JP2023531511A - 半減期が延長されたｍＲＮＡ治療薬を含むＬＮＰ組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、本明細書に記載の５´ＵＴＲ、本明細書に記載のペイロード及び終止エレメントを含むコード領域、及び本明細書に記載の３´ＵＴＲ、を含む該ポリヌクレオチド、ならびにそれらを含むＬＮＰ組成物を特徴とするものである。本開示のポリヌクレオチド及び／またはＬＮＰ組成物は、該ペイロードをコードするポリヌクレオチドまたは該ペイロードポリペプチドの半減期及び／または発現の持続時間を増加させることにより、該ペイロードのレベル及び／または活性を増加させることができる。また、本明細書では、本開示のＬＮＰ組成物を用いて、対象における疾患または障害を処置する方法が開示される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月２３日出願の米国仮出願第６３／０４２，８２２号、２０２１年３月２３日出願の米国仮出願第６３／１６５，０９４号、及び２０２１年３月２４日出願の米国仮出願第６３／１６５，４６９号の利益を主張する。前述の出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月２３日出願の米国仮出願第６３／０４２，８２２号、２０２１年３月２３日出願の米国仮出願第６３／１６５，０９４号、及び２０２１年３月２４日出願の米国仮出願第６３／１６５，４６９号の利益を主張する。前述の出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年６月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、Ｍ２１８０－７００７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４５，２１６バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年６月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、Ｍ２１８０－７００７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４５，２１６バイトのサイズである。
ｍＲＮＡの効力を高めるための試みは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を最適に配列設計したｍＲＮＡを生成することに焦点が置かれてきた。しかしながら、ｍＲＮＡ発現の潜在力及び持続力に関しては、これらの試みによっても効力が最高に達しているとは指し示されていない。このことは特にｍＲＮＡ治療薬の場合に当てはまる。従って、ＲＮＡバイオロジーを活用することにより、ｍＲＮＡ発現の潜在力及び持続力をさらに向上させる必要がある。
本開示は、とりわけ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチド、ならびにそれらを含むＬＮＰ組成物を提供する。一実施形態では、該コード領域は、ペプチドまたはポリペプチドペイロード（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード）をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）または該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、本明細書に記載の５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ、または終止エレメントを欠くバージョンよりも、レベル及び／または活性（例えば、発現量または半減期）が向上している。一実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のレベル及び／または活性が向上している。一実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドの発現のレベル、活性、及び／または持続時間が向上している。また、対象における、疾患もしくは障害を処置するために、または所望の生物学的効果を促進するために、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を使用する方法が本明細書に開示される。任意のＯＲＦは、開示されるエレメント、例えば、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、細胞内、膜貫通、それとも分泌かにかかわらず）をコードするＯＲＦと組み合わせることができることが理解されよう。本開示のさらなる態様を以下でさらに詳細に説明する。
５´ＵＴＲならびに３´ＵＴＲ及び／または終止エレメントを含む組み合わせ
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）であって、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが提供される。
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）であって、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが提供される。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、式Ａの核酸配列：
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３もしくは４）である；（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２もしくは３）である；Ｎ６はウラシルもしくはシトシンである；Ｎ７はウラシルもしくはグアニンである；及び／またはＮ８はアデニンもしくはグアニンであり、ｘは０～１の整数である。
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３もしくは４）である；（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２もしくは３）である；Ｎ６はウラシルもしくはシトシンである；Ｎ７はウラシルもしくはグアニンである；及び／またはＮ８はアデニンもしくはグアニンであり、ｘは０～１の整数である。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも５０％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも６０％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも７０％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも９０％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも９６％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも９７％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも９８％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５に対して少なくとも１００％同一である配列を含む。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも３０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも４０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも５０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも６０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも７０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも８０％のウリジン含量で構成される。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも２個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも３個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも４個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも５個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも６個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも７個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも８個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも９個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも１０個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも１１個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも１２個の連続したウリジンを含む。
一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１２、４～１２、５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、１１～１２、２～６、または３～５個の連続したウリジンを少なくとも含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも２～６個の連続したウリジンを少なくとも含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも２～５個の連続したウリジンを少なくとも含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも２～４個の連続したウリジンを少なくとも含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも３～４個の連続したウリジンを少なくとも含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも３～５個の連続したウリジンを少なくとも含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも４～５個の連続したウリジンを少なくとも含む。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、２個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、３個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、４個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、５個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、６個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、７個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、８個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、９個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、１０個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、１１個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、１２個の連続したウリジンを含む。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、１つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、２つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、３つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、４つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、５つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、６つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、７つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、８つのポリウリジントラクトを含む。
一実施形態では、１つ以上の該ポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している。一実施形態では、該ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、互いに隣接している（例えば、該ポリウリジントラクトの全てが連続している）。一実施形態では、１つ以上の該ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている。一実施形態では、該ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている。一実施形態では、第１のポリウリジントラクト及び第２のポリウリジントラクトは、互いに隣接している。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、コザック配列（例えば、ＧＣＣＲＣＣヌクレオチド配列（配列番号４３）、ここで、Ｒはアデニンまたはグアニンである）を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１の配列もしくは配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１の配列または配列番号１のヌクレオチド２～７５、３～７５、４～７５、５～７５、６～７５、もしくは７～７５を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４１の配列もしくは配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列または配列番号４１のヌクレオチド２～８１、３～８１、４～８１、５～８１、６～８１、もしくは７～８１を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４１の配列または配列番号４１のヌクレオチド２～８１、３～８１、４～８１、５～８１、６～８１、もしくは７～８１を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４２の配列もしくは配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列または配列番号４２のヌクレオチド２～８１、３～８１、４～８１、５～８１、６～８１、もしくは７～８１を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４２の配列または配列番号４２のヌクレオチド２～８１、３～８１、４～８１、５～８１、６～８１、もしくは７～８１を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲにより、該ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、該ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該半減期の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または本明細書に開示される５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書の実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される。
一実施形態では、該５´ＵＴＲにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する。一実施形態では、該５´ＵＴＲにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する。一実施形態では、該活性の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または本明細書に開示される５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む。
一実施形態では、該（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初（すなわち、最も５´側）の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つ以上（例えば、２つまたは３つ）の本明細書に記載のＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１または９２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
一実施形態では、（ｉ）該（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、及び（ｉｉ）該（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列における最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つ以上（例えば、２つまたは３つ）の本明細書に記載のＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１または９２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
３´ＵＴＲならびに５´ＵＴＲ及び／または終止エレメントを含む組み合わせ
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるコア配列またはその断片を含む３´ＵＴＲを含む該ポリヌクレオチドが開示される。
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるコア配列またはその断片を含む３´ＵＴＲを含む該ポリヌクレオチドが開示される。
一実施形態では、該３´ＵＴＲコア配列は、該（ｂ）の終止エレメントのすぐ下流に配置される。一実施形態では、該３´ＵＴＲコア配列は、該ポリヌクレオチドのＣ末端部に配置される。
一実施形態では、コア配列を含む該３´ＵＴＲは、第１のフランキング配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、第２のフランキング配列を含むコア配列を含む。一実施形態では、コア配列を含む該３´ＵＴＲは、第１のフランキング配列及び第２のフランキング配列を含む。
一実施形態では、該第１のフランキング配列は、約５～２５、約５～２０、約５～１５、約５～１０、約１０～２５、約１５～２５、約２０～２５ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、該第１のフランキング配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド（例えば、１１ヌクレオチド）の配列を含む。
一実施形態では、該第２のフランキング配列は、約２０～８０、約２０～７５、約２０～７０、約２０～６５、約２０～６０、約２０～５５、約２０～５０、約２０～４５、約２０～４０、約２０～３５、約２０～３０、約２０～２５、約２５～８０、約３０～８０、約３５～８０、約４０～８０、約４５～８０、約５０～８０、約５５～８０、約６０～８０、約６５～８０、約７０～８０または約７５～８０ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、該第２のフランキング配列は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ヌクレオチド（例えば、３９ヌクレオチド）の配列を含む。
一実施形態では、該第１のフランキング配列は、該コア配列の上流または下流にある。一実施形態では、該第２のフランキング配列は、該コア配列の上流または下流にある。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１の断片（例えば、配列番号１１の５ヌクレオチド（ｎｔ）、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、または７０ｎｔ断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１の６０ｎｔ断片から構成される１５～２５ｎｔ断片を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列またはその断片を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列またはその断片を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲにより、該ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、該ポリヌクレオチドの半減期が、例えば、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）により測定して、約１．５～１０倍増加）する。
一実施形態では、該３´ＵＴＲにより、ポリヌクレオチドの平均半減期スコアが１０を超える。一実施形態では、該３´ＵＴＲにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する。一実施形態では、該増加は、３´ＵＴＲを有さない、異なる３´ＵＴＲを有する、または本明細書に開示される３´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０またはそれらの組み合わせのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位、（例えば、２、３、４、５、６、７または８つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。一実施形態では、該複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、同一または異なるｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一実施形態では、該（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初（すなわち、最も５´側）の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメント配列を含む。一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む。
一実施形態では、（ｉ）該（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び（ｉｉ）該（ｂ）の終止エレメントは、表３に示されている終止エレメント配列を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む。
終止エレメントならびに５´ＵＴＲ及び／または終止エレメントを含む組み合わせ
別の態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメントを含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが提供される。
別の態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメントを含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが提供される。
一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号９３または配列番号９６の配列を含む。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、式Ｂ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、式Ｃ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、式Ｄ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
一実施形態では、該コンセンサス配列は、ＧＣ含量が高い（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％のＧＣ含量）。
一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、該ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該半減期の増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または本明細書に開示される終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される。
一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）が増加する。一実施形態では、該ポリペプチドの該レベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）の増加は、ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される。一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する。一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、検出可能なレベルまたは活性）が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、約１．５～２０倍増加する。一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベルまたは活性が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、検出可能になる。
一実施形態では、該増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または本明細書に開示される終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、該（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つ以上（例えば、２つまたは３つ）の本明細書に記載のＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１または９２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
一実施形態では、（ｉ）該（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び（ｉｉ）該（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つ以上（例えば、２つまたは３つ）の本明細書に記載のＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１または９２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
本明細書に開示されるｍＲＮＡ構築物の任意の特性
一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該コード領域は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該コード領域は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列を含む。
一実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、または細胞間タンパク質を含む。
一実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選択される。一実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの５´キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。
一実施形態では、該５´キャップ構造は、
の配列を含み、ここで、下線を引いたイタリック体のＧは、５´－５´－三リン酸基が続く反転したＧヌクレオチドである。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、３´安定化領域（例えば、安定化テール、例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。一実施形態では、該３´安定化領域は、ポリＡテール（例えば、８０～１５０個、例えば、１２０個のアデニンを含むポリＡテール（配列番号１２３））を含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、１個以上の非アデノシン残基（例えば、１個以上のグアノシン、例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、ＵＣＵＡＧ配列（配列番号４４）を含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、配列番号４４の上流に約８０～１２０個（例えば、１００個）のアデニンを含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、配列番号４４の下流に約１～４０個（例えば、２０個）のアデニンを含む。
一実施形態では、該３´安定化領域は、少なくとも１つの代替ヌクレオシドを含み、任意選択で、該代替ヌクレオシドは、反転したチミジン（ｉｄＴ）である。
一実施形態では、該３´安定化領域は、式ＶＩＩの構造：
またはその塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミンを表す。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを構成する。
ＬＮＰ組成物及び使用方法
別の態様において、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物が開示される。
別の態様において、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物が開示される。
一態様において、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を含む医薬組成物が開示される。
一態様において、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を含む細胞を提供する。
さらに別の態様において、本明細書では、細胞におけるペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）の発現量を増加させる方法であって、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を該細胞に投与することを含む該方法が提供される。
関連する態様において、本明細書では、細胞におけるペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）の発現量を増加させる方法で使用するための、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を含む組成物が提供される。
一態様において、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を送達する方法が提供される。一実施形態では、該方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで、該細胞を該ＬＮＰ組成物と接触させることを含む。
一態様において、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を、疾患または障害（例えば、本明細書に記載のもの）を有する対象に送達する方法が提供される。
別の態様において、本明細書では、対象における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする該対象に、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む該方法が提供される。
関連する態様において、本開示は、対象における免疫応答を調節する方法で使用するための、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を含む組成物を提供する。
一態様において、本明細書では、疾患もしくは障害の処置方法、予防方法、またはその症状の予防方法であって、それを必要とする対象に本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、該方法が提供される。
関連する態様において、本開示は、疾患もしくは障害の処置方法、予防方法、またはその症状の予防方法で使用するための、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を含む組成物を提供する。
本明細書に開示される使用のための方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、肺または経口送達用に製剤化される。
本明細書に開示される使用のための方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該対象は哺乳類（例えば、ヒト）である。
本明細書に開示される使用のための方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該対象は、本明細書に開示される疾患または障害を有する。
本明細書に開示される組成物及び方法のさらなる特性
本明細書に開示される使用のための該ＬＮＰ組成物、前記ＬＮＰを含む医薬組成物、方法または組成物のいずれかにおけるさらなる特性としては、以下の実施形態が挙げられる。
本明細書に開示される使用のための該ＬＮＰ組成物、前記ＬＮＰを含む医薬組成物、方法または組成物のいずれかにおけるさらなる特性としては、以下の実施形態が挙げられる。
本明細書に開示される方法または組成物のいずれかにおけるいくつかの実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、該イオン化脂質は、式（ＩＩａ）の化合物を含む。いくつかの実施形態では、該イオン化脂質は、式（ＩＩｅ）の化合物を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法または使用のいずれかにおけるいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドのコード領域は、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、または細胞間タンパク質をコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選択される。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、抗体、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法または使用のいずれかにおけるいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを構成する。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、該化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４´－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２´－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。一実施形態では、該化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、該化学修飾は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。一実施形態では、該脂質ナノ粒子内の各ｍＲＮＡは、完全修飾Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法または使用のいずれかにおけるいくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、肺または経口送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、静脈内送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、皮下送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、筋肉内送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、鼻腔内送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、眼内送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、直腸送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、肺送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、経口送達用に製剤化される。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法または使用のいずれかにおけるいくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び、任意選択で、（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、アミノ脂質を含むイオン化脂質を含む。一実施形態では、該イオン化脂質は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）のいずれかの化合物を含む。一実施形態では、該イオン化脂質は、式（Ｉ）の化合物を含む。一実施形態では、該イオン化脂質は、式（ＩＩａ）の化合物を含む。一実施形態では、該イオン化脂質は、式（ＩＩｅ）の化合物を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。一実施形態では、該リン脂質は、ＤＳＰＣ（例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物）である。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、構造脂質を含む。１つの実施形態では、該構造脂質は、フィトステロールまたはフィトステロールとコレステロールの組み合わせである。１つの実施形態では、該フィトステロールは、β－シトステロール、スチグマステロール、β－シトスタノール、カンペステロール、ブラシカステロール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
１つの実施形態では、該構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない群から選択され得る。いくつかの実施形態では、該構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるように、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
１つの実施形態では、該構造脂質は、β－シトステロール及びコレステロールから選択される。一実施形態では、該構造脂質は、β－シトステロールである。一実施形態では、該構造脂質は、コレステロールである。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ脂質を含む。１つの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される。一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。
一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物から選択される。一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である。一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である。一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物である。一実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物である。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のイオン化脂質、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％のステロールまたは他の構造脂質、及び約０．５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％のイオン化脂質、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％のステロールまたは他の構造脂質、及び約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質、約１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％のステロールまたは他の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９．８３ｍｏｌ％のイオン化脂質、約９．８３ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３ｍｏｌ％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５．５ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６ｍｏｌ％～約４９ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６．５ｍｏｌ％～約４８．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７ｍｏｌ％～約４８ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４９ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４８．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４８ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４７．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４６．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４６ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４５．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約４５．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４８ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４８．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％～約４６ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５．５ｍｏｌ％～約４６．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６．５ｍｏｌ％～約４７．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７ｍｏｌ％～約４８ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７．５ｍｏｌ％～約４８．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４８ｍｏｌ％～約４９ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４８．５ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４５．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４６．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４７．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４８ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４８．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９．５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１．５ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２．５ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約３ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約３．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１．５ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約３．５ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、約１ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約３．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
１つの実施形態では、ステロールまたは他の構造脂質のｍｏｌ％は、フィトステロール１８．５％であり、構造脂質の総ｍｏｌ％は３８．５％である。１つの実施形態では、ステロールまたは他の構造脂質のｍｏｌ％は、フィトステロール２８．５％であり、構造脂質の総ｍｏｌ％は３８．５％である。
本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％の式（ＩＩａ）の化合物及び約１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、５０ｍｏｌ％の式（ＩＩａ）の化合物及び約１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％の式（ＩＩａ）の化合物及び１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、５０ｍｏｌ％の式（ＩＩａ）の化合物及び１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９．８３ｍｏｌ％の式（ＩＩａ）の化合物、約９．８３ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３ｍｏｌ％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％の式（ＩＩｅ）の化合物及び約１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、５０ｍｏｌ％の式（ＩＩｅ）の化合物及び約１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％の式（ＩＩｅ）の化合物及び１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、５０ｍｏｌ％の式（ＩＩｅ）の化合物及び１０ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の１つの実施形態では、該ＬＮＰは、約４９．８３ｍｏｌ％の式（ＩＩｅ）の化合物、約９．８３ｍｏｌ％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３ｍｏｌ％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示される使用のためのＬＮＰ組成物、方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、眼内、鼻腔内、直腸、肺または経口送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、静脈内送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、皮下送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、筋肉内送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、眼内送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、鼻腔内送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、直腸送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、肺送達用に製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰは、経口送達用に製剤化される。
本明細書に開示される使用のための方法または組成物のいずれかにおける一実施形態では、該対象は哺乳類（例えば、ヒト）である。
前述したＬＮＰ組成物または前記ＬＮＰ組成物を使用する方法のいずれかのさらなる特性としては、以下に列挙した実施形態の１つ以上が挙げられる。当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するかまたは確認できるであろう。このような均等物は、以下に列挙した実施形態によって包含されることが意図される。
本開示の他の実施形態
１．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、
（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、を含む前記ポリヌクレオチド。
１．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、
（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、を含む前記ポリヌクレオチド。
２．前記５´ＵＴＲは、式Ａの核酸配列：
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３または４）である；
（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２または３）である；
Ｎ６はウラシルもしくはシトシンである；
Ｎ７はウラシルもしくはグアニンである；及び／または
Ｎ８はアデニンもしくはグアニンであり、ｘは０～１の整数である、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３または４）である；
（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２または３）である；
Ｎ６はウラシルもしくはシトシンである；
Ｎ７はウラシルもしくはグアニンである；及び／または
Ｎ８はアデニンもしくはグアニンであり、ｘは０～１の整数である、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
３．配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
４．配列番号１のバリアントは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のウリジン含量で構成される、実施形態１または３に記載のポリヌクレオチド。
５．配列番号１のバリアントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む、実施形態１、または３～４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６．配列番号１のバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、少なくとも２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１２、４～１２、５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、１１～１２、２～６、または３～５個の連続したウリジンを含む、実施形態５に記載のポリヌクレオチド。
７．配列番号１のバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、４個の連続したウリジンを含む、実施形態１または３～６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８．配列番号１のバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、５個の連続したウリジンを含む、実施形態１または３～７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９．配列番号１のバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のポリウリジントラクトを含む、実施形態１または３～８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１０．配列番号１のバリアントは、３つのポリウリジントラクトを含む、実施形態９に記載のポリヌクレオチド。
１１．配列番号１のバリアントは、４つのポリウリジントラクトを含む、実施形態９に記載のポリヌクレオチド。
１２．配列番号１のバリアントは、５つのポリウリジントラクトを含む、実施形態９に記載のポリヌクレオチド。
１３．１つ以上の前記ポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している、実施形態１または３～１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１４．前記ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、互いに隣接している（例えば、前記ポリウリジントラクトの全てが連続している）、実施形態１または３～１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５．１つ以上の前記ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている、実施形態１または３～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６．前記ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている、実施形態１または３～１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７．第１のポリウリジントラクト及び第２のポリウリジントラクトは、互いに隣接している、実施形態１または３～１６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８．後続の（例えば、第３、第４、第５、第６もしくは第７、第８、第９、または第１０の）ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドによって、前記第１のポリウリジントラクト、前記第２のポリウリジントラクト、または前記後続のポリウリジントラクトのいずれか１つから分離されている、実施形態１７に記載のポリヌクレオチド。
１９．第１のポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドによって、後続のポリウリジントラクト（例えば、第２、第３、第４、第５、第６もしくは第７、第８、第９、または第１０のポリウリジントラクト）から分離されている、実施形態１または３～１８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２０．１つ以上の前記後続のポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している、実施形態１９に記載のポリヌクレオチド。
２１．前記５´ＵＴＲは、コザック配列（例えば、ＧＣＣＲＣＣヌクレオチド配列（配列番号４３）、ここで、Ｒはアデニンまたはグアニンである）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２．前記コザック配列は、前記５´ＵＴＲ配列の３´末端に配置される、実施形態２１に記載のポリヌクレオチド。
２３．前記５´ＵＴＲは、配列番号１の配列もしくは配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２４．前記５´ＵＴＲは、配列番号１の配列を含む、実施形態２３に記載のポリヌクレオチド。
２５．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１の配列もしくは配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２６．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１の配列または配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠くその断片を含む、実施形態２５に記載のポリヌクレオチド。
２７．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２の配列もしくは配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２の配列または配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠くその断片を含む、実施形態２７に記載のポリヌクレオチド。
２９．前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、前記ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）する、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３０．前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または実施形態１～２８のいずれか１つに記載の５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態２９に記載のポリヌクレオチド。
３１．前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、実施形態２９～３０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２．前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３．前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する、実施形態３２に記載のポリヌクレオチド。
３４．前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性（例えば、産生量）の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または実施形態１～２８のいずれか１つに記載の５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態３２または３３に記載のポリヌクレオチド。
３５．前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性（例えば、産生量）の増加は、ポリペプチドのレベル及び／または活性を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６．前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの活性が増加（例えば、約１．２～１０倍増加）する、実施形態３５に記載のポリヌクレオチド。
３７．前記活性の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または実施形態１～２８のいずれか１つに記載の５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態３６に記載のポリヌクレオチド。
３８．前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの前記レベルの増加は、ポリペプチドのレベルを測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、実施形態３６または３７に記載のポリヌクレオチド。
３９．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０の配列、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む５´ＵＴＲ、
（ｂ）終止エレメントを含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲを含み、
前記５´ＵＴＲは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む、前記ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０の配列、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む５´ＵＴＲ、
（ｂ）終止エレメントを含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲを含み、
前記５´ＵＴＲは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む、前記ポリヌクレオチド。
４０．前記５´ＵＴＲは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９または配列番号９０のバリアントを含む、実施形態３９に記載のポリヌクレオチド。
４１．前記５´ＵＴＲバリアントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４０に記載のポリヌクレオチド。
４２．前記５´ＵＴＲバリアントは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のウリジン含量で構成される、実施形態４０または４１に記載のポリヌクレオチド。
４３．前記５´ＵＴＲバリアントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む、実施形態４０～４２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４４．前記５´ＵＴＲバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、少なくとも２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１２、４～１２、５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、１１～１２、２～６、または３～５個の連続したウリジンを含む、実施形態４３に記載のポリヌクレオチド。
４５．前記５´ＵＴＲバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、４個の連続したウリジンを含む、実施形態４０～４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４６．前記５´ＵＴＲバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、５個の連続したウリジンを含む、実施形態４０～４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４７．前記５´ＵＴＲバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のポリウリジントラクトを含む、実施形態４０～４６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４８．前記５´ＵＴＲバリアントは、３つのポリウリジントラクトを含む、実施形態４７に記載のポリヌクレオチド。
４９．前記５´ＵＴＲバリアントは、４つのポリウリジントラクトを含む、実施形態４７に記載のポリヌクレオチド。
５０．前記５´ＵＴＲバリアントは、５つのポリウリジントラクトを含む、実施形態４７に記載のポリヌクレオチド。
５１．１つ以上の前記ポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している、実施形態４０～５０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５２．前記ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、互いに隣接している（例えば、前記ポリウリジントラクトの全てが連続している）、実施形態４０～５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５３．１つ以上の前記ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている、実施形態４０～５２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５４．前記ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている、実施形態４０～５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５５．第１のポリウリジントラクト及び第２のポリウリジントラクトは、互いに隣接している、実施形態４０～５４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５６．後続の（例えば、第３、第４、第５、第６もしくは第７、第８、第９、または第１０の）ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドによって、前記第１のポリウリジントラクト、前記第２のポリウリジントラクト、または前記後続のポリウリジントラクトのいずれか１つから分離されている、実施形態５５に記載のポリヌクレオチド。
５７．第１のポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドによって、後続のポリウリジントラクト（例えば、第２、第３、第４、第５、第６もしくは第７、第８、第９、または第１０のポリウリジントラクト）から分離されている、実施形態４０～５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５８．１つ以上の前記後続のポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している、実施形態５７に記載のポリヌクレオチド。
５９．前記５´ＵＴＲは、コザック配列（例えば、ＧＣＣＲＣＣヌクレオチド配列（配列番号４３）、ここで、Ｒはアデニンまたはグアニンである）を含む、実施形態３９～５８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６０．前記コザック配列は、前記５´ＵＴＲ配列の３´末端に配置される、実施形態５９に記載のポリヌクレオチド。
６１．前記５´ＵＴＲは、配列番号２の配列またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６２．前記５´ＵＴＲは、配列番号３の配列またはその断片（例えば、配列番号３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６３．前記５´ＵＴＲは、配列番号４の配列またはその断片（例えば、配列番号４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６４．前記５´ＵＴＲは、配列番号５の配列またはその断片（例えば、配列番号５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６５．前記５´ＵＴＲは、配列番号６の配列またはその断片（例えば、配列番号６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６６．前記５´ＵＴＲは、配列番号８の配列またはその断片（例えば、配列番号８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６７．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１の配列またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６８．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２の配列またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６９．前記５´ＵＴＲは、配列番号６３の配列またはその断片（例えば、配列番号６３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７０．前記５´ＵＴＲは、配列番号６４の配列またはその断片（例えば、配列番号６４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７１．前記５´ＵＴＲは、配列番号６５の配列またはその断片（例えば、配列番号６５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７２．前記５´ＵＴＲは、配列番号６６の配列またはその断片（例えば、配列番号６６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７３．前記５´ＵＴＲは、配列番号６７の配列またはその断片（例えば、配列番号６７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７４．前記５´ＵＴＲは、配列番号６８の配列またはその断片（例えば、配列番号６８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７５．前記５´ＵＴＲは、配列番号６９の配列またはその断片（例えば、配列番号６９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７６．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７７．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７８．前記５´ＵＴＲは、配列番号７１の配列またはその断片（例えば、配列番号７１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７９．前記５´ＵＴＲは、配列番号７２の配列またはその断片（例えば、配列番号７２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８０．前記５´ＵＴＲは、配列番号７３の配列またはその断片（例えば、配列番号７３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８１．前記５´ＵＴＲは、配列番号７４の配列またはその断片（例えば、配列番号７４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８２．前記５´ＵＴＲは、配列番号７５の配列またはその断片（例えば、配列番号７５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８３．前記５´ＵＴＲは、配列番号７６の配列またはその断片（例えば、配列番号７６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８４．前記５´ＵＴＲは、配列番号７７の配列またはその断片（例えば、配列番号７７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８５．前記５´ＵＴＲは、配列番号７８の配列またはその断片（例えば、配列番号７８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８６．前記５´ＵＴＲは、配列番号８８の配列またはその断片（例えば、配列番号８８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８７．前記５´ＵＴＲは、配列番号８９の配列またはその断片（例えば、配列番号８９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８８．前記５´ＵＴＲは、配列番号９０の配列またはその断片（例えば、配列番号９０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３９～６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８９．前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加する、実施形態３９～８８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９０．前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、実施形態８９に記載のポリヌクレオチド。
９１．前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９２．前記終止エレメントは、配列番号２６の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９３．前記終止エレメントは、配列番号２７の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９４．前記終止エレメントは、配列番号２８の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９５．前記終止エレメントは、配列番号２９の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９６．前記終止エレメントは、配列番号３０の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９７．前記終止エレメントは、配列番号３１の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９８．前記終止エレメントは、配列番号３２の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
９９．前記終止エレメントは、配列番号３３の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１００．前記終止エレメントは、配列番号３４の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０１．前記終止エレメントは、配列番号３５の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０２．前記終止エレメントは、配列番号３６の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０３．前記終止エレメントは、配列番号６２の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０４．前記終止エレメントは、配列番号９３の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０５．前記終止エレメントは、配列番号９６の配列を含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０６．前記（ｂ）のコード領域は、配列番号３７、配列番号５６または配列番号５７のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態９１に記載のポリヌクレオチド。
１０７．実施形態１～９０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであって、前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
１０８．実施形態１０７に記載のポリヌクレオチドであって、前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
１０９．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列、もしくは配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１０．前記３´ＵＴＲは、配列番号１２の配列、もしくは配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１１．前記３´ＵＴＲは、配列番号１３の配列、もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１２．前記３´ＵＴＲは、配列番号１４の配列、もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１３．前記３´ＵＴＲは、配列番号１５の配列、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１４．前記３´ＵＴＲは、配列番号１６の配列、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１５．前記３´ＵＴＲは、配列番号１７の配列、もしくは配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１６．前記３´ＵＴＲは、配列番号１８の配列、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１７．前記３´ＵＴＲは、配列番号１９の配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１８．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１１９．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２０．前記３´ＵＴＲは、配列番号２２の配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２１．前記３´ＵＴＲは、配列番号２３の配列、もしくは配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２２．前記３´ＵＴＲは、配列番号２４の配列、もしくは配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２３．前記３´ＵＴＲは、配列番号２５の配列、もしくは配列番号２５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２４．前記３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列、もしくは配列番号４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２５．前記３´ＵＴＲは、配列番号７９の配列、もしくは配列番号７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号７９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２６．前記３´ＵＴＲは、配列番号８０の配列、もしくは配列番号８０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２７．前記３´ＵＴＲは、配列番号８１の配列、もしくは配列番号８１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２８．前記３´ＵＴＲは、配列番号８２の配列、もしくは配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１２９．前記３´ＵＴＲは、配列番号８３の配列、もしくは配列番号８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３０．前記３´ＵＴＲは、配列番号８４の配列、もしくは配列番号８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３１．前記３´ＵＴＲは、配列番号８５の配列、もしくは配列番号８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３２．前記３´ＵＴＲは、配列番号８６の配列、もしくは配列番号８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３３．前記３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号８７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３４．前記３´ＵＴＲは、配列番号９４の配列、もしくは配列番号９４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３５．前記３´ＵＴＲは、配列番号９５の配列、もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３６．前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、実施形態１０７または１０８に記載のポリヌクレオチド。
１３７．前記ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列を含む、及び／または前記ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１または９２の配列を含む、実施形態１３６に記載のポリヌクレオチド。
１３８．実施形態１～９０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列（例えば、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれか）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
（ｉ）前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列（例えば、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれか）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
１３９．前記終止エレメントは、配列番号２６の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４０．前記終止エレメントは、配列番号２７の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４１．前記終止エレメントは、配列番号２８の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４２．前記終止エレメントは、配列番号２９の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４３．前記終止エレメントは、配列番号３０の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４４．前記終止エレメントは、配列番号３１の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４５．前記終止エレメントは、配列番号３２の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４６．前記終止エレメントは、配列番号３３の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４７．前記終止エレメントは、配列番号３４の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４８．前記終止エレメントは、配列番号３５の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１４９．前記終止エレメントは、配列番号３６の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５０．前記終止エレメントは、配列番号３７の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５１．前記終止エレメントは、配列番号５６の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５２．前記終止エレメントは、配列番号５７の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５３．前記終止エレメントは、配列番号６２の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５４．前記終止エレメントは、配列番号９３の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５５．前記終止エレメントは、配列番号９６の配列を含む、実施形態１３８に記載のポリヌクレオチド。
１５６．前記（ｂ）のコード領域は、配列番号３７のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１３９に記載のポリヌクレオチド。
１５７．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列、もしくは配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５８．前記３´ＵＴＲは、配列番号１２の配列、もしくは配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５９．前記３´ＵＴＲは、配列番号１３の配列、もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６０．前記３´ＵＴＲは、配列番号１４の配列、もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６１．前記３´ＵＴＲは、配列番号１５の配列、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６２．前記３´ＵＴＲは、配列番号１６の配列、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６３．前記３´ＵＴＲは、配列番号１７の配列、もしくは配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６４．前記３´ＵＴＲは、配列番号１８の配列、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６５．前記３´ＵＴＲは、配列番号１９の配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６６．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６７．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６８．前記３´ＵＴＲは、配列番号２２の配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６９．前記３´ＵＴＲは、配列番号２３の配列、もしくは配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７０．前記３´ＵＴＲは、配列番号２４の配列、もしくは配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７１．前記３´ＵＴＲは、配列番号２５の配列、もしくは配列番号２５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７２．前記３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列、もしくは配列番号４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７３．前記３´ＵＴＲは、配列番号７９の配列、もしくは配列番号７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号７９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７４．前記３´ＵＴＲは、配列番号８０の配列、もしくは配列番号８０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７５．前記３´ＵＴＲは、配列番号８１の配列、もしくは配列番号８１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７６．前記３´ＵＴＲは、配列番号８２の配列、もしくは配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７７．前記３´ＵＴＲは、配列番号８３の配列、もしくは配列番号８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７８．前記３´ＵＴＲは、配列番号８４の配列、もしくは配列番号８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７９．前記３´ＵＴＲは、配列番号８５の配列、もしくは配列番号８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８０．前記３´ＵＴＲは、配列番号８６の配列、もしくは配列番号８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８１．前記３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号８７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８２．前記３´ＵＴＲは、配列番号９４の配列、もしくは配列番号９４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８３．前記３´ＵＴＲは、配列番号９５の配列、もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８４．前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、実施形態１３９～１５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８５．前記ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列を含む、及び／または前記ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１または９２の配列を含む、実施形態１８４に記載のポリヌクレオチド。
１８６．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、
（ｂ）表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメントを含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、を含む前記ポリヌクレオチド。
（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、
（ｂ）表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメントを含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、を含む前記ポリヌクレオチド。
１８７．前記終止エレメントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１８８．前記終止エレメントは、配列番号２６の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１８９．前記終止エレメントは、配列番号２７の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９０．前記終止エレメントは、配列番号２８の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９１．前記終止エレメントは、配列番号２９の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９２．前記終止エレメントは、配列番号３０の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９３．前記終止エレメントは、配列番号３１の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９４．前記終止エレメントは、配列番号３２の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９５．前記終止エレメントは、配列番号３３の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９６．前記終止エレメントは、配列番号３４の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９７．前記終止エレメントは、配列番号３５の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９８．前記終止エレメントは、配列番号３６の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
１９９．前記終止エレメントは、配列番号６２の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
２００．前記終止エレメントは、配列番号９３の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
２０１．前記終止エレメントは、配列番号９６の配列を含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
２０２．前記（ｂ）のコード領域は、式Ｂ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
２０３．前記（ｂ）のコード領域は、式Ｃ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧまたはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧまたはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
２０４．前記（ｂ）のコード領域は、式Ｄ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態１８６に記載のポリヌクレオチド。
２０５．前記コンセンサス配列は、ＧＣ含量が高い（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％のＧＣ含量）、実施形態２０２～２０４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２０６．前記ポリヌクレオチドの半減期が増加するかまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、実施形態２０２～２０５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２０７．前記ポリヌクレオチドは、半減期が約１．２～１０倍増加している、実施形態２０２～２０６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２０８．前記半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）を用いて測定される、実施形態２０７に記載のポリヌクレオチド。
２０９．前記半減期の増加は、実施形態１９９の終止エレメントを有さないコード領域を含む、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態２０７に記載のポリヌクレオチド。
２１０．位置Ｘ－１は、コドン（例えば、アミノ酸を指定するコドン）の３番目の位置である、実施形態２０２に記載のポリヌクレオチド。
２１１．前記位置Ｘ－１のヌクレオチドは、ポリペプチドに組み込まれる前記アミノ酸を変更しない、実施形態２１０に記載のポリヌクレオチド。
２１２．位置Ｘ－１のＣにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加するかまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、実施形態２０２に記載のポリヌクレオチド。
２１３．前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）により測定される、実施形態２１２に記載のポリヌクレオチド。
２１４．前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、前記ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）する、実施形態１８６～２１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１５．前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または実施形態１８６に記載の終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態２１４に記載のポリヌクレオチド。
２１６．前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、実施形態２１４または２１５に記載のポリヌクレオチド。
２１７．前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）が増加する、実施形態１８６～２１６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１８．前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）の増加は、ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載されたアッセイ）に従って測定される、実施形態２１７に記載のポリヌクレオチド。
２１９．前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する、実施形態２１８に記載のポリヌクレオチド。
２２０．前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、検出可能なレベルまたは活性）が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、約１．５～２０倍増加する、実施形態２１８に記載のポリヌクレオチド。
２２１．前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベルまたは活性が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、検出可能になる、実施形態２２０に記載のポリヌクレオチド。
２２２．前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）の増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または実施形態１８６に記載の終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態２１７～２２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２３．前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態１８６～２２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２４．前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２２５．前記５´ＵＴＲは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２２６．前記５´ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２２７．前記５´ＵＴＲは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２２８．前記５´ＵＴＲは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２２９．前記５´ＵＴＲは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３０．前記５´ＵＴＲは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３１．前記５´ＵＴＲは、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３２．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３３．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３４．前記５´ＵＴＲは、配列番号６３の配列またはその断片（例えば、配列番号６３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３５．前記５´ＵＴＲは、配列番号６４の配列またはその断片（例えば、配列番号６４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３６．前記５´ＵＴＲは、配列番号６５の配列またはその断片（例えば、配列番号６５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３７．前記５´ＵＴＲは、配列番号６６の配列またはその断片（例えば、配列番号６６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３８．前記５´ＵＴＲは、配列番号６７の配列またはその断片（例えば、配列番号６７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２３９．前記５´ＵＴＲは、配列番号６８の配列またはその断片（例えば、配列番号６８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４０．前記５´ＵＴＲは、配列番号６９の配列またはその断片（例えば、配列番号６９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４１．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４２．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４３．前記５´ＵＴＲは、配列番号７１の配列またはその断片（例えば、配列番号７１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４４．前記５´ＵＴＲは、配列番号７２の配列またはその断片（例えば、配列番号７２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４５．前記５´ＵＴＲは、配列番号７３の配列またはその断片（例えば、配列番号７３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４６．前記５´ＵＴＲは、配列番号７４の配列またはその断片（例えば、配列番号７４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４７．前記５´ＵＴＲは、配列番号７５の配列またはその断片（例えば、配列番号７５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４８．前記５´ＵＴＲは、配列番号７６の配列またはその断片（例えば、配列番号７６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２４９．前記５´ＵＴＲは、配列番号７７の配列またはその断片（例えば、配列番号７７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２５０．前記５´ＵＴＲは、配列番号７８の配列またはその断片（例えば、配列番号７８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２５１．前記５´ＵＴＲは、配列番号８８の配列またはその断片（例えば、配列番号８８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２５２．前記５´ＵＴＲは、配列番号８９の配列またはその断片（例えば、配列番号８９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２５３．前記５´ＵＴＲは、配列番号９０の配列またはその断片（例えば、配列番号９０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２２３に記載のポリヌクレオチド。
２５４．実施形態１８６～２２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであって、前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
２５５．実施形態２５４に記載のポリヌクレオチドであって、前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
２５６．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列、もしくは配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２５７．前記３´ＵＴＲは、配列番号１２の配列、もしくは配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２５８．前記３´ＵＴＲは、配列番号１３の配列、もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２５９．前記３´ＵＴＲは、配列番号１４の配列、もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６０．前記３´ＵＴＲは、配列番号１５の配列、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６１．前記３´ＵＴＲは、配列番号１６の配列、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６２．前記３´ＵＴＲは、配列番号１７の配列、もしくは配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６３．前記３´ＵＴＲは、配列番号１８の配列、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６４．前記３´ＵＴＲは、配列番号１９の配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６５．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかの最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６６．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６７．前記３´ＵＴＲは、配列番号２２の配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６８．前記３´ＵＴＲは、配列番号２３の配列、もしくは配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２６９．前記３´ＵＴＲは、配列番号２４の配列、もしくは配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７０．前記３´ＵＴＲは、配列番号２５の配列、もしくは配列番号２５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７１．前記３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列、もしくは配列番号４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７２．前記３´ＵＴＲは、配列番号７９の配列、もしくは配列番号７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号７９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７３．前記３´ＵＴＲは、配列番号８０の配列、もしくは配列番号８０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７４．前記３´ＵＴＲは、配列番号８１の配列、もしくは配列番号８１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７５．前記３´ＵＴＲは、配列番号８２の配列、もしくは配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７６．前記３´ＵＴＲは、配列番号８３の配列、もしくは配列番号８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７７．前記３´ＵＴＲは、配列番号８４の配列、もしくは配列番号８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７８．前記３´ＵＴＲは、配列番号８５の配列、もしくは配列番号８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２７９．前記３´ＵＴＲは、配列番号８６の配列、もしくは配列番号８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２８０．前記３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号８７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２８１．前記３´ＵＴＲは、配列番号９４の配列、もしくは配列番号９４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２８２．前記３´ＵＴＲは、配列番号９５の配列、もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２８３．前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２８４．前記ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列を含む、または前記ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１または９２の配列を含む、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２８５．実施形態１８６～２２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列（例えば、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれか）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
（ｉ）前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列（例えば、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれか）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
２８６．前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２８７．前記５´ＵＴＲは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２８８．前記５´ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２８９．前記５´ＵＴＲは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９０．前記５´ＵＴＲは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９１．前記５´ＵＴＲは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９２．前記５´ＵＴＲは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９３．前記５´ＵＴＲは、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９４．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９５．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９６．前記５´ＵＴＲは、配列番号６３の配列またはその断片（例えば、配列番号６３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９７．前記５´ＵＴＲは、配列番号６４の配列またはその断片（例えば、配列番号６４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９８．前記５´ＵＴＲは、配列番号６５の配列またはその断片（例えば、配列番号６５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９９．前記５´ＵＴＲは、配列番号６６の配列またはその断片（例えば、配列番号６６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３００．前記５´ＵＴＲは、配列番号６７の配列またはその断片（例えば、配列番号６７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０１．前記５´ＵＴＲは、配列番号６８の配列またはその断片（例えば、配列番号６８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０２．前記５´ＵＴＲは、配列番号６９の配列またはその断片（例えば、配列番号６９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０３．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０４．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０５．前記５´ＵＴＲは、配列番号７１の配列またはその断片（例えば、配列番号７１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０６．前記５´ＵＴＲは、配列番号７２の配列またはその断片（例えば、配列番号７２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０７．前記５´ＵＴＲは、配列番号７３の配列またはその断片（例えば、配列番号７３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０８．前記５´ＵＴＲは、配列番号７４の配列またはその断片（例えば、配列番号７４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３０９．前記５´ＵＴＲは、配列番号７５の配列またはその断片（例えば、配列番号７５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１０．前記５´ＵＴＲは、配列番号７６の配列またはその断片（例えば、配列番号７６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１１．前記５´ＵＴＲは、配列番号７７の配列またはその断片（例えば、配列番号７７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１２．前記５´ＵＴＲは、配列番号７８の配列またはその断片（例えば、配列番号７８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１３．前記５´ＵＴＲは、配列番号８８の配列またはその断片（例えば、配列番号８８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１４．前記５´ＵＴＲは、配列番号８９の配列またはその断片（例えば、配列番号８９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１５．前記５´ＵＴＲは、配列番号９０の配列またはその断片（例えば、配列番号９０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
３１６．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３１７．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列、もしくは配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３１８．前記３´ＵＴＲは、配列番号１２の配列、もしくは配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３１９．前記３´ＵＴＲは、配列番号１３の配列、もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２０．前記３´ＵＴＲは、配列番号１４の配列、もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２１．前記３´ＵＴＲは、配列番号１５の配列、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２２．前記３´ＵＴＲは、配列番号１６の配列、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２３．前記３´ＵＴＲは、配列番号１７の配列、もしくは配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２４．前記３´ＵＴＲは、配列番号１８の配列、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２５．前記３´ＵＴＲは、配列番号１９の配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２６．前記３´ＵＴＲは、配列番号２０の配列、もしくは配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２７．前記３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２８．前記３´ＵＴＲは、配列番号２２の配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３２９．前記３´ＵＴＲは、配列番号２３の配列、もしくは配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３０．前記３´ＵＴＲは、配列番号２４の配列、もしくは配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３１．前記３´ＵＴＲは、配列番号２５の配列、もしくは配列番号２５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３２．前記３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列、もしくは配列番号４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３３．前記３´ＵＴＲは、配列番号７９の配列、もしくは配列番号７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号７９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３４．前記３´ＵＴＲは、配列番号８０の配列、もしくは配列番号８０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３５．前記３´ＵＴＲは、配列番号８１の配列、もしくは配列番号８１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３６．前記３´ＵＴＲは、配列番号８２の配列、もしくは配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３７．前記３´ＵＴＲは、配列番号８３の配列、もしくは配列番号８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３８．前記３´ＵＴＲは、配列番号８４の配列、もしくは配列番号８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３３９．前記３´ＵＴＲは、配列番号８５の配列、もしくは配列番号８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３４０．前記３´ＵＴＲは、配列番号８６の配列、もしくは配列番号８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３４１．前記３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号８７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３４２．前記３´ＵＴＲは、配列番号９４の配列、もしくは配列番号９４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３４３．前記３´ＵＴＲは、配列番号９５の配列、もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号９５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３４４．前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、実施形態２８５～３１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３４５．前記ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列を含む、または前記ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１または９２の配列を含む、実施形態３４４に記載のポリヌクレオチド。
３４６．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、
（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び
（ｃ）配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるコア配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲ、を含む前記ポリヌクレオチド。
（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、
（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び
（ｃ）配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるコア配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲ、を含む前記ポリヌクレオチド。
３４７．前記３´ＵＴＲコア配列は、前記（ｂ）の終止エレメントのすぐ下流に配置される、実施形態３４６に記載のポリヌクレオチド。
３４８．前記３´ＵＴＲコア配列は、前記ポリヌクレオチドのＣ末端部に配置される、実施形態３４７に記載のポリヌクレオチド。
３４９．コア配列を含む前記３´ＵＴＲは、第１のフランキング配列を含む、実施形態３４６～３４８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５０．コア配列を含む前記３´ＵＴＲは、第２のフランキング配列を含む、実施形態３４６～３４９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５１．コア配列を含む前記３´ＵＴＲは、第１のフランキング配列及び第２のフランキング配列を含む、実施形態３４９または３５０に記載のポリヌクレオチド。
３５２．前記第１のフランキング配列は、約５～２５、約５～２０、約５～１５、約５～１０、約１０～２５、約１５～２５、約２０～２５ヌクレオチドの配列を含む、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５３．前記第１のフランキング配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド（例えば、１１ヌクレオチド）の配列を含む、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５４．前記第２のフランキング配列は、約２０～８０、約２０～７５、約２０～７０、約２０～６５、約２０～６０、約２０～５５、約２０～５０、約２０～４５、約２０～４０、約２０～３５、約２０～３０、約２０～２５、約２５～８０、約３０～８０、約３５～８０、約４０～８０、約４５～８０、約５０～８０、約５５～８０、約６０～８０、約６５～８０、約７０～８０または約７５～８０ヌクレオチドの配列を含む、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５５．前記第２のフランキング配列は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ヌクレオチド（例えば、３９ヌクレオチド）の配列を含む、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５６．前記第１のフランキング配列は、前記コア配列の上流にある、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５７．前記第１のフランキング配列は、前記コア配列の下流にある、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５８．前記第２のフランキング配列は、前記コア配列の上流にある、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３５９．前記第２のフランキング配列は、前記コア配列の下流にある、実施形態３４９～３５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６０．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の断片（例えば、配列番号１１の５ヌクレオチド（ｎｔ）、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、または７０ｎｔ断片）を含む、実施形態３４６～３５９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６１．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の６０ｎｔ断片から構成される１５～２５ｎｔ断片を含む、実施形態３４６～３６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６２．前記３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列を含む、実施形態３４６～３６１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６３．前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列を含む、実施形態３４６～３６１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６４．前記３´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、前記ポリヌクレオチドの半減期が、例えば、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）により測定して、約１．５～１０倍増加）する、実施形態３４６～３６３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６５．前記３´ＵＴＲにより、ポリヌクレオチドの平均半減期スコアが１０を超える、実施形態３６４に記載のポリヌクレオチド。
３６６．前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、３´ＵＴＲを有さない、異なる３´ＵＴＲを有する、または実施形態３４６～２４４のいずれか１つに記載の３´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態３４６～３６５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６７．前記３´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、実施形態３４６～３６３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３６８．前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性（例えば、産生量）の増加は、３´ＵＴＲを有さない、異なる３´ＵＴＲを有する、または実施形態３４６～３６３のいずれか１つに記載の３´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、実施形態２４８に記載のポリヌクレオチド。
３６９．前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、実施形態３４６～３６８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３７０．前記３´ＵＴＲは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０またはそれらの組み合わせのｍｉＲＮＡ結合部位を含む、及び／または前記ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１または９２の配列を含む、実施形態３６９に記載のポリヌクレオチド。
３７１．前記３´ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７または８つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含む、実施形態３６９または３７０に記載のポリヌクレオチド。
３７２．前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、同一または異なるｍｉＲＮＡ結合部位を含む、実施形態３７１に記載のポリヌクレオチド。
３７３．前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３４６～３７２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３７４．前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３７５．前記５´ＵＴＲは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３７６．前記５´ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３７７．前記５´ＵＴＲは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３７８．前記５´ＵＴＲは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３７９．前記５´ＵＴＲは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８０．前記５´ＵＴＲは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８１．前記５´ＵＴＲは、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８２．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８３．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８４．前記５´ＵＴＲは、配列番号６３の配列またはその断片（例えば、配列番号６３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８５．前記５´ＵＴＲは、配列番号６４の配列またはその断片（例えば、配列番号６４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８６．前記５´ＵＴＲは、配列番号６５の配列またはその断片（例えば、配列番号６５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８７．前記５´ＵＴＲは、配列番号６６の配列またはその断片（例えば、配列番号６６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８８．前記５´ＵＴＲは、配列番号６７の配列またはその断片（例えば、配列番号６７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３８９．前記５´ＵＴＲは、配列番号６８の配列またはその断片（例えば、配列番号６８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９０．前記５´ＵＴＲは、配列番号６９の配列またはその断片（例えば、配列番号６９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９１．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９２．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９３．前記５´ＵＴＲは、配列番号７１の配列またはその断片（例えば、配列番号７１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９４．前記５´ＵＴＲは、配列番号７２の配列またはその断片（例えば、配列番号７２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９５．前記５´ＵＴＲは、配列番号７３の配列またはその断片（例えば、配列番号７３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９６．前記５´ＵＴＲは、配列番号７４の配列またはその断片（例えば、配列番号７４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９７．前記５´ＵＴＲは、配列番号７５の配列またはその断片（例えば、配列番号７５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９８．前記５´ＵＴＲは、配列番号７６の配列またはその断片（例えば、配列番号７６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
３９９．前記５´ＵＴＲは、配列番号７７の配列またはその断片（例えば、配列番号７７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
４００．前記５´ＵＴＲは、配列番号７８の配列またはその断片（例えば、配列番号７８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
４０１．前記５´ＵＴＲは、配列番号８８の配列またはその断片（例えば、配列番号８８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
４０２．前記５´ＵＴＲは、配列番号８９の配列またはその断片（例えば、配列番号８９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
４０３．前記５´ＵＴＲは、配列番号９０の配列またはその断片（例えば、配列番号９０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態３７３に記載のポリヌクレオチド。
４０４．前記（ｂ）の終止エレメントは、表３に示されている終止エレメント配列を含む、実施形態３４６～３７２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４０５．前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４０６．前記終止エレメントは、配列番号２６の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４０７．前記終止エレメントは、配列番号２７の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４０８．前記終止エレメントは、配列番号２８の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４０９．前記終止エレメントは、配列番号２９の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１０．前記終止エレメントは、配列番号３０の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１１．前記終止エレメントは、配列番号３１の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１２．前記終止エレメントは、配列番号３２の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１３．前記終止エレメントは、配列番号３３の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１４．前記終止エレメントは、配列番号３４の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１５．前記終止エレメントは、配列番号３５の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１６．前記終止エレメントは、配列番号３６の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１７．前記終止エレメントは、配列番号６２の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１８．前記終止エレメントは、配列番号９３の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４１９．前記終止エレメントは、配列番号９６の配列を含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４２０．前記（ｂ）のコード領域は、配列番号３７のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態４０４に記載のポリヌクレオチド。
４２１．実施形態３４６～３７２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｂ）の終止エレメントは、表３に示されている終止エレメントを含む、前記ポリヌクレオチド。
（ｉ）前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｂ）の終止エレメントは、表３に示されている終止エレメントを含む、前記ポリヌクレオチド。
４２２．前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２３．前記５´ＵＴＲは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２４．前記５´ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２５．前記５´ＵＴＲは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２６．前記５´ＵＴＲは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２７．前記５´ＵＴＲは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２８．前記５´ＵＴＲは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４２９．前記５´ＵＴＲは、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３０．前記５´ＵＴＲは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３１．前記５´ＵＴＲは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３２．前記５´ＵＴＲは、配列番号６３の配列またはその断片（例えば、配列番号６３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３３．前記５´ＵＴＲは、配列番号６４の配列またはその断片（例えば、配列番号６４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３４．前記５´ＵＴＲは、配列番号６５の配列またはその断片（例えば、配列番号６５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３５．前記５´ＵＴＲは、配列番号６６の配列またはその断片（例えば、配列番号６６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３６．前記５´ＵＴＲは、配列番号６７の配列またはその断片（例えば、配列番号６７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３７．前記５´ＵＴＲは、配列番号６８の配列またはその断片（例えば、配列番号６８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３８．前記５´ＵＴＲは、配列番号６９の配列またはその断片（例えば、配列番号６９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４３９．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４０．前記５´ＵＴＲは、配列番号７０の配列またはその断片（例えば、配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４１．前記５´ＵＴＲは、配列番号７１の配列またはその断片（例えば、配列番号７１の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４２．前記５´ＵＴＲは、配列番号７２の配列またはその断片（例えば、配列番号７２の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４３．前記５´ＵＴＲは、配列番号７３の配列またはその断片（例えば、配列番号７３の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４４．前記５´ＵＴＲは、配列番号７４の配列またはその断片（例えば、配列番号７４の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４５．前記５´ＵＴＲは、配列番号７５の配列またはその断片（例えば、配列番号７５の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４６．前記５´ＵＴＲは、配列番号７６の配列またはその断片（例えば、配列番号７６の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４７．前記５´ＵＴＲは、配列番号７７の配列またはその断片（例えば、配列番号７７の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４８．前記５´ＵＴＲは、配列番号７８の配列またはその断片（例えば、配列番号７８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４４９．前記５´ＵＴＲは、配列番号８８の配列またはその断片（例えば、配列番号８８の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４５０．前記５´ＵＴＲは、配列番号８９の配列またはその断片（例えば、配列番号８９の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４５１．前記５´ＵＴＲは、配列番号９０の配列またはその断片（例えば、配列番号９０の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、実施形態４２１に記載のポリヌクレオチド。
４５２．前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、実施形態４２１～４５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４５３．前記終止エレメントは、配列番号２６の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４５４．前記終止エレメントは、配列番号２７の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４５５．前記終止エレメントは、配列番号２８の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４５６．前記終止エレメントは、配列番号２９の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４５７．前記終止エレメントは、配列番号３０の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４５８．前記終止エレメントは、配列番号３１の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４５９．前記終止エレメントは、配列番号３２の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６０．前記終止エレメントは、配列番号３３の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６１．前記終止エレメントは、配列番号３４の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６２．前記終止エレメントは、配列番号３５の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６３．前記終止エレメントは、配列番号３６の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６４．前記終止エレメントは、配列番号６２の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６５．前記終止エレメントは、配列番号９３の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６６．前記終止エレメントは、配列番号９６の配列を含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６７．前記（ｂ）のコード領域は、配列番号３７、配列番号５６または配列番号５７のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、実施形態４５２に記載のポリヌクレオチド。
４６８．前記ポリヌクレオチドの前記コード領域は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４６９．前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、または細胞間タンパク質を含む、実施形態４６８に記載のポリヌクレオチド。
４７０．前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選択される、実施形態４６９に記載のポリヌクレオチド。
４７１．前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む、実施形態４６９に記載のポリヌクレオチド。
４７２．前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、抗体またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む、実施形態４６９に記載のポリヌクレオチド。
４７３．前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む、実施形態４６９に記載のポリヌクレオチド。
４７４．前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む、実施形態４６８～４７３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４７５．配列番号１の５´ＵＴＲ、配列番号２８の終止エレメントを含むコード領域及び配列番号１１の３´ＵＴＲを含むポリヌクレオチドにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性が増加する、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４７６．前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性の増加は、約１．２～１０倍である、実施形態４７５に記載のポリヌクレオチド。
４７７．前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性の増加は、ポリペプチドの活性を測定するアッセイ（例えば、実施例１８に記載のアッセイ）により測定される、実施形態４７５または４７６に記載のポリヌクレオチド。
４７８．配列番号１、配列番号４１または配列番号４２の５´ＵＴＲ、及び反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む３´安定化領域を含むポリヌクレオチドにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現量）が増加する、実施形態１～４７４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４７９．前記ポリペプチドの前記発現量の増加は、例えば、ポリペプチドの発現量を測定するアッセイ（例えば、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー、例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）により測定すると、約１．２～１０倍である、実施形態４７８に記載のポリヌクレオチド。
４８０．前記ポリペプチドの前記活性の増加は、例えば、ポリペプチドの活性を測定するアッセイ（例えば、代謝物形成の動態を追跡するアッセイ）により測定すると、約１．２～１０倍である、実施形態４７８に記載のポリヌクレオチド。
４８１．前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性の増加は、本明細書に記載される５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ、終止エレメント及び／または３´安定化領域を有さないポリヌクレオチドによってコードされる、他の類似のポリペプチドと比較される、実施形態４７９または４８０に記載のポリヌクレオチド。
４８２．少なくとも１つの５´キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４８３．前記５´キャップ構造は、
配列を含み、ここで、下線を引いたイタリック体のＧは、５´－５´－三リン酸基が続く反転したＧヌクレオチドである、実施形態４８２に記載のポリヌクレオチド。
４８４．前記５´キャップ構造は、
の配列を含み、ここで、下線を引いたイタリック体のＧは、５´－５´－三リン酸基が続く反転したＧヌクレオチドである、実施形態４８３に記載のポリヌクレオチド。
４８５．前記５´キャップ構造は、
の配列を含み、ここで、下線を引いたイタリック体のＧは、５´－５´－三リン酸基が続く反転したＧヌクレオチドである、実施形態４８３に記載のポリヌクレオチド。
４８６．３´安定化領域（例えば、安定化テール、例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４８７．前記３´安定化領域は、ポリＡテール（例えば、８０～１５０個、例えば、１２０個のアデニンを含むポリＡテール（配列番号１２３））を含み、任意選択で前記ポリＡテールは、１個以上の非アデノシン残基（例えば、１個以上のグアノシン）を含む、実施形態４８６に記載のポリヌクレオチド。
４８８．前記ポリＡテールは、ＵＣＵＡＧ配列（配列番号４４）を含む、実施形態４８６または４８７に記載のポリヌクレオチド。
４８９．前記ポリＡテールは、配列番号４４の上流に約８０～１２０個（例えば、１００個）のアデニンを含む、実施形態４８８に記載のポリヌクレオチド。
４９０．前記ポリＡテールは、配列番号４４の下流に約１～４０個（例えば、２０個）のアデニンを含む、実施形態４８８または４８９に記載のポリヌクレオチド。
４９１．前記３´安定化領域は、少なくとも１つの代替ヌクレオシドを含む、実施形態４８６～４９０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４９２．前記代替ヌクレオシドは、反転したチミジン（ｉｄＴ）である、実施形態４９１に記載のポリヌクレオチド。
４９３．前記代替ヌクレオシドは、前記３´安定化領域の３´末端に配置される、実施形態４９１または４９２に記載のポリヌクレオチド。
４９４．前記３´安定化領域は、式ＶＩＩの構造：
またはその塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミンを表す、実施形態４８６～４９３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４９５．前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを構成する、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
４９６．前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む、実施形態４９５に記載のポリヌクレオチド。
４９７．前記化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４´－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２´－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、実施形態４９５または４９６に記載のポリヌクレオチド。
４９８．前記化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態４９７に記載のポリヌクレオチド。
４９９．前記化学修飾は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである、実施形態４９７に記載のポリヌクレオチド。
５００．前記ｍＲＮＡは、完全修飾Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含む、実施形態４９７に記載のポリヌクレオチド。
５０１．先行実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
５０２．実施形態５０１に記載のＬＮＰ組成物を含む、医薬組成物。
５０３．実施形態５０１または５０２に記載のＬＮＰ組成物を含む、細胞。
５０４．前記ＬＮＰ組成物と接触している、実施形態５０３に記載の細胞。
５０５．前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で維持される、実施形態５０３または５０４に記載の細胞。
５０６．細胞におけるペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）の発現量を増加させる方法であって、実施形態５０１または５０２に記載のＬＮＰ組成物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
５０７．実施形態５０１または５０２に記載のＬＮＰ組成物を細胞に送達する方法。
５０８．インビトロ、インビボまたはエクスビボで、前記細胞を前記ＬＮＰ組成物と接触させることを含む、実施形態５０７に記載の方法。
５０９．疾患または障害（例えば、本明細書に記載のもの）を有する対象に、実施形態５０１または５０２に記載のＬＮＰ組成物を送達する方法。
５１０．対象における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする前記対象に、実施形態５０１または５０２に記載のＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
５１１．疾患もしくは障害の処置方法、予防方法、またはその症状の予防方法であって、それを必要とする前記対象に、実施形態５０１または５０２に記載のＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
５１２．前記ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、実施形態５０１～５１１のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１３．前記イオン化脂質は、アミノ脂質を含む、実施形態５１２に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１４．前記イオン化脂質は、本明細書に記載される式（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＣ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８））のいずれかの化合物を含む、実施形態５１２または５１３に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１５．前記イオン化脂質は、式（Ｉ）の化合物を含む、実施形態５１２～５１４のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１６．前記イオン化脂質は、式（ＩＣ）の化合物を含む、実施形態５１２～５１４のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１７．前記イオン化脂質は、式（ＩＩａ）の化合物を含む、実施形態５１２～５１４のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１８．前記イオン化脂質は、式（ＩＩｅ）の化合物を含む、実施形態５１２～５１４のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５１９．前記非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣからなる群から選択される化合物を含む、実施形態５１２～５１８のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２０．前記リン脂質は、ＤＳＰＣ（例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物）である、実施形態５１２～５１９のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２１．前記構造脂質は、アルファ－トコフェロール、β－シトステロールまたはコレステロールから選択される、実施形態５１２～５１９のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２２．前記構造脂質は、アルファ－トコフェロールである、実施形態５１２～５２０のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２３．前記構造脂質は、β－シトステロールである、実施形態５１２～５２０のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２４．前記構造脂質は、コレステロールである、実施形態５１２～５２１のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２５．前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態５１２～５２４のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２６．前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、実施形態５１２～５２５のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２７．前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態５１２～５２５のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２８．前記ＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）または式（ＶＩ－Ｄ）から選択される化合物である、実施形態５１２～５２５のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５２９．前記ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である、実施形態５１２～５２５または５２８のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３０．前記ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である、実施形態５１２～５２５または５２８のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３１．前記ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン化脂質、５～２５％のリン脂質、２５～５５％のコレステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比で構成される、実施形態５１２～５３０のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３２．前記ＬＮＰは、約５０％のイオン化脂質、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ脂質のモル比で構成される、実施形態５１２～５３１のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３３．前記ＬＮＰは、約４９．８３％のイオン化脂質、約９．８３％のリン脂質、約３０．３３％のコレステロール、及び約２．０％のＰＥＧ脂質のモル比で構成される、実施形態５１２～５３２のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３４．前記ＬＮＰまたは系は、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、肺または経口送達用に製剤化される、実施形態５０１～５３３のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３５．前記対象は、哺乳類（例えば、ヒト）である、実施形態５０１～５３４のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
５３６．前記対象は、本明細書に開示される疾患または障害を有する、実施形態５０１～５３５のいずれか１つに記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
ｍＲＮＡの効力及び持続性は、（１）細胞質に送達されたｍＲＮＡが、リボソームと適切かつ生産的に会合することを確実にすること；及び（２）該ｍＲＮＡが所望のタンパク質産物を積極的に産生することに費やす時間を最大にすることにより最適化され得る。該ｍＲＮＡの配列は、これらの態様全体にわたる能力における、重要な決定因子である。
本明細書では、とりわけ、ｍＲＮＡの５´非翻訳領域（ＵＴＲ）、３´ＵＴＲ及び／または終止エレメントの配列が、前記ｍＲＮＡの該効力及び／または持続性を増加させるために最適化され得る、という発見が開示される。いくつかの実施形態では、本開示は、ｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの有効性（例えば、レベル及び／または活性）を増加させ得る、最適化された５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ及び／または終止エレメントを含むポリヌクレオチド及びＬＮＰ組成物を提供する。
ｍＲＮＡ及び／または本明細書に開示されるｍＲＮＡ構築物でのコードされたタンパク質の発現に対する例示的効果は、実施例１～１３及び１４～１８において提供される。実施例１～８は、Ａ１ ５´ＵＴＲまたはそのバリアント（Ａ２ ５´ＵＴＲまたはＡ３ ５´ＵＴＲ）を有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のレベル及び／または活性の増加（例えば、タンパク質発現量の増加、活性の増加、及び／またはタンパク質発現の持続時間）を示している。実施例９は、該ｍＲＮＡ構築物の半減期を延長するＢ１ ３´ＵＴＲの発見と使用を開示するものである。実施例１０～１３は、終止エレメントＣ２～Ｃ１１から選択される終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のレベル及び／または活性の増加（例えば、タンパク質発現量の増加、活性の増加、及び／またはタンパク質発現の持続時間）を示している。本明細書に開示される５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ及び／または終止エレメントの組み合わせを有するｍＲＮＡ構築物のインビボ効果は、実施例１５～１８において提供される。標的タンパク質のレベル及び／または活性の増加は、細胞型、種及び標的タンパク質全体にわたって観察される。
従って、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチド、ならびにそれらを含むＬＮＰ組成物が開示される。一実施形態では、該コード領域は、ペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）または該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、レベル及び／または活性（例えば、発現量または半減期）が増加している。一実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の該レベル及び／または活性が増加している。一実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドの発現の該レベル及び／または活性、または持続時間が増加している。また、対象における、疾患もしくは障害を処置するために、または所望の生物学的効果を促進するために、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を使用する方法が本明細書に開示される。
定義
ポリウリジントラクト：「ポリウリジントラクト」または「ポリウラシルトラクト」は、本明細書では互換的に用いられ、核酸配列中の２個以上のウリジンまたはウラシルが連続した区間を指す。ポリウリジントラクトは、核酸配列の任意の位置またはセクションに存在し得る。一実施形態では、ポリウリジントラクトは、核酸配列の５´ＵＴＲに存在する。一実施形態では、ポリウリジントラクトは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、核酸配列は、１つ超のポリウリジントラクトを含み得る。一実施形態では、該１つ超のポリウリジントラクトは、互いに隣接して配置され得るか、または１つ以上のヌクレオチドによって分離され得る。
ポリウリジントラクト：「ポリウリジントラクト」または「ポリウラシルトラクト」は、本明細書では互換的に用いられ、核酸配列中の２個以上のウリジンまたはウラシルが連続した区間を指す。ポリウリジントラクトは、核酸配列の任意の位置またはセクションに存在し得る。一実施形態では、ポリウリジントラクトは、核酸配列の５´ＵＴＲに存在する。一実施形態では、ポリウリジントラクトは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、核酸配列は、１つ超のポリウリジントラクトを含み得る。一実施形態では、該１つ超のポリウリジントラクトは、互いに隣接して配置され得るか、または１つ以上のヌクレオチドによって分離され得る。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は互換的であり、ある特定の核酸配列に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（配列中のウリジンまたはウラシルの総数）または相対値（核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ）として表現され得る。
終止エレメント：「終止エレメント」という用語は本明細書で使用される場合、終止コドンを含む核酸配列を指す。該終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから選択され得る。一実施形態では、終止エレメントは、２つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、３つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、４つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、５つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、１つ以上の終止コドンの上流及び／または下流に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のヌクレオチドをさらに含む。
３´安定化領域：「３´安定化領域」という用語は本明細書で使用される場合、安定化されるまたは安定化する領域を指す。３´安定化領域は、核酸配列の３´末端に存在し得る。一実施形態では、３´安定化領域は、ポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、３´安定化領域は、代替ヌクレオシド（例えば、反転したチミジン）を含む。
配列同一性：配列間の配列同一性の計算は、以下のように実施され得る。２つのヌクレオチド配列の同一性の割合を決定するために、該配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、最適なアライメントのために、第１及び第２のヌクレオチド配列の一方または両方にギャップが導入され得る）。いくつかの実施形態では、比較目的のためにアラインされた参照配列の長さは、該参照配列の長さの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）である。対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置にあるヌクレオチドと同じヌクレオチドによって占められている場合、当該分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性の割合は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、配列同士で共有される同一位置数の関数である。同一性の割合は、通常、アライメントの全長に対する、一致する残基数の比率を指す。配列同士の比較及び２つの配列間における同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。いくつかの実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、ペアワイズ配列アライメントプログラムまたはマルチプル配列アライメントプログラムを使用して決定される。例示的な配列アライメントプログラムとしては、ｌａｌｉｇｎプログラム（ｅｍｂｎｅｔ．ｖｉｔａｌ－ｉｔ．ｃｈ；Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，（１９９１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７－３５７）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａプログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ；Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．７：５３９）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該プログラムのデフォルトのパラメータが使用される。本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公的データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」として使用され得る。このような検索は、ＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｈｉ．ｇｏｖ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０）を用いて実施され得る。例えば、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ｂｌａｓｔｎプログラムで実施して、本明細書に記載されるヌクレオチド配列と同一または類似のヌクレオチド配列を取得することができる。いくつかの実施形態では、該プログラムのデフォルトのパラメータが使用される。
代替ヌクレオシド：ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド等、例えば、ｍＲＮＡ分子）に関して、「代替ヌクレオシド」という用語が本明細書で使用される場合、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオチドに対しての変更を指す。一般に、本明細書において、これらの用語が、天然に存在する５´末端ｍＲＮＡキャップ部位におけるリボヌクレオチドの変更を指すことは意図されない。該変更は、様々な異なる変更であってよい。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、該コード領域、隣接領域、及び／または末端領域（例えば、３´安定化領域）は、１個、２個、またはそれ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチドの変更を含有することがある。いくつかの実施形態では、細胞に導入された代替ポリヌクレオチドは、変更されていないポリヌクレオチドと比較して、該細胞内での分解が低減されることを示し得る。
投与：本明細書で使用される場合、「投与」は、対象または患者に組成物を送達する方法を指す。投与方法は、身体の特定の領域または系へ標的送達する（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。例えば、投与は、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、もしくは頭蓋内注射、及び任意の好適な注入技術）、経口、経皮または皮内、皮間、直腸、膣内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／またはドロップによる）、粘膜、鼻、頬、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入による；経口スプレー及び／または粉末、鼻スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを介するものであってもよい。好ましい投与手段は、静脈内または皮下である。
抗体分子：１つの実施形態では、抗体分子は、所望の細胞型への標的化のために使用され得る。本明細書で使用される場合、「抗体分子」は、天然に存在する抗体、操作された抗体、またはその断片、例えば、天然に存在する抗体または操作された抗体の抗原結合部分を指す。抗体分子としては、例えば、抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィドで連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂ等の単一ドメイン抗体（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ナノボディ、もしくはラクダ科ＶＨＨドメイン）、フィブロネクチンポリペプチドミニボディ等の抗原結合フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）スキャフォールド、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を挙げることができる。例示的な抗体分子としては、ヒト化抗体分子、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体；二重または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）；Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｄ´断片、Ｆｄ断片等の抗体断片、及び単離されたＣＤＲまたはそのセット；一本鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合物；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲ等のサメ単一ドメイン抗体またはその断片）；ラクダ科抗体；マスクした抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））；Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（「ＳＭＩＰ（商標）」）；単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）；ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｙ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎ；Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）；Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標）；及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
およそ、約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の対象の値に適用されるとき、記載される基準値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された基準値のいずれかの方向（よりも大きいか、よりも小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下に収まる値の範囲を指す。例えば、ＬＮＰの脂質成分における所与の化合物量の文脈で使用される場合、「約」は、列挙された値の＋／－５％を意味し得る。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質成分を含むＬＮＰは、３０～５０％の該化合物を含んでもよい。
コンジュゲートされる：本明細書で使用される場合、「コンジュゲートされる」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、該部分が、直接的に、または連結剤としての役目を果たす１つ以上の追加の部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合するかまたはつなげられて、十分に安定な構造を形成し、該構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、該部分が物理的に会合したままであるようにすることを意味する。いくつかの実施形態では、２つ以上の部分は、直接的な共有化学結合によってコンジュゲートされてもよい。その他の実施形態では、２つ以上の部分は、イオン結合または水素結合によってコンジュゲートされてもよい。
接触させること：本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞をｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物と接触させることは、該細胞及びｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子に物理的接続を共有させることを意味する。細胞を、インビボ、インビトロ、及びエクスビボのどれにおいても外部実体に接触させる方法は、生物学分野で周知である。本開示の例示的な実施形態では、哺乳類細胞を組成物（例えば、本開示のナノ粒子、または医薬組成物）と接触させるステップは、インビボで行われる。例えば、脂質ナノ粒子組成物と、生物（例えば、哺乳類）内に配置され得る細胞（例えば、哺乳類細胞）との接触は、任意の好適な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下投与を含む、該生物への非経口投与）によって行われ得る。インビトロに存在する細胞では、組成物（例えば、脂質ナノ粒子）及び細胞は、例えば、該組成物を該細胞の培養培地に添加することによって接触され得、トランスフェクションを伴うか、またはトランスフェクションをもたらし得る。さらに、２つ以上の細胞を、ナノ粒子組成物と接触させてもよい。
送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、実体を送り先に提供することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬の対象への送達は、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、肺または皮下経路によって）投与することを必要とし得る。哺乳類または哺乳類細胞へのＬＮＰの投与は、１つ以上の細胞を脂質ナノ粒子と接触させることを必要とし得る。
カプセル化する：本明細書で使用される場合、「カプセル化する」という用語は、密封する（ｅｎｃｌｏｓｅ）、包囲する（ｓｕｒｒｏｕｎｄ）、または包む（ｅｎｃａｓｅ）ことを意味する。いくつかの実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物は、完全にカプセル化され、部分的にカプセル化され、または実質的にカプセル化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）にカプセル化され得る。
カプセル化効率：本明細書で使用される場合、「カプセル化効率」は、ＬＮＰの調製に使用される治療薬及び／または予防薬の初期総量に対する、ＬＮＰの一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に最初に提供される合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がＬＮＰにカプセル化される場合、カプセル化効率は９７％となり得る。本明細書で使用される場合、「カプセル化」は、完全な、実質的な、または部分的な封入（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）、閉じ込め（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）、包囲（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）、または包装（ｅｎｃａｓｅｍｅｎｔ）を指し得る。
有効量：本明細書で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益または所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、従って、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、本開示の脂質組成物（例えばＬＮＰ）中の標的細胞送達強化脂質の量の観点から、標的細胞送達強化脂質の有効量は、標的細胞送達強化脂質を欠く脂質組成物（例えばＬＮＰ）と比較して、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。脂質組成物（例えばＬＮＰ）によってもたらされる有益または所望の結果の非限定的な例としては、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの増加、及び／または脂質組成物（例えばＬＮＰ）と会合した／にカプセル化された核酸によってコードされるタンパク質の発現レベルの増加が挙げられる。有効量の脂質ナノ粒子が対象の標的細胞に取り込まれるように、標的細胞送達強化脂質含有脂質ナノ粒子を投与するという観点から、標的細胞送達強化脂質含有ＬＮＰの有効量は、標的細胞送達強化脂質を欠くＬＮＰと比較して、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。対象における有益または所望の結果の非限定的な例としては、標的細胞送達強化脂質を欠くＬＮＰと比較した、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの増加、標的細胞送達強化脂質含有ＬＮＰと会合した／にカプセル化された核酸によってコードされるタンパク質の発現レベルの増加、及び／または標的細胞送達強化脂質含有ＬＮＰと会合した／にカプセル化された核酸もしくはそのコードされたタンパク質のインビボにおける予防もしくは治療効果の増加が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療有効量の標的細胞送達強化脂質含有ＬＮＰは、感染、疾患、障害、及び／または病状を患っているかまたはそれを患いやすい対象に投与されるとき、感染、疾患、障害、及び／または病状の症状を処置する、改善する、それを診断する、予防する、及び／またはその発症を遅延させるのに十分である。別の実施形態では、有効量の脂質ナノ粒子は、標的細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上における所望のタンパク質の発現をもたらすのに十分である。例えば、標的細胞送達強化脂質含有ＬＮＰの有効量は、単回静脈内注射後に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％の標的細胞のトランスフェクションをもたらす量であり得る。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、１つ以上の以下の事象を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物の処理（例えば、スプライシング、編集、５´ｃａｐ形成、及び／または３´末端処理による）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エクスビボ：本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）の外で生じる事象を指す。エクスビボ事象は、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に変化した環境で起こり得る。
断片：本明細書で使用される場合、「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られるか、または組み換えＤＮＡ技術によって得られるポリペプチドを含み得る。タンパク質の断片は、例えば、該タンパク質の断片が該タンパク質の機能活性を保持するように１つ以上の機能ドメインを含むタンパク質の一部分であり得る。
ＧＣリッチ：本明細書で使用される場合、「ＧＣリッチ」という用語は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはその誘導体もしくはアナログを含む、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）、またはその任意の部分（例えばＲＮＡエレメント）の核酸塩基成分であって、そのＧＣ含量が約５０％より大きい、核酸塩基成分を指す。「ＧＣリッチ」という用語は、約５０％のＧＣ含量で構成される、遺伝子、非コード領域、５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡエレメント、配列モチーフ、またはその任意の個別的な配列、断片、もしくはセグメントを含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの全て、または一部分を指す。本開示のいくつかの実施形態では、ＧＣリッチポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基のみから構成される。
ＧＣ含量：本明細書で使用される場合、「ＧＣ含量」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）またはその一部（例えば、ＲＮＡエレメント）における、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはその誘導体もしくはアナログのいずれかである核酸塩基の（ＤＮＡ及びＲＮＡ中のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの誘導体もしくはアナログを含む、考えられる核酸塩基の総数における）パーセンテージを指す。「ＧＣ含量」という用語は、遺伝子、非コード領域、５´または３´ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡエレメント、配列モチーフ、またはその任意の個別的な配列、断片、もしくはセグメントを含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの全て、または一部分を指す。
非相同：本明細書で使用される場合、「非相同」は、ある配列（例えば、アミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が、通常は、所与のポリペプチドまたはポリヌクレオチド内に存在していないことを指し示す。例えば、１つのタンパク質のドメインまたはモチーフに対応するアミノ酸配列は、第２のタンパク質に対して非相同であり得る。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（天然においてか実験環境においてかにかかわらず）物質または実体が会合していた成分の少なくともいくつかから分離されている物質または実体を指す。単離された物質は、それらが会合していた物質に関連して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（天然においてか実験環境においてかにかかわらず）物質または実体が会合していた成分の少なくともいくつかから分離されている物質または実体を指す。単離された物質は、それらが会合していた物質に関連して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。
コザック配列：「コザック配列」（「コザックコンセンサス配列」とも呼ばれる）という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を向上させる翻訳開始エンハンサーエレメントを指し、真核生物では、５´ＵＴＲに位置する。該コザックコンセンサス配列は、元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳における開始コドン（ＡＵＧ）周囲の単一変異の影響の分析に従い、ＧＣＣＲＣＣ（配列番号４３）（Ｒ＝プリン）の配列として定義された（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４：２８３－２９２）。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは修飾物を含む。（翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８０７，７０７号、参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙの米国特許第５，７２３，３３２号、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷｉｌｓｏｎの米国特許第５，８９１，６６５号を参照されたい）。
スキャニング漏れ：「スキャニング漏れ」として知られている現象は、ＰＩＣが、開始コドンをバイパスし、代わりに代替のまたは代替的な開始コドンが認識されるまで下流をスキャンし続けることによって発生し得るものである。発生頻度に応じて、ＰＩＣによる開始コドンのバイパスにより、翻訳効率が低下することがある。さらに、この下流ＡＵＧコドンからの翻訳が発生し得ると、所望の治療反応を誘発できない可能性がある、望ましくない異常な翻訳産物が産生することになる。場合によっては、該異常な翻訳産物により、実際に有害反応が引き起こされる恐れがある（Ｋｒａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３（４）：５０１－５０７）。
リポソーム：本明細書で使用される場合、「リポソーム」とは、水性内部を囲む脂質含有膜を含む構造を意味する。リポソームは、１つ以上の脂質膜を有し得る。リポソームとしては、単層（ｓｉｎｇｌｅ－ｌａｙｅｒｅｄ）リポソーム（当該技術分野において単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームとしても知られている）及び多層（ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｒｅｄ）リポソーム（当該技術分野において多重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームとしても知られている）が挙げられる。
修飾された：本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、本開示の分子の状態変化または構造変化（例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造の変化）を指す。分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、例えば、化学的に、構造的に、及び／または機能的に様々な方法で修飾され得る。例えば、分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、１つ以上のＲＮＡエレメントの組み込みによって構造的に修飾されてもよく、この場合、該ＲＮＡエレメントは、１つ以上の機能（例えば、翻訳調節活性）を提供する配列及び／またはＲＮＡの二次構造（複数可）を含む。従って、本開示の分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、１つ以上の修飾を含み得る（例えば、１つ以上の化学的、構造的、または機能的修飾（それらの任意の組み合わせを含む）を含み得る）。１つの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ分子）は、例えば、天然のリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関する、非天然のヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造等の非標準のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾された」とはみなされない。
ｍＲＮＡ：本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然に存在するものであっても、または天然に存在しないものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡは、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカー等の修飾及び／または天然に存在しない成分を含み得る。ｍＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。ｍＲＮＡが翻訳されると、例えば、インビボでｍＲＮＡが哺乳類細胞内において翻訳されると、ポリペプチドが産生され得る。従来、ｍＲＮＡ分子の基本成分には、少なくとも１つのコード領域、５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）、３´ＵＴＲ、５´キャップ、及びポリＡ配列が含まれる。一実施形態では、該ｍＲＮＡは、環状ｍＲＮＡである。
ナノ粒子：本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、約１０００ｎｍ未満のスケールで、同じ材料のバルクサンプルと比較したときに新規な特性を示す、任意の１つの構造的特徴を有する粒子を指す。通例では、ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍのスケールで、任意の１つの構造的特徴を有する。また、通例では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～約１２０ｎｍのスケールで任意の１つの構造的特徴を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１～１０００ｎｍのオーダーの１つ以上の大きさを有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍのオーダーの１つ以上の大きさを有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約５０～２００ｎｍのオーダーの１つ以上の大きさを有する粒子である。球状ナノ粒子であれば、例えば、約５０～１００または７０～１２０ナノメートルの直径を有するであろう。ナノ粒子は、ほとんどの場合、その輸送及び特性に関して、一単位としての挙動を示す。ナノ粒子を対応するバルク材料と差別化する新規な特性は、典型的には、１０００ｎｍ未満のサイズ尺度または約１００ｎｍのサイズで生じるものであるが、ナノ粒子のサイズは、例えば、楕円形、管状等の粒子では、より大きいものであり得ることに留意されたい。ほとんどの分子のサイズが上記の概要に当てはまるはずであるが、通常、個々の分子はナノ粒子とは呼ばれない。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２´－アミノ官能基を有する２´－アミノ－ＬＮＡ、及び２´－アミノ官能基を有する２´－アミノ－α－ＬＮＡが挙げられる））、またはそれらのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸構造：本明細書で使用される場合、「核酸構造」という用語（「ポリヌクレオチド構造」と互換的に使用される）は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する原子、化学的成分、エレメント、モチーフ、及び／または連結されたヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体が、配置または組織化されたものを指す。当該用語はまた、核酸の二次元または三次元状態を指す。従って、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する原子、化学的成分、エレメント、モチーフ、及び／または連結されたヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体が配置または組織化されたものを指し、及び／またはＲＮＡ分子の二次元及び／または三次元状態を指す。核酸構造は、組織化の複雑さの増大に基づいて、「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と本明細書で呼ばれる４つの組織化カテゴリーにさらに区分することができる。
核酸塩基：本明細書で使用される場合、「核酸塩基」（あるいは「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」）という用語は、核酸に見られるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指し、それらには、核酸またはその一部分もしくはセグメントに向上した特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性）を付与する、天然に存在するプリン及びピリミジンの任意の誘導体または類似体が含まれる。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルは、主に天然の核酸に見られる核酸塩基である。当該技術分野で公知である、及び／または本明細書に記載される、他の天然、非天然、及び／または合成の核酸塩基が核酸に組み込まれ得る。
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体もしくは類似体（これらも本明細書では「核酸塩基」と呼ばれる）に共有結合した糖分子（例えば、ＲＮＡ中のリボースまたはＤＮＡ中のデオキシリボース）またはその誘導体もしくは類似体を含有するが、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）を欠く化合物を指す。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）に共有結合されたヌクレオシド、または核酸またはその一部分もしくはセグメントに向上した化学的及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性）を付与するそれらの任意の誘導体、類似体、もしくは修飾体を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される場合、「ＯＲＦ」と略される「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。ＯＲＦは、開始コドンで始まって終止コドンで終了する連続した一続きの非重複インフレームコドンを含み、リボソームによって翻訳される。
患者：本明細書で使用される場合、「患者」は、処置を求めるかもしくは処置を必要とする可能性がある対象、処置を要求する対象、処置を受けている対象、処置を受けようとする対象、または訓練を受けた専門家によって特定の疾患もしくは病状について処置を受けている対象を指す。特定の実施形態では、患者は、ヒトの患者である。いくつかの実施形態では、患者は、自己免疫疾患（例えば、本明細書に記載のもの）を患う患者である。
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有することなくヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した、安全な医学的判断の範囲内にあり、妥当な利益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物及び／または剤形を指すために本明細書で用いられる。
薬学的に許容される賦形剤：「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書で使用される場合、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性であるという特性を有する、本明細書に記載の化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることが可能なビヒクル）を指す。賦形剤としては、例えば、付着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、香料、流動化剤（流動向上剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁化剤または分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられ得る。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミテート、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される塩：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の誘導体であって、既存の酸または塩基部分がその塩形態に変換されることによって（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることによって）親化合物が修飾されたものを指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の無機または有機酸性塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリまたは有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、アセテート、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホナート、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ性土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、限定するものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中またはその２つの混合物中で（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい）化学量論的な量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」という用語は、天然に（例えば、単離または精製されて）または合成的に生成され得る、典型的にはペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーを指す。
ＲＮＡ：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」は、天然に存在しても、または天然に存在しなくてもよいリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、修飾された及び／または天然に存在しない成分、例えば、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、インビボでのｍＲＮＡの哺乳類細胞内翻訳により、コードされたポリペプチドが産生され得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる非限定的な群から選択されてもよい。
ＲＮＡエレメント：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡエレメント」という用語は、生物学的機能をもたらす、及び／または生物学的活性（例えば、翻訳調節活性）を有する、ＲＮＡ分子の一部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載されるもの等の１つ以上のＲＮＡエレメントを組み込むことによってポリヌクレオチドを修飾すると、１つ以上の望ましい機能的特性が、修飾されたポリヌクレオチドにもたらされる。本明細書に記載されるＲＮＡエレメントは、天然に存在し得る、天然に存在し得ない、合成され得る、操作され得る、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、調節活性をもたらす天然に存在するＲＮＡエレメントには、ウイルス、原核生物、及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトーム全体に見られるエレメントが含まれる。特定の真核生物のｍＲＮＡ及び翻訳されるウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡエレメントは、細胞における多くの機能の媒介に関与していることが示されている。例示的な天然のＲＮＡエレメントとしては、翻訳開始エレメント（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ ７（２）：１９４－２０６を参照されたい）、翻訳エンハンサーエレメント（例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１０）：６４２１－６４３１を参照されたい）、ｍＲＮＡ安定性エレメント（例えば、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（２）：１１３－１２６を参照されたい）、翻訳抑制エレメント（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１０（１－２）：９７－１１２を参照されたい）、タンパク質結合ＲＮＡエレメント（例えば、鉄応答性エレメント、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５（１８）：３３０１－３３１０を参照されたい）、細胞質ポリアデニル化エレメント（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２－４５７）、及び触媒ＲＮＡエレメント（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９（９－１０）：６３４－６４１を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
特異的送達：本明細書で使用される場合、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、オフターゲット細胞（例えば、非標的細胞）と比較して、より多く（例えば、少なくとも１０％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも３０％多く、少なくとも４０％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）の治療薬及び／または予防薬がナノ粒子によって目的の標的細胞（例えば、哺乳類の標的細胞）へ送達されることを意味する。特定の細胞へのナノ粒子の送達レベルは、標的細胞で産生されるタンパク質の量を非標的細胞に対して比較することによって（例えば、フローサイトメトリーを使用した平均蛍光強度によって）、タンパク質を発現する標的細胞の％を非標的細胞に対して比較することによって（例えば、定量的フローサイトメトリーによって）、非標的細胞で産生されたタンパク質の量に対する標的細胞で産生されたタンパク質の量を、非標的細胞における総タンパク質量に対する前記標的細胞における総タンパク質量と比較することによって、あるいは非標的細胞における治療薬及び／または予防薬の量に対する標的細胞における治療薬及び／または予防薬の量を、非標的細胞における治療薬及び／または予防薬の総量に対する前記標的細胞における治療薬及び／または予防薬の総量と比較することによって測定されてもよい。標的細胞へ特異的に送達するナノ粒子の能力は、処置されている対象において決定される必要はなく、動物モデル等の代用物（例えば、マウスモデルまたはＮＨＰモデル）において決定されてもよいことが理解されよう。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の性質または特性を完全またはほぼ完全な程度または度合いに呈する定性的な状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象が、皆無ではないにせよ、完了に至り、及び／または完全な状態まで進行するか、あるいは絶対的な結果を達成または回避することは稀であることを理解するであろう。従って、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に内在する完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
患う：疾患、障害、及び／または病状を「患う」個人は、疾患、障害、及び／または病状の１つ以上の症状があると診断されているか、またはそれを示している。
標的化部分：本明細書で使用される場合、「標的化部分」は、特定の細胞型、組織型、及び／または臓器型へとナノ粒子を標的化し得る化合物または薬剤である。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されたときに、治療的、診断的、及び／または予防的効果を有し、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、該治療剤は、治療ペイロードを含むか、または治療ペイロードである。いくつかの実施形態において、該治療剤は、低分子もしくは生物学的物質（例えば、抗体分子）を含むか、または低分子もしくは生物学的物質である。
トランスフェクション：本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、種（例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド）を細胞に導入する方法を指す。
翻訳調節活性：本明細書で使用される場合、「翻訳調節活性」（「翻訳調節機能」と互換的に使用される）という用語は、翻訳装置の活性を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）（例えば、調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）、影響を与える、制御する、変える）生物学的な機能、機構、またはプロセスを指し、それらには、ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性が含まれる。いくつかの態様では、所望の翻訳調節活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を増進する及び／または強化する。いくつかの態様では、所望の翻訳調節活性は、スキャニング漏れを低減させる及び／または阻害する。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療目的で、本開示による組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳類）、及び／または植物が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は、患者であり得る。
処置すること：本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病状の１つ以上の症状または特徴を、部分的もしくは完全に軽減させる、改善する、好転させる、緩和する、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低減させる、及び／またはその発生率を低減させることを指す。例えば、がんを「処置すること」は、腫瘍の生存、増殖、及び／または広がりを阻害することを指し得る。処置は、疾患、障害、及び／または病状に関連する病態の発生のリスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／または病状の兆候を呈さない対象に、及び／または疾患、障害、及び／または病状の初期兆候のみを呈する対象に施され得る。
予防すること：本明細書で使用される場合、「予防すること」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病状の１つ以上の症状または特徴の発症を部分的または完全に阻害することを指す。
非修飾：本明細書で使用される場合、「非修飾」は、何らかの方法で変更される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。非修飾は、常にとは限らないが、野生型または天然型の生体分子を指し得る。分子は、各々の修飾分子が後続の修飾のための「非修飾」出発分子として働き得る一連の修飾を受け得る。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は互換的であり、ある特定の核酸配列に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（配列中のウリジンまたはウラシルの総数）として表すか、または相対値（核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ）として表すことができる。
ウリジン修飾配列：「ウリジン修飾配列」という用語は、ウリジン含量が全体的または局所的に異なる（ウリジン含量を高くするか、または低くする）ように配列が最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指すか、あるいは候補核酸配列のウリジン含量及び／またはウリジンパターンに対して異なるウリジンパターン（例えば、傾斜分布またはクラスター化）を有するように配列が最適化された核酸を指す。本開示の文脈では、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同義かつ互換的であるとみなされる。
「高ウリジンコドン」は２個または３個のウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は１個のウリジンを含むコドンとして定義され、「無ウリジンコドン」はウリジンを含まないコドンである。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンでの置換、高ウリジンコドンの無ウリジンコドンでの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンでの置換、低ウリジンコドンの無ウリジンコドンでの置換、無ウリジンコドンの低ウリジンコドンでの置換、無ウリジンコドンの高ウリジンコドンでの置換、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、無ウリジンコドンは、別の無ウリジンコドンで置き換えることができる。ウリジン修飾配列は、ウリジン富化またはウリジン希薄化されたものであり得る。
ウリジン富化：本明細書で使用される場合、「ウリジン富化」及び文法上の変形は、配列が最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）のウリジン含量（絶対値で表現されるか、またはパーセンテージ値として表現される）の、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対する増大を指す。ウリジン富化は、候補核酸配列のコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施することができる。ウリジン富化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列または領域に対して）であり得る。
ウリジン希薄化：本明細書で使用される場合、「ウリジン希薄化」及び文法上の変形は、配列が最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）のウリジン含量（絶対値で表現されるか、またはパーセンテージ値として表現される）の、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対する減少を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列のコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列または領域に対して）であり得る。
バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、例えば、当該技術分野で認識されるアッセイによって測定したとき、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の野生型分子の活性を有するか、または野生型分子に対する構造類似性を有する分子を指す。
５´ＵＴＲ配列
５´ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡへのリボソームのリクルートに重要であり、翻訳において役割を果たすことが報告されている（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：６２９２：１４１３－６）。
５´ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡへのリボソームのリクルートに重要であり、翻訳において役割を果たすことが報告されている（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：６２９２：１４１３－６）。
本明細書では、とりわけ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、もしくは該ポリヌクレオチドそれ自体の半減期の増加、発現量の増加及び／または活性の増加を付与する５´ＵＴＲを有する、該ポリヌクレオチドが開示される。一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、表１に示されているものまたはそのバリアントもしくは断片）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含み、ＬＮＰ組成物はそれらを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列またはそのバリアントもしくは断片（例えば、その機能的バリアントまたは断片）を含む５´ＵＴＲを含む。このような５´ＵＴＲは、天然では見出されない構築物に組み込まれる（例えば、このような５´ＵＴＲは、合成である、天然に存在する５´ＵＴＲの配列が変更されている、天然で見出されるものの切断または伸長したバージョンである、化学的に修飾した塩基を含む、天然で見出され得るものとは異なるＯＲＦ配列の５´にある等）ことが理解されよう。
一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の少なくとも最初（すなわち、最も５´側）の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の最初のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の最初の２個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の最初の３個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の最初の４個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の最初の５個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、表１に示されている配列の断片は、表１に示されている配列の最初の６個のヌクレオチドを欠く。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の少なくとも最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の最初のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の最初の２個のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の最初の３個のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の最初の４個のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の最初の５個のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表１に示されている配列の最初の６個のヌクレオチドを欠くが、その他の点では、表１に示されている配列に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む、５´ＵＴＲを含む。
一実施形態では、表１に示されている５´ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、該ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）している。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０倍、またはそれ以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約２倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約３倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約４倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約５倍以上である。
一実施形態では、表１に示されている５´ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する該ポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する。一実施形態では、該５´ＵＴＲにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する。一実施形態では、該レベル及び／または活性の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０倍、またはそれ以上である。一実施形態では、該レベル及び／または活性の増加は、約１．５倍以上である。一実施形態では、該レベル及び／または活性の増加は、約２倍以上である。一実施形態では、該レベル及び／または活性の増加は、約３倍以上である。一実施形態では、該レベル及び／または活性の増加は、約４倍以上である。一実施形態では、該レベル及び／または活性の増加は、約５倍以上である。
一実施形態では、該増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または表１に記載される５´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドの該半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドの該レベル及び／または活性（例えば、産生量）の増加は、ポリペプチドのレベル及び／または活性を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、表１に示されている配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９または配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９または配列番号９０）の断片に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含み、該断片は、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の少なくとも最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９または配列番号９０のいずれかのヌクレオチド１、ヌクレオチド１～２、ヌクレオチド１～３、ヌクレオチド１～４、またはヌクレオチド１～５を欠く）。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号６９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号６９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号７８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号７８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号８８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号８８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号８９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号８９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号９０の最初の、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠くその断片を含む。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１のバリアントを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、式Ａの核酸配列：
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、
式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３または４）である；
（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２または３）である；
Ｎ６はウラシルまたはシトシンである；
Ｎ７はウラシルまたはグアニンである；
Ｎ８はアデニンまたはグアニンであり、ｘは０～１の整数である。
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、
式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３または４）である；
（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２または３）である；
Ｎ６はウラシルまたはシトシンである；
Ｎ７はウラシルまたはグアニンである；
Ｎ８はアデニンまたはグアニンであり、ｘは０～１の整数である。
一実施形態では、（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０である。一実施形態では、（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは１である。一実施形態では、（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは２である。一実施形態では、（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは３である。一実施形態では、（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは４である。一実施形態では、（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは５である。
一実施形態では、（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０である。一実施形態では、（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは１である。
一実施形態では、（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０である。一実施形態では、（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは１である。
一実施形態では、（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０である。一実施形態では、（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは１である。一実施形態では、（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは２である。一実施形態では、（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは３である。一実施形態では、（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは４である。一実施形態では、（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは５である。
一実施形態では、Ｎ６はウラシルである。一実施形態では、Ｎ６はシトシンである。
一実施形態では、Ｎ７はウラシルである。一実施形態では、Ｎ７はグアニンである。
一実施形態では、Ｎ８はアデニンであり、ｘは０である。一実施形態では、Ｎ８はアデニンであり、ｘは１である。
一実施形態では、Ｎ８はグアニンであり、ｘは０である。一実施形態では、Ｎ８はグアニンであり、ｘは１である。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、配列番号１のバリアントを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも５０％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも６０％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも７０％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも８０％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９０％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９５％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９６％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９７％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９８％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９９％同一である配列またはその断片を含む。一実施形態では、配列番号１の断片は、配列番号１のヌクレオチド２～７５を含む。一実施形態では、配列番号１の断片は、配列番号１のヌクレオチド３～７５を含む。一実施形態では、配列番号１の断片は、配列番号１のヌクレオチド４～７５を含む。一実施形態では、配列番号１の断片は、配列番号１のヌクレオチド５～７５を含む。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも５％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも１０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも２０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも３０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも４０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも５０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも６０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも７０％のウリジン含量で構成される。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも８０％のウリジン含量で構成される。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、少なくとも２、３、４、５、６または７個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、少なくとも１～７、２～７、３～７、４～７、５～７、６～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、または３～５個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、４個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントにおける該ポリウリジントラクトは、５個の連続したウリジンを含む。
一実施形態では、配列番号１のバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、３つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、４つのポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号１のバリアントは、５つのポリウリジントラクトを含む。
一実施形態では、１つ以上の該ポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している。一実施形態では、該ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、互いに隣接している（例えば、該ポリウリジントラクトの全てが連続している）。
一実施形態では、１つ以上の該ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている。一実施形態では、該ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている。
一実施形態では、第１のポリウリジントラクト及び第２のポリウリジントラクトは、互いに隣接している。
一実施形態では、後続の（例えば、第３、第４、第５、第６もしくは第７、第８、第９、または第１０の）ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドによって、第１のポリウリジントラクト、第２のポリウリジントラクト、または後続のポリウリジントラクトのいずれか１つから分離されている。
一実施形態では、第１のポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドによって、後続のポリウリジントラクト（例えば、第２、第３、第４、第５、第６もしくは第７、第８、第９、または第１０のポリウリジントラクト）から分離されている。一実施形態では、１つ以上の該後続のポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している。
一実施形態では、該５´ＵＴＲは、コザック配列（例えば、ＧＣＣＲＣＣヌクレオチド配列（配列番号４３）、ここで、Ｒはアデニンまたはグアニンである）を含む。一実施形態では、該コザック配列は、該５´ＵＴＲ配列の３´末端に配置される。
一実施形態では、本明細書に開示される５´ＵＴＲ配列を含む該ポリヌクレオチドは、ペイロード（例えば、治療または予防ペイロード）をコードするコード領域を含む。
一態様において、本明細書に開示される５´ＵＴＲ配列を含む該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＬＮＰとして製剤化される。一実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象における、疾患もしくは障害を処置する方法、または免疫応答を阻害する方法で使用される。
一態様において、治療ペイロードまたは予防ペイロード（例えば、本明細書に記載のもの）をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、追加の薬剤（例えば、本明細書に記載のもの）とともに投与され得る。
３´ＵＴＲ配列
３′ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡの翻訳、半減期、及び細胞内局在に影響を及ぼすことが示されている（Ｍａｙｒ Ｃ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐ Ｂｉｏｌ ２０１９ Ｏｃｔ １；１１（１０）：ａ０３４７２８）。
３′ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡの翻訳、半減期、及び細胞内局在に影響を及ぼすことが示されている（Ｍａｙｒ Ｃ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐ Ｂｉｏｌ ２０１９ Ｏｃｔ １；１１（１０）：ａ０３４７２８）。
本明細書では、とりわけ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、もしくは該ポリヌクレオチドそれ自体の半減期の増加、発現量の増加及び／または活性の増加を付与する３´ＵＴＲを有する、該ポリヌクレオチドが開示される。一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、表２に示されているものまたはそのバリアントもしくは断片）を含み、ＬＮＰ組成物はそれらを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表２に示されている配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。
一実施形態では、表２に示されている３´ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する該ポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、該ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～１０倍増加）する。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０倍、またはそれ以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約２倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約３倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約４倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約５倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約６倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約７倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約８倍である。一実施形態では、該半減期の増加は、約９倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約１０倍以上である。
一実施形態では、表２に示されている３´ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する該ポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドの平均半減期スコアが１０を超える。
一実施形態では、表２に示されている３´ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する該ポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する。
一実施形態では、該増加は、３´ＵＴＲを有さない、異なる３´ＵＴＲを有する、または表２の３´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初（すなわち、最も５´側）の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初の２個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初の３個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初の４個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初の５個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初の６個のヌクレオチドを欠く。一実施形態では、該断片は、前述した配列のいずれかの最初の７個またはそれ以上（例えば、８、９、１０個、またはそれ以上）のヌクレオチドを欠く。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、組み合わされた終止エレメント（例えば、本明細書に記載される終止エレメント）及び３´ＵＴＲの長さが一定の長さになるように、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の断片を含む。例えば、Ｘヌクレオチドを有する終止エレメントを、Ｙヌクレオチドを有する３´ＵＴＲ配列と組み合わせて使用すると仮定すると、組み合わせた長さは、Ｘ＋Ｙヌクレオチドである。一実施形態では、Ｘ＋Ｎヌクレオチドを有する異なる終止エレメントが使用される場合、該３´ＵＴＲ配列の長さは、Ｙ－Ｎヌクレオチドに短縮されて（例えば、該３´ＵＴＲ配列の最初のＮヌクレオチドを削除することによって）、組み合わせた長さ（すなわち、Ｘ＋Ｙ）が一定に保たれる。一実施形態では、Ｘ＝３、６、９、１２、または１５である。一実施形態では、Ｎ＝－１５、－１２、－９、－６、－３、３、６、９、１２、または１５である。一実施形態では、Ｘ＝３、６、９、１２、または１５、及びＮ＝－１５、－１２、－９、－６、－３、３、６、９、１２、または１５である。一実施形態では、Ｘ＝９及びＮ＝６である。一実施形態では、Ｘ＝１５及びＮ＝－６である。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列、もしくは配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１２の配列、もしくは配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１３の配列、もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１４の配列、もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１５の配列、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１６の配列、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１７の配列、もしくは配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１８の配列、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号１９の配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号２０の配列、もしくは配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号２１の配列、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号２２の配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号２３の配列、もしくは配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号２４の配列、もしくは配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号２５の配列、もしくは配列番号２５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号２５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列、もしくは配列番号４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号７９の配列、もしくは配列番号７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号７９の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８０の配列、もしくは配列番号８０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８０の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８１の配列、もしくは配列番号８１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８２の配列、もしくは配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８３の配列、もしくは配列番号８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８３の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８４の配列、もしくは配列番号８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８４の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８５の配列、もしくは配列番号８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８６の配列、もしくは配列番号８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８６の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号８７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号８７の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号６０のヌクレオチド１６～１８８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号６０のヌクレオチド１６～１８８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８７の配列、もしくは配列番号６１のヌクレオチド１６～１８８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号６１のヌクレオチド１６～１８８の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む。このような３´ＵＴＲは、天然では見出されない構築物に組み込まれる（例えば、このような３´ＵＴＲは、合成である、天然に存在する３´ＵＴＲの配列が変更されている、天然で見出されるものの切断または伸長したバージョンである、化学的に修飾した塩基を含む、天然で見出され得るものとは異なるＯＲＦ配列の３´にある等）ことが理解されよう。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、ヒト細胞内に存在するｍｉＲに結合する、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０またはそれらの組み合わせのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位、（例えば、２、３、４、５、６、７または８つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。一実施形態では、該複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、同一または異なるｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ｍｉＲ１２２ ｂｓ＝ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ（配列番号３８）
ｍｉＲ－１４２－３ｐ ｂｓ＝ＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡ（配列番号３９）
ｍｉＲ－１２６ ｂｓ＝ＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡ（配列番号４０）
ｍｉＲ１２２ ｂｓ＝ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ（配列番号３８）
ｍｉＲ－１４２－３ｐ ｂｓ＝ＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡ（配列番号３９）
ｍｉＲ－１２６ ｂｓ＝ＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡ（配列番号４０）
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つ以上のターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＥＮＴ）を、該３´ＵＴＲを含む該ポリヌクレオチドにリクルートする、ＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、該ＴＥＮＴは、ＴＥＮＴ４（例えば、ＴＥＮＴ４Ａ及び／またはＴＥＮＴ４Ｂ）である。理論に束縛されることは望まないが、いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＥＮＴ（例えば、ＴＥＮＴ４Ａ及び／またはＴＥＮＴ４Ｂ）が、断続的な非アデノシン残基（例えば、グアノシン）を有する混合ポリＡテールを生成し、ｍＲＮＡを急速な脱アデニル化から保護する、と考えられている。
例示的なＴＥＮＴリクルート配列としては、
ＣＡＣＣＧＣＧＵＵＡＵＣＣＧＵＵＣＣＵＣＧＵＡＧＧＣＵＧＧＵＣＣＵＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＵＣＧＧＣＧＧ（配列番号９１）及び
ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＵＧＣＣＧＵＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＵＵＡＵＣＣＧＵＵＣＣＵＣＧＵＡＧＧＣＵＧＧＵＣＣＵＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＵＣＧＧＣＧＧＣＣＧＧＵＣＧＧＣＵＵＣＵＧＵＵＵＵＡ（配列番号９２）
が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＣＣＧＣＧＵＵＡＵＣＣＧＵＵＣＣＵＣＧＵＡＧＧＣＵＧＧＵＣＣＵＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＵＣＧＧＣＧＧ（配列番号９１）及び
ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＵＧＣＣＧＵＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＵＵＡＵＣＣＧＵＵＣＣＵＣＧＵＡＧＧＣＵＧＧＵＣＣＵＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＵＣＧＧＣＧＧＣＣＧＧＵＣＧＧＣＵＵＣＵＧＵＵＵＵＡ（配列番号９２）
が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、該ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、該ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、該ＴＥＮＴリクルート配列は、配列番号９２のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つ以上（例えば、２、３、４、５つ、またはそれ以上）のＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載される１つ以上のＴＥＮＴリクルート配列）を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、１つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、２つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、３つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、４つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、５つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。例えば、該３´ＵＴＲにおける複数のＴＥＮＴリクルート配列は、同一であり得るかまたは異なり得る。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む、ＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む、ＴＥＮＴリクルート配列を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む、１つ以上（例えば、２、３、４、５つ、またはそれ以上）のＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む、１つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列をそれぞれ含む、２つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列をそれぞれ含む、３つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列をそれぞれ含む、４つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列をそれぞれ含む、５つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む、１つ以上（例えば、２、３、４、５つ、またはそれ以上）のＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、２つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、３つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、４つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、５つのＴＥＮＴリクルート配列を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８０のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９４のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９４のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９５のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、もしくはそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、該３´ＵＴＲは、配列番号９５のヌクレオチド配列を含む。
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが開示される。
一態様において、本明細書に開示される３´ＵＴＲを含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象における、疾患もしくは障害を処置する方法、または免疫応答を阻害する方法で使用される。
一態様において、治療ペイロードまたは予防ペイロード（例えば、本明細書に記載のもの）をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、追加の薬剤（例えば、本明細書に記載のもの）とともに投与され得る。
終止エレメント
翻訳終止コドンであるＵＡＡ、ＵＡＧ、及びＵＧＡは、遺伝暗号の重要な構成要素であり、ｍＲＮＡの翻訳終結を知らせるものである。タンパク質合成中、終止コドンはタンパク質放出因子と相互作用し、この相互作用によりリボソーム活性が調節され得、従って翻訳が影響を受ける（Ｔａｔｅ ＷＰ，ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，４６（６）：１６１５－１６２）。
翻訳終止コドンであるＵＡＡ、ＵＡＧ、及びＵＧＡは、遺伝暗号の重要な構成要素であり、ｍＲＮＡの翻訳終結を知らせるものである。タンパク質合成中、終止コドンはタンパク質放出因子と相互作用し、この相互作用によりリボソーム活性が調節され得、従って翻訳が影響を受ける（Ｔａｔｅ ＷＰ，ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，４６（６）：１６１５－１６２）。
本明細書では、とりわけ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、もしくは該ポリヌクレオチドそれ自体の半減期の増加、発現量の増加及び／または活性の増加を付与する、終止エレメントを含むコード領域を有する、該ポリヌクレオチドが開示される。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含み、ＬＮＰ組成物はそれらを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表３に示されている終止エレメントを含むコード領域を含む。
本明細書で使用される場合、終止エレメントは、終止コドンを含む核酸配列を指す。該終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから選択され得る。一実施形態では、終止エレメントは、２つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、３つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、４つの連続した終止コドンを含む。一実施形態では、終止エレメントは、５つの連続した終止コドンを含む。
一実施形態では、該終止エレメントは、複数の同一の終止コドンを含む。一実施形態では、該終止エレメントは、複数の異なる終止コドンを含む。
一実施形態では、終止エレメントは、１つ以上の終止コドンの上流及び／または下流に、少なくとも１、２、３、４、５、または１０個のヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、終止エレメントは、１つ以上の終止コドンの上流に、少なくとも１、２、３、４、５、または１０個のヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、終止エレメントは、１つ以上の終止コドンの下流に、少なくとも１、２、３、４、５、または１０個のヌクレオチドをさらに含む。
本発明はまた、終止コドンエレメントと本明細書に記載のポリヌクレオチドとの両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、終止コドンエレメントは、終止コドン領域を含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの該コード領域は、該終止エレメントを含む。いくつかの実施形態では、該終止エレメントは、該ポリヌクレオチドの該３´ＵＴＲ配列の上流（例えば、前）にある。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、該３´非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。該終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は終止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、該追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、連続する３つの終止コドン、４つの終止コドン、またはそれ以上を含む。
表３に示されている配列を含む終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドの半減期が増加し得る、及び／または該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベルまたは活性が増加し得ることが観察されている。
一実施形態では、表３に示されている終止エレメントを有する該ポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドの半減期が増加するかまたは該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５～２０倍である。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０倍、またはそれ以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約１．５倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約２倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約３倍以上である。一実施形態では、該半減期の増加は、約４倍である。一実施形態では、該半減期の増加は、約５倍以上である。
一実施形態では、表３に示されている終止エレメントを有する該ポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）が増加する。一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、検出可能なレベルまたは活性）が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、約１．５～２０倍増加する。一実施形態では、該終止エレメントにより、該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドのレベルまたは活性が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、検出可能になる。
一実施形態では、該活性の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０倍、またはそれ以上である。一実施形態では、該活性の増加は、約１．５倍以上である。一実施形態では、該活性の増加は、約２倍以上である。一実施形態では、該活性の増加は、約３倍以上である。一実施形態では、該活性の増加は、約４倍以上である。一実施形態では、該活性の増加は、約５倍以上である。
一実施形態では、該増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または表３に示されている終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、該終止エレメントは、表３に示されている配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号２６の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号２７の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号２８の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号２９の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３０の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３１の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３２の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３３の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３４の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３５の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号３６の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号６２の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号９３の配列を含む。一実施形態では、該終止エレメントは、配列番号９６の配列を含む。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、式Ｂ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
一実施形態では、Ｘ１は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ１は、Ａである。
一実施形態では、Ｘ２は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ２は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ４は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ４は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ５は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ５は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ６は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ６は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ７は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ７は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ３は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ３は、Ａである。
一実施形態では、Ｘ８は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ８は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ１０は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１０は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ１１は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１１は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ１２は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１２は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ－１は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ－１は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ－３は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ－３は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ９は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ９は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ－２は、Ａである。一実施形態では、Ｘ－２は、Ｕである。
一実施形態では、式Ｂ（配列番号３７）のコンセンサス配列は、ＧＣ含量が高い（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％のＧＣ含量）。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約５０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約６０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約７０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約８０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約９０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約９９％である。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、式Ｃ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
一実施形態では、Ｘ－３は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ－３は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ－１は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ－１は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ２は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ２は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ５は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ５は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ６は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ６は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ７は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ７は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ８は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ８は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ９は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ９は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ１２は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ１２は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ－２は、Ａである。一実施形態では、Ｘ－２は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ３は、Ａである。一実施形態では、Ｘ３は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ４は、Ａである。一実施形態では、Ｘ４は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ１は、Ａである。一実施形態では、Ｘ１は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ１０は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１０は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ１１は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１１は、Ｕである。
一実施形態では、式Ｃ（配列番号５６）のコンセンサス配列は、ＧＣ含量が高い（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％のＧＣ含量）。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約５０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約６０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約７０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約８０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約９０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約９９％である。
一実施形態では、該（ｂ）のコード領域は、式Ｄ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む。
一実施形態では、Ｘ－３は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ－３は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ－１は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ－１は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ２は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ２は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ３は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ３は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ１０は、Ｇである。一実施形態では、Ｘ１０は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ－２は、Ａである。一実施形態では、Ｘ－２は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ９は、Ａである。一実施形態では、Ｘ９は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ１は、Ａである。一実施形態では、Ｘ１は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ４は、Ａである。一実施形態では、Ｘ４は、Ｇである。
一実施形態では、Ｘ５は、Ａである。一実施形態では、Ｘ５は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ８は、Ａである。一実施形態では、Ｘ８は、Ｃである。
一実施形態では、Ｘ６は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ６は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ７は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ７は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ１１は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１１は、Ｕである。
一実施形態では、Ｘ１２は、Ｃである。一実施形態では、Ｘ１２は、Ｕである。
一実施形態では、式Ｄ（配列番号５７）のコンセンサス配列は、ＧＣ含量が高い（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％のＧＣ含量）。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約５０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約６０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約７０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約８０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約９０％である。一実施形態では、該ＧＣ含量は、約９９％である。
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、表３に示されているもの）を含むコード領域、及び（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが開示される。
一態様において、本明細書に開示される終止エレメントを含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象における、疾患もしくは障害を処置する方法、または免疫応答を阻害する方法で使用される。
一態様において、治療ペイロードまたは予防ペイロード（例えば、本明細書に記載のもの）をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、追加の薬剤（例えば、本明細書に記載のもの）とともに投与され得る。
３´安定化領域
本明細書では、とりわけ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、及び（ｄ）３´安定化領域を含む該ポリヌクレオチドが開示される。また、それらを含むＬＮＰ組成物も本明細書に開示される。
本明細書では、とりわけ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、及び（ｄ）３´安定化領域を含む該ポリヌクレオチドが開示される。また、それらを含むＬＮＰ組成物も本明細書に開示される。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、３´安定化領域（例えば、安定化テール、例えば、本明細書に記載のもの）を含む。３´安定化領域（例えば、代替核酸塩基、糖、及び／または骨格を含む３´安定化領域）を含有するポリヌクレオチドは、安定性の増加、高い発現レベルの恩恵を受け得るので、治療用組成物に使用するのに特に有効であり得る。３´安定化領域を有するポリヌクレオチドを製造する例示的な方法は、実施例１４に記載する。
一実施形態では、該３´安定化領域は、ポリＡテール（例えば、８０～１５０個、例えば、１２０個のアデニンを含むポリＡテール（配列番号１２３））を含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、１個以上の非アデノシン残基（例えば、１個以上のグアノシン、例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、ＵＣＵＡＧ配列（配列番号４４）を含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、配列番号４４の上流に約８０～１２０個（例えば、１００個）のアデニンを含む。一実施形態では、該ポリＡテールは、配列番号４４の下流に約１～４０個（例えば、２０個）のアデニンを含む。
一実施形態では、該３´安定化領域は、少なくとも１つの代替ヌクレオシドを含む。一実施形態では、該代替ヌクレオシドは、反転したチミジン（ｉｄＴ）である。一実施形態では、該代替ヌクレオシドは、該３´安定化領域の３´末端に配置される。
一実施形態では、該３´安定化領域は、式ＶＩＩの構造：
またはその塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミンを表す。
一態様において、本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、及び（ｄ）３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）を含む該ポリヌクレオチドが開示される。
一態様において、本明細書に開示される安定化領域を含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象における、疾患もしくは障害を処置する方法、または免疫応答を阻害する方法で使用される。
一態様において、治療ペイロードまたは予防ペイロード（例えば、本明細書に記載のもの）をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、追加の薬剤（例えば、本明細書に記載のもの）とともに投与され得る。
ｍＲＮＡエレメントを含む構築物
本明細書に開示される調節エレメント（例えば、５´ＵＴＲ、終止エレメント、３´ＵＴＲ、安定化領域（例えば、ｉｄＴまたは修飾ポリＡテール））は、任意の目的のペプチドまたはタンパク質（例えば、治療または予防タンパク質、例えば、細胞内、膜貫通、それとも分泌かにかかわらず）をコードするＯＲＦとともに使用され得ることが理解されよう。本明細書に開示される調節エレメントは、モジュール方式で使用され得る、すなわち、当該技術分野の他の調節エレメントと組み合わせたｍＲＮＡ構築物中で使用され得ること（例えば、ＯＲＦ及び当該技術分野の他の調節領域と組み合わせた本発明の５´ＵＴＲ）、または本明細書に開示される他の調節エレメントと組み合わせて使用され得ること（例えば、本発明の５´ＵＴＲと本発明の３´ＵＴＲ等）がさらに理解されよう。さらに、本発明の終止エレメントは、終止コドンを欠く所望のＯＲＦと組み合わせて使用され得ることが理解されよう。所望のＯＲＦが終止コドンを含む場合、追加の終止コドンまたは終止エレメントは最終構築物に含まれないことも理解されよう。いくつかの実施形態では、該所望のＯＲＦの該終止コドンは、本明細書に記載の終止エレメントで置換され得る。
本明細書に開示される調節エレメント（例えば、５´ＵＴＲ、終止エレメント、３´ＵＴＲ、安定化領域（例えば、ｉｄＴまたは修飾ポリＡテール））は、任意の目的のペプチドまたはタンパク質（例えば、治療または予防タンパク質、例えば、細胞内、膜貫通、それとも分泌かにかかわらず）をコードするＯＲＦとともに使用され得ることが理解されよう。本明細書に開示される調節エレメントは、モジュール方式で使用され得る、すなわち、当該技術分野の他の調節エレメントと組み合わせたｍＲＮＡ構築物中で使用され得ること（例えば、ＯＲＦ及び当該技術分野の他の調節領域と組み合わせた本発明の５´ＵＴＲ）、または本明細書に開示される他の調節エレメントと組み合わせて使用され得ること（例えば、本発明の５´ＵＴＲと本発明の３´ＵＴＲ等）がさらに理解されよう。さらに、本発明の終止エレメントは、終止コドンを欠く所望のＯＲＦと組み合わせて使用され得ることが理解されよう。所望のＯＲＦが終止コドンを含む場合、追加の終止コドンまたは終止エレメントは最終構築物に含まれないことも理解されよう。いくつかの実施形態では、該所望のＯＲＦの該終止コドンは、本明細書に記載の終止エレメントで置換され得る。
ｍＲＮＡエレメントの組み合わせ
本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれも、以下のエレメントの１つ、２つ、３つ、または全てを含み得る：（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、及び任意選択で（ｄ）３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）。また、それらを含むＬＮＰ組成物も本明細書に開示される。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれも、以下のエレメントの１つ、２つ、３つ、または全てを含み得る：（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、及び任意選択で（ｄ）３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）。また、それらを含むＬＮＰ組成物も本明細書に開示される。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、（ａ）表１に記載の５´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片及び（ｂ）表３に示されている終止エレメントを含むコード領域を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）、またはポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、配列番号５０の配列を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、配列番号５０の配列を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、配列番号５０の配列を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、配列番号５０の配列を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、配列番号５０の配列を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、配列番号５０の配列を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む３´ＵＴＲ（例えば、配列番号８０の配列を含む３´ＵＴＲ）、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）のコピーを３つ含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む３´ＵＴＲ（例えば、配列番号８０の配列を含む３´ＵＴＲ）、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号６６の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む３´ＵＴＲ（例えば、配列番号９４の配列を含む３´ＵＴＲ）、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号６６の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む３´ＵＴＲ（例えば、配列番号９４の配列を含む３´ＵＴＲ）、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）配列番号１９の配列を含む３´ＵＴＲ、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む３´安定化領域を含むポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む３´ＵＴＲ（例えば、配列番号８０の配列を含む３´ＵＴＲ）、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基及び反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む３´安定化領域を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号６６の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、（ｃ）ＴＥＮＴリクルートエレメント（例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む３´ＵＴＲ（例えば、配列番号９４の配列を含む３´ＵＴＲ）、及び（ｄ）ポリＡテール（例えば、１つ以上のグアノシン残基及び反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む３´安定化領域を含むポリＡテールであって、任意選択で長さが１００ヌクレオチドである、該ポリＡテール）を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号１１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２９の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３０の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３２の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２９の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３０の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３２の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号２９の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３０の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３２の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、及び（ｂ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域を含む。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、（ａ）表１に記載の５´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片及び（ｃ）表２に記載の３´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）、またはポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、（ｃ）表２に記載の３´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片及び（ｂ）表３に示されている終止エレメントを含むコード領域を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表４に記載されるような終止エレメントを伴う３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれか、またはそのバリアントもしくは断片に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）、またはポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、（ａ）表１に記載の５´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片、（ｂ）表３に示されている終止エレメントを含むコード領域、及び（ｃ）表２に記載の３´ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）、またはポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、３´安定化領域（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３５の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３４の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３２の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１２２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３１の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３０の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２９の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２８の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３５の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号５９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３２の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号６０またはそのバリアントもしくは断片のヌクレオチド１６～１８８を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号６０の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号６１またはそのバリアントもしくは断片のヌクレオチド１６～１８８を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号６１の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号９４の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１２６の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号９５の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１２７の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２７の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号９７の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２７の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号９８の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２５の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１３の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号９９の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２５の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１４の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１００の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２５の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１５の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０１の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２７の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１６の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０２の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２７の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１７の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０３の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１８の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０４の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号１９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０５の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２０の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０６の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０７の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０８の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２３の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０９の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２４の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１０の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２５の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１１の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号７９の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１２の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８０の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１３の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１４の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１５の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８３の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１６の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３０の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８４の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１７の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号９６の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号２２の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１８の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８６の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１１９の配列を含む。
一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２７の配列を含む終止エレメントを含むコード領域、及び（ｂ）配列番号８７の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む３´ＵＴＲを含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１２０の配列を含む。
治療ペイロードまたは予防ペイロード
本明細書では、とりわけ、本明細書に記載される５´ＵＴＲ、本明細書に記載される３´ＵＴＲ、及び／または終止エレメントを含むコード領域を有するポリヌクレオチドであって、該コード領域は、ペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）をコードする配列をさらに含む、該ポリヌクレオチドが開示される。一実施形態では、該コード領域は、１つのペイロードをコードする。一実施形態では、該コード領域は、２つ以上のペイロード（例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上のペイロード、例えば、同じまたは異なるペイロード）をコードする。一実施形態では、各ペイロードをコードする配列は、該ポリヌクレオチド内で連続している。一実施形態では、各ペイロードをコードする配列は、少なくとも１～１０００ヌクレオチドで分離されている。いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、もしくは細胞間タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。
本明細書では、とりわけ、本明細書に記載される５´ＵＴＲ、本明細書に記載される３´ＵＴＲ、及び／または終止エレメントを含むコード領域を有するポリヌクレオチドであって、該コード領域は、ペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）をコードする配列をさらに含む、該ポリヌクレオチドが開示される。一実施形態では、該コード領域は、１つのペイロードをコードする。一実施形態では、該コード領域は、２つ以上のペイロード（例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上のペイロード、例えば、同じまたは異なるペイロード）をコードする。一実施形態では、各ペイロードをコードする配列は、該ポリヌクレオチド内で連続している。一実施形態では、各ペイロードをコードする配列は、少なくとも１～１０００ヌクレオチドで分離されている。いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、もしくは細胞間タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。
また、本明細書では、ペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）をコードするコード領域を含むポリヌクレオチド、を含むＬＮＰも開示される。いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、もしくは細胞間タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、抗体またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、酵素またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、ホルモンまたはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、リガンド、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、予防ワクチンである。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、治療ワクチン（例えば、がんワクチン）である。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、成長因子またはその成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該分泌タンパク質は、免疫調節因子（例えば、免疫チェックポイントアゴニストまたはアンタゴニスト）を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、膜結合タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該膜結合タンパク質は、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、予防ワクチンである。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、治療ワクチン（例えば、がんワクチン）である。いくつかの実施形態では、該膜結合タンパク質は、リガンド、そのバリアントまたは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該膜結合タンパク質は、膜輸送体、そのバリアントまたは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該膜結合タンパク質は、構造タンパク質、そのバリアントまたは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該膜結合タンパク質は、免疫調節因子（例えば、免疫チェックポイントアゴニストまたはアンタゴニスト）を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、細胞内タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該細胞内タンパク質は、酵素またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該細胞内タンパク質は、転写因子、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該細胞内タンパク質は、ヌクレアーゼ、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。いくつかの実施形態では、該細胞内タンパク質は、構造タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、成長因子、免疫調節因子、またはそれらの成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選択される。
いくつかの実施形態では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む。
本明細書に開示される調節エレメント（例えば、５´ＵＴＲ、終止エレメント、３´ＵＴＲ、安定化領域（例えば、ｉｄＴまたは修飾ポリＡテール））は、本明細書で記載されるペイロードをコードするＯＲＦとともに使用され得ることが理解されよう。本明細書に開示される調節エレメントは、モジュール方式で使用され得る、すなわち、当該技術分野の他の調節エレメントと組み合わせたｍＲＮＡ構築物中で使用され得ること（例えば、ＯＲＦ及び当該技術分野の他の調節領域と組み合わせた本発明の５´ＵＴＲ）、または本明細書に開示される他の調節エレメントと組み合わせて使用され得ること（例えば、本発明の５´ＵＴＲと本発明の３´ＵＴＲ等）がさらに理解されよう。さらに、本発明の終止エレメントは、終止コドンを欠く所望のＯＲＦと組み合わせて使用され得ることが理解されよう。所望のＯＲＦが終止コドンを含む場合、追加の終止コドンまたは終止エレメントは最終構築物に含まれないことも理解されよう。いくつかの実施形態では、該所望のＯＲＦの該終止コドンは、本明細書に記載の終止エレメントで置換され得る。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みにより、天然に存在するｍｉＲＮＡの組織特異的及び／または細胞型特異的発現に基づいて、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、ひいては、それからコードされるポリペプチドが調節される。
ｍｉＲＮＡ（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ）は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に結合する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡであり、該ポリヌクレオチドの安定性を低下させること、またはその翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８または２～７を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位のシード相補部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対するアデノシン（Ａ）と隣接している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位のシード相補部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対するアデノシン（Ａ）と隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照のこと。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施して、該細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または非存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補配列、またはマイクロＲＮＡシード相補配列を含む。このような配列は、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）で教示されたもの等、任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る（例えば、相補性を有し得る）。
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、核酸分子内（例えば、ＤＮＡ内または５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲを含めたＲＮＡ転写物内）の配列を指し、ｍｉＲＮＡの全てまたは領域に対して、該ｍｉＲＮＡと相互作用し、会合し、または結合するのに十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態では、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介調節（例えば、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介翻訳抑制または分解）を促進するのに十分な相補性度を指す。本開示の例示的な態様では、該ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介分解（例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ誘導ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断）を促進するのに十分な相補性度を指す。該ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分）に対して相補的であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解の場合、十分なまたは完全な相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さの全てまたはかなりの部分にわたって十分な相補性または完全な相補性）が好ましい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡのシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、または３つのヌクレオチド置換、末端付加、及び／または切断を別にすればｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡより５´末端、３´末端、またはその両方で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド（複数可）短い。さらに他の実施形態では、該マイクロＲＮＡ結合部位は、対応するマイクロＲＮＡより５´末端、３´末端、またはその両方で２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位はそれでもなお、１つ以上の該ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込んだｍＲＮＡを分解すること、または該ｍＲＮＡの翻訳を妨げることが可能である。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、Ｄｉｃｅｒを含有する活性ＲＩＳＣの一部である、対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位がＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへ結合することにより、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡが分解されるか、または該ｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を切断する。他の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に不安定性を誘導する。別の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の転写を抑制する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のミスマッチ（複数可）を有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に操作導入することによって、該当するｍｉＲＮＡが利用可能であれば、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、分解のための、または翻訳の低減のための標的とすることができる。これにより、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の送達に際するオフターゲット効果が低減され得る。例えば、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）が、組織または細胞に送達されることを意図していないが、前記組織または細胞に行き着く場合、該組織または細胞に豊富なｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲに操作導入されれば、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。
例えば、当業者であれば、リンパ系細胞以外の細胞型での発現を最小限にするために、１つ以上のｍｉＲ結合部位が核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に含まれ得ることを理解するであろう。１つの実施形態では、ｍｉＲ１２２結合部位が使用され得る。別の実施形態では、ｍｉＲ１２６結合部位が使用され得る。さらに別の実施形態では、これらのｍｉＲ結合部位の複数のコピーまたは組み合わせが使用されてもよい。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現量を増加させるために、それらが天然に存在する核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）配列から除去され得る。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位は、該ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞でのタンパク質発現を改善するために、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）から除去され得る。
複数の組織での発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ結合部位）の導入または除去によって達成され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するか挿入するかの決定は、発達中及び／または疾患における組織及び／または細胞でのｍｉＲＮＡの発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいてなされ得る。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターン及び生物学における役割の特定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、及びそれらの中の全参考文献。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、２００５／０２６１２１８号、及び２００５／００５９００５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された非限定的な例を含む、任意の既知の配列に対応し得る。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ、ひいてはタンパク質発現を調節することが既知の組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるがこれらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及び単球）、単球、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等で特異的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの態様を調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は免疫細胞でのみ発現し、特に骨髄樹状細胞で豊富である。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に対する免疫応答は、該ポリヌクレオチドの３´ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を付加することで遮断することができ、組織及び細胞へのより安定した遺伝子導入を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞で外因性核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
抗原媒介性免疫応答とは、生物に侵入した場合に該抗原提示細胞によってプロセシングされ、該抗原提示細胞の表面で提示される外来抗原によって誘発される免疫応答を指し得る。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、該抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
ｍｉＲ－１４２結合部位を本開示の核酸分子の５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲへ導入することで、ｍｉＲ－１４２媒介性の分解を介して抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制し、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それにより、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の送達後に抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、次いで、細胞傷害性排除を誘発することなく標的組織または細胞で安定に発現される。
１つの実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現されることが既知のｍｉＲＮＡの結合部位を本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に操作導入して、ｍｉＲＮＡ媒介性のＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞での該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現を抑制し、該抗原媒介性免疫応答を抑えることができる。該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞で維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、任意のｍｉＲ－１２２結合部位を除去することができ、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位を本開示の核酸分子の５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲに操作導入することができる。
ＡＰＣ及びマクロファージの選択的分解及び抑制をさらに促進するために、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、その５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲにさらなる負の調節エレメントを単独で、またはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせて含むことができる。非限定的な例として、該さらなる負の調節エレメントは、構成的崩壊要素（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ））である。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、新規なｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析により免疫細胞で特定され得る（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８。これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の任意の位置（例えば、５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲ）で挿入される。いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該３´ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲ及び該３´ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の挿入部位は、該ｍｉＲＮＡ結合部位の該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）への挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下での機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、また、該ｍｉＲＮＡの存在下では、該ｍｉＲＮＡ結合部位の該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）への挿入及び該ｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合が、該ポリヌクレオチドを分解することまたは該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を妨げることが可能な限り、該核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）内のどこであってもよい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）における該ＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおけるＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）におけるＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
ｍｉＲＮＡ遺伝子の調節は、該ｍｉＲＮＡの周囲の配列、例えば、これらに限定されないが、該周囲の配列の種、配列のタイプ（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、該周囲の配列の調節エレメント及び／または該周囲の配列の構造エレメントに影響を受ける可能性がある。該ｍｉＲＮＡは、５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲに影響を受ける可能性がある。非限定的な例として、非ヒト３´ＵＴＲは、同じ配列タイプのヒト３´ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対する該ｍｉＲＮＡ配列の調節効果を高め得る。
ｍｉＲＮＡ遺伝子の調節は、該ｍｉＲＮＡの周囲の配列、例えば、これらに限定されないが、該周囲の配列の種、配列のタイプ（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、該周囲の配列の調節エレメント及び／または該周囲の配列の構造エレメントに影響を受ける可能性がある。該ｍｉＲＮＡは、５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲに影響を受ける可能性がある。非限定的な例として、非ヒト３´ＵＴＲは、同じ配列タイプのヒト３´ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対する該ｍｉＲＮＡ配列の調節効果を高め得る。
１つの実施形態では、該５´ＵＴＲの他の調節エレメント及び／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子調節に影響を与え得る。調節エレメント及び／または構造エレメントの１つの例は、該５´ＵＴＲの構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であり、これは、タンパク質の翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。該５´ＵＴＲのこの二次的構造化エレメントへのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はさらに、マイクロＲＮＡ媒介性の遺伝子調節を高めるために、この構造化５´ＵＴＲを含むことができる。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの３´ＵＴＲに操作導入され得る。この状況では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３´ＵＴＲに操作導入され得る。例えば、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３´ＵＴＲに操作導入され得る。１つの実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ部位でも異なるｍｉＲＮＡ部位でもよい。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの２つ以上のコピーが組み込まれる組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とすることができる。非限定的な例として、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３´ＵＴＲにおける組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的なｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、特定の細胞型（例えば、肝細胞、骨髄細胞、内皮細胞、がん細胞等）における発現度が低減され得る。
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３´ＵＴＲの５´末端付近、３´ＵＴＲの５´末端と３´末端のほぼ中間、及び／または３´ＵＴＲの３´末端付近で操作導入され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３´ＵＴＲの５´末端付近及び該３´ＵＴＲの５´末端と３´末端のほぼ中間で操作導入され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３´ＵＴＲの３´末端付近及び該３´ＵＴＲの５´末端と３´末端のほぼ中間で操作導入され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３´ＵＴＲの５´末端付近及び該３´ＵＴＲの３´末端付近で操作導入され得る。
別の実施形態では、３´ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／または該シード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件でさらに標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、組織もしくは細胞で、または生物学的条件の観点から最適なタンパク質発現のために設計され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、免疫細胞でｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３´ＵＴＲに含んで、治療薬の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制することができる。非限定的な例として、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、抗原提示細胞内でより不安定にすることができる。これらｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉｒ－１４６－３ｐが挙げられる。
５´ＵＴＲ及び３´ＵＴＲのさらなる特性
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドの該コード領域と同種でも異種でもよい。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするＯＲＦと同種である。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするＯＲＦと異種である。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドの該コード領域と同種でも異種でもよい。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするＯＲＦと同種である。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするＯＲＦと異種である。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の５´ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の３´ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲもしくはその機能的断片、３´ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲもしくはその機能的断片、３´ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基（例えば、Ｎ１－メチルプソイドウラシルまたは５－メトキシウラシル）を含む。
ＵＴＲは、調節的な役割（例えば、安定性、局在化及び／または翻訳効率の向上もしくは低下）を与える特性を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与することができ、１つ以上の調節特性は常法を用いて測定され得る。いくつかの実施形態では、５´ＵＴＲまたは３´ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ、完全長の５´または３´ＵＴＲの１つ以上の調節特性を含む。
天然の５´ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特性を持つ。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーをかくまっている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１２５）を有し、ここで、Ｒは、後ろに別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である。５´ＵＴＲはまた、延長因子の結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
天然の５´ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特性を持つ。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーをかくまっている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１２５）を有し、ここで、Ｒは、後ろに別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である。５´ＵＴＲはまた、延長因子の結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
特定の標的臓器の豊富に発現される遺伝子に通常見られる特性を操作することにより、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を増強することができる。例えば、肝臓で発現するｍＲＮＡ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子の５´ＵＴＲの導入で、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡ由来の５´ＵＴＲを使用して、その組織での発現を改善することは、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）で可能である。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、転写物のタンパク質が共通の機能、構造、特性または性質を共有する該転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達の過程のある時点で発現されるタンパク質のファミリー（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特性、局在、起源、または発現パターンを共有する）に属し得る。該遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新たなポリヌクレオチドを作製することができる。
いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲ及び３´ＵＴＲは異種であり得る。いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲは、該３´ＵＴＲと異なる種由来であり得る。いくつかの実施形態では、該３´ＵＴＲは、該５´ＵＴＲと異なる種由来であり得る。
いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲ及び３´ＵＴＲは異種であり得る。いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲは、該３´ＵＴＲと異なる種由来であり得る。いくつかの実施形態では、該３´ＵＴＲは、該５´ＵＴＲと異なる種由来であり得る。
共有国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＯＲＦの隣接領域として本発明のポリヌクレオチドに使用され得る例示的なＵＴＲのリストを提供している。
本出願のさらなる例示的なＵＴＲとしては、グロビン、例えば、α－またはβ－グロビン（例えば、ツメガエル、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコーストランスポーター（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコーストランスポーター１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チュブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５´ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子の５´ＵＴＲ（オリゴピリミジントラクト））；リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ｒｐｓ９等のヒトまたはマウスリボソームタンパク質）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；延長因子（例えば、延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲンリジン、２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオビンディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲは、以下：β－グロビンの５´ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５´ＵＴＲ；シトクロムｂ－２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）の５´ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５´ＵＴＲ；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５´ＵＴＲ；ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）の５´ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５´近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）の５´ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の５´ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇの５´ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１の５´ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該３´ＵＴＲは、以下：β－グロビンの３´ＵＴＲ；ＣＹＢＡの３´ＵＴＲ；アルブミンの３´ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）の３´ＵＴＲ；ＶＥＥＶの３´ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の３´ＵＴＲ；α－グロビンの３´ＵＴＲ；ＤＥＮの３´ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）の３´ＵＴＲ；延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）の３´ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の３´ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）の３´ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１の３´ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａの３´ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼの３´ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該３´ＵＴＲは、以下：β－グロビンの３´ＵＴＲ；ＣＹＢＡの３´ＵＴＲ；アルブミンの３´ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）の３´ＵＴＲ；ＶＥＥＶの３´ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の３´ＵＴＲ；α－グロビンの３´ＵＴＲ；ＤＥＮの３´ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）の３´ＵＴＲ；延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）の３´ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の３´ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）の３´ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１の３´ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａの３´ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼの３´ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡ由来の野生型ＵＴＲが本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対する該ＵＴＲの向きもしくは位置を変更することによって、またはさらなるヌクレオチドを含めること、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、バリアントＵＴＲが得られるように野生型または天然のＵＴＲに対して変更され得る。いくつかの実施形態では、５´または３´ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つ以上のヌクレオチドが該ＵＴＲの末端に追加されるかまたは該ＵＴＲの末端から除去されたバリアントが利用され得る。
さらに、１つ以上の合成ＵＴＲが、１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わされて使用され得る。例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＭａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２を参照されたい。
ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置することもできれば、向きまたは位置を変更することもできる。従って、５´及び／または３´ＵＴＲは、反転すること、短縮すること、延長すること、または１つ以上の他の５´ＵＴＲもしくは３´ＵＴＲと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ（例えば、二重、三重、もしくは四重の５´ＵＴＲまたは３´ＵＴＲ）を含む。例えば、二重ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーを直列または実質的に直列に含む。例えば、二重ベータ－グロビンの３´ＵＴＲを使用することができる（参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ（例えば、二重、三重、もしくは四重の５´ＵＴＲまたは３´ＵＴＲ）を含む。例えば、二重ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーを直列または実質的に直列に含む。例えば、二重ベータ－グロビンの３´ＵＴＲを使用することができる（参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたい）。
本発明のポリヌクレオチドは、特性の組み合わせを含むことができる。例えば、該ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５´ＵＴＲ及び／またはポリＡテールの鋳型化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３´ＵＴＲによって隣接され得る。５´ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲ由来の第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含むことができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたい）。
他の非ＵＴＲ配列が、本発明のポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部が、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列を組み込むことにより、タンパク質産生ならびにポリヌクレオチドの発現レベルが向上し得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりに、またはそれに加えて配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＹａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３を参照のこと）。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、５´ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスのカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、合成５´ＵＴＲを非合成３´ＵＴＲと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、該ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント、または複数の翻訳エンハンサーエレメント（総称して「ＴＥＥ」、これは、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す）も含み得る。非限定的な例として、該ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。いくつかの実施形態では、該５´ＵＴＲはＴＥＥを含む。一態様では、ＴＥＥは、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳等であるがこれに限定されない核酸の翻訳活性を促進することができるＵＴＲ内の保存エレメントである。
ヌクレオチドキャップ
本開示はまた、５´キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、発現されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
本開示はまた、５´キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、発現されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
天然のｍＲＮＡの５´キャップ構造は、核外移行に関与し、ｍＲＮＡの安定性を高め、当該ｍＲＮＡのキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）（ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞内のｍＲＮＡの安定性と翻訳能力に関与する）に結合して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。該キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの過程で５´近位イントロンの除去を助ける。
内因性ｍＲＮＡ分子は、該ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５´末端転写センスヌクレオチド間で５´－ｐｐｐ－５´－三リン酸結合を生成するように５´末端キャップされ得る。この５´－グアニル酸キャップは、その後メチル化され、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。該ｍＲＮＡの５´末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意に２´－Ｏ－メチル化され得る。該グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断を介した５´－デキャッピングで、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を分解の標的とすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非加水分解性キャップ構造を含み、デキャッピングを防止し、ひいてはｍＲＮＡの半減期を増加させる。キャップ構造の加水分解には、５´－ｐｐｐ－５´－ホスホロジエステル結合の切断が必要なため、修飾ヌクレオチドがキャッピング反応の過程で使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製ワクシニアキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）を、製造業者の指示に従い、α－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用して、該５´－ｐｐｐ－５´キャップにホスホロチオエート結合を生成することができる。さらなる修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α－メチル－ホスホネート及びセレノ－リン酸ヌクレオチドが使用され得る。
さらなる修飾としては、該ポリヌクレオチド（上記）の５´末端及び／または５´末端前ヌクレオチドのリボース糖における当該糖環の２´－ヒドロキシル基の２´－Ｏ－メチル化が挙げられるがこれに限定されない。複数の異なる５´キャップ構造を用いて、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドの５´キャップを生成することができる。キャップアナログは、本明細書では合成キャップアナログ、化学キャップ、化学キャップアナログ、または構造的もしくは機能的キャップアナログとも呼ばれ、天然の（すなわち、内因性、野生型または生理的）５´キャップとはそれらの化学構造において異なるが、キャップ機能は保持する。キャップアナログは、化学的に（すなわち、非酵素的に）もしくは酵素的に合成することができ、及び／または本発明のポリヌクレオチドに連結することができる。
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５´－５´－三リン酸基で連結された２つのグアニンを含有し、１つのグアニンがＮ７メチル基及び３´－Ｏ－メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３´－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５´－三リン酸－５´－グアノシン（ｍ７Ｇ－３′ｍｐｐｐ－Ｇ、これは、同等に３′Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇと指定され得る）。他の未修飾グアニンの３´－Ｏ原子は、該キャップされたポリヌクレオチドの５´末端ヌクレオチドに連結する。該Ｎ７－及び３´－Ｏ－メチル化グアニンは、該キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシンに２´－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２´－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５´－三リン酸－５´－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
別の例示的なキャップは、ｍ７Ｇ－ｐｐｐ－Ｇｍ－Ａ（すなわち、Ｎ７，グアノシン－５′－三リン酸－２′－Ｏ－ジメチル－グアノシン－アデノシン）である。
いくつかの実施形態では、該キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。非限定的な例として、該ジヌクレオチドキャップアナログ、例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載のジヌクレオチドキャップアナログは、異なるリン酸位置で、ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）基で修飾され得る。
別の実施形態では、該キャップは、キャップアナログであり、当該技術分野で既知の及び／または本明細書に記載のキャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３´－ＯＧ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載の様々なキャップアナログ及びキャップアナログの合成方法を参照されたい）。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４－クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
本発明のポリヌクレオチドは、より確かな５´キャップ構造を生成するために、製造後（ＩＶＴかそれとも化学合成かにかかわらず）、酵素を用いてキャップすることもできる。本明細書で使用される場合、「より確かな」という表現は、構造上または機能上のいずれかで、内因性または野生型の特性を厳密に反映もしくは模倣する特性を指す。すなわち、「より確かな」特性は、従来技術の合成の特性またはアナログ等と比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理的細胞機能及び／または構造をよく表すか、または、対応する内因性、野生型、天然もしくは生理的特性を１つ以上の点で上回る。本発明のより確かな５´キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野で既知の合成５´キャップ構造（または野生型、天然もしくは生理的５´キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合が向上したもの、半減期が増加したもの、５´エンドヌクレアーゼに対する感受性が低下したもの及び／または５´デキャッピングが減少したものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２´－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５´末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチド間で標準的な５´－５´－三リン酸結合を形成させることができ、ここで、該キャップグアニンはＮ７メチル化を含有し、該ｍＲＮＡの５´末端ヌクレオチドは２´－Ｏ－メチルを含有する。かかる構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップにより、例えば、当該技術分野で既知の他の５´キャップアナログ構造と比較して、より高い翻訳能力及び細胞安定性ならびに細胞の炎症促進性サイトカイン活性化の低減がもたらされる。キャップ構造としては、７ｍＧ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｎ１ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｎ１ｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５′）－ｐｐｐ（５′）Ｎ１ｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるがこれらに限定されない。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャッピングは、より効率的であり、当該キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップすることができる。これは、キャップアナログがインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに連結された場合の約８０％と対照的である。
本発明によれば、５´末端キャップは、内因性のキャップまたはキャップアナログを含むことができる。本発明によれば、５´末端キャップは、グアニンアナログを含むことができる。有用なグアニンアナログとしては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２´フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが挙げられるがこれらに限定されない。
また、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型ＲＮＡポリメラーゼまたはそのバリアント、例えば、本明細書に記載のバリアント等）を使用する、リボ核酸（ＲＮＡ）合成の共転写キャッピング法で使用され得るものを含む、例示的なキャップが提供される。１つの実施形態では、ＲＮＡを「ワンポット」反応で産生する場合、別途キャッピング反応を必要とすることなく、キャップを付加することができる。従って、いくつかの実施形態では、該方法は、ポリヌクレオチド鋳型を、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップアナログとインビトロ転写反応条件下で反応させて、ＲＮＡ転写産物を生成することを含む。
本明細書で使用される場合、用語「キャップ」は、反転したＧヌクレオチドを含み、反転したＧヌクレオチドの３´における１個以上の追加のヌクレオチド（例えば、反転したＧヌクレオチドの３´における１、２、３個、またはそれ以上のヌクレオチド）及び５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載の５´ＵＴＲ）に対する５´を含み得る。
例示的なキャップは、
の配列を含み、ここで、下線を引いたイタリック体のＧは、５´－５´－三リン酸基が続く反転したＧヌクレオチドである。
１つの実施形態では、キャップは式（Ｉ）の化合物
またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩を含み、式中、
環Ｂ１は、修飾または未修飾グアニンである；
環Ｂ２及び環Ｂ３は、それぞれ独立して核酸塩基または修飾核酸塩基である；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ここで、ｐは０、１、または２である；
Ｙ０は、ＯまたはＣＲ６Ｒ７である；
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ここで、ｎは０、１、または２である；
各－－－は、単結合であるかまたは存在せず、ここで、各－－－が単結合の場合、Ｙｉは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり；各－－－が存在しない場合、Ｙ１は、空隙である；
Ｙ２は、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ここで、ｍは、０、１、または２である）、または－Ｏ－（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ－Ｑ０－（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ－（ここで、Ｑ０は結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは、０、１、または２であり、各ｕ及びｖは、独立して１、２、３または４である）である；
各Ｒ２及びＲ２´は、独立してハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３である；
各Ｒ３は、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルであり、Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルである場合、１つ以上のハロ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシル（１つ以上のＯＨまたはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキルで任意に置換されている）で任意に置換されている；
各Ｒ４及びＲ４´は、独立してＨ、ハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３ －である；
各Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して－Ｑ１－Ｔ１であり、ここで、Ｑ１は、結合または１つ以上のハロ、シアノ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシで任意に置換されているＣ１－Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている；
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１５は、独立して－Ｑ２－Ｔ２であり、ここで、Ｑ２は、結合または１つ以上のハロ、シアノ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシで任意に置換されているＣ１－Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ２は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている、または代替的に、Ｒ１２は、Ｒ１４と一緒にオキソであるか、Ｒ１３は、Ｒ１５と一緒にオキソである；
各Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、独立して－Ｑ３－Ｔ３であり、ここで、Ｑ３は、結合または１つ以上のハロ、シアノ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシで任意に置換されているＣ１－Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、モノ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ３は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている；
各Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６は、独立してＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルである；
各Ｒ２７及びＲ２８は、独立してＨまたはＯＲ２９である；あるいはＲ２７及びＲ２８は、一緒にＯ－Ｒ３０－Ｏを形成する；各Ｒ２９は、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルであり、Ｒ２９は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルである場合、１つ以上のハロ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシル（１つ以上のＯＨまたはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキルで任意に置換されている）で任意に置換されている；
Ｒ３０は、１つ以上のハロ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシルで任意に置換されているＣ１－Ｃ６アルキレンである；
各Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３は、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールである；
各Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３は、独立してＨ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意に置換されているＣ１－Ｃ６アルキルであり、または１つのＲ４１及び１つのＲ４３は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、Ｑ０とともにＣ４－Ｃ１０シクロアルキル、４～１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、または５～１４員のヘテロアリールを形成し、各シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５～６員のヘテロアリールは、１つ以上のＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、及びジ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノで任意に置換されている；
Ｒ４４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、またはアミン保護基である；
各Ｒ４５及びＲ４６は、独立してＨ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意に置換されているＣ１－Ｃ６アルキルである、ならびに
各Ｒ４７及びＲ４８は、独立してＨ、ハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３ －である。
環Ｂ２及び環Ｂ３は、それぞれ独立して核酸塩基または修飾核酸塩基である；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ここで、ｐは０、１、または２である；
Ｙ０は、ＯまたはＣＲ６Ｒ７である；
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ここで、ｎは０、１、または２である；
各－－－は、単結合であるかまたは存在せず、ここで、各－－－が単結合の場合、Ｙｉは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり；各－－－が存在しない場合、Ｙ１は、空隙である；
Ｙ２は、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ここで、ｍは、０、１、または２である）、または－Ｏ－（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ－Ｑ０－（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ－（ここで、Ｑ０は結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは、０、１、または２であり、各ｕ及びｖは、独立して１、２、３または４である）である；
各Ｒ２及びＲ２´は、独立してハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３である；
各Ｒ３は、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルであり、Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルである場合、１つ以上のハロ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシル（１つ以上のＯＨまたはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキルで任意に置換されている）で任意に置換されている；
各Ｒ４及びＲ４´は、独立してＨ、ハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３ －である；
各Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して－Ｑ１－Ｔ１であり、ここで、Ｑ１は、結合または１つ以上のハロ、シアノ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシで任意に置換されているＣ１－Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている；
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１５は、独立して－Ｑ２－Ｔ２であり、ここで、Ｑ２は、結合または１つ以上のハロ、シアノ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシで任意に置換されているＣ１－Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ２は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている、または代替的に、Ｒ１２は、Ｒ１４と一緒にオキソであるか、Ｒ１３は、Ｒ１５と一緒にオキソである；
各Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、独立して－Ｑ３－Ｔ３であり、ここで、Ｑ３は、結合または１つ以上のハロ、シアノ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシで任意に置換されているＣ１－Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、モノ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ３は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている；
各Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６は、独立してＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルである；
各Ｒ２７及びＲ２８は、独立してＨまたはＯＲ２９である；あるいはＲ２７及びＲ２８は、一緒にＯ－Ｒ３０－Ｏを形成する；各Ｒ２９は、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルであり、Ｒ２９は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはＣ２－Ｃ６アルキニルである場合、１つ以上のハロ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシル（１つ以上のＯＨまたはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキルで任意に置換されている）で任意に置換されている；
Ｒ３０は、１つ以上のハロ、ＯＨ及びＣ１－Ｃ６アルコキシルで任意に置換されているＣ１－Ｃ６アルキレンである；
各Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３は、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールである；
各Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３は、独立してＨ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意に置換されているＣ１－Ｃ６アルキルであり、または１つのＲ４１及び１つのＲ４３は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、Ｑ０とともにＣ４－Ｃ１０シクロアルキル、４～１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリール、または５～１４員のヘテロアリールを形成し、各シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５～６員のヘテロアリールは、１つ以上のＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ、及びジ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノで任意に置換されている；
Ｒ４４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、またはアミン保護基である；
各Ｒ４５及びＲ４６は、独立してＨ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意に置換されているＣ１－Ｃ６アルキルである、ならびに
各Ｒ４７及びＲ４８は、独立してＨ、ハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３ －である。
本明細書で提供されるキャップアナログは、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年４月２０日に公開された国際公開ＷＯ２０１７／０６６７９７に記載のキャップアナログのいずれかを含み得ると理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、Ｂ２の中央位置は、非リボース分子、例えば、アラビノースであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、エチルに基づくものである。
従って、いくつかの実施形態では、キャップは、以下の構造を含む：
他の実施形態では、キャップは、以下の構造を含む：
さらに他の実施形態では、キャップは、以下の構造を含む：
さらなる他の実施形態では、キャップは、以下の構造を含む：
いくつかの実施形態では、Ｒは、アルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキル）である。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチル基（例えば、Ｃ１アルキル）である。いくつかの実施形態では、Ｒは、エチル基（例えば、Ｃ２アルキル）である。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＡＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＡＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＡＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＣＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＣＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＣＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＧＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＧＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＧＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＧＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＵＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＵＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＵＵを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＵを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＵを含む。
他の実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵを含む。
さらに他の実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇｐｐｐｍ６Ａ２´ＯｍｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ｍ７Ｇｐｐｐｅ６Ａ２´ＯｍｅｐＧを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＣＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＧＧを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の構造のいずれか１つを含む：
いくつかの実施形態では、該キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＮ１Ｎ２Ｎ３を含み、ここで、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３は任意であり（すなわち、存在しなくてもよく、または１つ以上が存在してもよい）、独立して、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、ｍ７Ｇは、さらに（例えば、３´位で）メチル化されている。いくつかの実施形態では、該ｍ７Ｇは、３´位でＯ－メチルを含む。いくつかの実施形態では、存在する場合、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３は、任意に、独立してアデニン、ウラシル、グアニジン、チミン、またはシトシンである。いくつかの実施形態では、存在する場合、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３の１つ以上（または全て）は、（例えば、２´位で）メチル化されている。いくつかの実施形態では、存在する場合、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３の１つ以上（または全て）は、２´位でＯ－メチルを有する。
いくつかの実施形態では、該キャップは、以下の構造を含む：
式中、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３は、独立して、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である；ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、独立してＯＨまたはＯ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３はＯ－メチルであり、Ｒ４はＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４はＯ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｏ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＯ－メチルであり、Ｒ４はＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＯ－メチルであり、Ｒ４はＯ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも１つはＯ－メチルであり、Ｒ３はＯ－メチルであり、Ｒ４はＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも１つはＯ－メチルであり、Ｒ３はＯ－メチルであり、Ｒ４はＯ－メチルである。
いくつかの実施形態では、Ｂ１、Ｂ３、及びＢ３は、天然のヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３のうち少なくとも１つは、修飾または非天然の塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３のうち少なくとも１つは、Ｎ６－メチルアデニンである。いくつかの実施形態では、Ｂ１は、アデニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。いくつかの実施形態では、Ｂ１はアデニンであり、Ｂ２はウラシルであり、Ｂ３はアデニンである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２はＯＨであり、Ｒ３及びＲ４はＯ－メチルであり、Ｂ１はアデニンであり、Ｂ２はウラシルであり、Ｂ３はアデニンである。
いくつかの実施形態では、該キャップは、以下の配列：ＧＡＡＡ、ＧＡＣＡ、ＧＡＧＡ、ＧＡＵＡ、ＧＣＡＡ、ＧＣＣＡ、ＧＣＧＡ、ＧＣＵＡ、ＧＧＡＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＧＡ、ＧＧＵＡ、ＧＵＣＡ、及びＧＵＵＡから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、該キャップは、以下の配列：ＧＡＡＧ、ＧＡＣＧ、ＧＡＧＧ、ＧＡＵＧ、ＧＣＡＧ、ＧＣＣＧ、ＧＣＧＧ、ＧＣＵＧ、ＧＧＡＧ、ＧＧＣＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＵＧ、ＧＵＣＧ、ＧＵＧＧ、及びＧＵＵＧから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、該キャップは、以下の配列：ＧＡＡＵ、ＧＡＣＵ、ＧＡＧＵ、ＧＡＵＵ、ＧＣＡＵ、ＧＣＣＵ、ＧＣＧＵ、ＧＣＵＵ、ＧＧＡＵ、ＧＧＣＵ、ＧＧＧＵ、ＧＧＵＵ、ＧＵＡＵ、ＧＵＣＵ、ＧＵＧＵ、及びＧＵＵＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、該キャップは、以下の配列：ＧＡＡＣ、ＧＡＣＣ、ＧＡＧＣ、ＧＡＵＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＵＣ、ＧＧＡＣ、ＧＧＣＣ、ＧＧＧＣ、ＧＧＵＣ、ＧＵＡＣ、ＧＵＣＣ、ＧＵＧＣ、及びＧＵＵＣから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＧｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡｐＵｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＧｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣｐＵｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＧｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧｐＵｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＧｐＮ、及びｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵｐＵｐＮから選択される配列を含み、ここで、Ｎは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。
他の実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、及びｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵｐＮから選択される配列を含み、ここで、Ｎは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。
さらに他の実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧｐＮ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵｐＮから選択される配列を含み、ここで、Ｎは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。
他の実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、及びｍ７Ｇ３´ＯＭｅｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮから選択される配列を含み、ここで、Ｎは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。
さらに他の実施形態では、キャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＡ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＣ２´ＯＭｅｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＧ２´ＯＭｅｐＮ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２´ＯＭｅｐＵ２´ＯＭｅｐＮから選択される配列を含み、ここで、Ｎは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。
いくつかの実施形態では、キャップは、ＧＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、以下の構造を含む：
ポリＡテール
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、さらにポリＡテールを含む。さらなる実施形態では、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡテールは、デス－３´ヒドロキシルテールを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、さらにポリＡテールを含む。さらなる実施形態では、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡテールは、デス－３´ヒドロキシルテールを含む。
ＲＮＡプロセシングの過程で、長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡテール）をポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子に付加して、安定性を高めることができる。転写直後、転写物の３´末端を切断して、３´ヒドロキシルを遊離させることができる。次いで、ポリＡポリメラーゼが該ＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれる該プロセスは、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含めたおよそ８０～およそ２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。１つの実施形態では、該ポリＡテールは、１００ヌクレオチドの長さである（配列番号１２１）。
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号１２１）
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号１２１）
ポリＡテールは、当該構築物が核から移行された後に付加することもできる。
本発明によれば、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス－３´ヒドロキシルテールを含むことができる。それらは、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）によって教示された構造部分または２´－Ｏメチル修飾も含むことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含めた代替ポリＡテール構造を備えた転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡにて検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後の潜在的に毒性のあるヒストン蓄積の防止に重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３´ポリ（Ａ）テールの欠如によって区別され、その機能として、代わりに安定なステムループ構造及びその同族ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって仮定され、後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡのＰＡＢＰのものと同じ機能を果たす」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，２０１３年８月２９日にオンラインで公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
独自のポリＡテールの長さが、本発明のポリヌクレオチドに、ある特定の利点を与える。一般に、存在する場合、ポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチドより長い。別の実施形態では、該ポリＡテールは、３５ヌクレオチドよりも長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドまたはそれより長い）。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）を含む。
いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、ポリヌクレオチドの全長またはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の形または領域の長さを基にすることも、当該ポリヌクレオチドから発現される最終的な産物の長さを基にすることもできる。
これに関連して、該ポリＡテールは、当該ポリヌクレオチドまたはその形よりも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長い場合がある。該ポリＡテールはまた、それが属するポリヌクレオチドの一部として設計することもできる。これに関連して、該ポリＡテールは、当該構築物の全長、構築物の領域または当該構築物の全長から該ポリＡテールを引いた長さの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％またはそれ以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質に対する操作導入された結合部位及びポリヌクレオチドの結合が発現を向上させ得る。
さらに、複数の異なるポリヌクレオチドは、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して、３´末端を通じ、当該ポリＡテールの３´末端で修飾されたヌクレオチドを用いて互いに連結され得る。トランスフェクション実験は、関連する細胞株で行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクションの１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計される。該Ｇカルテットは、４個のグアニンヌクレオチドが環状で水素結合した配置であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成され得る。本実施形態では、該Ｇカルテットは、該ポリＡテールの末端に組み込まれる。得られるポリヌクレオチドは、安定性、タンパク質産生及び様々な時点での半減期を含めた他のパラメータについてアッセイされる。該ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡテール単独（配列番号５１）を用いて見られるものの少なくとも７５％に相当するｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが分かっている。
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号５１）
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号５１）
いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、非アデノシン残基（例えば、グアノシン）を断続的に有する混合ポリＡテールである。いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、グアニル化されている。いくつかの実施形態では、該混合ポリＡテールは、１つ以上のＴＥＮＴ（例えば、ＴＥＮＴ４Ａ及び／またはＴＥＮＴ４Ｂ）のリクルートメントの結果である。理論に束縛されることは望まないが、いくつかの実施形態では、該混合ポリＡテールは、ｍＲＮＡを急速な脱アデニル化から保護することができる、と考えられている。
いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、１つ以上の非アデノシン残基を含む。いくつかの実施形態では、該非アデノシン残基はグアノシンである。いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、１～２０（例えば、１～１５、１～１０、１～５、１５～２０、１０～２０、５～２０、２～１５、５～１０、１～５、２～１０、または５～１５）の非アデノシン残基（例えば、グアノシン）を含む。例えば、該ポリＡテールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の非アデノシン残基（例えば、グアノシン）を含み得る。いくつかの実施形態では、該ポリＡテールにおける残基の少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％）が、非アデノシン残基（例えば、グアノシン）である。いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、グアニル化されている（例えば、１つ以上のグアノシン残基を含む）。
一実施形態では、１つ以上の非アデノシン残基を含む該ポリＡテールは、化学的に合成される。
開始コドン領域
本発明は、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似の、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
本発明は、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似の、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始され得る。該ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドン、例えば、これらに限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧで開始され得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１参照。参照によりその各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＡＣＧで開始される。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＣＴＧまたはＣＵＧで開始される。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＧＴＧまたはＧＵＧで開始される。
翻訳を開始するコドン、例えば、これらに限定されないが、開始コドンまたは代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／または構造に影響を与えることが知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１参照。参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかのマスキングを用いて、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び／または構造を変更することができる。
いくつかの実施形態では、マスキング剤を開始コドンまたは代替的な開始コドンの近傍で使用して該コドンをマスクまたは隠し、マスクされた開始コドンまたは代替的な開始コドンでの翻訳開始の確率を低下させることができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣを記載しているＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）参照。参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用してポリヌクレオチドの開始コドンをマスクし、翻訳が代替的な開始コドンで開始される可能性を高めることができる。いくつかの実施形態では、マスキング剤を使用して第１の開始コドンまたは代替的な開始コドンをマスクして、マスクされた開始コドンまたは代替的な開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで翻訳が開始される機会を増やすことができる。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体内に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体はマスキング剤と同様、当該ポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造の制御に役立ち得る。非限定的な例として、該開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体の中央に位置し得る。該開始コドンまたは代替的な開始コドンは、最初のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、２０番目のヌクレオチドまたは２１番目のヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンを当該ポリヌクレオチド配列から除去して、当該開始コドンではないコドンで該ポリヌクレオチドの翻訳を開始させることができる。該ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンに続くコドンまたは下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始され得る。非限定的な例では、開始コドンであるＡＴＧまたはＡＵＧを当該ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去して、下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで翻訳を開始させる。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列はさらに、下流の開始コドン及び／または代替的な開始コドンのマスキング剤の少なくとも１つを含んで、翻訳の開始、該ポリヌクレオチドの長さ及び／または該ポリヌクレオチドの構造を制御するかまたは制御を試みることができる。
ポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補体の作製方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を用いて構築され得る。
本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補体の作製方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を用いて構築され得る。
他の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いた化学合成によって構築され得る。他の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を用いて作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞による発現、または当該技術分野で既知の任意の他の方法の１つ以上の組み合わせによって作製される。
天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列に存在するヌクレオシドを完全にまたは部分的に自然に置き換えることができ、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。得られるｍＲＮＡは、その後、タンパク質の産生能力及び／または治療結果を生み出す能力について試験され得る。
ＲＮＡは当該技術分野で周知の方法を用いて合成的に作製することができるが、一実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、ＲＮＡ転写産物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント）に接触させて合成する。
いくつかの態様では、本開示は、ＩＶＴ（インビトロ転写）反応を行う方法を提供し、該方法は、ＲＮＡ転写産物の生成をもたらす条件下、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント等のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）と、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝剤の存在下で接触させることを含む。
本開示の他の態様は、キャッピング法（例えば、共転写キャッピング法または当該技術分野で既知の他の方法）を提供する。１つの実施形態では、キャッピング法は、ポリヌクレオチド鋳型を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップアナログとインビトロ転写反応条件下で反応させて、ＲＮＡ転写物を生成することを含む。
ＩＶＴ条件は、通常、プロモーターを含む精製された線状ＤＮＡ鋳型、ヌクレオシド三リン酸、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにＲＮＡポリメラーゼを必要とする。該転写反応で使用される正確な条件は、特定の用途に必要なＲＮＡの量に依存する。通常のＩＶＴ反応は、ＤＮＡ鋳型を、ＲＮＡポリメラーゼ及びＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ（またはヌクレオチドアナログ）等のヌクレオシド三リン酸と、転写緩衝液中でインキュベートすることによって行われる。５´末端グアノシン三リン酸を有するＲＮＡ転写産物がこの反応から生成される。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、単にＲＮＡポリメラーゼに対する核酸鋳型である。ＤＮＡ鋳型は、目的のポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから５´側に位置し、該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む。ＤＮＡ鋳型は、目的の遺伝子の３´末端に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチド配列もまた含み得る。
目的のポリペプチドとしては、生物製剤、抗体、抗原（ワクチン）、及び治療用タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。「タンパク質」という用語は、ペプチドを包含する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ＩＶＴ反応の生成物であり、当業者によって理解されるように、ＲＮＡ分子を作製するためのＤＮＡ鋳型は、塩基相補性に基づいて既知である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ポリＡテールに連結された目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であり、これは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
ヌクレオチドは、窒素塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボース）、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸を含む。ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）は、リボースに結合した核酸塩基及び単一のリン酸を含み、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）は、リボースに結合した核酸塩基及び２つのリン酸を含み、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、リボースに結合した核酸塩基及び３つのリン酸を含む。ヌクレオチドアナログは、一般的なヌクレオチドの構造を有するか、またはヌクレオチドと構造的に類似した化合物である。ヌクレオチドアナログとしては、例えば、ヌクレオチドの核酸塩基のアナログ、糖のアナログ、及び／またはリン酸基（複数可）のアナログが挙げられる。
ヌクレオシドは、窒素塩基及び五炭糖を含む。従って、ヌクレオシドにリン酸基を加えることでヌクレオチドになる。ヌクレオシドアナログは、一般的なヌクレオシドの構造を有するか、またはヌクレオシドと構造的に類似した化合物である。ヌクレオシドアナログとしては、例えば、ヌクレオシドの核酸塩基のアナログ及び／または糖のアナログが挙げられる。
「ヌクレオチド」という用語は、特に明記しない限り、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドを含むことを理解されたい。例えば、本明細書に提供するＩＶＴ反応でのＲＮＡの生成に使用される天然に存在するヌクレオチドの例としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、及び５－メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、及び／またはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）が使用される。
ヌクレオチドアナログの例としては、抗ウイルス性ヌクレオチドアナログ、リン酸アナログ（可溶性もしくは固定化、加水分解性もしくは非加水分解性）、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、例えば、キャップアナログ、もしくは酵素的キャッピング（ワクシニアまたはリガーゼ）のための前駆体／基質、キャップもしくは５´部分（ＩＲＥＳ）のライゲーション／コンジュゲーションを促進する官能基で標識されたヌクレオチド、キャップもしくは５´部分のライゲーションを促進するために５´ＰＯ４で標識されたヌクレオチド、または化学的もしくは酵素的に切断され得る官能基／保護基で標識されたヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス性ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログの例としては、ガンシクロビル、エンテカビル、テルビブジン、ビダラビン、及びシドフォビルが挙げられるが、これらに限定されない。
修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。例えば、本開示のＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）としては、プソイドウリジン（ψ）、１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４´－チオウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び２´－Ｏ－メチルウリジンから選択される修飾核酸塩基が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
本明細書に提供するヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、未修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは未修飾ＵＴＰ、修飾もしくは未修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは未修飾ＣＴＰを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、未修飾ＡＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＡＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、未修飾ＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、未修飾ＧＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＧＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、未修飾ＣＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＣＴＰを含む。
ＩＶＴ反応に含まれるヌクレオシド三リン酸及びキャップアナログの濃度は異なり得る。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ及びキャップアナログは、該反応中に等モル濃度で含まれる。いくつかの実施形態では、キャップアナログ（例えば、トリヌクレオチドキャップ）対ヌクレオシド三リン酸の該反応中でのモル比は、１：１より大きい。例えば、キャップアナログ対ヌクレオシド三リン酸の該反応中でのモル比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、５０：１、または１００：１であり得る。いくつかの実施形態では、キャップアナログ（例えば、トリヌクレオチドキャップ）対ヌクレオシド三リン酸の該反応中でのモル比は、１：１未満である。例えば、キャップアナログ（例えば、トリヌクレオチドキャップ）対ヌクレオシド三リン酸の該反応中でのモル比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、または１：１００であり得る。
ＩＶＴ反応におけるＮＴＰの組成もまた異なり得る。例えば、ＡＴＰは、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰより超過して使用され得る。非限定的な例として、ＩＶＴ反応は、７．５ミリモルのＧＴＰ、７．５ミリモルのＣＴＰ、７．５ミリモルのＵＴＰ、及び３．７５ミリモルのＡＴＰを含み得る。同じＩＶＴ反応は、３．７５ミリモルのキャップアナログ（例えば、トリヌクレオチドキャップ）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：１：１：０．５：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：１：０．５：１：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：０．５：１：１：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、０．５：１：１：１：０．５である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、プソイドウリジン（ψ）、１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン及びα－チオ－アデノシンから選択される修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、プソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、α－チオ－グアノシンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）は、α－チオ－アデノシンを含む。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、全配列を通して修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）で均一に修飾される場合があり、これは、ｍＲＮＡ配列における全てのウリジン残基が１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のいずれかのもの等の修飾残基で置き換えることにより、当該配列に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基に関して均一に修飾され得る。代替的に、該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、均一に修飾されない場合がある（例えば、部分的に修飾される、配列の一部が修飾される）。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、該緩衝系はトリスを含む。ＩＶＴ反応において使用されるトリスの濃度は、例えば、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭまたは少なくとも１１０ｍＭのリン酸であり得る。いくつかの実施形態では、リン酸の濃度は、２０～６０ｍＭまたは１０～１００ｍＭである。
いくつかの実施形態では、該緩衝系はジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。ＩＶＴ反応において使用されるＤＴＴの濃度は、例えば、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応において使用されるＤＴＴの濃度は、１～５０ｍＭまたは５～５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応において使用されるＤＴＴの濃度は、５ｍＭである。
いくつかの実施形態では、該緩衝系はマグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応中に含まれるＮＴＰ対マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋、例えば、ＭｇＣｌ２）のモル比は、１：１～１：５である。例えば、ＮＴＰ対マグネシウムイオンのモル比は、１：１、１：２、１：３、１：４または１：５であり得る。
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応中に含まれるＮＴＰプラスキャップアナログ（例えば、ＧＡＧ等のトリヌクレオチドキャップ）対マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋、例えば、ＭｇＣｌ２）のモル比は、１：１～１：５である。例えば、ＮＴＰ＋トリヌクレオチドキャップ（例えば、ＧＡＧ）対マグネシウムイオンのモル比は、１：１、１：２、１：３、１：４または１：５であり得る。
いくつかの実施形態では、該緩衝系は、トリス－ＨＣｌ、スペルミジン（例えば、１～３０ｍＭの濃度で）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００（ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェニルエーテル）及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
成長するＲＮＡ鎖の３´末端へのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の付加は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、例えば、本開示のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントの任意の１つ以上（例えば、Ｇ４７Ａ）によって触媒される。いくつかの実施形態では、該ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、反応（例えば、ＩＶＴ反応）中に、濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌで含まれる。例えば、該ＲＮＡポリメラーゼは、反応中に、濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌまたは１．０ｍｇ／ｍｌで含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドである。慣例では、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコード領域、５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ、５´キャップ、及びポリ－Ａテールが含まれる。本開示のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能することができるが、例えば、核酸ベースの治療薬を使用した効果的なポリペプチド生成における既存の問題を克服するのに役立つそれらの機能的及び／または構造的設計特性において、野生型ｍＲＮＡとは区別される。
ＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物は、第１の隣接領域及び第２の隣接領域と隣接している連結ヌクレオチドの第１の領域を含む。この第１の領域は、コードされた治療ペイロードまたは予防ペイロードを含み得るが、これに限定されない。第１の隣接領域は、当該ポリペプチドの天然５´ＵＴＲをコードする核酸のいずれかの５´ＵＴＲ、または異種５´ＵＴＲもしくは合成５´ＵＴＲ等であるがこれに限定されない非天然５´ＵＴＲ等の５´非翻訳領域（ＵＴＲ）として機能する連結ヌクレオシドの配列を含み得る。治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする該ＩＶＴは、１つ以上のシグナル配列をコードするシグナル配列領域を、その５末端で含み得る。該隣接領域は、１つ以上の完全または不完全な５´ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオチドの領域を含み得る。該隣接領域はまた、５´末端キャップを含み得る。第２の隣接領域は、治療ペイロードもしくは予防ペイロードの天然３´ＵＴＲ、または異種３´ＵＴＲもしくは合成３´ＵＴＲ等であるがこれに限定されない非天然３´ＵＴＲをコードし得る１つ以上の完全または不完全な３´ＵＴＲを含む、連結ヌクレオチドの領域を含み得る。該隣接領域はまた、３´テール配列を含み得る。該３´テール配列としては、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット及び／またはステムループ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
ＩＶＴポリヌクレオチド構造及びポリヌクレオチド作製方法のさらなる例示的な特性は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／２０１３２５に開示され、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
精製
他の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、精製され得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当該技術分野で既知の方法、例えば、これらに限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣ系の精製方法、例えば、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）によって行われ得る。「精製されたポリヌクレオチド」のように、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書で使用される場合、「汚染物質」は、別の物質を不適当、不純または劣るものにする任意の物質である。従って、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で存在するか、またはそれを処理または精製法に供する前に存在したものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
他の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、精製され得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当該技術分野で既知の方法、例えば、これらに限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣ系の精製方法、例えば、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）によって行われ得る。「精製されたポリヌクレオチド」のように、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書で使用される場合、「汚染物質」は、別の物質を不適当、不純または劣るものにする任意の物質である。従って、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で存在するか、またはそれを処理または精製法に供する前に存在したものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製で不純物を除去することにより、望ましくない免疫応答を低減または除去すること（例えば、サイトカイン活性を低下させること）ができる。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、投与前にカラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を用いて精製される。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチド（本明細書で開示される治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする）では、該治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量が、異なる精製法で精製された該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチドと比較して増加する。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする。いくつかの実施形態では、該精製されたポリヌクレオチドは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする。
いくつかの実施形態では、該精製されたポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
品質保証及び／または品質管理検査は、例えば、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣであるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。
別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲが挙げられるがこれに限定されない方法によって配列決定され得る。
ポリヌクレオチドの化学修飾
前述の通り、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドが本発明のポリヌクレオチドに含まれ得る。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体と、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）との組み合わせを含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
前述の通り、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドが本発明のポリヌクレオチドに含まれ得る。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体と、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）との組み合わせを含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造間（例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸間等）の水素結合が可能になる。このような非標準的塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示の核酸に組み込まれ得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）中の修飾核酸塩基は、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）中の修飾核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルプソイドウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、前述の任意の修飾核酸塩基（限定されるものではないが、化学修飾を含む）のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にＮ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にＮ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にプソイドウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、全配列を通して修飾される）。例えば、核酸は、Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで均一に修飾され得、これは、ｍＲＮＡ配列における全てのウリジン残基がＮ１－メチル－プソイドウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、核酸は、上記のもの等の修飾残基で置き換えることにより、当該配列に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基に関して均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。例えば、本開示の核酸内、またはその所定の配列領域内（例えば、ポリＡテールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つ以上もしくは全てまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）が均一に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸中（またはその配列領域中）の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであり得る。
該核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に対して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド（すなわち、任意のＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上）に対して）、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含み得る。任意の残りのパーセンテージ全てが、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在で占められることが理解されるであろう。
該核酸は、修飾ヌクレオチドを最低１％及び最大１００％で、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）で含んでもよい。例えば、該核酸は、修飾ウラシルまたはシトシン等の修飾ピリミジンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、該核酸におけるウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えることができ、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、該核酸におけるシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えることができ、または異なる構造（例えば、２、３、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。
配列最適化及びその方法
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、当該ＯＲＦは、配列最適化されている。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、当該ＯＲＦは、配列最適化されている。
本明細書に開示される配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列及び他の既知の配列最適化ヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、特有の組成上の特徴を有する。
いくつかの実施形態では、該参照野生型ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージに対して、配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージは、変更されている（例えば低下している）。そのような配列は、ウラシル修飾配列またはチミン修飾配列と呼ばれる。ヌクレオチド配列中のウラシルもしくはチミン含量のパーセンテージは、配列中のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除し、１００で乗じることによって求めることができる。いくつかの実施形態では、該配列最適化ヌクレオチド配列は、該参照野生型配列中のウラシルまたはチミン含量よりも低い含量でウラシルもしくはチミンを有する。いくつかの実施形態では、本開示の配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含量は、該参照野生型配列中のウラシルまたはチミン含量よりも多く、該参照野生型配列と比較して有益な効果（例えば、発現量及び／またはシグナル伝達応答の増加）を依然として維持する。
いくつかの実施形態では、本開示の最適化配列は、該配列においてウラシルまたはチミン（ＤＮＡの場合）を特有の範囲で含有する。該最適化配列のウラシルまたはチミン含量は、様々な方法（例えば、理論最小値に対する（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）、野生型に対する（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）、及び総ヌクレオチド含量に対する（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）最適化配列のウラシルまたはチミン含量）で表すことができる。ＤＮＡでは、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）が存在することが認識されており、Ｕが現れる場合はＴで置換することになる。ＲＮＡでは、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）が存在することが認識されている。当業者であれば、ＤＮＡ配列中のチミンがウラシルに置換されてＤＮＡ配列が与えられると、ＲＮＡ配列を容易に得ることができる。従って、例えば、ＲＮＡについての％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関する全開示は、ＤＮＡについての％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬに等しく適用できる。
ウラシルまたはチミン理論最小値に対するウラシルまたはチミン含量とは、配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの数を、仮想配列中の全コドンを可能な限り低いウラシルまたはチミン含量の同義コドンに置き換えた該仮想ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって求められるパラメータを指す。本明細書では、このパラメータを％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略記する。
いくつかの実施形態において、本開示のウラシル修飾配列では、連続したウラシルの数が、対応する野生型核酸配列に対して減少している。例えば、２つの連続したロイシンは、４ウラシルのクラスターを含む配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分配列は、例えば、該ウラシルクラスターを除去したＣＵＧＣＵＣで代用され得る。フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。故に、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンがＵＵＣにより置き換えられたとしても、当該同義コドンは依然としてウラシルペア（ＵＵ）を含む。従って、配列中のフェニルアラニンの数は、コードされたポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させることなしには排除することができない、最小数のウラシルペア（ＵＵ）を確立する。
いくつかの実施形態において、本開示のウラシル修飾配列では、ウラシルトリプレット（ＵＵＵ）の数が、野生型核酸配列に対して減少している。いくつかの実施形態において、ウラシル修飾配列では、ウラシルペア（ＵＵ）の数が、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数に対して減少している。いくつかの実施形態において、本開示のウラシル修飾配列では、ウラシルペア（ＵＵ）の数が、野生型核酸配列における可能な限り最小のウラシルペア（ＵＵ）の数に対応している。
「野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）に対するウラシルペア（ＵＵ）」という語句は、配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の総数で除し、１００を乗じることによって求められるパラメータを指す。本明細書では、このパラメータを％ＵＵｗｔと略記する。いくつかの実施形態では、ウラシル修飾配列は、１００％未満のいずれかの％ＵＵｗｔを有する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ウラシル修飾配列を含む。いくつかの実施形態では、該ウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基（例えば、５－メトキシウラシル）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のウラシル修飾配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、ウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウラシルである。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列最適化されている。
配列最適化されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書において「核酸」とも呼ばれる）は、参照配列（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする野生型配列）に対して少なくとも１つのコドン修飾を含む。故に、配列最適化された核酸において、少なくとも１つのコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）中の対応するコドンとは異なる。
一般に、配列最適化された核酸は、少なくとも参照配列中のコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含むステップによって生成される。かかる置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化された配列中の各アミノ酸をコードするコドンを提供する表）を適用することによって、または一組の規則（例えば、グリシンが中性アミノ酸の隣にある場合、グリシンはある特定のコドンによってコードされるが、それが極性アミノ酸の隣にある場合、それは別のコドンによってコードされる）を適用することによって達成され得る。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（不安定化モチーフ置換）等の、厳密にコドン最適化を目的とするのではない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物及び製剤は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする機能的に活性なインビボ発現を促進するために、それを必要とする対象に投与され得る。
配列最適化の追加の例示的な方法は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／２０１３２５に開示され、その内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰの脂質含量
上述のように、脂質に関して、本明細書に開示される送達媒体として使用するためのＬＮＰは、（ｉ）イオン化脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び、任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。これらのカテゴリーの脂質は、以下でより詳細に記載される。
上述のように、脂質に関して、本明細書に開示される送達媒体として使用するためのＬＮＰは、（ｉ）イオン化脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び、任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。これらのカテゴリーの脂質は、以下でより詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物として製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には、目的の核酸カーゴとともに、アミノ脂質、リン脂質、構造脂質及びＰＥＧ脂質成分を含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般的に知られている成分、組成物、及び方法を用いて生成することができる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９３、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６６２４２を参照。これらの全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して２０～６０％のモル比でアミノ脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、または５０～６０％のモル比でアミノ脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のモル比でアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して５～２５％のモル比でリン脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、５～３０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、２０～２５％、または２５～３０％のモル比でリン脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％のモル比で非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して２５～５５％のモル比で構造脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、１０～５５％、２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、または５０～５５％のモル比で構造脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％のモル比で構造脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して０．５～１５％のモル比でＰＥＧ脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、または１０～１５％のモル比でＰＥＧ脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のモル比でＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～６０％のアミノ脂質、５～２５％のリン脂質、２５～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～６０％のアミノ脂質、５～３０％のリン脂質、１０～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質を含む。
アミノ脂質
いくつかの態様では、本開示のアミノ脂質は、１つ以上の式（Ｉ）の化合物：
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり得、式中：
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ´Ｒ´からなる群から選択される；
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する；
Ｒ４は、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、
－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択される；
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここでＭ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルである；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択される；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択される；
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択される；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環である；
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択される；ならびに
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される；ここで、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４または５である場合に－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合に５、６、または７員のヘテロシクロアルキルではない。
いくつかの態様では、本開示のアミノ脂質は、１つ以上の式（Ｉ）の化合物：
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ´Ｒ´からなる群から選択される；
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する；
Ｒ４は、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、
－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択される；
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここでＭ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルである；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択される；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択される；
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択される；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環である；
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択される；ならびに
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される；ここで、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４または５である場合に－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合に５、６、または７員のヘテロシクロアルキルではない。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＡ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択される；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択される；Ｍ１は、結合またはＭ´である；Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである；Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択される；ならびにＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＢ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、それにおける全ての可変部は、本明細書に定義される通りである。例えば、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択される；Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである；Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択される；ならびにＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＣ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、それにおける全ての可変部は、本明細書に定義される通りである。例えば、Ｒ´は、分枝Ｃ１－１８アルキル及び分枝Ｃ２－１８アルケニルからなる群から選択される；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される；Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；Ｍ及びＭ１は、それぞれ独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択される；ｌは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；ならびにｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒｂは、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである。式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれＨである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；ＲｂはＣ１－１２アルキルである；ｌは５である；ならびにｍは７である。式（ＩＣ）のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり；ここで、
は結合点を示し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれＨである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；Ｒ´はＣ１－１２アルキルである；ｌは３である；ならびにｍは７である。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、ＲａαはＣ２－１２アルキルであり、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれＨである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は
であり、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は２である；Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；Ｒ´はＣ１－１２アルキルである；ｌは５である；ならびにｍは７である。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａα、Ｒａβ、及びＲａδは、それぞれＨであり、ＲａγはＣ２－１２アルキルである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；Ｒ´はＣ１－１２アルキルである；ｌは５である；ならびにｍは７である。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒｂは、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである。式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される；Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；Ｍ及びＭ´は、それぞれ独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択される；Ｒｂは、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；ｌは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；ならびにｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；Ｍ及びＭ´は、それぞれ独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択される；Ｒｂは、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；ｌは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；ならびにｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれＨである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；ＲｂはＣ１－１２アルキルである；ｌは５である；ならびにｍは７である。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれＨである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；ＲｂはＣ１－１２アルキルである；ｌは３である；ならびにｍは７である。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａβ及びＲａδは、それぞれＨであり、ＲａγはＣ２－１２アルキルである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´は、それぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；ＲｂはＣ１－１２アルキルである；ｌは５である；ならびにｍは７である。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される；Ｒ４は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される；各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択される；Ｍ及びＭ´は、それぞれ独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択される；Ｒｂは、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；ｌは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；ならびにｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
式（ＩＣ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´は
であり、ここで、
は結合点を示し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは、それぞれＨであり、ＲａαはＣ２－１２アルキルである；Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ１－１４アルキルである；Ｒ４は
であり、
は結合点を示し、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は２である；各Ｒ５はＨである；各Ｒ６はＨである；Ｍ及びＭ´はそれぞれ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である；ＲｂはＣ１－１２アルキルである；ｌは５である；ならびにｍは７である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＣ）の化合物は、
である。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択される；Ｍ１は、結合またはＭ´である；Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである；Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択される；ならびにＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。
１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの：
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）もしくは（ＩＩｅ）のもの：
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｆ）のもの：
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４である；ならびにｍ、Ｒ´、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載される通りである。例えば、各Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択されてもよい。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｇ）のもの、
またはそれらのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択される；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択される；Ｍ１は、結合またはＭ´である；Ｍ及びＭ´は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択される；ならびにＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキル（例えば、Ｃ１－４アルキル）またはＣ２－６アルケニル（例えば、Ｃ２－４アルケニル）である。例えば、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択される。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａは、Ｒ´分枝またはＲ´環式であり、
ここで、Ｒ´分枝は、
であり、Ｒ´環式は、
である；ならびに
Ｒ´ｂは、
である；
ここで、
は、結合点を示す；
Ｒａγ及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒａγ及びＲａδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
Ｒｂγ及びＲｂδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒｂγ及びＲｂδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
Ｙａは、Ｃ３－６炭素環である；
Ｒ＊”ａは、Ｃ１－１５アルキル及びＣ２－１５アルケニルからなる群から選択される；ならびに
ｓは、２または３である；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式中、Ｒ´ａは、Ｒ´分枝またはＲ´環式であり、
ここで、Ｒ´分枝は、
Ｒ´ｂは、
ここで、
Ｒａγ及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒａγ及びＲａδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
Ｒｂγ及びＲｂδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒｂγ及びＲｂδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
Ｙａは、Ｃ３－６炭素環である；
Ｒ＊”ａは、Ｃ１－１５アルキル及びＣ２－１５アルケニルからなる群から選択される；ならびに
ｓは、２または３である；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
である
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒａγ及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒａγ及びＲａδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒｂγ及びＲｂδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒｂγ及びＲｂδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
（ここで、
Ｒａγ及びＲａδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒａγ及びＲａδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒｂγ及びＲｂδは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、Ｒｂγ及びＲｂδのうち少なくとも１つは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
である
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれ独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
（ここで、
Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれ独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
である
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒａγは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
Ｒ´はＣ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
（ここで、
Ｒａγは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
Ｒ´はＣ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
である
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれ独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
（ここで、
Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれ独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
Ｒ１０はＮ（Ｒ）２であり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される）からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
である
（ここで、
は結合点を示し、
Ｒａγは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；
Ｒ´はＣ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
（ここで、
Ｒａγは、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される）；
Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；
Ｒ´はＣ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルである；
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される；
ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択される。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍ及びｌは、それぞれ５である。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｒ´は、独立して、Ｃ２－５アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´ｂは
であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´ｂは
であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ６－１０アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´ｂは
であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ８アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、Ｒａγは、Ｃ１－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ６－１０アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、Ｒａγは、Ｃ２－６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ６－１０アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、Ｒａγは、Ｃ２－６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ８アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ１－１２アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ２－６アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択され、各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、各Ｒ´は、独立して、Ｃ２－５アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択され、各Ｒ´は、独立してＣ１－１２アルキルであり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ１－１２アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、各Ｒ´は、独立してＣ２－５アルキルであり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ２－６アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択され、Ｒ´は、Ｃ１－１２アルキルであり、Ｒａγは、Ｃ１－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ６－１０アルキルである。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、Ｒ´はＣ２－５アルキルであり、Ｒａγは、Ｃ２－６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ８アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ４は
であり、ここで、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は２である。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ４は
であり、ここで、Ｒ１０はＮＨ（ＣＨ３）であり、ｎ２は２である。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択され、各Ｒ´は、独立してＣ１－１２アルキルであり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ１－１２アルキルであり、Ｒ４は
であり、ここで、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は２である。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、各Ｒ´は、独立してＣ２－５アルキルであり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ２－６アルキルであり、Ｒ４は
であり、ここで、Ｒ１０はＮＨ（ＣＨ３）であり、ｎ２は２である。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択され、Ｒ´は、Ｃ１－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してＣ６－１０アルキルであり、ＲａγはＣ１－１２アルキルであり、Ｒ４は
であり、ここで、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は２である。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、Ｒ´はＣ２－５アルキルであり、ＲａγはＣ２－６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ８アルキルであり、Ｒ４は
であり、ここで、Ｒ１０はＮＨ（ＣＨ３）であり、ｎ２は２である。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２、３、または４である。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ独立して、４、５、及び６から選択され、各Ｒ´は、独立してＣ１－１２アルキルであり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ１－１２アルキルであり、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２、３、または４である。式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
であり、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、各Ｒ´は、独立してＣ２－５アルキルであり、Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれＣ２－６アルキルであり、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｈ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
であり、Ｒ´ｂは
である
（ここで、
は結合点を示し、
ＲａγはＣ１－１２アルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキルである）；
Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；
Ｒ´はＣ１－１２アルキルである；
ｍは、４、５、及び６から選択される；ならびに
ｌは、４、５、及び６から選択される。
式中、Ｒ´ａはＲ´分枝であり、ここで、
Ｒ´分枝は
（ここで、
ＲａγはＣ１－１２アルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１４アルキルである）；
Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される；
Ｒ´はＣ１－１２アルキルである；
ｍは、４、５、及び６から選択される；ならびに
ｌは、４、５、及び６から選択される。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、ｎは２、３、または４である。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ´はＣ２－５アルキルであり、Ｒａγは、Ｃ２－６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ６－１０アルキルである。
式（ＩＩｈ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍ及びｌは、それぞれ５であり、ｎは２、３、または４であり、Ｒ´はＣ２－５アルキルであり、Ｒａγは、Ｃ２－６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＣ６－１０アルキルである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｉ）のもの：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
ＲａγはＣ２－６アルキルである；
Ｒ´はＣ２－５アルキルである；ならびに
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は、１、２、及び３からなる群から選択される）からなる群から選択される。
ＲａγはＣ２－６アルキルである；
Ｒ´はＣ２－５アルキルである；ならびに
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｊ）のもの：
であり、
式中
Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれ独立して、Ｃ２－６アルキルである；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ２－５アルキルである；ならびに
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
（ここで、
は結合点を示し、Ｒ１０はＮＨ（Ｃ１－６アルキル）であり、ｎ２は、１、２、及び３からなる群から選択される）からなる群から選択される。
式中
Ｒａγ及びＲｂγは、それぞれ独立して、Ｃ２－６アルキルである；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ２－５アルキルである；ならびに
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、３、４、及び５からなる群から選択される）、及び
式（ＩＩｉ）または（ＩＩｊ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ４は
であり、ここで、
Ｒ１０はＮＨ（ＣＨ３）であり、ｎ２は２である。
Ｒ１０はＮＨ（ＣＨ３）であり、ｎ２は２である。
式（ＩＩｉ）または（ＩＩｊ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ４は－（ＣＨ２）２ＯＨである。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１、６２／２５２，３１６、６２／２５３，４３３、６２／２６６，４６０、６２／３３３，５５７、６２／３８２，７４０、６２／３９３，９４０、６２／４７１，９３７、６２／４７１，９４９、６２／４７５，１４０、及び６２／４７５，１６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載される１つ以上の化合物である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体から選択される。
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は：
またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は
またはその塩である。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＣ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、または（ＩＩｇ）による脂質の中央のアミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。従って、脂質は、生理的ｐＨでは正電荷または部分正電荷を有し得る。かかるアミノ脂質は、カチオン性脂質、イオン化脂質、カチオン性アミノ脂質、またはイオン性アミノ脂質と呼ばれ得る。アミノ脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
いくつかの態様では、本開示のアミノ脂質は、１つ以上の式（ＩＩＩ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体であり得、式中、
Ｗは
であり、
環Ａは
である；
ｔは１または２である；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ＣＨまたはＮから選択される；
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）はどちらも存在しない；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ´、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択される；
ＲＸ１及びＲＸ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－３アルキルである；
各Ｍは、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択される；
Ｍ＊はＣ１－Ｃ６アルキルである；
Ｗ１及びＷ２は、それぞれ独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ６）－からなる群から選択される；
各Ｒ６は、独立して、Ｈ及びＣ１－５アルキルからなる群から選択される；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択される；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環である；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１２アルキル、Ｃ３－１２アルケニル及び－Ｒ＊ＭＲ´からなる群から選択される；ならびに
ｎは、１～６の整数である；
ここで、環Ａが
である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうち少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ´である。
Ｗは
環Ａは
ｔは１または２である；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ＣＨまたはＮから選択される；
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）はどちらも存在しない；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ´、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択される；
ＲＸ１及びＲＸ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－３アルキルである；
各Ｍは、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）－、－Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択される；
Ｍ＊はＣ１－Ｃ６アルキルである；
Ｗ１及びＷ２は、それぞれ独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ６）－からなる群から選択される；
各Ｒ６は、独立して、Ｈ及びＣ１－５アルキルからなる群から選択される；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択される；
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環である；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択される；
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択される；
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択される；
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１２アルキル、Ｃ３－１２アルケニル及び－Ｒ＊ＭＲ´からなる群から選択される；ならびに
ｎは、１～６の整数である；
ここで、環Ａが
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうち少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ´である。
いくつかの実施形態では、該化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ８）：
のいずれかのものである。
いくつかの実施形態では、該アミノ脂質は
またはその塩である。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）による脂質の中央のアミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。従って、脂質は、生理的ｐＨでは正電荷または部分正電荷を有し得る。
リン脂質
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負に帯電したリン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合により、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することを可能にし、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を可能にすることができる。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含めた非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化または架橋され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による付加環化を受ける可能性がある。かかる反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して、膜透過または細胞認識を容易にすることにおいて、またはナノ粒子組成物を有用な成分、例えば、標的化または画像化部分（例えば、染料）にコンジュゲートすることにおいて有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されない。リン脂質としてはまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物：
またはその塩であり、式中、
各Ｒ１は、独立して、任意に置換されるアルキルであるか、または、任意に、２つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される単環式カルボシクリルもしくは任意に置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意に、３つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される二環式カルボシクリルもしくは任意に置換される二環式ヘテロシクリルを形成する；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
Ａは、式：
のものである；
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置き換えられる；
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる；
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である；
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールである；ならびに
ｐは１または２であるが、
ただし、該化合物は、下記式のものではない：
式中、Ｒ２の各例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
各Ｒ１は、独立して、任意に置換されるアルキルであるか、または、任意に、２つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される単環式カルボシクリルもしくは任意に置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意に、３つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される二環式カルボシクリルもしくは任意に置換される二環式ヘテロシクリルを形成する；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
Ａは、式：
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置き換えられる；
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる；
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である；
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールである；ならびに
ｐは１または２であるが、
ただし、該化合物は、下記式のものではない：
いくつかの実施形態では、該リン脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号または２０１８年６月１５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７９２２（これらの各々の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のリン脂質の１つ以上でよい。
構造脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含む脂質も指す。
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含む脂質も指す。
脂質ナノ粒子内に構造脂質を組み込むことは、該粒子内の他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。いくつかの実施形態では、該構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるように、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
いくつかの実施形態では、該構造脂質は、米国出願第１６／４９３，８１４号に記載の構造脂質の１つ以上でよい。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。かかる脂質はＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステアリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃａｍｉｄｅ）（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
１つの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ－ＤＳＧ及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ脂質の脂質部分としては、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。１つの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ脂質、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載のものは当該技術分野では既知である。
概して、本明細書に記載される様々な式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、参照により全体として組み込まれる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号、出願日２０１６年１２月１０日、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」に記載の通りに合成され得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質等のポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含み得る。かかる種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれることもある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する：
１つの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載されるこれらの例示的なＰＥＧ脂質のうちのいずれかは、当該ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般的に定義される場合、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、当該脂質上に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、当該ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、当該ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（Ｖ）の化合物：
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は－ＯＲＯである；
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基である；
ｒは、１～１００（両端を含む）の整数である；
Ｌ１は、任意に置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられる；
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分であるか、または生理的条件下で切断可能な部分である；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
Ａは、式：
のものである；
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置き換えられる；
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる；
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である；
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールである；ならびに
ｐは１または２である。
Ｒ３は－ＯＲＯである；
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基である；
ｒは、１～１００（両端を含む）の整数である；
Ｌ１は、任意に置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられる；
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分であるか、または生理的条件下で切断可能な部分である；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である；
Ａは、式：
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置き換えられる；
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる；
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である；
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールである；ならびに
ｐは１または２である。
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は－ＯＲＯであり、ＲＯは水素である）。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ－ＯＨ）のもの：
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（ＶＩ－Ａ）の化合物：
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は－ＯＲＯである；
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基である；
ｒは、１～１００（両端を含む）の整数である；
Ｒ５は、任意に置換されるＣ１０－４０アルキル、任意に置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意に置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる；ならびに
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である。
Ｒ３は－ＯＲＯである；
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基である；
ｒは、１～１００（両端を含む）の整数である；
Ｒ５は、任意に置換されるＣ１０－４０アルキル、任意に置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意に置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる；ならびに
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－ＯＨ）のもの：
（ＶＩ－Ｂ）とも呼ばれる、
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは４０～５０である。
（ＶＩ－Ｂ）とも呼ばれる、
さらに他の実施形態では、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物は：
またはその塩である。
１つの実施形態では、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物は、
である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、米国出願第ＵＳ１５／６７４，８７２号に記載のＰＥＧ脂質の１つ以上でよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約２：１～約３０：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約６：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約３：１、４：１、または５：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該アミノ脂質成分の該ＲＮＡに対するｗｔ／ｗｔ比約１０：１～約１００：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該アミノ脂質成分の該ＲＮＡに対するｗｔ／ｗｔ比約２０：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該アミノ脂質成分の該ＲＮＡに対するｗｔ／ｗｔ比約１０：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰの平均直径は約３０ｎｍ～約１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰの平均直径は約６０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
例示的な追加のＬＮＰ成分
界面活性剤
ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、任意に１つ以上の界面活性剤を含む。
界面活性剤
ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、任意に１つ以上の界面活性剤を含む。
ある特定の実施形態では、該界面活性剤は、両親媒性ポリマーである。本明細書で使用される場合、両親媒性「ポリマー」は、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。
例えば、両親媒性ポリマーは、２つ以上のＰＥＧモノマー単位等のオリゴマー断片を含むことができる。例えば、本明細書に記載される両親媒性ポリマーは、ＰＳ ２０であり得る。
例えば、該両親媒性ポリマーは、ブロックコポリマーである。
例えば、該両親媒性ポリマーは、凍結保護剤である。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃及び大気圧で、水中で２×１０－４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃及び大気圧で、水中で約０．１×１０－４Ｍ～約１．３×１０－４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、凍結または凍結乾燥の前に、製剤中で、およそそのＣＭＣからＣＭＣの約３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲である。
例えば、該両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
例えば、該両親媒性ポリマーは、ポロキサマーである。例えば、該両親媒性ポリマーは、以下の構造のものである：
式中、ａは、１０～１５０の整数であり、ｂは、２０～６０の整数である。例えば、ａは約１２でありｂは約２０であるか、またはａは約８０でありｂは約２７であるか、またはａは約６４でありｂは約３７であるか、またはａは約１４１でありｂは約４４であるか、またはａは約１０１でありｂは約５６である。
例えば、該両親媒性ポリマーは、Ｐ１２４、Ｐ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、またはＰ４０７である。
例えば、該両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８である（例えば、ポロキサマー１８８、ＣＡＳ番号９００３－１１－６、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８としても知られる）。
例えば、該両親媒性ポリマーは、ポロキサミン、例えば、ｔｅｔｒｏｎｉｃ ３０４またはｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０４である。
例えば、該両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
例えば、該両親媒性ポリマーは、ＰＳ ２０等のポリソルベートである。
ある特定の実施形態では、該界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、該界面活性剤は、両親媒性ポリマーである。いくつかの実施形態では、該界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
例えば、該非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、及びこれらの誘導体からなる群から選択される。
例えば、該ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体であり、式中、
ｔは、１～１００の整数である；
Ｒ１ＢＲＩＪは、独立して、Ｃ１０－４０アルキル、Ｃ１０－４０アルケニル、またはＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ３－１０カルボシクリレン、４～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６－１０アリーレン、４～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられる；ならびに
ＲＮの各例は、独立して、水素、Ｃ１－６アルキル、または窒素保護基である。
例えば、該ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
ｔは、１～１００の整数である；
Ｒ１ＢＲＩＪは、独立して、Ｃ１０－４０アルキル、Ｃ１０－４０アルケニル、またはＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ３－１０カルボシクリレン、４～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６－１０アリーレン、４～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられる；ならびに
ＲＮの各例は、独立して、水素、Ｃ１－６アルキル、または窒素保護基である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルキルである。例えば、該ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ－ａ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルケニルである。例えば、該ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ－ｂ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態では、該ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、及びポロキサマー４０７からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該ポリソルベートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０である。
いくつかの実施形態では、ソルビタンの誘導体は、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、またはＳｐａｎ（登録商標）８５である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．００００１ｗ／ｖ％～約１ｗ／ｖ％、例えば、約０．００００５ｗ／ｖ％～約０．５ｗ／ｖ％、または約０．０００１ｗ／ｖ％～約０．１ｗ／ｖ％の範囲である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０００００１ｗｔ％～約１ｗｔ％、例えば、約０．０００００２ｗｔ％～約０．８ｗｔ％、または約０．０００００５ｗｔ％～約０．５ｗｔ％の範囲である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のＰＥＧ脂質の濃度は、約０．０１モル％～約５０モル％、例えば、約０．０５モル％～約２０モル％、約０．０７モル％～約１０モル％、約０．１モル％～約８モル％、約０．２モル％～約５モル％、または約０．２５モル％～約３モル％の範囲である。
アジュバント
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、任意に、１つ以上のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、任意に、１つ以上のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含む。
他の成分
本発明のＬＮＰは、任意に、前述のセクションに記載されるものに加えて１つ以上の成分を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、ビタミン（例えば、ビタミンＡもしくはビタミンＥ）またはステロール等の１つ以上の疎水性小分子を含んでもよい。また、脂質ナノ粒子は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤、または他の成分を含んでもよい。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載される分子であってもよい。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含んでもよい。
本発明のＬＮＰは、任意に、前述のセクションに記載されるものに加えて１つ以上の成分を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、ビタミン（例えば、ビタミンＡもしくはビタミンＥ）またはステロール等の１つ以上の疎水性小分子を含んでもよい。また、脂質ナノ粒子は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤、または他の成分を含んでもよい。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載される分子であってもよい。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含んでもよい。
脂質ナノ粒子をカプセル化または部分的にカプセル化するために、ポリマーを含めてもよい及び／または使用してもよい。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であってもよい。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーとしては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（ビニルアセテート）等のポリビニルエステル、ポリ（ビニルクロリド）（ＰＶＣ）等のポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびにそれらのコポリマー及び混合物等のアクリル酸のポリマー、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールが挙げられ得る。
表面改質剤としては、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム等のカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、マグワート、ブロメライン、パパイン、クレロデンドルム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、及びエルドステイン）、ならびにＤＮアーゼ（例えば、ｒｈＤＮアーゼ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。表面改質剤は、ナノ粒子内及び／またはＬＮＰの表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。
脂質ナノ粒子はまた、１つ以上の官能化脂質を含んでもよい。例えば、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露されたときに、環化付加反応を受け得るアルキン基で官能化されてもよい。特に、脂質二重層は、膜透過、細胞認識、または画像化を促進するのに有用な１つ以上の基により、この方法で官能化されてもよい。ＬＮＰの表面はまた、１つ以上の有用な抗体とコンジュゲートされてもよい。標的化細胞送達、画像化、及び膜透過において有用な官能基及びコンジュゲートは、当該技術分野において周知である。
これらの成分に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物に有用な任意の物質を含んでもよい。例えば、該脂質ナノ粒子は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または補助成分、例えば、限定されないが、１つ以上の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、流動化剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、油、防腐剤、及び他の種等を含んでもよい。また、ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味剤、及び芳香剤等の賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。
希釈剤の例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物、及び／またはそれらの組み合わせからなる非限定的なリストから選択され得る。
表面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミニウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
結合剤は、デンプン（例えば、コーンスターチ及びデンプンペースト）、ゼラチン、糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム（ｐａｎｗａｒ ｇｕｍ）、ガティガム（ｇｈａｔｔｉ ｇｕｍ）、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標）、及びカラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））、アルギン酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコール、ならびにそれらの組み合わせ、または任意の他の好適な結合剤であってもよい。
防腐剤の例には、抗酸化剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／または他の防腐剤が含まれ得るが、これらに限定されない。抗酸化剤の例としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌防腐剤の例としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。アルコール防腐剤の例としては、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、及び／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。酸性防腐剤の例としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
緩衝剤の例としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、リン酸水酸化カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノスルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンガー液、エチルアルコール、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。
油の例としては、アーモンド、アンズ核、アボカド、ババス、ベルガモット、クロフサスグリ種子、ボラージ、カデ、カモミール、カノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、カカオバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、ツキミソウ、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、グレープシード、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴーシード、メドウフォームシード、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、トウニン、ピーナッツ、ポピーシード、パンプキンシード、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、ビャクダン、サザンカ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイバリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油、ならびにステアリン酸ブチル、トリカプリル酸グリセリル（ｃａｐｒｙｌｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、トリカプリン酸グリセリル（ｃａｐｒｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
追加の例示的な脂質ナノ粒子及び化合物は、２０２０年９月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１６０９に開示され、その内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ組成物を使用する方法
本開示は、例えば、インビトロまたはインビボで、細胞（例えば、標的細胞）に送達され得るＬＮＰ組成物を提供する。インビトロでのタンパク質発現については、該ＬＮＰ及び該細胞をエクスビボでインキュベートすることによって、該細胞を該ＬＮＰと接触させる。かかる細胞は、その後、インビボで導入されてもよい。インビボでのタンパク質発現については、該ＬＮＰを対象に投与することによって該細胞を該ＬＮＰと接触させて、それにより、該対象内の細胞内または細胞上でタンパク質発現を増大させるかまたは誘導する。例えば、１つの実施形態では、該ＬＮＰは静脈内投与される。別の実施形態では、該ＬＮＰは筋肉内投与される。さらに他の実施形態では、該ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
本開示は、例えば、インビトロまたはインビボで、細胞（例えば、標的細胞）に送達され得るＬＮＰ組成物を提供する。インビトロでのタンパク質発現については、該ＬＮＰ及び該細胞をエクスビボでインキュベートすることによって、該細胞を該ＬＮＰと接触させる。かかる細胞は、その後、インビボで導入されてもよい。インビボでのタンパク質発現については、該ＬＮＰを対象に投与することによって該細胞を該ＬＮＰと接触させて、それにより、該対象内の細胞内または細胞上でタンパク質発現を増大させるかまたは誘導する。例えば、１つの実施形態では、該ＬＮＰは静脈内投与される。別の実施形態では、該ＬＮＰは筋肉内投与される。さらに他の実施形態では、該ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
インビトロ送達については、一実施形態では、該ＬＮＰ及び該標的細胞をエクスビボでインキュベートすることによって、該細胞を該ＬＮＰと接触させる。１つの実施形態では、該細胞はヒト細胞である。様々な種類の細胞がＬＮＰによってトランスフェクション可能であることが実証されている。
別の実施形態では、例えば、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、該細胞を該ＬＮＰと接触させる。
１つの実施形態では、１回の処置／トランスフェクションのために該細胞を該ＬＮＰと接触させる。別の実施形態では、複数回の処置／トランスフェクション（例えば、同じ細胞の２、３、４回またはそれ以上の処置／トランスフェクション）のために、該細胞を該ＬＮＰと接触させる。
別の実施形態では、インビボ送達のために、該ＬＮＰを対象に投与することによって該細胞を該ＬＮＰと接触させて、それにより、核酸を該対象内の細胞に送達する。例えば、１つの実施形態では、該ＬＮＰは静脈内投与される。別の実施形態では、該ＬＮＰは筋肉内投与される。さらに他の実施形態では、該ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
一態様において、本明細書では、細胞における治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量を増加させる方法であって、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物を該細胞に投与することを含む該方法が提供される。
関連する態様において、本明細書では、細胞における治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量を増加させる方法で使用するためのＬＮＰ組成物が提供される。
別の態様では、本開示は、対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量を増加させる方法であって、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物の有効量を該対象に投与することを含む該方法を提供する。
関連する態様において、本明細書では、対象における治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量を増加させる方法で使用するためのＬＮＰ組成物が提供される。
さらに別の態様において、本明細書では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物を送達する方法が提供される。
関連する態様において、本明細書では、細胞にＬＮＰ組成物を送達する方法で使用するための該ＬＮＰ組成物が提供される。
一実施形態では、該方法または使用は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで、該細胞を該ＬＮＰ組成物と接触させることを含む。
一実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物を、例えば、エクスビボまたはインビボで細胞と接触させ、分泌ポリペプチド、細胞内ポリペプチドまたは膜貫通ポリペプチドを対象に送達するために使用することができる。
一態様において、本開示は、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物を、疾患または障害（例えば、本明細書に記載のもの）を有する対象に送達する方法を提供する。
関連する態様において、本明細書では、疾患または障害（例えば、本明細書に記載のもの）を有する対象にＬＮＰ組成物を送達する方法で使用するための該ＬＮＰ組成物が提供される。
別の態様において、本明細書では、対象における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする該対象に、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む該方法が提供される。
関連する態様において、本明細書では、対象における免疫応答を調節する方法であって、該対象に、ＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む該方法で使用するための該ＬＮＰ組成物が提供される。
別の態様において、本明細書では、分泌ポリペプチド、細胞内ポリペプチドまたは膜貫通ポリペプチドを対象に送達する方法が提供される。
一態様において、本明細書では、疾患もしくは障害の処置方法、予防方法、またはその症状の予防方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物の有効量をに投与することを含む、該方法が提供される。
関連する態様において、本明細書では、対象における疾患もしくは障害の処置方法、予防方法、またはその症状の予防方法であって、それを必要とする対象に、ＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、該方法で使用するためのＬＮＰ組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、使用のための該方法または組成物により、該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの発現量及び／またはレベルが増加する。
いくつかの実施形態では、使用のための該方法または組成物により、該治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの発現量及び／またはレベルが持続する。
いくつかの実施形態では、使用のための該方法または組成物により、治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量及び／またはレベルが増加する。
いくつかの実施形態では、使用のための該方法または組成物により、治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現量及び／またはレベルが持続する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される機能的効果のいずれか１つは、以下の細胞と比較される：
（ａ）本明細書に開示されるＬＮＰ組成物と接触していない細胞、または
（ｂ）本明細書に記載される５´ＵＴＲ、本明細書に記載される３´ＵＴＲ及び／または本明細書に記載される終止エレメントを含むコード領域を含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰと接触していない細胞。
（ａ）本明細書に開示されるＬＮＰ組成物と接触していない細胞、または
（ｂ）本明細書に記載される５´ＵＴＲ、本明細書に記載される３´ＵＴＲ及び／または本明細書に記載される終止エレメントを含むコード領域を含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰと接触していない細胞。
併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される処置方法または組成物の使用は、追加の薬剤と組み合わせて本明細書に開示されるＬＮＰを投与することを含む。一実施形態では、該追加の薬剤は、疾患または障害（例えば、自己免疫疾患）の標準治療である。一実施形態では、該追加の薬剤は、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される処置方法または組成物の使用は、追加の薬剤と組み合わせて本明細書に開示されるＬＮＰを投与することを含む。一実施形態では、該追加の薬剤は、疾患または障害（例えば、自己免疫疾患）の標準治療である。一実施形態では、該追加の薬剤は、ｍＲＮＡである。
いくつかの態様において、本方法または組成物の対象は、１種以上の標準治療法で処置されている。他の態様において、本方法または組成物の対象は、１種以上の標準治療法または抗がん療法に応答していない。
医薬組成物
本開示は、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物のいずれかを含む医薬製剤を提供する。
本開示は、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物のいずれかを含む医薬製剤を提供する。
本開示のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物及び複合体に製剤化される。医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の追加の活性物質（例えば、治療上及び／または予防上活性な物質）を含み得る。本開示の医薬組成物は、無菌及び／またはパイロジェンフリーであり得る。該製剤の概論及び／または医薬品製造の概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的のため、「活性成分」という句は、一般に、本明細書に記載の通りに送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物に向けられているが、当業者には、かかる組成物が、一般に、任意の他の動物（例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類）への投与に適することが理解されよう。様々な動物への投与に好適な組成物を提供するために、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変が十分に理解されており、当業者である獣医薬理学者であれば、通常の実験（もしあれば）を行うだけで、そのような改変を設計及び／または実施することができる。医薬組成物の投与を検討する対象としては、ヒト及び／または他の霊長類、ひいては哺乳類が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、頭蓋内、心室内、経口、吸入スプレー、肺、局所、直腸、鼻、頬、膣、または植込リザーバー、筋肉内、皮下、もしくは皮内送達用に製剤化される。他の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、皮下または静脈内送達用に製剤化される。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。概して、かかる調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と会合した状態にするステップと、次いで、必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または多回用量単位に分割、成形、及び／またはパッケージングするステップとを含む。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の素性、サイズ、及び／または状態に応じて、さらには該組成物が投与される経路に応じて変動する。例として、該組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
製剤及び送達
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化され得る。
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化され得る。
１つ以上の賦形剤の機能は、例えば、（１）安定性を高める、（２）細胞トランスフェクションを増加させる、（３）持続放出もしくは遅延放出させる（例えば、該ポリヌクレオチドのデポー製剤から）、（４）体内分布を変化させる（例えば、該ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に標的化する）、（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させる、及び／または（６）コードされたタンパク質のインビボでの放出プロファイルを変化させることである。ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤等の従来の賦形剤に加えて、本開示の賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。従って、本開示の製剤は、１つ以上の賦形剤を、それぞれ合わせて、該ポリヌクレオチドの安定性を高め、該ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増加させ、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現量を増加させ、及び／またはポリヌクレオチドがコードするタンパク質の放出プロファイルを変化させる量で含み得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、自己組織化核酸ナノ粒子を用いて製剤化され得る。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。概して、かかる調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と会合させるステップを含む。
本開示による医薬組成物は、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として、バルクで調製、パッケージング、及び／または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。該活性成分の量は、概して、対象に投与されるはずの該活性成分の投与量及び／またはかかる投与量の便宜的な割合、例えば、かかる投与量の２分の１または３分の１に等しい。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の素性、サイズ、及び／または状態に応じて、さらには該組成物が投与される経路に応じて変動し得る。例えば、該組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、該組成物は、０．１％～１００％（例えば、．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％）（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する。非限定的な例として、該製剤は、１、２、３、４または５つのポリヌクレオチドを含有する。
本明細書で使用される場合、医薬製剤は、所望の特定の剤形に適するように、限定されないが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤等を含む、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物の製剤化のための様々な賦形剤及び該組成物を調製するための技術は、当該技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的作用が生じること、または他の点では該医薬組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用すること等により、物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内であると企図され得る。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子の粒径は、増加及び／または減少する。粒子サイズを変更することは、限定されないが炎症等の生物学的反応に対抗するのに役立つ可能性があるか、または哺乳類に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を高める可能性がある。
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、表面活性剤及び／または乳化剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、及び／または油が含まれるが、これらに限定されない。かかる賦形剤は、任意に、本開示の医薬製剤に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、コレステロール等の分子を隔離できるナノ構造体中で製剤化されるか、またはそれとともに送達されて投与される。これらのナノ構造体及びこれらのナノ構造体の作製方法の非限定的な例は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に記載されている。これらのナノ構造体の例示的な構造は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に示されており、コア及び該コアを取り囲むシェルを含み得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、コレステロール等の分子を隔離できるナノ構造体中で製剤化されるか、またはそれとともに送達されて投与される。これらのナノ構造体及びこれらのナノ構造体の作製方法の非限定的な例は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に記載されている。これらのナノ構造体の例示的な構造は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に示されており、コア及び該コアを取り囲むシェルを含み得る。
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて細胞に送達され得る。例えば、本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、脂質ベースの送達（例えば、トランスフェクション）、またはエレクトロポレーションによって細胞に送達され得る。
均等物及び範囲
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書に記載された本開示による具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するか、または確認できるであろう。本開示の範囲は、上の発明を実施するための形態に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書に記載された本開示による具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するか、または確認できるであろう。本開示の範囲は、上の発明を実施するための形態に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうち１つ、２つ以上、または全てが所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または他の点で関連する場合に満たされているとみなされる。本開示は、該群の厳密に１つのメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または他の点で関連する実施形態を含む。本開示は、該群のメンバーのうち２つ以上、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または他の点で関連する実施形態を含む。
「含む」という用語は、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包摂を許容するが、それを必要としないことにも留意されたい。本明細書で「含む」という用語が使用される場合、ひいては、「からなる」という用語も包含され、開示される。
範囲が与えられている場合、端点を含む。さらに、別段の指示がない限り、または文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が別途明確に示さない限り、本開示の異なる実施形態における記載された範囲内の任意の特定の値または部分的な範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができることを理解されたい。
たとえ引用で明示的に記載されていなくても、本明細書で引用されている全ての引用元、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、及び技術は、参照により本出願に組み込まれる。引用元及び本出願の記述が相反する場合、本出願の記述を優先するものとする。
本開示は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示を目的とするものに過ぎず、それに照らして、様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本出願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれることが理解される。
実施例１：Ａ１ ５´ＵＴＲの同定
本実施例は、Ａ１ ５´ＵＴＲを候補として５´ＵＴＲスクリーニングから同定することを説明するものである。該５´ＵＴＲスクリーニングのために、多様な供給源からの配列及びそれらの組み合わせを含めた。各５´ＵＴＲ候補については、２つのパラメータ：（１）ｅＧＦＰ－デグロンＩｎｃｕＣｙｔｅ測定による発現量、及び（２）Ｗｅｓスキャニング漏れアッセイによる開始忠実度を測定した。比較として、両アッセイにおける該５´ＵＴＲの性能を、Ａ１１参照５´ＵＴＲと比較した。本実施例では、ＧＧ配列を含むキャップを使用した。
本実施例は、Ａ１ ５´ＵＴＲを候補として５´ＵＴＲスクリーニングから同定することを説明するものである。該５´ＵＴＲスクリーニングのために、多様な供給源からの配列及びそれらの組み合わせを含めた。各５´ＵＴＲ候補については、２つのパラメータ：（１）ｅＧＦＰ－デグロンＩｎｃｕＣｙｔｅ測定による発現量、及び（２）Ｗｅｓスキャニング漏れアッセイによる開始忠実度を測定した。比較として、両アッセイにおける該５´ＵＴＲの性能を、Ａ１１参照５´ＵＴＲと比較した。本実施例では、ＧＧ配列を含むキャップを使用した。
該スクリーニングから、いくつかの５′ＵＴＲ配列が、参照５′ＵＴＲと比較して、発現量の増加に関連していた。発現量の実質的な増加に関連するほとんどの５′ＵＴＲが、それらの広範な有用性を妨げる何らかの特質を有していた。Ａ１は、試験したＯＲＦ及び細胞型全体にわたって、確かな性能を有することが明らかになった。該Ａ１ ５´ＵＴＲは、マウスＨｉｓｔ１ｈ１ｂ遺伝子（配列番号１）に由来する７６ヌクレオチド５′ＵＴＲ配列を含む。この配列は、Ｔ７転写リーダー配列の包摂により、天然の配列から改変されている。該Ａ１配列は、以下に基づくスクリーニングに含めた：高リボソーム密度（リボソームフットプリントによる、マウス胚線維芽細胞、Ｒｅｉｄ ＤＷ ｅｔ ａｌ （２０１４） Ｃｅｌｌ １５８（６）：１３６２－７４）、第１のＡＵＧにおける小リボソームサブユニットの高濃縮（小サブユニットマッピングによる）、その中程度の長さ及び配列におけるＡＵＧの非存在。
図１は、参照５´ＵＴＲまたは該Ａ１ ５´ＵＴＲのいずれかを有するｍＲＮＡ構築物からのタンパク質発現量を示している。Ｈｅｌａ細胞に、明記した５´ＵＴＲを有するｅＧＦＰ－デグロンをコードするｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。ｅＧＦＰタンパク質の発現量はＩｍａｇｉｎｇ（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３）で評価した。該Ａ１ ５´ＵＴＲでは、該参照５´ＵＴＲを有する構築物と比較して、タンパク質発現量が約２．４倍増加した（表５）。該Ａ１ ５´ＵＴＲでのｅＧＦＰ蛍光の動態に基づき（Ｍａｕｇｅｒ ＤＭ ｅｔ ａｌ（２０１９）ＰＮＡＳ １１６（４８）：２４０７５－８３に記載されるように）、対応するｍＲＮＡが、該参照５´ＵＴＲを含有する構築物での約１．９時間の半減期と比較して、約６．９時間の半減期を有したと推測した。要約すると、該Ａ１ ５´ＵＴＲにより、当該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現量が増加した。一実施形態では、この効果は、該ｍＲＮＡそれ自体の半減期の増加によるものである。
実施例２：Ａ１ ５´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡによるインビボでのタンパク質発現量の増加
本実施例は、マウス及びラットの動物モデルにおける、Ａ１ ５´ＵＴＲでのインビボタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、マウス及びラットの動物モデルにおける、Ａ１ ５´ＵＴＲでのインビボタンパク質発現量の増加を説明するものである。
マウスにおけるＡ１のインビボ効果を評価するために、ＬＮＰ製剤化ｆｆＬｕｃ ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇでＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与した。該ｍＲＮＡ構築物は、Ａ１１参照５´ＵＴＲまたは該Ａ１ ５´ＵＴＲのいずれかを有した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。該動物を投与６時間後及び４８時間後に画像化した。各群の動物は８匹とした。
図２Ａ～２Ｃのデータは、Ａ１が、マウスにおけるインビボでのｆｆＬｕｃ活性を実質的に増加（例えば、約１．２～２倍増加）させることを示している。図２Ａは、該ＬＮＰの投与６時間後における総フラックスを示し、図２Ｂは、該ＬＮＰの投与４８時間後における総フラックスを示す。影響は、試験した両方のＬＮＰ製剤（各々が式ＩＣに包含されるイオン化アミノ脂質、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む）にわたって認められた。
同様の実験を実施して、ラットにおけるＡ１の効果を評価した。ＬＮＰ製剤化標的ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇでＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内投与した。指定の時点で、標的タンパク質レベルを評価するために、動物から血清を得た。標的タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。各群のマウスは１１匹とした。
図３に示すように、該Ａ１ ５´ＵＴＲは、参照５´ＵＴＲと比較して、ラットにおける標的発現量を実質的に増加（例えば、約２．７倍増加）させた。
実施例３：Ａ１ ５´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡによる初代肝細胞における標的タンパク質発現量の増加
本実施例は、ラット、アカゲザル及びヒト初代肝細胞における、Ａ１ ５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、ラット、アカゲザル及びヒト初代肝細胞における、Ａ１ ５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。
要約すると、標的タンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを、ラット、アカゲザル、またはヒト肝臓由来の肝細胞が播かれたＨｅｐａｔｏＰａｃに送達した。該ｍＲＮＡ構築物は、Ａ１１参照５´ＵＴＲまたはＡ１ ５´ＵＴＲのいずれかを有した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。細胞を１％の適合する血清中で培養し、１ウェルあたり２００ｎｇのＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを送達した。
図４Ａ～４Ｃは、ラット（図４Ａ）、カニクイザル（図４Ｂ）及びヒト（図４Ｃ）初代肝細胞の細胞培地における、該Ａ１ ５´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡ構築物による分泌標的タンパク質の発現量が、該参照５´ＵＴＲと比較して大幅に増加したことを示している。
実施例４：Ａ１ ５´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡによるマウス免疫細胞における標的タンパク質発現量の増加
本実施例は、インビボでの様々な免疫細胞集団における標的タンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、インビボでの様々な免疫細胞集団における標的タンパク質発現量の増加を説明するものである。
標的タンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇでＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与した。該ｍＲＮＡ構築物は、Ａ１１参照５´ＵＴＲまたはＡ１ ５´ＵＴＲのいずれかを有した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。投与２４時間後、マウスを安楽死させ、脾臓及び血液を、標的タンパク質の発現量／レベルについてフローサイトメトリーで評価した。各群の動物は６匹とした。
データは表６～７にまとめている。Ａ１は、脾臓及び血液中の多様なマウス免疫細胞における標的タンパク質発現の発現量増加と一貫して関連していることが見出された。効果の大きさは細胞型によって異なり、平均蛍光強度（ＭＦＩ）への影響は、陽性細胞のパーセンテージと同様であった。
実施例５：Ａ１ ５´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡによるヒトＰＢＭＣにおける標的タンパク質発現量の増加
本実施例は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における標的タンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における標的タンパク質発現量の増加を説明するものである。
ヒトＰＢＭＣを、標的タンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡと接触させた。該ｍＲＮＡ構築物は、参照５´ＵＴＲまたは該Ａ１ ５´ＵＴＲのいずれかを有した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。該ＰＢＭＣ細胞は、ヒト血清の存在下で培養した。この実験では、３人のドナーの細胞を使用した。ＬＮＰとともに２４、４８、または７２時間インキュベートした後、該細胞を採取し、フローサイトメトリー用に処理した。
図５Ａ～５Ｂに示すように、Ａ１を有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡでは、コントロールと比較して、Ｔ細胞における該標的タンパク質の発現量が増加した。同様の効果がＢ細胞においても認められた（図５Ｃ～５Ｄ）。このデータは、ヒトＰＢＭＣにおいて、該ｍＲＮＡ構築物中にＡ１が存在することにより、コードされたタンパク質の発現量が増加することを示している。
実施例６：希少疾患モデルにおけるＡ１ ５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡのインビトロ効果
本実施例は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における、希少疾患に関連する標的タンパク質レベルについて説明するものである。該標的タンパク質は、Ａ１ ５´ＵＴＲまたはＡ１１参照５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる。
本実施例は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における、希少疾患に関連する標的タンパク質レベルについて説明するものである。該標的タンパク質は、Ａ１ ５´ＵＴＲまたはＡ１１参照５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる。
この実験のために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に、該標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。該標的タンパク質をコードするＯＲＦ配列を２つのバージョンで含むｍＲＮＡ構築物を使用した。該ｍＲＮＡ構築物は、Ａ１ ５´ＵＴＲまたは参照５´ＵＴＲを有した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。該細胞を、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃で培養した。トランスフェクションから２４時間後、該細胞を採取し、ウェスタンブロッティング用に処理した。
図６に示したように、該Ａ１ ５´ＵＴＲを伴うＯＲＦ配列のいずれかのバージョンを有するｍＲＮＡ構築物では、希少疾患に関連するコードされた標的タンパク質の発現量が増加した。
実施例７：Ａ１バリアントからのタンパク質発現量
本実施例は、異なるＡ１ ５´ＵＴＲ配列を有する構築物からのタンパク質発現量を説明するものである。緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を、以下の５´ＵＴＲ配列で生成した：Ａ１、Ａ２またはＡ３。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてｍＲＮＡをＨｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトし、ＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて蛍光をモニタリングした。総蛍光シグナルは、経時的に合計した。
本実施例は、異なるＡ１ ５´ＵＴＲ配列を有する構築物からのタンパク質発現量を説明するものである。緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を、以下の５´ＵＴＲ配列で生成した：Ａ１、Ａ２またはＡ３。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてｍＲＮＡをＨｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトし、ＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて蛍光をモニタリングした。総蛍光シグナルは、経時的に合計した。
結果を表８に示す。緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の全てが、同レベルのタンパク質発現量を示した。データは、該Ａ１ ５´ＵＴＲとその２つの誘導体では、タンパク質発現量が同レベルになることを示している。
実施例８：Ａ１バリアントからのインビボタンパク質発現量
本実施例は、修飾Ａ１ ５´ＵＴＲ配列を有する構築物からのインビボタンパク質発現量を説明するものである。
本実施例は、修飾Ａ１ ５´ＵＴＲ配列を有する構築物からのインビボタンパク質発現量を説明するものである。
マウスに、参照５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡ、または追加のウリジン及び改良されたコザック配列を有する修飾Ａ１配列を有するｍＲＮＡを投与した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。肝臓におけるコードされたタンパク質の発現量を、投与後２日目及び８日目にイムノブロットにより測定した。発現量は、ローディングコントロール及びコードされたタンパク質の内在性発現量に対して正規化した。
この実験の結果を図７に示す。該修飾Ａ１ ５´ＵＴＲを有する構築物からのインビボタンパク質発現量は、コントロールと比較して、投与後２日目及び８日目においてより多くなった。
実施例９：ｍＲＮＡ半減期延長のための３´ＵＴＲ配列の発見と適用
本実施例は、ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る３´ＵＴＲを同定するための３´ＵＴＲスクリーニングについて説明するものである。
本実施例は、ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る３´ＵＴＲを同定するための３´ＵＴＲスクリーニングについて説明するものである。
３種の各ＯＲＦ：ＧＦＰ－デグロン（細胞質）、ＧＬｕｃ（分泌）、及び膜タンパク質に対する１２０，０００の特有の３´ＵＴＲ配列を伴うｍＲＮＡプールを生成した。ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る３´ＵＴＲを同定するために、これらのプールをＨｅｐ３ｂ、ＨｅＬａ、ＡＭＬ－１２、及びＪＡＷＳＩＩ細胞にエレクトロポレーションし、次いで、アンプリコンシーケンシングで経時的に各３´ＵＴＲ配列の相対存在量を評価した。この実験では、３´ＵＴＲ配列の相対存在量の増加が、ｍＲＮＡの半減期の増加を指し示す場合があり、それを示すように定量化する（図８）。
高い半減期スコアに関連するいくつかの３´ＵＴＲ配列を、蛍光レポーターを使用して３´ＵＴＲ配列のいくつかのクラスの性能を評価する３´ＵＴＲスクリーニングに組み込んだ（図９）。このスクリーニングでは、計算モデリング（Ｍａｕｇｅｒ ＤＭ ｅｔ ａｌ（２０１９）ＰＮＡＳ １１６（４８）：２４０７５－８３）を使用して、各ｍＲＮＡに関連する翻訳効率及びｍＲＮＡ半減期を推測した。３´ＵＴＲの性能は、ＯＲＦ（Ｒ＝０．４）及び細胞型（Ｒ＝０．７）全体にわたり、かなり一貫していた。
計算モデルによると、ハイスループット半減期スクリーニングから選択された３´ＵＴＲ配列の各々は、参照３´ＵＴＲと比較してｍＲＮＡ半減期の増加と関連していた（図１０Ａ～１０Ｃ）。しかしながら、効果の規模は小さく、認められた最も長い半減期は、参照に対してわずか５０％増加しただけであった（図１０Ａ）。また、翻訳効率もこれらの３´ＵＴＲ配列間で異なり、長い推測半減期及び高い推測翻訳効率を有するｍＲＮＡによって、全体発現量が最高となった（図１０Ａ～１０Ｂ）。
半減期の延長と最も一貫して関連する配列は、Ｂ１遺伝子に由来する。その発現プロファイルの一例を示す（図１０Ｃ）。興味深いことに、天然のＢ１ ｍＲＮＡは、それ自体では著しく長い半減期を有さない（ｔ１／２＝５．５ｈ；Ｔａｎｉ Ｈ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（５）：９４７－９５６）。この配列はまた、ハイスループット３´ＵＴＲスクリーニングにおいて最も高い半減期スコアを有した。これらの観察に基づき、該Ｂ１ ３´ＵＴＲを、そのｍＲＮＡの半減期及びタンパク質発現量への影響をさらに評価するために、その後の研究で使用した。
実施例１０：終止エレメントの設計
本実施例は、連続した終止コドンを含む終止エレメントの設計を説明するものである。
本実施例は、連続した終止コドンを含む終止エレメントの設計を説明するものである。
終止コドンのコンテクスト及び終止コドン機能に対するその影響に関連する相当な文献を考慮し（Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ，（２０１５）ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １２（９）：９５０－９５８に概説されている）、終止コドンカセット（終止コドン及びそのヌクレオチドコンテクストとして定義される）もまた、ｍＲＮＡ半減期に影響を与える可能性があると仮定した。この可能性を評価するため、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡについて、ｍＲＮＡ半減期中央値（Ｔａｎｉ Ｈ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（５）：９４７－９５６）を算出した。異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡ間で半減期中央値に実質的かつ有意な差があり、連続する終止コドンに関するものは、半減期中央値が最も低いことと関連していた（図１１Ａ～１１Ｂ）。これらのデータに基づいて、いくつかの新規な終止コドンエレメントを、実施例９に記載した３´ＵＴＲスクリーニングからの蛍光レポーターで試験した。
いくつかのレポーター及び細胞型全体にわたり、計算モデリングによるｍＲＮＡ半減期の増加によって駆動された全体発現量は、中程度（約１．５ｘ）であるが一貫して増加したことが認められた（図１１Ｃに例示）。これらの新規な終止エレメントの概要を表９に示す。また、この表には、終止コドンに対する各位置における単一のヌクレオチドを、ｍＲＮＡ半減期との相関について個別に評価した、別のバイオインフォマティクス分析により導出した終止コドンカセットも含まれる（Ｃ７、Ｃ９、図１１Ｄ～１１Ｆ）。
実施例１１：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、希少疾患に関連している。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ１１、Ｃ３、参照終止エレメント（Ｃ１）、及びコントロールである。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。標的タンパク質レベルは、指定の時点でイムノブロットによって評価した。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、希少疾患に関連している。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ１１、Ｃ３、参照終止エレメント（Ｃ１）、及びコントロールである。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。標的タンパク質レベルは、指定の時点でイムノブロットによって評価した。
図１２に示すように、ＨｅｐＧ２細胞において、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して、インビトロでの中程度のタンパク質レベル増加と関連していた。
実施例１２：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、希少疾患に関連している。要約すると、マウスに、３種の終止エレメント（アルファ）または図の説明文に指し示される修飾終止エレメントを有するｍＲＮＡを投与した。肝臓におけるコードされたタンパク質の発現量を、投与後２日目及び８日目にイムノブロットにより測定し、ローディングコントロール及びコードされたタンパク質の内在性発現量に対して正規化した。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ８、または参照終止エレメントである。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、希少疾患に関連している。要約すると、マウスに、３種の終止エレメント（アルファ）または図の説明文に指し示される修飾終止エレメントを有するｍＲＮＡを投与した。肝臓におけるコードされたタンパク質の発現量を、投与後２日目及び８日目にイムノブロットにより測定し、ローディングコントロール及びコードされたタンパク質の内在性発現量に対して正規化した。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ８、または参照終止エレメントである。
図１３に示すように、マウス肝臓では、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して、２日目及び８日目におけるインビボでのタンパク質レベルの増加と関連していた。
実施例１３：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされるレポータータンパク質の発現量
本実施例は、緑色蛍光タンパク質をコードする配列及び異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる該緑色蛍光タンパク質の発現量を説明するものである。
本実施例は、緑色蛍光タンパク質をコードする配列及び異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる該緑色蛍光タンパク質の発現量を説明するものである。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞に、参照終止エレメント、Ｃ６終止エレメント、Ｃ４終止エレメント、またはＣ３終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物を（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によって）トランスフェクトし、蛍光をＩｎｃｕｃｙｔｅで１時間ごとにモニタリングし、最終発現量値を全ての時点にわたる蛍光の合計とした。表１０に本実験の結果を示す。全ての値は、該参照終止エレメントに対するものである。
該蛍光レポータータンパク質の発現量は、試験した全ての終止エレメントで増加し、Ｃ４またはＣ３終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物からの発現量が最も多かった。
該蛍光レポータータンパク質の発現量は、試験した全ての終止エレメントで増加し、Ｃ４またはＣ３終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物からの発現量が最も多かった。
実施例１４：安定したテール及びタンパク質バリアント発現量
標的タンパク質を全長型及び切断型のそれぞれで発現させ、２４時間及び９６時間でのインビトロ発現量についてスクリーニングした。選択したｍＲＮＡ構築物を、ライゲーションにより修飾して、ポリ（Ａ）テールを安定化させた。ライゲーションは、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ（５´キャップ１、３´Ａ１００）、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴＣＥＰ、１０００ユニット／ｍＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ１、１ｍＭのＡＴＰ、２０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール８０００、及び５：１モル比の修飾オリゴ対ｍＲＮＡを使用して実施した。修飾オリゴは、５´－リン酸－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－（反転デオキシチミジン（ｉｄＴ））の配列を有する（配列番号１２８）（下記を参照されたい）。ライゲーション反応物を混合し、室温（約２２℃）で４時間インキュベートした。ｄＴ精製、逆相精製、ヒドロキシアパタイト精製、水への限外濾過、及び滅菌濾過により、安定テールｍＲＮＡを精製した。各ｍＲＮＡについてのライゲーション効率は、ライゲーションされたｍＲＮＡとライゲーションされていないｍＲＮＡとのＵＰＬＣ分離によって評価したとき、＞８０％であった。得られた安定なテール含有ｍＲＮＡは、３´末端にて、ポリＡ領域から開始する以下の構造を含有していた：Ａ１００－ＵＣＵＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１２４）－反転デオキシチミジン。
テールを安定化するための修飾オリゴ（５´－リン酸－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－（反転デオキシチミジン（配列番号１２８））：
標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物の各々を０．１ｕｇ／ｍＬの濃度でトランスフェクトし、タンパク質発現量をトランスフェクション２４時間後及び９６時間後に検査し、コントロールのトランスフェクションから得られた発現量と比較した。
標的タンパク質を全長型及び切断型のそれぞれで発現させ、２４時間及び９６時間でのインビトロ発現量についてスクリーニングした。選択したｍＲＮＡ構築物を、ライゲーションにより修飾して、ポリ（Ａ）テールを安定化させた。ライゲーションは、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ（５´キャップ１、３´Ａ１００）、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴＣＥＰ、１０００ユニット／ｍＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ１、１ｍＭのＡＴＰ、２０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール８０００、及び５：１モル比の修飾オリゴ対ｍＲＮＡを使用して実施した。修飾オリゴは、５´－リン酸－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－（反転デオキシチミジン（ｉｄＴ））の配列を有する（配列番号１２８）（下記を参照されたい）。ライゲーション反応物を混合し、室温（約２２℃）で４時間インキュベートした。ｄＴ精製、逆相精製、ヒドロキシアパタイト精製、水への限外濾過、及び滅菌濾過により、安定テールｍＲＮＡを精製した。各ｍＲＮＡについてのライゲーション効率は、ライゲーションされたｍＲＮＡとライゲーションされていないｍＲＮＡとのＵＰＬＣ分離によって評価したとき、＞８０％であった。得られた安定なテール含有ｍＲＮＡは、３´末端にて、ポリＡ領域から開始する以下の構造を含有していた：Ａ１００－ＵＣＵＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１２４）－反転デオキシチミジン。
テールを安定化するための修飾オリゴ（５´－リン酸－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－（反転デオキシチミジン（配列番号１２８））：
実施例１５：本明細書に開示されるｍＲＮＡエレメントを有する、免疫チェックポイントタンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡのインビボでの効果
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ及び／または安定化テールを有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ及び／または安定化テールを有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
要約すると、マウスに、該免疫チェックポイントタンパク質をコードし、図１４Ａ～１４Ｂに明記したｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。本実験では、該免疫チェックポイントタンパク質をコードするＯＲＦは、ＷＴ ＯＲＦまたはそのバリアント（ｖ１）のいずれかとした。コントロールとして、参照５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡまたは安定化テールを有さないｍＲＮＡのいずれかを使用した。投与２４時間後及び７２時間後にマウスを安楽死させ、脾臓及び肝臓を、ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベル評価のために処理した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。
図１４Ａ～１４Ｂは、本実験の結果を表している。該免疫チェックポイントタンパク質の発現量の増加は、該Ａ１ ５´ＵＴＲ単独、該安定化テール単独、または両方を有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスの脾臓（図１４Ａ）及び肝臓（図１４Ｂ）において認められた。該Ａ１ ５´ＵＴＲと該安定化テールの両方を有するｍＲＮＡを投与したマウスでは、タンパク質発現量のさらなる増加が示された。脾臓では、タンパク質発現の増加は、両方の時点で認められた。肝臓では、その効果は２４時間の時点でより顕著であった。
まとめると、このデータは、該Ａ１ ５´ＵＴＲが該免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を増加させることを示すものである。また、このデータは、該Ａ１ ５´ＵＴＲと安定化テールとの相乗効果により、タンパク質の発現量がさらに増加することを裏付けている。
実施例１６：各種ｍＲＮＡエレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質の樹状細胞におけるインビボ発現量
本実施例は、免疫チェックポイントタンパク質をコードし、本明細書に開示される５´ＵＴＲ及び／または安定化テールを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウス由来の樹状細胞における該免疫チェックポイントタンパク質の発現量を説明するものである。
本実施例は、免疫チェックポイントタンパク質をコードし、本明細書に開示される５´ＵＴＲ及び／または安定化テールを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウス由来の樹状細胞における該免疫チェックポイントタンパク質の発現量を説明するものである。
要約すると、マウスに、該免疫チェックポイントタンパク質をコードし、図１５に明記したｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。本実験では、該免疫チェックポイントタンパク質をコードするＯＲＦは、ＷＴ ＯＲＦまたはそのバリアントのいずれかとした。コントロールとして、参照５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡまたは安定化テールを有さないｍＲＮＡのいずれかを使用した。投与２４時間後及び７２時間後にマウスを安楽死させ、樹状細胞を、フローサイトメトリー解析用に単離した。ＧＧ配列を含むキャップを使用した。
図１５に示すように、該免疫チェックポイントタンパク質の発現量の増加は、該Ａ１ ５´ＵＴＲ単独、該安定化テール単独、または両方を有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスにおいて、投与２４時間後及び７２時間後に認められた。該Ａ１ ５´ＵＴＲと該安定化テールの両方を有するｍＲＮＡを投与したマウス由来の樹状細胞では、タンパク質発現量のさらなる増加が示された。
要約すると、このデータは、該Ａ１ ５´ＵＴＲがマウス樹状細胞における免疫チェックポイントタンパク質の発現量を、コントロールと比較して増加させることを示している。また、このデータは、該Ａ１ ５´ＵＴＲと安定化テールとの相乗効果により、タンパク質の発現量がさらに増加することを裏付けている。
実施例１７：Ａ１ ５´ＵＴＲ（ＧＡ配列を含むキャップとともに）及び／またはＢ１ ３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡのインビボでの効果
本実施例は、Ａ１ ５´ＵＴＲ（ＧＡ配列を含むキャップとともに）、Ｂ１で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１ ３´ＵＴＲ」）、または両方を有するｍＲＮＡによってコードされるホタルルシフェラーゼルミネセンス及び／または標的タンパク質のインビボ評価について説明するものである。
本実施例は、Ａ１ ５´ＵＴＲ（ＧＡ配列を含むキャップとともに）、Ｂ１で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１ ３´ＵＴＲ」）、または両方を有するｍＲＮＡによってコードされるホタルルシフェラーゼルミネセンス及び／または標的タンパク質のインビボ評価について説明するものである。
本実験のために、マウスに該標的タンパク質及びホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを同時投与した。該ｍＲＮＡ構築物は、該Ａ１ ５´ＵＴＲ（ＧＡ配列を含むキャップとともに）、Ｂ１ ３´ＵＴＲ、もしくは両方、または参照ＵＴＲのいずれかを有した。２４時間後、血清を採取し、ＥＬＩＳＡで標的タンパク質レベルを分析した。続いて、肝臓及び脾臓を解剖し、ルミネセンスについて分析した。
本実験の結果を図１６Ａ～１６Ｃに示す。該Ａ１ ５´ＵＴＲ（ＧＡ配列を含むキャップとともに）、Ｂ１ ３´ＵＴＲ、または両方のいずれかを有するｍＲＮＡを投与したマウスの脾臓及び肝臓では、コントロールと比較してルミネセンスの増加が示された。該Ａ１ ５´ＵＴＲ（ＧＡ配列を含むキャップとともに）及び該Ｂ１ ３´ＵＴＲの両方を有するｍＲＮＡ構築物では、脾臓（図１６Ａ）及び肝臓（図１６Ｂ）においてルミネセンスが最も高くなり、これは、両方のエレメントの相加効果を裏付けるものであった。同様の効果が、血清中の標的タンパク質発現量について認められた（図１６Ｃ）。
実施例１８：肺疾患モデルにおける各種ｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡの効果
本実施例は、ヒト気管支上皮細胞における標的タンパク質の活性を説明するものであり、該標的タンパク質は、図１７に示す各種エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる。
本実施例は、ヒト気管支上皮細胞における標的タンパク質の活性を説明するものであり、該標的タンパク質は、図１７に示す各種エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる。
要約すると、該標的タンパク質をコードし、明記したｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを、ヒトＣＦ気管支上皮細胞に投与した。本実験では、該標的タンパク質をコードする２つの異なるＯＲＦ：ｖ１及びｖ２を使用した。投与１８時間後、該標的タンパク質の活性を測定した。コントロールとして、細胞を２種類の標準治療薬：陽性コントロール１及び陽性コントロール２で処置した。本実施例では、ＧＧ配列を含むキャップを使用した。
図１７に示すように、Ｂ１で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１ ３´ＵＴＲ」）及びＡ１ ５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡ構築物では、コントロールと比較して、標的タンパク質機能が向上した。また、該Ａ１ ５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡ構築物でも、標的タンパク質機能の向上が認められた。まとめると、このデータから、該Ａ１ ５´ＵＴＲとＢ１ ３´ＵＴＲの併用効果により、標的タンパク質の発現量が増加することが実証された。
実施例１９：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡにおける終止コドンリードスルーの効果
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡにおける終止コドンリードスルーの効果について説明するものである。該ｍＲＮＡ構築物の設計図は、図１８Ａに示している。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、及びＣ３である。該ｍＲＮＡ構築物は、３´ＵＴＲ及びＴ２Ａをコードする配列によって分離された、赤色蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム及び緑色蛍光タンパク質オープンリーディングフレームを有する。試験した全ての終止エレメントは、該赤色蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム内に組み込んだ。該赤色蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム内に組み込まれた終止コドンを有さないｍＲＮＡ構築物をコントロールとして使用した。該ｍＲＮＡ構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によりＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。該赤色及び緑色蛍光タンパク質の発現からそれぞれ生じる赤色及び緑色蛍光シグナルを、リアルタイムＩｎｃｕｃｙｔｅによってモニタリングした。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡにおける終止コドンリードスルーの効果について説明するものである。該ｍＲＮＡ構築物の設計図は、図１８Ａに示している。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、及びＣ３である。該ｍＲＮＡ構築物は、３´ＵＴＲ及びＴ２Ａをコードする配列によって分離された、赤色蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム及び緑色蛍光タンパク質オープンリーディングフレームを有する。試験した全ての終止エレメントは、該赤色蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム内に組み込んだ。該赤色蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム内に組み込まれた終止コドンを有さないｍＲＮＡ構築物をコントロールとして使用した。該ｍＲＮＡ構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によりＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。該赤色及び緑色蛍光タンパク質の発現からそれぞれ生じる赤色及び緑色蛍光シグナルを、リアルタイムＩｎｃｕｃｙｔｅによってモニタリングした。
図１８Ｂに示すように、該赤色蛍光タンパク質は、試験した全ての終止エレメントでは、Ｈｅｌａ細胞において同等のレベルで発現したが、図１８Ｃ～１８Ｄに示すように、該緑色蛍光タンパク質の発現量は、Ｈｅｌａ細胞において実質的に低かった。同様に、図１８Ｅに示すように、該赤色蛍光タンパク質は、試験した全ての終止エレメントでは、ＨＥＫ２９３細胞において同等のレベルで発現したが、図１８Ｆ～１８Ｇに示すように、該緑色蛍光タンパク質の発現量は、ＨＥＫ２９３細胞において実質的に低かった。ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞におけるリードスルー率の推定値を、それぞれ図１８Ｈ～１８Ｇに示す。試験した終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物のいずれにおいても、バックグラウンドを超えて検出される緑色蛍光シグナルが欠如していることは、終止コドンリードスルーのエビデンスがないことを意味する。
実施例２０：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後及び４８時間後に、標的タンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後及び４８時間後に、標的タンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した。
図１９Ａ～１９Ｃに示すように、ＨｅＬａ細胞において、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して同等のインビトロでのタンパク質レベルと関連していた。同様に、図１９Ｄ～１９Ｆに示すように、ＨＥＫ２９３細胞において、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して同等のインビトロでのタンパク質レベルと関連していた。
実施例２１：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅＬａ細胞及びＨｅｐ３ｂ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後及び４８時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅＬａ細胞及びＨｅｐ３ｂ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後及び４８時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
図２０Ａに示すように、ＨｅＬａ細胞において、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して同等のインビトロでのタンパク質レベルと関連していた。同様に、図２０Ｂに示すように、Ｈｅｐ３ｂ細胞において、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して同等のインビトロでのタンパク質レベルと関連していた。
実施例２２：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量
本実施例は、本明細書に開示される終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。
本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）及びヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。要約すると、試験した終止エレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与した。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。コードされたｆｆＬｕｃタンパク質の発現量は、投与２４時間後に全身ルミネセンスイメージングで測定した。コードされたｈＥＰＯタンパク質の発現量は、投与１、３、及び７日後にＥＬＩＳＡで測定した。
図２１Ａに示すように、各試験終止エレメントは、２４時間で、該参照終止エレメントと比較して、同等であるかまたは増加したインビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。図２１Ｂ～２１Ｅに示すように、各試験終止エレメントは、１、３、及び７日目に、該参照終止エレメントと比較して、同等であるかまたは増加したインビボでの血清ｈＥＰＯタンパク質レベルと関連していた。
実施例２３：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量
本実施例は、本明細書に開示される終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量の増加を説明するものである。
本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）及びヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ｈＥＰＯ用に使用される３´ＵＴＲは、３ｘ ｍＩＲ－１４２結合部位を含有する。
要約すると、図２２Ａ～２２Ｅに指し示される試験終止エレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．２５ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与した。コードされたｆｆＬｕｃタンパク質の発現量は、投与１、２、３、４、及び５日後に、全身ルミネセンスイメージングで測定し、また、投与５日後に、エクスビボ（脾臓及び肝臓）ルミネセンスイメージングで測定した。コードされたｈＥＰＯタンパク質の発現量は、投与４日後にＥＬＩＳＡで測定した。
図２２Ａ～２２Ｂに示すように、各試験終止エレメントは、投与１、２、３、４、及び５日後に、該参照終止エレメントと比較して、同等であるかまたは増加したインビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。図２２Ｃ～２２Ｄに示すように、各試験終止エレメントは、投与５日後の肝臓及び脾臓において、該参照終止エレメントと比較して、同等であるかまたは増加したエクスビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。図２２Ｅに示すように、各試験終止エレメントは、４日目に、該参照終止エレメントと比較して、同等であるかまたは増加したインビボでの血清ｈＥＰＯタンパク質レベルと関連していた。
実施例２４：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、７２、及び９６時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、７２、及び９６時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
図２３Ａ～２３Ｄに示すように、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して同等であるかまたは増加したインビトロでの肝細胞島におけるタンパク質レベルと関連していた。
実施例２５：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、７２、及び９６時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、７２、及び９６時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
図２４Ａ～２４Ｄに示すように、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して同等であるかまたは増加したインビトロでの肝細胞島におけるタンパク質レベルと関連していた。
実施例２６：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）及びヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、４８、７２、及び９６時間後に、コードされたｆｆＬｕｃの発現量はルシフェラーゼアッセイで測定し、コードされたＥＰＯタンパク質の発現量はＥＬＩＳＡで測定した。
本実施例は、異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）及びヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、４８、７２、及び９６時間後に、コードされたｆｆＬｕｃの発現量はルシフェラーゼアッセイで測定し、コードされたＥＰＯタンパク質の発現量はＥＬＩＳＡで測定した。
図２５Ａ～２５Ｃに示すように、カニクイザル及びヒトＨｅｐａｔｏＰａｃにおいて、各試験終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して増加したインビトロでのルシフェラーゼ発現量と関連していた。図２５Ｄ～２５Ｅに示すように、カニクイザル及びヒトＨｅｐａｔｏＰａｃにおいて、試験終止エレメントの大多数は、該参照終止エレメントと比較して増加したインビトロでのｈＥＰＯタンパク質発現量と関連していた。特に、Ｃ８終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して、より長い半減期（ｆｆＬｕｃ）及びより高い発現量（ｈＥＰＯ）と関連していた。
実施例２７：異なるｍＲＮＡエレメントを有する、免疫チェックポイントタンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡのインビボでの効果
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ、終止エレメント、及び任意に３´安定化領域を有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ、終止エレメント、及び任意に３´安定化領域を有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
要約すると、マウスに、該免疫チェックポイントタンパク質をコードし、図２６Ａ～２７Ｃに明記したｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１である。該終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。本実施例で使用した３´安定化領域は、反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む。２つのＬＮＰ製剤（各々が式ＩＣに包含されるイオン化アミノ脂質、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む）を試験した。投与６、２４、及び７２時間後に、マウスを安楽死させ、樹状細胞をフローサイトメトリー解析用に単離し、脾臓及び肝臓を、ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベル評価のために処理した。
図２６Ａ～２６Ｂに示すように、該３´安定化領域（ｉｄＴ）を有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスでは、投与２４及び７２時間後に、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋細胞（樹状細胞）における該免疫チェックポイントタンパク質の発現量の増加が認められた。該３´安定化領域（ｉｄＴ）を有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスの肝臓（図２７Ａ）、脾臓（図２７Ｂ）及び血漿（図２７Ｃ）において、投与６、２４及び７２時間後に、該免疫チェックポイントタンパク質の発現量の増加が認められた。
実施例２８：異なるｍＲＮＡエレメントを有する、免疫チェックポイントタンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡのインビボでの効果
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ、終止エレメント、及び最適に３´安定化領域を有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ、終止エレメント、及び最適に３´安定化領域を有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
要約すると、マウスに、該免疫チェックポイントタンパク質をコードし、図２８Ａ～２９Ｄに明記したｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１１及びＡ１である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ４、Ｃ５、及びＣ７である。全終止エレメントを、該免疫チェックポイントタンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。本実施例で使用した３´安定化領域は、反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む。投与７２及び１２０時間後に、マウスを安楽死させ、樹状細胞をフローサイトメトリー解析用に単離し、脾臓及び肝臓を、ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベル評価のために処理した。
図２８Ａ～２８Ｂに示すように、Ｃ５及びＣ７終止エレメントは、マウスにおける投与７２時間及び１２０時間後の該免疫チェックポイントタンパク質の発現量の増加と関連していた。また、図２８Ａ～２８Ｂに示すように、該安定化テールを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスにおいて、投与７２時間及び１２０時間後に、該免疫チェックポイントタンパク質の発現量の増加が認められた。
Ｃ５またはＣ７終止エレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスの肝臓（図２９Ａ～２９Ｂ）及び脾臓（図２９Ｃ～２９Ｄ）において、投与７２時間及び１２０時間後に、該参照終止エレメントと比較して、該免疫チェックポイントタンパク質の同等であるかまたは増加した発現量が認められた。該３´安定化領域（ｉｄＴ）を有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを投与したマウスの肝臓（図２９Ａ～２９Ｂ）及び脾臓（図２９Ｃ～２９Ｄ）において、投与７２時間及び１２０時間後に、該免疫チェックポイントタンパク質の発現量が増加したことが認められた。
実施例２９：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質の発現量
本実施例は、本明細書に開示される終止エレメント、及び任意に３´安定化領域を有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される終止エレメント、及び任意に３´安定化領域を有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５及びＣ７である。全終止エレメントを、該免疫チェックポイントタンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。本実施例で使用した３´安定化領域は、反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを３Ｔ３線維芽細胞と共培養した肝細胞島または３Ｔ３線維芽細胞単独にトランスフェクトした。トランスフェクション２４、４８、７２、及び９６時間後に、コードされた免疫チェックポイントタンパク質の発現量をＥＬＩＳＡで測定した。
図３０Ａ～３０Ｃに示すように、ラット、カニクイザル及びヒトＨｅｐａｔｏＰａｃにおいて、Ｃ５及びＣ７終止エレメントは、該参照終止エレメントと比較して増加したインビトロでの免疫チェックポイントタンパク質発現量と関連していた。また、図３０Ａ～３０Ｃに示すように、該３´安定化領域を有するｍＲＮＡでは、免疫チェックポイントタンパク質の発現量がさらに増加することが示された。
実施例３０：異なる終止エレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質の発現量
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ、終止エレメント、及び任意に３´安定化領域を有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）における発現量を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ、終止エレメント、及び任意に３´安定化領域を有するｍＲＮＡによってコードされる免疫チェックポイントタンパク質のヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）における発現量を説明するものである。
４人のドナーに由来する新たに解凍したｈＰＢＭＣに、免疫チェックポイントタンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡをトランスフェクトした。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１１及びＡ１である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）、Ｃ５及びＣ７である。全終止エレメントを、該免疫チェックポイントタンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。本実施例で使用した３´安定化領域は、反転したチミジン（ｉｄＴ）を含む。トランスフェクション２４、４８、及び７２時間後に、該免疫チェックポイントタンパク質の発現量をフローサイトメトリーで測定した。
図３１Ａ～３１Ｃに示すように、Ｃ５及びＣ７終止エレメントは、ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞（樹状細胞）において、該参照終止エレメントと比較して増加した免疫チェックポイントタンパク質発現量と関連していた。また、図３０Ａ～３０Ｃに示すように、該３´安定化領域を有するｍＲＮＡでは、免疫チェックポイントタンパク質の発現量がさらに増加することが示された。
実施例３１：異なるｍＲＮＡエレメントを有する標的タンパク質をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡのインビボでの効果
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ及び終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲ及び終止エレメントを有するｍＲＮＡ構築物によってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量を説明するものである。
本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）及びヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１１（参照）、Ａ１及びＡ３である。本実施例で使用した終止エレメントは、Ｃ１（参照）及びＣ８である。全終止エレメントを、該標的タンパク質のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ内に組み込んだ。要約すると、マウスに、標的タンパク質をコードし、図３２Ａ～３２Ｆに明記したｍＲＮＡエレメントを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．２５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。コードされたｆｆＬｕｃタンパク質の発現量は、投与６時間、２日、及び４日後に、全身ルミネセンスイメージングで測定し、また、投与４日後に、エクスビボ（脾臓及び肝臓）ルミネセンスイメージングで測定した。コードされたｈＥＰＯタンパク質の発現量は、投与６時間、２日及び４日後にＥＬＩＳＡで測定した。
図３２Ａ～３２Ｂに示すように、試験５´ＵＴＲ／終止エレメントの組み合わせは、投与６時間、２日、及び４日後に、参照５´ＵＴＲ／終止エレメントの組み合わせと比較して、同等であるかまたは増加したインビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。また、図３２Ｃ～３２Ｄに示すように、該試験５´ＵＴＲ／終止エレメントの組み合わせは、投与４日後に、該参照５´ＵＴＲ／終止エレメントの組み合わせと比較して、同等であるかまたは増加したエクスビボでの肝臓及び脾臓におけるｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。図３２Ｅ～３２Ｆに示すように、該試験５´ＵＴＲ／終止エレメントの組み合わせは、投与６時間、２日、及び４日後に、該参照５´ＵＴＲ／終止エレメントの組み合わせと比較して、同等であるかまたは増加したインビボでの血清ｈＥＰＯタンパク質レベルと関連していた。
実施例３２：異なる３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、本明細書に開示される３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例で使用した標的タンパク質は、２つの緑色蛍光タンパク質である。本実施例で使用した３´ＵＴＲは、Ｂ１０で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１０ ３´ＵＴＲ」、参照）及びＢ１８で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１８ ３´ＵＴＲ」）である。該３´ＵＴＲを、該標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ内に組み込み、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。６０時間の経過において、標的タンパク質レベルを評価した。
図３３Ａ～３３Ｄに示すように、ＨｅＬａ細胞において、該Ｂ１８ ３´ＵＴＲは、該参照３´ＵＴＲと比較して増加したインビトロでのタンパク質レベルと関連していた。
実施例３３：異なる３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量
本実施例は、本明細書に開示される３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、本明細書に開示される３´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）及びヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。本実施例で使用した３´ＵＴＲは、Ｂ１０で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１０ ３´ＵＴＲ」、参照）及びＢ１８で構成される３´ＵＴＲ（「Ｂ１８ ３´ＵＴＲ」）である。マウスに、図３４Ａ～３４Ｂに明記した３´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．２５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。コードされたｆｆＬｕｃタンパク質の発現量は、投与６時間、１、２、及び４日後に全身ルミネセンスイメージングで測定した。コードされたｈＥＰＯタンパク質の発現量は、投与６時間、１、２、及び４日後にＥＬＩＳＡで測定した。
図３４Ａに示すように、該Ｂ１８ ３´ＵＴＲは、投与６時間、１、２、及び４日後に、該参照３´ＵＴＲと比較して増加したインビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。同様に、図３４Ｂに示すように、該Ｂ１８ ３´ＵＴＲは、投与６時間、１、２、及び４日後に、該参照３´ＵＴＲと比較して増加したインビボでの血清ｈＥＰＯタンパク質レベルと関連していた。
実施例３４：異なる５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質の発現量
本実施例は、異なる５´ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例は、異なる５´ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。
本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２６、Ａ２７、及びＡ１１（参照）である。該５´ＵＴＲを、該標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ内に組み込み、ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。投与５、２４、３０、４８、７２、９６、及び１２０時間後に、標的タンパク質レベルをルシフェラーゼアッセイで評価した。
図３５Ａ～３５Ｂに示すように、ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞において、少なくともＡ２０、Ａ２６、Ａ１５、及びＡ１８ ５´ＵＴＲは、該参照５´ＵＴＲと比較して増加したインビトロでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。
実施例３５：異なる５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のインビボ発現量
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１２、Ａ１４、Ａ２０、Ａ２６、Ａ２７、Ａ１５及びＡ１１（参照）である。
本実施例は、本明細書に開示される５´ＵＴＲを有するｍＲＮＡによってコードされる標的タンパク質のタンパク質発現量の増加を説明するものである。本実施例で使用した標的タンパク質は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）である。本実施例で使用した５´ＵＴＲは、Ａ１２、Ａ１４、Ａ２０、Ａ２６、Ａ２７、Ａ１５及びＡ１１（参照）である。
マウスに、図３６Ａ～３６Ｄに明記した５´ＵＴＲを有するＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。コードされたｆｆＬｕｃタンパク質の発現量は、投与２及び４日後に全身ルミネセンスイメージングで測定した。
図３６Ａに示すように、ほぼ全ての試験５´ＵＴＲは、投与２日後に、該参照５´ＵＴＲと比較して増加したインビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。図３６Ｂに示すように、全ての試験５´ＵＴＲは、投与４日後に、該参照５´ＵＴＲと比較して増加したインビボでのｆｆＬｕｃタンパク質レベルと関連していた。５日目に、肝臓及び脾臓を、エクスビボルミネセンスイメージング用に採取した。図３６Ｃのプロットは、該参照５´ＵＴＲと比較した、各種５´ＵＴＲに関連する肝細胞での発現量増加を表している。同様に、図３６Ｄのプロットは、該参照５´ＵＴＲと比較した、各種５´ＵＴＲに関連する脾臓細胞での発現量増加を表している。
実施例３６：ＬＮＰ組成物の調製
Ａ．ナノ粒子組成物の調製
細胞への治療薬及び／または予防薬の送達に使用するための安全かつ有効なナノ粒子組成物を検討するために、様々な製剤を調製し試験する。具体的には、ナノ粒子組成物の脂質成分における特定の要素及びその比率を最適化する。
Ａ．ナノ粒子組成物の調製
細胞への治療薬及び／または予防薬の送達に使用するための安全かつ有効なナノ粒子組成物を検討するために、様々な製剤を調製し試験する。具体的には、ナノ粒子組成物の脂質成分における特定の要素及びその比率を最適化する。
ナノ粒子は、一方は該治療薬及び／または予防薬を含有し、他方は該脂質成分を有する２つの流体流れの微少流体技術及びＴ字型接合部混合等の混合プロセスで製造することができる。
脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＣ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、もしくは（ＩＩＩａ８）、による脂質または非カチオン性ヘルパー脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能なＤＯＰＥ、もしくはＤＳＰＣ等）、ＰＥＧ脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能なＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られている１，２ジミリストイルｓｎグリセロールメトキシポリエチレングリコール等）、及びフィトステロール（任意にコレステロール等の構造脂質を含む）を、溶媒（例えば、エタノール）中、約、例えば、５０ｍＭの濃度で組み合わせることにより調製する。溶液は、例えば－２０℃で保管するために冷蔵しなくてはならない。脂質は、所望のモル比（例えば、以下の表１１を参照）が得られるように組み合わせ、水及びエタノールで希釈して、例えば、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの間の最終脂質濃度にする。表１１のフィトステロール＊は、フィトステロール、または任意でフィトステロールと構造脂質との組み合わせ（ベータ－フィトステロールとコレステロール等）を指す。
治療薬及び／または予防薬ならびに脂質成分を含むナノ粒子組成物は、該脂質溶液を該治療薬及び／または予防薬を含む溶液と、脂質成分対治療薬及び／または予防薬のｗｔ：ｗｔ比、約５：１～約５０：１で組み合わせることにより調製する。該脂質溶液は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体ベースシステムを用いて、約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速で、該治療薬及び／または予防薬溶液に急速に注入して、水対エタノール比、約１：１～約４：１の懸濁液を生成する。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、脱イオン水中０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡ溶液を緩衝液（例えば、ｐＨ３～４の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）で希釈して、原液を形成する。
ナノ粒子組成物を透析で処理することにより、エタノールを除去し、緩衝液交換を行うことができる。製剤を、分子量カットオフが１０ｋＤａのＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用い、一次生成物の２００倍の体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して、２回透析する。１回目の透析は、室温にて３時間行う。次いで、該製剤を４℃で一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通してガラスバイアルへ濾過し、圧着クロージャーで密閉する。通常、０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が得られる。
上記の方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。Ｔ字形接合部及び直接注入が挙げられるがこれらに限定されない代替的なプロセスを用いて同一のナノ沈殿を実現してもよい。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特性評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、ナノ粒子組成物の粒径、多分散指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を、粒径の測定においては１×ＰＢＳ中、及びゼータ電位の測定においては１５ｍＭのＰＢＳ中で測定することができる。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、ナノ粒子組成物の粒径、多分散指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を、粒径の測定においては１×ＰＢＳ中、及びゼータ電位の測定においては１５ｍＭのＰＢＳ中で測定することができる。
紫外可視分光法を用いて、ナノ粒子組成物の治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）濃度を測定することができる。１×ＰＢＳで希釈した１００μＬの製剤を４：１（ｖ／ｖ）のメタノールとクロロホルムの混合物９００μＬに加える。混合した後、その溶液の吸収スペクトルを、例えば、ＤＵ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）にて２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。該ナノ粒子組成物の治療薬及び／または予防薬濃度は、該組成物に使用されている該治療薬及び／または予防薬の吸光係数、及び波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度と、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値の差に基づいて計算することができる。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ナノ粒子組成物によるＲＮＡのカプセル化を評価することができる。サンプルをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で希釈して、濃度およそ５μｇ／ｍＬにする。該希釈サンプル５０μＬをポリスチレン製の９６ウェルプレートに移し、ＴＥ緩衝液５０μＬまたは２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液５０μＬのいずれかを該ウェルに加える。該プレートを温度３７℃で１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液で１：１００に希釈し、この溶液１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値をサンプルの各値から引き、遊離ＲＮＡのパーセンテージを、インタクトなサンプル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加しない）の蛍光強度を破壊サンプル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで特定する。
Ｃ．インビボ製剤試験
様々なナノ粒子組成物が治療薬及び／または予防薬をどのくらい効率的に標的細胞に送達するかをモニタリングするために、特定の治療薬及び／または予防薬（例えば、修飾ＲＮＡまたは天然に存在するＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を含む異なるナノ粒子組成物を調製し、げっ歯類集団に投与する。マウスに、脂質ナノ粒子製剤でのナノ粒子組成物を含む単回用量を、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、または腫瘍内に投与する。場合によっては、マウスに用量を吸入させてもよい。用量サイズは、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、１０ｍｇ／ｋｇは、マウスの体重１ｋｇにつき１０ｍｇの治療薬及び／または予防薬がナノ粒子組成物に含まれる用量であることを表す。また、ＰＢＳを含むコントロール組成物も用いてよい。
様々なナノ粒子組成物が治療薬及び／または予防薬をどのくらい効率的に標的細胞に送達するかをモニタリングするために、特定の治療薬及び／または予防薬（例えば、修飾ＲＮＡまたは天然に存在するＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を含む異なるナノ粒子組成物を調製し、げっ歯類集団に投与する。マウスに、脂質ナノ粒子製剤でのナノ粒子組成物を含む単回用量を、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、または腫瘍内に投与する。場合によっては、マウスに用量を吸入させてもよい。用量サイズは、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、１０ｍｇ／ｋｇは、マウスの体重１ｋｇにつき１０ｍｇの治療薬及び／または予防薬がナノ粒子組成物に含まれる用量であることを表す。また、ＰＢＳを含むコントロール組成物も用いてよい。
ナノ粒子組成物をマウスに投与したらすぐに、特定の製剤及びその用量の用量送達プロファイル、用量応答、及び毒性を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、生物発光イメージング、または他の方法によって測定することができる。ｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、経時的なタンパク質発現量を評価することもできる。評価用にげっ歯類から採取されるサンプルには、血液、血清、及び組織（例えば、筋肉内注射部位の筋肉組織及び内部組織）が含まれ得る。サンプル採取には、動物を安楽死させることが必要となり得る。
ｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物は、治療薬及び／または予防薬を送達するための様々な製剤の有効性及び有用性の評価に有用である。ｍＲＮＡを含む組成物の投与により誘導されてタンパク質の発現レベルがより高くなることは、ｍＲＮＡ翻訳及び／またはナノ粒子組成物のｍＲＮＡ送達がより高効率であることを指し示すことになる。非ＲＮＡ成分が翻訳機構自体に影響を与えるとは考えられていないため、タンパク質発現レベルがより高くなることは、所与のナノ粒子組成物による治療薬及び／または予防薬の送達効率が、他のナノ粒子組成物またはそれが存在しない場合と比べてより高いことを指し示していると思われる。
実施例３７：式（Ｉ）の例示的な化合物の合成
３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアート
ステップ１：３－ブチルヘプタ－２－エン酸エチルの合成
ＴＨＦ（１４ｍＬ）中の水素化ナトリウム（１．８３ｇ、４５．７ｍｍｏｌ）懸濁液に、トリエチルホスホノアセテート（９．０７ｍＬ、４５．７ｍｍｏｌ）を２０分かけて滴加し、混合物をガスの発生が止むまで（およそ３０分）室温で撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、５－ノナノン（６．０５ｍＬ、３５．２ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。反応物を徐々に室温に温め、還流下で２４時間撹拌させた。反応物を室温に冷却した後、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液でクエンチした。水相をジエチルエーテルで抽出し、有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０～２０％ ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製して、３－ブチルヘプタ－２－エン酸エチル（５．２７ｇ、２４．８ｍｍｏｌ、７１％）を油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ５．６２ （ｓ， １Ｈ）；４．１４ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．５９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．１４ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．５０－１．２３ （ｍ， １１Ｈ）；０．９９－０．８２ （ｍ， ６Ｈ）．
３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアート
ステップ１：３－ブチルヘプタ－２－エン酸エチルの合成
ステップ２：３－ブチルヘプタン酸エチルの合成
撹拌棒を備えたスチール製のＰａｒｒリアクターに、エタノール（５０ｍＬ）中の３－ブチルヘプタ－２－エン酸エチル（１０．５ｇ、４９．５ｍｍｏｌ）を充填した。炭素上の水酸化パラジウム（１．０４ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）を添加し、容器を密閉し、排気し、Ｈ２ガス（３ｘ）で再充填し、圧力を２００ｐｓｉに設定した。２００ｐｓｉのＨ２ガス下、室温で２時間、５００ｒｐｍで反応物を撹拌した。次いで、容器を排気し、Ｎ２ガスで再充填し、開口した。粗反応混合物をＣｅｌｉｔｅパッドで濾過した。ＣｅｌｉｔｅパッドをＥｔＯＨで洗浄し、粗物質を濃縮して、３－ブチルヘプタン酸エチル（９．６９ｇ、４５．２ｍｍｏｌ、９１％）を油状物として得た。当該化合物をさらに精製することなく次のステップに持ち込んだ。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．１２ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）；２．２２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．９０－１．７６ （ｍ， １Ｈ）；１．３８－１．１９ （ｍ， １５Ｈ）；０．８８ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ステップ３：３－ブチルヘプタン－１－オールの合成
０℃でＮ２下、乾燥エーテル（２３ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（８５０ｍｇ、２２．４ｍｍｏｌ）混合物に、乾燥エーテル（１５ｍＬ）中の３－ブチルヘプタン酸エチル（４．００ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を室温で２．５時間撹拌した後、０℃に冷却した。水（ＬｉＡｌＨ４ １ｇあたり１ｍＬ）を当該溶液に滴加し、続いて１５％水酸化ナトリウム（ＬｉＡｌＨ４ １ｇあたり１ｍＬ）及び水（ＬｉＡｌＨ４ １ｇあたり３ｍＬ）をゆっくりと添加した。当該溶液を室温で数分間撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅパッドで濾過した。Ｃｅｌｉｔｅパッドをジエチルエーテルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（０～４０％ ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製して、３－ブチルヘプタン－１－オール（３．１９ｇ、１８．５ｍｍｏｌ、９９％）を油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ３．６６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．５３ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．４６－１．３６ （ｍ， １Ｈ）；１．３５－１．２１ （ｍ， １２Ｈ）；１．１８ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；０．８９ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ステップ４：３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアートの合成
塩化メチレン（３２ｍＬ）中の３－ブチルヘプタン－１－オール（３．１９ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）、８－ブロモオクタン酸（４．９６ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（４５３ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）溶液に、ＥＤＣＩ（５．３３ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、１０％塩酸溶液（１５０ｍＬ）を２０分かけてゆっくりと添加した。層を分離し、有機層を真空中で濃縮して、粗油状物を得た。油状物をヘキサン（１５０ｍＬ）中に溶解させ、アセトニトリル（１５０ｍＬ）と５％炭酸水素ナトリウム（１５０ｍＬ）の混合物で洗浄した。ヘキサン層を分離し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過した。溶媒を真空下で除去して、３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアート（６．９０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ、９９％）を油状物として得た。当該化合物をさらに精製することなく次のステップに持ち込んだ。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．４０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．８５ （五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．６９－１．５２ （ｍ， ４Ｈ）；１．４９－１．２０ （ｍ， １９Ｈ）；０．８９ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアートの合成
塩化メチレン中のヘプタデカン－９－オール、８－ブロモオクタン酸、及びＤＭＡＰ溶液に、ＥＤＣを添加して、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアートを得た。
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアートの合成
３－ペンチルオクチル８－ブロモオクタノアート
ステップ１：３－ペンチルオクタ－２－エン酸エチルの合成
ＴＨＦ（１６ｍＬ）中の水素化ナトリウム（２．１３ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）懸濁液に、トリエチルホスホノアセテート（１０．６ｍＬ、５３．４ｍｍｏｌ）を２０分かけて滴加し、混合物をガスの発生が止むまで（およそ３０分）室温で撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、６－ウンデカノン（８．４２ｍＬ、４１．１ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。反応物を徐々に室温に温め、還流下で６０時間撹拌させた。反応物を室温に冷却した後、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液でクエンチした。水相をジエチルエーテルで抽出し、有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（０～２０％ ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製して、３－ペンチルオクタ－２－エン酸エチル（８．７６ｇ、３６．５ｍｍｏｌ、８９％）を油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ５．６１ （ｓ， １Ｈ）；４．１４ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．５８ （ｄｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ９．０， ９．０， ６．０ Ｈｚ）；２．１３ （ｄｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０， ６．０， ３．０ Ｈｚ）；１．５２－１．３８ （ｍ， ３Ｈ）；１．３８－１．２３ （ｍ， １２Ｈ）；０．９３－０．８６ （ｍ， ６Ｈ）．
ステップ１：３－ペンチルオクタ－２－エン酸エチルの合成
ステップ２：３－ペンチルオクタン酸エチルの合成
撹拌棒を備えたスチール製のＰａｒｒリアクターに、エタノール（３７ｍＬ）中の３－ペンチルオクタ－２－エン酸エチル（８．７６ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を充填した。炭素上の水酸化パラジウム（７６８ｍｇ、５．４７ｍｍｏｌ）を添加し、容器を密閉し、排気し、Ｈ２ガス（３ｘ）で再充填し、圧力を２００ｐｓｉに設定した。２００ｐｓｉのＨ２ガス下、室温で２時間、５００ｒｐｍで反応物を撹拌した。次いで、容器を排気し、Ｎ２ガスで再充填し、開口した。粗反応混合物をＣｅｌｉｔｅパッドで濾過した。ＣｅｌｉｔｅパッドをＥｔＯＨで洗浄し、粗物質を濃縮して、３－ペンチルオクタン酸エチル（８．４５ｇ、３４．９ｍｍｏｌ、９６％）を油状物として得た。当該化合物をさらに精製することなく次のステップに持ち込んだ。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．１２ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．９２－１．７７ （ｂｒ． ｍ， １Ｈ）；１．３７－１．１９ （ｍ， １９Ｈ）；０．８８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ステップ３：３－ペンチルオクタン－１－オールの合成
０℃でＮ２下、乾燥エーテル（４２ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（１．５９ｇ、４１．８ｍｍｏｌ）混合物に、乾燥エーテル（２８ｍＬ）中の３－ペンチルオクタン酸エチル（８．４５ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を室温で２．５時間撹拌した後、０℃に冷却した。水（ＬｉＡｌＨ４ １ｇあたり１ｍＬ）を当該溶液に滴加し、続いて１５％水酸化ナトリウム（ＬｉＡｌＨ４ １ｇあたり１ｍＬ）及び水（ＬｉＡｌＨ４ １ｇあたり３ｍＬ）をゆっくりと添加した。当該溶液を室温で数分間撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅパッドで濾過した。Ｃｅｌｉｔｅパッドをジエチルエーテルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（０～４０％ ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製して、３－ペンチルオクタン－１－オール（６．９８ｇ、３４．９ｍｍｏｌ、１００％）を油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ３．６６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．５３ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．４７－１．３７ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；１．３６－１．１５ （ｍ， １７Ｈ）；０．８８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ステップ４：３－ペンチルオクチル８－ブロモオクタノアートの合成
塩化メチレン（１８ｍＬ）中の３－ペンチルオクタン－１－オール（２．００ｇ、９．９８ｍｍｏｌ）、８－ブロモオクタン酸（２．６７ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（２４４ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）溶液に、ＥＤＣＩ（２．８７ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、１０％塩酸溶液（７０ｍＬ）を２０分かけてゆっくりと添加した。層を分離し、有機層を真空中で濃縮して、粗油状物を得た。油状物をヘキサン（７０ｍＬ）中に溶解させ、アセトニトリル（７０ｍＬ）と５％炭酸水素ナトリウム（７０ｍＬ）の混合物で洗浄した。ヘキサン層を分離し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過した。溶媒を真空下で除去して、３－ペンチルオクチル８－ブロモオクタノアート（３．９４ｇ、９．７２ｍｍｏｌ、９７％）を油状物として得た。当該化合物をさらに精製することなく次のステップに持ち込んだ。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．４０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．２９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．８５ （五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．６８－１．５２ （ｍ， ４Ｈ）；１．４９－１．１９ （ｍ， ２３Ｈ）；０．８８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
３－ペンチルオクチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート
３－ペンチルオクチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアートの合成
ＥｔＯＨ（３８ｍＬ）中のＮ－（３－アミノプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１５．５ｇ、８８．８ｍｍｏｌ）溶液に、ＥｔＯＨ（３６ｍＬ）中の３－ペンチルオクチル８－ブロモオクタノアート（６．００ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を２０分にわたって添加した。反応物を６０℃に加熱し、この温度で１６時間撹拌させた。冷却後すぐに溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチルで希釈し、水層に白色沈殿物が観察されなくなるまでＮａＨＣＯ３飽和水溶液及びブライン（５Ｘ）で洗浄した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０～５～１０～２５～５０～１００％（ジクロロメタン中の１％ ＮＨ４ＯＨ、２０％ ＭｅＯＨ混合物）で精製して、３－ペンチルオクチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート（４．２３ｇ、８．４９ｍｍｏｌ、５７％）を油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ５．１７ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；４．０７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．１９ （ｂｒ． ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．６６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．５６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．７０－１．５２ （ｍ， ６Ｈ）；１．５１－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）；１．４４ （ｓ， ９Ｈ）；１．３６－１．１９ （ｍ， ２２Ｈ）；０．８８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
３－ペンチルオクチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアートの合成
３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオン
３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオンの合成
ジエチルエーテル１００ｍＬ中の３，４－ジメトキシ－３－シクロブテン－１，２－ジオン（１ｇ、７ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＨＦ中の２Ｍメチルアミン溶液（３．８ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）を添加すると、ほぼ同時に沈殿物が形成された。混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで濾過し、濾過固形物をジエチルエーテルで洗浄し、風乾した。濾過固形物を熱いＥｔＯＡｃ中に溶解させ、濾過し、濾液を室温まで冷却させ、次いで０℃まで冷却させて沈殿物を得た。これを濾過して単離し、冷たいＥｔＯＡｃで洗浄し、風乾し、次いで真空下で乾燥して、３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオン（０．７０ｇ、５ｍｍｏｌ、７３％）を固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ： ｐｐｍ ８．５０ （ｂｒ． ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６９ Ｈｚ）；４．２７ （ｓ， ３Ｈ）；３．０２ （ｓｄｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ４２ Ｈｚ， ４．５ Ｈｚ）．
３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオンの合成
３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアート
ステップ１：ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアートの合成
ＥｔＯＨ（５ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（１０ｇ、２１．６７ｍｍｏｌ）及びエタノールアミン（３９．７０ｇ、６４９．９６ｍｍｏｌ）溶液を６５℃まで１６時間加熱した。反応物を室温に冷却し、酢酸エチルに溶解させ、水（４Ｘ）で抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ中０～１００％（２０％ ＭｅＯＨ、８０％ ＤＣＭ、１％ ＮＨ４ＯＨ溶液）によるフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）で精製して、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアート（７．８５ｇ、８２％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．０６分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ３に対し４４２．６８９． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；３．６６ （ｔ， ２Ｈ）；２．７９ （ｔ， ２Ｈ）；２．６３ （ｍ， ２Ｈ）；２．３０ （ｔ， ２Ｈ）；１．７７－１．２０ （ｍ， ４０Ｈ）；０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．
ステップ１：ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアートの合成
ステップ２：化合物２２：３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアートの合成
ＣＰＭＥ（１５ｍＬ）とアセトニトリル（６ｍＬ）の混合物中の３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアート（６．１５ｇ、１６．３１ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアート（６．８６ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）溶液に、炭酸カリウム（８．５９ｇ、６２．１２ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２．８４ｇ、１７．０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を７７℃で１６時間撹拌させた。反応物を冷却及び濾過し、揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ中０～１００％（２０％ ＭｅＯＨ、８０％ ＤＣＭ、１％ ＮＨ４ＯＨ溶液）によるフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）で精製して、３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノアート（４．５３ｇ、３７．８％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ３．０４分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ４６Ｈ９１ＮＯ５に対し７３９．４６４． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；４．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｂｍ， ２Ｈ）；２．７３－２．３９ （ｍ， ６Ｈ）；２．３０ （ｍ， ４Ｈ）；１．７２－１．１７ （ｍ， ６４Ｈ）；０．９２ （ｍ， １２Ｈ）．
３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート
ステップ１：ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアートの合成
ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）中のＮ－（３－アミノプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（３４．３５ｇ、１９７．１５ｍｍｏｌ）溶液を６５℃に加熱し、ＥｔＯＨ（９０ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（２６ｇ、５６．３３ｍｍｏｌ）溶液を３時間かけて添加した。反応物を６５℃で３時間加熱した。反応物を＜５０℃に冷却し、ＥｔＯＨを真空下で蒸発させ、ヘプタン（４Ｘ）と共沸させた。２－ＭｅＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の粗生成物溶液に、５％ Ｋ２ＣＯ３（１５０ｍＬ）を添加し、得られた混合物を１０分間撹拌した。２つの層を形成させた。水層を除去し、２－ＭｅＴＨＦ層を１００ｍＬの水（ｘ３）で洗浄した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ中０～１００％（２０％ ＭｅＯＨ、８０％ ＤＣＭ、１％ ＮＨ４ＯＨ溶液）によるフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）で精製して、ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート（２０ｇ、６３．９％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．３４ 分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ３３Ｈ６６Ｎ２Ｏ４に対し５５５．３１９． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ５．１８ （ｂｓ， １Ｈ）；４．８９ （ｐ， １Ｈ）；３．２２ （ｍ， ２Ｈ）；２．６４ （ｔ， ２Ｈ）；２．５９ （ｔ， ２Ｈ）；２．３０ （ｔ， ２Ｈ）；１．７３－１．２１ （ｍ， ５０Ｈ）；０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．
ステップ１：ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアートの合成
ステップ２：３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアートの合成
プロピオニトリル（５２ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート（１１．７６ｇ、２１．１９ｍｍｏｌ）及び３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアート（９．２ｇ、２４．３７ｍｍｏｌ）溶液に、炭酸カリウム（４．３９ｇ、３１．７９ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（０．５３ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８０℃で１６時間加熱した。反応物を冷却及び濾過し、揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ中０～１００％（２０％ ＭｅＯＨ、８０％ ＤＣＭ、１％ ＮＨ４ＯＨ溶液）によるフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）で精製して、３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（９．６８ｇ、５３．６％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ３．０７分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ５２Ｈ１０２Ｎ２Ｏ６に対し８５１．２１６． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ５．６８ （ｂｓ， １Ｈ）；４．９０ （ｐ， １Ｈ）；４．１１ （ｔ， ２Ｈ）；３．２０ （ｍ， ２Ｈ）；２．５２－２．２４ （ｍ， １０Ｈ）；１．７６－１．２０ （ｍ， ７４Ｈ）；０．９０ （ｍ， １２Ｈ）．
ステップ３：３－ブチルヘプチル８－（（３－アミノプロピル）（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアートの合成
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（７ｇ、８．２２ｍｍｏｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（９．４ｍＬ、１２３．３２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌させた。反応物を真空下で蒸発させた。残渣をメチルＴＨＦ／ヘプタン（１：９）の混合物中に溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム（３Ｘ）で抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させて、３－ブチルヘプチル８－（（３－アミノプロピル）（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアートを得た。これを粗製物として、さらに精製することなく次のステップに移した。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．６３分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ４７Ｈ９４Ｎ２Ｏ４に対し７５１．３０５．
ステップ４：化合物２７：３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアートの合成
メチルＴＨＦ（３１ｍＬ）中の３－ブチルヘプチル８－（（３－アミノプロピル）（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（７ｇ、９．３２ｍｍｏｌ）溶液に、３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオン（１．７１ｇ、１２．１１ｍｍｏｌ）、及び１０％炭酸水素ナトリウム（８．６ｍＬ、１０．２５ｍｍｏｌ）水溶液を添加した。反応物を５０℃で２．５時間撹拌させた。反応物を室温に冷却し、ヘプタンで希釈し、水で抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ中０～１００％（２０％ ＭｅＯＨ、８０％ ＤＣＭ、１％ ＮＨ４ＯＨ溶液）によるフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）で精製して、３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート（５．４ｇ、６３％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．９８分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ５２Ｈ９７Ｎ３Ｏ６に対し８６１．７１４． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；４．１０ （ｔ， ２Ｈ）；３．７５ （ｍ， ２Ｈ）；３．３９－３．２０ （ｍ， ５Ｈ）；３．０８ （ｍ， ４Ｈ）；２．３１ （ｍ， ４Ｈ）；２．１２ （ｂｍ， ２Ｈ）；１．８１－１．２０ （ｍ， ６５Ｈ）；０．９０ （ｍ， １２Ｈ）．
ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアート
ステップ１：ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアートの合成
プロピオニトリル（３０ｍＬ）中の３－ペンチルオクチル８－ブロモオクタノアート（５．６１ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）及び３－ペンチルオクチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート（６．００ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）溶液に、炭酸カリウム（２．４９ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（３００ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８０℃で１６時間撹拌させた。室温に冷却した後すぐに、反応混合物を真空濾過で濾過した。容器内の残渣及び漏斗上の濾過ケーキをプロピオニトリルで２回洗浄した。次いで、濾液を４０℃にて減圧下で濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０～５～１０～２０～２５～３０～３５～４０～５０～８０～１００％（ジクロロメタン中の１％ ＮＨ４ＯＨ、２０％ ＭｅＯＨ混合物）で精製して、ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアート（７．３７ｇ、８．９５ｍｍｏｌ、７４％）を油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ５．６６ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；４．０８ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．１７ （ｂｒ． ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．４３ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．３４ （ｂｒ． ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）；１．６７－１．５２ （ｍ， １０Ｈ）；１．４８－１．３７ （ｍ， １４Ｈ）；１．３５－１．１７ （ｍ， ４５Ｈ）；０．８８ （ｔ， １２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ステップ１：ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアートの合成
ステップ２：ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－アミノプロピル）アザンジイル）ジオクタノアートの合成
撹拌棒を備えた丸底フラスコに、ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアート（３．００ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を添加した。当該油状物をシクロペンチルメチルエーテル（８ｍＬ）中に溶解させ、５分間撹拌した。シクロペンチルメチルエーテル中の３Ｍ ＨＣｌ（６．０７ｍＬ、１８．２ｍｍｏｌ）を滴加した。添加完了後、反応物を４０℃に１時間加熱し、反応完了をＴＬＣ／ＬＣＭＳ分析でモニタリングした。反応物を室温に冷却し、次いで０℃に冷却した。次いで、１０％ Ｋ２ＣＯ３溶液を反応混合物に滴加した。添加完了後、水性／シクロペンチルメチルエーテルエマルジョンをＥｔＯＡｃで希釈し、得られた混合物を１０分間撹拌した。溶液を分離漏斗に移し、層を分離した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。残渣をヘプタン中に再溶解させ、ＭｅＣＮで２回洗浄した。ヘプタン層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮して、粗ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－アミノプロピル）アザンジイル）ジオクタノアート（２．４３ｇ、３．３６ｍｍｏｌ、９２％）を油状物として得た。当該粗物質をさらに精製することなく次のステップに持ち込んだ。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．９８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．７１ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．５４ （ｂｒ． ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．７６ （ｂｒ． 五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ）；１．６６－１．５２ （ｍ， ９Ｈ）；１．５２－１．４３ （ｍ， ４Ｈ）；１．３７－１．１８ （ｍ， ４５Ｈ）；０．８８ （ｔ， １２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
ステップ３：化合物３０：ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアートの合成
撹拌棒を備えた丸底フラスコに、ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－アミノプロピル）アザンジイル）ジオクタノアート（２．４３ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）、３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオン（６１６ｍｇ、４．３６ｍｍｏｌ）及び２－メチルＴＨＦ（１０ｍＬ）を添加した。１０％ Ｋ２ＣＯ３溶液（１０ｍＬ）を添加し、得られた二相性混合物を４５℃に加熱し、３時間激しく撹拌した。反応の完了は、ＴＬＣ／ＬＣＭＳ分析によってモニタリングした。完了後すぐに、混合物を室温に冷却させた。反応物を水で希釈し、層を分離し、水層をヘプタンで２回抽出した。有機物を合わせ、水（３ｘ）、ブライン、及び１：１アセトニトリル／水混合液で洗浄した。次いで、合わせた有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣をＤＣＭ及びＭｅＯＨで３回共沸させ、濃縮して、淡黄色の粗ワックス状油状物を得た。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０～１００％（ジクロロメタン中の１％ ＮＨ４ＯＨ、２０％ ＭｅＯＨ混合物））で精製して、ビス（３－ペンチルオクチル）８，８´－（（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）アザンジイル）ジオクタノアート（２．１１ｇ、２．５４ｍｍｏｌ、７６％）を固体として得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．７９分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ５０Ｈ９３Ｎ３Ｏ６に対し８３２．３４． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ７．８３ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；７．６１ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；４．０３ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）；３．６４ （ｂｒ． ｓ， ２Ｈ）；３．２８ （ｂｒ． ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．４６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）；２．３３ （ｂｒ． ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．３３ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）；１．７４ （ｂｒ． 五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．６２－１．４７ （ｍ， ８Ｈ）；１．４１－１．１２ （ｍ， ５０Ｈ）；０．８３ （ｔ， １２Ｈ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ）．
３－ブチルヘプチル８－（（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート
ステップ１：３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアートの合成
シクロペンチルメチルエーテル（９ｍＬ）及びアセトニトリル（ａｃｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）（９ｍＬ）中の３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノアート（７９４ｍｇ、２．１１ｍｍｏｌ）及び３－ペンチルオクチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノアート（１．００ｇ、２．０１ｍｍｏｌ）溶液に、炭酸カリウム（１．６６ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（３６６ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８０℃で１６時間撹拌させた。冷却後すぐに、揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０～５～１０～２５～５０～１００％（ジクロロメタン中の１％ ＮＨ４ＯＨ、２０％ ＭｅＯＨ混合物））で精製して、３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート（８９６ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ、５６％）を油状物として得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．９５分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ４８Ｈ９４Ｎ２Ｏ６に対し７９５．５９．
ステップ１：３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアートの合成
ステップ２：３－ブチルヘプチル８－（（３－アミノプロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアートの合成
塩化メチレン（２３ｍＬ）中の３－ブチルヘプチル８－（（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート（８９６ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（１．７２ｍＬ、２２．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で４時間撹拌させた。反応物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０～５～１０～２５～５０～１００％（ジクロロメタン中の１％ ＮＨ４ＯＨ、２０％ ＭｅＯＨ混合物））で精製して、３－ブチルヘプチル８－（（３－アミノプロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート（６３２ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ、８１％）を油状物として得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．４７分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ４３Ｈ８６Ｎ２Ｏ４に対し６９５．６８．
ステップ３：化合物５４：３－ブチルヘプチル８－（（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアートの合成
エタノール（８ｍＬ）中の３－ブチルヘプチル８－（（３－アミノプロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート（６３２ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）溶液に、３－メトキシ－４－（メチルアミノ）シクロブタ－３－エン－１，２－ジオン（１９２ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６７℃で２０時間撹拌させた。２０時間後、反応物を室温に冷却し、ジエチルエーテルで希釈した。有機物をブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０～５～１０～２５～５０～１００％（ジクロロメタン中の１％ ＮＨ４ＯＨ、２０％ ＭｅＯＨ混合物））で精製して、３－ブチルヘプチル８－（（３－（（２－（メチルアミノ）－３，４－ジオキソシクロブタ－１－エン－１－イル）アミノ）プロピル）（８－オキソ－８－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート（２４０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、３３％）を固体として得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．６７分． ＭＳ （ＥＳ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） Ｃ４８Ｈ８９Ｎ３Ｏ６に対し８０４．２２． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ７．３８ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；７．０３ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；４．０７ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．６５ （ｂｒ． ｓ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．２７ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．５２ （ｂｒ． ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．４０ （ｂｒ． ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．７５ （ｂｒ． 五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．６７－１．５１ （ｍ， ８Ｈ）；１．４７－１．１７ （ｍ， ４６Ｈ）；０．９３－０．８２ （ｍ， １２Ｈ）．
他の実施形態
本開示は、その発明を実施するための形態とともに説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図し、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書に記載される全ての参照文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
本開示は、その発明を実施するための形態とともに説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図し、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書に記載される全ての参照文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
Claims (127)
- ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）であって、
（ａ）配列番号１の配列またはそのバリアントもしくは断片を含む５´ＵＴＲ、
（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、を含む前記ポリヌクレオチド。 - 前記５´ＵＴＲは、式Ａの核酸配列：
ＧＧＡＡＡＵＣＧＣＡＡＡＡ（Ｎ２）Ｘ（Ｎ３）ＸＣＵ（Ｎ４）Ｘ（Ｎ５）ＸＣＧＣＧＵＵＡＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＧＵＵＵＵＣＵＮ６Ｎ７ＣＡＡＣＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＵＣＧＣＣ（Ｎ８ＣＣ）ｘ（配列番号４６）を含み、
式中、
（Ｎ２）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝３または４）である；
（Ｎ３）ｘはグアニンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ４）ｘはシトシンであり、ｘは０～１の整数である；
（Ｎ５）ｘはウラシルであり、ｘは０～５の整数（例えば、ｘ＝２または３）である；
Ｎ６はウラシルもしくはシトシンである；
Ｎ７はウラシルもしくはグアニンである、及び／または
Ｎ８はアデニンもしくはグアニンであり、ｘは０～１の整数である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号１のバリアントは、配列番号１に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のウリジン含量で構成される、請求項１または３に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む、請求項１、または３～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、少なくとも２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１２、４～１２、５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、１１～１２、２～６、または３～５個の連続したウリジンを少なくとも含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、４個の連続したウリジンを含む、請求項１または３～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントにおける前記ポリウリジントラクトは、５個の連続したウリジンを含む、請求項１または３～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のポリウリジントラクトを含む、請求項１または３～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントは、３つのポリウリジントラクトを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントは、４つのポリウリジントラクトを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１のバリアントは、５つのポリウリジントラクトを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
- １つ以上の前記ポリウリジントラクトは、異なるポリウリジントラクトに隣接している、請求項１または３～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、互いに隣接している（例えば、前記ポリウリジントラクトの全てが連続している）、請求項１または３～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- １つ以上の前記ポリウリジントラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている、請求項１または３～１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリウリジントラクトの各々（例えば、全て）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０または６０個のヌクレオチドによって分離されている、請求項１または３～１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 第１のポリウリジントラクト及び第２のポリウリジントラクトは、互いに隣接している、請求項１または３～１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲは、コザック配列（例えば、ＧＣＣＲＣＣヌクレオチド配列（配列番号４３）、ここで、Ｒはアデニンまたはグアニンである）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲは、配列番号１の配列または配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲは、配列番号４１の配列もしくは配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲは、配列番号４２の配列もしくは配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、配列番号４２の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、前記ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）する、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または請求項１～２１のいずれか１項に記載の５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、請求項２２～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
- 前記活性の増加は、５´ＵＴＲを有さない、異なる５´ＵＴＲを有する、または請求項１に記載の５´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。 - 請求項２９に記載のポリヌクレオチドであって、前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、任意選択で、前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含み、任意選択で、前記３´ＵＴＲは、ＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号９１または９２の配列）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。 - 請求項１～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列（例えば、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれか）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。 - 前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む、及び／または前記３´ＵＴＲは、ＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む、請求項３２または３３に記載のポリヌクレオチド。
- ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、
（ｂ）表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメントを含むコード領域、及び
（ｃ）３´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、を含む前記ポリヌクレオチド。 - 前記終止エレメントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６の配列を含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ｂ）のコード領域は、式Ｂ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号３７）
（式中、
Ｘ１は、ＧもしくはＡである；
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６もしくはＸ７は、それぞれ独立してＣもしくはＵである；
Ｘ３は、ＣもしくはＡである；
Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ－１もしくはＸ－３は、それぞれ独立してＣもしくはＧである；
Ｘ９は、ＧもしくはＵである；及び／または
Ｘ－２は、ＡもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。 - 前記（ｂ）のコード領域は、式Ｃ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ｇ－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５６）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２、Ｘ３、もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；
Ｘ１は、ＡもしくはＧである；及び／または
Ｘ１０もしくはＸ１１は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。 - 前記（ｂ）のコード領域は、式Ｄ：
Ｘ－３－Ｘ－２－Ｘ－１－Ｕ－Ａ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２（配列番号５７）
（式中、
Ｘ－３、Ｘ－１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１０は、それぞれ独立してＧもしくはＣである；
Ｘ－２もしくはＸ９は、それぞれ独立してＡもしくはＵである；
Ｘ１もしくはＸ４は、それぞれ独立してＡもしくはＧである；
Ｘ５もしくはＸ８は、それぞれ独立してＡもしくはＣである；及び／または
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１もしくはＸ１２は、それぞれ独立してＣもしくはＵである）のコンセンサス配列を含む終止エレメントを含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。 - 前記コンセンサス配列は、ＧＣ含量が高い（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％のＧＣ含量）、請求項３６～３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、前記ポリヌクレオチドの半減期が約１．５～２０倍増加）する、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または請求項３４～３７のいずれか１項に記載の終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドの前記半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、請求項４０または４１に記載のポリヌクレオチド。
- 前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）が増加する、請求項３４～４２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドの前記レベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）の増加は、ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、発現の産生量または持続時間）を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）に従って測定される、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
- 前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が約１．５～２０倍増加する、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
- 前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、検出可能なレベルまたは活性）が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、約１．５～２０倍増加する、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
- 前記終止エレメントにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベルまたは活性が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１４日間、検出可能になる、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
- 前記増加は、終止エレメントを有さない、異なる終止エレメントを有する、または請求項３４～３９のいずれか１項に記載の終止エレメントを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、請求項３８～４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項３４～４８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項３４～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
- 請求項５１に記載のポリヌクレオチドであって、前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。 - 前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む、及び／または前記３´ＵＴＲは、ＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項３４～５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｃ）の３´ＵＴＲは、表２に示されている３´ＵＴＲ配列もしくは表２に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表２に示されている３´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、表４に示されている配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチド。 - 請求項５４に記載のポリヌクレオチドであって、前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含み、
任意選択で、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４７、４８、４９、５０、１２２、５２、５３、５４、５５、５９、６０、６１、１２６、１２７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、前記ポリヌクレオチド。 - 前記３´ＵＴＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項５４または５５に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号３８～４０のいずれか１つの配列）を含む、及び／または前記３´ＵＴＲは、ＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの、例えば、配列番号９１または９２の配列）を含む、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
- ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）５´ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載のもの）、
（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載のもの）を含むコード領域、及び
（ｃ）配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるコア配列またはその断片を含む３´ＵＴＲ、を含む前記ポリヌクレオチド。 - 前記３´ＵＴＲコア配列は、前記（ｂ）の終止エレメントのすぐ下流に配置される、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲコア配列は、前記ポリヌクレオチドのＣ末端部に配置される、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
- コア配列を含む前記３´ＵＴＲは、第１のフランキング配列を含む、請求項５８～６０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- コア配列を含む前記３´ＵＴＲは、第２のフランキング配列を含む、請求項５８～６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- コア配列を含む前記３´ＵＴＲは、第１のフランキング配列及び第２のフランキング配列を含む、請求項６１または６２に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第１のフランキング配列は、約５～２５、約５～２０、約５～１５、約５～１０、約１０～２５、約１５～２５、約２０～２５ヌクレオチドの配列を含む、請求項６１～６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第１のフランキング配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド（例えば、１１ヌクレオチド）の配列を含む、請求項６１～６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第２のフランキング配列は、約２０～８０、約２０～７５、約２０～７０、約２０～６５、約２０～６０、約２０～５５、約２０～５０、約２０～４５、約２０～４０、約２０～３５、約２０～３０、約２０～２５、約２５～８０、約３０～８０、約３５～８０、約４０～８０、約４５～８０、約５０～８０、約５５～８０、約６０～８０、約６５～８０、約７０～８０または約７５～８０ヌクレオチドの配列を含む、請求項６１～６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第２のフランキング配列は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ヌクレオチド（例えば、３９ヌクレオチド）の配列を含む、請求項６１～６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第１のフランキング配列は、前記コア配列の上流かまたは下流にある、請求項６１～６７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第２のフランキング配列は、前記コア配列の上流かまたは下流にある、請求項６１～６７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の断片（例えば、配列番号１１の５ヌクレオチド（ｎｔ）、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、または７０ｎｔ断片）を含む、請求項５８～６９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の６０ｎｔ断片から構成される１５～２５ｎｔ断片を含む、請求項５８～７０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、配列番号４５の配列またはその断片（例えば、配列番号４５の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項５８～７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、配列番号１１の配列またはその断片（例えば、配列番号１１の最初の１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項５８～７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドの半減期が増加（例えば、前記ポリヌクレオチドの半減期が、例えば、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ（例えば、本明細書に開示される実施例のいずれか１つに記載のアッセイ）により測定して、約１．５～１０倍増加）する、請求項５８～７３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲにより、ポリヌクレオチドの平均半減期スコアが１０を超える、請求項７４に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲにより、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドのレベル及び／または活性（例えば、産生量）が増加する、請求項５８～７３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記増加は、３´ＵＴＲを有さない、異なる３´ＵＴＲを有する、または請求項７６に記載の３´ＵＴＲを有さない、他の類似のポリヌクレオチドと比較される、請求項７４～７６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／またはＴＥＮＴリクルート配列（例えば、本明細書に記載のもの）を含む、請求項５８～７７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０もしくはそれらの組み合わせのｍｉＲＮＡ結合部位、及び／または配列番号９１もしくは９２の配列を含むＴＥＮＴリクルート配列を含む、請求項７８に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７または８つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含む、請求項７８または７９に記載のポリヌクレオチド。
- 前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、同一または異なるｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている５´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項５８～８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項８２に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメント配列を含む、請求項５８～８３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７）を含む、請求項８４に記載のポリヌクレオチド。
- （ｉ）前記（ａ）の５´ＵＴＲは、表１に示されている５´ＵＴＲ配列もしくは表１に示されている３´ＵＴＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、表１に示されている５´ＵＴＲ配列の最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、及び
（ｉｉ）前記（ｂ）の終止エレメントは、表３に示されている終止エレメント配列を含む、請求項５８～８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記５´ＵＴＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８８、配列番号８９もしくは配列番号９０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列、またはその断片（例えば、前述した配列のいずれかにおける最初の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを欠く断片）を含む、請求項８６に記載のポリヌクレオチド。
- 前記（ｂ）のコード領域は、表３に示されている終止エレメントから選択される終止エレメント（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６２、配列番号９３または配列番号９６）を含む、請求項５８～８１または８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドの前記コード領域は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、または細胞間タンパク質を含む、請求項８９に記載のポリヌクレオチド。
- 前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの成分、バリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選択される、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
- 前記治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも１つの５´キャップ構造（例えば、本明細書に記載のもの）及び／またはポリＡテール（例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含み、任意選択で、前記ポリＡテールは、１個以上の非アデノシン残基（例えば、１個以上のグアノシン）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記５´キャップ構造は、
- ３´安定化領域（例えば、安定化テール、例えば、本明細書に記載のもの）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´安定化領域は、ポリＡテール（例えば、８０～１５０個、例えば、１２０個のアデニンを含むポリＡテール（配列番号１２３））を含み、任意選択で前記ポリＡテールは、１個以上の非アデノシン残基（例えば、１個以上のグアノシン）を含む、請求項９５に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリＡテールは、ＵＣＵＡＧ配列（配列番号４４）を含む、請求項９５または９６に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリＡテールは、配列番号４４の上流に約８０～１２０個（例えば、１００個）のアデニンを含む、請求項９７に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリＡテールは、配列番号４４の下流に約１～４０個（例えば、２０個）のアデニンを含む、請求項９７または９８に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´安定化領域は、少なくとも１つの代替ヌクレオシドを含み、任意選択で、前記代替ヌクレオシドは、反転したチミジン（ｉｄＴ）である、請求項９５～９９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記３´安定化領域は、式ＶＩＩの構造：
- 前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを構成する、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド。
- 前記化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４´－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２´－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、請求項１０２または１０３に記載のポリヌクレオチド。
- 先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
- 請求項１０５に記載のＬＮＰ組成物を含む、医薬組成物。
- 請求項１０５または１０６に記載のＬＮＰ組成物を含む、細胞。
- 細胞におけるペイロード（例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロード）の発現量を増加させる方法であって、請求項１０５または１０６に記載のＬＮＰ組成物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
- 請求項１０５または１０６に記載のＬＮＰ組成物を細胞に送達する方法。
- インビトロ、インビボまたはエクスビボで、前記細胞を前記ＬＮＰ組成物と接触させることを含む、請求項１０９に記載の方法。
- 疾患または障害（例えば、本明細書に記載のもの）を有する対象に、請求項１０５または１０６に記載のＬＮＰ組成物を送達する方法。
- 対象における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１０５または１０６に記載のＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 疾患もしくは障害の処置方法、予防方法、またはその症状の予防方法であって、それを必要とする対象に、請求項１０５または１０６に記載のＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化脂質（例えば、アミノ脂質）、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、請求項１０５～１１３のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記イオン化脂質は、アミノ脂質を含む、請求項１１４に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記イオン化脂質は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＣ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）のいずれかの化合物を含む、請求項１１４または１１５に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記イオン化脂質は、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩａ）の化合物、または式（ＩＩｅ）の化合物を含む、請求項１０５～１１６のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣからなる群から選択される化合物を含む、請求項１０５～１１７のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記リン脂質は、ＤＳＰＣ（例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物）である、請求項１０５～１１８のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記構造脂質は、アルファ－トコフェロール、β－シトステロールまたはコレステロールから選択される、請求項１０５～１１９のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０５～１２０のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、請求項１０５～１２１のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記ＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）または式（ＶＩ－Ｄ）から選択される化合物である、請求項１０５～１２１のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン化脂質、５～２５％のリン脂質、２５～５５％のコレステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比で構成される、請求項１０５～１２３のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、肺または経口送達用に製剤化される、請求項１０５～１２４のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記対象は、哺乳類（例えば、ヒト）である、請求項１０５～１２５のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
- 前記対象は、本明細書に開示される疾患または障害を有する、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載の方法、またはＬＮＰ組成物。
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