CN109971756A - 抑制EGFR表达的siRNA及其前体和应用 - Google Patents

抑制EGFR表达的siRNA及其前体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制EGFR基因表达的siRNA，及其前体序列和应用。本发明给出的EGFR siRNA可以高效抑制EGFR基因的表达，并且体内实验表明对于EGFR高表达肿瘤有一定的抑制作用。本发明的siRNA的前体及其载体可以在其宿主中形成稳定的siRNA，并发挥作用。

Description

抑制EGFR表达的siRNA及其前体和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及抑制EGFR基因表达的siRNA及其前体和应用。
背景技术
人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族是具有酪氨酸激酶活性的膜受体。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。实验研究发现EGFR在许多人类肿瘤中有不同程度的过度表达，且已经证明EGFR与肿瘤的分化程度、恶性程度及浸润程度、放化疗敏感性、肿瘤耐药性及预后等密切相关。EGFR家族被认为是抗肿瘤治疗的理想分子靶点之一。
目前，针对EGFR的肿瘤分子靶向药物，按其性质主要分为两大类：一类是单克隆抗体，如西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等，一类为小分子抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、拉帕替尼等，虽然上述分子靶向药物与传统化疗药物相比，分子靶向药物具有特异性强、疗效明显、副作用少等优点。但是
RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA(Small interferingRNA)，是一种小RNA分子(～21-25核苷酸)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。siRNA在RNA沉默通路中起中心作用，是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。
siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。siRNA还存在一些问题，例如：裸露的siRNA由于血清中的RNase A和极高的肾清除率导致其极易被降解，半衰期短；RNAi可能引起的脱靶效应，有研究表明，siRNA作用过程中存在非特异性，可能与靶基因之外的其他基因作用而非特异性地阻断基因表达，产生意料之外的效应。
综上所述，本领域尚需要开发一种能够调控EGFR活性或表达量的siRNA。
发明内容
本发明提供了一种新的抑制EGFR基因表达的siRNA及其前体及其在治疗肿瘤中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：
B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括EGFR siRNA正义链序列，所述EGFR siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；
C为茎环结构序列；
A1和A2分别为无，或任选的由碱基组成的RNA序列；
其中，所述的前体序列能在宿主中加工形成EGFR siRNA。
在另一优选例中，所述茎环结构序列为SEQ ID NO.:2(GUUUUGGCCACUGACUGAC)或SEQ ID NO.:3(GUCAGUCAGUGGCCAAA)所示的序列。
在另一优选例中，所述加工形成的EGFR siRNA如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述的基本互补指所述B2与B1有2-8个碱基不互补，较佳地，所述B2与B1有3-5个碱基不互补。
在另一优选例中，所述B2的长度为18-22个碱基。
在另一优选例中，所述B2较B1添加或缺失0-2个碱基。
在另一优选例中，所述B2较B1缺失0-2个碱基，更佳地，缺失1-2个碱基。
在另一优选例中，所述的被缺失的1-2个碱基位于B1的中部，即9-14位中的1-2个碱基，如第9-10位，第10-11位，第11-12位，第12-13位或第13-14位。
在另一优选例中，所述B2为SEQ ID NO.:14(AGGAAUUAAGAAGCAACA)所示的序列。
在另一优选例中，所述A1和A2分别为无，或任选的由1-200个(较佳地3-100个，更佳地5-50个)碱基组成的RNA序列；
在另一优选例中，所述的A1为SEQ ID NO.:12(UGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCUG)所示的序列；和/或所述的A2为SEQ ID NO.:13(CAGGACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCCC)。
在另一优选例中，所述前体序列如SEQ ID NO.:15所示。
UGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCUGUGUUGCUUCUCUUAAUUCCUGUUUUGGCCACUGACUGACAGGAAUUAAGAAGCAACACAGGACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCCC(SEQ ID NO.:15)
本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第一方面中所述的前体序列。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体还含有TNC siRNA的前体序列或能被宿主转录形成TNC siRNA的前体序列的多核苷酸。
在另一优选例中，所述TNC siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4(CACACAAGCCAUCUACACAUG)所示。
在另一优选例中，所述的表达载体还含有(i)编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸，和(ii)TNC siRNA的前体序列或能被宿主转录形成TNC siRNA的前体序列的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。
在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。
在另一优选例中，所述的本发明第二方面所述的多核苷酸的上游为启动子，并且其下游为TKPA元件。
本发明的第四方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有：
(a)用于表达抑制EGFR基因表达的siRNA的表达载体；以及
(b)药学上可接受的载体；
其中，所述表达载体含有达本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸，或表达本发明第一方面所述的前体序列。
在另一优选例中，所述药物制剂还含有用于表达抑制TNC基因表达的siRNA的表达载体。
在另一优选例中，所述的制剂为液体剂型。
在另一优选例中，所述的制剂为注射剂。
在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。
在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。
在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达EGFR siRNA和/或TNC siRNA的表达盒。
在另一优选例中，所述的表达盒(即多核苷酸)为双链，并且具有以下结构：
启动子-attB1-任选的标签蛋白(如GFP或emGFP)-5’siRNA侧翼区序列-式I所示的序列-5’siRNA侧翼区序列-attB2-任选的TKPA元件。
在另一优选例中，所述的制剂为脂质体制剂。
本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有(a)本发明第一方面所述的前体序列、或本发明第三方面所述的表达载体，和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括EGFR siRNA质粒。
在另一优选例中，所述药物组合物还含有TNC的靶向药物，较佳地含有TNC siRNA或其前体序列、或用于表达抑制TNC基因表达的siRNA的表达载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为本发明第三方面所述的表达载体，较佳地，为含有本发明第一方面所述前体序列的质粒。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂；较佳地，所述的剂型为注射剂，如静脉注射剂、腹腔注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药；较佳地，所述施用方法包括直接注射质粒。
本发明的第六方面，提供了一种抑制EGFR基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述前体序列、本发明第三方面所述表达载体、或本发明第六方面所述siRNA的用途，(i)用于制备EGFR的抑制剂；和/或(ii)用于制备抗EGFR高表达恶性肿瘤的药物组合物；
较佳地，所述的恶性肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、口腔上皮癌、头颈癌、脑瘤或胶质细胞瘤。
在另一优选例中，所述恶性肿瘤为肺癌和/或胶质母细胞瘤。
本发明第八方面，提供了一种施用药物的方法，包括步骤：
将本发明第四方面所述的药物制剂施用于哺乳动物的第一部位，从而使得所述表达载体在所述哺乳动物体内被加工形成微粒子(microvesicle)，并被运输到所述哺乳动物的第二部位，并在所述的第二部位表达所述的siRNA。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的第一部位包括皮下、静脉、肠胃道、或肝脏。
在另一优选例中，所述的第二部位包括肝脏、肺、肾脏。
在另一优选例中，所述的施用包括口服、皮下注射、肌内注射、静脉注射。
本发明第九方面，提供了一种体外非治疗性抑制EGFR高表达恶性肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：
在本发明第五方面所述药物组合物存在情况下培养EGFR高表达恶性肿瘤细胞，从而抑制EGFR高表达恶性肿瘤细胞的生长。
本发明第十方面，提供了一种治疗EGFR高表达恶性肿瘤的方法，将安全有效量的本发明第三方面所述的表达载体或本发明第五方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而治疗EGFR高表达相关疾病。
在另一优选例中，所述施用的剂量为0.05-10mg/kg，较佳地，为0.1-5mg/kg。
在另一优选例中，所述施用包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药；
在另一优选例中，所述施用包括注射质粒。
本发明第十一方面，提供了一种治疗EGFR高表达相关疾病的方法，将含有本发明第一方面所述的前体序列的EGFR siRNA质粒通过静脉注射施用于所需对象，从而治疗EGFR高表达相关疾病。
本发明给出的EGFR siRNA及其前体、载体可以高效抑制EGFR基因的表达，并且体内实验表明对于EGFR高表达肿瘤有一定的抑制作用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在原位肺癌模型中，静脉注射MLFEGFR质粒缩减了肿瘤的大小。(A)实验设计流程图。裸鼠经静脉注射LLC细胞，30天后，采用显微C扫描分析确认肺肿瘤形成。将随机分配的4组荷瘤小鼠，分别经静脉注射PBS、MLFSCR质粒(5mg/kg)、MLFEGFR质粒(5mg/kg)或灌喂吉非替尼(作为阴性对照)，每2天一次，共进行7次。随后，分别监测这些小鼠的以确定其存活时间和肿瘤生长情况。(B)肺癌荷瘤小鼠的Kaplan–Meier生存曲线(PBS组,n＝9；MLFSCR组,n＝8；Gefitinib组(吉非替尼组),n＝5；MLFEGFR组,n＝16)。(C)注射质粒前后，小鼠肺部的纵向显微CT图像典型例。在X射线下，肿瘤有明显不同的密度，在这里所示的每个独立CT图像中，采用一条黄色的线来区分。(D)注射质粒前后，小鼠肺部3D重建图像典型例。肿瘤以褐红色显示，来确定其在3D图像中的位置。(E)根据3D重建的胸腔图像，采用半自动化定量图像分析系统估算每组肿瘤样本的体积(PBS,MLFSCR和吉非替尼,n＝3；MLFEGFR,n＝7)。(F)HE染色的肺部切片典型例。(G)用EGFR(上方)和用PCNA处理(下方)的肺部切片典型例。(H)对肺部切片中EGFR和PCNA水平的定量分析。(I)小鼠肝脏、肺和血浆中MLFEGFR的绝对表达水平。(J)肺肿瘤样本中EGFR蛋白免疫印迹图像典型例。(K)对EGFR蛋白水平的定量分析。*p<0.05；**p<0.01。
图2显示了通过静脉注射MLFEGFR+RVG质粒，使MLFEGFR靶向作用于脑组织。(A)构建质MLFEGFR+RVG粒和MLFEGFR+TNC+RVG质粒。(B)采用定量逆转录PCR方法检测的转染了MLFSCR质粒MLFEGFR质粒和MLFEGFR+RVG质粒的HEK293T细胞所产生的外泌体中MLFEGFR的表达水平。(C)从小鼠血浆中分离外泌体并作为FLAG和CD63免疫印迹检测的输入样本，基于anti-FLAG抗体和anti-CD63抗体的免疫印迹检测结果。(D)经静脉注射PBS、MLFSCR+RVG质粒(5mg/kg)、MLFEGFR质粒(5mg/kg)、MLFEGFR+RVG质粒(5mg/kg)后，小鼠肝脏、脾脏、肺、肾脏和脑组织中MLFEGFR表达的绝对水平。(E)经静脉注射PBS、MLFSCR+RVG质粒、MLFEGFR质粒、MLFEGFR+RVG质粒后，1mL血浆中和1mL血浆中分离的外泌体中MLFEGFR表达的绝对水平。
图3显示了在胶质母细胞瘤模型小鼠中，静脉注射MLFEGFR+RVG质粒减少肿瘤生长。(A).实验设计流程图。裸鼠颅内植入荧光标记的U87MG细胞，7天后使用BLI检测分析确定胶质母细胞瘤在脑内形成。将建模成功小鼠随机分为4组，两星期内分别静脉注射5mg/kg剂量的MLFSCR+RVG质粒、MLFEGFR质粒、MLFEGFR+RVG质粒和MLFEGFR+TNC+RVG质粒，共计7次。在静脉注射后的第14和21天，同时对这些进行生存分析和BLI扫描以评估肿瘤的生长情况。(B)(MLFSCR +RVG,MLFEGFR和MLFEGFR+RVG,n＝6；MLFEGFR+TNC+RVG,n＝12).胶质母细胞瘤荷瘤小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。(C)每只小鼠体内的胶质母细胞瘤的BLI扫描图像。(D)胶质母细胞瘤大小的定量分析(MLFSCR+RVG,MLFEGFR和MLFEGFR+RVG,n＝6；MLFEGFR+TNC+RVG,n＝12)。(E)胶质母细胞瘤的EGFR、TNC和PCNA染色切片典型例。(F)胶质母细胞瘤切片中EGFR、TNC、PCNA的定量分析。(G)胶质母细胞瘤样本中MLFEGFR和MLFTNC表达的绝对水平。(H)胶质母细胞瘤样本的EGFR和TNC蛋白免疫印迹反应结果典型。(I)EGFR和TNC蛋白的水平的定量分析结果。*p<0.05；**p<0.01。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，从一百多种EGFR siRNA序列中意外筛选到一种稳定性优异、特异性好，并能够非常有效杀伤肿瘤(如肺癌或胶质母细胞瘤)的EGFR siRNA(SEQ ID NO.:1)。并设计制备了一种能够高效表达本发明EGFR siRNA的前体siRNA。本发明前体siRNA经过宿主细胞的加工后，能够高效地表达siRNA，从而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明，本发明前体siRNA能够在体内有效表达EGFR siRNA序列，并对多种恶性肿瘤都具有更有效的治疗作用。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”、“所需对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类，如牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、骆驼、大鼠、小鼠、野兔和家兔。
类似microRNA片段
类似microRNA片段(microRNA-like fragment，简称MLF)包括miRNA,siRNA及其拮抗物。MLF表达质粒是基于以下四个条件设计的：1)MLF片段是一种siRNA、miRNA或者antagomir；2)MLF片段应区别于内源性miRNA和其他小分子RNA片段；3)MLF片段应该有最小范围的潜在靶基因(以避免产生意料外的病理反应或其他副作用)；4)MLF应由细胞培养获得的外泌体递送至生物体内并产生作用。
溶酶体相关膜蛋白-2
溶酶体相关膜蛋白-2(lysosome-associated membrane proteins,Lamp2)是位于溶酶体膜上的一组高糖基化跨膜蛋白。Lamp2的合成包括两个主要的生物合成途径，直接途径和间接途径。直接途径即新合成的Lamp2在细胞内涵体或晚期内涵体，再转运至溶酶体。间接途径是主要途径，即新合成的Lamp2从TGN转运到细胞表面，之后被内吞至早期内涵体，再转运到晚期内涵体，最后转运到溶酶体。
狂犬病毒糖蛋白
狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)是一种嗜神经性的蛋白质，能够与神经细胞表达的乙酰胆碱受体相结合。狂犬病毒为弹状病毒科狂犬病毒属，具有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒主要编码糖蛋白G，G蛋白以三聚体的形式锚定于病毒囊膜表面，并能够与细胞表面的受体结合，介导膜融合使病毒侵入细胞。同时，G蛋白是狂犬病毒主要的抗原蛋白，刺激机体产生中和抗体。RVG肽特异性结合神经元细胞所表达的胆碱体，RVG靶点在细胞膜外表达，引导外泌体通过血脑屏障，使MLF运输到神经细胞。
siRNA及其前体
如本文所用，所述的“siRNA”是指一类RNA分子，从可形成siRNA前体的转录物加工而来。成熟的siRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的siRNA分子。siRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的siRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
siRNA可从前体siRNA加工而来，所述的前体siRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体siRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。
在本发明中，所述的前体siRNA为人工合成的前体siRNA，且所述的前体siRNA具有式I所示的结构：
作为代表性的例子，B1为EGFR siRNA正义链序列；
B2为与B1互补(包括基本互补和完全互补)的序列；
C可为序列：5’-3’，GUUUUGGCCACUGACUGAC(SEQ ID NO.:2)；
A1和A2分别为无，或任选的由4个-5个碱基组成的核苷酸序列；
其中，所示的前体siRNA能在宿主中加工形成EGFR siRNA。
在本发明中，形成EGFR siRNA的前体miRNA可被剪切生成调节EGFR基因的siRNA，即EGFR siRNA(例如，SEQ ID NO.:1)。
在式I中，B2和B1为基本互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多8个不匹配的核苷酸，优选地，具有1、2、3、4、5个不匹配的核苷酸。
如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明中，“茎环结构”可存在于式I所示前体siRNA的末端，例如由于B1和B2形成基本互补后，C会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体siRNA内部，例如由于B1和B2之间并非完全互补，造成未互补结合的B1或B2的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。
本发明所述的EGFR高表达是指：EGFR蛋白高表达，或EGFR mRNA高表达。
根据本发明所提供的siRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的EGFR siRNA的量，从而降低EGFR的表达量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体siRNA，所述的前体siRNA可被人细胞剪切且表达成所述的siRNA。
在另一优选例中，所述前体序列如SEQ ID NO.:15所示。
UGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCUGUGUUGCUUCUCUUAAUUCCUGUUUUGGCCACUGACUGACAGGAAUUAAGAAGCAACACAGGACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCCC(SEQ ID NO.:15)
多核苷酸构建物
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物自5’至3’端含有式II所示的结构：
a1-b1-c-b2-a2 式II
式II中，
b1为可在细胞中表达成所述的EGFR siRNA的核苷酸序列，b2为与b1基本上互补或完全互补的核苷酸序列；c为位于b1和b2之间的间隔序列，并且所述间隔序列与B1和B2不互补；
a1和a2分别为无，或任选的由4个-5个碱基组成的核苷酸序列；
式II所示的结构在转入细胞后，形成式I所示的二级结构：
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的siRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中，所述表达载体没有特别限制，包括市售的或用常规制备的表达载体。代表性的例子包括(但并不限于)：pcDNATM6.2-GW/miR、pcDNA3、pMIR-REPORT miRNA、pAdTrack-CMV、pCMVp-NEO-BAN、pSV2、CMV4表达载体、pmiR-RB-ReportTM、pshOK-basic、mmu-mir 300-399miRNASelectTM、pshRNA-copGFP Lentivector、GV317、GV309、GV253、GV250、GV249、GV234、GV233、GV232、GV201、GV159或其他GV系列真核表达载体。
在另一优选例中，在所述表达载体中，与所述表达所述前体siRNA多核苷酸操作性相连的启动子包括组成型启动子或组织特异性启动子，优选在肝脏组织中特异性启动的启动子。换言之，这些启动子用于驱动前体siRNA的表达。
代表性的启动子包括(但并不限于)：Pcmv启动子、U6、H1、CD43启动子、CD45(LCA)启动子、CD68启动子、Endoglin(CD105)启动子、Fibronectin启动子、Flt-1(VEGFR-1)启动子、GFAP启动子、GPIIb(IntegrinαIIb)启动子、ICAM-2(CD102)启动子、MB(Myoglobin)启动子、NphsI(Nephrin)启动子、SPB启动子、SV40/hAlb启动子、SYN1启动子、WASP启动子或其组合。
药物组合物及施用方法
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)、微泡(micro vesicle)、外泌体(exosomes)、脱落囊泡(sheddingvesicle)、纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(β-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗EGFR表达量相关疾病的方法，即，将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象，从而治疗EGFR活性相关的疾病。通常，“EGFR表达量相关疾病”指的是患有所述疾病的患者中，肿瘤组织中EGFR的表达量E1与癌旁组织或正常组织中EGFR的量E0相比具有显著性差异，较佳地，所述“高表达”指的是E1≥1.5E0，更佳地E1≥2E0。肿瘤组织中，EGFR是否高表达可以通过常规方法检测。通常，所述的EGFR高表达恶性肿瘤包括(但不限于)肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌，较佳地为肺癌和/或胶质细胞瘤。
本发明有益效果
1.本发明前体EGFR siRNA能够有效的避免在过表达目的序列得同时也过表达目的序列得反向互补序列，从而有效避免了目的序列得反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。
2.本发明前体EGFR siRNA能够在体内有效表达EGFR siRNA序列，并且本发明EGFRsiRNA或前体EGFR siRNA稳定性优异、且特异性好，有效杀伤肿瘤并抑制肿瘤细胞增殖，对多种恶性肿瘤(尤其是肺癌和胶质母细胞瘤)都具有非常有效的治疗作用，从而用于开发新的肿瘤治疗药物。
3.本发明将前体EGFR siRNA与RVG多肽联用(如MLFEGFR+RVG质粒)，从而更有效地治疗恶性肿瘤如胶质母细胞瘤。
4.本发明前体EGFR siRNA与TNC siRNA联用(如MLFEGFR+TNC+RVG质粒)，具有协同作用，能更有效地治疗胶质母细胞瘤。
5.本发明利用肝脏作为生物发生器来产生和包裹小RNA并利用宿主内源性外泌体进入循环系统的优势来递送小RNA。与其他的小RNA递送系统相比，这种策略有几个内在的优势：1)更安全：作为小RNA的载体，外泌体是由宿主肝脏产生并分泌的，因此其无毒性和低免疫原性；2)更便宜：不需要大规模的细胞培养。相反的，肝脏作为产生小RNA的天然生物发生器，此外小RNA经肝细胞包裹形成外泌体，然后通过循环系统运输到其他组织，这种技术避免了与其他递送方法相关的高成本和高技术要求；3)更方便：大量的小RNA可以通过静脉注射RNA表达质粒产生而不需要额外的化合物(例如，阳离子脂质体和聚合物等)或是复杂的操作(例如，电穿孔和超声细胞降解等)；4)更有效：本发明已经实现了在注入质粒的小鼠体内持续表达小RNA并控制其目标基因有效地沉默。在一次注射5mg/kg剂量质粒后的9到12小时内，肝脏和肺中小RNA的水平值大约分别达到2000和1500拷贝/细胞。这些量化的结果揭示出，外源性小RNA诱导产生一系列浓度，这一浓度与内源性功能miRNA的范围相似。
本发明利用宿主肝脏作为生物发生器来产生、包裹和递送小RNA。宿主组织中的小RNA递送系统是一个高效、经济、方便的可在体内诱导RNAi治疗的策略。这项技术可扩大应用到那些现有药物难以靶向作用的基因位点上。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
1.构建EGFR siRNA表达载体
首先改造两种pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，一种是通过DNA限制性内切酶切除了EmGFP和Blasticidin(杀稻瘟菌素)，用于构建人体试验用的表达载体；一种是DNA限制性内切酶仅切除Blasticidin(杀稻瘟菌素)，保留的eGFP的联合表达是为了指示组织对该质粒的吸收和表达，用于构建小鼠试验用的表达载体。
然后在两种载体中分别通过插入EGFR沉默序列(5’-TGTTGCTTCTCTTAATTCCT-3’，SEQ ID NO.:9)或者TNC沉默序列(5’-CACACAAGCCATCTACACATG-3’，SEQ ID NO.:10)来构造MLFEGFR或MLFTNC质粒。构建出联合表达MLF和目标标记(RVG或FLAG)基因的质粒。简单的说，RVG或FLAG标记被融合到Lamp2b外泌体膜蛋白的N末端。然后，在MLF表达质粒中，被融合的Lamp2b标记被克隆到CMV启动子的下游，进而翻译产生一种同时编码了MLF和Lamp2b标记的功能性蛋白。设计该质粒旨在通过表达一个干扰性MLF片段而发挥负调控作用。
根据基因序列设计并合成2对互补oligo DNA，序列见表1。
设计合成的oligo结构如下：
2.细胞培养和小鼠
小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)和人类的胶质母细胞瘤细胞系(U87MG)购买自中国科学院上海细胞生物研究所(中国上海)。这些细胞培养在添加了10％的牛胎血清(FBS，Gibco，澳大利亚)、青霉素和链霉素的高糖(4.5g/L)DMEM培养基于5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。
6-8周大的雄性C57BL/6J小鼠购自南京大学模式动物研究所(中国，南京)并且在南京大学特殊的无菌条件下饲养。所有的动物饲养和处理程序都是按照国家卫生研究院的动物保健指导和实验室使用动物指导进行的，并得到了南京大学的制度委员会(中国，南京)的批准。
3.原位肺癌模型
将1×106的LLC细胞通过尾静脉注射到小鼠体内构建原位肺癌模型。经过14天饲养，采用非侵入性CT扫描检测，确定肺部肿瘤的形成。然后，将荷瘤小鼠随机分为以下4组：其中三组两周内分别静脉注射PBS、MLFSCR质粒(5mg/kg)和MLFEGFR质粒(5mg/kg)7次；另一组在两周用吉非替尼(gefitinib，5mg/kg)灌喂7次。由于吉非替尼无法有效抑制LLC细胞的增长而被作为阴性对照组。在上述四组操作之后，分别监测这些小鼠的生存期和肿瘤增长状况。对于分析生存期一组的小鼠，在不进行任何进一步治疗情况下观察记录其后100天的情况。对于分析肿瘤生长情况一组的小鼠，只对在两周的质粒注射期存活下来的小鼠进行CT检测。在显微CT扫描之后，将这些小鼠处死，通过心脏穿刺方式手机血液样本，分离肺部肿瘤并采用组织病理学染色法和免疫组织化学分析法对肿瘤情况进行分析。
4.颅内胶质母细胞瘤模型
编码了荧光素酶(luciferase)和嘌呤霉素(puromycin)的慢病毒载体pLv-Luc购自GenePharma公司(中国，上海)。pLv-Luc慢病毒被转导进入U87MG亲代细胞系中，形成一种U87MG-Luc(带有生物荧光的U87MG-慢病毒-飘零霉素)细胞系。表达Luc的细胞被挑选富集于1μg/ml G418(小牛血清细胞培养液)中。将1×106的U87MG-Luc细胞在距前囟后0.5mm、侧面2.5mm、脑实质内3.5mm处植入小鼠颅内以构建颅内胶质母细胞瘤模型。肿瘤细胞被植入后7天，采用非侵入性BLI(bioluminescent imaging,生物荧光成像)技术检测小鼠，确定颅内胶质母细胞瘤形成。然后，将这些胶质母细胞瘤荷瘤小鼠随机分成4组，两周内分别静脉注射5mg/kg的MLFSCR+RVG质粒、MLFEGFR质粒、MLFEGFR+RVG质粒(表达MLFEGFR和RVG-Lamp2b基因片段的质粒)和MLFEGFR+TNC+RVG质粒(表达MLFEGFR、MLFTNC和RVG-Lamp2b基因片段的质粒)7次。这些小鼠一部分被跟踪记录用于生存期分析，其余的分别在移植后第14、21天进行BLI扫描以评估肿瘤的增长情况。每只小鼠的这些数据形成都是以其开始治疗之前的生物荧光检测水平为标准。在BLI扫描之后，将这些小鼠处死并收集血液和组织样本，同时采用免疫组织化学分析法对胶质母细胞瘤进行分析。
5.显微CT扫描
显微CT分析被用于评估肺部肿瘤的生长情况，因为显微CT成像可以在不使用任何造影剂的条件下，清晰地区分肺部肿瘤与周边组织，并且重建的3D肺部图像很容易将肿瘤与血管区分开来。简单地说，显微CT扫描使用的是SkyScan 1176micro-CT分析仪，它能以35μM的分辨率和0.800的旋转步距扫描180°的平面区域。该系统是由两个金属陶瓷管组成，配备类一个固定的AL滤镜和两个分辨率为1280×1024的X射线数码相机。在(50kV，500μA)通电情况下形成图像。扫描时，小鼠采用仰卧位。根据制造商(SkyScan)的使用指南，显微CT的数据经过N-Recon程序被批量分类、处理和重建。随后使用DataViewer程序对重建后的数据进行成像，并使用CTan程序计算肿瘤的体积。
6.生物荧光成像
腹膜下注射30mg/kg剂量的水合氯醛(chloral hydrate，美国Sigma公司)麻醉小鼠。移植的肿瘤所发出的生物荧光信号经Perkin IVIS系统(美国，马塞诸塞州，PerkinElmer公司)重新编码处理。为了量化生物荧光，标记出了感兴趣的范围内相同的区域。荧光亮度是使用IVIS活体成像系统软件4.2(Perkin Elmer)确定的。
7.逆转录定量PCR检测
根据制造商使用说明，使用TRIzol试剂盒(加利福尼亚州，卡尔斯巴德市，Invitrogen公司)提取人工培养细胞和小鼠组织中的总RNA。使用的TaqMan miRNA探针(加利福尼亚州，福斯特城，Applied Biosystems公司)检测量化成熟microRNA。简述为，1μg总RNA为模板加入AMV逆转录酶(中国，大连，TaKaRa公司)和一个茎环结构的逆转录引物(Applied Biosystems)逆转录扩增cDNA。反应条件如下：16℃ 30min,42℃ 30min,and 85℃ 5min。实时定量PCR反应采用TaqMan PCR仪和AB公司的7300测序仪(AppliedBiosystems)。扩增反应采用96孔板，条件为95℃10分钟，随后95℃ 15s到60℃ 1min进行40个循环。所有反应设3个平行对照组。在反应完成后，根据设定的荧光值域确定CT值，并根据三次实验结果的出平均CT值。通过对一系列已知浓度的合成MLF寡聚核苷酸进行反转录及扩增来建立标准曲线，从而计算MLF的表达水平。在本次试验中，采用U6snRNA建立标准曲线，从而测定细胞和组织中MLF表达水平的。
8.MLF绝对值的计算
文献显示，每只小鼠的肝脏、肺和肾脏分别有157.3亿、515.6亿和350.6亿个细胞组成。在实时定量PCR实验中，测定了从小鼠的组织样本中分离的1μg总RNA量中MLFEGFR的绝对值。在肝脏、肺和肾脏细胞中，每1μg总RNA中MLF的量分别为0.272fmol、0.083fmol和0.013fmol。通常情况下，从小鼠的肝脏、肺和肾脏组织中可分别分离出2000,1000和1500μg的RNA。进而估算出在这些组织中MLF的最终浓度(每个细胞拷贝数)。用同样的方法可以估算出肺组织和脑组织中MLFEGFR和MLFTNC的拷贝数。
9.eGFP蛋白荧光强度检测
组织样品采用PBS(pH 7.4)冲洗后切碎并使用添加新鲜PMSF的RIPA裂解液，冰浴裂解处理30min，随后进行组织匀浆。匀浆液在12,000×g在4℃条件下离心10min，收集上清液，使用BAC蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。用双蒸水将上清液稀释10倍，使用FluoroMax-2荧光分光光度计在395nm激光下检测样品的荧光值。结果以蛋白质总浓度与为标准值。
10.免疫沉淀技术
免疫沉淀反应是用来验证在生物体内的外泌体表面是否载有RVG标志物的试验。简单地说，FLAG抗原决定基片段被克隆到外泌体膜蛋白Lamp2b片段中而取代了RVG肽。小鼠经静脉分别注射编码MLFSCR和FLAG-Lamp2b基因片段的质粒(MLFSCR+FLAG)、编码MLFEGFR基因片段的质粒(MLFEGFR)或编码MLFEGFR和FLAG-Lamp2b基因片段的质粒(MLFEGFR+FLAG)。经9小时后，分别从小鼠血浆中分离外泌体并作为FLAG和CD63免疫印迹输入样本。其中，CD63是作为外泌体存在的标志物，FLAG和CD63带的联合检测用于证明FLAG成功的表达嵌入外泌体。将结构完整的外泌体与表面连有anti-FLAG或anti-IgG抗体的玻璃珠混合进行免疫沉淀反应，以确定FLAG抗原决定基是否精确定位于外泌体表面。然后使用anti-FLAG抗体进行蛋白质免疫印迹实验。经anti-FLAG-免疫沉淀富集产生的FLAG条带表明了外泌体表面带有FLAG标志物。
11.蛋白质免疫印迹法
将细胞采用PBS(pH 7.4)冲洗，然后使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂(伊利诺伊州，罗克福德市，Thermo Scientific公司)的RIPA裂解液(中国，上海，Beyotime公司)冰浴中裂解处理30min。组织样本经液氮冷冻研磨陈成粉末，并使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液在冰浴中裂解处理30min。必要时，可对经冰浴的组织样本进行超声波破碎处理。细胞裂解液及组织匀浆均在(12000×g在4℃)下离心10min。然后使用BCA蛋白定量试剂盒检测上清液。采用免疫印迹法分析蛋白质水平，使用GAPDH抗体作为蛋白质检测的标准品。EGFR抗体(A2B1)(18986-1-AP)购自Proteintech公司(美国，伊利诺伊州，罗斯蒙特市)。GAPDH抗体(G-9)(sc-365062)购自Santa Cruz Biotechnology公司(美国，加州，圣克鲁斯)。TNC抗体(ab108930)购自Abcam公司(美国，马萨诸塞州，坎布里奇市)。FLAG抗体(MA1-91878)购自Thermo Fisher公司(美国，加州，圣何塞市)。使用ImageJ对蛋白质谱进行分析。
12.外泌体分离
从小鼠身上收集静脉血液样本(约1Ml)至于血浆分离管中。在室温下，经800×g离心10min分离血浆，再经10,000×g离心15min完全去除细胞碎片。血浆上清液被回收，并根据制造商说明，使用Total Exosome Isolation(总外泌体分离提取)试剂盒(美国，Invitrogen公司)分离提取外泌体。
13.统计分析
本发明中所示的所有免疫印迹图像、组织病理学染色和免疫组织化学着色部分均来自至少三组独立试验结果。实时定量PCR试验进行了三组平行试验，每项试验进行了数组重复试验。所有数据采用表示，组件比较采用t检验，当p<0.05认为数据具有显著性。
实施例1向原位肺癌模型静脉中注射表达抑制EGFR基因的MLF质粒能有效的抑制肿瘤
实验结果表明，在生物体内存在一个功能完善的miRNA肝脏传递系统。静脉注射MLF质粒，肝脏产生包裹MLF的外泌体，并将功能性MLF高效运输到其他组织中。
通过向LLC细胞诱导的原位肺癌模型静脉中注射可表达可抑制Lewis肺癌细胞中EGFR基因表达的MLFEGFR质粒来评估其在治疗领域的价值。
具体结果见图1所示。裸鼠经静脉注射LLC细胞，30天后，采用显微C扫描分析确认肺肿瘤形成。将随机分配的4组荷瘤小鼠，分别经静脉注射PBS、MLFSCR质粒(5mg/kg)、MLFEGFR质粒(5mg/kg)或灌喂吉非替尼(作为阴性对照)，每2天一次，共进行7次。在注射质粒和使用吉非替尼后，监测小鼠测定生存期和肿瘤的生长情况(图1A)。在生存期方面，注射PBS、乱序MLF表达质粒(MLFSCR)或吉非替尼治疗的小鼠都有类似的生存结果，大部分小鼠在两周内死亡(中位生存期:PBS、MLFSCR和吉非替尼分别为3天、8天和7天)(图1B)。相比之下，注射MLFEGFR质粒治疗显著提高了荷瘤小鼠的整体存活时间，其中2只小鼠的存活时间超过100天(中位生存期＝151天和32天(图1B)。在肿瘤生长方面，同一小鼠的个体显微CT扫描图像与相应的3D重建的完整胸腔图像形象的展示了在注射MLFEGFR质粒治疗的小鼠中，肺肿瘤负荷减少得多，在一些实验例中，出现了完全衰退的现象(图1C和1D)。对肿瘤体积的定量分析显示，在注射MLFEGFR质粒治疗的小鼠中，大多数肿瘤的大小都缩小到了几乎无法检测的尺寸，而注射PBS、MLFSCR或吉非替尼治疗的小鼠的肿瘤的大小则明显增大(图1E)。对肺部的组织病理学检测显示，在注射PBS、MLFSCR或吉非替尼治疗的小鼠中存在显示出相当大的细胞学异型性的高度细胞性肿瘤，然而，从一些注射MLFEGFR质粒治疗的小鼠体内获得的肺组织却没有显示出肿瘤病变(图1F)。免疫组织化学分析表明，在注射MLFEGFR质粒治疗的小的肺部肿瘤中EGFR的表达水平明显较低(图1G和3H)。值得注意的是，增殖细胞核阳性抗原(PCNA)的较低百分比表明，注射MLFEGFR质粒治疗小鼠的肺部肿瘤具有显著较低的肿瘤细胞增殖率(图1G和1H)。最后，注射MLFEGFR质粒治疗小鼠的肝脏、肺和血浆中MLFEGFR的水平显著更高(图1I)。结果是，在这些小鼠的肺部肿瘤中EGFR蛋白水平显著降低，不仅回到了正常的水平，而且甚至比正常的水平略低(图1J和1K)。
实施例2通过静脉注射MLFEGFR+RVG质粒，使MLFEGFR靶向作用于脑组织
由于血脑屏障的存在，阻止了包括分子靶向药物在内的98％的药物进入大脑。考虑到EGFR在神经胶质瘤形成中也起着关键的作用，构建了一个质粒，同时表达MLFEGFR片段和Lamp2b蛋白(一种在外泌体中被广泛表达的膜蛋白)并融合了一种狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽与神经细胞表达的乙酰胆碱受体相结合)(图2A)。在肝脏吸收并加工MLFEGFR+RVG质粒后，设计表达在外泌体膜上的RVG标签能够指导外泌体穿过BBB屏障并使其递送的MLFEGFR进入神经细胞。
经MLFEGFR质粒或MLFEGFR+RVG质粒转染的HEK293T细胞内分离的外泌体中，MLFEGFR的水平显著提高(图2B)。
小鼠分别静脉注射表达MLFSCR和FLAG-Lamp2b基因片段的质粒(MLFSCR+FLAG)、表达MLFEGFR基因片段的质粒或表达MLFEGFR和FLAG-Lamp2b基因片段的质粒(MLFEGFR+FLAG)，随后从这些小鼠血浆中分离外泌体并作为FLAG和CD63免疫印迹检测的输入样本。结果如图2C所示，基于anti-FLAG抗体和anti-CD63抗体免疫印迹检测结果(中间和下方条带)显示FLAG已载入外泌体。将结构完整的外泌体与表面连有anti-FLAG或anti-IgG抗体的玻璃珠进行免疫沉淀反应，确定FLAG抗原决定基是否已定位于外泌体表面。基于免疫印迹反应所示的FLAG-外泌体被anti-FLAG-玻璃珠有效吸附这一强有力的结果(最上面条带)，说明FLAG已准确的定为于外泌体表面。因此，免疫沉淀反应实验确定了设计的标签精确的定位与外泌体的表面而不是在外泌体内或是插入到细胞内Lamp2b蛋白区域。
在体内研究显示，注射MLFEGFR+RVG质粒小鼠的大脑中MLFEGFR得到有效的积累，然而注射MLFSCR+RVG质粒或MLFEGFR质粒小鼠的大脑内则没有检测到MLFEGFR(图2D)。同样地，存在于小鼠血浆中的MLFEGFR主要是外泌体内包裹的(图2E)。
这些结果表明，肝脏能有效包裹形成RVG标记的外泌体，并且这些外泌体能有效地递送MLF片段穿过血脑屏障进入脑组织。
实施例3静脉注射MLFEGFR+RVG质粒将MLFEGFR靶向递送到大脑并阻止胶质母细胞瘤的增长
为了评估其在体内治疗的潜力，通过颅内植入生物发光性的U87MG细胞建立了一个胶质母细胞瘤小鼠模型。将建模成功小鼠随机分为4组，两星期内分别静脉注射5mg/kg剂量的MLFSCR+RVG质粒、MLFEGFR质粒、MLFEGFR+RVG质粒和MLFEGFR+TNC+RVG质粒，共计7次。在静脉注射后的第14和21天，进行生存分析并且用生物荧光成像扫描评估肿瘤的生长情况(图3A)。注射MLFSCR+RVG质粒的小鼠(中位生存期＝24天)的总体存活时间要显著长于注射MLFSCR +RVG质粒(中位生存期＝14天)或MLFEGFR质粒(中位生存期＝14天)的小鼠(图3B)。当TNC被筛选作为联合靶点时，其综合治疗的效果甚至会更好。正如图3C所示，在静脉注射了同时含有MLFEGFR基因和MLFTNC基因又融合了RVG-Lamp2b功能蛋白的质粒后，小鼠的存活时间显著延长(中位生存期＝34天)。在注射MLFSCR+RVG质粒或MLFEGFR质粒治疗的小鼠大脑内观察到了广泛的肿瘤负荷和肿瘤的加速生长，然而在注射MLFEGFR+RVG质粒和MLFEGFR+TNC+RVG质粒治疗的小鼠体内肿瘤的大小显著减小(图3C和3D)。免疫组织化学染色显示出，在注射MLFEGFR+RVG质粒或MLFEGFR+TNC+RVG质粒治疗小鼠的胶质母细胞瘤中，EGFR和PCNA的表达水平显著低于那些注射MLFSCR+RVG质粒或MLFEGFR质粒治疗的小鼠，并且注射MLFEGFR+TNC+RVG质粒治疗的小鼠的胶质母细胞瘤中TNC的水平较低(图3E和3F)。在注射MLFEGFR+RVG质粒和MLFEGFR+TNC+RVG质粒治疗的情况下，MLFEGFR的水平显著增高而EGFR蛋白水平则相对较低(图3G、3H和3I)。同样地，注射MLFEGFR +TNC+RVG质粒治疗后胶质母细胞瘤中，MLFEGFR水平增加，TNC蛋白水平下降(图3G、3H和3I)。
实施例4EGFR siRNA的临床应用
首先改造pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒，通过DNA限制性内切酶切除了EmGFP和Blasticidin(杀稻瘟菌素)，然后构建EGFR siRNA表达载体MLFEGFR。MLFEGFR用于非小细胞肺癌患者(NSCLC)的临床实验经过了南京大学伦理委员会批准。
供试患者情况：67岁的中国男性患者，2015年7月被诊断为非小细胞肺癌(IV期腺癌)；2015年7月至2016年7月，患者接受了一线和二线化疗，但是没能够控制肿瘤进展，并产生了严重的副作用(4级骨髓抑制)。2016年8月至2017年6月，患者静脉注射MLFEGFR10个月，每周3次，在治疗过程中，检测肿瘤生物标志物水平。
具体结果见表2。
表2注射MLFEGFR后肿瘤标记物的表达水平
从表2可以看出，肿瘤标志物CEA(癌胚抗原)从100纳克/毫升急剧下降到正常水平(＜10纳克/毫升)。同时，CYFRA21-1和NSE水平也明显降低，处于到正常水平内。患者在治疗过程中没有出现不良反应，并且病情稳定，没有复发或加剧病情的状况。因此，本发明的EGFR siRNA能有效治疗肿瘤。
实施例5
构建EGFR siRNA过表达载体(MLFEGFR0质粒)，采用的序列EGFR siRNA成熟体正义链序列：5’-AGGAAUUAAGAGAAGCAACAU-3’(SEQ ID NO.:11)，除相应EGFR沉默序列不同，MLFEGFR0质粒其他部分均与MLFEGFR质粒相同。然后向原位肺癌模型静脉中注射MLFEGFR0质粒，具体操作如实施例1所述。定量检测小鼠肝脏、肺和血浆中MLFEGFR0的绝对表达水平，并对EGFR蛋白水平的定量分析。*p<0.05；**p<0.01。
结果发现，注射MLFEGFR0质粒治疗小鼠(n＝3)的肝脏、肺和血浆中，表达的MLFEGFR0水平与未注射的小鼠(normal组,n＝1)相比有增高，但是增高幅度比注射MLFEGFR质粒的小鼠(n＝3)所获得的MLFEGFR增高幅度小(平均仅为约40％)。
另外，在这些注射MLFEGFR0质粒进行治疗小鼠的肺部肿瘤中EGFR蛋白水平虽然有所降低，但是仍远高于正常水平(normal组)(未示出)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏命码生物科技有限公司
<120> 抑制EGFR表达的siRNA及其前体和应用
<130> P2018-0433
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uguugcuucu cuuaauuccu 20
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
guuuuggcca cugacugac 19
<210> 3
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gucagucagu ggccaaa 17
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacacaagcc aucuacacau g 21
<210> 5
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggaggcttg ctgaaggctg tatgctgtgt tgcttctctt aattcctgtt ttggccactg 60
actgacagga attaagaagc aacacaggac acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa 120
caaatggccc 130
<210> 6
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggccatttg ttccatgtga gtgctagtaa caggccttgt gtcctgtgtt gcttcttaat 60
tcctgtcagt cagtggccaa aacaggaatt aagagaagca acacagcata cagccttcag 120
caagcctcca 130
<210> 7
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggaggcttg ctgaaggctg tatgctgaaa tgtactgcgc gtggagacgt tttggccact 60
gactgacgtc tccacgcagt acatttcagg acacaaggcc tgttactagc actcacatgg 120
aacaaatggc cc 132
<210> 8
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggccatttg ttccatgtga gtgctagtaa caggccttgt gtcctgaaat gtactgcgtg 60
gagacgtcag tcagtggcca aaacgtctcc acgcgcagta catttcagca tacagccttc 120
agcaagcctc ca 132
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgttgcttct cttaattcct 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacacaagcc atctacacat g 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggaauuaag agaagcaaca u 21
<210> 12
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uggaggcuug cugaaggcug uaugcug 27
<210> 13
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggacacaa ggccuguuac uagcacucac auggaacaaa uggccc 46
<210> 14
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggaauuaag aagcaaca 18
<210> 15
<211> 130
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
uggaggcuug cugaaggcug uaugcugugu ugcuucucuu aauuccuguu uuggccacug 60
acugacagga auuaagaagc aacacaggac acaaggccug uuacuagcac ucacauggaa 120
caaauggccc 130

Claims (10)

1.一种前体序列，其特征在于，其5’至3’端具有式I所示的结构：
B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括EGFRsiRNA正义链序列，所述EGFR siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；
C为茎环结构序列；
A1和A2分别为无，或任选的由碱基组成的RNA序列；
其中，所述的前体序列能在宿主中加工形成EGFR siRNA。
2.如权利要求1所述的前体序列，其特征在于，所述的基本互补指所述B2与B1有2-8个碱基不互补，较佳地，所述B2与B1有3-5个碱基不互补。
3.如权利要求1所述的前体序列，其特征在于，所述的A1为SEQ ID NO.:12(UGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCUG)所示的序列；和/或所述的A2为SEQ ID NO.:13(CAGGACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCCC)。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被宿主转录形成权利要求1中所述的前体序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的前体序列或权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有：
(a)用于表达抑制EGFR基因表达的siRNA的表达载体；以及
(b)药学上可接受的载体；
其中，所述表达载体含有达权利要求1所述的前体序列或权利要求4所述的多核苷酸，或表达权利要求1所述的前体序列。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有(a)权利要求1所述的前体序列、或权利要求5所述的表达载体，和(b)药学上可接受的载体。
8.一种抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
9.如权利要求1所述前体序列、权利要求5所述表达载体、或权利要求8所述siRNA的用途，其特征在于，(i)用于制备EGFR的抑制剂；和/或(ii)用于制备抗EGFR高表达恶性肿瘤的药物组合物；
较佳地，所述的恶性肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、口腔上皮癌、头颈癌、脑瘤或胶质细胞瘤。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述恶性肿瘤为肺癌和/或胶质母细胞瘤。
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