CN108350456A

CN108350456A - 治疗性寡核苷酸

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Publication number: CN108350456A
Application number: CN201680056604.5A
Authority: CN
Inventors: 迪法嘎格纳 F·达达; F·罗希洛; J·阿瓜多; C·琼斯-韦纳特
Original assignee: IFOM FOND ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE
Current assignee: IFOM FOND ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2018-07-31
Also published as: EA201890379A1; US20180223279A1; WO2017017253A1; MX2018001126A; EP3124609A1; JP2018521669A; AU2016300141B2; AU2016300141A1; KR102246814B1; JP7023834B2; BR112018001782A2; EA039775B1; US20210087567A1; KR20180057608A; CA2993128A1

Abstract

本发明涉及包含以下序列之一的寡核苷酸：(TTAGGG)SEQ ID No.1，(TAGGGT)SEQ ID No.2，(AGGGTT)SEQ ID No.3，(GGGTTA)SEQ ID No.4，(GGTTAG)SEQ ID No.5或(GTTAGG)SEQ ID No.6或其互补序列或其片段或变体或混合物，用于治疗和/或预防特征在于端粒替代性延长的疾病或与端粒功能障碍有关的非癌症状况以及相关的药物组合物以及相关的药物组合物和方法。

Description

治疗性寡核苷酸

技术领域

本发明涉及包含以下序列之一的寡核苷酸：(TTAGGG)SEQ ID No.1，(TAGGGT)SEQID No.2，(AGGGTT)SEQ ID No.3，(GGGTTA)SEQ ID No.4，(GGTTAG)SEQ ID No.5或(GTTAGG)SEQ ID No.6或其互补序列或其片段或变体或混合物，用于治疗和/或预防特征在于端粒替代性延长的疾病或与端粒功能失调有关的非癌症病症以及相关的药物组合物，并涉及相关的药物组合物和方法。

背景技术

DNA是细胞中一种独特类型的分子，如果受损，它不能被替代。所谓的“DNA损伤反应”(DDR)是一组协调一致的进化保守事件，当检测到DNA损伤后触发时，它会阻止细胞周期(DNA损伤检查点功能)并协调DNA修复(Jackson和Bartek，2009)。DNA损伤是一种生理事件。衰老和癌症可能是哺乳动物中两个最好的例子，突出了DNA损伤积累，DDR激活及其后果的相关性。已经对理解DDR参与衰老和癌症作出了重大贡献(d′Adda di Fagagna，2008；Jackson和Bartek，2009)。

最近，本发明人揭示并报道了完整的DDR激活取决于RNA分子。他们观察到DNA双链断裂(DSBs)触发了在DNA损伤位点局部产生非编码RNA，其携带损伤位点周围的序列。他们还表明，这些RNA(作者称他们为DDRNA)对DDR激活至关重要。事实上，RNA酶处理去除DDRNA抑制了DDR的活化，并且通过添加化学合成的DDRNA可以完全恢复DDR，该DDRNA携带损伤位点周围的序列，但不携带其他序列(Francia等，2012)。

一些研究表明，RNA功能可以通过使用抑制性反义寡核苷酸(ASO)来抑制，ASO通过与靶RNA配对从而削弱其功能来发挥作用。它们的使用正成功达到临床阶段(Janssen等，2013；Li和Rana，2014；Monteleone等，2015；Stenvang等，2012)。癌细胞必须保持端粒长度并且抵消自然端粒磨耗以保持无限的增殖潜力。大多数癌症细胞通过重新激活端粒酶表达来实现这一点，端粒酶是一种延长短端粒的酶。然而，10-15％的所有人类肿瘤(在不限于以下的肿瘤中发生率更高：骨肉瘤，软组织肉瘤，原发性脑肿瘤，多形性成胶质细胞瘤(GBM)和成神经细胞瘤)通过所谓的端粒延长(ALT)机制基于端粒间同源重组(HR)维持端粒长度(Cesare和Reddel，2010；Durant，2012；Henson和Reddel，2010)。

虽然ALT肿瘤可能携带导致其转化和恶性状态的不同基因突变，但大多数ALT癌细胞在DAXX和ATRX基因中显示突变，从而使得通过常见遗传分析将肿瘤分类为ALT成为可能(Heaphy等，2011)。

ALT机制从未在健康/正常细胞中报道过(Cesare和Reddel，2010)。然而，除了癌症之外，在EBV感染的细胞中已经报道了ALT机制(Kamranvar等，2013)，强调了其他病毒感染可能引发这种机制的可能性。

端粒酶抑制剂在癌症治疗中的应用已被广泛研究(Ruden和Puri，2013)；然而，这种方法的固有局限性在于肿瘤中缺乏端粒酶活性可导致ALT阳性克隆的选择，如(Hu等，2012)所报道。不同的是，到目前为止，还没有报道过从ALT到端粒酶维持端粒机制的逆转。

ALT细胞在端粒处显示慢性DDR激活，表明在这些细胞中端粒的功能失调性。然后通过涉及HR途径的DDR机制延长/“修复”极短/功能失调的端粒。ALT相关的PML小体(APB)含有端粒DNA和DDR因子，是ALT细胞的已知生物标志物(Cesare和Reddel，2010；Yeager等，1999)。HR是DDR的DNA修复机制的一部分，并且它已被证明是维持ALT细胞端粒所必需的。MRN(MRE11/RAD50/NBS1)复合体是参与HR途径的关键DDR因子。事实上，通过短发夹介导的敲减或抑制性蛋白质SP100的过表达对其进行灭活决定了对ALT阳性细胞中特异性端粒维持的抑制(Jiang等，2005；Jiang等，2007；Zhong等，2007)。RNA干扰介导SMC5/6复合体的消耗，其促进HR介导的DSB修复，导致ALT细胞中缩短的端粒和细胞衰老(Potts和Yu，2007)。RPA在HR的初始阶段与单链DNA结合，并且其通过RNA干扰的下调导致ALT活性的受损(Jiang等，2007)。最近，ATR小分子抑制剂已被证明可以特异性地阻止ALT阳性细胞的细胞生长(Flynn等，2015)，尽管这种特异性似乎更广泛，包括非ALT癌细胞并且仅与CHK1抑制剂组合(Sanjiv等，2016)。一致的是，最近的另一份报告表明，与端粒维持机制相比，ATR抑制剂的细胞类型特异性与细胞汇合度更相关(http：//biorxiv.org/content/early/2016/06/04/053280)。

可以利用对ALT细胞中端粒的DDR和后续重组事件的抑制来构想用于抗癌治疗的新型潜在治疗途径。一致地，如上所述，已经提出ALT细胞对ATR激酶(Flynn等，2015)的抑制高度敏感(Flynn等，2015)，ATR激酶是一种在由HR进行DNA修复的情况下涉及DDR信号传导的蛋白质，尽管其特异性最近受到质疑(Sanjiv等，2016)和(http：//biorxiv.org/content/early/2016/06/04/053280)。

类似地，以端粒DNA损伤为特征的病症通常导致早老症表型(早衰)，预期与具有端粒序列的DDRNA的产生有关。

WO2013/167744涉及在DNA损伤位点产生的小RNA分子(DDRNA)，其具有受损基因座的特定序列。既没有描述来自显示ALT的细胞如ALT癌细胞，或EBV感染的ALT细胞或来自早衰病症的细胞中端粒的DDRNA的存在和产生，也没有描述DDRNA抑制作为治疗原理。

WO2014092609涉及使用人端粒DNA的特定G链寡核苷酸序列来影响细胞增殖状态的方法。

US2013065950公开了包含与脂质部分共价连接的寡核苷酸部分的化合物。寡核苷酸部分包含与人端粒酶的RNA组分互补的序列。这些化合物抑制细胞中的端粒酶活性。

WO97/38013没有具体提及以端粒替代性延长(ALT)为特征的疾病(特别是癌症)，以及以功能失调的端粒为特征的非癌症病症。另外，它涉及抑制端粒酶。相反，本发明的寡核苷酸对端粒酶阳性癌细胞没有活性。

WO 2006/107949涉及治疗氧化应激病症的方法。本发明涉及特征在于功能失调的端粒的非癌症病症和ALT癌细胞的特异性治疗。

CN1936011涉及由聚阳离子脂质体和反义寡核苷酸构成的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸化合物。

WO2006028160涉及硫代磷酸酯寡核苷酸偶联物，其对人白血病细胞提取物中所含的端粒酶具有高抑制活性，并且其与互补DNA产生稳定的双链体杂交体。

US2006183704涉及通过向受感染哺乳动物施用有效量的包含pTT的组合物或包含与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列相同性的一种或多种寡核苷酸的组合物来治疗过度增殖性病症(包括癌症)的方法。

WO01/74342涉及治疗或预防影响上皮细胞的过度增殖性疾病或癌前病症，例如牛皮癣，白癜风，特应性皮炎，或过度增殖或UV-反应性皮肤病，过度增殖或过敏介导的其他上皮细胞疾病的方法以及减少光至衰老，或氧化应激或用于预防或减少皮肤癌发展可能性的方法。

WO96/23508公开了一种抑制癌症和其他永生型细胞疾病状态增殖的方法。该方法包括引入模仿端粒基序的合成寡核苷酸。

Sandra Sampl等(论文集：AACR年会2014；2014年4月5-9日；摘要2743，加利福尼亚州圣迭戈(San Diego，CA))指出来自称为TERRA的端粒的RNA转录物被鉴定为潜在地通过直接结合TERC来阻断端粒酶活性(TA)。

TERRA是组成型单链非编码RNA，长度从约100个碱基至至少9千碱基(Azzalin等，2007)。它们从位于亚端粒区域的启动子开始转录，因此它们携带亚端粒和富含G的端粒序列。不同的是，DDRNA是可能形成双链RNA的短RNA(至少6或8个核苷酸长或10至50个核苷酸长，约22个核苷酸长)。它们通过处理前体转录物而产生，所述前体转录物从两个端粒链转录，从端粒末端或端粒重复序列内开始产生富含G的和富含C的含端粒重复的RNA分子。

因此，仍然需要治疗以替代性延长端粒为特征的疾病和与端粒功能失调相关的非癌症病症。

发明内容

本发明基于这样的发现：在端粒DNA损伤或功能失调时，非编码RNA(称为tDDRNA)积累。这些是使用功能失调的端粒作为用于转录长RNA前体的模板合成的RNA转录物，其然后可以通过切酶(Dicer)和/或Drosha加工成更短的非编码RNA(tDDRNA)。

在本发明中令人惊讶地发现，tDDRNA及其前体的产生和/或合成和/或功能抑制剂也抑制DDR活化，因此可用于治疗与端粒DNA损伤或功能失调相关的ALT相关病症和病症。

合成了反义寡核苷酸(ASO)，例如与tDDRNA和/或其前体互补的锁核酸(LNA)形式的反义寡核苷酸，以及具有不相关序列的LNA作为阴性对照。据观察，端粒ASO可以特异性抑制DDR激活，抑制信号传导和随后的DNA修复。

使用序列特异性ASO，获得显示ALT细胞中特异性降低的细胞增殖的结果。

ALT肿瘤中的端粒DDR激活可能被序列特异性ASO靶向，从而削弱端粒维持并减少增殖。本发明人合成了LNA ASO，其具有与端粒DNA损伤或功能失调时产生的端粒RNA互补的序列。他们观察到携带特定端粒序列的ASO寡核苷酸的转染能够强烈抑制ALT阳性细胞系(即骨肉瘤U-2 OS和G292细胞系，成胶质细胞瘤GBM14细胞系，成纤维细胞WI38VA13和SW26)的增殖，而具有不靶向端粒RNA且不靶向任何人序列的不同序列的相同量的ASO没有显著作用。重要的是，平行测试表明，这些ASO均不影响正常人类成纤维细胞(间充质来源如骨肉瘤)增殖或端粒酶阳性癌细胞的增殖，这表明这种方法对ALT肿瘤是特异性的，并且表明这种治疗在活动物和人类患者中不会有毒性。在这个阶段，他们已经：

1)鉴定了一种新的潜在治疗剂；

2)定义了可能受益于该药物治疗的特定肿瘤亚群。

此外，衰老与DDR激活有关，特别是在端粒上(d′Adda di Fagagna等，2003；Fumagalli等，2012；Herbig等，2006；Herbig等，2004；Hewitt等，2012)。哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)(Pollex和Hegele，2004)是一种由核纤层蛋白A，也称为早老蛋白的突变形式引起的早衰综合征的示例。早衰表示过早衰老。HGPS早衰表型可通过表达端粒酶，通过减少早老蛋白诱导的DNA损伤信号传导来抑制(Kudlow等，2008)。这表明HGPS细胞(并延伸至HGPS患者)的早衰表型是由造成DDR的功能失调的端粒引起的。事实上，在HGPS细胞的端粒中发现DDR(Benson等，2010；Chojnowski等，2015)。鱼类Danio rerio(斑马鱼)是一种简单的脊椎动物模型，适用于衰老研究。事实上，已经显示端粒酶突变通过加快端粒缩短和后续的端粒功能失调和DDR激活来加速生理衰老(Henriques等，2013)。特别是端粒酶突变的鱼的特点是寿命更短，组织萎缩和生育力下降。它们代表与端粒功能失调相关的非癌症病症的模型。

通过使用LNA ASO，其序列与端粒DNA损伤或功能失调时产生的tDDRNA及其前体互补，发明人阻止了表达早老蛋白的细胞中的细胞衰老。此外，他们延长了HGPS的小鼠模型和端粒酶突变的斑马鱼的寿命，表明它们可以抑制衰老相关的表型。

在本发明中，通过抑制DDRNA和/或其前体对DDR的抑制具有序列特异性的巨大优点，因此，例如通过使DDR抑制远离端粒使正常细胞中不利副作用的可能性最小化。

此外，在癌症治疗的背景下，这些抑制剂可能与端粒酶抑制剂协同作用，以防止可能出现使用ALT端粒维持机制从而对端粒酶抑制有抗性的癌细胞克隆。

事实上，现有的抗癌疗法是通过破坏癌细胞中的DNA或抑制其中的DDR发挥作用的有效抗癌治疗。然而，它们中大多数的DNA损伤活性或DDR抑制不是序列特异性的。本发明的寡核苷酸以序列特异性方式损害DDR，然后它们还可以赋予现有DNA损伤性治疗序列特异性，从而增强功效。

因此，本发明提供了包含以下序列之一的寡核苷酸：

(TTAGGG)SEQ ID No.1，(TAGGGT)SEQ ID No.2，(AGGGTT)SEQ ID No.3，(GGGTTA)SEQ ID No.4，(GGTTAG)SEQ ID No.5或(GTTAGG)SEQ ID No.6或其互补序列或其片段或变体或混合物，用于治疗和/或预防特征在于端粒替代性延长的疾病。

寡核苷酸或其片段或变体优选包含以下序列之一：(TTAGGG)_n，(TAGGGT)_n，(AGGGTT)_n，(GGGTTA)_n，(GGTTAG)_n或(GTTAGG)_n，其中1＜n＜1000，优选1＜n＜500，优选1＜n＜200，优选1＜n＜100，优选1＜n＜50，优选1＜n＜20，优选1＜n＜10，优选1＜n＜5。

优选地，所述寡核苷酸与RNA的序列互补，所述RNA是使用特定功能失调的端粒DNA作为转录模板合成的RNA转录物或所述RNA转录物的片段，所述片段(DDRNA)通过切酶(Dicer)和/或Drosha加工产生。

优选地，该疾病是癌症或爱波斯坦-巴尔(Epstein-Bar)病毒感染。更优选地，该疾病是ALT阳性癌症。

优选，癌症选自：软组织肉瘤，优选软骨肉瘤，未分化的多形性肉瘤，包括恶性纤维组织细胞瘤，平滑肌肉瘤，上皮样肉瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤和变体，血管肉瘤和神经纤维瘤，中枢神经系统癌症，优选2级弥漫性星形细胞瘤；3级间变性星形细胞瘤；4级儿科多形性成胶质细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间变性髓母细胞瘤，1级毛细胞型星形细胞瘤，非间变性髓母细胞瘤，脑膜瘤，神经鞘瘤，膀胱癌，尤其是小细胞癌症和侵袭性尿路上皮癌，肾上腺或外周神经系统癌症，尤其是多发性神经胶质瘤，神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤，神经内分泌肿瘤如副神经节瘤和类癌瘤，肾癌，尤其是嫌色细胞癌，肉瘤样癌和透明细胞和乳头状癌，肺和胸膜癌，尤其是恶性间皮瘤，大细胞癌和小细胞癌，皮肤癌如恶性黑素瘤，肝癌如肝细胞癌，睾丸癌如非精原细胞瘤性生殖细胞瘤，乳腺癌，尤其是小叶癌；导管癌和髓样癌，子宫癌如浆液性子宫内膜癌，子宫颈鳞状癌，卵巢癌，尤其是透明细胞癌，子宫内膜样癌，胆囊癌如腺癌，食管癌。

在另一方面，本发明提供了包含以下序列之一的寡核苷酸：

(TTAGGG)SEQ ID No.1，(TAGGGT)SEQ ID No.2，(AGGGTT)SEQ ID No.3，(GGGTTA)SEQ ID No.4，(GGTTAG)SEQ ID No.5或(GTTAGG)SEQ ID No.6或其互补序列或其片段或变体或混合物，用于治疗和/或预防与端粒功能失调相关的非癌症疾病。

优选地，与端粒功能失调相关的非癌症病症选自：哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)，维尔纳综合征，布鲁姆综合征，共济失调毛细血管扩张症，家族性IPF，散发性IPF，再生障碍性贫血，先天性常染色体显性角化不全，家族性MDS-AML，先天性角化不全，先天性X染色体连锁隐性角化不良，Hoyrara-Hreiderasson综合征，Revesz综合征，先天性常染色体隐性角化不全，Coats plus综合征，由TRF1、POT1、TPP1、TINF2、RAP1或TRF2中任一个的突变或失活导致的病症，部分肝切除后的再生障碍，肝纤维化，肝脏慢性炎症，肝硬化，肺纤维化，骨髓祖细胞分化改变，骨髓衰竭，慢性阻塞性肺病(COPD)，神经病症包括阿尔茨海默病，骨质疏松症，动脉粥样硬化，心脏病，杜兴氏肌营养不良症，2型糖尿病，生育力受损，伤口愈合受损，关节炎，白内障，年龄相关性黄斑变性，衰老。

优选地，寡核苷酸是锁核酸(LNA)修饰的寡核苷酸或2′-O-甲基修饰的寡核苷酸。

LNA通常被认为是RNA模拟物，其中核糖部分通过氧亚甲基桥连接C(2’)-和C(4’)-原子而被锁定，其在构象上将LNA单体限制为N型糖折叠(Veedu R等，2010)。LNA是含有至少一个带有LNA修饰的核苷酸的分子。优选地，LNA含有至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，至少15个，至少20个带有LNA修饰的核苷酸。

2′-O-甲基修饰的寡核苷酸是含有至少一个带有2′-O-甲基修饰的核苷酸的分子。优选地，2′-O-甲基修饰的寡核苷酸含有，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，至少15个，至少20个带有2′-O-甲基修饰的核苷酸。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种如上定义的寡核苷酸和药学上可接受的运载体，用于治疗和/或预防以端粒的替代性延长为特征的疾病或用于治疗和/或预防与端粒功能失调相关的非癌症病症。

优选地，药物组合物还包含至少另一种治疗剂，优选该其它治疗剂选自：抗肿瘤剂、镇痛剂、镇吐剂(例如阿瑞吡坦、福沙吡坦、格拉司琼、昂丹司琼、帕洛诺司琼、托烷司琼，或雷莫司琼、地塞米松)。

优选地，其它治疗剂选自：ATR抑制剂、DDR抑制剂、HR抑制剂、特异性地靶向端粒的分子，优选G-四联体相互作用分子、特异性地在端粒处造成DNA损伤生成的分子。

在另一方面，本发明提供鉴定待用上文定义的寡核苷酸或用上文定义的药物组合物治疗的对象的方法，其包括检测RNA的存在和/或测量RNA的量，所述RNA是使用特异性功能失调的端粒DNA作为转录模板合成的RNA转录物或所述RNA转录物的片段，所述片段(DDRNA)通过由切酶(Dicer)和/或Drosha处理而产生，其中所述对象受到以端粒的替代性延长为特征的疾病的影响或受到与端粒功能失调相关的非癌症病症的影响。

在本发明中，DDRNA是非编码RNA。它们是使用特异性受损和/或功能失调的端粒DNA作为转录长RNA前体的模板而合成的RNA转录物，该前体然后可由切酶和/或Drosha加工成更短的非编码RNA(DDRNA或tDDRNA)。

DDRNA起源于基因座并携带受损基因座的序列。当通过切酶和/或DROSHA切割跨越该基因座的转录物而在体外化学合成或生成时，即使在没有其他哺乳动物RNA的情况下，DDRNA也在RNA酶A处理的细胞中的DNA损伤位点处促进DDR活化。

由于如下所示(Francia等，2012)，DDRNA与微RNA和典型的RNAi机制的作用不同：

●DDRNA在不需要任何其他细胞RNA的情况下起作用(参见在RNA酶A处理的细胞实验中用凝胶提取的RNA和合成RNA获得的结果)。

●DDRNA可以具有没有内源性细胞转录物匹配的序列(LAC或TET重复序列)，并仍然是生物活性的。

●在室温下，DDRNA可以在抑制转录和翻译的细胞中快速(数分钟)起作用(参见在RNA酶A处理的细胞实验中获得的结果)。

●GW蛋白(典型miRNA的效应物)的失活不影响DDR病灶。

DDRNA是小RNA，具有形成双链对的潜力，它们通过切酶和/或DROSHA加工由损伤的DNA基因座的转录所合成的序列特异性RNA转录物而产生。DDRNA是长度在10到50个核苷酸的小RNA。例如，17至32个核苷酸的长度。例如，20至25个核苷酸的长度。例如，21至23个核苷酸的长度。

所述DDRNA通过有利于DDR因子在DNA损伤的特定位点的序列特异性积累起作用并促进DDR活化(即，包括但不限于DNA损伤信号传导，诸如通过蛋白质磷酸化事件和DNA损伤修复，如同源重组)。

DDRNA前体是比DDRNA更长的RNA分子(至少25个碱基长，优选至少30个碱基长，优选至少50个碱基长，优选至少100个碱基长，优选至少150个碱基长，优选至少200个碱基长，优选至少250个碱基长，优选至少300个碱基长)，其在DNA受损后使用受损的DNA作为模板转录。它们由DROSHA和/或切酶加工以产生DDRNA。端粒DDRNA前体是多重端粒DDRNA。

在本发明中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的片段是具有与所述序列相同治疗活性的功能性片段。该片段对应于本发明的寡核苷酸，其在5′末端，3′末端或5′末端和3′末端被截短一个或多个核苷酸，只要保留未截短的寡核苷酸的至少两个连续核苷酸即可。优选地，截短的寡核苷酸具有在未截断的寡核苷酸中发现的2，3，4或5个连续核苷酸。

本发明还包括含有重复1次或更多次的上述序列(SEQ ID No.1至6)的寡核苷酸，例如，包含以下序列之一的寡核苷酸：(TTAGGG)_n，(TAGGGT)_n，(AGGGTT)_n，(GGGTTA)_n，(GGTTAG)_n或(GTTAGG)_n，其中1＜n＜1000，优选1＜n＜500，优选1＜n＜200，优选1＜n＜100，优选1＜n＜50，优选1＜n＜20，优选1＜n＜10，优选1＜n＜5。

寡核苷酸也可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸等的长度。它们不一定是6个核苷酸的倍数。

在本发明中，SEQ ID No.1-6的变体是其中1、2、3、4或5个核苷酸被不同的核苷酸取代的寡核苷酸。该变体与SEQ ID No.1-6具有至少50％的相同性，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％的相同性。该变体具有与寡核苷酸相同的治疗活性。

优选的端粒六核苷酸变体包括：TCAGGG，TTCGGG，GTAGGG，TGAGGG，TTGGGG，TAAGGG，ATAGGG，CTAGGG，TTTGGG，TTAAGGG及其互补序列((Lee等，2014)的图5)。

本发明的寡核苷酸，其片段或其变体与DDRNA和/或其前体的序列互补，从而抑制DDRNA和/或其前体功能。

寡核苷酸优选是LNA分子或2′-O-甲基修饰的寡核苷酸。

这些寡核苷酸包括但不限于锁核酸(LNA)，硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸，硫代磷酸酯修饰的锁核酸，2′-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸，2′O-甲基修饰的寡核苷酸，2O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]核糖核苷，甲基膦酸酯，吗啉代寡核苷酸，LNA-DNA-LNA gapmer寡核苷酸，mixmer，嵌合2′-O-甲基RNA-DNA gapmer，N3′-P5′亚磷酰胺，2′-氟-阿拉伯糖核酸，吗啉代氨基磷酸酯，环己烯核酸，三环DNA，肽核酸，解锁核酸，己糖醇核酸，硼烷磷酸酯寡核苷酸，磷酰胺酸酯寡核苷酸，优选地所述修饰的寡核苷酸是硫代磷酸酯化的，和/或由质粒编码的基因表达的寡核苷酸，通过不同手段(包括但不限于质粒转染，病毒感染)。

在本发明中，以端粒替代性延长为特征的疾病是特征在于存在这样的细胞的疾病，该细胞尽管缺乏端粒酶活性和/或显示出下面列出的一个或多个特征，但仍维持端粒。

特别地，端粒的替代性延长可以通过以下特征中的至少一个来鉴定/测量：

-缺乏端粒酶活性(例如，通过酶测定法测量)

-如通过端粒限制片段和Southern印迹分析，或基于原位杂交的其他手段所测量，与端粒酶阳性细胞相比，存在更长和更异质的端粒。

-如通过免疫荧光所检测，存在与ALT相关的PML小体(APB)，它是PML蛋白的灶点，与端粒染色质共定位。

-如通过免疫荧光或其他手段所检测，共定位于端粒的DDR标记物(如H2AX，RPA，HR蛋白)的存在。

-ATRX和/或DAXX基因中突变的存在或其改变的表达或功能(Heaphy等，2011)。

-存在c-环，其是单链富c染色体外的端粒DNA。

-存在t-环，其是染色体外的双链端粒DNA。

-端粒姐妹染色单体交换，端粒间重组的标志物。

-在MS32微卫星基因座处增加的串联重复不稳定性。

这些特征可以通过本领域已知的方法测量/鉴定，例如(Henson和Reddel，2010)(通过引用包括在本文中)中所报道的。

在本发明中，与端粒功能失调相关的非癌症病症是特征在于端粒与DDR器件的组件衔接的疾病或病症或综合征。在本发明中，“端粒功能失调”或“功能失调的端粒”是具有受损端粒DNA和/或极短端粒DNA和/或未封端端粒DNA和/或脱保护端粒DNA和/或加速端粒损失的端粒和/或DDR信号在端粒处有活性的任何情况的端粒。

端粒功能失调在多种退行性疾病中具有因果作用。其表现包括常见疾病状态，如哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)，维尔纳综合征，布鲁姆综合征，共济失调毛细血管扩张症，家族性IPF，散发性IPF，再生障碍性贫血，先天性常染色体显性角化不全，家族性MDS-AML，先天性角化不全，先天性X染色体连锁隐性角化不良，Hoyrara-Hreiderasson综合征，Revesz综合征，先天性常染色体隐性角化不全，Coats plus综合征，由TRF1、POT1、TPP1、TINF2、RAP1或TRF2中任一个的突变或失活导致的病症，部分肝切除后的再生障碍，肝纤维化，肝脏慢性炎症，肝硬化，肺纤维化，骨髓祖细胞分化改变，骨髓衰竭，慢性阻塞性肺病(COPD)，神经病症包括阿尔茨海默病，骨质疏松症，动脉粥样硬化，心脏病，杜兴氏肌营养不良症，2型糖尿病，生育力受损，伤口愈合受损，关节炎，白内障，年龄相关性黄斑变性，衰老。例如，加速的端粒损失，即端粒功能失调，已被认为是导致细胞周转率高的慢性疾病如肝硬化的末期器官衰竭的因素(Rudolph等，2000)。

尽管这些疾病似乎在临床上多种多样，但总体而言，它们包括一系列以短或受损和更广泛的功能失调的端粒为特征的综合征，并且端粒功能失调也是衰老和与年龄相关的疾病的关键特征(参见(Armanios和Blackburn，2012；Gray等，2015；Opresko和Shay，2016；Wang等，2015；Xi等，2013；Satyanarayana等，2003；Rudolph等，2000))。

其他端粒功能失调可能由以下的突变或失活导致，特别是TRF1(官方名称TERF1，gene ID 7013)，POT1(gene ID 25913)，TPP1(官方名称ACD，gene ID 65057)，TINF2(geneID 26277)，RAP1(官方名称TERF2IP，gene ID 54386)或TRF2(官方名称TERF2，gene ID7014)。

此外，TRF2KO模型引起端粒功能失调，并重现与端粒功能失调相关的非癌症病症。

端粒功能失调可通过以下特征或方法中的至少一种来鉴定/测量：间接免疫荧光，免疫组织化学，染色质免疫沉淀，tDDRNA检测。

更具体地，本发明涉及多核苷酸，寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸或二核苷酸二聚体或类似化合物，用于抑制细胞增殖或抑制DNA修复的用途。如本文所用，抑制细胞增殖包括完全消除细胞分裂，部分抑制细胞分裂和暂时抑制细胞分裂，细胞死亡，细胞凋亡，坏死，细胞衰老，细胞分化，有丝分裂风暴，如通过本领域标准测试所测量并如实施例中所述。本发明还涉及预防和/或治疗以ALT为特征的疾病，该疾病包括但不限于癌症和癌前病症，其中该疾病影响任何器官和任何胚胎来源的细胞。可以通过本发明的方法治疗在治疗后再生长或复发的转移性ALT肿瘤和癌症，以及原发性肿瘤。

在一个实施方式中，本发明的组合物包含约2-200个碱基长度的寡核苷酸，其可以在适当的载剂中给予哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方式中，寡核苷酸的长度是约5至约100个核苷酸。在另一个实施方式中，寡核苷酸的长度是约5至约50个核苷酸。在另一个实施方式中，DNA寡核苷酸的长度是约8至30个核苷酸。优选它们长度为8-21个核苷酸，仍然优选长度为8-16个核苷酸。

合理预期将本发明的寡核苷酸给予生物体以使得寡核苷酸接触和/或进入感兴趣的细胞或组织的任何合适的方法是有效的。使用常规优化方案可以优化效果。

本发明的寡核苷酸，脱氧核苷酸可以从任何合适的来源获得，或者可以合成产生。

DNA片段，寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸或二核苷酸二聚体可以施用于皮肤，并且可以单独施用，或与生理学上可接受的运载体(包括溶剂，香料或着色剂，稳定剂，防晒剂或其他成分，用于医疗或美容用途)结合施用。它们可以在载剂，例如水，盐水或其他合适的递送载剂中给予。递送载剂可以是递送寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，或二核苷酸二聚体的任何合适的载剂。在一个实施方式中，寡核苷酸的浓度范围可以为0.1nM至500μM，优选体外范围为0.2nM至300μM，优选体外范围为0.5nM至200μM。优选的体内范围是0.1-500mg/kg，优选体内范围是1-50mg/kg。

为了允许组合物的活性成分进入更深的皮肤细胞，可使用提高了穿透皮肤外层，例如，角质层的穿透性的载剂。用于此目的的载剂成分包括但不限于，乙醇，异丙醇，二甘醇醚如二甘醇单乙醚，氮酮(1-十二烷基氮杂环庚-2-酮)，油酸，亚油酸，丙二醇，高渗浓度甘油，乳酸，乙醇酸，柠檬酸和苹果酸。在一个实施方式中，丙二醇用作递送载剂。在一个优选的实施方式中，使用含有3％苄基磺酸和5％油醇的丙二醇∶乙醇∶肉豆蔻酸异丙酯(1∶2.7∶1)的混合物。

在另一个实施方式中，可以使用脂质体制剂。脂质体制剂可以包含穿透感兴趣的细胞或角质层并与细胞膜融合的脂质体，导致脂质体内容物递送到细胞中。例如，可以使用脂质体如Yarosh的美国专利号5,077,211，Redziniak等的美国专利号4,621,023，或Redziniak等的美国专利号4,508,703中所述的那些。旨在靶向皮肤病症的本发明的组合物可以在哺乳动物皮肤暴露于UV或引起氧化损伤的试剂之前，期间或之后给予。其他合适的制剂可以使用泡囊。泡囊是与脂质体相似的脂质囊泡，其膜主要由非离子脂质组成，其中一些形式可有效地将化合物运输通过角质层。

主要用于皮肤的其他合适的递送方法包括使用水凝胶制剂，除了寡核苷酸之外还包含水性或含水醇介质和胶凝剂。合适的胶凝剂包括甲基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，卡波姆(carbopol)，水灵胶(hypan)，聚丙烯酸酯和聚丙烯酸甘油酯。

在一个实施方式中，将寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，二核苷酸二聚体或包含一种或多种前述物质的组合物局部施用于皮肤表面。在其他实施方式中，将寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，二核苷酸二聚体或包含一种或多种前述物质的组合物递送至身体的其他细胞或组织如上皮细胞。可以通过以下方法治疗这样的组织细胞，其中这些物质进入该细胞的屏障比进入皮肤的屏障更小：例如，口服至口腔；通过气溶胶喷洒到呼吸道上皮细胞上；通过灌注膀胱上皮细胞；通过灌注或栓入肠(上皮)或通过其他局部或表面施用手段施用于体内的其他细胞或组织，包括滴眼剂，滴鼻剂和使用血管成形术的应用。此外，本发明的寡核苷酸可以静脉内给药或皮内，皮下，肌肉内或腹膜内直接注射到感兴趣组织中。此外，为了治疗血细胞，本发明的化合物可以静脉内给药或在细胞的体外循环过程中给药，例如通过光电泳装置给药。如本文所证明的，所需要的只是使感兴趣的细胞与本发明的寡核苷酸组合物接触。

将寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，二核苷酸二聚体，促进分化的试剂或包含一种或多种前述物质的组合物以适当的方式给予(引入或接触)感兴趣的细胞。

如本文所用的“感兴趣的细胞”是可能受到以ALT为特征的疾病或由功能异常的端粒影响或可能逐渐受其影响的那些细胞。

在适当的时间以有效量施用寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，二核苷酸二聚体，促进分化的试剂或包含一种或多种前述物质的组合物。根据使用的寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，二核苷酸二聚体，或采用的其他试剂的类型和分子量，要治疗或预防的病症，寻求的结果和个体患者，所述“合适的时间”将会变化。

如本文所用的“有效量”是足以实现可测量的期望结果的量或浓度。根据使用的寡核苷酸，脱氧核苷酸，二核苷酸，二核苷酸二聚体，或采用的试剂的类型和分子量，要治疗或预防的病症，寻求的结果和个体患者，所述有效量将会变化。例如，为了治疗或预防ALT过度增殖性疾病，癌症或癌前病症，有效量是实现下述效果所必需的量：减少或减轻疾病的任何一种症状，减少受疾病影响的细胞的体积、面积或数量，防止受影响区域的形成，或降低受过度增殖性疾病影响的细胞的生长速率。

如本文所证明的，本发明的抑制剂在体外和体内以未修饰的形式下有活性，所述形式例如，通过磷酸二酯键连接的未修饰的寡核苷酸的序列。如本文所用，术语“寡核苷酸”，“二核苷酸”等是指具有核糖和/或脱氧核糖作为糖并且具有天然存在的磷酸二酯键(“磷酸酯骨架”)的分子，除非指明不同的键或主链。

寡核苷酸是相对较短的多核苷酸。多核苷酸是核苷酸单体的线性聚合物，其中核苷酸通过一个核苷酸的3′位置和相邻核苷酸的5′位置之间的磷酸二酯键连接。除非另外指出，如本文所述的本发明的“寡核苷酸”具有磷酸二酯主链。

为了增强通过皮肤的递送，本发明的寡核苷酸可以被修饰以掩蔽或减少其负电荷或以其他方式改变它们的化学特性。这可以通过，例如，使用本领域公知的容易获得的试剂和方法制备寡核苷酸的铵盐来完成。优选的寡核苷酸铵盐包括三甲基-，三乙基-，三丁基-，四甲基-，四乙基-，和四丁基-铵盐。铵和其他带正电的基团可以使用可酶促降解的连接共价键合到寡核苷酸上以促进其运输穿过角质层，在抵达表皮活层的细胞内时所述可酶促降解的连接释放寡核苷酸。

用于减少或掩蔽寡核苷酸的负电荷的另一种方法包括使用本领域公知的方法和试剂将聚氧乙烯间隔物添加至寡核苷酸的5′磷酸基团和/或寡核苷酸的内部磷酸酯。实际上，这向磷酸酯添加了6或12碳修饰剂(接头)，使净负电荷减少+1，并使寡核苷酸的亲水性更低。

通过向聚氧乙烯接头的末端添加亚磷酰胺来进一步减少负电荷，从而提供额外的中和正电荷。

本发明的寡核苷酸的磷酸二酯主链也可以经修饰或合成以减少负电荷。一种优选的方法涉及使用甲基膦酸(或手性甲基膦酸酯)，其中磷酸酯中带负电的氧原子之一被甲基取代。这些寡核苷酸类似于具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸，其包含硫酸酯而不是甲基并且也在本发明的范围内。

本发明的寡核苷酸还可以采取肽核酸(PNA)的形式，其中核苷酸的碱基通过肽主链彼此连接。

寡核苷酸的其他修饰，例如在美国专利号6,537,973和6,506,735以及(Stenvang等，2012)中(对于其中描述的寡核苷酸修饰，所有这些文献全部引入本文作为参考)和其他所述的那些对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

寡核苷酸还可以是“嵌合”寡核苷酸，其被合成以具有两种或更多种化学上不同的主链连接的组合，其中一种是磷酸二酯。在一个实施方式中，嵌合寡核苷酸在3′末端具有一个或多个磷酸二酯键。在一个实施方式中，嵌合寡核苷酸在5′末端具有一个或多个磷酸二酯键。在另一个实施方式中，嵌合寡核苷酸在3′和5′末端具有一个或多个磷酸二酯键。

一种或多种寡核苷酸用于治疗和/或预防以端粒替代性延长为特征的疾病，例如癌症或爱波斯坦-巴尔病毒感染，特别是软组织肉瘤，优选软骨肉瘤，未分化的多形性肉瘤包括恶性纤维组织细胞瘤，平滑肌肉瘤，上皮样肉瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤和变体，血管肉瘤和神经纤维瘤，中枢神经系统癌症，优选2级弥漫性星形细胞瘤；3级间变性星形细胞瘤；4级儿科多形性成胶质细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间变性髓母细胞瘤，1级毛细胞型星形细胞瘤，非间变性髓母细胞瘤，脑膜瘤，神经鞘瘤，膀胱癌，尤其是小细胞癌症和侵袭性尿路上皮癌，肾上腺或外周神经系统癌症，尤其是多发性神经胶质瘤，神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤，神经内分泌肿瘤如副神经节瘤和类癌瘤，肾癌，尤其是嫌色细胞癌，肉瘤样癌和透明细胞和乳头状癌，肺和胸膜癌，尤其是恶性间皮瘤，大细胞癌和小细胞癌，皮肤癌如恶性黑素瘤，肝癌如肝细胞癌，睾丸癌如非精原细胞瘤性生殖细胞瘤，乳腺癌，尤其是小叶癌；导管癌和髓样癌，子宫癌如浆液性子宫内膜癌，子宫颈鳞状癌，卵巢癌，尤其是透明细胞癌，子宫内膜样癌，胆囊癌如腺癌，食管癌，或用于治疗和/或预防端粒功能失调相关的非癌症病症，特别是哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)，维尔纳综合征，布鲁姆综合征，共济失调毛细血管扩张症，家族性IPF，散发性IPF，再生障碍性贫血，先天性常染色体显性角化不全，家族性MDS-AML，先天性角化不全，先天性X染色体连锁隐性角化不良，Hoyrara-Hreiderasson综合征，Revesz综合征，先天性常染色体隐性角化不全，Coats plus综合征，由TRF1、POT1、TPP1、TINF2、RAP1或TRF2中任一个的突变或失活导致的病症，部分肝切除后的再生障碍，肝纤维化，肝脏慢性炎症，肝硬化，肺纤维化，骨髓祖细胞分化改变，骨髓衰竭，慢性阻塞性肺病(COPD)，神经病症包括阿尔茨海默病，骨质疏松症，动脉粥样硬化，心脏病，杜兴氏肌营养不良症，2型糖尿病，生育力受损，伤口愈合受损，关节炎，白内障，年龄相关性黄斑变性，衰老。

例如(Durant，2012)(在此通过引用包含)中描述了这类疾病。

寡核苷酸可与药学或生理学上可接受的运载体组合用于组合物中。这种组合物还可以含有稀释剂，填充剂，盐，缓冲剂，稳定剂，增溶剂，和本领域公知的其它物质。阳离子脂质例如DOTAP[N-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵盐可以与寡核苷酸一起使用以增强稳定性。寡核苷酸可以与PLGA/PLA共聚物，壳多糖或富马酸/癸二酸共聚物络合以提高生物利用度(其中PLGA是[聚(丙交酯-共-乙交酯)]；PLA是聚(L-丙交酯)}。术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”指不干扰活性成分的生物学活性效果的无毒物质。运载体的特点将取决于给药途径。

待用作用于ALT疾病的抗增殖试剂的组合物可进一步包含其它试剂，该其它试剂增强所述寡核苷酸的活性或补足其活性或治疗中的应用，例如化疗性或放射性试剂。此类其它因素和/或试剂可包括在所述组合物中，以与一种或多种寡核苷酸产生协同作用，或使副作用最小化。此外，本发明组合物的给予可与其它治疗同时给予，例如，与化疗或辐照治疗方案联合给予。本文所述的寡核苷酸可与用于治疗疾病的其它组合物和方法联合使用。例如，肿瘤可常规地采用手术、辐照、化疗或免疫治疗，与寡核苷酸治疗组合，进行治疗，然后可后续向所述患者给予寡核苷酸，以延长微小转移的静息状态并且稳定并抑制任何残留的原发性肿瘤的生长。寡核苷酸可以与端粒酶抑制剂组合使用，以防止端粒酶阴性、ALT阳性克隆的扩增。

优选地，所述其它治疗剂选自：ATR抑制剂、DDR抑制剂、HR抑制剂、特异性地靶向端粒处的DNA损伤生成和/或特异性地造成端粒处的DNA损伤生成的分子，优选G-四联体相互作用分子。

本发明中，ATR抑制剂是能够抑制ATR的激酶活性的小分子化合物，包括但不限于，VE-821(福泰制药(Vertex Pharmaceuticals))、VE-822(福泰制药(VertexPharmaceuticals))、AZ20(阿斯利康(AstraZeneca))、AZD6738(阿斯利康(AstraZeneca))(描述于Flynn等，2015；Weber和Ryan，2015)(全部文献通过引用纳入本文)。

DDR抑制剂是能够破坏或抑制称为DNA损伤应答(DDR)的细胞过程的任何化合物或实验方式，包括但不限于：咖啡因、渥曼青霉素、KU-55933、KU-60019、KU-559403、五味子乙素、NU6027、NVP-BEZ235(描述于Begg等，2011；Kelley等，2014；Weber和Ryan，2015，全部文献通过引用纳入本文)。

HR抑制剂是能够破坏或抑制称为通过同源重组(HR)的DNA修复的细胞过程的任何化合物或实验方式，包括但不限于：依尼帕尼(SAR240550，BSI-201；赛诺菲安万特(Sanofi-Aventis))、奥拉帕尼(AZD2281，KU-0069436；阿斯利康(AstraZeneca))、尼拉帕尼(Tesaro)、瑞卡帕布(CO-338，AG-014699，PF-O1367338；辉瑞(Pfizer))、维利帕尼(ABT-888；雅培(Abbott))、AZD2461(阿斯利康(AstraZeneca))、BMN673(马林制药(BioMarinPharmaceutical))、CEP-9722(瑟法隆(Cephalon))、E7016(亿赛(Esai))、INO-1001(Inotek制药)、MK-4827(默克(Merck))、甲氧胺(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、RI-1、IBR2、B02、哈里醌(描述于Feng等，2015；Kelley等，2014；Ward等，2015，全部文献通过引用纳入本文)。

特异性地靶向和/或造成端粒处的DNA损伤的分子是特异性地或优先地与端粒相互作用，诱导端粒DNA中的DNA损伤和/或活化或抑制DDR信号转导和/或DNA修复的任何化合物或实验方式，包括但不限于：G-四联体-结合配体(例如BRACO-19、端粒抑素、RHPS4、夸弗罗素(Quarfloxin)、TMPyP4、AS1410)、拓扑异构酶抑制剂、顺铂、羟基脲(描述于Lu等，2013；Muller和Rodriguez，2014；Neidle，2010；Salvati等，2015；Sissi和Palumbo，2014，全部文献通过引用纳入本文)。

可与寡核苷酸组合使用的其它分子是：Abitrexate(甲氨蝶呤注射液)，Abraxane(紫杉醇注射液)，Adcetris(布妥昔单抗注射液)，Adriamycin(阿霉素)，Adrucil注射液(5-FU(氟尿嘧啶))，Afinitor(依维莫司)，Afinitor Disperz(依维莫司)，Alimta(培美曲塞)，Alkeran注射液(美法仑注射液)，Alkeran片剂(美法仑)，Aredia(帕米膦酸盐)，Arimidex(阿那曲唑)，Aromasin(依西美坦)，Arranon(奈拉滨)，Arzerra(奥法木单抗注射液)，Avastin(贝伐单抗)，Bexxar(托西莫单抗)，BiCNU(卡莫司汀)，Blenoxane(博来霉素)，Bosulif(博舒替尼)，Busulfex注射液(白消安注射液)，Campath(阿来组单抗)，Camptosar(伊立替康)，Caprelsa(凡德他尼)，Casodex(比卡鲁胺)，CeeNU(洛莫司汀)，CeeNU剂量包装(洛莫司汀)，Cerubidine(柔红霉素)，Clolar(氯法拉滨注射液)，Cometriq(卡博替尼)，Cosmegen(放线菌素D)，CytosarU(阿糖胞苷)，Cytoxan(癌得星)，Cytoxan注射液(环磷酰胺注射液)，Dacogen(地西他滨)，DaunoXome(柔红霉素液体复合注射液)，Decadron(地塞米松)，DepoCyt(阿糖胞苷液体复合注射液)，Dexamethasone Intensol(地塞米松)，DexpakTaperpak(地塞米松)，Docefrez(多西他赛)，Doxil(多柔比星液体复合注射液)，Droxia(羟基脲)，DTIC(达卡巴嗪)，Eligard(亮丙瑞林)，Ellence(表阿霉素(表柔比星))，Eloxatin(Eloxatin(奥沙利铂))，Elspar(天冬酰胺酶)，Emcyt(雌二醇)，Erbitux(西妥昔单抗)，Erivedge(维莫德吉)，Erwinaze(菊欧文氏菌天冬酰胺酶)，Ethyol(氨磷汀)，Etopophos(依托泊甙注射液)，Eulexin(氟他胺)，Fareston(托瑞米芬)，Faslodex(氟维司群)，Femara(来曲唑)，Firmagon(地加瑞克注射液)，Fludara(氟达拉滨)，Folex(甲氨蝶呤注射液)，Folotyn(普拉曲沙注射液)，FUDR(FUDR(氟尿苷))，Gemzar(吉西他滨)，Gilotrif(阿法替尼)，Gleevec(甲磺酸伊马替尼)，Gliadel Wafer(卡莫司汀晶片)，Halaven艾力布林注射液)，Herceptin(曲妥珠单抗)，Hexalen(六甲蜜胺)，Hycamtin(拓扑替康)，Hycamtin(拓扑替康)，Hydrea(羟基脲)，Iclusig(普纳替尼)，Idamycin PFS(伊达比星)，Ifex(异环磷酰胺)，Inlyta(Axitinib)，Intron A alfab(干扰素α-2a)，Iressa(吉非替尼)，Istodax(罗米地辛注射液)，Ixempra(伊沙匹隆注射液)，Jakafi(鲁索替尼)，Jevtana(卡巴他赛注射液)，Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗)，Kyprolis(卡非佐米)，Leukeran(苯丁酸氮芥)，Leukine(沙格司亭)，Leustatin(克拉屈滨)，Lupron(亮丙瑞林)，Lupron Depot(亮丙瑞林)，LupronDepotPED(亮丙瑞林)，Lysodren(米托坦)，Marqibo Kit(长春新碱脂质复合注射液)，Matulane(丙卡巴肼)，Megace(甲地孕酮)，Mekinist(曲美替尼)，Mesnex(美司钠)，Mesnex(美司钠注射液)，Metastron(锶-89氯化物)，Mexate(甲氨蝶呤注射液)，Mustargen(氮芥)，Mutamycin(丝裂霉素)，Myleran(白消安)，Mylotarg(吉姆单抗奥佐米星)，Navelbine(长春瑞滨)，Neosar注射液(环磷酰胺注射液)，Neulasta(非格司亭)，Neulasta(聚乙二醇非格司亭)，Neupogen(非格司亭)，Nexavar(索拉非尼)，Nilandron(Nilandron(尼鲁丹酰胺))，Nipent(喷他他汀)，Nolvadex(他莫昔芬)，Novantrone(米托蒽醌)，Oncaspar(培门冬酶)，Oncovin(长春新碱)，Ontak(地尼白介素)，Onxol(紫杉醇注射液)，Panretin(阿利维A酸)，Paraplatin(卡铂)，Perjeta(帕妥珠单抗注射液)，Platinol(顺铂)，Platinol(顺铂注射液)，PlatinolAQ(顺铂)，PlatinolAQ(顺铂注射液)，Pomalyst(泊马度胺)，PrednisoneIntensol(泼尼松)，Proleukin(阿地白介素)，Purinethol(巯嘌呤)，Reclast(唑来膦酸)，Revlimid(来那度胺)，Rheumatrex(甲氨蝶呤)，Rituxan(利妥昔单抗)，RoferonA alfaa(干扰素α-2a)，Rubex(阿霉素)，Sandostatin(奥曲肽)，Sandostatin LAR库(奥曲肽)，Soltamox(他莫昔芬)，Sprycel(达沙替尼)，Sterapred(泼尼松)，Sterapred DS(泼尼松)，Stivarga(瑞格拉非尼)，Supprelin LA(组氨瑞林植入物)，Sutent(舒尼替尼)，Sylatron(聚乙二醇化干扰素α-2注射液(Sylatron))，Synribo(高三尖杉酯碱注射液)，Tabloid(硫鸟嘌呤)，Taflinar(达拉菲尼)，Tarceva(埃罗替尼)，Targretin胶囊(贝沙罗汀)，Tasigna(氨烯咪胺)，Taxol(紫杉醇注射液)，Taxotere(多西他赛)，Temodar(替莫唑胺)，Temodar(替莫唑胺注射液)，Tepadina(噻替哌)，Thalomid(沙利度胺)，TheraCys BCG(BCG)，Thioplex(噻替哌)，TICE BCG(BCG)，Toposar(依托泊苷注射液)，Torisel(坦西莫司)，Treanda(苯达莫司汀盐酸盐)，Tretastar(曲普瑞林注射液)，Trexall(氨甲蝶呤)，Trisenox(三氧化二砷)，Tykerb(拉帕替尼)，Valstar(膀胱内戊柔比星)，Vantas(组氨瑞林植入物)，Vectibix(帕尼单抗)，Velban(长春花碱)，Velcade(硼替佐米)，Vepesid(依托泊苷)，Vepesid(依托泊苷注射液)，Vesanoid(维A酸)，Vidaza(阿扎胞苷)，Vincasar PFS(长春新碱)，Vincrex(长春新碱)，Votrient(帕佐替尼)，Vumon(替尼泊苷)，Wellcovorin IV(亚叶酸钙注射液)，Xalkori(克罗替尼)，Xeloda(卡培他滨)，Xtandi(恩扎鲁胺)，Yervoy(伊匹单抗注射液)，Zaltrap(阿柏西普注射液)，Zanosar(链脲菌素)，Zelboraf(威罗非尼)，Zevalin(替伊莫单抗)，Zoladex(戈舍瑞林)，Zolinza(伏立诺他)，Zometa(唑来膦酸)，Zortress(依维莫司)，Zytiga(阿比特龙)，尼妥珠单抗和免疫检查点抑制剂例如尼莫单抗，多替珠单抗/MK-3475，彭美罗珠单抗和靶向PD-1的AMP-224；和靶向PD-L1的BMS-935559，MEDI4736，MPDL3280A和MSB0010718C以及靶向CTLA-4的那些如易普利姆单抗。

放疗表示利用辐照，通常是X射线，来治疗疾病。X射线发现于1895年，自那时起，辐照就被用于诊断和研究(X射线)和治疗(放疗)的医学。放疗可以外部放疗的形式来自身体外部，采用X射线、钴辐照、电子和更多罕见的其它颗粒例如质子。其还可以作为内部放疗的形式来自身体内部，其采用放射性金属或液体(同位素)以治疗癌症。

其它方面还包括将本文所述的寡核苷酸与其它抗癌疗法组合，以产生协同或加和益处。

现有的抗癌疗法是通过破坏癌细胞中的DNA或抑制DDR发挥作用的有效抗癌治疗。然而，其中大多数的DNA损伤活性不是序列特异性的。本发明的寡核苷酸以序列特异性方式损害DDR，然后它们可以赋予现有DNA损伤性治疗序列特异性，从而增强功效。

采用所述组合的治疗方案可预见，所述寡核苷酸伴随上文所述的任何“伴侣”治疗剂，在所述治疗剂之前和/或之后给予。

组合疗法可被用于疾病晚期阶段，但在辅助和新辅助疗法的设计中也可能具有前景。

在本发明中，“功能失调的端粒DNA”是受损的端粒DNA和/或极短的端粒DNA和/或未封端的端粒DNA和/或去保护的端粒DNA和/或DDR信号在端粒上有活性的任何情况。

本发明的组合物可以是脂质体的形式，其中本发明的寡核苷酸除了其他药学上可接受的运载体之外还与两性试剂例如以聚集形式如胶粒，不溶单层，液晶或水溶液中的层状层存在的脂质。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油单酯，甘油二酯，硫苷脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂苷，胆汁酸等。可以制备含有寡核苷酸的药物组合物用于抗增殖治疗。这种药物组合物的给予可以以本领域普通技术人员已知的多种常规方式进行，例如口服，吸入，例如气雾剂，局部或经肠施用，或颅内，脑室内，大脑内，阴道内，子宫内，口服，直肠或肠胃外(例如，静脉内，脊柱内，皮下或肌肉内)途径，或皮肤，皮下，腹膜内，肠胃外或静脉内注射。给药途径可以根据肿瘤部位，待靶向的生长或病灶来确定。为了将包含有效量的一种或多种寡核苷酸的组合物递送到生长或肿瘤部位，可以采用直接注射到该部位。或者，对于可接近的粘膜位点，可以使用通过将寡核苷酸涂覆在微米直径的珠上或通过口内喷射注射装置的弹道递送。用于在基因疗法中递送DNA的病毒载体多年来一直是研究的对象。逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，痘苗病毒和植物特异性病毒可用作包装和递送寡核苷酸的系统以治疗癌症或其他生长。已经开发了腺相关病毒载体，其不能复制，但保留感染细胞的能力。一个优点是免疫原性低，允许重复给药。递送系统已综述于，例如(Page和Cudmore，2001)。使用寡核苷酸根据其抑制靶核酸功能的理论进行的研究(反义寡核苷酸)，大多数用硫代磷酸寡核苷酸进行的这些研究已经发现有效的递送至靶细胞的方法。临床试验中的反义寡核苷酸已经在无特殊递送载剂的盐水溶液中给予(综述于(Hogrefe，1999))。适用于胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得制剂与指定接受者的流体等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包含助悬剂和增稠剂。可存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和药瓶，也可通过冻干条件保存这些制剂，临用前只需要加入无菌液体运载体(如注射用水)即可使用。临时用的注射溶液和混悬液可以由前文描述的无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。除了本发明的寡核苷酸之外，用于静脉内，皮肤或皮下注射的优选药物组合物应该含有等渗载剂如氯化钠注射液，林格氏注射液，右旋糖注射液，右旋糖和氯化钠注射液，乳酸林格氏液注射液或本领域已知的其他载剂。本发明的药物组合物也可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其他添加剂。

定时释放或持续释放递送系统的使用也包括在本发明中。在难以或不可能进行手术的情况下，这种系统是非常理想的，例如，由于年龄或疾病过程本身虚弱的患者，或者风险-收益分析指示控制超过治愈的情况。一种方法是使用可植入泵在一段时间内递送测量剂量的制剂，例如在肿瘤部位。缓释基质可以用作递送包含寡核苷酸的药物组合物的方法，特别是用于局部治疗生长或肿瘤。它是由可通过酶促或酸/碱水解或溶解而降解的材料(通常为聚合物)制成的基质。一旦插入体内，基质就受到酶和体液的作用。缓释基质理想地选自生物相容性材料如脂质体，聚丙交酯(聚乳酸)，聚乙交酯(乙醇酸聚合物)，聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸共聚物)聚酐，聚(原酸)酯，多蛋白，透明质酸，胶原，硫酸软骨素，羧酸，脂肪酸，磷脂，多糖，核酸，多胺酸，氨基酸如苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，多核苷酸，聚乙烯丙烯，聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。优选的生物可降解基质是聚交酯，聚乙交酯或聚交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一的基质。本发明的药物组合物中本发明的寡核苷酸的量将取决于所治疗病症的性质和严重程度以及患者已经进行的在先治疗的性质。对于人类患者，主治医师将决定用于治疗每个个体患者的本发明寡核苷酸的剂量。最初，主治医师可以给予低剂量并观察患者的反应。可以给予较大的剂量，直到获得对患者最佳的治疗效果，并且在该点，剂量不会进一步增加。使用本发明的药物组合物的治疗持续时间将根据所治疗的疾病的严重程度以及每个个体患者的病症和潜在的特异性反应而变化。

本发明还提供了包含至少一种如上定义的寡核苷酸或包含其的药物组合物的试剂盒。该试剂盒可包含书面说明。寡核苷酸可以在单独的容器中。

在本发明中，用上文定义的寡核苷酸或用上文定义的药物组合物鉴定待治疗对象的方法可以进一步包括将测量的DDRNA或tDDRNA的量与对照量进行比较。对照量可以是在健康对象中测量的量，对照量可以是在不受ALT-疾病影响或不受与端粒功能失调相关的非癌症病症影响的对象中测量的量，对照量可以是在治疗干预之前或之后在相同对象中测量的量。

通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。

图1。端粒处产生的DDRNA和LNA寡核苷酸分子的示意图。TeloG和TeloC DDRNA由功能失调的端粒产生，是DDR激活所必需的。反义寡核苷酸(抗TeloG和抗TeloC)可以结合并抑制DDRNA功能，从而具有治疗活性。所示的序列是本发明的非限制性示例。所报道的序列是可能的ASO序列的一个示例。

图2。端粒脱帽时端粒DDRNA上调。通过RT-qPCR分析所选尺寸(短于40个核苷酸)的RNA种类。使用MicroRNA mir29b作为标准品(n＝4次独立实验)。TRF2+/-和TRF2-/-指具有TRF2杂合或纯合缺失的细胞；TeloG和TeloC是具有端粒链序列的DDRNA，如图1所述。

图3。端粒DDRNA在ALT细胞系中上调。通过RT-qPCR分析所选尺寸(短于40个核苷酸)的RNA以检测DDRNA水平。将WI-38VA-13ALT细胞系与其亲本非ALT(或ALT阴性)细胞系WI-38进行比较(n＝3次独立实验)；将端粒酶阳性(非ALT或ALT阴性)细胞系SW39与ALT阳性细胞系SW26进行比较(n＝2次独立实验)。使用人工渗入RNA寡核苷酸作为标准品。TeloG和TeloC是具有端粒链序列的DDRNA，如图1所述。

图4。具有端粒序列的LNA寡核苷酸在U-2 OS细胞中特异性地减少细胞生长。在第0，3和7天用200nM的指定LNA(空白，对照物，抗TeloG或抗TeloC)转染U-2 OS(ALT或ALT阳性)，BJ ELR(非ALT或ALT阴性)和BJ hTERT(非ALT或ALT阴性)。图显示基于第0天标准化的相对细胞数(n＝3次独立实验；*＝p值＜0.05，**＝p值＜0.01)。

图5。具有端粒序列的LNA寡核苷酸减少了U-2 OS中ALT相关的PML小体(APB)的数量。用指定LNA以200nM的最终浓度转染U-2 OS细胞，并在转染后第3天对APB进行染色(n＝3次独立实验；**＝p值＜0.001)。

图6。具有端粒序列的AN LNA寡核苷酸降低不同ALT细胞系中的细胞生长。在第0，3和7天用最终浓度为200nM的指定LNA转染U-2 OS，Saos-2和WI-38VA-13细胞。图显示第10天的相对细胞数，基于第0天标准化。

图7。具有端粒序列的硫代磷酸酯主链LNA寡核苷酸(PSLNA)在抑制细胞生长和保留对ALT细胞的特异性方面更有效10倍。在第0，3和7天用指定浓度的指定PS LNA转染U-2OS和BJ hTERT细胞。图显示第10天的相对细胞数，基于第0天标准化。

图8。具有端粒序列的硫代磷酸酯主链LNA寡核苷酸(PSLNA)在特异性抑制U-2 OS细胞的细胞生长方面有效。在第0，3和7天用20nM浓度的指定PS LNA转染U-2OS和BJ hTERT细胞。图显示第10天的相对细胞数，基于第0天标准化。

图9。端粒处产生的DDRNA和微小LNA寡核苷酸分子的示意图。微小LNA分子可以结合并抑制TeloG和TeloC DDRNA，从而具有治疗活性。所示的序列是本发明的非限制性示例。

图10。微小抗TeloC LNA寡核苷酸有效抑制U-2 OS细胞中的细胞生长。在第0，3和7天用20nM终浓度的指定硫代磷酸酯LNA转染U-2 OS细胞。图显示通过刃天青方法(参见材料和方法)测量的相对细胞生长，基于第0天标准化(n＝3次独立实验；***＝p值＜0.001)。

图11。微小抗TeloC LNA寡核苷酸在特异性抑制U-2 OS细胞的细胞生长中有效。在第0，3和7天用20nM浓度的指定LNA转染U-2 OS和BJ细胞。图显示通过刃天青方法测量的相对细胞生长，基于第0天标准化。

图12。当以高3倍的浓度使用时，微小抗TeloC LNA寡核苷酸在抑制U-2 OS细胞的细胞生长中显示出与PS抗TeloC LNA寡核苷酸类似的功效。在第0天用所示的硫代磷酸酯LNA以20nM(PS抗TeloC)或60nM(微小对照，微小抗TeloG，微小抗TeloC)的浓度转染U-2 OS细胞。图显示在第6天通过刃天青方法测量的第6天相对细胞生长，基于第0天标准化。

图13。在高3倍浓度下，微小抗TeloC LNA寡核苷酸对U-2 OS细胞具有特异性。在第0天用所示的硫代磷酸酯LNA以60nM(微小对照，微小抗TeloG，微小抗TeloC)或20nM(PS抗TeloC)的浓度转染U-2 OS和BJ细胞。图显示通过刃天青方法测量的相对细胞生长，基于第0天标准化。

图14。GBM14细胞对裸露递送的PS抗TeloC LNA寡核苷酸以浓度依赖性方式敏感。将GBM14与10或40μM的指定PS LNA在细胞培养基中温育。图显示通过刃天青方法测量的相对细胞生长，基于第0天标准化。

图15。GBM14细胞对裸露递送的微小抗TeloC LNA寡核苷酸敏感。将GBM14与120μM的指定的微小LNA在细胞培养基中温育。图显示通过刃天青方法测量的相对细胞生长，基于第0天标准化。

图16。用PS抗TeloC和微小抗TeloC处理后，体内G292肿瘤生长减少。腹膜内注射指定寡核苷酸或PBS作为对照处理携带G292肿瘤的小鼠。(每组n＝7只小鼠；**＝p值＜0.01)。

图17。当用PS抗TeloC处理时，G292肿瘤较慢地达到1cm³的大小。(每组n＝7只小鼠；**＝p值＜0.01；***＝p值＜0.001)。

图18。用PS抗TeloC或抗TeloG处理的第二代端粒酶突变体斑马鱼显示严重程度较低的表型。用PS LNA注射端粒酶突变体斑马鱼并杂交获得第二代。图显示第二代鱼中显示与端粒酶突变相关的形态学缺陷的不同严重程度的百分比(每个样品分析至少200条鱼)。

图19。用PS抗TeloC或抗TeloG处理的第二代端粒酶突变体斑马鱼存活时间更长。图显示第二代端粒酶突变体斑马鱼的存活率(每个样品分析至少200条鱼)。

图20。PS抗TeloG和抗TeloC阻止表达早老蛋白的细胞中的细胞生长。用指定PSLNA(20nM)转染表达核纤层蛋白A或早老蛋白的逆转录病毒感染的BJ细胞。细胞固定并在8小时BrdU脉冲后进行免疫荧光染色。使用针对BrdU和KI67的抗体进行定量。

图21。在PS LNA处理的样品中，早老蛋白表达水平相似。探测表达核纤层蛋白A或早老蛋白的逆转录病毒感染的BJ细胞的核纤层蛋白(其检测同种型A和C)，早老蛋白，和纽蛋白表达作为上样对照。

图22。PS抗TeloG增加皮肤中早老蛋白表达的小鼠模型的存活率。图显示与未处理的小鼠(n代表每组分析的小鼠数)相比，用PS抗TeloG LNA寡核苷酸处理的HGPS(表达早老蛋白)和野生型小鼠的存活率。

图23。端粒前体转录物的检测。(a)从指定基因型的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)中分离总细胞RNA并用于链特异性RT-qPCR以检测端粒前体转录物。(b)使用与(a)中相同的RT-qPCR来检测来自人成纤维细胞的端粒前体转录物。对于右图，从SW39(非ALT)和SW26(ALT)分离总细胞RNA。

图24。抗TeloC处理后ALT细胞中细胞凋亡途径的激活。用指定LNA处理U-2 OS细胞。PS LNA以20nM转染，而微小LNA以60nM转染。在第0天，第3天和第7天转染细胞。在指定天数收获样品用于蛋白质检测细胞凋亡标志物胱冬酶3和Parp-1裂解，或用于FACS分析(亚G1(Sub G1)级分和胱冬酶3裂解)。

图25。抗TeloC LNA诱导ALT细胞中的S期延长。在第0，3和7天用指定LNA，20nM的PSLNA和60nM的微小LNA转染U-2 OS细胞。在第2，6和9天收获细胞用于细胞周期的FACS分析。

图26。抗TeloC LNA是一种ALT特异性抑制剂。在第0，3和7天用指定LNA，20nM的PSLNA和60nM的微小LNA转染细胞系。图显示通过刃天青值测量的相对细胞数，标准化至第0天。

图27。LNA的裸露递送足以抑制U-2 OS细胞生长。(A)在第0天用指定浓度的LNA处理U-2 OS细胞。图显示在第7天通过刃天青值测量的相对细胞数，标准化至第0天。(B)将U-2OS细胞如(A)中那样处理，而在第6天测量细胞数。

图28。G-292的生长受到抗TeloC LNA的抑制。在第0天和第3天用200nM的指定LNA转染G-292。图显示通过刃天青值测量的相对细胞数，标准化至第0天。

图29。LNA的裸露递送足以抑制G-292细胞生长。在第0天用指定浓度的LNA处理G-292细胞。图显示在第7天通过刃天青值测量的相对细胞数，标准化至第0天。

图30。2′-O-甲基(2′-O-Me)ASO抗TeloC ASO在U-2 OS细胞中特异性抑制细胞生长中有效。在第0天用20nM浓度的指定2′-O-Me ASO或PS抗TeloC转染U-2 OS和BJ细胞。图显示通过刃天青值测量的相对细胞数，标准化至第0天。

图31。2′-O-Me ASO在至多100nM下无毒。在指定浓度下，在第0天用指定ASO转染U-2 OS细胞。图显示通过刃天青值测量的相对细胞数，标准化至第0天。

发明详述

材料和方法

培养的细胞：MEF CRE-ER TRF2^fl/fl和MEF CRE-ER TRF2^fl/+(Celli和de Lange，2005)在补充有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的DMEM中培养；对于CRE激活和TRF2敲除诱导，用600nM的4羟基他莫昔芬处理细胞24小时，并在24小时后分析。U-2 OS细胞(ATCC)在补充有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的DMEM中生长。Saos-2细胞(ATCC)在补充有15％胎牛血清的McCoy′s 5A+Glutamax中生长。WI-38和WI-38VA-13(ATCC)在补充有10％胎牛血清，10mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的MEM+Glutamax中生长。将端粒酶阳性细胞系SW39(ALT阴性)和ALT阳性细胞系SW26(Bechter等，2003)在补充有10％确定的补充小牛血清的达氏改良伊氏培养基199的4∶1混合物中生长。通过用人端粒酶表达质粒对BJ细胞(ATCC)进行逆转录病毒感染获得BJ hTERT，并使其在补充有10％胎牛血清，10mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的MEM+Glutamax中生长。BJ ELR(Hahn等，1999)在补充有10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和25mM HEPES的DMEM∶M1994∶1中生长。GBM14(ALT阳性)在补充有2％B27，5μg/ml肝素，20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的GlutaMAX的DMEM/F12中生长。G-292(ATCC)在补充有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的McCoy′s 5A+Glutamax中生长。

转染：将LNA在90℃煮沸5分钟，并在用Lipofectamine RNAiMAX(英杰公司(Invitrogen))转染之前，根据制造商的说明在指定的终浓度下在冰中冷冻5分钟。空白转染的细胞仅用RNAiMAX处理。

生长曲线：在每个指定的时间点，用以下一式三份对细胞进行计数：CoulterCounter(贝克曼公司(Beckman))或体外毒理学测定试剂盒，基于刃天青(西格玛公司(Sigma))，其允许分光光度测定活细胞的代谢活性，按照制造商的说明。

免疫荧光：细胞在室温下用1∶1甲醇/丙酮溶液固定2分钟。封闭后，细胞在室温下用抗PML(圣克鲁兹公司(Santa Cruz))一抗染色1小时，洗涤并与偶联的抗小鼠二抗在室温下温育40分钟。用DAPI对核进行染色(1μg/ml)。使用Leica TCS SP2AOBS共焦激光显微镜通过沿光轴在不同水平采集光学z切片获得共聚焦切片，并通过CellProfiler软件对每个细胞的APB数量进行计数。

RNA分离：根据制造商的说明，使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))提取总细胞RNA。

小RNA的qPCR：使用miScript PCR系统(凯杰公司(Qiagen))进行cDNA合成和RT-PCR。通过在聚丙烯酰胺变性凝胶上运行5μg总RNA来分离RNA。凝胶提取短于40个核苷酸的RNA种类，并使用具有HiSpec缓冲液的miScript II RT试剂盒合成cDNA。将反应在37℃孵育60分钟，随后是95℃下5分钟热灭活步骤。使用miScript SYBR Green PCR主混合物，miScript通用引物，mir29b引物(TAGCACCATTTGAAATCAGTGTT)SEQ ID No.7，渗入引物(CGAATTCCACAAATTGTTATCC)SEQ ID No.8分析cDNA以监测从凝胶和含端粒序列引物(TAGGGTTAGGGTTAGGGT，SEQ ID No.9，CCCTAACCCTAACCCTAA SEQ ID No.10)提取RNA的效率。

链特异性qPCR：使用来自mirVana^TM miRNA分离试剂盒的总RNA。用DNA酶I(热科学公司(Thermo Scientific))处理样品以去除任何可能的残余基因组DNA污染。使用具有链特异性引物的Superscript第一链cDNA合成试剂盒(英杰公司)对1000ng总RNA进行逆转录。所使用的反转录引物：用于检测管家Rplp0 mRNA的RPP0rev；用于检测富G链的端粒前体的teloCrev；用于检测含C链的端粒前体的teloGrev。

使用Roche SYBR green进行RT-qPCR。对于每个RT-qPCR反应，使用50ng的cDNA。为了扩增端粒重复序列，发明人改造了(Cawthon，2002)中描述的技术，其允许产生固定长度的扩增产物。使用的qPCR引物：用于检测管家Rplp0mRNA的RPP0fwd和RPP0rev；用于检测端粒前体的teloF和teloR。

以下，用于链特异性RT-qPCR的引物列表(5′-3′方向)：

RPP0fwd：TTCATTGTGGGAGCAGAC(SEQ ID No.11)

RPP0rev：CAGCAGTTTCTCCAGAGC(SEQ ID No.12)

teloCrev：CCCTAACCCTAACCCTAA(SEQ ID No.13)

teloGrev：TAGGGTTAGGGTTAGGGT(SEQ ID No.14)

teloF：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGG TTTGGGTT(SEQ ID No.15)

teloR：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCC TTACCCTTACCCT(SEQ ID No.16)

针对小RNA的定向测序。将两个接头连接到待分析的样品中的RNA分子的两个末端。通过在25℃孵育1小时的T4RNA连接酶2截短酶(NEB)将起始RNA的3′末端连接至单腺苷酸化DNA接头。在37℃下温育1小时由烟草酸焦磷酸酶(Epicentre)除去5′帽子结构后，在20℃下通过T4RNA连接酶1(NEB)将5′RNA接头与靶RNA连接1小时。使用PrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara)使接头启动cDNA合成。逆转录反应在44℃孵育1小时。如下进行使用高保真DNA聚合酶(NEB)的后续PCR扩增：98℃2分钟；22个循环：98℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃5分钟；保持在4℃下。为了捕获扩增的cDNA靶标，使用含有生物素标记的核苷酸的互补RNA诱饵。这些RNA诱饵通过使用AMbion MAXIscript T7体外转录试剂盒(生命技术公司)和生物素RNA标记混合物(罗氏公司)生产。将含T7启动子的dsDNA在37℃下孵育1小时以允许体外转录。在SUPER酶抑制剂(生命技术公司)和以下阻断剂存在下，将RNA诱饵和cDNA靶标于37℃孵育48小时：人Cot-1(生命技术公司)，UltraPure^TM鲑鱼精子DNA溶液(热科学公司)和200uM定制嵌段。通过MyOne^TM链霉亲和素C1(生命技术公司)珠捕获杂交的RNA-cDNA分子，同时洗去非靶向的cDNA。然后用Script Script PCR引物(亿明达公司(Illumina))通过PCR对捕获的cDNA进行条形码化，并用MiSeq(亿明达公司)测序仪进行测序。寡核苷酸序列(5′-3′方向)是：

3’DNA接头AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-胺(SEQ ID No.17)

5’RNA接头ACACUCUUUCCCUACACGACGCUCUUCCGAUCU(SEQ ID No.18)

RT引物GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.29)

PCR Fw

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNo.30)

PCR Rv

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNo.31)

嵌段Fw

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNo.32)

嵌段Rv

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQID No.33)

Western印迹：在裂解缓冲液TEB150(50mM Hepes，150mM NaCl，2mM MgCl2，5mMEGTA，0.5％曲通，10％甘油)中收集细胞，并在液氮中快速冷冻直至样品制备用于Western印迹。为了裂解，将细胞在冰上解冻，在+4℃和13200RPM下旋转15分钟。保存含蛋白质的上清液，并且弃去细胞碎片。使用Bradford测定法定量蛋白质。转移后，用抗胱冬梅-3抗体(细胞信号公司(Cell Signaling)9661)，抗PARP抗体(赛罗泰克公司(Serotec))和抗微管蛋白抗体(密理博公司(Millipore))探测膜。对于核纤层蛋白A/C，早老蛋白和微管蛋白，将细胞收集在Laemmli 1×缓冲液中并储存在-80℃。为了裂解，将细胞通过注射器并在95℃下煮沸5分钟。使用Lowry测定法定量蛋白质。转移后，用抗核纤层蛋白抗体(圣克鲁兹生物技术公司sc-6215)探测膜，识别核纤层蛋白同种型A和C以及早老蛋白和抗微管蛋白抗体(密理博公司)。

FACS分析：为了进行细胞周期分析，保存培养基上清液并用胰蛋白酶消化的细胞离心沉淀，固定在75％乙醇中并用碘化丙啶(PI，西格玛公司，50μg/ml)和RNA酶A(西格玛公司，250μg/ml)在1X PBS中的溶液染色。对于通过FACS进行的胱冬酶-3切割分析，将培养基上清液保存并用胰蛋白酶消化细胞离心沉淀，在冰上1％甲酰胺中固定20分钟，储存在75％乙醇中，用胱冬酶-3抗体(细胞信号公司9661)和随后偶联至荧光团FITC(抗兔FITC，ImmunoJackson)染色，并用PI/RNA酶A溶液染色。在BD Facs CantoII上分析样品，对于FITC使用488nm激光和530/30过滤器，对于PI使用670nm激光和585/42过滤器。采用软件BDFacsDIVA v6.1.1进行采集，并使用软件ModfitLT3.0进行分析。对于亚G-1和胱冬酶阳性细胞，每个样品分析至少500个事件。对于细胞周期，每个样品分析至少8000个事件。

裸递送：将PBS中的寡核苷酸直接加入平板培养的细胞，而空白处理的细胞仅给予PBS。在每个实验中每个条件使用恒定量的PBS。

逆转录病毒感染：用表达野生型核纤层蛋白A或突变型早老蛋白基因并用嘌呤霉素选择的逆转录病毒载体转导BJ细胞。

G292异种移植物的体内治疗：将来自查尔斯河意大利公司(Charles RiverItaly)的CD-1裸雄性小鼠保持在使用蒸汽高压灭菌(无菌)的垫草，γ辐射的饮食和酸化矿泉水的笼中。

在第0天将10×10⁶个G-292细胞皮下注射到裸雄性小鼠的左胁腹。定期检查动物的肿瘤外观。当肿瘤达到90-220mm³体积时，将小鼠随机分配到处理组中，目标每组7只小鼠。当治疗开始时，平均肿瘤体积约为0.14cm³。在第13，17，21，25天对于PBS和微小抗TeloC，在第13和17天对于PS抗TeloC，以15mg/kg的剂量腹膜内给予治疗。

所有用于动物饲养和处理的程序都严格遵守意大利和欧洲实验动物福利准则。肿瘤植入当天的体重：25-38g。

Tert突变体斑马鱼的体内处理：杂交杂合端粒酶突变体斑马鱼(Tert+/-，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2762901/)，并将在单细胞阶段将0.5ng/μl的PSLNA注入在卵黄中。注射的鱼在苗圃中长到成年，然后通过鳍片夹进行基因分型，以鉴定纯合突变鱼(第1代tert-/-)，其经内交并分析它们的后代(第2代)的存活率和表型。

HGPS小鼠的体内治疗：表皮角质形成细胞中表达早老蛋白的HGPS小鼠(McKenna等，Aging cell 2014)每隔3-4天腹腔内注射15mg/Kg浓度的PS LNA寡核苷酸，在胚胎第17.5天开始。

反义寡核苷酸：

LNA序列：由Exiqon产生LNA寡核苷酸。

具有磷酸酯主链的LNA(图4，5，6)：

对照ACTGATAGGGAGTGGTAAACT(SEQ ID No.19)

反TeloG CCCTAACCCTAACCCTAACCC (SEQ ID No.20)

反TeloC GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(SEQ ID No.21)

具有完全硫代磷酸酯主链的LNA(LNA-PS)(图7，8，10，11，12，13，14，16，17，18，19，20，21，22，24，25，26，27，28，29，30，31)：

(*表示硫代磷酸酯修饰)

PS对照 A*C*T*G*A*T*A*G*G*G*A*G*T*G*G*T*A*A*A*C*T(SEQ ID No.19)

PS抗TeloG C*C*C*T*A*A*C*C*C*T*A*A*C*C*C*T*A*A*C*C*C(SEQ ID No.20)

PS抗TeloC

G*G*G*T*T*A*G*G*G*T*T*A*G*G*G*T*T*A*G*G*G(SEQ ID No.21)

具有完全硫代磷酸酯主链的微小(8-聚体)LNA(图10，11，12，13，15，16，17，24，25，26，27，28，29)：

微小对照 C*G*T*C*A*T*A*C(SEQ ID No.22)

微小抗TeloG C*C*C*T*A*A*C*C(SEQ ID No.20的nt 1至8)

微小抗TeloC G*G*G*T*T*A*G*G(SEQ ID No.21的nt 1至8)

2’O-甲基寡核苷酸(图30，31)：2′-O-甲基寡核苷酸由集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)生产。

(*表示硫代磷酸酯修饰；m表示2′位置上的甲基修饰)

2’-O-Me对照：

mU*mU*mA*mU*mC*mC*mG*mC*mU*mC*mA*mC*mA*mA*mU*mU*mC*mC*mA*mC*mA*mU(SEQID No.34)

2’-O-Me抗TeloG：

mC*mC*mC*mT*mA*mA*mC*mC*mC*mT*mA*mA*mC*mC*mC*mT*mA*mA*mC*mC*mC(SEQ IDNo.20)

2’-O-Me抗TeloC：

mG*mG*mG*mT*mT*mA*mG*mG*mG*mT*mT*mA*mG*mG*mG*mT*mT*mA*mG*mG*mG(SEQ IDNo.21)

统计学分析：结果显示为平均值加上或减去标准偏差或平均值的标准误差。根据情况，通过斯氏双尾t检验，卡方检验，曼-惠特尼检验或MC检验计算P值。

结论

本发明人通过qPCR测量了受损端粒处生成的DDRNA的水平。为此，他们使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，其中通过敲除端粒结合蛋白TRF2可以使端粒脱保护(Celli和deLange，2005)。这导致在几乎所有的端粒上激活DDR。这是一个公认的端粒功能失调模型。已经显示，当DNA受损时，在该特定受损基因座处产生称为DDRNA的小RNA分子，并且它们携带受损DNA的相同序列(Francia等，2012)；因此发明人推断在端粒去保护时可以产生两组不同的DDRNA分子，一组源自富G端粒DNA链(TeloC DDRNA)的转录并且一组源自富C端粒DNA链(TeloG DDRNA；图1)的转录。通过RT-qPCR和针对小RNA的定向测序，与具有正常端粒的对照细胞相比，它们能够在具有脱保护的端粒的细胞中检测到TeloC和TeloG DDRNA的可重复地增加2到3倍(图2)。

在具有去保护端粒的细胞中，与对照细胞相比，TeloG和TeloC DDRNA前体转录物都被强烈诱导(图23a)，表明端粒去保护诱导端粒处的转录。

ALT阳性细胞在端粒处显示出强烈的慢性DDR激活(Cesare和Reddel，2010)。本发明人发现这与如下相关：如通过RT-qPCR所检测，ALT阳性WI-38VA-13中比其亲本细胞系WI-38人成纤维细胞中更高水平的tDDRNA，和ALT阳性SW26中比端粒酶阳性的SW39胎儿肺成纤维细胞中更高水平的tDDRNA，SW39胎儿肺成纤维细胞是成纤维细胞系IMR90永生化的细胞系，导致不同的端粒维持机制(Bechter等，2003)(图3)。此外，与对照SW39细胞相比，TeloG和TeloC DDRNA前体转录物也在SW26ALT阳性细胞中强烈上调(图23b)。

ALT阳性细胞依靠同源重组机制维持其端粒(Cesare和Reddel，2010)；因此发明人测试了它们是否对DDRNA抑制超敏。

本发明人用分别靶向富G或富C的端粒转录物(分别为抗TeloG和抗TeloC)的锁核酸(LNA)(Veedu和Wengel，2010)，或对照LNA转染ALT细胞系，U-2 OS人骨肉瘤细胞，并且发明人监测细胞生长十天。用对照和抗TeloG LNA转染的细胞的生长与空白处理的细胞没有差异；不同的是，抗TeloC LNA显著削弱了U-2 OS的生长(图4)。

由于抗TeloC LNA对转化(BJ ELR)或正常(BJ hTERT)(图4)的表达端粒酶的人成纤维细胞的生长速率没有显著影响，所以该作用对ALT细胞是特异性的。

为了监测LNA治疗对ALT生物标志物的影响，本发明人评估了ALT相关的PML小体(APB)，含有重组因子的核结构和ALT细胞特异性的端粒DNA(Henson和Reddel，2010)。通过针对PML蛋白的间接免疫染色，本发明人观察到与对照或抗TeloG LNA相比，用抗TeloC LNA处理的U-2 OS细胞中的APB减少(图5)。

为了扩展他们的观察，发明人用抗TeloG和抗TeloC LNA转染ALT阳性细胞系U-2OS，Saos-2和WI-38VA-13。抗TeloC LNA在所有三种细胞系中显著抑制细胞生长(图6)。

硫代磷酸酯主链(“PS”)是使寡核苷酸对核酸酶降解更具抗性并且通常用于增强寡核苷酸的活性，特别是体内活性的修饰。本发明人设计了具有磷酸二酯LNA的相同序列但具有完全硫代磷酸酯主链(PS LNA，参见材料和方法)的LNA分子。PS抗TeloC LNA可防止浓度为20nM的U-2OS细胞生长，其浓度比磷酸二酯LNA使用的浓度低10倍(图7和8)，但对用作对照的BJ hTERT细胞的影响较小。

已经证明，所谓“微小/短LNA寡核苷酸”，至少6nt，优选至少8nt长的完全LNA寡核苷酸，在体外和体内都限制特异性靶向它们的互补RNA靶标(Obad等，2011)。本发明人设计了具有硫代磷酸酯主链的微小/短LNA寡核苷酸，其被命名为“微小抗TeloC”和“微小抗TeloG”，其长度为8个核苷酸并且靶向端粒转录物(图9)。

用微小抗TeloC寡核苷酸转染的U-2 OS细胞生长显著低于空白转染的细胞或用对照或微小抗TeloG寡核苷酸转染的细胞(图10)。该作用对ALT细胞是特异性的，因为抗TeloCLNA不会损害正常人成纤维细胞(BJ细胞)中的细胞生长(图11)。然而，与以相同摩尔浓度使用的PS抗TeloC LNA相比，微小抗TeloC寡核苷酸对细胞生长的影响不太明显(图10)。

通过使用3倍较高量的微小LNA寡核苷酸(60nM)，这与它们的较短长度成比例并且因此与它们匹配端粒重复RNA的能力成比例，发明人观察到微小抗TeloC LNA对ALT细胞增殖的抑制作用，与20nM浓度的PS抗TeloC LNA相似(图12)。同样在这个较高的浓度下，微小/短的抗TeloC LNA对ALT细胞具有特异性(图13)。

由PS LNA和微小LNA两者引起的抗TeloC LNA介导的生长受损伴随着诱导凋亡，由胱冬酶-3裂解证明，并且增加了指示细胞死亡的亚G-1细胞，如FACS分析所示，以及如通过胱冬酶-3和PARP-1切割所示，如通过Western印迹分析所示(图24)。此外，用抗TeloC LNA转染的U-2 OS细胞显示出延长的S期(图25)，表明加剧的复制压力，认为其与ALT机制有关(O′Sullivan和Karlseder，2010)。

为了进一步证明抗TeloC LNA的特异性，发明人测试了LNA转染对配对细胞系SW26(ALT)和SW39(端粒酶阳性)的影响，如前所述。抗TeloC LNA抑制ALT细胞的生长比匹配的非ALT对照多更多(图26)。

由于细胞的转染可以在体外实现，但不能在体内实现，测试细胞在没有转染剂的情况下摄取“裸”LNA的能力是非常重要的。这个过程被称为“自主递送”，并被认为是体内治疗效果的更好预测指标(Stein等，2010)。因此，发明人试图确定在多种ALT细胞系中LNA裸露递送的功效。

在U-2 OS细胞中LNA的裸递送是有效的，PS抗TeloC LNA和微小抗TeloC LNA均抑制细胞生长(图27A，B)。同时，对照和抗TeloG处理的细胞相对不受影响。

为了证明硫代磷酸酯主链寡核苷酸的功效不限于骨肉瘤细胞系，本发明人通过裸递送在另一种细胞类型，ALT阳性胶质母细胞瘤细胞系GBM14(Heaphy等，2011)上测试了它们。与未处理的细胞相比，只有PS抗TeloC和微小抗TeloC LNA显著减少细胞生长(图14，15)。

另一种ALT阳性细胞系G-292能够在小鼠中作为异种移植物生长(Lauvrak等，2013)。本发明人首先确定该细胞系也仅受到抗TeloC LNA而不受对照的影响(图28)。然后，他们确定裸露递送的功效，发现PS抗TeloC和微小抗TeloC能够抑制生长，而各自的对照PS抗TeloG、微小对照和微小抗TeloG没有效果(图29)。

为了测试ASO治疗对体内ALT阳性肿瘤生长的效力，将G-292细胞注射到裸鼠的胁腹，直到它们形成可检测的肿瘤块。用ASO腹膜内处理荷瘤小鼠。与载剂(PBS)注射的小鼠相比，PS抗TeloC和微小抗TeloC减少肿瘤生长(图16)。发明人没有进行最大耐受剂量研究，因此较高剂量可能对肿瘤生长具有较强的抑制作用。此外，PS抗TeloC和微小抗TeloC增加了肿瘤达到1cm³大小所需的时间(图17)。

本发明人测试了具有硫代磷酸酯主链的另一类ASO，2′-O-甲基(2′-O-Me)ASO的功效和特异性。仅转染2′-O-Me抗-TeloC的U-2 OS生长显著低于空白转染的细胞，而对照和抗TeloG ASO不影响细胞生长(图30)。重要的是，当以相同浓度(20nM)使用时，2′-O-Me抗TeloC对细胞生长的作用大于PS抗TeloC。不同的是，2′-O-Me抗TeloC不影响BJ细胞生长。此外，2′-O-Me ASO在至多100nM下无毒(图31)。

与端粒功能失调相关的非癌症病症

鱼类Danio rerio(斑马鱼)中端粒酶功能的遗传失活诱导端粒功能失调和多种以加速形式重现衰老的病理事件(Anchelin等，2013；Carneiro等，2016)。因此，这是一种端粒功能失调，特别是生理衰老的成熟忠实的脊椎动物模型。研究第二代端粒酶突变型斑马鱼动物，因为与第一代斑马鱼相比其表型更强。动物的特征是形态学缺陷和寿命缩短，并且动物在出生后几天死亡。将PS LNA注射入第一代端粒酶突变型鱼的单细胞胚胎中，将其杂交以获得第二代。从用抗TeloC或抗TeloG处理的个体出生的鱼显示与早衰相关的形态缺陷显著减少(图18)并且存活时间更长(图19)。

发明人用表达突变形式的核纤层蛋白A基因(也称为早老蛋白)(Gonzalo等，2016)或作为对照的野生型核纤层蛋白A基因的载体感染正常人成纤维细胞。该基因在HGPS患者中发生突变，其表达导致细胞生长减慢并导致早衰，重现在端粒综合征例如HGPS患者中观察到的早衰表型。已经显示早老蛋白表达引起端粒功能失调(Chojnowski等，2015)。发明人监测这些细胞在PS LNA转染后的细胞生长。在存在PS抗TeloC或PS抗TeloG的情况下，如通过BrdU并入和增殖标志物K167的表达(图20)所监测，表达早老蛋白的细胞的生长比空白转染或用PS对照LNA转染的细胞生长更多，尽管有类似水平的早老蛋白表达(图21)。这些结果表明，靶向tDDRNA的ASO能够阻止早老蛋白诱导的衰老建立。

在表皮角质形成细胞中表达早老蛋白的HGPS小鼠模型显示出表皮增生，严重的皮肤异常，毛发变薄，明显的角化过度，真皮中度纤维化，炎性细胞浸润，并且它们在产后头两周内死亡(McKenna等，2014)。本发明人在妊娠期间用PS抗TeloG LNA处理表达早老蛋白和野生型的小鼠一次，注射妊娠雌性，并且在出生后每3天注射一次。与未处理的动物相比，抗TeloG处理显著延长了小鼠的寿命(图22)。

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序列表

<110> IFOM

F·地阿达迪法嘎格纳（D'ADDA DI FAGAGNA, Fabrizio）

F·罗希洛（ROSSIELLO, Francesca）

J·阿瓜多（AGUADO, Julio）

C·琼斯－韦纳特（JONES-WEINERT, Corey）

<120> 治疗性寡核苷酸

<130> PCT 130108

<150> EP15178809.8

<151> 2015-07-29

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

ttaggg 6

<210> 2

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

tagggt 6

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

agggtt 6

<210> 4

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

gggtta 6

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

ggttag 6

<210> 6

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

gttagg 6

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

tagcaccatt tgaaatcagt gtt 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

cgaattccac aaattgttat cc 22

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

tagggttagg gttagggt 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

ccctaaccct aaccctaa 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

ttcattgtgg gagcagac 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

cagcagtttc tccagagc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

ccctaaccct aaccctaa 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

tagggttagg gttagggt 18

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcac 34

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

acacucuuuc ccuacacgac gcucuuccga ucu 33

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

actgataggg agtggtaaac t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

ccctaaccct aaccctaacc c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

gggttagggt tagggttagg g 21

<210> 22

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

cgtcatac 8

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

caatcccaat cccaatccca a 21

<210> 24

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

uuaggguuag gguuaggg 18

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag gg 42

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

aatcccaatc ccaatcccaa tcccaatccc aatcccaatc cc 42

<210> 27

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

aaucccaauc ccaauccc 18

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

gttagggtta gggttagggt t 21

<210> 29

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

<210> 30

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 31

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc tcttccgatc 60

t 61

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成

<400> 32

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 33

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

uuauccgcuc acaauuccac au 22

Claims

1.一种寡核苷酸，包含以下序列之一：

(TTAGGG)SEQ ID No.1，(TAGGGT)SEQ ID No.2，(AGGGTT)SEQ ID No.3，(GGGTTA)SEQID No.4，(GGTTAG)SEQ ID No.5或(GTTAGG)SEQ ID No.6或其互补序列或其片段或变体或混合物，用于治疗和/或预防特征在于端粒替代性延长的疾病。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸或其片段或变体，包含以下序列之一：(TTAGGG)_n，(TAGGGT)_n，(AGGGTT)_n，(GGGTTA)_n，(GGTTAG)_n或(GTTAGG)_n，其中1＜n＜1000，优选1＜n＜500，优选1＜n＜200，优选1＜n＜100，优选1＜n＜50，优选1＜n＜20，优选1＜n＜10，优选1＜n＜5。

3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与RNA的序列互补，所述RNA是使用特定功能失调的端粒DNA作为转录模板合成的RNA转录本或所述RNA转录本的片段，所述片段(DDRNA)通过切酶和/或Drosha加工产生。

4.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述疾病是癌症或爱波斯坦-巴尔病毒感染。

5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其中所述疾病是ALT-阳性癌症。

6.如权利要求4或5所述的寡核苷酸，其中所述癌症选自：软组织肉瘤，优选软骨肉瘤，未分化的多形性肉瘤，包括恶性纤维组织细胞瘤，平滑肌肉瘤，上皮样肉瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤和变体，血管肉瘤和神经纤维瘤，中枢神经系统癌症，优选2级弥漫性星形细胞瘤；3级间变性星形细胞瘤；4级儿科多形性成胶质细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间变性髓母细胞瘤，1级毛细胞型星形细胞瘤，非间变性髓母细胞瘤，脑膜瘤，神经鞘瘤，膀胱癌，尤其是小细胞癌症和侵袭性尿路上皮癌，肾上腺或外周神经系统癌症，尤其是多发性神经胶质瘤，神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤，神经内分泌肿瘤如副神经节瘤和类癌瘤，肾癌，尤其是嫌色细胞癌，肉瘤样癌和透明细胞和乳头状癌，肺和胸膜癌，尤其是恶性间皮瘤，大细胞癌和小细胞癌，皮肤癌如恶性黑素瘤，肝癌如肝细胞癌，睾丸癌如非精原细胞瘤性生殖细胞瘤，乳腺癌，尤其是小叶癌；导管癌和髓样癌，子宫癌如浆液性子宫内膜癌，子宫颈鳞状癌，卵巢癌，尤其是透明细胞癌，子宫内膜样癌，胆囊癌如腺癌，食管癌。

7.一种寡核苷酸，包含以下序列之一：

(TTAGGG)SEQ ID No.1，(TAGGGT)SEQ ID No.2，(AGGGTT)SEQ ID No.3，(GGGTTA)SEQID No.4，(GGTTAG)SEQ ID No.5或(GTTAGG)SEQ ID No.6或其互补序列或其片段或变体或混合物，用于治疗和/或预防与端粒功能失调相关的非癌症病症。

8.如权利要求7所述的寡核苷酸，其中所述与端粒功能失调相关的非癌症病症选自：哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)，维尔纳综合征，布鲁姆综合征，共济失调毛细血管扩张症，家族性IPF，散发性IPF，再生障碍性贫血，先天性常染色体显性角化不全，家族性MDS-AML，先天性角化不全，先天性X染色体连锁隐性角化不良，Hoyrara-Hreiderasson综合征，Revesz综合征，先天性常染色体隐性角化不全，Coats plus综合征，由TRF1、POT1、TPP1、TINF2、RAP1或TRF2中任一个的突变或失活导致的病症，部分肝切除后的再生障碍，肝纤维化，肝脏慢性炎症，肝硬化，肺纤维化，骨髓祖细胞分化改变，骨髓衰竭，慢性阻塞性肺病(COPD)，神经病症包括阿尔茨海默病，骨质疏松症，动脉粥样硬化，心脏病，杜兴氏肌营养不良症，2型糖尿病，生育力受损，伤口愈合受损，关节炎，白内障，年龄相关性黄斑变性，衰老。

9.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其是锁核酸(LNA)-修饰的寡核苷酸，2′-O-甲基修饰的寡核苷酸，硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸，硫代磷酸酯修饰的锁核酸，2′-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸，2O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]核糖核苷，甲基膦酸酯，吗啉代寡核苷酸，LNA-DNA-LNA gapmer寡核苷酸，mixmer，嵌合2′-O-甲基RNA-DNA gapmer，N3′-P5′亚磷酰胺，2′-氟-阿拉伯糖核酸，吗啉代氨基磷酸酯，环己烯核酸，三环DNA，肽核酸，解锁核酸，己糖醇核酸，硼烷磷酸酯寡核苷酸，磷酰胺酸酯寡核苷酸，优选地所述修饰的寡核苷酸是硫代磷酸酯化的。

10.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-9中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的运载体，用于治疗和/或预防以替代性延长端粒为特征的疾病或用于治疗和/或预防与端粒功能失调相关的非癌症病症。

11.如权利要求10所述的药物组合物，还包含至少一种其他治疗剂，优选所述其他治疗剂是抗肿瘤剂，镇痛剂，或镇吐剂。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述其它治疗剂选自：ATR抑制剂、DDR抑制剂、HR抑制剂、特异性地靶向端粒的分子，优选G-四联体相互作用分子、在端粒处造成DNA损伤生成的分子。

13.一种鉴定待用权利要求1-9中任一项所述的寡核苷酸或用权利要求10-12中任一项所述的药物组合物治疗的对象的方法，包括检测RNA的存在和/或测量RNA的量，所述RNA是使用特异性功能失调的端粒DNA作为转录模板合成的RNA转录本或所述RNA转录本的片段，所述片段(DDRNA或tDDRNA)通过由切酶和/或Drosha处理而产生，其中所述对象受到以端粒的替代性延长为特征的疾病的影响或受到与端粒功能失调相关的非癌症病症的影响。