KR20180057608A - 치료용 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

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파브리지오 다다 디 파가냐
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Abstract

본 발명은 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening)을 특징으로 하는 질병, 또는 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환(non-cancer condition)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 하기 서열들 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 관련 약제학적 조성물들, 및 관련 약제학적 조성물 및 방법에 관한 것이다:
(TTAGGG) SEQ ID No. 1, (TAGGGT) SEQ ID No. 2, (AGGGTT) SEQ ID No. 3, (GGGTTA) SEQ ID No. 4, (GGTTAG) SEQ ID No. 5, 또는 (GTTAGG) SEQ ID No. 6 또는 이의 상보적 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 혼합물.

Description

치료용 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병 또는 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환(non-cancer condition)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 하기 서열들: (TTAGGG) SEQ ID No. 1, (TAGGGT) SEQ ID No. 2, (AGGGTT) SEQ ID No. 3, (GGGTTA) SEQ ID No. 4, (GGTTAG) SEQ ID No. 5 또는 (GTTAGG) SEQ ID No. 6 또는 이의 상보적 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 혼합물 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 관련 약제학적 조성물들, 및 관련 약제학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
DNA는 손상을 받는 경우, 대체 불가능한 세포 내의 독특한 유형의 분자이다. 소위 "DNA 손상 반응"(DDR)은, DNA 손상 검출 시 촉발되는 경우 세포 주기를 저지하고(DNA 손상 체크포인트 기능) DNA 복구를 조직화하는, 진화적으로 보존된 사건들의 조직화된 세트이다(문헌[Jackson and Bartek, 2009]). DNA 손상은 생리학적 사건이다. 노화 및 암은 아마도, DNA 손상 축적, DDR 활성화 및 그 결과의 관련성을 강조하는, 포유류에서의 2개의 최상의 예들이다. 노화 및 암 둘 다에서 DDR 관여의 이해에 대해 상당한 기여들이 이루어져 왔다(문헌[d'Adda di Fagagna, 2008; Jackson and Bartek, 2009]).
보다 최근, 본 발명자들은, 완전한(full) DDR 활성화가 RNA 분자에 의존함을 밝혀내었고 이를 보고하였다. 이들은, DNA 이중 가닥 절단(DSB; double-strand break)이, 손상된 부위를 둘러싸고 있는 서열을 가지는 DNA 손상 부위에서 비-코딩 RNA의 국소 발생을 촉발함을 관찰하였다. 이들은 또한, 이들 RNA(저자들이 DDRNA라고 지칭함)가 DDR 활성화에 필수적임을 보여주었다. 사실상, RNase A 처리에 의한 DDRNA의 제거는 DDR 활성화를 저해하고, DDR은 손상된 부위를 둘러싸고 있는 서열을 가지지만 다른 서열은 갖지 않는 화학적으로 합성된 DDRNA의 첨가에 의해 완전히 복구될 수 있다(문헌[Francia et al., 2012]).
몇몇 연구들은, RNA 기능이, 표적 RNA들과 쌍을 이루어서 이들 RNA의 기능에 손상을 주는 작용을 하는 저해성 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)의 사용에 의해 저해될 수 있음을 보여주었다. 이들 ASO의 사용은 임상 단계에 성공적으로 도달하고 있다(문헌[Janssen et al., 2013; Li and Rana, 2014; Monteleone et al., 2015; Stenvang et al., 2012]). 암세포는 무제한 증식 잠재성을 보유하기 위해, 텔로미어 길이를 보존하고 천연 텔로미어 소모에 대항해야 한다. 대부분의 암세포는, 짧은 텔로미어를 연장시키는 효소인 텔로머라제 발현을 재활성화시킴으로써 이를 달성한다. 그러나, 모든 인간 종양들 중 10% 내지 15%, 그리고 전적인 것은 아니지만 발병률이 더 높은 골육종, 연조직 육종, 일차성 뇌종양, 다형교아종(GBM; glioblastoma multiforme) 및 신경모세포종은 텔로미어 중에서 상동성 재조합(HR)을 기반으로 한 소위 대안적 텔로미어 유지 기작(ALT) 메커니즘에 의해 텔로미어 길이를 유지한다(문헌[Cesare and Reddel, 2010; Durant, 2012; Henson and Reddel, 2010]).
ALT 종양들이 이들의 형질변환된 악성 상태의 원인이 되는 상이한 유전적 돌연변이들을 갖고 있을 수 있긴 하지만, 대부분의 ALT 암세포는 DAXX 유전자 및 ATRX 유전자에서 돌연변이를 나타내고 있어서, 종양을 보편적인 유전적 분석에 의해 ALT로서 분류할 수 있다(문헌[Heaphy et al., 2011]).
ALT 메커니즘은 건강한/정상 세포에서는 전혀 보고된 바가 없다(문헌[Cesare and Reddel, 2010]). 그러나, 암 외에도, ALT 메커니즘은 EBV-감염된 세포에서 보고된 바가 있으며(문헌[Kamranvar et al., 2013]), 이는 다른 바이러스 감염도 이러한 ALT 메커니즘을 촉발할 수 있다는 가능성을 강조하는 것이다.
암 치료법에서 텔로머라제 저해제의 사용은 널리 조사되어 왔으나(문헌[Ruden and Puri, 2013]); 이러한 접근법의 내재적인 제한은, 종양에서 텔로머라제 활성의 결여가 문헌[Hu et al., 2012]에서 보고된 바와 같이 ALT 양성 클론의 선택을 초래할 수 있다는 점이다. 상이하게 현재까지, ALT로부터 텔로머라제의 텔로미어 유지 메커니즘으로의 역행은 보고된 적이 없다.
ALT 세포는 텔로미어에서의 만성 DDR 활성화를 보여주며, 이는 이러한 세포에서 텔로미어의 고장난(dysfunctional) 성질을 가리킨다. 이후, 위태롭게(critically) 짧은/고장난 텔로미어는 HR 경로를 이용하는 DDR 메커니즘에 의해 연장/"복구"된다. ALT-연관된 PML 바디(body)(APB)는 텔로머릭 DNA(telomeric DNA) 및 DDR 인자를 함유하고, ALT 세포의 공지된 바이오마커이다(문헌[Cesare and Reddel, 2010; Yeager et al., 1999]). HR은 DDR의 DNA 복구 메커니즘의 일부이고, ALT 세포에서 텔로미어의 유지에 필수적인 것으로 나타나 있다. MRN(MRE11/RAD50/NBS1) 복합체는 HR 경로에 관여하는 주요 DDR 인자이다. 사실상, 저해성 단백질 SP100의 과발현 또는 짧은 헤어핀-매개 넉다운에 의한 상기 복합체의 불활성화는 ALT-양성 세포에서 텔로미어 유지의 저해를 특이적으로 결정한다(문헌[Jiang et al., 2005; Jiang et al., 2007; Zhong et al., 2007]). DSB의 HR-매개 복구를 촉진하는, SMC5/6 복합체의 RNA 간섭-매개 결실은 ALT 세포에서 텔로미어 단축 및 세포 노화를 초래한다(문헌[Potts and Yu, 2007]). RPA는 HR의 초기 단계(phase) 동안 단일 가닥 DNA에 결합하고, RNA 간섭을 통한 이의 하향조절은 ALT 활성에서 손상을 초래한다(문헌[Jiang et al., 2007]). 보다 최근에는, ATR 저분자 저해제가 ALT-양성 세포의 세포 성장을 특이적으로 방지하는 것으로 나타났지만(문헌[Flynn et al., 2015]), 이러한 특이성은 비-ALT 암세포를 포함하여, CHK1 저해제와 조합된 경우에만 더 넓어진 것으로 보인다(문헌[Sanjiv et al., 2016]). 일관적으로, 또 다른 최근의 보고는 ATR 저해제의 세포-유형 특이성이, 텔로미어 유지 메커니즘보다 세포 포화도(confluency)와 더욱 관련이 있음을 제시하였다(http://biorxiv.org/content/early/2016/06/04/053280).
ALT 세포에서의 텔로미어에서 DDR 및 결과적인 재조합 사건의 저해는 항암 치료를 위한 신규 잠재적인 치료 방안의 고안에 이용될 수 있을 것이다. 일관적으로 상기 언급된 바와 같이 ALT 세포는, HR에 의한 DNA 복구의 맥락에서 DDR 신호전달(signalling)에 관여하는 단백질인 ATR 키나아제의 저해에 고도로 민감한 것으로 제안되어 왔지만(문헌[Flynn et al., 2015]), 이의 특이성은 최근에 의문으로 제시되었다(문헌[Sanjiv et al., 2016]) 및 (http://biorxiv.org/content/early/2016/06/04/053280).
유사하게, 종종 조로증(progeric) 표현형(조기 노화(premature ageing))을 야기하는 텔로머릭 DNA 손상을 특징으로 하는 질환이 텔로머릭 서열을 가진 DDRNA의 발생과 연관이 있는 것으로 예상된다.
WO2013/167744는 DNA 손상 부위에서 생성되며 손상된 유전자좌의 특정 서열을 가진 RNA 저분자(DDRNA)에 관한 것이다. ALT를 나타내는 세포, 예컨대 ALT 암세포, 또는 EBV-감염된 ALT 세포 또는 조로 질환 세포에서의 텔로미어로부터 DDRNA의 존재 및 발생은 기재되어 있지도 않으며, 치료 근거로서의 DDRNA 저해가 제시되어 있지도 않다.
WO2014092609는 인간 텔로머릭 DNA의 특이적인 G-사슬 올리고뉴클레오타이드 서열을 사용하여 세포의 증식 상태에 영향을 주는 방법에 관한 것이다.
US2013065950은 지질 모이어티에 공유 연결된 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 화합물을 개시하고 있다. 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 인간 텔로머라제의 RNA 구성성분에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 화합물은 세포에서 텔로머라제 활성을 저해한다.
WO97/38013은 대안적 텔로미어 유지 기작(ALT)을 특징으로 하는 질병(특히 암) 또는 고장난 텔로미어를 특징으로 하는 비-암 질환을 구체적으로 언급하고 있지 않다. 또한, 이는 텔로머라제의 저해에 관한 것이 아니다. 대조적으로, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 텔로머라제-양성 암세포 상에서 활성이지 않다.
WO 2006/107949는 산화 스트레스 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 ALT 암세포 및 고장난 텔로미어를 특징으로 하는 비-암 질환의 특이적 치료에 관한 것이다.
CN1936011은 폴리케이션(polycation) 리포좀 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성된 폴리케이션 리포좀 텔로미어 효소 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다.
WO2006028160은 인간 백혈병 세포 추출물에 함유된 텔로머라제에 대해 높은 저해 활성을 갖고, 상보적 DNA와의 안정한 듀플렉스 하이브리드를 제공하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
US2006183704는 유효량의, pTT를 포함하는 조성물, 또는 인간 텔로미어 오버행 반복부와 적어도 50%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 공유하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 질병에 걸린 포유류에게 투여함으로써, 암을 포함한 과증식성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
WO01/74342는 상피 세포에 영향을 미치는 과증식성 질병 또는 전암성 질환, 예컨대 건선, 백반증, 아토피성 피부염, 또는 과증식성 또는 UV-반응성 피부병, 다른 상피의 과증식성 또는 알레르기 매개 질병의 치료 또는 예방 방법, 광노화 또는 산화 스트레스의 감소 방법 또는 피부암의 발병 가능성에 대한 예방 또는 감소 방법에 관한 것이다.
WO96/23508은 암 및 다른 불멸 유형 세포의 질병 상태의 증식을 저해하는 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법은 텔로미어 모티프를 모방하는 합성 올리고뉴클레오타이드의 도입을 포함한다.
Sandra Sampl 등(문헌[Proceedings: AACR Annual Meeting 2014; April 5-9, 2014; Abstract 2743, San Diego, CA])은, TERRA라고 하는 텔로미어 유래의 RNA 전사체가 TERC에의 직접적인 결합을 통해 텔로머라제 활성(TA)을 잠재적으로 차단하는 것으로 확인되었음을 보여준다.
TERRA는 길이가 약 100 베이스(base)에서 적어도 9 킬로베이스(kilobase)까지인 구성적인(constitutive) 단일 가닥 비-코딩 RNA이다(문헌[Azzalin et al., 2007]). 이들 TERRA는 서브텔로머릭 영역에 위치한 프로모터로부터 출발하여 전사되므로, 서브텔로머릭 서열 및 G-풍부한 텔로머릭 서열을 둘 다 운반한다. 상이하게, DDRNA는 이중 가닥 RNA를 잠재적으로 형성할 수 있는 짧은 RNA(적어도 6개 또는 8개 뉴클레오타이드 길이 또는 10개 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 약 22개 뉴클레오타이드 길이)이다. 이들 DDRNA는, 텔로미어의 바로 끝부분에서 또는 텔로머릭 반복부 내에서 출발하는 G-풍부한 텔로머릭 반복부-함유 RNA 분자 및 C-풍부 텔로머릭 반복부-함유 RNA 분자를 발생시키는 2가지 텔로머릭 가닥 모두로부터 전사된 전구체 전사체의 가공에 의해 발생된다.
따라서, 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병, 및 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 치료가 여전히 요망되고 있다.
본 발명은 텔로머릭 DNA 손상 또는 기능 장애시 비-코딩 RNA(tDDRNA라고 지칭됨)가 축적된다는 발견을 기반으로 한다. 이들 비-코딩 RNA는, 고장난 텔로미어를, 길이가 긴 RNA 전구체의 전사를 위한 주형으로서 사용하여 합성된 RNA 전사체이며, 이후 다이서(Dicer) 및/또는 드로샤(Drosha)에 의해 더 짧은 비-코딩 RNA(tDDRNA)로 가공될 수 있다.
본 발명에서 놀랍게도, tDDRNA들 및 이들의 전구체의 발생 및/또는 합성 및/또는 기능의 저해제가 DDR 활성화도 저해하며, 따라서 ALT-연관 질환 및 텔로머릭 DNA 손상 또는 기능 장애와 연관된 질환의 치료에 적용될 수 있다는 것이 확인되었다.
tDDRNA들 및/또는 이들의 전구체에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 예를 들어 락트 핵산(LNA; locked nucleic acid) 형태의 ASO는, 음성 대조군으로서 관련이 없는 서열을 갖는 LNA와 함께 합성되었다. 텔로머릭 ASO는 DDR 활성화를 특이적으로 저해하여, 신호전달 및 뒤이은 DNA 복구를 둘 다 저해할 수 있는 것으로 관찰되었다.
서열-특이적 ASO를 이용한 경우, ALT 세포에서 세포 증식이 특이적으로 감소되었음을 보여주는 결과가 얻어졌다.
ALT 종양에서 텔로머릭 DDR 활성화는 서열-특이적 ASO에 의해 표적화될 수 있으며, 따라서 텔로미어 유지에 손상을 주고 증식을 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 텔로미어 DNA 손상 또는 기능 장애 시 발생된 텔로머릭 RNA에 상보적인 서열을 갖는 LNA ASO를 합성하였다. 이들은, 특이적인 텔로머릭 서열을 운반하는 ASO 올리고뉴클레오타이드에 의한 형질감염은 ALT 양성 세포주(즉, 골육종 U-2 OS 및 G292 세포주, 교아종 GBM14 세포주, 섬유아세포 WI38 VA13 및 SW26)의 증식을 강하게 억제할 수 있었으며, 한편 텔로머릭 RNA를 표적화하지 않고 임의의 인간 서열을 표적화하지 않는 상이한 서열을 갖는 동일한 양의 ASO는 유의한 효과가 없었음을 관찰하였다. 중요하게, 동시 시험된 바와 같이, 이들 ASO 중 어느 것도 정상 인간 섬유아세포(골육종과 같이 간엽성 기원의 섬유아세포)의 증식 또는 텔로머라제-양성 암세포의 증식에 영향을 미치지 않으며, 이는 이러한 접근법이 ALT 종양에 특이적이고, 이러한 치료는 살아 있는 동물 및 인간 환자에 독성이 아닐 것임을 제시한다. 이 단계에서, 본 발명자들은
1) 새로운 잠재적인 치료제를 확인하였고;
2) 이러한 제제를 이용한 치료로부터 이득을 얻을 종양의 특이적인 서브세트를 규정하였다.
더욱이 노화는, 특히 텔로미어에서의 DDR 활성화와 연관이 있다(문헌[d'Adda di Fagagna et al., 2003; Fumagalli et al., 2012; Herbig et al., 2006; Herbig et al., 2004; Hewitt et al., 2012]). 휴킨슨-길포드 조로 증후군(HGPS; Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome)(문헌[Pollex and Hegele, 2004])은 프로게린이라고도 하는 라민 A의 돌연변이체 형태에 의해 야기되는 조로 증후군의 일례이다. 조로증은 조기 노화를 의미한다. HGPS 조로증 표현형은 프로게린-유도 DNA-손상 신호전달을 감소시킴으로써, 텔로머라제의 발현에 의해 억제될 수 있다(문헌[Kudlow et al., 2008]). 이는, HGPS 세포(및 더 나아가 HGPS 환자)의 조로증 표현형은 DDR을 야기하는 고장난 텔로미어에 의해 유발됨을 가리킨다. 사실상, DDR은 HGPS 세포 내 텔로미어에서 발견된다(문헌[Benson et al., 2010; Chojnowski et al., 2015]). 다니오 레리오(Danio rerio) 피시(제브라피시(zebrafish))는 노화 연구에 적합한 단순 척추동물 모델이다. 사실상, 텔로머라제 돌연변이는 텔로미어 단축, 및 결과적인 텔로미어 기능 장애 및 DDR 활성화의 속도를 높임으로써 생리학적 노화를 가속화하는 것으로 나타났다(문헌[Henriques et al., 2013]). 구체적으로는, 텔로머라제-돌연변이체 피시는 더 짧은 수명, 조직 위축증 및 감소된 생식력을 특징으로 한다. 이들 피시는 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 모델을 대표한다.
텔로미어 DNA 손상 또는 기능 장애 시 발생된 tDDRNA들 및 이들의 전구체에 상보적인 서열을 갖는 LNA ASO를 사용함으로써, 본 발명자들은 프로게린-발현 세포에서 세포 노화를 방지하였다. 더욱이, LNA ASO는 HGPS에 대한 마우스 모델 및 텔로머라제-돌연변이체 제브라피시의 수명을 연장시켰으며, 이는 LNA ASO가 노화-관련된 표현형을 억제할 수 있을 것임을 제시한다.
본 발명에서, DDRNA들 및/또는 이들의 전구체의 저해를 통한 DDR의 저해는 서열 특이적이라서, 예를 들어 텔로미어로부터 이격된 곳에서 DDR 저해로 인해 정상 세포에서 부작용이 발생할 가능성을 최소화한다는 큰 이점을 갖고 있다.
나아가 암 치료의 맥락에서 이들 저해제는, 텔로미어 유지의 ALT 메커니즘을 사용하므로 텔로머라제 저해에 내성인 암세포의 클론의 잠재적인 출현을 방지하기 위해, 텔로머라제 저해제와 상승작용을 할 수 있다.
사실상, 기존의 항암 치료법들은 암세포에서 DNA에 손상을 주거나 DDR을 저해함으로써 작용하는 효과적인 항암 치료들이다. 그러나, 이들 치료법 중 대부분의 DNA 손상 활성 또는 DDR 저해는 서열 특이적이지 않다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 서열-특이적인 방식으로 DDR을 손상시키며, 그런 다음 이들 올리고뉴클레오타이드는 또한, 기존의 DNA 손상 치료에 서열 특이성을 부여하여, 효능을 증강시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 하기 서열들 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
(TTAGGG) SEQ ID No. 1, (TAGGGT) SEQ ID No. 2, (AGGGTT) SEQ ID No. 3, (GGGTTA) SEQ ID No. 4, (GGTTAG) SEQ ID No. 5, 또는 (GTTAGG) SEQ ID No. 6 또는 이의 상보적 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 혼합물.
바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 단편 또는 변이체는 하기 서열들: (TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n, 또는 (GTTAGG)n 중 하나를 포함하며, 여기서, 1 < n < 1000, 바람직하게는 1 < n < 500, 바람직하게는 1 < n < 200, 바람직하게는 1 < n < 100, 바람직하게는 1 < n < 50, 바람직하게는 1 < n < 20, 바람직하게는 1 < n < 10, 바람직하게는 1 < n < 5이다.
바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA의 서열에 상보적이며, 상기 RNA는 특이적인 고장난 텔로머릭 DNA를 전사용 주형으로서 사용하여 합성된 RNA 전사체, 또는 상기 RNA 전사체의 단편이고, 상기 단편(DDRNA)은 다이서 및/또는 드로샤에 의한 가공에 의해 발생된다.
바람직하게는, 질병은 암 또는 엡스타인-바(Epstein-Bar) 바이러스 감염이다. 보다 바람직하게는, 질병은 ALT-양성 암이다.
더욱 바람직하게는, 암은 연조직 육종, 바람직하게는, 연골 육종(chondrosarcoma), 악성 섬유 조직구종을 포함하는 미분화된 다형성 육종(pleomorphic sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 상피모양 육종(epithelioid sarcoma), 지방 육종(liposarcoma), 섬유 육종(fibrosarcoma) 및 변이체, 혈관 육종(angiosarcoma) 및 신경 섬유종(neurofibroma), 중추신경계 암, 바람직하게는, 그레이드 II 미만성 별아교세포종(grade 2 diffuse astrocytoma); 그레이드 3 역형성 별아교세포종(grade 3 anaplastic astrocytoma); 그레이드 4 소아 다형교아종, 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 역형성 수모세포종(anaplastic medulloblastoma), 그레이드 1 털모양 별아교세포종(grade 1 pilocytic astrocytoma), 비-역형성 수모세포종(nonanaplastic medulloblastoma), 수막종(meningioma), 슈반세포종(schwannoma), 방광암, 특히 소세포 암종 및 침습성 요로상피 암종(invasive urothelial carcinoma), 부신 또는 말초신경계 암, 특히 신경절신경모세포종(ganglioneurobalstoma), 신경모세포종 및 크롬친화성 세포종(pheochromocytoma), 신경내분비 신생물(neuroendocrine neoplasm), 예컨대 부신경절종(paraganglioma) 및 유암종 종양(carcinoid tumour), 신장암, 특히 난염성 암종(chromophobe carcinoma), 육종성 암종(sarcomatoid carcinoma) 및 투명 세포(clear cell) 및 유두상(papillary) 암종, 폐 및 늑막 암, 특히 악성 중피종(mesothelioma), 대세포 암종 및 소세포 암종, 피부암, 예컨대 악성 흑색종, 간암, 예컨대 간세포 암종, 고환암, 예컨대 비정상피종성 생식세포 종양, 유방암, 특히 소엽암종(lobular carcinoma); 관암종(ductal carcinoma) 및 속질암종(medullary carcinoma), 자궁암, 예컨대 장액성 자궁내막 암종(serous endometrial carcinoma), 자궁경부의 편평세포 암종, 난소암, 특히 투명 세포 암종, 자궁내막 암종, 담낭암, 예컨대 선암종(adenocarcinoma), 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 하기 서열들 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
(TTAGGG) SEQ ID No. 1, (TAGGGT) SEQ ID No. 2, (AGGGTT) SEQ ID No. 3, (GGGTTA) SEQ ID No. 4, (GGTTAG) SEQ ID No. 5, 또는 (GTTAGG) SEQ ID No. 6 또는 이의 상보적 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 혼합물.
바람직하게는, 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환은 휴킨슨-길포드 조로 증후군(HGPS), 베르너 증후군(Werner's syndrome), 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 모세혈관확장성 운동실조증(ataxia telangiectasia), 가족력 IPF, 산발성 IPF, 재생불량성 빈혈, 상염색체-우성 선천성 각화이상증(autosomal-dominant dyskeratosis congenital), 가족력 MDS-AML, 드 노보 선천성 각화이상증(de novo dyskeratosis congenita), X-연관 열성 선천성 각화이상증(X-linked recessive dyskeratosis congenita), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreiderasson syndrome), 레베츠 증후군(Revesz syndrome), 상염색체-열성 선천성 각화이상증(Autosomal-recessive dyskeratosis congenita), 코트 플러스 증후군(Coats plus syndrome), TRF1, POT1, TPP1, TINF2, RAP1 또는 TRF2 중 임의의 하나의 돌연변이 또는 불활성화에 의해 유발되는 질환, 부분 간절제술 시 손상된 재생, 간 섬유증, 간 만성 염증, 간 경화증, 폐 섬유증, 변경된 골수 전구체 분화, 골수부전(bone marrow failure), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알츠하이머 질병을 포함한 신경학적 장애, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심질환, 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 2형 당뇨병, 손상된 생식력, 손상된 상처 치유, 관절염, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 노화로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 락트 핵산(LNA)-변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 2'-O-메틸-변형된 올리고뉴클레오타이드이다.
LNA는 일반적으로, 리보스 당 모이어티가 C(2')-원자 및 C(4')-원자를 연결하는 옥시메틸렌 가교에 의해 락킹된(locked) RNA 모방체인 것으로 여겨지며, 이러한 가교는 LNA 단량체를 N-유형 당 퍼커링(puckering)으로 형태적으로 제한한다 (문헌[Veedu R et al. 2010]). LNA는 LNA 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 함유하는 분자이다. 바람직하게는, LNA는 LNA 변형을 갖는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
2'-O-메틸-변형된 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 함유하는 분자이다. 바람직하게는, 2'-O-메틸-변형된 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 갖는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 적어도 또 다른 치료제를 추가로 포함하며, 바람직하게는 또 다른 치료제는 항종양제, 진통제, 항구토제(예컨대 아프레피탄트(aprepitant), 포사프레피탄트(fosaprepitant), 돌라세트론(Dolasetron), 그라니세트론(granisetron), 온단세트론(ondansetron), 팔로노세트론(palonosetron), 트로피세트론(tropisetron), 라모세트론(ramosetron) 또는 덱사메타손)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 다른 치료제는 ATR 저해제, DDR 저해제, HR 저해제, 텔로미어를 특이적으로 표적화하는 분자, 바람직하게는 G-콰드루플렉스(quadruplex) 상호작용 분자, 또는 텔로미어에서 DNA 손상 발생을 특이적으로 야기하는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물로 치료되는 피험자의 확인(identify) 방법을 제공하며, 상기 확인 방법은 RNA의 존재를 검출하고/거나 RNA의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 RNA는 특이적인 고장난 텔로머릭 DNA를 전사용 주형으로서 사용하여 합성된 RNA 전사체, 또는 상기 RNA 전사체의 단편이며, 상기 단편(DDRNA)은 다이서 및/또는 드로샤에 의한 가공에 의해 발생되고, 상기 피험자는 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병에 의해 영향을 받고 있거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환에 의해 영향을 받고 있다.
본 발명에서, DDRNA는 비-코딩 RNA이다. 이러한 DDRNA는 특이적인 손상된 및/또는 고장난 텔로머릭 DNA를 길이가 긴 RNA 전구체의 전사를 위한 주형으로서 사용하여 합성된 RNA 전사체이며, 이러한 RNA 전사체는 다이서 및/또는 드로샤에 의해 더 짧은 비-코딩 RNA(DDRNA 또는 tDDRNA)로 가공될 수 있다.
DDRNA는 유전자좌에서 기원하고, 손상된 유전자좌의 서열을 운반한다. DDRNA는, 유전자좌를 둘러싸고 있는(spanning) 전사체의 다이서 및/또는 드로샤 절단에 의해 시험관내에서 화학적으로 합성되거나 발생되는 경우, 심지어 다른 포유류 RNA의 부재 하에서도 RNase A-처리된 세포 내 DNA 손상 부위에서 DDR 활성화를 촉진한다.
DDRNA는 (문헌[Francia et al., 2012])에 나타낸 바와 같이,
· DDRNA는 임의의 다른 세포성 RNA를 필요로 하지 않고 작용하며(RNase A-처리된 세포 실험에서 겔-추출된 RNA 및 합성 RNA를 이용하여 수득된 결과를 참조).
· DDRNA는 내인성 세포성 전사체 매치를 갖지 않고 여전히 생물학적으로 활성인 서열(LAC 또는 TET 반복부)을 가질 수 있으며,
· DDRNA는 전사 및 번역이 저해된 세포에서 실온에서 신속하게(수분 이내에) 작용할 수 있고(RNAse A-처리된 세포 실험에서 수득된 결과를 참조),
· GW 단백질(카노니컬(canonical) miRNA의 효과기)의 불활성화는 DDR 병소(foci)에 영향을 미치지 않기 때문에,
마이크로 RNA 및 카노니컬 RNAi 메커니즘과 상이하게 작용한다.
DDRNA는 이중 가닥 쌍을 형성하는 잠재성을 가진 스몰(small) RNA이며, 손상된 DNA 유전자좌의 전사 시 합성된 서열-특이적 RNA 전사체의 다이서 및/또는 드로샤에 의한 가공에 의해 발생된다. DDRNA는 길이가 10 내지 50개 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이가 17개 내지 32개, 뉴클레오타이드길이가 20개 내지 25개 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이가 21개 내지 23개 뉴클레오타이드인 스몰 RNA이다.
상기 DDRNA는 특이적인 DNA 손상 부위에서 DDR 인자의 서열-특이적 축적을 선호함으로써 작용하고, DDR 활성화를 촉진한다(즉, 비제한적으로, DNA 손상 신호전달, 예컨대 단백질 인산화 사건을 통한 신호전달, 및 예컨대 상동성 재조합과 같은 DNA 손상 복구).
DDRNA 전구체는, DNA 손상 시 손상된 DNA를 주형으로 사용하여 전사되는 DDRNA(적어도 25개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 30개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 50개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 100개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 150개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 200개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 250개 염기 길이, 바람직하게는 적어도 300개 염기 길이)보다 더 긴 RNA 분자이다. 이들 전구체가 드로샤 및/또는 다이서에 의해 가공되어, DDRNA가 발생된다. 텔로머릭 DDRNA 전구체는 텔로머릭 DDRNA의 멀티플(multiple)이다.
본 발명에서, SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 6의 단편은 상기 서열과 동일한 치료 활성을 가진 기능성 단편이다. 이러한 단편은, 비절단된(untruncated) 올리고뉴클레오타이드의 적어도 2개의 이어지는(contiguous) 뉴클레오타이드들이 유지되는 한, 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 절단된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 상응한다. 바람직하게는, 절단된 올리고뉴클레오타이드는 비절단된 올리고뉴클레오타이드에서 발견되는 2, 3, 4 또는 5개의 이어지는 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 발명은 또한, 1회 이상 반복되는 상기 서열(SEQ ID No. 1 내지 6)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 하기 서열들: (TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n, 또는 (GTTAGG)n 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서, 1 < n < 1000, 바람직하게는 1 < n < 500, 바람직하게는 1 < n < 200, 바람직하게는 1 < n < 100, 바람직하게는 1 < n < 50, 바람직하게는 1 < n < 20, 바람직하게는 1 < n < 10, 바람직하게는 1 < n < 5이다.
올리고뉴클레오타이드는 또한, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25개 등... 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 필연적으로 6개 뉴클레오타이드의 멀티플이 아니다.
본 발명에서, SEQ ID No. 1 내지 6의 변이체는, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 치환된 올리고뉴클레오타이드이다. 변이체는 SEQ ID No. 1 내지 6과 적어도 50%의 동일성, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 변이체는 올리고뉴클레오타이드와 동일한 치료 활성을 갖는다.
바람직한 텔로머릭 헥사뉴클레오타이드 변이체는 TCAGGG, TTCGGG, GTAGGG, TGAGGG, TTGGGG, TAAGGG, ATAGGG, CTAGGG, TTTGGG, TTAAGGG 및 이들의 상보적 서열을 포함한다(문헌[(Lee et al., 2014)]의 도 5).
본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 이의 단편 또는 이의 변이체는 DDRNA들 및/또는 이들의 전구체의 서열에 상보적이며, 이로써 DDRNA들 및/또는 이들의 전구체 기능을 저해한다.
바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 LNA 분자 또는 2'-O-메틸 변형된 올리고뉴클레오타이드이다.
이들 올리고뉴클레오타이드는 비제한적으로, 락트 핵산(LNA), 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 락트 핵산, 2'-O-메톡시에틸 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2' O-메틸 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2O-[2-(N-메틸카르바모일)에틸] 리보뉴클레오사이드, 메틸포스포네이트, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, LNA-DNA-LNA 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오타이드, 믹스머(mixmer), 키메릭(Chimeric) 2'-O-메틸 RNA-DNA 갭머, N3'-P5' 포스포로아미데이트, 2'-플루오로-아라비노 핵산, 포스포로아미데이트 모르폴리노, 사이클로헥센 핵산, 트리사이클로-DNA, 펩타이드 핵산, 언락트(Unlocked) 핵산, 헥시톨(Hexitol) 핵산, 보라노포스페이트 올리고뉴클레오타이드, 포스포로아미데이트 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 상이한 수단(비제한적으로 플라스미드 형질감염, 바이러스 감염 포함)에 의해 전달되는 플라스미드-인코딩된 유전자에 의해 발현되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 바람직하게는 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트화된다.
본 발명에서, 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병은, 텔로머라제 활성이 결여되고/거나 하기 열거된 하나 이상의 특징을 보여줌에도 불구하고, 텔로미어를 유지하는 세포의 존재를 특징으로 하는 질병이다.
특히, 대안적 텔로미어 유지 기작은 하기 특징들 중 적어도 하나에 의해 확인/측정될 수 있다:
- 텔로머라제 활성(예를 들어 효소적 분석법에 의해 측정됨)의 결여,
- 텔로미어 제한 단편 및 서던 블롯 분석, 또는 인 시추 혼성화를 기반으로 하는 다른 수단에 의해 측정되는 바와 같이, 텔로머라제-양성 세포와 비교하여 더 길고 더 많은 이종성 텔로미어의 존재,
- 면역형광에 의해 검출되는 바와 같이, 텔로미어 염색질과 공동-위치화하는 PML 단백질의 병소(foci)인 ALT-연관된 PML 바디(APB)의 존재,
- 면역형광 또는 다른 수단에 의해 검출되는 바와 같이, 텔로미어에서 공동-위치화하는 DDR 마커(예컨대 γH2AX, RPA, HR 단백질)의 존재,
- ATRX 및/또는 DAXX 유전자에서 돌연변이 또는 이의 변경된 발현 또는 기능의 존재(문헌[Heaphy et al., 2011]).
- 단일 가닥 c-풍부한 염색체외 텔로머릭 DNA인 c-서클의 존재,
- 염색체외 이중 가닥 텔로머릭 DNA인 t-서클의 존재,
- 텔로미어 중에서 재조합의 마커인 텔로미어 자매 염색분체 교환,
- MS32 미소부수체(minisatellite) 유전자좌에서 증가된 탠덤(tandem) 반복 불안정성.
이들 특징은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌[(Henson and Reddel, 2010)](원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 보고된 바와 같이 측정/확인될 수 있다.
본 발명에서, 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환은 DDR 머시너리(machinery)의 구성성분을 이용하는 텔로미어를 특징으로 하는 질병, 질환 또는 증후군이다. 본 발명에서, "텔로미어 기능 장애 " 또는 "고장난 텔로미어"는 손상된 텔로머릭 DNA 및/또는 위태롭게 짧은 텔로머릭 DNA 및/또는 캡핑되지 않은(uncapped) 텔로머릭 DNA 및/또는 탈보호된 텔로머릭 DNA 및/또는 가속화된 텔로미어 손실, 및/또는 DDR 신호가 텔로미어에서 활성인 임의의 경우를 갖는 텔로미어이다.
텔로미어 기능 장애는 다수의 퇴행성 장애들에서 원인이 되는 역할을 갖는다. 이들 장애의 징후는 보편적인 질병 상태, 예컨대 휴킨슨-길포드 조로 증후군 (HGPS), 베르너 증후군, 블룸 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 가족력 IPF, 산발성 IPF, 재생불량성 빈혈, 상염색체-우성 선천성 각화이상증, 가족력 MDS-AML, 드 노보 선천성 각화이상증, X-연관 열성 선천성 각화이상증, 호에랄-레이다슨 증후군, 레베츠 증후군, 상염색체-열성 선천성 각화이상증, 코트 플러스 증후군, TRF1, POT1, TPP1, TINF2, RAP1 또는 TRF2 중 임의의 하나의 돌연변이 또는 불활성화에 의해 유발되는 질환, 부분 간절제술 시 손상된 재생, 간 섬유증, 간 만성 염증, 간 경화증, 폐 섬유증, 변경된 골수 전구체 분화, 골수부전, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알츠하이머 질병을 포함한 신경학적 장애, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심질환, 뒤시엔느 근이영양증, 2형 당뇨병, 손상된 생식력, 손상된 상처 치유, 관절염, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 노화를 포함한다. 예에서, 가속화된 텔로미어 손실, 즉 텔로미어 기능 장애는 간 경화증과 같이 높은 세포 턴오버를 갖는 만성 질병에서 말기 장기 부전을 초래하는 인자인 것으로 제안되어 왔다(문헌[Rudolph et al. 2000]).
이들 장애가 임상적으로 다양한 것으로 보이긴 하지만, 종합적으로 이들 장애는 짧거나 손상되고 보다 광범위하게 고장난 텔로미어를 특징으로 하는 증후군의 스펙트럼을 포함하고, 텔로미어 기능 장애는 노화 및 연령-관련 질병의 주요 특징이기도 하다(문헌[(Armanios and Blackburn, 2012; Gray et al., 2015; Opresko and Shay, 2016; Wang et al., 2015; Xi et al., 2013; Satyanarayana et al, 2003; Rudolph et al. 2000)] 참조).
추가의 텔로미어 기능 장애는 특히, TRF1(공정명 TERF1, 유전자 ID 7013), POT1(유전자 ID 25913), TPP1(공정명 ACD, 유전자 ID 65057), TINF2(유전자 ID 26277), RAP1(공정명 TERF2IP, 유전자 ID 54386) 또는 TRF2(공정명 TERF2, 유전자 ID 7014)의 돌연변이 또는 불활성화에 의해 야기될 수 있다.
또한, TRF2KO 모델은 텔로미어 기능 장애를 야기하고, 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환을 재현한다(recapitulate).
텔로미어 기능 장애는 하기 특징 또는 방법: 간접 면역형광, 면역조직화학, 염색질 면역침전, tDDRNA 검출 중 적어도 하나에 의해 확인/측정될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 세포 증식의 저해 또는 DNA 복구의 저해를 위한, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체 또는 유사한 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포 증식의 저해는 당업계의 표준 시험에 의해 측정되는 바와 같이, 그리고 실시예에 기재된 바와 같이, 세포 분열의 완전한 소멸(abrogation), 세포 분열의 부분적인 저해 및 세포 분열의 일시적인 저해, 세포 사멸, 세포자멸사, 세포괴사, 세포 노화, 세포 분화, 유사분열 곤란(mitotic catastrophe)을 포함한다. 본 발명은 또한, ALT를 특징으로 하는 질병, 예컨대 비제한적으로 암 및 전암성 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 것이며, 여기서, 상기한 질병은 임의의 장기 및 임의의 배아 기원의 세포에 영향을 미친다. 원발성 종양뿐만 아니라 치료 후 재성장하거나 재발된 전이성 ALT 종양 및 암이 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 길이가 대략 2 내지 200개 염기인 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 이러한 조성물은 적절한 비히클 내에서 포유류(예를 들어 인간)에게 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 5 내지 약 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 보다 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 5 내지 약 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 실시형태에서, DNA 올리고뉴클레오타이드는 약 8 내지 약 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직하게는, 이들 DNA 올리고뉴클레오타이드는 8 내지 21개 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 8 내지 16개 뉴클레오타이드 길이이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 관심 세포 또는 조직과 접촉하고/거나 도입되도록 상기 올리고뉴클레오타이드를 유기체에게 투여하는 임의의 적합한 방법은 합리적으로 효과적일 것으로 예상된다. 그 효과는 일상적인 최적화 프로토콜을 사용하여 최적화될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드는 임의의 적절한 공급원으로부터 수득될 수 있거나 합성에 의해 생성될 수 있다.
DNA 단편, 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 또는 다이뉴클레오타이드 이량체는 피부에 적용될 수 있고, 단독으로, 또는 의료 또는 미용 용도의 용매, 향료 또는 착색제, 안정화제, 선스크린 또는 다른 성분들을 포함하는 생리학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 비히클, 예컨대 물, 식염수, 또는 또 다른 적절한 전달 비히클 내에서 투여될 수 있다. 전달 비히클은 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 또는 다이뉴클레오타이드 이량체를 전달하는 임의의 적절한 비히클일 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드의 농도 범위는 0.1 nM 내지 500 μM일 수 있으며, 바람직하게는 시험관내 범위는 0.2 nM 내지 300 μM이고, 바람직하게는 시험관내 범위는 0.5 nM 내지 200 μM이다. 바람직한 생체내 범위는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/ kg이고, 바람직하게는 생체내 범위는 1 mg/kg 내지 50 mg/kg이다.
조성물의 활성 성분이 더 심부의 피부 세포에 접근할 수 있도록, 피부의 외층, 예를 들어 각질층을 통한 침투를 개선하는 비히클이 유용하다. 이러한 목적을 위한 비히클 구성 성분으로는, 에탄올, 이소프로판올, 다이에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르과 같은 다이에틸렌 글리콜 에테르, 아존(1-도데실아자사이클로헵탄-2-온), 올레산, 리놀레산, 프로필렌 글리콜, 고장성 농도의 글리세롤, 락트산, 글리콜산, 시트르산 및 말산 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, 프로필렌 글리콜은 전달 비히클로서 사용된다. 바람직한 실시형태에서, 3% 벤질설폰산 및 5% 올레일 알코올을 함유하는 프로필렌 글리콜: 에탄올: 이소프로필 미리스테이트(1: 2.7 : 1)의 혼합물이 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 리포좀 조제물이 사용될 수 있다. 리포좀 조제물은 관심 세포 또는 각질층에 침투하고 세포막과 융합하여 리포좀의 내용물을 세포 내로 전달하는 리포좀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포좀, Yarosh의 미국 특허 5,077,211, Redziniak 등의 미국 특허 4,621,023 또는 Redziniak 등의 미국 특허 4,508,703에 기재된 것과 같은 리포좀이 사용될 수 있다. 피부 질환을 표적으로 하고자 하는 본 발명의 조성물은 포유류의 피부를 UV 또는 산화 손상을 야기하는 제제에 노출시키기 이전, 동안 또는 이후에 투여될 수 있다. 다른 적합한 제형은 니오좀(niosome)을 이용할 수 있다. 니오좀은 리포좀과 유사한 지질 비히클로서, 막이 대체로 비이온성 지질로 구성되어 있으며, 이들 중 일부 형태는 각질층을 가로질러 화합물을 수송하는 데 효과적이다.
주로 피부에 적용하고자 하는 다른 적합한 전달 방법은, 올리고뉴클레오타이드(들) 외에도 수성 또는 수성-알코올성 매질 및 겔화제를 포함하는 하이드로겔 제형의 사용을 포함한다. 적합한 겔화제로는, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 카르보머(카르보폴), 하이팬(hypan), 폴리아크릴레이트 및 글리세롤 폴리아크릴레이트를 포함한다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 피부 표면에 국소적으로 적용된다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물은 신체의 다른 세포 또는 조직, 예컨대 상피 세포에 전달된다. 그러한 물질의 도입에 대해 피부보다 더 약한 장벽을 가진 것으로 인지되는 조직의 세포는 예를 들어 경구에 의해 구강으로; 에어로졸에 의해 호흡기 상피로; 점적 주입(instillation)에 의해 방광 상피로; 점적 주입 또는 좌제에 의해 장(상피)로, 또는 다른 국소 또는 표면 적용 수단에 의해 신체 내 다른 세포 또는 조직으로, 예컨대 점안액, 점비액 및 혈관형성술을 사용한 적용에 의해 치료될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 정맥내로 투여되거나, 관심 조직 내로 피내, 피하, 근육내 또는 복강내로 직접 주입될 수 있다. 또한, 혈액 세포의 치료의 경우, 본 발명의 화합물은 정맥내로 투여되거나 세포의 체외 순환 동안 예를 들어 광 영동(photophoresis) 장치를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 필요한 모든 것은, 관심 세포를 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 조성물과 접촉시키는 것이다.
올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체, 분화를 촉진하는 제제, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물은 관심 세포에 적절한 방식으로 투여(도입 또는 접촉)된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "관심 세포"는 ALT 또는 고장난 텔로미어를 특징으로 하는 질병에 의해 영향을 받게 될 수 있거나 영향을 받고 있는 세포이다.
올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체, 분화를 촉진하는 제제, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물은 적절한 시기에 유효량으로 적용된다. "적절한 시기"는 이용되는 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체 또는 다른 제제의 유형 및 분자량, 치료 또는 예방되는 질환, 모색된 결과 및 개별 환자에 따라 다를 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "유효량"은 측정 가능한 요망되는 결과를 달성하기에 충분한 양 또는 농도이다. 유효량은 이용되는 올리고뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 이량체 또는 다른 제제의 유형 및 분자량, 치료 또는 예방되는 질환, 모색된 결과 및 개별 환자에 따라 다를 것이다. 예를 들어, ALT 과증식성 질병, 암성 질환 또는 전암성 질환의 치료 또는 예방을 위해, 유효량은 질병의 증상들 중 임의의 하나를 감소 또는 경감시키거나, 질병에 의해 영향을 받는 세포의 부피, 면적 또는 수를 감소시키거나, 영향을 받는 면적의 형성을 예방하거나, 과증식성 장애에 의해 영향을 받는 세포의 성장 속도를 감소시키는 데 필요한 양이다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 발명의 저해제들은 이들의 비변형된 형태, 예를 들어 포스포다이에스테르 결합에 의해 연결된 비변형된 올리고뉴클레오타이드의 서열 형태에서 시험관내 및 생체내에서 활성이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드", "다이뉴클레오타이드" 등은 리보스 및/또는 데옥시리보스를 당으로서 갖고, 상이한 연결 또는 백본이 명시되지 않는 한 자연적으로 발생하는 바와 같은 포스포다이에스테르 연결("포스페이트 백본")을 갖는 분자를 지칭한다.
올리고뉴클레오타이드는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드이다. 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 단량체들의 선형 중합체로서, 이러한 중합체 내에서 뉴클레오타이드들은 하나의 뉴클레오타이드의 3' 위치와 인접한 뉴클레오타이드의 5' 위치 사이에서 포스포다이에스테르 결합에 의해 연결되어 있다. 다르게 지시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 "올리고뉴클레오타이드"는 포스포다이에스테르 백본을 갖는다.
피부를 통한 전달을 증강시키기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 이들의 음전하를 가리거나 감소시키거나 그렇지 않다면 이들의 화학적 특징을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 쉽게 입수 가능한 시약 및 당업계에 공지된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드의 암모늄염을 제조함으로써 달성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 암모늄염으로는, 트리메틸-, 트리에틸-, 트리부틸-, 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸-암모늄염이 포함된다. 암모늄 기 및 다른 양으로 하전된 기는, 각질층을 가로지르는 올리고뉴클레오타이드의 수송을 촉진하기 위해 효소적으로 분해 가능한 연결을 사용하여 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합될 수 있으며, 효소적으로 분해 가능한 연결은 표피의 생존 가능한 층(viable layer)의 세포 내에 도달 시, 상기 올리고뉴클레오타이드를 방출시킨다.
올리고뉴클레오타이드의 음전하를 감소시키거나 가리는 또 다른 방법은 당업계에 잘 공지된 방법 및 시약을 사용하여 올리고뉴클레오타이드의 5' 포스페이트 기 및/또는 올리고뉴클레오타이드의 내부 포스페이트에 폴리옥시에틸렌 스페이서를 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 사실상, 순 음전하를 +1만큼 감소시키고 올리고뉴클레오타이드를 덜 친수성으로 만드는 6-탄소 또는 12-탄소 변형제(링커)를 포스페이트에 첨가한다.
나아가 음전하 감소는, 폴리옥시에틸렌 링커의 말단에 포스포로아미다이트를 첨가함으로써 부가적인 중화 양전하를 제공함으로써 달성된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 포스포다이에스테르 백본은 또한, 음전하를 감소시키도록 변형되거나 합성될 수 있다. 바람직한 방법은 메틸 포스폰산(또는 키랄-메틸포스포네이트)의 사용을 수반하며, 이로써 포스페이트 내의 음으로 하전된 산소 원자들 중 하나는 메틸기로 대체된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는, 메틸기 대신에 설페이트를 포함하며 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 있는 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드와 유사하다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 또한, 뉴클레오타이드의 염기들이 펩타이드 백본을 통해 서로 연결되어 있는 펩타이드 핵산(PNA) 형태를 취할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 다른 변형들, 예컨대 미국 특허 6,537,973 및 미국 특허 6,506,735, 뿐만 아니라 문헌[(Stenvang et al., 2012)](이들은 모두 이들 문헌에 기재된 모든 올리고뉴클레오타이드 변형들에 대해 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있음) 및 다른 것들에 기재된 변형들을 당업자는 쉽게 알게 될 것이다.
올리고뉴클레오타이드는 또한, 2개 이상의 화학적으로 구별되는 백본 연결들의 조합을 갖도록 합성된 "키메릭" 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 이러한 백본 연결들 중 하나는 포스포다이에스테르이다. 일 실시형태에서, 키메릭 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에 하나 이상의 포스포다이에스테르 연결을 갖는다. 일 실시형태에서, 키메릭 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 하나 이상의 포스포다이에스테르 연결을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 키메릭 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단 및 5' 말단에 하나 이상의 포스포다이에스테르 연결을 갖는다.
올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드들은 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병, 예컨대 암 또는 엡스타인-바 바이러스 감염, 특히 연조직 육종, 바람직하게는, 연골 육종, 악성 섬유 조직구종을 포함한 미분화된 다형성 육종, 평활근육종, 상피모양 육종, 지방 육종, 섬유 육종 및 변이체, 혈관 육종 및 신경 섬유종, 중추신경계 암, 바람직하게는, 그레이드 II 미만성 별아교세포종; 그레이드 3 역형성 별아교세포종; 그레이드 4 소아 다형교아종, 희소돌기아교세포종, 역형성 수모세포종, 그레이드 1 털모양 별아교세포종, 비-역형성 수모세포종, 수막종, 슈반세포종, 방광암, 특히 소세포 암종 및 침습성 요로상피 암종, 부신 또는 말초신경계 암, 특히 신경절신경모세포종, 신경모세포종 및 크롬친화성 세포종, 신경내분비 신생물, 예컨대 부신경절종 및 유암종 종양, 신장암, 특히 난염성 암종, 육종성 암종 및 투명 세포 및 유두상 암종, 폐 및 늑막 암, 특히 악성 중피종, 대세포 암종 및 소세포 암종, 피부암, 예컨대 악성 흑색종, 간암, 예컨대 간세포 암종, 고환암, 예컨대 비정상피종성 생식세포 종양, 유방암, 특히 소엽암종; 관암종 및 속질암종, 자궁암, 예컨대 장액성 자궁내막 암종, 자궁경부의 편평세포 암종, 난소암, 특히 투명 세포 암종, 자궁내막 암종, 담낭암, 예컨대 선암종, 식도암의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것이거나, 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환, 특히 휴킨슨-길포드 조로 증후군(HGPS), 베르너 증후군, 블룸 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 가족력 IPF, 산발성 IPF, 재생불량성 빈혈, 상염색체-우성 선천성 각화이상증, 가족력 MDS-AML, 드 노보 선천성 각화이상증, X-연관 열성 선천성 각화이상증, 호에랄-레이다슨 증후군, 레베츠 증후군, 상염색체-열성 선천성 각화이상증, 코트 플러스 증후군, TRF1, POT1, TPP1, TINF2, RAP1 또는 TRF2 중 임의의 하나의 돌연변이 또는 불활성화에 의해 유발된 질환, 부분 간절제술 시 손상된 재생, 간 섬유증, 간 만성 염증, 간 경화증, 폐 섬유증, 변경된 골수 전구체 분화, 골수부전, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알츠하이머 질병을 포함한 신경학적 장애, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심질환, 뒤시엔느 근이영양증, 2형 당뇨병, 손상된 생식력, 손상된 상처 치유, 관절염, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 노화의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것이다.
예를 들어, 이러한 질병은 문헌[(Durant, 2012)](원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오타이드는 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 조성물에서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 용해제 및 당업계에 잘 공지된 다른 물질들을 함유할 수 있다. 양이온성 지질, 예컨대 DOTAP[N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄염은 안정성 증강을 위해 올리고뉴클레오타이드와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 개선된 생체이용률을 위해 PLGA/PLA 공중합체, 키토산 또는 푸마르산/세바스산 공중합체와 복합될 수 있다{여기서, PLGA는 [폴리(락타이드-코-글리콜라이드)]이며; PLA는 폴리(L-락타이드)임}. 용어 "약제학적으로 허용 가능한" 및 "생리학적으로 허용 가능한"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 무독성 물질임을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 따라 다를 것이다.
ALT 질병에 대한 항증식제로서 사용되는 조성물은 올리고뉴클레오타이드(들)의 활성을 증강시키거나 치료 시 이의 활성 또는 사용을 보완하는 다른 제제, 예컨대 화학치료제 또는 방사능제를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 부가적인 인자 및/또는 제제는 올리고뉴클레오타이드(들)와 상승작용 효과를 발휘하거나 부작용을 최소화하기 위해 조성물에 포함될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 조성물의 투여는 다른 치료법과 동시에 투여될 수 있으며, 예를 들어 화학치료법 또는 방사선 치료 섭생과 함께 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드는 질병의 치료를 위해 다른 조성물 및 절차와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양은 통상 올리고뉴클레오타이드 치료법과 병행된 수술, 방사선 치료, 화학치료법 또는 면역치료법으로 치료될 수 있으며, 그런 다음 올리고뉴클레오타이드가 후속적으로 환자에게 투여되어, 미소전이의 휴면(dormancy)을 연장시키고 임의의 잔여 원발성 종양의 성장을 안정화 및 저해할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 텔로머라제-음성, ALT-양성 클론의 증식(expansion)을 방지하기 위해 텔로머라제 저해제와 조합되어 사용될 수 있다.
바람직하게는, 다른 치료제는 ATR 저해제, DDR 저해제, HR 저해제, 텔로미어에서의 DNA 손상 발생을 특이적으로 표적화하고/거나 특이적으로 야기하는 분자, 바람직하게는, G-콰드루플렉스 상호작용 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서, ATR 저해제는 비제한적으로 VE-821(Vertex Pharmaceuticals), VE-822(Vertex Pharmaceuticals), AZ20(AstraZeneca), AZD6738(AstraZeneca)(문헌[(Flynn et al., 2015; Weber and Ryan, 2015)](모든 참조문헌들은 원용에 의해 포함됨)에 기재된 바와 같음)을 포함하여, ATR의 키나아제 활성을 저해할 수 있는 저분자 화합물이다.
DDR 저해제는 비제한적으로 카페인, 보르트만닌(Wortmannin), KU-55933, KU-60019, KU-559403, 스키산드린 B(Schisandrin B), NU6027, NVP-BEZ235(문헌[(Begg et al., 2011; Kelley et al., 2014; Weber and Ryan, 2015)]에 기재된 바와 같으며, 이들 문헌은 모두 원용에 의해 포함됨)을 포함하는, DNA 손상 반응(DDR)으로 공지된 세포 과정에 손상을 주거나 저해할 수 있는 임의의 화합물 또는 실험적 접근법이다.
HR 저해제는 비제한적으로 이니파리브(Iniparib)(SAR240550, BSI-201; Sanofi-Aventis), 올라파리브(Olaparib)(AZD2281, KU-0069436; AstraZeneca), 니라파리브(Niraparib)(Tesaro), 루카파리브(Rucaparib)(CO-338, AG-014699, PF-O1367338; Pfizer), 벨리파리브(Veliparib)(ABT-888; Abbott), AZD2461(AstraZeneca), BMN673(BioMarin Pharmaceutical), CEP-9722(Cephalon), E7016(Esai), INO-1001(Inotek Pharmaceuticals), MK-4827(Merck), 메톡시아민(Sigma Aldrich), RI-1, IBR2, B02, 할레나퀴논(Halenaquinone)(문헌[(Feng et al., 2015; Kelley et al., 2014; Ward et al., 2015)]에 기재된 바와 같으며, 모든 참조문헌들은 원용에 의해 포함됨)을 포함하는, 상동성 재조합(HR)에 의한 DNA 복구로서 공지된 세포 과정을 손상시키거나 저해할 수 있는 임의의 화합물 또는 실험적 접근법이다.
텔로미어에서의 DNA 손상 발생을 특이적으로 표적화하고/거나 야기하는 분자는 비제한적으로 G-쿼드루플렉스-결합 리간드(예를 들어 BRACO-19, 텔로메스타틴(Telomestatin), RHPS4, 쿼르플록신(Quarfloxin), TMPyP4, AS1410), 토포이소머라제 저해제, 시스플라틴, 하이드록시우레아(문헌[(Lu et al., 2013; Muller and Rodriguez, 2014; Neidle, 2010; Salvati et al., 2015; Sissi and Palumbo, 2014)]에 기재된 바와 같으며, 모든 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 포함하는, 텔로미어와 특이적으로 또는 우선적으로 상호작용하여, 텔로머릭 DNA 내에서의 DNA 손상 및/또는 DDR 신호전달의 활성화 또는 저해 및/또는 DNA 복구의 활성화 또는 저해를 유도하는 임의의 화합물 또는 실험적 접근법이다.
올리고뉴클레오타이드와 조합하여 사용될 수 있는 다른 분자로는, 아비트렉세이트(Abitrexate)(메토트렉세이트 주사), 아브락산(Abraxane)(파클리탁셀 주사), 아드세트리스(Adcetris)(브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab Vedotin) 주사), 아드리아마이신(Adriamycin)(독소루비신), 아드루실(Adrucil) 주사(5-FU(플루오로우라실)), 아피니토르(Afinitor)(에베롤리무스(Everolimus)), 아피리토르 디스페르즈(Afinitor Disperz)(에베롤리무스(Everolimus)), 알림타(Alimta)(페메트렉세드(PEMETREXED)), 알케란(Alkeran) 주사(멜팔란 주사), 알케란 정제(멜팔란), 아레디아(Aredia)(파미드로네이트(Pamidronate)), 아리미덱스(Arimidex)(아나스트로졸(Anastrozole)), 아로마신(Aromasin)(엑세메스탄(Exemestane)), 아라논(Arranon)(넬라라빈(Nelarabine)), 아르제라(Arzerra)(오파투무맙(Ofatumumab) 주사), 아바스틴(Avastin)(베바시주맙(Bevacizumab)), 벡사르(Bexxar)(토시투모맙(Tositumomab)), BiCNU(카르무스틴(Carmustine)), 블레녹산(Blenoxane)(블레오마이신), 보술리프(Bosulif)(보수티닙(Bosutinib)), 부술펙스(Busulfex) 주사(부술판 주사), 캄파스(Campath)(알렘투주맙(Alemtuzumab)), 캄토사(Camptosar)(이리노테칸(Irinotecan)), 카프렐사(Caprelsa)(반데타닙(Vandetanib)), 카소덱스(Casodex)(비칼루타미드(Bicalutamide)), CeeNU(로무스틴(Lomustine)), CeeNU 용량 팩(로무스틴), 세루비딘(Cerubidine)(다우노루비신(Daunorubicin)), 클롤라(Clolar)(클로파라빈(Clofarabine) 주사), 코메트리크(Cometriq)(카보잔티닙(Cabozantinib)), 코스메겐(Cosmegen)(닥티노마이신(Dactinomycin)), 시토사르U(CytosarU)(시타라빈(Cytarabine)), 시톡산(Cytoxan)(시톡산), 시톡산 주사(사이클로포스파미드 주사), 다코겐(Dacogen)(데시타빈(Decitabine)), 다우녹솜(DaunoXome)(다우노루비신 지질 복합체 주사), 데카드론(Decadron)(덱사메타손), 데포시트(DepoCyt)(시타라빈 지질 복합체 주사), 덱사메타손 인텐솔(덱사메타손), 덱스팍 타페르팍(Dexpak Taperpak)(덱사메타손), 도세프레즈(Docefrez)(도세탁셀), 독실(Doxil)(독소루비신 지질 복합체 주사), 드록시아(Droxia)(하이드록시우레아), DTIC(데카바진(Decarbazine)), 엘리가르드(Eligard)(류프롤라이드(Leuprolide)), 엘렌스(Ellence)(엘렌스(에피루비신(epirubicin))), 엘록사틴(Eloxatin)(엘록사틴(옥살리플라틴(oxaliplatin))), 엘스파르(Elspar)(아스파라기나제), 엠시트(Emcyt)(에스트라무스틴(Estramustine)), 에르비툭스(Erbitux)(세툭시맙(Cetuximab)), 에리베드게(Erivedge)(비스모데깁(Vismodegib)), 에르위나제(Erwinaze)(아스파라기나제 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)), 에티올(Ethyol)(아미포스틴(Amifostine)), 에토포포스(Etopophos)(에토포사이드 주사), 율렉신(Eulexin)(플루타마이드(Flutamide)), 파레스톤(Fareston)(토레미펜(Toremifene)), 파슬로덱스(Faslodex)(풀베스트란트(Fulvestrant)), 페마라(Femara)(레트로졸(Letrozole)), 피르마곤(Firmagon)(데가렐릭스(Degarelix) 주사), 플루다라(Fludara)(플루다라빈(Fludarabine)), 플로렉스(Folex)(메토트렉세이트 주사), 폴로틴(Folotyn)(프랄라트렉세이트(Pralatrexate) 주사), FUDR(FUDR(플록수리딘(floxuridine))), 겜자(Gemzar)(겜시타빈), 길로트리프(Gilotrif)(아파티닙(Afatinib)), 글리벡(Gleevec)(이마티닙 메실레이트), 글리아델 웨이퍼(Gliadel Wafer)(카르무스틴 웨이퍼(Carmustine wafer)), 할라벤(Halaven)(에리불린(Eribulin) 주사), 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙(Trastuzumab)), 헥살렌(Hexalen)(알트레타민(Altretamine)), 하이캄틴(Hycamtin)(토포테칸), 하이캄틴(토포테칸), 하이드레아(Hydrea)(하이드록시우레아), 이클루시그(Iclusig)(포나티닙(Ponatinib)), 이다마이신 PFS(Idamycin PFS)(이다루비신(Idarubicin)), 이펙스(Ifex)(이포스파미드(Ifosfamide)), 인리타(Inlyta)(악시티닙(Axitinib)), 인트론 A 알파b(Intron A alphab)(인터페론 알파-2a), 이레싸(Iressa)(게피티닙(Gefitinib)), 이스토닥스(Istodax)(로미뎁신(Romidepsin) 주사), 익셈프라(Ixempra)(익사베필론(Ixabepilone) 주사), 쟈카피(Jakafi)(룩솔리티닙(Ruxolitinib)), 제브타나(Jevtana)(카바지탁셀(Cabazitaxel) 주사), 카드실라(Kadcyla)(아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-trastuzumab Emtansine)), 키프롤리스(Kyprolis)(카르필조밉(Carfilzomib)), 류케란(Leukeran)(클로람부실), 류킨(Leukine)(사그라모스팀(Sargramostim)), 류스타틴(Leustatin)(클라드리빈(Cladribine)), 루프론(Lupron)(류플롤라이드(Leuprolide)), 루프론 데폿(류플롤라이드), 루프론 데폿PED(류플롤라이드), 라이소드렌(Lysodren)(미토탄(Mitotane)), 마르퀴보 키트(Marqibo Kit)(빈크리스틴(Vincristine) 지질 복합체 주사), 마툴란(Matulane)(프로카바진), 메가세(Megace)(메게스트롤(Megestrol)), 메키니스트(Mekinist)(트라메티닙(Trametinib)), 메스넥스(Mesnex)(메스나(Mesna)), 메스넥스(메스나 주사), 메타스트론(Metastron)(스트론튬-89 클로라이드), 멕세이트(Mexate)(메토트렉세이트 주사), 무스타르겐(Mustargen)(메클로레타민(Mechlorethamine)), 무타마이신(Mutamycin)(미토마이신), 마일레란(Myleran)(부술판), 마일로타르그(Mylotarg)(겜투주맙 오조가미신(Gemtuzumab Ozogamicin)), 나벨빈(Navelbine)(비노렐빈(Vinorelbine)), 네오사(Neosar) 주사(사이클로포스파미드 주사), 네울라스타(Neulasta)(필그라스팀(filgrastim)), 네울라스타(페그필그라스팀(pegfilgrastim)), 네우포겐(Neupogen)(필그라스팀), 넥사바(Nexavar)(소라페닙(Sorafenib)), 닐란드론(Nilandron)(닐란드론(닐루타미드(nilutamide))), 니펜트(Nipent)(펜토스타틴(Pentostatin)), 놀바덱스(Nolvadex)(타목시펜(Tamoxifen)), 노반트론(Novantrone)(미톡산트론(Mitoxantrone)), 온카스파르(Oncaspar)(페가스파르가제(Pegaspargase)), 온코빈(Oncovin)(빈크리스틴), 온탁(Ontak)(데닐루킨 디프티톡스(Denileukin Diftitox)), 온솔(Onxol)(파클리탁셀 주사), 판레틴(Panretin)(알리트레티노인(Alitretinoin)), 파라플라틴(Paraplatin)(카르보플라틴), 페르제타(Perjeta)(페르투주맙(Pertuzumab) 주사), 플라티놀(Platinol)(시스플라틴), 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방사선치료법은 병의 치료를 위한 방사선, 통상 X-선의 사용을 의미한다. X-선은 1985년에 발견되었으며, 그때부터 방사선은 진단 및 연구(X-선) 및 치료(방사선치료법)를 위해 의학에서 사용되어 왔다. 방사선치료법은 X-선, 코발트 조사, 전자 및 보다 드물게는 다른 입자들, 예컨대 양성자를 사용하는 외부 방사선치료법으로서 신체의 외측으로부터 행해질 수 있다. 방사선치료법은 또한, 암 치료를 위해 방사성 금속 또는 액체(동위원소)를 사용하는 내부 방사선치료법으로서 신체내로부터 행해질 수 있다.
보다 추가의 양태는 상승작용 또는 부가적 이득을 위해, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 다른 항암 치료법과 병용하는 단계를 포함한다.
기존의 항암 치료법은 암세포의 DNA에 손상을 주거나 또는 DDR을 저해함으로써 작용하는 효과적인 항암 치료이다. 그러나, 이들 항암 치료법의 대부분의 DNA 손상 활성은 서열 특이적이지 않다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 서열-특이적인 방식으로 DDR을 손상시키며, 그런 다음 이들 올리고뉴클레오타이드는 기존의 DNA 손상 치료에 서열 특이성을 부여하여, 효능을 증강시킬 수 있다.
병용 치료 스케쥴은, 올리고뉴클레오타이드가 상기 확인된 "파트너" 치료제들 중 임의의 치료제와 동시에, 이전에 및/또는 이후에 투여되는 것으로 예상할 수 있다.
병용 치료법은 진행된 질병 단계에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 예상컨대 보조제 및 네오-보조제 설정에서 이용될 수 있다.
본 발명에서, "고장난 텔로머릭 DNA"는 손상된 텔로머릭 DNA 및/또는 위태롭게 짧은 텔로머릭 DNA 및/또는 캡핑되지 않은 텔로머릭 DNA 및/또는 탈보호된 텔로머릭 DNA 및/또는 DDR 신호가 텔로미어에서 활성인 임의의 경우를 갖는 텔로미어이다.
본 발명의 조성물은 리포좀 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 리포좀 내에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(들)는 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체 외에도, 양친매성 제제, 예컨대 수용액 내에서 미쉘, 불용성 단일층, 액체 결정 또는 라멜라 층으로서 응집된 형태로 존재하는 지질과 조합된다. 리포좀 제형에 적합한 지질로는 비제한적으로, 모노글리세라이드, 다이글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산이 포함된다. 약제학적 조성물은 항증식 치료법에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드를 함유하도록 제조될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물의 투여는 당업자에게 공지된 여러 가지 통상적인 방식들, 예컨대 경구 섭취, 흡입, 예를 들어 에어로졸의 흡입, 국소 또는 경피(transdennal) 적용, 또는 두개내, 뇌실내, 대뇌내, 질내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예를 들어 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로, 또는 피부, 피하, 복강내, 비경구 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 투여 경로는 표적화되는 종양, 성장 또는 병변의 부위에 따라 결정될 수 있다. 유효량의 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 성장 또는 종양 부위로 전달하기 위해, 부위 내로의 직접 주입이 사용될 수 있다. 대안적으로, 접근 가능한 점막 부위에 대해서는, 볼리스틱 전달(ballistic delivery), 올리고뉴클레오타이드를 마이크로미터 직경의 비드 상으로 코팅시키는 방법, 또는 구강내 제트 주사 장치 방법이 사용될 수 있다. 유전자 치료법에서 DNA 전달용 바이러스 벡터가 수년 동안 연구 대상이 되어 왔다. 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시나 바이러스 및 식물-특이적 바이러스가, 암 또는 다른 성장물의 치료를 위한 올리고뉴클레오타이드를 포장하고 전달하기 위한 시스템으로서 사용될 수 있다. 아데노-연관 바이러스 벡터는 복제될 수 없는 것으로 개발되어 왔으나, 세포를 감염시키는 능력은 보유한다. 그 이점은 낮은 면역원성으로서, 반복된 투여를 가능하게 한다. 전달 시스템은 예를 들어, 문헌[(Page and Cudmore, 2001)]에서 검토되어 있다. 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산(안티센스 올리고뉴클레오타이드)의 기능을 저해한다는 이론을 기반으로 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행된 연구들은 표적 세포에의 효과적인 전달 방법을 발견하였으며, 이들 연구 중 대부분은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행되었다. 임상 시험에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특수 전달 비히클 없이 식염수 용액 내에서 투여되어 왔다(문헌[(Hogrefe, 1999)]에서 검토됨). 비경구 투여에 적합한 제형으로는, 항산화제, 완충제, 세균 발육 억제제, 및 제형을 의도된 수여자의 유체와 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 있다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이얼로 주어질 수 있고, 사용 직전에, 멸균된 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조된(동결건조된(lyophilized)) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 언급된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(들) 외에도, 등장성 비히클, 예컨대 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드 주사액, 락테이트화된 링거 주사액 또는 당업계에 공지된 다른 비히클을 함유해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한, 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제 또는 당업자에게 공지된 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
지효성(timed release) 또는 서방성(sustained release) 전달 시스템의 사용 또한, 본 발명에 포함된다. 이러한 시스템은 수술이 어렵거나 불가능한 상황, 예를 들어 연령 또는 질병 경로 그 자체에 의해 심신이 약화된 환자, 또는 위험-이득 분석이 치유를 능가하는 제어(control over cure)를 가리키는 경우에 매우 바람직하다. 하나의 방법은 예를 들어 종양 부위에서, 측정된 용량의 제형을 일정한 기간에 걸쳐 전달하기 위해 이식 가능한 펌프를 사용하는 것이다. 서방성 매트릭스는 특히 성장물 또는 종양의 국소 치료를 위해, 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 전달 방법으로서 사용될 수 있다. 이러한 매트릭스는 효소적 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해 가능한 물질, 통상 중합체로 제조된 매트릭스이다. 이러한 매트릭스는 일단 체내로 삽입되면, 효소 및 체액에 의해 작동된다. 서방성 매트릭스는 바람직하게는, 생체적합성 물질, 예컨대 리포좀, 폴리락타이드(폴리락트산), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락타이드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, 폴리 (오르토) 에스테르, 폴리단백질, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아민산, 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오타이드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘으로부터 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 또는 폴리락타이드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 중 하나의 매트릭스이다. 본 발명의 약제학적 조성물 중 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 양은 치료되는 질환의 성질 및 중증도, 및 환자가 받은 과거의 치료의 성질에 따라 다를 것이다. 인간 환자의 경우, 담당의사는 각각의 개별 환자를 치료하기 위해 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 용량을 결정할 것이다. 처음에, 담당의사는 저용량을 투여하고 환자의 반응을 관찰할 수 있다. 최적의 치료 효과가 환자에게서 얻어질 때까지 더 많은 용량(dose)이 투여될 수 있으며, 그 시점에서 투여량(dosage)은 더 증가되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 치료법의 기간은 치료되는 질병의 중증도 및 각각의 개별 환자의 상태 및 잠재적인 특이한(idiosyncratic) 반응에 따라 다양할 것이다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 작성된 설명서를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 별개의 용기 내에 존재할 수 있다.
본 발명에서, 상기 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물로 치료를 받을 피험자의 확인 방법은, 측정된 양의 DDRNA 또는 tDDRNA를 대조군 양과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대조군 양은 건강한 피험자에서 측정된 양일 수 있으며, 대조군 양은 ALT-질병에 의해 영향을 받지 않고 있거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환에 의해 영향을 받지 않고 있는 피험자에서 측정된 양일 수 있으며, 대조군 양은 치료 개입 이전 또는 이후에 동일한 피험자에서 측정된 양일 수 있다.
본 발명은 하기 도면을 참조로 하여 비제한적인 실시예에 의해 예시될 것이다.
도 1. 텔로미어에서 발생된 DDRNA 분자 및 LNA 올리고뉴클레오타이드의 모식도이다. TeloG 및 TeloC DDRNA는 고장난 텔로미어로부터 발생되고, DDR 활성화에 필수적이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(안티 TeloG 및 안티 TeloC)는 DDRNA에 결합하여 그 기능을 저해할 수 있으며, 이로써 치료 활성을 갖는다. 도시된 서열은 본 발명의 비제한적인 예이다. 보고된 서열은 가능한 ASO 서열의 일례이다.
도 2. 텔로머릭 DDRNA는 텔로미어 언캡핑(uncapping) 시 상향조절된다. 크기에 의해 선별된(40개 뉴클레오타이드보다 더 짧은) RNA 종을 RT-qPCR에 의해 분석하였다. 마이크로 RNA mir29b를 노멀라이저(normalizer)로서 사용하였다(n = 4 독립적인 실험). TRF2+/- 및 TRF2-/-는 TRF2의 이종성 또는 동종성 결실을 갖는 세포를 지칭하며; TeloG 및 TeloC는 도 1에 기재된 바와 같은 텔로머릭 가닥 서열을 갖는 DDRNA이다.
도 3. 텔로머릭 DDRNA는 ALT 세포주에서 상향조절된다. 크기에 의해 선별된(40개 뉴클레오타이드보다 더 짧은) RNA를 RT-qPCR에 의해 분석하여, DDRNA 수준을 검출하였다. WI-38 VA-13 ALT 세포주를 이의 부모 비-ALT(또는 ALT 음성) 세포주 WI-38과 비교하였으며(n = 3 독립적인 실험); 텔로머라제-양성(비-ALT 또는 ALT 음성) 세포주 SW39를 ALT-양성 세포주 SW26과 비교하였다(n = 2 독립적인 실험). 인공 스파이트-인(spike-in) RNA 올리고뉴클레오타이드를 노멀라이저로서 사용하였다. TeloG 및 TeloC는 도 1에 기재된 바와 같은 텔로머릭 가닥 서열을 갖는 DDRNA이다.
도 4. 텔로머릭 서열을 갖는 LNA 올리고뉴클레오타이드는 U-2 OS 세포에서 세포 성장을 특이적으로 감소시킨다. U-2 OS(ALT 또는 ALT 양성), BJ ELR(비-ALT 또는 ALT 음성) 및 BJ hTERT(비-ALT 또는 ALT 음성) 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 200 nM 농도의 지시된 LNA로 형질감염시켰다(모크(mock), 대조군, 안티 TeloG 또는 안티 TeloC). 그래프는 제0일에 정상화된 상대적인 세포수를 보여준다(n = 3 독립적인 실험; * = p 값 < 0.05, ** = p 값 < 0.01).
도 5. 텔로머릭 서열을 갖는 LNA 올리고뉴클레오타이드는 U-2 OS에서 ALT-연관된 PML 바디(APB)의 수를 감소시킨다. U-2 OS 세포를 최종 농도 200 nM의 지시된 LNA로 형질감염시키고, 형질감염 후 제3일에 APB에 대해 염색하였다(n = 3 독립적인 실험; ** = p 값 < 0.001).
도 6. 텔로머릭 서열을 갖는 LNA 올리고뉴클레오타이드는 상이한 ALT 세포주에서 세포 성장을 감소시킨다. U-2 OS, Saos-2 및 WI-38 VA-13 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 최종 농도 200 nM의 지시된 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 제10일의 상대적인 세포수를 보여준다.
도 7. 텔로머릭 서열을 갖는 포스포로티오에이트 백본 LNA 올리고뉴클레오타이드(PSLNA)는 세포 성장을 저해하는 데 있어서 10배 더 효과적이고 ALT 세포에 대한 특이성을 보유한다. U-2 OS 및 BJ hTERT 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 지시된 농도의 지시된 PS LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 제10일의 상대적인 세포수를 보여준다.
도 8. 포스포로티오에이트 백본 LNA 올리고뉴클레오타이드(PSLNA)는 U-2 OS 세포에서 세포 성장을 특이적으로 저해하는 데 효과적이다. U-2 OS 및 BJ hTERT 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 20 nM의 농도의 지시된 PS LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 제10일의 상대적인 세포수를 보여준다.
도 9. 텔로미어에서 발생된 DDRNA 분자 및 타이니(tiny) LNA 올리고뉴클레 오타이드의 모식도이다. 타이니 LNA 분자는 TeloG DDRNA 및 TeloC DDRNA에 결합하여 저해할 수 있으며, 이로써 치료 활성을 갖는다. 도시된 서열은 본 발명의 비제한적인 예이다.
도 10. 타이니 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드는 U-2 OS 세포에서 세포 성장을 저해하는 데 효과적이다. U-2 OS 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 최종 농도 20 nM의 지시된 포스포로티오에이트 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된, 레사주린(resazurin) 방법(재료 및 방법을 참조)에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포 성장을 보여준다(n = 3 독립적인 실험; *** = p 값 < 0.001).
도 11. 타이니 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드는 U-2 OS 세포에서 세포 성장을 특이적으로 저해하는 데 효과적이다. U-2 OS 및 BJ 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 20 nM 농도의 지시된 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된, 레사주린 방법에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포 성장을 보여준다.
도 12. 타이니 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드는 3배 더 높은 농도로 사용되었을 때, U-2 OS 세포에서 세포 성장을 저해하는 데 있어서 PS 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드와 유사한 효능을 보여준다. U-2 OS 세포를 제0일에 20 nM(PS 안티 TeloC) 또는 60 nM(타이니 대조군, 타이니 안티 TeloG, 타이니 안티 TeloC) 농도의 지시된 포스포로티오에이트 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 제6일에 정상화된, 레사주린 방법에 의해 측정된 바와 같은 제6일째의 상대적인 세포 성장을 보여준다.
도 13. 타이니 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드는 3배 더 높은 농도로 사용되었을 때, U-2 OS 세포에 대해 특이적이다. U-2 OS 및 BJ 세포를 제0일에 60 nM(타이니 대조군, 타이니 안티 TeloG, 타이니 안티 TeloC) 또는 20 nM(PS 안티 TeloC) 농도의 지시된 포스포로티오에이트 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된, 레사주린 방법에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포 성장을 보여준다.
도 14. GBM14 세포는 네이키드-전달된(naked-delivered) PS 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드에 대해 농도-의존적 방식으로 민감하다. GBM14를 세포 배양 배지 중 10 μM 또는 40 μM 농도의 지시된 PS LNA와 함께 인큐베이션하였다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된, 레사주린 방법에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포 성장을 보여준다.
도 15. GBM14 세포는 네이키드-전달된 타이니 안티 TeloC LNA 올리고뉴클레오타이드에 민감하다. GBM14를 세포 배양 배지 중 120 μM 농도의 지시된 타이니 LNA와 함께 인큐베이션하였다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된, 레사주린 방법에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포 성장을 보여준다.
도 16. 생체내에서 G292 종양 성장은 PS 안티 TeloC 및 타이니 안티 TeloC를 이용한 치료 시 감소된다. G292 종양을 갖는 마우스를, 지시된 올리고뉴클레오타이드 또는 대조군으로서 PBS를 복강내 주사하여 치료하였다(n = 7 마우스/그룹; ** = p 값 < 0.01).
도 17. G292 종양은 PS 안티 TeloC로 치료된 경우, 1 cm 3 크기에 더 느리게 도달하였다. (n = 7 마우스/그룹; ** = p 값 < 0.01; *** = p 값 < 0.001).
도 18. PS 안티 TeloC 또는 안티 TeloG로 치료를 받은 2세대 텔로머라제 돌연변이체 제브라피시는 덜 중증의 표현형을 보여준다. 텔로머라제 돌연변이체 제브라피시에게 PS LNA를 주사하고, 교배시켜 2세대를 수득하였다. 그래프는 텔로머라제 돌연변이와 연관된 형태적 결함의 중증도를 상이한 정도로 보여주는 2세대 피시의 퍼센트를 보여준다(1개 시료 당 적어도 200마리의 피시를 분석하였음).
도 19. PS 안티 TeloC 또는 안티 TeloG로 치료를 받은 2세대 텔로머라제 돌연변이체 제브라피시는 더 오래 생존한다. 그래프는 2세대 텔로머라제 돌연변이체 제브라피시의 생존율을 보여준다(1개 시료 당 적어도 200마리의 피시를 분석하였음).
도 20. PS 안티 TeloG 및 안티 TeloC는 프로게린-발현 세포에서 세포 성장을 방지한다. 라민 A 또는 프로게린을 발현하는 레트로바이러스 감염된 BJ 세포를 지시된 PS LNA(20 nM)로 형질감염시켰다. 세포를 고정하고, 면역형광을 위해 8시간-BrdU 펄스 후 염색하였다. BrdU 및 KI67에 대한 항체를 정량화에 사용하였다.
도 21. 프로게린은 PS LNA-처리된 시료에서 유사한 수준으로 발현된다. 라민 A 또는 프로게린을 발현하는 레트로바이러스 감염된 BJ 세포를 라민(이소폼(isoform) A 및 C를 둘 다 검출함), 프로게린, 및 로딩 대조군으로서 빈쿨린(vinculin) 발현에 대해 프로브(probe)하였다.
도 22. PS 안티 TeloG는 피부에서의 프로게린 발현의 마우스 모델에서 생존율을 증가시킨다. 그래프는 비처리된 마우스와 비교하여, PS 안티 TeloG LNA 올리고뉴클레오타이드로 처리된 HGPS(프로게린-발현) 및 야생형 마우스의 생존율을 보여준다(n은 각각의 그룹 당 분석된 마우스의 수를 나타냄).
도 23. 텔로머릭 전구체 전사체의 검출이다. (a) 총 세포 RNA를 지시된 유전자형의 MEF(마우스 배아 섬유아세포)로부터 단리하고, 가닥-특이적인 RT-qPCR에 사용하여 텔로머릭 전구체 전사체를 검출하였다. (b) (a)에서와 동일한 RT-qPCR을 사용하여, 인간 섬유아세포 유래의 텔로머릭 전구체 전사체를 검출하였다. 총 세포 RNA를 우측 패널에 대해 SW39(비-ALT) 및 SW26(ALT)로부터 단리하였다.
도 24. 안티 TeloC 처리 시, ALT 세포에서의 세포자멸사 경로의 활성화이다. U-2 OS 세포에 지시된 LNA를 처리하였다. PS LNA를 20 nM에서 형질감염시킨 한편, 타이니 LNA를 60 nM에서 형질감염시켰다. 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 형질감염시켰다. 시료를 세포자멸사 마커, 카스파제 3 및 Parp-1 절단의 단백질 검출을 위해, 또는 FACS 분석을 위해 지시된 일수(day)에 수합하였다(서브 G1 분획 및 카스파제 3 절단).
도 25. 안티 TeloC LNA는 ALT 세포에서 길어진 S-단계를 유도한다. U-2 OS 세포를 제0일, 제3일 및 제7일에 20nM에서 지시된 LNA, PS LNA 및 60nM에서 타이니 LNA로 형질감염시켰다. 세포를 세포 주기의 FACS 분석을 위해 제2일, 제6일 및 제9일에 수합하였다.
도 26. 안티 TeloC LNA는 ALT-특이적 저해제이다. 세포주를 제0일, 제3일 및 제7일에 20nM에서 지시된 LNA, PS LNA 및 60nM에서 타이니 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 레사주린 값에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포수를 보여준다.
도 27. LNA의 네이키드 전달은 U-2 OS 세포 성장을 저해하는 데 충분하다. (a) U-2 OS 세포를 제0일에 지시된 농도의 LNA로 처리하였다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 레사주린 값에 의해 측정된 바와 같은 제7일의 상대적인 세포수를 보여준다. (b) U-2 OS 세포를 (a)에서와 같이 처리한 한편, 세포수를 제6일에 측정하였다.
도 28. G-292 성장은 안티 TeloC LNA에 의해 저해된다. G-292를 제0일 및 제3일에 200 nM의 지시된 LNA로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 레사주린 값에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포수를 보여준다.
도 29. LNA의 네이키드 전달은 G-292 세포 성장을 저해하는 데 충분하다. G-292 세포를 제0일에 지시된 농도의 LNA로 처리하였다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 레사주린 값에 의해 측정된 바와 같은 제7일의 상대적인 세포수를 보여준다.
도 30. 2'-O-메틸(2'-O-Me) ASO 안티 TeloC ASO는 U-2 OS 세포에서 세포 성장을 특이적으로 저해하는 데 효과적이다. U-2 OS 및 BJ 세포를 제0일에 20 nM 농도의 지시된 2'-O-Me ASO 또는 PS 안티 TeloC로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 레사주린 값에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포수를 보여준다.
도 31. 2'-O-Me ASO는 100 nM까지는 비독성이다 . U-2 OS 세포를 제0일에 지시된 농도의 지시된 ASO로 형질감염시켰다. 그래프는 제0일에 대해 정상화된 레사주린 값에 의해 측정된 바와 같은 상대적인 세포수를 보여준다.
재료 및 방법
배양된 세포: MEF CRE-ER TRF2fl/fl 및 MEF CRE-ER TRF2fl/+(Celli and de Lange, 2005)를 10% 태아 소 혈청 및 1% 글루타민이 보충된 DMEM에서 성장시켰으며; CRE 활성화 및 TRF2 넉아웃 유도를 위해, 세포에 600 nM의 4 하이드록시타목시펜을 24시간 동안 처리하고, 24시간 후에 분석하였다. U-2 OS 세포(ATCC)를 10% 태아 소 혈청 및 1% 글루타민이 보충된 DMEM에서 성장시켰다. Saos-2 세포(ATCC)를 15% 태아 소 혈청이 보충된 McCoy's 5A + 글루타맥스에서 성장시켰다. WI-38 및 WI-38 VA-13(ATCC)을 10% 태아 소 혈청, 10 mM 비필수 아미노산 및 1 mM 소듐 피루베이트가 보충된 MEM + 글루타맥스에서 성장시켰다. 텔로머라제-양성 세포주 SW39(ALT 음성) 및 ALT-양성 세포주 SW26(문헌[Bechter et al., 2003])을 10% 한정 보충된 우아(bovine calf) 혈청이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지-배지 199의 4:1 혼합물에서 성장시켰다. BJ hTERT를, BJ 세포(ATCC)를 인간 텔로머라제 발현 플라스미드로 레트로바이러스 감염시켜 수득하고, 10% 태아 소 혈청, 10 mM 비필수 아미노산 및 1 mM 소듐 피루베이트가 보충된 MEM + 글루타맥스에서 성장시켰다. BJ ELR(문헌[Hahn et al., 1999])을 10% 태아 소 혈청, 1% 글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트 및 25 mM HEPES가 보충된 DMEM:M199 4:1에서 성장시켰다. GBM14(ALT 양성)를 2%의 B27, 5 ㎍/ml 헤파린, 20 ng/ml의 bFGF 및 20 ng/ml의 EGF가 보충된 글루타맥스와 함께 DMEM/F12에서 성장시켰다. G-292(ATCC)를 10% 태아 소 혈청 및 1% 글루타민이 보충된 McCoy's 5A + 글루타맥스에서 성장시켰다.
형질감염: LNA를 90℃에서 5분 동안 가열하고, 얼음 내에서 5분 동안 냉각시킨 다음, 리포펙타민 RNAiMAX(Invitrogen)를 제조업체의 설명에 따라 지시된 최종 농도에서 형질감염시켰다. 모크-형질감염된 세포에는 RNAiMAX만 처리하였다.
성장 곡선: 각각의 지시된 시점에서 세포를, Coulter Counter(Beckman)를 이용하거나, 살아 있는 세포의 대사 활성의 분광광도 측정을 허용하는 레사주린-기반의 시험관내 독성학 검정법 키트(Sigma)를 제조업체의 설명에 따라 이용하여 3벌 중복으로 계수하였다.
면역형광 : 세포를 1:1 메탄올/아세톤 용액을 이용하여 실온에서 2분 동안 고정시켰다. 블라킹(blocking) 후, 세포를 안티 PML(Santa Cruz) 1차 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 염색하고, 세척한 다음, 컨쥬게이트된 안티 마우스 2차 항체와 함께 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 핵을 DAPI(1 ㎍/ml)로 염색시켰다. 공초점 절편(section)을 Leica TCS SP2 AOBS 공초점 레이저 현미경을 이용하여 광학 축을 따라 상이한 레벨(level)에서 광학 z 절편의 획득에 의해 수득하였으며, 1개 세포 당 APB의 수를 CellProfiler 소프트웨어에 의해 계수하였다.
RNA 단리: 총 세포성 RNA를 mirVana™ miRNA 단리 키트(Life Technologies)를 제조업체의 설명에 따라 사용하여 추출하였다.
스몰 RNA의 qPCR : cDNA 합성 및 RT-PCR을 miScript PCR 시스템(Qiagen)을 사용하여 수행하였다. RNA를, 5 ㎍의 전체 RNA를 폴리아크릴아미드 변성 겔 상에서 진행시킴으로써 분획화하였다. 40개 뉴클레오타이드보다 더 짧은 RNA 종을 겔 추출하고, cDNA를 HiSpec 완충제와 함께 miScript II RT 키트를 사용하여 합성하였다. 반응을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 95℃에서 5분 동안 가열-불활성화 단계를 수행하였다. cDNA를 miScript SYBR 그린 PCR 마스터 믹스, miScript 유니버셜 프라이머, mir29b 프라이머(TAGCACCATTTGAAATCAGTGTT) SEQ ID No. 7, 스파이크-인 프라이머(CGAATTCCACAAATTGTTATCC) SEQ ID No. 8을 사용하여 분석하여, 겔로부터의 RNA 추출의 효능 및 텔로미어 서열-함유 프라이머(TAGGGTTAGGGTTAGGGT, SEQ ID No. 9, CCCTAACCCTAACCCTAA SEQ ID No. 10)를 모니터링하였다.
가닥 특이적인 qPCR : mirVana™ miRNA 단리 키트로부터의 전체 RNA를 사용하였다. 시료에 DNase I(Thermo Scientific)을 처리하여, 임의의 잠재적인 잔여 게놈 DNA 오염을 제거하였다. 1000 ng의 전체 RNA를, 가닥-특이적인 프라이머와 함께 Superscript First Strand cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 역전사시켰다. 사용된 역전사용 프라이머는, 하우스키핑 Rplp0 mRNA의 검출의 경우 RPP0rev; G-풍부한-가닥 텔로머릭 전구체의 검출의 경우 teloCrev; C-풍부한-가닥 텔로머릭 전구체의 검출의 경우 teloGrev이었다.
RT-qPCR을 Roche SYBR 그린을 사용하여 수행하였다. 각각의 RT-qPCR 반응을 위해, 50 ng의 cDNA를 사용하였다. 텔로머릭 반복부를 증폭시키기 위해, 본 발명자들은 문헌[(Cawthon, 2002)]에서 기재된, 고정된 길이의 증폭 생성물의 발생을 허용하는 기술을 채택하였다. 사용된 qPCR용 프라이머는, 하우스키핑 Rplp0 mRNA의 검출의 경우 RPP0fwd 및 RPP0rev; 텔로머릭 전구체의 검출의 경우 teloF 및 teloR이었다.
하기에, 가닥-특이적인 RT-qPCR에 사용된 프라이머(5'-3' 배향)의 목록이 나타나 있다:
Figure pct00001
.
스몰 RNA의 표적화된 시퀀싱. 2개의 링커들을, 분석되는 시료 내 RNA 분자의 2개의 말단들에 연결하였다. 출발 RNA의 3' 말단을 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 T4 RNA 리가제 2 절단된 효소(NEB)에 의해, 모노아데닐화된 DNA 링커에 연결하였다. 그런 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 타바코산 피로포스페이트(Epicentre)에 의해 5' 캡 구조를 제거한 후, 5' RNA 링커를 20℃에서 1시간 동안 T4 RNA 리가제 1(NEB)에 의해 표적 RNA에 연결하였다. 링커는 PrimeScript RT-PCR 키트(Takara)를 사용한 cDNA 합성을 가능하게 하였다. 역전사 반응물을 44℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Phusion® 하이-피델리티 DNA 폴리머라제(NEB)를 사용한 후속적인 PCR 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 98℃에서 2분; 98℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 구성된 22 사이클; 72℃에서 5분; 4℃에서 유지. 증폭된 cDNA 표적을 포획하기 위해, 비오틴-표지된 뉴클레오타이드를 함유하는 상보적 RNA 베이트(bait)를 사용하였다. 이들 RNA 베이트를, AMbion MAXIscript T7 시험관내 전사 키트(Life Technologies) 및 비오틴 RNA 표지화 믹스(Roche)를 사용하여 제조하였다. T7-프로모터-함유 dsDNA를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여, 시험관내 전사를 가능하게 하였다. RNA 베이트 및 cDNA 표적을 SUPERase-저해제(Life Technologies) 및 하기 블라킹 제제들: 인간 Cot-1(Life Technologies), UltraPure™ 연어 정자 DNA 용액(Thermo Scientific) 및 200 uM 커스터마이즈드 블락(Customized Block)의 존재 하에 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 하이브리드 RNA-cDNA 분자를 Dynabeads® MyOne™ 스트렙타비딘 C1(Life Technologies)에 의해 포획한 한편, 비-표적화된 cDNA는 세척 제거하였다. 그런 다음, 포획된 cDNA를, Script Index PCR 프라이머(Illumina)를 이용한 PCR에 의해 바코드(barcode)하고, MiSeq (Illumina) 시퀀서에 의해 시퀀싱하였다. 올리고뉴클레오타이드 서열(5'-3' 배향)은 하기와 같았다:
Figure pct00002
웨스턴 블롯 : 세포를 용해 완충제 TEB150(50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 0.5% 트리톤(Triton), 10% 글리세린)에서 수집하고, 웨스턴 블롯용 시료를 제조할 때까지 액체 질소 내에서 급속 냉동하였다. 용해를 위해, 세포를 얼음 상에서 해동시키고, +4℃ 및 13200 RPM에서 15분 동안 회전시켰다. 단백질-함유 상층액을 수득하고, 세포 찌꺼기를 버렸다. 단백질을 브래드포드(Bradford) 검정법을 사용하여 정량화하였다. 트랜스퍼 후, 막을 안티-카스파제-3 항체(세포 신호전달 9661), 안티-PARP 항체(Serotec) 및 안티-튜불린 항체(Millipore)를 이용하여 프로브하였다. 라민 A/C, 프로게린 및 튜불린을 위해, 세포를 Laemmli 1x 완충제에서 수집하고, -80℃에서 보관하였다. 용해를 위해, 세포를 주사기를 통해 통과시키고, 95℃에서 5분 동안 끓였다. 단백질을 로리(Lowry) 검정법을 사용하여 정량화하였다. 트랜스퍼 후, 막을, 라민 이소폼 A 및 C를 둘 다 인지하는 안티-라민 항체(Santa Cruz Biotech sc-6215), 및 프로게린 및 안티-튜불린 항체(Millipore)를 이용하여 프로브하였다.
FACS 분석: 세포 주기 분석을 위해, 배지 상층액을 수득하고, 트립신처리된 세포와 함께 회전 침강시키고, 75% 에탄올에서 고정한 다음, 1X PBS 중 프로피디움 이오딘(PI, Sigma, 50 ㎍/ml) 및 RNase A(Sigma, 250 ㎍/ml) 용액을 이용하여 염색하였다. FACS에 의한 카스파제-3 절단 분석을 위해, 배지 상층액을 수득하고, 트립신처리된 세포와 함께 회전 침강시키고, 얼음 상에서 1% 포름아미드에서 20분 동안 고정한 다음, 75% 에탄올에 보관하고, 카스파제-3 항체(Cell Signaling 9661)를 이용하여 염색한 다음, 후속해서 형광단 FITC(안티 토끼 FITC, ImmunoJackson)에 컨쥬게이션시키고, PI/RNase A 용액을 이용하여 염색하였다. 시료를 BD Facs CantoII 상에서 FITC용 488 nm 레이저 및 530/30 필터 및 PI용 670 nm 레이저 및 585/42 필터를 사용하여 분석하였다. 획득을 소프트웨어 BDFacsDIVA v6.1.1을 이용하여 수행하고, 분석을 소프트웨어 ModfitLT3.0을 사용하여 수행하였다. 서브 G-1 및 카스파제 양성 세포에 대해, 적어도 500개의 사건을 1개 시료당 분석하였다. 세포 주기에 대해, 적어도 8000개의 사건을 1개 시료당 분석하였다.
네이키드 전달: PBS 중 올리고뉴클레오타이드를 평판배양된 세포에 직접 첨가한 한편, 모크-처리되는 세포에는 PBS만 제공하였다. 일정한 양의 PBS를 각각의 실험에서 1개 조건당 사용하였다.
레트로바이러스 감염: BJ 세포를 야생형 라민A 또는 돌연변이체 프로게린 유전자를 발현하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입하고, 퓨로마이신을 이용하여 선별하였다.
G292 이종이식물의 생체내 치료: Charles River Italy의 CD-1 수컷 누드 마우스를 스팀 오토클레이브된(멸균된) 베딩(bedding), γ-방사선 조사된 식이요법 및 산성화된 미네랄 워터를 사용하여 케이지에서 유지시켰다.
10x106개의 G-292 세포를 제0일에 수컷 누드 마우스의 좌측 옆구리 내로 피하 주사하였다. 동물들을 종양의 출현에 대해 정기적으로 검사하였다. 종양의 부피가 90 mm3 내지 220 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 치료군으로 무작위로 나누고 할당하였으며, 1개 그룹 당 7마리의 마우스를 표적으로 하였다. 치료가 시작될 때, 평균 종양 부피는 약 0.14 cm3이었다. 치료제를 PBS 및 타이니 안티 TeloC의 경우 제13일, 제17일, 제21일, 제25일에, PS 안티 TeloC의 경우 제13일 및 제17일에 15 mg/kg의 용량으로 복강내 투여하였다.
동물의 사육 및 취급을 위해 채택된 모든 절차들은 실험 동물 복지에 대한 이탈리아 및 유럽의 가이드라인에 엄격하게 부응하였다. 종양 이식 일자에 체중은 25 g 내지 38 g이었다.
Tert 돌연변이체 제브라피시의 생체내 치료: 이종성 텔로머라제 돌연변이체 제브라피시(Tert+/-, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2762901/)를 동종교배시키고, 난황으로의 1-세포 단계(one cell stage)에서 알(egg)에 0.5 ng/㎕의 PS LNA를 주사하였다. 주사를 놓은 피시를 너서리(nursery)에서 성어가 될 때까지 기른 다음, 핀 클립(fin clip)에 의해 유전자형 분석을 수행하여, 동종성 돌연변이체 피시(1세대 tert -/-)를 확인하였으며, 이들 피시를 동종교배시키고, 이들의 자손(2세대)을 생존율 및 표현형에 대해 분석하였다.
HGPS 마우스의 생체내 치료: 표피 케라티노사이트에서 프로게린을 발현하는 HGPS 마우스(문헌[McKenna et al, Aging cell 2014])에게, 배아 17.5일에 시작하여 3일 내지 4일마다 15 mg/Kg 농도의 PS LNA 올리고뉴클레오타이드를 복강내 주사하였다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 :
LNA 서열: LNA 올리고뉴클레오타이드는 Exiqon에 의해 제조되었다.
포스페이트 백본을 가진 LNA(도 4, 5, 6):
Figure pct00003
완전한 포스포로티오에이트 백본을 가진 LNA(LNA-PS)(도 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31):
(*는 포스포로티오에이트 변형을 표시함)
Figure pct00004
완전한 포스포로티오에이트 백본을 가진 타이니(8량체) LNA(도 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 24, 25, 26, 27, 28, 29):
Figure pct00005
2'-O- 메틸 올리고뉴클레오타이드 (도 30, 31): 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드는 Integrated DNA Technologies에 의해 제조되었다.
(*는 포스포로티오에이트 변형을 표시하며; m은 2' 위치 상에서의 메틸기 변형을 표시함)
Figure pct00006
Figure pct00007
통계학적 분석: 결과는 평균 ± 평균의 표준 편차 또는 표준 오차로 나타나 있다. p 값을 적합하게 스튜던츠 2-테일드 t-테스트(Student's two-tailed t-test), 카이-제곱 테스트(Chi-square test), 만 휘트니 테스트(Mann Whitney test) 또는 만텔-콕스 테스트(Mantel-Cox test)에 의해 계산하였다.
결과
본 발명자들은 손상된 텔로미어에서 발생된 DDRNA의 수준을 qPCR에 의해 측정하였다. 이를 위해 이들은, 텔로미어 결합 단백질 TRF2를 넉아웃시킴으로써 텔로미어가 탈보호될 수 있는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 사용하였다(문헌[Celli and de Lange, 2005]). 이는 사실상 모든 텔로미어에서 DDR의 활성화로 이어진다. 이는 텔로미어 기능 장애의 허용된 모델이다. DNA가 손상되는 경우, DDRNA라고 하는 스몰 RNA 분자들이 해당 특이적인 손상된 유전자좌에서 발생되고, 이들 스몰 RNA 분자는 손상된 DNA와 동일한 서열을 운반한다는 것은 이미 나타나 있으며(문헌[Francia et al., 2012]); 따라서, 본 발명자들은 2개의 상이한 세트의 DDRNA 분자들이 텔로미어 탈보호 시 발생될 수 있을 것이라고 판단하였으며, 상기의 세트들 중 하나의 세트는 G-풍부한 텔로머릭 DNA 가닥의 전사로부터 유래되고(TeloC DDRNA), 다른 하나의 세트는 C-풍부한 텔로머릭 DNA 가닥의 전사로부터 유래된다(TeloG DDRNA; 도 1). 스몰 RNA의 RT-qPCR 및 표적화된 시퀀싱에 의해, 본 발명자들은 정상 텔로미어를 가진 대조군 세포와 비교하여, 탈보호된 텔로미어를 가진 세포에서 TeloC DDRNA 및 TeloG DDRNA 둘 다의 재현 가능한 2배 내지 3배 증가를 검출할 수 있었다(도 2).
탈보호된 텔로미어를 가진 세포에서, TeloG 및 TeloC DDRNA 전구체 전사체들은 둘 다, 대조군 세포와 비교하여 강하게 유도되었으며(도 23a), 이는 텔로미어 탈보호가 텔로미어에서의 전사를 유도함을 가리킨다.
ALT-양성 세포는 텔로미어에서 강한 만성 DDR 활성화를 나타낸다(문헌[Cesare and Reddel, 2010]). 본 발명자들은 이것이 RT-qPCR에 의해 검출되는 바와 같이 ALT-양성 WI-38 VA-13에서, 이의 부모 세포주인 WI-38 인간 섬유아세포와 비교하여, 그리고 ALT-양성 SW26에서, 동일한 섬유아세포 세포주인, IMR90으로부터 불멸화되어 상이한 텔로미어 유지 메커니즘을 초래하는 세포주인 텔로머라제-양성 SW39 태아 폐 섬유아세포와 비교하여, 더 높은 수준의 tDDRNA와 상관관계가 있음을 발견하였다(문헌[Bechter et al., 2003])(도 3). 또한, TeloG 및 TeloC DDRNA 전구체 전사체들은 또한, 대조군 SW39 세포와 비교하여 SW26 ALT-양성 세포에서 강하게 상향조절되었다(도 23b).
ALT-양성 세포들은 이들의 텔로미어를 유지하기 위해 상동성 재조합 메커니즘에 의존하며(문헌[Cesare and Reddel, 2010]); 따라서, 본 발명자들은 이들 세포가 DDRNA 저해에 과민성인지의 여부를 시험하였다.
본 발명자들은 ALT 세포주, U-2 OS 인간 골육종 세포를, G 또는 C-풍부한 텔로머릭 전사체를 표적으로 하는 락트 핵산(LNA)(문헌[Veedu and Wengel, 2010]) 분자(각각 안티 TeloG 및 안티 TeloC) 또는 대조군 LNA로 형질감염시켰으며, 본 발명자들은 세포 성장을 10일 동안 모니터링하였다. 대조군 및 안티 TeloG LNA로 형질감염된 세포의 성장은 모크-처리된 세포와 상이하지 않았으며; 상이하게는, 안티 TeloC LNA는 U-2 OS 성장을 상당히 손상시켰다(도 4).
이러한 효과는, 안티 TeloC LNA가 형질전환되거나(BJ ELR) 또는 정상인(BJ hTERT) 텔로머라제-발현 인간 섬유아세포의 성장 속도에는 상당한 영향을 미치지 않았기 때문에 ALT 세포에 특이적이다(도 4).
ALT 바이오마커에 미치는 LNA 처리의 영향을 모니터링하기 위해, 본 발명자들은 ALT-연관된 PML 바디(APB), 재조합 인자를 함유하는 핵 구조물 및 ALT 세포에 특이적인 텔로머릭 DNA의 존재를 평가하였다(문헌[Henson and Reddel, 2010]). PML 단백질에 대한 간접 면역염색에 의해, 본 발명자들은 대조군 또는 안티 TeloG LNA와 비교하여, 안티 TeloC LNA로 처리된 U-2 OS 세포에서 APB의 감소를 관찰하였다(도 5).
본 발명자들의 관찰을 확장시키기 위해, 본 발명자들은 ALT-양성 세포주 U-2 OS, Saos-2 및 WI-38 VA-13을 안티 TeloG LNA 및 안티 TeloC LNA로 형질감염시켰다. 안티 TeloC LNA는 시험된 모든 3개의 세포주들에서 세포 성장을 상당히 저해하였다(도 6).
포스포로티오에이트 백본("PS")은 올리고뉴클레오타이드를 뉴클레아제 분해에 대해 더욱 내성이 되게 만들고, 특히 생체내에서 올리고뉴클레오타이드의 활성을 증강시키는 데 보편적으로 사용되는 변형이다. 본 발명자들은 포스포다이에스테르 LNA와 동일한 서열을 갖지만 완전한 포스포로티오에이트 백본을 갖는 LNA 분자(PS LNA, 재료 및 방법 참조)를 설계하였다. PS 안티 TeloC LNA는 20 nM의 농도에서 U-2 OS 세포 성장을 방지하며, 상기 농도는 포스포다이에스테르 LNA에 대해 사용되는 농도보다 10배 더 낮으며(도 7 및 도 8), 한편 PS 안티 TeloC LNA는 대조군으로서 사용되는 BJ hTERT 세포에 대해서는 더 작은 효과를 가졌다.
소위 "타이니/짧은 LNA 올리고뉴클레오타이드"들은 적어도 6nt, 바람직하게는 적어도 8nt 길이의 완전한 LNA 올리고뉴클레오타이드이며, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 이들의 상보적 RNA 표적을 특이적으로 표적화하는 것으로 나타났다(문헌[Obad et al., 2011]). 본 발명자들은 길이가 8개 뉴클레오타이드이고 텔로머릭 전사체를 표적화하는 "타이니 안티 TeloC" 및 "타이니 안티 TeloG"라고 명명되는, 포스포로티오에이트 백본을 가진 타이니/짧은 LNA 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다(도 9).
타이니 안티 TeloC 올리고뉴클레오타이드에 의해 형질감염된 U-2 OS 세포는 모크 형질감염된 세포, 또는 대조군 또는 타이니 안티 TeloG 올리고뉴클레오타이드에 의해 형질감염된 세포보다 상당히 덜 성장하였다(도 10). 이러한 효과는, 안티 TeloC LNA가 정상 인간 섬유아세포(BJ 세포)에서 세포 성장에 손상을 주지 않았기 때문에 ALT 세포에 특이적이었다(도 11). 그러나, 세포 성장에 미치는 타이니 안티 TeloC 올리고뉴클레오타이드의 효과는 동일한 몰농도로 사용된 PS 안티 TeloC LNA와 비교하여 덜 두드러졌다(도 10).
더 짧은 길이 및 그 결과 텔로머릭 반복부 RNA와 매칭하는 능력에 비례하여 3배 더 높은 양(60 nM)의 타이니 LNA 올리고를 사용함으로써, 본 발명자들은 ALT 세포 증식에 미치는 타이니 안티 TeloC LNA의 저해 효과를 20 nM 농도에서의 PS 안티 TeloC LNA와 유사하게 관찰하였다(도 12). 또한, 이러한 더 높은 농도에서, 타이니/짧은 안티 TeloC LNA의 효과는 ALT 세포에 특이적이었다(도 13).
PS LNA 및 타이니 LNA에 의한 안티 TeloC LNA-매개 성장 장애에는, 카스파제-3 절단에 의해 입증되는 세포자멸사의 유도 및 FACS 분석에 의해 나타난 바와 같이 세포 사멸을 가리키는 서브 G-1 세포의 증가가 수반되었으며, 뿐만 아니라 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 바와 같이 카스파제-3 및 PARP-1 절단이 수반되었다(도 24). 부가적으로는, 안티 TeloC LNA에 의해 형질감염된 U-2 OS 세포는 길어진 S 단계를 나타내었으며(도 25), 이는 ALT 메커니즘과 연관지어 생각되는 악화된 복제 스트레스를 가리킨다(문헌[O'Sullivan and Karlseder, 2010]).
안티 TeloC LNA의 특이성을 더 입증하기 위해, 본 발명자들은 이전에 언급된 페어드(paired) 세포주 SW26(ALT) 및 SW39(텔로머라제-양성)에 미치는 LNA 형질감염의 효과를 시험하였다. 안티 TeloC LNA는 ALT 세포의 성장을 매칭된 비-ALT 대조군보다 훨씬 더 많이 저해하였다(도 26).
세포의 형질감염이 생체내에서가 아니라 시험관내에서 달성될 수 있기 때문에, 형질감염 제제를 이용하지 않고 "네이키드" LNA를 흡수하는 세포의 능력을 시험하는 것이 중요하다. 이러한 과정을 "김노틱 전달(gymnotic delivery)"이라고 하며, 생체내에서 치료의 효과에 대한 더 양호한 예측자인 것으로 생각된다(문헌[Stein et al., 2010]). 따라서, 본 발명자들은 다수의 ALT 세포주들에서 LNA의 네이키드 전달의 효능을 확인하고자 하였다.
LNA의 네이키드 전달은 U-2 OS 세포에서 효과적이었으며, PS 안티 TeloC LNA 및 타이니 안티 TeloC LNA 둘 다, 세포 성장을 저해하였다(도 27a, b). 한편, 대조군-처리된 세포 및 안티 TeloG-처리된 세포는 상대적으로 영향을 받지 않았다.
포스포로티오에이트 백본 올리고뉴클레오타이드들의 효능이 골육종 세포주에 제한되지 않았음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 이러한 올리고뉴클레오타이드들을 또 다른 세포 유형인 ALT-양성 교아종 세포주 GBM14에서 네이키드 전달에 의해 시험하였다(문헌[Heaphy et al., 2011]). PS 안티 TeloC 및 타이니 안티 TeloC LNA만이, 비처리된 세포와 비교하여 세포 성장을 상당히 감소시켰다(도 14, 15).
또 다른 ALT-양성 세포주인 G-292는 마우스에서 이종이식물로서 성장할 수 있다(문헌[Lauvrak et al., 2013]). 본 발명자들은 우선, 이 세포주 또한, 대조군이 아니라 안티 TeloC LNA에 의해서만 영향을 받는지 확인하였다(도 28). 그런 다음, 본 발명자들은 네이키드 전달의 효능을 확인하였으며, PS 안티 TeloC 및 타이니 안티 TeloC가 성장을 저해할 수 있는 한편, 각각의 대조군인 PS 안티 TeloG, 타이니 대조군 및 타이니 안티 TeloG는 아무런 효과가 없었음을 확인하였다(도 29).
생체내에서 ALT-양성 종양의 성장에 미치는 ASO 치료의 효능을 시험하기 위해, G-292 세포를, 검출 가능한 종양 덩어리가 형성될 때까지 누드 마우스의 옆구리에 주사하였다. 종양을 가진 마우스에게 ASO를 복강내 처리하였다. PS 안티 TeloC 및 타이니 안티 TeloC는 둘 다, 비히클(PBS)-주사된 마우스와 비교하여 종양 성장을 감소시켰다(도 16). 본 발명자들은 관용되는 최대 용량 연구를 수행하지 않았으며, 따라서, 더 높은 용량이 종양 성장에 더 강한 저해 효과를 가질 수 있을 것이라는 점이 가능하다. 또한, PS 안티 TeloC 및 타이니 안티 TeloC는 종양이 1 cm3의 크기에 도달하는 데 필요한 시간을 증가시켰다(도 17).
본 발명자들은 또 다른 부류의 ASO인 포스포로티오에이트 백본을 가진 2'-O-메틸(2'-O-Me) ASO의 효능 및 특이성을 시험하였다. 2'-O-Me 안티-TeloC에 의해 형질감염된 U-2 OS만이 모크-형질감염된 세포보다 상당히 덜 성장하였으며, 한편 대조군 및 안티-TeloG ASO는 세포 성장에 영향을 미치지 않았다(도 30). 중요하게는, 동일한 농도(20 nM)로 사용되었을 때, 세포 성장에 미치는 2'-O-Me 안티-TeloC의 효과는 PS 안티 TeloC보다 더 컸다. 상이하게는, 2'-O-Me 안티-TeloC는 BJ 세포 성장에 손상을 주지 않았다. 부가적으로, 2'-O-Me ASO는 100 nM까지는 비독성이었다(도 31).
텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환
다니오 레리오 피시(제브라피시)에서 텔로머라제 기능의 유전적 불활성화는 가속화된 형태의 노화를 재현하는 텔로미어 기능 장애 및 다수의 병리학적 사건들을 유도한다(문헌[Anchelin et al., 2013; Carneiro et al., 2016]). 따라서, 이는 텔로미어 기능 장애, 특히 생리학적 노화의 신뢰할만한 구축된 척추동물 모델이다. 2세대 텔로머라제-돌연변이체 제브라피시 동물이 1세대 제브라피시와 비교하여 더 강한 표현형을 갖고 있기 때문에 연구되었다. 이 동물은 형태적 결함 및 더 짧은 수명을 특징으로 하고, 이러한 동물은 생후 수일 이내에 사망한다. PS LNA를 1세대 텔로머라제 돌연변이체 피시 유래의 1-세포 배아들에 주사하였으며, 이들을 교배시켜 2세대를 수득하였다. 안티 TeloC 또는 안티 TeloG로 처리된 개체들로부터 태어난 피시는 조기 노화와 연관된 형태적 결함의 상당한 감소를 보여주었으며(도 18), 더 오래 생존하였다(도 19).
본 발명자들은 정상 인간 섬유아세포를, 프로게린(문헌[Gonzalo et al., 2016])으로도 공지된 라민 A 유전자의 돌연변이화된 형태를 발현하는 벡터, 또는 대조군으로서 야생형 라민 A 유전자로 감염시켰다. 이러한 유전자는 HGPS 환자에서 돌연변이화되고, 이의 발현은 세포 성장의 서행 및 조기 노화로 이어져, 텔로미어 증후군, 예컨대 HGPS 환자에서 관찰된 조기 노화 표현형을 재현한다. 프로게린 발현은 텔로미어 기능 장애를 야기하는 것으로 나타났다(문헌[Chojnowski et al., 2015]). 본 발명자들은 PS LNA 형질감염 시, 이들 세포의 세포 성장을 모니터링하였다. PS 안티 TeloC 또는 PS 안티 TeloG의 존재 시 프로게린-발현 세포는 BrdU 혼입 및 증식 마커 KI67의 발현에 의해 모니터링된 바와 같이(도 20), 유사한 수준의 프로게린 발현에도 불구하고(도 21), 모크 형질감염된 세포 또는 PS 대조군 LNA로 형질감염된 세포보다 더 많이 성장하였다. 이들 결과는, tDDRNA를 표적화하는 ASO가 프로게린-유도 노화 구축을 방지할 수 있음을 제시한다.
표피 케라티노사이트에서 프로게린을 발현하는 HGPS 마우스 모델은 표피 과증식(epidermal hyperplasia), 중증 피부 비정상, 모발 약화, 뚜렷한 각막비후증(marked hyperkeratosis), 피부의 중등도 섬유증, 염증 세포에 의한 침윤을 나타내고, 이들 마우스는 생후 첫 2주 이내에 사망한다(문헌[McKenna et al., 2014]). 본 발명자들은 프로게린-발현 마우스 및 야생형 마우스를 임신한 암컷에게 PS 안티 TeloG LNA를 임신 동안 1회, 생후에는 3일마다 주사하여 치료하였다. 안티 TeloG를 이용한 치료는 비처리된 동물과 비교하여 조로증 마우스의 수명을 상당히 연장시켰다(도 22).
참조문헌
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> IFOM D'ADDA DI FAGAGNA, Fabrizio ROSSIELLO, Francesca AGUADO, Julio JONES-WEINERT, Corey <120> Therapeutic oligonucleotides <130> PCT 130108 <150> EP15178809.8 <151> 2015-07-29 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 ttaggg 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 tagggt 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 agggtt 6 <210> 4 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 gggtta 6 <210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 ggttag 6 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 gttagg 6 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 tagcaccatt tgaaatcagt gtt 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 cgaattccac aaattgttat cc 22 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 tagggttagg gttagggt 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 ccctaaccct aaccctaa 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 ttcattgtgg gagcagac 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 12 cagcagtttc tccagagc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 ccctaaccct aaccctaa 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 tagggttagg gttagggt 18 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcac 34 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 acacucuuuc ccuacacgac gcucuuccga ucu 33 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 actgataggg agtggtaaac t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 ccctaaccct aaccctaacc c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 gggttagggt tagggttagg g 21 <210> 22 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 cgtcatac 8 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 caatcccaat cccaatccca a 21 <210> 24 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 uuaggguuag gguuaggg 18 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag gg 42 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 aatcccaatc ccaatcccaa tcccaatccc aatcccaatc cc 42 <210> 27 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 27 aaucccaauc ccaauccc 18 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 28 gttagggtta gggttagggt t 21 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 29 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34 <210> 30 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 31 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc tcttccgatc 60 t 61 <210> 32 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 33 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 uuauccgcuc acaauuccac au 22

Claims (13)

  1. 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 하기 서열 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드:
    (TTAGGG) SEQ ID No. 1, (TAGGGT) SEQ ID No. 2, (AGGGTT) SEQ ID No. 3, (GGGTTA) SEQ ID No. 4, (GGTTAG) SEQ ID No. 5, 또는 (GTTAGG) SEQ ID No. 6 또는 이의 상보적 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 혼합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 단편 또는 변이체가 하기 서열들: (TTAGGG)n, (TAGGGT)n, (AGGGTT)n, (GGGTTA)n, (GGTTAG)n, 또는 (GTTAGG)n 중 하나를 포함하며, 여기서, 1 < n < 1000, 바람직하게는 1 < n < 500, 바람직하게는 1 < n < 200, 바람직하게는 1 < n < 100, 바람직하게는 1 < n < 50, 바람직하게는 1 < n < 20, 바람직하게는 1 < n < 10, 바람직하게는 1 < n < 5인, 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드가 RNA의 서열에 상보적이며,
    상기 RNA가 특이적인 고장난 텔로머릭(telomeric) DNA를 전사용 주형으로서 사용하여 합성된 RNA 전사체, 또는 상기 RNA 전사체의 단편이고,
    상기 단편(DDRNA)이 다이서(Dicer) 및/또는 드로샤(Drosha)에 의한 가공에 의해 발생되는 것인, 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병이 암 또는 엡스타인-바(Epstein-Bar) 바이러스 감염인, 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 질병이 ALT-양성 암인, 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 암이 연조직 육종, 바람직하게는, 연골 육종(chondrosarcoma), 악성 섬유 조직구종(malignant fibrous histiocytoma)을 포함하는 미분화된 다형성 육종(undifferentiaed pleomorphic sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 상피모양 육종(epithelioid sarcoma), 지방 육종(liposarcoma), 섬유 육종(fibrosarcoma) 및 변이체, 혈관 육종(angiosarcoma) 및 신경 섬유종(neurofibroma), 중추신경계 암, 바람직하게는, 그레이드 II 미만성 별아교세포종(grade 2 diffuse astrocytoma); 그레이드 3 역형성 별아교세포종(grade 3 anaplastic astrocytoma); 그레이드 4 소아 다형교아종(grade 4 paediatric glioblastoma multiforme), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 역형성 수모세포종(anaplastic medulloblastoma), 그레이드 1 털모양 별아교세포종(grade 1 pilocytic astrocytoma), 비-역형성 수모세포종(nonanaplastic medulloblastoma), 수막종(meningioma), 슈반세포종(schwannoma), 방광암, 특히 소세포 암종 및 침습성 요로상피 암종(invasive urothelial carcinoma), 부신 또는 말초신경계 암, 특히 신경절신경모세포종(ganglioneurobalstoma), 신경모세포종 및 크롬친화성 세포종(pheochromocytoma), 신경내분비 신생물(neuroendocrine neoplasm), 예컨대 부신경절종(paraganglioma) 및 유암종 종양(carcinoid tumour), 신장암, 특히 난염성 암종(chromophobe carcinoma), 육종성 암종(sarcomatoid carcinoma) 및 투명 세포(clear cell) 및 유두상(papillary) 암종, 폐 및 늑막 암, 특히 악성 중피종(mesothelioma), 대세포 암종 및 소세포 암종, 피부암, 예컨대 악성 흑색종, 간암, 예컨대 간세포 암종, 고환암, 예컨대 비정상피종성 생식세포 종양(non seminomatous germ cell tumor), 유방암, 특히 소엽암종(lobular carcinoma); 관암종(ductal carcinoma) 및 속질암종(medullary carcinoma), 자궁암, 예컨대 장액성 자궁내막 암종(serous endometrial carcinoma), 자궁경부의 편평세포 암종, 난소암, 특히 투명 세포 암종, 자궁내막 암종, 담낭암, 예컨대 선암종(adenocarcinoma), 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 대안적 텔로미어 유지 기작(alternative lengthening of telomeres, ALT)을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  7. 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환(non-cancer condition)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 하기 서열 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드:
    (TTAGGG) SEQ ID No. 1, (TAGGGT) SEQ ID No. 2, (AGGGTT) SEQ ID No. 3, (GGGTTA) SEQ ID No. 4, (GGTTAG) SEQ ID No. 5, 또는 (GTTAGG) SEQ ID No. 6 또는 이의 상보적 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 혼합물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환이 휴킨슨-길포드 조로 증후군(HGPS; Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome), 베르너 증후군(Werner's syndrome), 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 모세혈관확장성 운동실조증(ataxia telangiectasia), 가족력 IPF, 산발성 IPF, 재생불량성 빈혈, 상염색체-우성 선천성 각화이상증(autosomal-dominant dyskeratosis congenital), 가족력 MDS-AML, 드 노보 선천성 각화이상증(de novo dyskeratosis congenita), X-연관 열성 선천성 각화이상증(X-linked recessive dyskeratosis congenita), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreiderasson syndrome), 레베츠 증후군(Revesz syndrome), 상염색체-열성 선천성 각화이상증(Autosomal-recessive dyskeratosis congenita), 코트 플러스 증후군(Coats plus syndrome), TRF1, POT1, TPP1, TINF2, RAP1 또는 TRF2 중 임의의 하나의 돌연변이 또는 불활성화에 의해 유발되는 질환, 부분 간절제술 시 손상된 재생, 간 섬유증, 간 만성 염증, 간 경화증, 폐 섬유증, 변경된 골수 전구체 분화(altered myeloid progenitor differentiation), 골수부전(bone marrow failure), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알츠하이머 질병을 포함한 신경학적 장애, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심질환, 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 2형 당뇨병, 손상된 생식력, 손상된 상처 치유, 관절염, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 노화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환(non-cancer condition)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드가 락트 핵산(LNA; locked nucleic acid)-변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-O-메틸-변형된 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 락트 핵산, 2'-O-메톡시에틸 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2O-[2-(N-메틸카르바모일)에틸] 리보뉴클레오사이드, 메틸포스포네이트, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, LNA-DNA-LNA 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오타이드, 믹스머(mixmer), 키메릭 2'-O-메틸 RNA-DNA 갭머, N3'-P5' 포스포로아미데이트, 2'-플루오로-아라비노 핵산, 포스포로아미데이트 모르폴리노, 사이클로헥센 핵산, 트리사이클로-DNA, 펩타이드 핵산, 언락트(Unlocked) 핵산, 헥시톨(Hexitol) 핵산, 보라노포스페이트 올리고뉴클레오타이드, 포스포로아미데이트 올리고뉴클레오타이드이고,
    바람직하게는 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트화된 것인, 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환(non-cancer condition)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드.
  10. 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 적어도 또 다른 치료제를 추가로 포함하고,
    바람직하게는 또 다른 치료제가 항종양제, 진통제 또는 항구토제인, 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 또 다른 치료제가 ATR 저해제, DDR 저해제, HR 저해제, 텔로미어를 특이적으로 표적화하는 분자, 바람직하게는 G-콰드루플렉스(quadruplex) 상호작용 분자, 또는 텔로미어에서 DNA 손상 발생을 유발하는 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  13. RNA의 존재를 검출하고/거나 RNA의 양을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 RNA는 특이적인 고장난 텔로머릭 DNA를 전사용 주형으로서 사용하여 합성된 RNA 전사체, 또는 상기 RNA 전사체의 단편이며,
    상기 단편(DDRNA 또는 tDDRNA)은 다이서 및/또는 드로샤에 의한 가공에 의해 발생되고,
    상기 피험자는 대안적 텔로미어 유지 기작을 특징으로 하는 질병에 의해 영향을 받고 있거나 텔로미어 기능 장애와 연관된 비-암 질환에 의해 영향을 받고 있는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물로 치료되는 피험자의 확인(identify) 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
US20190127795A1 (en) * 2017-04-13 2019-05-02 Tiffany Wu Method for prognosing and reducing cardiovascular disease in patients with kidney diseases
JP7007559B2 (ja) 2017-05-31 2022-02-10 国立大学法人福井大学 白内障の予防剤および治療剤、並びに、これらを製造するための、ｄｎａ損傷に応答するシグナル伝達経路を阻害する阻害剤の使用
CN107385018A (zh) * 2017-06-22 2017-11-24 哈尔滨博泰生物科技有限公司 一种优化的rna高通量测序文库构建的方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6046307A (en) * 1996-04-09 2000-04-04 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
US20070270363A1 (en) * 1992-09-29 2007-11-22 Bennett C F Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
KR20110098405A (ko) * 2010-02-26 2011-09-01 굿젠 주식회사 Ｙ형 프로브 및 이것의 변형형, 및 이를 이용한 ｄｎａ 마이크로어레이, 키트 및 유전자 분석방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2521565B1 (fr) 1982-02-17 1985-07-05 Dior Sa Parfums Christian Melange pulverulent de constituants lipidiques et de constituants hydrophobes, procede pour le preparer, phases lamellaires lipidiques hydratees et procede de fabrication, compositions pharmaceutiques ou cosmetiques comportant des phases lamellaires lipidiques hydratees
FR2534487B1 (fr) 1982-10-15 1988-06-10 Dior Christian Parfums Procede d'homogeneisation de dispersions de phases lamellaires lipidiques hydratees, et suspensions obtenues par ce procede
US5077211A (en) 1988-07-06 1991-12-31 Applied Genetics, Inc. Purification and administration of dna repair enzymes
US6537973B1 (en) 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US5643890A (en) 1995-01-31 1997-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences for use in treatment of cancer and other diseases
US6066625A (en) 1998-02-03 2000-05-23 Methylgene, Inc. Optimized antisense oligonucleotides complementary to DNA methyltransferase sequences
EP1274410A2 (en) 2000-03-31 2003-01-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
WO2004063339A2 (en) * 2003-01-08 2004-07-29 Lesley Davenport G-quadruplex binding assays and compounds therefor
BRPI0414222B8 (pt) 2003-09-09 2021-05-25 Geron Corp compostos oligonucleotídeos modificados para inibição da telomerase, métodos, composição farmacêutica e usos relacionados
JP2006075110A (ja) 2004-09-10 2006-03-23 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規ｓ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれを有効成分とするアンチセンス剤
CN1936011B (zh) 2006-10-17 2011-12-07 浙江医药高等专科学校 聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物及制备
KR100998365B1 (ko) * 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
WO2011035375A1 (en) * 2009-09-22 2011-03-31 Children's Medical Research Institute Methods and assays for the detection of alternative lengthening of telomeres (alt) activity in cells
EP2847332B1 (en) 2012-05-10 2019-08-28 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare Rna products and uses thereof
RU2550267C2 (ru) 2012-12-12 2015-05-10 Елена Андреевна Чирясова Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070270363A1 (en) * 1992-09-29 2007-11-22 Bennett C F Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US6046307A (en) * 1996-04-09 2000-04-04 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
KR20110098405A (ko) * 2010-02-26 2011-09-01 굿젠 주식회사 Ｙ형 프로브 및 이것의 변형형, 및 이를 이용한 ｄｎａ 마이크로어레이, 키트 및 유전자 분석방법
US20130237427A1 (en) * 2010-02-26 2013-09-12 Goodgene Inc. Y-shaped probe and variant thereof, and dna microarray, kit and genetic analysis method using the same

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