KR20240053627A - 안지오포이에틴-유사 3(angptl3) 단백질의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

안지오포이에틴-유사 3(angptl3) 단백질의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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동쉬 슈
펑청 패트릭 샤오
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상하이 아르고 바이오파마슈티칼 씨오., 엘티디.
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Abstract

안지오포이에틴-유사 3 (ANGPTL3) 유전자의 발현을 감소시키고 ANGPTL3 관련 질병 및 병태의 치료에 유용한 조성물 및 방법이 제공된다. 세포 및 대상체에서 ANGPTL3 발현을 감소시키는 데 사용할 수 있는 ANGPTL3 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제, ANGPTL3 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 포함하는 조성물, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) 단백질의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 부분적으로 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) 단백질 발현을 억제하는 데 사용할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
안지오포이에틴-유사 단백질 3(Angiopoietin-like protein 3, ANGPTL3)은 주로 간세포에서 발현되는 분비 단백질이다(Conklin et al. Identification of a mammalian angiopoietin-related protein expressed specifically in liver. Genomics 1999, 62:477-482). 이는 지단백질 리파아제(lipoprotein lipase, LPL)와 내피 리파아제(endothelial lipase, EL)의 억제제(inhibitor)이다. LPL및 EL의 억제를 통해 작용하는 ANGPTL3는 특히 근육과 지방 조직에서 트리글리세리드(triglycerides, TG)의 가수분해를 감소시킨다(Kersten S. Physiological regulation of lipoprotein lipase. Biochem Biophys Acta 2014; 1841:919-933. Shimamura et al. Angiopoietin-like protein3 regulates plasma HDL cholesterol through suppression of endothelial lipase. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27:366-372). 따라서 ANGPTL3의 억제는 LPL 및 EL 활성이 비억제되어, TG 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)이 감소한다. ANGPTL3의 억제는 또한 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C)의 감소로 이어지며, 이는 아마도 VLDL의 EL 매개 처리(EL-mediated processing)를 통해 가능한다(Adam, et al. Angiopoietin-like protein3 governs LDL-cholesterol levels through endothelial lipase-dependent VLDL clearance. J Lipid Res 2020; 61:1271-1286). 또한 스타틴 및 PCSK9 억제제와 같은 현재의 LDL-C 강하 요법(LDL-C lowering therapies)은 LDL-R 의존적이며, 잔류 LDL-R 활성이 낮거나 없는 환자에게는 효과적이지 않다는 점도 주목할 만한다. ANGPTL3 억제를 통한 LDL-C 강하는 LDL-R과 무관하므로, LDL-R 활성이 낮거나 없는 환자의 지질 관리를 위한 효과적인 치료법이 될 수 있다.
고지혈증은 고혈압, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 심장병, 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH) 등의 질병과 밀접한 관련이 있다. 연구에서 인간에서 ANGPTL3의 손실 기능 돌연변이가 유익한 효과가 나타났다. ANGPTL3 기능의 동형 접합성(Homozygous) 상실은 낮은 혈장 트리글리세리드, 고밀도 지단백(HDL) 콜레스테롤 및 LDL-C 수준을를 특징으로 하는 가족성 복합 고지혈증과 관상동맥 질환의 위험 감소를 유발한다(Romeo et el., Rare loss-of-function mutations in ANGPTL family members contribute to plasma triglyceride levels in humans., J. Clin. Invest., 2009, 119:70-79; Musunuru, et al., Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia., N Engl J Med, 2010, 363:2220-2227). ANGPTL3는 개발 중인 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, ASO), 및 siRNA를 포함하는 치료 모달리티(therapeutic modalities)를 고지혈증에 의해 발생하는 질병을 치료하기 위한 유망한 약물 표적으로 부상하고 있다. 특히 GalNAc에 결합된 siRNA는 안전하고, 효과적이며, 활성 지속 시간이 긴 것으로 나타났다. 따라서, 다양한 질병과 병태를 치료하기 위한 새로운 ANGPTL3 siRNA 제제가 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 일 측면에 따르면, 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(double-stranded ribonucleic acid, dsRNA) 제제가 제공되며, 상기 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 2 내지 18은 ANGPTL3 RNA 전사체에 대한 상보성 영역(region of complementarity)을 포함하고, 상기 상보성 영역은 표 1 내지 5 중 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 0, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드가 다른 적어도 15 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 표적 리간드(targeting ligand)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ANGPTL3 RNA 전사체에 대한 상보성 영역은 표 1 내지5 중 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 3 이하의 뉴클레오티드가 다른, 적어도 15, 16, 17, 18 또는 19 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 적어도 서열번호 235의 표적 영역 중 어느 하나에 대해 실질적으로 상보적이며 표 1 내지 5 중 어느 하나에 제공된다. 일부 실시양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 서열번호 235의 표적 영역 중 어느 하나에 대해 완전히 상보적이며 표 1 내지 5 중 어느 하나에 제공된다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 센스 가닥 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 서열은 적어도 dsRNA 제제 내의 안티센스 가닥 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 센스 가닥 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 서열은 dsRNA 제제 내의 안티센스 가닥 서열과 완전히 상보적이다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 안티센스 가닥 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 듀플렉스 서열(duplex sequence)로 규정된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II: 5'-z1uagaguauaaccuuccz2-3' 로 구성된다, 상기 z1 는 c, g, a 또는 u 중에서 선택되고, z2 는 뉴클레오티드 서열 IV이다. 특정 실시양태에서, z1 는 u이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV 는 길이가 0 내지 15 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV는 a, au, aa, ac, ag, auu, aua, auc, aug, auug, auuu, auua, auuc, auuuu, auuuug, auucuu, auucga, auuuuga, auuuugag, auuuugaga 또는 auuuugagacuucca 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV는 길이가 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV는 a, au, aa, ac, ag, auu, aua, auc, aug, auug, auuu, auua 또는 auuc 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II': 5'-z1uagaguauaaccuuccaz2'-3'로 구성된다, 상기 z1 는 c, g, a 또는 u 중에서 선택되고, z2' 는 뉴클레오티드 서열 IV'이다. 특정 실시양태에서, z1 는 u이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV' 는 길이가 0-15 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV'는 길이가 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 IV' 는 u, a, c, g, uu, ua, uc, ug, uug, uuu, uua 또는 uuc 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, dsRNA의 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III: 5'-z3ggaagguuauacucuaz4-3'로 구성되며, 상기 z3 는 뉴클레오티드 서열 V , z4 는 c, g, a 또는 u로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, z4 는 a이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 V 는 길이가 0 내지 15 뉴클레오티드 이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 V 는 u, au, uu, gu, cu, aau, uau, gau, cau, gaau, caau, aaau, uaau, aaaau, caaaau, ucaaaau, cucaaaau, ucucaaaau 또는 uggaagucucaaaau 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 V 는 길이가 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 V 는 u, au, uu, gu, cu, aau, uau, gau, cau, gaau, caau, aaau 또는 uaau 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서, dsRNA의 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III': 5'-z3'uggaagguuauacucuaz4-3'로 구성된다, 상기 z3' 는 뉴클레오티드 서열 V', z4 는 c, g, a 또는 u 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서 z4 는 a이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 V' 는 길이가 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 V' 는 a, u, g, c, aa, ua, ga, ca, gaa, caa, aaa 또는 uaa 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, z1 는 z4 에 상보적인 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, z2 는 z3 에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, z2' 는 z3' 에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNA의 안티센스 가닥은 전술한 바와 같이 뉴클레오티드 서열 II 또는 II' 로 구성되고, 센스 가닥은 적어도 15, 16, 17, 18 또는 19 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥에 상보성 영역을 포함하는 길이가 30 뉴클레오티드 이하이다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNA의 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III 으로 구성되고 dsRNA의 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II 로 구성되며, 상기 뉴클레오티드 서열 II 및 III 은 상술한 바와 같다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNA의 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III'로 구성되고 dsRNA의 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II'로 구성되며, 상기 뉴클레오티드 서열 II' 및 III'는 상술한 바와 같다.
일부 실시양태에서, dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 다음의 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나로부터 0, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드가 다른, 적어도 15 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
5'- uacaugaaaaacuugagaguc -3' (서열번호 139)
5'- uuagaguauaaccuuccauuc -3' (서열번호 158)
5'- uguuuuugaaauaugucauuc -3' (서열번호 120)
5'- uucauaaaaagacugaucaac -3' (서열번호 123)
5'- uuaguuuauauguaguucuuc -3' (서열번호 125)
5'- uguugaguucaagugacauac -3' (서열번호 129)
5'- uuuuugugauccaucuauucc -3' (서열번호 147)
5'- uauugaaguuuugugauccac -3' (서열번호 149)
5'- ugauuucccaaguaaaaagac -3' (서열번호 155)
5'- uuuuucuccacacucaucauc -3' (서열번호 156)
특정 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5'-gacucucaaguuuuucaugua-3' (서열번호 22)
5'- uacaugaaaaacuugagaguc -3' (서열번호 139)
5'- gaauggaagguuauacucuaa -3' (서열번호 41)
5'- uuagaguauaaccuuccauuc -3' (서열번호 158)
5'- gaaugacauauuucaaaaaca -3' (서열번호 3)
5'- uguuuuugaaauaugucauuc -3' (서열번호 120)
5'- guugaucagucuuuuuaugaa -3' (서열번호 6)
5'- uucauaaaaagacugaucaac -3' (서열번호 123)
5'- gaagaacuacauauaaacuaa -3' (서열번호 8)
5'- uuaguuuauauguaguucuuc -3' (서열번호 125)
5'- guaugucacuugaacucaaca -3' (서열번호 12)
5'- uguugaguucaagugacauac -3' (서열번호 129)
5'- ggaauagauggaucacaaaaa -3' (서열번호 30)
5'- uuuuugugauccaucuauucc -3' (서열번호 147)
5'- guggaucacaaaacuucaaua -3' (서열번호 32)
5'- uauugaaguuuugugauccac -3' (서열번호 149)
5'- gucuuuuuacuugggaaauca -3' (서열번호 38)
5'- ugauuucccaaguaaaaagac -3' (서열번호 155)
5'- gaugaugaguguggagaaaaa -3' (서열번호 39)
5'- uuuuucuccacacucaucauc -3' (서열번호 156)
일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 또는 실질적으로 전부는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 다음을 포함한다: 2'-O-메틸 뉴클레오티드(2'-O-methyl nucleotide), 2'-플루오로 뉴클레오티드(2'-Fluoro nucleotide), 2'-데옥시 뉴클레오티드(2'-deoxy nucleotide), 2'3'-세코 뉴클레오티드 유사체(2'3'-seco nucleotide mimic), 잠금 뉴클레오티드(locked nucleotide), 잠금 해제 핵산 뉴클레오티드(unlocked nucleic acid nucleotide, UNA), 글리콜 핵산 뉴클레오티드(glycol nucleic acid nucleotide, GNA), 2'-F-아라비노 뉴클레오티드(2'-F-Arabino nucleotid), 2'-메토옥시에틸 뉴클레오티드(2'-methoyxyethyl nucleotide), 비염기성(abasic) 뉴클레오티드, 리비톨(ribitol), 역위된(inverted) 뉴클레오티드, 역위된 비염기성 뉴클레오티드, 역위된 2'-OMe 뉴클레오티드(inverted 2'-Ome nucleotide), 역위된 2'-데옥시 뉴클레오티드(inverted 2'-deoxy nucleotide), 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 모폴리노 뉴클레오티드 및 3'-OMe 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기(5'-phosphorothioate group)를 포함하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테릴 유도체(cholesteryl derivative) 또는 도데카노산 비스데실아마이드 그룹(dodecanoic acid bisdecylamide group), 2'-아미노 변형 뉴클레오티드(2'-amino-modified nucleotide), 포스포라미다이트(phosphoramidite) 또는 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기에 연결된 말단 뉴클레오티드(non-natural base including nucleotide). 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 가이드 가닥(guide strand)의 5´ 끝(end)에 E-비닐포스포네이트(E-vinylphosphonate) 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 또는 실질적으로 전부는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 센스 가닥은 표 2-5 중 하나에 규정된 변형된 센스 가닥 서열이다. 일부 실시양태에서, 변형된 안티센스 가닥은 표 2-5 중 하나에 규정된 변형된 안티센스 가닥 서열이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적이거나 실질적으로 상보적이며, 상보성 영역은 길이가 16~23 뉴클레오티드 사이이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 19-21 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 각 가닥은 길이가 30 뉴클레오티드 이하이다. 일부 실시양태에서, 각 가닥은 길이가 25 뉴클레오티드 이하이다. 일부 실시양태에서, 각 가닥은 길이가 23 뉴클레오티드 이하이다. 일부 실시양태에서, 각 가닥은 길이가 21 뉴클레오티드 이하이다. 특정 실시양태에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하며, 하나 이상의 표적기(targeting group) 또는 연결기(linking group)를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적기 또는 연결기는 센스 가닥에 접합된다(conjugated). 일부 실시양태에서, 표적기 또는 연결기는 N-아세틸-갈락토사민(N-acetyl-galactosamine, GalNAc)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적기는 하기 구조를 갖는다:
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특정 실시양태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 접합된 표적기를 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-말단에 접합되는 표적기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에 하나의 역위된 비염기성 잔기(residue)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 3' 또는/및 5' 말단에 하나 또는 2개의 역위된 비염기성 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 두 개의 뭉툭한 끝(blunt end)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1 뉴클레오티드의 3' 돌출부(overhang)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2 뉴클레오티드의 3' 돌출부을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 AD00108, AD00108-1, AD00112, AD00112-1, AD00112-2, AD00133, AD00134, AD00135, AD00135-2, AD00136, AD00136-1, AD00142, AD00143, AD00143-2, AD00145 및 AD00146 으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스(duplex)를 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 AD00112, AD00112-1, AD00112-2, AD00135, AD00135-2, AD00136 및 AD00136-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스를 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 AD00112-1, AD00112-2, AD00135-2 및 AD00136-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스를 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 다음과 같이 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 변형을 포함한다.
5'- g*a*cucucaAgUuUuucaugu*a(GLO-0)-3' (서열번호 343)
5'- u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c -3' (서열번호 370)
5'- g*a*auggaaGgUuAuacucua*a(GLO-0)-3' (서열번호 347)
5'- u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c -3' (서열번호 374)
5'- g*a*augacaUaUuUcaaaaac*a(GLO-0)-3' (서열번호 349)
5'- u*G*uuuuUgaaaUaUgUcau*u*c -3' (서열번호 376)
5'- g*u*ugaucaGuCuUuuuauga*a (GLO-0)-3' (서열번호 350)
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5'- g*a*agaacuAcAuAuaaacua*a (GLO-0)-3' (서열번호 351)
5'- u*U*aguuUauauGuAgUucu*u*c -3' (서열번호 378)
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5'- u*U*uuugUgaucCaUcUauu*c*g -3' (서열번호 385)
5'- a*u*ggaucaCaAaAcuucaau*a (GLO-0)-3' (서열번호 359)
5'- u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*u -3' (서열번호 386)
5'- g*u*cuuuuuAcUuGggaaauc*a (GLO-0)-3' (서열번호 361)
5'- u*G*auuuCccaaGuAaAaag*a*c -3' (서열번호 388)
5'- c*a*ugaugaGuGuGgagaaaa*a (GLO-0)-3' (서열번호 362)
5'- u*U*uuucUccacAcUcAuca*u*g -3' (서열번호 389)
5'- (GLS-5)*(Invab)*gacucucaAgUuUuucaugua*(Invab) -3' (서열번호 397)
5'- u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c -3' (서열번호 424)
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5'- u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c -3' (서열번호 428)
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5'- u*U*cauaAaaagAcUgAuca*a*c -3' (서열번호 431)
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5'- u*G*uugaGuucaAgUgAcau*a*c -3' (서열번호 433)
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5'- u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c -3' (서열번호 617)
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5'- u*U*uuugUgaucCaUcUauu*c*g -3' (서열번호 623)
5'- (GLS-15)*(Invab)*guggaucaCaAaAcuucaaua*(Invab) -3' (서열번호 624)
5'- u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*u -3' (서열번호 625)
5'- (GLS-15)*(Invab)*gucuuuuuAcUuGggaaauca*(Invab) -3' (서열번호 626)
5'- u*G*auuuCccaaGuAaAaag*a*c -3' (서열번호 627)
5'- (GLS-15)*(Invab)*caugaugaGuGuGgagaaaaa*(Invab) -3' (서열번호 628)
5'- u*U*uuucUccacAcUcAuca*u*g -3' (서열번호 629).
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 측면의 임의의 실시양태를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 또한 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 키트, 용기, 팩, 디스펜서, 사전 충전된 주사기 또는 바이알에 포장된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 피하 투여를 위해 제형화되거나 정맥(IV) 투여를 위해 제형화된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 측면의 임의의 실시양태를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유류 세포, 선택적으로 인간 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (i) 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 측면의 임의의 실시양태 또는 본 발명의 전술한 조성물의 임의의 실시양태의 유효량을 포함하는 세포를 제조하는 단계. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 또한 다음을 포함한다: (ii) 제조된 세포를ANGPTL3 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지함으로써, 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 단계. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체(subject) 내에 있고 dsRNA 제제는 대상체에게 피하(subcutaneously) 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체 내에 있고 dsRNA 제제는 대상체에게 정맥 투여(IV administration)를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 또한 대상체에 dsRNA 제제를 투여한 후, ANGPTL3 유전자의 억제를 평가하는 것을 포함하며, 상기 평가를 위한 수단은 이하를 포함한다: (i) 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성을 결정하는 단계 및 (ii) 결정된 생리적 특성을 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성(baseline pre-treatment physiological characteristic) 및/또는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 대조군(control) 생리적 특성과 비교하는 단계, 상기 비교는 대상체에서 ANGPTL3 유전자 발현의 억제 유무 중 하나 이상을 나타내는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결정된 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준(serum lipid level), 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상의 감소는 대상체에서 AGNPTL3 유전자 발현의 감소를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상체에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술한 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 측면의 실시양태 또는 본 발명의 전술한 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 대상체에게 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, dsRNA 제제는 대상체에게 정맥 투여에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 또한 다음을 포함한다: dsRNA 제제의 투여에 따른 ANGPTL3 유전자의 억제를 평가하는 단계, 상기 평가는 이하를 포함한다: (i) 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성을 결정하는 단계 및 (ii) 결정된 생리적 특성을 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성 및/또는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 대조군 생리적 특성과 비교하는 단계, 상기 비교는 대상체에서 ANGPTL3 유전자 발현의 억제 유무 중 하나 이상을 나타내는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결정된 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상이다. 특정 실시양태에서, 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상의 감소는 대상체에서 AGNPTL3 유전자 발현의 감소를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, ANGPTL3 단백질의 존재와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: ANGPTL3 유전자 발현을 억제하기 위해, 본 발명의 전술한 임의의 dsRNA 제제 측면의 실시양태 또는 전술한 임의의 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 질병 또는 병태는 다음 중 하나 이상이다: 고지혈증(hyperlipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상(abnormal lipid and/or cholesterol metabolism), 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증(homozygous and heterozygous familial hypercholesterolemia), 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증(statin resistant hypercholesterolemia), 심장 대사 질환(cardiometabolic disease), 비만(obesity), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 제2형 당뇨병(type II diabetes mellitus), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis), 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease), 고중성지방혈증으로 인한 췌장염(pancreatitis caused by hypertriglyceridemia). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 또한 대상체에게 추가 치료 요법(additional therapeutic regimen)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 치료 요법은 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 대한 치료제(treatment)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가 치료 요법은 이하를 포함한다: 본 발명의 하나 이상의 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계, 비-ANGPTL3 dsRNA 치료제를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체의 행동 수정 단계. 일부 실시양태에서, 비-ANGPTL3 dsRNA 치료제는 다음 중 하나 이상이다: (i) 스타틴(statin), (ii) 항체(antibody), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, ASO) 및 PCSK9 발현을 감소시킬 수 있는 PCSK9 siRNA 분자 중 하나 이상, (iii) 대상체에서 지질 축적을 감소시킬 수 있는 치료제, 및 (iv) 대상체에서 콜레스테롤 수준 및/또는 축적을 감소시킬 수 있는 치료제. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 대상체에게 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, dsRNA 제제는 대상체에게 정맥 투여에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 또한 대상체에서 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 효능을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 치료의 효능을 결정하는 수단은 이하를 포함한다: (i) 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성을 결정하는 단계; 및 (ii) 결정된 생리적 특성을 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성과 비교하는 단계, 상기 비교는 대상체에 대한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 투여의 여부 및 효능의 수준 중 하나 이상을 나타내는 단계. 일부 실시양태에서, 결정된 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준 및 대상체의 간 내 지방량이다. 특정 실시양태에서, 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상의 감소는 대상체에게 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 투여가 효능이 있음을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 대상체 내의 치료 전 기준치인 ANGPTL3 단백질 수준과 비교하여 대상체 내의 ANGPTL3 단백질의 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 ANGPTL3 유전자 발현 수준을 감소시키기 위해, 본 발명의 전술한 임의의 dsRNA 제제 측면의 실시양태 또는 전술한 임의의 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 대상체에 피하 투여되거나 대상체에 정맥 투여에 의해 투여된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 대상체에서 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 대상체에서 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성과 비교하여 변경하는 방법이 제공된다, 상기 방법은 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 변경하기 위해, 본 발명의 전술한 임의의 dsRNA 제제 측면의 실시양태 또는 전술한 임의의 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함하는 방법. 일부 실시양태에서, dsRNA 제제는 대상체에 피하 투여되거나 대상체에 정맥 투여에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상술한 ANGPTL3 단백질의 존재와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 dsRNA 제제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 질병 또는 병태는 다음 중 하나 이상이다: 고지혈증, 고중성지방혈증, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상, 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증, 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증, 심장 대사 질환, 비만, 죽상 동맥경화증, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 관상 동맥 질환, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환, 고중성지방혈증으로 인한 췌장염.
본 발명의 다른 측면에 따르면, ANGPTL3 단백질의 발현을 억제하기 위한 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제(antisense polynucleotide agent)가 제공되며, 상기 제제는 10 내지 30 연속적인 뉴클레오티드(contiguous nucleotides)를 포함하고, 상기 연속적인 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 변형 뉴클레오티드이며, 상기 제제의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 235의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 영역(equivalent region)의 전체 길이에 걸쳐 약 80% 상보적(complementary)이다. 일부 실시양태에서, 상응하는 영역은 서열번호 235의 표적 영역 중 임의의 하나이고 상보적인 서열은 표 1 내지 5 중 하나에 제공된 서열이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 표 1 내지 5 중 하나에 제공된 안티센스 서열 중 하나를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 실시양태를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 또한 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료를 위한 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 키트, 용기, 팩, 디스펜서, 사전 충전된 주사기 또는 바이알에 포장된다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 피하 또는 정맥 투여를 위해 제형화된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 실시양태를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 포유류 세포, 선택적으로 인간 세포이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 실시양태의 유효량을 포함하는 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 또한 (ii) (i)에서 제조된 세포를 ANGPTL3 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지함으로써, 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상체에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 실시양태의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 ANGPTL3 단백질의 존재와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하기 위해, 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 또는 본 발명의 전술한 임의의 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질병 또는 병태는 다음 중 하나 이상이다: 고지혈증, 고중성지방혈증, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상, 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증, 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증, 심장 대사 질환, 비만, 죽상 동맥경화증, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 관상 동맥 질환, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환, 고중성지방혈증으로 인한 췌장염.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상체 내 치료 전 기준치인 ANGPTL3 단백질의 수준과 비교하여 대상체 내 ANGPTL3 단백질의 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 ANGPTL3 유전자 발현의 수준을 감소시키기 위해, 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 실시양태 또는 전술한 임의의 본 발명의 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 대상체에게 피하 또는 정맥 투여를 통해 투여된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하기 위한 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 제공되며, 상기 제제는 10 내지 30 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 연속 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 변형 뉴클레오티드이며, 상기 제제의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 235의 뉴클레오티드 서열과 상응하는 영역의 전체길이에 걸쳐 약 80% 또는 약 85% 상보적이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성과 비교하여 변경하는 방법이 제공된다, 상기 방법은 대상체에서 ANGPTL-3 질병 또는 병태의 생리적 특성을 변경하기 위해, 전술한 임의의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 실시양태 또는 전술한 임의의 본 발명의 조성물의 실시양태를 대상체에 유효량 투여하여 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 대상체에게 피하 또는 정맥 투여에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상이다.
서열에 대한 간략한 설명
서열번호(SEQ ID NOs): 1-117, 484-514는 표 1에 나타나 있으며 센스 가닥 서열이다.
서열번호: 118-234, 515-545는 표 1에 나타나 있으며 안티센스 가닥 서열이다.
서열번호 235는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) mRNA[NCBI 참조 서열: NM_014495.4]이다:
agaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgatcaagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggttttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccagagggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaatggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaatgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaataatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctatttaagattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataatactatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtgaacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaatatcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagaggactggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagtatgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatgtttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtctttaaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttatttgttaaaatatatactgtatacattttatatattttaacacttaatactatgaaaacaaataattgtaaaggaatcttgtcagattacagtaagaatgaacatatttgtggcatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatgctgtgattctaatacattcgtgtaggttttcaagtagaaataaacctcgtaacaagttactgaacgtttaaacagcctgacaagcatgtatatatgtttaaaattcaataaacaaagacccagtccctaaattatagaaatttaaattattcttgcatgtttatcgacatcacaacagatccctaaatccctaaatccctaaagattagatacaaattttttaccacagtatcacttgtcagaatttatttttaaatatgattttttaaaactgccagtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatatggtgacctacctttgtcaatacttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgtcacatatataaaagatatgtatgatctatgtgaatcctaagtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataaaggtaaaaataatctataattttcaggaccacagactaagctgtcgaaattaacgctgatttttttagggccagaataccaaaatggctcctctcttcccccaaaattggacaatttcaaatgcaaaataattcattatttaatatatgagttgcttcctctatttggtttcc.
서열번호 236 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 안지오포이에틴-유사 3(Angptl3), mRNA [NCBI 참조 서열: NM_013913.4]
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서열번호 237-336, 546-605는 표 2에 나타나 있으며, 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 및 티오인산염(thiophosphate): *으로 표시된다
서열번호 337-390은 표 3에 나타나 있다. 전달 분자(delivery molecule)는 각 센스 가닥의 3' 끝에 "GLX-__"로 표시된다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *으로 표시된다.
서열번호 391-444, 606-629는 표 4에 나타나 있다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *; 및 Invab = 역위된 비염기성 으로 표시된다.
서열번호 445-482는 표 5에 나타나 있다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *; 및 Invab = 역위된 비염기성 으로 표시된다.
서열번호 483은 예측된 마카카 파시큘라리스(Predicted Macaca fascicularis) 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3), mRNA [NCBI 참조 서열: XM_005543185.2]:
tacaatttcaaattacctattaagttagttgctcatttctttgatttcatttagcattgatgtaactcaatgtggaagaaggttacattcgtgcaagttaacatggcttaatgattaactatattcacctgccaaccttgccttttctgtggcaaatattggtatatatagagttaagaagtctaggtctgcttccagaagaacacagttccacgctgcttgaaattgaaaatcaggataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgaccaagacaattcatcatttgattctgtatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagactaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcactgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgcaactccagaacatccagaagtaacttcacttaaaagttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagactgtggaagaacaatataagcaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaatgactaatattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagctgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgattgtaccaccatttacaatagaggtgaacatataagtggcacgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttgtatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggtttcgggaggcttgatggagaattctggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattacgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatgtagttaagattactggcaatgtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcagctgtccagagagttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagaacaaaatctaagccagagcggagaagaggattatcctggaagtctcaaaatggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaatgaactgaggcaaatttaaaaggcaataaattaaacattaaactcattccaagttaatgtggtttaataatctggtattaaatccttaagagaaggcttgagaaatagatttttttatcttaaagtcactgtcaatttaagattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccatttacatttctcaatcaaaattcttacaacactatttgttttatattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcgcaatctaaattataatcaacaggtgaacttactaaataacttttctaaataaaaaacttagagactttaattttaaaagtcatcatatgagctaatatcacaattttcccagtttaaaaaactagttttcttgttaaaactctaaacttgactaaataaagaggactgataattatacagttcttaaatttgttgtaatattaatttcaaaactaaaaattgtcagcacagagtatgtgtaaaaatctgtaatataaatttttaaactgatgcctcattttgctacaaaataatctggagtaaatttttgataggatttatttatgaaacctaatgaagcaggattaaatactgtattaaaataggttcgctgtcttttaaacaaatggagatgatgattactaagtcacattgactttaatatgaggtatcactataccttaacatatttgttaaaacgtatactgtatacattttgtgtattttaatacttaatactatgaaaacaagtaattgtaaacgtatcttgtcagattacaataggaatgaacatattggtgacatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatgctgcgattccaatatattcatgtaggttttcaagcagaaataaaccttgtaacaagttactgactaaacagcctgacaagtatgtatatatgtttaaaattcaataaataaagacccagtcttctaaattataaaaatttaaattagtcttgcacaaattaaattattcatcacaaaagatgtattgttatttttaagtcatttaagccctaaatccctaaagattagatataaattttttttgccagagtataaattgtcagaatttatttttaaatatattttttaaaactaccagtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatacggtgacctacctttgtcaatatttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgttgcatatataaaagatatacacgatttatgtgaatcctatgtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataaaggtaaaaataatcca.
도 1은 원숭이 혈장 내 1일차(siRNA 투여 전)로 정규화된 ANG3의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 원숭이 혈장 내 1일차(siRNA 투여 전)로 정규화된 HDL의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 원숭이 혈장 내 1일차(siRNA 투여 전)로 정규화된 LDL의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 원숭이 혈장 내 1일차(siRNA 투여 전)로 정규화된 총 콜레스테롤(TC)의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 원숭이 혈장 내 1일차(siRNA 투여 전)로 정규화된 트리글리세리드(TG)의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 원숭이 혈장 내 기준선으로 정규화된 ANG3의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 원숭이 혈장 내 기준선(siRNA 투여 전)으로 정규화된 HDL의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 원숭이 혈장 내 기준선(siRNA 투여 전)으로 정규화된 LDL의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 원숭이 혈장 내 기준선(siRNA 투여 전)으로 정규화된 총 콜레스테롤(TC)의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 원숭이 혈장 내 기준선(siRNA 투여 전)으로 정규화된 트리글리세리드(TG)의 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.
상세한 설명
본 발명은 부분적으로, 예를 들어, 이중 가닥(ds) RNAi 제제를 포함하지만, 이에 국한되지 않고, 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) 유전자 발현을 억제할 수 있는 RNAi 제제를 포함한다. 본 발명은 부분적으로 ANGPTL3 RNAi 제제를 포함하는 조성물 및 그 조성물의 사용 방법도 포함한다. 본 발명에 개시된 ANGPTL3 RNAi 제제는 간세포(hepatocytes)를 포함한 세포에 전달하기 위해 전달 화합물에 부착될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 ds ANGPTL3 제제 및 전달 화합물(delivery compound)을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 전달 화합물은 GalNAc 함유 전달 화합물이다. 세포에 전달되는 ANGPTL3 RNAi 제제는 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하여, 해당 유전자의 ANGPTL3 단백질 산물(product)의 세포 내 활성을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 dsRNAi 제제는 ANGPTL3 관련 질병 및 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 세포 또는 대상체에서 ANGPTL3 발현을 감소시키는 것은 각각 세포 또는 대상체에서 ANGPTL3 발현과 관련된 질병 또는 병태를 치료한다. ANGPTL3 활성을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 질병 및 병태의 비제한적인 예는 다음과 같다: 고지혈증, 고중성지방혈증, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상, 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증, 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증, 심장 대사 질환, 비만, 죽상 경화증, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 관상 동맥 질환, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환, 고중성지방혈증으로 인한 췌장염 또는 ANGPTL3 단백질의 수준 및 활성을 낮추는 것이 의학적으로 유익한 기타 질환.
이하에서는 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하기 위한 ANGPTL3 단일 가닥(ssRNA) 및 dsRNA 제제를 포함하는 조성물의 제조 및 사용 방법과 ANGPTL3 유전자 발현에 의해 유발되거나 조절되는 질병 및 병태를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 대해 설명한다. "RNAi"라는 용어는 당업자에게도 알려져 있으며, "siRNA"로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "RNAi"라는 용어는 RNA를 구성하고 RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC) 경로를 통해 RNA 전사의 표적 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, RNAi 표적 영역(target region)은 1차 전사 산물(primary transcription product)의 RNA 처리(RNA processing) 산물인 메신저 RNA(mRNA)를 포함하여, 유전자 전사 중에 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속적인 부분을 지칭한다. 서열의 표적 부분은 적어도 해당 부분 또는 그 근처에서 RNAi 지시 절단(RNAi-directed cleavage)에 대한 기질(substrate)로 작용할 수 있을 만큼 충분히 길어야 한다. 표적 서열은 8-30 뉴클레오티드 길이(포함), 10-30 뉴클레오티드 길이(포함), 12-25 뉴클레오티드 길이(포함), 15-23 뉴클레오티드 길이(포함), 16-23 뉴클레오티드 길이(포함), 또는 18-23 뉴클레오티드 길이(포함)일 수 있고, 각 규정된 범위 내의 모든 짧은 길이를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적 서열은 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 표적 서열은 9 내지 26 뉴클레오티드 길이(포함)이고, 그 사이의 모든 하위 범위 및 정수를 포함한다. 예를 들어, 제한하려는 의도는 아니지만, 본 발명의 특정 실시양태에서 표적 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 뉴클레오티드 길이이며, 상기 서열은 ANGPTL3 유전자 RNA 전사체의 적어도 일부와 완전히 또는 적어도 실질적으로 상보적인 서열을 가진다. 본 발명의 일부 측면은 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 ANGPTL3 RNAi는 ANGPTL3 단백질의 발현을 억제한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "dsRNA 제제"는 서열 특정 방식으로 표적 mRNA의 메신저 RNA(mRNA) 전사체의 번역을 분해하거나 억제할 수 있는 RNA 또는 RNA 유사(예: 화학적 변형 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물을 의미한다. 특정 이론에 국한되기를 원하지는 않지만, 본 발명의 dsRNA 제제는 RNA 간섭 메커니즘(즉, 포유류 세포의 RNA 간섭 경로 기계(RNA 유도 침묵 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통한 RNA 간섭 유도) 또는 다른 메커니즘 또는 경로를 통해 작동할 수 있다. 식물, 무척추동물 및 척추동물 세포에서 유전자를 침묵시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다[예를 들어, (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485; Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363; Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309; and Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)], 각 공개는 본 명세서 전체에 참조로 통합되어 있다.] 당업자에게 공지된 유전자 침묵 절차(gene silencing procedures)는 본원에 제공된 개시와 함께 ANGPTL3의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 dsRNA 제제는 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 포함되며, 짧은 간섭 RNA(siRNA), RNAi 제제, 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 다이서(dicer) 기질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 설명된 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA와 적어도 부분적으로 상보적이다. 당업자는 표적 유전자 발현을 억제하기 위해 서로 다른 길이의 dsRNA 듀플렉스 구조(duplex structure)를 사용할 수 있음을 이해한다. 예를 들어, 19, 20, 21, 22, 및 23 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA는 RNA 간섭을 유도하는 데 효과적인 것으로 알려져 있다(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). 또한, 더 짧거나 더 긴 RNA 듀플렉스 구조도 역시 RNA 간섭을 유도하는 데 효과적이라는 것이 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서 ANGPTL3 dsRNA는 최소 21 nt 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있거나, 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 서열 중 하나에 기초하여 한쪽 또는 양쪽 끝에 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오티드를 뺀 더 짧은 듀플렉스를 갖는 것도 표 1 내지 5에 각각 규정된 dsRNA와 비교하여 효과적일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 표 1 내지 5의 하나 이상의 서열 중 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 부분 서열을 가질 수 있으며, 전체 서열을 포함하는 dsRNA에 의한 억제 수준과 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하로 ANGPTL3 유전자 발현 억제 능력이 다르며, 본 명세서에서는 "부모" 서열로도 지칭한다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 실시양태는 조성물 및/또는 대상체에게 투여되는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 예를 들어, 표 1 내지 5 중 어느 하나에 열거된 것과 같은 안티센스 가닥은 대상체에서 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 및/또는 ANGPTL3 유전자의 발현을 감소시키기 위하여 대상체에 투여되는 조성물 또는 조성물에 포함될 수 있다. 표 1 내지 5는 특정 ANGPTL3 dsRNA 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 코어 스트레치 염기 서열을 나타낸다. 본 발명의 특정 조성물에 포함될 수 있고/또는 특정 방법에서 투여될 수 있는 단일 가닥 안티센스 분자를 본 명세서에서는 "단일 가닥 안티센스 제제(single-strand antisense agent)" 또는 "안티센스 폴리뉴클레오티드 제제(antisense polynucleotide agent)"로 지칭한다. 본 발명의 특정 조성물에 포함될 수 있고/또는 특정 방법에 따라 투여될 수 있는 단일 가닥 센스 분자는 본 명세서에서 "단일 가닥 센스 제제(single-strand sense agent)" 또는 "센스 폴리뉴클레오티드 제제(sense polynucleotide agent)"로 지칭한다. "염기 서열(base sequence)"이라는 용어는 화학적 변형 또는 전달 화합물이 없는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 표 1에 나타난 센스 가닥 gaaagacuuuguccauaagaa (서열번호 2)는 표 3의 서열번호 337 및 표 4의 서열번호 391에 대한 염기 서열이며, 서열번호 337 및 서열번호 391은 그들의 화학적 변형 및 전달 화합물과 함께 나타난다. 본 명세서에 개시된 서열에는 식별자(identifier)가 할당될 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 센스 서열은 "센스 가닥 SS#" 으로 식별될 수 있고; 단일 가닥 안티센스 서열은 "안티센스 가닥 AS#" 및 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 듀플렉스는 "듀플렉스 AD#/AV#"로 식별될 수 있다.
표 1에는 센스 및 안티센스 가닥이 포함되어 있으며 표 1의 같은 줄(same line)에 센스 및 안티센스 가닥에서 형성된 듀플렉스의 식별번호를 제공한다. 센스 가닥 식별번호 69-117은 위치 1, 2, 3 및 21에 무작위 뉴클레오베이스(n)를 포함한다. 안티센스 가닥 식별번호 186-234는 위치(position) 1, 19, 20 및 21 에무작위 뉴클레오베이스(n)를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 안티센스 서열의 위치 1에 뉴클레오베이스 u 또는 뉴클레오베이스 a 를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 안티센스 서열의 위치 1에 뉴클레오베이스 u를 포함한다. 표 1에 나타난 서열에서 "n"은 뉴클레오베이스 a, u, c, g 및 t 중 어느 하나일 수 있으며, 센스 및 안티센스 가닥에 대해 독립적으로 선택될 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥에서 "n"의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 센스 가닥의 위치에 선택 및 포함된 뉴클레오베이스 "n"은 센스 가닥이 짝을 이루는 안티센스 가닥의 "n"과 동일한 뉴클레오베이스가 아니라, 일반적으로 반대 가닥의 매칭 위치에 있는 뉴클레오베이스 "n"과 상보적인 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 센스 가닥과 안티센스 가닥의 "매칭 위치"라는 용어는 두 가닥이 듀플렉스 가닥(duplexed strands)일 때 "쌍을 이루는(pair)" 각 가닥의 위치를 의미한다. 예를 들어, 21 뉴클레오베이스 센스 가닥과 21 뉴클레오베이스 안티센스 가닥에서 센스 가닥의 위치 1 및 안티센스 가닥의 위치 21 뉴클레오베이스는 "일치하는 위치(matching positions)"에 있다. 23 뉴클레오베이스 센스 가닥 및 23 뉴클레오베이스 안티센스 가닥의 또 다른 비제한적 예에서, 센스 가닥의 뉴클레오베이스 2와 안티센스 가닥의 위치 22는 일치하는 위치에 있다. 다른 비제한적인 예에서, 18 뉴클레오베이스 센스 가닥 및 18 뉴클레오베이스 안티센스 가닥에서, 센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오베이스와 안티센스 가닥의 뉴클레오베이스 18은 일치하는 위치에 있고, 센스 가닥의 뉴클레오베이스 4와 안티센스 가닥의 뉴클레오베이스 15는 일치하는 위치에 있다. 당업자는 센스 및 안티센스 가닥에서 어떻게 일치하는 위치를 식별하는지 이해할 것이며, 이들은 듀플렉스 가닥 및 쌍을 이루는 가닥이 될 것이다.
(n)은 a, u, c, g 또는 t 중 어느 하나일 수 있지만, 일반적으로 센스 가닥의 위치 1에 있는 "n"은 안티센스 가닥의 위치 21에 있는 (n)과 상보적이다. 두 가지 비제한적인 예에서, (1) 센스 가닥의 1번 위치가 "g"이면 안티센스 가닥의 21번 위치는 "c"이고, (2) 센스 가닥의 1번 위치가 "a"이면 안티센스 가닥의 21번 위치는 "u" 또는 "t"이다. 이러한 유형의 컴플리멘터리 매칭 쌍(complimentary matching pairing)은 (2) 센스 가닥의 위치 2 및 안티센스 가닥의 위치 20에 있는 (n); 센스 가닥의 위치 21 및 안티센스 가닥의 위치 1에 있는 (n)에 적용된다. 비록 n이 이들 위치에서 임의의 뉴클레오티드일 수 있지만, 센스 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드는 일반적으로 여전히 상보적(일치(match))이다, 하지만 특정 실시양태에서는 불일치(mismatch)를 가질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 제한하려는 의도는 아니지만, 일부 실시양태에서 "n"은 "무작위(random)"일 수 있으며, 이는 상보적일 수 있지만 반드시 상보적일 필요는 없음을 의미한다. 특정 실시양태에서 "n"은 상보적이다. 비제한적인 예로서, 안티센스 1의 위치에서 "n"은 "u"이고 센스 가닥 21의 위치에서 "n"은 "a"이다.
표 1의 마지막 열(final column)은 동일한 테이블 행에 센스 및 안티센스 서열을 포함하는 듀플렉스에 대한 듀플렉스 AD#/AV#를 나타낸다. 예를 들어, 표 1은 센스 가닥 서열번호 6 및 안티센스 가닥 서열번호 123을 포함하는 듀플렉스 AD# AD00007에 할당된 듀플렉스를 나타낸다. 따라서, 표 1의 각 행은 동일한 행에 표시된 센스 및 안티센스 서열을 각 포함하는 본 발명의 듀플렉스를 식별하며, 각 듀플렉스에 할당된 식별자는 행의 마지막 열에 표시된다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 1에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNAi 제제가 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 투여되는 RNAi 제제는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 서열 변형을 포함하여 표 1에규정된 염기 서열 중 적어도 하나를 포함하는 듀플렉스를 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 1에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNAi 제제는 전달 분자에 부착되며, 그 비제한적인 예는 GalNAc 화합물을 포함하는 전달 화합물이다.
변형되지 않은 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열. 모든 서열은 5' ~ 3' 방향으로 나타나 있다. 듀플렉스(Duplex) AD# 및 AV#는 표의 같은 행에 있는 두 가닥의 듀플렉스에 할당된 번호이다.
센스 가닥 서열번호 안티센스 가닥 서열번호 듀플렉스 AD#/AV#
guuaaagacuuuguccauaaa 1 uuuauggacaaagucuuuaac 118 AD00001
gaaagacuuuguccauaagaa 2 uucuuauggacaaagucuuuc 119 AD00002
gaaugacauauuucaaaaaca 3 uguuuuugaaauaugucauuc 120 AD00004
gaaacucaacauauuugauca 4 ugaucaaauauguugaguuuc 121 AD00005
gaacucaacauauuugaucaa 5 uugaucaaauauguugaguuc 122 AD00006
guugaucagucuuuuuaugaa 6 uucauaaaaagacugaucaac 123 AD00007
ggaucagucuuuuuaugauca 7 ugaucauaaaaagacugaucc 124 AD00008
gaagaacuacauauaaacuaa 8 uuaguuuauauguaguucuuc 125 AD00009
gcuacauauaaacuacaagua 9 uacuuguaguuuauauguagc 126 AD00010
gaagagguaaagaauauguca 10 ugacauauucuuuaccucuuc 127 AD00011
gagguaaagaauaugucacua 11 uagugacauauucuuuaccuc 128 AD00012
guaugucacuugaacucaaca 12 uguugaguucaagugacauac 129 AD00013
gacucaaaacuugaaagccua 13 uaggcuuucaaguuuugaguc 130 AD00014
gaacuugaaagccuccuagaa 14 uucuaggaggcuuucaaguuc 131 AD00015
ggaaaaaauucuacuucaaca 15 uguugaaguagaauuuuuucc 132 AD00016
ggaagagcaacuaacuaacua 16 uaguuaguuaguugcucuucc 133 AD00017
guucaagaacccacagaaaua 17 uauuucuguggguucuugaac 134 AD00018
gucaagaacccacagaaauua 18 uaauuucuguggguucuugac 135 AD00019
gucucuaucuuccaagccaaa 19 uuuggcuuggaagauagagac 136 AD00020
gcaagaacuacucccuuucua 20 uagaaagggaguaguucuugc 137 AD00021
gcaacucucaaguuuuucaua 21 uaugaaaaacuugagaguugc 138 AD00022
gacucucaaguuuuucaugua 22 uacaugaaaaacuugagaguc 139 AD00023
gcucucaaguuuuucauguca 23 ugacaugaaaaacuugagagc 140 AD00024
gcucaaguuuuucaugucuaa 24 uuagacaugaaaaacuugagc 141 AD00025
gucaaguuuuucaugucuaca 25 uguagacaugaaaaacuugac 142 AD00026
guuuucaugucuacugugaua 26 uaucacaguagacaugaaaac 143 AD00027
gucaugucuacugugauguua 27 uaacaucacaguagacaugac 144 AD00028
guggacauuaauucaacauca 28 ugauguugaauuaauguccac 145 AD00029
gaacaucgaauagauggauca 29 ugauccaucuauucgauguuc 146 AD00030
ggaauagauggaucacaaaaa 30 uuuuugugauccaucuauucc 147 AD00031
gauagauggaucacaaaacua 31 uaguuuugugauccaucuauc 148 AD00032
guggaucacaaaacuucaaua 32 uauugaaguuuugugauccac 149 AD00033
gcaaaacuucaaugaaacgua 33 uacguuucauugaaguuuugc 150 AD00034
ggggagaacuacaaauaugga 34 uccauauuuguaguucucccc 151 AD00035
gagagaagauauacuccauaa 35 uuauggaguauaucuucucuc 152 AD00036
ggagaagauauacuccauaga 36 ucuauggaguauaucuucucc 153 AD00037
gagauauacuccauagugaaa 37 uuucacuauggaguauaucuc 154 AD00038
gucuuuuuacuugggaaauca 38 ugauuucccaaguaaaaagac 155 AD00039
gaugaugaguguggagaaaaa 39 uuuuucuccacacucaucauc 156 AD00040
ggaaaacaaccuaaaugguaa 40 uuaccauuuagguuguuuucc 157 AD00041
gaauggaagguuauacucuaa 41 uuagaguauaaccuuccauuc 158 AD00042
ggguuauacucuauaaaauca 42 ugauuuuauagaguauaaccc 159 AD00043
gucacaaaacuucaaugaaaa 43 uuuucauugaaguuuugugac 160 AD00044
gcuugaaagccuccuagaaga 44 ucuucuaggaggcuuucaagc 161 AD00045
gugaacucaacucaaaacuua 45 uaaguuuugaguugaguucac 162 AD00046
gggacauuaauucaacaucga 46 ucgauguugaauuaauguccc 163 AD00047
ggacauuaauucaacaucgaa 47 uucgauguugaauuaaugucc 164 AD00048
guaauucaacaucgaauagaa 48 uucuauucgauguugaauuac 165 AD00049
gaagggccaaauuaaugacaa 49 uugucauuaauuuggcccuuc 166 AD00050
aagggccaaauuaaugacaua 50 uaugucauuaauuuggcccuu 167 AD00132
gaaagauuuuguccauaagaa 51 uucuuauggacaaaaucuuuc 168 AD00178
gcaaaaucaagauuugcuaua 52 uauagcaaaucuugauuuugc 169 AD00179
guuaaagauuuuguccauaaa 53 uuuauggacaaaaucuuuaac 170 AD00180
gaaaccaacuacacgcuacaa 54 uuguagcguguaguugguuuc 171 AD00181
gaagcucaacauauuugauca 55 ugaucaaauauguugagcuuc 172 AD00182
gagcucaacauauuugaucaa 56 uugaucaaauauguugagcuc 173 AD00183
guauuugaucagucuuuuuaa 57 uuaaaaagacugaucaaauac 174 AD00184
gcacccagaaguaacaucaca 58 ugugauguuacuucugggugc 175 AD00185
guaaagauuuuguccauaaga 59 ucuuauggacaaaaucuuuac 176 AD00186
gcaguccauggacauuaauua 60 uaauuaauguccauggacugc 177 AD00187
gaaagacuuuguccauaagaa 61 uucuuauggacaaagucuuuc 178 AD00102
cuuaaagacuuuguccauaaa 62 uuuauggacaaagucuuuaag 179 AD00180-1
gaaaccaacuauacgcuacaa 63 uuguagcguauaguugguuuc 180 AD00181-1
gaaacucaacauauuugauca 64 ugaucaaauauguugaguuuc 181 AD00103
gaacucaacauauuugaucaa 65 uugaucaaauauguugaguuc 182 AD00183-1
acacccagaaguaacuucaca 66 ugugaaguuacuucugggugu 183 AD00185-1
guaaagacuuuguccauaaga 67 ucuuauggacaaagucuuuac 184 AD00186-1
guaguccauggacauuaauua 68 uaauuaauguccauggacuac 185 AD00187-1
nnnaaagacuuuguccauaan 69 nuuauggacaaagucuuunnn 186 AD00001-1
nnnagacuuuguccauaagan 70 nucuuauggacaaagucunnn 187 AD00002-1
nnnugacauauuucaaaaacn 71 nguuuuugaaauaugucannn 188 AD00004-1
nnnacucaacauauuugaucn 72 ngaucaaauauguugagunnn 189 AD00005-1
nnncucaacauauuugaucan 73 nugaucaaauauguugagnnn 190 AD00006-1
nnngaucagucuuuuuaugan 74 nucauaaaaagacugaucnnn 191 AD00007-1
nnnucagucuuuuuaugaucn 75 ngaucauaaaaagacugannn 192 AD00008-1
nnngaacuacauauaaacuan 76 nuaguuuauauguaguucnnn 193 AD00009-1
nnnacauauaaacuacaagun 77 nacuuguaguuuauaugunnn 194 AD00010-1
nnngagguaaagaauaugucn 78 ngacauauucuuuaccucnnn 195 AD00011-1
nnnguaaagaauaugucacun 79 nagugacauauucuuuacnnn 196 AD00012-1
nnnugucacuugaacucaacn 80 nguugaguucaagugacannn 197 AD00013-1
nnnucaaaacuugaaagccun 81 naggcuuucaaguuuugannn 198 AD00014-1
nnncuugaaagccuccuagan 82 nucuaggaggcuuucaagnnn 199 AD00015-1
nnnaaaaauucuacuucaacn 83 nguugaaguagaauuuuunnn 200 AD00016-1
nnnagagcaacuaacuaacun 84 naguuaguuaguugcucunnn 201 AD00017-1
nnncaagaacccacagaaaun 85 nauuucuguggguucuugnnn 202 AD00018-1
nnnaagaacccacagaaauun 86 naauuucuguggguucuunnn 203 AD00019-1
nnnucuaucuuccaagccaan 87 nuuggcuuggaagauagannn 204 AD00020-1
nnnagaacuacucccuuucun 88 nagaaagggaguaguucunnn 205 AD00021-1
nnnacucucaaguuuuucaun 89 naugaaaaacuugagagunnn 206 AD00022-1
nnnucucaaguuuuucaugun 90 nacaugaaaaacuugagannn 207 AD00023-1
nnncucaaguuuuucaugucn 91 ngacaugaaaaacuugagnnn 208 AD00024-1
nnncaaguuuuucaugucuan 92 nuagacaugaaaaacuugnnn 209 AD00025-1
nnnaaguuuuucaugucuacn 93 nguagacaugaaaaacuunnn 210 AD00026-1
nnnuucaugucuacugugaun 94 naucacaguagacaugaannn 211 AD00027-1
nnnaugucuacugugauguun 95 naacaucacaguagacaunnn 212 AD00028-1
nnngacauuaauucaacaucn 96 ngauguugaauuaaugucnnn 213 AD00029-1
nnncaucgaauagauggaucn 97 ngauccaucuauucgaugnnn 214 AD00030-1
nnnauagauggaucacaaaan 98 nuuuugugauccaucuaunnn 215 AD00031-1
nnnagauggaucacaaaacun 99 naguuuugugauccaucunnn 216 AD00032-1
nnngaucacaaaacuucaaun 100 nauugaaguuuugugaucnnn 217 AD00033-1
nnnaaacuucaaugaaacgun 101 nacguuucauugaaguuunnn 218 AD00034-1
nnngagaacuacaaauauggn 102 nccauauuuguaguucucnnn 219 AD00035-1
nnnagaagauauacuccauan 103 nuauggaguauaucuucunnn 220 AD00036-1
nnngaagauauacuccauagn 104 ncuauggaguauaucuucnnn 221 AD00037-1
nnnauauacuccauagugaan 105 nuucacuauggaguauaunnn 222 AD00038-1
nnnuuuuuacuugggaaaucn 106 ngauuucccaaguaaaaannn 223 AD00039-1
nnngaugaguguggagaaaan 107 nuuuucuccacacucaucnnn 224 AD00040-1
nnnaaacaaccuaaaugguan 108 nuaccauuuagguuguuunnn 225 AD00041-1
nnnuggaagguuauacucuan 109 nuagaguauaaccuuccannn 226 AD00042-1
nnnuuauacucuauaaaaucn 110 ngauuuuauagaguauaannn 227 AD00043-1
nnnacaaaacuucaaugaaan 111 nuuucauugaaguuuugunnn 228 AD00044-1
nnnugaaagccuccuagaagn 112 ncuucuaggaggcuuucannn 229 AD00045-1
nnnaacucaacucaaaacuun 113 naaguuuugaguugaguunnn 230 AD00046-1
nnnacauuaauucaacaucgn 114 ncgauguugaauuaaugunnn 231 AD00047-1
nnncauuaauucaacaucgan 115 nucgauguugaauuaaugnnn 232 AD00048-1
nnnauucaacaucgaauagan 116 nucuauucgauguugaaunnn 233 AD00049-1
nnngggccaaauuaaugacan 117 nugucauuaauuuggcccnnn 234 AD00050-1
gaauggaagguuauacucuau 484 auagaguauaaccuuccauuc 515 AV01087
gaauggaagguuauacucuac 485 guagaguauaaccuuccauuc 516 AV01088
gaauggaagguuauacucuag 486 cuagaguauaaccuuccauuc 517 AV01089
ggaagguuauacucuaa 487 uuagaguauaaccuucc 518 AV01090
uggaagguuauacucua 488 uagaguauaaccuucca 519 AV01320
uggaagguuauacucuaa 489 uuagaguauaaccuucca 520 AV01091
auggaagguuauacucuaa 490 uuagaguauaaccuuccau 521 AV01092
uuggaagguuauacucuaa 491 uuagaguauaaccuuccaa 522 AV01093
guggaagguuauacucuaa 492 uuagaguauaaccuuccac 523 AV01094
cuggaagguuauacucuaa 493 uuagaguauaaccuuccag 524 AV01095
aauggaagguuauacucuaa 494 uuagaguauaaccuuccauu 525 AV01096
uauggaagguuauacucuaa 495 uuagaguauaaccuuccaua 526 AV01097
gauggaagguuauacucuaa 496 uuagaguauaaccuuccauc 527 AV01098
cauggaagguuauacucuaa 497 uuagaguauaaccuuccaug 528 AV01099
caauggaagguuauacucuaa 498 uuagaguauaaccuuccauug 529 AV01100
aaauggaagguuauacucuaa 499 uuagaguauaaccuuccauuu 530 AV01101
uaauggaagguuauacucuaa 500 uuagaguauaaccuuccauua 531 AV01102
aaaauggaagguuauacucuaa 501 uuagaguauaaccuuccauuuu 532 AV01103
caaaauggaagguuauacucuaa 502 uuagaguauaaccuuccauuuug 533 AV01104
ucaaaauggaagguuauacucuaa 503 uuagaguauaaccuuccauuuuga 534 AV01105
cucaaaauggaagguuauacucuaa 504 uuagaguauaaccuuccauuuugag 535 AV01106
ucucaaaauggaagguuauacucuaa 505 uuagaguauaaccuuccauuuugaga 536 AV01107
uggaagucucaaaauggaagguuauacucuaa 506 uuagaguauaaccuuccauuuugagacuucca 537 AV01108
gaauggaagguuauacucuaa 507 uuagaguauaaccuuccauucuu 538 AV01109
gaauggaagguuauacucuaa 508 uuagaguauaaccuuccauucga 539 AV01110
gaauggaagguuauacucuaa 509 uuagaguauaaccuuccauuc 540 AV01111
gaauggaagguuauacucuaa 510 uuagaguauaaccuuccauuc 541 AV01112
gaauggaagguuauacucuaa 511 uuagaguauaaccuuccauuc 542 AV01113
gaauggaagguuauauucuaa 512 uuagaguauaaccuuccauuc 543 AV01114
gaauggaagguuauacucuga 513 ucagaguauaaccuuccauuc 544 AV01115
gaauggaagguuauacucuaa 514 uuagaguauaaccuuccauuc 545 AV01116
표 2는 본 발명의 특정 화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열을 나타낸다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 2에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제는 세포 및/또는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 2에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제가 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 투여되는 RNAi 제제는 표 2의 1열의 행에서 식별되는 듀플렉스가 포함되며, 표 2의 3 및 6열의 같은 행에서 각각 센스 및 안티센스 가닥 서열에 나타난 서열 변형을 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 2에 나타난 서열은 대상체의 세포 및/또는 조직에 RNAi 제제를 전달할 수 있는 화합물에 부착(이하, "접합(conjugated)"이라 지칭함)될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 전달 화합물의 비제한적인 예는 GalNAc 함유 화합물이다. 표 2에서, 첫 번째 열은 표 1에 표시된 바와 같이 염기 서열의 듀플렉스 AD#/AV#를 나타낸다. 듀플렉스 AD#/AV#는 염기 서열을 식별하며, 표시된 센스 및 안티센스 가닥은 염기 서열을 포함하지만 표 2의 같은 행에 표시된 화학적 변형이 있는 것을 나타낸다. 예를 들어, 표 1은 염기 단일 가닥 서열 서열번호 1(센스) 및 서열번호 118(안티센스)을 나타내며, 상기 두 서열을 합쳐서 이중 가닥 듀플렉스로 식별된다: 듀플렉스 AD# AD00001 및 표 2에는 듀플렉스 AD# AD00001이 나열되어 있으며, 이는 서열번호 237 및 서열번호 287의 듀플렉스가 각각 서열번호 1 및 서열번호 118의 염기 서열을 포함하지만, 각각 3 및 6열에 나타낸 센스 및 안티센스 서열에 화학적 변형이 있음을 나타낸다. 표 2의 2열 "센스 가닥(Sense strand) SS#"은 같은 행의 3열에 표시된 센스 서열(변형 포함)에 할당된 식별자이다. 표 2의 5열 "안티센스 가닥 AS#"은 6열에 표시된 안티센스 서열(변형 포함)에 할당된 식별자이다.
화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열을 제공한다. 모든 서열은 5'~3'로 나타나 있다. 이러한 서열은 여기에 설명된 특정 시험관 내(in vitro) 시험 연구에서 사용되었다. 화학적 변형은 다음과 같이 표시된다: 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *
듀플렉스( Duplex) AD#/AV# 센스 가닥(Sense strand) SS# 센스 서열(Sense Sequence) 서열번호 안티센스 가닥(Antisense strand) AS# 안티센스 서열(Antisense Sequence) 서열번호
AD00001 AD00001-SS g*u*uaaagaCuUuGuccauaa*a 237 AD00001-AS u*U*uaugGacaaAgUcUuua*a*c 287
AD00002 AD00002-SS g*a*aagacuUuGuCcauaaga*a 238 AD00002-AS u*U*cuuaUggacAaAgUcuu*u*c 288
AD00003 AD00003-SS g*c*ucaacaUaUuUgaucagu*a 239 AD00003-AS u*A*cugaUcaaaUaUgUuga*g*c 289
AD00004 AD00004-SS g*a*augacaUaUuUcaaaaac*a 240 AD00004-AS u*G*uuuuUgaaaUaUgUcau*u*c 290
AD00005 AD00005-SS g*a*aacucaAcAuAuuugauc*a 241 AD00005-AS u*G*aucaAauauGuUgAguu*u*c 291
AD00006 AD00006-SS g*a*acucaaCaUaUuugauca*a 242 AD00006-AS u*U*gaucAaauaUgUuGagu*u*c 292
AD00007 AD00007-SS g*u*ugaucaGuCuUuuuauga*a 243 AD00007-AS u*U*cauaAaaagAcUgAuca*a*c 293
AD00008 AD00008-SS g*g*aucaguCuUuUuaugauc*a 244 AD00008-AS u*G*aucaUaaaaAgAcUgau*c*c 294
AD00009 AD00009-SS g*a*agaacuAcAuAuaaacua*a 245 AD00009-AS u*U*aguuUauauGuAgUucu*u*c 295
AD00010 AD00010-SS g*c*uacauaUaAaCuacaagu*a 246 AD00010-AS u*A*cuugUaguuUaUaUgua*g*c 296
AD00011 AD00011-SS g*a*agagguAaAgAauauguc*a 247 AD00011-AS u*G*acauAuucuUuAcCucu*u*c 297
AD00012 AD00012-SS g*a*gguaaaGaAuAugucacu*a 248 AD00012-AS u*A*gugaCauauUcUuUacc*u*c 298
AD00013 AD00013-SS g*u*augucaCuUgAacucaac*a 249 AD00013-AS u*G*uugaGuucaAgUgAcau*a*c 299
AD00014 AD00014-SS g*a*cucaaaAcUuGaaagccu*a 250 AD00014-AS u*A*ggcuUucaaGuUuUgag*u*c 300
AD00015 AD00015-SS g*a*acuugaAaGcCuccuaga*a 251 AD00015-AS u*U*cuagGaggcUuUcAagu*u*c 301
AD00016 AD00016-SS g*g*aaaaaaUuCuAcuucaac*a 252 AD00016-AS u*G*uugaAguagAaUuUuuu*c*c 302
AD00017 AD00017-SS g*g*aagagcAaCuAacuaacu*a 253 AD00017-AS u*A*guuaGuuagUuGcUcuu*c*c 303
AD00018 AD00018-SS g*u*ucaagaAcCcAcagaaau*a 254 AD00018-AS u*A*uuucUguggGuUcUuga*a*c 304
AD00019 AD00019-SS g*u*caagaaCcCaCagaaauu*a 255 AD00019-AS u*A*auuuCugugGgUuCuug*a*c 305
AD00020 AD00020-SS g*u*cucuauCuUcCaagccaa*a 256 AD00020-AS u*U*uggcUuggaAgAuAgag*a*c 306
AD00021 AD00021-SS g*c*aagaacUaCuCccuuucu*a 257 AD00021-AS u*A*gaaaGggagUaGuUcuu*g*c 307
AD00022 AD00022-SS g*c*aacucuCaAgUuuuucau*a 258 AD00022-AS u*A*ugaaAaacuUgAgAguu*g*c 308
AD00023 AD00023-SS g*a*cucucaAgUuUuucaugu*a 259 AD00023-AS u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c 309
AD00024 AD00024-SS g*c*ucucaaGuUuUucauguc*a 260 AD00024-AS u*G*acauGaaaaAcUuGaga*g*c 310
AD00025 AD00025-SS g*c*ucaaguUuUuCaugucua*a 261 AD00025-AS u*U*agacAugaaAaAcUuga*g*c 311
AD00026 AD00026-SS g*u*caaguuUuUcAugucuac*a 262 AD00026-AS u*G*uagaCaugaAaAaCuug*a*c 312
AD00027 AD00027-SS g*u*uuucauGuCuAcugugau*a 263 AD00027-AS u*A*ucacAguagAcAuGaaa*a*c 313
AD00028 AD00028-SS g*u*caugucUaCuGugauguu*a 264 AD00028-AS u*A*acauCacagUaGaCaug*a*c 314
AD00029 AD00029-SS g*u*ggacauUaAuUcaacauc*a 265 AD00029-AS u*G*auguUgaauUaAuGucc*a*c 315
AD00030 AD00030-SS g*a*acaucgAaUaGauggauc*a 266 AD00030-AS u*G*auccAucuaUuCgAugu*u*c 316
AD00031 AD00031-SS g*g*aauagaUgGaUcacaaaa*a 267 AD00031-AS u*U*uuugUgaucCaUcUauu*c*c 317
AD00032 AD00032-SS g*a*uagaugGaUcAcaaaacu*a 268 AD00032-AS u*A*guuuUgugaUcCaUcua*u*c 318
AD00033 AD00033-SS g*u*ggaucaCaAaAcuucaau*a 269 AD00033-AS u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*c 319
AD00034 AD00034-SS g*c*aaaacuUcAaUgaaacgu*a 270 AD00034-AS u*A*cguuUcauuGaAgUuuu*g*c 320
AD00035 AD00035-SS g*g*ggagaaCuAcAaauaugg*a 271 AD00035-AS u*C*cauaUuuguAgUuCucc*c*c 321
AD00036 AD00036-SS g*a*gagaagAuAuAcuccaua*a 272 AD00036-AS u*U*auggAguauAuCuUcuc*u*c 322
AD00037 AD00037-SS g*g*agaagaUaUaCuccauag*a 273 AD00037-AS u*C*uaugGaguaUaUcUucu*c*c 323
AD00038 AD00038-SS g*a*gauauaCuCcAuagugaa*a 274 AD00038-AS u*U*ucacUauggAgUaUauc*u*c 324
AD00039 AD00039-SS g*u*cuuuuuAcUuGggaaauc*a 275 AD00039-AS u*G*auuuCccaaGuAaAaag*a*c 325
AD00040 AD00040-SS g*a*ugaugaGuGuGgagaaaa*a 276 AD00040-AS u*U*uuucUccacAcUcAuca*u*c 326
AD00041 AD00041-SS g*g*aaaacaAcCuAaauggua*a 277 AD00041-AS u*U*accaUuuagGuUgUuuu*c*c 327
AD00042 AD00042-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*a 278 AD00042-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 328
AD00043 AD00043-SS g*g*guuauaCuCuAuaaaauc*a 279 AD00043-AS u*G*auuuUauagAgUaUaac*c*c 329
AD00044 AD00044-SS g*u*cacaaaAcUuCaaugaaa*a 280 AD00044-AS u*U*uucaUugaaGuUuUgug*a*c 330
AD00045 AD00045-SS g*c*uugaaaGcCuCcuagaag*a 281 AD00045-AS u*C*uucuAggagGcUuUcaa*g*c 331
AD00046 AD00046-SS g*u*gaacucAaCuCaaaacuu*a 282 AD00046-AS u*A*aguuUugagUuGaGuuc*a*c 332
AD00047 AD00047-SS g*g*gacauuAaUuCaacaucg*a 283 AD00047-AS u*C*gaugUugaaUuAaUguc*c*c 333
AD00048 AD00048-SS g*g*acauuaAuUcAacaucga*a 284 AD00048-AS u*U*cgauGuugaAuUaAugu*c*c 334
AD00049 AD00049-SS g*u*aauucaAcAuCgaauaga*a 285 AD00049-AS u*U*cuauUcgauGuUgAauu*a*c 335
AD00050 AD00050-SS g*a*agggccAaAuUaaugaca*a 286 AD00050-AS u*U*gucaUuaauUuGgCccu*u*c 336
AV01087 AV01087-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*u 546 AV01087-AS a*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 576
AV01088 AV01088-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*c 547 AV01088-AS g*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 577
AV01089 AV01089-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*g 548 AV01089-AS c*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 578
AV01090 AV01090-SS g*g*aaGgUuAuacucua*a 549 AV01090-AS u*U*agagUauaaCcUu*C*c 579
AV01091 AV01091-SS u*g*gaaGgUuAuacucua*a 550 AV01091-AS u*U*agagUauaaCcUuC*c*a 580
AV01092 AV01092-SS a*u*ggaaGgUuAuacucua*a 551 AV01092-AS u*U*agagUauaaCcUuCc*a*u 581
AV01093 AV01093-SS u*u*ggaaGgUuAuacucua*a 552 AV01093-AS u*U*agagUauaaCcUuCc*a*a 582
AV01094 AV01094-SS g*u*ggaaGgUuAuacucua*a 553 AV01094-AS u*U*agagUauaaCcUuCc*a*c 583
AV01095 AV01095-SS c*u*ggaaGgUuAuacucua*a 554 AV01095-AS u*U*agagUauaaCcUuCc*a*g 584
AV01096 AV01096-SS a*a*uggaaGgUuAuacucua*a 555 AV01096-AS u*U*agagUauaaCcUuCca*u*u 585
AV01097 AV01097-SS u*a*uggaaGgUuAuacucua*a 556 AV01097-AS u*U*agagUauaaCcUuCca*u*a 586
AV01098 AV01098-SS g*a*uggaaGgUuAuacucua*a 557 AV01098-AS u*U*agagUauaaCcUuCca*u*c 587
AV01099 AV01099-SS c*a*uggaaGgUuAuacucua*a 558 AV01099-AS u*U*agagUauaaCcUuCca*u*g 588
AV01100 AV01100-SS c*a*auggaaGgUuAuacucua*a 559 AV01100-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*g 589
AV01101 AV01101-SS a*a*auggaaGgUuAuacucua*a 560 AV01101-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*u 590
AV01102 AV01102-SS u*a*auggaaGgUuAuacucua*a 561 AV01102-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*a 591
AV01103 AV01103-SS a*a*aauggaaGgUuAuacucua*a 562 AV01103-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauu*u*u 592
AV01104 AV01104-SS c*a*aaauggaaGgUuAuacucua*a 563 AV01104-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuu*u*g 593
AV01105 AV01105-SS u*c*aaaauggaaGgUuAuacucua*a 564 AV01105-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuuu*g*a 594
AV01106 AV01106-SS c*u*caaaauggaaGgUuAuacucua*a 565 AV01106-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuuug*a*g 595
AV01107 AV01107-SS u*c*ucaaaauggaaGgUuAuacucua*a 566 AV01107-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuuuga*g*a 596
AV01108 AV01108-SS u*g*gaagucucaaaauggaaGgUuAuacucua*a 567 AV01108-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuuugagacuuc*c*a 597
AV01109 AV01109-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*a 568 AV01109-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuc*u*u 598
AV01110 AV01110-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*a 569 AV01110-AS u*U*agagUauaaCcUuCcauuc*g*a 599
AV01111 AV01111-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*a 570 AV01111-AS u*U*aga(gUNA)UauaaCcUuCcau*u*c 600
AV01112 AV01112-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*a 571 AV01112-AS u*U*agag(uUNA)auaaCcUuCcau*u*c 601
AV01113 AV01113-SS g*a*auggaaGGUuauacucua*a 572 AV01113-AS u*U*agaGuauaaccUuCcau*u*c 602
AV01114 AV01114-SS g*a*auggaaGgUuAuauucua*a 573 AV01114-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 603
AV01115 AV01115-SS g*a*auggaaGgUuAuacucug*a 574 AV01115-AS u*C*agagUauaaCcUuCcau*u*c 604
AV01116 AV01116-SS g*a*auggaaGgUuAuacucu*a*a 575 AV01116-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 605
표 3은 본 발명의 특정 화학적 변형 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열을 나타낸다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 3에 나타난 RNAi 제제는 세포 및/또는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 3에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제가 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 투여되는 RNAi 제제는 표 3, 1열의 행에서 식별되는 듀플렉스가 포함되며, 표 3의 3 및 열 6의 동일한 행에서 각각 센스 및 안티센스 가닥 서열에 나타난 서열 변형 및/또는 전달 화합물을 포함한다. 상기 서열은 본 명세서의 다른 부분에 기술된 특정 생체 내(in vivo) 시험 연구에서 사용되었다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 3에 나타낸 서열은 전달용 화합물에 부착(본 명세서에서는 "접합"이라고도 함)될 수 있으며, 비제한적인 예는 GalNAc 함유 화합물이고, 전달 화합물은 표 3에서 3열의 센스 가닥에 "GLX-n"으로 식별된다. 본 명세서 및 표 3에 나타낸 바와 같이, "GLX-n"은 부착된 GalNAc 함유 화합물이 화합물 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16 중 어느 하나임을 나타내기 위해 사용된다, 각 구조는 본 명세서의 다른 부분에서 제공된다. 표 3의 1열은 표의 해당 행에 있는 센스 및 안티센스 서열의 듀플렉스에 할당된 듀플렉스(Duplex) AD#을 제공한다. 예를 들어, 듀플렉스 AD# AD00102는 센스 가닥 서열번호 337 및 안티센스 가닥 서열번호 364의 듀플렉스이다. 표 3의 각 줄은 센스 가닥과 안티센스 가닥을 제공하며, 나타낸 센스 가닥과 안티센스 가닥의 듀플렉스를 개시한다. 표 3의 2열의 "센스 가닥 SS#"은 같은 행의 3열에 나타낸 센스 서열(변형 포함)에 할당된 식별자이다. 표 3의 5열의 "안티센스 가닥 AS#"는 6열 에 나타낸 안티센스 서열(변형 포함)에 할당된 식별자이다. 특정 부착된 GalNAc 함유 GLO 화합물에 대한 식별자는 GLO-0으로 나타내며, 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 실시양태에 포함된 결과 화합물과 함께, GLO-0으로 나타낸 화합물에 대해 다른 GLO-n 또는 GLS-n 화합물이 치환될 수 있음을 이해할 수 있다.
표 3은 화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열을 제공한다. 모든 서열은 5'~3'로 나타내어 있다. 상기 서열은 본 문서의 다른 부분에서 설명한 특정 생체 내(in vivo) 시험 연구에서 사용되었다. 생체 내 연구에 사용된 전달 분자는 각 센스 가닥의 3' 끝에 "GLO-0"으로 나타내어 있다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: * 으로 나타낸다.
듀플렉스 AD# 센스 가닥 SS# 센스 서열 서열번호 안티센스 가닥 AS# 안티센스 서열 서열번호
AD00102 AD00102-SS g*a*aagacuUuGuCcauaaga*a(GLO-0) 337 AD00102-AS u*U*cuuaUggacAaAgUcuu*u*c 364
AD00103 AD00103-SS g*a*aacucaAcAuAuuugauc*a(GLO-0) 338 AD00103-AS u*G*aucaAauauGuUgAguu*u*c 365
AD00104 AD00104-SS g*g*aucaguCuUuUuaugauc*a(GLO-0) 339 AD00104-AS u*G*aucaUaaaaAgAcUgau*c*c 366
AD00105 AD00105-SS g*a*gguaaaGaAuAugucacu*a(GLO-0) 340 AD00105-AS u*A*gugaCauauUcUuUacc*u*c 367
AD00106 AD00106-SS g*g*aagagcAaCuAacuaacu*a(GLO-0) 341 AD00106-AS u*A*guuaGuuagUuGcUcuu*c*c 368
AD00107 AD00107-SS g*u*caagaaCcCaCagaaauu*a(GLO-0) 342 AD00107-AS u*A*auuuCugugGgUuCuug*a*c 369
AD00108 AD00108-SS g*a*cucucaAgUuUuucaugu*a(GLO-0) 343 AD00108-AS u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c 370
AD00109 AD00109-SS g*c*ucucaaGuUuUucauguc*a(GLO-0) 344 AD00109-AS u*G*acauGaaaaAcUuGaga*g*c 371
AD00110 AD00110-SS g*c*ucaaguUuUuCaugucua*a(GLO-0) 345 AD00110-AS u*U*agacAugaaAaAcUuga*g*c 372
AD00111 AD00111-SS g*u*ggacauUaAuUcaacauc*a(GLO-0) 346 AD00111-AS u*G*auguUgaauUaAuGucc*a*c 373
AD00112 AD00112-SS g*a*auggaaGgUuAuacucua*a(GLO-0) 347 AD00112-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 374
AD00132 AD00132-SS a*a*gggccaAaUuAaugacau*a(GLO-0) 348 AD00132-AS u*A*ugucAuuaaUuUgGccc*u*u 375
AD00133 AD00133-SS g*a*augacaUaUuUcaaaaac*a(GLO-0) 349 AD00133-AS u*G*uuuuUgaaaUaUgUcau*u*c 376
AD00134 AD00134-SS g*u*ugaucaGuCuUuuuauga*a(GLO-0) 350 AD00134-AS u*U*cauaAaaagAcUgAuca*a*c 377
AD00135 AD00135-SS g*a*agaacuAcAuAuaaacua*a(GLO-0) 351 AD00135-AS u*U*aguuUauauGuAgUucu*u*c 378
AD00136 AD00136-SS g*u*augucaCuUgAacucaac*a(GLO-0) 352 AD00136-AS u*G*uugaGuucaAgUgAcau*a*c 379
AD00137 AD00137-SS g*a*cucaaaAcUuGaaagccu*a(GLO-0) 353 AD00137-AS u*A*ggcuUucaaGuUuUgag*u*c 380
AD00138 AD00138-SS g*c*uugaaaGcCuCcuagaag*a(GLO-0) 354 AD00138-AS u*C*uucuAggagGcUuUcaa*g*c 381
AD00139 AD00139-SS c*u*caaguuUuUcAugucuac*a(GLO-0) 355 AD00139-AS u*G*uagaCaugaAaAaCuug*a*g 382
AD00140 AD00140-SS g*u*uuucauGuCuAcugugau*a(GLO-0) 356 AD00140-AS u*A*ucacAguagAcAuGaaa*a*c 383
AD00141 AD00141-SS c*a*acaucgAaUaGauggauc*a(GLO-0) 357 AD00141-AS u*G*auccAucuaUuCgAugu*u*g 384
AD00142 AD00142-SS c*g*aauagaUgGaUcacaaaa*a(GLO-0) 358 AD00142-AS u*U*uuugUgaucCaUcUauu*c*g 385
AD00143 AD00143-SS a*u*ggaucaCaAaAcuucaau*a(GLO-0) 359 AD00143-AS u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*u 386
AD00144 AD00144-SS g*c*aaaacuUcAaUgaaacgu*a(GLO-0) 360 AD00144-AS u*A*cguuUcauuGaAgUuuu*g*c 387
AD00145 AD00145-SS g*u*cuuuuuAcUuGggaaauc*a(GLO-0) 361 AD00145-AS u*G*auuuCccaaGuAaAaag*a*c 388
AD00146 AD00146-SS c*a*ugaugaGuGuGgagaaaa*a(GLO-0) 362 AD00146-AS u*U*uuucUccacAcUcAuca*u*g 389
AD00147 AD00147-SS a*g*guuauaCuCuAuaaaauc*a(GLO-0) 363 AD00147-AS u*G*auuuUauagAgUaUaac*c*u 390
표 4는 본 발명의 특정 화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스-가닥 및 센스-가닥 서열을 나타낸다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 4에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제가 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 투여되는 RNAi 제제는 표 4의 1열의 행에서 식별되는 듀플렉스를 포함하고, 표 4의 3열 및 6열의 동일한 행에서 각각 센스 및 안티센스 가닥 서열에 나타낸 서열 변형 및/또는 전달 화합물을 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 4에 나타낸 서열은 대상체의 세포 및/또는 조직에 RNAi 제제를 전달할 수 있는 화합물에 부착될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 전달 화합물의 비제한적인 예는 GalNAc 함유 화합물이다. 표 4에서, "GLX-n"이라는 용어는 나타낸 바와 같이 센스 가닥의 GalNAc 함유 화합물을 나타낸다. "표 4"에서, "GLX-n"은 첨부된 GalNAC 함유 화합물이 화합물 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16 중 어느 하나임을 나타내는 데 사용된다, 각 구조는 본 문서의 다른 부분에서 제공된다. 표 4의 첫 번째 열은 표 3에 나타낸 듀플렉스에 상응하는 듀플렉스 AD#을 나타낸다. Duplex AD#은 표 3의 듀플렉스 서열을 식별하여, 표 4의 센스, 안티센스, 및 듀플렉스 서열이 표 3의 동일한 Duplex AD#을 가진 서열과 동일한 염기 서열을 갖지만, 표 4의 서열 및 듀플렉스는 표 3에 나타낸 상응하는 서열 및 듀플렉스에 비해 다른 화학적 변형 및/또는 전달 화합물을 가짐을 나타낸다. 예를 들어, 표 3에 나타낸 듀플렉스 AD# AD00102로서 서열번호 337(센스), 서열번호 364(안티센스), 및 이들의 이중 가닥 듀플렉스는 표 4에 나타낸 서열번호 391, 서열번호 418, 및 AD# AD00102-1와 각각 동일 염기 서열을 가지며, 각 표에 나타낸 대로 화학적 변형 및/또는 전달 화합물을 가지고 있다.
화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열. 서열은 본 명세서의 다른 부분에서 설명한 특정 생체 내 연구에서 사용되었다. 모든 서열은 5'~3'로 나타내어 있다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *; Invab(인바브)= 역위된 비염기성 으로 표시된다.
듀플렉스 AD# 센스 가닥 SS# 센스 서열 5'->3' 서열번호 안티센스 가닥 AS# 안티센스 서열 5'->3' 서열번호
AD00102-1 AD00102-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaaagacuUuGuCcauaagaa*(Invab) 391 AD00102-1-AS u*U*cuuaUggacAaAgUcuu*u*c 418
AD00103-1 AD00103-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaaacucaAcAuAuuugauca*(Invab) 392 AD00103-1-AS u*G*aucaAauauGuUgAguu*u*c 419
AD00104-1 AD00104-1-SS (GLS-5)*(Invab)*ggaucaguCuUuUuaugauca*(Invab) 393 AD00104-1-AS u*G*aucaUaaaaAgAcUgau*c*c 420
AD00105-1 AD00105-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gagguaaaGaAuAugucacua*(Invab) 394 AD00105-1-AS u*A*gugaCauauUcUuUacc*u*c 421
AD00106-1 AD00106-1-SS (GLS-5)*(Invab)*ggaagagcAaCuAacuaacua*(Invab) 395 AD00106-1-AS u*A*guuaGuuagUuGcUcuu*c*c 422
AD00107-1 AD00107-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gucaagaaCcCaCagaaauua*(Invab) 396 AD00107-1-AS u*A*auuuCugugGgUuCuug*a*c 423
AD00108-1 AD00108-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gacucucaAgUuUuucaugua*(Invab) 397 AD00108-1-AS u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c 424
AD00109-1 AD00109-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gcucucaaGuUuUucauguca*(Invab) 398 AD00109-1-AS u*G*acauGaaaaAcUuGaga*g*c 425
AD00110-1 AD00110-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gcucaaguUuUuCaugucuaa*(Invab) 399 AD00110-1-AS u*U*agacAugaaAaAcUuga*g*c 426
AD00111-1 AD00111-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guggacauUaAuUcaacauca*(Invab) 400 AD00111-1-AS u*G*auguUgaauUaAuGucc*a*c 427
AD00112-1 AD00112-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaauggaaGgUuAuacucuaa*(Invab) 401 AD00112-1-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 428
AD00132-1 AD00132-1-SS (GLS-5)*(Invab)*aagggccaAaUuAaugacaua*(Invab) 402 AD00132-1-AS u*A*ugucAuuaaUuUgGccc*u*u 429
AD00133-1 AD00133-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaaugacaUaUuUcaaaaaca*(Invab) 403 AD00133-1-AS u*G*uuuuUgaaaUaUgUcau*u*c 430
AD00134-1 AD00134-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guugaucaGuCuUuuuaugaa*(Invab) 404 AD00134-1-AS u*U*cauaAaaagAcUgAuca*a*c 431
AD00135-1 AD00135-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaagaacuAcAuAuaaacuaa*(Invab) 405 AD00135-1-AS u*U*aguuUauauGuAgUucu*u*c 432
AD00136-1 AD00136-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guaugucaCuUgAacucaaca*(Invab) 406 AD00136-1-AS u*G*uugaGuucaAgUgAcau*a*c 433
AD00137-1 AD00137-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gacucaaaAcUuGaaagccua*(Invab) 407 AD00137-1-AS u*A*ggcuUucaaGuUuUgag*u*c 434
AD00138-1 AD00138-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gcuugaaaGcCuCcuagaaga*(Invab) 408 AD00138-1-AS u*C*uucuAggagGcUuUcaa*g*c 435
AD00139-1 AD00139-1-SS (GLS-5)*(Invab)*cucaaguuUuUcAugucuaca*(Invab) 409 AD00139-1-AS u*G*uagaCaugaAaAaCuug*a*g 436
AD00140-1 AD00140-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guuuucauGuCuAcugugaua*(Invab) 410 AD00140-1-AS u*A*ucacAguagAcAuGaaa*a*c 437
AD00141-1 AD00141-1-SS (GLS-5)*(Invab)*caacaucgAaUaGauggauca*(Invab) 411 AD00141-1-AS u*G*auccAucuaUuCgAugu*u*g 438
AD00142-1 AD00142-1-SS (GLS-5)*(Invab)*cgaauagaUgGaUcacaaaaa*(Invab) 412 AD00142-1-AS u*U*uuugUgaucCaUcUauu*c*g 439
AD00143-1 AD00143-1-SS (GLS-5)*(Invab)*auggaucaCaAaAcuucaaua*(Invab) 413 AD00143-1-AS u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*u 440
AD00144-1 AD00144-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gcaaaacuUcAaUgaaacgua*(Invab) 414 AD00144-1-AS u*A*cguuUcauuGaAgUuuu*g*c 441
AD00145-1 AD00145-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gucuuuuuAcUuGggaaauca*(Invab) 415 AD00145-1-AS u*G*auuuCccaaGuAaAaag*a*c 442
AD00146-1 AD00146-1-SS (GLS-5)*(Invab)*caugaugaGuGuGgagaaaaa*(Invab) 416 AD00146-1-AS u*U*uuucUccacAcUcAuca*u*g 443
AD00147-1 AD00147-1-SS (GLS-5)*(Invab)*agguuauaCuCuAuaaaauca*(Invab) 417 AD00147-1-AS u*G*auuuUauagAgUaUaac*c*u 444
AD00112-2 AD00112-2-SS (GLS-15)*(Invab)*gaauggaaGgUuAuacucuaa*(Invab) 606 AD00112-2-AS u*U*agagUauaaCcUuCcau*u*c 611
AD00135-2 AD00135-2-SS (GLS-5)*(Invab)*caagaacuAcAuAuaaacuaa*(Invab) 607 AD00135-2-AS u*U*aguuUauauGuAgUucu*u*g 612
AD00135-3 AD00135-3-SS (GLS-15)*(Invab)*caagaacuAcAuAuaaacuaa*(Invab) 608 AD00135-3-AS u*U*aguuUauauGuAgUucu*u*g 613
AD00136-2 AD00136-2-SS (GLS-15)*(Invab)*guaugucaCuUgAacucaaca*(Invab) 609 AD00136-2-AS u*G*uugaGuucaAgUgAcau*a*c 614
AD00143-2 AD00143-2-SS (GLS-5)*(Invab)*guggaucaCaAaAcuucaaua*(Invab) 610 AD00143-2-AS u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*c 615
AD00108-2 AD00108-2-SS (GLS-15)*(Invab)*gacucucaAgUuUuucaugua*(Invab) 616 AD00108-2-AS u*A*caugAaaaaCuUgAgag*u*c 617
AD00133-2 AD00133-2-SS (GLS-15)*(Invab)*gaaugacaUaUuUcaaaaaca*(Invab) 618 AD00133-2-AS u*G*uuuuUgaaaUaUgUcau*u*c 619
AD00134-2 AD00134-2-SS (GLS-15)*(Invab)*guugaucaGuCuUuuuaugaa*(Invab) 620 AD00134-2-AS u*U*cauaAaaagAcUgAuca*a*c 621
AD00142-2 AD00142-2-SS (GLS-15)*(Invab)*cgaauagaUgGaUcacaaaaa*(Invab) 622 AD00142-2-AS u*U*uuugUgaucCaUcUauu*c*g 623
AD00143-3 AD00143-3-SS (GLS-15)*(Invab)*guggaucaCaAaAcuucaaua*(Invab) 624 AD00143-3-AS u*A*uugaAguuuUgUgAucc*a*u 625
AD00145-2 AD00145-2-SS (GLS-15)*(Invab)*gucuuuuuAcUuGggaaauca*(Invab) 626 AD00145-2-AS u*G*auuuCccaaGuAaAaag*a*c 627
AD00146-2 AD00146-2-SS (GLS-15)*(Invab)*caugaugaGuGuGgagaaaaa*(Invab) 628 AD00146-2-AS u*U*uuucUccacAcUcAuca*u*g 629
표 5는 본 발명의 특정 화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스-가닥 및 센스-가닥 서열을 나타낸다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 5에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제가 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 투여되는 RNAi 제제는 표 5의 1열의 행에서 식별되는 듀플렉스를 포함하고, 표 5의 3 및 6열의 동일한 행에서 각각 센스 및 안티센스 가닥 서열에 표시된 서열 변형 및/또는 전달 화합물을 포함하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 표 5에 나타낸 서열은 대상체의 세포 및/또는 조직에 RNAi 제제를 전달할 수 있는 화합물에 부착될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 전달 화합물의 비제한적인 예는 GalNAc 함유 화합물이다. 표 5에서, "GLO-0" 및 "GLS-5"라는 용어는 각각 나타낸 바와 같이 센스 가닥에 부착된 상이한 GalNAc 함유 화합물을 나타낸다. 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 실시양태에 포함되는 결과 화합물과 함께, GLO-0으로 나타낸 화합물 대신 다른 GLO-n 또는 GLS-n 화합물이 치환될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 유사하게, GLS-n 또는 GLO-n 화합물 중 다른 화합물은 GLS-5로 나타낸 화합물로 치환될 수 있으며, 결과 화합물은 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 실시양태에 포함된다. 본 발명의 특정 실시양태는 표 5에 나타낸 서열을 가지지만, 하기 GalNAc 함유 화합물 중 어느 하나에 부착되는 본 발명의 RNAi 제제를 포함하는 것으로 이해할 수 있다: GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15,및 GLO-16, 각 구조는 본 문서의 다른 부분에서 제공된다. 표 5의 첫 번째 열은 듀플렉스 AD# 번호(number)를 식별한다: AD00178 ~ AD# AD00187로, 각 행의 번호는 각각 3열과 6열의 같은 행에 나타낸 센스 및 안티센스 가닥으로 포함된 듀플렉스를 식별하며, 변형을 포함하고 센스 가닥에 부착된 3' GLO- 또는 GLS-전달 화합물을 포함한다. 듀플렉스 AD# AD00178~AD00187은 마우스 ANGPTL3 mRNA 서열과 완전히 상보적이지만 인간 ANGPTL3 mRNA 서열과 0 또는 1 불일치한다.
표 5의 첫 번째 열은 듀플렉스 AD# 번호를 식별한다: AD00179-1, AD00180-1, AD00181-1, AD00103-1, AD00183-1, AD00184-1, AD00185-1, AD00186-1, 및 AD00187-1, 각 행의 번호는 각각 3 및 6열의 같은 행에 나타낸 센스 및 안티센스 가닥이 포함된 듀플렉스를 식별하고, 변형을 포함하며, 센스 가닥에 부착된 5' 또는 3' GLS-n 또는 GLO-n 전달 화합물을 나타낸다. 변형은 다음과 같이 나타난다: 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *; Invab = 역위된 비염기성. 듀플렉스 AD00179-1, AD00180-1, AD00181-1, AD00103-1, AD00183-1, AD00184-1, AD00185-1, AD00186-1, 및 AD00187-1은 인간 ANGPTL3 mRNA 서열과 완전히 상보적이지만 마우스 ANGPTL3 mRNA 서열과 0 또는 1 불일치한다.
표 5는 화학적으로 변형된 ANGPTL3 RNAi 제제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 서열을 제공한다. 상기 서열은 본 명세서의 다른 부분에서 설명하는 일부 생체 내 연구에서 사용되었다. 모든 서열은 5'~3'로 나타내어 있다. 변형은 다음과 같이 표시된다: 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오인산염: *; Invab = 역위된 비염기성
듀플렉스 AD# 센스 가닥 SS# 센스 서열 서열번호 안티센스 가닥
AS#		 안티센스 서열 서열번호
마우스 풀 매치-인간 1mm(3' GLO-)
AD00178 AD00178-SS g*a*aagauuUuGuCcauaaga*a(GLO-0) 445 AD00178-AS u*U*cuuaUggacAaAaUcuu*u*c 464
AD00179 AD00179-SS g*c*aaaaucAaGaUuugcuau*a(GLO-0) 446 AD00179-AS u*A*uagcAaaucUuGaUuuu*g*c 465
AD00180 AD00180-SS g*u*uaaagaUuUuGuccauaa*a(GLO-0) 447 AD00180-AS u*U*uaugGacaaAaUcUuua*a*c 466
AD00181 AD00181-SS g*a*aaccaaCuAcAcgcuaca*a(GLO-0) 448 AD00181-AS u*U*guagCguguAgUuGguu*u*c 467
AD00182 AD00182-SS g*a*agcucaAcAuAuuugauc*a(GLO-0) 449 AD00182-AS u*G*aucaAauauGuUgAgcu*u*c 468
AD00183 AD00183-SS g*a*gcucaaCaUaUuugauca*a(GLO-0) 450 AD00183-AS u*U*gaucAaauaUgUuGagc*u*c 469
AD00184 AD00184-SS g*u*auuugaUcAgUcuuuuua*a(GLO-0) 451 AD00184-AS u*U*aaaaAgacuGaUcAaau*a*c 470
AD00185 AD00185-SS g*c*acccagAaGuAacaucac*a(GLO-0) 452 AD00185-AS u*G*ugauGuuacUuCuGggu*g*c 471
AD00186 AD00186-SS g*u*aaagauUuUgUccauaag*a(GLO-0) 453 AD00186-AS u*C*uuauGgacaAaAuCuuu*a*c 472
AD00187 AD00187-SS g*c*aguccaUgGaCauuaauu*a(GLO-0) 454 AD00187-AS u*A*auuaAugucCaUgGacu*g*c 473
마우스 1mm-인간 풀 매치 & 양쪽 풀 매치(5' GLS-5)
AD00179-1 AD00179-1-SS (GLS-5)*(Invab)*ccaaaaucAaGaUuugcuaua*(Invab)
 455 AD00179-1-AS u*A*uagcAaaucUuGaUuuu*g*g 474
AD00180-1 AD00180-1-SS (GLS-5)*(Invab)*cuuaaagaCuUuGuccauaaa*(Invab) 456 AD00180-1-AS u*U*uaugGacaaAgUcUuua*a*g 475
AD00181-1 AD00181-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaaaccaaCuAuAcgcuacaa*(Invab) 457 AD00181-1-AS u*U*guagCguauAgUuGguu*u*c 476
AD00103-1 AD00103-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaaacucaAcAuAuuugauca*(Invab) 458 AD00103-1-AS u*G*aucaAauauGuUgAguu*u*c 477
AD00183-1 AD00183-1-SS (GLS-5)*(Invab)*gaacucaaCaUaUuugaucaa*(Invab) 459 AD00183-1-AS u*U*gaucAaauaUgUuGagu*u*c 478
AD00184-1 AD00184-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guauuugaUcAgUcuuuuuaa*(Invab) 460 AD00184-1-AS u*U*aaaaAgacuGaUcAaau*a*c 479
AD00185-1 AD00185-1-SS (GLS-5)*(Invab)*acacccagAaGuAacuucaca*(Invab) 461 AD00185-1-AS u*G*ugaaGuuacUuCuGggu*g*u 480
AD00186-1 AD00186-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guaaagacUuUgUccauaaga*(Invab) 462 AD00186-1-AS u*C*uuauGgacaAaGuCuuu*a*c 481
AD00187-1 AD00187-1-SS (GLS-5)*(Invab)*guaguccaUgGaCauuaauua*(Invab) 463 AD00187-1-AS u*A*auuaAugucCaUgGacu*a*c 482
불일치(Mismatches)
당업자에게는 dsRNA의 효능을 위해 불일치가 용인되는 것으로 알려져 있으며, 특히 불일치가 dsRNA의 말단 영역 내에 있는 것으로 알려져 있다. 특정 불일치는 더 잘 용인되며, 예를 들어 와블 염기쌍 G:U 및 A:C의 불일치는 효능을 위해 더 잘 용인된다(Du et el., A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 21;33(5):1671-7. Doi: 10.1093/nar/gki312. Nucleic Acids Res. 2005;33(11):3698). 본 발명의 방법 및 화합물의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 ANGPTL3 표적 서열과 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 불일치를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 1개 이하의 불일치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 2개 이하의 불일치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 3개 이하의 불일치를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 상보성 영역의 중앙에 위치하지 않는 ANGPTL3 표적 서열과 불일치하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 상보성 영역의 5' 또는 3' 끝 중 하나 또는 둘 모두에서 마지막 5, 4, 3, 2, 또는 1 뉴클레오티드 내에 있는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 불일치를 포함한다. 본원에 설명된 방법 및/또는 당업자에게 공지된 방법은 ANGPTL3 표적 서열과 불일치를 포함하는 ANGPTL3 dsRNA 제제가 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 데 효과적인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
상보성(Complementarity)
본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, "상보적(complementary)"이라는 용어는 제1 뉴클레오티드 서열 (예: ANGPTL3 dsRNA 제제 센스 가닥 또는 표적 ANGPTL3 mRNA)을 제2 뉴클레오티드 서열 (예: ANGPTL3 dsRNA 제제 안티센스 가닥 또는 단일 가닥 안티센스 폴리뉴클레오티드)과 관련하여 설명하는 데 사용될 때, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 혼성화(hybridize)하고[포유류 생리적 조건(또는 시험관 내 유사한 조건)에서 염기쌍 수소 결합(base pair hydrogen bond) 형성] 특정 조건에서 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 듀플렉스 또는 이중 나선(double helical) 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 다른 조건, 예를 들어생체 내에서 발생할 수 있는 생리적 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종 용도(ultimate application)에 따라 두 서열의 상보성 시험에 가장 적합한 조건 집합을 결정할 수 있다. 상보적 서열은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairs) 또는 비왓슨-크릭 염기쌍을 포함하며, 적어도 위의 혼성화 요건이 충족되는 범위 내에서 천연 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 서열 동일성(identity) 또는 상보성은 변형과 무관하다.
예를 들어, 본 명세서에서 설명하는 ANGPTL3 dsRNA 내에서 상보적 서열은, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 하나 또는 두 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 염기-쌍을 이루는 것을 포함한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 서로에 대해 "완전히 상보적(fully complementary)"이라고 지칭될 수 있다. 두 개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시 하나 이상의 단일 가닥 돌출부(overhang)를 형성하도록 설계된 실시양태에서, 그러한 돌출부는 상보성 결정과 관련하여 불일치로 간주되지 않는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, ANGPTL3 dsRNA 제제는 길이가 19 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 하나와 길이가 20 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 다른 하나를 포함한다, 상기 더 긴 올리고뉴클레오티드가 더 짧은 올리고뉴클레오티드와 완전히 상보적인 19 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우에도 본 명세서에 기술된 목적에 따라 "완전히 상보적"이라고 언급할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "완전히 상보적"이란 제1 폴리뉴클레오티드의 연속적인 서열에 있는 모든(100%) 염기가 제2 폴리뉴클레오티드의 연속적인 서열에 있는 동일한 수의 염기와 혼성화된다는 것을 의미한다. 연속적인 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보적(substantially complementary)"이라는 용어는 혼성화된 한 쌍의 뉴클레오베이스 서열에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 연속적인 서열에 있는 염기의 적어도 약 85%(전부는 아니지만)가 제2 폴리뉴클레오티드의 연속적인 서열에 있는 동일한 수의 염기와 혼성화됨을 의미한다. "실질적으로 상보적(substantially complementary)"이라는 용어는 두 서열이 최대 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 염기쌍(bp)의 듀플렉스에 대해 혼성화 시 하나 이상, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 불일치 염기쌍을 포함하면서, 최종 용도와 가장 관련된 조건에서 혼성화 능력을 유지하는 경우, 제1 서열에 제2 서열이 관련하여 사용될 수 있다, 예: RISC 경로를 통한 ANGPTL3 유전자 발현 억제. 본 명세서에서 "부분적으로 상보적(partially complementary)"이라는 용어는 제1 폴리뉴클레오티드의 연속적인 서열에 있는 염기의 전부는 아니지만 적어도 75%가 제2 폴리뉴클레오티드의 연속적인 서열에 있는 동일한 수의 염기와 혼성화되는 뉴클레오베이스 서열의 혼성화 쌍과 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "부분적으로 상보적"이란, 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 제1 폴리뉴클레오티드 연속적인 서열의 염기가 제2 폴리뉴클레오티드 연속적인 서열의 동일한 수의 염기와 혼성화됨을 의미한다.
본 명세서에서 "상보적", "완전히 상보적", "실질적으로 상보적" 및 "부분적으로 상보적"이라는 용어는 ANGPTL3 dsRNA 제제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, ANGPTL3 dsRNA 제제의 안티센스 가닥과 표적 ANGPTL3 mRNA의 서열 사이, 또는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 ANGPTL3 mRNA의 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있다. "ANGPTL3 dsRNA 제제의 안티센스 가닥"이라는 용어는 "ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제"의 동일한 서열을 지칭할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 핵산 서열과 관련하여 사용되는 "실질적으로 동일(substantially identical)" 또는 "실질적 동일성(substantial identity)"이라는 용어는 참조 서열과 비교하여 적어도 약 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 서열 동일성 백분율은 비교 창(comparison window)에서 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하여 결정된다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치 수로 나눈 다음 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 계산한다. 본원에 개시된 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예: 표 1 내지 5). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 서열은 본원에 개시된 것과 정확히 동일하거나, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다(예: 표 1 내지 5).
본 명세서에서 사용되는 "서열을 포함하는 가닥(strand comprising a sequence)"이라는 용어는 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 언급된 서열로 설명되는 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "이중 가닥 RNA(double-stranded RNA)" 또는 "dsRNA"라는 용어는 표적 ANGPTL3 RNA에 대해 "센스" 및 "안티센스" 방향을 갖는 것으로 언급되는 2개의 반평행(anti-parallel)하고 실질적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥을 포함한 혼성화된 듀플렉스 영역이 있는 RNA 분자 또는 분자 복합체를 포함하는 RNAi를 지칭하는 용어이다. 듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 원하는 표적 ANGPTL3 RNA의 특정 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있지만, 일반적으로 길이가 9 내지 30 염기쌍 범위이다(예: 15~30염기쌍 길이). 9 내지 30 염기쌍 사이의 듀플렉스를 고려할 때, 듀플렉스는 이 범위의 임의의 길이, 예를 들어 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30, 및 그 사이의 하위 범위가 될 수 있다, 15-30 베이스 쌍, 15-26 베이스 쌍, 15-23 베이스 쌍, 15-22 베이스 쌍, 15-21 베이스 쌍, 15-20 베이스 쌍, 15-19 베이스 쌍, 15-18 베이스 쌍, 15-17 베이스 쌍, 18-30 베이스 쌍, 18-26 베이스 쌍, 18-23 베이스 쌍, 18-22 베이스 쌍, 18-21 베이스 쌍, 18-20 베이스 쌍, 19-30 베이스 쌍, 19-26 베이스 쌍, 19-23 베이스 쌍, 19-22 베이스 쌍, 19-21 베이스 쌍, 19-20 베이스 쌍, 20-30 베이스 쌍, 20-26 베이스 쌍, 20-25 베이스 쌍, 20-24 베이스 쌍, 20-23 베이스 쌍, 20-22 베이스 쌍, 20-21 베이스 쌍, 21-30 베이스 쌍, 21-26 베이스 쌍, 21-25 베이스 쌍, 21-24베이스 쌍, 21-23 베이스 쌍 또는 21-22 베이스 쌍을 포함하되, 이에 제한되지 않는다. Dicer 및 유사한 효소로 처리하여 세포에서 생성된 ANGPTL3 dsRNA 제제는 일반적으로 길이가 19-22 염기쌍 범위이다. ANGPTL3 dsDNA 제제의 듀플렉스 영역의 한 가닥은 표적 ANGPTL3 RNA의 영역과 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 듀플렉스 구조를 형성하는 두 가닥은 적어도 하나의 자기 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로부터 형성될 수도 있고, 두 개 이상의 개별 RNA 분자로부터 형성될 수도 있다. 듀플렉스 영역이 단일 분자의 두 가닥으로부터 형성되는 경우, 분자는 한 가닥의 3'-끝과 듀플렉스 구조를 형성하는 각각의 다른 가닥의 5'-끝 사이에 단일 가닥 뉴클레오티드 사슬(이하 "헤어핀 루프(hairpin loop)"라 함)로 분리된 듀플렉스 영역을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 헤어핀 모양은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 쌍을 이루지 않은(unpaired) 뉴클레오티드를 포함한다. ANGPTL3 dsRNA 제제의 실질적으로 상보적인 두 가닥은 별도의 RNA 분자로 포함되는 경우, 상기 분자는 반드시 연결될 필요는 없지만 공유 결합으로 연결될 수 있다. 두 가닥이 헤어핀 루프가 아닌 다른 방법으로 공유 결합으로 연결된 경우, 연결 구조를 "링커(linker)"라고 한다. "siRNA"라는 용어는 본 명세서에서 설명된 대로 dsRNA 제제를 지칭하기 위해 사용되기도 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 dsRNA 제제의 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 짝을 이루지 않는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 없는 센스 및 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드가 없는 끝을 "뭉툭한 끝(blunt end)"이라고 하며 뉴클레오티드 돌출부가 없는 것으로 지칭한다. dsRNA 제제의 양쪽 끝이 뭉툭한 경우, 상기 dsRNA를 "뭉툭한 끝(blunt ended)"이라고 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, dsRNA 제제의 제1 끝은 뭉툭하다, 일부 실시양태에서 dsRNA 제제 제2 끝은 뭉툭하다. 그리고 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제의 양쪽 끝이 모두 뭉툭하다.
본 발명의 일부 실시양태에서, dsRNA는 하나 또는 두 개의 뭉툭한 끝을 갖지 않는다. 이러한 경우, dsRNA 제제의 가닥 끝에 적어도 하나의 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드가 있다. 예를 들어, 한 가닥의 3'-끝이 다른 가닥의 5'-끝을 넘어 확장되거나 그 반대의 경우 뉴클레오티드 돌출부가 존재한다. dsRNA는 적어도 e1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 돌출부가 포함될 수 있다. 뉴클레오티드 돌출부는 데옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide)/뉴클레오시드(nucleoside)를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 구성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 돌출부는 dsRNA 제제의 센스 가닥, dsRNA 제제의 안티센스 가닥, 또는 dsRNA 제제의 양 끝에 존재하고, 돌출부의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5' 끝, 3' 끝 또는 양 끝에 존재할 수 있음을 이해하게 될 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 돌출부의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 뉴클레오시드 티오포스페이트로 치환된다.
본 명세서에서 사용되는 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"이라는 용어는 ANGPTL3 표적 서열과 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 ANGPTL3 dsRNA 제제의 가닥을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥"은 ANGPTL3 dsRNA 제제의 안티센스 가닥의 영역과 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 ANGPTL3 dsRNA 제제의 가닥을 지칭한다.
변형(Modifications)
본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 RNAi 제제의 RNA는 안정성 및/또는 하나 이상의 다른 유익한 특성을 향상시키기 위해 화학적으로 변형된다. 본 발명의 특정 실시양태에서 핵산은 당업자에게 잘 확립된 방법, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되어 있는 "핵산 화학의 최신 프로토콜", Beaucage, S. L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y, USA에 기술된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 특정 실시양태에 존재할 수 있는 변형은, 예를 들어, (a) 끝 변형 (예: 5' 끝 변형(인산화(phosphorylation), 접합(conjugation), 역위된 결합(inverted linkage) 등) 3' 끝 변형(접합, DNA 뉴클레오티드, 역위된 결합 등)), (b) 염기 변형, (예: 안정화 염기, 불안정화 염기 또는 확장된 파트너 레퍼토리와 염기쌍을 이루는 염기로의 교체, 염기(비염기성 뉴클레오티드)의 제거 또는 접합된 염기) (c) 당(sugar) 변형(예: 2' 위치 또는 4' 위치) 또는 당 교체, (d) 포스포디에스테르 결합(phosphodiester linkages)의 변형 또는 교체를 포함한 백본(backbone) 변형이 모두 포함된다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시양태에서 유용한 RNA 화합물의 구체적 예는 변형된 백본을 포함하거나 천연 뉴클레오시드간 연결이 없는 RNA를 를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비제한적인 예로서, 변형된 백본을 갖는 RNA는 백본에 인(phosphorus) 원자를 갖지 않을 수 있다. 뉴클레오시드간(internucleoside) 백본에 인 원자가 없는 RNA는 올리고뉴클레오시드라고 할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 변형된 RNA는 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖는다.
"RNA 분자" 또는 "RNA" 또는 "리보핵산 분자"라는 용어는 자연에서 발현되거나 발견되는 RNA 분자뿐만 아니라 본 명세서 또는 당업자에게 알려진 바와 같이 하나 이상의 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체로 포함된 RNA의 유사체 및 유도체도 포함하는 것으로 이해될 것이다. "리보뉴클레오시드(ribonucleoside)" 및 "리보뉴클레오티드"라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. RNA 분자는 예를 들어, 아래에 설명된 바와 같이 뉴클레오베이스 구조 또는 리보스(ribose)-인산(phosphate) 백본 구조에서 변형될 수 있으며, 리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 분자는 듀플렉스를 형성하는 능력을 유지해야 한다. 비제한적인 예로서, RNA 분자는 또한 2'-O-메틸(2'-O-methyl) 변형 뉴클레오시드, 5' 포스포로티오에이트기(5' phosphorothioate group)를 포함하는 뉴클레오시드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데카노산 비스데실아마이드기(cholesteryl derivative or dodecanoic acid bisdecylamide group)에 연결된 말단 뉴클레오시드, 잠긴(locked) 뉴클레오시드, 비염기성(abasic) 뉴클레오시드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-deoxy-2'-fluoro) 변형 뉴클레오시드, 2'-아미노 변형(2'-amino-modified) 뉴클레오시드, 2'-알킬 변형 뉴클레오시드, 모폴리노(morpholino) 뉴클레오시드, 포스포라미드산염(phosphoramidate) 또는 뉴클레오시드를 포함하는 비-천연 염기, 또는 이들의 임의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 적어도 하나의 변형 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, RNA 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 변형 리보뉴클레오시드인 ANGPTL3 dsRNA 제제 분자의 리보뉴클레오시드 전체 길이를 포함한다. RNA 분자 내의 다수의 변형된 리보뉴클레오시드 각각에 대한 변형이 같을 필요는 없다.
본 발명의 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드는 일부 실시양태에서 하나 이상의 독립적으로 선택된 변형 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 비-포스포디에스테르 연결(non-phosphodiester linkage)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "독립적으로 선택된"이라는 용어는 변형 뉴클레오티드, 비-포스포디에스테르 연결 등과 같은 선택된 요소(selected element)와 관련하여 사용되는 것으로, 둘 이상의 선택된 요소가 서로 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "뉴클레오티드 염기", "뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오베이스"는 모든 핵산의 표준 구성 요소인 헤테로사이클릭 피리미딘(heterocyclic pyrimidine) 또는 퓨린(purine) 화합물이며, 뉴클레오티드 아데닌(a), 구아닌(g), 사이토신(c), 티민(t), 및 우라실(u)을 형성하는 염기를 포함한다. 뉴클레오베이스는 범용(universal) 염기, 소수성(hydrophobic) 염기, 비특이적(promiscuous) 염기, 크기 확장 염기 및 불소화 염기(fluorinated base )를 포함하도록 추가로 변형될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 본 명세서에서 변형되지 않은 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 대리 대체 모이티(surrogate replacement moiety)를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 구아닌, 사이토신, 아데닌 및 우라실이 그러한 대체 모이티를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이티로 대체될 수 있음을 인식할 것이다.
일 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 변형된 RNA는 필요한 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 가지며, RISC 경로를 통해 표적 RNA의 특정 분해를 허용하거나 매개하는 펩타이드 핵산(PNA)이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 RNA 간섭제(interference agent)는 표적 ANGPTL3 RNA 서열과 상호 작용하여 표적 ANGPTL3 RNA의 분해를 지시하는 단일 가닥 RNA를 포함한다.
변형된 RNA 백본은 예를 들어 포스포로티오산염(phosphorothioate), 키랄 포스포로티오산염(chiral phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 포스파라미디데이트(phosphoramidate)(3'- 아미노포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트(aminoalkylphosphoramidate) 포함), 티오노포스포라미데이트(thionophosphoramidate), 티오노알킬포스포네이트(thionoalkylphosphonate), 티오노알킬포스포트리에스테르(thionoalkylphosphotriester) 및 정상적인 3'-5' 결합을 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 그리고 인접한 뉴클레오시드 단위 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역위된 극성을 가진 것들이 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태도 또한 포함된다. 인 함유 결합를 제조하는 수단은 당업에서 일상적으로 실시되며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형 ANGPTL3 dsRNA 제제, 특정 변형 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 특정 변형 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하는 데 사용될 수 있다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 백본은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결(internucleoside linkages), 혼합 이종 원자와 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 이종 원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결로 형성되는 백본을 갖는다. 여기에는 모폴리노 연결(부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성됨); 실록산 백본; 황화물(sulfide); 설폭사이드(sulfoxide) 및 설폰 백본; 포르마세틸(formacetyl) 및 티오포르마세틸(thioformacetyl) 백본; 메틸렌 포르마세틸 및 티오포르마세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 기타 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합되어 있는 백본을 갖는 것이 포함된다. 인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 백본을 제조하는 방법은 당업에서 일상적으로 실시되고 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형된 ANGPTL3 dsRNA 제제, 특정 변형된 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 특정 변형된 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, RNA 모방체는 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉 백본을 새로운 그룹으로 대체하는 것과 같은 방식으로 ANGPTL3 dsRNA, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드에 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 실시양태에서, 염기 단위는 적절한 ANGPTL3 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 이러한 올리고머 화합물 중 하나인 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 RNA 모방체를 펩타이드 핵산(PNA)이라고 한다. PNA 화합물에서, RNA의 당 백본은 아미드를 포함하는 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오베이스는 유지되며 백본의 아미드 부분의 아자(aza) 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. RNA 모방체를 제조하는 수단은 당업에서 일상적으로 실시되고 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형된 ANGPTL3 dsRNA 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 백본을 갖는 RNA 및 이종 원자(heteroatom) 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드, 특히 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2-- [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려짐], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2---- [상기 네이티브 포스포디에스테르 백본은 --O--P--O--CH2--으로 나타냄]가 포함된다. 포스포로티오에이트 백본을 갖는 RNA 및 이종 원자 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드를 제조하는 방법은 당업에서 일상적으로 실시되고 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형 ANGPTL3 dsRNA제, 특정 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 특정 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이티를 포함할 수 있다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드, 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O--, S-- 또는 N-알킬; O--, S-- 또는 N-알케닐; O--, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 에서 C10 알케닐 및 알키닐로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 예시적인 적합한 변형으로는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, and O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, 상기 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시양태에서, dsRNA는 2' 위치에 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 하부 알킬, 치환된 하부 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O- 아랄킬, SH, SCH3 , OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리 알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 그룹, 리포터 그룹, 인터칼레이터(intercalator), ANGPTL3 dsRNA 제제의 약동학적(pharmacokinetic) 특성을 향상하기 위한 그룹, 또는 ANGPTL3 dsRNA 제제의 약력학적(pharmacodynamic) 특성을 향상하기 위한 그룹, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체. 일부 실시양태에서, 변형은 2'-메톡시 에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려져 있음) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 2'- 디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2) 2ON(CH3)2 그룹, 2'-DMAOE로도 알려져 있으며, 아래 예시에 설명된 바와 같다, 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업에서는 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려짐), 즉, 2'-O--CH2-O--CH2--N(CH2)2 이다. 기술된 바와 같은 변형된 RNA를 제조하는 방법은 당업자에게 일상적으로 실시되고 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형된 ANGPTL3 dsRNA 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다.
다른 변형으로는 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2 ) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드의 RNA의 다른 위치에서도 이루어질 수 있다, 특히 3' 말단 뉴클레오티드의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 ANGPTL3 dsRNA, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드에서, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 이루어질 수 있다. ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드는 펜토푸라노실 당(pentofuranosyl sugar) 대신 시클로부틸 모이티(cyclobutyl moieties)와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 기술된 것과 같은 변형된 RNA를 제조하는 방법은 당업자에게 일상적으로 실시되며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형된 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하는 데 사용될 수 있다.
ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드는 일부 실시양태에서, 뉴클레오베이스(본원에서 종종 단순히 "염기"로 지칭되는) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "변형되지 않은(unmodified)" 또는 "천연(natural)" 뉴클레오베이스는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오베이스에는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신(cytosine), 크산틴(xanthine), 하이폭산틴(hypoxanthine), 2- 아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오라실(2-thiouracil), 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 에이널(hydroxyl anal) 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자데닌과 같은 기타 합성 및 천연 뉴클레오베이스가 포함된다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 특정 실시양태에 포함될 수 있는 추가 뉴클레오베이스는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 다음과 같다: 생화학, 생명공학 및 의학에서의 변형 뉴클레오시드, Herdewijn, P. Ed. Wiley-VCH, 2008; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, Ed. John Wiley & Sons, 1990, English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. 본 명세서에 기술된 것과 같은 뉴클레오베이스 변형 및/또는 치환을 포함하는 dsRNA, ANGPTL3 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 가닥 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당업자에게 일상적으로 실시되며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시양태는 하나 이상의 잠긴 핵산(locked nucleic acid, LNA)을 포함하도록 변형된 RNA를 포함한다. 잠긴 핵산은 2'와 4' 탄소를 연결하는 추가 브리지를 포함하는 변형된 리보스 모이티를 가진 뉴클레오티드를 말한다. 상기 구조는 리보스를 3'-엔도(endo) 구조 형태로 효과적으로 "잠그는(lock)" 역할을 한다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드에 잠긴 핵산을 첨가하면 혈청 내 안정성을 높이고 표적 이탈 효과를 줄일 수 있다(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, O R. et al., (2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 잠긴 핵산(들)을 포함하는 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당업자에게 일상적으로 실시되며, 이러한 방법은 본 발명의 특정 변형 ANGPTL3 dsRNA 제제를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 화합물, 센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시양태는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 다음을 포함한다: 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'3'-세코(seco) 뉴클레오티드 유사체, 잠금 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메토옥시에틸 뉴클레오티드, 2'- 아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모폴리노 뉴클레오티드 및 3'-OMe 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테릴 유도체 또는 도데카노산 비스데실아마이드기에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-아미노 변이 뉴클레오티드, '포스포라미데이트 또는 비-천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 화합물은 안티센스 가닥의 5´ 끝에 E-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 포함하며, 본 명세서에서 가이드 가닥(guide strand)이라고도 한다.
본 발명의 특정 실시양태에서 ANGPTL3 dsRNA 화합물, 센스 폴리뉴클레오티드의 3' 및 5' 끝, 및/또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 3' 끝은 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 다음을 포함한다: 비염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역위된 뉴클레오티드, 역위된 비염기성 뉴클레오티드, 역위된 2'-OMe 뉴클레오티드, 역위된 2'-데옥시 뉴클레오티드. 당업자에게는 올리고 뉴클레오티드 끝에 비염기성 또는 역 비염기성 뉴클레오티드가 포함시키는 것이 안정성을 향상시키는 것으로 알려져 있다(Czauderna et al. Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003;31(11):2705-2716. doi:10.1093/nar/gkg393).
본 발명의 특정 실시양태에서 ANGPTL3 dsRNA 화합물, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 잠금 해제된 핵산 뉴클레오티드(UNA) 또는/및 글리콜 핵산 뉴클레오티드(GNA)를 포함한다. 당업자에게는 UNA 및 GNA가 열적으로 불안정한 화학적 변형으로 알려져 있으며, siRNA 화합물의 오프-표적 프로파일(off-target profile )을 크게 개선할 수 있다 Janas, et al., Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity. Nat Commun. 2018;9(1):723. doi:10.1038/s41467-018-02989-4; Laursen et al., Utilization of unlocked nucleic acid (UNA) to enhance siRNA performance in vitro and in vivo. Mol BioSyst. 2010;6:862-70).
본 발명의 특정 실시양태의 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드의 RNA에 포함될 수 있는 또 다른 변형은, ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특성을 각각 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이티 또는 접합을 RNA에 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 향상될 수 있는 특성의 예는 제한되지 않는다: ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드 활성, 세포 분포(cellular distribution), ANGPTL3 dsRNA 제제의 전달, ANGPTL3 dsRNA 제제의 약동학적 특성, 및 ANGPTL3 dsRNA 제제의 세포 흡수(cellular uptake). 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 하나 이상의 표적기 또는 연결기를을 포함하며, 특정 실시양태에서 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 센스 가닥에 접합되어 있다. 표적기의 비제한적인 예는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 화합물이다. "표적기", "표적제", "연결제(linking agent)", "표적 화합물", 및 "표적 리간드"라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 접합된 표적 화합물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-말단에 접합된 표적 화합물을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 GalNAc를 포함하는 표적기를을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-말단 끝 및 5'-말단 끝 중 하나 또는 둘 모두에 접합된 표적 화합물을 포함하지 않는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단 끝 및 3'-말단 끝 중 하나 또는 둘 모두에 접합된 표적화 화합물을 포함하는 GalNAc를 포함하지 않는다.
추가적인 표적 및 연결제는 당업자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 표적 및 연결제는 콜레스테롤 모이티(Letsinger et al, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(cholic acid)(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어 베릴-S-트리틸티올(beryl-S-tritylthiol)(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질(phospholipid), 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-di-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid) (Manoharan et al., Tetrahedron Lett, 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐옥시콜레스테롤 모이티Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)와 같은 지질 모이티를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 특정 실시양태는 ANGPTL3 dsRNA 제제의 분포, 표적 등을 변경하는 리간드를 포함할 수 있다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 포함하는 조성물의 일부 실시양태에서, 리간드는 예를 들어, 그러한 리간드가 없는 종과 비교하여, 선택된 표적, 예를 들어 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체 부위에 대한 친화성(affinity)을 증가시킨다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법에 유용한 리간드는 단백질(예: 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 저밀도 지단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예: 덱스트란, 풀룰란(pullulan), 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질 등 자연적으로 발생하는 물질일 수 있다. 리간드는 합성 중합체(예: 합성 폴리아미노산 또는 폴리아민)와 같은 재조합 또는 합성 분자일 수도 있다. 폴리 아미노산의 예로는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산(poly L-aspartic acid), 폴리 L-글루탐산(poly L-glutamic acid), 스티렌-말레산 무수물 공중합체(styrene-maleic acid anhydride copolymer), 폴리(L-락티드-공-글리콜리드) 공중합체(L-lactide-co-glycolied) copolymer), 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진이 있다. 폴리아민의 예로는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리라이신(polylysine, PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염(quaternary salt of a polyamine), 또는 알파 나선형 펩타이드(alpha helical peptide)를 포함한다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법에 포함된 리간드는 세포 또는 조직 표적제, 예를 들어 렉틴, 당단백질(glycoprotein), 지질 또는 단백질, 예를 들어 신장 세포 또는 간 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체와 같은 표적기를을 포함할 수 있으며, 그 예는 제한되지 않는다. 표적기는 티로트로핀(thyrotropin), 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A(surfactant protein A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스( multivalent lactose), 다가 갈락토스(multivalent galactose), N-아세틸-갈락토사민(N-acetyl-galactosamine), N-아세틸-글루코사민 다가 만노스(N-acetyl-gulucosamine multivalent mannose), 다가 푸코스(multivalent fucose), 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트(polyglutamate), 폴리아스파르테이트(polyaspartate), 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산(bile acid), 엽산(folate), 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴(biotin), 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다,
리간드의 다른 예로는 염료, 인터칼레이팅제(intercalating agent )(예: 아크리딘), 가교제(예: 소랄렌(psoralene), 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환방향족탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons )(예: 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도핵 효소(artificial endonucleases )(예: EDTA), 지친성 분자(lipophilic molecule), 예: 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산(1-pyrene butyric acid), 디하이드로테스토스테론, 1,3-Bis-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기(geranyloxyhexyl group), 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올(1,3-propanediol), 헵타데실기, 팔미트산, 미리스틱산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜레닉산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 접합체(peptide conjugates)(예: 안테나피디아 펩타이드(antennapedia peptide), 타트 펩타이드(Tat peptide)), 알킬화제(alkylating agent), 인산염(phosphate), 아미노(amino), 머캅토(mercapto), PEG(예: PEG-40K), MPEG, [MPEG]2 , 폴리아미노, 알킬, 치환 알킬, 방사성 표지 마커(radiolabeled marker), 효소, 합텐(예: 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레시즈(ribonucleases)(예: 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, Eu3+ 테트라아자마이크로사이클 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법에 포함된 리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질 또는 펩타이드, 예를 들어 공동 리간드(co-ligand)에 대한 특정 친화성을 갖는 분자, 또는 항체일 수 있다(예를 들어. 암세포, 내피 세포, 심장 세포 ,또는 뼈 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체). 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 실시양태에서 유용한 리간드는 호르몬 또는 호르몬 수용체일 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 실시양태에서 유용한 리간드는 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 코팩토스(cofactos), 다가 락토스(multivalent lactose), 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 또는 다가 푸코스(multivalent fucose)일 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 실시양태에서 유용한 리간드는 예를 들어, 세포의 세포골격을 방해함으로써, 예를 들어 세포의 미세소관(microtubules), 미세 필라멘트(microfilaments) 및/또는 중간 필라멘트(intermediate filaments)를 방해함으로써, 세포 내로 ANGPTL3 dsRNA 제제의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질일 수 있다. 이러한 유형의 제제의 비제한적인 예로는 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트룬쿨린 A(latrunculin A), 팔로이딘, 스윈홀라이드 A, 인다노신 및, 미오서빈이 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제에 부착된 리간드는 약동학(PK) 조절제로서 기능한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 PK 조절제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 친지질(lipophiles), 담즙산(bile acid), 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG, 비타민, 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고리피드, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴, 혈청 단백질과 결합하는 압타머(aptamer) 등을 포함하나 이에 국한되지 않습니다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드도 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으므로, 짧은 올리고뉴클레오티드(예: 백본에 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 약 5염기, 10염기, 15염기 또는 20염기의 올리고뉴클레오티드)는 리간드로서 본 발명 조성물 및/또는 방법에 사용될 수 있다.
ANGPTL3 dsRNA 제제 조성물(ANGPTL3 dsRNA agent compositions)
본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 조성물 내에 존재한다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체, 전달제, 표적제, 검출 가능한 라벨(detectable label) 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에 따라 유용할 수 있는 표적제의 비제한적인 예는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 치료 대상 세포로 및/또는 세포 내로 유도하는 제제이다. 선택되는 표적제는 다음과 같은 요소에 따라 달라질 수 있다: ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 특성 및 표적화되는 세포 유형. 비제한적인 예로서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 간 세포에 및/또는 간 세포로 ANGPTL3 dsRNA 제제를 표적하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 치료제는 추가적인 부착 요소 없이, 전달제 (예를 들어 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 전달제)만을 갖는 ANGPTL3 dsRNA 제제를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일부 측면에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 GalNAc를 포함하는 전달 화합물에 부착되고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 포함되며 ANGPTL3 dsRNA 제제에 부착된 검출 가능한 라벨, 또는 표적제 등이 없이 세포 또는 대상에 투여될 수 있다.
본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제가 하나 이상의 전달제, 표적제, 표지제(labeling agent) 등과 함께 및/또는 부착되어 투여되는 경우, 당업자는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 제제를 선택하고 사용할 수 있을 것이다. 표지제는 본 발명의 특정 방법에서 세포 및 조직에서 ANGPTL3 dsRNA 제제의 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 본 발명의 방법에서 투여된 ANGPTL3 dsRNA 제제를 포함하는 치료 조성물의 세포, 조직 또는 기관(organ) 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 효소 표지) enzymatic label), 염료, 방사성 표지 등과 같은 표지제를 부착하고 활용하는 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 표지제는 ANGPTL3 dsRNA 제제에 포함된 센스 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다에 부착되는 것으로 이해될 것이다.
ANGPTL3 dsRNA 제제 및 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 전달(Delivery of ANGPTL3 dsRNA agents and ANGPTL3 antisense polynucleotide agents)
본 발명의 방법의 특정 실시양태는 ANGPTL3 dsRNA 제제를 세포 내로 전달하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어인 '전달(delivery)'은 세포로의 흡수(uptake) 또는 흡수(absorption)를 촉진하거나 영향을 미치는 것을 의미한다. ANGPTL3 dsRNA 제제의 흡수 또는 흡수(Absorption or uptake)는 비보조 확산(unaided diffusive) 또는 활성 세포 과정(active cellular processes)을 통해, 또는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제와 연관될 수 있는 전달제, 표적제 등을 사용하여 발생할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 전달 수단은 다음을 포함하되 이에 한정되지 않는다: 생체 내(in vivo) 전달, ANGPTL3 dsRNA 제제가 조직 부위에 주입되거나 전신적으로 투여되는 생체 내 전달. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 전달제에 부착된다.
세포, 조직 및/또는 대상체에게 ANGPTL3 dsRNA 제제를 전달하는 데 사용할 수 있는 방법의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: ANGPTL3 dsRNA-GalNAc 접합체, SAMiRNA 기술, LNP 기반 전달 방법, 네이키드 RNA(naked RNA) 전달. 이러한 전달 방법 및 기타 전달 방법은 간 질환, 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria, AIP), 혈우병, 폐섬유증(pulmonary fibrosis) 등과 같은 다양한 질병 및 병태의 치료를 위한 치료용 RNAi 제제를 전달하기 위해 당업에서 성공적으로 사용되어 왔으나, 이에 제한되지 않는다. 다양한 전달 수단에 대한 자세한 내용은 다음과 같은 간행물에서 확인할 수 있다: Nikam, R.R. & K. R. Gore (2018) Nucleic Acid Ther, 28 (4), 209-224 Aug 2018; Springer A.D. & S.F. Dowdy (2018) Nucleic Acid Ther. Jun 1; 28(3): 109-118; Lee, K. et al., (2018) Arch Pharm Res, 41(9), 867-874; and Nair, J.K. et al., (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961, 각 내용은 여기에 참조로 통합되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)를 사용하여 세포, 조직 및/또는 대상체에 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 전달하는 것을 포함한다. LNP는 치료용 ANGPTL3 dsRNA 제제를 포함하여 ANGPTL3 dsRNA 제제의 생체 내 전달에 일상적으로 사용된다. LNP 또는 기타 전달제를 사용하는 것의 한 가지 이점은 LNP 또는 기타 전달제를 사용하여 대상체에게 전달될 때 ANGPTL3 RNA 제제의 안정성이 증가한다는 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, LNP는 본 발명의 하나 이상의 ANGPTL3 RNAi 분자가 로드된 양이온성(cationic) LNP를 포함한다. ANGPTL3 RNAi 분자를 포함하는 LNP를 대상체에 투여하면, LNP 및 이에 부착된 ANGPTL3 RNAi 분자가 세포 내 수용을 통해(via endocytosis) 세포에 흡수되고, 그 존재는 RNAi를 매개하는 RNAi 트리거 분자(RNAi trigger molecule)의 방출을 초래한다.
세포, 조직 및/또는 대상체에 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 전달하기 위해 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있는 전달제의 또 다른 비제한적인 예는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제에 부착되어 세포, 조직 및/또는 대상체에 ANGPTL3 dsRNA 제제를 전달하는 GalNAc를 포함하는 제제이다. 본 발명의 방법 및 구성의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 GalNAc를 포함하는 특정 추가 전달제의 예는 PCT 출원 (WO2020191183A1)에 개시되어 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 세포에 ANGPTL3 dsRNA 제제를 전달하기 위해 사용할 수 있는 GalNAc 표적 리간드의 비제한적인 예는 표적 리간드 클러스터(targeting ligand cluster)이다. 본 명세서에 제시된 표적 리간드 클러스터의 예는 다음과 같다: 포스포디에스테르 링크가 있는 GalNAc 리간드(GalNAc Ligand with phosphodiester link, GLO) 및 포스포로티오에이트 링크가 있는 GalNAc 리간드(GalNAc Ligand with phosphorothioate link, GLS). 본 명세서에서 "GLX-n"이라는 용어는 첨부된 GalNAC 함유 화합물이 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15, 및 GLO-16 중 어느 하나임을 나타내는 데 사용될 수 있다, 각각의 구조는 아래에 나타내어 있으며, 각각의 맨 오른쪽에 본 발명의 RNAi 제제에 대한 GalNAc 표적 리간드의 부착 위치("" 로 표시됨)가 아래에 나타내어 있다. 본 발명의 임의의 RNAi 및 dsRNA 분자는 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15, and GLO-16, GLO-1부터 GLO-16까지 및 GLS-1부터 GLS-16까지의 구조에 부착될 수 있음을 이해할 것이다.
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본 발명의 일부 실시양태에서, 생체 내 전달은 또한 미국 특허 출원 제5,032,401호 및 제5,607,677호 및 미국 공개번호 2005/0281781에 기술된 것과 같은 베타글루칸 전달 시스템에 의해 이루어질 수 있으며, 이는 본 명세서 전체에 참조로 통합되어 있다. ANGPTL3 RNAi 제제를 세포에 시험관 내(In vitro)에서 도입하는 것은 또한 전기천공(electroporation) 및 리포펙션(lipofection)과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA는 표적제 없이 전달된다. 이러한 RNA는 "네이키드(naked)" RNA 분자로 전달될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA는 GalNAc 표적 화합물과 같은 표적제는 포함하지 않고, RNAi 제제를 포함하는 약학적 조성물에서 간 질환과 같은 대상체의 ANGPTL3 관련 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 기술된 특정 전달 수단 외에도, 본원에 기술된 것들 및 당업계에서 사용되는 것과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, RNAi 전달 수단은 본원에 기술된 ANGPTL3 RNAi 제제 및 치료 방법의 실시양태와 함께 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 세포 및/또는 대상체에서 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준 및 활성을 감소시키는 데 효과적인 양 및 방식으로 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 ANGPTL3 발현 및 활성과 관련된 질병 또는 병태를 치료하기 위해 세포 및/또는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 방법은, 일부 실시양태에서, 투여하여 대상체의 ANGPTL3 발현과 관련된 질병 또는 병태를 감소시키기 위해 그러한 치료가 필요한 대상체에게 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 세포 중 하나 이상에서 ANGPTL3 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 세포 내 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준, 따라서 활성은 세포에 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달(예를 들어, 도입(introducing))함으로써 감소된다. 표적제 및 방법은 특정 세포 유형(cell type), 세포 아형(cell subtype), 장기(organ), 대상 내 공간 영역(spatial region) 및/또는 세포 내 하위 세포 영역으로 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 전달을 돕기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 방법에서 ANGPTL3 dsRNA 제제는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 ANGPTL3 dsRNA 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4 또는 그 이상의 독립적으로 선택된 ANGPTL3 dsRNA 제제가 대상체에게 투여된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하기 위한 하나 이상의 추가 치료 요법과 함께 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하기 위해 ANGPTL3 dsRNA 제제를 대상체에게 투여한다. 추가 치료 요법의 비제한적인 예는 본 발명의 하나 이상의 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 투여, 비-ANGPTL3 dsRNA 치료제의 투여, 및 행동 수정(behavioral modification이다. 추가 치료 요법은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 투여 전, 투여와 동시에, 투여 후 중 하나 이상의 시점에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 동시 투여는, 시간 제로로부터 5분 이내, 시간 제로로부터 10분 이내, 시간 제로로부터 30분 이내, 시간 제로로부터 45분 이내, 및 시간 제로로부터 60분 이내, "시간 제로(time zero)"는 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 투여의 시간임을 이해할 것이다. 비-ANGPTL3 dsRNA 치료제의 비제한적인 예는: 하나 이상의 스타틴; 하나 이상의 항체, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 또는 프로단백질 전환 효소 서브틸신/켁신 9형(proprotein convertase subtilsin/kexin type 9, PCSK9) 발현을 감소시킬 수 있는 siRNA 분자(German CA, Shapiro MD. Small Interfering RNA Therapeutic Inclisiran: A New Approach to Targeting PCSK9. BioDrugs. 2020 Feb;34(1):1-9. Doi: 10.1007/s40259-019-00399-6. PMID: 31782112.); 대상체에서 지질 축적을 감소시킬 수 있는 치료제 및 대상체에서 콜레스테롤 수준 및/또는 축적을 감소시킬 수 있는 치료제. 행동 수정의 비제한적인 예로는 식이요법, 상담 및 운동 요법이 있다. 이들 및 기타 치료제 및 행동 수정은 당업자에게 공지되어 있으며, 대상체의 ANGPTL3 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용되며, ANGPTL3 질병 또는 병태를 치료하기 위해 본 발명의 하나 이상의 ATGPTL3 dsRNA 제제의 투여와 함께 대상체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 ANGPTL3 관련 질환 또는 병태를 치료하기 위해 세포 또는 대상체에 투여되는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 하나 이상의 다른 치료제 또는 활성과 시너지 방식으로 작용하고 하나 이상의 치료제 또는 활성의 효과를 증가시키고/하거나 ANGPTL3 관련 질환 또는 병태를 치료하기 위한 ANGPTL3 dsRNA 제제의 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 ANGPTL3 dsRNA 제제의 투여를 포함하는 것으로, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태가 발병하기 전 및/또는 질병 또는 병태의 초기 단계, 중간 단계 및 후기 단계 및 이들 모든 단계 전후를 포함하여 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태가 존재하는 경우에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 위한 하나 이상의 다른 치료제 및/또는 치료 활동이 성공적이지 못했거나, 최소한의 성공이 있었거나/또는 더 이상 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 성공하지 못한 하나 이상의 다른 치료제로 이전에 치료를 받은 적이 있는 대상체를 치료하는 것일 수도 있다.
벡터 인코딩 dsRNA (Vector Encoded dsRNAs )
본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 벡터를 사용하여 세포 내로 전달될 수 있다. ANGPTL3 dsRNA 제제 전사 유닛(transcription unit)은 DNA 또는 RNA 벡터에 포함될 수 있다. 세포 및/또는 대상체에 서열을 전달하기 위한 형질전환 유전자(transgene)를 인코딩(encoding)하는 이러한 벡터의 제조 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법에서 벡터는 ANGPTL3 dsRNA의 일시적(transient) 발현을 초래하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10시간 이상, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상 동안). 일시적 발현의 길이는 선택된 특정 벡터 구조와 표적 세포 및/또는 조직과 같은 요소에 기반한 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 형질전환 유전자는 선형 구조, 원형 플라스미드, 또는 바이러스 벡터로 도입될 수 있으며, 이는 통합 또는 비통합 벡터가 될 수 있다. 또한 형질전환 유전자는 염색체 외 플라스미드로 유전될 수 있도록 설계될 수도 있다(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. USA (1995) 92:1292).
ANGPTL3 dsRNA 제제의 개별 가닥은 발현 벡터의 프로모터(promoter)로부터 전사될 수 있다. 예를 들어, dsRNA를 생성하기 위해 두 개의 별도의 가닥이 발현되어야 하는 경우, 두 개의 별도의 발현 벡터를 트랜스펙션(transfection)이나 감염(infection)과 같은 수단을 사용하여 세포에 공동으로 도입할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 각 개별 가닥은 동일한 발현 벡터에 포함된 두개의 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제는 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 결합된 역위된 반복 폴리뉴클레오티드로서 발현되어 ANGPTL3 dsRNA 제제가 스템 및 루프 구조를 갖도록 한다.
RNA 발현 벡터의 비제한적인 예로는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 있다. 본 발명의 실시양태에서 유용한 발현 벡터는 진핵 세포(eukaryotic cell)와 호환될 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업에서 일상적으로 사용되며 여러 상업적 출처에서 구할 수 있다. ANGPTL3 dsRNA 발현 벡터의 전달은 정맥 또는 근육 내 투여, 대상체로부터 채취된 표적 세포에 투여한 후 대상체에 재도입하는 방법, 또는 원하는 표적 세포에 도입할 수 있는 다른 수단을 통해 전신적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법의 실시양태에 포함될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 다음을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: (a) 아데노 바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus) 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노 관련 바이러스 벡터; (d) 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex virus vectors); (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마(polyoma) 바이러스 벡터; (g) 파필로마(papilloma) 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스(picornavirus) 벡터; (i) 오토폭스(orthopox)(예: 백신 바이러스 벡터)나 아비폭스(avipox (예: 카나리 폭스(canary pox)나 가금 포크스(fowl pox))와 같은 폭스(pox) 바이러스 벡터; (j) 헬퍼-의존적 또는 장내 바이러스가 없는 아데노바이러스(helper-dependent or gutless adenovirus). ANGPTL3 dsRNA 제제의 재조합 발현을 위한 구성물(Construct)은 프로모터, 인헨서 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있으며, 이는 구성적 또는 조절/유도적 발현을 제공하기 위해 선택될 수 있는 수 있다. 바이러스 벡터 시스템, 프로모터 및 인핸서(enhancer) 등의 사용은 당업에서 통상적이며 본 명세서에 설명된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에는 ANGPTL3 dsRNA 제제를 세포 내로 전달하기 위한 바이러스 벡터의 사용이 포함된다. 예를 들어, 폐, 간, 중추 신경계, 내피 세포, 및 근육에 전달하기 위해 수많은 아데노 바이러스 기반 전달 시스템이 일상적으로 당업에서 사용된다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 다음과 같다: AAV 벡터, 백시니아 바이러스(vaccinia virus와 같은 수두 바이러스(pox virus), 변형 바이러스 앙카라(Modified Virus Ankara, MVA), NYVAC, 수두(fowl pox) 또는 카나리아 수두(canary pox)와 같은 아비폭스(avipox).
본 발명의 특정 실시양태는 벡터를 사용하여 ANGPTL3 dsRNA 제제를 세포 내로 전달하는 방법을 포함하며, 이러한 벡터는 유전자 전달체가 내장된(imbedded) 서방출 매트릭스(slow release matrix)를 포함할 수는 있지만 반드시 포함해야 하는 것은 아닌 약학적으로 허용 가능한 담체에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA를 전달하기 위한 벡터는 재조합 세포로부터 생산될 수 있으며, 본 발명의 약학 조성물은 ANGPTL3 dsRNA 전달 시스템을 생산한 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
ANGPTL3 dsRNA 또는 ssRNA 제제를 함유하는 의약품 조성물(Pharmaceutical Compositions Containing ANGPTL3 dsRNA or ssRNA agents)
본 발명의 특정 실시양태는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에서 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 제약 조성물은 세포에서 ANGPTL3 유전자 발현 및 ANGPTL3 활성을 감소시키기 위해 사용될 수 있으며, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 유용하다. 이러한 약학 조성물은 전달 방식에 따라 제형화될 수 있다. 전달 방식에 대한 제형의 비제한적인 예로는: 피하 전달을 위해 제형화된 조성물, 비경구 전달을 통한 전신 투여를 위해 제형화된 조성물, 정맥 내(IV) 전달을 위해 제형화된 조성물, 척수강 내 전달(intrathecal delivery)을 위해 제형화된 조성물, 뇌로 직접 전달을 위해 제형화된 조성물 등.
본 발명의 약학적 조성물을 세포에 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하기 위해 투여하는 것은 다음과 같은 하나 이상의 수단을 사용하여 수행될 수 있다: 국소(topical)(예를 들어, 경피 패치(transdermal patch)에 의해), 폐(pulmonary), 예를 들어 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 흡입을 통한("by inhalation or insufflation), 네뷸라이저를 포함하여; 기관내, 비강내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구. 비경구 투여에는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주사 또는 주입을 포함하며; 피하, 예를 들어 이식된 장치를 통해; 또는 두개 내(intracranial), 예를 들어 실질 내(intraparenchymal), 척수강 내(intrathecal 또는 뇌실 내(intraventricular), 투여(administration)가 포함된다. ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 또한 표적 조직, 예를 들어 간으로 직접, 신장 등으로 직접 전달될 수 있다.
"ANGPTL3 dsRNA 제제의 전달" 또는 "ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 전달"은 세포 내로 각각 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 전달을 포함하는 것으로 이해될 것이다, 세포 내로 전달되는 인코딩 벡터로부터 세포 내로 직접 전달하는 것뿐만 아니라, 세포 내로 전달되는 인코딩 벡터로부터 세포 내로 ANGPTL3 dsRNA 제제를 발현시키는 것, 또는 ANGPTL3 dsRNA 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 세포 내에 존재하도록 하는 임의의 적절한 수단에 의해 발현시키는 것을 포함한다. 억제 RNA를 전달하기 위한 제형 및 수단의 제조 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있으며 일상적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약학적 조성물(pharmaceutical composition )"은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 약리학적으로 효과적인 양 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. "약학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"라는 용어는 치료제의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이러한 담체는 식염수(saline), 완충 식염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하되 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 특히 세포 배양 배지(cell culture medium )를 제외한다. 경구 투여 약물의 경우 약학적으로 허용되는 담체에는 불활성 희석제, 붕해제(disintegrating agent), 결합제, 윤활제(lubricating agent), 감미제(sweetening agent), 향료(flavoring agent), 착색제 및 방부제와 같은 약학적으로 허용되는 부형제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 불활성 희석제에는 탄산나트륨 및 탄산칼슘(sodium and calcium carbonate), 인산나트륨 및 인산칼슘(sodium and calcium phosphate), 락토오스(lactose)가 포함되며 옥수수 전분(corn starch) 및 알긴산(alginic acid)은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분(starch)과 젤라틴(gelatin)을 포함할 수 있으며, 윤활제가 존재하는 경우 일반적으로 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 스테아르산(stearic acid) 또는 활석(talc)을 포함할 수 있다. 원하는 경우, 위장관에서 흡수를 지연시키기 위해 정제를 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트(glyceryl distearate)와 같은 물질로 코팅할 수 있다. 약물 제형에 포함된 제제는 아래에 자세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 다음과 같습니다: "약리학적으로 효과적인 양(pharmacologically effective amount)", "치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)" 및 "유효량(effective amount)"은 의도된 약리학, 치료 또는 예방 결과를 생성하기 위한 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 해당 양을 지칭한다. 예를 들어, 특정 임상 치료가 질병 또는 장애와 관련된 측정 가능한 파라미터의 최소 10% 감소가 있을 때 효과적인 것으로 간주되는 경우, 해당 질병 또는 장애의 치료를 위한 치료적으로 효과적인 약물의 양은 해당 파라미터의 최소 10% 감소에 필요한 양이다. 예를 들어, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 치료적으로 효과적인 양은 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준을를 최소 10%까지 감소시킬 수 있다.
유효량(Effective amounts))
본 발명의 방법은, 일부 측면에서는, 접촉된 세포에서 ANGPTL3 유전자 발현을 감소시키기 위해 효과적인 양으로 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 세포를 접촉하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태는 ANGPTL3 유전자 발현을 감소시키고 대상체에서 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 양으로 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. ANGPTL3의 발현을 감소시키고/하거나 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 사용되는 "유효량"은 원하는 생물학적 효과를 실현하는 데 필요하거나 충분한 양을 말한다. 예를 들어, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하기 위한 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 (i) 질병 또는 병태의 진행을 늦추거나 중단하거나 (ii) 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전, 감소 또는 제거하는 데 필요한 양이 될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 유효량은 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료가 필요한 대상체에 투여될 때, 질병 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 치료 반응을 초래하는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양이다. 본 발명의 일부 측면에 따르면, 유효량은 본 발명의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 대한 다른 치료 요법과 병용(combined) 또는 병용 투여(co-administered) 시 질병 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 치료 반응을 초래하는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제로 대상체를 치료하는 생물학적 효과는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태로 인한 증상의 개선(amelioration) 및/또는 절대적 제거일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생물학적 효과는 예를 들어, 대상체가 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태가 없음을 나타내는 진단 시험에 의해 입증되는 바와 같이, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 완전한 폐지(abrogation)를 의미한다. 검출될 수 있는 생리적 증상의 비제한적인 예로는 본 발명의 제제 투여 후 대상체의 간에서 지질 축적이 감소하는 것을 포함한다. ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 상태를 평가하는 추가적인 당업자 공지 수단을 사용하여 본 발명의 제제 및/또는 방법이 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 미치는 효과를 결정할 수 있다.
전형적으로, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하기 위한 수준으로 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성을 감소시키는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 임상시험에서 결정되며, 블라인드 연구에서 시험 집단과 대조 집단에 대한 유효 용량을 설정한다. 일부 실시양태에서, 유효량은 원하는 반응(예: 세포, 조직 및/또는 질병 또는 병태를 가진 대상체에서 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 감소시키는 양)을 초래하는 양이 될 수 있다. 따라서, ANGPTL3 폴리펩타이드 활성을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하기 위한 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 투여 시 대상체에서 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 양을 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여하지 않은 경우 세포, 조직 및/또는 대상체에 존재할 양보다 적은 양으로 감소시키는 양일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 접촉하거나 투여하지 않은 세포, 조직 및/또는 대상체에 존재하는 ANGPTL3 폴리펩티드 활성, 및/또는 ANGPTL3 유전자 발현의 수준을 "대조" 양이라고 지칭한다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 대조 양은 대상체에 대한 치료 전 양(pre-treatment amount), 즉, ANGPTL3 제제의 투여 전 대상체의 수준이 대상체에 대한 대조 수준이 될 수 있으며, 대상체에 투여된 siRNA에 따른 대상체의 ANGPTL3 폴리펩티드 활성 및/또는 ANGPTL3 유전자 발현 수준과 비교될 수 있다. ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 경우, 원하는 반응은 세포, 조직 및/또는 대상체에서 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소하거나 제거하는 것일 수 있다. 감소 또는 제거는 일시적일 수도 있고 영구적일 수도 있다. ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 상태는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성, ANGPTL3 유전자 발현, 증상 평가, 임상 시험 등을 결정하는 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 일부 측면에서는, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료에 대한 바람직한 반응은 질병 또는 병태의 발병을 지연시키거나 심지어 발병을 예방하는 것이다.
ANGPTL3 폴리펩타이드 활성을 감소시키는 화합물의 유효량은 세포 또는 대상체에 대한 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 투여에 따른 생리적 효과(예: 투여 후 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 감소)를 평가함으로써 결정될 수도 있다. 대상체에 대한 분석 및/또는 증상 모니터링은 본 발명의 약학적 화합물로 투여될 수 있는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능을 결정하고 치료에 대한 반응의 유무를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 하나 이상의 혈청 지질 프로파일 시험이 당업자에게 공지되어 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 하나 이상의 당업상 알려진 간 기능 검사는 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제로 대상체를 치료하기 전과 후에 대상체에서 ANGPTL3 관련 간 질병 또는 병태의 병태를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 간 내 콜레스테롤 축적에 대한 하나 이상의 당업상 공지된 시험이 대상체에서 ANGPTL3 관련 질환의 상태를 결정하기 위해 사용된다. 이 예에서, 질병은 콜레스테롤 축적을 포함하며, 이러한 시험은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제로 대상체를 치료하기 전과 후에 대상체의 콜레스테롤 수준을를 결정하는 데 사용된다.
본 발명의 일부 실시양태는 대상체에게 투여되는 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능을 결정하는 방법, 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 "생리적 특성"을 평가 및/또는 모니터링하여 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 포함한다. ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성에 대한 비제한적인 예는 대상체의 혈청 지질 수준(serum lipid level), 대상체의 LDL 수준(LDL level),, 대상체의 HDL 수준대상체의 LDL : HDL 비율, 대상체의 트리글리세리드 수준(triglyceride level), 대상체의 간 내 존재하는 지방, 신체 증상 등이다. 이러한 생리적 특성을 결정하는 표준 수단은 당업자에게 알려져 있으며 혈액 검사, 영상 검사, 신체 검사 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
대상체에 투여되는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양은 적어도 부분적으로는 대상체에 대해 결정된 질병 및/또는 상태 및/또는 생리적 특성에 기초하여 수정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 치료의 양은 ANGPTL3-dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 증가 또는 감소시킴으로써, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 투여되는 조성물을 변경함으로써, 투여 경로를 변경함으로써, 투약 시기를 변경함으로써 각각 변화될 수 있다. ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 치료 중인 특정 병태, 치료 대상자의 연령 및 신체 상태; 질환의 중증도, 치료 기간, 동시 치료의 특성(있는 경우), 특정 투여 경로, 및 의료인의 지식과 전문성에 따른 추가 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 유효량은 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 및/또는 ANGPTL3 유전자 발현의 원하는 수준에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 특정 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량을 과도한 실험 없이도 경험적으로 결정할 수 있다. 본원에 제공된 가르침과 결합하여, 본 발명의 다양한 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 중에서 선택하고, 효능, 상대 생체이용률, 환자 체중, 부작용의 심각성 및 바람직한 투여 방식과 같은 요소들을 평가함으로써, 특정 대상을 치료하는데 효과적인 효과적인 예방 또는 치료 치료 요법을 계획할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 세포와 접촉할 때 세포에서 원하는 생물학적 효과를 초래하는 양이 될 수 있다.
ANGPTL3 유전자 침묵(silencing)은 구성적으로 또는 게놈 공학에 의해, 그리고 임의의 적절한 분석에 의해 ANGPTL3를 발현하는 임의의 세포에서 결정될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 유전자 발현은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 투여함으로써 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 유전자 발현은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 투여에 의해 5% 및 10%, 5% 및 25%, 10% 및 50%, 10% 및 75%, 25% 및 75%, 25% 및 100% 또는 50% 및 100% 사이에서 감소된다.
복용량(Dosing)
ANGPTL3 dsRNA 제제 및 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 약학적 조성물에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 전달된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 용량은 1일당(per day) 수용자(recipient)의 체중 킬로그램(kilogram)당 0.01 내지 200.0 밀리그램(milligram)의 범위이며, 일반적으로 1일당 체중 킬로그램(body weight)당 1 내지 50 mg, 5 내지 40 mg/kg 체중, 10 내지 30 mg/kg 체중, 1 내지 20 mg/kg 체중, 1 내지 10 mg/kg 체중, 4 내지 15 mg/kg 체중 1일당 범위에서 이루어진다. 예를 들어, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 약 0.01 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg, 1회 투여량당 50mg/kg 신체(body)까지의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 투여량 및 전달 시기를 결정할 때 다양한 요인이 고려될 수 있다. 전달되는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 절대적인 양은 동시 치료(concurrent treatment), 투여 횟수 및 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 포함한 개별 대상 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 이들은 당업자에게 잘 알려진 요소들이며, 일상적인 실험만으로 해결할 수 있다. 이러한 요인들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 일상적인 실험만으로 해결할 수 있다. 일부 실시양태에서, 최대 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 일부 실시양태에서, 대상체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 용량의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 약학적 화합물(예를 들어, ANGPTL3 dsRNA 제제를 포함하거나 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는)을 적어도 매일, 격일, 매주, 격주, 매월 등에 대상체에게 투여할 수 있다. 투여량(Doses)은 하루에 한 번 또는 하루에 한 번 이상, 예를 들어 24시간 동안 2, 3, 4, 5 또는 그 이상 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 1일 1회 투여하거나, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 하루 동안 적절한 간격으로 2회, 3회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여하거나, 제어 방출 제형을 통한 연속 주입 또는 전달을 사용하여 투여할 수도 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 하루에 한 번 이상, 일주일에 한 번 이상, 한 달에 한 번 이상, 또는 일 년에 한 번 이상 대상체에게 투여된다.
본 발명의 방법은, 일부 측면에서는, 약학적 화합물을 단독으로 투여하거나, 하나 이상의 다른 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 병용하거나, 및/또는 다른 약물 요법 또는 치료 활동 또는 요법과 병용하여 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학적 화합물은 약학적 조성물에서 투여될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 약학적 조성물은 멸균될 수 있으며, 대상체에게 투여하기에 적합한 중량 또는 부피 단위로 원하는 반응을 일으키기에 충분한 수준으로 ANGPTL3 폴리펩타이드의 활성을 감소시키는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함할 수 있다. ANGPTL3 단백질 활성을 감소시키기 위해 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 약학적 조성물의 대상체에 투여되는 용량은 다양한 파라미터, 특히 사용되는 투여 방식 및 대상체의 상태에 따라 선택할 수 있다. 다른 요인으로는 원하는 치료 기간을 포함한다. 초기 투여 용량으로 대상체의 반응이 불충분한 경우, 환자의 내성이 허용하는 한도 내에서 더 높은 용량(또는 다른 국소 전달 경로를 통해 효과적으로 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.
치료(Treatment)
ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준 및/또는 활성의 감소가 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 ANGPTL3 관련 질병 및 병태는, ANGPTL3 발현을 억제하는 본 발명의 방법 및 ANGPTL3 dsRNA 제제를 사용하여 치료할 수 있다. 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 본 발명의 치료 방법으로 치료할 수 있는 질병 및 병태의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 고지혈증, 고중성지방혈증, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상, 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증, 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증, 심장 대사 질환, 비만, 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 관상 동맥 질환, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간질환 및, 고중성지방혈증으로 인한 췌장염을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 이러한 질병 및 병태는 본 문서에서 "ANGPTL3 관련 질병 및 병태" 및 "ANGPTL3에 의해 유발 및/또는 조절되는 질병 및 병태"로 지칭할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 대상체는 본 발명의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 진단 전 또는 진단 후 중 하나 이상의 시점에 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여받을 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서는, 대상체는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 가지고 있거나 발병할 위험에 처해 있다. ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 발병 위험에 처한 대상체는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 발병 위험에 처한 대조군에 비해 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 발병 위험이 증가된 확률을 갖는 사람이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 위험 수준은 대조 위험 수준과 비교하여 통계적으로 유의할 수 있다. 예를 들어, 위험에 처한 대상체는, 대상체가 기존 질병 또는 유전적 이상이 없는 대조 대상체보다 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 더 취약하게 만드는 기존 질병 및/또는 유전적 이상이 있는 대상체; ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 가족 및/또는 개인 병력이 있는 대상체; 및 이전에 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 대해 치료를 받은 적이 있는 대상체를 포함할 수 있다. 대상체가 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 더 취약하게 만드는 기존 질병 및/또는 유전적 이상은, 존재할 경우 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 발병 가능성과 상관관계가 있는 것으로 이전에 확인된 질병 또는 유전적 이상일 수 있음을 이해해야 한다.
개별 대상체의 의학적 상태에 기초하여 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체에게 투여할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 대상체에게 제공되는 의료 서비스는 대상체로부터 얻은 샘플에서 측정된 지질 수준을 평가하고, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여함으로써 대상체의 지질 수준을 감소시키는 것이 바람직하다고 판단할 수 있다. 이 예에서, 지질 수준은 대상체가 본 명세서에 개시된 것과 같은 ANGPTL3 관련 질환을 갖는 것으로 진단되지 않더라도, ANGPTL3 관련 질환의 생리적 특성으로 간주될 수 있다. 의료진은 투여된 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능의 척도로서 대상체의 지질 수준의 변화를 모니터링할 수 있다. 비제한적인 예에서, 혈액 또는 혈청 샘플과 같은 생물학적 샘플이 대상체로부터 얻어질 수 있고, 샘플에서 대상체의 지질 수준이 결정될 수 있다. ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체에게 투여하고, 투여 후 대상체로부터 혈액 또는 혈청 샘플을 얻고, 샘플을 사용하여 지질 수준을 결정하고 그 결과를 대상체의 투여 전(이전) 샘플에서 결정된 결과와 비교한다. 투여 후 샘플에서 대상체의 지질 수준이 투여 전 수준에 비해 감소하면 투여된 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 대상체의 지질 수준을 감소시키는 효능이 있음을 나타낸다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태는 적어도 부분적으로는 치료로 인한 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 대한 대상자의 생리적 특성 중 하나 이상의 변화에 대한 평가에 기초하여 대상자에게 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여하는 것을 포함하는 치료법을 조정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 투여된 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효과는 대상체에 대해 결정되고, 이후에 대상체에 투여되는 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 조절하는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 대상체에 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 투여되고, 투여 후 대상체의 지질 수준이 결정되며, 결정된 수준에 적어도 부분적으로 기초하여, 투여된 제제의 생리적 효과를 증가시키기 위해, 예를 들어 대상체의 지질 수준을 감소시키거나 더 감소시키기 위해, 많은 양의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 바람직한 것으로 결정된다. 다른 비제한적인 예에서, 대상체에게 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 투여되고, 투여 후 대상체의 지질 수준이 결정되고, 결정된 수준에 적어도 부분적으로 기초하여, 더 적은 양의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 대상체에 투여되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 대상체의 이전 치료로 인한 하나 이상의 생리적 특성의 변화를 평가하여 대상체에게 후속적으로 투여되는 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 조정하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태는 투여된 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능을 평가 및/또는 모니터링하기 위해 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 결정을 포함하고, 선택적으로 결정들을 사용하여 본 발명의 방법의 일부 실시예는 다음과 같습니다: 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하기 위한 본 발명의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 용량, 투여 요법 및/또는 투여 빈도 하나 이상을 조정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명의 유효량의 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체에게 투여한 바람직한 결과는 대상체의 지질 수준, 혈청 지질 수준, LDL 수준, LDL : HDL 비율, 트리글리세리드 수준, 대상체의 간에 존재하는 지방 등이 대상체에 대해 결정된 이전 수준, 또는 대조 수준과 비교하여 감소되는 것이다.
본 문서에서 사용되는 "치료(treat)", "치료된(treated)" 또는 "치료하는(treating)"라는 용어는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태와 관련하여 사용될 때 대상체가 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태에 걸릴 확률을 감소시키는 예방적 치료를 지칭할 수 있다, 또한 대상체가 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태가 발생한 후 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 수준을 제거하거나 감소시키기 위한 치료, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태가 더 진행(예: 더 심각하게)되는 것을 방지하기 위한 치료, 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드의 활성을 감소시키는 치료가 없을 때와 비교하여 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 진행을 늦추기 위한 치료를 지칭할 수 있다.
본 발명의 제제, 조성물, 및 방법의 특정 실시양태는 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 ANGPTL3 유전자의 발현과 관련하여 사용되는 "억제(inhibit)", "침묵(silence)", "감소(reduce)", "하향 조절(down-regulate)" 및 "넉다운(knockdown)"이라는 용어는 다음 중 하나 이상에 의해 측정되는 ANGPTL3 유전자의 발현을 의미한다: ANGPTL3 유전자가 전사된 세포, 세포군, 조직, 기관, 또는 대상체에 유전자로부터 전사된 RNA의 수준, 발현된 ANGPTL3의 활성 수준, mRNA로부터 번역된 ANGPTL3 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준은 세포, 세포군, 조직, 기관 또는 대상체가 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 접촉(예: 치료(treated with)될 때, ANGPTL3 유전자로부터 전사된 RNA의 대조 수준, 발현된 ANGPTL3의 활성 수준 또는 MRNA로부터 번역된 ANGPTL3의 수준과 비교하여, 각각 감소된다. 일부 실시양태에서, 대조 수준은 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 접촉(예: 치료(treated with))되지 않은 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서의 수준이다.
관리 방법(Administration methods)
본 발명의 방법에는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제에 대한 다양한 투여 경로(administration route)가 사용될 수 있다. 선택된 특정 전달 방식(delivery mode)은 적어도 부분적으로는 치료되는 특정 질환 및 치료 효능에 필요한 용량에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법은 일반적으로 의학적으로 허용되는 임의의 투여 방식, 즉 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 일으키지 않으면서 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 효과적인 수준으로 치료하는 임의의 방식(mode)를 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 경구, 장내, 점막, 피하, 및/또는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. "비경구(parenteral)"라는 용어에는 피하(subcutaneous), 정맥(intravenous), 척수강 내(intrathecal), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal) 및 흉강 내(intrasternal) 주사 또는 주입 기술이 포함된다. 다른 경로에는 비강(예: 위-비강 관을 통한), 피부(dermal), 질(vaginal), 직장(rectal), 설하(sublingual) 및 흡입이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 전달 경로는 척수강 내(intrathecal), 뇌실 내(intraventricular) 또는 두개강 내(intracranial)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 서방형 매트릭스(slow release matrix) 내에 배치되고 대상체 내에 매트릭스를 배치하여 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서는, 특정 세포 또는 소기관을 표적으로 하는 전달제로 코팅된 나노입자를 사용하여 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체 세포에 전달할 수 있다. 다양한 전달 수단, 방법, 제제가 당업자에게 공지되어 있다. 전달 방법 및 전달제의 비제한적인 예들이 본 명세서의 다른 부분에 추가로 제공된다. 본 발명의 일부 측면에서, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 관련하여 "전달(delivering)"는 용어는 하나 이상의 "네이키드" ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 서열을 세포 또는 대상체에 대한 투여를 의미할 수 있고, 본 발명의 특정 측면에서 "전달"은 트랜스펙션(transfection) 수단을 통해 세포 또는 대상체에 투여하는 것을 의미할 수 있다, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 세포를 대상체에게 전달하는 것, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 인코딩하는 벡터를 세포 및/또는 대상체에게 전달하는 것 등을 포함한다. 트랜스펙션 수단을 사용하여 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하는 것은 세포 및/또는 대상에 벡터를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 방법에서, 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 약학적으로 허용되는 제형으로 투여될 수 있으며, 이는 약학적으로 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 호환 가능한 담체, 보조제 및 선택적으로 다른 치료 성분을 일상적으로 함유할 수 있는 용액으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 동시 투여를 위해 다른 치료제와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 약학적 조성물에서 투여될 수 있다. 일반적으로, 약학적 조성물은 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과, 예를 들어 세포 또는 대상체에서 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하는 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 능력을 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 치료용으로 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여 및 전달하는 수많은 방법이 당업자에게 알려져 있으며 본 발명의 방법에 활용될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체에는 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 가용화제 및 당업자에게 잘 알려진 기타 물질이 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 미국 특허 번호 5,211,657호 및 다른 것들에서 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 제제는 통상적으로 염, 완충제, 방부제, 호환 가능한 담체, 및 선택적으로 다른 치료제를 포함할 수 있다. 의약품에 사용되는 경우, 염은 약학적으로 허용되어야 하지만, 약학적으로 허용되지 않는 염은 약학적으로 허용되는 염을 제조하는 데 편리하게 사용될 수 있으며 본 발명의 범위에서 제외되지 않는다. 이러한 약리학적 및 약리학적으로 허용되는 염은 염산(hydrochloric), 브롬화수소산(hydrobromic), 황산(sulfuric), 질산, 인산, 말레산(maleic), 아세트산(acetic), 살리실산(salicylic), 구연산(citric), 포름산(formic), 말론산(malonic), 숙신산(succinic) 등으로부터 제조된 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 약학적으로 허용되는 염은 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염과 같은 알칼리성 금속 또는 알칼리토염(metal or alkaline earth salts)으로 제조할 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태는 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 조직에 직접 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물이 투여되는 조직은 ANGPTL3 관련 질환 또는 병태가 존재하거나 발생할 가능성이 있는 조직이며, 간 또는 신장을 예로 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 직접 조직 투여는 직접 주사 또는 기타 수단을 통해 이루어질 수 있다. 많은 경구 전달 화합물은 자연적으로 간과 신장으로 이동하여 이를 통과하며, 본 발명의 치료 방법의 일부 실시양태는 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제를 대상체에게 경구 투여하는 것을 포함한다. ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 1회 투여되거나, 또는 복수의 투여로 투여될 수 있다. 여러 번 투여하는 경우, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 서로 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 제한하려는 것은 아니지만, 제1(또는 제1 복수의) 투여는 피하를 통해 이루어질 수 있고 하나 이상의 추가 투여는 경구 및/또는 전신 투여일 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전신적으로 투여하는 것이 바람직한 경우, ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 주사, 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 예를 들어 앰플 또는 다중 용량 용기와 같은 단위 용량 형태로 제공될 수 있으며, 방부제가 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있다. ANGPTL3 dsRNA 제제 제형(약학적 조성물이라고도 함)은 유성 또는 수성 매체에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며 현탁액, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제조에는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸 올레에이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 운반체에는 물, 알코올성/수성 용액, 식염수 및 완충 매체를 포함한 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 용매(Parenteral vehicle)에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스(dextrose) 및 염화나트륨, 락틱 링거(lactated Ringer's), 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥 용매(Intravenous vehicle)에는 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예: 링거용 포도당 기반 수액) 등이 포함된다. 방부제 및 기타 첨가제(예: 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등)도 존재할 수 있다. 정맥 투여와 같은 다른 형태의 투여로 인해 더 적은 용량이 투여될 수 있다. 대상체의 반응이 초기 투여 용량으로 불충분한 경우, 환자의 내성이 허용하는 한도 내에서 더 높은 용량(또는 다른 국소 전달 경로를 통해 효과적으로 더 높은 용량)을 사용할 수 있다. 필요에 따라 하루에 여러 번 투여하여 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 적절한 전신 또는 국소 수준을 달성하고 ANGPTL3 단백질 활성의 적절한 감소를 달성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 생체 적합성 미립자(biocompatible microparticle), 나노 입자 또는 수용자(예: 대상체)에 이식하기에 적합한 임플란트와 같은 전달체(delivery vehicle)를 사용하는 것을 포함한다. 본 방법에 따라 유용할 수 있는 예시적인 생분해성 임플란트(bioerodible implant)는 생물학적 거대 분자를 포함하는 생체 적합성, 생분해성 고분자 매트릭스에 대해 설명하는 PCT 공개번호 WO 95/24929(여기에 참조로 통합됨)에 설명되어 있다.
본 발명의 방법에서는 비분해성 및 생분해성 고분자 매트릭스를 모두 사용하여 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체에게 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 매트릭스는 생분해성일 수 있다. 매트릭스 중합체는 천연 중합체 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 방출(release)을 원하는 기간에 따라 선택될 수 있으며, 일반적으로 몇 시간에서 1년 이상에 걸쳐 선택될 수 있다. 일반적으로 몇 시간에서 3~12개월 사이의 기간에 걸쳐 방출하는 것을 사용할 수 있다. 중합체는 선택적으로 물에서 무게의 약 90%까지 흡수할 수 있는 하이드로겔 형태이며, 추가적으로 선택적으로 다가 이온 또는 다른 중합체와 가교 결합(cross-linked)할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 일부 실시양태에서는 확산 또는 고분자 매트릭스의 분해에 의해 생분해성 임플란트를 사용하여 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달할 수 있다. 이러한 사용을 위한 예시적인 합성 중합체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 생분해성 중합체 및 비생분해성 중합체는 당업에 알려진 방법을 사용하여 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 전달에 사용될 수 있다. 생분해성 하이드로젤과 같은 생체접착성 중합체(H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubell, Macromolecules, 1993, 26, 581-587 참조, 그 가르침은 여기에 참조로 통합됨)도 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료를 위한 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 추가로 적합한 전달 시스템에는 시간 방출, 지연 방출 또는 서방 방출(sustained release) 전달 시스템이 포함될 수 있다. 이러한 시스템은 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 반복 투여를 피할 수 있어 대상체와 의료 전문가의 편의성을 높일 수 있다. 다양한 유형의 방출 전달 시스템이 이용 가능하며 당업자에게 공지되어 있다. (예시 참조: U.S. 특허. 5,075,109; 4,452,775; 4,675,189; 5,736,152; 3,854,480; 5,133,974; 및 5,407,686 (각각의 가르침은 참조로 여기에 통합되어 있다). 또한, 펌프 기반 하드웨어 전달 시스템(pump-based hardware delivery systems)을 사용할 수 있으며, 그 중 일부는 이식(implantation)에 적합하도록 조정된다.
장기 지속 방출(long-term sustained release) 임플란트의 사용은 대상체의 예방적 치료 및 재발성 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태가 발생할 위험이 있는 대상체에게 적합할 수 있다. 본 문서에서 사용되는 장기 방출(Long-term release)이란 임플란트가 최소 10일, 20일, 30일, 60일, 90일, 6개월, 1년 또는 그 이상 동안 치료 수준의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하도록 구성 및 배열된 것을 의미한다. 장기 지속 방출 임플란트는 당업자에게 잘 알려져 있으며 위에서 설명한 방출 시스템 중 일부를 포함한다.
ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 치료용 제형은 원하는 순도를 갖는 분자 또는 화합물을 선택적 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제[Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, (2006) ]와 혼합하여 동결 건조 제형 또는 수용액 형태로 보관(storage)을 위해 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량과 농도에서 수용자에게 무독성이며 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌(methionine)을 포함한 항산화제; 방부제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄염화물( octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄염화물(hexamethonium chloride); 벤잘코늄염화물(benzalkonium chloride), 벤제토늄염화물(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(잔기가 약 10개 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 제; 자당(sucrose), 만니톨(mannitol), 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당(sugar); 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온(salt-forming counter-ion); 금속 착물(metal complexe) (예: 아연-단백질 착물) 및/또는 비이온성 계면활성제(예: TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 포함한다.
세포, 대상체 및 대조(Cells, Subjects, and Controls)
본 발명의 방법은 세포, 조직, 기관 및/또는 대상체와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 대상체는 개, 고양이, 말, 소, 염소, 마우스(mouse), 쥐(rat) 및 영장류(예: 원숭이)를 포함하되 이에 제한되지 않는 인간 또는 척추 포유류이다. 따라서, 본 발명은 인간 및 비인간 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 대상체는 농장 동물(farm animal), 동물원 동물(zoo animal), 가축 또는 비가축 동물일 수 있으며, 본 발명의 방법은 수의학 예방 및 치료 요법에 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이며 본 발명의 방법은 인간 예방 및 치료 요법에 사용될 수 있다.
본 발명이 적용될 수 있는 대상체의 비제한적인 예는 바람직한 수준보다 높은 ANGPTL3 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 병태를 진단받았거나, 의심되거나, 또는 그러한 위험이 있는 대상자, 즉 "ANGPTL3 발현의 상승된 수준(elevated levels of ANGPTL3 expression)"이라고도 하는 대상자이다. 바람직한 수준보다 높은 수준의 ANGPTL3 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 및 병태의 비제한적인 예들이 본 명세서의 다른 부분에 설명되어 있다. 본 발명의 방법은 치료 시점에 바람직한 수준보다 높은 ANGPTL3 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 병태를 갖는 것으로 진단된 대상체 또는 바람직한 수준보다 높은 ANGPTL3 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 병태를 갖거나 발병할 위험이 있는 것으로 간주되는 대상체에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서는 바람직한 수준보다 높은 ANGPTL3 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 병태가 급성 질병 또는 병태이고, 본 발명의 특정 측면에서는 바람직한 수준보다 높은 ANGPTL3 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 병태가 만성 질병 또는 병태다이다.
비제한적인 예에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증으로 진단되었거나, 의심되거나, 또는 발병 위험이 있는 대상체에게 투여되며, 이는 ANGPTL3 발현을 감소시키는 것이 바람직한 질병이다. 본 발명의 방법은 치료 시점에 상기 질병 또는 병태가 있는 것으로 진단된 대상체 또는 해당 질병 또는 병태가 있거나 발병할 위험이 있는 것으로 간주되는 대상체에게 적용될 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제는 고지혈증으로 진단받았거나, 의심되거나, 또는 발병 위험이 있는 대상에게 투여되며, 이는 ANGPTL3 발현을 감소시키는 것이 바람직한 질병이다. 본 발명의 방법은 치료 시점에 상기 질병 또는 병태가 있는 것으로 진단된 대상체 또는 해당 질병 또는 병태가 있거나 발병할 위험이 있는 것으로 간주되는 대상체에게 적용될 수 있다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 시험관 내 세포, 생체 내 세포, 생체 외 세포를 포함한다. 세포는 대상체, 배양액 및/또는 현탁액 또는 기타 적절한 상태 또는 조건에 있을 수 있다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 간 세포, 간세포, 심장 세포, 췌장 세포, 심혈관 세포, 신장 세포 또는 인간 및 비인간 포유류 세포를 포함하는 다른 유형의 척추 동물 세포일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 질병 세포로 알려지지 않은 건강한 정상 세포이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물이 적용되는 세포는 간 세포(liver cell), 간세포(hepatocyte), 심장 세포(cardiac cell), 췌장 세포(pancreatic cell), 심혈관 세포(cardiovascular cell) 및/또는 신장 세포이다. 본 발명의 특정 측면에서, 대조 세포는 정상 세포이지만, 질병 또는 병태를 갖는 세포도 특정 상황에서 대조 세포로서 작용할 수 있는 것으로 이해될 것이다(예를들어 질병 또는 병태를 갖는 치료된 세포와 질병 또는 병태를 갖는 치료되지 않은 세포의 결과를 비교하기 위한 경우 등).
본 발명의 방법에 따라, ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 수준을 결정하고 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 대조 수준과 비교할 수 있다. 대조군은 미리 결정된 값일 수 있으며, 이는 다양한 형태를 취할 수 있다. 중앙값(median) 또는 평균(mean)과 같은 단일 컷오프 값일 수 있다. 이는 ANGPTL3 폴리펩타이드 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 정상 수준을 갖는 그룹 및 ANGPTL3 폴리펩타이드 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 증가 수준을 갖는 그룹과 같은 비교 그룹에 기초하여 설정될 수 있다. 비교 그룹의 또 다른 비제한적인 예로는, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 진단을 갖는 그룹; 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 진단을 갖지 않는 그룹; 본 발명의 siRNA 치료제가 투여된 대상체 그룹; 본 발명의 siRNA 치료제가 투여되지 않은 대상체 그룹이 포함될 수 있다. 전형적으로, 대조군은 적절한 연령대의 겉으로 건강한 정상인 또는 겉으로 건강한 세포를 기반으로 할 수 있다. 본 발명에 따른 대조군은 미리 결정된 값 외에도 실험 물질(experimental material)과 병행하여 시험된 물질의 샘플일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 대조군으로부터의 샘플 또는 실험 샘플과 병행하여 시험하기 위해 제조를 통해 생성된 대조군 샘플이 포함된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대조군은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제와 접촉 또는 치료되지 않은 세포 또는 대상체를 포함할 수 있으며, 이러한 경우, ANGPTL3 폴리펩타이드 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 대조 수준은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 접촉된 세포 또는 대상체에서의 ANGPTL3 폴리펩타이드 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 수준과 비교될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 대해 결정된 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준은 다른 시점에 동일한 대상체에 대해 결정된 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준을 비교하는 대조 수준이 될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 발명의 ANGPTL3 치료제를 투여하지 않은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 ANGPTL3의 수준이 결정된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 대상체로부터 얻은 샘플에서 결정된 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준은 대상체에 대한 기준값(baseline) 또는 대조값(control value)으로 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 따라 대상체에게 ANGPTL3 dsRNA 제제를 하나 이상 투여한 후, 대상체로부터 하나 이상의 추가 혈청 샘플을 얻을 수 있고, 후속 샘플에서 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준을 대상체에 대한 대조/기준 수준과 비교할 수 있다. 이러한 비교는 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 발병, 진행 또는 후퇴를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 얻은 기준 샘플의 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준이 대상체에게 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여한 후 동일한 대상체로부터 얻은 수준보다 높으면 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 퇴행을 나타내며, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료를 위한 본 발명의 투여된 ANGPTL3 dsRNA 제제의 효능을 나타낸다.
본 발명의 일부 측면에서, 대상체에 대해 결정된 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 중 하나 이상의 값은 동일한 대상체에서 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준 및/또는 ANGPTL3 활성의 후기 비교를 위한 대조값으로 사용될 수 있으므로, 대상체의 "기준선(baseline)" ANGPTL3 폴리펩타이드 활성으로부터 변화를 평가할 수 있게 한다. 따라서, 초기 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준 및/또는 초기 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 수준이 대상체 내에 존재 및/또는 결정될 수 있으며, 본 발명의 방법 및 화합물은 대상체 내의 ANGPTL3 폴리펩타이드 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 수준을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 초기 수준은 그 대상체의 대조 수준으로서 작용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 및/또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 대상체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 투여 및 치료의 효능은 대상체로부터 얻은 혈청 샘플에서 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준이 이전 시점에 대상체로부터 얻은 혈청 샘플에서 투여 전 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준과 비교하여, 또는 비접촉 대조 수준, 예를 들어 대조 혈청 샘플의 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준과 비교하여 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상으로 감소할 때 평가할 수 있다
ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준 및 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 수준은 모두 ANGPTL3 유전자 발현의 수준과 상관관계가 있는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태는 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하는 데 효과적인 양으로 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 및/또는 ANGPTL3 안티센스제를 대상체에 투여하여 대상체에서 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준을 감소시키고 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성의 수준을 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 하나 이상의 대상체로부터 얻은 하나 이상의 생물학적 샘플에서 ANGPTL3 폴리펩타이드의 여부(presence, absence) 및/또는 양(이하 본 명세서에서는 수준이라고도 함)을 측정하는 것을 포함한다. 상기 결정은 본 발명의 치료 방법의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 및/또는 ANGPTL3 안티센스 제제의 투여로 이전에 치료받은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준을 결정하는 데 사용될 수 있다. 치료 대상체로부터 얻은 혈청 샘플에서 결정된 ANGPTL3 폴리펩타이드의 수준이 해당 대상체에 대해 결정된 치료 전 ANGPTL3 폴리펩타이드 수준과 비교하거나, 비접촉 대조군 생물학적 샘플 수준과 비교하여 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 낮으면, 대상체에 투여된 치료의 효능 수준을 나타낸다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체에 대해 결정된 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성은 다른 시간에 동일한 대상체에서 결정된 생리적 특성과 비교되는 대조 결정이 될 수 있다. 비제한적인 예에서, 지질 수준 및/또는 HDL : LDL 비율과 같은 생리적 특성은 본 발명의 ANGPTL3 치료제를 투여받지 않은 대상체로부터 얻은 혈청 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 결정된다. 대상체로부터 얻은 샘플에서 결정된 지질 수준 및/또는 HDL : LDL 비율(및/또는 ANGPTL3 질환 또는 병태의 기타 생리적 특성)은 대상체에 대한 기준값 또는 대조값으로 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 따라 대상체에게 ANGPTL3 dsRNA 제제를 하나 이상 투여한 후, 대상체로부터 하나 이상의 추가 혈청 샘플을 얻을 수 있으며, 후속 샘플의 지질 수준 및/또는 HDL : LDL 비율을 각각 대상체에 대한 대조/기준선 수준 및/또는 비율과 비교할 수 있다. 이러한 비교는 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 발병, 진행 또는 후퇴를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 얻은 기준 샘플의 지질 수준이 대상체에게 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여한 후 동일한 대상체로부터 얻은 샘플에서 결정된 지질 수준보다 높으면 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 퇴행을 나타내며, ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료를 위해 투여된 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제의 효능을 나타낸다.
본 발명의 일부 측면에서는, 대상체에 대해 결정된 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성 중 하나 이상의 값이 동일한 대상체의 생리적 특성을 나중에 비교하기 위한 대조값으로 사용될 수 있으므로, 대상체의 "기준선" 생리적 특성으로부터의 변화를 평가할 수 있다. 따라서, 초기 생리적 특성이 대상체에게 존재 및/또는 결정될 수 있으며, 본 발명의 방법 및 화합물은 대상체의 ANGPTL3 폴리펩타이드 및/또는 ANGPTL3 폴리펩타이드 활성 수준을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 초기 생리적 특성 결정은 해당 대상체에 대한 대조군으로 작용할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여, 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 제제 및/또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 ANGPTL3 질병 또는 병태를 치료하기 위해 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 투여 및 치료의 효능은 ANGPTL3 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성의 변화를 결정함으로써 평가할 수 있다. 비제한적인 예에서, 대상체로부터 얻은 혈청 샘플의 지질 수준은 이전 시점에 대상체로부터 얻은 혈청 샘플의 투여 전 지질과 비교하거나 비접촉 대조 수준, 예를 들어 대조 혈청 샘플의 지질 수준과 비교하여 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 감소한다. 지질 수준, HDL 수준, HDL : LDL 비율, 트리글리세리드 수준, 대상체의 간 내 지방량은 각각 ANGPTL3 유전자 발현 수준과 상관관계가 있음을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태는 본 발명의 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하는 데 효과적인 양으로 본 발명의 ANGPTL3 dsRNA 및/또는 ANGPTL3 안티센스 제제를 대상체에 투여하여 지질 수준, HDL 수준, HDL : LDL 비율, 트리글리세리드 수준, 대상체의 간 내 지방량을 감소시키거나 대상체의 생리적 특징에 긍정적인 영향을 주는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태는 다음과 같은 방법을 사용하여 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성의 여부 및/또는 변화를 결정하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: (1) 생리적 특성에 대해 하나 이상의 대상체로부터 얻은 하나 이상의 생물학적 샘플 평가, (2) 대상체 영상 촬영(예: 간 이미지 획득, 그러나 이에 제한되지 않는다), (3) 또는 대상체의 신체 검사. 상기 결정은 본 발명의 치료 방법의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
키트
또한 본 발명의 범위에는 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제 및/또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 키트와 본 발명의 방법에서 이를 사용하기 위한 지침이 포함된다. 본 발명의 키트는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있는 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드, 및 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 사용하기 위해 하나 이상의 ANGPTL3 dsRNA 제제, ANGPTL3 센스 폴리뉴클레오티드, 및 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 키트를 제조할 수 있다. 본 발명의 키트 구성 요소는 수성 매체(aqueous medium) 또는 동결 건조된 형태로 포장될 수 있다. 본 발명의 키트는 시험관, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등과 같은 하나 이상의 용기 수단(container means) 또는 일련의 용기 수단을 밀폐하여 수용하도록 구획된 캐리어를 포함할 수 있다. 제1 용기 수단 또는 일련의 용기 수단은 ANGPTL3 dsRNA 제제 및/또는 ANGPTL3 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 같은 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 제2 용기 수단 또는 일련의 용기 수단은 본 발명의 치료 방법의 실시양태에서 투여되는 ANGPTL3 dsRNA 제제 및/또는 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드의 일부로서 포함될 수 있는 표적제, 표지제, 전달제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에는 지침도 포함될 수 있다. 지침은 일반적으로 서면 형식으로 제공되며 키트에 구현된 치료법을 수행하고 해당 치료법을 기반으로 결정을 내리기 위한 지침을 제공한다.
다음의 실시예는 본 발명의 실시의 구체적인 예를 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다. 당업자에게는 명백할 것이지만, 본 발명은 다양한 조성물 및 방법에 적용될 수 있다.
실시예
실시예 1.
ANGPTL3 RNAi 제제 합성.
위의 표 2-5에 나타낸 ANGPTL3 RNAi 제제 듀플렉스는 다음과 같은 일반적인 절차에 따라 합성되었다:
포스포라미다이트 화학에 기반한 잘 확립된 고상 합성(solid phase synthesis) 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성기에서 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥 서열을 합성했다. 올리고뉴클레오티드 사슬 전파(Oligonucleotide chain propagation)는 각 뉴클레오티드를 추가하기 위한 탈보호(deprotection), 응축(condensation), 캡핑(capping), 산화(oxidation) 또는 황화(sulfurization) 단계의 4단계 사이클을 통해 이루어진다. 합성은 제어된 기공 유리(CPG, 1000 Å)로 만든 고체 지지체 위에서 수행되었다. 단량체 포스포라미다이트는 상업적 출처에서 구입했다. GalNAc 리간드 클러스터를 갖는 포스포라미다이트(비제한적 예로서 GLPA1 및 GLPA2)는 본 명세서의 실시예 2-3의 절차에 따라 합성되었다. 시험관 내(in vitro) 스크리닝(표 2.)에 사용되는 siRNA의 경우, 2 μmol 규모(scale)로 합성을 수행했으며, 생체 내(in vivo) 시험(표 3, 4 및 5)에 사용되는 siRNA의 경우, 5 μmol 이상의 규모로 합성을 수행했다. 센스 가닥의 3'-끝에 GalNAc 리간드(비제한적인 예로 GLO-0)가 부착된 경우, GalNAc 리간드가 부착된 CPG 고체 지지체가 사용됐다. 감각 가닥의 5'-끝에 GalNAc 리간드(비제한적인 예로서 GLS-1 또는 GLS-2)가 부착된 경우, 마지막 결합 반응(the last coupling reaction)에는 GalNAc 포스포라미다이트(비제한적인 예로서 GLPA1 또는 GLPA2)가 사용되었다. 4,4′디메톡시트리틸 보호기(of 4,4′protecting group, DMT)의 비보호화(deprotection)를 위해 디클로로메탄에 3% 트리클로로아세트산(TCA)을 사용했다. 5-에틸티오-1H-테트라졸(5-Ethylthio-1H-tetrazole)을 활성화제(activator)로 사용했다. 산화 및 황화 반응에는 각각 THF/Py/H2O에서의 I2 및 피리딘/MeCN에서의 페닐아세틸 디설파이드(phenylacetyl disulfide, PADS)를 사용했다. 최종 고상 합성 단계 후, 고체 지지체 결합 올리고머를 절단하고 40 중량 %의 물에서의 메틸아민 및 28 % 수산화암모늄(ammonium hydroxide) 용액의 1:1 부피 용액으로 처리하여 보호기를 제거했다. 체외 스크리닝에 사용되는 siRNA 합성을 위해, 조 혼합물(crude mixture)을 농축했다. 남은 고체는 1.0M NaOAc에 용해하고, 얼음처럼 차가운 EtOH를 첨가하여 추가 정제 없이 어닐링(annealing)에 사용된 나트륨 염으로서 단일 가닥 생성물을 침전시켰다. 생체 내(in vivo) 시험에 사용되는 siRNA 합성을 위해, 조 단일 가닥 생성물(crude single strand product)을 이온 페어링 역상 HPLC(ion pairing reversed phase HPLC, IP-RP-HPLC)로 추가 정제했다. IP-RP-HPLC에서 정제된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 1.0M NaOAc에 용해하여 나트륨 염으로 전환하고 얼음처럼 차가운(ice cold) EtOH를 첨가하여 침전시켰다. 동등 몰 비율의 상보적인(equimolar complementary) 센스 가닥 및 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드를 물에서 어닐링하여 이중 가닥 siRNA 생성물을 형성하고, 동결 건조하여 푹신한 백색 고체(fluffy white solid)를 얻었다.
표 2에 제공된 siRNA의 질량 및 순도 정보 - 듀플렉스 ID 번호 참조
듀플렉스 ID AD# 센스 가닥 안티센스 가닥
계산된 질량 관측된 질량 HPLC 순도 계산된 질량 관측된 질량 HPLC 순도
AD00001 6972.77 6973.28 90% 6941.70 6941.84 >80%
AD00002 7034.85 7035.29 92% 6894.64 6895.1 >80%
AD00003 6948.74 6949.23 86% 6980.75 6980.99 84%
AD00004 7002.85 7003.42 85% 6896.61 6897.16 >80%
AD00005 6955.78 6956.4 86% 6958.68 6959.34 >80%
AD00006 6955.79 6956.27 85% 6958.69 6959.2 >80%
AD00007 6943.68 6944.1 87% 6970.80 6971.41 >80%
AD00008 6942.70 6943.41 86% 6986.79 6986.93 >80%
AD00009 7025.89 7026.56 89% 6873.57 6874.09 82%
AD00010 6978.83 6979.2 85% 6935.66 6936.29 89%
AD00011 7137.95 7138.63 86% 6791.54 6792.11 88%
AD00012 7074.87 7075.56 87% 6854.62 6855.26 >80%
AD00013 6947.76 6948.47 86% 6996.73 6997.31 85%
AD00014 6993.82 6994.51 85% 6950.66 6950.84 85%
AD00015 7009.83 7010.53 84% 6949.67 6950.27 84%
AD00016 6978.83 6979.56 86% 6935.65 6936.25 >80%
AD00017 7056.91 7057.52 87% 6887.58 6888.14 85%
AD00018 7016.88 7017.58 86% 6927.62 6928.25 83%
AD00019 7016.90 7017.34 87% 6927.64 6928.46 85%
AD00020 6883.71 6884.18 85% 7075.82 7076.53 >80%
AD00021 6883.71 6884.16 88% 7075.80 7076.35 89%
AD00022 6885.68 6886.17 86% 7043.82 7044.36 89%
AD00023 6902.66 6903.06 89% 7026.84 7027.34 88%
AD00024 6878.62 6879.13 85% 7065.84 7066.38 88%
AD00025 6902.67 6903.06 87% 7026.83 7027.36 89%
AD00026 6902.66 6903.09 87% 7026.84 7027.36 87%
AD00027 6919.65 6920.09 89% 7009.83 7010.01 81%
AD00028 6958.69 6959.22 90% 6985.82 6986.45 88%
AD00029 6971.78 6972.48 88% 6957.69 6958.29 86%
AD00030 7073.88 7074.55 87% 6870.61 6871.25 86%
AD00031 7120.95 7121.52 86% 6808.54 6809.2 85%
AD00032 7057.88 7058.26 87% 6871.61 6872.22 88%
AD00033 6994.83 6995.26 85% 6934.67 6935.23 89%
AD00034 7017.86 7018.53 86% 6911.62 6912.2 87%
AD00035 7152.97 7153.65 88% 6806.57 6807.27 86%
AD00036 7057.89 7058.52 86% 6871.61 6872.78 >80%
AD00037 7073.90 7074.24 84% 6870.61 6871.2 88%
AD00038 7034.87 7035.46 86% 6894.64 6895.21 82%
AD00039 6942.68 6943.32 86% 6986.79 6987.38 86%
AD00040 7193.95 7194.55 85% 6750.52 6751 85%
AD00041 7080.94 7081.51 87% 6848.55 6849.29 81%
AD00042 7051.83 7052.46 86% 6877.67 6878.18 83%
AD00043 6972.79 6973.59 89% 6941.70 6942.23 81%
AD00044 7001.87 7002.43 89% 6912.61 6913.22 82%
AD00045 7025.84 7026.44 91% 6948.69 6949.15 82%
AD00046 6954.81 6955.27 86% 6974.68 6975.21 83%
AD00047 7010.83 7011.44 87% 6933.69 6934.26 85%
AD00048 6994.82 6995.43 88% 6934.66 6935.26 83%
AD00049 7018.86 7019.6 >80% 6895.62 6896.25 >80%
AD00050 7096.93 7096.96 >80% 6847.57 6848.13 >80%
실시예 2. 중간체-A(Intermediate-A) 및 중간체-B 의 제조.
아래 반응식 1(Scheme 1)에 나타낸 바와 같이, 시중에서 판매되는 갈락토사민 펜타아세테이트를 디클로로메탄(DCM)에 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf)로 처리하여 중간체-A를 합성했다. 그 후 Cbz로 보호된 2-(2- 아미노에톡시)에탄-1-올로 글리코실화하여 화합물 II를 얻었다. Cbz 보호기는 수소화를 통해 제거되어 중간체-A를 트리플루오로아세테이트(TFA) 염으로 얻었다. 중간체 B는 출발 물질로 Cbz로 보호된 2-(2-(2- 아미노에톡시)에톡시)에탄-1-올을 사용한 것을 제외하고 동일한 방식으로 합성되었다.
중간체-A
중간체-B
반응식 1
1,2-디클로로에탄(DCE) 100mL의 화합물 I(20.0 g, 51.4 mmol)의 용액에 TMSOTf(17.1 g, 77.2 mmol)를 첨가했다. 생성된 반응 용액을 60°C에서 2시간 동안 교반한 다음, 25°C에서 1시간 동안 교반하였다. 4Å 분말 분자체(10 g)로 건조시킨 DCE(100mL)의 Cbz로 보호된 2-(2-아미노 에톡시)에탄-1-올(13.5g, 56.5mmol)을 0°C에서 N2 분위기(atmosphere)에서 위에서 언급한 반응 용액에 적가하였다(added dropwise). 생성된 반응 혼합물을 N2 분위기에서 25°C에서 16시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 여과하고 포화 NaHCO3 (200 mL), 물(200 mL) 및 포화 염수(sat. brine)(200 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 로 건조시키고 여과 및 감압 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 2-메틸테트라하이드로푸란/헵탄(5/3, v/v, 1.80 L)으로 2시간 동안 트리튜레이션(triturated)하였다. 결과 혼합물을 여과하고 건조하여 화합물 II (15.0 g, 50.3% 수율)를 백색 고체로 얻었다.
건조되고 아르곤으로 퍼지된 수소화 병(dried and argon purged hydrogenation bottle)에 10% Pd/C(1.50 g)를 조심스럽게 첨가한 다음, 10 mL 테트라하이드로푸란(THF)을 첨가하고 THF(300 mL)와 TFA(트리플루오로아세트산, 3.00 g, 26.4 mmol)에 화합물 II(15.0 g, 26.4 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 세 번 H2 로 탈기 및 퍼지(degassed and purged)하고 H2 (45psi) 분위기에서 25°C에서 3시간 동안 교반하였다. 얇은 층 크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC, 용매: DCM:MeOH = 10:1)는 화합물 II가 완전히 소진되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하였다. 잔류물(Residue)을 무수 DCM(500mL)에 용해하고 농축하였다. 이 과정을 3회 반복하여 중간체-A(14.0 g, 96.5% 수율)를 거품이 있는 백색 고체(foamy white solid)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz DMSO-d 6 ): δppm 7.90 (d, J = 9.29 Hz, 1 H), 7.78 (br s, 3 H), 5.23 (d, J = 3.26 Hz, 1 H), 4.98 (dd, J = 11.29, 3.26 Hz, 1 H), 4.56 (d, J = 8.53 Hz, 1 H), 3.98 - 4.07 (m, 3 H), 3.79 - 3.93 (m, 2 H), 3.55 - 3.66 (m, 5 H), 2.98 (br d, J = 4.77 Hz, 2 H), 2.11 (s, 3 H), 2.00 (s, 3 H), 1.90 (s, 3 H), 1.76 (s, 3 H)
중간체-B는 중간체-A의 합성과 유사한 절차를 사용하여 합성되었다. . 1H NMR (400 MHz DMSO-d 6 ): δppm 7.90 (br d, J = 9.03 Hz, 4 H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1 H), 4.97 (dd, J = 11.1 Hz, 1 H), 4.54 (d, J = 8.53 Hz, 1 H), 3.98 - 4.06 (m, 3 H), 3.88 (dt, J = 10.9 Hz, 1 H), 3.76 - 3.83 (m, 1 H), 3.49 - 3.61 (m, 9 H), 2.97 (br s, 2 H), 2.10 (s, 3 H), 1.99 (s, 3 H), 1.88 (s, 3 H), 1.78 (s, 3 H). Mass calc. for C20H34N2O11: 478.22; found: 479.3 (M+H+).
실시예 3. GalNAc 리간드 클러스터 포스포라미다이트 GLPA1, GLPA2 및 GLPA15의 합성.
아래 반응식 2를 따라 GLPA1과 GLPA2를 제조하였다. 벤질 보호된 프로판-1,3-다이아민(benzyl protected propane-1,3-diamine)으로부터 시작하여, tert-부틸 2-브로모아세테이트(tert-butyl 2-bromoacetate)와 알킬화하여 트리에스터(triester) 화합물 I을 얻었다. 벤질 보호기를 수소화로 제거하여 2차 아민 화합물 II를 얻었다. 6-하이드록시헥사노산(6-hydroxyhexanoic acid)과의 아미드 결합(Amide coupling)은 화합물 III을 얻었다. 그 후 tert-부틸 보호기를 디옥산(dioxane)에서 HCl로 처리에 의해 제거하여 트리산(triacid) 화합물 IV를 생성했다. 트리산 화합물 IV와 중간체-A 또는 중간체-B 사이의 아미드 결합(Amide coupling)을 수행하여 화합물 Va 또는 Vb를 얻었다. 포스포라미다이트 GLPA1 또는 GLPA2는 화합물 Va 또는 Vb를 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2-Cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite)와 촉매량의 1H-테트라졸(1H-tetrazole)으로 인산화(phosphitylation)하여 합성되었다.
반응식 2
디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF, 100mL)의 N-벤질-1,3-프로판디아민(N-Benzyl-1,3-propanediamine)(5.00g, 30.4mmol) 용액에 tert-부틸 2-브로모아세테이트(23.7g, 121mmol)를 첨가한 후, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 23.61g, 182mmol)을 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 25-30°C에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 N-벤질-1,3-프로판디아민이 완전히 소모되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 H2O (500mL)로 희석하고 EtOAc(500mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기물(combined organics)을 포화 염수(brine)(1 L)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하고 감압으로 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피(silica gel column chromatography) (그래디언트(gradient) : 석유 에테르(petroleum ether) : 에틸 아세테이트 20:1에서 5:1까지)로 정제되었다. 화합물 I (12.1 g, 78.4 % 수율)은 무색 오일로 얻어졌다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.26 - 7.40 (m, 5 H), 3.79 (s, 2 H), 3.43 (s, 4 H), 3.21 (s, 2 H), 2.72 (dt, J = 16.9, 7.34 Hz, 4 H), 1.70 (quin, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.44 - 1.50 (m, 27 H).
건조된 수소화 병을 아르곤으로 세 번 퍼지하였다. Pd/C(200 mg, 10%)를 첨가한 다음 MeOH(5mL)를 첨가한 후 MeOH(5mL)의 화합물 I(1.00 g, 1.97 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 진공 상태에서 탈기하고 H2로 재충전하였다. 이 과정을 세 번 반복하였다. 혼합물을 25°C에서 12시간 동안 H2 (15psi) 분위기에서 교반하였다. LCMS는 화합물 I이 완전히 소모되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에서 감압 여과하였다. 여과액을 감압 농축하여 화합물 II (655 mg, 79.7 % 수율)를 황색 오일로 얻었으며, 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 3.44 (s, 4 H), 3.31 (s, 2 H), 2.78 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.68 (t, J = 6.9 Hz, 2 H), 1.88 (br s, 1 H), 1.69 (quin, J = 7.03 Hz, 2 H), 1.44 - 1.50 (s, 27 H).
화합물 II (655 mg, 1.57 mmol) , 6-하이드록시헥사노산(6-hydroxyhexanoic acid)(249 mg, 1.89 mmol), DIEA (1.02 g, 7.86 mmol) , 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)(EDCI, 904 mg, 4.72 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 637 mg, 4.72 mmol)을 DMF(6 mL)에 넣고 세 번 N2 으로 탈기 및 퍼지한 후, N2 분위기에서 25°C에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 원하는 생성물을 나타내었다. 반응 혼합물을 H2O(10 mL)로 희석하고 EtOAc 20 mL(10 mL x 2)로 추출하였다. 유기물을 결합하고 포화 염수(20 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하고 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피 (그래디언트 : 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 5 : 1에서 1 : 1까지)로 정제하여 화합물 III (650mg, 77.8 % 수율)를 황색 오일로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 3.90 - 3.95 (s, 2 H), 3.63 (t, J = 6.40 Hz, 2 H), 3.38 - 3.45 (m, 6 H), 2.72 (t, J = 6.65 Hz, 2 H), 2.40 (t, J = 7.28 Hz, 2 H), 1.55 - 1.75 (m, 8 H), 1.44 (s, 27 H). Mass calc. for C27H50N2O8: 530.36; found: 531.3 (M+H+).
화합물 III(5.5g, 10.3mmol)을 HCl/디옥산(2M, 55mL)에 혼합하여 25°C에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 III의 완전한 소모를 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하고 EtOAc(50mL)로 세척한 후 감압 건조하여 조 생성물을 얻었다. 이를 CH3CN (50mL)에 용해하고 진공 상태에서 휘발성 물질을 제거하였다. 이 과정을 세 번 반복하여 화합물 IV(2.05g, 54.5% 수율)를 백색 고체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O): δppm 4.21 (s, 1 H), 4.07 (d, J = 4.5 Hz, 4 H), 3.99 (s, 1 H), 3.45 - 3.52 (m, 3 H), 3.42 (t, J = 6.5 Hz, 1 H), 3.32 - 3.38 (m, 1 H), 3.24 - 3.31 (m, 1 H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 1.99 (dt, J = 15.5, 7.53 Hz, 1 H), 1.85 - 1.94 (m, 1 H), 1.85 - 1.94 (m, 1 H), 1.39 - 1.56 (m, 4 H), 1.19 - 1.31 (m, 2 H).
화합물 IV(500 mg, 1.05 mmol), 중간체-A(2.02 g, 3.67 mmol), DIEA(813 mg, 6.30 mmol), EDCI(704 mg, 3.67 mmol) 및 HOBt(496 mg, 3.67 mmol)의 혼합물을 DMF(10 mL)에서 세 번 N2 로 탈기 및 퍼지한 다음 혼합물을 N2 분위기에서 25°C에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 원하는 생성물을 나타내었다. 반응 혼합물을 H2O (10mL)를 첨가하여 켄칭(quench)하고 DCM(10mL x 2)으로 추출하였다. 결합된 유기물을 10% 구연산(20mL)으로 추출하였다. 수성상은 포화 NaHCO3 용액으로 중화시킨 후 DCM(10mL x 2)으로 재추출하였다. 유기물을 황산나트륨으로 건조시키고 여과 및 감압 농축하여 화합물 Va(570mg, 0.281mmol, 26.8% 수율)를 백색 고체로 얻었다. 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) ppm δ7.84 - 8.12 (m, 3 H), 6.85 - 7.15 (m, 2 H), 6.66 - 6.81 (m, 1 H), 5.36 (br d, J = 2.7 Hz, 3 H), 5.11 - 5.27 (m, 3 H), 4.63 - 4.85 (m, 3 H), 3.90 - 4.25 (m, 18 H), 3.37 - 3.75 (m, 28 H), 3.15 - 3.28 (m, 4 H), 2.64 (br d, J = 6.53 Hz, 2 H), 2.30 - 2.46 (m, 2 H), 2.13 - 2.18 (m, 9 H), 2.05 (s, 9 H), 1.94 - 2.03 (m, 18 H), 1.68 (br s, 2 H), 1.45 (br s, 2 H), 1.12 (br t, J = 7.0 Hz, 2 H).
무수 DCM(5mL)의 화합물 Va(260 mg, 0.161 mmol) 용액에 디이소프로필암모늄 테트라졸라이드(30.3 mg, 0.177 mmol)를 첨가한 후 N2 하에서 상온(ambient temperature)에서 3-bis(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(194 mg, 0.645 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 20~25°C에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 Va가 완전히 소모되었음을 나타내었다. -20°C로 냉각한 후, 반응 혼합물을 0°C에서 교반한 염수(brine)/포화 수용액 NaHCO3 (1:1, 5mL)에 첨가하였다. 1분간 교반한 후 DCM(5mL)을 첨가하였다. 층을 분리되었다. 유기물을 염수/포화 NaHCO3 수용액(1:1, 5mL)으로 세척하고, Na2SO4 으로 건조시키고 여과한 후 약 1mL 부피 이내로 농축하였다. 잔류 용액을 20mL의 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)에 교반하면서 적가하였다. 그 결과 백색 고체가 침전되었다. 혼합물을 원심분리하고 고체를 회수하였다. 고체를 1mL의 DCM에 재용해하고 MTBE(20mL)를 첨가하여 침전시켰다. 다시 원심분리로 고체를 분리하였다. 회수된 고체를 무수 CH3CN 에 용해하였다. 휘발성 물질을 제거하였다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 GalNAc 리간드 포스포라미다이트 화합물 GLPA1(153 mg, 84.4 μmol)을 백색 고체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): ppm δ7.71 - 8.06 (m, 2 H), 6.60 - 7.06 (m, 3 H), 5.37 (br d, J = 3.0 Hz, 3 H), 5.18 - 5.32 (m, 3 H), 4.70 - 4.86 (m, 3 H), 3.92 - 4.25 (m, 18 H), 3.42 - 3.85 (m, 30 H), 3.25 (m, 4 H), 2.59 - 2.75 (m, 4 H), 2.27 - 2.44 (m, 2 H), 2.15 - 2.20 (s, 9 H) 2.07 (s, 9 H), 1.96 - 2.03 (m, 18 H), 1.65 (br s, 4 H), 1.44 (br d, J = 7.28 Hz, 2 H), 1.14 - 1.24 (m, 12 H). 31P NMR (CDCl3): ppm δ147.15.
GalNAc 리간드 포스포라미다이트 화합물 GLPA2는 중간체-B를 사용한 것을 제외하고 동일한 절차를 사용하여 합성되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): ppm δ7.94 - 8.18 (m, 1 H), 7.69 (br s, 1 H), 6.66 - 7.10 (m, 3 H), 5.35 (d, J = 3.5 Hz, 3 H), 5.07 - 5.25 (m, 3 H), 4.76 - 4.86 (m, 3 H), 4.01 - 4.31 (m, 10 H), 3.91 - 4.01 (m, 8 H), 3.74 - 3.86 (m, 4 H), 3.52 - 3.71 (m, 30 H), 3.42 - 3.50 (m, 6 H), 3.15 - 3.25 (m, 4 H), 2.52 - 2.70 (m, 4 H), 2.22 - 2.45 (m, 2 H), 2.15 - 2.22 (s, 9 H), 2.06 (s, 9 H), 1.95 - 2.03 (m, 18 H), 1.77 (br s, 2 H), 1.58 - 1.66 (m, 4 H), 1.40 (m, 2 H), 1.08 - 1.24 (m, 12 H). 31P NMR (CDCl3): ppm δ147.12.
아래의 반응식 3을 따라 GLPA15를 준비하였다.
반응식 3
2차 아민 화합물 I(화학식 2의 화합물 II)에서 시작하여 화합물 II를 얻기 위해 Cbz 보호(Cbz protection)를 도입하였다. 화합물 II의 tert-부틸기를 산으로 처리하여 제거하여 트리산(triacid) 화합물 III을 얻었다. 화합물 III과 중간체-A의 아미드 결합(Amide coupling)은 화합물 IV를 얻었다. 화합물 IV의 Cbz 보호기를 수소화에 의해 제거하여 2차 아민 화합물 V를 얻었고, 이를 글루타르산(glutaric anhydride) 무수물과 반응시켜 카르복실(carboxylic) 화합물 VI를 얻었다. 화합물 VI는 아미드 결합 반응 조건에서 피페리딘-4-올(piperidin-4-ol)과 반응하여 화합물 VII를 얻었습니다. 포스포라미다이트 화합물 GLPA15는 화합물 VII를 2-시아노에틸 N,N 디이소프로필클로로포스포라미다이트(Cyanoethyl N,N diisopropylchlorophosphoramidite)와 촉매량의 1H-테트라졸으로 처리하여 합성되었다.
1H NMR (400 MHz in DMSO-d6): δppm 8.05 (br d, J = 6.50 Hz, 2 H), 7.81 (br d, J=9.01 Hz, 3 H), 5.22 (d, J=3.25 Hz, 3 H), 4.98 (dd, J=11.26, 3.25 Hz, 3 H), 4.55 (br d, J=8.50 Hz, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.64 - 3.97 (m, 12 H), 3.55 - 3.63 (m, 6 H), 3.50 (br s, 5 H), 3.40 (br d, J=6.13 Hz, 6 H), 3.17 - 3.30 (m, 9 H), 3.07 (br d, J=14.26 Hz, 4 H), 2.76 (t, J=5.82 Hz, 2 H), 2.18 - 2.47 (m, 6 H), 2.10 (s, 9 H), 1.99 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.78 (s, 9 H), 1.52 - 1.74 (m, 6 H), 1.12 - 1.19 (m, 12 H). 31P NMR (DMSO-d6): ppm δ145.25.
특정 연구에서, 감각 가닥의 5'-끝에 GalNAc(이하 GalNAc 전달 화합물이라고도 함)을 포함하는 표적기를 부착하는 데 사용되는 방법에는 고상 합성의 마지막 결합 단계에서 GalNAc 포스포라미다이트(GLPA1)의 사용이 포함되며, 이는 감각 가닥의 5'-끝에 뉴클레오티드를 추가하는 올리고뉴클레오티드 사슬 전파(oligonucleotide chain propagation)가 수행되는 경우 사용되는 공정과 같은 합성 프로세스를 사용한다.
일부 연구에서, 감각 가닥의 3'-끝에 GalNAc를 포함하는 표적기를 부착하는 방법은 GLO-n을 포함하는 고체 지지체(CPG)를 사용하는 것이 포함된다. 일부 연구에서, 센스 가닥의 3'-끝에 GalNAc을 포함하는 표적기를 부착하는 방법은 에스테르 결합을 통해 CPG 고체 지지체에 GalNAc 표적기를 부착하고, 센스 가닥을 합성할 때 부착된 GalNAc 표적기가 있는 결과물인 CPG를 사용하는 것을 포함하며, 이는 센스 가닥의 3'-끝에 GalNAc 표적기를 부착하는 결과를 가져온다.
실시예 4. ANGPTL3 siRNA 듀플렉스의 시험관 내 스크리닝
Hep3B 세포를 트립신화하여 적절한 밀도로 조정한 후 96웰 플레이트(96-well plate)에 시딩(seeded)하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라 프로토콜에 따라, 시딩과 동시에 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMax(Invitrogen -13778-150)를 사용하여 세포에 시험 siRNA 또는 대조 siRNA를 감염시켰다(transfected). siRNA는 두 가지 농도(0.2 nM 및 1.0 nM)로 3중으로 시험하였고, 대조군 siRNA는 4.6 pM에서 10 nM까지 3배 희석하여 8가지 농도로 3중으로 시험하였다.
감염 후 24시간 동안 세포를 배양하였다. 배지(medium)를 제거하고 RNA 추출을 위해 세포를 채취하였다. 매뉴얼에 따라 RNeasy®96 키드 (QIAGEN-74182)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다.
cDNA는 매뉴얼에 따라 FastKing RT 키트 (With gDNase, Tiangen- KR116-02)로 합성되었다. 인간 ANGPTL3 cDNA 발현은 GAPDH의 발현에 정규화된 TaqMan 유전자 발현 분석법(ANGPTL3, Thermo, Assay ID-Hs00205581_m1)을 사용하여 qPCR로 측정하였다(TaqMan 유전자 발현 분석법, Thermo, Assay ID-Hs02786624_g1 ). 억제율은 siRNA의 ANGPTL3 발현과 PBS 처리 샘플의 발현을 비교하여 계산되었다.
표 7은 ANGPTL3 발현을 억제하기 위해 다양한 ANGPTL3 RNAi 제제를 사용한 시험관 내 실험 결과를 제공한다. 사용된 듀플렌스 염기 서열은 표 2에 나타낸 것과 일치한다. 이러한 siRNA의 질량 및 순도 정보는 표 6에 제공되어 있다.
듀플렉스 AD#/AV# 평균 억제율 %
1 nM 0.2 nM
평균 SD 평균 SD
AD00001 -5.19 5.52 -0.78 10.86
AD00002 12.15 5.42 -19.15 13.82
AD00003 62.73 4.90 25.33 6.36
AD00004 57.79 4.53 27.11 2.89
AD00005 15.53 5.08 -29.56 52.97
AD00006 41.97 4.52 12.94 2.66
AD00007 69.11 2.77 51.52 7.13
AD00008 0.82 6.73 -15.73 21.57
AD00009 56.00 5.01 21.08 3.43
AD00010 -3.40 10.63 -16.26 1.85
AD00011 23.78 3.25 -1.38 3.37
AD00012 -21.96 3.21 -15.78 3.86
AD00013 70.81 4.85 46.13 6.26
AD00014 70.20 4.65 32.31 9.84
AD00015 40.80 10.10 12.68 4.57
AD00016 6.87 9.41 -9.49 4.42
AD00017 30.80 7.22 13.91 5.95
AD00018 38.10 7.57 9.06 8.13
AD00019 19.58 9.07 3.75 8.63
AD00020 15.40 13.52 6.17 5.77
AD00021 28.15 7.00 19.27 2.01
AD00022 37.00 9.75 11.35 10.36
AD00023 65.04 4.58 34.56 5.92
AD00024 48.97 1.68 31.66 6.61
AD00025 61.31 1.68 19.91 2.19
AD00026 63.83 4.01 26.37 6.87
AD00027 61.27 4.59 46.87 4.54
AD00028 33.07 5.81 8.61 13.96
AD00029 60.69 4.00 39.93 2.51
AD00030 45.51 3.70 22.33 1.27
AD00031 54.39 3.11 25.73 3.89
AD00032 36.39 3.99 3.76 13.22
AD00033 68.59 3.52 33.45 10.79
AD00034 75.68 1.50 34.45 5.85
AD00035 49.84 4.63 10.10 3.16
AD00036 0.77 2.56 -9.31 7.84
AD00037 36.14 2.80 11.00 1.06
AD00038 12.46 7.03 6.59 5.32
AD00039 61.61 5.84 26.26 2.53
AD00040 79.03 1.57 48.36 2.65
AD00041 49.34 6.87 18.31 4.89
AD00042 89.60 1.39 75.58 2.05
AD00043 49.66 6.43 18.20 1.58
AD00044 64.20 3.93 28.78 1.80
AD00045 61.35 3.18 29.41 6.91
AD00046 58.59 2.08 13.60 1.45
AD00047 33.71 4.50 4.87 4.54
AD00048 46.07 5.28 20.77 9.12
AD00049 35.83 3.07 12.33 4.69
AD00050 40.56 5.91 23.04 6.28
AV01087 92.70 0.21 89.84 0.24
AV01088 89.22 0.46 80.21 3.75
AV01089 86.31 2.92 69.73 2.30
AV01091 83.55 1.69 62.86 1.78
AV01092 88.15 0.60 77.92 1.80
AV01093 83.68 5.04 69.18 3.90
AV01094 88.17 1.24 70.78 2.59
AV01095 86.05 1.80 65.41 2.88
AV01096 87.50 0.50 76.20 1.00
AV01097 94.68 0.31 90.56 0.91
AV01098 94.19 0.35 87.02 2.24
AV01099 90.29 1.30 85.08 1.39
AV01100 92.59 1.52 87.37 2.42
AV01101 93.55 0.64 89.64 0.64
AV01102 93.18 1.00 89.49 0.65
AV01103 95.83 0.46 92.55 0.38
AV01104 94.35 0.82 91.25 0.83
AV01105 90.25 0.76 84.18 3.34
AV01106 90.51 1.29 83.34 2.67
AV01107 89.69 1.12 79.67 0.52
AV01108 85.19 1.10 66.55 1.85
AV01109 93.62 1.44 89.83 0.67
AV01110 92.26 1.88 84.95 1.73
AV01111 91.76 2.29 87.96 0.48
AV01112 87.14 2.11 70.92 3.59
AV01113 92.81 0.27 82.52 0.99
AV01114 94.11 0.21 89.72 0.26
AV01115 91.31 0.64 76.63 2.43
AV01116 93.66 1.97 84.28 5.60
실시예 5.
ANGPTL3 siRNA 듀플렉스의 생체 내(In Vivo) 시험
ANGPTL3 siRNA의 생체 내 활성을 평가하기 위해 인간 ANGPTL3 유전자를 인코딩하는 AAV에 감염된 마우스(각 그룹당 4마리)가 사용되었다. siRNA를 투여하기 14일 전에 암컷 C57BL/6J 마우스에 인간 ANGPTL3 유전자를 인코딩하는 아데노 연관 바이러스 8(AAV8) 벡터의 원액 25 μL 을 정맥 투여하여 감염시켰다. 0일째에 마우스에 3mg/kg의 ANGPTL3 siRNA 제제 또는 PBS를 피하 투여하였다. 0일차에는 siRNA 투여 전, 7일차에는 투여 종료 시점에 혈액 샘플을 채취하였다. 제조사의 권장 프로토콜(R&D Systems, 인간 안지오포이에틴-유사 3 Quantikine ELISA 키트)에 따라 ELISA 분석법으로 인간 ANGPTL3 단백질 농도를 측정하였다. siRNA 처리군의 7일째 마우스 혈장 샘플에서 인간 ANGPTL3 수준을 PBS 처리군과 비교하여 녹다운 백분율을 계산하였다. 화합물 AD00112, AD00135 및 AD00143의 녹다운 활성 백분율은 각각 91%, 83% 및 84% 이었다(표 3). 이 실시예에서, 상기 화합물 AD00112, AD00135 및 AD00143의 GLO-0은 Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 1695816961에서 화합물 GalNAc3을 참조한다
실시예 6
ANGPTL3 siRNA 듀플렉스의 생체 내 시험
siRNA를 투여하기 14일 전에 암컷 C57BL/6J 마우스(각 그룹당 4마리)에 인간 ANGPTL3 및 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 인코딩하는 아데노 연관 바이러스 8(AAV8) 벡터 용액을 정맥 투여하여 감염시켰다. 0일째에 마우스에게 3mg/kg의 ANGPTL3 siRNA 제제 또는 PBS를 단회 피하 투여하였다. 0일차에는 siRNA 투여 전, 7일차에는 투여 종료 시점에 혈액 샘플을 채취하였다. 혈청 샘플을 분리하고 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 혈청 샘플의 루시퍼라제 활성을 측정했다. 인간 ANGPTL3 수준의 발현은 루시퍼라제의 발현 수준과 상관관계가 있으므로 루시퍼라제 활성 측정은 ANGTPL3 발현의 대리 지표이다. 각 마우스에 대한 siRNA 처리 전(0일차)과 처리 후(7일차) 샘플의 루시퍼라제 활성을 비교하고 같은 기간 동안 대조군 처리 마우스 샘플의 루시퍼라제 활성 변화로 정규화하여 ANGPTL3의 잔존 백분율을 계산하였다. 결과는 표 8에 요약되어 있다. 이 실시예에서, 표 3의 상기 화합물에서 GLO-0은 Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 1695816961에서 화합물 GalNAc3를 참조한다.
표 8은 ANGPTL3 발현을 억제하기 위해 다양한 ANGPTL3 RNAi 제제를 사용한 생체 내 실험 결과를 제공한다. 사용된 듀플렉스 염기 서열은 표 3 및 표 4에 나타낸 것과 일치한다.
듀플렉스 AD# 7일차, PBS 기준
(평균 ± SD)		 듀플렉스 AD# 7일차, 0일차 대비 남은 루시퍼라제 활성도, PBS 처리 그룹의 변화에 따라 정상화됨
(평균 ± SD)
PBS 1±0.21 AD00135-2 0.11±0.04
AD00108 0.2±0.06 AD00136 0.09±0.02
AD00108-1 0.24±0.03 AD00136-1 0.13±0.06
AD00112 0.13±0.04 AD00142 0.16±0.04
AD00112-1 0.18±0.02 AD00143 0.15±0.05
AD00133 0.13±0.02 AD00143-2 0.22±0.07
AD00134 0.17±0.03 AD00145 0.21±0.04
AD00135 0.13±0.06 AD00146 0.16±0.05
실시예 7
ANGPTL3 siRNA 듀플렉스의 생체 내 시험
siRNA를 투여하기 14일 전에 암컷 C57BL/6J 마우스에 인간 ANGPTL3 및 루시퍼라제 유전자를 인코딩하는 아데노 연관 바이러스 8(AAV8) 벡터 용액을 정맥 투여하여 감염시켰다. 0일에 마우스에 AD00112-2를 1, 3 또는 10 mg/kg 또는 PBS를 단회 피하 투여했다. 0일차에는 siRNA 투여 전, 7일차에는 종료 시점에 혈액 샘플을 채취했다. 혈청 샘플을 분리하고 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 혈청 샘플의 루시퍼라제 활성을 측정했다. 인간 ANGPTL3 수준의 발현은 루시퍼라제의 발현 수준과 상관관계가 있으므로 루시퍼라제 활성 측정은 ANGTPL3 발현의 대리 지표이다. 결과는 표 9에 요약되어 있다.
표 9는 생체 내 연구의 실험 결과를 제공한다. 사용된 듀플렉스 염기 서열은 표 4에 나타낸 것과 일치한다.
듀플렉스 AD# 복용량
(mg/kg)		 7일차, 0일차 대비 남은 루시퍼라제 활성도, PBS 처리 그룹의 변화에 따라 정상화됨
(평균 ± SD)
AD00112-2 1 0.33 ± 0.06
AD00112-2 3 0.20 ± 0.09
AD00112-2 10 0.11 ± 0.03
실시예 8
NHP PD 모델에서 ANGPTL3 siRNA 듀플렉스의 생체 내 시험
수컷 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이(13~22세, 체중 7~9kg, 각 그룹에 4마리씩)가 연구에 참여되었다. 각 원숭이는 1일째에 4 mg/kg의 PBS로 제조된 시험 물질 중 하나를 피하 주사하였다(siRNA 사전 투여). 하룻밤 금식 후 -7일(투여 전), 1일(투여 전), 8일, 15일, 22일, 29일, 43일 및 50일에 혈액샘플을 채취하였다. 혈청 내 ANGPTL3 단백질 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 화합물 AD00112, AD00135 및 AD00136을 투여한 그룹의 ANGPTL3 잔존 비율(1일차, siRNA 투여 전으로 정규화)은 도 1에 나타냈다. 지질 프로필도 측정되었다. 도 2, 3, 4 및 5에는 각각 혈청 내 HDL, LDL, TC(총 콜레스테롤) 및 TG(트리글리세리트) 수준의 백분율 변화(siRNA 투여 전 1일째로 정규화)가 나타나 있다. 세 그룹 모두에서 siRNA 화합물을 투여한 원숭이에서 혈청 내 ANGPTL3의 유의미하고 지속적인 감소(최대 86%)가 관찰되었다. TG의 현저한 감소(최대 60% 감소)와 HDL-C 및 TC의 완만한 감소도 관찰되었다.
실시예 9
NHP 질병 모델에서 ANGPTL3 siRNA 듀플렉스의 생체 내 시험
수컷 시노몰구스 원숭이(13~21세)를 대상으로 HDL, LDL, TC(총 콜레스테롤), TG(트리글리세리드)를 포함한 기준 지질 프로필(baseline lipid profiles)을 검사하였다. 기준 LDL(1.03-2.36 mmol/L) 및 TG(1.42-6.71 mmol/L) 수준이 높은 원숭이 20마리를 선정하여 두 그룹으로 무작위 배정하여 0일째에 식염수 또는 AD00112-2를 10 mg/kg 단회 피하 주사하였다. 하룻밤 금식 후 -10일(투여 전), -2일(투여 전), 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일에 혈액 샘플을 채취하였다. 혈청 내 ANGPTL3 단백질 농도를 ELISA법으로 측정하였다. 식염수 또는 화합물 AD00112-2를 10 mg/kg 투여한 각 그룹의 ANGPTL3 잔존 백분율(기준선으로 정규화, -10일 및 -2일 평균)은 도 6에 나타나 있다. 지질 프로필도 측정되었다. 도 7, 8, 9 및 10에는 각각 혈청 내 HDL, LDL, TC(총 콜레스테롤) 및 TG(트리글리세리드) 수준의 백분율 변화(기준선으로 정규화, siRNA 투여 전)가 나타나 있다. ANGPTL3 농도와 TG 수준의 깊고 지속적인 감소가 관찰되었다. HDL-C, LDL-C 및 TC 수준의 완만한 감소도 관찰되었다.
등가물(Equivalents)
본 발명의 여러 실시양태가 본 명세서에 설명 및 예시되었지만, 당업자는 본 발명의 기능을 수행 및/또는 결과 및/또는 하나 이상의 장점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 그러한 각 변형 및/또는 수정은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자들은 본 명세서에 설명된 모든 파라미터, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것이며, 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 구성은 본 발명의 가르침이 사용되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 본 명세서에 기술된 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시양태들은 단지 예시로서만 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 등가물 범위 내에서, 본 발명은 구체적으로 설명되고 청구된 바와는 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우, 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법의 둘 이상의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 약관에서 정의하고 사용하는 모든 정의는 사전적 정의, 참조로 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 통상적 의미에 우선하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 반대되는 의미가 명확하게 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 "및/또는"이라는 문구는 그렇게 결합된 요소들, 즉 어떤 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소들의 "어느 하나 또는 둘"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별되는 요소 외에 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있으며, 이는 반대의 명백한 표시가 없는 한 구체적으로 식별되는 요소와 관련되거나 관련되지 않는 요소이다.
본 출원에 인용되거나 언급된 모든 참고 문헌, 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 출원에 참조용으로 전체가 포함된다.

Claims (93)

  1. 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    상기 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 2 내지 18은 ANGPTL3 RNA 전사체에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역은 표 1 내지 5 중 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 0, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드가 다른 적어도 15 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 선택적으로 표적 리간드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 ANGPTL3 RNA 전사체에 대한 상보성 영역은 표 1 내지 5 중 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 3 이하의 뉴클레오티드가 다른, 적어도 15, 16, 17, 18 또는 19 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 dsRNA의 안티센스 가닥은 적어도 서열번호 235의 표적 영역 중 어느 하나에 대해 실질적으로 상보적이며 표 1 내지 5 중 어느 하나에 제공되는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 dsRNA의 안티센스 가닥은 상기 서열번호 235의 표적 영역 중 어느 하나에 대해 완전히 상보적이며 표 1 내지 5 중 어느 하나에 제공되는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 센스 가닥 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 서열은 상기 dsRNA 제제 내의 안티센스 가닥 서열과 적어도 실질적으로 상보적인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 센스 가닥 서열을 포함하며, 상기 센스 가닥 서열은 상기 dsRNA 제제 내의 안티센스 가닥 서열과 완전히 상보적인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 규정된 안티센스 가닥 서열을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 듀플렉스 서열(duplex sequence)로 규정된 서열을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  11. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드가 다음을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제: 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'3'-세코 뉴클레오티드 유사체, 잠금 뉴클레오티드, 잠금 해제 핵산 뉴클레오티드(UNA), 글리콜 핵산 뉴클레오티드(GNA), 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메트옥시에틸 뉴클레오티드, 비염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역위된 뉴클레오티드, 역위된 비염기성 뉴클레오티드, 역위된 2'-OMe 뉴클레오티드, 역위된 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 모폴리노 뉴클레오티드, 및 3'-OMe 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, '포스포라미드산염, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 염기.
  12. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    가이드 가닥의 5´ 끝(end)에 E-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage)을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 변형된 센스 가닥은 표 2 내지 5 중 하나에 규정된 변형된 센스 가닥 서열인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  20. 제 1항에 있어서,
    상기 변형된 안티센스 가닥은 표 2 내지 5 중 하나에 규정된 변형된 안티센스 가닥 서열인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적이거나 실질적으로 상보적이며, 상기 상보성 영역은 길이가 16 내지 23 뉴클레오티드인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  22. 제 1항에 있어서,
    상기 상보성 영역은 길이가 19-21 뉴클레오티드인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  23. 제 1항에 있어서,
    각 가닥은 길이가 30 뉴클레오티드 이하인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  24. 제 1항에 있어서,
    각 가닥은 길이가 25 뉴클레오티드 이하인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  25. 제 1항에 있어서,
    각 가닥은 길이가 23 뉴클레오티드 이하인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  26. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 하나 이상의 표적기(target group) 또는 연결기(linking group)를 더 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적기 또는 연결기는 센스 가닥에 접합되는(conjugated), 이중 가닥 리보핵산 제제.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
    상기 표적기 또는 연결기는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  29. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
    상기 표적기는 이하 어느 하나의 구조를 갖는, 이중 가닥 리보핵산 제제:
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
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    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,

    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    , 또는
    .
  30. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단 끝에 접합된 표적기를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  31. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-말단(terminal) 끝에 접합된 표적기를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  32. 제 1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥은 3'-말단 끝에 하나의 역위된 비염기성 잔기를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  33. 제 1항에 있어서,
    상기 센스 가닥은 3' 또는/및 5' 말단 끝에 하나 또는 2개의 역위된 비염기성 잔기를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  34. 제 1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제는 두 개의 뭉툭한 끝(blunt ends)를 갖는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  35. 제 1항에 있어서,
    적어도 하나의 가닥은 적어도 1 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  36. 제 1항에 있어서,
    적어도 하나의 가닥은 적어도 2 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 제제.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 포함하는, 조성물.
  38. 제 37항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는, 조성물.
  39. 제 38항에 있어서,
    하나 이상의 추가 치료제를 더 포함하는, 조성물.
  40. 제 39항에 있어서,
    상기 조성물은 키트, 용기, 팩, 디스펜서, 사전 충전된 주사기 또는 바이알에 포장된, 조성물.
  41. 제 37항에 있어서,
    상기 조성물은 피하 투여를 위해 제조되거나 정맥(IV) 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
  42. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 포함하는, 세포.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 세포, 선택적으로 인간 세포인, 세포.
  44. 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 이하를 포함하는, 방법:
    (i) 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는 세포를 제조하는 단계.
  45. 제 44항에 있어서, 이하를 더 포함하는, 방법:
    (ii) 제 44항에서 제조된 세포를 ANGPTL3 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지함으로써, 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 단계.
  46. 제 44항에 있어서,
    상기 세포는 대상체 내에 있고, 상기 dsRNA 제제는 대상체에게 피하 투여되는, 방법.
  47. 제 44항에 있어서,
    상기 세포는 대상체 내에 있고, 상기 dsRNA 제제는 대상체에게 정맥 투여에 의해 투여되는, 방법.
  48. 제 46항 또는 제 47항에 있어서,
    대상체에 dsRNA 제제를 투여한 후, ANGPTL3 유전자의 억제를 평가하는 단계를 더 포함하는 방법으로서, 상기 평가를 위한 수단은 이하를 더 포함하는, 방법:
    (i) 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성을 결정하는 단계; 및
    (ii) 결정된 생리적 특성을 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성 및/또는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 대조군 생리적 특성과 비교하는 단계로서,
    상기 비교는 대상체에서 ANGPTL3 유전자의 발현 억제 유무 중 하나 이상을 나타내는, 단계.
  49. 제 48항에 있어서,
    상기 결정된 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 어느 하나 이상인, 방법.
  50. 제 49항에 있어서,
    상기 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준 및 대상체의 간 내 지방량 중 어느 하나 이상의 감소는 대상체의 ANGPTL3 유전자 발현의 감소를 나타내는 것인, 방법.
  51. 대상체에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제 51항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 대상체에게 피하 투여되는, 방법.
  53. 제 51항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 대상체에게 정맥 투여에 의해 투여되는, 방법.
  54. 제 51항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 투여에 따른 ANGPTL3 유전자의 억제를 평가하는 단계를 더 포함하는 방법으로서, 상기 평가는 이하를 포함하는, 방법:
    (i) 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성을 결정하는 단계; 및
    (ii) 결정된 생리적 특성을 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성 및/또는 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 대조군 생리적 특성과 비교하는 단계로서,
    상기 비교는 대상체에서 ANGPTL3 유전자의 발현 억제 유무 중 하나 이상을 나타내는, 단계.
  55. 제 54항에 있어서,
    상기 결정된 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 어느 하나 이상인, 방법.
  56. 제 55항에 있어서,
    상기 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상의 감소는 대상체의 AGNPTL3 유전자 발현의 감소를 나타내는 것인, 방법.
  57. ANGPTL3 단백질의 존재와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 ANGPTL3 유전자 발현을 억제하기 위해 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제 57항에 있어서,
    상기 질병 또는 병태는 다음 중 하나 이상인, 방법:
    고지혈증(hyperlipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상(abnormal lipid and/or cholesterol metabolism), 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증(homozygous and heterozygous familial hypercholesterolemia), 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증(statin resistant hypercholesterolemia), 심장 대사 질환(cardiometabolic disease), 비만(obesity), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 제2형 당뇨병(type II diabetes mellitus), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis), 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease), 고중성지방혈증으로 인한 췌장염(pancreatitis caused by hypertriglyceridemia).
  59. 제 57항에 있어서,
    상기 대상체에 추가 치료 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  60. 제 59항에 있어서,
    상기 추가 치료 요법은 이하를 포함하는, 방법:
    본 발명의 하나 이상의 ANGPTL3 안티센스 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계, 비-ANGPTL3 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 치료제를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체의 행동 수정 단계.
  61. 제 60항에 있어서,
    상기 비-ANGPTL3 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 치료제는 다음 중 하나 이상인, 방법:
    (i) 스타틴; (ii) 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 및 PCSK9 발현을 감소시킬 수 있는 PCSK9 siRNA 분자 중 하나 이상; (iii) 대상체에서 지질 축적을 감소시킬 수 있는 치료제, 및 (iv) 대상체에서 콜레스테롤 수준 및/또는 축적을 감소시킬 수 있는 치료제.
  62. 제 57항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 대상체에게 피하 투여되는, 방법.
  63. 제 57항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 대상체에게 정맥 투여에 의해 투여되는, 방법.
  64. 제 57항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에 대한 상기 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 효능을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  65. 제 64항에 있어서,
    대상체에 대한 치료의 효능을 결정하는 수단은 이하를 포함하는, 방법:
    (i) 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리적 특성을 결정하는 단계; 및
    (ii) 결정된 생리적 특성을 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성과 비교하는 단계로서,
    상기 비교는 대상체에 대한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 투여 여부 및 효능 수준 중 하나 이상을 나타내는, 방법.
  66. 제 65항에 있어서,
    상기 결정된 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량인, 방법.
  67. 제 65항에 있어서,
    상기 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 혈청 HDL 수준, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상의 감소는 대상체에게 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 투여가 효능이 있음을 나타내는 것인, 방법.
  68. 대상체 내 치료 전 기준치인 ANGPTL3 단백질 수준과 비교하여 대상체 내 ANGPTL3 단백질 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 ANGPTL3 유전자 발현 수준을 감소시키기 위해 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  69. 제 68항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 대상체에 피하 투여되거나 대상체에 정맥 투여에 의해 투여되는, 방법.
  70. 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성과 비교하여 변경하는 방법으로, 상기 방법은 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 변경하기 위해, 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 유효량 투여하는 것을 포함하는, 방법
  71. 제 70항에 있어서,
    상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 대상체에 피하 투여되거나 대상체에 정맥 투여에 의해 투여되는, 방법.
  72. 제 70항에 있어서,
    상기 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상인, 방법.
  73. ANGPTL3 단백질의 발현을 억제하기 위한 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제로서, 상기 제제는 10 내지 30 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 연속적인 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 변형된 뉴클레오티드이며, 상기 제제의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 235의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 영역(equivalent region)의 전체 길이에 걸쳐 약 80% 상보적인, 제제.
  74. 제 73항에 있어서,
    상기 상응하는 영역은 서열번호 235의 표적 영역 중 임의의 하나이고, 상보적인 서열은 표 1 내지 5 중 어느 하나에 제공된 서열인, 제제.
  75. 제 73항에 있어서,
    상기 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 표 1 내지 5 중 어느 하나에 제공된 안티센스 서열 중 어느 하나를 포함하는, 제제.
  76. 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 해당하는 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는, 조성물.
  77. 제 76항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는, 조성물.
  78. 제 76항 또는 제 77항에 있어서,
    ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료를 위한 하나 이상의 추가 치료제를 더 포함하는, 조성물.
  79. 제 76항에 있어서,
    상기 조성물은 키트, 용기, 팩, 디스펜서, 사전 충전된 주사기 또는 바이알에 포장되는, 조성물.
  80. 제 76항에 있어서,
    상기 조성물은 피하 또는 정맥 투여를 위해 제형화된, 조성물.
  81. 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는, 세포.
  82. 제 81항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 세포, 선택적으로 인간 세포인, 세포.
  83. 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 이하를 포함하는, 방법:
    (i) 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량을 포함하는 세포를 제조하는 단계.
  84. 제 83항에 있어서, 이하를 더 포함하는, 방법:
    (ii) (i)에서 제조된 세포를 ANGPTL3 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지함으로써, 세포에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 단계.
  85. 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제, 또는 제 76항 내지 제 80항의 조성물을 대상체에 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  86. ANGPTL3 단백질의 존재와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    ANGPTL3 유전자 발현을 억제하기 위해 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 또는 제 76항 내지 제 80항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 제 86항에 있어서,
    상기 질병 또는 병태는 다음 중 어느 하나 이상인, 방법:
    고지혈증, 고중성지방혈증, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 이상, 동형 접합 및 이형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증, 스타틴 저항성 고콜레스테롤혈증, 심장 대사 질환, 비만, 죽상 동맥경화증, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 관상 동맥 질환, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환, 고중성지방혈증으로 인한 췌장염.
  88. 대상체 내 치료 전 기준치인 ANGPTL3 단백질 수준과 비교하여 대상체 내 ANGPTL3 단백질 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 ANGPTL3 유전자 발현 수준을 감소시키기 위해 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제, 또는 제 76항 내지 제 80항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제 86항 내지 제 88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 대상체에게 피하 또는 정맥 투여를 통해 투여되는, 방법.
  90. ANGPTL3 유전자의 발현을 억제하기 위한 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제로서, 상기 제제는 10 내지 30 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 연속적인 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 변형된 뉴클레오티드이며, 상기 제제의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 235의 뉴클레오티드 서열과 상응하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 약 80% 또는 약 85% 상보적인, 제제.
  91. 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 대상체의 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 치료 전 기준 생리적 특성과 비교하여 변경하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에서 ANGPTL3 관련 질병 또는 병태의 생리적 특성을 변경하기 위해, 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 또는 제 76항 내지 제 80항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  92. 제 91항에 있어서,
    상기 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 대상체에게 피하 또는 정맥 투여에 의해 투여되는, 방법.
  93. 제 91항에 있어서,
    상기 생리적 특성은 대상체의 혈청 지질 수준, 대상체의 HDL 수준, 대상체의 HDL : LDL 비율, 대상체의 혈청 트리글리세리드 수준, 및 대상체의 간 내 지방량 중 하나 이상인 방법.
KR1020247011040A 2021-09-23 2022-09-22 안지오포이에틴-유사 3(angptl3) 단백질의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 KR20240053627A (ko)

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