EA039775B1 - Терапевтические олигонуклеотиды для лечения или профилактики заболеваний, характеризующихся альтернативным удлинением теломер - Google Patents

Терапевтические олигонуклеотиды для лечения или профилактики заболеваний, характеризующихся альтернативным удлинением теломер Download PDF

Info

Publication number
EA039775B1
EA039775B1 EA201890379A EA201890379A EA039775B1 EA 039775 B1 EA039775 B1 EA 039775B1 EA 201890379 A EA201890379 A EA 201890379A EA 201890379 A EA201890379 A EA 201890379A EA 039775 B1 EA039775 B1 EA 039775B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
cells
seq
oligonucleotide
lna
Prior art date
Application number
EA201890379A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201890379A1 (ru
Inventor
Фабрицио Д'Адда Ди Фаганья
Франческа Россьелло
Джулио Агуадо
Кори Джоунз-Вейнерт
Original Assignee
Ифом - Фондационе Иституто Фирк Ди Онколоджа Молеколаре
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ифом - Фондационе Иституто Фирк Ди Онколоджа Молеколаре filed Critical Ифом - Фондационе Иституто Фирк Ди Онколоджа Молеколаре
Publication of EA201890379A1 publication Critical patent/EA201890379A1/ru
Publication of EA039775B1 publication Critical patent/EA039775B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Abstract

Изобретение относится к олигонуклеотиду, включающему одну из нижеследующих последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID NO: 1, (TAGGGT) SEQ ID NO: 2, (AGGGTT) SEQ ID NO: 3, (GGGTTA) SEQ ID NO: 4, (GGTTAG) SEQ ID NO: 5 или (GTTAGG) SEQ ID NO: 6 или комплементарную им последовательность или их фрагмент или вариант или смесь для применения в целях лечения и/или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер, или неракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломеры, и к родственным фармацевтическим композициям и родственной фармацевтической композиции и к способу.

Description

FRANCESCA SANTAMBROGIO ET AL.: MicroRNA-dependent regulation of telomere maintenance mechanisms: a field as much unexplored as potentially promising, CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, vol. 20, no. 41, 1 December 2014 (2014-12-01), pages 6404-6421, ХР055241065, NL ISSN: 1381-6128, 001:10.2174/1381612820666140630095918, the whole document
I. DRASKOVIC AND A. LONDONOVALLEJO: Telomere recombination and the ALT pathway: a therapeutic perspective for cancer, CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, vol. 20, no. 41, 1 December 2014 (2014-12-01), pages 6466-6471, ХР055241057, NL ISSN: 1381-6128, D01:10.2174/1381612820666140630085857, the whole document
M. ARMANIOS AND E.H. BLACKBURN: The telomere syndromes, NATURE REVIEWS GENETICS, vol. 13, no. 10, 11 September 2012 (2012-09-11), pages 693-704, ХР055241805, GB ISSN: 1471-0056, DOI: 10.1038/nrg3246, the whole document
039775 Bl
E.K. BENSON ET AL.: Role of progerininduced telomere dysfunction in HGPS premature cellular senescence, JOURNAL OF CELL SCIENCE, vol. 123, no. 15, 6 July 2010 (2010-07-06), pages 2605-2612, XP055241815, GB ISSN: 0021-9533, DOI: 10.1242/jcs.067306, the whole document (57) Изобретение относится к олигонуклеотиду, включающему одну из нижеследующих последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID NO: 1, (TAGGGT) SEQ ID NO: 2, (AGGGTT) SEQ ID NO: 3, (GGGTTA) SEQ ID NO: 4, (GGTTAG) SEQ ID NO: 5 или (GTTAGG) SEQ ID NO: 6 или комплементарную им последовательность или их фрагмент или вариант или смесь для применения в целях лечения и/или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер, или неракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломеры, и к родственным фармацевтическим композициям и родственной фармацевтической композиции и к способу.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, включающему одну из нижеследующих последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID No: 1, (TAGGGT) SEQ ID No: 2, (AGGGTT) SEQ ID No: 3, (GGGTTA) SEQ ID No: 4, (GGTTAG) SEQ ID No: 5 или (GTTAGG) SEQ ID No: 6 или комплементарную им последовательность или их фрагмент или вариант или смесь для применения в целях лечения и/или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер, или не-ракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломеры, и к родственным фармацевтическим композициям и к родственной фармацевтической композиции, а также к способу.
Предшествующий уровень техники
ДНК представляет собой клеточную молекулу уникального типа которая, при ее повреждении не может быть заменена. Так называемый ответ на повреждение ДНК (DDR) представляет собой координированную серию эволюционно консервативных событий, которые, в случае их запуска после детектирования повреждения ДНК, прекращают клеточный цикл (функция сверочной точки повреждения ДНК) и координируют репарацию ДНК (Jackson and Bartek, 2009). Повреждение ДНК является физиологическим событием. Старение и рак у млекопитающих, вероятно, представляют собой два наилучших примера, характерирующихся аккумуляцией поврежденной ДНК, активацией DDR и их последствиями. Был сделан значительный вклад в понимании взаимодействия DDR при старении и при раке (d'Adda di Fagagna, 2008; Jackson and Bartek, 2009).
Совсем недавно авторы настоящего изобретения обнаружили и сообщили, что полная активация DDR зависит от молекул РНК. Авторами было отмечено, что двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) запускают локальное продуцирование некодирующих РНК в сайте повреждения ДНК, несущем последовательность, окружающую поврежденный участок. Авторами было также обнаружено, что эти РНК (обозначенные DD-PHK) необходимы для активации DDR. Действительно, удаление DD-PHK посредством обработки РНКазой А ингибирует активацию DDR, и DDR может быть полностью восстановлен путем добавления химически синтезированный DD-PHK, несущей последовательность, окружающую поврежденный участок, но не другие последовательности (Francia et al., 2012).
Несколько исследований показали, что функции РНК могут быть ингибированы с использованием ингибирующих антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), которые действуют путем спаривания с РНКмишенями и таким образом нарушают их функции. Использование этих нуклеотидов было успешным в клинической стадии (Janssen et al., 2013; Li and Rana, 2014; Monteleone et al., 2015; Stenvang et al., 2012). Раковые клетки должны сохранять длину теломеры и противодействовать природному укорачиванию теломер для сохранения своего неограниченного пролиферативного потенциала. Большинство раковых клеток приобретает это свойство посредством реактивации экспрессии теломеразы, то есть фермента, который удлиняет короткие теломеры. Однако 10-15% всех человеческих опухолей, в большинстве случаев, но не исключительно, остеосаркомы, саркомы мягких тканей, первичные опухоли головного мозга, мультиформные глиобластомы (МГБ) и нейробластомы поддерживают длину теломеры посредством так называемого альтернативного механизма удлинения теломер (ALT) на основе гомологичной рекомбинации (HR) среди теломер (Cesare and Reddel, 2010; Durant, 2012; Henson and Reddel, 2010).
Хотя ALT-опухоли могут нести различные генетические мутации, приводящие к развитию трансформированных и злокачественных состояний, однако, было обнаружено, что большинство раковых ALT-клеток имеют мутации в генах DAXX и ATRX, что позволяет классифицировать эти опухоли как ALT с помощью общих генетических анализов (Heaphy et al., 2011).
До сих пор ничего не сообщалось о механизмах ALT в здоровых/нормальных клетках (Cesare and Reddel, 2010). Однако сообщалось, что механизмы ALT помимо раковых клеток, наблюдаются также в EBV-инфицированных клетках (Kamranvar et al., 2013), что еще раз подтверждает вероятность того, что такие механизмы могут запускаться и другими вирусными инфекциями.
Применение ингибиторов теломеразы в терапии рака было широко исследовано (Ruden and Puri, 2013); однако природным ограничением этого метода является отсутствие теломеразной активности в опухолях, которое может приводить к отбору ALT-позитивных клонов, как сообщалось в литературе (Hu et al., 2012). Другими словами, до сих пор ничего не сообщалось о превращении ALT в теломеразные механизмы сохранения теломеры.
ALT-клетки обнаруживают хроническую активацию DDR в теломерах, что указывает на дисфункциональную природу теломер в таких клетках. В особых случаях, короткие/нефункциональные теломеры затем удлиняются/репарируются по механизму DDR, участвующему в HR-путях. ALTассоциированные тельца PML (АРВ) содержат теломерную ДНК и DDR-факторы и являются известными биомаркерами ALT-клеток (Cesare and Reddel, 2010; Yeager et al., 1999). HR представляет собой механизм репарации ДНК как часть DDR, и было показано, что он необходим для сохранения теломер в ALTклетках. Комплекс MRN (MRE11/RAD50/NBS1) является ключевым фактором DDR, участвующим в HRпути. Действительно, его инактивация благодаря сверхэкспрессии ингибирующего белка SP100 или нокдауну, опосредуемому короткой шпилькой, определяет ингибирование сохранения теломеры, в частности, в ALT-позитивных клетках (Jiang et al., 2005; Jiang et al., 2007; Zhong и др., 2007). Истощение комплекса SMC5/6, опосредуемое интерференцией РНК, стимулирует HR-опосредуемую репарацию DSB,
- 1 039775 что приводит к укорочению теломеры и к старению ALT-клеток (Potts and Yu, 2007). RPA связывается с одноцепочечной ДНК во время начальной фазы HR, и euj подавление посредством интерференции РНК приводит к ослаблению ALT-активности (Jiang et al., 2007). Совсем недавно было обнаружено, что низкомолекулярный ингибитор ATR предотвращает рост клеток, а в частности, ALT-позитивных клеток (Flynn et al., 2015), хотя такая специфичность может быть более широкой, включая раковые не-ALT клетки, и действует только в комбинации с ингибиторами СНК1 (Sanjiv et al., 2016). В соответствии с этим, в другом недавно появившемся сообщении было высказано предположение, что специфичность ингибиторов ATR для клеток такого типа больше ассоциируется с конфлюэнтностью клеток, чем с механизмом сохранения теломер (http://biorxiv.org/content/early/2016/06/04/053280).
Ингибирование DDR и последующие события рекомбинации в теломерах в ALT-клетках могут быть взяты за основу для лучшего понимания новых потенциальных терапевтических способов лечения рака. В соответствии с этим, как упоминалось выше, было высказано предположение, что ALT-клетки являются в высокой степени чувствительными к ингибированию ATR-киназы (Flynn et al., 2015), то есть, белка, участвующего в передаче сигнала DDR при репарации ДНК с помощью HR, хотя его специфичность пока еще остается под вопросом (Sanjiv et al., 2016) и (http://biorxiv.org/content/early/2016/06/04/053280).
Аналогичным образом, состояние, характеризующееся повреждением теломерной ДНК и часто приводящее к прогерическому фенотипу (преждевременному старению), предположительно ассоциируется с генерированием DD-PHK, имеющей теломерную последовательность.
WO 2013/167744 относится к небольшим молекулам РНК (DD-PHK), продуцируемым в сайте повреждения ДНК и имеющим специфическую последовательность поврежденного локуса. Присутствие и продуцирование DD-PHK из теломер в клетках, имеющих ALT, таких как раковые ALT-клетки, или в EBV-инфицированных ALT-клетках, или в клетках в условиях преждевременного старения, не было описано ранее, и не было высказано предположение, что ингибирование DD-PHK может представлять собой терапевтически эффективный способ.
WO 2014092609 относится к способу влияния на пролиферативный статус клеток с использованием специфических олигонуклеотидных последовательносей G-цепи человеческой теломерной ДНК.
В US 2013065950 описаны соединения, содержащие олигонуклеотидную часть, ковалентно связанную с липидной частью. Олигонуклеотидная часть содержит последовательность, комплементарную РНК-компоненту теломеразы человека. Эти соединения ингибируют активность теломеразы в клетках.
WO 97/38013 не относится конкретно ни к заболеванию (в частности, к раку), характеризующемуся альтернативным удлинением теломер (ALT), ни к не-раковому состоянию, характеризующемуся дисфункциональными теломерами. Кроме того, эта заявка относится к ингибированию теломеразы. В противоположность этому олигонуклеотиды согласно изобретению не являются активными в раковых клетках, позитивных по теломеразе.
WO 2006/107949 относится к способу лечения расстройств, вызываемых окислительным стрессом. Настоящее изобретение относится к специфической терапии состояний, ассоциированных с раковыми ALT-клетками, и не-раковых состояний, характеризующихся дисфункциональными теломерами.
CN 1936011 относится к антисмысловому олигонуклеотидному соединению, содержащему поликатионный липосомный теломерный фермент, и это соединение состоит из поликатионной липосомы и антисмыслового олигонуклеотида.
WO 2006028160 относится к фосфотиоатному олигонуклеотидному конъюгату, который обладает высокой ингибирующей активностью в отношении теломеразы, содержащейся в человеческом экстракте лейкозных клеток, и который дает стабильный гибридный дуплекс с комплементарной ДНК.
US 2006183704 относится к способам лечения гиперпролиферативных расстройств, включая рак, путем введения млекопитающему, страдающему такими расстройствами, эффективного количества композиции, содержащей pTT, или композиции, содержащей один или более олигонуклеотидов, нуклеотидная последовательность которых по меньшей мере на 50% идентична нуклеотидной последовательности выступающего повтора человеческой теломеры.
WO 01/74342 относится к способам лечения или профилактики гиперпролиферативных заболеваний или предраковых состояний, влияющих на эпителиальные клетки, таких как псориаз, витилиго, атопический дерматит, гиперпролиферативные или УФ-дерматозы, гиперпролиферативные или аллергические заболевания других эпителиев, и к способам снижения фотостарения или окислительного стресса или профилактики или снижения вероятности развития рака кожи.
В WO 96/23508 раскрывается способ ингибирования прогрессирования рака и других патологических состояний, ассоциированных с иммортализованными клетками. Этот способ включает введение синтетических олигонуклеотидов, которые имитируют мотивы теломеры.
В публикации Sandra Sampl et al. (Proceedings: AACR Annual Meeting 2014; April 5-9, 2014; Abstract 2743, San Diego, CA) указано, что РНК-транскрипты теломер, обозначаемые TERRA, были идентифицированы как транскрипты, блокирующие теломеразную активность (TA), вероятно, посредством прямого связывания с TERC.
TERRA представляет собой конститутивную одноцепочечную некодирующую РНК, длина которой составляет приблизительно от 100 оснований и по меньшей мере до 9 т.п.н. (Azzalin et al., 2007). Они
- 2 039775 транскрибируются из промотора, расположенного в субтеломерной области, таким образом, что они несут субтеломерные и G-богатые теломерные последовательности. Другими словами, DD-PHK представляют собой короткие РНК (длиной по меньшей мере 6 или 8 нуклеотидов или от 10 до 50 нуклеотидов, а приблизительно 22 нуклеотида), которые могут образовывать двухцепочечные РНК. Эти РНК продуцируются посредством процессинга транскриптов-предшественников, которые транскрибируются на обеих теломерных цепях, образуя молекулы РНК, содержащие G-богатые и C-богатые теломерные повторы, начинающиеся с самого конца теломер или в пределах теломерных повторов.
Следовательно, потребность в лечении заболеваний, характеризующихся альтернативным удлинением теломер, и не-раковых состояний, ассоциированных с дисфункцией теломер, все еще остается актуальной.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что при повреждении теломерных ДНК или при их дисфункции, аккумулируются некодирующие РНК (обозначаемые tDDRNA). Эти РНК представляют собой РНК-транскрипты, синтезированные с использованием дисфункциональной теломеры в качестве матрицы для транскрипции длинного РНК-предшественника, который может быть затем процессирован ферментами Dicer и/или Drosha с образованием более коротких некодирующих РНК (tDDRNA).
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что ингибиторы генерирования и/или синтеза и/или функций tDDRNA и их предшественников также ингибируют активацию DDR и, таким образом, могут быть применены для лечения ALT-ассоциированных состояний и состояний, ассоциированных с повреждением теломерной ДНК или ее дисфункцией.
Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), например, в форме блокированных нуклеиновых кислот (LNA), комплементарных tDDRNA и/или их предшественникам, были синтезированы вместе с LNA, содержащими неродственные последовательности в качестве негативного контроля. Было отмечено, что теломерные ASO могут специфически ингибировать активацию DDR, и тем самым ингибировать передачу сигнала и последующую репарацию ДНК.
С использованием последовательность-специфических ASO были получены результаты, указывающие на снижение уровня пролиферации клеток, а в частности, ALT-клеток.
Активация теломерного DDR в ALT-опухолях может быть достигнута с помощью последовательность-специфических ASO, что будет приводить к укорочению теломер и к снижению пролиферации. Авторами настоящего изобретения были синтезированы LNA-ASO с последовательностью, комплементарной теломерным РНК, генерируемым при повреждении или дисфункции ДНК теломеры. Авторами было обнаружено, что трансфекция олигонуклеотида ASO, несущего специфическую теломерную последовательность, способна значительно подавлять пролиферацию ALT-позитивных клеточных линий (т.е., клеточных линий U-2 OS остеосаркомы и G2 92, клеточных линий GBM14 глиобластомы, фибробластов WI38 VA13 и SW26), а такое же количество ASO с другой последовательностью, не нацеленной на теломерную РНК и не нацеленной на любую человеческую последовательность, не дает значимого эффекта. Важно отметить, что ни один из этих ASO не влияет на пролиферацию нормальных человеческих фибробластов (мезенхимального происхождения, таких как остеосаркомы) или на пролиферацию позитивных по теломеразе раковых клеток, протестированных параллельно, что позволяет предположить, что такой подход является специфичным для ALT-опухолей и указывает на то, что такое лечение будет не токсичным для животных и человека.
На этом этапе уже были получены:
1) идентифицированное новое потенциальное терапевтическое средство;
2) определенная специфическая субсерия опухолей, которые могут поддаваться лечению с помощью этого средства. Кроме того, старение ассоциируется с активацией DDR, в частности в теломерах (d'Adda di Fagagna et al., 2003;. Fumagalli et al., 2012;. Herbig et al., 2006;. Herbig et al., 2004; Hewitt et al., 2012). Прогерический синдром Хатчинсона-Гилфорда (HGPS) (Pollex and Hegele, 2004) является одним из примеров синдрома старения, вызываемого мутантной формой ламина А, также называемого прогерином. Прогерия означает преждевременное старение. Прогерические фенотипы HGPS могут подавляться посредством экспрессии теломеразы за счет снижения индуцированной прогерином передачи сигнала повреждения ДНК (Kudlov et al., 2008). Это указывает на то, что прогерический HGPS-фенотип клеток (и пациентов с HGPS при их пролиферации) вызывается дисфункциональными теломерами, стимулирующими DDR. Действительно, DDR обнаруживается в теломерах клеток HGPS (Benson et al., 2010; Chojnowski et al., 2015). Рыбы Danio rerio (рыбы-зебры) представляют собой простую модель позвоночных, подходящую для исследования старения. Действительно, было показано, что мутация теломеразы ускоряет физиологическое старение за счет ускорения укорочения теломеры и последующей дисфункции теломеры и активации DDR (Henriques et al., 2013). В частности, мутантные по теломеразе рыбы отличаются более короткой продолжительностью жизни, атрофией тканей и снижением фертильности. Они представляют собой модель не-ракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломеры. При использовании LNA-ASO с последовательностью, комплементарной tDDRNA и их предшественникам, генерируемым при повреждении ДНК теломеры или ее дисфункции, авторами изобретения было предот-
- 3 039775 вращено старение клеток, экспрессирующих прогерин. Кроме того, была увеличена продолжительность жизни мышей с моделью HGPS и рыбы-зебры с мутантной теломеразой, что позволяет предположить, что эти последовательности могут подавлять фенотипы, ассоциированные со старением.
В настоящем изобретении ингибирование DDR посредством ингибирования DD-PHK и/или их предшественников имеют большое преимущество, поскольку оно является последовательностьспецифическим и минимизирует вероятность нежелательных побочных эффектов в нормальных клетках, например, из-за ингибирования DDR теломер.
Кроме того, что касается противораковых терапевтических средств, то эти ингибиторы могут действовать синергически с ингибиторами теломеразы, предотвращая тем самым возможное появление клонов раковых клеток по ALT-механизму сохранения теломеры и, таким образом, являются резистентными к ингибированию теломеразы.
Действительно, уже существующие противораковые терапевтические средства являются эффективными противораковыми средствами, которые действуют посредством повреждения ДНК или ингибирования DDR в раковых клетках. Однако, активность повреждения ДНК или ингибирования DDR большинства из них не является последовательность-специфической. Олигонуклеотиды согласно изобретению ингибируют DDR по последовательность-специфическому механизму, а поэтому они могут также сообщать имеющимся препаратам для устранения повреждения ДНК последовательность-специфические свойства, что будет приводить к повышению эффективности.
Таким образом, настоящее изобретение относится олигонуклеотиду, содержащему одну из следующей последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID NO: 1, (TAGGGT) SEQ ID NO: 2, (AGGGTT) SEQ ID NO: 3, (GGGTTA) SEQ ID NO: 4, (GGTTAG) SEQ ID NO: 5 или (GTTAGG) SEQ ID NO: 6 или комплементарную им последовательность, или их фрагмент или вариант или смесь для применения в целях лечения и/или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер.
Предпочтительно, олигонуклеотид или его фрагмент или вариант содержит одну из следующих последовательностей:
(TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n или (GTTAGG)n, где 1<n<1000, предпочтительно 1<n<500, предпочтительно 1<n<200, предпочтительно 1<n<100, предпочтительно 1<n< 50, предпочтительно 1<n<20, предпочтительно 1<n<10 и предпочтительно 1<n<5.
Предпочтительно указанный олигонуклеотид комплементарен последовательности РНК, где указанной РНК является РНК-транскрипт, синтезированный с использованием специфической дисфункциональной теломерной ДНК в качестве матрицы для транскрипции, или фрагмент указанного РНКтранскрипта, где указанный фрагмент (DD-PHK) генерируется посредством процессинга ферментами Dicer и/или Drosha.
Предпочтительно заболевание представляет собой рак или вирусную инфекцию Эпштейна-Барра. Однако, предпочтительным заболеванием является ALT-позитивный рак.
Более предпочтительно рак выбран из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, предпочтительно, хондросаркомы, недифференцированных плейоморфных сарком, включая злокачественную фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, эпителиоидную саркому, липосаркому, фибросаркому и их варианты, ангиосаркому и нейрофиброму, рака центральный нервной системы, предпочтительно диффузной астроцитомы 2-й степени;
анапластической астроцитомы 3-й степени; детской мультиформной глиобластомы 4-й степени, олигодендроглиомы, анапластической медуллобластомы, пилоцитозной астроцитомы 1-й степени, неанапластической медуллобластомы, менингиомы, шванномы, рака мочевого пузыря, а в частности мелкоклеточной карциномы и инвазивной уротелиальной карциномы, рака коры надпочечников или периферической нервной системы, а в частности ганглионейробластомы, нейробластомы и феохромоцитомы;
нейроэндокринных новообразований, таких как параганглиома и карциноидная опухоль; рака почек, а в частности хромофобной карциномы, саркоматоидной карциномы и прозрачноклеточной карциномы и карциномы сосочков; рака легких и плевры, а в частности злокачественной мезотелиомы, крупноклеточной карциномы и мелкоклеточной карциномы; рака кожи, такого как злокачественная меланома; рака печени, такого как гепатоцеллюлярная карцинома; рака яичек, такого как опухоль несеменных зародышевых клеток; рака молочной железы, а в частности лобулярной карциномы; карциномы протоков и медуллярной карциномы; рака матки, такого как серозная карцинома эндометрия; плоскоклеточной карциномы шейки матки, рака яичника, а в частности, прозрачноклеточной карциномы, эндометриоидной карциномы, рака желчного пузыря, такого как аденокарцинома; рака пищевода.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему одну из нижеследующих последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID NO: 1, (TAGGGT) SEQ ID NO: 2, (AGGGTT) SEQ ID NO: 3, (GGGTTA) SEQ ID NO: 4, (GGTTAG) SEQ ID NO: 5 или (GTTAGG) SEQ ID NO: 6 или комплементарных им последовательностей, или их фрагментов или вариантов, или их смесей для применения в целях лечения и/или профилактики неракового состояния, ассоциированного с дисфункци- 4 039775 ей теломер.
Предпочтительно не-раковое состояние, ассоциированное с дисфункцией теломеры, выбрано из группы, состоящей из прогерического синдрома Хатчинсона-Гилфорда (HGPS), синдрома Вернера, синдрома Блума, атаксии-телеангиэктазии, наследственного ИФЛ, спорадического ИФЛ, апластической анемии, аутосомно-доминантного наследственного дискератоза, наследственной МДС-ОМЛ, врожденного дискератоза de novo, X-сцепленного рецессивного врожденного дискератоза, синдрома ХейралаГрейдерсона, синдрома Ревесца, аутосомно-рецессивного врожденного дискератоза, синдрома Коатса+, состояния, вызываемого мутациями или инактивацией любого из TRF1, POT1, ТРР1, TINF2, RAP1 или TRF2; нарушения регенерации при частичной гепатэктомии; фиброза печени, хронического воспаления печени, цирроза печени, фиброза легких; заболевания, ассоциированного с изменением дифференцировки миелоидных клеток-предшественников; недостаточности костного мозга; хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ); нервных расстройств, включая болезнь Альцгеймера; остеопороза, атеросклероза, болезни сердца, мышечной дистрофии Дюшенна, диабета типа 2, нарушения репродуктивных функций, нарушения заживления ран, артрита, катаракты, возрастной дегенерации желтого пятна, старения.
Предпочтительно олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид, модифицированный блокированной нуклеиновой кислотой (LNA), или 2'-О-метилмодифицированный олигонуклеотид.
LNA, как правило, рассматривается как РНК-миметик, в котором молекула сахара рибозы блокирована оксиметиленовым мостиком, соединяющим С(2')- и С(4')-атомы, которые конформационно ограничивает мономеры LNA с образованием сахарного кармана N-типа (Veedu R et al., 2010). LNA представляет собой молекулу, которая содержит по меньшей мере один нуклеотид, несущий модификацию LNA. Предпочтительно, LNA содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 нуклеотидов, несущих модификацию LNA.
2'-О-метил-модифицированный олигонуклеотид представляет собой молекулу, которая содержит по меньшей мере один нуклеотид, несущий 2'-О-метилмодификацию. Предпочтительно 2'-О-метилмодифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 нуклеотидов, несущих 2'-О-метил-модификацию.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один олигонуклеотид, определенный выше, и фармацевтически приемлемые носители, для применения в целях лечения и/или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер или в целях лечения и/или профилактики неракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломер.
Предпочтительно фармацевтическая композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, другое терапевтическое средство, предпочтительно выбранное из группы, состоящей из противоопухолевого средства, болеутоляющего средства, противорвотного средства (такого как апрепитант, фозапрепитант, доласетрон, гранисетрон, ондансетрон, палоносетрон, трописетрон, или рамозетрон, дексаметазон).
Предпочтительно другое терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора ATR, ингибитора DDR, ингибитора HR, молекулы, которая специфически нацелена на теломеры, предпочтительно, молекул, взаимодействующих с G-квадруплексами; молекулы, которая вызывает повреждение ДНК, в частности в теломерах.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации индивидуума, подвергаемого лечению олигонуклеотидом, определенным выше, или фармацевтической композицией, определенной выше, где указанный способ включает детектирование присутствия РНК и/или определение количества РНК, где указанной РНК является РНК-транскрипт, синтезированный с использованием специфической дисфункциональной теломерной ДНК в качестве матрицы для транскрипции, или фрагмент указанного РНК-транскрипта, где указанный фрагмент (DD-PHK) генерируется посредством процессинга ферментами Dicer и/или Drosha, где указанный индивидуум страдает заболеванием, характеризующимся альтернативным удлинением теломер, или не-раковым состоянием, ассоциированным с дисфункцией теломер.
В настоящем изобретении DD-PHK представляют собой некодирующие РНК. Они являются РНКтранскриптами, синтезированными с использованием специфически поврежденной и/или дисфункциональной теломерной ДНК в качестве матрицы для транскрипции длинного РНК-предшественника, который может быть затем процессирован ферментами Dicer и/или Drosha с образованием более коротких некодирующих РНК (DD-PHK или tDDRNA).
DD-PHK изначально присутствует в локусе и несет последовательность поврежденного локуса. При химическом синтезе или продуцировании in vitro посредством расщепления транскриптов, охватывающих локус, ферментами DICER и/или Drosha, DD-PHK стимулируют активацию DDR в сайте повреждения ДНК в клетках, обработанных РНКазой А, даже в отсутствие других РНК млекопитающих.
DD-PHK действуют по механизмам, отличающимся от механизмов действия микроРНК и канонических РНКи, как показано в литературе (Francia et al., 2012):
DD-PHK действуют в отсутствие какой-либо другой клеточной РНК (см. результаты, полученные в
- 5 039775 экспериментах, проводимых с использованием экстрагированных гелем РНК и синтетических РНК в клетках, обработанных РНКазой А).
DD-PHK могут иметь последовательность (повторы LAC или ТЕТ), которая не имеет соответствующих эндогенных клеточных транскриптов, но все же обладает биологической активностью.
DD-PHK могут действовать быстро (в течение нескольких минут) при комнатной температуре в клетках для ингибирования транскрипции и трансляции (см. результаты, полученные в экспериментах, проводимых с использованием клеток, обработанных РНКазой А).
Инактивация GW белков (эффекторов канонических миРНК) не влияет на локусы DDR.
DD-PHK представляют собой небольшие РНК, способные образовывать двухцепочечные пары, генерируемые посредством процессинга последовательность-специфического РНК-транскрипта ферментами DICER и/или Drosha, синтезированными после транскрипции локуса поврежденной ДНК. DD-PHK представляют собой небольшие РНК длиной от 10 до 50 нуклеотидов. Так, например, их длина составляет от 17 до 32 нуклеотидов, например, от 20 до 25 нуклеотидов. Так, например, их длина составляет 2123 нуклеотидов.
Указанные DD-PHK функционируют предпочтительно посредством последовательностьспецифической аккумуляции факторов DDR в специфических сайтах повреждения ДНК и стимулируют активацию DDR (т.е., включая, но не ограничиваясь ими, сигнализацию повреждения ДНК, например, посредством событий фосфорилирования белка и репарации повреждений ДНК, таких как гомологичная рекомбинация).
Предшественники DD-PHK представляют собой молекулы РНК, которые являются более длинными, чем DD-PHK (имеют длину по крайней мере 25 оснований, предпочтительно по меньшей мере 30 оснований, предпочтительно по меньшей мере 50 оснований, предпочтительно по меньшей мере 100 оснований, предпочтительно по меньшей мере 150 оснований, предпочтительно по меньшей мере 200 оснований, предпочтительно по меньшей мере 250 оснований и предпочтительно по меньшей мере 300 оснований), и которые транскрибируются после повреждения ДНК посредством поврежденной ДНК, используемой в качестве матрицы. Они процессируются ферментами Drosha и/или DICER с образованием DD-PHK. Теломерные предшественники DD-PHK представляют собой множество теломерных DDPHK.
В настоящем изобретении фрагмент SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 6 представляет собой функциональный фрагмент, который имеет такую же терапевтическую активность, как и указанные последовательности. Этот фрагмент соответствует олигонуклеотидам согласно изобретению, которые являются усеченными по одному или более нуклеотидам у 5'-конца, 3'-конца или 5'- и 3'-концов, при условии, что будут присутствовать по меньшей мере два смежных нуклеотида не-усеченного олигонуклеотида. Предпочтительно, усеченные олигонуклеотиды имеют 2, 3, 4 или 5 последовательных нуклеотидов, присутствующих в неусеченных олигонуклеотидах.
Настоящее изобретение также включает олигонуклеотиды, содержащие вышеуказанные последовательности (SEQ ID NO: 1-6), которые повторяются 1 или более раз, например, олигонуклеотиды, содержащие одну из нижеследующих последовательностей: (TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n или (GTTAGG)n, где 1<n<1000, предпочтительно 1<n<500, предпочтительно 1<n<200, предпочтительно 1<n<100, предпочтительно 1<n<50, предпочтительно 1<n<20, предпочтительно 1<n<10 и предпочтительно 1<n<5.
Олигонуклеотиды могут также иметь длину 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25 нуклеотидов и т.п. Эти олигонуклеотиды необязательно должны состоять из 6 нуклеотидов.
В настоящем изобретении, вариант SEQ ID NO: 1-6 представляет собой олигонуклеотиды, в которых 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов замещены другим нуклеотидом. Эти варианты по меньшей мере на 50%, а предпочтительно по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичны последовательности SEQ ID N: 1-6. Этот вариант обладает такой же терапевтической активностью, как и олигонуклеотид. Предпочтительными вариантами теломерных гексануклеотидов являются TCAGGG, TTCGGG, GTAGGG, TGAGGG, TTGGGG, TAAGGG, ATAGGG, CTAGGG, TTTGGG, TTAAGGG и комплементарные им последовательности (фиг. 5 (см. Lee et al., 2014)).
Олигонуклеотид согласно изобретению или его фрагмент или вариант комплементарны последовательности DD-PHK и/или их предшественников и тем самым ингибируют DD-PHK и/или функцию их предшественников.
Предпочтительно олигонуклеотид представляет собой молекулу LNA или 2'-О-метилмодифицированный олигонуклеотид.
Эти олигонуклеотиды включают, но не ограничиваются ими, блокированные нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоатные модифицированные олигонуклеотиды, модифицированные фосфоротиоатом блокированные нуклеиновые кислоты, 2'-O-метоксиэтил-модифицированные олигонуклеотиды, 2'-Oметилмодифицированные олигонуклеотиды, 2-O-[2-(N-метилкарбамоил)этил]рибонуклеозиды, метил- 6 039775 фосфонаты, морфолиноолигонуклеотиды, гапмерные LNA-ДНК-LNA-олигонуклеотиды, миксмеры, химерный 2'-О-метил-РНК-ДНК-гапмер, N3'-Р5'-фосфорαмидαт, 2'-фтор-арабино-нуклеиновую кислоту, фосфорамидат-морфолино, циклогексен-нуклеиновую кислоту, трицикло-ДНК, пептид-нуклеиновую кислоту, неблокированную нуклеиновую кислоту, гексит-нуклеиновую кислоту, боранофосфатолигонуклеотиды, фосфорамидат-олигонуклеотиды, где указанный модифицированный олигонуклеотид, предпочтительно, содержит фосфортиогруппу и/или олигонуклеотиды, экспрессируемые кодируемыми плазмидой генами, доставляемыми различными способами (включая, но не ограничиваясь ими, трансфекцию плазмиды, вирусную инфекцию).
В настоящем изобретении заболеванием, характеризующимся альтернативным удлинением теломер, является заболевание, характеризующееся присутствием клеток, сохраняющих теломеры, несмотря на отсутствие теломеразной активности, и/или одним или более признаками, перечисленными ниже.
В частности, альтернативное удлинение теломер может быть идентифицировано/определено по меньшей мере по одному из нижеследующих признаков:
по отсутствию теломеразной активности (например, определенной с помощью ферментативных анализов);
по наличию более длинных и более гетерогенных теломер по сравнению с теломеразо-позитивными клетками, как было определено с помощью анализа с использованием теломерного рестрикционного фрагмента и Саузерн-блот-анализа или другими способами на основе гибридизации in situ;
по присутствию ALT-ассоциированных телец PML (АРВ), которые представляют собой локусы белка PML, локализованные вместе с хроматином теломеры и обнаруживаемые с помощью иммунофлуоресценции:
по присутствию маркеров DDR, таких как белки yH2AX, RPA, HR, солокализованные в теломерах, как было определено с помощью иммунофлуоресценции или другими способами;
по присутствию мутаций в генах ATRX и/или DAXX или по изменению их экспрессии или функции (Heaphy et al., 2011);
по присутствию с-колец, которые представляют собой одноцепочечные с-богатые внехромосомные теломерные ДНК;
по присутствию t-колец, которые представляют собой внехромосомные двухцепочечные теломерные ДНК;
по обмену сестринских хроматидных теломер, то есть маркера рекомбинации теломер;
по повышению нестабильности тандемных повторов в минисателлитном локусе MS32.
Эти признаки могут быть измерены/идентифицированы известными методами, например, описанными в литературе (Henson & Reddel, 2010) (приводится здесь посредством ссылки).
В настоящем изобретении нераковым состоянием, ассоциированным с дисфункцией теломеры, является заболевание или состояние или синдром, характеризующиеся сцеплением теломер с компонентами механизма DDR. В настоящем изобретении дисфункция теломеры или дисфункциональная теломера представляют собой теломеру с поврежденной теломерной ДНК и/или очень короткой теломерной ДНК и/или не-кэпированной теломерной ДНК и/или деблокированной теломерной ДНК и/или ДНК с ускоренной потерей теломеры и/или любой вариант, где сигнал DDR является активным в теломере.
Дисфункция теломеры играет важную роль в развитии ряда дегенеративных расстройств. Их манифестации охватывают общие патологичесике состояния, такие как прогерический синдром ХатчинсонаГилфорда (HGPS), синдром Вернера, синдром Блума, атаксия-телеангиэктазиия, наследственный ИФЛ, спорадический ИФЛ, апластическая анемия, аутосомно-доминантный наследственный дискератоз, наследственная МСК-ОМЛ, врожденный дискератоз de novo, Х-сцепленный рецессивный врожденный дискератоз, синдром Хейрала-Грейдерсона, синдром Ревесца, аутосомно-рецессивный врожденный дискератоз, синдром Коатса+, состояние, вызываемое мутациями или инактивацией любого из TRF1, РОТ1, ТРР1, TINF2, RAP1 или TRF2; нарушение регенерации при частичной гепатэктомии; фиброз печени, хроническое воспаление печени, цирроз печени, фиброз легких; заболевание, ассоциированное с изменением дифференцировки миелоидных клеток-предшественников;
недостаточность костного мозга; хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ); нервные расстройства, включая болезнь Альцгеймера; остеопороз, атеросклероз, болезнь сердца, мышечная дистрофия Дюшенна, диабет типа 2, нарушение репродуктивных функций, нарушение заживления ран, артрит, катаракта, возрастная дегенерация желтого пятна, старение. Так, например, ускоренная потеря теломеры, то есть, дисфункция теломеры, рассматривается как фактор, ответственный за недостаточность органов в конечной стадии хронических заболеваний, ассоциированных с высоким уровнем клеточного метаболизма, таких как цирроз печени (Rudolph et al., 2000).
Хотя эти расстройства рассматриваются как клинически разнообразные, однако в совокупности они включают спектр синдромов, характеризующихся короткими или поврежденными, а в более широком смысле, дисфункциональными теломерами, и дисфункция теломеры также является ключевым признаком старения и возрастных заболеваний (см., Armanios & Blackburn, 2012; Gray et al., 2015;. Opresko & Shey, 2016; Wang et al., 2015; Xi et al., 2013; Satyanarayana et al., 2003; Rudolph et al., 2000)). Последующая дисфункция теломеры может быть вызвана мутациями или инактивациями, а в частности TRF1 (офици- 7 039775 альное название TERF1, ген ID 7013), РОТ1 (ген ID 25913), ТРР1 (официальное название ДСА, ген ID
65057), TINF2 (ген ID 26277), RAP1 (официальное название TERF2IP, ген ID 54386) или TRF2 (официальное название TERF2, ген ID 7014).
Кроме того, модели TRF2KO вызывают дисфункцию теломеры, и приводят к развитию нераковых состояний, ассоциированных с дисфункцией теломеры.
Дисфункция теломеры может быть идентифицирована/определена по меньшей мере по одному из нижеследующих признаков или любыми методами, такими как: непрямая иммунофлуоресценция, иммуногистохимия, иммунопреципитация хроматином, детектирование tDDRNA.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению полинуклеотидов, олигонуклеотидов, дезоксинуклеотидов, динуклеотидов или динуклеотидных димеров, или аналогичных соединений для ингибирования пролиферации клеток или ингибирования репарации ДНК. Используемый здесь термин ингибирование пролиферации клеток включает полную отмену деления клеток, частичное ингибирование деления клеток и временное ингибирование деления клеток, гибель клеток, апоптоз, некроз, старение клеток, дифференцировку клеток, митотическую вспышку, как было определено с помощью стандартных тестов специалистами в данной области и как описано в примерах. Настоящее изобретение также относится к профилактике и/или лечению заболеваний, характеризующихся ALT, включая, но не ограничиваясь ими, рак и предраковые состояния, где указанное заболевание поражает клетки любого органа и любого эмбрионального происхождения. Метастазирующие ALT-опухоли и раковые опухоли, которые появлялись снова или рецидивировали после лечения, а также первичные опухоли могут быть подвергнуты лечению способами согласно изобретению.
В одном из вариантов осуществления изобретения композиции согласно изобретению включают олигонуклеотиды длиной приблизительно 2-200 оснований, которые могут быть введены млекопитающему (например, человеку) в соответствующем носителе. В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотиды имеют длину приблизительно от 5 до 100 нуклеотидов. В еще одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотиды имеют длину приблизительно от 5 до 50 нуклеотидов. В еще одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотиды ДНК имеют длину приблизительно 8-30 нуклеотидов. Предпочтительно их длина составляет 8-21 нуклеотид, а еще более предпочтительно 8-16 нуклеотидов.
Любой подходящий способ введения олигонуклеотида согласно изобретению в организм, а именно так, чтобы олигонуклеотид контактировал с представляющими интерес клетками или тканями и/или проникал в эти клетки или ткани, может рассматриваться как эффективный. Эффекты могут быть оптимизированы в соответствии с рутинными протоколами оптимизации.
Олигонуклеотид, дезоксинуклеотиды согласно изобретению могут быть получены из любого подходящего источника, либо они могут быть получены путем синтеза.
Фрагменты ДНК, олигонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, динуклеотиды или динуклеотидные димеры могут быть нанесены на кожу и могут быть введены отдельно или в комбинации с физиологически приемлемыми носителями, включая растворители, отдушки или красители, стабилизаторы, солнцезащитные кремы или другие ингредиенты, используемые в медицине или в косметике. Они могут быть введены в носителе, таком как вода, физиологический раствор, или в другом соответствующем носителе для доставки.
Носителем для доставки может быть любой подходящий носитель, доставляющий олигонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, динуклеотиды или динуклеотидные димеры. В одном из вариантов осуществления изобретения, концентрация олигонуклеотида может составлять от 0,1 нМ до 500 мкМ, предпочтительно в пределах от 0,2 нМ до 300 мкМ, а еще более предпочтительно, in vitro в пределах от 0,5 нМ до 200 мкМ. Предпочтительная концентрация in vivo составляет в пределах 0,1-500 мг/кг, а еще более предпочтительно, in vivo в пределах 1-50 мг/кг.
Для облегчения доступа активных ингредиентов композиции в глубоко лежащие клетки кожи могут быть использованы носители, которые улучшают проникновение через внешние слои кожи, например, роговой слой эпидермиса. Компонентами носителей, используемых для этих целей, являются, но не ограничиваются ими, этанол, изопропанол, эфиры диэтиленгликоля, такие как моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, азон (1-додецилазациклогептан-2-он), олеиновая кислота, линолевая кислота, пропиленгликоль, глицерин в концентрациях, имеющих высокое осмотическое давление, молочная кислота, гликолевая кислота, лимонная кислота и яблочная кислота. В одном из вариантов осуществления изобретения, пропиленгликоль используют в качестве носителя для доставки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется смесь пропиленгликоля:этанола:изопропилмиристата (1:2,7:1), содержащая 3% бензилсульфоновую кислоту и 5% олеиловый спирт.
В другом варианте осуществления изобретения может быть использован липосомный препарат. Липосомный препарат может содержать липосомы, которые проникают в представляющие интерес клетки или в роговой слой эпителия и связываются с клеточной мембраной, что приводит к доставке содержимого липосомы в клетку. Так, например, могут быть использованы липосомы, описанные в патенте США № 5077211 Yarosh, в патенте США № 4621023, Redziniak и др. или в патенте США № 4508703 Redziniak и др. Композиции согласно изобретению, предназначенные для лечения кожных болезней, мо- 8 039775 гут быть введены до, во время или после воздействия на кожу млекопитающего УФ-облучения или агентов, вызывающих окислительное повреждение. В других подходящих препаратах могут быть использованы ниосомы. Ниосомы представляют собой липидные везикулы, которые сходны с липосомами, но имеют мембраны, состоящие, главным образом, из неионных липидов, некоторые из которых являются эффективными для доставки соединений в роговой слой эпителия.
Другими подходящими методами доставки на кожу являются, главным образом, применение гидрогелевого препарата, содержащего водную или водно-спиртовую среду и гелеобразующий агент в дополнение к олигонуклеотиду(ам). Подходящими гелеобразующими агентами являются метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбомер (Карбопол), гипан, полиакрилат и полиакрилат глицерина.
В одном из вариантов осуществления изобретения олигонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, динуклеотиды, динуклеотидные димеры или композицию, содержащую один или более из указанных выше компонентов, наносят местно на поверхность кожи. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, динуклеотиды, динуклеотидные димеры или композицию, содержащую один или более из указанных выше компонентов, доставляют в другие клетки или ткани организма, такие как эпителиальные клетки. Клетки ткани, которые, как известно, имеют меньший барьер для проникновения таких веществ, чем кожа, могут быть введены, например, перорально в ротовую полость, в виде аэрозоля в дыхательный эпителий, путем закапывания в эпителий мочевого пузыря, путем инстилляции или с помощью суппозиториев для кишечника (кишечного эпителия) или с помощью других местных или поверхностных применений для других клеток или тканей организма, включая глазные капли, капли в нос, и применения с помощью, например, ангиопластики. Кроме того, олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть введены внутривенно или доставлены непосредственно в представляющую интерес ткань внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно. Кроме того, для лечения клеток крови соединения согласно изобретению могут быть введены внутривенно или во время экстракорпорального кровообращения, например, с использованием устройства для фотофореза. Как показано в настоящей заявке, главное, что необходимо - это контактирование представляющих интерес клеток с олигонуклеотидными композициями согласно изобретению.
Олигонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, динуклеотиды, динуклеотидные димеры, агенты, стимулирующие дифференцировку, или композицию, содержащую один или более из вышеуказанных компонентов, вводят в представляющие интерес клетки (или вводят в контакт с этими клетками) соответствующим способом.
Используемый здесь термин представляющие интерес клетки означают клетки, которые могут поражаться или поражаются заболеванием, характеризующимся ALT или дисфункциональными теломерами.
Олигонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, динуклеотиды, динуклеотидные димеры, агент, стимулирующий дифференцировку или композицию, содержащую один или более из вышеуказанных компонентов, вводят в подходящее время в эффективном количестве. Подходящее время может варьироваться в зависимости от типа и молекулярной массы олигонуклеотидов, дезоксинуклеотидов, динуклеотидов, динуклеотидных димеров или другого используемого агента, состояния, подвергаемого лечению или профилактике, желаемых результатов и индивидуальных особенностей пациента.
Используемый здесь термин эффективное количество означает количество или концентрацию, достаточные для достижения желаемого результата. Эффективное количество зависит от типа и молекулярной массы олигонуклеотидов, дезоксинуклеотидов, динуклеотидов, динуклеотидных димеров или другого используемого агента, состояния, подвергаемого лечению или профилактике, желаемых результатов и индивидуальных особенностей пациента. Так, например, для лечения или профилактики гиперпролиферативных ALT-заболеваний, раковых или предраковых состояний, эффективным количеством является количество, необходимое для уменьшения или ослабления любого симптома заболевания, для уменьшения объема, площади или числа клеток, пораженных этим заболеванием, для предупреждения образования пораженных участков или для уменьшения скорости роста клеток, пораженных гиперпролиферативным расстройством.
Как продемонстрировано в настоящей заявке, ингибиторы согласно изобретению являются активными in vitro и in vivo в их немодифицированной форме, например, в виде последовательностей немодифицированных олигонуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями. Используемые здесь термины олигонуклеотид, динуклеотид и т.д., означают молекулы, имеющие рибозу и/или дезоксирибозу в качестве сахара и имеющие фосфодиэфирные связи (фосфатный остов) в качестве природной молекулы, если не указаны другие связи или остовы.
Олигонуклеотиды представляют собой относительно короткие полинуклеотиды. Полинуклеотиды представляют собой линейные полимеры, состоящие из нуклеотидных мономеров, в которых нуклеотиды связаны фосфодиэфирными связями между 3'-положением одного нуклеотида и 5'-положением смежного нуклеотида. Если это не оговорено особо, то описанные здесь олигонуклеотиды согласно изобретению имеют фосфодиэфирный остов.
Для улучшения доставки через кожу олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть модифи- 9 039775 цированы так, чтобы они маскировали или уменьшали свои отрицательные заряды или как-либо иначе изменяли свои химические свойства. Это может быть осуществлено, например, путем получения аммониевых солей олигонуклеотидов с использованием легко доступных реагентов и с применением хорошо известных методов. Предпочтительными аммониевыми солями олигонуклеотидов являются соли триметил-, триэтил-, трибутил-, тетраметил-, тетраэтил- и тетрабутиламмония. Аммоний и другие положительно заряженные группы могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидом для облегчения его переноса через роговой слой эпителия с использованием ферментативно разлагаемой связи, что приводит к высвобождению олигонуклеотида после его проникновения в клетки жизнеспособных слоев эпидермиса.
Другой способ уменьшения или маскировки отрицательного заряда олигонуклеотидов включает присоединение полиоксиэтиленового спейсера к 5'-фосфатным группам олигонуклеотидов и/или внутренних фосфатов олигонуклеотидов с применением способов и реагентов, хорошо известных специалистам. По существу, это приводит к присоединению 6- или 12-углеродного модификатора (линкера) к фосфату, что уменьшает суммарный отрицательный заряд на +1 и делает олигонуклеотиды менее гидрофильными.
Дальнейшее снижение отрицательного заряда достигается за счет присоединения фосфороамидита к концу полиоксиэтиленового линкера, обеспечивая тем самым дополнительный нейтрализующий положительный заряд. Фосфодиэфирный остов олигонуклеотидов согласно изобретению может быть также модифицирован или синтезирован для уменьшения отрицательного заряда.
Предпочтительный способ включает использование метилфосфоновых кислот (или хиральных метилфосфонатов), в результате чего один из отрицательно заряженных атомов кислорода в фосфате заменяется метильной группой. Эти олигонуклеотиды подобны олигонуклеотидам, имеющим фосфоротиоатные связи, которые содержат сульфат вместо метильной группы и которые также входят в объем настоящего изобретения.
Олигонуклеотиды согласно изобретению могут также иметь форму пептидсодержащих нуклеиновых кислот (PNA), в которых основания нуклеотидов связаны друг с другом посредством пептидного остова.
Другие модификации олигонуклеотидов, например, модификации, описанные в патентах США NN. 6537973 и 6506735, а также в публикации Stenvang и др., 2012 (которые вводится в настоящее описание посредством ссылки для всех описанных там олигонуклеотидных модификаций) и т.п. будут очевидны специалистам в данной области.
Олигонуклеотидами могут быть также химерные олигонуклеотиды, которые синтезируют так, чтобы они имели комбинацию из двух или более химически отличающихся связей остова, одна из которых представляет собой фосфодиэфир. В одном из вариантов осуществления изобретения химерные олигонуклеотиды имеют одну или более фосфодиэфирных связей у 3'-конца. В одном из вариантов осуществления изобретения химерные олигонуклеотиды имеют одну или более фосфодиэфирных связей у 5'конца. В другом варианте осуществления изобретения химерные олигонуклеотиды имеют одну или более фосфодиэфирных связей у 3'- и 5'-концов.
Олигонуклеотид или олигонуклеотиды используются для лечения и/или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер, такого как рак или вирусная инфекция Эпштейна-Барра, а в частности саркома мягких тканей, предпочтительно хондросаркома, недифференцированная плейоморфная саркома, включая злокачественную фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, эпителиоидную саркому, липосаркому, фибросаркому и их варианты, ангиосаркому и нейрофиброму; рак центральный нервной системы, предпочтительно, диффузная астроцитома 2-й степени; анапластическая астроцитома 3-й степени; детская мультиформная глиобластома 4-й степени, олигодендроглиома, анапластическая медуллобластома, пилоцитозная астроцитома 1-й степени, неанапластическая медуллобластома, менингиома, шваннома, рак мочевого пузыря, а в частности, мелкоклеточная карцинома и инвазивная уротелиальная карцинома, рак коры надпочечников или периферической нервной системы, а в частности ганглилнейробластома, нейробластома и феохромоцитома; нейроэндокринные новообразования, такие как параганглиома и карциноидная опухоль; рак почек, а в частности хромофобная карцинома, саркоматоидная карцинома и прозрачноклеточная карцинома и карцинома сосочков; рак легких и плевры, а в частности злокачественная мезотелиома, крупноклеточная карцинома и мелкоклеточная карцинома; рак кожи, такой как злокачественная меланома; рака печени, такой как гепатоцеллюлярная карцинома; рак яичек, такой как опухоль несеменных зародышевых клеток; рак молочной железы, а в частности лобулярная карцинома; карцинома протоков и медуллярная карцинома; рак матки, такой как серозная карцинома эндометрия, плоскоклеточная карцинома шейки матки, рак яичника, а в частности прозрачноклеточная карцинома, эндометриоидная карцинома, рак желчного пузыря, такой как аденокарцинома; рак пищевода, или для лечения и/или профилактики не-ракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломеры, а в частности, прогерического синдрома ХатчинсонаГилфорда (HGPS), синдрома Вернера, синдрома Блума, атаксии-телеангиэктазии, наследственного ИФЛ, спорадическоого ИФЛ, апластической анемии, аутосомно-доминантного наследственного дискератоза, наследственной МДС-ОМЛ, врожденного дискератоза de novo, X-сцепленного рецессивного врожденного дискератоза, синдрома Хейрала-Грейдерсона, синдром Ревесца, аутосомно-рецессивного врожденного
- 10 039775 дискератоза, синдрома Коатса+, состояния, вызываемого мутациями или инактивацией любого из TRF1, РОТ1, ТРР1, TINF2, RAP1 или TRF2; нарушения регенерации при частичной гепатэктомии; фиброза печени, хронического воспаления печени, цирроза печени, фиброза легких; заболевания, ассоциированного с изменением дифференцировки миелоидных клеток-предшественников; недостаточности костного мозга; хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ); нервных расстройств, включая болезнь Альцгеймера; остеопороза, атеросклероза, болезни сердца, мышечной дистрофии Дюшенна, диабета типа 2, нарушения репродуктивных функций, нарушения заживления ран, артрита, катаракты, возрастной дегенерации желтого пятна, старения.
Так, например, такие заболевания описаны в публикации (Durant, 2012) (которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Олигонуклеотиды могут быть использованы в композиции в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем. Такая композиция может также содержать разбавители, наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы и другие вещества, хорошо известные специалистам в данной области. Катионные липиды, такие как соли DOTAP [N-(2,3-диолеоилокси) пропил]N,N,N-триметиламмония, могут быть использованы вместе с олигонуклеотидами для повышения стабильности. Олигонуклеотиды могут быть получены в виде комплексов с сополимерами PLGA/PLA, хитозаном или с сополимерами фумаровой кислоты/себациновой кислоты для повышения биодоступности {где PLGA представляет собой сополимер лактида и гликолида; PLA представляет собой поли-Lлактид}. Термины фармацевтически приемлемый и физиологически приемлемый означают нетоксичное вещество, которое не оказывает негативного влияния на эффективность биологической активности активного(ых) ингредиента(ов). Свойства носителя зависят от способа введения.
Композиция, используемая в качестве антипролиферативного агента для лечения ALT-заболевания, может дополнительно содержать и другие агенты, которые либо повышают активность олигонуклеотида(ов), либо дополняют его активность, или она может быть использована для лечения, при котором применяются химиотерапевтические или радиоактивные агенты. Такие дополнительные факторы и/или агенты могут быть включены в композиции для достижения синергического эффекта с олигонуклеотидом(ами) или для минимизации побочных эффектов. Кроме того, введение композиции согласно изобретению может быть осуществлено одновременно с другими видами терапии, например, в комбинации с химиотерапией или лучевой терапией. Описанные здесь олигонуклеотиды могут быть использованы в комбинации с другими композициями и методами для лечения заболеваний. Так, например, опухоль может быть удалена обычным хирургическим способом, с помощью лучевой терапии, химиотерапии или иммунотерапии в комбинации с олигонуклеотидной терапией, а затем олигонуклеотиды могут быть введены пациенту для продления периода покоя микрометастазов и стабилизации, а также ингибирования роста любой остаточной первичной опухоли. Олигонуклеотиды могут быть использованы в комбинации с ингибиторами теломеразы для предотвращения размножения негативных по теломеразе ALTпозитивных клонов.
Предпочтительно другое терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из ингибитора ATR, ингибитора DDR, ингибитора HR, молекулы, которая специфически нацелена на повреждение ДНК и/или вызывает такое повреждение, в частности, в теломерах, а предпочтительно молекул, взаимодействующих с G-квадруплексами.
В настоящем изобретении ингибитор ATR представляет собой низкомолекулярное соединение, способное ингибировать киназную активность ATR, включая, но не ограничиваясь ими, VE-821 (Vertex Pharmaceuticals), VE-822 (Vertex Pharmaceuticals), AZ20 (AstraZeneca), AZD6738 (AstraZeneca) (как описано в публикациях Flynn et al., 2015; Weber & Ryan, 2015) (все публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
Ингибитор DDR представляет собой любое соединение или экспериментальное средство, способное нарушать или ингибировать клеточный процесс, известный как ответ на повреждение ДНК (DDR), включая, но не ограничиваясь ими: кофеин, вортманнин, КА-55933, KA-60019, КА-559403, шисандрин В, NU6027, NVP-BEZ235 (как описано в публикациях (Begg et al., 2011; Kelly et al., 2014; Weber & Ryan, 2015), все публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
Ингибитор HR представляет собой любое соединение или экспериментальное средство, способное нарушать или ингибировать клеточный процесс, известный как репарация ДНК посредством гомологичной рекомбинации (HR), включая, но не ограничиваясь ими: инипариб (SAR240550, BSI-201; SanofiAventis), олапариб (AZD2281, КУ-0069436; AstraZeneca), нирапариб (Tesaro), рукапариб (СО-338, AG014699, PF-01367338; Pfizer), велипариб (АВТ-888; Abbott), AZD2461 (AstraZeneca), BMN673 (BioMarin Pharmaceutical), CEP-9722 (Cephalon), E7016 (Esai), INO-1001 (Inotek Pharmaceuticals), MK-4827 (Merck), метоксиамин (Sigma Aldrich), RI-1, IBR2, B02, галенхинон, описанные в публикациях (Feng et al., 2015; Kelly et al., 2014; Ward et al., 2015), где все эти публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
Молекула, которая специфически нацелена на повреждение ДНК и/или вызывает такое повреждение, в частности, в теломерах, представляет собой любое соединение или экспериментальное средство, которое специфически или преимущественно взаимодействует с теломерами, индуцирует повреждение
- 11 039775
ДНК в теломерной ДНК и/или активирует или ингибирует передачу сигнала DDR и/или репарацию ДНК, включая, но не ограничиваясь ими: лиганды, связывающиеся с G-квадруплексами (например, BRACO19, теломестатин, RHPS4, кварфлоксин, TMPyP4, AS1410), ингибиторы топоизомеразы, цисплатин, гидроксимочевина, (как описано в публикациях (Lu et al., 2013; Muller and Rodriguez, 2014; Neidle, 2010; Salvati et al., 2015; Sissi and Palumbo, 2014) все эти публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
Другими молекулами, которые могут быть использованы в комбинации с олигонуклеотидами, являются абитрексат (метотрексат для инъекций), абраксан (паклитаксел для инъекций), Adcetris (брентуксимаб-ведотин для инъекций), адриамицин (доксорубицин), адруцил для инъекций (5-FU (фторурацил)), Afinitor (эверолимус), Afinitor Disperz (эверолимус), алимта (пеметрексед), алкеран для инъекций (мелфалан для инъекций), алкеран в виде таблеток (мелфалан), Aredia (памидронат), аримидекс (анастрозол), аромазин (экземестан), арранон (неларабин), Arzerra (офатумумаб для инъекций), авастин (бевацизумаб), BEXXAR (тозитумомаб), BiCNU (кармустин), бленоксан (блеомицин), босулиф (бозутиниб), бусуфлекс для инъекций (бусульфан для инъекций), Campath (алемтузумаб), камптозар (иринотекан), Caprelsa (вандетаниб), касодекс (бикалутамид), CeeNU (ломустин), CeeNU в дозируемой упаковке (ломустин), церубидин (даунорубицин), Clolar (клофарабин для инъекций), Cometriq (кабозантиниб), Cosmegen (дактиномицин), CytosarU (цитарабин), цитоксан (Cytoxan), цитоксан для инъекций (циклофосфамид для инъекций), Dacogen (децитабин), DaunoXome (даунорубицин в виде липидного комплекса для инъекций), Decadron (дексаметазон), DepoCyt (цитарабин в виде липидного комплекса для инъекций), дексаметазон Intensol (дексаметазон), Dexpak Taperpak (дексаметазон), Docefrez (доцетаксел), Doxil (доксорубицин в виде липидного комплекса для инъекций), Droxia (гидроксимочевина), DTIC (декарбазин), Eligard (лейпролид), Элленс (Ellence (эпирубицин)), Элоксатин (Eloxatin (оксалиплатин)), Elspar (аспарагиназа), Emcyt (эстрамустин), эрбитукс (цетуксимаб), Erivedge (висмодегиб), Erwinaze (аспарагиназа Erwinia chrysanthemi), Ethyol (амифостин), Etopophos (Этопозид для инъекций), Eulexin (флутамид), Fareston (торемифен), Faslodex (фулвестрант), Femara (летрозол), Firmagon (дегариликс для инъекций), флудар (флударабин), Folex (метотрексат для инъекций), Folotyn (пралатрексат для инъекций), FUDR (FUDR (флоксуридин) ), гемзар (гемцитабин), гилотриф (афатиниб), Гливек (мезилат иматиниба), Gliadel Wafer (кармустин в виде облаток), Halaven (эрибулин для инъекций), герцептин (трастузумаб), гексален (альтретамин), гикамтин (топотекан), гикамтин (топотекан), Hydrea (гидроксимочевина), Iclusig (понатиниб), Idamycin PFS (идаруцибин), Ифекс (ифосфамид), Inlyta (акситиниб), Intron A alfab (интерферон альфа-2а), Iressa (гефитиниб), Istodax (ромидексин для инъекций), Ixempra (иксабепилон для инъекций), Jakafi (руксолитиниб), Jevtana (кабазитаксел для инъекций), Kadcyla (адо-трастузумабэмтансин), Kyprolis (карфилзониб), Leukeran (хлорамбуцил), Leukine (сарграмостим), Leustatin (кладрибин), Lupron (лейпролид), Lupron Depot (лейпролид), Lupron DepotPED (лейпролид), Lysodren (митотан), Marqibo Kit (винкристин в виде липидного комплекса для инъекций), Matulane (прокарбазин), Медасе (мегестрол), Mekinist (траметиниб), Mesnex (месна), Mesnex (месна для инъекций), метастрон (хлорид стронция-89), мексат (метотрексат для инъекций), мустарген (мехлорэтамин), мутамицин (митомицин), милеран (бусульфан), милотарг (гемтузумаб озогамицин), навелбин (винорелбин), неозар для инъекций (циклофосфамид для инъекций), Neulasta (филграстим), Neulasta (пегфилграстим), нейпоген (филграстим), нексавар (сорафениб), ниландрон (Nilandron (нилутамид)), Nipent (пентостатин), нолвадекс (тамоксифен), новантрон (митоксантрон), Oncaspar (пегаспаргаза), онковин (винкристин), Ontak (денилейкин дифтитокс), Onxol (паклитаксел для инъекций), панретин (алитретиноин), параплатин (карбоплатин), Perjeta (пертузумаб для инъекций), платинол (цисплатин), платинол (цисплатин для инъекций), PlatinolAQ (цисплатин), PlatinolAQ (цисплатин для инъекций), Pomalyst (помалидомид), Prednisone Intensol (преднизон), Proleukin (альдеслейкин), Purinethol (меркаптопурин), Reclast (золедроновая кислота), Revlimid (леналидомид), Rheumatrex (метотрексат), ритускан (ритуксимаб), RoferonA alfaa (интерферон альфа-2а), Rubex (доксорубицин), сандостатин (остреотид), Sandostatin LAR Depot (остреотид), Soltamox (тамоксифен), Sprycel (дазатиниб), Sterapred (преднизон), Sterapred DS (преднизон), Stivarga (регорафениб), супрелин LA (гистрелин в виде имплантата), Sutent (сунитиниб), Sylatron (пегинтерферон альфа-2b для инъекций (Sylatron)), Synribo (омацетаксин для инъекций), Tabloid (тиогуанин), Taflinar (дабрафениб), Tarceva (эрлотиниб), таргетин в капсулах (бексаротен), Tasigna (декарбазин), таксол (паклитаксел для инъекций), Taxotere (доцетаксел), Temodar (темозоломид), Temodar (темозоломид для инъекций), Tepadina (тиотепа), Thalomid (талидомид), TheraCys BCG (BCG), Thioplex (тиотепа), TICE BCG (БЦЖ), Toposar (этопозид для инъекций), Torisel (темсиролимус), Treanda (гидрохлорид бендамустина), Trelstar (трипторелин для инъекций), Trexall (метотрексат), Trisenox (триоксид мышьяка), Tykerb (лапатиниб), Valstar (валрубицин для интравезикулярного введения), Vantas (гистрелин в виде имплантата), Vectibix (панитумумаб), Velban (винбластин), Velcade (бортезомиб), Vepesid (этопозид), Vepesid (этопозид для инъекций), Vesanoid (третиноин), Vidaza (азацитидин), Vincasar PFS (винкристин), Vincrex (винкристин), Votrient (пазопаниб), Vumon (тенипозид), Wellcovorin IV (лейковорин для инъекций), Xalkori (кризотиниб), кселода (капецитабин), Xtandi (энзалутамид), Yervoy (ипилимумаб для инъекций), Zaltrap (зивафлиберцепт для инъекций), Zanosar (стрептозоцин), Zelboraf (вемурафениб), зевалин (ибритумомаб-тиуксетан), золадекс (гозерелин), Zolinza (вориностат), Zometa (золедроновая кислота), Zortress (эверолимус), Zytiga (абиратерон), нимотузумаб и иммун- 12 039775 ные ингибиторы сверочных точек, такие как ниволумаб, пембролизумаб/МК-3475, пидилизумаб и АМР224 для нацеливания на PD-1; и BMS-935559, MEDI4736, MPDL3280A и MSB0010718C для нацеливания на PD-L1 и на CTLA-4, такие как ипилимумаб.
Термин лучевая терапия означает облучение, обычно рентгеновскими лучами, для лечения заболевания. Рентгеновские лучи были открыты в 1895 году, и с тех пор такое излучение используется в медицине для диагностики и исследования (с помощью рентгеновских лучей) и для лечения (лучевой терапии). Лучевая терапия может быть применена экстракорпорально в виде внешней лучевой терапии с использованием рентгеновских лучей, облучения кобальтом, облучения электронами и реже другими частицами, такими как протоны. Она может быть также интракорпоральной лучевой терапией, при которой используются радиоактивные металлы или жидкости (изотопы) для лечения рака.
Кроме того, дополнительные аспекты изобретения включают объединение описанных здесь олигонуклеотидов с другими противораковыми терапевтическими средствами для достижения синергического или аддитивного эффекта.
Существующие противоопухолевые терапии представляют собой эффективные методы лечения рака, которые действуют посредством повреждения ДНК или ингибирования DDR раковых клеток. Однако ДНК-повреждающая активность большинства из них не является последовательность-специфической. Олигонуклеотиды согласно изобретению блокируют DDR по последовательность-специфическому механизму, что может сообщать последовательность-специфический эффект терапии, направленной на повреждение ДНК и тем самым повышать их эффективность.
Схема комбинированной терапии может включать введение олигонуклеотида до, во время и/или после введения любого партнера терапевтического средства, идентифицированного выше.
Комбинированная терапия может быть использована на поздней стадии заболевания, а также профилактически, в присутствии адъюванта и неоадъюванта.
В настоящем изобретении дисфункциональная теломерная ДНК представляет собой поврежденную теломерную ДНК и/или очень короткую теломерную ДНК и/или некэпированную теломерную ДНК и/или деблокированную теломерную ДНК и/или любой вариант, где сигнал DDR является активным в теломере. Композиции согласно изобретению могут быть получены в форме липосомы, в которой олигонуклеотид(ы) согласно изобретению объеденены помимо других фармацевтически приемлемых носителей с амфипатических агентами, такими как липиды, которые существуют в агрегированной форме в виде мицелл, нерастворимых монослоев, жидких кристаллов или ламеллярных слоев в водном растворе. Подходящими липидами для приготовления липосомных композиций являются, но не ограничиваются ими, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и т.п.
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены так, чтобы они содержали олигонуклеотиды, которые будут использованы в антипролиферативной терапии. Введение таких фармацевтических композиций может быть осуществлено различными стандартными способами, известными специалистам в данной области, такими как пероральное введение, введение путем ингаляции, например, в виде аэрозоля, местное или трансдермальное введение, или внутричерепное, интрацеребровентрикулярное, внутримозговое, интравагинальное, внутриматочное, пероральное, ректальное или парентеральное введение (например, внутривенное, интраспинальное, подкожное или внутримышечное) введение, или кожная, подкожная, внутрибрюшинная, парентеральная или внутривенная инъекция. Способ введения может быть определен в зависимости от локализации или роста опухоли-мишени. Для доставки композиции, содержащей эффективное количество одного или более олигонуклеотидов, на участок роста опухоли или на саму опухоль может быть использована прямая инъекция в этот участок. Альтернативно, для доставки в нужный участок слизистой может быть осуществлена биобаллистическая доставка, доставка путем нанесения олигонуклеотидов на сферы микрометрового диаметра или с помощью устройства для перорального впрыска струи. В генной терапии для доставки ДНК используют вирусные векторы, которые являются объектом исследования уже в течение ряда лет. В качестве систем для упаковки и доставки олигонуклеотидов для лечения рака или других опухолей могут быть использованы ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус коровьей оспы и растение-специфические вирусы. Были разработаны векторы на основе аденоассоциированного вируса, которые не могут реплицироваться, но сохраняют способность инфицировать клетки. Преимуществом таких векторов является низкая иммуногенность, что позволяет осуществлять повторное введение. Системы доставки были описаны, например, в публикации Page and Cudmore, 2001. Исследования, проведенные с использованием олигонуклеотидов исходя из теории их ингибирования функции нуклеиновой кислоты-мишени (антисмысловых олигонуклеотидов), большинство из которых были осуществлены с использованием фосфоротиоатных олигонуклеотидов, позволили разработать эффективные способы доставки в клетки-мишени. В клинических испытаниях антисмысловые олигонуклеотиды были введены в физиологических растворах без специальных носителей для доставки (как описано Hogrefe, 1999)). Композиции, пригодные для парентерального введения, включают водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, которые придают препарату изотоничность с жидкостями предполагаемого реципиента; и водные и безводные стерильные
- 13 039775 суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Препараты могут быть представлены в контейнерах с унифицированной дозой или с дробными дозами, например, в виде запаянных ампул и флаконов, и могут храниться в виде осушенного вымораживанием (лиофилизированного) препарата, непосредственно перед использованием которого необходимо лишь добавить стерильный жидкий носитель, например воду для инъекций перед использованием. Растворы и суспензии для немедленного введения в виде инъекции могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного ранее типа. Предпочтительная фармацевтическая композиция для внутривенной, кожной или подкожной инъекции должна содержать помимо олигонуклеотида(ов) согласно изобретению изотонический носитель, такой как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, декстроза для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, лактат-содержащий раствор Рингера для инъекций или другой носитель, известный специалистам. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может также содержать стабилизаторы, консерванты, буферы, антиоксиданты или другие добавки, известные специалистам в данной области.
В настоящее изобретение также входит использование систем доставки продолжительного или пролонгированного высвобождения. Такие системы являются в высокой степени предпочтительными в тех случаях, когда хирургическое вмешательство затруднено или невозможно, например, у ослабленных пожилых пациентов или у пациентов, страдающих заболеванием, или когда анализ на риск-пользу указывает на необходимость контроля за ходом лечения. Один из способов заключается в использовании имплантируемого насоса для доставки отмеренных доз препарата в течение определенного периода времени, например, на участок локализации опухоли. Матрица с пролонгированным высвобождением может быть использована в качестве средства для доставки фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотиды, а в частности, для местного лечения новообразования или опухоли. Эта матрица состоит из материалов, обычно полимеров, которые разлагаются посредством ферментативного или кислотного/щелочного гидролиза, или растворения. Эта матрица после ее введения в организм действует посредством ферментов и физиологических жидкостей. Матрицу с пролонгированным высвобождением предпочтительно выбирают из биологически совместимых материалов, таких как липосомы, полилактиды (полимолочная кислота), полигликолид (полимер гликолевой кислоты), сополимер лактида и гликолида (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидриды, поли(орто)эфиры, полипротеины, гиалуроновая кислота, коллаген, сульфат хондроитина, карбоновые кислоты, жирные кислоты, фосфолипиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, полиаминокислоты, аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин, изолейцин, полинуклеотиды, поливинилпропилен, поливинилпирролидон и силикон. Предпочтительная биоразлагаемая матрица представляет собой матрицу, полученную из любого полилактида, полигликолида или сополимера лактида и гликолида (сополимеров молочной кислоты и гликолевой кислоты). Количество олигонуклеотида согласно изобретению в фармацевтической композиции согласно изобретению зависит от природы и тяжести состояния, подвергаемого лечению, и от типа предшествующего лечения, которое проходил пациент. Для человека лечащий врач может назначить дозу олигонуклеотида согласно изобретению, подходящую для лечения каждого отдельного пациента. Сначала лечащий врач может ввести низкие дозы и наблюдать за реакцией пациента. Более высокие дозы могут быть введены до достижения оптимального терапевтического эффекта у пациента и на этой стадии дозу уже не увеличивают. Продолжительность терапии с использованием фармацевтической композиции согласно изобретению варьируется в зависимости от тяжести заболевания, подвергаемого лечению, и от состояния и потенциального идиосинкратического ответа у каждого отдельного пациента.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему по меньшей мере один олигонуклеотид, определенный выше, или фармацевтическую композицию, содержащую этот олигонуклеотид. Набор может содержать письменные инструкции. Олигонуклеотид может присутствовать в отдельном контейнере.
В настоящем изобретении способ для идентификации индивидуума, нуждающегося в лечении определенным выше олигонуклеотидом или определенной выше фармацевтической композиции, может также включать сравнение измеренного количества DD-PHK или tDDRNA с контрольным количеством. Контрольное количество может означать количество, определенное у здорового индивидуума, количество, определенное у индивидуума, не страдающего ALT-заболеванием или не страдающего не-раковым состоянием, ассоциированным с дисфункцией теломеры, или количество, определенное у того же самого индивидуума до или после терапевтического вмешательства.
Настоящее изобретение описано на неограничивающих примерах, проиллюстрированные со ссылкой на прилагаемые чертежи.
Фиг. 1. Схематическое представление молекул DD-PHK, генерируемых на теломерах и LNAолигонуклеотидов. DD-PHK TeloG и TeloC продуцируются из дисфункциональных теломер и необходимы для активации DDR. Антисмысловые олигонуклеотиды (олигонуклеотиды против TeloG и TeloC) могут связываться с DD-PHK и ингибировать ее функцию, а поэтому они обладают терапевтической активностью. Представленные последовательности являются неограничивающими примерами осуществления настоящего изобретения. Представленные последовательности являются примерами возможных последовательностей ASO.
- 14 039775
Фиг. 2. Теломерные DD-PHK активируются после удаления кэпа из теломеры. Отобранные по размеру молекулы РНК (менее, чем 40 нуклеотидов) анализировали с помощью ОТ-кол.ПЦР. Микро-РНК mir29b была использована в качестве нормализатора (n=4 независимых эксперимента). TRF2+/- и TRF2-/относятся к клеткам, которые имеют гетерозиготную или гомозиготную делецию TRF2; TeloG и TeloC представляют собой DD-PHK с любой последовательностью теломерной цепи, как показано на фиг. 1.
Фиг. 3. Теломерные DD-PHK активируются в ALT-клеточных линиях. Отобранные по размеру молекулы РНК (менее, чем 40 нуклеотидов) анализировали с помощью ОТ-кол.ПЦР для детектирования уровней DD-PHK. ALT-клеточную линию WI-38 VA-13 сравнивали с родительской не-ALT (или негативной по ALT) клеточной линией WI-3 8 (n=3 независимых эксперимента); а позитивную по теломеразе (не-ALT или ALT-негативную) клеточную линию SW39 сравнивали с ALT-позитивной клеточной линией SW26 (n=2 независимых эксперимента). Искусственно встроенный РНК-олигонуклеотид был использован в качестве нормализатора. TeloG и TeloC представляют собой DD-PHK с любой последовательностью теломерной цепи, как показано на фиг. 1.
Фиг. 4 . LNA-олигонуклеотид с теломерной последовательностью специфически снижает рост клеток U-2 OS. Клетки U-2 OS (ALT или ALT-позитивные), BJ ELR (не-ALT или ALT-негативные) и BJ hTERT (не-ALT или ALT-негативные) трансфицировали на дни 0, 3 и 7 указанной LNA (имитатором, контролем, LNA против TeloG или против TeloC) в концентрации 200 нМ. На графиках показано относительное число клеток, нормализованное на день 0 (n=3 независимых эксперимента; *=величина р<0,05, **=величина р<0,01).
Фиг. 5. LNA-олигонуклеотид с теломерной последовательностью снижает число ALTассоциированных телец PML (АРВ) в U-2 OS. Клетки U-2 OS трансфицировали указанной LNA в конечной концентрации 2 00 нМ и окрашивали на АРВ на 3-й день после трансфекции (n=3 независимых эксперимента; **=величина p<0,001).
Фиг. 6. LNA-олигонуклеотид с теломерной последовательностью снижает рост клеток в различных ALT-клеточных линиях. Клетки U-2 OS, Saos-2 и WI-38 VA-13 трансфицировали на дни 0, 3 и 7 указанной LNA в конечной концентрации 200 нМ. На графиках показано относительное число клеток на день 10, нормализованное на день 0.
Фиг. 7. LNA-олигонуклеотид с фосфоротиоатным остовом (PSLNA) и с теломерной последовательностью является в 10 раз более эффективным для ингибирования роста клеток и сохраняет специфичность к ALT-клеткам. Клетки U-2 OS и BJ-hTERT трансфицировали на дни 0, 3 и 7 указанной PS-LNA в указанных концентрациях. На графиках показано относительное число клеток на день 10, нормализованное на день 0.
Фиг. 8. LNA-олигонуклеотид с фосфоротиоатным остовом (PSLNA) и с теломерной последовательностью является эффективным для специфического ингибирования роста клеток U-2 OS. Клетки U-2 OS и BJ-hTERT трансфецировали на дни 0, 3 и 7 указанной PS-LNA в концентрации 20 нМ. На графиках показано относительное число клеток на день 10, нормализованное на день 0.
Фиг. 9. Схематическое представление молекул DD-PHK, продуцированных в теломерах, и небольших LNA-олигонуклеотидов. Небольшие молекулы LNA могут связываться с DD-PHK TeloG и TeloC и ингибировать ее функцию, а поэтому они обладают терапевтической активностью. Представленные последовательности являются неограничивающими примерами осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 10. Небольшой LNA-олигонуклеотид против TeloC является эффективным для ингибирования роста клеток U-2 OS. Клетки U-2 OS трансфецировали на дни 0, 3 и 7 указанной фосфортиоатной LNA в конечной концентрации 2 0 нМ. На графиках показан относительный рост клеток, определенный методом с использованием резазурина (см. Материалы и методы), и нормализованный на день 0 (n=3 независимых эксперимента; ***=величина р<0,001).
Фиг. 11. Небольшой LNA-олигонуклеотид против TeloC является эффективным для специфического ингибирования роста клеток U-2 OS. Клетки U-2 OS и BJ трансфецировали на дни 0, 3 и 7 указанной LNA в концентрации 2 0 нМ. На графиках показан относительный рост клеток, определенный методом с использованием резазурина и нормализованный на день 0.
Фиг. 12. Небольшой LNA-олигонуклеотид против TeloC, если он используется в 3 раза более высокой концентрации, обладает такой же эффективностью в отношении ингибирования роста клеток U-2 OS, как и PS-LNA олигонуклеотид против TeloC. Клетки U-2 OS трансфецировали на день 0 указанной фосфортиоатной LNA в концентрации либо 20 нМ (PS против TeloC), либо 60 нМ (небольшая контрольная LNA, небольшая LNA против TeloG, небольшая LNA против TeloC). На графике показан относительный рост клеток на день 6, определенный методом с использованием резазурина и нормализованный на день 0.
Фиг. 13. Небольшой LNA-олигонуклеотид против TeloC, если он используется в 3 раза более высокой концентрации, обладает специфичностью к клеткам U-2 OS. Клетки U-2 OS и BJ трансфецировали на день 0 указанной фосфортиоатной LNA в концентрации 60 нМ (небольшая контрольная LNA, небольшая LNA против TeloG, небольшая LNA против TeloC) или 20 нМ (PS против TeloC). На графике показан относительный рост клеток, определенный методом с использованием резазурина и нормализованный на
- 15 039775 день 0.
Фиг. 14. Клетки GBM14 являются чувствительными к PS-LNA-олигонуклеотиду против TeloC, доставленному с помощью оголенной ДНК в зависимости от концентрации. GBM14 инкубировали с 10 или 40 мкМ указанной PS-LNA в клеточной культуральной среде. На графиках показан относительный рост клеток, определенный методом с использованием резазурина и нормализованный на день 0.
Фиг. 15. Клетки GBM14 являются чувствительными к небольшому LNA-олигонуклеотиду против TeloC, доставленному с помощью оголенной ДНК. GBM14 инкубировали с 120 мкМ указанной небольшой LNA в клеточной культуральной среде. На графиках показан относительный рост клеток, определенный методом с использованием резазурина и нормализованный на день 0.
Фиг. 16. Рост опухоли G292 in vivo уменьшается после обработки PS против TeloC и небольшой молекулой против TeloC. Мышей, несущих опухоли G2 92, обрабатывали путем внутрибрюшинной инъекции указанного олигонуклеотида или PBS в качестве контроля (n=7 мышей на группу; **=величина р<0,01).
Фиг. 17. Опухоли G292 достигали размера 1 см3 медленнее, если они были обработаны PS против TeloC. (n=7 мышей на группу; **=величина р<0,01; ***=величина р<0,001).
Фиг. 18. Рыба-зебра с мутантной теломеразой второго поколения, обработанная PS против TeloC или против TeloG, имеет фенотип менее тяжелой патологии. Рыбе-зебре с мутантной теломеразой инъецировали PS-LNA и скрещивали с получением второго поколения. На графиках показан процент рыб второго поколения, имеющих морфологические дефекты различной степени тяжести, ассоциированные с теломеразной мутацией (было проанализировано по меньшей мере 200 рыб на образец).
Фиг. 19. Рыба-зебра с мутантной теломеразой второго поколения, обработанная PS против TeloC или против TeloG, имеет большую продолжительность жизни. На графике указана продолжительность жизни рыбы-зебры с мутантной теломеразой второго поколения (было проанализировано по меньшей мере 200 рыб на образец).
Фиг. 20. PS против TeloG и против TeloC предотвращает рост клеток, экспрессирующих прогерин. Инфицированные ретровирусом клетки BJ, экспрессирующие ламин А или прогерин, трансфицировали указанной PS-LNA (20 нМ). Клетки фиксировали и окрашивали после 8-часовой подачи BrdU-импульса для иммунофлуоресценции. Антитела против BrdU и Ki67 были использованы для количественной оценки.
Фиг. 21. Прогерин экспрессируется на аналогичных уровнях в PS-LNA-обработанных образцах. Инфицированные ретровирусом клетки BJ, экспрессирующие ламин А или прогерин, зондировали на экспрессию ламина (который детектируется как изоформы А и С), прогерина и винкулина в качестве загрузочного контроля.
Фиг. 22. PS против TeloG повышает продолжительность жизни у мышей с моделью экспрессии прогерина в коже. На графике показана продолжительность жизни у мышей с HGPS (экспрессирующих прогерин) и у мышей дикого типа, обработанных PS-LNA-олигонуклеотидом против TeloG по сравнению с необработанными мышами (п означает число мышей, анализируемых в каждой группе).
Фиг. 23. Детектирование транскриптов теломерных предшественников. (а) Общую клеточную РНК выделяли из MEF (мышиных эмбриональных фибробластов) указанного генотипа и использовали в цепьспецифическиой ОТ-кол.ПЦР для детектирования транскриптов теломерных предшественников. (Ь) Для детектирования транскриптов теломерных предшественников в человеческих фибробластах использовали ту же самую ОТ-кол.ПЦР как в (а). Общую клеточную РНК выделяли из SW39 (не-ALT) и SW26 (ALT) как показано на правой панели.
Фиг. 24. Активация путей апоптоза ALT-клеток после обработки LNA против TeloC. Клетки U-2 OS обрабатывали указанными LNA. PS-LNA трансфецировали в концентрации 20 нМ, а небольшие LNA трансфецировали в концентрации 60 нМ. Клетки трансфецировали на дни 0, 3 и 7. Образцы собирали в указанные дни для детектирования белков-маркеров апоптоза, расщепления каспазой 3 и Parp-1 или для FACS-анализа (расщепления субфракцией G1 и каспазой 3).
Фиг. 25. LNA против TeloC индуцирует более продолжительную S-фазу ALT-клеток. Клетки U-2 OS трансфецировали указанными LNA, PS-LNA в концентрации 20 нМ, и небольшой LNA в концентрации 60 нм, на дни 0, 3 и 7. Клетки собирали на дни 2, 6 и 9 для FACS-анализа клеточного цикла.
Фиг. 26. LNA против TeloC представляет собой ALT-специфический ингибитор. Клеточные линии трансфецировали указанными LNA, PS-LNA в концентрации 20 нМ и небольшой LNA в концентрации 60 нМ, на дни 0, 3 и 7. На графиках показано относительное число клеток, определенное методом с использованием резазурина и нормализованное на день 0.
Фиг. 27. Доставка LNA с помощью оголенной ДНК является достаточной для ингибирования роста клеток U-2 OS. (А) Клетки U-2 OS обрабатывали LNA в указанных концентрациях на день 0. На графиках показано относительное число клеток на день 7, определенное по величинам резазурина, нормализованным на день 0. (В) Клетки U-2 OS обрабатывали, как описано в (А), а число клеток определяли на день 6.
Фиг. 28. Рост G-292 ингибируется LNA против TeloC. G-292 трансфицировали указанными LNA в
- 16 039775 концентрации 200 нМ на день 0 и 3. На графике показано относительное число клеток, измеренное по величинам резазурина, нормализованным на день 0.
Фиг. 29. Доставка LNA с помощью оголенной ДНК является достаточной для ингибирования роста клеток G-292. Клетки G-292 обрабатывали LNA в указанных концентрациях на день 0. На графике показано относительное число клеток на 7-й день, измеренное по величинам резазурина, нормализованным на день 0.
Фиг. 30. 2'-О-метил (2'-О-Ме) ASO против TeloC является эффективным для специфического ингибирования роста клеток U-2 OS. Клетки U-2 OS и BJ трансфицировали на день 0 указанными 2'-О-Ме ASO или PS против TeloC в концентрации 20 нМ. На графиках показано относительное число клеток, измеренное по величинам резазурина, нормализованным на день 0.
Фиг. 31. 2'-О-Ме ASO являются нетоксичными в концентрации до 100 нМ. Клетки U-2 OS трансфицировали на день 0 указанными ASO в указанных концентрациях. На графиках показано относительное число клеток, измеренное по величинам резазурина, нормализованным на день 0.
Подробное описание изобретения Материалы и методы
Культивированные клетки: MEF CRE-ER TRF2fl/fl и MEF CRE-ER TRF2 fl/+ Celli and de Lange, 2005) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1 % глутамина; и для активации CRE и индуцирования TRF2-нокаута, клетки обрабатывали 600 нМ 4-гидрокситамоксифена в течение 24 ч и анализировали через 24 ч. Клетки U-2 OS (ATCC) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% глутамина. Клетки Saos-2 (ATCC) культивировали в среде Маккоя 5A+Glutamax с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки. WI-38 и WI-38 ВА-13 (АТСС) культивировали в MEM+Glutamax с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата натрия. Позитивную по теломеразе клеточную линию SW39 (ALT-негативную) и ALT-позитивную клеточную линию SW26 (Bechter et al., 2003) культивировали в смеси модифицированной по способу Дульбекко среды Игла и среды 199, в которую была добавлена 10% телячья сыворотка определенного состава (4:1). Клетки BJ hTERT получали путем ретровирусного инфицирования клеток BJ (АТСС) плазмидой, экспрессирующей человеческую теломеразу, и культивировали в MEM+Glutamax с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата натрия. Клетки BJ ELR (Hahn et al., 1999) культивировали в среде DMEM:M199 (4:1) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 25 мМ HEPES. GBM14 (ALT-позитивные) культивировали в среде DMEM/F12 с GlutaMAX с добавлением 2% В27, 5 мкг/мл гепарина, 20 нг/мл bFGF и 20 нг/мл EGF. Клетки G-292 (АТСС) культивировали в среде Маккоя 5A+Glutamax с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% глутамина.
Трансфекция: LNA кипятили при температуре 90°С в течение 5 мин и охлаждали на льду в течение 5 мин до трансфекции липофектамином RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителей в указанных конечных концентрациях. Псевдотрансфецированные клетки обрабатывали только RNAiMAX.
Кривые роста: Клетки в каждый указанный момент времени подсчитывали с тремя повторностями на счетчике Култера (Beckman) или с помощью набора для анализа на токсичность in vitro с использованием резазурина (Sigma), что позволяет осуществлять спектрофотометрическое измерение метаболической активности живых клеток в соответствии с инструкции производителей.
Иммунофлуоресценция: Клетки фиксировали раствором метанола/ацетона (1:1) в течение 2 мин при комнатной температуре. После блокирования, клетки окрашивали первым антителом против PML (Santa Cruz) в течение 1 ч при комнатной температуре, промывали и инкубировали с конъюгированными антимышиными вторыми антителами в течение 40 мин при комнатной температуре. Ядра окрашивали DAPI (1 мкг/мл). Конфокальные срезы были получены на конфокальном лазерном микроскопе Leica TCS SP2 AOBS путем взятия оптических Z-срезов на различных уровнях вдоль оптической оси и подсчета число АРВ на клетку с помощью компьютерной программы CellProfiler.
Выделение РНК: Общую клеточную РНК экстрагировали с помощью набора для выделения миРНК Mirvana™ (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителей.
Кол.ПЦР небольшой РНК: Синтез кДНК и ОТ-ПЦР осуществляли с использованием ПЦР-системы miScript (Qiagen). РНК фракционировали путем нанесения 5 мкг общей РНК на денатурирующий полиакриламидный гель. Молекулы РНК, длина которых составляла менее, чем 40 нуклеотидов, подвергали гель-экстрации, и кДНК синтезировали с использованием набора miScript II RT с буфером HISpec. Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение 60 мин с последующей стадией термоинактивации в течение 5 мин при 95°С. кДНК анализировали с использованием смеси для ПЦР miScript SYBR Green PCR Master Mix, универсального праймера miScript, праймера mir29b (tagcaccatttgaaatcagtgtt) SEQ ID NO: 7, встроенного праймера (CGAATTCCACAAATTGTTATCC) SEQ ID NO: 8 для мониторинга эффективности экстракции РНК из геля и праймеров, содержащих теломерную последовательность (TAGGGTTAGGGTTAGGGT, SEQ ID NO: 9, СССТААСССТААСССТАА SEQ ID NO:
10) .
Цепь-специфическая кол.ПЦР: Была использована общая РНК, взятая из набора для выделения
- 17 039775 миРНК Mirvana™. Образцы обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific) для удаления любого возможного остаточного загрязнения геномной ДНК. 1000 нг общей РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК Superscript (Invitrogen) с использованием цепьспецифических праймеров. Были использованы следующие праймеры для обратной транскрипции: RPPOrev для детектирования мРНК домашнего хозяйства Rplp0; teloCrev для детектирования Gбогатой цепи теломерного предшественника; teloGrev для детектирования С-богатой цепи теломерного предшественника.
ОТ-кол.ПЦР проводили с использованием зеленого Roche SYBR. Для каждой ОТ-кол.ПЦР-реакции использовали 50 нг кДНК. Для амплификации теломерных повторов, авторами был адаптирован метод, описанный в литературе (Cawthon, 2002), что позволяет продуцировать продукт амплификации фиксированной длины. Были использованы праймеры для кол.ПЦР: RPPOfwd и RPPOrev для детектирования мРНК домашнего хозяйства Rplp0; teloF и teloR для детектирования теломерных предшественников.
Ниже представлен список праймеров (в 5'-3'-ориентации), используемых для цепь-специфической ОТ-кол.ПЦР:
RPPOfwd: TTCATTGTGGGAGCAGAC (SEQ ID No. 11)
RPPOrev: CAGCAGTTTCTCCAGAGC (SEQ ID No. 12) teloCrev: CCCTAACCCTAACCCTAA (SEQ ID No. 13) teloGrev: TAGGGTTAGGGTTAGGGT (SEQ ID No. 14) teloF: CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGG TTTGGGTT (SEQ ID No. 15) teloR: GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCC TTACCCTTACCCT (SEQ ID No. 16) .
Нацеленное секвенирование небольшой РНК
Два линкера лигировали по двум концам молекул РНК в образце для анализа. 3'-конец исходной РНК лигировали с моноаденилированным ДНК-линкером под действием усеченного фермента РНКлигазы 2 Т4 (NEB) и инкубировали в течение 1 ч при 25°С. Затем 5'-РНК-линкер лигировали под действием РНК-лигазы 1 Т4 (NEB) с РНК-мишенью при 20°С в течение 1 ч, и после удаления 5'-кэп-структуры под действием кислой пирофосфатазы табака (Epicenter), инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Синтез кДНК посредством линкеров осуществляли с использованием набора для ОТ-ПЦР PrimeScript (Takara). Реакционную смесь для обратной транскрипции инкубировали при 44°С в течение 1 ч. Последующую ПЦР-амплификацию с использованием ДНК-полимеразы Phusion® High-Fidelity (NEB) проводили при следующих условиях: 98°С, 2 мин; 22 цикла: 98°С, 30 с, 55°С, 30 с, 72°С, 30 с; 72°С, 5 мин; и выдерживание при температуре 4°С. Для захвата амплифицированных кДНК-мишеней использовали комплементарные РНК-ловушки, содержащие меченные биотином нуклеотиды. Эти РНК-ловушки получали с использованием набора для транскрипции AMbion MAXIscript T7 in vitro (Life Technologies) и смеси для мечения РНК биотином (Roche). дцДНК, содержащую промотор Т7, инкубировали при 37°С в течение 1 ч для транскрипции in vitro. РНК-ловушки и кДНК-мишени инкубировали при 37°С в течение 48 ч в присутствии ингибитора SUPERase (Life Technologies) и следующих блокирующих агентов: человеческого Cot-1 (Life Technologies), раствора ДНК спермы лосося UltraPure™ (Thermo Scientific) и 200 мкМ специально синтезированного блокирующего агента. Гибридные молекулы РНК-кДНК были иммобилизованы на стрептавидиновых сферах Dynabeads® MyOne™ C1 (Life Technologies), а нежелательные кДНК удаляли путем отмывки. Затем иммобилизованные кДНК подвергали ПЦР для присваивания штрихового кода с использованием ПЦР-праймеров Script Index (Illumina) и секвенировали на секвенаторе MiSeq (Illumina). Были использованы следующие олигонуклеотидные последовательности (в 5'-3'-ориентации):
- 18 039775
З'-ДНК-линкер AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-амин (SEQ
ID No. 17)
5'-РНК-линкер ACACUCUUUCCCUACACGACGCUCUUCCGAUCU (SEQ ID No.
18)
ОТ-праймер GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (SEQ ID No.
29)
Прямой ПЦР-праймер (PCR Fw)
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT (SEQ ID No. 30)
Обратный ПЦР-праймер (PCR Rv)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGAT
CT (SEQ ID No. 31)
Прямой блокирующий праймер Fw
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT (SEQ ID No. 32)
Обратный блокирующий праймер Rv
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC
GATCT (SEQ ID No. 33).
Вестерн-блот-анализ: Клетки собирали в буфере для лизиса ТЕВ150 Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 5 мМ EGTA, 0,5% Тритон, 10% глицерина) и быстро замораживали в жидком азоте, после чего препарат образца подвергали Вестерн-блот-анализу. Для лизиса, клетки оттаивали на льду, центрифугировали в течение 15 мин при +4°С и 13200 об/мин. Супернатант, содержащий белок, сохраняли, а клеточный дебрис отбрасывали. Белки количественно оценивали с помощью анализа Брэдфорда. После переноса, мембраны зондировали с использованием антитела против каспазы-3 (Cell Signaling 9661), анти-PARP антитела (Serotec) и антитела против тубулина (Millipore). Для ламина А/С, прогерина и тубулина, клетки собирали в буфере Лэммли 1х и хранили при -80°С. Для лизиса, клетки пропускали через шприц и кипятили при 95°С в течение 5 мин. Белки количественно оценивали с помощью анализа Лаури. После переноса мембраны зондировали с использованием антитела против ламина (Santa Cruz Biotech sc-6215), распознающего изоформы А и С ламина и прогерин, и антитела против тубулина (Millipore).
FACS-анализ: Для анализа клеточного цикла среду супернатанта сохраняли, а затем центрифугировали с трипсинизированными клетками, фиксировали в 75% этаноле и окрашивали иодидом пропидия (PI, Sigma, 50 мкг/мл) и раствором РНКазы A (Sigma, 250 мкг/мл) в 1xPBS. Для анализа расщепления каспазой-3, проводимого с помощью FACS, среду супернатанта сохраняли и центрифугировали с трипсинизированными клетками, фиксировали в 1% формамиде на льду в течение 20 мин, хранили в 75% этаноле, окрашивали антителом против каспазы-3 (Cell Signaling 9661), а затем конъюгировали с флуорофором ФИТЦ (ФИТЦ-конъюгированным антикроличьим антителом Immunojackson), и окрашивали раствором PI/РНКазы. Образцы анализировали на BD FACS CantoII с использованием лазера на 488 нм и фильтра 530/30 для ФИТЦ и лазера на 670 нм и фильтра 585/42 для PI. Сбор данных осуществляли с использованием компьютерной программы BDFacsDIVA v6.1.1, а анализ проводили с использованием компьютерной программы ModfitLT3.0. Для субфрагмента G1 и каспазо-позитивных клеток было проанализировано по меньшей мере 500 событий на образец. Для клеточного цикла было проанализировано по меньшей мере 8000 событий на образец.
Доставка с помощью оголенных ДНК: Олигонуклеотиды в PBS добавляли непосредственно к посеянным клеткам, а клетки, обработанные контролем, получали только в PBS. В каждом эксперименте использовали постоянное количество PBS на каждое условие.
Ретровирусная инфекция: Клетки BJ трансдуцировали ретровирусным вектором, экспрессирующим либо ген ламина А дикого типа, либо мутантный ген прогерина и отбирали в присутствии пуромицина.
Обработка in vivo ксенотрансплантатов G292: Голых самцов мышей CD-I, поставляемых от Charles River (Италия), содержали в клетках на подстилках, автоклавированных паром (стерильных), давали γ-облученный корм и подкисленную минеральную воду.
10x106 клеток G-292 вводили подкожно в левый бок самцов голых мышей на день 0. Животных регулярно осматривали на появление опухолей. Когда опухоли достигали объема от 90 до 220 мм3, то мышей произвольно распределяли на группы и определяли их как группы обработки, состоящие из 7 мышей на группу. После начала обработки, средний объем опухоли составлял приблизительно 0,14 см3. Обработку проводили внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг на дни 13, 17, 21, 25 для PBS и для небольшого олигонуклеотида против TeloC, и на дни 13 и 17 для PS против TeloC. Все процедуры были обобрены
- 19 039775
Комитетом по содержанию и обращению с животными в соответствии со строгим соблюдением правил ухода за лабораторными животными, принятых в Италии и в других странах Европы. Вес тела на день имплантации опухоли составлял 25-38 г.
Обработка in vivo рыбы-зебры с трет-мутантом:
Гетерозиготных по теломеразе мутантных рыб-зебр (Tert +/-, http://www.nebi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2762901/) скрещивали и в желток икры на одной клеточной стадии вводили 0,5 нг/мкл PS LNA. Инъецированных рыб доводили до зрелых особей в питомнике, а затем генотипировали путем прокалывания плавников в целях идентификации гомозиготных мутантов рыб (поколение 1 Tert -/-), которые были скрещены, и их потомство (поколение 2) анализировали на выживаемость и фенотип.
Обработка in vivo мышей HGPS: Мышам HGPS, экспрессирующим прогерин в эпидермальных кератиноцитах (McKenna et al., Aging cell 2014), внутрибрюшинно инъецировали PS LNAолигонуклеотиды PS LNA в концентрации 15 мг/кг, каждые 3-4 дня, начиная со дня получения эмбриона 17,5.
Антисмысловые олигонуклеотиды:
Последовательности LNA: LNA-олигонуклеотиды были получены от Exiqon.
LNA с фосфатным остовом (фиг. 4, 5, 6):
Контроль: ACTGATAGGGAGTGGTAAACT (SEQ ID No: 19)
Олигонуклеотид против TeloG: ссстаассстаассстаассс (SEQ ID No: 20)
Олигонуклеотид против TeloC: GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (SEQ ID No: 21)
LNA с полностью фосфортиоатным остовом (LNA-PS) (фиг. 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31): (* означает фосфортиоатную модификацию)
PS-контроль: A*C*T*G*A*T*A*G*G*G*A*G*T*G*G*T*A*A*A*C*T (SEQ ID No: 19)
PS против TeloG: c*c*c*t*a*a*c*c*c*t*a*a*c*c*^^ (SEQ ID No. 20)
PS против TeloC: g*g*g*t*t*a*g*g*g*t*t*a*g*g*g*t*t*a*g*g*g (seq id No: 21)
Небольшая (8-мерная) LNA с полностью фосфортиоатным остовом (фиг. 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 24, 25, 26, 27, 28, 29):
Небольшая контрольная LNA: C*G*T*C*A*T*A*C (SEQ ID No: 22)
Небольшая LNA против TeloG: С*С%*Т*А^А%*С (нуклеотиды 1-8 SEQ ID No: 20)
Небольшая LNA против TeloC: G*G*G*T*T*A*G*G (нуКлеотиды 1-8 SEQ ID No: 21).
2-О-метил-олигонуклеотиды (фиг. 30, 31): 2-O-метил-олигонуклеотиды были получены от Integrated DNA Technologies.
(*означает фосфортиоатную модификацию; m означает модификацию метильной группы во 2'положении)
2'-0-Ме-контроль :
mU*mU*mA*mU*mC*mC*mG*mC*mU*mC*iiiA*mC*mA*mA*mU*mU*mC*mC*mA*mC * mA*mU (SEQ ID No. 34)
2'-O-Me против TeloG:
mC*mC*mC*mT*mA*mA*mC*mC*mC*mT*mA*irA*mC*mC*mC*mT*mA*mA*mC*mC * mC (SEQ ID No. 20)
2'-O-Me против TeloC:
mG*mG*mG*mT*mT*mA*mG*mG*mG*mT*mT*mA*mG*mG*mG*mT*mT*mA*mG*mG * mG (SEQ ID No. 21)
Статистический анализ: Результаты представлены как среднее + стандартное отклонение или стандартная ошибка среднего. Значение Р вычисляли по двустороннему критерию Стьюдента, критерию хиквадрат, критерию Манна-Уитни или, если это необходимо, по критерию Мантеля-Кокса.
Результаты
Авторами настоящего изобретения были измерены уровни DD-РНК, генерируемых в поврежденных теломерах, с помощью кол.ПЦР. Для этого были использованы фибробласты мышиных эмбрионов (ФМЭ), в которых теломеры могут быть деблокированы путем удаления связывающегося с теломерой белка TRF2 (Celli and de Lange, 2005). Это приводит к активации DDR практически на всех теломерах. Это модель представляет собой общепринятую модель дисфункции теломеры. Как уже было показано, что при повреждении ДНК небольшие молекулы РНК, обозначаемые DD-PHK, генерируются в этом специфическом поврежденном локусе и несут ту же самую последовательность поврежденной ДНК (Francia et al., 2012.); и таким образом, авторами настоящего изобретения было предположено, что две различных серии молекул DD-PHK могут продуцироваться после деблокирования телломеры, то есть, серия, образующаяся после транскрипции G-богатой цепи теломерной ДНК (TeloC DD-PHK), и серия, образующаяся после транскрипции С-богатой цепи теломерной ДНК (TeloG DD-PHK; фиг. 1). С помощью ОТ- 20 039775 кол.ПЦР и нацеленного секвенирования небольшой РНК, авторы смогли детектировать репродуцируемое 2-3-кратное увеличение уровней DD-PHK TeloC и TeloG в клетках с деблокированными теломерами, по сравнению с контрольными клетками, имеющими нормальные теломеры (фиг. 2).
В клетках с деблокированными теломерами, транскрипты-предшественники DD-PHK TeloG и TeloC индуцировались на более высоком уровне, чем в контрольных клетках (фиг. 23а), что свидетельствует о том, что деблокирование теломер индуцирует транскрипцию в теломерах.
ALT-позитивные клетки обнаруживают сильную хроническую активацию DDR в теломерах (Cesare & Reddel, 2010). Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что это коррелирует с более высокими уровнями tDDRNA, как было детектировано с помощью ОТ-кол.ПЦР в ALT-позитивных WI-38 VA-13, по сравнению с их родительской клеточной линией, в человеческих фибробластах WI-38, и в ALT-позитивных SW26 по сравнению с позитивными по теломеразе фибробластами легких плода SW39, которые представляют собой клеточные линии, иммортализованные из одной и той же клеточной линии фибробластов, IMR90, что приводит к вырабатыванию различных механизмов сохранения теломер (Bechter et al., 2003) (фиг. 3). Кроме того, оба транскрипта-предшественника DD-PHK TeloG и TeloC также сильно активировались в ALT-позитивных клетках SW26 по сравнению с контрольными клетками SW39 (фиг. 23b).
ALT-позитивные клетки зависят от механизма гомологичной рекомбинации, способствующего сохранению теломер (Cesare & Reddel, 2010), и таким образом, авторами настоящего изобретения было протестировано, обладают ли они гиперчувствительностью к ингибированию DD-PHK.
Авторами настоящего изобретения были трансфецированы ALT-клеточная линия и клетки человеческой остеосаркомы U-2 OS блокированной нуклеиновой кислотой (LNA) (Veedu и Wengel, 2010), то есть, молекулами, направленными на G- или С-богатые транскрипты теломер (анти-TeloG и анти-TeloC молекулами, соответственно), или контрольной LNA, и авторами настоящего изобретения был проведен мониторинг роста клеток в течение десяти дней. Рост клеток, трансфецированных контрольной LNA и анти-TeloG LNA, не отличался от роста псевдообработанных клеток; а в другом случае анти-TeloC LNA значительно снижали рост U-2 OS (фиг. 4).
Этот эффект является специфичным для ALT-клеток, поскольку анти TeloC-LNA не оказывает значительного влияния на скорость роста экспрессирующих теломеразу человеческих фибробластов, либо трансформированных (BJ-ELR), либо нормальных (BJ-hTERT) (фиг. 4).
Для мониторинга влияния LNA-обработки на биомаркеры ALT авторами настоящего изобретения было оценено присутствие ALT-ассоциированных телец PML (АРВ), то есть, ядерных структур, содержащих факторы рекомбинации и теломерную ДНК, специфичную к ALT-клеткам (Henson & Reddel, 2010). Благодаря непрямому иммуннологическому окрашиванию на белок PML авторами настоящего изобретения было выявлено снижение уровней АРВ в клетках U-2 OS, обработанных анти-TeloC LNA, по сравнению с контролем или анти-TeloG LNA (фиг. 5).
Для расширения данных своих наблюдений авторы настоящего изобретения трансфицировали ALT-позитивные клеточные линии U-2 OS, Saos-2 и WI-38 VA-13 молекулами LNA против TeloG и против TeloC. Анти-TeloC LNA значительно ингибировала рост клеток во всех трех протестированных клеточных линиях (фиг. 6).
Фосфоротиоатный остов (PS) представляет собой модификацию, которая делает олигонуклеотид более резистентным к разложению нуклеазой и которая обычно используется для усиления активности олигонуклеотидов, особенно in vivo. Авторами настоящего изобретения были сконструированы молекулы LNA, которые имеют такую же последовательность, как и фосфодиэфирная LNA, но с полностью фосфортиоатным остовом (PS LNA, см. Материалы и методы). PS LNA против TeloC предотвращает рост клеток U-2 OS при концентрации 20 нМ, которая в 10 раз ниже, чем концентрация, используемая для фосфодиэфирной LNA (фиг. 7 и 8), но дает меньший эффект в отношении клеток BJ hTERT, используемых в качестве контроля.
Было показано, что так называемые небольшие/короткие LNA-олигонуклеотиды, которые имеют полный LNA-олигонуклеотидный остов длиной меньшей мере в 6 нуклеотидов, а предпочтительно, по меньшей мере 8 нуклеотидов, специфически нацелены на комплементарную РНК-мишень, как in vitro, так и in vivo (Obad et al., 2011). Авторами настоящего изобретения были сконструированы небольшие/короткие LNA-олигонуклеотиды с фосфортиоатным остовом, называемые небольшой анти-TeloC LNA и небольшой анти-TeloG LNA, которые имеют длину в 8 нуклеотидов и нацелены на теломерные транскрипты (фиг. 9).
Клетки U-2 OS, трансфецированные небольшим анти-TeloC олигонуклеотидом, росли значительно медленнее, чем псевдотрансфецированные клетки или клетки, трансфецированные контролем или небольшим анти-TeloG олигонуклеотидом (фиг. 10). Этот эффект был специфичным для ALT-клеток, поскольку анти-TeloC LNA не снижала рост нормальных человеческих фибробластов (клеток BJ) (фиг. 11). Однако влияние небольшого анти-TeloC олигонуклеотида на рост клеток было менее выраженным, чем влияние PS LNA против TeloC, используемой в той же самой молярности (фиг. 10).
С использованием в 3 раза большего количества небольших LNA-олигонуклеотидов (60 нМ) пропорционально их более короткой длине, и соответствующих теломерным повторам РНК, авторы настоя- 21 039775 щего изобретения обнаружили ингибирующее действие на пролиферацию ALT-клеток с использованием небольшой анти-TeloC LNA, аналогичное действию PS LNA против TeloC в концентрации 20 нМ (фиг.
12). Кроме того, при этой более высокой концентрации, эффект от небольшой/короткой анти-TeloC LNA был специфичным для ALT-клеток (фиг. 13).
Снижение роста клеток, опосредуемое анти-TeloC LNA, a именно, PS LNA и небольшой LNA, сопровождалось индуцированием апоптоза, о чем свидетельствует расщепление каспазой-3, и увеличением числа суб-G1 клеток, на что указывает гибель клеток, как было подтверждено с помощью FACS-анализа, а также анализа на расщепление каспазой-3 и PARP-1 и Вестерн-блот-анализа (фиг. 24). Кроме того, клетки U-2 OS, трансфецированные анти-TeloC LNA, имели более длительную S-фазу (фиг. 25), что свидетельствует об увеличении репликативного стресса, вероятно сцепленного с ALT-механизмом (О'Sullivan & Karlseder, 2010).
Для дополнительного подтверждения специфичности анти-TeloC LNA авторами настоящего изобретения было оценено влияние трансфекции LNA на пары клеточных линий SW26 (АЛТ) и SW39 (позитивных по теломеразе), описанных ранее. Анти-TeloC LNA ингибировали рост ALT-клеток на значительно большем уровне, чем соответствующие не-ALT контроли (фиг. 26).
Поскольку трансфекция клеток может быть достигнута in vitro, но не in vivo, то важно протестировать способность клеток поглощать оголенную LNA без какого-либо агента для трансфекции. Этот процесс называется гимнотической доставкой и, вероятно, является наилучшим показателем эффективности обработки in vivo (Stein et al., 2010). Таким образом, авторами настоящего изобретения была предпринята попытка определить эффективность доставки оголенных LNA во множество ALTклеточных линий.
Доставка оголенных LNA была эффективной в клетках U-2 OS, a PS-LNA против TeloC и небольшая LNA против TeloC ингибировали рост клеток (фиг. 27 А, В). Тем не менее, клетки, обработанные контролем и анти-TeloG LNA, были относительно непораженными.
Для того чтобы продемонстрировать, что эффективность олигонуклеотидов с фосфоротиоатным остовом не ограничивается клеточными линиями остеосаркомы, авторы изобретения протестировали эти олигонуклеотиды на клетках других типов, а именно, на ALT-позитивной клеточной линии глиобластомы GBM14 (Heaphy et al., 2011) посредством доставки оголенной LNA.
Только PS против TeloC и небольшая анти-TeloC LNA значительно снижали рост клеток по сравнению с необработанными клетками (фиг. 14, 15).
Другая ALT-позитивная клеточная линия, G-292, способна расти как ксенотрансплантат у мышей (Lauvrak et al., 2013). Авторами настоящего изобретения было сначала определено, что на эту клеточную линию также влияет только анти-TeloC LNA, а не контроль (фиг. 28). Затем авторы определили эффективность доставки оголенной LNA и обнаружили, что PS-LNA против TeloC и небольшая молекула против TeloC способны ингибировать рост, а соответствующие контроли, PS против TeloC, небольшая контрольная молекула и небольшая молекула против TeloG не давали никакого эффекта (фиг. 29).
Для оценки эффективности ASO-обработки в отношении роста ALT-позитивных опухолей in vivo, клетки G-292 инъецировали в бок голых мышей до тех пор, пока у них не детектировалась опухолевая масса. Мышей с опухолью внутрибрюшинно обрабатывали ASO. PS против TeloC и небольшая LNA против TeloC снижали рост опухоли по сравнению с мышами, обработанными носителем (PBS) (фиг. 16). Авторы настоящего изобретения не проводили исследования максимально переносимой дозы, а поэтому возможно, что более высокая доза может оказывать более сильное ингибирующее действие на рост опухоли. Кроме того, PS против TeloC и небольшая молекула против TeloC увеличивали время, необходимое для достижения размера опухоли 1 см3 (фиг. 17).
Авторами настоящего изобретения были протестированы эффективность и специфичность ASO другого класса, то есть 2'-O-метил (2'-O-Ме) ASO с фосфортиоатным остовом. Только клетки U-2 OS, трансфицированные 2'-О-Ме-молекулой против TeloC, росли значительно меньше, чем псевдотрансфецированные клетки, а контроль и анти-TeloG ASO не влияли на рост клеток (фиг. 30). Важно отметить, что при использовании в той же концентрации (20 нМ) влияние молекулы 2'-О-Ме против TeloC на рост клеток было выше, чем влияние PS против TeloC. В другом случае молекула 2'-О-Ме против TeloC не снижала рост клеток BJ. Кроме того, 2'-O-Me-ASO был не токсичным в концентрации до 100 нМ (фиг. 31).
Нераковые состояния, ассоциированные с дисфункцией теломер
Генная инактивация теломеразных функций у рыбы Danio rerio (рыбы-зебры) индуцирует дисфункцию теломер и ряд патологических событий, приводящих к ускоренному старению (Anchelin et al., 2013; Carneiro et al., 2016). Поэтому такая модель представляет собой наиболее достоверную модель дисфункции теломер у позвоночных, а в частности, модель физиологического старения. Были исследованы мутантные по теломеразе рыбы-зебры второго поколения, поскольку они имеют более выраженный фенотип по сравнению с рыбами-зебрами первого поколения. Эти животные характеризуются морфологическими дефектами и более короткой продолжительностью жизни и погибают через несколько дней после рождения. PS LNA была инъецирована в одноклеточные эмбрионы мутантных по теломеразе рыб первого поколения, которые были скрещены с получением рыб второго поколения. Рыбы, выращенные из осо- 22 039775 бей, обработанных либо молекулой против TeloC, либо молекулой против TeloG, обнаруживали значительное снижение морфологических дефектов, ассоциированных с преждевременным старением (фиг.
18) и имели большую продолжительность жизни (фиг. 19).
Авторы настоящего изобретения инфицировали нормальные человеческие фибробласты вектором, экспрессирующим мутированную форму гена ламина А, также известную как прогерин (Gonzalo et al., 2016) или гена ламина А дикого типа в качестве контроля. Этот ген был мутированным у пациентов с HGPS, и его экспрессия приводила к замедлению роста клеток и к преждевременному старению, в результате чего наблюдался фенотип преждевременного старения в случае теломерного синдрома, например, у пациентов с HGPS. Было показано, что экспрессия прогерина вызывает дисфункцию теломер (Chojnowski et al., 2015). Авторами настоящего изобретения был проведен мониторинг роста этих клеток после PS LNA-трансфекции. В присутствии либо PS против TeloC, либо PS против TeloG, прогеринэкспрессирующие клетки росли быстрее, чем псевдотрансфецированные клетки, или клетки, трансфецированные контрольной PS LNA, как показал мониторинг включения BrdU и экспрессии маркера пролиферации Ki67 (фиг. 20), несмотря на аналогичные уровни экспрессии прогерина (фиг. 21). Эти результаты свидетельствуют о том, что ASO, нацеленные на tDDRNA, способны предотвращать индуцированное прогерином старение клеток.
У мышиной модели HGPS, у которой экспрессируется прогерин в эпидермальных кератиноцитах, наблюдались эпидермальная гиперплазия, тяжелые поражения кожи, истончение шерсти, явно выраженный гиперкератоз, умеренный фиброз дермы и инфильтрация воспалительных клеток, и эти мыши погибали в течение первых двух недель после рождения (McKenna et al., 2014). Авторами настоящего изобретения была проведена обработка мышей, экспрессирующих прогерин, и мышей дикого типа молекулами PS LNA против TeloG один раз во время беременности путем инъекции беременным самкам, и каждые 3 дня после рождения. Обработка анти-TeloG молекулой приводила к значительному увеличению продолжительности жизни прогерических мышей, по сравнению с необработанными животными (фиг. 22).
- 23 039775
Библиография
Anchelin, М., Alcaraz-Perez, F., Martinez, C.M., BernabeGarcia, M., Mulero, V., and Cayuela, M.L. (2013). Premature aging in telomerase-deficient zebrafish. Dis Model Meeh 6, 11011112 .
Armanios, M., and Blackburn, E.H. (2012). The telomere syndromes. Nature reviews Genetics 13, 693-704.
Azzalin, C.M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., and Lingner, J. (2007) . Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science 318, 798-801.
Bechter, O.E., Zou, Y., Shay, J.W., and Wright, W.E. (2003) . Homologous recombination in human telomerase-positive and ALT cells occurs with the same frequency. EMBO Rep 4, 11381143.
Begg, A.C., Stewart, F.A., and Vens, C. (2011). Strategies to improve radiotherapy with targeted drugs. Nat Rev Cancer 11, 239-253.
Benson, E.K., Lee, S.W., and Aaronson, S.A. (2010) . Role of progerin-induced telomere dysfunction in HGPS premature cellular senescence. J Cell Sci 123, 2605-2612.
Carneiro, M.C., Henriques, CM., Nabais, J., Ferreira, T., Carvalho, T., and Ferreira, M.G. (2016). Short Telomeres in Key Tissues Initiate Local and Systemic Aging in Zebrafish. PLoS Genet 12, el005798.
Cawthon, R.M. (2002). Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res 30, e47.
Celli, G.B., and de Lange, T. (2005). DNA processing is not required for ATM-mediated telomere damage response after TRF2 deletion. Nat Cell Biol 7, 712-718.
Cesare, A.J., and Reddel, R.R. (2010). Alternative
- 24 039775 lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet 11, 319-330.
Chojnowski, A., Ong, P.F., Wong, E.S., Lim, J.S., Mutalif, R.A., Navasankari, R., Dutta, B., Yang, H., Liow, Y.Y., Sze, S.K., et al. (2015). Progerin reduces LAP2alpha-telomere association in Hutchinson-Gilford progeria. Elife 4.
d'Adda di Fagagna, F. (2008). Living on a break: cellular senescence as a DNA-damage response. Nat Rev Cancer 8, 512-522.
d'Adda di Fagagna, F., Reaper, P.M., Clay-Farrace, L., Fiegler, H., Carr, P., Von Zglinicki, T., Saretzki, G., Carter, N.P., and Jackson, S.P. (2003). A DNA damage checkpoint response in telomere-initiated senescence. Nature 426, 194-198.
Durant, S.T. (2012) . Telomerase-independent paths to immortality in predictable cancer subtypes. J Cancer 3, 67-82.
Feng, F.Y., de Bono, J.S., Rubin, M.A., and Knudsen, K.E. (2015). Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol Cell 58, 925-934.
Flynn, R.L., Сох, K.E., Jeitany, M., Wakimoto, H., Bryll, A.R., Ganem, N.J., Bersani, F., Pineda, J.R., Suva, M.L., Benes, C.H., et al. (2015). Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science 347, 273-277.
Francia, S., Michelini, F., Saxena, A., Tang, D., de Hoon, M., Anelli, V., Mione, M., Carninci, P., and d'Adda di Fagagna, F. (2012). Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature 488, 231-235.
Fumagalli, M., Rossiello, F., Clerici, M., Barozzi, S., Cittaro, D., Kaplunov, J.M., Bucci, G., Dobreva, M., Matti, V., Beausejour, CM., et al. (2012) . Telomeric DNA damage is irreparable and causes persistent DNA-damage-response activation. Nat Cell Biol 14, 355-365.
Gonzalo, S., Kreienkamp, R., and Askjaer, P. (2016). Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome: A premature aging disease caused by LMNA gene mutations. Ageing Res Rev. Gray, K. , Kumar, S., Figg, N., Harrison, J., Baker, L., Mercer, J., Littlewood, T., and Bennett, M. (2015). Effects of DNA damage in smooth
- 25 039775 muscle cells in atherosclerosis. Circ Res 116, 816-826.
Hahn, W.C., Counter, CM., Lundberg, A.S., Beijersbergen, R.L., Brooks, M.W., and Weinberg, R.A. (1999) . Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature 400, 464-468.
Heaphy, CM., de Wilde, R.F., Jiao, Y., Klein, A.P., Edil, B.H., Shi, C, Bettegowda, C, Rodriguez, F.J., Eberhart, C.G., Hebbar, S., et al. (2011) . Altered telomeres in tumors with ATRX and DAXX mutations. Science 333, 425.
Henriques, CM., Carneiro, M.C, Tenente, I.M., Jacinto, A., and Ferreira, M.G. (2013). Telomerase is required for zebrafish lifespan. PLoS Genet 9, el003214.
Henson, J.D., and Reddel, R.R. (2010). Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers. FEBS letters 584, 3800-3811.
Herbig, U., Ferreira, M., Condel, L., Carey, D., and Sedivy, J.M. (2006). Cellular senescence in aging primates. Science 311, 1257.
Herbig, U., Jobling, W.A., Chen, B.P., Chen, D.J., and Sedivy, J.M. (2004). Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21(CIPl), but not pl6(INK4a). Mol Cell 14, 501-513.
Hewitt, G., Jurk, D., Marques, F.D., Correia-Melo, C, Hardy, T., Gackowska, A., Anderson, R., Taschuk, M., Mann, J., and Passes, J.F. (2012). Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nat Commun 3, 708.
Hogrefe, R.I. (1999) . An antisense oligonucleotide primer. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 9, 351-357.
Hu, J., Hwang, S.S., Liesa, M., Gan, B., Sahin, E., Jaskelioff, M., Ding, Z., Ying, H., Boutin, A.T., Zhang, H., et al. (2012) . Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell 148, 651-663.
Jackson, S.P., and Bartek, J. (2009). The DNA-damage response in human biology and disease. Nature 461, 1071-1078.
Janssen, H.L., Reesink, H.W., Lawitz, E.J., Zeuzem, S., Rodriguez-Torres, M., Patel, K. , van der Meer, A.J., Patick,
- 26 039775
A.К., Chen, A., Zhou, Y., et al. (2013) . Treatment of HCV infection by targeting microRNA. N Engl J Med 368, 1685-1694.
Jiang, W.Q., Zhong, Z.H., Henson, J.D., Neumann, A.A., Chang, A.C., and Reddel, R.R. (2005). Suppression of alternative lengthening of telomeres by SplOO-mediated sequestration of the MRE11/RAD50/NBS1 complex. Mol Cell Biol 25, 2708-2721.
Jiang, W.Q., Zhong, Z.H., Henson, J.D., and Reddel, R.R. (2007) . Identification of candidate alternative lengthening of telomeres genes by methionine restriction and RNA interference. Oncogene 26, 4635-4647.
Kamranvar, S.A., Chen, X., and Masucci, M.G. (2013). Telomere dysfunction and activation of alternative lengthening of telomeres in B-lymphocytes infected by Epstein-Barr virus. Oncogene 32, 5522-5530.
Kelley, M.R., Logsdon, D., and Fishel, M.L. (2014). Targeting DNA repair pathways for cancer treatment: what's new? Future Oncol 10, 1215-1237.
Kudlow, B.A., Stanfel, M.N., Burtner, C.R., Johnston, E.D., and Kennedy, B.K. (2008) . Suppression of proliferative defects associated with processing-defective lamin A mutants by hTERT or inactivation of p53. Mol Biol Cell 19, 5238-5248.
Lauvrak, S.U., Munthe, E., Kresse, S.H., Stratford, E.W., Namlos, H.M., Meza-Zepeda, L.A., and Myklebost, 0. (2013). Functional characterisation of osteosarcoma cell lines and identification of mRNAs and miRNAs associated with aggressive cancer phenotypes. Br J Cancer 109, 2228-2236.
Lee, M., Hills, M., Conomos, D., Stutz, M.D., Dagg, R.A., Lau, L.M., Reddel, R.R., and Pickett, H.A. (2014) . Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res 42, 17331746.
Li, Z., and Rana, T.M. (2014). Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nat Rev Drug Discov 13, 622-638.
Lu, Y., Leong, W., Guerin, 0., Gilson, E., and Ye, J. (2013). Telomeric impact of conventional chemotherapy. Front Med
- 27 039775
7, 411-417.
McKenna, T., Rosengardten, Y., Viceconte, N., Baek, J.H., Grochova, D., and Eriksson, M. (2014) . Embryonic expression of the common progeroid lamin A splice mutation arrests postnatal skin development. Aging Cell 13, 292-302.
Monteleone, G., Neurath, M.F., Ardizzone, S., Di Sabatino, A., Fantini, M.C., Castiglione, F., Scribano, M.L., Armuzzi, A., Caprioli, F., Sturniolo, G.C., et al. (2015). Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med 372, 1104-1113.
Muller, S., and Rodriguez, R. (2014). G-quadruplex interacting small molecules and drugs: from bench toward bedside. Expert Rev Clin Pharmacol 7, 663-679.
Neidle, S. (2010). Human telomeric G-quadruplex: the current status of telomeric G-quadruplexes as therapeutic targets in human cancer. FEBS J 277, 1118-1125.
O'Sullivan, R.J., and Karlseder, J. (2010). Telomeres: protecting chromosomes against genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 171-181.
Obad, S., dos Santos, CO., Petri, A., Heidenblad, M., Broom, 0., Ruse, C, Fu, C, Lindow, M., Stenvang, J., Straarup, E.M., et al. (2011) . Silencing of microRNA families by seedtargeting tiny LNAs. Nat Genet 43, 371-378.
Opresko, P.L., and Shay, J.W. (2016). Telomere-associated aging disorders. Ageing Res Rev.
Page, D.T., and Cudmore, S. (2001). Innovations in oral gene delivery: challenges and potentials. Drug Discov Today 6, 92-101.
Pollex, R.L., and Hegele, R.A. (2004). Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Clin Genet 66, 375-381.
Potts, P.R., and Yu, H. (2007). The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nat Struct Mol Biol 14, 581-590.
Ruden, M., and Puri, N. (2013). Novel anticancer therapeutics targeting telomerase. Cancer Treat Rev 39, 444-456.
- 28 039775
Rudolph KL, Chang S, Millard M, Schreiber-Agus N, DePinho RA. (2000). Inhibition of experimental liver cirrhosis in mice by telomerase gene delivery. Science. 287(5456): 1253-8.
Salvati, E., Rizzo, A., lachettini, S., Zizza, P., Cingolani, C, D'Angelo, C, Porru, M., Mondello, C, Aiello, A., Farsetti, A., et al. (2015) . A basal level of DNA damage and telomere deprotection increases the sensitivity of cancer cells to G-quadruplex interactive compounds. Nucleic Acids Res 43, 1759-1769.
Sanjiv, K., Hagenkort, A., Calderon-Montano, J.M., Koolmeister, T. , Reaper, P.M., Mortusewicz, 0., Jacques, S.A., Kuiper, R.V., Schultz, N., Scobie, M., et al. (2016). CancerSpecific Synthetic Lethality between ATR and CHK1 Kinase Activities. Cell Rep 14, 298-309.
Satyanarayana A, Wiemann SU, Buer J, Lauber J, Dittmar KE, Wustefeld T, Blasco MA, Manns MP, Rudolph KL. (2003) Telomere shortening impairs organ regeneration by inhibiting cell cycle re-entry of a subpopulation of cells. EMBO J. 22 (15), 4003-13.
Sissi, C, and Palumbo, M. (2014). Telomeric G-quadruplex architecture and interactions with potential drugs. Curr Pharm Des 20, 6489-6509.
Stein, C.A., Hansen, J.B., Lai, J., Wu, S., Voskresenskiy, A., Hog, A., Worm, J., Hedtjarn, M., Souleimanian, N., Miller, P., et al. (2010). Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res 38, e3.
Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., and Kauppinen, S. (2012) . Inhibition of micro RNA function by antimiR oligonucleotides. Silence 3, 1.
Veedu, R.N., and Wengel, J. (2010). Locked nucleic acids: promising nucleic acid analogs for therapeutic applications. Chern Biodivers 7, 536-542.
Wang, J., Uryga, A.K., Reinhold, J., Figg, N., Baker, L., Finigan, A., Gray, K., Kumar, S., Clarke, M., and Bennett, M. (2015) . Vascular Smooth Muscle Cell Senescence Promotes
Atherosclerosis and Features of Plaque Vulnerability. Circulation 132, 1909-1919.
Ward, A., Khanna, K.K., and Wiegmans, A.P. (2015). Targeting homologous recombination, new pre-clinical and clinical therapeutic combinations inhibiting RAD51. Cancer Treat Rev 41, 35-45.
Weber, A.M., and Ryan, A.J. (2015). ATM and ATR as therapeutic targets in cancer. Pharmacol Ther 149, 124-138.
Xi, H., Li, C, Ren, F., Zhang, H., and Zhang, L. (2013). Telomere, aging and age-related diseases. Aging Clin Exp Res 25, 139-146.
Yeager, T.R., Neumann, A.A., Englezou, A., Huschtscha, L.I., Noble, J.R., and Reddel, R.R. (1999). Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Res 59, 4175-4179.
Zhong, Z.H., Jiang, W.Q., Cesare, A.J., Neumann, A.A. , Wadhwa, R., and Reddel, R.R. (2007). Disruption of telomere maintenance by depletion of the MRE11/RAD50/NBS1 complex in cells that use alternative lengthening of telomeres. J Biol Chern 282, 29314-29322.
- 29 039775
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение олигонуклеотида, содержащего одну из следующих последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID NO: 1, (TAGGGT) SEQ ID NO: 2, (AGGGTT) SEQ ID NO: 3, (GGGTTA) SEQ ID NO: 4, (GGTTAG) SEQ ID NO: 5 или (GTTAGG) SEQ ID NO: 6 или их вариант или смесь, для лечения или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер, где указанный вариант содержит одну из следующих последовательностей: TCAGGG, TTCGGG, GTAGGG, TGAGGG, TTGGGG, TAAGGG, ATAGGG, CTAGGG, TTTGGG или TTAAGGG.
  2. 2. Применение олигонуклеотида, содержащего одну из следующих последовательностей: (TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n или (GTTAGG)n, где 1<n<1000, для лечения или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер.
  3. 3. Применение по п.2, где 1<n<500, предпочтительно 1<n<200, предпочтительно 1<n<100, предпочтительно 1<n<50, предпочтительно 1<n<20, предпочтительно 1<n<10 и предпочтительно 1<n<5.
  4. 4. Применение по любому из пп.1-3, где указанный олигонуклеотид комплементарен последовательности РНК, где указанной РНК является РНК-транскрипт, синтезированный с использованием специфической дисфункциональной теломерной ДНК в качестве матрицы для транскрипции, или фрагмент указанного РНК-транскрипта, где указанный фрагмент (DD-PHK) генерируется посредством процессинга ферментами Dicer и/или Drosha.
  5. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где заболевание представляет собой рак или вирусную инфекцию Эпштейна-Барра.
  6. 6. Применение по п.5, где заболеванием является ALT-позитивный рак.
  7. 7. Применение по п.5 или 6, где рак выбран из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, предпочтительно хондросаркомы, недифференцированных плейоморфных сарком, включая злокачественную фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, эпителиоидную саркому, липосаркому, фибросаркому и их варианты, ангиосаркому и нейрофиброму; рака центральный нервной системы, предпочтительно диффузной астроцитомы 2-й степени; анапластической астроцитомы 3-й степени; детской мультиформной глиобластомы 4-й степени, олигодендроглиомы, анапластической медуллобластомы, пилоцитозной астроцитомы 1-й степени, неанапластической медуллобластомы, менингиомы, шванномы; рака мочевого пузыря, а в частности мелкоклеточной карциномы и инвазивной уротелиальной карциномы; рака коры надпочечников или рака периферической нервной системы, а в частности ганглионейробластомы, нейробластомы и феохромоцитомы; нейроэндокринных новообразований, таких как параганглиома и карциноидная опухоль; рака почек, а в частности хромофобной карциномы, саркоматоидной карциномы и прозрачноклеточной карциномы и карциномы сосочков; рака легких и плевры, а в частности злокачественной мезотелиомы, крупноклеточной карциномы и мелкоклеточной карциномы; рака кожи, такого как злокачественная меланома; рака печени, такого как гепатоцеллюлярная карцинома; рака яичек, такого как опухоль несеменных зародышевых клеток; рака молочной железы, а в частности, лобулярной карциномы; карциномы протоков и медуллярной карциномы; рака матки, такого как серозная карцинома эндометрия, плоскоклеточная карцинома шейки матки; рака яичника, а в частности прозрачноклеточной карциномы, эндометриоидной карциномы; рака желчного пузыря, такого как аденокарцинома; рака пищевода.
  8. 8. Применение олигонуклеотида, содержащего одну из нижеследующих последовательностей: (TTAGGG) SEQ ID NO: 1, (TAGGGT) SEQ ID NO: 2, (AGGGTT) SEQ ID NO: 3, (GGGTTA) SEQ ID NO: 4, (GGTTAG) SEQ ID NO: 5 или (GTTAGG) SEQ ID NO: 6 или комплементарную им последовательность, или их вариант, или их смесь, для лечения или профилактики неракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломер, где указанный вариант содержит одну из следующих последовательностей: TCAGGG, TTCGGG, GTAGGG, TGAGGG, TTGGGG, TAAGGG, ATAGGG, CTAGGG, TTTGGG или TTAAGGG.
  9. 9. Применение олигонуклеотида, содержащего одну из следующих последовательностей: (TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n или (GTTAGG)n, где 1<n<1000, для лечения или профилактики неракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломер.
  10. 10. Применение по п.9, где 1<n<500, предпочтительно 1<n<200, предпочтительно 1<n<100, предпочтительно 1<n<50, предпочтительно 1<n<20, предпочтительно 1<n<10 и предпочтительно 1<n<5.
  11. 11. Применение по любому из пп.8-10, где нераковое состояние, ассоциированное с дисфункцией теломеры, выбрано из группы, состоящей из прогерического синдрома Хатчинсона-Гилфорда (HGPS), синдрома Вернера, синдрома Блума, атаксии-телеангиэктазии, наследственного ИФЛ, спорадическоого ИФЛ, апластической анемии, аутосомно-доминантного наследственного дискератоза, наследственной МДС-ОМЛ, врожденного дискератоза de novo, Х-сцепленного рецессивного врожденного дискератоза, синдрома Хейрала-Грейдерсона, синдрома Ревесца, аутосомно-рецессивного врожденного дискератоза, синдрома Коатса+, состояния, вызываемого мутациями или инактивацией любого из TRF1, РОТ1, ТРР1, TINF2, RAP1 или TRF2; нарушения регенерации при частичной гепатэктомии; фиброза печени, хронического воспаления печени, цирроза печени, фиброза легких; заболевания, ассоциированного с изменением дифференцировки миелоидных клеток-предшественников; недостаточности костного мозга; хрониче-
    - 30 039775 ской обструктивной болезни легких (ХОБЛ); нервных расстройств, включая болезнь Альцгеймера; остеопороза, атеросклероза, болезни сердца, мышечной дистрофии Дюшенна, диабета типа 2, нарушения репродуктивных функций, нарушения заживления ран, артрита, катаракты, возрастной дегенерации желтого пятна, старения.
  12. 12. Применение по любому из предшествующих пунктов, представляющее собой олигонуклеотид, модифицированный блокированной нуклеиновой кислотой (LNA), 2'-O-метилмодифицированный олигонуклеотид, олигонуклеотид, модифицированный фосфоротиоатом, блокированную нуклеиновую кислоту, модифицированную фосфоротиоатом, 2'-О-метоксиэтилмодифицированный олигонуклеотид, 2-O-[2(N-метилкарбамоил)этил]рибонуклеозид, метилфосфонат, морфолиноолигонуклеотид, гапмерный LNAДНК-LNA-олигонуклеотид, миксмер, химерный 2'-O-метил-РНК-ДНК-гапмер, N3'-Р5'-фосфорамидат, 2'фтор-арабинонуклеиновую кислоту, фосфорамидат-морфолино, циклогексеннуклеиновую кислоту, трицикло-ДНК, пептиднуклеиновую кислоту, неблокированную нуклеиновую кислоту, гекситнуклеиновую кислоту, боранофосфат-олигонуклеотид, фосфорамидатолигонуклеотид, где указанный модифицированный олигонуклеотид предпочтительно содержит фосфортиогруппу.
  13. 13. Применение фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один олигонуклеотид, охарактеризованный в любом из пп.1-12, и фармацевтически приемлемые носители для лечения или профилактики заболевания, характеризующегося альтернативным удлинением теломер, или в целях лечения и/или профилактики неракового состояния, ассоциированного с дисфункцией теломер.
  14. 14. Применение по п.13, где композиция также включает, по меньшей мере, другое терапевтическое средство, где другим терапевтическим средством предпочтительно является противоопухолевое средство, болеутоляющее средство или противорвотное средство.
  15. 15. Применение по п.14, где другое терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора ATR, ингибитора DDR, ингибитора HR, молекулы, которая специфически нацелена на теломеры, предпочтительно молекул, взаимодействующих с G-квадруплексами; молекулы, которая вызывает повреждение ДНК в теломерах.
EA201890379A 2015-07-29 2016-07-29 Терапевтические олигонуклеотиды для лечения или профилактики заболеваний, характеризующихся альтернативным удлинением теломер EA039775B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15178809.8A EP3124609A1 (en) 2015-07-29 2015-07-29 Therapeutics oligonucleotides
PCT/EP2016/068162 WO2017017253A1 (en) 2015-07-29 2016-07-29 Therapeutic oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201890379A1 EA201890379A1 (ru) 2018-08-31
EA039775B1 true EA039775B1 (ru) 2022-03-11

Family

ID=53762044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201890379A EA039775B1 (ru) 2015-07-29 2016-07-29 Терапевтические олигонуклеотиды для лечения или профилактики заболеваний, характеризующихся альтернативным удлинением теломер

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20180223279A1 (ru)
EP (1) EP3124609A1 (ru)
JP (1) JP7023834B2 (ru)
KR (1) KR102246814B1 (ru)
CN (1) CN108350456A (ru)
AU (1) AU2016300141B2 (ru)
BR (1) BR112018001782A2 (ru)
CA (1) CA2993128A1 (ru)
EA (1) EA039775B1 (ru)
MX (1) MX2018001126A (ru)
WO (1) WO2017017253A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
US20190127795A1 (en) * 2017-04-13 2019-05-02 Tiffany Wu Method for prognosing and reducing cardiovascular disease in patients with kidney diseases
JP7007559B2 (ja) 2017-05-31 2022-02-10 国立大学法人福井大学 白内障の予防剤および治療剤、並びに、これらを製造するための、ｄｎａ損傷に応答するシグナル伝達経路を阻害する阻害剤の使用
CN107385018A (zh) * 2017-06-22 2017-11-24 哈尔滨博泰生物科技有限公司 一种优化的rna高通量测序文库构建的方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6046307A (en) * 1996-04-09 2000-04-04 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
US20070270363A1 (en) * 1992-09-29 2007-11-22 Bennett C F Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
WO2013167744A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Ifom Fondazione Istituto Firc Di Oncologia Molecolare Rna products and uses thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2521565B1 (fr) 1982-02-17 1985-07-05 Dior Sa Parfums Christian Melange pulverulent de constituants lipidiques et de constituants hydrophobes, procede pour le preparer, phases lamellaires lipidiques hydratees et procede de fabrication, compositions pharmaceutiques ou cosmetiques comportant des phases lamellaires lipidiques hydratees
FR2534487B1 (fr) 1982-10-15 1988-06-10 Dior Christian Parfums Procede d'homogeneisation de dispersions de phases lamellaires lipidiques hydratees, et suspensions obtenues par ce procede
US5077211A (en) 1988-07-06 1991-12-31 Applied Genetics, Inc. Purification and administration of dna repair enzymes
US6537973B1 (en) 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US5643890A (en) 1995-01-31 1997-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences for use in treatment of cancer and other diseases
US6066625A (en) 1998-02-03 2000-05-23 Methylgene, Inc. Optimized antisense oligonucleotides complementary to DNA methyltransferase sequences
EP1274410A2 (en) 2000-03-31 2003-01-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
US7781163B2 (en) * 2003-01-08 2010-08-24 Lesley Davenport G-quadruplex binding assays and compounds therefor
KR101298493B1 (ko) 2003-09-09 2013-08-21 제론 코포레이션 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
JP2006075110A (ja) 2004-09-10 2006-03-23 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規ｓ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれを有効成分とするアンチセンス剤
CN1936011B (zh) 2006-10-17 2011-12-07 浙江医药高等专科学校 聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物及制备
KR100998365B1 (ko) * 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
CN102639713B (zh) * 2009-09-22 2015-09-02 儿童医学研究所 用于检测细胞中的替代性端粒延长(alt)活性的方法和测定法
KR101177320B1 (ko) * 2010-02-26 2012-09-10 문우철 Ｙ형 프로브 및 이것의 변형형, 및 이를 이용한 ｄｎａ 마이크로어레이, 키트 및 유전자 분석방법
RU2550267C2 (ru) 2012-12-12 2015-05-10 Елена Андреевна Чирясова Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070270363A1 (en) * 1992-09-29 2007-11-22 Bennett C F Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US6046307A (en) * 1996-04-09 2000-04-04 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
WO2013167744A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Ifom Fondazione Istituto Firc Di Oncologia Molecolare Rna products and uses thereof

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COURTNEY A. LOVEJOY ET AL.: "Loss of ATRX, genome instability, and an altered DNA damage response are hallmarks of the alternative lengthening of telomeres pathway", PLOS GENETICS, vol. 8, no. 7, 19 July 11574, DOI: 10.1371/journal.pgen.1002772, the whole document *
D. CONOMOS, M. D. STUTZ, M. HILLS, A. A. NEUMANN, T. M. BRYAN, R. R. REDDEL, H. A. PICKETT: "Variant repeats are interspersed throughout the telomeres and recruit nuclear receptors in ALT cells", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 282, no. 40, 10 December 2012 (2012-12-10), US , pages 29314 - 906, XP055241472, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1083/jcb.201207189 *
E. K. BENSON, S. W. LEE, S. A. AARONSON: "Role of progerin-induced telomere dysfunction in HGPS premature cellular senescence", JOURNAL OF CELL SCIENCE, COMPANY OF BIOLOGISTS LIMITED, CAMBRIDGE, vol. 123, no. 15, 1 August 2010 (2010-08-01), Cambridge , pages 2605 - 2612, XP055241815, ISSN: 0021-9533, DOI: 10.1242/jcs.067306 *
ELAYADI A, ET AL.: "Implications of High-Affinity Hybridization by locked Nucleic Acid Oligomers for Inhibition of human Telomerase.", BIOCHEMISTRY, vol. 41, no. 31, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 9973 - 9981, XP002990849, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/bi025907j *
FRANCESCA SANTAMBROGIO, GANDELLINI PAOLO, CIMINO-REALE GRAZIELLA, ZAFFARONI NADIA, FOLINI MARCO: "MicroRNA-dependent regulation of telomere maintenance mechanisms: A field as much unexplored as potentially promising", CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 20, no. 41, 1 December 2014 (2014-12-01), NL , pages 6404 - 6421, XP055241065, ISSN: 1381-6128, DOI: 10.2174/1381612820666140630095918 *
IRENA DRASKOVIC 6466, LONDOÑO-VALLEJO ARTURO: "Telomere recombination and the ALT pathway: A therapeutic perspective for cancer", CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 20, no. 41, 1 December 2014 (2014-12-01), NL , pages 6466 - 6471, XP055241057, ISSN: 1381-6128, DOI: 10.2174/1381612820666140630085857 *
M. FOLINI, ZAFFARONI N.: "Targeting Telomerase by Antisense-Based Approaches: Perspectives for New Anti-Cancer Therapies", CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 11, no. 9, 1 April 2005 (2005-04-01), NL , pages 1105 - 1117, XP055240893, ISSN: 1381-6128, DOI: 10.2174/1381612053507558 *
MARCO FOLINI, LORENZA VENTURINI, GRAZIELLA CIMINO-REALE, NADIA ZAFFARONI: "Telomeres as targets for anticancer therapies", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC TARGETS, INFORMA HEALTHCARE, UK, UK , pages 1 - 15, XP055240854, ISSN: 1472-8222, DOI: 10.1517/14728222.2011.556621 *
MARY ARMANIOS, ELIZABETH H. BLACKBURN: "The telomere syndromes", NATURE REVIEWS GENETICS, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 13, no. 10, GB , pages 693 - 704, XP055241805, ISSN: 1471-0056, DOI: 10.1038/nrg3246 *
POTTS P R, YU H.: "The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins", NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP US, NEW YORK, vol. 14, no. 7, 1 July 2007 (2007-07-01), New York , pages 581 - 590, XP002753025, ISSN: 1545-9993, DOI: 10.1038/nsmb1259 *
TAMURA Y. ET AL.: "Inhibition of human telomerase activity by antisense phosphorothioate oligonucleotides encapsulated with the transfection reagent, FuGENE6, in HeLa cells", ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT., MARY ANN LIEBERT, INC., NEW YORK., US, vol. 10, no. 2, 1 April 2000 (2000-04-01), US , pages 87 - 96, XP002763529, ISSN: 1087-2906 *
ZACHARY CREES, GIRARD JENNIFER, RIOS ZECHARY, BOTTING GREGORY M, HARRINGTON KYMBERLY, SHEAR-ROW CALEB, WOJDYLA LUKE, STONE AMANDA : "Oligonucleotides and G-quadruplex stabilizers: targeting telomeres and telomerase in cancer therapy.", CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 20, no. 41, 1 December 2014 (2014-12-01), NL , pages 6422 - 6437, XP055241061, ISSN: 1381-6128, DOI: 10.2174/1381612820666140630100702 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210087567A1 (en) 2021-03-25
KR20180057608A (ko) 2018-05-30
BR112018001782A2 (pt) 2018-09-18
US20180223279A1 (en) 2018-08-09
EA201890379A1 (ru) 2018-08-31
JP7023834B2 (ja) 2022-02-22
AU2016300141B2 (en) 2022-06-16
JP2018521669A (ja) 2018-08-09
KR102246814B1 (ko) 2021-04-30
MX2018001126A (es) 2018-09-11
AU2016300141A1 (en) 2018-03-01
WO2017017253A1 (en) 2017-02-02
CN108350456A (zh) 2018-07-31
EP3124609A1 (en) 2017-02-01
CA2993128A1 (en) 2017-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210087567A1 (en) Therapeutic oligonucleotides
JP2015518714A (ja) 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法
JP2016522674A (ja) 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518713A (ja) Ｕｔｒｎ発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518710A (ja) ヘモグロビン遺伝子ファミリー発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518712A (ja) Ｍｅｃｐ２発現を調節するための組成物及び方法
JP2016531570A (ja) ユークロマチン領域を標的とするオリゴヌクレオチド
JP2015518711A (ja) Ｂｄｎｆ発現を調節するための組成物及び方法
JP2016506923A (ja) カプセル化アンタゴｍｉｒを含む組成物
JP2018531046A6 (ja) 核酸ベースのｔｉａ−１阻害剤
JP2018531046A (ja) 核酸ベースのｔｉａ−１阻害剤
EP3329004B1 (en) Therapeutic oligonucleotides
US9220724B2 (en) MicroRNA-based approach to treating malignant pleural mesothelioma
JP6666002B2 (ja) Ｔｄｐ−４３プロテノパシーの予防又は治療用組成物
WO2009003211A1 (en) Treatment of rheumatoid arthritis
US9879255B2 (en) Modulation of RNA activity and vascular permeability
US20220267769A1 (en) Medical uses, methods and uses
KR101783444B1 (ko) miR-33-5p 를 이용한 뇌신경세포 보호 물질 스크리닝 방법
US20170362590A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising microrna
US20230374505A1 (en) Human XIST Antisense Oligonucleotides for X Reactivation Therapy
US20230287427A1 (en) Inhibition of lncExACT1 to Treat Heart Disease
US20220117917A1 (en) Ph-activated nanoparticles