CN114786683A - 一种siRNA、药物组合物以及使用其治疗糖尿病的方法 - Google Patents
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- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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Abstract
本申请提供了治疗受试者的组合物和方法。所述组合物可包括短干扰RNA(siRNA)分子，其包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链。所述方法可包括向受试者施用包括药剂的药物组合物，其中药剂用于降低受试者中尿苷5’‑二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)水平。所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。所述正义RNA链和所述反义RNA链可以是70％‑100％互补的。
Description
技术领域
本申请一般涉及RNA，尤其涉及一种短干扰RNA(siRNA)、药物组合物及治疗糖尿病的方法。
背景技术
糖尿病是世界上四种主要的非传染病之一。根据世界卫生组织的一份报告，世界上约有422万人患有糖尿病，每年有160万人死亡。当胰腺不能产生足够的胰岛素或当人体不能有效地使用胰岛素来调节血糖时，发生糖尿病。
糖尿病很难治疗，常规药物往往会导致巨大的医疗费用、心理痛苦和身体折磨。人们为寻找新的治疗靶点和开发治疗糖尿病的新药付出了巨大的努力，但仍然需要新的发现和治疗。
新药物的候选类别之一是小干扰RNA(siRNA)，其已被研究作为新型治疗剂，用于治疗各种病症。基于siRNA的治疗方法包括将合成的siRNA引入受试者体内以激发RNA干扰(RNAi)，从而抑制特定基因的mRNA表达以产生基因沉默或抑制作用。
因此，期望提供经济、持久的或更低的物理损害的新糖尿病疗法(例如，siRNA药物)。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了治疗患有糖尿病的受试者的方法。所述方法可以包括向受试者施用包括药剂的药物组合物。所述试剂可以用于减少受试者中尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)水平。
在一些实施例中，可通过抑制Ugt2b1基因的表达用于减少UGT水平。
在一些实施例中，药剂可以是一种抑制性RNA。
在一些实施例中，抑制性RNA可以是短干扰RNA(siRNA)。
在一些实施例中，siRNA可以包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。正义RNA链和反义RNA链可以是70％-100％互补的。
在一些实施例中，siRNA可以包括正义RNA链和反义RNA链。所述正义RNA链可具有与SEQ ID No.1至少80％相似性的核苷酸序列。反义RNA链可以具有与SEQ ID No.2至少80％相似性的核苷酸序列。所述正义RNA链可以具有与SEQ ID No.3至少80％相似性的核苷酸序列。反义RNA链可以具有与SEQ ID No.4至少80％相似性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述正义RNA链可以具有SEQ ID No.1的核苷酸序列。反义RNA链可以具有SEQ ID No.2的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述正义RNA链可具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。反义RNA链可以具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。
在一些实施例中，正义RNA链和/或反义RNA链可包括约在25％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。
在一些实施例中，修饰核苷酸可包括O-甲基修饰核苷酸、硫代磷酸修饰核苷酸或氟修饰核苷酸中的一种或以上。
在一些实施例中，正义RNA链可包括具有SEQ ID No.11或SEQ ID No.13核苷酸序列的修饰RNA链，其中“m”代表氧-甲基修饰，“s”代表硫代磷酸修饰，“f”代表氟修饰。
在一些实施例中，反义RNA链可包括具有SEQ ID No.12或SEQ ID No.14核苷酸序列的修饰RNA链，其中“m”代表氧-甲基修饰，“s”代表硫代磷酸修饰，“f”代表氟修饰。
在一些实施例中，siRNA可包括双链RNA，包括具有15至25个Ugt2b1 mRNA碱基的正义RNA链和与15至25个Ugt2b1 mRNA碱基互补的反义RNA链。
根据本申请的另一方面，提供了治疗患有与Ugt2b1基因表达相关的疾病的受试者的方法。该方法可以包括向受试者施用短干扰RNA(siRNA)。siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。正义RNA链和反义RNA链可以是70％-100％互补的。
根据本申请的另一方面，提供了治疗患有糖尿病的受试者的方法。所述方法可以包括给予受试者的有效量的siRNA。所述siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和反义RNA链形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。正义RNA链或反义RNA链可与Ugt2b1基因核苷酸序列的一部分70％-100％互补。
根据本申请的另一方面，提供了一种短干扰RNA(siRNA)分子。siRNA分子可以包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。正义RNA链或反义RNA链可与Ugt2b1基因核苷酸序列的一部分70％-100％互补。
根据本申请的另一方面，提供了一种用于抑制Ugt2b1基因表达的抑制性RNA。抑制性RNA可包括双链RNA，包括具有15至25个Ugt2b1 mRNA碱基的正义RNA链和与15至25个Ugt2b1 mRNA碱基互补的反义RNA链。
根据本申请的另一方面，提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包括短干扰RNA(siRNA)分子，所述短干扰RNA(siRNA)分子包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。正义RNA链或反义RNA链可与Ugt2b1基因核苷酸序列的一部分70％-100％互补。siRNA可用于减少Ugt2b1基因的表达。
正义RNA链和反义RNA链可以形成发夹结构。
根据申请的另一方面，提供了包括在一种药物制剂中的短干扰RNA(siRNA)分子的组合物在用于治疗患有糖尿病的受试者的用途。siRNA可以用于减少受试者中的尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)水平。
根据本申请的另一个方面，提供了在用于治疗患有糖尿病的受试者的药物制剂中抑制Ugt2b1基因表达的短干扰RNA(siRNA)的用途。siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是15到25个核苷酸。正义RNA链和反义RNA链可以是70％-100％互补的。
本说明书的一部分附加特性可以在以下描述中进行说明。通过对以下描述和相应附图的研究或者对实施例的生产或操作的了解，本说明书的一部分附加特性对于本领域技术人员是明显的。本说明书的特征可以通过实践或使用下面讨论的详细示例中所述的方法、工具和组合的各个方面来实现和获取。
附图说明
本申请将通过示例性实施例进行进一步描述。这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。应该注意的是，图纸不是按比例绘制的。这些实施例是非限制性的示例性实施例，在这些实施例中，各图中相同的编号表示相似的结构，其中：
图1是示出根据本申请的一些实施例ob/ob小鼠使用GTT测试的血糖水平的分析图；
图2是示出根据本申请的一些实施例ob/ob小鼠使用ITT测试的血糖水平的分析图；
图3是示出根据本申请的一些实施例db/db小鼠使用GTT测试的血糖水平的分析图；
图4是示出根据本申请的一些实施例db/db小鼠使用ITT测试的血糖水平的分析图；
图5是说明在三种不同组织中的ob/ob小鼠和db/db小鼠之间的差异表达基因的重叠数量的维恩图；
图6是说明ob/ob小鼠和db/db小鼠的三种不同组织中重叠基因的表达倍数变化分布的热图；
图7A是说明对照样品和5个siRNA处理的样品中参考基因36B4的CT值的分析图；
图7B是说明对照样品和5个siRNA处理的样品中Ugt2b1基因的相对表达的分析图；
图8是说明对照db/db小鼠和siRNA-1864处理的db/db小鼠中Ugt2b1基因的相对表达的分析图；
图9是说明对照db/db小鼠和siRNA-1864处理的db/db小鼠中静息血糖水平(由G0表示)的分析图；以及
图10是说明在db/db小鼠和siRNA-1864处理的db/db小鼠中测试的2小时后载葡萄糖水平(由G120表示)的分析图。
具体实施方式
在特定的应用及其要求中提供了以下描述，通过以下描述可以使本领域技术人员能够制作和使用本申请。对于本领域的普通技术人员来讲，显然可以对所披露的实施例作出各种改变，并且在不偏离本说明书的原则和范围的情况下，本说明书中所定义的普遍原则可以适用于其他实施例和应用场景。因此，本说明书不限于所示的实施例，而是符合与权利要求一致的最宽的范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定示例实施例，并不旨在限制。如本说明书使用的单数形式“一”、“一个”及“该”同样可以包括复数形式，除非上下文明确提示例外情形。将进一步理解，当在本说明书中使用术语“包括”、“包含”、“包括”和/或“包括”时，其规定了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或以上其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组。
在参考附图考虑以下描述后，本申请的这些和其他特征、操作方法、结构相关元件的功能、部件组合和制造经济性可以变得更加明显，所有这些构成本说明书的一部分。然而，应该明确地理解，图仅是用于说明和描述的目的，并且不旨在限制本申请的范围。应当理解的是，附图并不是按比例绘制的。
本申请提供了一种治疗患有糖尿病的受试者的方法。该方法可包括向受试者施用包括药剂的药物组合物。该药剂可被用于通过抑制Ugt2b1基因的表达来降低UGT水平。该药剂可以是抑制性RNA(例如，siRNA)。siRNA可用于沉默Ugt2b1基因，从而抑制Ugt2b1基因的表达并进一步降低UGT水平。Ugt2b1基因表达减少或沉默可以降低血糖，从而治疗糖尿病患者，尤其是II型糖尿病患者。还提供了siRNA和包括siRNA的药物组合物。因此，通过使用包括能够有效抑制Ugt2b1基因表达的siRNA在内的药物组合物，可以以更少的副作用和更少的经济负担来治疗糖尿病患者。与传统药物相比，siRNA药物具有选择性靶点多、制备容易、生物学特异性高、长期维持药效、不易产生耐药性等优点。在一些实施例中，siRNA也可用于治疗具有与Ugt2b1基因表达相关的疾病的受试者。与Ugt2b1基因表达相关的疾病可以包括，例如，糖尿病、与高脂饮食相关的疾病、肝肿瘤、脂肪肝、肥大、胆汁淤积、纤维化、药物诱导的肝损伤等。
如本文所用，术语“小干扰RNA(siRNA)”(也称为短干扰RNA或沉默RNA)是指一类双链RNA和/或非编码RNA分子。siRNA药物可用于诱导编码蛋白质的基因的沉默。siRNA可用于靶向特定基因的mRNA以产生基因沉默效果。例如，siRNA可以通过转录后降解mRNA，从而干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达，并阻止转录。
如本文所用，本申请的术语“受试者”指可向其施用siRNA或包括本申请的siRNA的药物组合物的生物体。受试者可包括任何人类或非人动物、任何人类或非人动物的器官、组织或细胞等，或其任何组合。示例性非人类动物可包括哺乳动物(例如，黑猩猩、其他猿类和猴类等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、山羊和马等)、家养哺乳动物(例如，狗和猫等)、实验室动物(例如，小鼠、大鼠和豚鼠等)等。在一些实施例中，受试者可以是来自实验室动物(例如，小鼠)的细胞。例如，受试者可以是来自小鼠的肝癌细胞(例如，hepa1-6)。在一些实施例中，受试者可患有一种或以上疾病(例如，糖尿病、与高脂饮食相关的疾病、肝肿瘤、脂肪肝、肥大、胆汁淤积、纤维化、药物诱导的肝损伤等)。例如，受试者可以是患有II型糖尿病的小鼠(例如，ob/ob小鼠，db/db小鼠)。ob/ob小鼠和db/db小鼠是II型糖尿病的动物模型。ob/ob小鼠或肥胖小鼠是突变小鼠，由于负责产生瘦素的基因突变而过度进食，并变得极度肥胖。db/db小鼠是一种基因突变小鼠，其瘦素受体不能正常发挥作用。db/db小鼠极度肥胖，可以存在许多在ob/ob小鼠中发现的代谢缺陷(例如，过度吞噬、高血糖、高胰岛素血症和不孕症)。
根据本说明书的一个方面，提供了治疗患有糖尿病的受试者的方法。该方法可包括向受试者施用包括药剂的药物组合物。
该药物组合物的药剂可在治疗糖尿病中发挥重要作用。该药剂可以用于减少受试者中尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)水平以减轻或治疗糖尿病。这里的UGT水平是指UGT蛋白表达水平，和/或UGT酶活性水平，或编码UGT基因的RNA表达水平。在一些实施例中，可将药剂用于通过抑制UGT的蛋白质表达来减少UGT水平。UGT的蛋白质表达水平或蛋白质活性水平或编码UGT基因的RNA表达水平可根据常规方法进行确定。例如，可以通过诺瑟(Northern)杂交、RT-PCR等确定RNA表达水平。作为另一个例子，蛋白质表达水平可以通过蛋白质印迹、ELISA等来确定。
在一些实施例中，可通过抑制编码UGT的基因表达来减少UGT水平。编码UGT的基因对于不同的受试者可以是不同的。对于与人类高同源性的小鼠，UGT可以主要包括UGT1A系列和UGT2家族。UGT2家族可以包括UGT 2A系列和UGT 2B系列。编码UGT的基因可包括编码UGT1A系列的基因，编码UGT 2A系列的基因，以及编码UGT 2B系列的基因。编码UGT 1A家族的示例性基因可包括Ugt1a1基因。编码UGT 2A家族的示例性基因可包括Ugt2a1基因、Ugt2a2基因和Ugt2a3基因。编码UGT 2B家族的示例性基因可包括Ugt2b1基因、Ugt2b5基因、Ugt2b34基因、Ugt2b35基因、Ugt2b36基因、Ugt2b37基因和Ugt2b38基因。对于人类来说，UGT可以包括UGT1A系列、UGT2系列、UGT3家族和UGT8家族。UGT2家族可以包括UGT 2A系列和UGT2B系列。编码UGT的基因可以包括编码UGT 1A系列的基因、编码UGT 2A系列的基因、编码UGT2B系列的基因、编码UGT3家族的基因以及编码UGT8家族的基因。编码UGT 1A家族的示例性基因可包括Ugt1a1基因、Ugt1a3基因、Ugt1a4基因、Ugt1a5基因、Ugt1a6基因、Ugt1a7基因、Ugt1a8基因、Ugt1a9基因和Ugt1a10基因。编码UGT 2A家族的示例性基因可包括Ugt2a1基因、Ugt2a2基因和Ugt2a3基因。编码UGT 2B家族的示例性基因可包括Ugt2b4基因、Ugt2b7基因、Ugt2b10基因、Ugt2b11基因、Ugt2b15基因、Ugt2b17基因和Ugt2b28基因。编码UGT3家族的示例性基因可包括Ugt3a1基因和Ugt3a2基因。编码UGT8家族的示例性基因可包括Ugt8a1基因。在一些实施例中，可以通过抑制编码UGT 2B系列的至少一种基因的表达用于减少UGT水平。在一些实施例中，该药剂可被用于通过抑制Ugt2b1基因的表达来降低UGT水平。在一些实施例中，该药剂可被用于通过抑制编码UGT的多个基因的表达来降低UGT水平，例如，Ugt2b1基因和一个或以上其他基因(例如，Ugt2a1基因、Ugt2b8基因)。
Ugt2b1基因的表达水平可以与糖尿病有关，尤其是由肥胖或超重引起的II型糖尿病。Ugt2b1基因可以参与胰高血糖素信号通路。胰高血糖素可提高葡萄糖浓度，可以与胰高血糖素受体(GCGR)呈正相关，例如，胰高血糖素可促进GCGR的产生。此外，GCGR可通过组成性雄甾烷受体(CAR)和孕烷X受体(PXR)促进Ugt2b1基因的表达。因此，Ugt2b1基因的表达可以与葡萄糖呈正相关。也就是说，Ugt2b1基因的上调表达可增加血糖，而Ugt2b1基因的下调表达可降低血糖(参见下文描述的实施例1和2)。因此，Ugt2b1基因可以被认为是糖尿病的原因之一，并可以被选为siRNA治疗的靶点。
在一些实施例中，该药剂可包括一个或以上小分子或基于蛋白质的药剂(例如抗体)，以阻断UGT的蛋白质表达或降低UGT的蛋白质活性。例如，小分子可以包括地氯雷他定、拉帕替尼、帕佐帕尼、雷戈拉非尼、索拉非尼等。基于蛋白质的药剂可包括抗UGT2B7抗体、抗UGT2B10抗体、抗UGT2B15抗体等。
在一些实施例中，该药剂可以是或包括抑制性RNA。抑制性RNA可以是用于抑制基因表达的工程化RNA分子。抑制性RNA可用于减少UGT水平，例如，通过抑制编码UGT的基因(例如Ugt2b1基因)的表达。抑制性RNA可包括微RNA(miRNA)、siRNA和短发夹RNA(shRNA)。在一些实施例中，抑制性RNA可以是miRNA。miRNA可用于抑制至少两个目标基因的表达，例如，Ugt2b1基因和一种或以上其他基因(例如，Ugt2a1基因，Ugt2b8基因)。在一些实施例中，抑制性RNA可以是siRNA。siRNA可仅用于靶向一个特定基因，例如Ugt2b1基因以使其沉默(例如，下调其表达)。
siRNA和miRNA可以下调编码UGT和/或其mRNA转录物的一种或以上基因的表达。通过靶向基因(如Ugt2b1基因)，发现并开辟了一种全新的疾病治疗方法，该基因与糖尿病等病理过程有因果关系。在一些实施例中，siRNA可用于治疗具有与Ugt2b1基因表达相关的疾病的受试者。与Ugt2b1基因表达相关的疾病可以包括，例如，糖尿病、与高脂饮食相关的疾病、肝肿瘤、脂肪肝、肥大、胆汁淤积、纤维化、药物诱导的肝损伤等。
siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链，每条链的3'端有两个核苷酸悬垂(overhang)。正义RNA链可以是与目标基因(例如Ugt2b1基因)的部分mRNA序列相同的链。反义RNA链可以是与目标目标基因(例如Ugt2b1基因)的部分mRNA序列互补的链。反义RNA链可被用于识别目标基因的mRNA，然后与之结合以启动转录沉默。
在一些实施例中，正义RNA链或反义RNA链可包括或不包括在3'端悬垂的一个或以上核苷酸(也称为悬垂)。本文中的悬垂可用于增加受试者中外源性siRNA的稳定性，增强核酸酶抗性和/或降低成本。示例性悬垂可包括一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸等，其在本文中不受限制。在一些实施例中，一条siRNA链的3'端可以有两个悬垂部分。悬垂可以是siRNA设计的默认选项(例如，UU或dTdT)，或与目标基因的部分mRNA序列互补。在一些实施例中，正义RNA链可不包括在3'端长度上悬垂的两个核苷酸，而反义RNA链可包括在3'端长度上悬垂的两个核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链可包括在3'端悬垂的两个核苷酸，而反义RNA链可不包括在3'端悬垂的两个核苷酸。在一些实施例中，悬垂在正义RNA链3'端的两个核苷酸可以是例如UU或dTdT。反义RNA链3'端悬垂的核苷酸(例如，两个核苷酸)可以是规定的(例如，UU或dTdT)或与目标基因mRNA的核苷酸序列的一部分互补的(例如，GC、UC、CA、AC、AA)。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可各自包括悬垂在3'端的两个核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可各自不包括在3'端悬垂的两个核苷酸。应注意，有或无悬垂的正义RNA链和/或反义RNA链均在本发明的保护范围内。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可形成发夹结构，以提高siRNA的稳定性和/或增强siRNA的功能性能。例如，正义RNA链和反义RNA链可通过环连接以形成发夹结构。
在一些实施例中，正义RNA链或反义RNA链的长度可为15至27个核苷酸(不包括悬垂)。在一些实施例中，正义RNA链或反义RNA链的长度可为15至25个核苷酸(不包括悬垂)。在一些实施例中，正义RNA链或反义RNA链的长度可为19至23个核苷酸(不包括悬垂)。在一些实施例中，正义RNA链或反义RNA链的长度可为19至21个核苷酸(不包括悬垂)。在一些实施例中，正义RNA链的长度可以是19个核苷酸(不包括悬垂)。在一些实施例中，反义RNA链的长度可为21个核苷酸(不包括悬垂)。
正义RNA链和反义RNA链可以是70％-100％互补的。本文中的互补百分比是指正义RNA链和反义RNA链的互补长度与两者的更长长度的百分比。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可为75％-100％互补、80％-100％互补、85％-100％互补、90％-100％互补等。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可以是90％-100％互补的。在一些实施例中，互补百分比可与正义RNA链和反义RNA链的长度相关。正义RNA链和反义RNA链的互补性可以大于90％，例如，当正义RNA链的长度为19个核苷酸，反义RNA链的长度为21个核苷酸时，互补性可以是90.47％。
在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.1相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，反义RNA链可具有与SEQ ID No.2相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ IDNo.1至少80％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.2至少80％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.1至少90％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.2至少90％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.1至少95％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQID No.2至少95％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有SEQ ID No.1的核苷酸序列，而反义RNA链可具有SEQ ID No.2的核苷酸序列。
在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.3相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，反义RNA链可具有与SEQ ID No.4相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ IDNo.3至少80％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.4至少80％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.3至少90％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.4至少90％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.3至少95％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQID No.4至少95％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有SEQ ID No.3的核苷酸序列，而反义RNA链可具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。
在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.5相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，反义RNA链可具有与SEQ ID No.6相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ IDNo.5至少80％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.6至少80％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.5至少90％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.6至少90％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.5至少95％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQID No.6至少95％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有SEQ ID No.5的核苷酸序列，而反义RNA链可具有SEQ ID No.6的核苷酸序列。
在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.7相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，反义RNA链可具有与SEQ ID No.8相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ IDNo.7至少80％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.8至少80％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.7至少90％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.8至少90％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.7至少95％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQID No.8至少95％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有SEQ ID No.7的核苷酸序列，而反义RNA链可具有SEQ ID No.8的核苷酸序列。
在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.9相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，反义RNA链可具有与SEQ ID No.10相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或99％等)的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ IDNo.9至少80％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.10至少80％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.9至少90％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.10至少90％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有与SEQ ID No.9至少95％相似性的核苷酸序列，且反义RNA链可具有与SEQ ID No.10至少95％相似性的核苷酸序列。在一些实施例中，正义RNA链可具有SEQ IDNo.9的核苷酸序列，而反义RNA链可具有SEQ ID No.10的核苷酸序列。
在一些实施例中，siRNA可包括双链RNA，其正义RNA链具有Ugt2b1 mRNA的248至266位、1019至1037位、1253至1271位、1864至1882位和/或2082至2100位碱基，其反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的246至266位(或248至266位)、1017至1037位(或1019至1037位)、1251至1271位(或1253至1271位)、1862至1882位(或1864至1882位)和/或2080至2100位(或2082至2100位)碱基互补。在一些实施例中，siRNA可包括双链RNA，其正义RNA链具有Ugt2b1 mRNA的1253至1271位、1864至1882位和/或2082至2100位碱基，其反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的1251至1271位(或1253至1271位)、1862至1882位(或1864至1882位)和/或2080至2100位(或2082至2100位)碱基互补。在一些实施例中，siRNA可以是双链RNA，其正义RNA链具有Ugt2b1mRNA的1253至1271位和/或1864至1882位碱基，其反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的1251至1271位(或1253至1271位)和/或1862至1882位(1864至1882位)碱基互补。Ugt2b1 mRNA的序列可为SEQ ID No.27所示。
出于说明目的，第一siRNA可以是正义RNA链具有Ugt2b1 mRNA的248至266位碱基，反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的246至266位(或248至266位)碱基互补的双链RNA；第二siRNA可以是正义RNA链具有Ugt2b1 mRNA的1019至1037位碱基，反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的1017至1037位(或1019至1037位)碱基互补的双链RNA；第三siRNA可以是正义RNA链具有Ugt2b1mRNA的1253至1271位碱基，反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的1251至1271位(或1253至1271位)碱基互补的双链RNA；第四siRNA可以是正义RNA链具有Ugt2b1 mRNA的1864至1882位碱基，反义RNA链与Ugt2b1 mRNA的1862至1882位(或1864至1882位)碱基互补的双链RNA；第五siRNA可以是正义RNA链具有Ugt2b1 mRNA的2082至2100位碱基，反义RNA链具有与Ugt2b1 mRNA的2080至2100位(或2082至2100位)碱基互补的双链RNA。
在一些实施例中，siRNA减少或抑制Ugt2b1基因表达的沉默效率可根据与siRNA互补的目标基因(例如，Ugt2b1基因)的mRNA区域而变化。本文中siRNA的沉默效率是指被siRNA沉默的基因的mRNA水平与参考基因(例如，36B4基因)的mRNA水平的比率。mRNA水平可以通过例如RT-PCR确定。沉默效率可以由例如百分比表示。在一些实施例中，siRNA(例如，第一siRNA、第二siRNA、第三siRNA、第四siRNA和/或第五siRNA)的沉默效率可大于或等于25％。在一些实施例中，上述至少四种siRNA(例如，第二种siRNA、第三种siRNA、第四种siRNA、第五种siRNA)的沉默效率可大于或等于40％。在一些实施例中，上述至少四种siRNA(例如，第二种siRNA、第三种siRNA、第四种siRNA、第五种siRNA)的沉默效率可大于或等于50％。在一些实施例中，至少三种以上siRNA(例如，第二种siRNA、第三种siRNA、第四种siRNA)的沉默效率可大于或等于60％。在一些实施例中，上述至少两种siRNA(例如，第三种siRNA、第四种siRNA)的沉默效率可大于或等于75％。在一些实施例中，上述至少一种siRNA(例如，第四种siRNA)的沉默效率可大于或等于85％。
应当注意，对于本领域技术人员，用于靶向Ugt2b1基因的siRNA可以通过使用各种策略(例如，操纵G/C含量、避免富含U的序列、防止与其他基因同源的siRNA序列等)来设计，并且上述siRNA序列并不旨在限制。
在一些实施例中，可对siRNA的一个或以上核苷酸进行化学修饰以形成修饰核苷酸。siRNA核苷酸的化学修饰可增加siRNA的稳定性和/或特异性，最小化siRNA的免疫原性，并降低siRNA的靶向效应。siRNA的修饰核苷酸可用于制备用于治疗糖尿病的药物组合物或用于减少或抑制Ugt2b1基因表达的药物组合物。siRNA中常用的示例性化学修饰可包括核糖2′-OH基团修饰、锁定核酸(locked nucleic acid，LNA)和解锁核酸(unlocked nucleicacid，UNA)修饰、骨架修饰等。核糖2′-OH基团修饰可以涉及用其他化学基团取代核糖2′-OH基团，包括2′-O-甲基(2′-O-Me)、2′-氟(2′-F)和2′-甲氧基乙基(2′-O-MOE)。在LNA修饰中，核糖可以通过引入2'-O和4'-C亚甲基桥锁定在C3'内构象中。在UNA修饰中，核糖环可以在2'-C和3'-C之间断裂。主链修饰可涉及取代磷酸二酯主链键，并包括硫代磷酸酯修饰或磷酸硼酸盐修饰。非桥连磷酸原子可被硫原子取代以得到硫代磷酸修饰，或被硼烷(BH3)部分取代以得到硼烷磷酸修饰。
在一些实施例中，可以应用使用这些化学修饰的不同策略。例如，可组合使用两种或多种化学修饰(例如，可对单个核苷酸进行两种或多种化学修饰)。作为另一个示例，一个或以上化学修饰(例如，核糖2′-OH基团修饰)可与硫代磷酸修饰一起使用。作为另一个实例，可以仅使用一种化学修饰。相应地，在一些实施例中，siRNA的修饰核苷酸可包括O-甲基修饰核苷酸、氟修饰核苷酸、O-MOE修饰核苷酸、硫代磷酸或磷酸硼砂修饰核苷酸、LNA修饰核苷酸、UNA修饰核苷酸等，或其任何组合。在一些实施例中，siRNA的修饰核苷酸可包括O-甲基修饰核苷酸、氟修饰核苷酸、O-MOE修饰核苷酸、硫代磷酸修饰核苷酸等，或其任何组合。在一些实施例中，siRNA的修饰核苷酸可包括O-甲基修饰核苷酸、氟修饰核苷酸、硫代磷酸修饰核苷酸等，或其任何组合。
为简洁起见，O-甲基修饰核苷酸可由字母“m”表示，硫代磷酸修饰核苷酸可由字母“s”表示，氟修饰核苷酸可由字母“f”表示。仅作为示例，siRNA的修饰核苷酸可包括O-甲基修饰的鸟嘌呤(即Gm)、O-甲基修饰的胞嘧啶(即Cm)、O-甲基修饰的腺嘌呤(即Am)和/或O-甲基修饰的尿嘧啶(即Um)。作为另一示例，siRNA的修饰核苷酸可包括硫代磷酸修饰的鸟嘌呤(即Gs)、硫代磷酸修饰的胞嘧啶(即Cs)、硫代磷酸修饰的腺嘌呤(即As)和/或硫代磷酸修饰的尿嘧啶(即Us)。作为又一示例，siRNA的修饰核苷酸可包括氟修饰鸟嘌呤(即Gf)、氟修饰胞嘧啶(即Cf)、氟修饰腺嘌呤(即Af)和/或氟修饰尿嘧啶(即Uf)。作为又一示例，siRNA的修饰核苷酸可包括O-甲基和硫代磷酸修饰的鸟嘌呤(即Gms)、O-甲基和硫代磷酸修饰的胞嘧啶(即Cms)、O-甲基和硫代磷酸修饰的腺嘌呤(即Ams)和/或O-甲基和硫代磷酸修饰的尿嘧啶(即Ums)。作为又一示例，siRNA的修饰核苷酸可包括氟和硫代磷酸修饰的鸟嘌呤(即Gfs)、氟和硫代磷酸修饰的胞嘧啶(即Cfs)、氟和硫代磷酸修饰的腺嘌呤(即Afs)和/或氟和硫代磷酸修饰的尿嘧啶(即Ufs)。
在一些实施例中，仅可修饰所述正义RNA链的核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链可包括约在25％到100％核苷酸位置处的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链可包括约在60％到100％核苷酸位置处的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链可包括约在80％到100％核苷酸位置处的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链可包括约在90％到100％核苷酸位置处的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链可包括在100％核苷酸位置处的修饰核苷酸。在一些实施例中，siRNA可包括修饰正义RNA链和未修饰反义RNA链。修饰正义RNA链的核苷酸序列与SEQ ID No.11(或SEQ ID NOs.13，15，17，或19)具有70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％或99％等)相似性，未修饰反义RNA链与SEQ ID No.2(或SEQ ID Nos.4，6，8，或10)具有70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％或99％等)相似性。在一些实施例中，siRNA可包括修饰正义RNA链和未修饰反义RNA链。修饰正义RNA链的核苷酸序列具有与SEQ ID No.11(或SEQ ID Nos.13，15，17或19)至少90％的相似性，未修饰反义RNA链具有与SEQ ID No.2(或SEQ ID Nos.4，6，8或10)至少90％的相似性。在一些实施例中，siRNA可包括具有如SEQ ID No.11(或SEQ ID Nos.13，15，17或19)所示核苷酸序列的修饰正义RNA链，以及具有如SEQ ID No.2(或SEQ ID Nos.4，6，8或10)所示核苷酸序列的未修饰反义RNA链。
在一些实施例中，仅可修饰反义RNA链的核苷酸。在一些实施例中，反义RNA链可包括约在25％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，反义RNA链可包括约在60％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，反义RNA链可包括约在80％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，反义RNA链可包括约在90％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，反义RNA链可包括在100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，siRNA可包括未修饰正义RNA链，其核苷酸序列具有与SEQ ID No.1(或SEQ ID Nos.3，5，7或9)相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％或99％等)，以及具有与SEQ ID No.12(或SEQ ID Nos.14，16，18或20)相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％或99％等)的核苷酸序列的修饰反义RNA链。在一些实施例中，siRNA可包括未修饰正义RNA链，其核苷酸序列与SEQ ID No.1(或SEQ ID Nos.3，5，7或9)具有至少90％的相似性，以及修饰反义RNA链，其核苷酸序列与SEQ ID No.12(或SEQ ID Nos.14，16，18或20)具有至少90％的相似性。在一些实施例中，siRNA可包括具有如SEQ ID No.1(或SEQ ID Nos.3，5，7或9)所示核苷酸序列的未修饰正义RNA链，以及具有如SEQ ID No.12(或SEQ ID Nos.14，16，18或20)所示核苷酸序列的修饰反义RNA链。
在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链的核苷酸均可修饰。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可包括约在25％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可包括约在60％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可包括约在80％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。正义RNA链和反义RNA链可包括约在90％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。在一些实施例中，正义RNA链和反义RNA链可包括在100％核苷酸位置处的修饰核苷酸。正义RNA链可包括分别具有与SEQ ID No.11(或SEQ ID Nos.13，15，17或19)相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％或99％等)的核苷酸序列的修饰RNA链，反义RNA链可包括分别具有与SEQ IDNo.12(或SEQ ID Nos.14，16，18或20)相似性70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％或99％等)的核苷酸序列的修饰RNA链。所述正义RNA链可包括分别具有与SEQ IDNo.11(或SEQ ID Nos.13，15，17或19)至少90％、95％或99％相似性的核苷酸序列的修饰RNA链，且反义RNA链可包括分别具有与SEQ ID No.12(或SEQ ID Nos.14，16，18或20)至少90％、95％或99％相似性的核苷酸序列的修饰RNA链。在一些实施例中，正义RNA链可包括具有如SEQ ID No.11(或SEQ ID Nos.13，15，17或19)所示核苷酸序列的修饰RNA链，反义RNA链可包括具有如SEQ ID No.12(或SEQ ID Nos.14，16，18或20)所示核苷酸序列的修饰RNA链。在一些实施例中，所述正义RNA链可包括具有SEQ ID No.11或SEQ ID No.13核苷酸序列的修饰RNA链。在一些实施例中，反义RNA链可包括具有SEQ ID No.12或SEQ ID No.14核苷酸序列的修饰RNA链。仅作为示例，siRNA可包括具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的修饰RNA链，反义RNA链可包括具有如SEQ ID No.12所示核苷酸序列的修饰RNA链。
在一些实施例中，药物组合物可进一步包括递送介质。在一些实施例中，递送介质可用于促进药剂向受试者输送和/或促进药剂摄取。例如，递送介质可用于递送受试者中的siRNA，以促进靶向Ugt2b1基因的siRNA的细胞摄取，从而保护siRNA的核苷酸免受核酸酶过早降解，减少或防止siRNA的潜在副作用，从而提高疾病(如糖尿病)的治疗效率。示例性递送介质可包括病毒载体(例如，腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体)、非病毒载体等。非病毒载体可包括基于聚合物的载体(例如，聚乙烯亚胺(PEI)、树状大分子、去端胶原等)、基于脂质的载体，或由聚合物和脂质组成的脂溶复合物(例如，硬脂酸修饰的PEI、胆固醇和脱氧胆酸修饰的PEI)，试图通过结合两者的有利特征来解决基于聚合物和基于脂质的载体的局限性。示例性基于脂质的载体可包括可电离脂质纳米颗粒(iLNP)(例如，实施例4中所述的LP171)、阳离子脂质等。例如，阳离子脂质可以是1，2-二乙氧基-3-三甲基丙烷铵(DOTAP)和1，2-二-O-十八烷基-3-三甲基丙烷铵(DOTMA)，它们通常与中性脂质如二乙氧基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇结合使用以提高转染效率。许多商业上可获得的基于脂质的载体可以包括脂质体胺(Lipofectamine)、低聚脂质体胺(Oligofectamine)、DharmaFECT、siP或T和TransIT-TKO，它们经常用于RNA传递。在一些实施例中，递送介质可包括外显体、多肽、碳纳米管、纳米载体(例如，非病毒纳米载体、金属纳米载体)等。在一些实施例中，可使用病毒载体或非病毒载体来递送siRNA。在一些实施例中，基于脂质的载体(例如LP171)可用于递送siRNA。应当注意的是，上述递送介质仅作为说明而提供，并不旨在限制。
在一些实施例中，药物组合物可包括药理学上可接受的载体，其包括例如稀释剂(例如，水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、柠檬酸、乙酸、磷酸、乳酸、乳酸钠、硫酸、氢氧化钠等)，pH调节剂或缓冲剂(例如，柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸钠等)和/或稳定剂(例如，焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸、巯基乙酸、硫代乳酸、单糖精、双糖、糖醇、氨基酸、非离子表面活性剂、人白蛋白等)等。在一些实施例中，药物组合物可进一步包括足量的用于制备等渗溶液的化合物(例如，盐、葡萄糖、甘露醇或甘油等)。在一些实施例中，药物组合物可包括用于增加药物组合物的营养和吸收率的佐剂(例如，葡萄糖、氨基酸、人白蛋白)。
该药物组合物可通过多种途径施用，包括口服途径或肠外途径(例如注射)。口服给药的制剂类型可包括例如，片剂、药丸、胶囊、粉末、颗粒、糖浆等。用于肠外给药的制剂类型可包括，例如，注射剂、外部制剂、栓剂等。
该药物组合物可包括治疗糖尿病的有效量的siRNA。siRNA的有效量可在约0.05mg/kg/天至1mg/kg/天、0.1mg/kg/天至1mg/kg/天、0.08mg/kg/天至0.8mg/kg/天、0.1mg/kg/天至0.6mg/kg/天、0.12mg/kg/天至0.4mg/kg/天、0.14mg/kg/天至0.35mg/kg/天、0.16mg/kg/天至0.32mg/kg/天、0.18mg/kg/天至0.3mg/kg/天，或0.2mg/千克/天至0.25mg/千克/天的范围内。在一些实施例中，siRNA的有效量可约为0.2mg/kg/天。在一些实施例中，可每天、每2天、每3天、每5天、每周等向受试者施用该药物组合物。
由于药物组合物的给药剂量可以因受试者的活性成分(例如siRNA)、给药途径、年龄、体重、状况等而不同，因此不能固定。仅作为说明，药物组合物的剂量可在约0.1mg/kg/天至2mg/kg/天、0.16mg/kg/天至1.6mg/kg/天、0.2mg/kg/天至1.2mg/kg/天、或0.24mg/kg/天至0.8mg/kg/天、0.28mg/kg/天至0.7mg/kg/天、0.32mg/kg/天至0.64mg/kg/天、0.36mg/kg/天至0.6mg/kg/天的范围内，或0.4mg/千克/天至0.5mg/千克/天。在一些实施例中，siRNA的有效量可约为0.4mg/kg/天。
根据本说明书的另一方面，提供了一种治疗患有与Ugt2b1基因表达相关疾病的受试者的方法。该方法可以包括向受试者施用短干扰RNA(siRNA)。siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链和反义RNA链可以是70％-100％互补的。关于治疗患有与Ugt2b1基因表达相关疾病的受试者的siRNA的更多描述可在本说明书的其他地方找到，这里不再重复。
根据本说明书的另一方面，提供了一种治疗患有糖尿病的受试者的方法。该方法可以包括向受试者施用有效量的siRNA。siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是19到21个核苷酸。正义RNA链和反义RNA链可与Ugt2b1基因的一部分核苷酸序列70％-100％互补。siRNA的有效量可在约0.05mg/kg/天至1mg/kg/天、0.1mg/kg/天至1mg/kg/天、0.08mg/kg/天至0.8mg/kg/天、0.1mg/kg/天至0.6mg/kg/天、0.12mg/kg/天至0.4mg/kg/天、0.14mg/kg/天至0.35mg/kg/天、0.16mg/kg/天至0.32mg/kg/天、0.18mg/kg/天至0.3mg/kg/天，或0.2mg/千克/天至0.25mg/千克/天的范围内。关于治疗患有与Ugt2b1基因表达相关疾病的受试者的siRNA的更多描述可在本说明书的其他地方找到，这里不再重复。
根据本说明书的另一方面，提供了一种短干扰RNA(siRNA)分子。siRNA分子可包括上述siRNA和/或递送介质。另外或可选地，siRNA分子可包括上述药理学上可接受的载体(例如稳定剂、缓冲液等)。可通过全身给药和局部给药将siRNA分子引入受试者，无论是否带有可接受的载体。全身给药可包括静脉注射、腹腔注射、吸入、口服等。局部给药可包括皮下注射、玻璃体内给药、鞘内给药、肺内给药、肌肉内给药等。siRNA分子可以配制并用作例如用于口服给药的粉末、片剂、胶囊或酏剂、用于直肠给药的栓剂、无菌溶液、用于注射给药的悬浮液以及本领域已知的其他组合物。在一些实施例中，siRNA分子可以是冻干粉末，并且可以溶解于可注射给药(例如静脉注射)的溶剂(例如水、盐溶液)。
在一些实施例中，siRNA的有效量可在约0.05mg/kg/天至1mg/kg/天、0.1mg/kg/天至1mg/kg/天、0.08mg/kg/天至0.8mg/kg/天、0.1mg/kg/天至0.6mg/kg/天、0.12mg/kg/天至0.4mg/kg/天、0.14mg/kg/天至0.35mg/kg/天、0.16mg/kg/天至0.32mg/kg/天、0.18mg/kg/天至0.3mg/kg/天，或0.2mg/千克/天至0.25mg/千克/天的范围内。在一些实施例中，siRNA的有效量可约为0.2mg/kg/天。在一些实施例中，可每3天、5天、一周等向受试者施用该药物组合物。
根据本说明书的另一方面，提供了一种用于抑制Ugt2b1基因表达的抑制性RNA。抑制性RNA可包括siRNA。siRNA可包括双链RNA，包括具有15至25个Ugt2b1 mRNA碱基的正义RNA链和与15至25个Ugt2b1 mRNA碱基互补的反义RNA链。关于抑制Ugt2b1基因表达的抑制性RNA的更多描述可在本说明书的其他地方找到，这里不再重复。
根据本说明书的另一方面，提供了一种包括短干扰RNA(siRNA)分子的药物组合物。siRNA可用于减少Ugt2b1基因的表达。关于包括短干扰RNA(siRNA)分子的药物组合物的更多描述可在本说明书的其他地方找到，这里不再重复。
根据本说明书的另一方面，提供了包括短干扰RNA(siRNA)分子的组合物在制备用于治疗患有糖尿病的受试者的药物中的用途。siRNA可用于降低受试者的尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)水平。关于包括siRNA分子的组合物的更多描述可在本说明书的其他地方找到，这里不再重复。
根据本说明书的另一方面，提供了在用于治疗患有糖尿病的受试者的药物制剂中抑制Ugt2b1基因表达的短干扰RNA(siRNA)的用途。siRNA可包括正义RNA链和反义RNA链。正反义RNA链可以形成RNA双链。正义RNA链或反义RNA链的长度可以是19到21个核苷酸；并且正义RNA链和反义RNA链可以是70％-100％互补的。关于siRNA分子的更多描述可在本说明书的其他地方找到，这里不再重复。
根据以下示例进一步描述本发明，这些示例不应被解释为限制本说明书的范围。
表1
实施例
方法
ob/ob小鼠的治疗
将12只6周龄的ob/ob小鼠(购自中国南京大学模型动物研究中心)随机分为对照组(N＝4)和实验组(N＝8)。ob/ob小鼠是突变小鼠，由于负责产生瘦素的基因突变而过度进食，并变得极度肥胖。在第四周观察到ob/ob小鼠明显的高血糖。ob/ob小鼠的血糖水平在3-5个月后达到峰值，此时ob/ob小鼠的食物摄入量非常高，生长迅速。实验组的ob/ob小鼠每天腹腔注射胰高血糖素(300μg/kg，Sigma-Aldrich，St.Louis，密苏里州，美国)，持续14天。对照组中的ob/ob小鼠以同样的方式给予生理盐水。盐水处理的小鼠被用作对照。停止胰高血糖素和生理盐水给药后，对两组的ob/ob小鼠进行葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。
db/db小鼠的治疗
将6周龄的12只db/db小鼠(购自中国南京大学模型动物研究中心)随机分为对照组(N＝4)和实验组(N＝8)。db/db小鼠是基因突变小鼠，瘦素受体不能正常发挥作用。db/db小鼠极度肥胖，并有许多代谢缺陷(如贪食症、高血糖症、高胰岛素血症和不孕症)。实验组的db/db小鼠每日腹腔注射胰高血糖素受体(GCGR)拮抗剂II(500μg/kg，MerckMillip或e，马萨诸塞州，美国)，持续14天。对照组的db/db小鼠以同样的方式给予生理盐水。盐水处理的小鼠被用作对照。停止胰高血糖素和生理盐水给药后，对两组的db/db小鼠进行GTT和ITT。
GTT和ITT
四组小鼠隔夜禁食16-18小时，在干净的笼子里自由饮水。对于GTT，小鼠腹腔注射1.5g/kg体重的D-葡萄糖。在注射后0、15、30、60和120分钟，使用
主动血糖仪(RocheDiagnostics)在每只小鼠的尾端确定血糖。对于ITT，ob/ob和db/db小鼠腹腔注射胰岛素(
NovoN或disk，巴格斯韦德，丹麦)，剂量为3IU/kg。在注射后0、15、30、45、60、90、120、150和180分钟，使用
主动血糖仪在每只小鼠的尾端确定血糖。使用标准方法计算曲线下面积(AUC)。
下一代测序和数据分析
按照TrizolRNA分离程序，从每只小鼠的冷冻组织(如脂肪、肝脏和肌肉)中提取总RNA，以进行RNA测序。输入RNA的质量由安捷伦2100控制，仅使用RNA完整性编号(RIN)不小于7的样本。然后在IlluminaHiseq系统上以150bp配对末端读取模式对总RNA进行聚(A)阳性RNA测序。HISAT2(V2.1.0)根据Ensembl下载的小鼠基因组注释，将RNAseq读数与参考基因组对齐。通过Stringtie(V1.3.4)确定外显子模型每千碱基的片段数(FPKM)，并进行唯一的映射读取。使用DESeq2(V1.14.1)对实验组(即使用胰高血糖素和胰高血糖素受体拮抗剂II治疗的组)和对照组进行差异表达分析，基因计数矩阵从Stringtie获得，选项为'-e-B'。简单地说，使用DESsq2软件计算的P值小于0.05和padj值小于0.1的基因作为差异表达基因。为了生成热图、维恩图或其他图，使用R包中的“热图”、“VennDiagram”或“ggplot2”。
数据分析
所有数据均使用Ig或Pro软件(Wavemetrics，俄勒冈州，美国)进行分析。所有数据均以平均值±s.e.m表示。每项实验所用的小鼠数量已显示。使用Student's t检验对单一高斯分布数据集进行统计显著性评估，或使用曼-怀氏秩和检验(Mann-Whitney rank-sumtest)对非单一高斯分布数据集进行统计显著性评估。*、**和***的标签分别表示显著性小于0.05、0.01和0.001。
实施例1ob/ob小鼠和db/db小鼠的GTT和ITT结果
如上所述，对小鼠进行饲养和处理两周。ob/ob小鼠的GTT和ITT结果如图1和2所示。ob/ob小鼠的GTT和ITT结果如图1和2所示。用胰高血糖素治疗的ob/ob小鼠被称为ob/ob-胰高血糖素，用生理盐水治疗的ob/ob小鼠被称为ob/ob-生理盐水。如图1所示，ob/ob小鼠实验组的血糖水平高于对照组。具体而言，在注射后0分钟、15分钟、30分钟和120分钟，实验组的血糖水平显著高于对照组。结果表明，胰高血糖素处理的ob/ob小鼠的糖耐量比生理盐水处理的小鼠差。如图2所示，ob/ob小鼠实验组的血糖水平高于对照组。具体而言，在注射后45分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟，ob/ob小鼠实验组的血糖水平显著高于对照组。结果表明，胰高血糖素治疗的ob/ob小鼠的胰岛素耐受性比生理盐水治疗的小鼠差。ob/ob小鼠的GTT和ITT结果与提高血糖水平的胰高血糖素效应一致。
db/db小鼠的GTT和ITT结果如图3和4所示。图3和4是分别说明db/db小鼠的GTT结果和ITT结果的分析图。用GCGR拮抗剂II治疗的db/db小鼠被称为db/db-GCGR拮抗剂II，用生理盐水治疗的db/db小鼠被称为db/db-生理盐水。如图3所示，db/db小鼠实验组的血糖水平低于对照组。具体而言，在注射后0分钟和120分钟，实验组的血糖水平显著低于对照组。结果表明，GCGR拮抗剂II治疗的db/db小鼠的糖耐量优于生理盐水治疗的db/db小鼠。如图4所示，db/db小鼠实验组的血糖水平低于对照组。具体而言，注射后30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟，实验组db/db小鼠的血糖水平显著低于对照组。结果表明，GCGR拮抗剂II治疗的db/db小鼠的胰岛素耐受性优于生理盐水治疗的db/db小鼠。db/db小鼠的GTT和ITT结果与GCGR拮抗剂II降低血糖水平的效果一致。
实施例2确定siRNA治疗的目标基因
对从四组中提取的脂肪、肝脏和肌肉等冷冻组织进行RNA测序，其中用胰高血糖素治疗的ob/ob小鼠和用生理盐水治疗的db/db小鼠出现糖尿病发作和胰岛素抵抗，用生理盐水处理的ob/ob小鼠和用GCGR拮抗剂II处理的db/db小鼠没有糖尿病发作。根据RNA测序结果，发现糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠的基因表达变化不同。图5是维恩图，分别显示了三种不同组织中ob/ob小鼠和db/db小鼠之间差异表达基因的重叠数量。如图5所示，db/db小鼠在脂肪、肝脏和肌肉中的差异表达基因计数分别为1930、1786和814。ob/ob小鼠在脂肪、肝脏和肌肉中的差异表达基因计数分别为248、122和663。如本文所用，db/db小鼠或ob/ob小鼠的差异表达基因是指与db/db小鼠或ob/ob小鼠的对照组相比，db/db小鼠或ob/ob小鼠的实验组中表达发生变化的基因。ob/ob小鼠和db/db小鼠在三种组织中的差异表达基因重叠数分别为81、33和55，表明这些基因在db/db小鼠和ob/ob小鼠之间的表达发生了变化，进一步表明这些变化的基因与糖尿病代谢物有关。
为了进一步研究这些重叠基因的表达变化(例如，改善或抑制)，确定了这些重叠基因的表达倍数变化。图6是示出这些重叠基因在小鼠三个不同组织中的表达倍数变化分布的热图。在重叠基因中，需要几个在ob/ob小鼠和db/db小鼠中具有相反表达倍数变化的基因，其中一个目标基因Ugt2b1在ob/ob小鼠中具有增加的表达倍数变化，而在db/db小鼠中具有减少的表达倍数变化，被选择用于siRNA治疗。治疗后db/db和ob/ob小鼠中Ugt2b1基因的表达变化如表2所示。
表2
在表2中，BaseMean指的是对照组(例如，用盐水处理的小鼠)中Ugt2b1基因表达的平均值，FoldChange指的是实验组小鼠在治疗后与对照组相比Ugt2b1基因表达的变化。Log2FoldChange大于0表明实验组与对照组相比Ugt2b1基因表达增加。Log2FoldChange小于0表明实验组与对照组相比Ugt2b1基因表达降低。FoldChange通过实验组Ugt2b1基因表达的变化与对照组的变化来确定。lfcSE是log2FoldChange标准差。p值小于0.05，表明治疗前后基因表达存在显著差异。总之，由于Ugt2b1基因的表达与小鼠的血糖水平呈正相关，因此Ugt2b1基因与血糖调节途径相关。Ugt2b1基因是一个有效且适合siRNA的靶点。
实施例3细胞中不同siRNA的处理
设计了5个siRNA，分别命名为siRNA248、siRNA1019、siRNA1253、siRNA1864和siRNA2082，用于沉默Ugt2b1基因。对5个siRNA进行化学修饰。siRNA的修饰核苷酸包括O-甲基修饰核苷酸、氟修饰核苷酸、硫代磷酸修饰核苷酸。siRNA248的修饰正义RNA链和修饰反义RNA链分别具有SEQ ID NOs.17和18的核苷酸序列。siRNA1019的修饰正义RNA链和修饰反义RNA链分别具有SEQ ID NOs.19和20的核苷酸序列。siRNA1253的修饰正义RNA链和修饰反义RNA链分别具有SEQ ID NOs.13和14的核苷酸序列。siRNA1864的修饰正义RNA链和修饰反义RNA链分别具有SEQ ID NOs.11和12的核苷酸序列。siRNA2082的修饰正义RNA链和修饰反义RNA链分别具有SEQ ID NOs.15和16的核苷酸序列。检测5个siRNA以确定抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6上Ugt2b1基因表达的效果。
小鼠肝癌细胞的Hepa1-6在6孔培养皿中培养，并分别转染5个siRNA，干扰siRNA荧光素酶转染作为阴性对照。通过使用Lipofectamine2000试剂将siRNA转染到6孔板中，每孔添加0.5-1μg的siRNA。然后在下一步之前将细胞培养过夜(12小时)。收集转染细胞，提取RNA进行进一步RT-PCR。使用两对Ugt2b1基因引物和一对参考基因36B4引物，进行RT-PCR以确定经5个siRNA处理的Ugt2b1基因和参考基因36B4的相对表达。Ugt2b1基因的两对引物分别具有SEQ ID NOs.21和22的核苷酸序列以及SEQ ID NOs.23和24的核苷酸序列。参考基因36B4的一对引物的核苷酸序列为SEQ ID NOs.25和26。
图7A是示出对照样品和经5个siRNA处理的样品中参考基因36B4的CT值的分析图。从图7a中看出，用siRNA1019和siRNA2082处理的样品的CT值偏离未用siRNA处理的对照样品的CT值。siRNA248、siRNA1253和siRNA1864基本上不影响对照基因的表达。图7B是图示对照样品和经5个siRNA处理的样品中Ugt2b1基因的相对表达的分析图。如图7所示，除了siRNA248外，siRNA1019、siRNA1253、siRNA1864和siRNA2082抑制Ugt2b1基因的表达。因此，siRNA1253和siRNA1864有效抑制Ugt2b1基因的表达，而不影响参考基因36B4的表达。
实施例4小鼠中siRNA的治疗
选择siRNA1864在db/db小鼠中进行试验。将6周龄的18只db/db小鼠平均分为3组，即第一组、第二组和第三组。第一组给予生理盐水作为空白对照。第二组用干扰的siRNA荧光素酶作为阴性对照。第三组施用siRNA-1864。通过脂质载体LP171向第三组的db/db小鼠静脉注射siRNA。所有小鼠均被饲养4周。每5天给药一次，每次1mg/kg生理盐水溶液、乱序siRNA荧光素酶和siRNA-1864。检测血糖水平，每两周进行一次GTT。实验4周后，取每只小鼠的肝组织提取总RNA，检测siRNA-1864的沉默效率。每只小鼠的组织样本分别测试三次，以避免实验误差。
图8是说明对照db/db小鼠和用siRNA-1864治疗的db/db小鼠中Ugt2b1基因相对表达的分析图。如图8所示，与两个对照组相比，siRNA-1864显著抑制了db/db小鼠肝脏中Ugt2b1的RNA表达水平。
图9-10是在对照db/db小鼠和用siRNA-1864治疗的db/db小鼠中，用GTT测试静息血糖(以G0表示)和2小时负荷后血糖水平(以G120表示)的分析图。在第六周实验开始时，三组小鼠的血糖水平几乎没有差异。治疗后，与两个对照组相比，用siRNA-1864治疗的db/db小鼠的静息血糖水平显著降低。因此，针对Ugt2b1基因的siRNA-1864可显著抑制Ugt2b1的RNA表达水平，并有效降低db/db小鼠的血糖水平。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于阅读此申请后的本领域的普通技术人员来说，上述发明披露仅作为示例，并不构成对本说明书的限制。虽然此处并未明确说明，但本领域的普通技术人员可以会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。例如，“一个实施例”、“一实施例”、和“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特性。因此，应当强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或以上提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一种或以上实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
此外，本领域的普通技术人员可以理解，本说明书的各方面可以通过若干具有可专利性的种类或情况进行说明和描述，包括任何新的和有用的过程、机器、产品或物质的组合，或对其任何新的和有用的改进。因此，本说明书的各个方面可以完全由硬件、软件(包括固件、驻留软件、微代码等)或结合软件和硬件实现来实现，它们在本文中通常被称为“模块”、“单元”、“组件”、“设备”或“系统”此外，本说明书的各个方面可以采取在一个或以上计算机可读介质中包含计算机可读程序代码的计算机程序产品的形式。
此外，除非权利要求中明确说明，本说明书所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本说明书流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本说明书实施例实质和范围的修正和等价组合。例如，虽然以上所描述的系统组件可以通过硬件设备实现，但是也可以只通过软件的解决方案得以实现，如在现有的服务器或移动设备上安装所描述的系统。
类似地，应当理解，在本说明书实施例的前述描述中，有时在单个实施例、图或其描述中将各种特征组合在一起，以简化本说明书，帮助理解一个或以上不同实施例。然而，本说明书的该方法不应被解释为反映所声称的待扫描对象物质需要比每个权利要求中明确记载的更多特征的意图。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
序列表
<110> 北京大学
<120> 一种siRNA、药物组合物以及使用其治疗糖尿病的方法
<141> 2022-05-12
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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tacatctctg aatcttctta ctcttaagca aagtattata ccactttaga atgtggtcag 2160
tgatttaaag gtgtttaggt aactcataaa agagaattta tgctctcttc aagaacatat 2220
agtaaatgcc agagacgtgt tgaacagcta aagaaataaa gaatcaatat cttcactaaa 2280
tagaaattgt attctacttg gaaacattat agtgatgaag agatgttata tacactgtga 2340
caaacgttat acattgttat attagataaa cagataagtt gaagatatat ccaacagaga 2400
tgagatgtaa tgtcctagaa tccttgtgaa gttacaatga cctagccaat gtacagggtt 2460
agattaatga atgaaaagaa gagaggaaaa atagaaaatt gaaacaacca ttgaaagaat 2520
gacagactta gataagcagg acgatgacat ggcaggcagg agtttttgga cagcttcatg 2580
tatgcatgtt ccacacatgg ctctctttta acctttccac ttccttggag tctttctacc 2640
cttaggttct gcagggattt attttttgtc tttgtagttt ccacatgcaa aagaaaacaa 2700
cacttatctt tctgtttctg gcttattgat taatctcctg tcctctaaac aatagctatt 2760
ttcctaaatt atttaataat aataacattt ttctatctga gtaaaacaca attatgtata 2820
tttaccaaca ctttgataca cattgatcac ttgaagaata tctaagctaa tcctatatag 2880
gggaattttg aataatgatg taataaacat tattatgtag atttttcact tgcaattatt 2940
tccttcagat atcaccaaag agtggcatag gttaactgta tgtaacacat taatgttatt 3000
tatatcaaga cgcttattta tgtattttat ctaattttac atttccaaat atgataaatg 3060
cataaatgtt caatttccat attatctgta ggagcatttt tatagtacat acatttttgt 3120
gacattcatg ataagtggat tatgatggaa tattgatata ttttgaattt atttttttaa 3180
tagctgacat tattgaaaga ttttcagata attgtaagct atttaaatct gagggaacaa 3240
ctactttgga tcatttgcct aagttaattg aattcttatt tcttctgatg ttagtttgtt 3300
tttttaatta gcatactctc ttaaaaattt atgaatatta cacaactctt tagagagtct 3360
cttcattttg atagattttt ttgttcttca taagctttta ctataaggta ctcctatttt 3420
tcaattccca aattactccc aatgctactg tggttattca atacattact gctttttatt 3480
ctatgtcatg gagtttctct tcttttttcc ctatttttat gtagtagaaa cacattactt 3540
ttatttagaa tgtactaaag ataatttctt ttttttcaat gtgagaatac ataatttttt 3600
caattaatta atttatttat gccccaaatg ttgcctacat cgtggtcccc ctcttagagt 3660
tcttctctat ccctcatctc cctctatctc tccttcccta catttcttct tcttttctat 3720
tccctccttt gctgctcgtc cttctcattt ctctcaaaga aaccacaaaa aagaaaatca 3780
aagaaatgaa cttaaaaaaa taagaccaaa aatattccag caaaacgaaa ggaaagaaaa 3840
agcacacata agatttaata taaataaata aataaataaa taaataaata aataaaaaca 3900
tggcatttat tttaggtggc taactattcc tgggcttggg acctcctctg gtgtatgatt 3960
gatttaccca gtcactactg gggaaagctg gttttcccct ttgttatcag ataccacttg 4020
caaatagctt cttagttaga agtggaagtc catgaacatt ttctattctg tgcgcaggaa 4080
cttcatctgc cttgaacctg ggcaggtctt agacatgctg ctacagtctc tgtgagttta 4140
tatgagcatc agtcttatta tgcctggtag accctgggat gtcattcatc ccctctggat 4200
cttataaact ttctccctcc tactcatgat ggtttgaaaa tacctcctaa tgaaactcta 4260
aatttcaata actctactga caataatttt ttactctaat tttcttatgt tggtaaattg 4320
tactatagca caaatgtact ctccatgaac acatgactgc tgaggcaatg gatacactgg 4380
tctcactaaa ataattccag taattacatt atttcctctg gtaatgtttg tctcagttcc 4440
ttagacagtg cttcccaggc agccattaat ttgtgatgtc acaactgtct tcataggaaa 4500
tggaagaatt tgttcagagc tctggagaac atggtgtggt ggtgttttct ctgggatcaa 4560
tggttaaaaa cattaaagaa gaaaaggcca atgtagttgc ttctgctctt gcccagattc 4620
cacagaaggt aacataaaga gttcactggg tggacaaatg tattgtaagt ctattgaact 4680
ctgaaaggat tgcagtagga aaaactgctg tgaaatataa agtaaggggt tctttcctat 4740
gaatctcaaa caccacatta aaaagaaaag aatgaattgc agaagataaa atattagtct 4800
ggttctgatt gacattataa cctgaaggat cacacttaga tccagcatgg ttgtgcatac 4860
ctgacctgtt ggagcttaaa gagctgaggt aggtcttttt cttcatattt acaaccagtt 4920
tacacttcat gttgattccc aggcttttct gagtcattca gtgtgtcagt gtctcaaaag 4980
gagagaagta aaagaaagaa aggatggaag gaaggagaaa cagaagggag atgtacagtt 5040
atgaggaata ttatgctgag gctggaaagg tgcctcagtg atgcattaag aacacaggct 5100
gctcttccag aggaactgga cttgattgct aggacttaca tagtagctca taagtatccc 5160
caactcaatt gccagggaat ctcatgtgtt cttcatgccc cagacagaac agtcacagtg 5220
catgcactga attacatgca ggcaaaagat catatacata aaatgaaaca aaaatatctg 5280
taaagaaaga ggaaaatatc ttcttgccag tgactgatgt aggaaaacat aagagaaaag 5340
ataaaaaaaa taggtgctga ctctgcagtg aactcaggat tataaaatta tgaactcatc 5400
aacaggaact atgcttctag cacatcagat aaacatgttt ttctggatgg tgaaagaggc 5460
tgtaatttaa gatggagtct tatgtaagca aggacagtgt gggaagaatc cagcagctcc 5520
caacgtcata aactctattg ttgaattact tcctaaaagc agaagtcttt tgatgtttgt 5580
aaactacatt tactctatta cttgatactg ataccgccta ttgtggagat aattttttat 5640
cttacaaaac acaaagcata cagaaagtaa agactgacag ttattattcc agtttgtgaa 5700
acttccttgt acgttagaac tcagtttgat actagacatg aaatgtattc aggacaattc 5760
aaagcatatt ttcaattttc ctattgacaa ttgtttcttt tttgtttttg tttttgtttt 5820
tgagacaatt tttcatggac agtcgttaat agactttatc tgaaatgaag catacttgct 5880
agtaagaaag aaattatttt tagaaatggg aaattatatc atggtatatt atgaatcaaa 5940
ataaacctaa ttataatgaa tagctgaaag aacacggaaa tataggtaaa actatgtggc 6000
tatgatttta aaagatgcaa tattgagatt atatgtaata tttacatata tcctatatat 6060
aggattatat atgaaatata cataatcaca taatcataaa atattactaa tttaacactg 6120
ttttcccagt aaggattata ttaactctct aaaaatgtca tgtatacaag aatttgtcgt 6180
taattatcag atatataaaa attgtaacac agaagtggat gctcacagtc agctcttgga 6240
tggatcacag ggctcccaat ggaggagcta gagaaagtat ccaaggagct aaagggatct 6300
gcaaccctat agatggaaca acattatgaa ctaaccagta ccccagagct cttgactcta 6360
gctgcatatg tatcgaaaga tgacctagtc ggccatcact ggaaagagag gcccattgga 6420
cttgcaaact ttatatgccc cagtacaggg gaacaccagg gccaaaaagg gggagtgggt 6480
gggtagggga gtggggggcg gtatggggga cttttgggat agcattggaa atgtaaatga 6540
ggaaaatacc taataaaaaa ttaaaaaaac agaaatttta aaaaatgtat aattaaatgg 6600
catgctcaag ttattaggaa gccatgtata gaaaatgtat tatttatttc agtcttttaa 6660
tatctcatac tagtttagat ttcccttcta ttaaatttta tagtccatca tctggataat 6720
gttcaactga gtaatctcaa ttctctagaa tcaaaatatg ccaaagcctt ggatttcttt 6780
aattaaataa ggtagtgtct gtgtgtaaca ggttctgtgg agatttgatg gtaagaaacc 6840
agacacctta ggatccaaca ctcggctcta caagtggatc ccccagaatg accttcttgg 6900
taaggcaaag ttccactaca gctttggggc tatagtaata tacttatttg agaacagccc 6960
ccttctgagc cttcatattc cccctgtctt taatattatg atcaataatt atgtaaaact 7020
tcttctcact gcaggtcatc caaaaaccaa agcttttata gctcatggtg gaaccaatgg 7080
catctatgag gcgatctacc atggcattcc tattgttggt attcccttgt ttggggatca 7140
acctgataat attaaccaca tagtagccaa gggagcagct gttagagtgg actttgatac 7200
aatgtcaact acagaccttc tcactgcctt gaagactgtc attaatgacc cttcgtgagt 7260
ctatttgttg tttgtttcct tgtttgaagt tgttttggtt ttttttaagg tttttttttc 7320
ttttcttttc ttttttgttt tgtactatgt aaccacaaga ccagccaata actgatatag 7380
gtctgcttgc ttctgtctcc tgagtgctag aattaaaact atgtgcattc acgcttgatg 7440
gtgaataact attcctttga aaatattgct agattcacaa catcagattg atttttatcc 7500
tatttgaagg agaataattt tgaataactt tgtgatattg catgtctgaa atatgtgctt 7560
actttaacaa taaagatacc ttgaatttaa gtttcaataa atgagacatg ataagtctta 7620
aactattcta tatacataaa taatatcaca aatatatgtc tattggtaac aaggacacta 7680
tttcaagata gaatgtacat agtattcatg aaccatgatc ttaaatgaaa agttaaacat 7740
ttacccatat tttctgaagt tataaaactt ttggtaaaac tttaatttct ataatgatat 7800
gtgatattgc ataaccagta ctgaagaaat gagagagagt attaaattat taccataccc 7860
agagaacact gttggtagtt tcaaggtatt ccaatagaca aatgtaccta atgagaatat 7920
ccagaggcaa aataacagga gaaagtgcac ctggttcttc catacacagt ctcctagtcc 7980
aggaacacaa ttacattgct ttccatccag tcagaagtct gctggaaatt ctgttcaagg 8040
aagaataata acttagcaag tgttttcaaa acatgaatct gattataaaa agaaattagg 8100
aaacagagat agaagagaag aggagaaacc aaaactagag aggagatatc cagcatgaga 8160
tatgaccctg tagagtttaa aagaattcag tgtccacttc ttttcttaaa acttacacac 8220
acatacacac acacacacac acacacacac acacactttc tcttgccaat gtttgaaata 8280
ttgctcaact tcaaattaaa aataagtatt ctatggggaa taaagcaaaa ataagccaag 8340
tgtacctgag gagctggtat acaaggtaag ctcattagtt ggaggtaaat tcaggacttc 8400
attaagacca gtgtcaacta cacaccaagt tcaaaaaaaa acctgtacta aacaagactg 8460
tttcactgac ttccctgtca ctcaactgtc ctccctatca cctcataaaa catagtactt 8520
gtgtgggaag tttatgccat tcattttgag actcttgtgg gacttttccc caaaccaata 8580
aatgttaggg aagtcgacaa attagcttta attttagttg catgcattgt cctttcagct 8640
ataaagagaa tgccatgaga ttatccagaa tccaccatga ccagccaatg aagcccttgg 8700
accgagctgt cttctggatc gagtatgtca tgcgcaacaa gggagccaag caccttcgcc 8760
cagctctgca tgaccttacc tggttccagt accactctct ggatgtgatt gggttcctat 8820
tggtctgtgt ggtagctgtg gtattcatca ttgcaaaatg ttgcctcttt tgttgccata 8880
agactgctaa catgggaaag aagaaaaaag agtagcttca tgaaggctga agcagagagt 8940
cctgagagat gagcctctgc cagctgcttc cagcagaaac ctgttgtctg tcccaggtgc 9000
cttccctctg aaacaagaca gggtcaggac ttcattaaag atagctctca tagatgcact 9060
atatgttgaa tgcacgtaag gatttatgca agctatacac tcagagctct agaagcaaaa 9120
ttgtgtgttc agtttagaat gttttaatgt aaatgaggaa ctatacccaa caacaatcac 9180
tgaggttact gtagttcaca aaatttgcat aggcataaag cctttgaaaa acctctctaa 9240
atattagtta attttttatg ctctgtcttc atttaatgaa cttatttttc ttcccttcct 9300
tttttcttct ctttcatttt tttttgtatt gctcataaat aatagcgttc aggtacagaa 9360
catttgaaat agactcactt ttccatcaat ataaggaaag ccattgtttc tggttattaa 9420
ttgggtacag caaacttcca acaaatattt cctaaagggc ctgtggtgga ggctactctc 9480
cttcaatcag aagccttttt cagacactaa tcttcaagca tttactctta ctgctcctga 9540
cataaattcc agtacttggg agttcttagg cttggcaaga ttattgattt attttccttc 9600
ttatctctta ctcacaactg acctgaacac tgtcattctc attctgcctt ttgaagtaga 9660
tttaagctgc caaatgtccc attctctctc gctttgaaag tacacatcca agagaagatt 9720
atctttttaa gtcataccat cacctagctc atgttatatt tcgtatctga aatatccccc 9780
acagacacac aatgtacttt gctgattttg tttaactcat tcatacagaa tttcttacct 9840
tgattcaata aaatgttaaa atctt 9865
Claims (21)
1.一种治疗患有糖尿病的受试者的方法，包括向所述受试者施用包含药剂的药物组合物，其中所述药剂用于降低受试者中的尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药剂用于通过抑制Ugt2b1基因的表达来降低UGT水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述药剂是抑制性RNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抑制性RNA是短干扰RNA(siRNA)。
5.根据权利要求4所述的方法，所述siRNA包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链，其中：
所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度为15至25个核苷酸；以及
所述正义RNA链和所述反义RNA链的70％-100％是互补的。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述siRNA包括正义RNA链和反义RNA链，其中：
所述正义RNA链具有与SEQ ID No.1至少80％相似性的核苷酸序列，所述反义RNA链具有与SEQ ID No.2至少80％相似性的核苷酸序列；或
所述正义RNA链具有与SEQ ID No.3至少80％相似性的核苷酸序列，所述反义RNA链具有与SEQ ID No.4至少80％相似性的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：
5'-GGUUACUAGUCAAA-3'
SEQ ID No.2：
5'-UUUGUGAACUACAGUAACCUC-3'
SEQ ID No.3：
5'-GGACUUUUGUAUGCA-3'
SEQ ID No.4：
5'-UGACAUUGUAUCAAAGUCCAC-3'
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述正义RNA链具有SEQ ID No.1的核苷酸序列，且所述反义RNA链具有SEQ ID No.2的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述正义RNA链具有SEQ ID No.3的核苷酸序列，且所述反义RNA链具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述正义RNA链和/或所述反义RNA链包括在约25％到100％核苷酸位置的修饰核苷酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述修饰核苷酸包括O-甲基修饰核苷酸、硫代磷酸修饰核苷酸或氟修饰核苷酸中的一种或以上。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述正义RNA链包括修饰RNA链，其具有SEQ ID No.11或SEQ ID No.13的核苷酸序列，其中“m”代表O-甲基修饰，“s”代表硫代磷酸修饰，“f”代表氟修饰。
SEQ ID No.11:
5'-GmsGmsUmUmAfCmUfGfUfAmGmUmUmCmAmCmAmAmAm-3'
SEQ ID No.13：
5'-GmsGmsAmCmUfUmUfGfAfUmAmCmAmAmUmGmUmCmAm-3'
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述反义RNA链包括修饰RNA链，其具有SEQ ID No.12或SEQ ID No.14的核苷酸序列，其中“m”代表O-甲基修饰，“s”代表硫代磷酸修饰，“f”代表氟修饰。
SEQ ID No.12:
5'-UmsUfsUmGmUmGfAmAfCfUmAmCmAmGfUmAfAmCmCmsUmsCm-3'
SEQ ID No.14:
5'-UmsGfsAmCmAmUfUmGfUfAmUmCmAmAfAmGfUmCmCmsAmsCm-3'
13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述siRNA包括双链RNA，所述双链RNA包括具有15至25个Ugt2b1 mRNA碱基的正义RNA链和与15至25个Ugt2b1 mRNA碱基互补的反义RNA链。
14.一种治疗患有与Ugt2b1基因表达相关疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用短干扰RNA(siRNA)，其中所述siRNA包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链，其特征在于：
所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度为15至25个核苷酸；以及
所述正义RNA链和所述反义RNA链70％-100％是互补的。
15.一种治疗患有糖尿病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的siRNA，所述siRNA包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链，且其特征在于：
所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度为15至25个核苷酸；以及
所述正义RNA链或所述反义RNA链与Ugt2b1基因核苷酸序列的一部分70％-100％互补。
16.一种短干扰RNA(siRNA)分子，包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链，其特征在于：
所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度为15至25个核苷酸；以及
所述正义RNA链或所述反义RNA链与Ugt2b1基因核苷酸序列的一部分70％-100％互补。
17.一种用于抑制Ugt2b1基因表达的抑制性RNA，包含双链RNA，所述双链RNA包括具有15至25个Ugt2b1 mRNA碱基的正义RNA链和与15至25个Ugt2b1 mRNA碱基互补的反义RNA链。
18.一种包含短干扰RNA(siRNA)分子的药物组合物，所述短干扰RNA(siRNA)分子包含正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链，其特征在于：
所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度为15至25个核苷酸；
所述正义RNA链或所述反义RNA链与Ugt2b1基因核苷酸序列的一部分70％-100％互补；以及
所述siRNA用于减少Ugt2b1基因的表达。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成发夹结构。
20.一种组合物在治疗患有糖尿病的受试者的药物制剂中的应用，所述组合物包括短干扰RNA(siRNA)分子，所述siRNA用于降低受试者中尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)的水平。
21.一种抑制Ugt2b1基因表达的短干扰RNA(siRNA)在治疗糖尿病的药物制剂中的应用，所述siRNA包括正义RNA链和反义RNA链，所述正义RNA链和所述反义RNA链形成RNA双链，其特征在于：
所述正义RNA链或所述反义RNA链的长度为15至25个核苷酸；以及
所述正义RNA链和所述反义RNA链的70％-100％是互补的。
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