CN112972702A - 用于治疗耐药菌感染的外泌体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗耐药菌感染的外泌体制剂，具体地，本发明提供一种负载抑制剂的外泌体，所述外泌体包括抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质，本发明还提供了一种外泌体制剂，本发明的外泌体可显著提高耐药菌对抗生素的敏感性，本发明的外泌体制剂可显著治疗耐药菌的感染。

Description

用于治疗耐药菌感染的外泌体制剂
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种用于治疗耐药菌感染的外泌体制剂。
背景技术
小RNA是一类长约20-30个核苷酸的小分子RNA，它们不编码蛋白质，但却参与机体的各种重要的生理和病理过程。它们能够与其互补的基因序列结合，使mRNA降解或抑制mRNA翻译，从而导致特定基因的沉默。内源小RNA主要分为3类：微小RNA(microRNA，miRNA)，小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)和与piwi相互作用的RNA(piRNA)。研究证实，由小RNA引发的基因沉默现象不仅可以作为一种防御机制来沉默外来物种的基因，比如病毒和转座子，而且在控制和微调基因表达、参与众多的细胞过程中发挥着重要作用。
近年的研究进展表明，来自不同物种的小RNA进入人体后，均可通过相似机制对人体细胞的基因表达进行调控，展现了小RNA在物种间跨界调控的重要角色。更重要地，在人体对抗外来物种(寄生虫，病毒等)侵扰时，内源性(人体自身产生)或外源性(食物或药物来源)的小RNA常常扮演重要的防御作用。例如，针对通过血液传播的原生动物疟原虫P.falciparum，人体内镰刀型红细胞中富集存在的miR-451，以高浓度被转运进疟原虫，并靶向其cAMP依赖性蛋白激酶PKA-R，抑制蛋白翻译，使得疟原虫生长受抑制，缓解疟疾症状。再如，金银花来源的miRNA-2911能够直接靶向甲型流感病毒，可预防小鼠感染，并降低感染H5N1病毒后的死亡率。
尽管围绕小RNA在不同物种中的生物学功能及医学应用已经进行了大量的研究，小RNA对细菌的基因表达调控仍属于起步阶段，知之甚少。而该领域对人类健康及医治由细菌感染引发的疾病，具有非常重要的意义。一方面，在人体内共生的细菌，尤其是肠道菌群，与人体健康密切相关；而人类肠道环境中含有大量miRNA，极有可能对肠道菌群的平衡及代谢状态具有重要调控作用。另一方面，在抗生素大量使用(甚至滥用)的背景下，由耐药性细菌引发的感染疾病正日益成为棘手的公众健康问题，缺少有效的应对手段。
因此本领域迫切需要开发一种治疗耐药菌感染的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗耐药菌感染的新方法。
本发明第一方面提供了一种负载抑制剂的外泌体，所述外泌体包括抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质。
在另一优选例中，所述耐药基因来源于选自下组的菌的耐药基因：葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
在另一优选例中，所述来源于葡萄球菌的耐药基因选自下组：mecA、kpc、imp、vim、ndm、或其组合。
在另一优选例中，所述来源于大肠杆菌的耐药基因选自下组：AcrA、AcrB、TolC、pbp2、pbp3、ampC、或其组合。
在另一优选例中，所述来源于铜绿假单胞菌的耐药基因选自下组：vim、OprN、ampC、imp、或其组合。
在另一优选例中，所述抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质选自下组：siRNA、miRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述siRNA的长度(bp)为15－33，较佳地，19－22。
在另一优选例中，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.:1所示。
本发明第二方面提供了一种制剂，包括：
(a)本发明第一方面所述的外泌体；
(b)抗生素；和
(c)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述抗生素选自下组：甲氧西林、碳青霉烯类抗生素、或其组合。
在另一优选例中，所述碳青霉烯类抗生素选自下组：亚胺培南、美罗培南、厄他培南、或其组合。
在另一优选例中，所述制剂还包括其他治疗耐药菌感染的药物。
在另一优选例中，所述耐药菌选自下组：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
在另一优选例中，所述制剂中，所述外泌体的含量为30－800μg，较佳地，50－600μg，更佳地，80-500μg，更佳地，100-300μg，按所述制剂的总重量计。
在另一优选例中，所述制剂中，所述抗生素的含量为10－300μM，较佳地，25－200μM，更佳地，30-100μM，更佳地，40－60μM，按所述制剂的总浓度计。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂、和/或冻干粉制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：磷酸盐缓冲液、生理盐水、或其组合。
本发明第三方面提供了一种药盒，包括：
(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的本发明第一方面所述的外泌体，或含有本发明第一方面所述的外泌体的药物；
(b1)任选的第二容器，以及位于所述第二容器中的抗生素，或含有抗生素的药物。
在另一优选例中，所述药盒还包括：
(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗耐药菌感染的药物，或含有其他预防和/或治疗耐药菌感染的药物的药物。
在另一优选例中，所述抗生素选自下组：甲氧西林、碳青霉烯类抗生素、或其组合。
在另一优选例中，所述碳青霉烯类抗生素选自下组：亚胺培南、美罗培南、厄他培南、或其组合。
在另一优选例中，所述耐药菌选自下组：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器、第三容器、是相同或不同的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含权利要求1所述的外泌体的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含抗生素的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含其他预防和/或治疗耐药菌感染的药物的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。
在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：
(a)将本发明第一方面所述的外泌体用于提高耐药菌(比如MRSA)对抗生素(比如methici llin)敏感性的方法；
(b)将本发明第一方面所述的外泌体与抗生素、和/或任选的其他预防和/或治疗耐药菌感染的药物联用来治疗耐药菌感染的方法。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的制剂、或本发明第三方面所述的药盒的用途，用于制备治疗耐药菌感染的药物。
在另一优选例中，所述药物还用于选自下组的一种或多种用途：
(a)提高耐药菌对抗生素的敏感性；
(b)在转录后水平调节细菌基因表达。
在另一优选例中，所述耐药菌选自下组：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
本发明第五方面提供了一种治疗耐药菌感染的方法，包括：
给需要的对象施用本发明第二方面所述的制剂、或本发明第三方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述对象包括受耐药菌感染的人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述外泌体的施用剂量0.1-40－mg/kg体重，较佳地为1-20mg/kg体重，更佳地，2-10mg/kg体重。
在另一优选例中，所述抗生素的施用剂量为0.1－50mg/kg体重，较佳地为1－20mg/kg体重，更佳地为2-6mg/kg体重。
在另一优选例中，所述外泌体的施用频率为1-10次/周，更佳地，3－9次/周，更佳地为5-8次/周。
在另一优选例中，所述抗生素的施用频率为1-10次/周，更佳地，3－9次/周，更佳地为5-8次/周。
在另一优选例中，所述外泌体的施用时间为2-20天，较佳地为3-15天，更佳地，5-8天。
在另一优选例中，所述抗生素的施用时间为2-20天，较佳地为3-15天，更佳地，5-8天。
在另一优选例中，所述外泌体与抗生素同时或先后施用。
本发明第六方面提供了一种体外非治疗性的提高耐药菌对抗生素敏感性的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的外泌体的存在下，培养耐药菌菌株，从而提高耐药菌菌株对抗生素的敏感性。
在另一优选例中，通过将外泌体中的抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质(比如siRNA、miRNA)导入耐药菌菌株，调控耐药菌菌株中的耐药基因表达和/或活性，从而提高耐药菌对抗生素敏感性的方法。
在另一优选例中，所述外泌体的作用浓度为30－800μg/ml，较佳地，50－600μg/ml，更佳地，80-500μg/ml，更佳地，100-300μg/ml。
在另一优选例中，所述耐药菌选自下组：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示和游离状态的siRNA相比，exosome能够高效将其包裹的siRNA(si-ada)运输进E.coli，并且呈现剂量效应。
图2显示exosome包裹的siRNA(si-ada)进入E.coli后对靶蛋白Ada表达抑制的剂量依赖效应。
图3显示利用exosome包裹运输导入methicill in-resistant S.aureus(MRSA)的siRNA(si-mecA)量。
图4显示利用exosome包裹运输导入MRSA的siRNA(si-mecA)对靶蛋白PBP2a表达的抑制效果。
图5显示利用exosome包裹运输导入MRSA的si-mecA能显著提高抗生素methicillin对MRSA的抑制效果。
图6是示意图“通过人体细胞分泌出的含有小RNA的外泌体囊泡将小RNA传递入细菌内，并通过抑制耐药基因的表达降低细菌耐药性”。
图7显示尾静脉注射siRNA表达载体，联合抗生素甲氧西林，显著改善耐药菌MRSA感染小鼠的生存率。
图8显示了利用exosome包裹运输导入铜绿假单胞菌P.aeruginosa的siRNA(siMecA)量。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，负载有抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质的外泌体可显著提高耐药菌对抗生素的敏感性，并且将上述外泌体与抗生素联用，还可治疗耐药菌的感染。
具体地，本发明通过设计合成针对耐药菌，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicill in-resistant S.aureus,MRSA)耐药基因mecA的siRNA，利用外泌体(exosome)的包裹及运输功能，将siRNA导入耐药菌细胞内，通过降低其耐药性基因的表达及耐药相关蛋白的生产，解除其耐药性，使其重新对常规的抗生素治疗敏感。此外，本发明人还意外的发现，将包裹有针对耐药菌的耐药基因的siRNA的外泌体与抗生素联用，可显著治疗耐药菌的感染。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”、“所需对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类，如牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、骆驼、大鼠、小鼠、野兔和家兔。
耐药基因
在本发明中，耐药基因指细菌中编码与抗生素耐药相关蛋白的基因。
在另一优选例中，所述耐药基因来源于选自下组的菌：葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
在另一优选例中，所述来源于葡萄球菌的耐药基因选自下组：mecA、kpc、imp、vim、ndm、或其组合。
在另一优选例中，所述来源于大肠杆菌的耐药基因选自下组：AcrA、AcrB、TolC、pbp2、pbp3、ampC、或其组合。
在另一优选例中，所述来源于铜绿假单胞菌的耐药基因选自下组：vim、OprN、ampC、imp、或其组合。
在一优选实施方式中，所述耐药菌包括，但并不限于，葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌。
mecA蛋白和多核苷酸
在本发明中，术语“本发明蛋白”、“蛋白”、“mecA多肽”可互换使用，都指具有mecA氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的mecA蛋白。此外，该术语还包括全长的mecA及其片段。本发明所指的mecA蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
mecA基因整合在称为葡萄球菌染色体盒(SCC)mec的染色体遗传元件中，编码蛋白为PBP2a，全称“青霉素结合蛋白2a”，668个氨基酸。mecA基因在葡萄球菌属中分布广泛。目前葡萄球菌属以外的细菌中尚未检出mecA基因。
在本发明中，术语“mecA基因”、“mecA多核苷酸”可互换使用，都指具有mecA核苷酸序列的核酸序列。PBP2a是mecA基因的编码蛋白。
在本发明中，mecA基因的基因组全长为2007bp(登录号为Gene ID:5776902)。在得到了mecA的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的mecA核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的mecA多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码mecA多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，mecA多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含mecA编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
外泌体
如本文所用，外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞(免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。
在本发明中，外泌体包括抑制耐药基因(比如来源于葡萄球菌的耐药基因(如mecA、kpc,imp,vim,ndm)；来源于大肠杆菌的耐药基因(如AcrA,AcrB,TolC，pbp2,pbp3，ampC；来源于铜绿假单胞菌的耐药基因(如vim,OprN，ampC,imp等)的表达和/或其蛋白活性的物质(比如siRNA、miRNA等)。
外泌体制剂
本发明的胞外泌体制剂，含有安全有效量的外泌体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
在一优选实施方式中，本发明的制剂还可含有安全有效量的其他预防和/或治疗耐药菌感染的药物。
本发明的药物组合物可以被制成液态制剂，其制备可通过常规方法进行,液态制剂应在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约50毫克/千克体重，约5微克/千克体重-约10毫克/千克体重，约10微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明制剂还可与其他治疗剂一起使用。
使用本发明的制剂时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
抑制基因表达的物质
如本文所用，术语“抑制基因表达的物质”是指，只要是抑制靶基因的mRNA转录的物质、分解已转录的mRNA的物质、或抑制由mRNA翻译成蛋白质的物质即可没有特别限定。作为所述的物质，可举出核酸，可示例：siRNA、miRNA等。其中，优选siRNA。作为“抑制基因表达的物质”，除上述之外，还包含蛋白质或肽、或者其他的小分子。需说明的是，在本发明中，靶基因是耐药基因，如mecA基因、kpc、imp、vim、ndm、AcrA、AcrB、TolC、pbp2、pbp3、ampC、OprN、imp等。
在本发明中，“siRNA”是指，具有由约15～40碱基组成的双链RNA部分的RNA分子，切割与上述siRNA的反义链具有互补序列的靶基因的mRNA，并具有抑制靶基因表达的功能。详细而言，本发明中的siRNA是包含由有义RNA链和反义RNA链组成的双链RNA部分的RNA，所述有义RNA链由与耐药基因，如mecA、kpc,imp,vim,ndm；AcrA,AcrB,TolC；pbp2,pbp3；ampC、OprN，imp的mRNA中的连续的RNA序列相同的序列组成，所述反义RNA链由与该有义RNA序列互补的序列组成。所述siRNA和后述的变异体siRNA的设计和制造在本领域技术人员的技能范围内。
在本发明中，“miRNA”是指，具有由约21～25碱基组成的双链RNA部分的RNA分子，通过与靶基因的mRNA结合而具有抑制靶基因表达的功能。详细而言，本发明中的miRNA是包含由有义RNA链和反义RNA链组成的双链RNA部分的RNA，所述有义RNA链由与本发明的耐药基因，如mecA基因、kpc,imp,vim,ndm；AcrA,AcrB,TolC；pbp2,pbp3；ampC、OprN，imp的mRNA中的连续的RNA序列相同的序列组成，所述反义RNA链由与该有义RNA序列互补的序列组成。所述miRNA和后述的变异体siRNA的设计和制造在本领域技术人员的技能范围内。
关于siRNA的双链RNA部分的长度，作为碱基，优选为约15～40碱基，更优选为15～30碱基，进一步优选为15～25碱基，进一步优选为18～23碱基，更进一步优选是19～21碱基。另外，关于miRNA的双链RNA部分的长度，作为碱基，优选为约21～25碱基，更优选为22～24碱基。作为siRNA和miRNA的有义链或反义链的末端结构，没有特别限定，可以根据目的适当选择，例如可以具有平滑末端，也可以具有突出末端(overhang，突出端)，优选3'末端突出的类型。在有义RNA链和反义RNA链的3'末端具有由多个碱基、优选1～3个碱基、更优选2个碱基组成的突出端的siRNA和miRNA，大多情形抑制靶基因表达的效果较大，是优选者。突出端的碱基的种类没有特别限定，可以是构成RNA的碱基或构成DNA的碱基。
而且，在上述siRNA和miRNA的有义链或反义链的一方或两方中有1～数个为止的核苷酸被缺失、取代、插入和/或添加的siRNA和miRNA，也可以用于本发明的外泌体。在此，1～数个碱基是指，没有特别限定但优选为1～4碱基、更优选为1～3碱基、进一步优选为1～2碱基。作为所述变异的具体例，可举出：3'末端的突出端部分的碱基数为0～3个，将3'末端的突出端部分的碱基序列变更成其他的碱基序列、或通过碱基的插入、添加或缺失上述有义RNA链和反义RNA链的长度为1～3碱基不同，有义链和/或反义链中碱基被另外的碱基取代等，但不限于这些。然而，在这些的变异体siRNA和miRNA中有义链和反义链可以杂交、以及这些的变异体siRNA和miRNA与不具有变异的siRNA和miRNA具有同等的基因表达抑制能是必要的。
而且，该siRNA和miRNA可以是一方的端封闭的结构的分子、例如具有发夹结构的siRNA和miRNA(Short hairpin RNA；shRNA)。shRNA是包含靶基因的特定序列的有义链RNA、由与该有义链RNA互补的序列组成的反义链RNA和连接其两链的接头序列的RNA，并且有义链部分和反义链部分进行杂交，形成双链RNA部分。
希望siRNA和miRNA在临床应用时不显示所谓的脱靶(off-target)效应。脱靶效应是指，除了靶基因以外，抑制与使用的siRNA和miRNA具有部分同源的其他基因表达的作用。为了避免脱靶效应，对于候选siRNA和miRNA，可以预先利用DNA微阵列等确认不存在交叉反应。另外，使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)等提供的已知数据库，除了成为靶的基因之外，还确认是否存在包含与候选siRNA和miRNA序列同源性高的部分的基因，由此可以避免脱靶效应。
为了制作本发明的siRNA和miRNA，可以适当使用：化学合成的方法和使用基因重组技术的方法等已知的方法。在合成的方法中，可以根据序列信息、通过常规方法合成双链RNA。另外，在使用基因重组技术的方法中，构建插入了有义链序列或反义链序列的表达载体，将该载体导入到体外培养的哺乳动物细胞后，分别获取通过转录而生成的有义链RNA或反义链RNA，由此也可以制作。另外，使包含靶基因的特定序列的有义链RNA、由与该有义链RNA互补的序列组成的反义链RNA和连接其两链的接头序列，且形成发夹结构的shRNA表达，由此也可以制作所需的双链RNA。
siRNA和miRNA只要具有靶基因的表达抑制活性，则构成siRNA和miRNA的核酸的一部分也可以是DNA。另外，siRNA和miRNA只要具有靶基因的表达抑制活性，则构成siRNA和miRNA的核酸全部或其一部分也可以是经修饰的核酸。
在本发明中，经修饰的核酸是指，对核苷(碱基位点，糖位点)和/或核苷间键位点实施修饰、与天然的核酸具有不同的结构。作为构成经修饰的核酸的“经修饰的核苷”，例如可举出：脱碱基(abasic无碱基)核苷；阿糖核苷、2'-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷、具有其他的糖修饰的核苷；肽核酸(PNA)、键合有磷酸基的肽核酸(PHONA)、锁定核酸(LNA)、吗啉代核酸等。具有上述糖修饰的核苷中，包含：2'-O-甲基核糖、2'-脱氧-2'-氟核糖、3'-O-甲基核糖等的取代戊糖；1',2'-脱氧核糖；阿拉伯糖；取代阿拉伯糖；己糖和具有α-端基的糖修饰的核苷。这些的核苷也可以是碱基位点被修饰的修饰碱基。这样的修饰碱基中，例如可举出：5-羟基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫尿嘧啶等的嘧啶；6-甲基腺嘌呤、6-硫代鸟嘌呤等的嘌呤；和其他的杂环碱基等。作为构成经修饰的核酸的“经修饰的核苷间键”，例如可举出：烷基接头、甘油接头、氨基接头、聚(乙二醇)键、甲基膦酸酯核苷间键、甲基硫代膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前体药物、砜、氨磺酰、氨基磺酸酯、甲缩醛、N-甲基羟胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、吗啉代、硼代膦酸酯、氨基磷酸酯等的非天然核苷间键。
用途
本发明所制备的外泌体，可有效提高耐药菌对抗生素的敏感性，并且本发明制备的外泌体制剂，可有效治疗耐药菌的感染。
在一优选实施方式中，本发明用途可通过如下技术方案实现：
1、一种利用外泌体将小RNA导入细菌并调控基因表达的方法，该方法包括：获取包裹siRNA的外泌体，外泌体和细菌(E.coli、S.aureus)共培养，检测外泌体和细菌内siRNA的含量。
2、一种靶向MRSA耐药基因mecA mRNA的siRNA序列。
3、一种利用外泌体的包裹及运输功能，将小RNA导入耐药菌细胞内，通过降低其耐药相关蛋白的生产，提高其对抗生素治疗敏感性的方法。
4、一种体内治疗耐药菌感染的方法。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，负载有抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质的外泌体可显著提高耐药菌对抗生素的敏感性，并且将上述外泌体与抗生素联用，还可治疗耐药菌的感染。
(2)本发明首次发现，通过设计合成针对耐药菌，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)耐药基因mecA mRNA的siRNA，利用外泌体(exosome)的包裹及运输功能，将siRNA导入耐药菌细胞内，通过降低其耐药性基因的表达及耐药相关蛋白的生产，解除其耐药性，使其重新对常规的抗生素治疗敏感。
(3)本发明首次发现，将包裹有针对耐药菌的耐药基因的siRNA的外泌体与抗生素联用，可显著治疗耐药菌的感染。
(4)在本发明中，利用外泌体将小RNA导入细菌并调控基因表达的方法，以大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)为例，首次报道了外泌体介导的小RNA对细菌基因的跨界调控方式，内容创新，探索异源小RNA对细菌胞内基因表达水平的调控策略及机制，具有重要的生物学意义。
(5)本发明进一步拓展了外泌体作为体内运输载体的应用范围，它不仅可以在哺乳动物组织之间传递小RNA分子信号，还能介导哺乳动物与细菌在小RNA层面上的跨界交流。本发明提出利用外泌体的包裹及运输功能，将小RNA导入耐药菌细胞内，通过降低其耐药性基因的表达及耐药相关蛋白的生产，解除其耐药性，使其重新对常规的抗生素治疗敏感。此策略将推广到一系列与细菌重要生命活动，毒力因子和抗免疫因子产生相关的基因调控上，从而开发新的抗击细菌感染的治疗策略。并且，通过静脉注射siRNA表达载体，在体内表达靶向耐药基因的siRNA，和抗生素联用，治疗耐药菌感染，提高生存率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明说明书中所用的试剂和材料均为市售产品。
实施例1获取外泌体
利用lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将siRNA转染进体外培养的哺乳动物细胞例如293T细胞，然后使用低血清培液培养细胞24-48小时，收集培液，使用exosomeisolation kit(from cel l culture)(Invitrogen)提取293T细胞分泌的外泌体，具体操作如下：培液先经过300g x 5min，3000g x 25min预离心去除细胞碎片，取上清，然后向其中加入一半体积的exosome isolation kit，颠倒混匀后4℃放置过夜；第二天经10000g x1h，4℃离心后，弃上清，沉淀以PBS重悬。该方法获得包裹有siRNA的外泌体(siRNA-exosome)。使用BCA蛋白定量法得到外泌体的浓度(μg/μl)。
其中siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.:1所示：
si-mecA sense GCAAUCGCUAAAGAACUAATT。
siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.:2所示：
si-mecA antisense UUAGUUCUUUAGCGAUUGCTT。
实施例2外泌体和细菌共培养
(1)外泌体和细菌共培养：取过夜培养的菌液，按1％的标准接种于LB培养基中。向菌液中加入外泌体使其终浓度为200μg/ml，混合均匀，在37℃，220rpm的条件下培养若干小时后，收取菌液。
(2)洗涤处理菌体：将菌液以3000rpm离心5min后获得菌体沉淀，经PBS洗涤后，加入含0.1％Triton X-100的PBS重悬，室温放置5min后，加入RNase A(终浓度100μg/ml)，37℃温育30min。该步骤是为了去除细菌外的exosome对后续检测的干扰。之后，细菌经3000rpm离心5min后弃上清，沉淀用PBS洗涤，并分成两等份，一份加入Trizol试剂，用于抽提RNA；另一份加入2x SDS loading buffer，95℃，加热10min，用于western blot样品。
(3)检测进入E.coli的siRNA：将从(2)抽提的RNA逆转录为cDNA，用实时荧光定量PCR方法(探针法)对blank组、ctrl exosome组和siRNA-exosome组进行检测，得出siRNA进入E.coli的量。该结果显示出外泌体作为运输载体能使siRNA高效进入E.coli。(图1)
(4)检测E.coli中的蛋白表达：将从(2)得到的蛋白样品用于western blot，检测靶蛋白Ada和内参DnaK蛋白的表达水平，得出利用外泌体运送进E.coli的siRNA对靶蛋白表达的调控效率。结果显示外泌体导入E.coli的siRNA可有效调控靶蛋白表达，并且该调控具有剂量依赖效应。(图2)
(5)检测进入S.aureus的siRNA：检测方法同(3)。该结果显示外泌体可以将小RNA导入S.aureus。(图3)
(6)检测S.aureus中的蛋白表达：检测方法同(4)，靶蛋白是PBP2a。结果显示利用外泌体导入S.aureus的siRNA可有效调控靶蛋白表达。(图4)
(7)检测MRSA对甲氧西林抗生素的敏感性：取过夜培养的菌液，在LB培养基中按1％的标准接种于96孔细胞培养板。实验分为三组：Mock组不加exosome，ctrl exo组加入ctrl exosome，siRNA exo组加入siRNA-exosome(终浓度为200μg/ml)。并分别加入不同浓度的抗生素methicill in，使得终浓度为0、10、25、50μM。在37℃，220rpm的条件下培养6h后测定菌液的光密度值(OD600)。结果显示siRNA-exosome可以显著提高MRSA对methicil lin的敏感性，在抗生素浓度为10、25、50μM时尤为明显。(图5)
(8)检测进入铜绿假单胞菌P.aeruginosa的siRNA：检测方法同(3)。该结果显示外泌体可以将小RNA导入P.aeruginosa。(图8)
实施例3体内治疗耐药菌感染
通过眼眶静脉注射5×107CFU MRSA细菌的方法来感染BALB/c小鼠，建立菌血症模型。感染小鼠通过腹膜注射接受3mg/kg抗生素甲氧西林的治疗剂量，并通过尾静脉注射接受5mg/kg包含siRNA的外泌体，注射间隔为24小时，治疗7天。甲氧西林和包含siRNA的外泌体联合用药，有效保护了小鼠免于致死剂量的MRSA细菌感染(图7)。联合用药期间，小鼠存活率显著提高，并在停药后14天的观察期内保持健康，说明药物没有严重的副作用。
图6显示了本发明的外泌体治疗耐药菌感染的机理图。
构建菌血症模型小鼠，通过尾静脉注射siRNA表达载体，使体内表达靶向耐药基因mecA的siRNA，同时给药抗生素甲氧西林，观察小鼠的生存曲线。
结果显示，与不治疗组、单给甲氧西林治疗组相比，联用甲氧西林+siRNA组的小鼠生存率显著提高。(图7)
此外，发明人发现，甲氧西林和包含siRNA的外泌体联合用药，也可有效保护了小鼠免于致死剂量的铜绿假单胞菌的感染。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南京大学
<120> 用于治疗耐药菌感染的外泌体制剂
<130> P2019-0392
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gcaaucgcua aagaacuaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
uuaguucuuu agcgauugct t 21

Claims (10)

1.一种负载抑制剂的外泌体，其特征在于，所述外泌体包括抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质。
2.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述耐药基因来源于选自下组的菌的耐药基因：葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、或其组合。
3.如权利要求2所述的外泌体，其特征在于，所述来源于葡萄球菌的耐药基因选自下组：mecA、kpc、imp、vim、ndm、或其组合。
4.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述抑制耐药基因表达和/或其蛋白活性的物质选自下组：siRNA、miRNA、或其组合。
5.如权利要求4所述的外泌体，其特征在于，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.:1所示。
6.一种制剂，其特征在于，包括：
(a)权利要求1所述的外泌体；
(b)抗生素；和
(c)药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述抗生素选自下组：甲氧西林、碳青霉烯类抗生素、或其组合。
8.一种药盒，其特征在于，包括：
(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的权利要求1所述的外泌体，或含有权利要求1所述的外泌体的药物；
(b1)任选的第二容器，以及位于所述第二容器中的抗生素，或含有抗生素的药物。
9.一种权利要求6所述的制剂、或权利要求8所述的药盒的用途，其特征在于，用于制备治疗耐药菌感染的药物。
10.一种体外非治疗性的提高耐药菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，包括步骤：在权利要求1所述的外泌体的存在下，培养耐药菌菌株，从而提高耐药菌菌株对抗生素的敏感性。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114517197A (zh) * 2022-02-16 2022-05-20 河南科技大学 大肠杆菌sRNA120、DNA分子、重组载体及在调控细菌耐药能力方面的应用
CN114560914A (zh) * 2022-03-09 2022-05-31 丽水市中心医院 一种抑制blaNDM基因表达的肽核酸及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101457222A (zh) * 2007-12-14 2009-06-17 李宝健 用于抑制和杀灭耐药性细菌的双链小分子干扰核酸及其组合
US20110177054A1 (en) * 2008-06-06 2011-07-21 Derrick Gibbings Use of endo-lysosomal system and secreted vesicles (exosome-like) in treatments and diagnostics based on small rna and experimental study of small rna
CN102497887A (zh) * 2009-04-17 2012-06-13 Isis创新公司 递送遗传物质的组合物
US20150216899A1 (en) * 2012-08-15 2015-08-06 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
CN108602849A (zh) * 2016-04-06 2018-09-28 俄亥俄州国家创新基金会 用于通过rna纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的rna配体展示外来体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016275046B2 (en) * 2015-06-10 2022-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of exosomes for the treatment of disease
CN105412153B (zh) * 2015-12-10 2019-10-25 中国人民解放军第二军医大学 间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用
EP3500244A4 (en) * 2016-08-22 2020-05-13 Codiak BioSciences, Inc. METHOD FOR SUPPRESSING THE DELIVERY OF EXOSOMES TO LIVER AND SPLEEN
KR20210005031A (ko) * 2018-03-29 2021-01-13 테크니온 리서치 엔드 디벨로프먼트 화운데이션 엘티디. Pten 억제제를 포함하는 소포 및 이의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101457222A (zh) * 2007-12-14 2009-06-17 李宝健 用于抑制和杀灭耐药性细菌的双链小分子干扰核酸及其组合
US20110177054A1 (en) * 2008-06-06 2011-07-21 Derrick Gibbings Use of endo-lysosomal system and secreted vesicles (exosome-like) in treatments and diagnostics based on small rna and experimental study of small rna
CN102497887A (zh) * 2009-04-17 2012-06-13 Isis创新公司 递送遗传物质的组合物
US20150216899A1 (en) * 2012-08-15 2015-08-06 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
CN108602849A (zh) * 2016-04-06 2018-09-28 俄亥俄州国家创新基金会 用于通过rna纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的rna配体展示外来体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
耿先龙: "耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测及耐药基因沉默方法学研究" *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114517197A (zh) * 2022-02-16 2022-05-20 河南科技大学 大肠杆菌sRNA120、DNA分子、重组载体及在调控细菌耐药能力方面的应用
CN114517197B (zh) * 2022-02-16 2023-08-29 河南科技大学 大肠杆菌sRNA120、DNA分子、重组载体及在调控细菌耐药能力方面的应用
CN114560914A (zh) * 2022-03-09 2022-05-31 丽水市中心医院 一种抑制blaNDM基因表达的肽核酸及其应用
CN114560914B (zh) * 2022-03-09 2023-10-20 丽水市中心医院 一种抑制blaNDM基因表达的肽核酸及其应用

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Publication number Publication date
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