JP2010527914A - 呼吸器系への抑制性核酸分子の治療的送達 - Google Patents
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Abstract
本発明は、呼吸器系に直接的に抑制性核酸分子を送達することによる全ての型の呼吸器障害、例えば肺障害の治療方法に関する。siRNA又はその他の核酸が、疾患の治療のために肺/呼吸器系に送達される。
Description
本出願は、米国特許仮出願60/926559(2007年4月26日提出)(この記載内容はその全体が参照により本明細書中で援用される)の優先権を主張する。
本出願全体を通して、種々の特許及び科学出版物が引用される。全体としてのこれらの出版物に関する開示は、これにより本発明が関する当該分野の状態をさらに詳細に記載するために本出願中で参照により援用される。
本発明は、呼吸器系に直接的に抑制性核酸分子を送達することにより全ての型の呼吸器障害(肺障害を含めて)を治療する方法に関する。
肺疾患は、広範な症状発現及び病因を包含し、そして考え得る療法の全身投与で処置するのが特に困難であり得る。多数の型の線維症を含めて、肺胞間の組織である間質の150より多くの疾患が同定されている。他の肺疾患としては、ガス交換の障害、血液循環の障害、気道の障害及び胸膜の障害が挙げられる。肺癌は、原発性肺癌、並びに種々の他の器官又は組織の原発性癌からの転移の両方を包含する。肺の感染性疾患は、ウイルス、細菌及び真菌性感染因子を包含する。生物学的利用能を改善しようと及び/又は身体内の特定位置への送達を標的化しようと努力して、医学的に重要な分子、例えば小分子、核酸及び/又はタンパク質又はペプチド組成物を送達するための多数の一般的方法が記載されている。このような方法としては、プロドラッグの使用、リポソーム又は他の粒子中への封入、並びに取込み増強処方物における同時投与が挙げられる(再検討のためには、例えばCritical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Stephen D. Bruck, ed., CRC Press, 1991参照)。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、1600万人を超える米国人が罹患しており、米国における第四位の死因である。喫煙は衰弱性疾患の大部分の発生を引き起こすが、しかし他の環境因子は排除され得ない(Petty TL. 2003. Clin. Cornerstone, 5-10)。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、1600万人を超える米国人が罹患しており、米国における第四位の死因である。喫煙は衰弱性疾患の大部分の発生を引き起こすが、しかし他の環境因子は排除され得ない(Petty TL. 2003. Clin. Cornerstone, 5-10)。
肺気腫は、COPDの主な症状発現である。終末細気管支に遠位の末梢気腔の永久的破壊は、気腫の特徴である(Tuder RM, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 29: 88-97; 2003)。気腫は、細気管支及び肺胞構造におけるマクロファージ及び好中球のような炎症細胞の蓄積によっても特性化される(Petty, 2003)。
気腫の病因は、複雑で、多因性である。ヒトにおいて、炎症細胞により産生されるプロテアーゼの阻害剤、例えばアルファ1−アンチトリプシンの欠乏は、プロテアーゼ/アンチプロテアーゼ不均衡の一因となり、それにより喫煙(CS)誘導性気腫における肺胞細胞外マトリックスの破壊を促進することが示されている(Eriksson, S. 1964. Acta Med Scand 175: 197-205. Joos, L., Pare, P.D.及びSandford, A.J. 2002. Swiss Med Wkly 132: 27-37)。CSの長期吸入により引き起こされる気腫に対するマクロファージ・メタロエラスターゼ・ノックアウトマウスの抵抗性により実証されるように、マトリックス・メタロプロテイナーゼ(MMP)は実験的気腫において中心的役割を演じる(Hautamaki, et al: Science 277: 2002-2004)。さらに、トランスジェニックマウスにおけるインターロイキン−13の肺過剰発現は、MMP−及びカテプシン−依存性気腫を生じる(Zheng, T., et al 2000. J Clin Invest 106: 1081-1093)。近年の研究は、気腫をもたらす肺組織破壊における中隔細胞アポトーシスの関与を記載する(Rangasamy T, et al. J. Clin. Invest. 114(9): 1248-1259 (2004);Tuder RM et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 29: 88-97; 2003;Yokohori N, Aoshiba K, Nagai A, Chest. 2004 Feb;125(2): 626-32;Aoshiba K, Yokohori N, Nagai A., Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 May; 28(5): 555-62)。
気腫における肺破壊の両経路の基礎を成すメカニズムの中で、反応性酸素種(ROS)の過剰生成は、言及される全てのうちの最初であるべきである。酸化促進剤/酸化防止剤の不均衡は、喫煙者の血液中にそして肺組織中に存在する、ということは十分に確立されている(Hulea SA, et al: J Environ Pathol Toxicol Oncol. 1995; 14(3-4): 173-80; Rahman I, MacNee W. Am J Physiol. 1999 Dec; 277(6 Pt 1): L1067-88;MacNee W. Chest. 2000 May; 117(5 Suppl 1): 303S-17S.; Marwick JA, Kirkham P, Gilmour PS, Donaldson K, MacNEE W, Rahman I. Ann N Y Acad Sci. 2002 Nov; 973: 278-83; Aoshiba K, Koinuma M, Yokohori N, Nagai A. Inhal Toxicol. 2003 Sep; 15(10): 1029-38;Dekhuijzen PN. Eur Respir J. 2004 Apr;23(4): 629-36; Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Taraseviciene-Stewart L, Kasahara Y, Salvemini D, Voelkel NF, and Flores SC. Am J Respir Cell Mol Biol, 29: 88-97; 2003)。CSへのマウスの1時間曝露後、特にタイプIIの、肺胞上皮細胞における8−ヒドロキシ−2’−デオキシグアノシン(8−OHdG)の劇的増大が認められる(上記のInhal Toxicol. 2003 Sep; 15(10): 1029-38参照)。
過剰産生反応性酸素種は、直接DNA損傷作用からそしてアポトーシス性シグナル伝達経路の活性化から生じるそれらの細胞毒性に関して知られている(Takahashi A, Masuda A, Sun M, Centonze VE, Herman B. Brain Res Bull. 2004 Feb 15; 62(6): 497-504;Taniyama Y, Griendling KK. Hypertension. 2003 Dec; 42(6): 1075-81. Epub 2003 Oct 27.;Higuchi Y. Biochem Pharmacol. 2003 Oct 15; 66(8): 1527-35;Punj V, Chakrabarty AM. Cell Microbiol. 2003 Apr; 5(4): 225-31;Ueda S, Masutani H, Nakamura H, Tanaka T, Ueno M, Yodoi J. 2002 Jun; 4(3): 405-14)。
ROSは、それ自体細胞傷害性であるだけでなく、前炎症性刺激であり、レドックス感受性転写因子NFkB及びAP−1の顕著な活性剤である(Rahman I. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2002 Sep; 1(3): 291-315で再検討)。両転写因子は、順次、前炎症性サイトカイン(Renard P, Raes M. Cell Biol Toxicol. 1999; 15(6): 341-4;Lentsch AB, Ward PA. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000; 48(2): 59-63で再検討)及びマトリックス分解プロテイナーゼ(Andela VB, Gordon AH, Zotalis G, Rosier RN, Goater JJ, Lewis GD, Schwarz EM, Puzas JE, O’Keefe RJ. NFkappaB: Clin Orthop. 2003 Oct; (415 Suppl): S75-85;Fleenor DL, Pang IH, Clark AF. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003 Aug; 44(8): 3494-501;Ruhul Amin AR, Senga T, Oo ML, Thant AA, Hamaguchi M. Genes Cells 2003 Jun; 8(6): 515-23)の転写の刺激に強く関係する。前炎症性サイトカインは、順次、マトリックス分解酵素、サイトカイン及び反応性酸素種も分泌する炎症細胞の誘因物質として役立つ。したがって、病原性因子、例えばCSが、反応性酸素種が肺破壊の主要媒介物質として作用する病理学的網様構造を誘発する、ということは明らかである。
吸引されたタバコの煙からの反応性酸素種(ROS)及び炎症細胞により内因的に形成されるものはともに、肺内酸化剤負荷増大の一因となる。
COPDの病因に関する一付加的病原性因子は、気腫性患者の肺におけるVEGF及びVEGFRIIの観察された発現低減である(Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001)。さらに、化学的VEGFR阻害剤を用いたVEGFシグナル伝達の抑制は、肺胞内の両方の型の細胞の密接に関係のある構造的/機能的結合の破壊のために、肺胞中隔内皮細胞の、そして次に上皮細胞のアポトーシスをもたらす(Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Lamute Tarasevicience-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. J. Clin. Invest. 106: 1311-1319 (2000);Voelkel NF, Cool CD. Eur Respir J Suppl. 2003 Nov; 46: 28s-32s)。
肺癌
肺癌は、肺の組織中に、通常は気道内部の細胞に生じる癌である。2つの主な型は、小細胞肺癌と非小細胞肺癌である。これらの型は、顕微鏡下での細胞の形態学に基づいて診断される。それは、年間300万例までの死亡に関与する世界中の全ての癌のうち、最も致死的である。非小細胞肺癌(NSCLC)では、標準治療の結果は、最も限局性の癌を除いて、不十分である。外科手術は、この疾患のための最も潜在的に治効的な療法的選択肢である;放射線療法は、少数の患者において治癒を生じ、そして大半の患者において一時的緩和を提供し得る。アジュバント化学療法は、切除NSCLCを有する患者に付加的利益を提供し得る。進行段階疾患では、化学療法は中央値生存率の適度の改善を提供するが、しかし全体的生存率は不十分である。化学療法は、疾患関連症候における短期改善を生じた。
肺癌は、肺の組織中に、通常は気道内部の細胞に生じる癌である。2つの主な型は、小細胞肺癌と非小細胞肺癌である。これらの型は、顕微鏡下での細胞の形態学に基づいて診断される。それは、年間300万例までの死亡に関与する世界中の全ての癌のうち、最も致死的である。非小細胞肺癌(NSCLC)では、標準治療の結果は、最も限局性の癌を除いて、不十分である。外科手術は、この疾患のための最も潜在的に治効的な療法的選択肢である;放射線療法は、少数の患者において治癒を生じ、そして大半の患者において一時的緩和を提供し得る。アジュバント化学療法は、切除NSCLCを有する患者に付加的利益を提供し得る。進行段階疾患では、化学療法は中央値生存率の適度の改善を提供するが、しかし全体的生存率は不十分である。化学療法は、疾患関連症候における短期改善を生じた。
siRNA及びRNA干渉
本発明は、一般的に、2又はそれより多くの遺伝子の発現を下方制御する化合物に、特に新規な低分子干渉RNA(siRNA)に、そして種々の疾患及び医学的症状の治療におけるこれら新規のsiRNAの使用に関する。
本発明は、一般的に、2又はそれより多くの遺伝子の発現を下方制御する化合物に、特に新規な低分子干渉RNA(siRNA)に、そして種々の疾患及び医学的症状の治療におけるこれら新規のsiRNAの使用に関する。
本発明は、in vivoでの標的遺伝子の発現を抑制するための方法及び組成物を提供する。概して、該方法は、2又はそれより多くの特定mRNAに標的され、そして生物学的条件下(細胞内)でそれをハイブリダイズするか又はそれと相互作用する低分子干渉RNA(即ち、siRNA)、あるいは細胞中でsiRNAを産生し得る核酸物質のようなオリゴリボヌクレオチドを、RNA干渉メカニズムにより2又はそれより多くの標的遺伝子の発現を下方制御するのに十分な量で投与することを包含する。付加的には、本発明のsiRNAは、siRNAと競合するか又はその作用を克服する小化合物を探すための化合物スクリーニング系の一部としてin vitroで用いられ得る。
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖(ds)RNA依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングを伴う現象である。最初は、この現象を試験する、そして哺乳類細胞を操作する試みは、実験的には、長いdsRNA分子に応答して活性化される活性非特異的抗ウイルス防御メカニズムにより無効にされた;Gil et al. 2000, Apoptosis, 5: 107-114参照。後に、21ヌクレオチドRNAの合成二重鎖は一般的抗ウイルス防御メカニズムの刺激を伴わずに、哺乳類細胞における遺伝子特異的RNAiに介在する、ということが発見された(Elbashir et al. Nature 2001, 411: 494-498及びCaplen et al. Proc Natl Acad Sci 2001, 98: 9742-9747参照)。その結果、短い二本鎖RNAである低分子干渉RNA(siRNA)は、遺伝子機能を理解しようとする場合の強力なツールになった。
したがってRNA干渉(RNAi)は、低分子干渉RNA(siRNA)(Fire et al, 1998, Nature 391, 806)又はミクロRNA(miRNA)(Ambros V. Nature 431: 7006, 350-355 (2004)及びBartel DP. Cell. 2004 Jan 23; 116(2): 281-97)により媒介される哺乳類における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。植物における対応する過程は、特異的転写後遺伝子サイレンシング又はRNAサイレンシングと一般に呼ばれ、そして真菌においてはクエリングとも呼ばれる。siRNAは、遺伝子/その内因性(細胞性)同等物の発現を下方制御するか又は抑圧する(防止する)二本鎖RNA分子である。RNA干渉は、特定タンパク質複合体に進入するdsRNA種の能力に基づいており、この場合、それは次に相補的細胞RNAに標的化され、そして特定的にそれを分解する。したがってRNA干渉応答は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する1本鎖RNAの開裂を媒介するRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)と一般に呼ばれるsiRNAを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴づける。標的RNAの切断は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こり得る(Elbashir et al. 2001, Genes Dev., 15, 188)。さらに詳細には、より長いdsRNAは、III型RNアーゼにより短い(17〜29 bp)dsRNA断片(短い抑制RNA − 「siRNA」とも呼ばれる)に消化される(DICER, DROSHA, etc., Bernstein et al., Nature, 2001, v.409, p.363-6;Lee et al., Nature, 2003, 425, p.415-9)。RISCタンパク質複合体は、これらの断片及び相補的mRNAを認識する。全体的過程は、標的mRNAのエンドヌクレアーゼ切断により完結する(McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, v.3, p.737-47;Paddison & Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003 Jun; 5(3): 217-24)。これらの用語及び提案されたメカニズムに関する情報については、Bernstein E., Denli AM. Hannon GJ: 2001. RNA. I; 7(11): 1509-21;Nishikura K.: 2001 Cell. I16; 107(4): 415-8およびPCT公報WO 01/36646 (Glover等)を参照されたい。
既知の遺伝子に対応するsiRNAの選択及び合成は、広範に報告されている;例えばChalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. 2004 Biochem. Biophys. Res. Commun. Jun 18; 319(1): 264-74;Sioud M, Leirdal M., 2004, Methods Mol Biol.; 252: 457-69;Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. 2004, I 12; 20(3): 430-2及びUi-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Nucleic Acids Res. 2004 I9; 32(3): 936-48を参照。Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR., Biochemistry, 2004 I 24; 43(7): 1921-7も参照されたい。PCT公報WO 2004/015107 (Atugen)及びWO 02/44321 (Tuschl等)も、そして修飾された/より安定なsiRNAの産生に関してはChiu YL, Rana TM. RNA 2003 Sep; 9(9): 1034-48並びに特許第5898031号及び第6107094号(Crooke)も参照。
いくつかのグループは、細胞内でsiRNAを生成し得るDNAベースのベクターの開発を記載している。該方法は一般的に、効率的にプロセシングして細胞内でsiRNAを形成する短いヘアピンRNAの転写を伴う(Paddison et al. PNAS 2002, 99: 1443-1448;Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16: 948-958;Sui et al. PNAS 2002, 8: 5515-5520;及びBrummelkamp et al. Science 2002, 296: 550-553)。これらの報告は、多数の内因性及び外因性発現遺伝子を特異的にターゲッティングし得るsiRNAを生成する方法を記載する。
siRNA療法は、哺乳類及びヒトの両方においてin vivoで有効である、ということをいくつかの研究は明示した。呼吸器合胞体ウイルス(RSV)ヌクレオキャプシドN遺伝子に対して向けられる特定のsiRNA分子は、鼻内に投与される場合、マウスを治療するのに有効である、ということをBitko等は示している(Bitko et al., Nat. Med. 2005, 11(1): 50-55)。siRNAの治療的適用の再検討に関しては、例えばBarik (Mol. Med 2005, 83: 764-773);Chakraborty (Current Drug Targets 2007 8(3): 469-82)及びDykxhoorn等(Gene Therapy 2006, 13, 541-552)を参照されたい。さらに、加齢性黄斑変性症(AMD)の治療のためにVEGFR1受容体を標的にする短いsiRNA分子を用いた第I相臨床試験が、ヒト患者において実行されている。試験において、硝子体内(眼内)注射により投与されるこのようなsiRNAは、試験された14例の患者において有効で且つ安全であることが見出された(Kaiser, Am J Ophthalmol. 2006, 142(4): 660-8)。
喘息を治療するための低分子量薬、例えばベータ・アンドロゲン作動性アンタゴニストからなる治療用組成物の肺投与が、観察されている。肺で活性であるその他の治療薬は、全身投与され、そして肺吸収を介して標的化されている。呼吸器系への直接送達、任意に口−鼻又は気管送達は、以下の理由のために治療薬の投与のための有望な技法であると考えられ得る:鼻は、多数の微絨毛による上皮表面の被度のために、薬剤吸収に利用可能な大表面積を有し、上皮下層は高度に血管新生され、鼻からの静脈血は全身循環に直接進み、したがって肝臓における初回通過代謝による薬剤の損失を回避し、それが、より低い用量、治療薬血中レベルのより迅速な獲得、薬理学的活性のより迅速な開始、より少ない副作用、高い総血流量/cm3、多孔性内皮基底膜、並びにそれが容易に到達可能であること。
製剤又は薬剤の有効性は、当該標的細胞への効率的送達によっている。エーロゾル送達は非侵襲性であり、高濃度の治療用分子を送達するための可能性を有する。ウイルスベクター、ポリマー、界面活性剤又は賦形剤を用いた肺への核酸のエーロゾル送達が記載されている。McDonald等は、非ヒト霊長類への嚢胞性線維症膜貫通伝導度調節タンパク質(CFTR)をコードするアデノウイルスベクターのエーロゾル送達を記載する(McDonald, et al., Human Gene Therapy 8: 411-422 (1997))。Canonico等は、ウサギへのエーロゾルによる、組換えヒトアルファ1−アンチトリプシン遺伝子及び陽イオン性リポソームと錯体形成されるサイトメガロウイルスプロモーターを含有するプラスミドのin vivo遺伝子移入を記載する(Canonico, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10: 24-29 (1994))。Stribling等は、陽イオン性リポソーム担体と錯体形成されるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子のエーロゾル送達がマウス肺におけるCAT遺伝子発現を生じ得る、ということを記載する(Stribling, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11277-11281 (1992))。Massaro等は、鼻開口部中への液体沈着を介したマウスにおける肺胞への、表面活性物質又はSAMとして既知であるリポタンパク質肺界面活性剤と錯体形成される低分子抑制RNA分子の送達を記載する(Massaro et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L 1066-L 1070 (2004))。米国特許出願第2005/0008617号(Chen等)は、肺中への導入に適した陽イオン性ポリマー、修飾陽イオン性ポリマー、脂質及び/又は界面活性剤と錯体形成される短い干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)並びにRNAi誘導性ベクターを含めたRNA誘導性作因の送達を記載する。米国特許出願第2003/0157030号(Davis等)は、鼻送達のためのsiRNAのようなRNAi構築物またはポリマーと錯体形成されるsiRNAを生じる核酸の投与を記載する。
in vivoでのsiRNA投与に関する限定数のその他の報告の間では、全て、全身送達、トランスフェクション化学物質又はウイルスベクターを用いる(Hasuwa, et al., FEBS Lett., 532: 227-230 (2002);McCaffrey, et al., Nature, 418: 38-39 (2002);Reich, et al., Mol. Vis., 9: 210-216 (2003);Sorensen, et al., J. Mol. Biol., 327: 761-766 (2003);及びZender, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 7797-7802 (2003))。
内部肺への直接送達は、そのための一般療法が不適切であるCOPD、気管支炎、喘息、嚢胞性線維症、肺癌、肺線維症及び急性呼吸窮迫症候群のような症状のための治療の可能性を提供する。核酸及び/又はトランスフェクション化学物質又はウイルスベクターの全身送達の使用と関連した毒性は、臨床的使用の懸念を生じる;さらに、プラスミドDNA構築物の使用は、潜在的治療薬としてのプラスミドDNAの効能及び送達を限定する。したがって本発明は、潜在的副作用低下及び効能増大という利点を提供する。
したがって、種々の肺疾患の治療のための、ベクターを伴わない、そして好ましくはポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又はまったく伴わない、核酸を含有する肺内投与のための組成物を提供することは、本発明の一目的である。疾患の治療のための化学薬剤に関する監督官庁の認可を確認しそして得るのが困難であるため、本発明の送達方式は、それらが安全で、副作用がなく、そして任意の疾患の治療のために種々の製剤組成物を送達するために用いられ得る。
ウイルス又はプラスミドベクターを伴わず、そして好ましくはポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又はまったく伴わずに、核酸、特にsiRNAを含有する肺内投与のための方法が、本明細書中で記載される。一実施形態では、送達のための組成物は、本質的には、少なくとも1つの核酸分子、並びに水性溶液からなる。鼻内送達のための適切な核酸としては、dsDNA、dsRNA、ssDNA、ssRNA、短い干渉RNA、ミクロRNA及びアンチセンスRNAが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸のサイズの範囲は30又は23ヌクレオチド長又はそれ未満であるが、しかし5〜60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド分子が利用され得る。好ましい一実施形態では、核酸のサイズの範囲は19〜23ヌクレオチド長である。
組成物は、肺疾患の少なくとも1つの症候又は症状発現の治療、予防又は診断を必要とする患者に投与される。一実施形態では、口−鼻及び/又は肺内投与のための組成物は、好ましくは肺において、遺伝子発現を抑制するための有効量で投与される。組成物は、1〜10 g/被験者の体重1 kg/日の用量範囲で、0.1 kg/体重1 kg/日の上限用量で投与される。好ましい一実施形態では、組成物は1〜5 g/体重1 kg/日の用量範囲で投与される。一実施形態では、組成物は、肺におけるRTP801の発現を抑制するのに有効な量で投与される。別の実施形態では、組成物は、肺におけるp53の発現を抑制するのに有効な量で投与される。さらなる情報に関しては、PCT特許出願公報WO06/023544A及びWO06/035434(本発明の譲受人に譲渡)を参照されたい。その発現が好ましくは内部肺で抑制される付加的遺伝子としては、RTP801、p53、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA、DUOX1、NRF2、REDD2、NOX4、MYC、PLK1、ESPL1、KEAP1及びSHC1、特にDUOX1、TYROBP及びCTGFが挙げられるが、これらに限定されない。
少なくとも1つの症候を軽減するための、核酸分子、好ましくはsiRNAを含有する有効量の組成物の内部肺への口−鼻あるいは経口又は鼻送達による投与からなる肺疾患の少なくとも1つの症候の治療、診断又は予防のための方法も記載される。組成物は、典型的には、口−鼻投与のために、エーロゾル又は他の許容可能な処方物として処方される。一実施形態では、口−鼻投与により送達される組成物は、肺における遺伝子発現の抑制を生じる。別の実施形態では、組成物の肺特異的送達は、肺疾患の少なくとも1つの症候を治療し、診断し又は予防するのに有効な量で送達される。治療、診断又は予防のための適切な肺疾患としては、肺癌;肺炎症性症状、例えば喘息、嚢胞性線維症、気腫、気管支炎及び気管支拡張症;間質性肺疾患及び間質性線維症;細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又はマイコバクテリア感染により引き起こされる肺炎;職業性肺疾患、例えば石炭、シリカ、アスベスト及びイソシアネート関連疾患;全身性紅斑性狼瘡のような膠原血管病に続発する肺疾患;慢性関節リウマチ;強皮症;皮膚筋炎;混合性結合組織障害;血管炎関連肺疾患、例えばウェーゲナー肉芽腫症及びグッドパスチャー症候群;類肉腫;並びに急性肺損傷/急性呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸分子は、RTP801又はp53の発現を抑制する。
「呼吸器障害」は、呼吸器系の症状、疾患又は症候を指し、例としては全ての型の肺障害、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、慢性気管支炎、喘息、肺癌、並びに本明細書中に開示される任意のその他の肺疾患又は呼吸器障害が挙げられるが、これらに限定されない。気腫及び慢性気管支炎は、COPDと一緒に又は独立して起こり得る。
したがって、一実施形態では、本発明は、肺疾患に罹患している被験者の治療方法であって、被験者の内部肺へのエーロゾルの形態での遺伝子の発現を抑制する有効量の裸の修飾siRNA化合物を被験者に投与することを包含する方法からなる。
「裸の」ポリヌクレオチド、DNA又はRNAという用語は、細胞への進入を手助けし、促進し又は助長するよう作用する任意の送達ビヒクル、例えばウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン又は沈殿剤等を有さない配列を指す。例えば水又はPBS中のsiRNAは、裸のsiRNAである。
さらに、siRNAは、本明細書中に開示される1つまたは複数の修飾により修飾される。siRNA化合物は任意に23ヌクレオチド長又はそれ未満であり、そしてsiRNAに適切であるとして本明細書中で特定された任意の長さを有し得る。さらに、siRNAの代わりに、アンチセンスRNA又はmiRNAが用いられ得る。dsDNA、dsRNA、ssDNA又はssRNAを組合せる抑制性核酸分子も用いられ得るし、上記分子は、siRNA/抑制性RNA分子の状況で本明細書中に開示される特徴のいずれかを含み得る。
化合物は、0.1〜10 g/被験者の体重1 kg/日の範囲の用量で投与され得る;付加的な考え得る用量は、本明細書中に開示されている。
本発明により抑制されるべき遺伝子は、好ましくは、RTP801、p53、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA DUOX1、NRF2、REDD2、NOX4、MYC、PLK1、ESPL1、KEAP1及びSHC1、特にDUOX1 TYROBP及びCTGFからなる群から、特にRTP801、p53、DUOX1、TYROBP及びCTGFからなる群から選択される。
本発明に従って治療されるべき肺疾患は、COPD、肺癌、喘息、嚢胞性線維症、気腫、気管支炎、気管支拡張症、間質性肺疾患、間質性線維症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、真菌性肺炎、寄生生物性肺炎、マイコバクテリア誘発性肺炎、石炭、シリカ、アスベスト及びイソシアネートのような作因により引き起こされる職業性肺疾患;全身性紅斑性狼瘡のような膠原血管病に続発する続発性肺疾患、慢性関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、混合性結合組織障害;血管炎関連肺疾患、例えばウェーゲナー肉芽腫症及びグッドパスチャー症候群;類肉腫;並びに急性肺損傷又は急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される疾患である。
本発明によるエーロゾルは、直径約1〜5 μm、任意に直径1又は2又は3又は4又は5 μmの平均粒子サイズを有し得る。さらに、本発明によるエーロゾルは、好ましくは、直径約4.1〜4.9 μm、任意に直径4.4〜4.7 μm又は4.5〜4.6 μmの平均粒子サイズを有する。付加的には、エーロゾルは、好ましくは、0.3 mL/分より大きい流速で投与される。エーロゾルは、好ましくは、経口的に、鼻に、又は口−鼻に投与される。本明細書中に開示されているように、付加的投与方式が考えられる。
経口、鼻又は口−鼻送達のための適切な核酸としては、dsDNA、dsRNA、ssDNA、ssRNA、短い干渉RNA、ミクロRNA及びアンチセンスRNAが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一実施形態では、裸の修飾siRNAが用いられる。このような核酸は、それらが疾患の1つまたは複数の症候を予防するか又は治療する場合、あるいはそれらが診断に役立ち得る場合、治療用であり得る。口−鼻送達のための適切な核酸は、当業者に既知の種々の方法により構築され得る。核酸分子のサイズ範囲は、好ましくは30ヌクレオチド長又はそれ未満、さらに好ましくは23ヌクレオチド長又はそれ未満であるが、しかし60ヌクレオチド長までである分子が利用可能である。さらに好ましくは、核酸分子のサイズ範囲は19〜23ヌクレオチド長(23も含めて)である。
所望の作用を達成するために有用である任意のDNAが、本明細書中に記載されるように用いられ得る。好ましくはDNAは、二本鎖又は1本鎖である。さらに好ましくはDNAは、1本鎖である。例えば核酸による遺伝子発現の不活性化は、ゲノム二本鎖DNAとオリゴヌクレオチドとの間の三重らせん形成によっても発揮され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、ワトソン・クリック塩基対のプリン塩基間(即ち、チミジン及びTA塩基対間、及びプロトン化シトシン及びCG塩基対間)にフーグスティーン型結合を形成することにより、二重らせんDNAの主溝と認識の高特異性で結合され得る。二本鎖DNAの三重らせん認識のための二次モチーフは、プリン高含有オリゴヌクレオチドがワトソン・クリックプリン鎖と逆平行のDNAと結合するホモプリンモチーフにより構成される。ピリミジン非修飾オリゴデオキシヌクレオチド又は骨格修飾オリゴヌクレオチドは、配列特異的やり方で遺伝子転写を遮断し得る。二重らせんDNAと特異的に結合して局所的三重らせん構造を形成し得るオリゴヌクレオチドは10年以上の間特性化されてきており、そしてそれらの構造及び安定性を左右するパラメーターに関する多数の情報が入手可能である(Sun, et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 327-333 (1996))。プロモーター内の三重鎖形成は、in vitroでの遺伝子活性化に到達し、抑制する転写因子を遮断することが示されており、そしていくつかの研究は、三重らせん形成オリゴヌクレオチド(TFO)が指示された方法で哺乳類細胞における遺伝子発現を低減し得る、ということを実証している(Seidman, et al., J Clin Invest. 112(4): 487-94 (2003)で再検討)。TFOは、ゲノム修飾を媒介して、標的配列における変化を生じるためにも用いられ得る。これは、標的配列における永久的変化を誘導するという利点を有する。それは、遺伝子ノックアウト・ツールとしての、そして遺伝子補正のための一手段としての能力も有する。
アンチセンスRNA(asRNA)技術は、遺伝子発現の下方制御又はサイレンシングを伴う。「アンチセンス」RNA分子は、細胞のタンパク質コードRNAの相補体を含有し、したがってそれとハイブリダイズし得る。アンチセンス・オリゴマーは、特定部位でメッセンジャーRNAと結合し、タンパク質へのRNAの翻訳、mRNAのスプライシング又はウイルスRNAの逆転写、並びにmRNA又はウイルスRNAのその他のプロセシングを抑制することが示されている。
RNAサイレンシングは、広範囲の生物体中に保存される配列特異的RNA分解系である。RNAサイレンシングは、二本鎖RNA(dsRNA)が遺伝子発現を抑圧する過程である。RNAサイレンシングに関与するdsRNAの2つの型としては、多数の生物体において見出される短い二本鎖リボ核酸である低分子干渉RNA(siRNA)及びミクロRNA(miRNA)が挙げられる(再検討のためにはDykxhoorn et al. 2003 Nature Reviews Mol Cell Biol 4: 457-466参照)。siRNA様遺伝子サイレンシング・メカニズムは、ヒトを含めて実質的に全ての種において機能的である。多数のmiRNAの配列は既知であり、ゲノム又は染色体中のそれらの位置が発表されている。
siRNA及びmiRNAの発現及び成熟において多少の差が認められるが、しかし最終及び活性産物は、両方の場合で、好ましくは短い、19〜22ヌクレオチド長の二本鎖RNA分子である(Dykxhoorn et al. 2003 Nature Reviews Mol Cell Biol 4: 457-466及びSteinberg 2003 Scientist June 16: 22-24)。miRNAは、非タンパク質コードDNAから合成され、そして逆方向反復を収容する転写物から代謝される。フォールドバックにより形成される二本鎖RNAは、動物ではダイサー、植物ではダイサー様と呼ばれる酵母からヒト及び高等植物まで進化を通して高度に保存されたRNアーゼIII様酵素によりプロセシングされる。これらの分子は、転写物の3’−UTRと相互作用し、そして翻訳を抑制し得る。
水性溶液
in vivo投与に薬学的に適している組成物を提供するために、核酸分子は任意の水性担体、ビヒクル又は溶液中に調製され得る。水溶液を調製する方法は、当業者によく知られている。好ましくは水溶液は、水、あるいは塩及び/又は緩衝剤を含有する生理学的に許容可能な水溶液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、あるいは動物又はヒトへの投与のために許容可能な任意のその他の水溶液である。このような溶液は当業者に良く知られており、例としては蒸留水、脱イオン水、純水又は超純水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、並びに核酸と相溶性である他の緩衝剤を含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、溶液を等張にするために塩化ナトリウム及びグルコース又はマンニトールも含有し得る。組成物は、適切な補助化合物、例えばpH、浸透圧及び張度調整剤を含有し得る。水溶液中に処方されるsiRNA化合物は、本発明による裸のsiRNAと考えられる。
in vivo投与に薬学的に適している組成物を提供するために、核酸分子は任意の水性担体、ビヒクル又は溶液中に調製され得る。水溶液を調製する方法は、当業者によく知られている。好ましくは水溶液は、水、あるいは塩及び/又は緩衝剤を含有する生理学的に許容可能な水溶液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、あるいは動物又はヒトへの投与のために許容可能な任意のその他の水溶液である。このような溶液は当業者に良く知られており、例としては蒸留水、脱イオン水、純水又は超純水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、並びに核酸と相溶性である他の緩衝剤を含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、溶液を等張にするために塩化ナトリウム及びグルコース又はマンニトールも含有し得る。組成物は、適切な補助化合物、例えばpH、浸透圧及び張度調整剤を含有し得る。水溶液中に処方されるsiRNA化合物は、本発明による裸のsiRNAと考えられる。
上気道を介した投与のために、組成物は、エーロゾルとしての口−鼻投与のための適切な濃度で、溶液中に、例えば水、あるいは緩衝された又は緩衝されない等張生理食塩水中に、あるいは懸濁液として、処方される。好ましくはこのような溶液又は懸濁液は、鼻分泌液に比して等張であり、そして例えば約pH4.0〜約pH7.4、又はpH6.0〜pH7.0の範囲のほぼ同一pHを有する。緩衝液は、生理学的に適合性であり、単なる例としては、リン酸塩緩衝液が挙げられる。例えば代表的な鼻うっ血除去薬は、約6.2のpHに緩衝されると記載されている(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Ed. Arthur Osol, page 1445 (1980))。鼻及び/又は上気道投与のための無害水溶液のための適切な生理食塩水含量及びpHを、当業者は容易に確定し得る。
その他の適切な水性ビヒクルとしては、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液は、懸濁化剤、例えばセルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及びトラガカントゴム、並びに湿潤剤、例えばレシチンを含み得る。水性懸濁液のための適切な防腐剤としては、エチル及びn−プロピルp−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
組成物は、少量のポリマー、界面活性剤又は当業者によく知られたその他の賦形剤を含有し得る。この状況では、「少量」は、肺の細胞中の核酸の取込みに影響を及ぼすか又は媒介し得る補助剤又は物質が存在しない、ということを意味する。
気道への組成物の投与
A. 投与方法
本明細書中に記載されるようにポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又は全く伴わない核酸分子処方物の肺特異的送達は、広範囲の肺疾患のための診断的、予防的及び治療的用途を有する。肺投与は、典型的には医療介入(自己投与)を必要とせずに完了され得るし、注射療法にしばしば伴う疼痛が回避され、そして経口療法でしばしば出くわす生体活性剤の酵素的及びpH媒介性分解の量が有意に低減される。
A. 投与方法
本明細書中に記載されるようにポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又は全く伴わない核酸分子処方物の肺特異的送達は、広範囲の肺疾患のための診断的、予防的及び治療的用途を有する。肺投与は、典型的には医療介入(自己投与)を必要とせずに完了され得るし、注射療法にしばしば伴う疼痛が回避され、そして経口療法でしばしば出くわす生体活性剤の酵素的及びpH媒介性分解の量が有意に低減される。
気道は、大気と血流との間のガス交換に関与する構造である。肺は、最終的にはガス交換が起きる肺胞に終わる分枝構造である。肺胞表面積は呼吸器系において最大であり、そして薬剤吸収が起きる場所である。肺胞は、繊毛又は粘液層を伴わない薄い上皮で被覆され、そして界面活性リン脂質を分泌する(J.S. Patton & R.M. Platz. Adv. Drug Del. Rev. 8: 179-196 (1992))。
気道は、上気道、例えば中咽頭及び喉頭、その後の下気道(これは気管と、その後の気管支及び細気管支への二分岐を含む)を包含する。上及び下気道は、誘導気道と呼ばれる。終末細気管支は次に、呼吸細気管支に分かれ、これは次に、最終的呼吸帯、即ち肺胞、又は深部肺に導く(Gonda, I. in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6: 273-313 (1990))。内部肺、例えば深部肺/肺胞は、全身薬剤送達のための吸入治療用エーロゾルの主要標的である。
吸入エーロゾルは、限局性肺障害、例えば喘息及び嚢胞性線維症の治療のために用いられてきたし(Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989))、同様にペプチド及びタンパク質の全身送達のための可能性を有する(Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 179-196 (1992))。エーロゾル及び/又は噴霧化合物の送達は、とりわけ、鼻、経口又は口−鼻であり得る。
エーロゾル投与量、処方物及び送達系は、例えばGonda, I.(上記)に;そしてMoren, "Aerosol dosage forms and formulations," in: Aerosols in Medicine, Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Eds. Esevier, Amsterdam, 1985に記載されているように、特定の治療用途のために選択され得る。エーロゾルという用語は、本明細書中で用いる場合、噴射剤を用いて生成されるか否かにかかわらず、溶液又は懸濁液中に存在し得る粒子の微細ミストの任意の調製物を指す。エーロゾルは、標準技法、例えば特に超音波処理又は高圧処理を用いて生成され得る。本発明の一実施形態によれば、エーロゾルはAeroneb噴霧器を用いて生成される(例えば米国特許第6,615,824号(Power)参照)。
処方物は、呼吸器系への投与のために製薬上許容可能である水溶液中で投与され得る。好ましい実施形態では、化合物は、液体粒子及び/又は固体粒子のような形態で吸入により投与される。適切な例としては、エーロゾル、噴霧剤、ミスト、霧化試料、及び液体滴剤が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトへの投与のために用いられ得る典型的装置としては、定量噴霧式吸入器(MDI)、噴霧器、例えばAeroneb、及び滴注技法が挙げられる。処方物は、肺疾患の1つまたは複数の症候に関して治療し、予防し又は診断するのに有効な量で投与される。siRNAは、乾燥粉末吸入器を用いて乾燥粉末としても投与され得るが、この場合、粒子は肺分泌物内に溶解する。
患者の気道に粒子を投与するために用いられ得る吸入の種々の適切な用具及び方法は、当業界で既知である。噴霧器は、溶液又は懸濁液から微細なミストを作り出し、これが患者に吸入される。米国特許第5,709,202号(Lloyd等)に、又は米国特許第6,615,824号(Power)に記載された用具が用いられ得る。MDIは、典型的には、メーターバルブを有する加圧キャニスターを包含し、この場合、キャニスターは溶液又は懸濁液、及び噴射剤を充填される。溶媒それ自体は噴射剤として機能し、あるいは組成物は、噴射剤、例えばフレオンと併合され得る。組成物は、圧力の放出のためにキャニスターから放出される場合、微細ミストである。噴射剤及び溶媒は、圧力の減少のために全体的に又は部分的に蒸発され得る。
組成物は、好ましくは、有効用量の核酸の送達を生じる薬物動態プロフィールで、肺中に送達される。本明細書中で一般的に用いられるように、本発明の核酸の「有効量」は、化合物又は治療薬を摂取していない適合被験者と比較して、化合物又は治療薬が投与される被験者において肺疾患の1つまたは複数の症候を治療し、肺疾患の1つまたは複数の症候の進行を逆行させ、肺疾患の1つまたは複数の症候の進行を停止し、肺疾患の1つまたは複数の症候の発生を防止し、肺疾患の症状発現を低減し、あるいは肺疾患の1つまたは複数の症候を診断し得る量である。薬剤の実際の有効量は、利用されている特定の薬剤又はその組合せ、処方される個々の組成物、投与方式、並びに患者の年齢、体重、症状、そして治療されている症候又は症状の重症度によって変わり得る。個々の患者のための投与量は、慣用的考察を用いて(例えば適切な慣用的薬理学的プロトコールにより)、当業者により確定され得る。一実施形態では、組成物は、0.1〜10 g/体重1 kg/日の用量範囲で、0.1 kg/体重1 kg/日の上限用量で送達される。好ましい一実施形態では、組成物は1〜5 g/体重1 kg/日の用量範囲で投与される。
これらの分子のうちの1つまたは複数が動物(例えばヒト)に投与されて、1つまたは複数の標的ポリペプチドの発現又は活性を調整し得る。医者は、例えば最初に相対的に低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで、用量を増大し得る。さらに、任意の個々の被験者に関する特定用量レベルは、用いられる特定化合物の活性、被験者の年齢、体重、全身の健康、性別及び食餌、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬剤組合せ、並びに調整されるべき発現又は活性の程度を含めた種々の因子によっている、と理解される。
治療の効能は、標的遺伝子mRNAの量(例えば実時間PCRを用いて)又は標的遺伝子mRNAによりコードされるポリペプチドの量(ウエスタンブロット分析)を測定することによりモニタリングされ得る。
B. 治療されるべき患者及び疾患
組成物は、治療、予防又は診断を必要とする患者に投与される。組成物は、動物又はヒトに投与され得る。肺疾患は、COPD、肺癌、気道又は肺感染、間質の疾患、ガス交換又は血液循環の障害、気道の疾患又は胸膜の障害であり得る。本明細書中で用いる場合、「肺癌」は、原発性肺腫瘍(例えば気管支原性癌又は気管支カルチノイド)、あるいは別の器官又は組織(例えば乳房、結腸、前立腺、腎臓、甲状腺、胃、子宮頚部、直腸、精巣、骨又は黒色腫)の原発性腫瘍からの転移を指す。本明細書中で用いる場合、「気道又は肺感染」は、呼吸器系の任意の部分の任意の細菌、ウイルス、真菌又は寄生生物感染を指す。本明細書中で用いる場合、「間質の疾患」は、線維症を含めた間質の任意の障害(例えば間質性肺線維症、間質性肺炎、間質性肺疾患、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、サルコイドーシス又は特発性肺血鉄症)を包含する。本明細書中で用いる場合、「ガス交換又は血液循環の障害」は、血液及び肺への/からのガスの分布及び/又は交換に影響を及ぼす任意の異常(例えば肺水腫、肺塞栓症、呼吸器不全(例えば弱い筋肉のため)、急性呼吸窮迫症候群又は肺高血圧症)を指す。本明細書中で用いる場合、「気道の疾患」としては、遺伝的及び環境的病因の障害を含めた規則的呼吸パターンの任意の障害(例えば喘息、慢性気管支炎、細気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、気腫、慢性閉塞性肺疾患、びまん性汎細気管支炎又はリンパ管平滑筋腫症)が挙げられる。本明細書中で用いる場合、「胸膜の障害」としては、例えば胸水(例えば血胸症(胸膜腔への血液)又は気腫(胸膜腔への膿)、気胸(空気、例えば外傷性、自発性又は張力)、胸膜炎あるいは胸膜線維症又は石灰化が挙げられる。
組成物は、治療、予防又は診断を必要とする患者に投与される。組成物は、動物又はヒトに投与され得る。肺疾患は、COPD、肺癌、気道又は肺感染、間質の疾患、ガス交換又は血液循環の障害、気道の疾患又は胸膜の障害であり得る。本明細書中で用いる場合、「肺癌」は、原発性肺腫瘍(例えば気管支原性癌又は気管支カルチノイド)、あるいは別の器官又は組織(例えば乳房、結腸、前立腺、腎臓、甲状腺、胃、子宮頚部、直腸、精巣、骨又は黒色腫)の原発性腫瘍からの転移を指す。本明細書中で用いる場合、「気道又は肺感染」は、呼吸器系の任意の部分の任意の細菌、ウイルス、真菌又は寄生生物感染を指す。本明細書中で用いる場合、「間質の疾患」は、線維症を含めた間質の任意の障害(例えば間質性肺線維症、間質性肺炎、間質性肺疾患、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、サルコイドーシス又は特発性肺血鉄症)を包含する。本明細書中で用いる場合、「ガス交換又は血液循環の障害」は、血液及び肺への/からのガスの分布及び/又は交換に影響を及ぼす任意の異常(例えば肺水腫、肺塞栓症、呼吸器不全(例えば弱い筋肉のため)、急性呼吸窮迫症候群又は肺高血圧症)を指す。本明細書中で用いる場合、「気道の疾患」としては、遺伝的及び環境的病因の障害を含めた規則的呼吸パターンの任意の障害(例えば喘息、慢性気管支炎、細気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、気腫、慢性閉塞性肺疾患、びまん性汎細気管支炎又はリンパ管平滑筋腫症)が挙げられる。本明細書中で用いる場合、「胸膜の障害」としては、例えば胸水(例えば血胸症(胸膜腔への血液)又は気腫(胸膜腔への膿)、気胸(空気、例えば外傷性、自発性又は張力)、胸膜炎あるいは胸膜線維症又は石灰化が挙げられる。
肺疾患の少なくとも1つの症候の治療、診断又は予防のための適切な肺疾患としては、COPD;肺癌;肺炎症性症状、例えば喘息、嚢胞性線維症、気腫、気管支炎及び気管支拡張症;間質性肺疾患及び間質性線維症;細菌、ウイルス、真菌、寄生生物及びマイコバクテリア感染により引き起こされる肺炎;石炭、シリカ、アスベスト及びイソシアネートのような作因により引き起こされる職業性肺疾患;全身性紅斑性狼瘡のような膠原血管病に続発する続発性肺疾患;慢性関節リウマチ;強皮症;皮膚筋炎;混合性結合組織障害;血管炎関連肺疾患、例えばウェーゲナー肉芽腫症及びグッドパスチャー症候群;類肉腫;並びに急性肺損傷の症候又は急性呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。全身送達のための好ましい一実施形態では、核酸は、以下の遺伝子のうちの1つまたは複数の発現を抑制する:p53、RTP801、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、カスパーゼ12、カスパーゼ14、Apaf−1、Nod1、Nod2、Ipaf、DEFCAP、RAIDD、RICK、Bcl10、ASC、TUCAN、ARC、CLARP、FADD、DEDD、DEDD2、Cryopirin、PYC1、Pyrin、TRADD、UNC5a、UNC5b、UNC5c、ZUD、p84N5、LRDD、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK9、PITSLRE A、CHK2、LATS1、Prk、MAP4K1、MAP4K2、STK4、SLK、GSK3アルファ、GSK3ベータ、MEKK1、MAP3K5(Ask1)、MAP3K7、MAP3K8、MAP3K9、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K12、DRP−1、MKK6、p38、JNK3、DAPK1、DRAK1、DRAK2、IRAK、RIP、RIP3、RIP5、PKR、IRE1、MSK1、PKCアルファ、PKCベータ、PKCデルタ、PKCイプシロン、PKCイータ、PKCミュー、PKCシータ、PKCゼータ、CAMK2A、HIPK2、LKB1、BTK、c−Src、FYN、Lck、ABL2、ZAP70、TrkA、TrkC、MYLK、FGFR2、EphA2、AATYK、c−Met、RET、PRKAA2、PLA2G2A、SMPD1、SMPD2、SPP1、FAN、PLCG2、IP6K2、PTEN、SHIP、AIF、AMID、Cytochrome c、Smac、HtrA2、TSAP6、DAP−1、FEM−1、DAP−3、Granzyme B、DIO−1、DAXX、CAD、CIDE−A、CIDE−B、Fsp27、Ape1、ERCC2、ERCC3、BAP31、Bit1、AES、Huntingtin、HIP1、hSir2、PHAP1、GADD45b、GADD34、RAD21、MSH6、ADAR、MBD4、WW45、ATM、mTOR、TIP49、ジユビキチン/FAT10、FAF1、p193、Scythe/BAT3、Amida、IGFBP−3、TDAG51、MCG10、PACT、p52/RAP、ALG2、ALG3、プレセネリン−1、PSAP、AIP1/Alix、ES18、mda−7、p14ARF、ANT1、p33ING1、p33ING2、p53AIP1、p53DINP1、MGC35083、NRAGE、GRIM19、リポカリン2、グリコデリンA、NADE、ポリミン、STAG1、DAB2、ガレクチン-7、ガレクチン-9、SPRC、FLJ21908、WWOX、XK、DKK−1、Fzd1、Fzd2、SARP2、アキシン1、RGS3、DVL1、NFkB2、IkBアルファ、NF−ATC1、NF−ATC2、NF−ATC4、zf3/ZNF319、Egr1、Egr2、Egr3、Sp1、TIEG、WT1、Zac1、Icaros、ZNF148、ZK1/ZNF443、ZNF274、WIG1、HIVEP1、HIVEP3、Fliz1、ZPR9、GATA3、TR3、PPARG、CSMF、RXRa、RARa、RARb、RARg、T3Ra、ERベータ、VDR、GR/GCCR、p53、p73アルファ、p63(ヒト[ta アルファ、ta ベータ、ta ガンマ、da アルファ、daベータ、da ガンマ])、53BP2、ASPP1、E2F1、E2F2、E2F3、HIF1アルファ、TCF4、c−Myc、Max、Mad、MITF、Id2、Id3、Id4、c−Jun、c−Fos、ATF3、NF−IL6、CHOP、NRF1、c−Maf、Bach2、Msx2、Csx、Hoxa5、Ets−1、PU1/Spi1、Ets−2、ELK1、TEL1、c−Myb、TBX5、IRF1、IRF3、IRF4、IRF9、AP−2アルファ、FKHR、FOXO1A、FKHRL1、FOXO3a、AFX1、MLLT7、Tip60、BTG1、AUF1、HNRPD、TIA1、NDG1、PCBP4、MCG10、FXR2、TNFR2、LTbR、CD40、CD27、CD30、4−1BB、TNFRSF19、XEDAR、Fn14、OPG、DcR3、FAS、TNFR1、WSL−1、p75NTR、DR4、DR5、DR6、EDAR、TNFアルファ、FASリガンド、TRAIL、リンフォトキシン・アルファ、リンフォトキシン・ベータ、4−1BBL、RANKL、TL1、TWEAK、LIGHT、APRIL、IL−1−アルファ、IL−1−ベータ、IL−18、FGF8、IL−2、IL−21、IL−5、IL−4、IL−6、LIF、IL−12、IL−7、IL−10、IL−19、IL−24、IFNアルファ、IFNベータ、IFNガンマ、M−CSF、プロラクチン、TLR2、TLR3、TLR4、MyD88、TRIF、RIG−1、CD14、TCRアルファ、CD3ガンマ、CD8、CD4、CD7、CD19、CD28、CTLA4、SEMA3A、SEMA3B、HLA-A、HLA−B、HLA−L、HLA−DMアルファ、CD22、CD33、CALL、DCC、ICAM1、ICAM3、CD66a、PVR、CD47、CD2、Thy−1、SIRPa1、CD5、E−カドヘリン、ITGAM、ITGAV、CD18、ITGB3、CD9、IgE Fc Rベータ、CD82、CD81、PERP、CD24、CD69、KLRD1、ガレクチン1、B4GALT1、C1qアルファ、C5R1、MIP1アルファ、MIP1ベータ、RANTES、SDF1、XCL1、CCCKR5、OIAS/OAS1、INDO、MxA、IFI16、AIM2、iNOS、HB−EGF、HGF、MIF、TRAF3、TRAF4、TRAF6、PAR−4、IKKガンマ、FIP2、TXBP151、FLASH、TRF1、IEX−1S、Dok1、BLNK、CIN85、Bif−1、HEF1、Vav1、RasGRP1、POSH、Rac1、RhoA、RhoB、RhoC、ALG4、SPP1、TRIP、SIVA、TRABID、TSC−22、BRCA1、BARD1、53BP1、MDC1、Mdm4、Siah−1、Siah−2、RoRet、TRIM35、PML、RFWD1、DIP1、Socs1、PARC、USP7、CYLD、SOX9、ASPP1、CTSD、CAPNS1、FAS、FASリガンド、HES1、HESS、ID1、ID2、ID3 CDKN1B、CDKN2A;並びに特にRTP801、p53、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA DUOX1、NRF2、REDD2、NOX4、MYC、PLK1、ESPL1、KEAP1及びSHC1、特にRTP801、p53、DUOX1 TYROBP及びCTGF。
C. 投与されるべきsiRNA
哺乳類遺伝子を下方制御する任意の二本鎖オリゴリボヌクレオチド(例えばsiRNA)は、本発明の方法に従って投与され得る。本発明に従って投与されるべきsiRNAは、センス鎖が哺乳類遺伝子、任意に本明細書中に開示される遺伝子のmRNA配列に由来し、そしてアンチセンス鎖がセンス鎖と相補的である二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。概して、標的mRNA配列からの多少の逸脱はsiRNA活性を危うくすることなく耐容される(例えばCzauderna et al., 2003, NAR 31(11), 2705-2716参照)。本発明のsiRNAは、mRNAの破壊を伴って又は伴わずに、転写後レベルで遺伝子発現を抑制する。理論に縛られることなく、siRNAは、特異的切断及び分解のためにmRNAを標的にし得るし、及び/又は標的化メッセージからの翻訳を抑制し得る。
哺乳類遺伝子を下方制御する任意の二本鎖オリゴリボヌクレオチド(例えばsiRNA)は、本発明の方法に従って投与され得る。本発明に従って投与されるべきsiRNAは、センス鎖が哺乳類遺伝子、任意に本明細書中に開示される遺伝子のmRNA配列に由来し、そしてアンチセンス鎖がセンス鎖と相補的である二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。概して、標的mRNA配列からの多少の逸脱はsiRNA活性を危うくすることなく耐容される(例えばCzauderna et al., 2003, NAR 31(11), 2705-2716参照)。本発明のsiRNAは、mRNAの破壊を伴って又は伴わずに、転写後レベルで遺伝子発現を抑制する。理論に縛られることなく、siRNAは、特異的切断及び分解のためにmRNAを標的にし得るし、及び/又は標的化メッセージからの翻訳を抑制し得る。
本明細書中で用いる場合、「リボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成、非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に対する、塩基部分に対する、及び/又はオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変化を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴリボヌクレオチドは修飾siRNAを含む。種々の実施形態では、siRNAは、第一鎖及び第二鎖を含むRNA二重鎖を含み、それにより第一鎖は標的核酸の約18〜約40連続ヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性であるリボヌクレオチド配列を含み、そして第二鎖は第一鎖と少なくとも部分的に相補性であるリボヌクレオチド配列を含み、この場合、上記第一鎖及び/又は上記第二鎖は、糖部分の2’位置に修飾を有する修飾リボヌクレオチドの複数の群を含み、それにより、各鎖内では、修飾リボヌクレオチドの各群は、フランキング・リボヌクレオチドの一群が片側又は両側に位置し、それによりフランキング・リボヌクレオチドの群を形成する各リボヌクレオチドが非修飾リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドの群の修飾と異なる修飾を有するリボヌクレオチドから選択される。
一実施形態では、修飾リボヌクレオチドの群及び/又はフランキング・リボヌクレオチドの群は、1〜12の整数からなる群から選択される多数のリボヌクレオチドを含む。したがって、群は、1つのヌクレオチド、2つのヌクレオチド、3つのヌクレオチド、4つのヌクレオチド、5つのヌクレオチド、6つのヌクレオチド、7つのヌクレオチド、8つのヌクレオチド、9つのヌクレオチド、10のヌクレオチド、11のヌクレオチド又は12のヌクレオチドを含む。
修飾ヌクレオチド及びフランキング・ヌクレオチドの群は、鎖のうちの少なくとも1つの上で一パターンで組織化され得る。いくつかの実施形態では、第一及び第二鎖は、修飾ヌクレオチドの一パターンを含む。別の実施形態では、1つの鎖のみが、修飾ヌクレオチドの一パターンを含む。種々の実施形態では、上記第一鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、第二鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに比して同一である。
他の実施形態では、上記第一鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、第二鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに比して1つまたは複数のヌクレオチドによりシフトされる。
いくつかの好ましい実施形態では、アンチセンス鎖中の中央リボヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。例えば19−オリゴマーアンチセンス鎖において、リボヌクレオチド数10は非修飾である;21−オリゴマーアンチセンス鎖では、リボヌクレオチド数11は非修飾である;そして23−オリゴマーアンチセンス鎖では、リボヌクレオチド数12は非修飾である。siRNAの修飾又は修飾のパターンは(もしあれば)、これを可能にするよう計画されなければならない。糖残基の2’部分における修飾としては、アミノ、フルオロ、アルコキシ、例えばメトキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、CN、CF、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル又はアラルキル、OCF3、OCN、O−、S−、又はN−アルキル;O−、S又はN−アルケニル;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2、N3;ヘテロシクロアルキル;ヘテロシクロアルカリル;アミノアルキルアミノ;ポリアルキルアミノ又は置換シリル(特に、欧州特許EP 0 586 520 B1又はEP 0 618 925 B1に記載されたような)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、siRNAは、一端又は両端で平滑末端化される。さらに特定的には、siRNAは、第一鎖の5’末端および第二鎖の3’末端により限定される末端で、あるいは第一鎖の3’末端及び第二鎖の5’末端により限定される末端で平滑末端化され得る。他の実施形態では、2つの鎖のうちの少なくとも1つは、5’末端に少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。鎖のうちの少なくとも1つは、任意に、3’末端に少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングも有し得る。オーバーハングは、約1〜約5連続ヌクレオチドで構成され得る。オーバーハングのヌクレオチドは、修飾又は非修飾リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであり得る。
RNA二重鎖の長さは、約18〜約40リボヌクレオチド、好ましくは19、21又は23リボヌクレオチドである。さらに、各鎖の長さは、独立して、約15〜約40塩基、好ましくは18〜23塩基、さらに好ましくは19、21又は23リボヌクレオチドからなる群から選択される長さを有する。
付加的には、上記第一鎖及び標的核酸間の相補性は、完全であり得る。いくつかの実施形態では、鎖は、実質的に相補性であり、即ち、上記第一鎖及び標的核酸間に1、2又は3つまでのミスマッチを有する。実質的に相補性とは、別の配列と約84%より大きい相補性を指す。例えば19塩基対からなる二重鎖領域では、1つのミスマッチは94.7%相補性を生じ、2つのミスマッチは約89.5%相補性を生じ、そして3つのミスマッチは約84.2%相補性を生じ、二重鎖領域を実質的に相補性にさせる。したがって実質的に同一であるとは、別の配列と約84%より大きい同一性を指す。
或る実施形態では、第一鎖及び第二鎖は各々、修飾リボヌクレオチドの少なくとも1つの群及びフランキング・リボヌクレオチドの少なくとも1つの群を含み、それにより修飾リボヌクレオチドの各群は少なくとも1つのリボヌクレオチドを含み、そしてそれによりフランキング・リボヌクレオチドの各群は少なくとも1つのリボヌクレオチドを含むが、この場合、第一鎖の修飾リボヌクレオチドの各群は第二鎖上のフランキング・リボヌクレオチドの一群と一列に並べられ、そしてこの場合、5’最末端リボヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドの一群から選択され、そして第二鎖の3’最末端リボヌクレオチドはフランキング・リボヌクレオチドの群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドの各群は単一のリボヌクレオチドから成り、フランキング・リボヌクレオチドの各群は単一のヌクレオチドヌクレオチドからなる。
さらに別の実施形態では、第一鎖上のフランキング・リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドに比して3’方向に整列される非修飾リボヌクレオチドであり、そして第二鎖上の修飾リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドは、フランキング・リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドに比して5’方向に整列される修飾リボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、siRNAの第一鎖は5〜約20、8〜12、好ましくは9〜12群の修飾リボヌクレオチドを含み、そして第二鎖は7〜11、好ましくは8〜11群の修飾リボヌクレオチドを含む。
第一鎖及び第二鎖は、非核酸ポリマー、例えば特にポリエチレングリコールで構成され得るループ構造により連結され得る。代替的には、ループ構造は、修飾及び非修飾リボヌクレオチド並びに修飾及び非修飾デオキシリボヌクレオチドを含めた核酸で構成され得る。
さらに、siRNAの第一鎖の5’末端は第二鎖の3’末端と連結され得るし、あるいは第一鎖の3’末端は第二鎖の5’末端と連結され、上記連結は核酸リンカー又は非核酸リンカーを介している。或る実施形態では、核酸リンカーは約2〜100核酸、好ましくは約2〜約30核酸の長さを有する。
種々の実施形態において、本発明は、以下の構造を有する化合物の投与を提供する:
5’(N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’Z’−(N’)y 5’ (センス鎖)
(ここで、N及びN’は各々、その糖残基で修飾されるか又は修飾され得ないリボヌクレオチドであり;そして(N)x及び(N’)yの各々は、N又はN’が共有結合により次のN又はN’とつなげられ、ここで、x及びyの各々は、18から40の間の整数であり;
Z及びZ’は各々、存在するか又は存在せず、しかし存在する場合、それが存在する鎖の3’末端に共有結合される1〜5連続ヌクレオチドであり;そして
(N’)yの配列は、哺乳類mRNA中の約18〜約40連続リボヌクレオチドと実質的同一性を有するセンス配列を含む)。好ましい実施形態では、mRNAは本明細書中に開示される遺伝子のうちのいずれか1つから転写されるmRNAから選択される。
5’(N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’Z’−(N’)y 5’ (センス鎖)
(ここで、N及びN’は各々、その糖残基で修飾されるか又は修飾され得ないリボヌクレオチドであり;そして(N)x及び(N’)yの各々は、N又はN’が共有結合により次のN又はN’とつなげられ、ここで、x及びyの各々は、18から40の間の整数であり;
Z及びZ’は各々、存在するか又は存在せず、しかし存在する場合、それが存在する鎖の3’末端に共有結合される1〜5連続ヌクレオチドであり;そして
(N’)yの配列は、哺乳類mRNA中の約18〜約40連続リボヌクレオチドと実質的同一性を有するセンス配列を含む)。好ましい実施形態では、mRNAは本明細書中に開示される遺伝子のうちのいずれか1つから転写されるmRNAから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物はホスホジエステル結合を含む。
種々の実施形態では、化合物は、x=yであり、そしてxが18、19、20、21、22及び23からなる群から選択される整数であるリボヌクレオチドを含む。或る実施形態では、x=y=19又はx=y=23である。
いくつかの実施形態では、化合物は、平滑末端化され、例えばこの場合、Z及びZ’はともに存在しない。代替的一実施形態では、化合物は少なくとも1つの3’オーバーハングを含み、この場合、Z又はZ’のうちの少なくとも1つが存在する。Z及びZ’は、独立して、以下に記載されるような1つまたは複数の共有結合修飾又は非修飾ヌクレオチド、例えば逆方向dT又はdA;dT、LNA(ロックされた核酸)、鏡像体ヌクレオチド等を含み得る。いくつかの実施形態では、Z及びZ’は、各々独立して、dT及びdTdTから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、それらの糖残基中に修飾されない1つまたは複数のリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、化合物は、糖残基中に修飾された少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化合物は、糖残基の2‘位置に一修飾を含む。糖残基の2’位置における修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ及びアルキル部分を包含する。或る好ましい実施形態では、アルコキシ修飾は、糖残基の2‘位置のメトキシ部分である(2’−O−メチル;2’−O−Me;2’−O−CH3)。
いくつかの実施形態では、化合物は、アンチセンス及びセンス鎖の一方又は両方に修飾交互リボヌクレオチドを含む。或る実施形態では、化合物は、アンチセンス及びセンス鎖に修飾交互リボヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の中央リボヌクレオチドは修飾されない;例えば19−mer鎖中の位置10におけるリボヌクレオチド。
或る実施形態では、本発明は、以下の構造を有する化合物の投与を提供する:
5’(N)x3’ (アンチセンス鎖)
3’(N’)y5’ (センス鎖)
(ここで、各々のx及びy=19であり、並びに(N)x及び(N’)yは完全相補性であり;
(N)x及び(N’)y中の交互リボヌクレオチドはリボヌクレオチドの糖残基中に2’−O−メチル修飾を生じるよう修飾され;
(N)xの5’及び3’末端の各Nは修飾され;
(N)yの5’及び3’末端の各N’は修飾されず;
(N)x及び(N’)yの各々は、哺乳類遺伝子、任意に本明細書中に開示される遺伝子の1つから転写されるmRNA中に存在するか又はそれと相補的である。
(N)x及び(N’)yは、3’及び5’末端でリン酸化されるか又は非リン酸化され得る)。
5’(N)x3’ (アンチセンス鎖)
3’(N’)y5’ (センス鎖)
(ここで、各々のx及びy=19であり、並びに(N)x及び(N’)yは完全相補性であり;
(N)x及び(N’)y中の交互リボヌクレオチドはリボヌクレオチドの糖残基中に2’−O−メチル修飾を生じるよう修飾され;
(N)xの5’及び3’末端の各Nは修飾され;
(N)yの5’及び3’末端の各N’は修飾されず;
(N)x及び(N’)yの各々は、哺乳類遺伝子、任意に本明細書中に開示される遺伝子の1つから転写されるmRNA中に存在するか又はそれと相補的である。
(N)x及び(N’)yは、3’及び5’末端でリン酸化されるか又は非リン酸化され得る)。
本発明の或る実施形態では、交互リボヌクレオチドは、化合物のアンチセンス及びセンス鎖の両方における糖残基の2’位置で修飾される。特に、例示的siRNAは、2’−O−メチル(Me)基がアンチセンス鎖の第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13、第15、第17及び第19ヌクレオチド上に存在し、それにより非常にぴったり同一の修飾、即ち2’−O−Me基がセンス鎖の第2、第4、第6、第8、第10、第12、第14、第16及び第18ヌクレオチドに存在した。付加的には、これらの特定のsiRNA化合物も平滑末端化される、ということが留意されるべきである。
或る実施形態では、化合物のアンチセンス及びセンス鎖の一方又は両方に修飾されたリボヌクレオチドを有する交互化合物が投与され、19−mer及び23−merに関しては、アンチセンス鎖の5’及び3’末端のリボヌクレオチドがそれらの糖残基で修飾され、そしてセンス鎖の5’及び3’末端のリボヌクレオチドはそれらの糖残基で修飾されない。21−merに関しては、センス鎖の5‘及び3’末端のリボヌクレオチドがそれらの糖残基で修飾され、そしてアンチセンス鎖の5’及び3’末端のリボヌクレオチドはそれらの糖残基で修飾されない。上記のように、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチドは修飾されない、というのが好ましい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、投与されているsiRNAのアンチセンス及びセンス鎖は、3’末端でのみリン酸化され、5’末端ではリン酸化されない。本発明の別の好ましい実施形態によれば、アンチセンス及びセンス鎖は非リン酸化される。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、センス鎖の最5’リボヌクレオチドは、in vivo5’リン酸化の任意の可能性を無くすよう修飾される。
これ以上詳述しないが、当業者は、前述の説明を用いて、その最高程度まで本発明を利用し得ると考えられる。したがって以下の好ましい特定の実施形態は、単なる例証として意図されるべきであって、如何なる点でも本発明を限定するものではない。
本明細書中に特定的に記載されない当業界で知られた標準分子生物学プロトコールは、一般的に、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992)に、並びにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988)におけるのと本質的に同様に模範とされる。
本明細書中に特定的に記載されない当業界で知られた標準有機合成プロトコールは、一般的に、Organic syntheses: vol. 1-79, editors vary, J. Wiley, New-York (1941-2003);Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Ooganic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001)におけるのと本質的に同様に模範とされる。
本明細書中に特定的には記載されない当業界で既知の標準医学化学的方法は、一般的に、Pergamon Pressにより出版された種々の著者及び編集者によるシリーズ「総合医薬品化学(Comprehensive Medicinal Chemistry)」におけるのと本質的に同様に模範とされる。
明細書、特許請求の範囲及び/又は図面に開示された本発明の特徴は、別々に、そしてその任意の組合せで、その種々の形態で本発明を具体化するための材料であり得る。
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語及び科学用語は全て、開示される本発明が属する当業界の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似の又は等価の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験に用いられ得るが、しかし好ましい方法、用具及び材料は記載されるようなものである。本発明が従来の発明によるこのような開示に先行する権利を有さないことを認めると意図されるべきものは、本明細書中にはない。
COPD及び肺気腫に関するモデル及び結果
以下に示すように、遺伝子RTP801(同時譲渡特許公報WO 06/023544A2及び同時譲渡出願PCT/US2007/01468参照)(これらの記載内容は参照により全体が本明細書中で援用される)に対して向けられる水溶液中の例示的siRNA(REDD14と呼ばれる)を、以下の動物モデルで試験した:
*喫煙誘導性肺気腫モデル: タバコの煙への長期曝露は、いくつかの動物、例えば特にマウス、モルモットにおいて肺気腫を引き起こす。
*肺気腫の引き金としての肺プロテアーゼ活性。
*肺気腫のVEGFR抑制モデル。
*齧歯類におけるヒト好中球/膵臓エラスターゼによる気管支滴下注入。
*MMP(マトリックス・メタロプロテアーゼ)誘導性肺気腫。
*炎症誘導性肺気腫。
以下に示すように、遺伝子RTP801(同時譲渡特許公報WO 06/023544A2及び同時譲渡出願PCT/US2007/01468参照)(これらの記載内容は参照により全体が本明細書中で援用される)に対して向けられる水溶液中の例示的siRNA(REDD14と呼ばれる)を、以下の動物モデルで試験した:
*喫煙誘導性肺気腫モデル: タバコの煙への長期曝露は、いくつかの動物、例えば特にマウス、モルモットにおいて肺気腫を引き起こす。
*肺気腫の引き金としての肺プロテアーゼ活性。
*肺気腫のVEGFR抑制モデル。
*齧歯類におけるヒト好中球/膵臓エラスターゼによる気管支滴下注入。
*MMP(マトリックス・メタロプロテアーゼ)誘導性肺気腫。
*炎症誘導性肺気腫。
付加的には、肺気腫モデルは、遺伝的手段により作られ得る(例えばTSK突然変異を保有するマウス)し、肺気腫動物は、肺気腫に対する感受性を有する既知の修飾因子、とりわけ肺損傷、肺胞形成不全、過酸素症、糖質コルチコイド処置及び栄養により作成され得る。
A. 肺気腫のマウスモデル(RTP801ノックアウトマウスを使用)における疾患発症に及ぼすRTP801の欠如の影響の評価
(1)喫煙(CS)誘導性炎症及びアポトーシスを、5匹のRTP801 KO及び5匹の対照野生型4月齢雄マウスで開始した。マウスを、7日間、強度のCS(Rangasamy et al.(上記参照)に記載されたような)に付した。上記のVEGFR抑制実験からのKO及びWT非処置マウスも、この実験のための非処置対照群として役立てた。その後、肺をアガロース膨張し、固定し、そしてパラフィン中に包埋して、KOマウスにおける発症酸化ストレスを、以下により査定した:
a)肺切片中の8−オキソ−dGの免疫組織化学的局在及び定量;
b)特異的抗体を用いた肺切片における活性カスパーゼ3の免疫組織化学的局在及び定量、あるいはTUNEL陽性細胞数の定量的評価;
c)肺抽出物中のセラミド濃度の測定;
d)肺抽出物中のカスパーゼ活性の測定。
(1)喫煙(CS)誘導性炎症及びアポトーシスを、5匹のRTP801 KO及び5匹の対照野生型4月齢雄マウスで開始した。マウスを、7日間、強度のCS(Rangasamy et al.(上記参照)に記載されたような)に付した。上記のVEGFR抑制実験からのKO及びWT非処置マウスも、この実験のための非処置対照群として役立てた。その後、肺をアガロース膨張し、固定し、そしてパラフィン中に包埋して、KOマウスにおける発症酸化ストレスを、以下により査定した:
a)肺切片中の8−オキソ−dGの免疫組織化学的局在及び定量;
b)特異的抗体を用いた肺切片における活性カスパーゼ3の免疫組織化学的局在及び定量、あるいはTUNEL陽性細胞数の定量的評価;
c)肺抽出物中のセラミド濃度の測定;
d)肺抽出物中のカスパーゼ活性の測定。
(2)KOマウスにおける長期喫煙
6匹のKO及び6匹の月齢適合WT雌マウスを、6ヶ月の期間中、強度の喫煙(5時間/日)に付した。次にマウスを屠殺し、平均中隔間直径(肺気腫発症のパラメーター)を形態学的アプローチを用いて評価した。
6匹のKO及び6匹の月齢適合WT雌マウスを、6ヶ月の期間中、強度の喫煙(5時間/日)に付した。次にマウスを屠殺し、平均中隔間直径(肺気腫発症のパラメーター)を形態学的アプローチを用いて評価した。
B. RTP801不活性siRNAの肺内送達を用いた内因性RTP801を抑制することによる肺気腫のマウスモデルにおける疾患進行に及ぼすRTP801の欠如の影響の評価
CS誘導性炎症を、C57BL6マウス、10匹/群の2群における7日喫煙により誘導した。群1:CS+対照siRNA(REDD8)siRNAの送達;群2:CS+RTP801 siRNA(REDD14)。マウスの対照群にいずれかの型のsiRNAを滴注したが、室内エアコンディション中に保持した。ノックアウトマウスを用いた上記の実験の場合と同様に、動物を評価した。
CS誘導性炎症を、C57BL6マウス、10匹/群の2群における7日喫煙により誘導した。群1:CS+対照siRNA(REDD8)siRNAの送達;群2:CS+RTP801 siRNA(REDD14)。マウスの対照群にいずれかの型のsiRNAを滴注したが、室内エアコンディション中に保持した。ノックアウトマウスを用いた上記の実験の場合と同様に、動物を評価した。
方法
喫煙(CS)への曝露
喫煙機(モデルTE−10、Teague Enterprises, Davis, CA, USA)を用いて、2R4F参照タバコ(2.45 mgニコチン/タバコ;米国ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学タバコ研究所から購入)を燃焼することにより、曝露を実行した(7 時間/日、7日/週)。各々のくすぶっているタバコを2秒間吐き出し、1.05 L/分の流速で、毎分1回、全部で8回吐き出して、35 cm3の標準吐出量を提供した。一度に5本のタバコを燃焼することにより、副流煙(89%)と主流煙(11%)の混合物を生じるよう、喫煙機を調整した。小室大気を総懸濁微粒子及び一酸化炭素に関してモニタリングし、それぞれ90 mg/m3及び350 ppmの濃度であった。
喫煙(CS)への曝露
喫煙機(モデルTE−10、Teague Enterprises, Davis, CA, USA)を用いて、2R4F参照タバコ(2.45 mgニコチン/タバコ;米国ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学タバコ研究所から購入)を燃焼することにより、曝露を実行した(7 時間/日、7日/週)。各々のくすぶっているタバコを2秒間吐き出し、1.05 L/分の流速で、毎分1回、全部で8回吐き出して、35 cm3の標準吐出量を提供した。一度に5本のタバコを燃焼することにより、副流煙(89%)と主流煙(11%)の混合物を生じるよう、喫煙機を調整した。小室大気を総懸濁微粒子及び一酸化炭素に関してモニタリングし、それぞれ90 mg/m3及び350 ppmの濃度であった。
形態学的及び外形計測的分析
マウスのCSへの曝露又はRTP801発現プラスミドの滴注後、マウスをハロタンで麻酔して、以前に記載されたように肺を25 cmの定圧で0.5%低溶融アガロースで膨張させた。膨張肺を10%緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。切片(5 μm)をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。平均肺胞直径、肺胞長及び平均線形中隔を、Image Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)を用いたコンピューター援用外形計測により測定した。各群の肺切片を暗号化し、ニコンE800顕微鏡、20×レンズを用いて、スライドの同一性を知らされていない研究者が代表的画像(15/肺切片)を得た。
マウスのCSへの曝露又はRTP801発現プラスミドの滴注後、マウスをハロタンで麻酔して、以前に記載されたように肺を25 cmの定圧で0.5%低溶融アガロースで膨張させた。膨張肺を10%緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。切片(5 μm)をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。平均肺胞直径、肺胞長及び平均線形中隔を、Image Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)を用いたコンピューター援用外形計測により測定した。各群の肺切片を暗号化し、ニコンE800顕微鏡、20×レンズを用いて、スライドの同一性を知らされていない研究者が代表的画像(15/肺切片)を得た。
気管支肺胞洗浄(BAL)及び表現型分類
CSへの曝露又はRTP801発現プラスミドの滴注後、マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。マウスの肺から収集したBAL液を遠心分離(4℃で500 g)し、細胞ペレットをリン酸塩緩衝生理食塩水中に再懸濁した。洗浄液中の細胞の総数を確定し、2×104細胞をガラススライド上で細胞遠心分離(Shandon Southern Products, Pittsburgh, PA, USA)して、ライト・ギムザ染色で染色した。標準細胞学的技法に従って、300細胞に関して鑑別細胞計数を実施した。
CSへの曝露又はRTP801発現プラスミドの滴注後、マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。マウスの肺から収集したBAL液を遠心分離(4℃で500 g)し、細胞ペレットをリン酸塩緩衝生理食塩水中に再懸濁した。洗浄液中の細胞の総数を確定し、2×104細胞をガラススライド上で細胞遠心分離(Shandon Southern Products, Pittsburgh, PA, USA)して、ライト・ギムザ染色で染色した。標準細胞学的技法に従って、300細胞に関して鑑別細胞計数を実施した。
肺中の肺胞アポトーシス細胞集団の同定
肺中でアポトーシスを受けている異なる肺胞細胞型を同定するために、活性カスパーゼ3の免疫組織化学的染色を、室内空気(RA)並びにCS曝露マウスからの肺切片で実施した。肺中のアポトーシスII型上皮細胞を同定するために、活性カスパーゼ3標識後、肺切片を抗マウス界面活性タンパク質C(SpC)抗体とともに、次に抗ウサギテキサスレッド抗体とともにインキュベートした。先ず抗マウスCD 31抗体とともに、次にビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体とともに切片をインキュベートすることにより、アポトーシス上皮細胞を同定した。肺切片をPBS中ですすぎ、次にストレプトアビジン−テキサスレッド共役複合体とともにインキュベートした。先ずラット抗マウスMac−3抗体とともに、次に抗ラットテキサスレッド抗体とともに切片をインキュベートすることにより、肺中のアポトーシスマクロファージを同定した。最後に、DAPIを全ての肺切片に適用し、5分間インキュベートして、洗浄し、Vectashield HardSet封入剤で封入した。DAPI及びフルオレセインをそれぞれ330〜380 nm及び465〜495 nmで可視化した。ニコンE800顕微鏡、40×レンズで、肺切片の画像を得た。
肺中でアポトーシスを受けている異なる肺胞細胞型を同定するために、活性カスパーゼ3の免疫組織化学的染色を、室内空気(RA)並びにCS曝露マウスからの肺切片で実施した。肺中のアポトーシスII型上皮細胞を同定するために、活性カスパーゼ3標識後、肺切片を抗マウス界面活性タンパク質C(SpC)抗体とともに、次に抗ウサギテキサスレッド抗体とともにインキュベートした。先ず抗マウスCD 31抗体とともに、次にビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体とともに切片をインキュベートすることにより、アポトーシス上皮細胞を同定した。肺切片をPBS中ですすぎ、次にストレプトアビジン−テキサスレッド共役複合体とともにインキュベートした。先ずラット抗マウスMac−3抗体とともに、次に抗ラットテキサスレッド抗体とともに切片をインキュベートすることにより、肺中のアポトーシスマクロファージを同定した。最後に、DAPIを全ての肺切片に適用し、5分間インキュベートして、洗浄し、Vectashield HardSet封入剤で封入した。DAPI及びフルオレセインをそれぞれ330〜380 nm及び465〜495 nmで可視化した。ニコンE800顕微鏡、40×レンズで、肺切片の画像を得た。
活性カスパーゼ−3の免疫組織化学的局在
活性カスパーゼ−3検定の免疫組織化学的染色を抗活性カスパーゼ−3抗体を用いて実施し、そして活性カスパーゼ−3陽性細胞をImage Pro Plusプログラムを用いてマクロで計数した。肺胞長と呼ばれる本明細書中の肺胞プロフィールの和により計数を正規化し、μmで表した。肺胞長は、平均線形中隔と逆相関し、即ち、肺胞中隔が破壊されると、平均線形中隔は総肺胞長として増大し、即ち総肺胞中隔長は低減する。
活性カスパーゼ−3検定の免疫組織化学的染色を抗活性カスパーゼ−3抗体を用いて実施し、そして活性カスパーゼ−3陽性細胞をImage Pro Plusプログラムを用いてマクロで計数した。肺胞長と呼ばれる本明細書中の肺胞プロフィールの和により計数を正規化し、μmで表した。肺胞長は、平均線形中隔と逆相関し、即ち、肺胞中隔が破壊されると、平均線形中隔は総肺胞長として増大し、即ち総肺胞中隔長は低減する。
カスパーゼ3活性検定
カスパーゼ−3活性の活性を、メーカーの使用説明書に従って蛍光計測検定を用いて肺組織抽出物中で測定した。瞬間凍結肺組織(n=3/群)を検定緩衝液でホモジナイズし、その後、音波処理し、800 ×gで遠心分離した。核及び細胞破砕屑の除去後、上清(300 μgタンパク質)を次にプロ蛍光性基質とともに室温で1時間インキュベートし、蛍光強度をTyphoonホスホイメージャー(Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ, USA)を利用して測定した。結果を、カスパーゼ3酵素活性の単位で表現され、総タンパク質濃度により正規化される特定カスパーゼ−3基質切断の速度として表す。活性組換えカスパーゼ3を、検定標準(0〜4 U)として利用した。基質を伴わない組織溶解物、検定緩衝液単独、及びカスパーゼ3阻害剤を伴う溶解物を、陰性対照として利用した。
カスパーゼ−3活性の活性を、メーカーの使用説明書に従って蛍光計測検定を用いて肺組織抽出物中で測定した。瞬間凍結肺組織(n=3/群)を検定緩衝液でホモジナイズし、その後、音波処理し、800 ×gで遠心分離した。核及び細胞破砕屑の除去後、上清(300 μgタンパク質)を次にプロ蛍光性基質とともに室温で1時間インキュベートし、蛍光強度をTyphoonホスホイメージャー(Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ, USA)を利用して測定した。結果を、カスパーゼ3酵素活性の単位で表現され、総タンパク質濃度により正規化される特定カスパーゼ−3基質切断の速度として表す。活性組換えカスパーゼ3を、検定標準(0〜4 U)として利用した。基質を伴わない組織溶解物、検定緩衝液単独、及びカスパーゼ3阻害剤を伴う溶解物を、陰性対照として利用した。
8−オキソ−dGの免疫組織化学的局在
8−オキソ−dGの免疫組織化学的局在及び定量化に関して、CSに曝露されるか又はRTP801発現プラスミドで滴注されたマウスの肺切片を、抗8−オキソ−dG抗体とともにインキュベートし、マウス抗体を用いるInnoGenexTM Iso-IHC DABキットを用いて染色した。8−オキソ−dG陽性細胞をマクロ(Image Pro Plus使用)で計数し、記載したように肺胞長により計数を正規化した。
8−オキソ−dGの免疫組織化学的局在及び定量化に関して、CSに曝露されるか又はRTP801発現プラスミドで滴注されたマウスの肺切片を、抗8−オキソ−dG抗体とともにインキュベートし、マウス抗体を用いるInnoGenexTM Iso-IHC DABキットを用いて染色した。8−オキソ−dG陽性細胞をマクロ(Image Pro Plus使用)で計数し、記載したように肺胞長により計数を正規化した。
マウス肺へのプラスミドDNAの滴下注入
RTP801発現及び対照ベクターのプラスミドDNAを、内毒素無含有DNA単離キット下で調製した。気管内滴下注入のために、50 ugのプラスミドDNAを80 ul滅菌ペルフルオロカーボン中で送達した。ペルフルオロカーボンの酸素保有特性はこれらの容積でそれを良好耐容性にするが、一方、その物理化学的特性は、気管内に滴下注入されると、非常に効率的な遠位肺送達を可能にする。マウスを短時間吸入ハロタン曝露により麻酔して、舌を鉗子によりそっと前方に引き出して、鈍端血管カテーテルを用いて舌の基部に適用したペルフルオロカーボン溶液で気管を滴注した。
RTP801発現及び対照ベクターのプラスミドDNAを、内毒素無含有DNA単離キット下で調製した。気管内滴下注入のために、50 ugのプラスミドDNAを80 ul滅菌ペルフルオロカーボン中で送達した。ペルフルオロカーボンの酸素保有特性はこれらの容積でそれを良好耐容性にするが、一方、その物理化学的特性は、気管内に滴下注入されると、非常に効率的な遠位肺送達を可能にする。マウスを短時間吸入ハロタン曝露により麻酔して、舌を鉗子によりそっと前方に引き出して、鈍端血管カテーテルを用いて舌の基部に適用したペルフルオロカーボン溶液で気管を滴注した。
マウス肺へのsiRNAの滴下注入
ケタミン/キシラジン(115/22 mg/kg)の腹腔内注射により、マウスを麻酔した。5連続10 μl部分を送達することにより、0.9%NaClの50 μl容積中で、50 μgのsiRNAを鼻内滴注した。鼻内滴注の終了時に、マウスの頭部を1分間真直ぐに保持して、滴注溶液全てが内側に流れ込むのを保証した。
ケタミン/キシラジン(115/22 mg/kg)の腹腔内注射により、マウスを麻酔した。5連続10 μl部分を送達することにより、0.9%NaClの50 μl容積中で、50 μgのsiRNAを鼻内滴注した。鼻内滴注の終了時に、マウスの頭部を1分間真直ぐに保持して、滴注溶液全てが内側に流れ込むのを保証した。
さらなる情報に関しては、以下を参照されたい:Rangasamy T, Cho CY, Thimmulappa, RK, Zhen L, Srisuma SS, Kensler TW, Yamamoto M, Petrache I, Tuder RM, Biswal S. Submitted to Journal of Clinical Investigation;Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel.. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001;Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder Lamute Teraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. J. Clin. Invest. 106: 1311-1319 (2000);並びに総論:Robin M. Tuder, Sharon McGrath and Enid Neptune, The Pathological mechanisms of emphysema models: what do they have in common?, Pulmonary Pharmacology & Therpaeutics 2002における再検討。
結果
1. RTP801発現プラスミドの滴下注入は、マウス肺における肺気腫様表現型を生じ、これは、(1)気管支肺胞洗浄細胞数の増大(図1A);(2)肺中隔細胞のアポトーシス(図1B)及び肺胞直径の増大(図1C)により明らかである。
2. RTP801 siRNA(REDD14)の滴下注入は、肺におけるRTP801発現の低減を生じた(図3B)。
3. 肺胞直径の拡大の欠如により明らかなように、RTP801 KOマウスは6ヶ月の喫煙後に肺気腫発症から防護された(図4)。
4. 1週間の喫煙後の炎症気管支肺胞細胞数の低減により明らかなように、RTP801 KOマウスは喫煙誘導性炎症から防護された(図2、A−B)。
5. 活性化カスパーゼに関する肺切片染色により明らかなように、RTP801 KOマウスは肺中隔細胞の喫煙誘導性アポトーシスから防護された(図2C)。
6. 1週間の喫煙後の炎症気管支肺胞細胞数の低減により明らかなように、REDD14滴注マウスは喫煙誘導性炎症から部分的に防護された(図3A)。
7. 活性化カスパーゼに関する肺切片染色により、そして抗活性化カスパーゼ3抗体を用いた肺抽出物の免疫ブロッティングにより明らかなように、REDD14滴注マウスは肺中隔細胞の喫煙誘導性アポトーシスから部分的に防護された(図3C)。
したがってsiRNAは首尾よく肺に送達され、肺気腫の種々のマウスモデルにおける疾患進行を防止した。
1. RTP801発現プラスミドの滴下注入は、マウス肺における肺気腫様表現型を生じ、これは、(1)気管支肺胞洗浄細胞数の増大(図1A);(2)肺中隔細胞のアポトーシス(図1B)及び肺胞直径の増大(図1C)により明らかである。
2. RTP801 siRNA(REDD14)の滴下注入は、肺におけるRTP801発現の低減を生じた(図3B)。
3. 肺胞直径の拡大の欠如により明らかなように、RTP801 KOマウスは6ヶ月の喫煙後に肺気腫発症から防護された(図4)。
4. 1週間の喫煙後の炎症気管支肺胞細胞数の低減により明らかなように、RTP801 KOマウスは喫煙誘導性炎症から防護された(図2、A−B)。
5. 活性化カスパーゼに関する肺切片染色により明らかなように、RTP801 KOマウスは肺中隔細胞の喫煙誘導性アポトーシスから防護された(図2C)。
6. 1週間の喫煙後の炎症気管支肺胞細胞数の低減により明らかなように、REDD14滴注マウスは喫煙誘導性炎症から部分的に防護された(図3A)。
7. 活性化カスパーゼに関する肺切片染色により、そして抗活性化カスパーゼ3抗体を用いた肺抽出物の免疫ブロッティングにより明らかなように、REDD14滴注マウスは肺中隔細胞の喫煙誘導性アポトーシスから部分的に防護された(図3C)。
したがってsiRNAは首尾よく肺に送達され、肺気腫の種々のマウスモデルにおける疾患進行を防止した。
噴霧エーロゾル処方物の単回口鼻吸入投与後のカニクイザルにおけるsiRNA(REDD14Cy3.5及びI5NP)の薬物動態及び組織分布
要約
蛍光標識REDD14Cy3.5及び/又はI5NP siRNAの噴霧エーロゾル処方物の単回口鼻吸入用量を、雄カニクイザルに投与した。用量投与後、血漿中のI5NPの濃度、血漿中のI5NPの非区画素因動態、肺におけるREDD14Cy3.5の定性的分布、並びに肺中のI5NPの半定量的分布を確定した。
要約
蛍光標識REDD14Cy3.5及び/又はI5NP siRNAの噴霧エーロゾル処方物の単回口鼻吸入用量を、雄カニクイザルに投与した。用量投与後、血漿中のI5NPの濃度、血漿中のI5NPの非区画素因動態、肺におけるREDD14Cy3.5の定性的分布、並びに肺中のI5NPの半定量的分布を確定した。
試験に用いられるsiRNAの配列:
REDD14は、例示的RTP801抑制siRNAである;I5NPは例示的p53抑制siRNAである。
3つの別個の用量処置を、以下で詳述するように動物に施した。理論的吸入達成用量のsiRNAを毎分呼吸量(前処置中に測定)、試験品のエーロゾル濃度(噴霧器の前処置較正中に重量計測的に測定)、処置時間、総エーロゾル沈着分画(100%と仮定される)、並びに各用量投与前日の動物の体重から算定した。
I5NP又はI5NPとREDD14Cy3.5 siRNAの混合物の吸入用量投与後のサルのいずれにおいても、処置関連臨床徴候は観察されなかった。
処置1(I5NPのみで用量投与)後、血液試料を用量投与後種々の時点で採取し、I5NP濃度をハイブリダイゼーション検定を用いて血漿中で測定した。血漿中のI5NPの最高平均濃度(21.0±5.01 ng/mL)は、用量投与後分析した最初の時点(用量投与終了の15分後)で観察されたが、これは、吸入用量からの全身循環中へのI5NPの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、用量投与終了の8時間又は24時間後まで急速に減少し、その後、それらは定量限界より低かった(0.1 ng/mL)。
サル血漿中のI5NP濃度に関して非区画薬物動態パラメーターを算定し、これらを以下に示す:
排出半減期(即ち1.5〜5.7時間)及びAUC0-inf(16.1〜72.0 ng.h/mL)の変動により実証されるように、個々の動物間のかなりの程度の変動が認められた。
処置2(9:1の比でのI5NP及び蛍光標識REDD14Cy3.5 siRNAの混合物)を、約2週間の洗浄期間後に動物101及び102に投与した。動物を安楽死させて、肺を用量投与終了の約30分後に採取した。動物102からの肺及び右腎臓を無傷で採取して、4%(v/v)パラホルムアルデヒド中で固定し、蛍光分析に出した。全ての肺葉から採取した切片全てにおいて、蛍光物質を検出した。細気管支から外側に肺胞壁に放射する蛍光標識を観察した。最強シグナルは、右尾状葉、並びに左頭葉の尾状切片と関連していると思われた。右腎で観察された標識はほとんどなく、せいぜい、わずかな残留染色が腎尿細管の管腔で観察された。
動物101からの肺を取り出し、肺の各葉を切断して、細気管支組織と残りの末梢肺組織の試料を提供した。ハイブリダイゼーション分析によるI5NP濃度の分析のために必要になるまで、これらの試料を凍結保存した(約−80℃)。結果は、サル肺に関する特定検定が開発されていないため、半定量的であると考えられた。用量投与終了の約30分後、I5NPは、各肺の全葉の細気管支と末梢組織の両方で、高濃度で見出された。濃度は肺葉全てを通して同様であり、そして一般的に細気管支試料より末梢組織の方が高かった。
I5NPのみを含む処置3を、処置2の約3週間後に動物103、104及び105に投与した。全動物から用量投与終了15分後に、そして各々個々のサルに関して最終時点で、血液試料を採取した。用量投与終了の6、24及び72時間後にI5NP濃度のハイブリダイゼーション検定のために、肺試料を採取した。用量投与終了の15分後のI5NPの平均血漿濃度は、40.3±14.5 ng/mLであった。用量投与終了の6時間後、I5NPレベルは11.1 ng/mL(動物103)で、24時間後では、0.192 ng/mL(動物104)であった。I5NPの濃度は、用量投与終了の72時間後では血漿における定量限界(0.10 ng/mL)より低かった(動物105)。
肺の左頭及び右尾状葉から採取した細気管支及び末梢肺組織において、I5NPの相対濃度を測定した。相対濃度は各時点で採取した組織試料では同様であって、これらは時間の経過に伴って減少したが、しかしこれらは用量投与終了の72時間後に依然として検出可能であった。
肺組織におけるsiRNAのレベルは、全時点で、全身循環中のレベルよりはるかに高かった。I5NPレベルは、用量投与後の各時点で肺の全葉において非常に良く似ていたが、これは、試験物質が全葉に送達されていた、ということを示す。用量投与終了の約30分後に、細気管支領域より高レベルのI5NPが肺の末梢域に存在したが、これは、吸入用量投与により細気管支に送達された試験物質が迅速に吸収され、残りの肺組織に分布した、ということを示唆する。
要するに、雄カニクイザルへの、蛍光標識REDD14Cy3.5及び/又はI5NP siRNAの噴霧エーロゾル処方物の単回口−鼻吸入用量の投与後、siRNAの肺中分布及び全身曝露(血漿中)を確定した。血漿中のI5NPの最高平均濃度は、用量投与終了後に分析した最初の時点で観察されたが、これは、吸入用量投与から全身循環中へのI5NPの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、急速に減少した。肺中のI5NPのレベルは、全ての時点で血漿中のレベルより大きく、そしてレベルは用量投与終了後72時間でも依然として検出可能であった。肺中の両siRNAの分布は、全面的で且つ広範囲に及んだ。I5NPは投与部位(細気管支)から迅速に吸収されることが判明し、そして用量投与終了の30分後までに肺の末梢組織で高濃度で見出された。
実験手順
用量処方物の調製
処置1及び処置3処方物の調製
用量投与当日に、各用量処方物を調製した。処方物は、清浄技法を用いて層流式フード下で調製した。
用量処方物の調製
処置1及び処置3処方物の調製
用量投与当日に、各用量処方物を調製した。処方物は、清浄技法を用いて層流式フード下で調製した。
I5NP siRNAを計量し、注射用滅菌水USP中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。I5NP siRNAの取扱いは全て、光を遮断して、又は黄色光条件下で実施した。
その結果生じた溶液を、滅菌容器中に濾過(0.22 μmフィルター)した。
処置2処方物の調製
用量投与当日に、各用量処方物を調製した。処方物は、清浄技法を用いて層流式フード下で調製した。I5NP siRNAを計量し、注射用滅菌水USP中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。REDD14Cy3.5 siRNAを計量し、注射用滅菌水USP中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。I5NPおよびREDD14Cy3.5の取扱いは全て、光を遮断して、又は黄色光条件下で実施した。
用量投与当日に、各用量処方物を調製した。処方物は、清浄技法を用いて層流式フード下で調製した。I5NP siRNAを計量し、注射用滅菌水USP中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。REDD14Cy3.5 siRNAを計量し、注射用滅菌水USP中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。I5NPおよびREDD14Cy3.5の取扱いは全て、光を遮断して、又は黄色光条件下で実施した。
REDD14Cy3.5(40 mg/mL)及びI5NP(40 mg/mL)溶液を1:9の比で混合し、滅菌容器中に濾過(0.22 μmフィルター)した。
前処置及び処置手順
吸入曝露用具
流入及び流出管並びに呼吸ループを装備した小児麻酔型口鼻マスクを用いて、試験エーロゾルで動物を処置した。処置中、動物を拘束スリングに入れた。Aeroneb(Aerogen)噴霧器を用いて試験大気を発生させて、下記のように出力に関して査定した。試験物質への曝露のレベルを、曝露継続時間を変えることにより達成した。
吸入曝露用具
流入及び流出管並びに呼吸ループを装備した小児麻酔型口鼻マスクを用いて、試験エーロゾルで動物を処置した。処置中、動物を拘束スリングに入れた。Aeroneb(Aerogen)噴霧器を用いて試験大気を発生させて、下記のように出力に関して査定した。試験物質への曝露のレベルを、曝露継続時間を変えることにより達成した。
処置の開始前に、動物を、時間を漸次増大しながら、スリングおよび曝露マスクに順化させた。順化の後期段階中、注射用0.9%(w/v)滅菌塩化ナトリウム、USPのエーロゾルに動物を曝露して、曝露系の全構成成分をそれらに提示した。
前試験大気特性化
処置開始前に、試験エーロゾルの大気特性化を、I5NP siRNA処方物のみを用いて実施した。
処置開始前に、試験エーロゾルの大気特性化を、I5NP siRNA処方物のみを用いて実施した。
2つのAerogen Aeroneb(登録商標)Pro Laboratory噴霧器系(1つは試験用そして1つはバックアップ用器具)に関して、呼吸帯での試験品出力の評価を重力測定的に実施した。物品エーロゾルの粒子サイズ分布分析を1つのマスクを通して実施し、Cascade Impactorを用いて重力測定データから質量中央値空気力学的直径(MMAD)±幾何標準偏差(GSD)を算定した。
達成投与量の算定
各処置レベルに関する活性成分の達成用量(mg/kg/回)を、以下のように確定した:
活性成分の達成用量(mg/kg/日)=RMV×活性濃度×T×D/BW
ここで、RMV(L/分)=前処置期間中に2回測定される毎分呼吸量*
活性濃度(mg/L)=前処置期間中に重力測定的分析により確定される活性成分のエーロゾル濃度
T(分)=処置時間
D =総エーロゾル沈着分画は100%であると仮定された
BW(kg)=体重/処置前動物
* Buxco Bio System XAを用いて前処置期間中に測定
各処置レベルに関する活性成分の達成用量(mg/kg/回)を、以下のように確定した:
活性成分の達成用量(mg/kg/日)=RMV×活性濃度×T×D/BW
ここで、RMV(L/分)=前処置期間中に2回測定される毎分呼吸量*
活性濃度(mg/L)=前処置期間中に重力測定的分析により確定される活性成分のエーロゾル濃度
T(分)=処置時間
D =総エーロゾル沈着分画は100%であると仮定された
BW(kg)=体重/処置前動物
* Buxco Bio System XAを用いて前処置期間中に測定
siRNAの理論的吸入達成用量を、以下のように算定した:
毎分呼吸量査定
前処置中2回、各サルの毎分呼吸量を15分間継続的に記録した。15分間隔の全体的平均を各動物に関して確定し、このパラメーターは処置による影響を及ぼされない、と仮定した。Buxco Bio System XAを用いて測定を行なった。
前処置中2回、各サルの毎分呼吸量を15分間継続的に記録した。15分間隔の全体的平均を各動物に関して確定し、このパラメーターは処置による影響を及ぼされない、と仮定した。Buxco Bio System XAを用いて測定を行なった。
処置
動物を以下のように処置した:
動物を以下のように処置した:
処置1に関して
試験1日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のI5NP siRNAを、利用可能なサルのうちの4匹(101〜104)に投与した。2.0 L/分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びに40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与された総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。動物は、単回較正試験Aeronebを用いて、平行してというよりむしろ、順次、処置を受けた。
試験1日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のI5NP siRNAを、利用可能なサルのうちの4匹(101〜104)に投与した。2.0 L/分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びに40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与された総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。動物は、単回較正試験Aeronebを用いて、平行してというよりむしろ、順次、処置を受けた。
処置2に関して
試験15日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のI5NP及びREDD14Cy3.5(蛍光標識)siRNAの混合物を、利用可能な動物のうちの2匹(101及び102)に投与した。2.0 L/分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びにsiRNAの40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与されたsiRNAの総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。
試験15日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のI5NP及びREDD14Cy3.5(蛍光標識)siRNAの混合物を、利用可能な動物のうちの2匹(101及び102)に投与した。2.0 L/分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びにsiRNAの40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与されたsiRNAの総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。
処置3に関して
試験35日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のI5NP siRNAを、3匹の残りの主要試験動物(103〜105)に投与した。2.0 L/分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びに40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与された総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。
試験35日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のI5NP siRNAを、3匹の残りの主要試験動物(103〜105)に投与した。2.0 L/分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びに40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与された総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。
分析のための試料採取
血液/血漿(処置1)
用量投与前、吸入終了の15分後、30分後、1、2、4、6、8及び24時間後に、全用量を摂取した各動物(101、102、103及び106)の左又は右大腿静脈から、血液試料(0.5 mL)を採取した。抗凝血剤としてK3EDTAを有する試験管中に血液を収集し、次に遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
血液/血漿(処置1)
用量投与前、吸入終了の15分後、30分後、1、2、4、6、8及び24時間後に、全用量を摂取した各動物(101、102、103及び106)の左又は右大腿静脈から、血液試料(0.5 mL)を採取した。抗凝血剤としてK3EDTAを有する試験管中に血液を収集し、次に遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
血液/血漿及び組織(処置2)
用量投与前、吸入終了の15分後及び30分後に、血液試料(0.5 mL)を採取した。各動物(101及び102)の左大腿静脈からK3EDTA試験管中に血液を収集し、遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
用量投与前、吸入終了の15分後及び30分後に、血液試料(0.5 mL)を採取した。各動物(101及び102)の左大腿静脈からK3EDTA試験管中に血液を収集し、遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
30分血液採取後できるだけ直ぐに、前麻酔剤(ケタミン/キシラジン・カクテル)の筋肉内注射を動物に施し、剖検域に移した。次に動物をペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により麻酔し、その後、腋窩動脈又は大腿動脈の切開により失血させた。
血液/血漿及び組織(処置3)
用量投与前、吸入終了の15分後に、血液試料(0.5 mL)を全動物(103、104及び105)から採取した。第3血液試料は、吸入終了の6時間後(動物103)、24時間後(動物104)又は72時間後(動物105)に採取した。各動物(103〜105)の左又は右大腿静脈からK3EDTA試験管中に血液を収集し、遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
用量投与前、吸入終了の15分後に、血液試料(0.5 mL)を全動物(103、104及び105)から採取した。第3血液試料は、吸入終了の6時間後(動物103)、24時間後(動物104)又は72時間後(動物105)に採取した。各動物(103〜105)の左又は右大腿静脈からK3EDTA試験管中に血液を収集し、遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
最終血液採取直後に、前麻酔剤(ケタミン/キシラジン・カクテル)の筋肉内注射を動物に施し、剖検域に移した。次に動物をペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により麻酔し、その後、腋窩動脈又は大腿動脈の切開により失血させた。以下の組織及び器官を各動物から採取した:ハイブリダイゼーション検定のために両肺;肝臓、腎臓(両側)、脾臓、心臓、脳及び精巣。
試料処理
血液/血漿に関する試料処理(処置1、2及び3)
血液を、それが遠心分離されるまで、4℃で2700 rpmで約10分間、湿潤氷上に保持して、血漿を分離した(採取1時間以内)。血漿試料を分離し、適切に標識したバイアルに移し、ドライアイス上に載せた後、約−80℃で保存した。
血液/血漿に関する試料処理(処置1、2及び3)
血液を、それが遠心分離されるまで、4℃で2700 rpmで約10分間、湿潤氷上に保持して、血漿を分離した(採取1時間以内)。血漿試料を分離し、適切に標識したバイアルに移し、ドライアイス上に載せた後、約−80℃で保存した。
ワトソンLIMS系を用いて、血漿試料をトラッキングした。
肺に関する試料処理(処置2)
処置2の後の剖検時に、動物101の肺を動物から取り出した。肺を、個々の肺葉に分離した。気管支/細気管支並びに各肺葉の直周囲領域をできるだけ注意して切り出し、肺葉毎にプールした。残りの組織域を、肺葉毎にプールした。各プール試料(即ち、気管支/細気管支及び各肺葉に関する残りの組織)を、ハイブリダイゼーション検定による分析のために急速冷凍(−80℃)保存した。動物101からの肺試料を、ワトソンLIMS系を用いてトラッキングした。
処置2の後の剖検時に、動物101の肺を動物から取り出した。肺を、個々の肺葉に分離した。気管支/細気管支並びに各肺葉の直周囲領域をできるだけ注意して切り出し、肺葉毎にプールした。残りの組織域を、肺葉毎にプールした。各プール試料(即ち、気管支/細気管支及び各肺葉に関する残りの組織)を、ハイブリダイゼーション検定による分析のために急速冷凍(−80℃)保存した。動物101からの肺試料を、ワトソンLIMS系を用いてトラッキングした。
処置2の後の剖検時に、動物102の肺、気管支および気管を動物から取り出した。肺を、気管及び/又は気管支を介して注射器を用いて導入した4%パラホルムアルデヒドで灌流し、この固定液中に、周囲温度で約21時間、保存した。この後、できるだけ多くの元の固定液を、気管/気管支を介して注射器により引抜いて、0.2%パラホルムアルデヒドと入れ替えた。固定肺を、蛍光分布に関して分析した。
腎臓に関する試料処理(処置2)
処置2の後の剖検時に、動物102の右腎臓を動物から取り出した。腎臓を、各々が門部を通るよう、縦方向に1回、横方向に1回切断して4半分に切断した後、4%パラホルムアルデヒド中に浸漬して、約21時間冷蔵した。この後、固定液を0.2%パラホルムアルデヒドに変えて、蛍光分布に関して腎臓を分析した。
処置2の後の剖検時に、動物102の右腎臓を動物から取り出した。腎臓を、各々が門部を通るよう、縦方向に1回、横方向に1回切断して4半分に切断した後、4%パラホルムアルデヒド中に浸漬して、約21時間冷蔵した。この後、固定液を0.2%パラホルムアルデヒドに変えて、蛍光分布に関して腎臓を分析した。
肺に関する試料処理(処理3)
処置3の後の剖検の各特定時間に、動物103、104又は105の肺を動物から取り出した。各組の肺を、個々の肺葉に分離した。気管支/細気管支並びに各肺葉の直周囲領域をできるだけ注意して切り出し、肺葉毎にプールした。残りの組織域を、肺葉毎にプールした。各プール試料(即ち、気管支/細気管支及び各肺葉に関する残りの組織)を、ハイブリダイゼーション検定による分析のために急速冷凍(−80℃)保存した。動物103、104及び105からの肺試料を、ワトソンLIMS系を用いてトラッキングした。
処置3の後の剖検の各特定時間に、動物103、104又は105の肺を動物から取り出した。各組の肺を、個々の肺葉に分離した。気管支/細気管支並びに各肺葉の直周囲領域をできるだけ注意して切り出し、肺葉毎にプールした。残りの組織域を、肺葉毎にプールした。各プール試料(即ち、気管支/細気管支及び各肺葉に関する残りの組織)を、ハイブリダイゼーション検定による分析のために急速冷凍(−80℃)保存した。動物103、104及び105からの肺試料を、ワトソンLIMS系を用いてトラッキングした。
試料分析
血漿及び肺ハイブリダイゼーション分析
処置1及び3の後、認証ハイブリダイゼーション法に従ってPCS−MTLでのI5NP siRNA濃度に関して、血漿試料を分析した。
血漿及び肺ハイブリダイゼーション分析
処置1及び3の後、認証ハイブリダイゼーション法に従ってPCS−MTLでのI5NP siRNA濃度に関して、血漿試料を分析した。
動物101からの全ての肺試料(即ち、左頭葉、細気管支及び残り部分;左尾状葉、細気管支及び残り部分;右頭葉、細気管支及び残り部分;右中葉、細気管支及び残り部分;右尾状葉、細気管支及び残り部分;ならびに右副葉、細気管支及び残り部分)を、I5NP siRNA濃度に関して分析した。動物103、104及び105に関して、左頭葉(細気管支及び残り部分)及び右尾状葉(細気管支及び残り部分)を、I5NP siRNA濃度に関して分析した。ハイブリダイゼーション法を用いて分析を実施し、濃度値をラット腎臓較正曲線から外挿した。肺試料に関して得られた結果は、半定量的であると考えられた。
肺及び腎臓蛍光分析
処置2の後、動物102からの肺及び腎臓試料を、蛍光(REDD14Cy3.5 siRNAから)の分布に関して分析した。結果は、定量的であるとみなされた。
処置2の後、動物102からの肺及び腎臓試料を、蛍光(REDD14Cy3.5 siRNAから)の分布に関して分析した。結果は、定量的であるとみなされた。
データ分析
血漿濃度及び統計学的分析
平均血漿濃度値及び標準偏差を、適切な場合、算定した。
血漿濃度及び統計学的分析
平均血漿濃度値及び標準偏差を、適切な場合、算定した。
薬物動態
血漿における非区画素因動態を、処置1の後の個々の動物からの濃度データに関して実施した。以下のパラメーターを、適用可能な場合、概算した:
Cmax 最高観察血漿濃度
tmax 最高濃度が生じた時間
k 対数血漿対時間曲線の見掛けの最終相における選択時点の線形回帰分析により確定される最終速度定数
t1/2 1n2/kとして算定される最終半減期
AUC0-tlast 0時間から最終定量可能値までの血漿濃度対時間曲線下面積
AUC0-inf 0時間から無限時間までの血漿濃度対時間曲線下面積
外挿AUC0-inf% (AUC0-inf−AUC0-tlast)/×100
血漿における非区画素因動態を、処置1の後の個々の動物からの濃度データに関して実施した。以下のパラメーターを、適用可能な場合、概算した:
Cmax 最高観察血漿濃度
tmax 最高濃度が生じた時間
k 対数血漿対時間曲線の見掛けの最終相における選択時点の線形回帰分析により確定される最終速度定数
t1/2 1n2/kとして算定される最終半減期
AUC0-tlast 0時間から最終定量可能値までの血漿濃度対時間曲線下面積
AUC0-inf 0時間から無限時間までの血漿濃度対時間曲線下面積
外挿AUC0-inf% (AUC0-inf−AUC0-tlast)/×100
WinNonlinバージョン3.2コンピューターソフトウェアを用いて、全ての薬物動態パラメーターを概算した。
結果
動物及び用量特性
処置1を用量投与する前日、雄サルの平均体重は2.9±0.46 kg(2.6 kg〜3.6 kgの範囲)であった。処置2に関して、動物101及び102の体重は各動物に関して2.8 kgであったが、一方、処置3に関しては、平均体重は3.0±0.76 kg(2.3 kg〜3.8 kgの範囲)であった。
動物及び用量特性
処置1を用量投与する前日、雄サルの平均体重は2.9±0.46 kg(2.6 kg〜3.6 kgの範囲)であった。処置2に関して、動物101及び102の体重は各動物に関して2.8 kgであったが、一方、処置3に関しては、平均体重は3.0±0.76 kg(2.3 kg〜3.8 kgの範囲)であった。
投与したsiRNAの用量曝露時間及び概算用量レベル:処置1に関しては、用量曝露時間は15分(101、102)又は10分(103、106)であった。平均算定投与用量は、30.9±0.98 mg/kg(29.45〜31.56 mg/kgの範囲)であった。処置2に関しては、動物101は29.45 mg/kgの算定用量を15分に亘って摂取し、そして動物102は25.14 mg/kgの算定用量を13分に亘って摂取した。処置3に関しては、用量曝露時間は10分(103、104)又は12分(105)であった。平均算定投与用量は、30.4±2.17 mg/kg(29.13〜32.93 mg/kgの範囲)であった。
臨床観察
I5NP又はI5NPとREDD14Cy3.5 siRNAの混合物の吸入用量投与後のサルのいずれにおいても、処置関連臨床徴候は観察されなかった。種々の器官及び組織で観察された多種多様な肉眼的知見は、性的未熟性に関連し、死の直前であるか又は偶発的なものであると、そして毒物学的有意性を有さないと見なされた。
I5NP又はI5NPとREDD14Cy3.5 siRNAの混合物の吸入用量投与後のサルのいずれにおいても、処置関連臨床徴候は観察されなかった。種々の器官及び組織で観察された多種多様な肉眼的知見は、性的未熟性に関連し、死の直前であるか又は偶発的なものであると、そして毒物学的有意性を有さないと見なされた。
血漿中のI5NP siRNAの濃度及び薬物動態
血漿中のI5NP siRNAの濃度
処置1の後、雄サルの血漿中のI5NPの最高平均濃度は21.0±5.01 ng/mLで、用量投与終了の15分後(測定された最初の時点)に観察された。その後、血漿I5NPレベルは、用量投与終了の8時間後まで減少した(0.588±0.561 ng/mL、Cmax値の約3%)。動物101では、I5NPは用量投与終了の24時間後に依然として検出可能であった(0.205 ng/mL)が、しかし値は他のすべての動物においてこの時点で定量限界(LLQQ)より低かった。検定のためのLLQQは0.10 ng/mlであった。
血漿中のI5NP siRNAの濃度
処置1の後、雄サルの血漿中のI5NPの最高平均濃度は21.0±5.01 ng/mLで、用量投与終了の15分後(測定された最初の時点)に観察された。その後、血漿I5NPレベルは、用量投与終了の8時間後まで減少した(0.588±0.561 ng/mL、Cmax値の約3%)。動物101では、I5NPは用量投与終了の24時間後に依然として検出可能であった(0.205 ng/mL)が、しかし値は他のすべての動物においてこの時点で定量限界(LLQQ)より低かった。検定のためのLLQQは0.10 ng/mlであった。
処置3の後、用量投与終了の15分後に全ての動物から、そして最終的には単一動物/時点(用量投与終了の6時間後、14時間後及び72時間後)から、血液試料を採取した。用量投与終了の15分後のI5NPの平均血漿濃度は、40.3±14.5 ng/mLであった。用量投与終了後6時間目に、I5NPレベルは11.1 ng/mL(動物103)、24時間目では0.192 ng/mL(動物104)であった。I5NPの濃度は、用量投与終了の72時間後には血漿中で定量限界(0.10 ng/mL)未満であった(動物105)。
血漿中のI5NP siRNAの薬物動態(処置1)
AUC0-tlastに関する平均値は、38.9±23.6 ng・h/mL(15.8〜70.3の範囲)であった。排出相は4動物全てに関して明瞭に定義されると考えられ、したがって排出速度定数(kel)、排出半減期(t1/2)及びAUC0-infを、各サルに関して概算した。平均kelは0.279±0.143 h-1、平均t1/2は3.12±1.83 h、そして平均AUC0-infは40.6±24.5 ng・h/mL(16.1〜72.0 ng・h/mLの範囲)であった。tlastから無限時間までの外挿%は、0.82〜9.40%の範囲であった。
AUC0-tlastに関する平均値は、38.9±23.6 ng・h/mL(15.8〜70.3の範囲)であった。排出相は4動物全てに関して明瞭に定義されると考えられ、したがって排出速度定数(kel)、排出半減期(t1/2)及びAUC0-infを、各サルに関して概算した。平均kelは0.279±0.143 h-1、平均t1/2は3.12±1.83 h、そして平均AUC0-infは40.6±24.5 ng・h/mL(16.1〜72.0 ng・h/mLの範囲)であった。tlastから無限時間までの外挿%は、0.82〜9.40%の範囲であった。
肺及び腎臓におけるREDD14Cy3.5 siRNAの定量的分布
肺の全肺葉から採取した全切片において、蛍光標識を検出した。細気管支から外側に肺胞壁に放射する蛍光標識を観察した。最強シグナルは、右尾状葉、並びに左頭葉の尾状切片と関連していると思われた。
肺の全肺葉から採取した全切片において、蛍光標識を検出した。細気管支から外側に肺胞壁に放射する蛍光標識を観察した。最強シグナルは、右尾状葉、並びに左頭葉の尾状切片と関連していると思われた。
右腎で観察された標識はほとんどなく、せいぜい、わずかな残留染色が腎尿細管の管腔で観察された。
肺中のI5NP siRNAの半定量的分布
動物101(処置2の後)からの肺組織に関して、各肺葉を、細気管支及び直周囲組織並びに残りの部分、末梢肺葉組織に分離した。両組織型で、そして肺の6つの肺葉全てに関して、測定を行なった。用量投与終了の約30分後、I5NPは細気管支並びに各肺の全肺葉の末梢組織の両方において高濃度であることが判明した。濃度は肺葉全てを通して同様であり、そして一般的に細気管支試料より末梢組織の方が高かった。
動物101(処置2の後)からの肺組織に関して、各肺葉を、細気管支及び直周囲組織並びに残りの部分、末梢肺葉組織に分離した。両組織型で、そして肺の6つの肺葉全てに関して、測定を行なった。用量投与終了の約30分後、I5NPは細気管支並びに各肺の全肺葉の末梢組織の両方において高濃度であることが判明した。濃度は肺葉全てを通して同様であり、そして一般的に細気管支試料より末梢組織の方が高かった。
これらの結果に従って、動物103、104及び105に吸入用量のI5NPを投与し、用量投与終了の6、24及び72時間後の肺の左頭葉および右尾状葉から採取した細気管支および末梢肺組織で相対濃度を測定した。I5NPの相対濃度は、各時点で採取された組織試料において類似した。I5NPの濃度は用量投与終了後時間の増大に伴って減少したが、しかし用量投与終了の72時間後で依然として検出可能であった。
考察
血漿中のI5NPの最高平均濃度は、用量投与後分析した最初の時点(用量投与終了の15分後)で観察されたが、これは、吸入用量からの全身循環中へのI5NPの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、用量投与終了の8時間又は24時間後まで急速に減少し、その後、それらは定量限界より低かった。排出半減期(即ち1.5〜5.7時間)並びにAUC0-inf(16.1〜72.0 ng.h/mLの範囲)における変動により実証されるように、個々の動物間にかなりの程度の変動が認められた。
血漿中のI5NPの最高平均濃度は、用量投与後分析した最初の時点(用量投与終了の15分後)で観察されたが、これは、吸入用量からの全身循環中へのI5NPの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、用量投与終了の8時間又は24時間後まで急速に減少し、その後、それらは定量限界より低かった。排出半減期(即ち1.5〜5.7時間)並びにAUC0-inf(16.1〜72.0 ng.h/mLの範囲)における変動により実証されるように、個々の動物間にかなりの程度の変動が認められた。
肺組織におけるsiRNAのレベルは、全身循環中のレベルよりはるかに高かった。I5NPレベルは、用量投与後の各時点で肺の全葉において非常に良く似ていたが、これは、試験物質が全葉に送達されていた、ということを示す。用量投与終了の約30分後に、細気管支領域より高レベルのI5NPが肺の末梢域に存在したが、これは、吸入用量投与により細気管支に送達された試験物質が迅速に吸収され、残りの肺組織に分布した、ということを示唆する。肺組織中のI5NPのレベルは、用量投与終了後時間の増大に伴って減少したが、しかし用量投与終了の72時間後で依然として検出可能であった。全時点で、肺中のI5NPレベルは血漿中よりも高かった。
I5NP及びREDD14Cy3.5 siRNAの分布の比較(後者は蛍光検出により定量的に分析した)は、肺における2つの試験物質の分布にほとんど差はなかった、ということを示した。
結論
雄カニクイザルへの蛍光標識REDD14Cy3.5及び/又はI5NP siRNAの噴霧エーロゾル処方物の単回口−鼻吸入用量の投与後、siRNAの肺中分布及び全身曝露(血漿中)を確定した。
雄カニクイザルへの蛍光標識REDD14Cy3.5及び/又はI5NP siRNAの噴霧エーロゾル処方物の単回口−鼻吸入用量の投与後、siRNAの肺中分布及び全身曝露(血漿中)を確定した。
血漿中のI5NPの最高平均濃度は、用量投与終了後に分析した最初の時点で観察されたが、これは、吸入用量投与から全身循環中へのI5NPの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、急速に減少した。肺中のI5NPのレベルは、全ての時点で血漿中のレベルより大きく、そしてレベルは用量投与終了後72時間でも依然として検出可能であった。肺中の両siRNAの分布は、全面的で且つ広範囲に及んだ。I5NPは投与部位(細気管支)から迅速に吸収されることが判明し、そして用量投与終了の30分後までに肺の末梢組織で高濃度で見出された。
RTP801、p53、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA及びDUOX1に対して向けられる修飾siRNA(水溶液中に処方される)を、2つの記載siRNAに関して本質的に上記と同様に試験し、同様の結果を得たが、これは、siRNAが肺に首尾よく送達される、ということを示す。
in vivoでの腫瘍増殖に及ぼすNrf2 siRNA肺投与の作用
方法:
腫瘍異種移植: A549細胞(5×106)を雄無胸腺ヌードマウスの後肢に注射し、腫瘍を毎週測定した。以下の式を用いて腫瘍容積を測定した:[長さ(mm)×幅(mm)×幅(mm)×0.52]肺転移実験において、2×106のA549−C8−luc細胞をSCID-Beigeマウス(Charles River, MA)に静脈内注射した。
方法:
腫瘍異種移植: A549細胞(5×106)を雄無胸腺ヌードマウスの後肢に注射し、腫瘍を毎週測定した。以下の式を用いて腫瘍容積を測定した:[長さ(mm)×幅(mm)×幅(mm)×0.52]肺転移実験において、2×106のA549−C8−luc細胞をSCID-Beigeマウス(Charles River, MA)に静脈内注射した。
in vivo実験のために、全てのsiRNA化合物を化学的に合成して、両鎖上の2−O’−Me修飾を変更することにより安定化した。in vivo実験のために用いられるヒトNrf2をターゲッティングするsiRNAの配列は、5’-UCCCGUUUGUAGAUGACAA-3’(センス)及び5’-UUGUCAUCUACAAACGGGA-3’(アンチセンス)である。GFPをターゲッティングする対照siRNAの配列は、5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3’(センス)及び5’-GGUGCGCUCCUGGACGUAGCC-3’(アンチセンス)である。
肺腫瘍送達のために、雌C57B6マウスにルイス肺癌(LLC)細胞(0.5×106)を送達実験の24日前に静脈内注射した。肺転移の発症時に、3連続日に噴霧器吸入により100 μg/マウスのCy3標識裸の化学的安定化参照siRNAをマウスに投与した。最終吸入の24時間後に、マウスを安楽死させた。終了時に、肺を氷冷4%パラホルムアルデヒドで膨張させて、その後、剃刀の刃を用いて手で切片にした。明らかに目に見える大きな表面腫瘍を別々に切片にした。その結果生じた切片を、20×Water対物レンズと、合計40×倍率を生じるよう組合された2×ズームレンズを用いて、Bio-Rad共焦点顕微鏡により分析した。対照非siRNA処理肺を用いて、バックグラウンド蛍光レベルを設定した。
肺腫瘍へのNrf2又はGFP siRNAのエーロゾル送達のために、PBS中に希釈した100 μgのsiRNA二重鎖を噴霧器を用いてエーロゾル化した。噴霧器を用いて4週間、毎週、3用量のsiRNA(100 μg/用量)をマウスに与えた。カルボプラチンの腹腔内注射を、30 mg/体重1 kgの用量で週2回投与した。
In vivo画像診断:ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を発現するA549−C8−luc細胞を接種した動物を麻酔して、発光基質(15 mg/ml)D−ルシフェリンFirefly(Xenogenカタログ番号XR−1001)250 ulを腹腔内注射した。次に、ジョンズ・ホプキンス腫瘍学センターのXenogenIVIS光学画像診断装置を用いて、動物を画像診断し、分析した。
統計学的分析−スチューデントt検定により、統計学的比較を実施した。p<0.05という値は、統計学的に有意であるとみなされた。腫瘍重量及び腫瘍容積の変化を、記述統計学を用いて要約した。一般化推定方程式(GEE)とともに線形回帰モデルを用いて、処置群間の腫瘍測定値における差を検査した。両腫瘍測定値の分布は非対称にされ、そこで対数変換を用いた。
肺腫瘍によるsiRNAの取込みを実証するために、噴霧器を用いて、肺腫瘍を保有するマウスにCy3標識化RTP801 siRNA(REDD14−上記参照)を送達した。小型実質内腫瘍は、強いCy3シグナルを明示した。大型表面突出腫瘍もCy3シグナルを示したが、しかしその強度は数倍低かった。
同所性肺腫瘍中への裸のsiRNA二重鎖の送達を調べた。ルイス肺癌細胞をマウスに注射し、24日後(マウスがより大きな腫瘍を発症した時)、3連続日の間、噴霧器を用いて、100 μg/日/マウスのCy3標識裸の化学的安定化参照siRNAをマウスに吸入させた。最終siRNA投与の24時間後に、マウスを屠殺した;肺を採取し、切片作製した。その結果生じた切片を、20× Water対物レンズと、合計40×倍率を生じるよう組合された2×ズームレンズを用いて、Bio-Rad共焦点顕微鏡により分析した。対照、非siRNA処理肺を用いて、バックグラウンド蛍光レベルを設定した。蛍光結果は、大型表面腫瘍中の、特に実質内腫瘍中のCy3標識化siRNAの局在を明示した。大型表面突出腫瘍はCy3シグナルを示したが、しかしその強度は小型実質内腫瘍で観察されたものより数倍低かった。
次のステップにおいて、ARE−Luc Nrf2依存性レポーターを発現する同所性増殖腫瘍を有するマウスを用いた。A549肺腫瘍を有するマウスを、噴霧器を用いて鼻内的にNrf2 siRNAで処置し、その後、カルボプラチン処置した。図5で実証されるように、鼻内投与されたNrf2 siRNAはin vivoでNrf2レポーター活性を抑制したが、これは、鼻内投与後のNrf2 siRNAを用いたNrf2発現の特異的抑制を示す。Nrf2 siRNAをカルボプラチンと一緒に摂取しているマウスは、GFP siRNAをカルボプラチンと一緒に摂取している対照マウスと比較して、より高い増殖抑制を実証した(表6)。終了時の平均肺重量、並びに光束強度(in vivo画像診断により評価)は、Nrf2 siRNA+カルボプラチンで処置したマウスにおいては最低であった。したがってNrf2とカルボプラチン/放射線の組合せは、いずれかの作因単独と比較して、4週間の処置後、腫瘍増殖の低減をもたらした。
さらなる情報は、PCT出願PCT/IL2008/000391(本出願の譲受人に譲渡)(この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される)に含まれている。
本明細書中に開示される遺伝子のいずれかに向けられる付加的siRNA分子は同様のやり方で試験されるが、この場合、それらは類似の作用を有し、そして肺腫瘍の増殖を抑制することが示されている。
Claims (14)
- 肺疾患に罹患している被験者の治療方法であって、被験者の肺内部にエーロゾルの形態で遺伝子の発現を抑制する有効量の裸の修飾siRNA化合物を被験者に投与することを包含する方法。
- siRNA化合物が23ヌクレオチド長又はそれ未満である請求項1記載の方法。
- 化合物が0.1〜10 g/被験者の体重1 kg/日の範囲の用量で投与される請求項1記載の方法。
- 遺伝子がRTP801、p53、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、NOX3、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA DUOX1、NRF2、REDD2、NOX4、MYC、PLK1、ESPL1、KEAP1、SHC1 DUOX1、TYROBP及びCTGFからなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 遺伝子がRTP801、p53、DUOX1、TYROBP及びCTGFからなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 肺疾患がCOPD、肺癌、喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、気管支炎、気管支拡張症、間質性肺疾患、肺炎、急性肺損傷及び急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される疾患である請求項1記載の方法。
- エーロゾルが直径約1〜5 μmの平均粒子サイズを有する請求項1記載の方法。
- エーロゾルが直径約4.1〜4.9 μmの平均粒子サイズを有する請求項7記載の方法。
- エーロゾルが直径約4.4〜4.7 μmの平均粒子サイズを有する請求項8記載の方法。
- エーロゾルが直径約4.5〜4.6 μmの平均粒子サイズを有する請求項9記載の方法。
- エーロゾルが0.3 mL/分より大きい流速で投与される請求項1記載の方法。
- エーロゾルが鼻投与により投与される請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- エーロゾルが経口投与により投与される請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- エーロゾルが口鼻投与により投与される請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
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