y SERPINH1_88. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_ 4 (SEO ID NO: 195 y 220), SERPINH1_12 (SEO ID NO: 196 y 221), SERPINH1_30 (SEO ID NO: 199 y 224) Y SERPINH1_58 (SEO ID NO: 208 y 233).
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica incluye los pares de secuencias expuestos en SERPtNH1_ 4 (SEO ID NO: 195 y 220). En algunas realizaciones de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento incluye las cadenas antisentido y sentido de los pares de secuencias expuestos en
SERPINH1_12 (SEO ID NO: 196 y 221). Enalgunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento incluye los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_30 (SEO ID NO: 199 y 224). En algunas realizaciones de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento incluye las cadenas antisentido y sentido de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_58 (SEO ID NO: 208
Y 233).
En determinadas realizaciones, la cadena antisentido de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias antisentido mostradas en una cualquiera de las
tablas B o C.
En determinadas realizaciones preferidas, la cadena antisentido de una molécula de écido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias antisentido mostradas en la tabla 5. En determinadas realizaciones preferidas, la cadena antisentido y la cadena se seleccionan de los pares de secuencias mostrados en la tabla 5. En algunas realizaciones de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga en el presente documento incluye las cadenas antisentido y sentido seleccionadas de los pares de secuencias expuestos en
•
SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127),
•
SERPINH1_6 (SEO ID NO: 63 y 130),
•
SERPINH1_11 (SEO ID NO: 68 y 135),
•
SERP1NH1_13 (SEO ID NO: 69 y 136),
•
SERP1NH1_ 45 (SEO ID NO: 97 y 164),
•
SERPINH1_ 45a (SEO ID NO: 98 y 165),
•
SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y 168),
•
SERPINH1_52 (SEO ID NO: 102 y 169) o
•
SERPINH1_86 (SEO ID NO: 123 y 190).
•
SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127),
•
SERPINH1_6 (SEO ID NO: 63 y 130),
•
SERPINH1_ 45a (SEO ID NO: 98 y 165), Y
•
SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y 168).
En algunas realizaciones preferidas, las cadenas antisenlido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en
En i:llyuna:; realiLacione:; preferida:; de uni:l moli:culi:l de acido nudeico (por ejemplo, una moli:cula de ANip) tal como se divulga en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica incluye las cadenas antisentido y sentido seleccionadas de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127).
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido incluyen los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_6 (SEO ID NO: 63 y 130). En algunas realizaciones de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) lal como se divulga en el presente documento incluye las cadenas anlisenlido y sentido de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_11 (SEO ID NO: 68 y 135). En algunas realizaciones, las
5 cadenas anlisenlido y sentido son los pares de secuencias expues:os en SERPINH1_13 (SEO ID NO: 69 y 136). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_ 45 (SEO ID NO: 97 y 164). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_ 45a (SEO 10 NO: 98 y 165). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_51 (SEO 10 NO: 101 y 168).
En determinadas realizaciones, la cadena antisentido de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se divulga como componente de una formulación farmacéutica en el presente documento incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias antisentido mostradas en una cualquiera de las tablas O o E.
15
En diversas realizaciones de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica, la cadena antisentido puede tener de 15 a 49 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud); o 17-35 nucleótidos de longitud; o
17-30 nucleótidos de longitud; o 15-25 nucleótidos de longitud; o 18-25 nucleótidos de longitud; o 18-23 nucleótidos de longitud; o 19-21 nucleótidos de longitud; o 25-30 nucleótidos de longitud; o 26-28 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente documento, la cadena antisentido puede tener 19 nucle6tidos de longitud. De manera similar. la cadena sentido de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente
25 documento puede tener de 15 a 49 nucleótidos de longitud (por ejemplo,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27,28,29, 30,31,32,33,34, 35,36,37,38, 39,40,41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud);
o 17-35 nucleótidos de longitud; o 17-30 nucleótidos de longitud; o 15-25 nucleótidos de longitud; o 18-25 nuc1eótidos de longitud; o 18-23 nucleótidos de longitud; o 19-21 nUcleótidos de longitud; o 25-30 nucleótidos de longitud; o 26-28 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones de moléculas de acido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente documento, la cadena sentido puede tener 19 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones de moléculas de ácido nucleiQ) (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente documento, la cadena antisentido y la cadena sentido pueden tener 19 nucleótidos de longitud. La región de dúplex de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente documento puede tener de 15-49 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33. 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud), 15-35 nucleótidos de longitud; o 15-30 nucleótidos de longitud; o aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud; o 17-25 nucleótidos de longitud; o 17-23 nucleólidos de longitud; o 17-21 nucleótidos de longitud; o 25-30 nucleótidos de longitud: o 25-28 nucleótidos de longitud, En diversas realizaciones de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el presente
documento, la región de dúplex puede tener 19 nucleótidos de longitud.
En determinadas realizaciones, las cadenas sentido y antisentido de un ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico ANip) tal como se proporciona en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica son cadenas polinucleotídicas separadas. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido
45 separadas forman una estructura bicatenaria a través de puentes de hidrógeno, por ejemplo, formación de pares de bases de Watson-Crick. En algunas realizaciones, las cadenas sentido y antisentido son dos cadenas separadas que están unidas covalentemente entre si. En otras realizaciones, las cadenas sentido y antisentido son parte de una única cadena polinucleotidica que tienen una región tanto sentido como antisentido; en algunas realizaciones preferidas, la cadena polinucleotídica tiene una estructura de horquilla.
En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nUcleico (por ejemplo, molécula de ANip) es una molécula de ácido nucleico bicatenario (ANbc) que es simétrica con respecto a las proyecciones, y tiene un extremo romo en amoos extremos. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, molécula de ANip) es una molécula de ANbc que es simétrica con respecto a las proyecciones, y tiene una proyección en ambos extremos de 55 la molécula de ANbc; preferiblemente la molécula tiene proyecciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos; preferiblemente la molécula tiene proyecciones de 2 nucleótidos. En algunas realizaciones, las proyecciones son proyecciones en 5'; en realizaciones alternativas, las proyecciones son proyecciones en 3'. En determinadas
realizaciones, los nucleótidos de la proyección se modifican con modificaciones lal como se divulga en el presente
documento. En algunas realizaciones, los nucleótidos de la proyección son 2'-desoxinucle6tidos.
En determinadas realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, molécula de ANip) como componente de una formulación farmacéutica es una molécula de ANbc que es asimétrica con respecto a las proyecciones, y tiene un extremo romo en un extremo de la molécula y una proyección en el otro extremo de la molt:cula. En determinadels realizaciones, lel proyecciun tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 rlu¡;leólillos; preferiblemente la 65 proyección tiene 2 nucleótidos. En algunas realizaciones preferidas, una molécula de ANbc asimétrica tiene una proyección en 3' (por ejemplo,una proyección en 3' de dos nucleótidos) en un lado de un dúplex que se produce en
la cadena sentido; y un extremo romo en el otro lado de la molécula. En algunas realizaciones preferidas, una molécula de ANbc asimétrica tiene una proyección en 5' (por ejemplo, una proyección en 5' de dos nucleólidos) en un lado de un dúplex que se produce en la cadena sentido; y un extremo romo en el otro lado de la moléoJla. En otras realizaciones preferidas, una molécula de ANbc asimétrica tiene una proyección en 3' (por ejemplo, una
5 proyección en 3' de dos nucleótidos) en un lado de un dúplex que se produce en la cadena anlisenlido; y un extremo romo en el otro lado de la molécula. En algunas realizaciones preferidas, una molécula de ANbc asimétrica tiene una proyección en 5' (por ejemplo, una proyección en 5' de dos nucleótidos) en un lado de un dúplex que se produce en la cadena antisentido; y un extremo romo en el airo lado de la molécula. En determinadas realizaciones preferidas, las proyecciones son 2'-desoxinucle6tidos.
10
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico (por ejemplo. molécula de ANip) como componente de una formulación farmacéutica tiene una estructura de horquilla (que tiene la cadena sentido y la cadena antisenlido en un polinucleótido), con una estructura de bucle en un extremo y un extremo romo en el otro extremo. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura de horquilla. con una estructura de bucle en un
15 extremo y un extremo de proyección en el otro extremo (por ejemplo, una proyección de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nueleótidos); en determinadas realizaciones, la proyección es una proyección en 3'; en determinadas realizaciones, la proyección es una proyección en 5'; en determinadas realizaciones, la proyección eslá en la cadena senlido; en delerminadas realizaciones, la proyección esta en la cadena anlisenlido.
20 En algunas realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico se selecciona de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la labia 3.
Las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, molécula de Al\ip) divulgadas en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica pueden incluir una o más modificaciones o nucleótidos modificados lal
25 como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleica (por ejemplo, molécula de ANip) tal como se proporciona en el presente documento puede incluir un nucle6tido modificado que tiene un azúcar modificado; un nucleótido modificado que tiene una nucleobase modificada; o un nucleótido modificado que tiene un grupo fosfato modificado. De manera similar, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, molécula de ANip) tal como se proporciona en el presente documento puede incluir una estructura principal de fosfodiéster y/o puede 30 incluir un grupo fosfato terminal modificado.
Las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se proporcionan como componente de una formulación farmacéutica pueden tener uno o más nucleótidos que incluyen un reslo de azúcar modificado, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones preferidas, el resto de azúcar
35 modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'OMe, 2'-metoxietoxilo, 2'-desoxilo, 2'-f1uoro, 2'-alilo, 2'-0-(2(metilamino)-2-oxoetilo), 4'-lio, 4'-(CH2)2-0-2'-puente, 2'-ANB (el resto de ribesa de un nucle6tido de ANB está mudificado con un puente adiciunal que conecta el oxigenu en 2' y el carbono en 4') y 2'-0-(N-lIletilcarballlatu).
Las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se proporcionan como componente de
una formulación farmacéutica pueden tener una o más nucleot,ase(s) modificada(s), por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, que preferiblemente pueden ser una seleccionada del grupo que consiste en xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil-y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil-y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 5-halo-uracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y citosina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-liouracilo, O-halo, amino, tiol, tioalquil-, hidroxi-y otras adeninas y
45 guaninas sustituidas en 8. 5-trifluorometil-y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5. 7-metilguanina, y aciclonucleótidos.
Las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se proporcionan como componente de una formulación farmacéutica pueden tener una o más modificaciones en la estructura principal de fosfodiéster, por
50 ejemplo, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones preferidas, el enlace fosfodiéster se modifica sustituyendo el enlace fosfodiester con un fosforotioato, 3'-(0 S'-)desoxi-3'-(0 S'-)tio-fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenatos, 3'-(0 -S')desoxifosfinatcs, boranofosfatos, 3'-(0 S'-)desoxi-3'-(0 5'-)3minofosforamidalos, hidrogenofosfonatos, ésteres de boranoJosfato, fosforamidatcs, alquil-o aril-fosfonatos y fosfotriéster o uniones con fósforo.
55
En diversas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas (por ejemplo, moléculas de ANip) como componente de una formulación farmacéutica pueden incluir una o modificaciones en la cadena sentido pero no en la cadena antisentido. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas (por ejemplo, moléculas de ANip) incluyen una o más modificaciones en la cadena antisentido pero no en la cadena sentido. En
60 algunas realizaciones, las moléculas de ácido nudeico proporcionadas (por ejemplo, moléculas de ANip) incluyen una o más modificaciones tanto en la cadena sentido como en la cadena antisentido.
En algunas realizaciones en las Que las moléculas de ácido nucleico proporcionadas (por ejemplo, moléculas de ANlp) como componenta de una formulación farmacéutica tienoo modificaciones, la cadena sentido incluye un
65 patrón de nude6tidos modificados y no modificados alternantes, y/o la cadena antisentido incluye un patrón de nucle6tidos modificados y no modificados alternantes; en algunas versiones preferidas de tales realizaciones, la
ES 2 586 593 T3
modificación es un reslo 2'OMe. El patrón de nucleótidos modificados y no modificados alternantes puede comenzar con un nucleótido modificado en el extremo 5' o el extremo 3' de una de las cadenas; por ejemplo, el palrón de nucle6tidos modificados y no modificados alternantes puede comenzar con un nucleótido modificado en el extremo 5' (} el extremo 3' de la cadena sentido y/o el patrón de nucleótidos modificados y no modificados alternantes puede
5 comenzar con un nucleótido modificado en el extremo 5' o el extremo 3' de la cadena antisentido. Cuando lanto la cadena antisentido como la sentido incluyen un patrón de nucle6tidos modificados alternantes, el patrón de nucleótidos modificados puede estar configurado de tal manera que los nucleótidos modificados en la cadena sentido son opuestos a nucleótidos modificados opuestos en la cadena antisentido; o puede haber un deplazamiento de fase en el patrón de tal manera que los nucle6tidos modificados de la cadena sentido son opuestos a nucleótidos no modificados en la cadena antisentido y viceversa.
La moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se proporciona en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica pueden incluir de uno a tres (es decir, 1, 2 o 3) deoxinucleótidos en el extremo 3' de la cadena sentido y/o antisentido.
15
La moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se proporciona en el presente documento como componente de una formulación farmacéutica pueden incluir un grupo fosfato en el extremo 5' de la cadena sentido y/o antisentido.
En un aspecto, como componente de una formulación farmacéutica se proporcionan moléculas de ácido nucleico bicatenario que tienen la estructura (A1):
(A1) 5' (NkZ 3' (cadena antisentido)
25 3' Z'-(N'kz· 5' (cadena sentido)
en la que cada uno de N y N' es un nucleótido que puede no estar modificado o estar modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de (Nh y (N')y es un oligonucleótido en el que cada N o N' consecutivo está unido al siguiente N
o N' mediante un enlace covalente;
en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente incluye independientemente 1-5 nucle6tidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los
35 mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que esta presente;
en la que L.M puede estar presente u ausente, pero si está presente es UI1 resto de ocupaciól1 de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal de (N'}y;
en la que cada uno de x e y es independientemente un número entero de entre 18 y 40;
en la que la secuencia de (N')y tiene complemenlariedad con respecto a la secuencia de (N).; y
en la que (Nh incluye una secuencia antisentido con respecto a SE:) ID NO: 1.
En algunas realizaciones, (Nh incluye un oligonucle6tido antisentido presente en la tabla 4. En otras realizaciones, (N)x se selecciona de un otigonucle6tido antisentido presente en las labias B o C.
En algunas realizaciones, el enlace covalente que une cada N o N' consecutivo es un enlace fosfocliéster.
En algunas realizaciones, x = y, y cada uno de x e y es 19, 20, 21, 22 o 23. En diversas realizaciones, x = y =1 9.
En algunas realizaciones de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) tal como se divulga en el pre;;ente documento, la molécula de ácido nucleico bicatenario es un ARNip, ANip o un miARN.
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en
•
SERPINH1_ 4 (SEO ID ND: 195 y 220),
•
SERPINH'_'2 (SEO ID NO: 196y221),
•
SERPINH1_30 (SEO ID NO: 199 y 224), Y
•
SERPINH1_58 (SEO ID NO: 208 y 233).
En algunas realizaciones, las cadenas anlisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_ 4
(SEO ID NO: 195 y 220). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_'2 (SeO ID NO: 196 y 221). En algunas realizaciones, las cadenas anlisenlido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_30 (SEO ID NO: 199 y 224). En algunas realizaciones, las cadenas anlisenlido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_58 (SeO ID NO: 208 y 233).
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico bicatenario como componente de una formulación farmacéutica comprenden un reslo de AON o un apareamiento erróneo con la diana en la posición 1 de la cadena antisentido (extremo 5'-terminal). Una estructura de este tipo se describe en el presente documento. Según una realización, se proporcionan moléculas de ácido nucleico modificadas que tienen una estructura (A2) expuesta a continuación:
(A2)
N'-(N), -Z
3' (cadena antisentido)
3' Z'-N'-(N'), -z· 5' (cadena sentido)
en la que cada uno de N2, N Y N' es un ribonucle6tido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de (N). y (N')y es un oligonucle6tido en el que cada N o N' consecutivo está unido al N o N' adyacente mediante un enlace covalente;
en la que cada uno de x e y es independientemente un número entero de entre 17 y 39;
en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con respecto a la secuencia de (N)x y (NJx tiene complementariedad con respecto a una secuencia consecutiva en un ARN diana;
en la que NI está unido covalentemente a (N},. y presenta apareamiento erróneo con respecto al ARN diana o es un resto de ADN complementario al ARN diana;
en la que NI es un resto seleccionado del grupo que consiste en uridina natural o modificada, desoxirribouridina,
ribotimidina, desoxirribotimidina, adenosina o desoxiadenosina;
en la que z· puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupación de centros reactivos unido covalenlemente al extremo 5'-terminal de N2_ (N')y; Y
en la que cada uno de Z y Z' esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 nucleótidos consecutivos, restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalentemente al extremo 3'-lerminal de la cadena en la que está presente.
En algunas realizaciones, la secuencia de IN'), es completamente complementaria a la secuencia de (N)x. En diversas realizaciones, la secuencia de N -(N')y es complementaria a la secuencia de NI-(N}x. En algunas realizaciones, (N). comprende un fragmento antisentido que es completamente complementario a de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucle6tidos consecutivos en un ARN diana. En otras realizaciones, (N). comprende un fragmento antisentido que es sustancialmente complementario a de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucle6tidos consecutivos en un ARN diana.
En algunas realizaciones, NI y N2 forman un par de bases de Watson-Crick. En algunas realizaciones, NI y N2 forman un par de bases distinto de Watson-Crick. En algunas realizaciones, se forma un par de bases entre un ribonucleótido y un desoxirribonucle6tido.
En algunas realizaciones, x =y=18, x =y=19 o x =y=20. En realizaciones preferidas, x=y=18. Cuando x=18 en NI(N)., NI se refiere a la posición 1 y las posiciones 2-19 se incluyen en (N)18. Cuando y=18 en N2_(N')y, N2 se refiere a la posición 19 y las posiciones 1-18 se incluyen en {N'ha.
En algunas realizaciones, NI está unido covalentemente a (N). y presenta apareamiento err6neo con respecto al
ARN diana. En diversas realizaciones, NI esta unido covalentemente a (N). y es un resta de AON complementario al ARN diana.
En algunas realizaciones, una uridina en la posición 1 de la cadena anlisentido está sustituida con un NI seleccionado de adenosina, desoxiadenosina, desoxiuridina (dU), ribotimidina a desoxitimidina. En diversas realizaciones, NI se selecciona de adenosina, desoxiadenosina o desoxiuridina.
En algunas realizaciones, guanosina en la posición 1 de la cadena antisentido está sustituida con un NI
seleccionado de adenosina, desoxiadenosina, uridina, desoxiuridina, ribotimidina o desoxitimidina. En diversas
imagen1
NI se selecciona de adenosina, desoxiadenosina, uridina o desoxiuridina.
En algunas realizaciones, citidina en la posición 1 de la cadena antisentido está sustituida con un NI seleccionado de
adenosina, desoxiadenosina, uridina, desoxiuridina, ribolimidina o desoxilimidina. En diversas realizaciones, N ' se selecciona de adenosina, desoxiadenosina, uridina o desoxiuridina.
N' En algunas realizaciones, adenosina en la posición 1 de la cadena antisenlido está sustituida con un
seleccionado de desoxiadenosina, desoxiuridina, ribotimidina o desoxitimidina. En diversas realizaciones. N ' se selecciona de desoxiadenosina o desoxiuridina.
'
En algunas realizaciones, N y N2 forman un par de bases entre uridina o desoxiuridina, y adenosina o deoxiadenosjna. En otras realizaciones, N ' y N2 forman un par de bases entre desoxiuridina yadenosina.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico bicalenario como componente de una formulación farmacéutica es un ARNip, ANip o un miARN. las moléculas de ácido nucleico bicatenario tal como se proporciona en el presente documento también se denominan dúplexM.
En algunas realizaciones, (Nh incluye un oligonucleótido anlisenlido presente en la labia 5. En algunas
1
realizaciones, x=y=18 y N_(N). incluye un oligonucle6tido antisenlido presente en la tabla 4. En algunas rea'izaciones, x=y=19 o x=y=20. En determinadas realizaciones preferidas, x =y=18. En algunas realizaciones, x=oy=18 y las secuencias de N1_(N)x Y N2_(N')y se seleccionan del Rar de oligonucleótidos expuestos en la tabla 4. En
1
algunas realizaciones, x=y=18 y las secuencias de N.(N)x y N.(N'}y se seleccionan del par de oligonucleótidos
expuestos en las tablas O y E. En algunas realizaciones, las cadenas antisenlido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en
•
SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127).
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SERPINH1-6 (SEO ID NO: 63 y 130).
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SERPINH1_" (SEO ID NO: 66 y 135).
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SERPINH'_'3 (SEO ID NO: 69 y 136).
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SERPINH1_45 (SEO ID NO: 97 y 164).
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SERPINH1_ 45. (SEO ID NO: 96 y 165).
•
SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y 168),
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SERPINH1_51a (SEO ID NO: 105 y 172).
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SERPINH1_52 (SEO ID NO: 102 y 169), Y
•
SERPINH1_66 (SEO ID NO: 123 y 190).
En algunas realizaciones preferidas, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en
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SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127).
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SERPINH1_6 (SEO ID NO: 63 y 130).
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SERPINH14_45. (SEQ ID NQ: 96 y 165).
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SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y 166). Y
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SERPINH1 _51. (SEO ID NO: 105 y 172).
En algunas realizaciones preferidas, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_6 (SEO ID NO: 63 y 130). En algunas realizaciones, las cadenas anbsentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_11 (SEO ID NO: 68 y 135). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_13 (SEO ID NO 69 Y 136). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido 'f sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_ 45 (SEO ID NO: 97 y 164). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_45a (SEO ID NO: 98 y 165). En algunas realizaciones, las cadenas anbsentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y 168). En algunas realizaciones, las cadenas anlisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_51a (SEO ID NO 105 Y 172). En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_52 (SEO ID NO: 102 y 169). En algunas realizadones, las cadenas antisentido y sentido son los pares de secuencias expuestos en (SEO ID NO: 123 y 190). En algunas realizaciones preferidas, las cadenas anbsentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEa ID NO: 63 y 130), SERPINH1_ 45a (SEO ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y
168) Y SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 y 172).
I I 2
En algunas realizaciones, Ny N2 forman un par de bases de Watson·Crick. En olras realizaciones, Ny Nforman
'
un par de bases distinto de Watson-Crick. En algunas realizaciones, N es una riboadenosina modificada o una ribouridina modificada.
I 2
En algunas realizaciones, Ny N2 forman un par de bases de Wat;on-Crick. En otras realizaciones, NI y Nforman
I
un par de bases distinto de Watson-Crick. En determinadas realizaciones, Nse selecciona del grupo Que consiste en riboadenosina, riboadenosina modificada, desoxirriboadenos na, desoxirriboadenosina modificada. En otras
I
realizaciones, Nse selecciona del grupo que consiste en ribouridina, desoxirribouridina, ribouridina modificada y
desoxirribouridina modificada.
En determinadas realizaciones, la posición 1 en la cadena antisentido (extremo 5'-terminal) induye
I
desoxirribouridina (dU) o adenosina. En algunas realizaciones, Nse selecciona del grupo Que consiste en riboadenosina, riboadenosina modificada, desoxirriboadenosina, desoxirriboadenosina modificada y N:! se selecciona
del grupo Que consiste en ribouridina, desoxirribouridina, ribouridina modificada y desoxirribouridina modificada. En determinadas realizaciones, N ' se selecciona del grupo que consiste en riboadenosina y riboadenosina modificada y N2 se selecciona del grupo Que consiste en ribouridina y ribouridina modificada.
I
En determinadas realizaciones, Nse selecciona del grupo que consiste en ribouridina, desoxirribouridina,
ribouridina modificada y desoxirribouridina modificada y N2 se selecciona del grupo que consiste en riboadenosina, riboadenosina modificada, desoxirriboadenosina y desoxirriboadenosina modificada. En determinadas realizaciones,
N' se selecciona del grupo que consiste en ribouridina y desoxirribouridina y N2 se selecciona del grupo Que consiste
I 2
en riboadenosina y riboadenosina modificada. En determinadas realizaciones, Nes ribouridina y Nes
' 2
riboadenosina. En determinadas realizaciones, N es desoxirribouridina y Nes riboadenosina.
N'
En algunas realizaciones de la estructura (A2), induye ribauracilo modificado con 2'OMe o riboadenosina
2
modificada con 2'OMe. En determinadas realizaciones de la estructura (A2), Ninduye un ribonucle6tido o desoxirribonucle6tido modificado con 2'OMe.
I
En algunas realizaciones de la estructura (A2), Nincluye ribouracib modificado con 2'OMe o ribocitosina modificada con 2'OMe. En determinadas realizaciones de la estructura (A2), N! incluye un ribonude6tido modificado con 2'OMe.
En algunas realizaciones, cada uno de N y N' es un nucleótido no modificado. En algunas realizaciones, al menos uno de N o N' incluye un nucleótido modificado químicamente o un resto no convencional. En algunas realizaciones,
el resto no convencional se selecciona de un nucJeótido especular, un resto de ribosa abásico y un resto de desoxirribosa aMsico. En algunas realizaciones, el resto no convencional es un nucleótido especular, preferiblemente un resto de L-ADN. En algunas realizaciones, al menos uno de N o N' incluye un ribonucleótido mo:lificado con 2'OMe.
En algunas realizaciones, la secuencia de (N').,. es completamente complementaria a la secuencia de (N)x. En otras rea'izaciones, la secuencia de (N'N es sustancialmente complemeriaria a la secuencia de (Nk
En algunas realizaciones, (N)x incluye una secuencia antisentido que es completamente complementaria a de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucleótidos consecutivos en un ARNm diana. En otras realizaciones,
(N)x incluye un fragmento antisentido que es sustancialmente complementario a de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucleótidos consecutivos en un ARNm diana.
En algunas realizaciones de la estructura Al y la estructura A2, el compuesto tiene extremos romos, por ejemplo, en el que tanto Z como Z' están ausentes. En una realización alternativa, al menos uno de l o Z' está presente. l y l' inck.Jyen independientemente uno o mas nucle6tidos modificados ylo no modificados unidos covalentemente, inckJyendo desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, O un resto no convencional, por ejemplo, resto de desoxirribosa abasico invertido o resto de ribosa abásico; un resto distinto de nucle6tido C3, C4 o CS, un resto amine>-6, un nucle6tido especular, y similares. En algunas realizaciones, cada lila de l y Z' incluye independientemente un resto C3 o un resto amino-C6. En algunas realizaciones, Z' está ausente y Z está presente e incluye un resto dis1into de
nucleótido C3. En algunas realizaciones, Z está ausente y Z' está presente e incluye un resto distinto de nucleótido e3.
En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, cada N consiste en un libonucleótido no modificado. En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, cada N' consiste en un nucleótido no modificado. En
rea'izaciones preferidas, al menos uno de N y N' es un ribonucle6tido modificado o un resto no convencional.
En otras realizaciones, el compuesto de la estructura A1 o la estructura A2 incluye al menos un ribonucleótido modificado en el residuo de azúcar. En algunas realizaciones. el compuesto incluye una modificación en la posición 2' del residuo de azúcar. En algunas realizaciones, la modificación en la posición 2' incluye la presencia de un resto ami no, uno f1uoro, uno alcoxilo o uno alquilo. En determinadas realizaciones, la modificación en 2' incluye un resto
5 alcoxilo. En realizaciones preferidas, el resto alcoxilo es un resto metoxilo (2'OMe). En algunas realizaciones, el compuesto de ácido nueleica incluye ribonucle6tidos altemantes modificados con 2'OMe en una o ambas de las cadenas antisentido y sentido. En olras realizaciones, el compuesto incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en la cadena antisentido, (N) o Nl_(N), únicamente. En determinadas realizaciones, el ribonucleótido central de la cadena antisentido; por ejemplo, el ribonucle6tido en la posici6n 10 en una cadena de 19 meros, no está modificado.
En diversas realizaciones, el compuesto de acido nucleico incluye al menos 5 ribonucle6lidos no modificados y modificados con 2'OMe alternantes. En realizaciones adicionales, el compueslo de la estructura A1 o la estructura A2 incluye ribonucle6tidos modificados en posiciones alternantes en las Que cada ribonucle6tido en los extremos S' y 3'-tenTIinales de (N)" o N '-(N" están modificados en sus residuos de azúcar, y cada ribonucle6tido en los extremos 5' y 3'·terminales de (N') o N ·(N)y no estan modificados en sus residuos de azúcar.
15
En algunas realizaciones, la molécula bicatenaria como componente de una fOnTIulación farmacéutica incluye una o mas de las siguientes modificaciones
• N en al menos una de las posiciones 5, 6, 7, 8 o 9 de la cadena antisentido se selecciona de un 2'·S'-nucle6tido o
un nucleótido especular;
• N' en al menos una de las posiciones 9 o 10 de la cadena sentido se selecciona de un 2'-S'-nucle6tido y una pseudo-uridina; y
25 • N' en 4. 5 o 6 posiciones consecutivas en las posiciones del extremo 3'-terminal de (N')y comprende un 2'-5'nucleótido.
En algunas realizaciones, la molécula bicatenaria incluye una combinación de las siguientes modificaciones
• la cadena antisentido incluye un 2'-S'-nucle6tido o un nucleótido especular en al menos una de las posiciones 5, 6,
7.809;y
• la cadena senlido incluye al menos uno de un 2'-S'-nucle6lido y una pseudo-uridina en las posiciones 9 0 10.
35 En algunas realizaciones, la molécula bicatenaria incluye una combinación de las siguientes modificaciones
•
la cadena anlisentido incluye un 2'-5'-nucle6lido o UII nucleólido especular en al menos una de las posiciones 5, 6, 7, 809;y
•
la cadena sentido incluye 4, 5 o 6 2'-S'-nucle6tidos consecutivos en las posiciones penúltima en 3' o 3'-terminaL
En algunas realizaciones, la cadena sentido ((N)" o N'.(N),,) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 ribonucle6tidos mo:lificados con 2'OMe. En algunas realizaciones, la cadena antisentido incluye ribonucle6tidos modificados con 2'Ctv1e en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 Y 19. En otras realizaciones, la cadena antisentido incluye
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19. En otras realizaciones, la cadena antisentido incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5. 7. 9, 11, 13, 15, 17 Y 19. En algunas realizaciones, la cadena antisentido incluye una o más pirimidinas modificadas con 2'OMe. En algunas realizaciones, todos los nucle6tidos de pirimidina en la cadena antisentido estan modificados con 2'OMe. En algunas realizaciones, la cadena sentido incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe.
En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, ni la cadena sentido ni la cadena anlisentido está fosforilada en los extremos 3' y S'-terminales. En otras realizaciones, una o ambas de la cadena sentido o la cadena antisentido estan fosforiladas en los extremos 3'.
55 En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, (N}y incluye al menos un resto no convencional seleccionado de un nucle6tido especular, un 2'-5'-nucleótido y un ANT. En algunas realizaciones, el resto no convencional es un nucleótido especular. En diversas realizaciones, el nucle6tido especular se selecciona de un L· ribonucle6tido (L-ARN) y un L-desoxirribonucle6tido (L-ADN). En realizaciones preferidas, el nucle6tido especular es L-ADN, En detenTIinadas realizaciones, la cadena sentido comprende un resto no convencional en la posición 9 o 10 (desde el extremo 5'·terminal). En realizaciones preferidas, la cadena sentido incluye un resto no convencional en la posici6n 9 (desde el extremo S'-terminal). En algunas realizaciooes, la cadena sentido tiene 19 nucleótidos de longitud y comprende 4, 5 o 6 restos no convencionales consecutivos en las posiciones 15 (desde el extremo 5'lenTIinal), En algunas realizaciones, la cadena sentido incluye 4 2'·5'-ribonucle6tidos consecutivos en las posiciones 15, 16, 17 Y 18. En algunas realizaciones, la cadena sentido incluye 5 2'-5'-ribonuclaótidos consecutivos en las
65 posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19. En diversas realizaciones, la cadena sentido comprende ademas Z'. En algunas rea' izaciones, Z' incluye un resto C30H o un resto C3Pi.
ES 2 586 593 T3
En algunas realizaciones de la estroctura Al (N'}y incluye al menos un reslo de L-AON. En algunas realizaciones, x=y= 19 y (N')y, consiste en ribonucle6tidos no modificados en las posiciones 1-17 y 19 Y un L-AON en la penúltima posición en 3' (posición 18). En otras realizaciones, x=y=19 y (N')y consiste en ribonucleótidos no modificados en las
5 posiciones 1-16 y 19 Y dos l-ADN consecutivos en la penúltima posición en 3' (posidones 17 y 18). En diversas realizaciones , el resto no convencional es un nucleótido unido a un nucle6tido adyacente mediante una unión fosfato internucleotídica 2'·5'. Segun diversas realizaciones, (N'}y incluye 2, 3, 4, 5 o 6 ribonucleótidos consecutivos en el extremo 3'-terminal unidos mediante enlaces internucleotídicos 2'-5'. En una realización, cuatro nucleótidos consecutivos en el extremo 3'-terminal de (N'}y están unidos mediante tres enlaces fosfodiéster 2'-5', en los que uno
o más de los 2'-5' nucleótidos que forman los enlaces fosfodiéster 2'-5' incluye además una modificación de azúcar con 3'-O-metilo (3'OMe). Preferiblemente, el nucle6tido 3'-terminal de (N')y incluye una modificación con 2'OMe. En determinadas realizaciones, x=y=19 y (N')y incluye dos o más nucleótidos consecutivos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19 incluyen un nucle6tido unido a un nucleótido adyacente mediante un enlace internucleotidico 2'-5' (2'-5' nucle6tido). En diversas realizaciones, el nucle6tido que forma el enlace intemucleotídico 2'-5' incluye un nucleótido
15 de 3'-desoxirribasa o un nucle6tido de 3'-metoxilo (3' H o 3'OMe en lugar de 3' OH). En algunas realizaciones, x=y=19 y (N')y incluye 2'-5' nucle6tidos en las posiCiones 15, 16 Y 17 de tal manera que nucle6tidos adyacentes están unidos mediante un enlace internucleotídico 2'-5' entre las posiciones 15-16, 16-17 Y 17-18; o en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19 de tal manera que nucleótidos adyacentes están unidos mediante un enlace internucleotídico 2'-5' entre las posiciones 15-16, 16-17, 17-18 Y 16-19 Y un 3'OH está disponible en el nucleótido 3'terminal o en las posiciones 16, 17 Y 18 de tal manera que nucleótidos adyacentes están unidos mediante un enlace internucleotidico 2'-5' entre las posiciones 16-17, 17-18 Y 18-19. En algunas realizaciones, x=y=19 y (N')y incluye 2'5'-nucleótidos en las posiciones 16 y 17 o en las posiciones 17 y 18 o en las posiciones 15 y 17 de tal manera que nucle6tidos adyacentes están unidos mediante un enlace internucleotldico 2'-5' entre las posiciones 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 17-18 y 18-19 o entre las posiciones 15-16 y 17-18, respectivamente. En otras realizaciones, los
25 ribonucleótidos de pirimidina (rU, rC) en (N·)y están sustituidos con nucleótidos unidos al nucleótido adyacente mediante un enlace intemucleotídico 2'-5'. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1 4, SERPINHl 12, SERPINHl 18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 o SERPINH1_88, Y x=y=19 Y (N')y romprende cinco nucle6tidos consecutivos en el extremo 3'-terminal unidos mediante cuatro uniones 2'-5', especificamente las uniones entre los nucleótidos en la poSición 15-16, 16-17, 17-18 Y 18-19.
En algunas realizaciones, las uniones incluyen enlaces fosfodiéster. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_SB o SERPINH1_88 Y x=y=19 Y (N')y comprende cinco nucleótidos
35 consecutivos en el extremo 3'-terminal unidos mediante cuatro uniones 2'-5' y opcionalmente incluye ademas Z' y z' seleccionados independientemente de un resto abásico invertido y un grupo de ocupaCión de centros reactivOS alquilo C3 [C3; rnono(dillidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol]. El glupo de ocupación de centros reactivos alquilo C3 está unido covalentemente al nucleótido 3' o 5' terminal. En algunas realizaciones, el grupo de ocupación de centros rea:livos C3 3'-terminal comprende además un 3'-fosfato. En algunas realizaciones, el grupo de ocupación de centros reactivos C3 3'-terminal comprende además un grupo hidroxilo 3'-terminal.
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido como componentes de una formulación farmacéutica se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1 4, SERPINHl 12, SERPINHl 18, SERPINH1_30, SERPINH1_56 o SERPINH 1_00 y x=y=19 Y (N )y incluye un L-ADN en la-posición 10; Y (N')y
45 opcionalmente incluye además Z' y z' seleccionados independientemente de un resto abésico invertido y un grupo de ocupación de centros reactivos alquilo C3 [C3; mono(dihidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol].
En algunas realizaciones, (N')y incluye un fosfato 3'-terminal. En algunas realizaciones, (N')y incluye un hidroxilo 3'terminal.
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido como componentes de una formulación farmacéutica se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 o SERPINH1_88 y x=y=19 Y (N)x incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19. En algunas realizaciones, las cadenas anlisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 y SERPINH1_88 y x=y=19 y (N) incllye pirimidinas modificadas con 2'OMe. En algunas realizaoones, todas las pirimidinas en (N)x incluyen la modificación con 2'OMe.
En algunas realizaciones, las cadenas anljsentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINHl 2, SERPINH1 6; SERPINH1 11, SERPINH1 13, SERPINH1 45, SERPINH1 45a, SERPINH1 51,
SERPIN51a. SERPINH1_52 o SERPINH1:86 y x=y=18 y NTes un reslo de riboadenosina.
En algunas realizaciones, las cadenas anlisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en 65 SERPINH1 2, SERPINH1 6, SERPINH1 11, SERPINH1 13 SERPINH1 45, SERPINH1 45a, SERPINH1 51, SERPIN51a. SERPINH1_52 o SERPINH1-="86 y x=y=18, y N2.(N')y incluye-cinco nucle6lidos consecutivos en el
extremo 3'·terminal unidos mediante cuatro uniones 2'-5', específicamente las uniones entre los nucleótidos en la posición 15-16, 16-17, 17-18 Y 18-19. En algunas realizaciones, las uniones incluyen enlaces fosfodiéster.
En algunas realizaciones, las cadenas anlisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERP1NH1_1 1. SERPINH1_13, SERPINH1_ 45, SERPINH1_45a. SERPINH1_51.
SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_66 y x=y=18 y N2'iN')y incluye cinco nucle6tidos consecutivos en el extremo 3'·terminal unidos mediante cuatro uniones 2'·5' y opcionalmente incluye además Z' y z' seleccionados independientemente de un resto abásico invertido y un grupo de ocupación de centros reactivos alquilo C3 [C3; mono(dihidrogenofosfato) de 1 ,3-propanodiol)
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de tos pares de secuencias expuestos en SERPINH1 2, SERPINH1 6, SERPlNH1 11, SERPINH1 13, SERPINH1 45, SERPINH1 45a, SERPINH1 51, SERPINH()la, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x=y=18 y N2-(N'}y incluye un L-AON enla posición 18; y (N')y opcionalmente incluye además Z' y z' seleccionados independientemente de un resto abásico invertido y un grupo
de ocupación de centros reactivos alquilo C3 [C3; mono(dihidrogenofosfato) de 1,3.propanodiol).
En algunas realizaciones, N2.(N'}y comprende un fosfato 3'·terminal. En algunas realizaciones, N2.(N'}y comprende un hidroxilo 3'·terminal.
En algunas realizaciones, las cadenas antisenlido y sentido como componentes de una formulación farmacéutica se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH 1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_1 ', SERPINH1_13, SERPINH1_ 45, SERPINH1_ 45a, SERPINH1_51, SERPINHl _51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x=y=18 y NI. (N)x incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones imagen1 1, 3, 5, 7, 9, 1" 13, 15, 17, 19 o en las posiciones 1, 3, 5, 9, 1"
imagen1 13, 15, 17, 19, oen las posiciones 3, 5, 9. 1', 13, 15, 17, oen las posiciones 2,4, 6, 8, 11,
13, 15, 17, 19, En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de seruencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6. SERPINH1_1 1. SERPINH1_13, SERPINH1_ 45. SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 o SERPINH1_·96 y x=y=18 y N1.(N)x incluye ribonucle6tidos moclificados con 2'OMe en las posiciones 11, 13, 15, 17 Y 19. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINHl 2, SERPINH1 6, SERPINH1 11,
SERPINH1 13, SERPINH1 45, SERPINH1 45a, SERPINH1 51 , SERPINH1 51a, SERPINH1 52 o SERPINH'-86 Y x=y=18 y Ñl·(N). incluye ribonucleótidos mimagen1 odificados con 2'OMe en las posiCiones 1, 3, 5, 7, 9. 11, 13, 15, 17, '-9 o en las posiciones 3, 5, 7, 9, 1"
13, 15, 17, 19. En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_'1, SERPINH1_13, SERPINH 1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 )' x=y=18 Y N1_(N). incluye
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 1" 13, 15, 17, 19.
En algunas reali.-:aciones, las cadenas antisenlido y sentido corno componentes de una formulación farmacéutica se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_", SERPINH1_13, SERPINH1_ 45, SERPINH1_ 45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 Y x=y=18 Y NI.
(N)x incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe. En algunas realizaciones, todas las pirimidinas en (N)x inCluyen la modificación con 2'OMe. En algunas realizaciones, la cadena antisentido incluye además un L·ADN o un 2'·5' nude6tido en la posición 5, 6 o 7. En otras realizaciones, la cadena antisentido incluye además un ribonucleótido Que genera una unión internucleotídica 2'·5' entre los ribonucleótidos en las posiciones 5-6 o 6-7.
En realizaciones adicionales, N1.(N). incluye además Z en la que Z incluye una proyección distinta de nucleótido. En algunas realizaciones, la proyección distinta de nucleótido es C3-C3 [mono(dihidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol)2.
En algunas realizaciones de la estructura A2, (N)y incluye al menos un resto de L-ADN. En algunas realizaciones, x=y=18 y (N')y consiste en ribonucle6tidos no modificados en las posiciones 1-16 y 18 Y un L-ADN en la penúltima
posici6n en 3' (posici6n 17). En otras realizaciones, x=y= 18 y (N 'h' consiste en ribonucle6tidos no modificados en la posición 1-15 y 18 Y dos L-ADN consecutivos en la penúltima posición en 3' (posiciones 16 y 17). En diversas realizaciones, el resto no convencional es un nucleótido unido a un nucleótido adyacente mediante una unión fosfato internucleotidica 2'-5'. Según diversas realizaciones, (N'}y incluye 2, 3, 4, 5 o 6 ribonudeótidos consecutivos en el extremo 3'-terminal unidos mediante uniones internucleotídicas 2'-5'. En una realizaci6n, cuatro nucle6tidos
consecutivos en el extremo 3'-terminal de (N'}y están unidos mediante tres enlaces fosfodiéster 2'-5', en los que uno
o más de los 2'-5' nucleótidos que forman los enlaces fosfod iéster 2'-5' incluye además una modificaci6n de azúcar con 3'-O-metilo (3'OMe). Preferiblemente, el nucle6tido 3'-terminal de (N')y incluye una modificación con 2'OMe. En determinadas realizaciones, x=y=18 y en (N'}y dos o más nucleótidos consecutivos en las posiciones 14, 15, 16, 17 Y 18 incluyen un nucleótido unido a un nucleótido adyacente mediante un enlace internucleotidico 2'-5'. En diversas realizaciones, el nucle6tido que forma el enlace internucleotidico 2'-5' incluye un nucleótido de 3'-desoxirribosa o un nucle6tido de 3'-metodo. En algunas realizaciones, x=y=18 y (N')y incluye nucle6tidos unidos al nucleótido adyacente mediante un enlace intemucleolidico 2'-5' entre las posiciones 15-16. 16·17 Y 17-18 o entre las posiciones 16-17 y 17-18. En algunas realizaciones, x=y=18 y (N')y incluye nucle6tidos unidos al nucleótido adyacente mediante un enlace internucleotidico 2'-5' entre las posiciones 14-15, 15-16,16-17 Y 17-18 o entre las
posiciones 15-16. 16-17 Y 17-18 o entre las posiciones 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 17-18 o entre las posiciones 15-16 y 17-18. En otras realizaciones, los ribonucleótidos de pirimidina (rU, rC) en (N ')y están sustituidos
con nudeótidos unidos al nude6tido adyacente mediante un enlace internucleolidico 2'-5'.
En algunas realizaciones, las cadenas antisentido y sentido se seleccionan de los pares de oligonucle6tidos expuestos en la tabla 5 e identificados en el presente documento como SERPINH1_2 (SEO ID NO: 60 y 127),
SERPINH1_6 (SEO ID NO: 63 y 130), SERPINH1_ 45a (SEO ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEO ID NO: 101 y 168), Y SERPINH1_51a (SEO ID NO: 105 y 172).
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico bicatenario como componente de una formulación farmacéutica incluye la cadena antisentido expuesta en SEa ID NO: 127 y la cadena sentido expuesta en SEa ID NO: 60; identificada en el presente documento como SERPINH1_2. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nudeico bicatenario tiene la estructura
5' UAUAGCACCCAUGUGUCUC -z 3' (anlisenlido SEQ ID NO: 127)
1111111111111111111
3' Z'-AUAUCGUGGGUACACAGAG z" 51 (senlidoSEQ ID NO:60)
-
en la que cada "1" representa formación de pares de bases entre los ribonucleótidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleótido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente 1-5 nucle6tidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que está presente; y
en la que z» puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupaCión de cenuos reactivos
unido covalentemente al extremo 5'-terminal de N2_(N')y.
En algunas realizaciones, se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena antisentido (SEO ID NO: 127) incluye una o mas pirimidinas y/o purinas modificadas con 2'OMe, un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 5, 6, 7 u 8, y una proyección de nucleótido o distinta de nucleótido 3'·terminal. En algunas realizaciones, la
cadena sentido (SEO ID NO: 60) incluye 4 o 5 2'-5'-nucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminal o penúltima en 3', un nucleótido o resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemenle al extremo 5'·terminal. En otras realizaciones, la cadena sentido (SEO ID NO: 60) incluye una o más 2'OMe-pirimidina, un nucleótido o resto distinto de nucleótido unido covéllenlcmenle 01 extremo 3'-terminéll y un resto de ocupélción de centros reoctivos unido covéllenlemcnte 01
extremo 5'-terminal.
En algunas realizaciones, se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena antisentido (SEO ID NO: 127) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17 Y 19; un 2'· 5'-ribonude6tido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al exlremo 3'-terminal; y la cadena
sentido (SEO ID NO: 60) se selecciona de una cadena sentido que incluye
•
2'-5'-ribonucle6tidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; una proyección distinta de nudeótido de C30H 3'terminal; y JO resto de desoxirribonucle6tido abásico in .... ertido JOido co .... alenlemenle al extremo 5'-terminal; o
•
2'·5'·ribonude6lidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un fosfato 3'-terminal; y un reslo de desoxirribonucle6tido abásioo invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; o
•
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 5, 7, 13 Y 16; un 2'·5'·ribonucle6tido en la posición 18; un resto C3-OH unido co .... alentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico in .... ertido
unido oo .... alentemente al extremo 5'-terminal; o
•
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 7, 13, 16 Y 18; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; o
•
2'-5'-ribonucleótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto C3-Pi unido oovalentemente al extremo 3'terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido co .... alentemente al extremo 5'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de á::ido nucleico bicatenario en la que la cadena
anbsentido (SEO ID NO: 127) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido co .... alentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 60) incluye 2'-5'-ribonucle6Iidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; una proyección de C3 3'·terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásioo invertido unido oovalentemenle al extremo 5'·terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bica!enario en la que la cadena anbsentido (SEO ID NO: 127) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; un 2'·5'·ribonucleótido en la posición 7; y una proyección de C3Pi-C30H 3'·terminal; y la cadena sentido (SEO 10
NO: 60) incluye 2'-5'-ribonudeólidos en las posiciones 15, 16, 17. 18 Y 19: un fosfato 3'-terminal: y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena anUsentido (SEO ID NO: 127) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11. 15, 17,
19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7 y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 60) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones S, 7, 13 Y 16: un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 18; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abasico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena antsentido (SEO ID NO: 127) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiCiones 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7 y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 60) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 7, 13,16 Y 18; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto de
desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena antisentido (SEO 10 NO: 127) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11,15, 17, 19; un 2'·5'·ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi·C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la
cadena sentido (SEO 10 NO: 60) incluye 2'-5'-ribonucle6tidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto C3-Pi unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemenle al extremo S'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporcioné una molécula de ácido nucleico bicatenario en la
que la cadena antisentido (SEO ID NO: 127) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19; Y una proyección de C3-C3 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO 10 NO: 60) induye ribonudeótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 7, 9, 13, 16 Y 18; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporcioné una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO 10 NO: 60) incluye 2'·5'-ribonucle6tidos en las posiciones 15, 16, 17. 18 Y 19; un fosfato 3'-temlinal; y un resto de desoxirribonucl9Óliuo abásico invellido unidu covalentemente al extremo S'-Ienninal; y la cadena antisentido (SEO 10 NO: 127) incluye una cadena antisentido seleccionada de uno de
•
ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, S, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; Y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
•
ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 6, 8, 10, 12. 14, 17, 18; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bic<;tenario como componente de una formulaci6n farmacéutica que incluye la cadena antisentido expuesta en SEO ID NO: 130 y la cadena sentido expuesta en SEO ID NO: 63; identificada en el presente documento como SERPINH1_6. En algunas realizaciones el dúplex comprende la estructura
5' UACUCGUCUCGCAUCUUGU -Z J' (anlisenlido SEQ ID NO: 130)
1111111111111111111
-z lO 5'
3' Z' -.AUGAGCAGAGCGUAGAACA (sen1idoSEQ ID NO:63)
en la que cada "1" representa formación de pares de bases entre los ribonucle6tidos;
en la que cada uno de A, C. G. U es independientemente un ribonucleótido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente 1-5 nucle6tidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los
mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que está presente; y
en la que z puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal de N2_(N')y.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 63) incluye una o más pirimidinas modificadas con 2'OMe; una proyección de nucleótido o distinta de nucleótido 3'-terminal; y resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al
5 extremo 5'-terminal. En algunas realizaciones, la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) incluye una o más pirimidinas modificadas con 2'OMe; un nucleótido o resto distinto de nucleótido unido covalenlemenle al extremo 3'terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo S'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la
que la cadena sentido (SEO 10 NO: 63) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 14 Y 18; un resto C30H o C3Pi unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) se selecciona de una cadena antisentido que incluye
•
ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
•
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posici6n 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
•
ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posici6n 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
•
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un dU en la posición 1; un 2'-5'
25 ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3' -terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO 10 NO: 63) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 14 Y 18; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido
unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de oligonucleótido en dúplex en la
35 que la cadena sentido (SEO ID NO: 63) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18 Y opcionalmente en la posición 2; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'ribonucleólido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de oligonuCle6tidO en dúplex en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 63) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5' -terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) se selecciona de una
45 cadena antisentido que incluye
•
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C3Pi o C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
•
ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C3Pi o C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 63) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18; un resto C3-0H unido
55 covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) incluye ribonucleótidos roodificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido
covalentemente al extremo 3'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 63) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 130) incluye ribonucleótidos roodificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-rioonucleótido en la poi(;ión 7; y uni:l proyección de C3Pi-C30H 3'
65 terminal.
imagen4
en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente 1-5 nucleótidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalenlemente al extremo 3'·terminal de la cadena en la que está presente; y
5
en la Que z" puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemenle al extremo S'·terminal de Nl.(N')y.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la
10 que la cadena sentido (SEO ID NO:101) incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe, opcionalmente un 2'-5'ribonucleótido en la posición 9 o 10; un nucleótido o resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'terminal; y opcionalmente un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo S'-terminaL En algunas realizaciones, la cadena antisentido (SEO ID NO:168) incluye pirimidinas y/o purinas modificadas con 2'OMe; un 2'-S' nucleótido en la posición S, 6, 7 u 8; y un nucleótido o resto distinto de nucleótido unido
lS covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO:101) incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe en las posiciones 4,11, 13 Y 17; opcionalmente un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 9 o 10; un resto distinto de nucleótido C3Pi o C30H unido
20 covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO:168) se selecciona de una cadena antisentido que incluye
a) ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 8 Y 1S; un 2'·S'-ribonucleótido en la posición 6 o 7; y una proyección de C3Pi-C30H unida covalenlemente al extremo 3'-terminal; o
25 b) ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1,4,8,13 Y lS; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 6 o 7; y una proyección de C3Pi·C30H unida covalentemente al extremo 3'-terminal; o
c) ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 4, S, 11 Y 1S; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 6;
Y una proyección de C3Pi-C30H unida covalentemente al extremo 3'-terminal; o
d) ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1,3,8, 12, 13 Y 1S; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi·C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminaL
3S En el presente documento se proporciona una molécula de écido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEOID NO:101) incluye ribonucleólidos modificados con 2'OMe en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; opcionalmente un 2'-5'·ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C3-0H unido covalentemente al extremo 3'· terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO:168) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 8 Y 1S; un
40 2'-5'-ribonucleólido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminaL
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO:101) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las pOSiciones 4, 11, 13 Y 17; opcionalmente un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C3-0H unido covalentemente al extremo 3'·
4S terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO:168) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1,4,8, 13 Y 1S; un 2'-S'-ribonucle6tido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido
SO (SEO ID NO:101) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un 2'-S'ribonucleótido en la posiCión 9; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisenlido (SEO ID NO:168) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y lS: un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminaL
55 En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO:101) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 4, 11, 13; y 17; un 2'-S'ribonucleólido en la posición 9; un resto distinlo de nucleólido C30H unido covalentemenle al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena
60 antisentido (SEO ID NO:168) incluye ribonudeótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 8, 12, 13 Y lS; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico bicatenario es un componente de una formulación farmact:utica 4ue incluye la cadena an!i:;enlido expuesta en SEO ID NO:168 y la cadena :;entido expuesta en SEO
6S ID NO:101: identificada en el presente documento como SERPINH1_S1a, En algunas realizaciones, el dúplex comprende la estructura
imagen5
(SEO ID NO: 105) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un 2'·5'· ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalenlemenle al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena anbsenlido (SEO ID NO: 172) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 8, 12, 13 Y 15; un
5 2'-5'·ribonudeólido en la posición 6; y un reslo C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones. las cadenas antisenlido y sentido se seleccionan de los pares de oligonucle6tidos expuestos en la tabla 5 e identificadas en el presente documento como SERP1NH1_4 (SEO ID NO: 195 y 220) Y SERPINHU2 (SEO ID NO: 196 y 221).
10
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico bicatenario es un componente de una formulación farmacéutica Que incluye la cadena antisentido expuesta en SEO 10 NO: 220 y la cadena sentido expuesta en SEO ID NO: 195; identificada en el presente documento como SERPINH1_ 4. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nudeico bicatenario tiene la estructura
15
5' AAUAGCACCCAUGUGUCUC -Z 3' (anlisenndo SEQ ID NO:220)
111I111111111111111
3 I z I -UUAUCGUGGGUACACAGAG _ z u 5' (serlidoSEQ ID NO: 195)
en la Que cada "1" representa formación de pares de bases entre los ribonucleótidos;
20 en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleótido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente. pero si está presente es independientemente 1-5 nucle6tidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los
25 mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que está presente; y
en la Que z" puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupaCión de centros reactivos
2
unido covalentemente al extremo S'-terminal de N-(N')y.
30 En algunas realizaciones se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la Que la cadena antisentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9,11,15, 17 Y 19, un 2'-5'ribonucle6lido en la posición 7, y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 195) se selecciona de una cadena sentido Que induye
35 a) 2'-5'-ribonucleótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19, un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalenlemente al extremo S'-terminal; o
b) 2'-5'-ribonude6lidos en las posiciones 1S, 16, 17, 18 Y 19, un fosfato 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al exlremo 5'-terminal; o
40 c) ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 5, 7, 13 Y 16; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 18; un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido ul1ido covalentemente al extremo 5'-tenl1inal; o
45 d) ribonucle6tidos modifICados con 2'OMe en las posiciones 7, 13, 16 Y 18; un 2'-S'-ribonudeótido en la posición 9; un resto C30H unido covalenlemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; o
e) 2'-S'-ribonucle6tidos en las posiciones 15, 16, 17. 18 Y 19; un resto C3Pi unido covalentemente al extremo 3'terminal; y un resto de desoxirribonucleólido abásico invertido unido covalenlemente al extremo 5' -terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de óddo nueleico bicotenario en la que la cadena antisentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5. 9, 11. 15. 17, 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la
55 cadena sentido (SEO ID NO: 19S) incluye 2'·5'-ribonucle6tidos en las posiciones 1S, 16, 17, 18 Y 19; un resto C3 unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena
60 antisentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5. 9, 11, 15. 17, 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 195) induye 2'-5'-ribonucleótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un fosfato 3'terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de á:ido nucleico bicatenario en la que la cadena anbsentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; un 2'·5'·ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido cavalentemente al extremo 3'-terminal; y la
5 cadena sentido (SEO ID NO: 195) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 5, 7, 13 Y 1 6; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posición 18; un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemenle al extremo 5'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena
antisentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posici6n 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 195) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 7. 13, 16 Y 18; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posici6n 9; un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
15
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena anUsentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posici6n 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 195) incluye 2'-5'-ribonucle6tidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19; un resto C3Pi
unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un reslo de desoxirribonucle6tido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporcioné una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena antisentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3,
25 5, 9, 11. 13, 15, 17, 19; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido (SEO ID NO: 195) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 7, 9, 13,16 y 18; y un resto de desoxirribonucJe6tido abásico invertido unido covalentemente al exlremo 5'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporcioné una molécula de ácido nucleico bicatenario en la
que la cadena sentido (SEO ID NO: 195) incluye 2'-5'-ribonucleótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un fosfato 3'-terminal y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 220) incluye una cadena antisentido seleccionada de uno de
a) ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; y un resto C3Pi-C30H
35 unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
b) rioonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 6, 6, 10, 12, 14, 17, 18; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario como componente de una formulación farmacéutica que incluye la cadena antisentido expuesta en SEO ID NO: 130 y la cadena sentido expuesta en SEO ID NO: 63; identificada en el presente documento como SERPINH1_12. En algunas realizaciones, el dúplex comprende la estructura
5' AACUCGUCUCGCAUCUUGU -z 3' (anlisenlido SEQ ID NO:221)
1111111111111111111
imagen1
3' Z' -UUGAGCAGAGCGUAGAACA -z" 5' (senlidoSEQ ID NO: 196)
45 en la que cada "1" representa formación de pares de bases entre los ribonucleótidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucle6tido no modificado o modificado, o un resto
no convencional;
en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente 1-5 nucle6tidos o restos distintos de nucle6tidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que está presente; y
en la que z· puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de ocupación de centros reactivos
2
unido covalentemente al extremo 5'-terminal de N_(N')y.
En algunas realizaciones se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido
(SEO ID NO: 196) incluye una o rn';¡s pirirnidinas rnodifiGadas con 2'OMe; una pruyecciún de nucleótido o distinta de nucle6tido 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal. En algunas realizaciones, la cadena antisentido (SEO ID NO: 221) incluye una o más pirimidinas mcx:lificadas con 2'OMe; un nucleótido o resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalenlemente al extremo 5'·terminal.
En algunas realizaciones, se proporciona una molécula de ácido nucleico bicalenario en la que la cadena sentido
5 (SEa ID NO: 196) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 14 Y 18; un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abásico ¡nvenido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEa ID NO: 221) se s31ecciona de una cadena anlisenlido que incluye
a) ribonucle6tidos modicados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9. 11, 13, 15 Y 17; un 2'·5'-ribonucle6tido en la
10 posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemenle al extremo 3'-terminal; o
b) ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'·5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemenle al extremo 3'-lerminal.
15 En algunas realizaciones se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 196) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 14 Y 18; un resto C3-0H unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'·terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 221) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, ", 13, 15 Y 17; un 2'·5'·ribonucleótido en la posición 7; y un resto
20 C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones se proporciona una molécula de oligonucle6tido en dúplex en la que la cadena sentido (SEa ID NO: 196) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18 Y opcionalmente en la posición 2; un resto C3·0H unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico
25 invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 221) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posición 7; 'i un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones se proporciona una molécula de oligonucle6tido en dúplex en la que la cadena sentido
30 (SEO ID NO: 196) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18; un resto C3-0H unido covalentemenle al extremo 3'-terminal; y un reslo de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEa ID NO: 221) se selecciona de una cadena antisentido que incluye
a) ribonucle6tidos modifcados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-5'-ribonucleólido en la
35 posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; o
b) libonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto C3Pi·C30H unido covalentemente al extremo 3'·terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicatenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 196) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18; un resto C3·0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido (SEa ID NO: 220) incluye ribonude6tidos rn:xIificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 Y 17; un 2'-5'-ribonucle6lido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido
45 covalentemente al extremo 3'-terminal.
En el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico bicalenario en la que la cadena sentido (SEO ID NO: 196) incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 14 y 18; un resto C3·0H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al
50 extremo 5'·terminal; y la cadena antisentido (SEO ID NO: 220) incluye ribonucle6tidos modificados con 2'OMe en las posiciones " imagen1 3, 5, 7, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En realizaciones adicionales de las estructuras A1 y A2, (N'}y incluye 1-8 ribonucleótidos modificados en las que el
55 ribonudeótido modificado es un nucle6tido de AON_ En determinadas realizaciones (N'}y incluye " imagen1 2, 3, 4, 5, 6, 7 o hasta 8 restos de ADN. En algunas realizaciones, o bien l o bien Z está presente e induye independientemente dos restos distintos de nuc!eótidos.
60 En realizaciones adicionales, l y l' están presentes y cada uno incluye independientemente dos restos distintos de nuc!e6tidos.
En algunas realizaciones, cada uno de l y l' incluye un resto abásico, por ejemplo, un resto desoxirribo-abásico
65 (denominado en el presente documento "dAb") o resto ribo-abásioo (denominado en el presente documento "rAbO). En algunas realizaciones, cada uno de l y/o l' incluye dos restos abásicos unidos covalentemenle y es, por
ejemplo, dAb-dAb o rAb-rAb o dAb-rAb o rAb-dAb, en los que cada resto está unido covalentemente a un resto adyacente, preferiblemente a través de un enlace basado en fosfo. En algunas realizaciones, el enlace basado en fosfo incluye un enlace fosforotioato, uno fosfonoacetato o uno fosfodiéster. En realizaciones preferidas. el enlace basado en fasto incluye un enlace fosfodiéster.
5
En algunas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye independ' entemente un resto alQuilO, opcionalmente resto propano ((CH2)J) (C3") o un derivado del mismo incluyendo propanodiol (C30H) y derivado de fasto de propanodiol (C3pn. En algunas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos alquilo unidos covalenlemente al extremo 3'·terminal de la cadené! antisentido o cadena sentido a través de una uniÓn fosfodiéster o fosforotioato y unidos
10 covalentemenle entre sí a través de una unión fosfodiéster o foslorotioato y en algunos ejemplos es C3Pi-C3Pi o C3Pi-C30H_ El extremo 3'-terminal de la cadena antisentido y/o el extremo 3'-terminal de la cadena sentido está unido covalentemente a un resto C3 a través de un enlace basado en fosfo y el resto C3 está conjugado covalentemenle a un resto C30H a través de un enlace basado en fosfo. En algunas realizaciones, los enlaces basados en fosfo incluyen un enlace fosforotioato, uno fosfonoacetato o uno fosfodiéster. En realizaciones preferidas el enlace basado en fosfo incluye un enlace fosfodiéster.
En diversas realizaciones de la estructura A1 o la estructura A2, Z y Z' están ausentes. En otras realizaciones, l o l' está presente. En algunas realizaciones, cada uno de l y/o l' inck.Jye independientemente un resto alquilo C2, C3, C4, CS o C6, opcionalmente un resto C3 o un derivado del mismo incluyendo propanol (C30H/C30H), propanodiol,
20 y derivado de fosfodiéster de propanodiol (C3Pi). En realizaciones preferidas, cada uno de l y/o l' incluye dos restos hidrocarbonados y en algunos ejemplos es C3Pi-C30H o C3Pi-C3Pi. Cada C3 está conjugado covalentemente a un C3 adyacente a través de un enlace covalente, preferiblemente un enlace basado en fosfo. En algunas realizaciones, el enlace basado en fosfo es un enlace fosforolioato, uno fosfonoacetato o uno fosfodiéster.
25 En realizaciones específicas, x=y=19 y l comprende al menos una proyección de alquilo C3. En algunas rea'izaciones, la proyección de C3-C3 está unida covalentemente al extremo 3'-terminal de (N)x o (N')y a través de una unión covalente, preferiblemente una unión fosfodiéster. En algunas realizaciones, la unión entre un primer C3 y un segundo C3 es una unión fosfodiéster. En algunas realizaciores, la proyección distinta de nucleótido en 3' es C3Pi-C3Pi. En algunas realizaciones, la proyección distinta de nucleótido en 3' es C3Pi-C3Pi. En algunas
30 rea'izaciones, la proyección distinta de nucle6iido en 3' es C3Pi-C30H.
En diversas realizaciones, el resto alquilo comprende un derivado de alquilo incluyendo un resto alquilo C3, alquilo C4, alquilo C5 o alquilo e6 que comprende un grupo hidroxilo terminal, uno amino terminal o uno fosfato terminal. En algunas realizaciones, el resto alquilo es un resto alquilo C3 o derivado de alquilo C3. En algunas realizaciones, el
35 resto alquilo C3 comprende propanol, fosfato de propilo, fosforotioato de propilo o una combinación de los mismos. El resto alquilo C3 está unido covalentemente al extremo 3'-terminal de (N'h y/o al extremo 3'-terminal de (N)x a tra\"és de un enlace fosfodiéster. En algunas leali¿aciones, el resto alquilo comprende propanol, fosfato de propilo o fosforotioato de propilo. En algunas realizaciones, cada uno de Z y l' se selecciona independientemente de propanol, fosfato de propilo, fosforolioalo de propilo, combinaciones de los mismos o múltiplos de los mismos en
40 particular 2 o 3 propanoles, fosfalos de propilo, fosforolioatos de propilo o combinaciones de los mismos unidos covalentemenle. En algunas realizaciones, cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, propilfosfopropanol; fosforotioato de propilfosfo-propilo; fosfato de propilfosfo-propilo; (fosfato de propilo)J, (fosfato de propilo)T-propanol, (fosfato de propilo)z-fosforotioato de propilo. Cualquier resto conjugado de propano o propanol puede incluirse en l o l'.
45 las estructuras de restos distintos de nucleótidos 3'-terminales a modo de ejemplo son de la siguiente manera:
imagen6
extremo 3'-temllnaJ-C3Pi.c30H
elllfemo 3·.otenn",·\9I-C3pr¡-C3.c30H
En algunas realizaciones, cada uno de Z y l' se selecciona independientemente de propanol, fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, combinaciones de los mismos o múltiplos de los mismos.
5
En algunas realizaciones, cada uno de Z y l' se selecciona independientemente de fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, propilfosfo-propanol; fosforotioalo de propilfosfo-propilo; fosfato de propilfosfo-propilo; (fosfato de propiloh, (fosfato de propilo)rpropanol, (fosfato de propilo)rfosforotioato de propilo. Cualquier resto conjugado de proano o propanol puede incluirse en Z o z'.
10 En realizaciones adicionales, cada uno de Z y/o Z' incluye una combinación de un resto abásico y un desoxirribonucle6tido O ribonucle6tido no modificado o una combinaci6n de un resto hidrocarbonado y un desoxirribonucle6tido o ribonucle6tido no modificado o una combinación de un resto abásico (desoxirribo o ribo) y un resto hidrocarbonado. En tales realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye C3-rAb o C3-dAb en los que cada resto 15 está unido covalentemente al resto adyacenle a través de un enlace basado en fosfo, preferiblemente una uni6n fosfodiéster, fosforolioalo o fosfonoacetalo.
En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico lal como se divulga en el presente documento incluyen una secuencia oligonucleotidica sentido seleccionada de Jno cualquiera de los 0ligonucle6tidos mostrados
20 a continuación en las labias 4 y 5 (SEO ID NO: 60-126 y 194-2 16).
En determinadas realizaciones preferidas, los compuestos proporcionados incluyen Compuesto_1, CompueSlo_2, Compuesto_3, Compuesto_ 4, Compuesto_S, Compuesto_6, Compuesto_7, Compuesto_8 y Compuesto_9, descritos a continuación.
5 En algunas realizaciones, (tales como, por ejemplo, Compuesto_1, Compueslo_5 y Compuesto_6) se proporcionan moléculas de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en las que la cadena anlisenlido es SEO ID NO: 127 y la cadena sentido es SEO ID NO: 60. En determinadas realizaciones, se proporcionan moléculas de acido nucleico bicatenario de 19 meros en las que la cadena antisentido es SEO ID NO: 127 e incluye ribonucleólidos modificados con 2'OMe: un 2'-5'·ribonucleótido en al menos una de las posiciones 1, 5, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido
10 unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido es SEO ID NO: 60 e incluye al menos un 2'-5'ribonucleótido o ribonucleótido modificado con 2'OMe; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena antisentido es SEO ID NO: 127; e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13,
15 15,17 y 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido es SEO ID NO: 60 e incluye cinco 2'-5'-ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto distinto de nucleótido C3Pi unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
20 En una realización, se proporciona Compuesto _1 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena antisentido es SEO ID NO: 127 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleólido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido es SEO ID NO: 60 e incluye cinco 2'-5'ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16; 17, 18 Y 19; un resto distinto de nucleótido C3Pi
25 unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'terminal; y que incluye además un ribonucleót:do modificado con 2'QMe en la posición 1 de la cadena antisentido.
En una realización, se proporciona Compuesto_6 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena antisentido es SEO ID NO: 127 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la poSición 7; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido es (SEO ID NO: 60) e incluye cinco 2'-5'ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto distinto de nucleótido C3Pi unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'terminal; y que incluye además un 2'-5'-ribonll:leótido en la posición 1 de la cadena antisentido.
En una realizaci6n, se proporciona Compuesto_5 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena antisentido es SEO ID NO: 127 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3,5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'-ribonucleótido en la poSición 7; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y la cadena sentido es SEO ID NO: 60 e incluye ribonucleótidos
40 modificados con 2'OMe en las posiciones 7,13,16 Y 18; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucle6tido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invenido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
En algunas realizaciones, (tales como, por ejemplo, Compuesto_2 y Compuesto_7, descritos a continuación) se
45 proporcionan moléculas de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en las que la cadena sentido es SEO ID NO: 63 y la cadena antisentido es SEO ID NO: 130. En algunas realizaciones, se proporcionan moléculas de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en las Que la cadena sentido es SEO ID NO: 63 e incluye ribonucleótidos de pirimidina modificada con 2'OMe; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupaci6n de centros reactivos unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEO ID NO:
50 130 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal. En algunas realizaciones se proporcionan moléculas de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en las que la cadena sentido es SEO ID NO: 63 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido es SEO 10NO:
55 130 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un 2'-5'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones 5, 6
o 7: y un resto distinto de nucle6tido unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
En una realización, se proporciona Compuesto_2 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena sentido es SEO ID NO: 63 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'QMe en las posiciones 2, 14
60 Y 18; un resto C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEO ID NO; 130 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 12, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones S, 6 o 7; y resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'lermini:ll.
65
En una realización, se proporciona Compuesto_7 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la Que la cadena sentido es SEQ ID NO: 63 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 14 Y 18; un resto C30H unido covalenlemenle al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemenle al extremo 5'-terminal; y la cadena antisentido es SEO ID NO: 130 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'QMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13 Y 17; un 2'-S'-ribonucleólido en la posición
5 7; Y un reslo distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalenlemenle al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones, (tales como, por ejemplo, Compuesto_3, descrito a continuaCión) se proporcionan moléculas de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en las que la cadena sentido es SEa ID NO: 98 y la cadena antisentido es SEa ID NO: 165. En algunas realizaciones, se proporcionan moléculas ce ácido nucleico bicatenario
10 de t9 meros en las que la cadena sentido es SEa ID NO: 98 e incluye 2'-S'-ribonucleótidos en las posiciones en el extremo 3'-terminal; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente a[ extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEa [O NO: 165 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un 2'-S'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones 5, 6
o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal. En una realización, se proporciona
Compuesto_3 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena sentido es SEa ID NO: 98 e incluye 2'-S'-ribonuc[eótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto C3-0H 3' unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleólido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEa ID NO: 165 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'·S'-ribonucleótido en la posición 7; y un C3Pi-C30H unido
20 covalentemente al extremo 3'-terminal.
En algunas realizaciones, (tales como, por ejemplo, Compuesto_ 4, Compuesto_8 y Compuesto_9, descritos a
continuación) se proporcionan moléculas de ácido nucleico bicalenario de 19 meros en las que la cadena sentido es
SEa ID NO: 101 y la cadena antisentido es SEa ID NO: 168. En algunas realizaciones se proporcionan moléculas
25 de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en las que la cadena sentido es SEa ID NO: 101 e incluye ribonucleótidos de pirimidina modificada con 2'OMe; un 2'-S'-ribonucleótido opcional en una de la posición 9 o 10; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'·terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEa ID NO: 168 e incluye
ribonucleótidos modificados con 2'OMe; un 2'-S'-ribonucleótido, en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7; y un
resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'·terminal.
En una realización, se proporciona Compuesto_ 4 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena sentido es SEa ID NO: 101 e incluye ribonucleó[ idos modificados con 2'OMe en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al
35 extremo 3'·terminal; y un resto de desoxirribonucle6tido abésico invertido unido covalentemente al extremo S'· terminal; y la cadena antisentido es SEO[D NO: 168 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y 15; un 2'-S'-ribonucleótido en la posición 6; una proyección de C3Pi-C30H unida covalentemente al extremo 3'-terminal.
40 En una realización, se proporciona Compuesto_S que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en la que la cadena sentido es SEOID NO: 101 e incluye ribonucleó1idos modificados con 2"OMe en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEa ID NO: 168 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 4, 8, 13 Y 15; un 2'-5'
45 ribonucleótido en la posición 6; y una proyeccon de C3Pi-C30H unida covalentemente al extremo 3'·terminal.
En una realización, se proporciona Compuesto_9 que es una molécula de ácido nucleico bicatenario de 19 meros en
la que la cadena sentido es SEa ID NO: 101 e incluye ribonucleó[idos modificados con 2'OMe en las posiciones 2,
4, 11, 13 Y 17; un resto distinto de nucleólido C30H unido cova:entemente al extremo 3'-terminal; y un resto de
50 desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo S'-terminal; y la cadena antisentido es SEa ID NO: 168 e incluye ribonucleótidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y 15; un 2'-5'ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3' -terminal.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para reducir la expresión de hsp47 en una célula introduciendo en una
55 célula una molécula de ácido nucleico tal como se proporciona en el presente documenlo en una cantidad suficiente para reducir la expresión de hsp47. En una realización, la célula es una célula estrellada hepatocelular. En otra realización, la célula es una célula estrellada en tejido renal o pulmonar. En determinada realización, el método se realiza in vi/ro. En otra realización, el método se realiza in vivo.
60 En otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar a un individuo que padece una enfermedad asociada con hsp47. Los métodos incluyen administrar al individuo una molécula de acido nucleico tal como se proporciona en el presente documento en una cantidad suficiente para reducir la expresión de hsp47. En determinadas realizaciones, la enfermedad asociada con hsp47 es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en fibrosis hepatica, cirrosi:;, rilJrosis pulmonar incluyendo filJrosi:; de pulmun (incluyendo ILF), (;ual4Uier estado 4ue provoque filJrosi:;
65 renal (por ejemplo, CKO incluyendo ESRD), fibrosis peritoneal, daño hepático crónico, fibrilogénesis; enfermedades fibróticas en otros órganos; cicatrización anómala (queloides) asociada con todos los posibles tipos de lesión
cutánea, por accidente y yatrogénica (operaciones), esclerodermia, cardiofibrosis, insuficiencia de la operación de filtrado de glaucoma y adhesiones intestinales. En algunas realizaciones, los compuestos pueden ser útiles en el tratamiento de indicaciones específicas de órgano, por ejemplo, indicaciones que incluyen las mostradas en la tabla 1 a continuación, que enumera órganos e indicaciones respectivas:
TABLA 1
Piel • Cicatrización patológica tal como queloide y cicatriz hipertrófica • Cicatrización quirúrgica • Cicatrización de lesión • Queloide, o dermopalia fibrosante
Peritoneo • Fibrosis peritoneal • Adhesiones • Esclerosis asociada con diálisis ambulatoria continua
Hígado • Cirrosis incluyendo cirrosis tras hepatitis e, cirrosis biliar primaria • Fibrosis hepática, por ejemplo, prevención de fibrosis hepática en portadores de hepatitis e • Esquistosomiasis • Colangitis • Cirrosis hepática debida a Hepatitis e tras trasplante de o esteatohepatitis no alcohólica
Páncreas · Fibrosis inter{peri)lobular (por ejemplo, pancreatitis crónica alcohólica), fibrosis periductal (por ejemplo, pancreatitis fibrosis periductal e interlobular (por pancreatitis autoinmunitaria), fibrosis inter e intralobular crónica
Riñón • Enfermedad renal crónica (eKO) de cualquier etiología. El tratamiento de eKO de fase temprana (Ser elevada) en pacientes diabéticos (previene el deterioro adicional en la función renal) • Fibrosis renal asociada con lupus glomeruloesclerosante • diabética
eorazón • Insuficiencia cardiaca congestiva, • Fibrosis endomiocárdica, • Cardiofibrosis • Fibrosis asociada con infarto de miocardio
Pulmón • Asma, fibrosis pulmonar idiopática (IPF); • Fibrosis de pulmón intersticial (ILF) • Neumonía por radiación Que conduce a fibrosis pulmonar (por ejemplo, debido a radiación para el tratamiento de
Médula ósea • Trastornos mieloproliferativos: mielofibrosis (MF), policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET) • Mielofibrosis idiopática • Mielofibrosis inducida por fármacos.
Ojo • Segmento anterior: opacificación de la córnea, por ejemplo, tras distrofias heredadas, queratitis herpetica o pterigiones; glaucoma • Segmento posterior: fibrosis y desprendimiento de retina por tracción, una complicación de retinopatía diabética avanzada (OR); cicatrización fibrovascular y gliosis en la retina; • Bajo la retina: fibrosis, por ejemplo, tras hemorragia subretiniana asociada con AMO neovascular • Fibrosis retro-orbital, cirugía poscataratas, vitreorretinopatía proferativa. • cicatricial ocular
Intestino • Fibrosis intestinal, • Enfermedad de erohn
Cuerdas vocales • Cicatrización de las cuerdas vocales, • Fibrosis de la mucosa de las cuerdas vocaes, • Fibrosis de la
Vasculatura • Aterosclerosis, • Reestenosis arterial
Multisistémico • Esclerodermia, esclerosis sistémica;
• Fibroesclerosis mullifocal:
imagen1 ósea, y
•
Enfermedad injerto contra huésped esclerodermatosa en receptores de trasplante de
•
Fibrosis sistémica a de contraste basados en 81 30 % de Tumores malignos de diversos orígenes
•
Cáncer melaslásico e invasiyo inhibiendo la función de miofibroblastos asociados con tumor activados
Otra realización de la descripción es un método para tratar un trastorno relacionado con células estrelladas, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita a continuación a un sujeto Que lo necesita. El trastorno incluye hepatitis, fibrosis hepática, cirrosis l1epática, cáncer de hígado,
5 pancreatitis, fibrosis pancreática, cáncer pancreático, cicatrización de las cuerdas vocales, fibrosis de la mucosa de las cuerdas vocales y fibrosis de la laringe. En algunas realizaciones, las indicaciones preferidas incluyen cirrosis hepática debida a hepatitis C tras trasplante de hígado; cirrosis hepática debida a esteatohepatitis no alcohólica (NASH): fibrosis pulmonar idiopática: neumonía por radiación Que conduce a fibrosis pulmonar: nefropatia diabética: esderosis peritoneal asociada con diálisis periloneal ambulatoria continua (CAPO) y penfigoide cicatricial ocular.
imagen1
las indicaciones de hígado fibrótico incluyen cirrosis alcohólica, cirrosis por hepatitis B, cirrosis por hepatitis C, cirrosis por hepatitis C (Hep C) tras trasplante de hígado ortotópico (Ol TX), esteatohepatitis no alcohólica I enfermedad de hígado graso no alcohólica I:NASH/NAFlO), cirrosis biliar primaria (paC).colangitis esclerosante primaria (PSC), atresia biliar, deficiencia de antitripsina alfa-1 (A1AO), enfermedades de acumulación de cobre
15 (enfermedad de Wilson), fructosemia, galactosemia, enfermedades de almacenamiento de glucógeno (especialmente tipos 111, IV, VI, IX Y X), síndromes de sobrecarga de hierro (hemocromatosis), anomalías de lípidos (por ejemplo, enfermedad de Gaucher), trastornos peroxisomales (por ejemplo, sindrome de Zellweger), tirosinemia, fibrosis hepática congénita, infecciones bacterianas (por ejemplo, brucelosis), enfermedades parasitarias (por ejemplo, equinococosis), síndrome de Budd-Chiari (enfermedad venooclusiva hepática).
20 las indicaciones pulmonares incluyen fibrosis pulmonar idiopática, silicosis, neumoconiosis, displasia broncopulmonar en recién nacidos tras sindrome de dificultad respiratoria neonatal, lesión pulmonar por bleomicinalQuimioterapia, bronQuiolitis obliterante (80S) tras trasplante de pulmón, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis quistica y asma.
25 las indicaciones cardiacas incluyen miocardiopatia, aterosclerosis (enfermedad de 8ergers, etc.), fibrosis endomiocárdica, fibrilación auricular, cicatrización tras infarto de miocardio (MI).
Otras indicaciones torácicas incluyen reaccones de tejido de la cápsula inducidas por radiación alrededor de
30 implantes de mama texturizados, y fibrosis submucosa oral.
las indicaciones renales incluyen enfermedad renal poliquística dominante autosómica (AOPKO), nefropatía diabética (glomeruloesclerosis diabética), glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS) (colapsante frente a otras variantes histológicas), nefropatía de IgA (enfermedad de Berger), lupus nefrítico, enfermedad de Wegner,
35 esderodermia, síndrome de Goodpasture, fibrosis tubulointersticial: inducida por fármacos (protectores) penicilinas, cefalosporinas, nefropatía por analgésicos, glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN), púrpura de HenochSchonlein, nefropalias congénitas: enfermedad quística medular, síndrome de uña-rótula y síndrome de Alport.
las indicaciones de la médula ósea incluyen linfangioliomiositosis (LAM), enfermedad injerto contra huésped
40 crónica, policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis.
la!'l indic;:¡done!'l ocul;:¡res incluyen relinopi'llia del prP.maluro (RoP), penfigoidp. dc;:¡lridi'l1 ocular, fihrosis dp. glándul;:¡ lacrimal, cirugía por desprendimiento de retina, opacidad de la córnea, Queratitis herpética, pterigiones, glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad (AMO/ARMO), retirppatía por diabetes mellitus asociada con fibrosis
45 retiniana (OM).
las indicaciones ginecológicas incluyen endometriosis, adición a terapia hormonal para prevenir la cicatrización, fibrosis/salfingitis tras ETS.
50 las indicaciones sistémicas incluyen enfermedad de Oupuytren, fibromatosis palmar, enfermedad de Peyronie, enfermedad de ledderhose, queloides, fibroesclerosis multifocal, fibrosis sistémica nefrógena y mielofibrosis (anemia).
las enfermedades fibróticas asociadas con lesiones incluyen cicatrización y contracción de piel y tejido blando
55 inducida por quemadura (incluidas las químicas), cicatrización de piel y órganos inducida por radiación, tras tratamiento con radiación terapéutica para el cáncer, Queloide (piel).
las indicaciones quirúrgicas incluyen fibrosis peritoneal tras catéter de diálisis periloneal, implante de córnea, implante coclear, otros implantes, implantes de silicona en la mama, sinusitis crónica; adhesiones, hiperplasia
60 pseudoíntima de injertos de diálisis.
Otras indicaciones incluyen pancreatitis crónica.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que padece fibrosis hepática que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente
5 documento, tratando de ese modo la fibrosis hepática. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hígado debido a hepatitis. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hígado debido a NASH.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de una molécula de acido nucleico divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar la fibrosis hepática. En algunas realizaciones, la
10 fibrosis hepática se debe a hepatitis. En algunas realizaciones, la fibrosis hepática se debe a NASH.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para el remodelado de tejido cicatricial que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento, realizando de ese modo el remodelado de tejido cicatricial. En algunas realizaciones, el tejido
15 cicatricial está en el hígado. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hígado debido a hepatitis. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hígado debido a NASH.
En algunas realizaciones, se proporciona Ln método para modular la regresión de la fibrosis que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada en el
20 presente documento, realizando de ese modo la regresión de la fibrosis.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para la reducción de tejido cicatricial en un sujeto que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento para reducir el tejido cicatricial. En algunas realizaciones, se proporciona un método para
25 reducir tejido cicatricial en un sujeto que comprende la etapa de aplicar por vía tópica al tejido cicatricial una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divugada en el presente documento para reducir el tejido cicatricial.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para mejorar el aspecto de tejido cicatricial que comprende la etapa de aplicar por vía tópica al tejido cicatricial una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada
30 en el presente documento para mejorar el aspecto del tejido cicatricial.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que padece fibrosis de pulmón que comprende administrar al sujeto una cant:dad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento, tratando de ese modo la fibrosis de pulmón. En algunas realizaciones, el sujeto padece fibrosis de
35 pulmón intersticial (ILF). En algunas realizaciones, el sujeto padece neumonía por radiación que conduce a fibrosis pulmonar. En algunas realizaciones, el sujeto padece fibrosis de pulmón inducida por fármacos.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar la fibrosis de pulmón. En algunas realizaciones, la
flbrosis de pulmón es ILF. En algunas realizaciones, la fibrosis de pulmón es fibrosis de pulmón inducida por fármacos o radiación.
En un aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se describe en el presente documento en un portador farmacéuticamente
45 aceptable. En determinadas realizaciones, la formulación farmacéutica incluye, o implica, un sistema de suministro adecuado para suministrar moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) a un individuo tal como un paciente; por ejemplo, sistemas de suministro descritos con más detalle a continuación.
En un aspecto relacionado, se proporcionan composiciones o kits que incluyen una molécula de ácido nucleico (por
ejemplo, una molécula de ANip) envasada para su uso por un paciente. El envase puede estar etiquetado o incluir una etiqueta de envase o prospecto que indique el contenido del envase y proporcione cierta información referente a cómo debe o puede usarse la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) por un paciente, por ejemplo, la etiqueta puede incluir información de dosificación y/o indicaciones de uso. En determinadas realizaciones, el contenido de la etiqueta incluirá un aviso en una forma recomendada por una agencia
55 gubernamental, por ejemplo, la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos. En determinadas realizaciones, la etiqueta puede indicar que la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) es adecuada para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada con hsp47; por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) es adecuada para su uso en el tratamiento de fibroides; o, por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la molécula de 60 ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) es adecuada para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en fibrosis, fibrosis hepatica, cirrosis, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis peritoneal, daño hepático crónico y fibrilogénesis.
Ti:ll como se usa en el presente documento, el tt:rmino "proteína de cho4ue It:rmioo 47" u "hsp47" o "HSP47" se USi:lrl
65 de manera intercambiable y se refieren a cualquier proteína de choque térmico 47, péptido, o polipéptido que tiene cualquier actividad de proteína hsp47. La proteína de choque térmico 47 es un inhibidor de serina proteinasa (serpina) también conocido, por ejemplo, como inhibidor de serpina peptidasa, ciado H, miembro 1 (SERPINH1 l,SERPINH2, proteína de unión a colágeno 1 (CBP1), CBP2, gp46; proteína transactivada por arsénico 3 (AsTP3); HSP47; gen de inducción de la proliferación 14 (PIG 14); PPROM; antígeno de artritis reumaloide A-47 (RA-A47); coligina 1; y coligina 2. En determinadas realizaciones preferidas, "hsp4r se refiere a hsp47 humana, La proteína de choque térmico 47 (o más particularmente hsp47 humana) puede tener una secuencia de aminoácidos que es la misma, o sustancialmente la misma, que SEO ID NO. 2.
Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia de nucleólidos que codifica hsp47" significa una seOJencia de nucleótidos que codifica una proteína hSp47, o parte de la misma. También se pretende que el término
"secuencia de nucleótidos que codifica hsp47" incluya secuencias codificantes de hsp47 tales como isoformas de hsp47, genes de hsp47 mutantes, variantes de corte y empalme de genes de hsp47, y polimorfismos de genes de hsp47. Una secuencia de ácido nucleico que codifica hsp47 incluye secuencias de ARNm que codifican hsp47, que también pueden denominarse "ARNm de hsp47." Una secuencia a modo de ejemplo de ARNm de hsp47 humana es SEQ ID NO: 1.
Tal como se usa en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico" se usa de manera intercambiable y se refieren a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido. Se describen variaciones de "molécula de ácido nucleico" con más detalle en el presente documento. Una molécula de ácido nucleico abarca tanto moléculas de ácido nucleico modificadas como moléculas de ácido nucleico no modificadas lal como se
describe en el presente documento. Una molécula de ácido nucleico puede incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o análogos de nucleótido en cualquier combinación.
Tal como se usa en el presente documento. el término "nucleótido" se refiere a un resto químico que tiene un azúcar (o un análogo del mismo, o un azúcar modificadO), una base de nucleótido (o un análogo de la misma, o una base
modificada) y un grupo fosfato (o análogo del mismo, o un grupo fosfato modificado). Un nucleótido abarca nucleótidos modificados o nucleótidos no modificados tal como se describe en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, los nucleótidos pueden incluir desoxirribonucleólidos (por ejemplo, desoxirribonucleólidos no modificados), ribonucleótidos (por ejempb, ribonucleótidos no modificados), y análogos de nucleótido modificados incluyendo, entre otros, ANB y ANNB, écidos nucleicos peplidicos, l-nucleótidos (también
denominados nucleótidos espeCUlares), ácido nucleico con puente de etileno (ANE), arabinósido, PACE, nucleótidos con un azúcar de 6 carbonos, así como análogos de nucleótido (incluyendo nucleótidos abásicos) que con frecuencia se considera que son distintos de nucleótidos. En algunas realizaciones, los nucleótidos pueden estar modificados en el azúcar, la base de nucleótido y/o en el grupo fosfato con cualquier modificación conocida en la técnica, tal como modificaciones descritas en el presente documento. Un "polinucleótido· u "oligonucleótido" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de nucleólidos unidos; los polinucleótidos y olinucleótidos también pueden tener modificaciones en el azúcar de nucleótido, las bases de nucleótido y las estructuras principales de fosfato tal como se conoce bien en la técnica y/o se divulgan en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico de interferencia pequeño", "ANip", o "molécula de ácido nucleico de interferencia pequeno" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de modular la expresión génica o la replicación vírica. Preferiblemente, el ANip inhibe o regula por disminución la expresión génica
o la replicación vírica. El ANip incluye sin limitación moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar en iARN especifica de secuencia, por ejemplo, ARN de interferenaa pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN), ARN de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido de interferencia pequeno, ácido nucleico de
interferencia pequeño, oligonucleátido modificado de interferencia pequeño, ARNip químicamente modificado, ARN de silenciamiento génico postranscripcional (ARNsgpt), y otros. Tal como se usa en el presente documento, "écido nucleico de interferencia pequeño", "ANip", o "molécula de ácido nucleico de interferencia pequeño" tiene el significado descrito con más detalle en otra parte en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "complementario" significa que un ácido nucleico puede formar puente(s) de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante tipos o bien tradicional de WatsonCrick o bien otros no tradicionales. En referencia a las moléculas nucleicas divulgadas en el presente documento, la energia libre de unión para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que avance la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, actividad de iARN. la determinación de energías libres de unión para moléculas de ácido nucleico se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Turner el al., 1987, CSH Symp. Quan!. Biol. III págs. 123-133; Frier el al., 1986, Proc. Na!. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Tumer el al., 1987, J. Am. Chem. Soco 109:3783-3785). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar puentes de hidrógeno (por ejemplo, formación de pares de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7,
8, 90 10 nucleótidos de un total de 10 nucleótidos en el primer oligonucleótido que forman formación de pares de bases con una segunda secuencia de ácido nucleico que tiene 10 nucleótidos representa el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, y el 100 % de complementariedad, respectivamente). "Completamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico formarán puentes de hidrógeno con el mismo número tle residuos conLiguos en una segunda secuencii:J tle citlo nudeico. En uni:J realiLaciun, una molecula de ácido nucleico divulgada en el presente documento incluye de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 o
más) nudeótidos que son complementarios con una o más moléculas de ácido nucleico diana o una parte de las mismas.
Tal como se usa en el presente documento, el lérmino región sentido se refiere a una secuencia de nucleótidos de
5 una molécula de ANip complementaria (parcial o completamente) a una región antisentido de la molécula de ANip.
La cadena sentido de una molécula de ANip puede incluir una secuencia de ácido nucleico Que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico diana. Tal como se usa en el presente documento. cadena sentido· se refiere a una molécula de ácido nucleico que induye una región sentido y también puede incluir nucle6tidos adicionales. Las poiciones de nucle6tido de la cadena sentido se numeran en el presente documento 5'>3'.
10
Tal como se usa en el presente documento. el término "región antisentido se refiere a una secuencia de nucle6tidos de una molécula de ANip complementaria (parcial o completamente) a una secuencia de acido nucleico diana. La cadena antisentido de una molécula de ANip puede incluir opcionalmente una secuencia de acido nucleico complementaria a una región sentido de la molécula de ANip. Tal como se usa en el presente documento, "cadena
15 antisentido se refiere a una molécula de acido nucleico que incluye una región anlisenlido y también puede incluir nucleótidos adicionales. Las posiciones de nucleólido de la cadena antisentido se numeran en el presente documento 5'>3'.
Tal como se usa en el presente documento, el término "ARW se refiere a una molécula que incluye al menos un
20 residuo de ribonucleótido.
Tal como se usa en el presente documento, el término "reg ón de dúplex· se refiere a la región en dos oligonucle6tidos complementarios o sustancialmente complementarios Que forman pares de bases entre sí, o bien mediante formación de pares de bases de Watson-Crick o bien de cualquier otra manera que permite formar un
25 dúplex entre cadenas oligonucleolídicas que son complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena oligonucleolídica que tiene 21 unidades de nucleótido puede formar pares de bases con otro oligonucleótido de 21 unidades de nucleótido, aunque solo 19 bases en cada cadena sean complementarias o sustancialmente complementarias, de tal manera que la "región de dúplex· consiste en 19 pares de bases. Los pares de bases restantes pueden existir, por ejemplo, como proyecciones en 5' y 3'. Ademas, dentro de la región de
30 dúplex, no se requiere el 100 % de complementariedad; puede permitirse complementariedad sustancial dentro de una región de dúplex. la complementariedad sustancial se refiere a complementariedad entre las cadenas de tal manera que son capaces de hibridarse en condiciones biológicas. En la técnica se conocen bien técnicas para determinar empíricamente si dos cadenas son capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Altemativamente, dos cadenas pueden sinletizarse y ai'iadirse jlJntas en condiciones biológicas para determinar si se hibridan entre si.
35
Tal como se usa en el presente documento, los términos "analogo de nucleótido sin formación de pares" significa un análogo de nucleólido que incluye un reslo sin ronnación pares de bases incluyendo, peru sin limitarse a: 6"desamino-adenosina (nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, S-nitroindol, Os, Pa, N3-Me-ribo-U, N3-Me-riboT, N3-Me-dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-elil-dC, N3-Me dC. En algunas realizaciones, el análogo de nude6tido sin
formación de pares de bases es un ribonucleólido. En otras realizaciones es un desoxirribonucleótido.
Tal como se usa en el presente documento, el término "grupo funcional terminal" induye sin limitación grupos halógeno, alcohol, amina, carboxílico, éster, amida, aldehído, cetona, éter.
45 Un "nude6lido abásico" o "anélogo de nudeótido abésico", tal como se usa en el presente documento, también puede denominarse con frecuencia en el presente documento y en la técnica pseudo-nucleótido o un resto no convencional. Mientras que un nucleótido es una unidad monomérica de ácido nucleico, que consisle generalmenle en un azúcar de ribosa o desoxirribosa, un fosfalo y una base (adenina, guanina, limina o citosina en el AON; adenina, guanina, uracil0 o cilosina en el ARN), un nucle6lido abasico o pseudo-nucleótido carece de una base, y
50 por tanto no es estrictamente un nucleótido tal como se usa generalmente el término en la técnica. Los restos de desoxirribosa abásicos incluyen, por ejemplo, 3'-fosfato de desoxirribosa abásica; 3-fosfato de 1,2-didesoxi-Oribofuranosa; 3-fosfalo de 1,4-anhidro-2-desoxi-D-ribilol. Los restos de desoxirribosa abasicos invertidos incluyen desoxirriboabasicos invertidos; 5'-fosfato desoxiabasico invertido en 3',5'.
55 El término resto de ocupación de cenlros reactivos (z") lal como se usa en el presenle documenlo incluye un reslo Que puede unirse covalentemente al extremo S'-terminal de (N')y e incluye restos de ribosa abásica, reslo de desoxirribosa abásica, modificaciones de restos de ribosa abásica y desoxirribosa abasica incluyendo modificaciones con 2'Q-alquilo; reslos de ribasa abásica y desoxirribosa abásica invertidos y modificaciones de los mismos; C6-imino-Pi; un nucleótido especular incluyendo L-AON y L-ARN; S'OMe-nudeótido; y analogos de
60 nucleólido incluyendo 4',5'-metilen-nucle6tido; 1-(-O-eritrofuranosil)nucleólido; 4'-tio-nucleótido, nucleótido carbocílcico: fosfato de S'-amino-alquilo: fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfalo de 3-amino-propilo; fosfato de 6aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; 1,5-anhidrohexilol-nucleólido; alfa-nudeótido; treo-penlofuranosil-nucleólido; 3',4'-seco-nucleólido acíclico; 3,4--dihidroxibulil-nudeótido; 3,5-dihidroxipentilnUcleótido, S'-S'-reslo abásico invertido; fosfalo de 1,4-bulanodiol: 5'-amino; y restos fosfonato de metilo y 5'
65 mercapto con formación de puentes o sin formación de puenles.
Determinados restos de ocupación de centros reactivos pueden ser restos de ribosa abásica o desoxirribosa abásica; restos de ribosa abásica o desoxirribosa abásica in'/ertidos; C6-amino-Pi; un nucle6tido especular incluyendo L-AON y L-ARN. Las moléculas de ácido nucleico lal como se divulga en el presente documento pueden sintetizarse usando uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo, timidina invertida o adenina invertida (por
5 ejemplo, véase Takei, el al., 2002. JBC 277(26):23800-06).
El término "resto no convencional" tal como se usa en el presente documento se refiere a restos distintos de nucleótidos que incluyen un resto abásicQ, un resto abasico invertido, un resto hidrocarbonado (alquilo) y derivados de los mismos, e incluye además un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleátido modificado, un nucleótido
10 especular (L-AON o L-ARN), un análogo de nucleótido sin formación de pares de bases y un nucleótido unido a un nucleótido adyacente mediante un enlace de fosfato intemucleotídico 2'-5'; ácidos nucleicos con unión en puente incluyendo ANB y ácidos nucleicos con unión en puente de etileno, nucleótidos con uniones modificadas (por ejemplo, PACE) y con bases modificadas así como restos adicionales explícitamente divulgados en el presente documento como restos no convencionales.
15
Tal como se usa en el presente documento, el término "inhibir", "regular por disminución" o "reducir" con respecto a la expresión génica significa que la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína (por ejemplo, ARNm), o actividad de una
o más proteinas o subunidades de proteína, se reduce por debajo de lo observado en ausencia de un factor inhibidor
20 (tal como una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un ANip, por ejemplo, que tenga características estructurales lal como se describe en el presente documento); por ejemplo, la expresión puede reducirse hasta el 90 %, el 80 %, el 70 %, el 60 %, el 50 %, el 40 %, el 30 %, el 20 %, el 10 %, el 5 % o menos de lo observado en ausencia de un inhibidor.
25 Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama que muestra un protocolo con respecto a la evaluación del efecto de gp46-ARNip in vitro usando células NRK, y la determinación de la secuencia, el tiempo y la concentración óptimos.
30 La figura 2 es un diagrama fotográfico que muestra el resultado de inmunotransferencia de tipo Western de gp46 y actina (cultivo de 24 horas, e;w;amen de la secuencia óptima).
La figura 3 es un diagrama fotográfico que muestra el resultado de inmunotransferencia de tipo Western de gp46 y actina (cultivo de 24 horas, examen de la concentración óptima).
35 La figura 4 es un diagrama fotográfico que muestra el resultado de inmunotransferencia de tipo Western de gp46 y actina (concentración 50 nM, examen del liempo de cultivo óptimo).
La figura 5 es un diagrama que muestra un protocolo para evaluar la inhibición de la expresión de colágeno
40 mediante gp46-ARNip en células NRK.
La figura 6 es un gráfico que muestra la inhibición de la síntesis de colágeno mediante ARNip.
La figura 7 es un diagrama fotográfico que muestra la transfección de ARNip específica de HSC.
45
La figura 8 es un diagrama fotográfico para evaluar el porcentaje de transfección de ARNip específica de HSC.
La figura g es un diagrama fotográfico para evaluar la inhibición de la expresión de gp46 mediante ARNip.
so La figura 10 es un diagrama fotográfico que muestra la tinción con azán de hígado de rata a la que se le había administrado OMN.
La figura 11 es un diagrama que muestra un protocolo de tratamiento de ratas de LC.
ss La figura 12 es un diagrama fotográfico que muestra la tinción con azán de hígado de rata de LC a la que se le había administrado VA-Lip-ARNip de gp46.
La figura 13 es un diagrama que muestra un método para extraer una parte teñida por medio de imagen de NIH (tomándose 6 posiciones al azar de una imagen teñida con azán).
60
La figura 14 es un gráfico que muestra la proporción en área ocupada por partes fibról:cas en histologia de hígado (proporción de colágeno en área, %).
La figura 15 e::; un griifico que lIlue::;!ra la cantidad de hidro;w;iprolina en tejido hep¡,jlico.
65
La figura 16 es un gráfico que muestra una curva de supervivencia para rata con cirrosis hepática a la que se le había administrado por via ¡ntraportal VA-lip-ARNip de gp46.
La figura 17 es un diagrama fotográfico que muestra tinción con azán de tejido hepático de rala con cirrosis hepática a la que se le había administrado por via intraportal VA-lip-ARNip de gp46.
5
la figura 18 es un gráfico Que muestra una curva de supervivencia para rala con cirrosis hepática a la que se le había administrado por via ¡ntraportal VA-lip-ARNip de gp46.
la figura 19 es un diagrama fotográfico Que muestra tinción con azán de tejido hepático de rata con cirrosis hepática
10 a la que se le había administrado por vía ¡ntraportal VA-lip-ARNip de gp46.
la figura 20 es un gráfico que muestra una curva de supervivencia para rata con cirrosis hepática a la que se le había administrado por via intravenosa VA-Lip-ARNip de gp46.
15 la figura 21 es un gráfico que muestra una curva de supervivencia para rata con cirrosis hepática a la que se le había administrado por vía intravenosa VA-Lip-ARNip de gp46.
la figura 22 es un diagrama fotográfico que muestra tinción con azán de tejido hepático de rata con cirrosis hepática a la que se le había administrado por vía intravenosa VA-Lip-ARNip de gp46.
20 la figura 23 es un diagrama que muestra la mejora de la eficacia de transfección de VA-Lip-ARNip de gp46 mediante RBP.
La figura 24 es un diagrama que muestra la inhibición de la transfección de VA-Lip-ARNip de gp46 mediante
25 anticuerpo anti-RBP.
La figura 25 es un gráfico de barras que muestra el efecto de ANip de GFP sobre diversas líneas de células indr::adoras. Se establecieron líneas celulares mediante inducción por lentivirus de constructo de ADNc de HSP47 humana-GFP o ADNc de GP46 de rata-GFP en HEK293, línea celular de fibrosarcoma humano HT1080, linea de
30 HSC humano hTERT o línea de células NRK. Se introdujo ANip de control negativo o ANip frente a GFP en las células y se midió la fluorescencia de GFP. Los resultados mostraron que ANip frente a GFP atenúa la fluorescencia en un grado diferente en diferentes líneas celulares. Se seleccionaron las líneas celulares 293_HSP47-GFP y 293_GP46-GFP para el examen de siHsp47 debido a su facilidad para transfectarse y sensibilidad a la atenuación de la fluorescencia.
35
Las figuras 26A, 26B, 26C y 26D son una serie de gráficos de barras que muestran la citoloxicidad y eficacia de atenuación de diversos siHsp47 en lineas celulares 293_HSP47-GFP y 293_GP46-GFP. El resultado mostró que siHsp47-C, siHsp47-2 y siHsp47-2d atenuaban eficazmente tanto HSP47 humana como GP46 de rata (el homólogo de
hsp47 humana) sin citotoxicidad sustancial. siGp46A frente a GP46 no atenúa la HSP47 humana.
Adicionalmente, los siHsp47 recién diseñados funcionaron mejor que siGp46A en la atenuación de GP46 de rata.
La figura 27 es un gráfico de barras que muestra el efecto de atenuación de diversos siHsp47 sobre ARNm de hsp47, medido mediante qPCR de TaqMan® usando la linea celular de HSC humano hTERT. El eje de las Y representa el nivel de ARNm restante de hsp47. HSP47-C fue el más eficaz entre todos los ANip de hsp47
45 sometidos a prueba.
La figura 28 es un gráfico de barras que muestra el efecto de diferentes ANip de hsp47 sobre la expresión de
colágeno I en células hTERT. El nivel de los niveles de ARNm de colágeno I se midió mediante PCR cuantitativa en
tiempo real usando una sonda TaqMan®. El eje de las Y representa el nivel de expresión de ARNm restante de
50 colágeno 1. El resultado mostró que el nivel de ARNm de colágeno I se reduce significativamente en las células tratadas con algunos de los candidatos (siHsp47-2, siHsp47-2d, y su combinación con siHsp47-1).
la figura 29 es un 9ráfico que muestra una disminución en las áreas fibróticas del hígado en animales tratados con siHSP47.
la figura 30 es un esquema del calendario de tratamiento y el métcx:lo de evaluación usados en el ejemplo 22.
La figura 31 muestra los resultados de la linción histológica con azán en el campo pulmonar. Las imágenes presentan el campo de pulmón representativo de secciones teñidas con azán de cada grupo con un aumento de
60 80X. (a) Tratamiento previo (BlM IT -'NV);(b) Rata con enfermedad (BlM IT-5W+PBS i.v.); y (c) Tratamiento (BlM IT +ARNip i.v.), (d) Simulado (solución salina-IT+PBS i.v.).
la figura 32 muestra la puntuación de fibrosis, que muestra los resultados de la evaluación de veinte campos de pulmón seleccionado al azar con un aumento de 80X para cada rata. El gr¡,jr¡co de barra reurne la puntación de
65 fibrosis de la sección teñida con azán para cada grupo. Se usaron análisis estadísticos de ANOVA de un factor, prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni usando el software Prism5.
imagen7
imagen8
imagen9
modificados (purinas y pirimidinas) tales como adenina, guanina, cilosina, uracilo. las nucleobases en una o ambas cadenas pueden modificarse con nucleobases naturales y sintéticas tales como, t.mina, xantina, hipoxantina, ¡nasina, 2-aminoadenina. 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, cualquier nucle6Udo de "base universal"; 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 5-halo-uracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y
5 citosina, 6-azo-uracilo. citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, S-halo, amino, tiol, tioalquilo. hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-trifluoromEtilo y otros uracilos y cilosinas sustituidos en 5, 7mecilguanina, desazapurinas, análogos de purinas y pirimidinas sustituidos heterociclicos, por ejemplo, aminoetiloxifenoxazina, derivados de purinas y pirimidinas (por ejemplo, derivados de 1-alquilo, 1-alquenilo, heteroaromáticos y 1-alquinila) y tautómeras de los mismos, 8-oxo-N6-metiladenina, 7·diazaxantina, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 5-(1
10 propinil)uracilo, 5-(1-propinil)citosina y 4,4-etanocitosina). Otros ejemplos de bases adecuadas incluyen bases distintas de purinilo y distintas de pirimidinilo tales como 2-aminopiridina y triazinas.
Restos de azúcar
15 Los restos de azúcar en un ácido nucleico divulgado en el presente documento pueden incluir resto de azúcar de 2'hidroxi-pentofuranosilo sin ninguna modificación. A1temativamente, los restos de azúcar pueden estar modificados tales como, resto de azúcar de 2'-desoxi-pentofuranosilo, D-ribosa, hexosa, modificación en la posición 2' del resto de azúcar de pentofuranosilo tal como 2'-0-alquilo (incluyendo 2'OMe y 2'-0-etilo), es decir, 2'-alcoxilo, 2'-amino, 2'O-alilo, 2'-S-alquilo, 2'-halógeno (incluyendo 2'-f1uoro, cloro, y tromo), 2'-metoxietoxilo, 2'-0-metoxietilo, 2'-0-2
20 metoxietilo, 2'-aliloxilo (-OCH2CH=CH2), 2'-propargilo, 2'-propilo, etinilo, etenilo, propenilo, CF, ciano, imidazol, carboxilato, tioato, alquilo inferior de C, a CIO, alquilo inferior sustituido, alcarito o aralquito, OCF3, OCN, 0-, S-o Nalquilo; 0-, S-o N-alquenilo; SOCH3; S02CH3; ON02; N02, N3; heterocicloalquilo; heterociclcalcarilo; aminoalQuilamino; polialquilamino o sililo sustituido, tal como se describe, entre otros, por ejemplo, en las patentes europeas EP0586520 o EP0618925.
El grupo alquilo incluye grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, bulilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de cadena ramificada (isopropilo, terc-butilo, isobutilo, etc.), grupos cicloatquilo (aliciclicos) (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicbheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En
30 determinadas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o cadena ramificada tiene seis o menos álomos de carbono en su estructura principal (por ejemplo, Cl-Ce para cadena lineat, C3-Ce para cadena ramificada), y más preferiblemente cuatro o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos pueden tener desde tres hasta ocho átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen cinco o seis carbonos en la estructura de anillo. El término c,-Ce incluye grupos alquilo que contienen de uno a seis atomos de carbono. El grupo alquilo puede ser
35 un grupo alquilo sustiluido tal como restos alquilo que tienen sustituyentes que sustituyen a un hidrógeno en uno o más carbonos de la estNctura principal hidrocarbonada. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxilo, arilcarboniloxilo, alcoxicarboniloxilo, ariloxicarboniloxilo, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquila mino, dialquilamino,
arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (inCluyendo a1c,Jilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, arillio, tiocarboxilalo, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonalo, su1famoilo, sulJonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o un resto aromático o heteroaromático.
El grupo alcoxilo incluye grus alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos y no sustituidos unidos covalentemente a un
45 élomo de oxigeno. Los ejemplos de grupos alcoxilo incluyen g'Upos metoxilo, eloxilo, isopropiloxilo, propoxilo, buloxil0 y pentoxilo. Los ejemplos de grus alcoxilo sustituidos incluyen grupos alcoxilo halogenados. Los grupos alcoxilo pueden estar sustituidos con grupos tales como alquenilo alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxilo, arilcarboniloxilo, alcoxicarboniloxilo, ariloxicarboniloxilo, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonil0, alqui¡tiocarbonilo, alcoxilo, fosfalo, fosfonalo, fosfinato,
ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquiiamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, ¡mino, sulfhidrilo, alquillio, ariltio, tiocarboxilalo, sultalos, alquilsulfinilo, sulfonalo, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclil0, alquilarilo,
o reslos aromáticos o heleroaromáticos. Los ejemplos de grupos alcoxilo suslituidos con halógeno incluyen, pero no se limitan a, f1uorometoxilo, difluorometoxilo, trifluorometoxilo, clorometoxilo, diclorometoxilo, triclorometoxilo, etc.
55 En algunas realizaciones, el anillo de pentafuronosilo puede sustiuirse con derivados acíclicos que carecen de la unión C2'-C3' del anillo de pentafuronosilo. Por ejemplo, los aciclonucleótidos pueden sustituir el azúcar 2'desoxirribofuranosilo normalmente presente en dNMP por un grupo 2-hidroxietoximetilo.
60 Los halógenos incluyen núor, bromo, cloro, yodo.
imagen1
Las subunidades nuc!eosidicas del ácido nucleico divulgado en el presente documento pueden estar unidas entre sí 65 mediante un enlace fosfodiéster. El enlace fosfodiéster puede sustituirse opcionalmente por otras uniones. Por
ejemplo, fosforotioato, entidades de tiofosfato-D-ribosa, triéster, ticato, estructura principal con puente en 2'-5'
S
10
15
20
25
30
35
ES 2 586 593 T3
(también puede denominarse 5'-2' o 2'-5'-nucle6tido o 2'-S'-ribonucleótido), PACE, 3'(0 -5')-desoxi-3'(o -5')-liofosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenatos, 3'(0 -S')-desoxifosfinatos, boranofosfatos, 3'(0 -S'}-desoxi-3'(o 5'-)aminofosforamidatos, hidrogenofosfonatas, fosionalos, ésteres de boranofosfalo, fosforamidalos, fosionalos de alquilo o arilo y modificaciones de fosfotriéster tales como alquilfosfotriésteres, fosfotriéster, uniones con fósforo. 5'
etoxifosfodiéster, P-alquiloxifosfotriéster, metilfosfonato y uniones que no contienen fósforo, por ejemplo, uniones de carbonato, carbamato, sililo, azufre, sulfonato, sulfonamida, formacetal, lioformacetilo, oxima, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo y metilenoximetilimino.
las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden incluir una estructura principal de
ácido nucleico peplídico (ANP). la estructura principal de ANP incluye unidades de N-(2-aminoetil}-glicina de repetición unidas mediante enlaces peptidicos. las diversas bases tales como purina, pirimidina, bases naturales y sintéticas están unidas a la estructura principal mediante enlaces de metilencarbonilo.
imagen1 Fosfatos terminales
Pueden realizarse modificaciones en los grupos fosfato terminales. Pueden usarse ejemplos no limitativos de diferentes químicas de estabilización, por ejemplo, para estabilizar el extremo 3' de secuencias de ácido nucleico, incluyendo desoxirribosa invertida (3'-3'); desoxirribonucleótido; (5'-3')-3'-desoxirribonucleótido; (5'-3'}-ribonucieótido; (5'-3')-3' -O-m etil-ribonucleótido; 3' -glicerilo; (3'-5 ')-3'-desoxirribonucleótido; (3 '-3')-desoxirribonucleótido; (5'-2')
desoxirribonucleótido; y (5-3')-didesoxirribonucleótido. Además, pueden combinarse químicas de estructura principal no modificada con una o más modificaciones de estructura principal diferentes descritas en el presente documento.
los grupos fosfato terminales químicamente modificados a modo de ejemplo incluyen los mostrados a continuación:
_
- -y 9
·O-p-O-O-r-O-O-f-O
,
_O QM. M.
o
s -I-
imagen10 11 Q-P-QO-p-O
I
O-r-o-CI
B I H
-y
O--CD,
Equivalente de acido sulfónico o
equivalente de vanadilo con
O
cualquier combinación de otras
modifICaCIones en el presente
documenlo
los nucleótidos y las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANip) modificados lal como se
proporciona en el presente documento pueden incluir conjugados, por ejemplo, un conjugado unido covalentemente a la molécula de ácido nucleico químicamente modificada. los ejemplos no limitativos de conjugados incluyen conjugados y ligandos descritos en Vargeese et al., documento estadounidense con n.o de serie 10/427.160. El conjugado puede estar unido covalentemente a una molécula de ácido nucleico (tal como una molécula de ANip) mediante un grupo de unión biodegradable. la molécula de conjugado puede estar unida al extremo 3' de cualquiera de la cadena sentido, la cadena antísentido, o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico quimicamente modificada. la molécula de conjugado puede estar unida al exlremo 5' de cualquiera de la cadena sentido, la cadena antisenlido. o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico químicamente modificada. la molécula de conjugado puede estar unida tanto al extremo 3' como al extremo 5' de cualquiera de la cadena sentido, la cadena anlisentido, o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico químicamente modificada, o cualquier combinación
imagen11
imagen12
molécula de ácido nucleico es monocatenaria, el porcentaje de rrodificación puede basarse en el número total de nucle6tidos presentes en la molécula de ácido nucleico monocatenaria. Asimismo, si la molécula de ácido nuc1eico es bicatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número lotal de nucleótidos presentes en la cadena sentido, cadena antisenlido, o las cadenas tanto sentido como antisentido.
las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden incluir ARN no modificado como porcentaje de los nucleótidos totales en la molécula de ácido nucleico. Como tal, una molécula de acido nucleico puede incluir de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 100 ''lode nucleótidos mooificados (por ejemplo, aproximadamente el 5 %, el lO %, el 15 %, el20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el
60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %o el 100 % de los nucleótidos totales presentes en una molécula de ácido nucleico).
Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo. una molécula de ANip) puede incluir una cadena sentido que incluye de aproximadamente una a aproximadamente cinco, de manera especifica aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 uniones
internucleotídicas de fosforotioato, yfo uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, o más) 2'-desoxílo, 2'OMe, 2'-desoxi-2'-fluoro, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, o más) nucleótidos universales con bases modificadas, y opcionalmente una molécula de ocupación de centros reactivos terminal en el extremo 3', el extremo 5', o los extremos tanto 3' como 5' de la cadena sentido; y en la que la cadena antisentido incluye de aproximadamente una a aproximadamente cinco o más, de manera especifica aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5, o más uniones internucleotídicas de fosforotioato, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8,9, 10 o más) 2'-desoxilo, 2'OMe, 2'-desoxi-2'-fluoro, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos universales con bases modificadas, y opcionalmente una molécula de ocupación de centros reactivos terminal en el extremo 3'. el extremo 5'. o los exlremos tanto 3' como 5' de la cadena antisentido. Una molécula de ácido nucleico puede incluir aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, nucleótidos de
pirimidina de la cadena de ácido nucleico sentido y/o antisentido que están químicamente modificados con 2'-desoxi, 2'OMe y/o 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, con o sin de aproximadamente una a aproximadamente cinco o más, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, o más uniones internucleotidicas de fosforotioato y/o una molécula de ocupación de centros reactivos terminal en el extremo 3', el extremo 5', o los extremos tanto 3' como 5', que está presente en la misma cadena o una cadena diferente.
Una molécula de ácido nucleico puede incluir de aproximadamente una a aproximadamente cinco o más (de manera especifica aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, o más) uniones internucleolidicas de fosforotioato en cada cadena de la molécula de ácido nucleico.
Una molécula de ácido nucleico puede incluir uniones internucleolidicas 2'-5', por ejemplo, en el extremo 3', el extremo 5', o los extremos tanto 3' como 5' de una o ambas cadenas de secuencia de ácido nucleico. Además, la(s) unión/uniones internucleotidica(s) 2'-5' puede(n) estar presente(s) en diversas otras posiciones dentro de una o ambas cadenas de secuencia de ácido nUCleico, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más incluyendo cada unión internucleotidica de un nucleótido de pirimidina en una o ambas cadenas de la molécula de ANip puede incluir una unión internucleotídica 2'-5', o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más incluyendo cada unión intemucleotídica de un nucleótido de purina en una o ambas cadenas de la molécula de ANip puede incluir una unión intemucleolídica 2'-5'.
Una molécula de ácido nucleico de interferencia pequer"io (ANip) químicamente modificada puede incluir una región antisentido, en la que cualquier (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótido de pirimidina presente en la región antisentido es nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina), y en la que cualquier (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótido de purina presente en la región antisentido es nucleótido de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina).
Una molécula de ácido nucleico de interferencia pequeño (ANip) químicamente modificada puede incluir una región antisentido, en la que cualquier (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótido de pirimidina presente en la región antisentido es nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina), y en la que cualquier (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótido de
purina presente en la región antisentido es nucleótido de 2'OMa-purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos
de purina son nucleótidos de 2'OMe-purina o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'OMe-purina).
Una molécula de ANip químicamente modificada capaz de mediaren la interferencia de ARN (iARN) frente a hsp47 dentro de una célula o sistema in vitro reconstituido puede incluir una región senlido, en la que uno o más nucleutitlo:; de pirimitlina pre:;ente:; en la regiun :;entitlo :;un nucleutitlo:; de 2'-tlewxi-2'-nuoro-pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina), y uno
imagen13
imagen14
imagen15
cadena anlisenlido o en la cadena tanlo sentido como antisentido.
A continuación se muestran patrones de ácido nucleico generales en los que X = nucleótido de cadena sentido en la región de düplex; X. = nucleótido de proyección en 5' en la cadena sentido; Xt, = nucleótido de proyección en 3' en la
5 cadena sentido; Y= nucleótido de cadena anlisentido en la región de dúplex; Y. =nucle6tido de proyección en 3' en la cadena antisentido; Yb = nucleótido de proyección en S' en la cadena antisentido; y f..A = un nucle6tido modificado en la región de dúplex. Cada a y b son independientemente de Oa 8 (por ejemplo, O, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u al. Cada X,
Y.a y b están independ.entemente modificados o no modificados. Las cadenas sentido y antisentido pueden tener cada una independientemente 17-49 nucleótidos de longitud. los ejemplos proporcionados a continuación tienen
10 una región de dúplex de 19 nucleótidos; sin embargo, las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden tener una región de dúplex en cualquier punto entre 17 y 49 nucle6tidos y en las que cada cadena tiene independientemente entre 17 y 49 nudeótidos de longitud.
S' X,xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX.
3' y.yyyyyyyyyyyyYyYYYYYY.
1S A continuación se muestran patrones de moléculas de ácido nucleico a modo de ejemplo adicionales en los que X = nucleólidos de cadena sentido no modificados; x '" un nude6lido de proyección no modificado en la cadena sentido; y = nucleólidos de cadena anlisentido no modificados; y =un nucleótido de proyección no modificado en la cadena antisentido; y M un nucle6tido modificado. las cadenas sentido y anlisentido pueden tener cada una=
20 independientemente 17--49 nucleótidos de longitud. los ejemplos proporcionados a continuación tienen una región de dúplex de 19 nucle6lidos; sin embargo, las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden tener una región de dúplex en cualquier punto entre 17 y49 nucleótidos y en la que cada cadena tiene independientemente entre 17 y 49 nucleótidos de longitud.
S' MDXXXXXXXKXMXXXXXXXXXMD
3' MDYYYYYYYYYYYYYYYYYMD
S' XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' YYYYYYYYYMYyyyyyyyy
S' .XXXXXXXXMMXXXXXXXXX
3' YYY''LYYYYYYYYY'iYYYYY
S' XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
'iYYYYYYYMMYYYYYYYYY
S' XXXXXXXXXMXXXXXXXXK
YYYYYYYYYMYYYYYYYYY
2S
3'
XXXXXXXXXXXXXMXXXX
MYYYYYYYYYYYYYYYYY
S'
3'
las moléculas de extremos romos en ambos extremos con ácidos nucleicos modificados alternantes. Los ácidos nucleicos modificados pueden estar ubicados en cualquier posición a lo largo de
5'
3'
5'
3'
5'
3'
imagen16
3'
5'
5'
XMMMXMMMXMMMXMMMXMM
3' MMMYMMMYMMM
Moléculas de ácido nucleico con un extremo 5' romo y un extremo con proyección de extremo 3' con un único ácido
10 nucleico modificado.
Moléculas de ácido nucleico con una proyección de extremo 5' y un extremo 3' romo con un único ácido nucleico modificado.
15 Las moléculas de ácido nucleico con proyecciones en ambos extremos y todas las proyecciones son ácidos nucleicos modificados. En el patrón inmediatamente a continuación, M es n número de ácidos nucleicos modificados, en el que n es un número entero de desde Ohasta 8 (es decir, O, 1,2,3,4,5,6,7 Y 8).
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM
3' MYYyyyyyyyyyyyyyyyyy
20 las moléculas de ácido nucleico con proyecciones en ambos extremos y algunos nucleótidos de proyección son nucleótidos modificados. En los patrones inmediatamente a continuación, M es n número de nucleólidos modificados, x es n número de nucleótidos de proyección no modificados en la cadena sentido, y es n número de nucleótidos de proyección no modificados en la cadena antisentido, en los que cada n es independientemente un
25 número entero de desde O hasta 8 (es decir, O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Y 8), Y en los que cada proyección tiene como máximo 20 nucleólidos; preferiblemente como máximo 8 nucleólidos (modificados y/o no modificados).
imagen17
5' xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' YYYYYYYYYYYYYYYYYYYMy
5' xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
5'
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYMyM
xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' YYYYYYYYYYYYYYYYYYYMyMy
3'
xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
YYYYYYYVYYYYYYVYYYYMyMyM
3'
xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYHyMyMy
5' xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' YY'iYYYYYYYYYYYYYYYYMyMyMyM
5'
xXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYMyMyMyMy
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
3' MYyyyyyyyyyyyyyyyyyy
3'
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
yMYYYYYYY'iyyyyyyyyyyy
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx 3' MyMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
5'
yMyMYYY.YYYYYYYYYYYYYYYY
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
5'
MyMyMYYYYYYYYYYYYVYYYYYY
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
yMyMyMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
3' MyMyMyMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
yMyMyMyMYYYYYY.YYYYYYYYYYYYY
Nucleótidos modificados en el extremo 3' de la región sentido.
XXXXXXXXXXXXXXXXXX""
3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
5 3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMM
3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5' xXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMMM
5' YYYVYYYYYYYYYYYYYVY
XXXXXXXXX·XXXXXXXXXXMMMMM
3' VYVyyyyyyyyyyyyyyyy
5' xxxxxxxXXXXXXXXXXXXMMMMMM
3' YYVYYYYYYYYYYYYYVYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMMMMMMM
3' YYYYYYYYVVyyyyyyyyy
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMMMMMMM
3' VYYVYYYVYVyyyyyyyyy
Proyección en el extremo 5' de la región sentido.
5' MXXXXXXXXxxXXXXXXXXX
3' YYYYYYYYYVYYYVyyyyy
5' MMXXXXXxXxxxxxxxXXXXX
3' YYYYYYYYYYYVyyyyyyy
3' "MMMXxxxxxxxxxxxxxXXXXX YYYYYYYVYYYYYYYYVYV
5' MMMMXxxxxxxxxxxxxxxxxxx
3' YYYYVyyyyyyyyyyyyyy
5' MMMMMXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5' MMMMMMXxxxxxxxxxxxxxxxxxx
3' YYYYYYYYYYVYYYYYYVY
5' MMMMMMMXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' YVYYYYYVYYYYYVyyyyy
5' MMMMMMMMXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
5 3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
Proyección en el extremo 3' de la región antisentido.
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3' K'iyyyyyyyyyyyyyyyyyy
10
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
MMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy
XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
MMMMYYYYYYYYYYYYYYy'yy;yy
XXXXXXXXXXXXxxXXXXX 5' XXXXXXXXXXXXXXXXX,XX
3' yyyyyyyyyyyyyyyyyy
5'
3' MMMMMYYYY'iYYYYYYYYYYYYYY
3'
XXXXXXXXXXXXXxXXXXX
MMMMMMYYYY'f.·YYYYYYYyYYYYYy
5' xxxxxxxxxxxxxxxxxxx
MMMMMMMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5' XXXXXXXXXXXXXXxx,XXx
3' MMMMMMMMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy
Nucleótido(s) modificado(s) dentro de la región sentido.
yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5' oxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
5 3' MMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy
A continuación se proporcionan moléculas deácido nucleico a modo de ejemplo junto con la estructura general equivalente en línea con los símbolos usados anteriormente:
10 ARNip de siHSP47-C frente a hsp47 humana y de rata que tiene una región de dúplex de 19 nucleótidos (es decir, 19 meros) y proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y antisentido.
5' GGACAGGCCUCUACAACUAdTdT 3 '
3' dTdTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
3'MMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy
15 ARNip de siHSP47-Cd frente a hsp47 humana y de rata que tiene una región de dúplex de 25 meros, una proyección de 2 nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido y 2 nucleótidos modificados en las posiciones 5'-terminal y penúltima en 5' de la cadena sentido.
5' GGCAGGCCUCUACAACUACUACdGdA 3' 3' UUCCUGUCCGGAGAUGUUGAUGAUGCU 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3'
3' yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5'
XXXXXXXXXMXXXXXXXXX
3'
yyyyyyyyyyyyyyyyyyy
5'
XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3'
YYYYYYYYYMYyyyyyyyy
5'
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
ARNip de siHSP47-1 frente a AONc 719-737 de hsp47 humana y de rata Que tiene una región de dúplex de 19 meros, y proyecciones de 2 nucle6tidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas
sentido y antisentido.
5'
CAGGCCUCUACAACUACUAdTdT 3'
3'
dTdTGUCCGGAGAUGUUGAUGAU 5'
5'
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3'
'
MMYYVVVyyyyyyyyyyyyyy 5
ARNip de siHSP47-1d frenle a AONc 719-743 de hsp47 humana que tiene 25 meros con un extremo romo en el
extremo 3' de la cadena sentido y una proyección de 2 nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido, y 2
nucleótidos modificados en las posiciones 5'-terminal y penúltima en 5' de la cadena sentido.
5'
CAGGCCUCUACAACUACUACGACdGdA 3' '
5
UtlGUCCGGAGAtlGUUGAUGAUGCUGCU
'5
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3' 3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
ARNip de siHSP47-2 frente a ADNc 469-487 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 19 meros, y proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y
15 antisentido,
'5
GAGCACUCCAAGAUCAACUdTdT
3' dTdTCUCGUGAGGUUCUAGUUGA
5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3'
MMYYyyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
ARNip de siHSP47-2d frente a AONc 469-493 de hsp47 humana Que tiene una región de dúplex de 25 meros con un
20 extremo romo en el extremo 3' de la cadena sentido y una proyección de 2 nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido, y 2 nucleótidos modificados en las posiciones S'-terminal y penúltima en 5' de la cadena sentido.
5' GAGCACUCCAAGAUCAACUUCCGdCdG 3' 3' UUCUCGUGAGGUUCUAGUUGAAGGCGC 5'
'5
'
5XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
yyyyyy'yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy
3'
ARNip de rata de siHSP47-2d frente a AONc 466-490 de Gp46 de rata Que tiene una región de dúplex de 25 meros
con un extremo romo en el extremo 3' de la cadena sentido y una proyección de 2 nucie6lidos en el extremo 3' de la
cadena antisentido, y 2 nucleótidos modificados en las posiciones 5'-terminal y penúltima en 5' de la cadena sentido.
3'
GAACACUCCAAGAUCAACUUCCGdAdG 3'
UUCUUGUGAGGÚllCUAGUUGAAGG.CUC 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXx
3' yyyyyyyyyy.yyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
ARNip de siHSP47-3 frente a AONc 980-998 de hsp47 humana Que tiene una región de dúplex de 19 meros, y proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y
35 antisentido.
5' CTGAGGCCATTGACAAGAAdTdT 31 51
3' dTdTGACUCCGGUAACUGUUCUU
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3' '
MMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5
ARNip de siHSP47-3d frente a ADNc 980-1004 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 25 meros con un extremo romo en el extremo 3' de la cadena sentido y una proyección de 2 nucle6tidos en el extremo 3' de la cadena antisentido, y 2 nucleótidos modificados en las posiciones 5'-terminal y penúltima en 5' de la cadena sentido.
5I I
CTGAGGCCATTGACAAGAACAAGdGdC 3
3' UUGACUCCGGUAACUGUUCUUGUUCCG 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXxMM 3'
3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
5 ARNip de siHSP47-4 frente a ADNc 735-753 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 19 meros, y proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y anlisenlido.
10
5' CUACGACGACGAGAAGGAAdTdT 3'
3' dTdTGAUGCUGCUGCUCUUCCUU 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3'
yyyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
ARNip de siH$P47-4d frente a ADNc 735-759 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 25 meros con un extremo romo en el extremo 3' de la cadena sentido y una proyecci6n de 2 nucle6tidos en el extremo 3' de la cadena
15 antisentido, y 2 nucleótidos modificados en las posiciones S'-terminal y penúltima en 5' de la cadena sentido.
S' CUACGACGACGAGAAGGAAAAGCdTdG 3'
3' UUGAUGCUGCUGCUCUUCCUUUUCGAC S'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM' 3'
3' yyYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY' S'
ARNip de siHSP47-S frente a ADNc 621-639 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 19 meros, y
20 proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y antisentido.
S' GCCACACUGGGAUGAGAAAdTdT 3'
3' dTdTCGGUGUGACCCUACUCUUU 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3'
MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5'
25 ARNip de siHSP47-6 frente a ADNc 446-464 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 19 meros, y proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y antisentido.
5'
GCAGCAAGCAGCACUACAAdTdT 3'
3'
dTdTCGUCGUUOGOCGUGAUGUU S'
5'
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM 3'
30
3' MMYyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
ARNip de siHSP47-7 frente a ADNc 692-710 de hsp47 humana que tiene una región de dúplex de 19 meros, y proyecciones de 2 nucleótidos modificados (es decir, desoxinucleótido) en los extremos 3' de las cadenas sentido y antisentido.
5'
imagen1 CCGUGGGUGUCAUGAUGAUdTdT
3'
dTdTGGCACCCACAGUACUACUA 5'
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM
MMYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 5'
imagen18
la cadena sentido de un sustrato de Dicer puede tener entre de aproximadamente 22 a aproximadamente 30 (por ejemplo, aproximadamente 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30); de aproximadamente 22 a aproximadamente 28; de aproximadamente 24 a aproximadamente 30; de aproximadamente 25 a aproximadamente 30; de aproximadamente 26 a aproximadamente 30; de aproximadamente 26 y 29; o de aproximadamente 27 a aproximadamente 28 5 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones preferidas los sustratos de Dicer contienen cadenas sentido y anlisenlido, Que tienen al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y no más de aproximadamente 30 nucle6tidos; entre aproximadamente 26 y 29 nuCleÓtidOS; o 27 nucleótidos de longilud. las cadenas sentido y antisentido pueden tener la misma longitud (extremos romos), diferentes longitudes (tener proyecciones), o una combinación. las cadenas sentido y antisentido pueden existir en el mismo polinucleótido o en polinucleótidos
diferentes. Un sustrato de Dicer puede tener una región de dúplex de aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 27 nucleótidos.
Como otras moléculas de ANip proporcionadas en el presente documento, la cadena antisentido de un sustrato de Dicer puede tener cualquier secuencia que se hibride con la cadena antisentido en condiciones biológicas, tales
como dentro del citoplasma de una célula eucariota.
los sustratos de Dicer pueden tener cualquier modificación en base de nUcleótido, azúcar o estructura principal de fosfato tal como se conoce en la técnica y/o tal como se describe en el presente documento para otras moléculas de acido nucleico (tales como moléculas de ANip).En determinadas realizaciones, los suslratos de Dicer pueden tener
una cadena sentido que se modifica para el procesamiento por Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la cadena sentido, es decir, el ARNbc esta diseñado para dirigir la orientación de la unión y procesamiento de Dicer. los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos. aciclonucleótidos y similares y moléculas con impedimento estérico. tales como moléculas fluorescentes y similares. los aciclonucleólidos sustituyen el azúcar de 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en dNMP por un grupo 2-hidroxietoximetilo. Otros modificadores de nucleótidos que pueden usarse en moléculas de ANip de sustrato de Dicer incluyen 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC), 2',3'-dideshidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T) y los nucleótidos de monofosfato de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AlT), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC) y 2',3'-dideshidro2',3'-didesoxitimidina (d4T). En una realización, se usan desoxinucleótidos como modificadores. Cuando se usan
modificadores de nucleótidos, pueden sustituir a ribonucleótidos (por ejemplo, los ribonucleótidos se sustituyen por 1-3 modificadores de nucleótidos, o 2 modificadores de nucleólidos, en el extremo 3' de la cadena sentido) de tal manera que la longitud del sustrato de Dicer no cambia. Cuando se usan moléculas con impedimento estérico, pueden unirse al ribonucleótido en el extremo 3' de la cadena antisentido. Por tanto, en determinadas realizaciones la longitud de la cadena no cambia con la incorporación de los modificadores. En determinadas realizaciones, dos
35 bases de ADN en el ARNbc se sustituyen para dirigir la orientación del procesamiento de Dicer de la cadena antisentido. En una realización adicional, dos ribonucleótidos se sustituyen por dos bases de ADN terminales en el extremo 3' de la cadena sentido formando un extremo romo del dúplex en el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentidO, y una proyección de ARN de dos nucleótidos se ubica en el extremo 3' de la cadena antisenlido. Esto es una composición asimétrica con ADN en el extremo romo y bases de ARN en el extremo con proyección.
En determinadas realizaciones se incluyen modificaciones en el sustrato de Dicer de tal manera que la modificación no impide que la molécula de ácido nucleico sirva como sustrato para Dicer. En una realización, se realizan una o mas modificaciones que potencian el procesamiento de Dicer del sustrato de Dicer. Pueden realizarse una o más
45 modificaciones que dan como resultado una generación de iARN mas eficaz. Pueden realizarse una o mas modificaciones que soportan un mayor efecto de iARN. Se realizan una o más modificaciones que dan como resultado una mayor potencia por cada sustrato de Dicer que se suministra a la célula. Pueden incorporarse modificaciones en la región 3'-terminal, la región S'-terminal, en la región tanto 3'-terminal como S'-terminal o en diversas posiciones dentro de la secuencia. Puede incorporarse cualquier número y combinación de modificaciones en el sustrato de Dicer siempre que la modificación no impida que la molécula de ácido nUcleico sirva como sustrato para Dicer. Cuando hay múltiples modificaciones presentes, pueden ser iguales o diferentes. Se contemplan modificaciones en bases, restos de azúcar, la estructura principal de fosfato, y sus combinaciones. Cualquier extremo S'-terminal puede fosforilarse.
55 los ejemplos de modificaciones en la estructura principal de fosfato de sustratos de Dicer incluyen fosfonatos, incluyendo metilfosfonato, fosforotioato, y modificaciones de fosfotriéster tales como alquilfosfotriésteres, y similares. los ejemplos de modificaciones en el resto de azúcar de sustratos de Dicer incluyen modificaciones de 2'alquilpirimidina, tal como 2'OMe, 2'-fluoro, amino, y desoxi y similares (véase, por ejemplo, Amarzguioui el al., 2003). los ejemplos de modificaciones en el grupo de base de sustratos de Dicer incluyen azúcares abásicos, pirimidinas modificadas con 2-0-alquilo, 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo y 5-(3-aminoalil)-uracilo y similares. También pueden incorporarse ANB.
la cadena sentido puede modificarse para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en el eldrerno 3' de la cadena senLido, es decir, el sustrato de Dice! esLe<. dijjado para dirigir lel orienLelción de uniun
65 y procesamiento de Dicer. los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tares romo desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, aciclonucleótidos y similares y moléculas con impedimento estérico, tales como moléculas
fluorescentes y similares. los aciclonucleótidos sustituyen el azúcar de 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en dNMP por un grupo 2-hidroxieloxime\i10. Otros modificadores de nucle6tidos pueden incluir cordicepina, AlT, ddl, 3TC, d4T y los nucle6tidos de monofosfato de AlT, 3TC y d4T. En una realización, se usan desoxinucleólidos como modificadores. Cuando se usan modifeadores de nucleótidos, los ribonucleólidos se 5 sustituyen por 1-3 modificadores de nucleótidos, o 2 modificadores de nucleótidos, en el extremo 3' de la cadena sentido. Cuando se usan moléculas con impedimento estérico, se unen al ribonucle6lido en el extremo 3' de la cadena antisenlido. Por tanto, la longitud de la cadena no cambia con ra incorporación de los modificadores. En otra realización, la descripción contempla sustituir dos bases de ADN en el sustrato de Dicer para dirigir la orientación del procesamiento de Dicer de la cadena antisentido. En una realización adicional de la presente descripción, dos
10 ribonucleótidos se sustituyen por dos bases de ADN terminales en el extremo 3' de la cadena sentido formando un extremo romo del dúplex en el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido, y una proyección de ARN de dos nucleótidos se ubica en el extremo 3' de la cadena antisentido. Esto es una composición asimétrica con ADN en el extremo romo y bases de ARN en el extremo con proyección.
15 la cadena antisentido puede modificarse para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la cadena antisentido, es decir, el ARNbc se diseña para dirigir la orientación de la unión y procesamiento de Dicer. los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucle6tidos, aciclonucleótidos y similares y moléculas con impedimento estérico, tales como moléculas fluorescentes y similares. Los aciclonucleótidos sustituyen el azúcar de 2'
20 desoxirribofuranosilo normalmente presente en dNMP por un grupo 2-hidroxietoximetilo. Otros modificadores de nucleótidos pueden incluir cordicepina, AZT, ddl, 3TC, d4T Y los nucleótidos de monofosfato de AZT, 3TC y d4T. En una realización, se usan desoxinucleótidos como modificadores. Cuando se usan modificadores de nucleótidos, los ribonucleótidos se sustituyen por 1-3 modificadores de nucleótidos. o 2 modificadores de nucleótidos. en el extremo 3' de la cadena antisentido. Cuando se usan moléculas con impedimento estérico, se unen al ribonucleótido en el
25 extremo 3' de la cadena antisentido. Por tanto, la longitud de la cadena no cambia con la incorporación de los modificadores. En otra realización, la descripción contempla sustituir dos bases de ADN en el ARNbc para dirigir la orientación del procesamiento de Dicer. En una descripción adicional, dos bases de ADN terminales se ubican en el extremo 3' de la cadena antisentido en lugar de dos ribonucleótidos formando un extremo romo del dúplex en el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido, y una proyección de ARN de dos
30 nucleótidos se ubica en el extremo 3' de la cadena sentido. Esta es una composición asimétrica con ADN en el extremo romo y bases de ARN en el extremo con proyección.
Pueden unirse sustratos de Dicer con una cadena sentido y una antisentido mediante una tercera estructura. La tercera estructura no bloqueará la actividad de Dicer sobre el sustrato de Dicer y no interferirá con la destrucción
35 dirigida del ARN transcrito a partir del gen diana. La tercera estructura puede ser un grupo de unión quimico. En la técnica se conocen grupos de unión qulmicos adecuados y pueden usarse. Alternativamente, la tercera estructura puede ser un oligonucleótido que une los dos oligonucleótidos del ARNbc de tal manera que se produce una estructura de horquilla tras la hibridación de los dos oligonucleótidos constituyendo el sustrato de Oicer. La estructura de horquilla preferiblemente no bloquea la actividad de Dicer sobre el sustrato de Dicer ni interfiere con la
40 destrucción dirigida del ARN transcrito a partir del gen diana.
No se requiere que las cadenas sentido y antisentido del sustrato de Dicer sean completamente complementarias. Solo se necesita que sean sustancialmente complementarias para hibridarse en condiciones bilógicas y proporcionar un sustrato para Dicer que produzca un ARNip lo suficientemente complementario con respecto a la secuencia
45 diana.
El sustrato de Dicer puede tener determinadas propiedades que JX)tencian su procesamiento por Dicer. El sustrato de Dicer puede tener una longitud suficiente de tal manera que se procesa por Dicer para producir moléculas de ácido nucleico activas (por ejemplo, ARNip) y puede tener una o más de las siguientes propiedades: el sustrato de
Dicer es asimétrico, por ejemplo, tiene una proyección en 3' en la primera cadena (cadena antisentido) y/o el sustrato de Oicer tiene un extremo 3' modificado en la segunda cadena (cadena sentido) para dirigir la orientación de unión y procesamiento de Dicer del sustrato de Dicer para dar un ARNip activo. El sustrato de Dicer puede ser asimétrico de tal manera que la cadena sentido incluye 22-28 nucleótidos y la cadena antisenlido incluye 24-30 nucleótidos. Por tanto, el sustrato de Oicer resultante tiene una proyección en el extremo 3' de la cadena antisentido.
55 La proyección tiene 1-3 nucleótidos, por ejemplo, dos nucleótidos. La cadena sentido también puede tener un 5' fosfato.
Un sustrato de Dicer puede tener una proyección en el extremo 3' de la cadena antisentido y la cadena sentido se modifica para el procesamiento de Oicer. El extremo 5' de la cadena sentido puede tener un fosfato. Las cadenas
60 sentido y antisentido pueden hibridarse en condiciones biológicas, tales como las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula. Una región de una de las cadenas, particularmente la cadena antisentido, del sustrato de Oicer puede tener una longitud de secuencia de al menos 19 nudeótidos, en la que estos nucle6tidos están en la región de 21 nucleótidos adyacente al extremo 3' de la cadena antisentido y son lo suficientemente complementarios a una sel;uencia de nucleulidos del ARN producido a partir del gen diana. Un sustralo de Dice!" Lambién puede Lener
65 una o más de las siguientes propiedades adicionales: la cadena antisentido tiene un desplazamiento a la derecha a partir de una cadena de 21 meros correspondiente (es decir, la cadena antisentido incluye nucleótidos en el lado
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de señales o expresión génica que está implicada, por ejemplo, en el mantenimiento o el desarrollo de enfermedades, características o estados descritos en el presente documento. Estos genes adicionales pueden analizarse para determ;nar sitios diana usando los métodos descritos para el gen de hsp4 7 en el presente documento. Por lanto, la modulación de olros genes y los efectos de tal modulación de los airas genes pueden
rea'izarse, determinarse y medirse tal como se describe en el presente documento.
En una realización, las romposiciones y los métodos proporcionados en el presente documento incluyan una molécula de ácido nucleico de interferencia pequeño (ANip) bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen de hsp47 (por ejemplo, hsp47 humana mostrada a modo de ejemplo mediante SEO ID NO: 1), en los que la
molécula de ácido nucleico incluye de aproximadamente 15 a aproximadamente 49 pares de bases.
En una realización, un ácido nucleico divulgado puede usarse para inhibir la expresión del gen de hsp47 o una familia de genes de hsp47 en el que los genes o las secuencias de la familia de genes comparten homologia de secuencia. Tales secuencias homólogas pueden identificarse tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, usando
alineaciones de secuencias. Pueden disei'lare moléculas de ácido nucleico para seleccionar como diana tales secuencias homólogas, por ejemplo, usando secuencias perfectamente complementarias ° incorporando pares de bases no canónicos, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o pares de bases con titubeo que pueden proporcionar secuencias diana adicionales. En casos en los que se identifican apareamientos erróneos, pueden usarse pares de bases no canónicos (por ejemplo, apareamientos erróneos y/o bases con titubeo) para generar moléculas de ácido
nucleico que seleccionan como diana más de una secuencia de gen. En un ejemplo no limitativo, se usan pares de bases no canónicos tales como pares de bases UU y CC para generar moléculas de ácido nucleico que son capaces de seleccionar como diana secuencias para diferentes dianas de hsp47 que comparten homologia de secuencia. Como tales, una ventaja de usar ANip divulgados en el presente documento es que puede diseñarse un único ácido nucleico para incluir una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se
conserva entre los genes homólogos. En este enfoque, puede usarse un único ácido nucleico para la inhibir la expresión de más de un gen en lugar de usar más de una molécu a de ácido nucleico para seleccionar como diana los diferentes genes.
Pueden usarse moléculas de ácido nucleico para seleccionar como diana secuencias cmservadas correspondientes
a una familia de genes o familias de genes tales como genes de la familia de hsp4 7. Como tales, moléculas de ácido nucleico que seleccionan como diana múltiples dianas de hsp47 pueden proporcionar un efecto terapéutico aunentado. Además, puede usarse ácido nucleico para caracterizar rotas de la función génica en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, pueden usarse moléculas de ácido nuceico para inhibir la actividad de gen(es) diana en una rota para determinar la función de gen(es) no caracterizados en el anélisis de la función génica, anélisis de la
función de ARNm o análisis de traducción. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para determinar posibles rutas de genes diana implicadas en diversas enfermedades y estados hacia el desarrollo farmacéutico. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para enlender rutas ::le expresión génica ilT1plicadas, por ejelT1plo, en fibrosis tales como fibrosis de higado, de riñón o pulmonar, y/o caracteristicas, enfermedades, trastornos y/o estados inflamatorios y proliferati'los.
En una realización, las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento incluyen una molécula de ácido nucleico que tiene actividad de iARN frente a ARN de hsp47, en los que la molécula de écido nucleico incluye una secuencia complementaria a cualquier ARN que tiene una secuencia que codifica hsp47, tal como las secuencias que tienen secuencias tal como se muestran en la tabla 3. En otra realización, una molécula de ácido nucleico puede tener actividad de iARN frente a ARN de hsp47, er la que la molécula de ácido nucleico incluye una seruencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia que codifica hsp4 7 variante, por ejemplo, otros genes de hsp47 mutantes no mostrados en la tabla 3 pero que se sabe en la técnica que están asociados con el mantenimiento y/o desarrollo de fibrosis. Pueden aplicarse modificaciones químicas tal como se muestra en la tabla 3 o descritas de otro modo en el presente documento a cualquier constructo de ácido nucleico divulgado en el
presente documento. En otra realización, una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento incluye una secuencia de nucleótidos que puede interaccionar con la secuencia de nucle6tidos de un gen de hsp4 7 y de ese modo mediar en el silenciamiento de la expresión génica de hsp47, por ejemplo, en la que la molécula de ácido nucleico media en la regulación de la expresión génica de hsp47 mediante procesos celulares que modulan la estructura de cromatina o los patrones de metilación del gen de hsp47 y previenen la transcripción del gen de hsp47.
Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden tener actividad de iARN frente a ARN de hsp47, en las que la molécula de ácido nUcleico incluye una secuencia complementaria a cualquier ARN que tiene una secuencia que codifica hsp47, tal como aquellas secuencias que tienen los n.os de registro de GenBank NM_001235. Las moléculas de ácido nucleico pueden tener actividad de iARN frente a ARN de hsp47, en las que la
molécula de ácido nucleico incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia que codifica hsp47 variante, por ejemplo, otros genes de hsp47 mutantes que se sabe en la tecnica que están asociados con el mantenimiento y/o desarrollo de fibrosis.
Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento incluyen una secuencia de nucleótidos que
puede interaccionar con una secuencia de nucleótidos de un gen de hsp47 y de ese modo mediar en el silencia miento de la expresión génica de hsp47, por ejemplo, en las que la molécula de ácido nucleico media en la
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hsp47 en el sujeto u organismo.
Un método para tratar o prevenir una o más fibrosis seleccionadas del grupo que consiste en fibrosis hepática, fibrosis renal, y fibrosis pUlmonar en un sujeto u organismo puede incluir poner en contaclo el sujeto u organismo con una molécula de ácido nucleico en cond:ciones adecuadas para modular la expresión del gen de hsp47 en el sujeto u organismo.
Enfermedades fibróticas
Las enfermedades fibr61icas se caracterizan generalmente por el exceso de depósito de un malerial fibroso dentro de la matriz exlracelular, lo cual contribuye a cambios anómalos en la arquitectura del tejido e interfiere con la función normal del órgano.
Todos los tejidos dañados por traumatismo responden mediante el inicio de un programa de cicatrización de heridas.
la fibrosis, un tipo de trastorno caracterizado por cicatrización excesiva, se produce cuando el proceso normal de remisión espontánea de la respuesta de cicatrización de heridas se ve alterado, y provoca un exceso de producción y depósito de colágeno. Como resultado, el tejido normal del órgano se sustituye por tejido cicatricial, lo cual conduce finalmente al fallo funcional del órgano.
La fibrosis puede iniciarse por diversas causas y en diversos órganos. Cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, sarcoidosis, queloides y fibrosis renal son todos estados crónicos asociados con fibrosis progresiva, provocando de ese modo una pérdida continua de la función normal del tejido.
Se produce fibrosis aguda (habitualmente con una apariCión repentina e intensa yde corta duración) como
respuesta común a diversas formas de traumatismo incluyendo lesiones por accidentes (particularmente lesiones a la médula espinal y el sistema nervioso central), infecciones, cirugía, enfermedad isquémica (por ejemplo, cicatrización cardiaca tras un ataque al corazón), quemaduras, contaminantes medioambientales, alcohol y otros tipos de toxinas, sindrome de dificultad respiratoria aguda, tratamientos por radiación y quimioterapia).
La fibrosis, una patología relacionada con fibrosis o una patobgía relacionada con reticulación aberrante de proteínas celulares, pueden tratarse todas ellas mediante los ARNip divulgados en el presente documento. Las enfermedades fibróticas o enfermedades en las que la fibrosis es evidente (patología relacionada con fibrosis) incluyen formas tanto agudas como crónicas de fibrosis de órganos, incluyendo todas las variantes etiológicas de las siguientes: fibrosis pulmonar, incluyendo enfermedad pulmonar intersticial y enfermedad pulmonar fibrótica, fibrosis hepática, fibrosis cardiaca incluyendo fibrosis de miocardio, fibrosis renal incluyendo insuficiencia renal crónica, fibrosis cutánea incluyendo esclerodermia, queloides y cicatrices hipertróficas; mielofibrosis (fibrosis de médula ósea); todos los tipos de cicatrización ocular incluyendo vitreorretinopatia proliferativa (PVR) y cicatrización resultante de cirugía para tratar cataratas o glaucoma; enfermedad inflamatoria del intestino de etiología variable, degeneración macular, oflalmopatía de Grave, ergotismo inducido por fármacos, cicatrices queloides, esclerodermia, psoriasis, glioblastoma en síndrome de Li-Fraumeni, glioblastoma esporádico, leucemia mieloide, leucemia mielógena aguda, sindrome mielodispléSiCO, sindrome mieloproferativo, céncer ginecológico, sarcoma de Kaposi, enfermedad de Hansen y colitis colagenosa.
En diversas realizaciones, los compuestos (moléculas de ácido nucleico) tal como se divulgan en el presente documento pueden usarse para tratar enfermedades fibróticas, por ejemplo, tal como se divulgan en el presente documento, así como muchas otras enfermedades y estados aparte de enfermedades fibróticas, por ejemplo, tal como se divulgan en el presente documento. Otros estados que van a tratarse incluyen enfermedades fibróticas en otros órganos: fibrosis renal por cualquier motivo (CKD incluyendo ESRD); fibrosis de pulmón (incluyendo ILF); mielofibrosis, cicatrización anómala (queloides) asociada con todos los posibles tipos de lesión cutánea por
accidente y yatrogénica (operaciones); esclerodermia; cardiofibrosis, insuficiencia de la operación de filtrado de glaucoma; adhesiones intestinales.
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Con frecuencia puede producirse contractura de tejido cicatricial resultante de la cirugia ocular. la cirugía del glaucoma para crear nuevos canales de drenaje con frecuencia no tiene éxito debido a la cicatrización y contracción de tejidos y el sistema de drenaje generado puede bloquearse requiriendo una intervención quirúrgica adicional. Los regímenes anlicicalrización actuales (milomicina C o 5FU) están mitados debido a las complicaciones implicadas (por ejemplo, ceguera), véase, por ejemplo, Cordeiro MF, el al.,Human anti-transforming growth factor-beta2
antibody: a new glaucoma anti-scarring agent Invest Ophthalmol Vis Sci. septiembre de 1999; 40(10):2225-34.
También puede formarse contracción de tejido cicatricial tras traumatismo corneal o cirugia corneal, por ejemplo, tratamiento por láser o quirúrgico para miopía o error refractario en el que la contracción de tejidos puede conducir a resultados poco precisos. Puede formarse tejido cicatricial sobre/dentro del humor vitreo o la retina, por ejemplo, y puede provoCi:lr finalmente ceyuera en alguno::; diaut:lico::;, y puede forrnar::;e Ira::; cirugii:l por desprendimiento, denominada vitreorretinopalía proliferativa (PVR). PVR es la complicación más común tras desprendimiento de retina y está asociada con una rotura u orifICio retiniano. PVR se refiere al crecimiento de membranas celulares
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manera activa por células estrelladas; los ejemplos de retinoide incluyen, pero no se lim lan a, trelinoina, adapaleno, palmitato de retinol, y en particular vitamina A, vitamina A saturada, ácido retinoico, y retina!. los ejemplos del conjugado de retinoide incluyen conjugados de PEG-retinoide. La presente descripción aprovecha la propiedad de células estrelladas de incorporar de manera positiva un retinoide y/o un conjugado de retinoide, y usando el retinoide
5 y/o conjugado de relinoide como portador de fármaco o uniéndolo a o incluyéndolo en otro componente de portador de fármaco. se transpona un material o cuerpo deseado específicamente a células estrelladas. Un retinoide es un miembro de la clase de compuestos que tienen un esqueleto en el que cuatro unidades de isoprenoide están unidas de una manera cabeza a cola. Véase G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents·, 2' ed. Portland Press. págs. 247-251 (1992). la vitamina A es un término descriptivo genérico para un retinoide que
10 muestra cualitativamente la actividad biológica de retinol. El retinoide en la presente descripción fomenta el suministro de sustancia especifica a una célula cancerosa y un CAF (es decir. la sustancia se dirige a esas células). Un retinoide de este tipo no está particularmente limitado. y los ejemplos del mismo incluyen relinol, vitamina A, vitamina A saturada, retinal, ácido retinoico, un éster de relinol y un ácido graso, un éster de un alcohol alifático y ácido relinoico. etretinalo, trelinoína, isotretinoína. adapaleno, acitretina, lazaroteno, y palmilato de retinol, y
análogos de vitamina A tales como fenretinida, y bexaroteno. los conjugados de retinoide incluyen conjugados de PEG, por ejemplo, diVA-PEG-diVA, mostrados en la siguiente estructura.
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20 Por tanto, el portador de fármaco de la presente descripción puede contener un componente de portador de fármaco distinto de un relinoide y/o conjugado de retinoide. Un componente de este tipo no está particularmente limitado. y puede usarse cualquier componente conocido en los campos de a medicina y la farmacia, pero es preferible que sea capaz de incluir un retinoide y/o conjugado de retinoide. los ejemplos de un componente de este tipo incluyen un I[pido, por ejemplo, un fosfolípido tal como glicerofosfolipido, un esfingolípido tal como esfingomielina, un esterol
tal como colesterol, un aceite vegetal tal como aceite de semilla de soja o aceite de semilla de adormidera. aceite mineral, y una lecitina tal como lecitina de yema de huevo, pero los ejemplos no se limitan a los mismos. Entre ellos, se prefieren aquellos que pueden formar un liposoma, por ejemplo, fosfolípidos naturales tales como lecitina, fosfolípidos semisintéticos tales como dímiristoilfosfatidilcolina (OMPC), dipalmitoitfosfatidilcotina (OPPC) y diestearoilfosfatidilcolina (DSPCl, y colesterol.
30 Además, el portador de fármaco de la presente descripción puede contener una sustancia que mejora la incorporación en células estrelladas, por ejemplo, proteína de unión a relinol (RBP).
la unión o inclusión del relinoide y/o conjugado de retinoide con el portador de fármaco de la presenle descripción
35 también puede llevase a cabo uniendo o incluyendo el relinoide y/o conjugado de retino:de con aIro componente del portador de fármaco medianle métodos Químicos y/o físicos. Alternativamente, la unión o inclusión del retinoide y/o conjugado de retinoide con el portador de fármaco de la presente descripción también puede llevarse a cabo mezclando el retinoide y/o conjugado de retinoide que tiene componentes del portador de fármaco básicos y de afinidad de formación, en los componentes de portador de fármaco durante la preparación del portador de fármaco.
40 la cantidad de retinoide y/o conjugado de retinoide unido a o incluido en el portador de fármaco de la presente descripción puede ser del 0,01 % al 100 % como proporción en peso con respeclo a los componentes de portador de fármaco, preferiblemente del 0,2 % al 20 % Y más preferiblemente del 1 % al 5 %.
los sistemas de suministro de ácido nucleico pueden incluir, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas,
múltiples emulsiones, microemulsiones, liposomas, pomadas, disoluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, polvos y bases de hidrocarburos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes, potenciadores de la permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos), y polimeros hidrófilos (por ejemplo, policarbófilo y polivinilpirrolidona). En una realización, el portador farmacéulicamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico. los ejemplos de liposomas que
50 pueden usarse en esta descripción incluyen los siguientes:
• CellFectin, una formulación de liposoma 1:1,5 (M/M) del lipido cati6nico N,NI,NII,NI"-tetramelil-N,NI.N",NI"letrapalmitilespermina y dioleoil-fosfalidiletanolamina (DOPE) (GIBCO BRl);
55 • Cylofectin GSV, una formulación de liposoma 2: 1 (MlM) de un lípido catiónico y DOPE (Glen Research);
• OOTAP (etilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)-N,N,N-tri-metil-amonio) (Boehringer Manheim);
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cuerpo Que suministra el presente portador de fármaco no está particularmente limitado, pero preferiblemente tiene un tamaño que permite el movimiento físico en un organismo vivo desde un sitio de administración hasta el hígado, páncreas, etc., en el que están presentes las células estrelladas. Por tanto, el portador de fármaco de la presente descripción puede transportar no solo un material tal como un átomo, una molécula, un compuesto, una proteína, o
5 un ácido nucleico sino también un cuerpo tal como un vector, una partícula de virus, una célula, un sistema de liberación de fármaco constituido por uno o más elementos, o una micromáquina. El material o cuerpo tiene preferiblemente la propiedad de ejercer algún efecto sobre células estrelladas, y ejemplos del mismo incluyen uno que marca células estrelladas y uno que controla la actividad o el crecimiento de células estrelladas.
Por lanlo, en una realización de la presente descripción, es un fármaco para controlar la actividad o el crecimiento de células estrelladas lo que suministra el portador de fármaco. Esto puede ser cualquier fármaco que inhibe directa
o indirectamente las acciones fisicoquimicas de células estrelladas implicadas en la promoción de fibrosis, y ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la actividad de TGFI} tales como un receptor de TGFIl tipo 11 truncado y un receptor de TGFI} tipo 11 soluble, preparaciones de factores de crecimiento tales como 15 HGF y vectores de expresión para los mismos, promotores de la producción de MMP tales como un vector de adenovirus que contiene gen de MMP, inhibidores de la producción de TIMP tales como un ácido nucleico de TlMP antisentido, un ligando de PPARy, inhibidores de la activación celular y/o inhibidores del crecimiento celular tales r.omo un inhihidor dA I r.lividd dA ngioten!;in, un inhihidor dA 111r.tividd de PDGF, Y un inhihidor de (,.Rnles dA sodio, y también inductores de la apoptosis tales como compuesto 861 y gliotoxina, adiponectina, y un compuesto que tiene actividad inhibidora de Rho cinasa tal como (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexano. Además, el fármaco para controlar la actividad o el crecimiento de células estrelladas en la presente descripción puede ser cualquier fármaco que promueve directa o indirectamente las acciones fisicoquímicas de células estrelladas directa o indirectamente implicadas en la inhibición de fibrosis, y ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, un fármaco para promover un sistema de degradación de colágeno, por ejemplo, promotores de la
25 producción de MMP tales como un vector de expresión de MMP, HGF, Y fármacos que tienen actividad de tipo HGF tales como análogos de HGF y vectores de expresión para los mismos.
Otros ejemplos del fármaco para controlar la actividad o el crecimiento de células estrelladas en la presente descripción incluyen un fármaco para controlar el metabolismo de una matriz extracelular tal como colágeno, por
ejemplo, una sustancia que tiene un efecto de inhibir la expresión de una molécula diana, tal como ARNip, ribozima, y ácido nucleico anlisentido (inCluyendo ARN, AON, ANP, y un material compuesto de los mismos), una sustancia que tiene un efecto negativo dominante, y vectores que expresan los mismos, Que seleccionan como diana, por ejemplo, una molécula constituyente de la matriz extracelular producida por células estrelladas o seleccionan como diana una o más moléculas que tienen la función de producir o secretar la molécula constituyente de la matriz
35 extra celular.
la presente descripción también se refiere a un medicamento para tratar un trastorno relacionado con células estrelladas, conteniendo el medicamento el portador de fármaco y el fármaco para controlar la actividad o el crecimienlo de células estrelladas, y se refiere al uso del portador de fármaco en la producción de una composición farmacéutica para tratar un trastorno relacionado con células estrelladas. El trastomo relacionado con células estrelladas al que se hace referencia en el presente documento significa un Iraslorno en el que las células estrelladas están directa o indirectamente implicadas en el proceso del trastorno, es decir, la aparición, exacerbación, mejora, remisión, cura, etc. del trastorno, y los ejemplos de los mismos incluyen trastornos hepáticos tales como hepatitis, en particular hepatitis crónica, fibrosis hepática, cirrosis hepática, y cáncer de higado, y
trastornos pancreáticos tales como pancrealitis, en particular pancreatitis crónica, fibrosis pancreática, y cáncer pancreático.
En el medicamento de la presente descripción, el portador de fármaco puede incluir un fármaco en su interior, estar unido al exterior de una sustancia que contiene fármaco, o mezclarse con un fármaco siempre que el retinoide y/o
conjugado de retinoide incluido en el portador de fármaco esté al menos parcialmente expuesto en el exterior de la preparación antes de Que alcance las células estrelladas como muy tarde. Por tanto, dependiendo de la vía de administración o la manera en la que se libera el fármaco, el medicamento puede cubrirse con un material apropiado, tal como, por ejemplo, un recubrimiento entérico o un material Que se disgrega a lo largo del tiempo, o puede incorporarse en un sistema de liberación de fármaco apropiado.
55 Por tanto, la presente descripción incluye un portador de fármaco o kit de preparación de medicamento Que contiene uno o más recipientes que contienen uno o más de un constituyente de portador de fármaco, un retinoide y/o un conjugado de retinoide, y/o un fármaco, y también incluye un componente esencial para el portador de fármaco o el medicamento proporcionado en forma de un kit de este tipo. El kit de la presente descripción puede contener, además de los descritos anteriormente, una descripción, etc. en la Que se describe un método de preparación o un método de administración para el portador de fármaco y el medicamento de la presente descripción. Además, el kit de la presente descripción puede contener todos los componentes para completar el portador de fármaco o el medicamento de la presente descripción pero no contiene necesariamente todos los componentes. Por tanto, no es necesario que el kit de la presente descripción contenga un reactivo o un disolvente que está normalmente
65 disponible en el lugar de tratamiento médico, una instalación de experimentación, etc. tal como, por ejemplo, agua estéril, solución salina o una disolución de glucosa.
La presente descripción se refiere además a un método para tratar un trastorno relacionado con células estrelladas, incluyendo el método administrar una cantidad eficaz del medicamento a un sujeto que lo necesita. Lacantidad eficaz a la que se hace referencia en el presente documento es una cantidad que suprime la aparición del trastorno
diana, reduce los síntomas del mismo, o previene la progresión del mismo, y preferiblemente es una cantidad que previene la aparición del trastorno diana o cura el trastorno diana. También es preferiblemente una cantidad Que no provoca un efecto adverso que supere el beneficio de la administración. Una cantidad de este tipo puede determinarse según sea apropiado mediante una prueba in vitro usando células en cultivo, etc. o mediante una prueba en un animal de modelo tal como un ratón, una rata, u perro o un cerdo, y tales métodos de prueba los
conoce bien un experto en la técnica.
En el método de la presente descripción, el término ·sujeto significa cualquier individuo vivo, preferiblemente un animal, más preferiblemente un mamifero, y aún más preferiblemente un individuo humano. En la presente descripción, el sujeto puede estar sano o afectado por algún trastorno, y en el caso de que se pretenda tratamiento
de un trastorno, el sujeto normalmente significa un sujeto afectado por el trastorno o que tiene riesgo de verse afectado.
Además, el término tratamiento incluye todos los tipos de intervención profiláctica y/o terapéutica médica mente aceptable con el propósito de la cura, remisión temporal, prevención, etc. de un trastorno. Por ejemplo, cuando el trastorno es fibrosis hepática, el término ·tratamiento incluye la inlervención médicamente aceptable para diversos fines incluyendo retrasar o detener la progresión de fibrosis, regresión o desaparición de lesiones, prevención de la aparición de fibrosis, o prevención de la recidi'¡a.
la presente descripción también se refiere a un método para suministrar un fármaco a células estrelladas usando el
portador de fármaco. Este método incluye, pero no se limita a, una etapa de soportar una sustancia que va a suministrarse sobre el portador de fármaco, y una etapa de administrar o añadir el portador de fármaco que porta la sustancia Que va a suministrarse a un medio u organismo vivo que contiene células estrelladas, tal como, por ejemplo, un medio de cultivo. Estas etapas pueden lograrse según sea apropiado según cualquier método conocido, el método descrito en la presente memoria descriptiva, etc. Este método de suministro puede combinarse con otro
método de suministro, por ejemplo, otro método de suministro en el que un órgano en el que están presentes células estrelladas es la diana, etc.
las moléculas de ácido nucleico pueden estar adaptadas para su uso para prevenir o tratar enfermedades, características, estados y/o trastornos de fibrosis (por ejemplo, de hígado, de riñón, peritoneal y pulmonar), y/o
cualquier otra característica, enfermedad, trastorno o estado que está relacionado con, o responderá a, los niveles de hSp47 en una célula o tejido, solas o en combinación con otras terapias. Una molécula de ácido nucleico puede incluir un vehículo de suministro, incluyendo liposomas, para su administración a un sujeto, portadores y diluyentes y sus sales, yfo puede estar presente en formulaciones farmacéuticamente aceptables.
las moléculas de ácido nucleico de la descripción pueden incluir secuencias mostradas en la tabla 3. Ejemplos de tales moléculas de acido nucleico consisten esencialmente en secuencias proporcionadas en la tabla 3.
las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse mediante suministro pulmonar, tal como mediante inhalación de un aerosol o pulverización de formulación seca administrada mediante un dispositivo de inhalación o nebulizador, proporcionando una rápida captación local delas moléculas de ácido nucleico en tejidos pulmonares relevantes.
Pueden prepararse composiciones particuladas sólidas que contienen partículas secas respirables de composiciones de ácido nucleico micronizadas triturando composiciones de ácido nudeico secadas o liofilizadas, y después haciendo pasar la composición micronizada a través, por ejemplo, de un tamiz de 400 de malla para descomponer o separar aglomerados grandes. Una composición particulada sólida que comprende las
composiciones de ácido nucleico de la descripción puede contener opcionalmente un dispersante que sirve para facitar la formación de un aerosol así como otros compuestos terapéuticos. Un dispersante adecuado es lactosa, que puede combinarse con el compuesto de ácido nucleico en cualquier proporción adecuada, tal como una proporción de 1 con respecto a 1 en peso.
los aerosoles de partículas líquidas pueden incluir una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento y pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.o 4.501.729). los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman disoluciones o suspensiones de un principio activo en una niebla de aerosol terapéutica o bien por medio de aceleración de un gas comprimido, normalmente aire u oxígeno, a través de un orificio estrecho de tipo
Venluri o bien por medio de agitación por ultrasonidos. las formulaciones adecuadas para su uso en nebulizadores incluyen el principio activo en un portador liquido en una cantidad de hasta el 40 % plp, preferiblemente menos del 20 % p/p de la formulación. El portador es normalmente agua o una disolución alcohólica acuosa diluida, preferiblemente que se vuelve isotónica con los liquidas corporales mediante la adición, por ejemplo, de cloruro de sodio u otra:; :;ales adecuadas. Lo:; aditivos opcionale:; incluyen con:;ervante:; :;i la rormulaciun no se prepara de
manera estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, aromatizantes, aceites volátiles, agentes tamponanles y emulsionantes y otros tensioactivos de formulación. Los aerosoles de partículas sólidas que incluyen
la composición activa y lensioacliva también pueden producirse con cualquier generador de aerosol particulado sólido. Los generadores de aerosol para administrar productos terapéuticos particulados sólidos a un sujeto producen partículas que son respirables, tal como se explicó anteriormente, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de una composición terapéutica a una velocidad adecuada para la 5 administración a humanos. Un tipo ilustrativo de generador de aerosol particulado sólido es un insuflador. las formulaciones adecuadas para administración mediante insuflación incluyen pOlvos finamente triturados Que pueden suministrarse por medio de un insuflador. En el insuflador, el porvo, por ejemplO, una dosis medida del mismo eficaz para llevar a cabo los tratamientos descritos en el presente documento, está contenido en cápsulas o cartuchos, normalmente compuestos por gelatina o plástico, que o bien se perforan o bien se abren in situ y el pOlvo se
10 suministra mediante aire extraído a través del dispositivo tras la inhalación o por medio de una bomba accionada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste o bien únicamente en el principio activo o bien en una combinación en polvo que comprende el principio activo, un diluyente en polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensioactivo opcional. El principio activo incluye normalmente desde 0,1 hasta 100 plp de la formulación. Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo incluye un inhalador de dosis medida. los inhaladores de dosis
medida son dispensadores de aerosol a presión, que contienen normalmente una formulación en suspensión o disolución del principio activo en un propelente licuado. Durante el uso estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para suministrar un volumen medido para producir una pulverización de partículas finas que contiene el principio activo. los propelentes adecuados incluyen determinados compuestos de clorofluorocarbono, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los
20 mismos. La formulación puede contener adicionalmente uno o más codisolventes, por ejemplo, etanol, emulsionantes y otros tensioactivos de formulación, tales como ácido oleico o trioleato de sorbitano, antioxidantes y agentes aromatizantes adecuados. Otros métodos para el suministro pulmonar se describen, por ejemplo, en los documentos U820040037780. U86592904. U86582728 Y U86565885. El documento W008132723 se refiere al suministro mediante aerosol de oligonucleótidos en general, y de ARNip en particular, al sistema respiratorio.
25
las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse al sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP). Experimentos han demostrado la captación eficaz in vivo de ácidos nucleicos mediante neuronas. Véase, por ejemplo, Sommer el al., 1998, Anlisense Nuc. Acid Drug Dev., 8:75; Epa el al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10:469; Broaddus el al, 1998, J. Neurosurg., 88:734; Karle el al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340:153;
30 Bannai el al., 1998, Cerebro Research, 784:304; Rajakumar el al., 1997, Synapse, 26:199; Wu-pong el al., 1999, BioPharm, 12:32; Bannai el al., 1998, Cerebro Res. Proloc., 3:83; y Simanlov el al., 19B6, Neuroscience, 74:39. Por lanlo, las moléculas de ácido nUcleico son susceplibles de suministro a, y caplación por, células en el SNC y/o SNP.
El suministro de moléculas de ácido nucleico al SNC se proporciona mediante una variedad de estrategias
35 diferentes. Los enfoques tradicionales para el suministro al SNC que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, administración intratecal e intracerebroventricular, implantación de catéteres y bombas, inyección directa o perfusión en el sitio del daño o la lesión, inyección en el sistema arterial cerebral, o mediante apertura química u osmótica de la barrera hematoencefálica. Otros enfoques pueden incluir el uso de diversos sistemas de transporte y portador, por ejemplo, mediante el uso de conjugados y polímeros biodegradabes. Además, pueden usarse enfoques de terapia
40 génica, por ejemplo, tal como se describe en Kaplilt el al., patente estadounidense n.O 6.180.613 y Davidson, documento WO 04f01 3280, para expresar moléculas de ácido nucleico en el SNC.
Pueden formularse o complejarse moléculas de ácido nucleico con polietilenimina (por ejemplo, PEI lineal o ramificada) y/o derivados de polietilenimina, incluyendo, por ejemplo, PEI injertadas tales como galactosa-PEI,
45 colesterol-PEI, PEI derivatizada con anticuerpos, y derivados de polietilenglicol-PEI (PEG-PEI) de los mismos (véase, por ejemplo, Ogris el al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11; Furgeson el al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath el al., 2002, Pharm Res 19:81 0-17; Choi el al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22:46-52; Bettinger el al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:558-561, Peterson el al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:845-54; Erbacher el al., 1999, J Gene Med 1:1-18; Godbey el al., 1999., PNAS, 96:5177-81; Godbey el al., 1999, J Controlled Release,
60:149-60; Diebold el al., 1999, J Biol Chem, 274:19087-94; Thomas el al., 2002, PNAS, 99, 14640-45; Y Sagara, patente estadounidense n.o 6.586.524).
las moléculas de ácido nucleico pueden incluir un bioconjugado, por ejemplo, un conjugado de ácido nucleico tal
O
como se describe en Vargeese el al., documento estadounidense con n.de serie 10/427.160; patente
55 estadounidense n.o 6.528.631; patente estadounidense n.o 6.335.434; patente estadounidense n.o 6.235.886; patente estadounidense n.o 6.153.737; patente estadounidense n.o 5.214.136; patente estadounidense n.o
5.138.045.
las composiciones, los métodos y los kits divulgados en el presente documento pueden incluir un vector de
60 expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ácido nucleico de la descripción de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico. los métodos de introducir moléculas de ácido nucleico o uno o más vectores capaces de expresar las cadenas de ARNbc en el entorno de la célula dependerán del tipo de célula y la composición de su entorno. la molécula de ácido nucleico o el constructo de vedor pueden inlroduGir:;¡e direGlamenle en la céluli:J (es deGÍr, de manera inLri:JGeluli:Jr); o inLrotluGirse tle nmneri:J
65 extracelular en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducirse por vla oral, o pueden introducirse bañando un organismo o una célula en una disolución que contiene ARNbc. la célula es preferiblemente una célula de mamífero: más preferiblemente una célula humana. la molécula de ácido nucleico del vector de expresión puede incluir una región sentido y una región antisentido. La región antisentido puede incluyen una secuencia complementaria a una secuencia de ARN o AON que codifica hsp47 y la región sentido puede incluir una secuencia complementaria a la región antisentido. La molécula de aeido nucleico puede incluir dos cadenas
5 distintas que tienen regiones sentido y anlisenlido complementarias. La molécula de ácido nucleico puede incluir una única cadena Que tiene regiones sentido y antisentido complementarias.
las moléculas de écido nucleico Que interaccionan con moléculas de ARN diana y regulan por disminución el gen que codifica moléculas de ARN diana (por ejemplo, moléculas de ARN diana mencionadas en los números de
10 registro de Genbank en el presente documento) pueden expresarse a partir de unidades de transcripción insertadas en 'lectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores viricos. Pueden construirse vectores viricos que expresan moléculas de ácido nucleico basándose en, pero sin limitarse a, virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus, o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ácido nucleico pueden suministrarse tal como se describe en el presente documento. y persistir en células diana.
15 Alternativamente, pueden usarse vectores víricos que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Tales vectores pueden administrarse de manera repetida según sea necesario. Una vez expresadas, las moléculas de ácido nucleico se unen y regulan por disminución la función o expresión génica mediante interferencia de ARN (iARN). El suministro de vectores que expresan moléculas de ácido nucleico puede ser sistémico, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana explantadas de un
20 sujeto seguida por reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que permitirá la introducción en la célula diana deseada.
Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento, de una manera que permite la expresión de la molécula de
25 ácido nucleico. Por ejemplo, el vector puede contener secuencia(s} que codifica(n) ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico que incluyen un dúplex. El 'lector también puede contener secuencia(s) que codifica(n) una única molécula de ácido nucleico que es complementaria consigo misma y por tanto forma una molécula de ácido nucleico. Se describen ejemplos no limitativos de tales vectores de expresión en Paul el al., 2002, Nature Biotech 19, 505; Miyagishi el al., 2002, Nature Biotech 19, 497; Lee el al., 2002, Nature Biotech 19, 500; Y Novina el al., 2002, Nature Med:10.1 038fnm725. También pueden incluirse vectores de expresión en una célula de mamífero (por ejemplo, humana),
Un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica dos o más moléculas de ácido nucleico, que pueden ser iguales o diferentes. Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia para una
35 molécula de ácido nueleico complementaria a una molécula de ácido nueleico a la que se hace referencia mediante un número de registro de Genbank NM_001235, por ejemplo, las mostradas en la tabla 2.
Un vector de expresión puede codificar una o ambas cadenas de un dúplex de ácido nucleico, o una única cadena complementaria consigo misma que se hibrida consigo misma para dar un dúplex de ácido nucleico. Las secuencias
40 de ácido nucleico que codifican moléculas de ácido nucleico pueden unirse operahvamente de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleieo (véaSe, por ejemplO, Paul el al., 2002, Nature Biotech, 19:505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Bioteeh 19:497; Lee el al., 2002, Nature Bioteeh 19:500; y Novina el al., 2002, Nalure Med, 10.1038Jnm725),
45 Un vector de expresión puede incluir uno o más de los siguientes: al una región de inicio de la transcripción (por ejemplo, región de inicio pol i, 11o 111eucariota); b) una región de terminación de la transcripción (por ejemplo, región de terminación pol i, 11o 111eucariota); el un intrón y d) una secuencia de ácido nueleico que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico, en el que dicha secuencia está operativamente unida a la región de inicio y la de terminación de una manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de ácido nueleico. El
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50 vector puede incluir opcionalmente un marco de lectura abierto (ORF) para una proteína operativamente unida al lado 5' o al lado 3' de la secuencia que codifica la molécula de ácido nucleico; ylo un intrón (secuencias intermedias).
La Iranscripción de las secuencias de moléculas de ácido nucleico puede impulsarse a partir de un promotor para
55 ARN polimerasa I (poi 1)eucariota, ARN polimerasa II (poi 11),o ARN polimerasa 111(poi 111).Los transcritos de promotores poi 11o poi 111se expresan a altos niveles en todas las células; los niveles de un promotor poi 11dado en un tipo de célula dado depende de la naturaleza de las secuencias reguladoras del gen (potenciadores, silenciadores, etc.) presentes cerca. También se usan promotores de ARN polimerasa eucariotas, siempre que la enzima ARN polimerasa procariota se exprese en las células apropiadas (Elroy el al., 1990, PNAS, 87:6743-47; Gao
60 el al., 1993, Nucleic Aeids Res 21:2867-72; Lieber el al., 1993, Methods Enzymol., 217:47-66; Zhou el al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4529-37). Varios investigadores han demostrado que moléculas de ácido nucleico expresadas a partir de tales promotores pueden funcionar en células de mamífero (por ejemplo, Kashani-Sabet el al., 1992, Antisense Res. Dev., 2:3-15; Ojwang el al., 1992, PNAS 89:10802-06; Chen el al., 1992, Nucleie Acids Res., 20:4581-89; Yu el al, 1993, PNAS, 90:6340-44; L'Huillier el al., 1992, EMBO J., 11:4411-18; li:;,iewicz el al., 1993, PNAS 90: 8000-04;
65 Thompson el al., 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259; Sullenger el al., 1993, Science, 262:1566). Más específicamente, unidades de transcripción tales como las derivadas de genes que codifican unidad pequeña
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10 micromolar, 100 micromolar o más.
Niveles de dosificación del orden de desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal al dia son útiles en el tratamiento de los estados indicados anteriormente (de aproximadamente
5 0,5 mg a aproximadamente 7 9 por sujeto al día). La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de dosificación individual varia dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. Las formas de unidades de dosificación contienen generalmente desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg de un principio activo.
10 Se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, hora de administración, vía de administración, y tasa de excreción, combinación de fármacos e intensidad de la enfermedad particular que está sometiéndose a terapia.
15 las composiciones farmacéuticas que incluyen la molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento pueden administrarse una vez al día, qid, tid, bid, QO, o a cualquier intervalo y durante cualquier duración que sea médicamente apropiada. Sin embargo, el agente terapéutico también puede administrarse en unidades de dosificación que contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas a intervalos apropiados a lo largo de todo el día. En ese caso, las moléculas de ácido nucleico contenidas en cada subdosis pueden ser
20 correspondientemente más pequeñas con el fin de lograr la unidad de dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede estar compuesta por una única dosis a lo largo de varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona liberación sostenida y constante del ARNbc a lo largo de un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida se corneen bien en la técnica. La unidad de dosificación puede contener un múltiplo correspondiente de la dosis diaria. La composición puede estar
25 compuesta de tal manera que la suma de las unidades múltiples de un ácido nucleico juntas contienen una dosis sufciente.
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30 También se proporcionan composiciones, kits, recipientes y formulaciones que incluyen una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANip) tal como se proporciona en el presente documento para reducir la expresión de hsp47 para administrar o distribuir la molécula de ácido nucleico a un paciente. Un kit puede incluir al menos un recipiente y al menos una etiqueta. los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como
35 vidrio, metal o plástico. El recipiente puede contener secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácido nucleico, población/poblaciones celular(es) ylo anticuerpo(s). En una realización, el recipiente contiene un polinucleótido para su uso en el examen del perfil de expresión de ARNm de una célula, junto con reactivos usados para este fin. En otra realización un recipiente incluye un anticuerpo, fragmento de unión del mismo o proteína de unión específica para su uso en la evaluación de la expresión de proteína hsp47 en células y tejidos, o
40 para fines relevantes de laboratorio, pronóstico, diagnóstico, profilácticos y terapéuticos; pueden incluirse indicaciones ylo instrucciones para tares usos en o con tal recipiente, al igual que reactivos y otras composiciones o herramientas usadas para estos fines. los kits pueden incluir además indicaciones ylo instrucciones asociadas; también pueden incluirse reactivos y otras composiciones o herramientas usadas para tal fin.
45 El recipiente puede contener alternativamente una composición que es eficaz para tratar, diagnosticar, pronosticar o realizar la profilaxis de un estado y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). los agentes activos en la composición pueden ser una molécula de ácido nucleico capaz de unirse específicamente a hsp47 ylo modular la función de hsp47.
Un kit puede incluir además un segundo recipiente que incluye un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, soludón de Ringer ylo disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agiladores, agujas, jeringuillas ylo prospectos con indicaciones ylo instrucciones de uso.
55 las ampollas de dosificación unitaria o recipientes multidosis, en los que se envasan las moléculas de ácído nucleico antes de su uso, pueden incluir un recipiente herméticamente sellado que encierra una cantidad de polinucleótído o disolución que contiene un polinucleótido adecuada para una dosis farmacéutica mente eficaz del mismo, o múltiplos de una dosis eficaz. El polinucleótido se envasa como formulación estéril, y el recipiente herméticamente sellado
60 está diseñado para conservar la esterilidad de la formulación hasta su uso.
El recipiente en el que el polinucieótido que incluye una secuencia que codifica un elemento de respuesta
inmunitaria celular o fragmento del mismo puede incluir un envase que tiene una etiqueta, y la etiqueta puede llevar
Uf! aviso en la forma recomendada por una agencia gUUemarnental, por ejemplo, la Fo:xJ and Orug AdrninisLralion,
65 aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia según la ley federal, de la fabricación, el uso o la comercialización del material de polinucleótido en el mismo para su administración a humanos.
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imagen30
1d 2d
humana
2d rata
de rala humana
3d
humana humana
EJEMPLO 13
5 Con el fin de seleccionar las potentes de diversas moléculas de ANip contra los genes de hsp47 tanto humana como de rata, se establecieron diversas lineas celulares indicadoras mediante inducción por lentivirus de constructo de AONc de HSP47 humana-proteína verde fluorescente (GFP) o ADNc de GP46 de rala-GFP en lineas celulares 293, HT1080, línea de HSC humana hTERT, o NRK. Se evaluaron adicionalmente estas líneas celulares mediante ARNip contra GFP. Se midió la senal de fluorescencia restante y se normalizó con respecto a ARNip alealorizado (Ambion)
10 y posteriormente se normalizó con respecto a la viabilidad celular. los resultados mostraron que ARNip contra GFP atenúa la fluorescencia en diferentes grados en diferentes líneas celulares (figura 25). Se seleccionaron las líneas celulares 293_HSP47-GFP y 293_GP46-GFP para el examen de siHsp47 debido a su facilidad de Iransfección ysensibilidad a la atenuación de la fluorescencia.
15 Se transfectaron células con 1,5 pmol por pocillo de ANip contra GFP en placas de cultivo tisular de 96 pOCillOS usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) en un modo de transfección inversa. Se sembraron células a
6.000 células por pocillO y se mezclaron con los complejos de ANip. Se tomaron lecturas de fluorescencia tras una incubación de 72 horas con un lector de microplacas multimodal Synergy 2 (BioTek).
20 Se midieron las células tratadas con o sin ANip para determinar la viabilidad tras una incubación de 72 horas usando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo según el manual (Promega). Se normalizaron las lecturas con respecto a muestras tratadas con moléculas de ANip aleatorizado.
imagen31
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imagen35
y proporcionan un suministro eficaz a las HSC a través del receptor de RBP. Estos liposamas se captan eficazmente mediante miofibroblaslos activados que expresan receptor de RBP en los pulmones de ratones tratados con bleomicina.
5 Diseño del estudio
Ratones -eS7 B 1 macho
N inicial (BlM i.p.) -40 (para el primer grupo piloto. 34 para el estudio, teniendo en cuenta una mortalidad prevista 10 deI25 %)
N inicial (total) -60
ARNip de prueba: compuestos de SERPINHI divulgados en el presente documento.
15
TABLA 8: Grupos:
imagen36
12
En el día 14, se sacrifican dos ratones del primer grupo y se extirpan los pulmones para la tinción con HE rápida y evaluación histopatol6gica rápida de la fibrosis. Cuando se confirma la fibrosis de pulmón, se clasifican las ratas restantes en los grupos y se tralan con ARNip en el día 14 tras el primer tratamiento con BLM. En caso de que no se desarrolle fibrosis suficiente en los pulmones en el día 14, se sacrifican los ratones restantes del primer grupo tratado en el día 21, seguido por evaluación histopatol6gica rápida de la fibrosis. Se trata el resto de los animales
30 con complejo de ARNip de prueba comenzando a partir del día 21 tras el tratamiento con BlM.
Administración de ARNip. En el día 14 o el día 21 tras la primera administración de BlM (a determinar durante el estudio, basándose en la evaluación piloto del establecimiento de fibrosis), se clasifican los animales en grupos,
según el PC. A los animales de los grupos 1 y 2 se les administra por vía intravenosa (inyección en la vena de la
cola) complejo de ARNip!vi\NCoatsome, a una concentración de ARNip de 4,5 mg/kg de PC, Se tratan los animales intactos de la misma edad (grupos 5 y 6) de la misma manera. Se usarán animales tratados con BlM (grupo 9) como control de vehiculo de vitA-Coatsome. A las 24 horas, se repile la inyección a todos los animales, como anteriormente.
Los animales con BlM de los grupos 3 y 4, Y los ratones intactos de los grupos 7 y 8, se anestesian con isonuorano
imagen37
de HSP47. Para inducir estos cambios, a ratas Sprague-Dawley macho se les inyectó por via intraperitoneal DMN en seis días consecutivos. Al final del periodo de tratamiento con DMN, se aleatorizaron los animales a grupos basándose en el peso corporal de animales individuales. Se administró la muestra de liposoma como una única dosis Lv. (0,375 o 0,75 mg/kg, reflejando la dosis de ARNip) una hora tras la última inyección de DMN. Un dia
5 después, se extirparon lóbulos hepáticos y se determinaron los niveles de ARNm tanto de HSP47 como de GAPDH mediante ensayo de RT-PCR cuantitativa (TaqMan). Se normalizaron los niveles de ARNm de HSP47 con respecto a los niveles de GAPDH. Tal como se muestra en la figura 33, se detectó una reducción de ARNm robusta y dependiente de la dosis para HSP47 en el hígado. Tras una única dosis de 0,75 mglkg de NO-L02-0101, se observó una reducción del 80 % de ARNm de HSP47. lncluso a la dosis menor, de 0,375 mglkg, se observó una atenuación
significativa del 40 %.
Los solicitantes se reservan el derecho a incorporar físicamente en esta solicitud todos y cada uno de los materiales e información de cualquier artículo, patente, solicitud de patente, u otro documento fisico y electrónico.
Resultará fácilmente evidente para un experto en la técnica que pueden realizarse diversas sustituciones y modificaciones en la descripción divulgada en el presente documento sin apartarse del alcance y espíritu de la descripción. Por tanto, tales realizaciones adicionales están dentro del alcance de la presente descripción y las siguientes reivindicaciones. La presente descripción enseña a un experto en la técnica a someter a prueba diversas combinaciones ylo sustituciones de modificaciones químicas descritas en el presente documento para la generación
de constructos de ácido nucleico con actividad mejorada para mediar en la actividad de iARN. Tal actividad mejorada puede incluir estabilidad mejorada, biodisponibilidad mejorada, ylo activación mejorada de respuestas celulares que median en iARN. Por tanto, las realizaciones espeCificas descritas en el presente documento no son limitativas y un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que pueden someterse a prueba combinaciones específicas de las modificaciones descritas en el presente documento sin experimentación excesiva para identificar
25 moléculas de ácido nucleico con actividad de iARN mejorada.
Las descripciones descritas de manera ilustrativa en el presente documento pueden ponerse en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no divulgados específicamente en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, los térmínos 'un" y "una" y "ellla" y referentes similares en el
contexto de describir la descripción (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse como que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o lo contradiga claramente el contexto. Los términos "que comprende, "que tiene, "que incluye", "que contiene", etc. deben interpretarse de manera expansiva y sin limitación (por ejemplo, significando "que incluye, pero no se limita a"). Se pretende que la mención de intervalos de valores en el presente documento simplemente sirva
35 como método abreviado para hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o lo contradiga claramente de otro modo el contexto. Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos, o términos a modo de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en el presente documento, simplemente ilustre mejor la descripción y no suponga una limitación sobre el alcance de la descripción a menos que se reivindique lo contrario. No debe interpretarse que ningún término en la memoria descriptiva indica que ningún elemento no reivindicado sea esencial para la puesta en práctica de la descripción. Adicionalmente, los términos y las expresiones empleados en el presente documento se han usado como términos
45 de descripción y no de limitación, y no se pretende que el uso de tales términos y expresiones excluya ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, sino que se reconoce que diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de la descripción reivindicada. Por tanto, debe entenderse que aunque la presente descripción se ha divulgado específicamente mediante realizaciones preferidas y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de las descripciones realizadas divulgadas en el presente documento, y que se considera que tales modificaciones y variaciones están dentro del alcance de esta descripción.
La descripción se ha descrito de manera amplia y genérica en el presente documento. Cada una de las especies y agrupamientos subgenéricos más estrechos que se encuentran dentro de la divulgación genérica también forman
55 parte de la descripción. Esto incluye la descripción genérica de la descripción con una condición o limitación negativa que elimina cualquier contenido del género, independientemente de si el material extraído se menciona espeCíficamente en el presente documento o no. Otras realizaciones se encuentran dentro de las siguientes reivindicaciones. Además, cuando se describen características o aspectos de la descripción en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la descripción también se describe de ese modo en términos de miembros individuales o subgrupos de miembros del grupo de Markush.

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    , . Composición farmacéutica que comprende un portador de fármaco y una molécula de ácido nucleico bicatenario, en la que el portador de fármaco comprende una molécula de retinoide conjugada con molécula 5 de polietilenglicol. y en la que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende la estructura:
    5' (N)x · Z 3' (cadena anlisentido)
    3' Z'-(N'}y ·z 5' (cadena sentido)
    10
    en la que cada uno de N y N' es un nucleótido que puede 10 estar modificado o estar modificado. o un resto no convencional;
    en la que cada uno de (N). y (N'}y es un oligonucle6tido en el que cada N o N' consecutivo está unido al 15 siguiente N o N' mediante un enlace covalenle;
    en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente incluye independientemente 1-5 nucleótidos o restos distintos de nucleótidos consecutivos o una combinación de los mismos unidos covalentemente al extremo 3'-terminal de la cadena en la que está presente;
    20
    en la que ZR puede estar presente o ausente, pero si eslá presente es un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal de (N'),.;
    en la que cada uno de x e y es independientemente un número entero de entre 18 y 40; 25
    en la que la seruencia de (N').,. tiene complementariedad ron respecto a la secuencia de (N)x;
    en la que el resto no convencional se selecciona del grupo que consiste en un resto abásico, un resto abásico invertido, un resto hidrocarbonado y derivados de los mismos, un desoxirribonucleótido, un
    30 desoxirribonucleótido modificado, un nucleótido especular, un análogo de nucle6tido sin formación de pares de bases '1 un nucle6tido unido a un nucleótido adyacenle medianle un enlace de fosfalo internucleotidico 2'-5'; ácidos nucleicos con unión en puente, nucJeótidos con uniones modificadas '1 nucle6tidos con bases modificadas; '1
    35 en la que (N). incluye una secuencia antisentido con respecto a la secuencia codificante de ARNm para hsp47 humana mostrada a modo de ejemplo mediante SEO ID NO: 1.
  2. 2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el portador de fármaco comprende una cantidad específica de células estrelladas de la molécula de retinoide conjugada con molécula de polietilenglicol.
  3. 3.
    Composición farmacéutica según la reivindicadón 1 o 2. en la que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende secuencias oligonucleotidicas seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias SEO ID NO: 60 '1 127 (SERPINH1_2) SEO ID NO: 96 '1 165 (SERPINH1_ 45a) y SEO ID NO: 101 '1 166 (SERPINH1_51).
  4. 4.
    Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el retinoide consiste en una seleccionada del grupo que consiste en vitamina A, ácido retinoico, retinal, tretinoína, adapaleno, palmitato de retinor '1 fenretinida (4-HPR).
    50
  5. 5. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la molécula de retinoide conjugada con molécula de polietilenglicol es diVA-PEG-diVA.
  6. 6. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el retinoide está al
    55 menos parcialmente expuesto en el exterior del portador de fármaco antes de que el portador de fármaco alcance la célula estrellada.
  7. 7. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el portador de
    fármaco está en una forma seleccionada del grupo que consiste en una micela polimérica, un liposoma, una 60 emulsión, una microesfera '1 una nanoesfera.
  8. 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que el portador de fármaco está en una forma de
    una vesicula lipidica.
    65 9. Composición farmacéutica según la reivindicación B. en la que las moléculas lipídicas comprenden HEDC de la siguiente estructura:
    imagen1
  9. 10. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1·9, en la Que una cadena de la
    molécula de ácido nucleico bicatenario comprende SEO ID NO: 127 y la segunda cadena comprende SEa 10 ID NO: 60.
  10. 11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que la cadena antisentido comprende SEQ ID NO: 127, y la cadena sentido comprende SEQ ID NO: 60.
    15 12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que la cadena antisentido comprende además ribonucle6tidos modificados con 2'-Q-metilo; un 2'-5'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones 1, 5, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covl'llenlemenle al extremo 3'-termin;:¡l: y en I¡;¡ que I¡;¡ Cl'lden¡;¡ sentido comprende además al menos un 2'-5'-ribonucleótido O ribonucleótido modificado con 2'-Q-metilo; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros
    20 reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
  11. 13. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-Q-metilo en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'ribonucleótido en la poSición 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'
    25 terminal; y en la que la cadena sentido comprende además cinco 2'-5'-ribonudeótidos consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto dislinto de nucleólido unido CQvalenlemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
  12. 14. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que la cadena antisentido comprende además
    30 ribonucleótidos modificados con 2'-Q-metilo en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; Y un resto distinto de nucleótido C3C3 unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además un resto distinto de nucleólido C3Pi unido covalenlemente al extremo 3' -terminal; y un resto abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
  13. 15.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-Q-metilo en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'ribonucleótido en la poSición 7; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además cinco 2'-5'-ribonucleótidos consecutivos en las posiciones 3'-tenninales 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto distinto de nucleótido C3Pi unido
    covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto abásico invertido unido co'/alentemenle al extremo 5'terminal.
  14. 16.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que la cadena antisentido comprende además
    ribonucleótidos modificados con 2'-Q-metilo en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'ribonucleótido en la posición 7; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'O-metito en las posiciones 7, 13, 16 Y 18; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleólido C3 unido covalentemenle al extremo 3'-terminal; y un reslo abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal.
    17, Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-9. en la que una cadena de la molécula de ácido nucleico bicalenario comprende SEO ID NO: 98 y la segunda cadena comprende SEO ID NO: 165.
  15. 18.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 17, en la que la cadena sentido comprende SEO ID NO: 98 y la cadena anlisenlido comprende SEO ID NO: 165:
  16. 19.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 18, en la que la cadena sentido comprende además 2'-5'ribonucleótidos en las posiciones en o cerca del extremo 3'-terminal; un resto distinto de nucleótido unido covalentemenle al extremo 3'-terminal: y un reslo de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y la cadena anlisentido comprende además un ribonucleótido modificado con 2'-0metilo; un 2'-S'-ribonuc1eótido en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemenle al extremo 3'-terminal.
  17. 20.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 18, en la que la cadena sentido comprende ademas 2'-5'ribonucleótidos en las posiciones 15, 16, 17, 18 Y 19; un resto C3-0H 3' unido covalentemente al extremo
    3'-terminal; y un reslo de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalenlemente al extremo 5'terminal; y la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 Y 19; un 2'-5'-ribonucle6tido en la posición 7; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
  18. 21.
    Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que una cadena de la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende SEQ ID NO: 101 y la segunda cadena comprende SEQ ID NO: 168,
  19. 22.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 21, en la que la cadena senlido comprende SEO ID NO:
    25 101 y la cadena antisentido comprende SEO ID NO: 168.
  20. 23. Composición farmacéutica según la reivindicación 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos de pirimidina modificados con 2'-O-metilo; un 2'-5'-ribonucleótido opcional en una de la posición 9 o 10; un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de ocupación de centros reactivos unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y en la que la cadena antisentido comprende además un ribonucleótido modificado con 2'-Q-metilo; un 2'-5'-ribonucleótido en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7; y un resto distinto de nucleótido unido covalentemente al extremo 3'terminal.
    35 24. Composición farmacéutica según la reivindicación 22, en la que la cadena sentido comprende ademés ribonucleótidos modificados con 2'-Q-metilo en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 9; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y en la que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y 15; un 2'-5'-ribonucleólido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'terminal.
  21. 25. Composición farmacéutica según la reivindicación 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 4, 11, 13 Y 17; un resto distinto de nucleótido
    45 C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y en la que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 1, 4, 8, 13 Y 15; un 2'-5'-ribonucleótido en la posición 6; y un resto C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3' -terminal.
  22. 26. Composición farmacéutica según la reivindicación 22, en la que la cadena sentido comprende además ribonucleótidos mooificados con 2'-O-metil0 en las poSiciones 2, 4, 11, 13 Y 17; un resto distinto de nucleótido C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal; y un resto de desoxirribonucleótido abásico invertido unido covalentemente al extremo 5'-terminal; y en la Que la cadena antisentido comprende además ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo en las posiciones 1, 4, 8, 11 Y 15; un 2'-5'
    ribonucleótido en la posición 6; y un resto distinto de nucleótido C3Pi-C30H unido covalentemente al extremo 3'-terminal.
  23. 27. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, que se administra por vía parenteral.
  24. 28.
    Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad asociada con hsp47.
  25. 29.
    Composición rarmact:utica según la reivindicacióll 28 para su uso segull la reivilldicación 28, en la que la
    enfermedad asociada con hsp47 se selecciona del grupo que consiste en fibrosis de órganos y tejidos incluyendo hígado, pulmón, riñón, páncreas, piel, corazón, cerebro, intestino, colon, cuerdas vocales, peritoneo, ojo, músculo, médula ósea, hueso, ovario, uréter y útero; y cáncer y tejidos fibróticos asociados con cáncer.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 28 para su uso según la reivindicación 28, en la que la 5 enfermedad asociada con hsp47 se selecciona del grupo que consiste en fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis peritoneal, daño hepático crónico y fibrilogénes:s.
  26. 31. Composición farmacéutica según la reivindicación 28 para su uso según la reivindicación 28, en la Que la enfermedad asociada con hsp47 se selecciona del grupo que consiste en cirrosis hepática debida a
    10 hepatitis e tras trasplante de hígado o esteatohepatilis no alcohólica (NASH); fibrosis pulmonar idiopálica; neumonía por radiación que conduce a fibrosis pulmonar; nefropalia diabética; esclerosis peritoneal asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD) o penfigoide cicatricial ocular.
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