CN108602849A - 用于通过rna纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的rna配体展示外来体 - Google Patents

用于通过rna纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的rna配体展示外来体 Download PDF

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Abstract

本文公开了组合物，所述组合物包含其表面上展示RNA纳米颗粒的细胞外囊泡诸如外来体。RNA纳米颗粒可以经由靶向部分将细胞外囊泡靶向给定的细胞。细胞外囊泡还可以包含功能部分，其可以用于治疗或诊断。

Description

用于通过RNA纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的RNA配体 展示外来体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月6日提交的美国临时申请第62/319,104号、和2016年8月26日提交的申请序列第62/380,233号的权益，将这些申请在此通过引用以其整体并入本文。
关于联邦赞助研究或开发的声明
本发明根据由美国国立卫生研究院(the National Institute of Health)授予的资助号P30CA177558；R01EB019036；R01EB012135；R01EB003730；R01CA186100，R01CA195573；R35CA197706；U01CA151648；和UH3TR000875在政府支持下进行。政府在本发明中拥有某些权利。
背景
特异性癌细胞靶向RNAi药物递送为用于许多疾病治疗包括癌症的非常有前景的策略。来自细胞内体膜的天然来源的纳米囊泡的外来体体外显示出非常令人鼓舞的将siRNA递送到细胞中的能力。但为了克服生理屏障并且在体内实现治疗作用，需要具有特异性癌细胞靶向特性的外来体。本文公开了用于生物发生后将配体展示到外来体表面的方法和组合物。RNA纳米结构可以被用作将基于RNA或化学品的配体展示到外来体表面上的工具，因此增加它们的细胞靶向特异性，并且因此可以被用于将治疗试剂(诸如RNAi治疗剂)特异性递送至靶向的细胞。
源自phi29DNA包装马达的包装RNA的RNA纳米结构已经显示出对于药物递送的巨大前景。pRNA的3WJ结构域为高度热力学稳定的，可以由3个具有高亲和力的短RNA寡核苷酸片段形成。此外，当使用3WJ作为核心用于构建RNA纳米颗粒时，3WJ可以驱动RNA纳米颗粒的总体折叠并且确保融合的适配体序列的正确折叠以保持功能。将胆固醇应用至修饰的pRNA-3WJ以用于将配体展示到外来体表面。结果表明，化学配体和RNA适配体两者均可以经由胆固醇修饰的pRNA 3WJ被展示在外来体上。配体展示外来体在体外具有增强的特异性肿瘤结合效率。在动物实验中，配体展示外来体在全身注射之后在肿瘤中显示出特异性积累。外来体还装载有siRNA，配体展示外来体可以在体外和体内增强至靶癌细胞的siRNA递送效率。
RNAi治疗剂对于治疗多种疾病包括癌症是非常有前景的，因为它具有修饰疾病基因表达的能力。然而，尽管经过多年的广泛研究，仍然缺乏有效且生物相容的RNAi递送系统。尽管脂质体在体外siRNA递送方面显示出巨大的成功，但当体内全身性施用时，问题在于肝积累和冻融循环，引起最终产物不稳定。
外来体，是一种起源于细胞内体膜的纳米级囊泡，近来作为RNAi药物递送系统已经被广泛研究。但要实现特异性癌细胞靶向仍然具有挑战性。当前的技术正在探索在外来体产生细胞上表达癌细胞特异性配体以增加外来体特异性，诸如在HEK293T细胞上的作为融合蛋白的外来体膜上的过表达肽配体。但使用融合肽用于靶向的外来体递送的一个问题为展示的肽可能在外来体生物发生期间被降解。
本领域需要的是用于通过RNA技术将治疗剂特异性递送至细胞的RNA配体展示外来体。
概述
在不损害健康细胞的情况下将治疗剂递送至患病细胞为医学中的主要挑战。外来体(20-100nm胞吞起源的特化膜囊泡)由于其以下的固有能力具有将RNA干扰(RNAi)剂、基因组编辑和修复模块以及化学治疗剂递送至患病细胞的巨大潜力：(1)以高效率与受体细胞融合以及(2)将包装的治疗性货物(cargo)递送至胞质溶胶，充分表达DNA和RNA，而在内体中不被捕获。然而，它们缺乏特异性细胞靶向能力以及在肝和其他健康器官中的非特异性积累为降低其治疗效力的主要问题。RNA纳米技术可以用于产生能够特异性靶向癌细胞的RNA纳米颗粒，而在健康的重要器官中很少或没有积累。然而，在经由受体介导的胞吞内化到癌细胞之后，RNA纳米颗粒可能在内体中被捕获，并且其内体逃逸效率仍然很低，因此治疗性货物具有有限的效力。本文将“外来体”和“RNA纳米技术”的领域组合以在外来体表面上展示特定配体。工程化外来体能够特异性靶向患病细胞并且有效地进入细胞以将其货物递送至胞质溶胶而在内体中不被捕获。
本文公开了一种组合物，所述组合物包含外来体，其中所述外来体在其表面上展示RNA纳米颗粒，例如锚定在外来体膜内。纳米颗粒可以是基于核酸诸如RNA的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒由三条或更多条核糖核酸链组装，所述三条或更多条核糖核酸链被双链化在一起以形成具有三个或更多个突出茎环的二级结构。在一些实施方案中，纳米颗粒在三个或更多个突出茎环中的一个处包含膜锚定部分。在一些实施方案中，纳米颗粒在剩余茎环处包含一个或更多个功能部分。
在一些实施方案中，三个或更多个核糖核酸链中的至少一个包含pRNA-3WJ核。例如，RNA纳米颗粒可以由三条核糖核酸链组装，所述三条核糖核酸链包含核酸序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，膜锚定部分包含胆固醇或修饰的胆固醇。胆固醇为疏水性的，并且当与寡核苷酸缀合时，可以便于摄取到细胞。在一些实施方案中，胆固醇还包含三甘醇(TEG)间隔物，其可以进一步增加细胞摄取。也可以使用能够将寡核苷酸锚定在外来体的脂质双层膜中的其他亲脂性部分。
在一些实施方案中，一个或更多个功能部分包含靶向部分。靶向部分可以例如将外来体导向感兴趣的细胞。在一些实施方案中，靶向部分选自RNA适配体、修饰的RNA适配体、DNA适配体、修饰的DNA适配体和化学配体。
在一些实施方案中，功能部分包含治疗部分或诊断部分。例如，治疗部分或诊断部分可以包括RNA适配体、核酶、siRNA、蛋白结合RNA适配体或小分子。
在一些实施方案中，纳米颗粒的三个或更多个突出茎环被构造为使得第一茎环在第一方向突出，并且所述第二茎环和第三茎环基本上远离所述第一方向突出。
还公开了一种将外来体靶向细胞的方法，所述方法包括：使细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分，其中所述靶向部分将所述外来体导向感兴趣的细胞。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞，诸如癌细胞。在一些实施方案中，RNA纳米颗粒还包含功能部分，诸如治疗部分或诊断部分。
还公开了一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括将在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体施用至所述受试者，其中纳米颗粒包含至少一个靶向部分，并且其中所述外来体还包含功能部分，其中所述功能部分部分能够治疗受试者中的疾病。例如，在一些实施方案中，疾病为感染。在一些实施方案中，疾病为癌症。
还公开了一种使细胞成像的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分、至少一个诊断部分。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞。
附图说明
图1示出了用于编程天然外来体的RNA纳米技术方法。外来体用携带以下的RNA纳米颗粒的装饰：用于膜锚定的疏水性结构域；用于特异性细胞结合的靶向配体；以及用于物理障碍以阻断在外来体中包封的RNA凸起(knobs)。包装到外来体中用于细胞递送的货物包括siRNA、miRNA、dsDNA或CRISPR-RNA模块。
图2A和图2B示出了携带以下的pRNA-3WJ纳米颗粒的示意图(图2A)和组装(图2B)：用于靶向的叶酸、用于膜锚定的胆固醇；以及用于成像的Alexa-647。a3WJ(SEQ ID NO:1)-叶酸；b3WJ(SEQ ID NO:2)-胆固醇；c3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图3A至图3D示出了来自HEK293细胞的外来体的表征。图3A包含显示外来体具有特征性杯形形态的EM图像。图3B包含显示提取的外来体的尺寸(66±15nm)的DLS(动态光散射)测定。图3C示出了外来体的明显的ζ电位(-18±15mV)。图3B包含显示外来体标志物TSG101富集的蛋白印迹。
图4A示出了从游离RNA尺寸排阻纯化携带pRNA-3WJ的外来体。图4B包含显示在细胞周围明亮的荧光环的共聚焦图像，表明胆固醇部分在细胞膜中的成功锚定(与没有胆固醇的对照相比)。a3WJ(SEQ ID NO:1)-叶酸；b3WJ(SEQ ID NO:2)；b3WJ(SEQ ID NO:2)-胆固醇；C3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图5A示出了外来体进入到受体细胞的常见机制。图5B示出了携带叶酸作为靶向配体的外来体可以通过叶酸受体介导的胞吞以及通过经由四跨膜蛋白和融合蛋白结构域与质膜融合进入HT29结肠直肠癌细胞。共聚焦图像为细胞核；细胞质；和具有表面锚定RNA的外来体的叠加。
图6A和图6B为全身(图6A)和内脏器官(图6B)的图像，显示全身注射后FA-3WJ-外来体特异性靶向的叶酸受体(+)KB细胞皮下异种移植物，并且在8小时之后在任何重要器官中未被检测到。
图7A为显示将RNAi装载到外来体中的效率>95％的荧光测定。图7B为显示在叶酸-3WJ-外来体与表达萤光素酶的叶酸受体(+)KB细胞一起孵育之后萤光素酶的特异性敲低(knockdown)(>80％)的双重萤光素酶测定。
图8A和图8B示出了基于生物发光成像，在全身注射之后KB细胞异种移植物中萤光素酶的特异性敲低。处理：靶向包封萤光素酶siRNA的3WJ-外来体的叶酸受体。对照：不具有叶酸但具有活性siRNA(萤光素酶)的3WJ-外来体。箭头指示注射时间点。(N＝3)；***p<0.001。
图9A至图9C为显示siRNA对Akt2的抑制抑制了结肠直肠癌细胞(在脾内注射)建立肝转移的能力的图像(图9A)、qRT-PCR结果(图9B)、和蛋白印迹结果(图9C)。NTC：无模板对照。图9D示出了在全身递送PI3KsiRNA之后对转移性肿瘤生长的抑制(在第35天成像)。癌细胞表达GFP。NTC：无模板对照。
图10包含显示Alexa647-pRNA-3WJ-EpCAM-适配体强结合并且进入HT29结肠直肠癌细胞的共聚焦图像。适配体选自基于RNA纳米技术的新型2'-F 3WJ文库。
图11A和图11B示出在原位小鼠模型中全身递送pRNA-3WJ-EGFR-antimiR-21之后对三阴性乳腺肿瘤生长的抑制。图11C为显示miR-21靶基因PTEN和PDCD4的上调的蛋白印迹。图11D示出了使用Ki67作为肿瘤细胞增殖的指示物以及活化的胱天蛋白酶-3作为肿瘤细胞凋亡的指示物的免疫组织化学测定的结果。
图12A至图12I示出了用于装饰天然EV的RNA纳米技术。图12A为噬菌体phi29的马达pRNA的延伸的3WJ的AFM图像。图12B为3WJ的箭头头部或箭头尾部(arrow-tail)的胆固醇标记的位置的图示。图12C包含来自用差速超速离心法和缓冲垫修改超速离心法(cushionmodified ultracentrifugation method)纯化的HEK293T细胞的EV的阴性染色的EM图像。图12D至图12G示出了用于尺寸分析的NTA和用于ζ电位测量的DLS。图12H示出了用于测试来自三个组分链的3WJ组装的2D结构(左图)及天然PAGE，如指示的。图12I示出了EV装载和RNA适配体展示。a3WJ(SEQ ID NO:1)；a3WJ(SEQ ID NO:1)-胆固醇；b3WJ(SEQ ID NO:2)；b3WJ(SEQID NO:2)-胆固醇；b3WJ(SEQ ID NO:2)-Alexa647；c3WJ(SEQ ID NO:3)；c3WJ-PSMAapt(SEQ IDNO:7)。
图13A至图13I示出了箭头头部与箭头尾部3WJ之间作用的比较。图13A和图13B包含显示箭头头部与箭头尾部展示之间的差异的图示。图13C示出了通过FBS中的RNA酶测试箭头头部和箭头尾部的Alexa647-3WJ/EV降解的Syner凝胶。图13D示出了在Alexa647通道成像的凝胶以及通过Image J定量的条带的结果。图13E至图13I示出了比较叶酸受体阳性和阴性细胞上的叶酸-3WJ箭头尾部(图13E至图13G)和箭头头部(图13H至图13I)的细胞结合的测定的结果。
图14A至图14C示出了使用PSMA适配体展示EV在体外对细胞的特异性结合和siRNA递送。图13A包含显示PSMA RNA适配体展示EV与PSMA-受体阳性和阴性细胞的结合的流式细胞术图像(左)和共聚焦图像(右)。细胞核、细胞骨架和RNA在共聚焦图像中被标记。图13B示出了通过EV的PSMA适配体介导的存活蛋白siRNA向PSMA(+)前列腺癌细胞的递送的RT-PCR测定。统计：n＝3；实验以双侧t检验以三个生物学重复和三个技术重复运行；将PSMAapt/EV/si存活蛋白分别与PSMAapt/EV/si加扰(PSMAapt/EV/siScramble)和3WJ/EV/si存活蛋白进行比较，p＝0.0061，0.0001。图13C包含显示降低的细胞增殖的MTT测定。n＝3，将PSMAapt/EV/si存活蛋白分别与PSMAapt/EV/si加扰和3WJ/EV/si存活蛋白进行比较，p＝0.003，0.031。*p<0.05,**p<0.01。
图15A至图15C示出了使用配体展示EV用于肿瘤抑制的动物试验。图15A示出了用PSMAapt/EV/si存活蛋白或PSMAapt/EV/si加扰(两者具有0.6mg/kg，siRNA/小鼠体重)和PBS对携带LNCaP-LN3皮下异种移植物的裸小鼠的静脉内治疗，每周两次注射持续三周。n＝10个生物学重复，2个独立实验，并且统计使用双侧t检验计算以平均值以及标准差表示，与对照相比，PSMAapt/EV/存活蛋白分别在第15天、第18天、第22天、第25天、第29天、第32天、第36天和第39天时，p＝0.347、0.6-2、1.5e-6、8.2e-8、2.1e-7、1.0e-7、1.9e-7、1.8e-6。图15B包含显示在EV治疗之后前列腺肿瘤中敲低的存活蛋白mRNA表达的趋势的RT-PCR的结果。图15C示出了在EV治疗时间过程期间小鼠的体重。
图16A至图16D示出了EGFR适配体展示EV可以将存活蛋白siRNA递送至乳腺癌原位异种移植物小鼠模型中。图16A示出了EGFR适配体展示EV在原位异种移植物小鼠模型中显示出对乳腺肿瘤的增强的靶向作用。图16B示出了用EGFRapt/EV/si存活蛋白和对照(n＝5)对携带乳腺癌原位异种移植物的裸小鼠的静脉内治疗。在6周之后，EGFRapt/EV/si存活蛋白治疗的组具有显著小于其他对照的肿瘤尺寸。将EGFRapt/EV/si存活蛋白与EGFRapt/EV/si加扰进行比较，p＝0.008。图16C包含肿瘤提取物中蛋白表达的分析，其显示EGFRapt/EV/si存活蛋白处理显著降低存活蛋白的表达，将EGFRapt/EV/si存活蛋白与EGFRapt/EV/si加扰进行比较，p＝0.0004。图16D包含来自肿瘤的提取的RNA的定量实时PCR分析，其显示EGFRapt/EV/si存活蛋白治疗的小鼠中的存活蛋白mRNA与对照相比的降低。将EGFRapt/EV/si存活蛋白与EGFRapt/EV/si加扰进行比较，p＝0.024。误差条(Error bars)指示s.e.m。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图17A至图17C示出了叶酸展示EV可以将存活蛋白siRNA递送至患者来源的结肠直肠癌异种移植物(PDX-CRC)小鼠模型。图17A包含器官图像，显示在将叶酸展示EV全身注射到具有皮下KB细胞异种移植物的小鼠之后8小时的特异性肿瘤靶向，n＝2，两个独立实验。图17B示出了用FA/EV/si存活蛋白和对照(n＝4)对携带PDX-CRC异种移植物的裸小鼠的静脉内治疗。在6周之后，FA/EV/si存活蛋白治疗的组具有显著更小的肿瘤尺寸，分别在第4周和第5周将FA/EV/si存活蛋白与FA/EV/si加扰进行比较，p＝0.0098和0.0387。图17C示出了在治疗之后与对照相比更低的肿瘤重量。将FA/EV/si存活蛋白与FA/EV/si加扰进行比较，p＝0.0024。误差条(Error bars)指示s.e.m。*p<0.05，**p<0.01。
图18A至图18E示出了PSMAapt/EV/si存活蛋白纳米颗粒的物理特性。图18A示出了测试来自纯化的HEK293T EV的EV标志物TSG101的存在的蛋白印迹测定。检测到EV对于整联蛋白α5、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β4、整联蛋白β5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的表达为阴性。HEK293T细胞裂解物和LNCaP细胞裂解物被用作对照。等量的细胞裂解物被用作阴性对照。图18B示出了携带存活siRNA序列的3WJ的一级序列和二级结构。图18C示出了用差速超速离心法或OptiPrep缓冲垫修改超速离心法从HEK293T细胞培养基纯化的EV的EM图像。图18D示出了siRNA到EV中的装载效率。对没有转染试剂Exo-Fect或EV的对照样品进行测试。在“无EV”对照样品中，将Alexa647标记的3WJ-存活蛋白RNA纳米颗粒用ExoFect处理，并且在添加ExoTC之后沉淀下来。在沉淀物中检测到约15％的Alexa647-3WJ-存活蛋白RNA，这可能是由与ExoTC形成复合物引起的。图18E示出了对3WJ-存活蛋白siRNA装载的EV或不具有EV的阴性对照或仅PBS定量颗粒量并且测试粒径分布的NTA的结果。a3WJ-存活蛋白基因(SEQ ID NO:5)；存活蛋白反义(SEQ ID NO:6)；b3WJ(SEQ ID NO:2)；C3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图19A和图19B示出了消化3WJ-胆固醇2'F RNA纳米颗粒的条件。图19A示出了2'FAlexa647-3WJ-胆固醇RNA纳米颗粒不能被在测试浓度的RNA酶A消化。图19B示出了它可以在67％FBS中被消化。将天然聚丙烯酰胺凝胶使用Cy5通道用Typhoon(GE healthcare)成像。在37℃与67％FBS一起孵育2小时的条件用于测试EV是否可以保护箭头头部或箭头尾部胆固醇展示3WJ 2'F RNA纳米颗粒。
图20A至图20D示出了在体外使用PSMA适配体展示EV对细胞的特异性siRNA递送。通过EV的PSMA适配体介导的存活蛋白siRNA至PSMA(+)前列腺癌LNCaP细胞(图20A)和PSMA(-)前列腺癌PC3细胞(图20B)的递送的蛋白印迹测定。图20C和图20D示出了用Image J软件并且将相对存活蛋白表达水平归一化为β-肌动蛋白的3个独立实验的定量条带强度。
图21A和图20B示出了RNA纳米颗粒的一级序列和二级结构。图21A显示用于乳腺癌研究的EGFRapt/3WJ/胆固醇RNA纳米颗粒。图21B示出了用于结肠直肠癌研究的FA/3WJ/胆固醇RNA纳米颗粒。a3WJ(SEQ ID NO:1)-胆固醇；b3WJ(SEQ ID NO:2)；b3WJ-EGFRapt(SEQ IDNO:10)；c3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647；叶酸-c3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图22示出了CRC PDX肿瘤中存活蛋白表达的分析。对于存活蛋白(存活蛋白(71G4B7)兔mAb#2808；Cell Signaling,1:500)的免疫组织化学染色的实例(n＝9个患者样品)。
详细说明
通过参考本文包括的以下详细描述、附图和实施例，可以更容易地理解所公开的主题。
在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应当理解的是，除非另外指明，它们不限于特定的合成方法，或者除非另外指明，它们不限于特定的试剂，因此它们当然可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅为了描述特定的方面的目的并且不被意图是限制性的。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料均可以用于实践或测试本发明，现在描述了示例性方法和材料。
此外，应当理解的是，除非另外明确说明，不以任何方式意图将本文阐述的任何方法解释为要求以特定顺序进行其步骤。因此，在方法权利要求实际上未叙述其步骤应遵循的顺序，或者在权利要求或说明书中未另外具体说明步骤被限于特定顺序的情况下，在任何方面决不意图顺序被推断出来。这适于任何可能的非明示的解释基础，包括关于步骤或操作流程的布置的逻辑问题、源自语法组织或标点的明确含义以及说明书中描述的方面的数目或类型。
本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开并且描述所引用的出版物相关的方法和/或材料。提供本文讨论的出版物仅由于它们的公开内容在本申请的递交日期之前。本文不应解释为承认由于先前发明使得本发明不具有优先于此类出版物的资格。此外，本文提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立确认。
应当理解的是，所公开的方法和系统不限于所描述的特定方法、方案和系统，因为这些可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限制。
SiRNA和miRNA具有沉默基因的潜力，DNA可以救援基因，并且RNA模块可以通过CRISPR方法编辑基因组。但，它们向人类身体中的细胞的胞质溶胶的递送是主要障碍。几种合成的纳米平台已经在特定的癌症靶向和递送方面取得了一定程度的成功，但纳米颗粒可能被肝脏中的Kupffer细胞以及肺和脾中的巨噬细胞捕获，导致到达靶细胞的低效率以及非特异性毒性或副作用。一种策略为使用外来体用于递送治疗剂。外来体能够跨越异质生物学屏障将其内容物递送至受体细胞而在内体中不被捕获。它们在体内是良好耐受的，并且可以是免疫原性惰性的。然而，它们缺乏选择性，并且也可以与正常细胞随机融合。对于临床翻译，主要障碍是对这些天然来源的外来体进行重编程以携带靶向配体以确保向患病细胞的特异性递送。有限数目的出版物已经证明具有体内表达的蛋白质配体的外来体可以增强特定细胞的靶向。然而，蛋白配体的体内表达限于配体种类的可用性并且取决于外来体和配体表达细胞类型。蛋白配体的使用导致较大尺寸的外来体在肝、肺和脾中被捕获。在外来体表面上的较低频率的分子展示不能有效地降低其与健康细胞的结合和融合比率。
使用RNA干扰、基因递送和CRISPR介导的基因组编辑的方法是有前景的，但这些技术在临床治疗剂中的重大挑战是对选择性靶向患病细胞的低效率和有限的特异性。健康器官中的非特异性进入和积累显著降低了治疗指数，并且通常导致严重的副作用。RNAi剂作为治疗剂具有令人难以置信的潜力，但以它们的天然形式易于在血清中降解，从血液中快速清除，可能产生非法免疫反应，并且它们的负电荷限制了细胞膜通过和细胞摄取。已经开发了几种纳米递送平台来解决这些问题，但障碍仍然存在，诸如毒性、免疫原性、肝积累和内体中的截留(entrapment)。天然来源的外来体可以被导出用于将RNA或DNA治疗剂靶向递送至患病细胞，而对健康细胞很少或没有附带损伤(collateral damage)。
靶向递送在医学中极为重要，包括用于RNAi疗法的siRNA/miRNA递送、用于补救遗传缺陷的基因递送、用于DNA修复的核酸递送以及用于所有类型疾病的化学治疗剂递送。外来体和RNA纳米技术两种领域已经证明了治疗剂体内递送的潜力。然而，当前各领域均缺乏一个关键方面来满足临床转化目标：(1)外来体可以通过膜融合有效地进入细胞并且递送功能活性蛋白和RNA/DNA以诱导靶细胞中的转录和翻译改变；然而，通过融合的细胞进入是非特异性的，并且特异性细胞靶向尚未解决。(2)经由RNA纳米技术构建的RNA纳米颗粒可以有效地和特异性地靶向癌细胞，但RNA纳米颗粒在细胞进入之后可能在内体中被捕获，并且内体逃逸效率仍然很低。
所公开的策略为通过RNA纳米技术方法在外来体表面上展示携带RNA适配体或化学配体的RNA纳米颗粒(图1)。使用纯化的外来体和RNA纳米颗粒的体外展示和装饰技术导致RNA配体展示的高频率以阻断由于物理障碍导致的外来体与健康细胞的非特异性融合。通过体外方法展示RNA或化学品配体扩大了靶向配体多样性的范围，便于工业规模生产，并且由于不诱导由RNA或化学试剂引起的宿主免疫应答而允许重复治疗慢性疾病。所公开的方法利用外来体和RNA纳米技术平台两者来实现特异性靶向、特定细胞进入的高效率以及体内递送到胞质溶胶中之后的siRNA、miRNA、mRNA或dsDNA的最佳功能。
外来体为源自由许多细胞类型释放的胞吞区室的20-100nm的特化膜囊泡。在许多研究中已经确认了外来体在经由转移生物活性脂质、细胞质和膜蛋白以及RNA介导细胞-细胞通讯的基本元件中的重要性。在癌症中，外来体能够刺激血管生成，诱导肿瘤增殖和转移，并且促进免疫逃逸。外来体作为递送载体具有很大的潜力，因为它们：(1)易于提取和再设计；(2)在体内是良好耐受的，因为它们已经被大多数细胞分泌；(3)如果源自适当的细胞，是免疫惰性的；(4)对于个体化疗法可以是患者来源的。它们不太可能被患者循环中的固有免疫细胞、抗体、补体或凝血因子攻击；(5)天然地能够基于它们将其内容物转移至受体细胞的先天能力细胞内递送生物分子；(6)具有大的表面积用于展示多个靶向配体；(7)具有纳米级尺寸和弹性(可变形)形状，具有跨越生物学屏障(诸如血脑屏障)以及规避肾和肝清除的内在能力；以及(8)可以避免对内体逃逸策略的需要，因为外来体可以通过其四次穿膜蛋白(tetraspanin)结构域与靶细胞上的表面糖蛋白相互作用直接与细胞膜融合并且将内容物直接递送至胞质溶胶。它们也可以在受体介导的胞吞之后与内体区室膜反融合(back-fuse)以将其包封的货物释放至胞质溶胶。因此，治疗性有效载荷诸如miRNA、siRNA、dsDNA或mRNA在递送到细胞中之后可以是有完整功能的。
基于以下方面，RNA作为构建材料具有独特的特性：(1)RNA是一种聚合物，可以用于以定义的结构、尺寸和化学计量控制合成；因此它们可以规避由颗粒异质性引起的非特异性副作用。(2)根据形状和化学计量RNA纳米颗粒具有10-50nm的尺寸，并且足以携带适配体作为细胞靶向配体。(3)RNA纳米颗粒的弹性和分支棘轮形状便于经由受体介导的胞吞的癌细胞膜结合、跨越和进入。这对于克服机械屏障、紊乱的脉管系统(disorganizedvasculatures)和高度免疫抑制性肿瘤微环境特别有用。(4)模块化设计和自下而上(bottom up)的自组装使经济工业规模生产成为可能。(5)RNA纳米颗粒是高度可溶性的，不易聚集，并且不需要连接至通常用于基于蛋白的试剂的PEG或白蛋白。(6)多价性质允许同时掺入多个靶向和成像模块，而无任何交联。(7)pRNA-3WJ纳米颗粒为热力学稳定的，这确保了所掺入的功能模块的正确折叠和独立活性。(8)pRNA-3WJ构建体在2'-氟(2'-F)修饰之后展示化学稳定性；基于RNA序列中2'-F核苷酸的数目和位置，体内半衰期是可调的。(9)基于pRNA的纳米颗粒展示出有利的PK/PD谱；是无毒的；并且甚至在重复施用30mg/kg之后也未诱导小鼠中的干扰素或细胞因子产生。RNA纳米颗粒不包含蛋白，并且不诱导宿主抗体应答，这允许重复治疗癌症。(10)在全身注射后，pRNA-3WJ纳米颗粒在3-4小时内在肿瘤中特异性积累，并且从健康器官诸如肝、肺、脾和肾中清除。(11)最后，RNA被分类为化学试剂。与基于蛋白的临床试剂相比，预期监管过程会更加有利。
外来体已经显示出有效的细胞进入和有效的内体逃逸能力；然而，缺乏特异性细胞靶向导致了低的治疗效力。与健康细胞的非特异性融合以及在肝和其他健康重要器官中的显著积累导致了毒性。一些出版物指示，外来体可以被工程化为经由将蛋白编码基因靶向外来体跨膜蛋白诸如LAMP2的遗传融合在外来体表面上表达某些细胞类型特异性的基于蛋白的靶向配体。然而，蛋白配体的体内表达限于配体的可用性并且取决于外来体和配体产生细胞类型。另外，蛋白配体的使用导致更大尺寸的颗粒可以在肝、肺和其他器官中被捕获，并且可以刺激宿主抗体的产生。通过内体蛋白酶降解靶向肽通常在外来体生物发生期间发生，这进一步限制了它们的能力。其他挑战包括来自供体细胞的外来体的大规模生产和纯化以及治疗性货物到外来体的低效装载。尽管RNA纳米技术已经快速发展，经由受体介导的胞吞将RNA纳米颗粒用于体内递送的使用导致了RNA纳米颗粒在内体中的捕获，并且因此限制了递送的治疗性货物的效力。
定义
除非另外明确说明，不以任何方式意图将本文阐述的任何方法或方面解释为要求其步骤以特定顺序进行。因此，在方法权利要求在权利要求或说明书中未具体说明步骤被限于特定顺序的情况下，不以任何方式意图顺序在任何方面被推断出来。这适于任何可能的非明示的解释基础，包括关于步骤或操作流程的布置的逻辑问题，源自语法组织或标点的明确含义或说明书中描述的方面的数目或类型。
除非上下文另外清楚地指明，如该说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
如本文使用的词语“或”意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
范围可以在本文中被表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当此类范围被表示时，另外方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该特定值形成另外方面。还应当理解的是，每一个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时均是重要的。还应当理解的是，本文公开了许多值，并且除了值本身以外，每一个值也在本文中被公开为“约”该特定值。例如，如果值“10”被公开，则“约10”也被公开。还应当理解的是，两个特定单元之间的每一个单元也被公开。例如，如果10和15被公开，则11、12、13和14也被公开。
如本文使用的，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可以发生或可以不发生，并且意指该描述包括其中所述事件或情形发生的情况和其中该事件或情形未发生的情况。
如本文使用的，术语“转化”和“转染”意指将核酸(例如，表达载体)引入受体细胞中，包括将核酸引入至所述细胞的染色体DNA中。本领域熟悉用于实现将核酸引入到受体细胞中的多种组合物、方法、技术等。本领域熟悉用于真核细胞和原核细胞两者的此类组合物、方法、技术等。本领域熟悉用于优化将核酸引入到受体细胞中并且在受体细胞中表达的此类组合物、方法、技术等。
术语“生物相容的”通常指通常对受体无毒且未对受试者造成任何显著副作用的物质及其任何代谢物或其降解产物。
术语“生物可降解的”通常指在生理条件下会降解或侵蚀为能够被受试者代谢、消除或排泄的较小单位或化学物质。降解时间为聚合物组成和形态的函数。合适的降解时间从几天至几个月。
术语“抗体”指选择性结合靶抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，还包括在术语“抗体”中的是那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物、以及选择性结合靶抗原的人类或人源化形式的免疫球蛋白分子。
术语“肽”、“蛋白”和“多肽”可互换使用，指包含通过一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的α氨基基团连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。
术语“蛋白结构域”指显示结构完整性的蛋白的一部分、蛋白的部分(portions)或整个蛋白；该确定可以基于蛋白的一部分、蛋白的部分或整个蛋白的氨基酸组成。
术语“核酸”指包含单个核苷酸或者在一个核苷酸的3'位置处与另一个核苷酸的5’末端处通过磷酸基团连接的两个或更多个核苷酸的天然或合成分子。核酸不受长度的限制，并且因此核酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
如本文使用的，当提及多肽(包括抗体)或受体时，术语“特异性结合”指确定蛋白或多肽或受体在蛋白和其他生物物质(biologies)的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定的条件下(例如在抗体情况下的免疫测定条件)，指定的配体或抗体当它不以显著量与样品中存在的其他蛋白结合或与配体或抗体可以在生物体中接触的其他蛋白结合时与其特定“靶”“特异性结合”(例如抗体与内皮抗原特异性结合)。
“嵌合分子”为通过连接在其天然状态分开存在的两个或更多个分子产生的单个分子。单个的嵌合分子具有其所有组成分子的期望的功能。通常，嵌合分子的组成分子之一为“靶向分子”或“靶向部分”。靶向分子为与其对应的靶例如细胞表面上的受体特异性结合的分子，诸如配体或抗体。
如本文使用的术语“特异性递送”指分子与携带特定靶分子或标志物的细胞或组织的优先缔合，且不与缺乏该靶分子的细胞或组织优先缔合。当然，认识到分子与非靶细胞或组织之间可能发生一定程度的非特异性相互作用。尽管如此，特异性递送可以被区分为通过特异性识别靶分子来介导。
通常，特异性递送导致递送的分子与携带靶分子的细胞之间的缔合比递送的分子与缺乏靶分子的细胞之间的缔合强得多。
如本文使用的“间隔物”指连接蛋白包括融合蛋白的肽。通常，除了连接蛋白或保存它们之间的一定最小距离或其他空间关系以外，间隔区不具有特殊的生物学活性。然而，可以选择间隔物的组成氨基酸以影响分子的一些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
术语“载体”或“构建体”指能够将载体序列所连接的另一种核酸转运到细胞中的核酸序列。术语“表达载体”包括包含呈适于被细胞表达的形式(例如，与转录控制元件连接)的基因构建体的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)。
术语“可操作地连接”指一种核酸与另一种核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列为与其他序列可操作地连接的核酸序列的实例。例如，DNA与转录控制元件的可操作连接指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得此类DNA的转录由启动子通过特异性识别、结合并且转录DNA的RNA聚合酶启动。
如本文使用的，“多肽”指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白。多肽包含连续的氨基酸。术语“多肽”涵盖天然存在的或合成的分子。
如本文使用的，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词语的列表。本文使用的氨基酸缩写为氨基酸的常规一个字母代码并且如下表示：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸(glutamate)、谷氨酸(glutamicacid)；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。
术语“变体”指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(即简并变体)、编码氨基酸的每一个密码子(即DNA和RNA)的摆动位置内的取代、添加至肽的C-末端的氨基酸的氨基酸序列或肽序列、或与参考序列具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性百分比的肽。
术语“序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比之后候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。为了确定序列同一性百分比的目的，比对可以以本领域技术范围内的多种方式，例如使用公众可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件来实现。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在比较的全长序列中实现最大比对所需的任何算法。在一个方面，一种或更多种治疗剂选自一种或更多种抗微生物化合物、一种或更多种抗细菌化合物、一种或更多种抗真菌化合物或一种或更多种抗癌剂或其组合。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种抗癌剂。在一个方面，一种或更多种抗癌剂可以包含顺铂。在一个方面，一种或更多种抗癌药物诱导凋亡。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种化学治疗性药物。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种辐射敏化剂。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含药学上可接受的载体。
如本文使用的，术语“受试者”指施用的靶，例如，动物。因此，本文公开的方法的对象可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。可选地，本文公开的方法的主题可以是人类、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不表示特定年龄或性别。因此，意图涵盖成人和新生儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性。在一个方面，受试者为患者。患者指罹患疾病或紊乱诸如例如癌症和/或异常细胞生长的受试者。术语“患者”包括人类和兽医受试者。在一个方面，受试者已经被诊断为需要治疗癌症和/或异常细胞生长。
如本文使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“疗法(therapy)”和“治疗性治疗(therapeutic treatment)”指治愈性疗法、预防性疗法(prophylactictherapy)和预防性疗法(preventative therapy)。如本文使用的，该术语指意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或紊乱(诸如例如癌症或肿瘤)的受试者或患者的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理状况或紊乱的改进的治疗，并且还包括因果治疗，即针对相关疾病、病理状况或紊乱的原因的去除的治疗。另外，该术语包括姑息治疗，即为减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或紊乱而设计的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或紊乱的发展的治疗；以及支持治疗，即用于补充针对相关疾病、病理状况或紊乱的改进的另一种特定疗法的治疗。在多个方面，该术语涵盖受试者(包括哺乳动物(例如，人类))的任何治疗，并且包括：(i)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中预防该疾病发生；(ii)抑制疾病，即阻止其发展；或(iii)缓解疾病，即引起疾病衰退。在一个方面，疾病、病理状况或紊乱为癌症，诸如例如乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肝癌或胰腺癌。在一个方面，癌症可以是本领域已知的任何癌症。
如本文使用的，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”指排除、避开(averting)、消除(obviating)、预防(forestalling)、停止、或阻止某些事情发生，特别是通过预先行动。应当应理解的是，除非另外明确指示，在本文中使用降低、抑制或预防的情况下，还明确地公开了使用其他两个词。例如，在一个方面，预防可以指预防癌细胞的复制或预防癌细胞的转移。
如本文使用的，术语“诊断的”意指已经由技术人员(例如医师或研究人员)进行身体检查，并且发现其具有可以通过本文公开的组合物或方法诊断或治疗的状况。例如，“诊断为患有癌症”意指已经由技术人员(例如医师或研究人员)进行身体检查，并且发现其具有可以通过减轻或改善癌症和/或异常细胞生长的化合物或组合物诊断或治疗的状况。
如本文使用的，术语“施用(administering)”和“施用(administration)”指向受试者提供组合物的任何方法。此类方法是本领域技术人员熟知的，并且包括，但不限于，心脏内施用、口服施用、经皮施用、通过吸入施用、鼻腔施用、局部施用、阴道内施用、眼部施用、耳内施用、大脑内施用、直肠施用、舌下施用、含服施用和肠胃外施用(包括可注射诸如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用和皮下施用)。施用可以是连续的或间歇的。在多个方面，制品(preparation)可以治疗性地施用；即施用以治疗现有的疾病或状况。在另外的多个方面，制品可以预防性地施用；即施用用于预防疾病或状况。
如本文使用的术语“接触”指使公开的组合物或肽或药物制品与细胞、靶受体或其他生物学实体以这样的方式在一起：化合物可以直接(即通过与靶本身相互作用)或间接(即通过与靶的活性所依赖于的另一种分子、辅因子、因子或蛋白相互作用)影响靶(例如，受体、转录因子、细胞等)的活性。
如本文使用的，术语“确定”可以指测量或确定表达和/或活性水平的数量或量或改变。
如本文使用的，术语“有效量(effective amount)”和“有效的量(amounteffective)”指足以实现期望的结果或对不期望的状况具有作用的量。例如，在一个方面，聚合物纳米颗粒的有效量为杀死和/或抑制细胞生长而未对周围非癌细胞造成额外损伤的量。例如，“治疗有效量”指足以实现期望的治疗结果或对不期望的症状具有作用但通常不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括被治疗的紊乱和紊乱的严重程度；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体化合物组合或同时使用的药物以及医学领域熟知的类似因素。
“调控”意指通过增加或减少来改变。如本文使用的，“调控物”可以意指可以增加或减少基因或基因产物诸如肽的表达水平或活性水平的组合物。
表达或活性的调控不必是完整的。例如，与其中基因或基因产物的表达或活性尚未被组合物调控的对照细胞相比，表达或活性可以被调控了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或在中间的任何百分比。
术语“药学上可接受的”描述了不是生物学上或其他方面不期望的，即不引起不可接受水平的不期望的生物学作用或以有害方式相互作用的材料。如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于临使用之前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂、或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的预防可以通过包括多种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、硼酸等来确保。还可以期望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过包括延迟吸收的剂，诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。可以通过在生物可降解聚合物(诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))中形成药物的微囊基质来制备可注射的长效(depot)形式。取决于药物与聚合物的比率以及采用的特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。长效可注射制剂还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射制剂可以例如通过截留细菌的过滤器过滤，或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在临使用之前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可以包括糖诸如乳糖。期望地，按重量计至少95％的活性成分颗粒具有在0.01至10微米范围内的有效粒径。
如本文使用的，术语“癌症”指由已经对正常生长控制失去易感性的细胞增殖引起或表征的增殖性紊乱或疾病。术语“癌症”包括肿瘤和任何其他增殖性紊乱。相同组织类型的癌症起源于相同的组织，并且可以基于其生物学特征将其分为不同的亚型。癌症包括，但不限于，黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和慢性淋巴细胞白血病。癌症还包括，但不限于，脑癌、骨癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、垂体癌、肾癌、胃癌、食管癌、肛门癌和直肠癌。
如本文使用的，术语“抗癌”或“抗赘生物”药物指可以用于治疗癌症和/或异常细胞生长的一种或更多种药物。
公开了用于制备本文公开的组合物的组分以及待用于本文公开的方法中的组合物本身。这些及其他材料被本文公开，并且应当理解的是，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，尽管不能明确公开对这些化合物的多种个体和集合性组合以及置换的每一种的具体引述，但每一个都被本文明确地设想和描述。例如，如果特定化合物被公开并讨论，并且讨论了可以对许多分子包括化合物做出的许多修饰，除非另外明确相反指示，则化合物以及可能的修饰的每一种及每种组合和置换被明确设想。因此，如果一类分子A、B、和C以及一类分子D、E、和F被公开，并且组合分子的实例A-D被公开，则即使每一个未被单独列举，每一个被单独或集合性地被设想意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F被认为是公开的。同样，也公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组将被认为是公开的。该概念适于本申请的所有方面，包括，但不限于，制造和使用本文公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多种另外的步骤，应当理解的是，这些另外的步骤的每一个可以与本文公开方法的任何具体的实施方案或实施方案的组合一起进行。
本文任何地方提及的所有专利、专利申请及其他科学或技术著作(writings)通过引用以其整体并入本文。公开的主题可以在不存在本文未明确公开的任何一个要素或更多个要素(any element or elements)、一个限制或更多个限制(limitation orlimitations)的情况下被实践。因此，例如，在本文的每一个实例中，术语“包括(comprising)”、“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“由......组成(consisting of)”的任何一个可以被另外两个术语中的任一个代替，同时保留它们的普通含义。已经采用的术语和表述被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所显示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但应认识到，多种改变在本发明要求保户的范围内是可能的。因此，应当理解的是，尽管本发明已经通过实施方案、任选的特征被具体公开，但本领域技术人员可以寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在如由本说明书及所附的权利要求所限定的本发明的范围内。
组合物
本文公开了组合物和方法，所述组合物和方法包括在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体。例如，这些外来体可以用于将药剂靶向细胞。这些剂可以被掺入到纳米颗粒中，分开展示在外来体的表面上，或者作为货物掺入于外来体内。
RNA纳米颗粒可以以为DNA的特征的简单性水平被制造，同时具有模拟一些蛋白的多功能三级结构和催化功能。
在一些实施方案中，RNA纳米颗粒由三个或更多个RNA寡核苷酸组装，所述三个或更多个RNA寡核苷酸被双链化在一起以形成具有三个或更多个突出茎环的二级结构。每一个茎环的数目、长度和相对角度可以被设计以提供化学计量的优点。例如，本文公开了具有“箭头尾部”构型的纳米颗粒。在该实施方案中，一个茎环与另一个茎环具有约60度的角度，但与其他茎环具有约180度的角度。这可以产生可以将RNA纳米颗粒锁定在适当地方的“钩(hook)”效应。此外，取决于哪个茎环被锚定于膜中，纳米粒子将有区别地存在于外来体上。因此，可以调整纳米颗粒的形状以根据需要更好地展示或保护部分。设想了其他形状，诸如源自“钩”形状的形状。在一些实施方案中，纳米颗粒维持不对称的取向。
如本文公开的，可以以精确控制形状、尺寸和化学计量来制造RNA纳米颗粒。在一些实施方案中，三个或更多个RNA寡核苷酸中的至少一个源自pRNA 3-式连接(pRNA 3-wayjunction)(3WJ)基序。
在一些实施方案中，三个或更多个RNA寡核苷酸中的至少一个源自噬菌体包装RNA(pRNA)。噬菌体phi29DNA包装马达的pRNA经由互锁环的交互(hand-in-hand)相互作用形成二聚体、三聚体和六聚体。
在一些实施方案中，三个或更多个RNA寡核苷酸中的至少一个包含来自pRNA的天然或修饰的3-式连接(3WJ)基序。3WJ基序可以见于，例如，GA1、SF5、M2、B103、和phi29噬菌体pRNA中。3WJ在不存在金属盐的情况下由具有异常高亲和力的三个RNA寡核苷酸组装；耐8M尿素变性；展示热力学稳定的特性；并且在超低浓度不解离。可以使用2'-氟(2'-F)修饰来产生耐RNA酶降解的RNA纳米颗粒，同时保留真正的折叠和生物学活性。因此，在一些实施方案中，RNA纳米颗粒可以由a3WJ RNA寡核苷酸(SEQ ID NO:1)、b3WJ RNA寡核苷酸(SEQ IDNO:2)、和c3WJRNA寡核苷酸(SEQ ID NO:3)组装。在一些实施方案中，RNA寡核苷酸包含产生不对称取向的人工和/或合成3WJ基序。
在一些实施方案中，分子具有范围从约-150mV至约150mV的ζ电位。RNA分子具有范围从约-140mV至约140mV、从约-130mV至约130mV、从约-120mV至约120mV、从约-110mV至约110mV的ζ电位。在一些实施方案中，分子具有范围从约-100mV至约100mV的ζ电位。RNA分子具有范围从约-95mV至约95mV、从约-90mV至约90mV、从约-85mV至约85mV、从约-80mV至约80mV、从约-75mV至约75mV、从约-70至约70mV、从约-65mV至约65mV、从约-60mV至约60mV、从约-55mV至约55mV、从约-50mV至约50mV的ζ电位。分子具有范围从约-45mv至约45mV、从约-40mV至约40mV、从约-35mV至约35mV、从约-35mV至约30mV、从约-35mV至约20mV、从约-25mV至约15mV的ζ电位。
在一些实施方案中，RNA纳米结构分子在从约2至约13的pH范围内基本上是稳定的。RNA分子在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的pH下是稳定的。如本文使用的，术语“基本上稳定的”可以指物理和/或化学稳定性。如本领域普通技术人员将认识到的，术语“基本上稳定的”可以指在某些条件下组合物相对于初始组合物(即当初始制备特定批次的组合物时)的稳定性。在这方面，如本领域普通技术人员将认识到的，藉以可以确定特定实施方案的组合物的稳定性的一种方式如下：制备一个批次实施方案的组合物，对组合物样品(对照样品)进行初始评价，使组合物样品经历感兴趣的条件(例如，在特定条件储存特定时间段)(测试样品)，对测试样品进行评价，并且将对照样品的评价与测试样品的评价进行比较。可以进行计算以确定测试样品中存在的量是否为在对照样品中的量的100％+20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％。
除了DNA、蛋白、脂质和碳水化合物以外，RNA为五种最重要的生物学大分子之一。关于一些与DNA相似的方面，包括四种核苷酸(包括腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟苷(G)和尿苷(U))的RNA在其均一性上是特殊的。
RNA为核苷酸的均聚物，但也为A、U、G和C的杂聚物。每一个核苷酸包含核糖、核碱基和磷酸基团。核苷酸通过相邻核糖单元之间的3'→5'磷酸二酯键共价连接在一起，赋予定义RNA为多核酸的糖-磷酸骨架方向性。骨架中的磷酸部分带负电荷，使RNA在生理pH成为聚阴离子大分子。
RNA分子通常为单链的；然而，沃森-克里克(Watson-Crick)(典型(canonical))碱基对相互作用(A:U和G:C)，摆动碱基配对(诸如G:U)或其他非典型碱基配对，诸如具有糖苷键相对于氢键的取向(顺式或反式)的12个基本几何家族的边缘与边缘相互作用(沃森-克里克、Hoogsteen/CH或糖边缘)，所有的一起产生显示环、发夹、凸起、茎、假结、连接等的多种结构构象，这些为引导和驱动RNA分子组装为期望的结构的基本要素。
定义RNA并且将其与DNA区分开的RNA的特征为骨架的每一个核糖上的2'-羟基。2'-OH基团为RNA提供了一种特殊特性，这可能是优点或缺点。从结构的角度来看，该另外的羟基的优点在于它可以将核糖锁定到3'-内椅型构象(3'-endo chair conformation)中。因此，RNA双螺旋在结构上有利的是采用与DNA双螺旋中通常存在的B型相比，短且宽约20％的A型。此外，RNA中的2'-OH基团为化学活性的，并且能够在S 2反应中启动对相邻3'磷酸二酯键的亲核攻击。这裂解了RNA糖磷酸骨架并且这种化学机制成为核酶中观察到的催化自我裂解的基础。缺点在于2'-OH基团使RNA对核酸酶消化敏感，因为许多RNA酶识别包括2'-OH基团的RNA结构作为特异性结合位点。
然而，此类酶不稳定性可以通过对2'-OH基团应用化学修饰来克服。例如，用氟(2-F)、O甲基(Omethyl)(2'-O-Me)或胺(2'-N3/4)取代2'羟基基团通过防止被RNA酶降解显著增加体内RNA稳定性。最近的研究还表明siRNA在血清中的稳定性还高度依赖于特定的RNA序列，并且短和长RNA双链体两者的降解主要发生在UA/UA或CA/UG位点处。因此，在一些实施方案中，RNA纳米颗粒在RNA寡核苷酸的2'位置处包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包括2'氟、2'胺和2'O-甲基。
在一些实施方案中，纳米颗粒在三个或更多个突出茎环中的一个、两个、或三个处包含膜锚定部分。例如，膜锚定部分可以是胆固醇分子。
在一些实施方案中，纳米颗粒在剩余茎环中的一个或更多个处包含一个或更多个功能部分。例如，在一些实施方案中，RNA纳米颗粒在剩余茎环中的一个或更多个处包含靶向部分。可以选择靶向部分诸如基于化学或核酸的配体以靶向特定组织类型，诸如，例如，肌肉、脑、肝、胰腺和肺，或靶向患病组织诸如肿瘤。在一些实施方案中，RNA纳米颗粒包含多于一个功能部分。在一些情况下，外来体具有多于一种类型的RNA纳米颗粒，每一种具有不同的功能部分。
在一些情况下，配体为能够结合细胞表面蛋白(例如受体)的任何分子。在一些情况下，配体为化学配体，诸如叶酸、半乳糖或其衍生物。
在一些实施方案中，配体为基于核酸的配体，诸如RNA或DNA适配体。例如，一个或更多个突出茎环可以是RNA适配体序列，或者配体可以与公开的纳米颗粒的茎环缀合。适配体靶的实例提供于下表1中。
表1中适配体的核酸序列是本领域已知的并且可以见于以下中：例如，Wilner SE等Molecular Therapy Nucleic Acids.2012 1(5):e21；Shigdar S,等Cancer Sci.2011102(5):991-8；Rockey WM,等Nucleic Acid Therapeutics.2011 21(5):299-314；Kim MY,等Nucleic Acid Ther.2011 21(3):173-8；Chen CB,等Proc Natl Acad Sci U S A.2003100(16):9226-9231；Esposito CL,PLoS One.2011 6(9):e24071；Liu Y,等BiolChem.2009 390(2):137-44；Lee YJ,等Gastroenterology.2012 143(1):155-65.e8；DavisKA,等Nucleic Acids Res.1998 26(17):3915-24；Mallikaratchy PR,等Nucleic AcidsResearch.2011；39(6):2458-2469；Xiao Z,等Chemistry.2008；14(6):1769-75；ShangguanD,等Clin Chem.2007Jun；53(6):1153-5；Daniels DA,等Proc Natl Acad Sci U SA.2003Dec 23；100(26):15416-21；Ababneh N,等Nucleic Acid Therapeutics.2013 23(6):401-407；和Shigdar S,等Cancer Lett.2013Mar1；330(1):84-95，其所有关于这些适配体包括其合适序列的教导通过引用并入本文。
在一些实施方案中，公开的外来体被装载有治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，诊断剂为成像部分。成像部分包括荧光染料，放射性核素和/或造影剂。
荧光染料的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料或近红外染料。荧光染料的另外的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料、近红外(近IR或NIR)染料，包括但不限于，IRdyegoo、Alexae47、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(Indocyanine green)(ICG)。在一些实施方案中，成像模块包括报告物成像模块。
在一些实施方案中，术语“放射性核素”包括具有不同同位素的放射性标记肽和蛋白。放射性同位素的非限制性实例包括86Y、90Y、111In、177Lu、225Ac、212Bi、213Bi、66Ga、67Ga、68Ga、64Cu、67Cu、71As、72As、76As、77As、65Zn、48V、203Pb、209Pb、212Pb、166Ho、149Pm、153Sm、201TI、188Re、186Re和99mTc。在一些实施方案中，放射性核素与RNA纳米颗粒的多于一个茎环偶联。在一些实施方案中，放射性核素通过螯合剂螯合。在一些实施方案中，螯合剂与RNA纳米颗粒的至少一个茎环偶联。螯合剂的非限制性实例包括EDTA、DOTA和NOTA。
如本文使用的，术语“造影剂”指用于改进内部身体结构在图像中的可见性的化合物，包括但不限于，X射线图像或扫描图像(例如CAT(计算机化的轴向层面摄影)扫描、MRI(磁共振成像)扫描)。术语造影剂在本文中也被称为放射造影剂。造影剂用于多种诊断(例如，心导管插入(cardiac catheterization))和治疗(例如，血管分流放置(vascularshunt placement))程序。磁共振成像(MRI)为一种功能强大的非侵入性技术，其提供高质量的组织三维图像，包括关于体内组织的解剖、功能和代谢的信息。钆为一种常见的Ti加权MRI造影剂。在一些实施方案中，造影剂为MRI造影剂。在一些实施方案中，MRI造影剂为胃肠MRI、静脉内MRI、血管内(血池)MRI肿瘤特异性MRI、肝胆MRI和网状内皮MRI。MRI造影剂的一个非限制性实例为钆造影剂。
在一些实施方案中，治疗剂为治疗性核酸。使用核酸，例如，寡核苷酸的治疗方法，已经被详细研究。这些方法包括小干扰RNA(siRNA)以及对过表达的miRNA的反义序列(antisense)或者疾病中被降低的miRNA的miRNA模拟物。普遍认为，治疗性寡核苷酸的递送为这些剂的临床开发中的主要瓶颈。寡核苷酸在循环中本质上(inheren)不稳定。由于寡核苷酸的尺寸和电荷，在脂质转染剂不存在的情况下它们很难穿透细胞膜。虽然脂质纳米颗粒为当前用于寡核苷酸递送的标准方法，它们具有某些限制。包含合成成分的脂质纳米颗粒将在体内分解产生细胞毒性或免疫原性活性。例如，显示脂质纳米颗粒产生多种毒性，包括促炎性反应和toll样受体4的活化(Kedmi R,等Biomaterials.2010 31:6867-75)。所公开的组合物提供了用于递送治疗性核酸的优良方法。
在一些实施方案中，治疗性核酸为通常不与外来体缔合的异源多核苷酸。因此，在一些实施方案中，治疗性核酸通常不与外来体缔合。治疗性核酸可以是单链的或双链的。治疗性核酸序列的非限制性实例包括siRNA、dsRNA、dsDNA、shRNA、mRNA、微小RNA、antagomir、反义序列、适配体和dsRNA/DNA杂合体。在一些情况下，剂为在过客链的嘌呤碱基上包含2'-氟化物修饰的合成siRNA。
可以基于对预期待递送到的细胞的期望作用和该作用藉以被实现的机制选择治疗性核酸。例如，治疗性核酸可以用于基因疗法，例如以为了在细胞或细胞组中表达期望的基因。此类核酸通常呈编码所期望的基因的质粒DNA或病毒载体的形式，并且被可操作地连接至适当的调节序列，诸如启动子、增强子等，使得质粒DNA在已经被递送至待治疗细胞后被表达。对基因疗法敏感的疾病的实例包括血友病B(因子IX)、囊性纤维化(CTFR)和脊髓性肌萎缩(SMN-1)。
治疗性核酸也可以用于例如免疫中以表达期望针对其产生免疫应答的一种或更多种抗原。因此，治疗性核酸可以编码期望针对其产生免疫应答的一种或更多种抗原，包括但不限于肿瘤抗原、来自病原体诸如病毒、细菌或真菌病原体的抗原。
治疗性核酸也可以用于基因沉默。此类基因沉默可以用于治疗以关闭异常基因表达或在动物模型研究中产生单个或更多个基因敲除。治疗性核酸分子可以充当靶分子所具有的特定活性的效应物、抑制剂(inhibitor)、调控物和刺激物，或者治疗性核酸分子可以具有独立于任何其他分子的从头活性。
治疗性核酸分子可以与任何大分子诸如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链相互作用。通常基于靶分子与治疗性核酸分子之间的序列同源性将治疗性核酸设计为与其他核酸相互作用。在其他情况下，治疗性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于治疗性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许特异性识别发生的三级结构的形成。
反义分子被设计为通过典型或非典型碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用被设计为通过，例如，RNAseH介导的RNA-DNA杂合体降解来促进靶分子的破坏。可选地，反义分子被设计为阻断通常会发生在靶分子上的加工功能，诸如转录或复制。可以基于靶分子的序列设计反义分子。存在用于通过找到所存在的靶分子的最易接近区域来优化反义效率的许多方法。
适配体为与靶分子相互作用的分子，优选地以特定的方式相互作用的分子。通常，适配体为长度范围从15-50个碱基的小核酸，其折叠为定义的二级和三级结构，诸如茎环或G四集体(G-quartets)。适配体可以结合小分子，诸如ATP(美国专利第5,631,146号)和茶碱(美国专利第5,580,737号)，以及大分子诸如逆转录酶(美国专利第5,786,462号)和凝血酶(美国专利第5,543,293号)。适配体可以以少于10-12M的Ka与靶分子非常紧密地结合。例如，已经分离了在靶分子和与该分子仅在单个位置上有区别的另一个分子之间的结合亲和力方面具有大于10,000倍的差异的适配体(美国专利第5,543,293号)。优选的是，适配体与靶分子具有比3/4与背景结合分子低至少10倍、100倍、1000倍、10,000倍、或100,000倍的Ka。当例如比较多肽时，背景分子是不同的多肽是优选的。如何制备并且使用适配体结合多种不同的靶分子的代表性实例可以见于美国专利第5,476,766号、5,503,978号、5,631,146号、5,731,424号、5,780,228号、5,792,613号、5,795,721号、5,846,713号、5,858,660号、5,861,254号、5,864,026号、5,869,641号、5,958,691号、6,001,988号、6,011,020号、6,013,443号、6,020,130号、6,028,186号、6,030,776号、和6,051,698号。
基因表达也可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异性的方式有效沉默。最初随着双链RNA(dsRNA)的添加观察到该沉默(FireA,等(1998)Nature,391:806-11；Napoli,C,等(1990)Plant Cell 2:279-89；Hannon,G.J.(2002)Nature,418:244-51)。在dsRNA进入细胞后，它被RNA酶III样酶Dicer裂解为长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA)，其在3'末端上包含2个核苷酸突出端(Elbashir,S.M.,等(2001)Genes Dev.,15:188-200；Bernstein,E.,等(2001)Nature,409:363-6；Hammond,S.M.等(2000)Nature,404:293-6)。在ATP依赖性步骤中，siRNA整合到通常被称为RNAi诱导沉默复合物(RISC)的多亚基蛋白复合物中，其将siRNA引导至靶RNA序列(Nykanen,A.,等(2001)Cell,107:309-21)。在某一时刻，siRNA双链体解开，并且似乎反义链仍然与RISC结合并且通过内切核酸酶和外切核酸酶的组合指导互补mRNA序列的降解(Martinez,J.,等(2002)Cell,110:563-74)。然而，iRNA或siRNA的作用或者其使用不限于任何类型的机制。
短干扰RNA(siRNA)为一种双链RNA，其可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而减少甚至抑制基因表达。在一个实例中，siRNA触发siRNA与靶RNA两者之间的序列同一性区域内的同源RNA分子(诸如mRNA)的特异性降解。例如，WO 02/44321公开了当与3'突出端末端碱基配对时能够对靶mRNA进行序列特异性降解的siRNA，关于制备这些siRNA的方法通过引用并入本文。序列特异性基因沉默可以使用模拟由酶dicer产生的siRNA的合成的短双链RNA在哺乳动物细胞中实现(Elbashir,S.M.等(2001)Nature,411:494 498)(Ui-Tei,K.,等(2000)FEBS Lett 479:79-82)。siRNA可以是化学或体外合成的，或者可以是在细胞内被加工为siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)的结果。合成siRNA通常使用算法和常规DNA/RNA合成仪来设计。供应商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、Glen Research(Sterling,Virginia)、MWB Biotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colorado)、和Qiagen(Vento,TheNetherlands)。siRNA也可以使用试剂盒诸如Ambion的siRNA构建试剂盒在体外合成。
从载体产生siRNA通常通过短发夹RNA(shRNA)的转录来完成。用于产生包含shRNA的载体的试剂盒是可用的，诸如，例如，Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。本文公开了如以上描述基于本文公开的炎症介质的序列设计的任何shRNA。
microRNA(miRNA)为小的调节性非编码RNA。miRNA基因通常位于编码基因或非编码基因的内含子中，并且也在外显子和基因间区域中被鉴定出(Kim VN,等TrendsGenet.2006 22:165-73)。内源miRNA通过RNA聚合酶II转录为长的初级转录物或pri-miRNA。通过核糖核蛋白复合物Drosha/DGCR8pri-miRNA被加工为～75nt的pre-miRNA。pri-miRNA和pre-miRNA两者均包含特征性发夹结构。在通过输出蛋白5进行细胞质转运之后，将pre-miRNA装载到去除发夹环的Dicer复合物中。将双链miRNA装载到miRISC复合物中，并且去除具有较差5’末端稳定性的链(SchwarzDS,等Cell.2003 115:199-208)。然后复合物扫描信使RNA以定位miRNA的靶。成熟miRNA的结合(经由7nt 5’种子序列的完全杂交)通常发生在mRNA的3'UTR中并且导致翻译抑制。迄今，在研究的所有癌症中均观察到改变的miRNA表达。根据miRNA、其表达水平及癌症类型，miRNA可能是致癌的或肿瘤抑制的。在过去的10年中，关于miRNA在HCC中的作用已经认识了很多，在(Braconi C,等Seminars inoncology.2011 38:752-63)中综述。与大多数癌症一样，某些miRNA在患有HCC的患者的肿瘤中表达增加，包括miR-221(Budhu A,等Hepatology.2008 47:897-907；Gramantieri L,等Cancer Res.2007 67:6092-9；Jiang J,等Clin Cancer Res.200814:419-27；Pineau P,等Proc Natl Acad Sci U S A.2009；Wang Y,等J Biol Chem.2008 283:13205-15)、miR-21(Budhu A,等Hepatology.200847:897-907；Jiang J,等Clin Cancer Res.2008 14:419-27；Meng F,等Gastroenterology.2007 133:647-58；Pineau P,等Proc Natl Acad Sci US A.2009)、和miR-181b(Ji J,等Hepatology.2009 50:472-80；Wang B,等Oncogene.201029(12):1787-97)。原发性HCC肿瘤具有降低的其他miRNA的表达，其他miRNA诸如miR-199a-3p(miR-199a*)(Jiang J,等Clin Cancer Res.2008 14:419-27；Murakami Y,等Oncogene.2006 25:2537-45；Wang Y,等J Biol Chem.2008 283:13205-15)、miR-122(Bai,等J Biol Chem.2009284:32015-27；Coulouarn C,等Oncogene.2009 28:3526-36；FornariF,等Cancer Res.2009 69:5761-7；Kutay H,等J Cell Biochem.2006 99:671-8)和miR-26a(Chen L,等Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy.2011 19:1521-8)。
Antagomirs为用于沉默内源微小RNA的一类特定的miRNA拮抗剂。例如，定制设计的Dharmacon meridianTM微小RNA发夹抑制剂从Thermo Scientific商购可得。这些抑制剂包括化学修饰和二级结构基序。具体地，在反向补体核心周围掺入高度结构化的双链侧翼区域显著增加抑制剂功能并且允许在亚纳摩尔浓度的多miRNA抑制。设想antagomir设计中的其他此类改进用于在所公开的方法中使用。
在一些情况下，治疗剂为抗癌药物。抗癌药物或抗赘生物药物的实例包括，但不限于以下：阿西维辛(Acivicin)；阿柔比星(Aclarubicin)；盐酸阿考达唑(AcodazoleHydrochloride)；AcrQnine；阿多来新(Adozelesin)；阿地白介素(Aldesleukin)；六甲蜜胺(Altretamine)；(安波霉素(Ambomycin)；乙酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)；氨鲁米特(Aminoglutethimide)；安吖啶(Amsacrine)；阿那曲唑(Anastrozole)；氨茴霉素(Anthramycin)；天冬酰胺酶(Asparaginase)；曲林菌素(Asperlin)；阿扎胞苷(Azacitidine)；阿扎替派(Azetepa)；阿佐霉素(Azotomycin)；巴马司他(Batimastat)；苯佐替派(Benzodepa)；比卡鲁胺(Bicalutamide)；盐酸必桑郡(BisantreneHydrochloride)；双奈法德(Bisnafide Dimesylate)；比折来新(Bizelesin)；硫酸博莱霉素(Bleomycin Sulfate)；布喹那钠(Brequinar Sodium)；溴匹立明(Bropirimine)；白消安(Busulfan)；放线菌素(Cactinomycin)；卡鲁睾酮(Calusterone)；卡醋胺(Caracemide)；卡贝替姆(Carbetimer)；卡铂(Carboplatin)；卡莫司汀(Carmustine)；盐酸卡米诺霉素(Carubicin Hydrochloride)；卡折来新(Carzelesin)；西地芬戈(Cedefingol)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；西罗霉素(Cirolemycin)；顺铂(Cisplatin)；克拉屈滨(Cladribine)；甲磺酸克雷斯托(Crisnatol Mesylate)；环磷酰胺(Cyclophosphamide)；阿糖孢苷(Cytarabine)；达卡巴嗪(Dacarbazine)；更生霉素(Dactinomycin)；盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)；地西他滨(Decitabine)；右奥马铂(Dexormaplatin)；地扎呱宁(Dezaguanine)；甲磺酸地扎呱宁(Dezaguanine Mesylate)；地吖醌(Diaziquone)；多西他赛(Docetaxel)；多柔比星(Doxorubicin)；盐酸多柔比星(DoxorubicinHydrochloride)；屈洛昔芬(Droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬(Droloxifene Citrate)；丙酸屈他雄酮(Dromostanolone Propionate)；达佐霉素(Duazomycin)；依达曲沙(Edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(Eflomithine Hydrochloride)；依沙芦星(Elsamitrucin)；恩洛铂(Enloplatin)；恩普氨酯(Enpromate)；依匹哌啶(Epipropidine)；盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)；厄布洛唑(Erbulozole)；盐酸依索比星(Esorubicin Hydrochloride)；雌莫司汀(Estramustine)；雌莫司汀磷酸钠(EstramustinePhosphate Sodium)；依他硝唑(Etanidazole)；乙碘油I131(Ethiodized Oil I 131)；依托泊苷(Etoposide)；磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)；艾托卜宁(Etoprine)；盐酸法屈唑(Fadrozole Hydrochloride)；法扎拉滨(Fazarabine)；维甲酰酚胺(Fenretinide)；氟尿苷(Floxuridine)；磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)；氟尿嘧啶(Fluorouracil)；氟西他滨(Flurocitabine)；磷喹酮(Fosquidone)；福司曲星钠(Fostriecin Sodium)；吉西他滨(Gemcitabine)；盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)；Gold Au 198；羟基脲(Hydroxyurea)；盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride)；异环磷酰胺(Ifosfamide)；llmofosine；干扰素α-2a(Interferon Alfa-2a)；干扰素α-2b(Interferon Alfa-2b)；干扰素α-n1(Interferon Alfa-n1)；干扰素α-n3(Interferon Alfa-n3)；干扰素β-I a(Interferon Beta-I a)；干扰素β-I b(Interferon Gamma-I b)；异丙铂(Iproplatin)；盐酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride)；醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)；来曲唑(Letrozole)；乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)；盐酸利阿唑(LiarozoleHydrochloride)；洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)；环己亚硝脲(Lomustine)；盐酸洛索蒽醌(Losoxantrone Hydrochloride)；马索罗酚(Masoprocol)；美登素(Maytansine)；盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)；乙酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)；乙酸美伦孕酮(Melengestrol Acetate)；美法仑(Melphalan)；美诺立尔(Menogaril)；巯嘌呤(Mercaptopurine)；甲氨蝶呤(Methotrexate)；甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)；氯苯氨啶(Metoprine)；美妥替哌(Meturedepa)；米丁度胺(Mitindomide)；米托卡星(Mitocarcin)；丝裂红素(Mitocromin)；米托洁林(Mitogillin)；米托马星(Mitomalcin)；丝裂霉素(Mitomycin)；丝裂帕菌素(Mitosper)；米托坦(Mitotane)；盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)；霉酚酸(MycophenolicAcid)；诺考达唑(Nocodazole)；诺加霉素(Nogalamycin)；奥马铂(Ormaplatin)；奥昔舒仑(Oxisuran)；紫杉醇(Paclitaxel)；培门冬酶(Pegaspargase)；培利霉素(Peliomycin)；戊氮芥(Pentamustine)；硫酸培洛霉素(Peplomycin Sulfate)；培磷酰胺(Perfosfamide)；哌泊溴烷(Pipobroman)；哌泊舒凡(Piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(PiroxantroneHydrochloride)；普卡霉素(Plicamycin)；普洛美坦(Plomestane)；卟吩姆钠(PorfimerSodium)；泊非霉素(Porfiromycin)；泼尼莫司汀(Prednimustine)；盐酸甲基苄肼(Procarbazine Hydrochloride)；嘌呤霉素(Puromycin)；盐酸嘌呤霉素(PuromycinHydrochloride)；吡唑呋喃菌素(Pyrazofurin)；利波腺苷(Riboprine)；罗谷亚胺(Rogletimide)；沙芬戈(Safmgol)；盐酸沙芬戈(Safingol Hydrochloride)；司莫司汀(Semustine)；辛曲秦(Simtrazene)；司泊索非钠(Sparfosate Sodium)；司帕霉素(Sparsomycin)；盐酸锗螺胺(Spirogermanium Hydrochloride)；螺莫司汀(Spiromustine)；螺铂(Spiroplatin)；链黑菌素(Streptonigrin)；链脲霉素(Streptozocin)；氯化锶Sr-89(Strontium Chloride Sr89)；磺氯苯脲(Sulofenur)；他利霉素(Talisomycin)；紫杉烷(Taxane)；紫杉烷(Taxoid)；替康兰钠(Tecogalan Sodium)；喃氟啶(Tegafur)；盐酸替洛蒽醌(Teloxantrone Hydrochloride)；替莫泊芬(Temoporfin)；替尼泊苷(Teniposide)；替罗昔隆(Teroxirone)；睾内酯(Testolactone)；硫咪嘌呤(Thiamiprine)；硫鸟嘌呤(Thioguanine)；塞替派(Thiotepa)；噻唑呋啉(Tiazofurin)；替拉扎明(Tirapazamine)；盐酸拓扑替康(Topotecan Hydrochloride)；柠檬酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)；乙酸曲托龙(Trestolone Acetate)；磷酸曲西立滨(TriciribinePhosphate)；三甲曲沙(Trimetrexate)；葡萄糖醛酸三甲曲沙(TrimetrexateGlucuronate)；曲普瑞林(Triptorelin)；盐酸妥布氯唑(Tubulozole Hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)；乌瑞替派(Uredepa)；伐普肽(Vapreotide)；维替泊芬(Verteporfin)；硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)；硫酸长春新碱(VincristineSulfate)；长春地辛(Vindesine)；硫酸长春地辛(Vindesine Sulfate)；硫酸长春匹定(Vinepidine Sulfate)；硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)；硫酸长春罗新(Vinleurosine Sulfate)；酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)；硫酸长春罗定(Vinrosidine Sulfate)；硫酸长春利定(Vinzolidine Sulfate)；伏罗唑(Vorozole)；折尼铂(Zeniplatin)；净司他丁(Zinostatin)；盐酸左柔比星(Zorubicin Hydrochloride)。
其他抗赘生物化合物包括：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、酰基富烯(acylfulvene)、阿的培诺(adecypenol)、阿多来新(adozelesin)、阿地介白素(aldesleukin)；ALL-TK拮抗剂(ALL-TKantagonists)；六甲蜜胺；氨莫司汀(ambamustine)；艾美多(amidox)；氨磷汀(amifostine)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑；穿心莲内酯(andrographolide)；血管生成抑制剂(angiogenesisinhibitors)；拮抗剂D(antagonistD)；拮抗剂G(antagonist G)；安雷利克斯(antarelix)；抗背部化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogeneticprotein-1)；抗雄激素(antiandrogen)；前列腺癌(prostatic carcinoma)；抗雌激素(antiestrogen)；抗新普拉通(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)、凋亡基因调控物(apoptosis gene modulator)、凋亡调节物(apoptosis regulator)、脱嘌呤核酸(apurinic acid)、ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶(arginine deaminase)；奥沙那宁(asulacrine)；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀(atrimustine)；阿新司坦汀1(axinastatin1)；阿新司坦汀2(axinastatin2)；阿新司坦汀3(axinastatin3)；阿扎司琼(azasetron)；阿扎托新(azatoxin)；重氮酪氨酸(azatyrosine)；巴卡亭III衍生物(baccatin III derivatives)；班兰诺(balanol)；巴马司他(batimastat)；BCR/ABL拮抗剂(BCR/ABL antagonist)；苯并二氢卟吩(benzochlorin)；苯甲酰基星形孢菌素(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物(betalactam derivative)；β-阿立辛(beta-alethine)；β可来霉素B(betaclamycinB)；桦木酸(betulinic acid)；bFGF抑制剂(bFGFinhibitor)；比卡鲁胺(bicalutamide)；比生群(bisantrene)；双氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德(bisnafide)；bistratene A；比折来新(bizelesin)；比锐来特(breflate)；溴匹立明(bropirimine)；布多替钛(budotitane)；丁硫氨酸磺酰亚胺(buthionine sulfoximine)；卡泊三醇(calcipotriol)；钙磷酸蛋白C(calphostin C)；喜树碱衍生物(camptothecinderivatives)；丝雀痘病毒IL-2(canarypox IL-2)；卡培他滨(capecitabine)；甲酰胺-氨基-三唑(carboxamide-amino-triazole)；羧酰胺基三唑(carboxyamidotriazole)；CaRestM3；CARN700；软骨源性抑制剂(cartilagederivedinhibitor)；卡折来新(carzelesin)；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)(caseinkinase inhibitors(ICOS))；栗树精胺(castanospermine)；杀菌肽B(cecropin B)；西曲瑞克(cetrorelix)；二氢卟酚(chlorin)；氯喹喏啉磺酰胺(chloroquinoxaline sulfonamide)、西卡前列素(cicaprost)；顺式卟啉(cis-porphyrin)；克拉屈滨(cladribine)；氯米芬类似物(clomifene analogue)；克霉唑(clotrimazole)；克立霉素A(collismycin A)；克立霉素B(collismycin B)；康柏斯达汀A4(combretastatin A4)；康柏斯达汀类似物(combretastatin analogue)；康纳京尼(conagenin)；卡那贝西汀816(crambescidin 816)；克里斯奈托(crisnatol)；念珠藻环肽8(cryptophycin 8)；念珠藻环肽A衍生物(cryptophycinA derivative)；卡拉新A(curacinA)；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinones)；环普兰姆(cycloplatam)；西匹霉素(cypemycin)；十八烷基磷酸阿糖胞苷(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子(cytolyticfactor)；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨(decitabine)；去氢膜海鞘素B(dehydrodidemnin B)；地洛瑞林(deslorelin)；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生(dexrazoxane)；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌(diaziquone)；膜海鞘素B(didemninB)；地多西(didox)；二乙基降精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞嘧啶核苷(dihydro-5-azacytidine)；9-二氢紫杉醇(dihydrotaxol，9-)；二恶霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀(diphenylspiromustine)；多可沙诺(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；脱氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；多卡霉素SA(duocannycin SA)；依布硒啉(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星(epirubicin)；爱普列特(epristeride)；雌莫司汀类似物(estramustine analogue)；雌激素激动剂(estrogen agonist)；雌激素拮抗剂(estrogen antagonist)；依他硝唑(etanidazole)；磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)；依西美坦(exemestane)；法屈唑(fadrozole)；法扎拉滨(fazarabine)；维甲酰酚胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；非那雄安(fmasteride)；夫拉平度(flavopiridol)；夫来折司汀(flezelastine)；夫斯特隆(fluasterone)；氟达拉滨(fludarabine)；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克(forfenimex)；福美司坦(formestane)；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀(fotemustine)；钆德卟啉(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓(gallium nitrate)；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；明胶酶抑制剂(gelatinasein hibitor)；吉西他滨(gemcitabine)；谷胱甘肽抑制剂(glutathione inhibitor)；和普苏姆(hepsulfam)；和瑞古林(heregulin)；六亚甲基双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊达比星(idarubicin)；艾多昔芬(idoxifene)；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新(ilmofosine)；伊洛马司他(ilomastat)；咪唑吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特(imiquimod)；免疫刺激剂肽(immunostimulantpeptide)；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂(insulin-likegrowthfactor-1receptorinhibitor)；干扰素激动剂(interferon agonist)；干扰素；白细胞介素；碘苄胍(iobenguane)；碘多柔比星(iododoxorubicin)；4-甘薯醇(ipomeanol，4-)；伊立替康(irinotecan)；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；异苯胍唑(isobengazole)；异质哈立康定B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼(itasetron)；杰斯普拉克立德(jasplakinolide)；卡哈拉立得F(kahalalide F)；三乙酸层状素-N(lamellarin-Ntriacetate)；兰乐肽(lanreotide)；leinamycin；来格司亭(lenograstim)；硫酸香菇多糖(lentinan sulfate)；leptolstatin；来曲唑(letrozole)；白血病抑制因子(leukemiainhibiting factor)；白血球α干扰素(leukocyte alpha interferon)；亮丙立德+雌激素+孕酮(leuprolide+estrogen+progesterone)；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑(liarozole)；直链聚胺类似物(linear polyamine analogue)；亲脂性二糖肽(lipophilic disaccharide peptide)；亲脂性铂化合物(lipophilic platinumcompound)；立索克林酰胺7(lissoclinamide 7)；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索(lometrexol)；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌(losoxantrone)；洛伐他汀(lovastatin)；洛索立宾(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；镥德卟啉(lutetium texaphyrin)；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽(lyticpeptides)；美坦新(maitansine)；麦洛坦汀A(mannostatin A)；马立马斯他(marimastat)；马索罗酚(masoprocol)；马司非(maspin)；基质溶素抑制剂(matrilysin inhibitors)；基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitors)；美诺立尔(menogaril)；麦尔巴隆(merbarone)；美替瑞林(meterelin)；甲硫氨酸酶(methioninase)；甲氧氯普胺(metoclopramide)；MIF抑制剂(MIF inhibitor)；美服培酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；米立司亭(mirimostim)；错配双链RNA；米托胍腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇(mitolactol)；丝裂霉素类似物(mitomycin analogue)；米托萘胺(mitonafide)；刺尾鱼毒素纤维母细胞生长因子-皂草素(mitotoxin fibroblast growth factor-saporin)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫法罗汀(mofarotene)；莫拉司亭(molgramostim)；单克隆抗体；人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin)；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁sk(monophosphoryl lipid A+myobacterium cell wall sk)；莫哌达醇(mopidamol)；多重药物耐受性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制因子1的疗法；芥末抗癌剂(mustardanticancer agent)；美卡普罗B(mycaperoxide B)；分枝杆菌(mycobacterial)细胞壁提取物；美瑞泡仁(myriaporone)；N-乙酰基地那林(N-acetyldinaline)；N-取代苯甲酰胺(N-substituted benzamide)；那法瑞林(nafarelin)；纳格瑞替(nagrestip)；纳洛酮(naloxone)+戊唑星(pentazocine)；纳普维(napavin)；萘特非(naphterpin)；那托司亭(nartograstim)；奈达铂(nedaplatin)；奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronicacid)；中性内肽酶(neutral endopeptidase)；尼鲁米特(nilutamide)；丽沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调物物；氮氧化物抗氧化剂；里挫林(nitrullyn)；O6-苯甲基鸟嘌呤(O6-benzylguanine)；奥曲肽(octreotide)；奥克恩(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼(ondansetron)；昂丹司琼；奥拉新(oracin)；口服细胞因子诱导物；奥马铂(ormaplatin)；奥沙特隆(osaterone)；奥赛力铂(oxaliplatin)；厄诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕诺明(palauamine)；十六酰基根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸(pamidronic acid)；人参三醇(panaxytriol)；帕诺米芬(panomifene)；帕拉贝新(parabactin)；帕折普汀(pazelliptine)；培门冬酶(pegaspargase)；皮地新(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠(pentosan polysulfate sodium)；喷司他汀(pentostatin)；喷唑(pentrozole)；潘氟隆(perflubron)；培磷酰胺(perfosfamide)；紫苏子醇(perillyl alcohol)；苯连氮霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；皮西板尼(picibanil)；盐酸毛果芸香碱(pilocarpinehydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；普来司汀A(placetinA)；普来司汀B(placetin B)；血纤维蛋白溶酶原活化物抑制剂；铂络合物(platinumcomplex)；铂化合物(platinum compound)；铂-三胺络合物(platinum-triaminecomplex)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；丙基双吖啶酮(propylbis-acridone)；前列腺素J2(prostaglandin J2)；蛋白酶抑制剂；基于蛋白A的免疫调控物；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻(microalgal)；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(protein tyrosine phosphatase inhibitor)；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素(purpurins)；吡唑并吖啶(pyrazoloacridine)；吡哆醛化血色素聚氧乙烯结合物(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate)；raf拮抗剂(rafantagonist)；雷替曲赛(raltitrexed)；雷莫司琼(ramosetron)；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替立汀(retelliptine demethylated)；依替膦酸铼Re186(rhenium Re 186etidronate)；根霉素(rhizoxin)；核酶；RII视黄酰胺(RII retinamide)；罗谷亚胺(rogletimide)；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽(romurtide)；罗喹美克(roquinimex)；鲁滨吉隆B1(rubiginone B1)；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈(Safmgol)；圣特平(saintopin)；SarCNU；沙卡弗托A(sarcophytol A)；沙格司亭(sargramostim)；Sdi1模拟物(Sdi1mimetics)；司莫司汀(semustine)；衰老源性抑制剂1(senescence derived inhibitor 1)；有义寡核苷酸(sense oligonucleotide)；信号转导抑制剂；信号转导调控物；单链抗原结合蛋白；西佐糖(sizofiran)；索布佐生(sobuzoxane)；硼卡钠(sodium borocaptate)；苯基乙酸钠(sodium phenylacetate)；索佛罗(solverol)；生长调节肽(somatomedin)结合蛋白；索纳明(sonermin)；斯帕福斯酸(sparfosic acid)；斯皮卡霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀(spiromustine)；斯兰罗皮汀(splenopentin)；海绵抑制素1(spongistatin 1)；角鲨胺(squalamine)；干细胞抑制剂(stem cellinhibitor)；干细胞分裂抑制剂；斯替皮米德(stipiamide)；基质溶素(stromelysin)抑制剂；索非罗新(sulfinosine)；超活性激脉肠肽拮抗剂(superactivevasoactive intestinal peptide antagonist)；磺化偏端霉素(suradista)；苏拉明(suramin)；苦马豆素(swainsonine)；合成糖胺(synthetic glycosaminoglycan)；他莫司汀(tallimustine)；甲碘化他莫昔芬(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀(tauromustine)；他扎罗汀(tazarotene)；替康兰钠(tecogalan sodium)；喃氟啶(tegafur)；碲哌喃鎓(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬(temoporfin)；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊苷(teniposide)；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；替唑明(tetrazomine)；噻立拉斯汀(thaliblastine)；沙利度胺(thalidomide)；噻考瑞林(thiocoraline)；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；促胸腺生成素受体激动剂(thymopoietin receptor agonist)；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone)；锡乙基初卟啉(tinethyl etiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；二氯二茂钛(titanocene dichloride)；拓扑替康(topotecan)；托普升替(topsentin)；托瑞米芬(toremifene)；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸(tretinoin)；三乙酰基尿苷(triacetyluridine)；曲西立滨(triciribine)；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司琼(tropisetron)；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖窦源性生长抑制因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor)；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽(vapreotide)、凡瑞林B(variolin B)、载体系统(vectorsystem)、红细胞基因疗法；维拉雷琐(velaresol)；凡拉明(veramine)；凡啶(verdins)；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；维萨汀(vinxaltine)；维他欣(vitaxin)；伏罗唑(vorozole)；扎诺特隆(zanoterone)；折尼铂(zeniplatin)；亚苄维C(zilascorb)；净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)。
如本文使用的，辐射敏化剂使得癌细胞更可能受损。辐射敏化剂增强了癌细胞和/或肿瘤对电离辐射的敏感性，从而增加了放射疗法的效力。辐射敏化剂的实例包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、己酮可可碱(pentoxifylline)和长春瑞滨。
外来体由许多不同类型的细胞产生，所述许多不同类型的细胞包括免疫细胞诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞(DC)和大部分细胞。外来体还由例如，神经胶质瘤、血小板、网织红细胞、神经元、肠上皮细胞和肿瘤细胞产生。用于在公开的组合物和方法中使用的外来体可以源自任何合适的细胞，包括以上鉴定的细胞。外来体也已经从生理体液，诸如血浆、尿液、羊水和恶性积液中分离出来。用于大量生产的合适外来体产生细胞的非限制性实例包括树突状细胞(例如，未成熟的树突状细胞)、人类胚肾293(HEK)细胞、293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人类ESC-来源的间充质干细胞。
在一些实施方案中，外来体源自DC，诸如未成熟的DC。由未成熟的DC产生的外来体不表达MHC-II、MHC-I或CD86。因此，这些外来体不以显著程度刺激幼稚T细胞(na'ive Tcells)，并且不能在混合淋巴细胞反应中诱导应答。因此，由未成熟的树突状细胞产生的外来体可以用于在递送遗传物质中使用。
外来体也可以从任何自体患者来源的、异源单倍型匹配的或异源干细胞获得，以减少或避免外来体被递送至的患者中免疫应答的产生。任何外来体产生细胞均可以用于该目的。
可以通过任何合适的方法从培养基中收集由细胞产生的外来体。通常可以通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液制备外来体制品。例如，可以通过差速离心(即低速(<20000g)离心以沉淀较大的颗粒，随后是高速(>100000g)离心以沉淀外来体)、用适当的过滤器(例如，0.22μm过滤器)尺寸过滤、梯度超速离心(例如，用蔗糖梯度)或这些方法的组合来制备外来体。
公开的外来体可以通过任何合适的手段施用至受试者。至人类或动物受试者的施用可以选自肠胃外、肌内、脑内、血管内、皮下或经皮施用。通常，递送方法为通过注射。优选地注射为肌内或血管内(例如静脉内)。医师将能够确定每一个特定患者所需的施用途径。
外来体优选地作为组合物递送。组合物可以被配制用于肠胃外、肌内、脑内、血管内(包括静脉内)、皮下或透皮施用。用于肠胃外施用的组合物可以包括无菌水性溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。外来体可以以药物组合物配制，除了外来体以外，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂和其他药学上可接受的载体或赋形剂等。
方法
还公开了一种将外来体靶向细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分，其中所述靶向部分将外来体导向感兴趣的细胞。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞，诸如癌细胞。在一些实施方案中，RNA纳米颗粒还包含功能部分，诸如治疗部分或诊断部分。
还公开了一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括将在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体施用至所述受试者，其中纳米颗粒包含至少一个靶向部分，并且其中所述外来体还包含功能部分，其中所述功能部分部分能够治疗受试者中的疾病。例如，在一些实施方案中，疾病为感染。在一些实施方案中，疾病为癌症。
还公开了一种使细胞成像的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分、至少一个诊断部分。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞。
施用
肠胃外施用通常以注射为特征，诸如皮下、肌内或静脉内。用于肠胃外施用的制品包括即用型注射用无菌溶液、无菌干燥可溶性产品诸如冻干粉末(使用之前易于与溶剂组合，包括皮下片剂)、即用型注射用无菌悬浮液、使用之前易于与媒介物组合的无菌干燥不溶性产品及无菌乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
如果静脉内施用，合适的载体包括，生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及包含增稠剂和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。肠胃外制品中使用的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、多价螯合剂(sequestering agents)或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物起源的不挥发性油，棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。必须将抗细菌或抗真菌浓度的抗微生物剂添加至在多于一个(multiple)剂量容器中包装的肠胃外制品中，所述抗微生物剂包括酚类或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。
抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procainehydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的多价螯合剂或螯合剂包括EDTA。药学上的载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。调节药学上的活性化合物的浓度，使得注射提供有效量以产生所期望的药理学作用。如本领域已知的那样，精确剂量取决于患者或动物的年龄、重量和状况。
单位剂量肠胃外制品包装在安瓿、小瓶或具有针头的注射器中。如本领域已知和实践的那样，所有肠胃外施用制剂均应该是无菌的。
施用治疗有效量的组合物。剂量可以根据多种参数确定，特别是根据待治疗的患者的状况的严重程度、年龄和重量；施用途径；和所需的方案确定。医师将能够确定用于任何特定患者的所需施用途径和剂量。最佳剂量可以根据单独构建体的相对效力而变化，并且可以通常基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50来评价。通常，剂量为从0.01mg/kg至100mg/kg体重。根据具体构建体的效力、待治疗受试者的年龄、重量和状况、疾病的严重程度以及施用的频率和途径，典型的每天剂量为从约0.1mg/kg至50mg/kg，优选地从约0.1mg/kg至10mg/kg体重。根据施用是通过肌内注射还是全身(静脉内或皮下)注射，可以施用不同剂量的构建体。
优选地，单次肌内注射的剂量在约5μg至20μg的范围内。优选地，单次或多于一次全身注射的剂量在10mg/kg至100mg/kg体重的范围内。
由于构建体清除(以及任何靶向的分子的分解)，患者可能必须重复治疗，例如每天、每周、每月或每年一次或更多次。本领域普通技术人员可以基于测量的构建体在体液或组织中的停留时间和浓度容易地评价用于给药的重复频率。在成功治疗之后，让患者经历维持疗法可以是可期望的，在该维持疗法中构建体以维持剂量施用，范围从0.01mg/kg至100mg体重，每天一次或更多次至每20年一次。
在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含(i)一种或更多种治疗剂，(ii)一种或更多种抗癌剂，(iii)一种或更多种化学治疗性药物，和/或(iv)一种或更多种辐射敏化剂。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种抗癌剂和一种或更多种化学治疗性药物。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种抗癌剂和一种或更多种辐射敏化剂。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种化学治疗剂和一种或更多种辐射敏化剂。
在一个方面，公开的治疗性组合物可以全身施用至受试者。在一个方面，受试者可以是哺乳动物。在一个方面，哺乳动物可以是灵长类动物。在一个方面，哺乳动物可以是人类。在一个方面，人类可以是患者。
在一个方面，公开的治疗性组合物可以重复施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以至少两次施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以两次或更多次施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以以常规间隔或规律间隔施用至受试者。例如，在一个方面，公开的治疗性组合物可以每天一次、或每天两次、或者每天三次或更多次施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以每天、或每周一次、或每周两次、或者每周三次或更多次等施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以每周、或每隔一周、或每三周、或每四周等施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以每月、或每隔一个月、或每三个月、或每四个月等施用至受试者。在一个方面，公开的组合物的重复施用在预定的或明确的持续时间内发生。在一个方面，公开的组合物的重复施用在不确定的时间段内发生。
在一个方面，在公开的治疗性组合物施用之后，使细胞对治疗敏感。在一个方面，在公开的治疗性组合物施用之后，可以使受试者对治疗敏感。在一个方面，可以根据如本领域已知的用于特定治疗的一种或更多种方法来测量对治疗(诸如治疗性治疗)的增加的敏感性或降低的敏感性。在一个方面，测量对治疗的敏感性的方法包括，但不限于，细胞增殖测定和细胞死亡测定。在一个方面，细胞或受试者对治疗的敏感性可以通过将在施用公开的治疗性组合物之后的细胞或受试者的敏感性与尚未施用公开的治疗性组合物的细胞或受试者的敏感性进行比较来测量或确定。
例如，在一个方面，在施用公开的治疗性组合物之后，细胞可以比尚未施用公开的治疗性组合物的细胞对治疗敏感2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、或更大。在一个方面，在施用公开的治疗性组合物之后，细胞可以比尚未施用公开的治疗性组合物的细胞对治疗的耐受低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、或更大。细胞或受试者的敏感性或耐受性的确定可以是本领域常规的并且在普通临床医师和/或研究人员的技能范围内。
在一个方面，细胞或受试者对治疗的敏感性或耐受性的确定可以被监测。例如，在一个方面，关于敏感性或耐受性的数据可以被周期性地获得，诸如每周、每隔一周、每月、每隔一个月、每3个月、每6个月、每9个月或每年、每隔一年、每5年、每10年持续受试者(例如，患有癌症和/或异常细胞生长的人类受试者或患者)的生命。在一个方面，关于灵敏性或耐受性的数据可以在多种时间而不是在周期性时间获得。在一个方面，可以基于关于细胞或受试者对治疗的敏感性或耐受性的数据修改受试者的治疗。例如，在一个方面，可以通过改变公开的组合物的剂量、公开的组合物的施用途径、公开的组合物的施用频率等来改变治疗。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供关于如何使用和评价本文要求保护的化合物、组合物、和方法的完整的公开内容和描述并且意图公开的主题的仅仅示例性的，并且不意图限制发明人认为是他们的发明的范围。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在被公开的具体方面做出许多改变，并且仍然获得同类或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。已经做出努力以确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指示，份数是按重量计份数，温度以℃计或处于环境温度，并且压力处于大气压下或临近大气压。
实施例1：
在该实施例中，使用RNA纳米技术方法来重编程天然来源的外来体，以用于将miRNA、siRNA、dsDNA或CRISPR-RNA货物靶向递送至癌细胞(图1)。使用源自噬菌体phi29DNA包装马达pRNA的超稳定3-式连接(3WJ)基序作为用于在外来体表面上展示具有真正的折叠和功能的靶向模块(化学配体或RNA适配体)的稳健多功能支架。靶向模块识别并且结合癌细胞膜上的特定受体并且经由受体介导的胞吞递送其治疗性内容物。靶向配体的密集网络不仅增强癌细胞特异性摄取，而且还使与正常细胞的相互作用最小化，因此降低非特异性细胞融合。在每一个3WJ纳米颗粒中掺入膜锚定结构域的策略确保RNA纳米颗粒被嵌入并因此展示在外来体表面上，但不包封在外来体中。使用体外方法展示非蛋白配体扩大了配体多样性的范围，以成本效益方式便于工业规模生产，并且由于RNA或化学品不诱导宿主抗体而允许重复治疗癌症。重要的是，这种方法保留了外来体用于有效细胞进入的所有有利的内源特性，诸如脂质组成，以及外来体蛋白的膜嵌入式专属家族(membrane embeddedexclusive families)(四次穿膜蛋白、热休克蛋白、溶酶体蛋白和融合蛋白)。
天然来源的外来体为生物相容的。它们由许多不同的细胞定期地释放。特化的脂质和膜蛋白阵列的组合有助于外来体和受体细胞之间的有效融合。重要的是，使用外来体可以消除对困扰治疗领域的内体逃逸策略的需要。
在外来体提取之后掺入RNA纳米颗粒确保外来体的内源组成被保留。体外装饰程序便于工业规模生产。RNA配体的使用进一步扩大了配体多样性的范围，超出了由抗体结合的某些可能性。RNA配体的负电荷使与带负电荷的细胞膜的非特异性结合最小化，因此降低毒性。
本文作为用于配体展示的支架使用的pRNA-3WJ纳米颗粒具有一些有利的属性。它们在尺寸、结构和化学计量上是均匀的；可以大量化学合成，并且以高效率自组装；热力学和化学稳定；无毒；无免疫原性；并且展示有利的生物分布和PK/PD谱。每一个掺入的靶向模块保留其折叠和用于特异性细胞结合和进入体内异种移植物和转移性细胞的独立功能。已经解析了(solved)pRNA-3WJ的晶体结构，这便于RNA纳米颗粒设计(适于在外来体表面上展示具有多种构象的配体)。
外来体可以一次递送多于一种治疗试剂而不是单个试剂。在miRNA或siRNA的情况下，可以同时抑制功能相关的基因。外来体不仅具有作为直接递送方法的临床潜力，而且在递送后，通过外来体介导的向肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞、细胞外基质和免疫细胞的转移可增强治疗的治疗程度。
方法和结果
使用RNA纳米技术构建携带细胞受体结合RNA适配体或化学配体以在外来体表面展示的膜锚定RNA复合物
该方法包括(1)构建携带靶向配体、成像剂和疏水性膜锚定结构域的多功能RNA纳米颗粒用于在外来体表面上展示；(2)分离纳米尺寸的外来体用于高效肿瘤靶向同时避免在健康器官中积累；和(3)RNA纳米颗粒和外来体的工业规模生产和纯化。
用于在外来体上展示的多功能RNA纳米颗粒的构建
pRNA-3WJ基序被用作用于构建用于外来体表面展示的多功能RNA纳米颗粒的稳健支架。pRNA-3WJ核心利用包含在不存在金属盐的情况下以非常高的亲和力组装的三个片段的模块化设计，对由8M尿素变性耐受，为热力学稳定的，并且在超低浓度不解离。解链温度为～60℃，并且解链曲线的斜率接近90°，表明极低的自由能(AG。37℃＝-28kcal/mol)，以及三个片段的同时组装。2'-F修饰导致RNA纳米颗粒耐受RNA酶降解，同时保留用于支架和所有功能模块的真正的折叠和生物学活性。
疏水性膜锚定结构域的掺入
胆固醇亚磷酰胺商购可得(Glen Research)，其携带三甘醇(TEG)接头。已知胆固醇-TEG标记的寡核苷酸自发插入到疏水性脂质核心中而不改变膜结构。用作一个结构域的一个pRNA-3WJ链(b3wj)在使用亚磷酰胺化学的化学合成期间用胆固醇标记(图2A)。
确保RNA纳米颗粒锚定在外来体表面上而不进入到外来体中的RNA纳米颗粒设计：
除了设计疏水性膜锚定结构域以外，还将更大的亲水性凸起设计到RNA纳米颗粒的胞外结构域中用于膜插入和表面展示。凸起可以使用具有多种形状和结构的RNA纳米颗粒构建。
靶向配体与pRNA-3WJ的缀合
已经通过体外SELEX产生了以高选择性和高敏感性与癌细胞表面受体结合的新兴类型的基于RNA适配体的靶向治疗性分子。已经构建了携带许多不同细胞受体结合适配体(参见表1)或化学配体的RNA纳米颗粒。
所得的RNA构建体保留其真正的折叠并且能够在体内有效结合并内化到癌细胞中。此外，模块化设计确保每一条链均可以通过高批次保真度和适应性修改用于控制体内降解进行化学合成。这些适配体的可用性和易于掺入确保外来体靶向配体的多样化以用于特异性靶向患病的细胞和组织。
成像剂与pRNA-3WJ支架的缀合
pRNA-3WJ链(C3WJ)中的一个用Alexa-647荧光团进行末端标记(图2A)。
由三条官能化组分链组装pRNA-3WJ
在将链(a3WJ-叶酸或RNA\适配体):(b3WJ-胆固醇):(c3WJ-Alexa-647)以1:1:1摩尔比混合后，pRNA-3WJ以高效率组装(图2B)。RNA构建体的生物物理特性使用良好建立的方法构建：
(1)使用天然PAGE凝胶测定RNA纳米颗粒折叠和组装。
(2)用SYBR Green、温度梯度凝胶或UV吸光度通过qPCR评价Tm。
(3)通过使用放射性标记的RNA或表面等离子体共振的竞争测定来评价KD。
(4)通过将RNA与RNA酶或50％FBS一起孵育来评价化学稳定性。
(5)在变性PAGE凝胶中检查对2-8M尿素变性的耐受性。
(6)通过原子力显微术(AFM)成像的结构表征：通过‘m-折叠'和其他RNA折叠算法预测2D结构。
携带功能模块的所有多功能pRNA-3WJ构建体在凝胶或HPLC纯化之后必须满足>95％的纯度；显示真正的折叠和结构，通过AFM成像证实；保留化学和热力学稳定特性，通过Tm分析、变性凝胶和血清稳定性测定进行验证。
从非免疫原性人类胚肾细胞系293(HEK293)中提取外来体
为了确保有利的生物分布和避免肝捕获，已经开发了用于从HEK293细胞中提取高质量外来体而不共纯化蛋白聚集体和其他膜状颗粒(membranous particles)的方法。通过电子显微术(图3A)、尺寸和表面电荷的动态光散射(DLS)(图3B-C)和真正外来体标志物的蛋白质组图谱(图3D)已经表征了外来体。
RNA纳米颗粒和外来体的大规模生产和纯化
纯化大量的RNA复合物对于动物试验和临床应用来说是至关重要的。已经开发了用于大规模纯化RNA的程序。先前，通过HPLC或凝胶电泳进行纯化，收率相对较低。还已经建立了一种使用柱凝胶的RNA工业规模纯化的新方法。已经设计了等渗压缓冲梯度超速离心(iso-osmotic pressure cushioned gradient ultracentrifugation method)方法，用于温和纯化外来体而不沉淀。该方法利用高密度的碘克沙醇代替显示出可损伤外来体的高渗透压的CsCl或蔗糖。通过该方法纯化的外来体保留高生物学活性和纯度，对外来体的形状和尺寸没有不利影响。
在外来体表面上RNA纳米颗粒的掺入
将荧光多功能pRNA-3WJ与纯化的外来体一起孵育。剩余的RNA悬浮液通过尺寸排阻层析去除(图4A)。共聚焦图像显示细胞膜展示出明亮的荧光环，表明胆固醇部分在膜中成功锚定而没有内化到细胞中(图4B)。
优化外来体尺寸和表面配体密度以增强肿瘤靶向并改进体内生物分布谱
调整外来体的尺寸，并且控制在外来体表面上展示的靶向配体的密度。外来体的尺寸和外来体膜锚定靶向配体的密度对于确保以下是关键的：外来体(1)以高效率特异性递送至肿瘤；以及外来体(2)不被健康细胞吸收，被健康细胞吸收可能导致非特异性副作用。使用结肠直肠癌和肝癌异种移植物和转移小鼠模型来评价递送平台。还可以探索外来体施用的最佳途径(静脉内与腹膜内)以实现有利的生物分布和药理学谱(稳定性；PK；PD；吸收、分布、代谢、排泄(ADME)；毒性和免疫应答)。
外来体表面上展示的配体对特异性细胞结合和进入的作用的评价
对于细胞结合和摄取研究，将展示pRNA-3WJ-叶酸或其他受体结合RNA适配体的外来体与叶酸或各自的受体阳性癌细胞一起孵育，并且通过流式细胞术和共聚焦显微术遵循已建立的程序测定。外来体能够通过受体介导的胞吞以及通过与癌细胞膜融合有效地结合并内化到特定细胞(KB、头颈癌和HT29结肠直肠癌)中(图5A和5B)。对于体内验证，在裸小鼠中通过皮下异种移植物产生KB细胞并且全身注射展示pRNA-3WJ-叶酸(或没有叶酸的对照)的外来体。全身和内脏器官成像显示携带叶酸的外来体能够靶向KB细胞肿瘤，在施用后8小时在健康的重要器官中很少或没有积累。结果突出显示了外来体介导的肿瘤靶向的‘主动和‘被动’机制之间的差异。
调整外来体表面配体密度以通过物理障碍阻断非特异性细胞进入
RNA纳米颗粒经由膜锚定结构域的高效膜整合使得通过体外方法在外来体表面修饰高密度的RNA配体是可能的。控制靶向配体的密度通过滴定pRNA-3WJ纳米颗粒(携带靶向配体和胆固醇(图2A))和外来体悬浮液的比率简单地实现。已经证实，300:1的pRNA-3WJ-叶酸与外来体的比率产生可以靶向叶酸受体(+)皮下肿瘤同时避免在健康器官中被截留的外来体(图6A和6B)。另外，一系列RNA支架(图3)可用于呈现特定构象的靶向配体。大量靶向配体且以不同构象的存在以及外来体上靶向配体的总负电荷可以消除与健康细胞的非特异性结合。
调整外来体尺寸以用于降低健康的器官和组织积累
几项研究表明纯化的外来体的静脉内施用导致肝、肾和脾中的非特异性积累。该生物分布谱与大多数纳米颗粒递送媒介物的生物分布谱一致，其通常通过胆汁排泄、肾清除或网状内皮系统的循环被清除。避免被肝、肺和脾非特异性摄取的RNA纳米颗粒的最佳尺寸在10-60nm范围内，这与使用60nm外来体的观察结果一致，所述外来体显示出特异性肿瘤靶向，而在健康器官和组织中不累积(图6A和6B)。外来体的尺寸是可变的并且取决于细胞类型。已经发现了将具有不同尺寸的囊泡分开的超速离心方法，其可以用于研究生物分布谱。可选地，可以调整外来体的尺寸。先前的经验已经表明，具有低多分散性的单层脂质体悬浮液可以以有效和快速的方式用聚碳酸酯膜过滤器来制备。在本文，将提取的外来体悬浮液加热高于外来体脂质混合物的相变温度，并且然后通过商购可得的过滤器(10nm、30nm、50nm、75nm和100nm)(Avanti Polar Lipids)挤出悬浮液以产生均匀尺寸的外来体。在生物分布研究之前，表征它们的尺寸和形态以及验证真正的外来体标志物的存在。
外来体的PK/PD和ADME(吸收、分布、代谢、排泄)的表征
已经建立了用于评价RNA纳米颗粒的PK/PD谱的稳健的测定，其用于评价外来体。在荷瘤小鼠中施用Alexa-647标记的外来体，用于PK/PD和ADME研究。关键PK参数，t1/2(半衰期)、AUC(曲线下面积)、Vd(分布体积)、C0(在时间零时的浓度)、CL(清除率)、和MRT(平均停留时间)遵循先前出版物通过毛细管电泳(CE)确定。使用基于生理学的药代动力学(PBPK)模型，遵循公布的RNA纳米颗粒程序，通过体内和离体实验两者分析外来体到器官和肿瘤中的分布。该模型允许模拟使外来体分配到肿瘤中最大化同时使健康器官中的积累最小化所需的最佳剂量。非靶向外来体被用作对照。外来体的排泄途径在体内通过研究肾和肝排泄来表征。
用于癌症靶向的外来体的腹膜内(i.p)对比静脉内(i.v)递送的比较
全身注射通常为能够将治疗剂递送至转移性细胞的唯一策略。由于其位于腹膜腔内，原发性结肠直肠肿瘤和肝肿瘤以及肝中的转移性细胞进一步适于i.p.施用。对于具有最佳切除肿瘤的患者，相对于i.v.注射，i.p注射标准化学治疗剂改进治疗结果。
外来体与血浆蛋白结合的评价
外来体与血浆蛋白结合显著影响其生物分布、清除和治疗作用。通常使用的蛋白质组学方法包括2D凝胶电泳、CE和LC-MS/MS，被用于既定性地又定量地表征与外来体结合的血浆蛋白(例如，诸如白蛋白、脂蛋白、糖蛋白以及α、β和γ球蛋白)。
外来体的毒性评价
用于使用外来体作为递送平台的一个重要标准为其安全性谱。用由先前出版物改进的方法，通过LC50确定体内外来体的急性全身毒性。可以使用3种不同的小鼠品系(BALB/c、C57BL/6和Swiss Webster)提供发现毒性的最大的机会。将小鼠以分级剂量水平注射外来体，并且监测死亡率、体重和毒性征象。收集血液样品用于标准组临床化学(包括PT、aPTT)、肝酶AST、ALT和LDH(评价肝毒性)、BUN和肌酸酐(评价肾毒性)、以及测量血清INF-α，TNF-α、IL-6和IFN-γ(确定脱靶作用)。记录总体病理学和器官重量，并且检查代表性部分的组织学损伤证据，其包括肝中的局灶性坏死或肝炎、肾中的肾小管坏死或肾病以及肺中的弥漫性肺泡损伤或肺炎。
在临床相关的异种移植物和实验转移小鼠模型中携带靶向配体作为载体的外来体的靶向的药物递送效率
RNAi货物到外来体中的优化装载
通常，使用电穿孔将siRNA/miRNA装载到细胞外的外来体中。但是，这种转移过程可能是低效的，使外来体的完整性受损并且产生RNA沉淀物。已经以成本效益方式发现了使用转染试剂的独特组合装载外来体的稳健且温和的方法。基于在装载之后包封的和游离的荧光siRNA货物的测量结果，到纯化的外来体中的RNA的包封效率被计算为>95％(图8A)。重要的是，外来体的尺寸、形状、表面特性和稳定性在RNAi包封之后保持几乎相同。
使用萤光素酶siRNA验证siRNA的递送和内体逃逸
对于功能测定，将萤光素酶siRNA装载的外来体与没有任何转染试剂的表达萤光素酶的KB细胞(KB-Luc)一起孵育。与加扰对照相比，在仅50nM siRNA装载的外来体的存在下敲低效率>80％(图8B)。对于体内验证，KB-Luc细胞异种移植物被产生并且全身注射装载有萤光素酶siRNA的叶酸-3WJ-外来体。基于降低的生物发光信号观察到萤光素酶的有效敲低，这表明siRNA装载的叶酸-3WJ-外来体能够内体逃避并且在体内触发基因沉默(图15)。通过可视化siRNA与染色内体/溶酶体区室的Lysotracker Red(Invitrogen)的共定位执行细胞内运输研究。在结肠直肠癌治疗中失败或耐受的主要因素是由于PI3K/Akt和RAS/RAF/MEK途径两者的同时活化。使用siRNA对这两种途径的双重抑制可以增强抗增殖作用，并且对药物耐受性结肠直肠癌特别有效。在高度转移性结肠直肠细胞中抑制Akt2和KRAS选择性地抑制其转移能力并增加结肠直肠细胞凋亡(图9A至9D)。在本文，评价了展示与EpCAM结合的RNA适配体的外来体(图10)和阻断PI3K和/或RAS途径的siRNA(单一治疗和组合治疗)的作用，以及它们在抑制结肠直肠癌进展和转移中的效力和安全性。
miRNA至癌细胞的靶向的递送
miRNA在肿瘤进展，细胞周期、分化、转移和凋亡的调节中发挥重要作用。使用展示靶向配体的外来体作为载体用于递送反义-miRNA以通过下调致癌miRNA，诸如牵涉在肿瘤进展和转移中的熟知的参与者miR-21来抑制结肠直肠肿瘤或肝肿瘤生长。在癌细胞膜上过表达的EpCAM抗原对于靶向是有吸引力的，因为它们在原发性和转移性结肠癌和肝癌(包括癌症干细胞)中过表达>1000倍。已经通过SELEX开发出了来自基于RNA纳米技术的2'-F 3WJ文库的对EpCAM具有异常强的结合亲和力的2'F RNA适配体(图10)，其展示在外来体表面上用于靶向结肠直肠肿瘤和肝肿瘤。还已经开发了一种配制用于有效递送反义-miRNA种子序列的RNA纳米颗粒构建体的方法。锁核酸(LNA)修饰的8核苷酸序列可以以高亲和力与miRNA种子区域结合并且触发miRNA抑制。在将反义-miR-21与EGFR靶向RNA适配体一起掺入到pRNA-3WJ支架之后，RNA纳米颗粒在全身注射之后，可以在三阴性乳腺癌原位异种移植物中敲低miR-21表达并且抑制肿瘤增殖和生长(图11)。通过qRT-PCR和蛋白印迹测定的，靶向miR-21导致肿瘤抑制因子和促凋亡基因(包括PTEN、PDCD4、RECK和Bcl2)的直接上调。评价携带EpCAM适配体和反义-miR-21货物的外来体在结肠直肠肿瘤和肝肿瘤模型中随时间推移诱导持续肿瘤生长抑制的能力。
可选的反义-miRNA：与健康和相邻的良性肝相比，miR-221表达为肝中上调最多的miRNA之一。MiR-221靶向许多关键的肿瘤抑制因子，包括p27、p57、PTEN、TIMP3和mTOR途径调控物。
用于基因救援的dsDNA的靶向的递送
将编码GFP蛋白的载体质粒装载到外来体中，将其与GFP阴性细胞一起孵育而没有任何转染试剂。GFP基因也可以被装载到展示RNA适配体的外来体(在表1中)中，其然后可以在具有表达对应于外来体上的配体的受体的癌症异种移植物的动物模型中被测试。用于在异种移植物肿瘤中表达GFP的组织学谱可以用于确定用于体内基因救援的dsDNA递送的可行性。
用于基因组编辑的CRISPR RNA模块的靶向的递送
细菌CRISPR-Cas(CRISPR:成簇的规律间隔的短回文重复；Cas：CRISPR相关)基因座编码几种蛋白，作为与针对病毒感染的RNA干扰相似的适应性免疫系统一起工作。这种适应性的自我防御系统被许多细菌使用以保护自身免受外来核酸的伤害，由Cas核酸酶和将靶指定至侵入物的基因组内的裂解位点的小RNA指导来介导。在II型CRISPR-Cas系统中，RNA指导的Cas9核酸酶可以重编程以在多种生物体(包括人类细胞)的基因组中产生双链DNA断裂。编辑机制通过同源定向修复或非同源末端连接机制实现，导致核苷酸缺失、取代或插入。用于CRISPR/Cas9系统的最著名的转化药物为将受调控的RNA指导的特异性原核基因组编辑过程应用到真核细胞中，作为不利疾病包括癌症、病毒感染和几种遗传疾病的有希望的基因组编辑疗法。然而，由于有限的非病毒体内RNA递送系统，将CRISPR组分递送到真核细胞中用于CRISPR介导的基因组编辑疗法是非常具有挑战性的。在本文，将特定设计的包含特定gRNA和Cas9mRNA的质粒DNA或RNA货物装载到外来体中。将CRISPR组分特异性递送至患病细胞通过在外来体表面展示特定配体(表1)来实现。通过使用细胞或动物模型破坏或修复编码与Cas9融合的标志物不同的基因(诸如β-gal、萤光素酶或荧光蛋白)的报告物基因关注概念验证集。
用于外来体评价的临床相关的异种移植物和转移小鼠模型
异种移植物模型：通过将HT29肿瘤细胞直接注射到侧腹已经建立了用于产生皮下结肠直肠癌异种移植物的程序，以及通过在外科手术之后将细胞(或患者来源的细胞)直接注射到裸小鼠的盲肠建立更多临床上相关的原位模型。可选地，可以使用原位肝癌小鼠模型。原位肝肿瘤通过将悬浮于Matrigel中的表达萤光素酶的PLC/PRF/5细胞直接肝内注射到肝叶中来建立。
转移模型：肝、肺和淋巴结转移通过将表达萤光素酶的HT29细胞注射到脾或盲肠来建立并且通过生物发光成像监测。已经证明，在全身注射之后，Alexa-647标记的pRNA-3WJ纳米颗粒可以有效靶向HT29异种移植物以及肝、肺和淋巴结转移性细胞。在健康重要器官和正常肝/肺实质中观察到很少或没有积累。
siRNA和miRNA的靶基因表达通过在mRNA水平的qRT-PCR以及通过在蛋白水平的蛋白印迹评价。RNA纳米颗粒对细胞生长和凋亡的作用可以通过WST-1、TUNEL、原位胱天蛋白酶活性、DNA片段化和膜联蛋白V/PI染色来测定。最后，可以探索治疗性外来体的PK/PD、ADME、和毒性谱。
实施例2：控制用于前列腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌的衰退的细胞外囊泡上的RNA表面展示的纳米颗粒取向
在该实施例中，RNA纳米技术被用于重编程天然细胞外囊泡，以用于在体外和体内将siRNA特异性递送至癌症模型。
材料和方法
已经报道了具有或不具有2'-F修饰或Alexa647标记的RNA纳米颗粒的构建、合成和纯化(Shu,D.,等Nature Nanotechnology 6:658-667(2011))。
所有RNA链的序列(小写字母指示2'-F核苷酸)为：
a3wj：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG-3’(SEQ ID NO:1)。
b3WJ：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc-3’(SEQ ID NO:2)。
c3WJ：5’-GGA ucA Auc AuG GcA A-3’(SEQ ID NO:3)。
a3WJ-sph1：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG AAu ccc GcG Gcc AuG Gcc GGG AG-3’(SEQ ID NO:4)。
a3WJ-存活蛋白有义：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG GcA GGu uCC uuA ucu GucAuu-3’(SEQ ID NO:5)。
a3WJ-存活蛋白有义(加扰)：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG AAu ccc GcG Gcc AuGGcc GGG AG-3’(SEQ ID NO:6)。
c3WJ-PSMA适配体：5’-GGA ucA Auc AuG GcA AuG GGA ccG AAA AAG Acc uGA cuucuA uAc uAA Guc uAc Guu ccc-3’(SEQ ID NO:7)。
存活蛋白反义：5’-UGA CAG AUA AGG AAC CUG C-3’(SEQ ID NO:8)。
存活蛋白反义(加扰)：5’-CUC CCG GCC AUG GCC GCG GGA UU-3’(SEQ ID NO:9)。
b3WJ-EGFR适配体：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc Gcc uuA GuA AcG uGc uuuGAu Guc GAu ucG AcA GGAGGc-3’(SEQ ID NO:10)。
a3WJ-叶酸：5’-(叶酸)uuG ccA uGu GuA uGu GGG-3’(加下划线的部分为SEQ IDNO:1)。
a3WJ-胆固醇：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG(胆固醇TEG)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:1)。
b3WJ-叶酸：5’-(叶酸)ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc-3’(加下划线的部分为SEQID NO:2)。
b3WJ-胆固醇：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc(胆固醇TEG)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:2)。
b3WJ-Alexa647：5’-(Alexa647)(AmC6)-cccAcA uAc uuu Guu GAu ccc-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:2)。
c3WJ-Alexa647：5’-GGA ucA Auc AuG GcA A(C6-NH)(Alexa647)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:3)。
叶酸-c3WJ-Alexa647：5’-(叶酸)GGA ucA Auc AuG GcA A(C6-NH)(Alexa647)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:3)。
EV纯化：使用修改的差速超离心方法纯化EV(Thery,C.,等Curr.Protoc.CellBiol Chapter 3,Unit 3.22(2006))。简言之，将用于细胞培养的胎牛血清(FBS)以100,000×g离心70min以去除现有的血清EV。已知FBS包含EV，并且先前已经报道了离心可能未去除所有的EV，因此从HEK293T细胞分离的一些EV实际上可能包含来自FBS的EV(Witwer,K.W.,JExtracell.Vesicles.2,(2013)；Shelke,G.V.,等J Extracell.Vesicles.3,(2014))。在细胞铺板之后48小时收获HEK293T细胞培养物(富含EV的培养基)的上清液并且以300×g离心10min以去除死亡的细胞，随后在4℃以10,000×g离心30min以去除细胞碎片和/或微泡。通过使用OptiPrep Cushion程序从培养基中浓缩EV(Jasinski,D.,等Methods in MolecularBiology 1297:67-82(2015))。OptiPrep缓冲垫提供等渗压并且防止EV的物理破坏。将200μL的60％碘克沙醇(Sigma)添加至每一个管的底部以形成缓冲垫层。在使用Beckman Sw28转子在4℃以100,000×g离心70min之后，EV迁移并且浓缩至60％碘克沙醇与富含EV的培养基之间的界面层。收集1mL靠近界面和缓冲垫的级分。将6mL EV溶液进一步洗涤并且用包含50μL 60％碘克沙醇缓冲垫的SW28管中的30mL PBS沉淀，然后在4℃以100,000×g离心70min。收集缓冲垫中的所有沉淀物，并且悬浮于1mL无菌PBS中以供进一步使用。
已经报道了用于细胞培养、EM成像、共聚焦显微术、DLS测量和流式细胞术的方法(varez-Erviti,L,等Nat Biotechnol.29:341-345(2011)；Shu,D.,等NatureNanotechnology 6:658-667(2011)；Shu,D.,等ACS Nano9:9731-9740(2015))。HEK293T、KB、LNCaP-FGC、和PC-3细胞从ATCC获得，并且LNCaP-LN3细胞从MD Anderson癌症中心获得。从ATCC购买的细胞培养物在购买之前通过短串联重复(STR)验证，并且在作为礼物接受细胞之前验证LNCaP-LN3细胞。测试每一个细胞系的支原体。尽管KB细胞系已经被列为由HeLa细胞污染来源的错误识别的细胞系，它在这些研究中用作理想的模型。已知KB细胞过表达叶酸受体，允许通过在RNA纳米颗粒上使用叶酸的适当的特异性靶向。KB细胞系的来源不影响其用作测试RNA展示EV的叶酸受体靶向特性的模型。
NTA：使用Malvern NanoSight NS300系统对以10μg蛋白/mL的浓度重悬于PBS中的EV进行NTA以用于分析。系统使激光束聚焦通过样品悬浮液。使用与光束轴对齐的常规光学显微镜通过光散射将EV可视化，该常规光学显微镜收集从视野中的每个颗粒散射的光。三个10秒的视频记录所有事件以用于通过NTA软件进一步分析。每一个颗粒的布朗运动在帧之间被追踪，最终允许通过应用Stokes Einstein方程来计算尺寸。
尺寸排阻层析：将Sephadex G200凝胶柱用PBS平衡并且装载荧光标记的EV样品。在用PBS洗涤之后，以5滴/孔收集级分。收集的级分中的Alexa647的荧光强度使用酶标仪(Synergy 4,Bio Tek Instruments,Inc)来测量。
将siRNA装载到EV中：将EV(100μg总蛋白)和RNA(10μg)在具有10μL ExoFectExosome转染(System Biosciences)的100μL PBS中混合，随后是热休克方案。将胆固醇修饰的RNA纳米颗粒与siRNA装载的EV在37℃孵育45min，然后在冰上放置1小时以制备RNA修饰的EV。装饰的RNA纳米颗粒以10μg RNA纳米颗粒/按蛋白量计100μg EV的比率保持。为了纯化RNA修饰的EV，将400μL RNA装饰的EV用包含20μL 60％碘克沙醇缓冲垫的SW-55管中的5mLPBS洗涤并且在4℃以100,000×g离心70min。收集缓冲垫中的所有沉淀物，并且悬浮于400μL无菌PBS中以供进一步使用。
测定到EV中的siRNA装载效率：将待装载到EV中的siRNA纳米颗粒在一条链的末端处用Alexa647标记。在如以上描述装载siRNA之后，将装载siRNA的EV用ExoTC(SystemBiosciences)沉淀下来，并且从上清液中收集未装载的siRNA纳米颗粒。游离RNA纳米颗粒和总输入RNA纳米颗粒的浓度使用荧光计以在635nm处的激发、在650-750nm处的发射，通过Alexa647荧光强度来测量。siRNA装载效率通过以下公式计算：
FBS消化实验：将15μL纯化的Alexa647-RNA-装饰的EV与30μL FBS(Sigma)混合并且在37℃孵育2小时。将样品装载到1％syner凝胶中以用于在TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mMEDTA)缓冲液中电泳以测试修饰的RNA的降解。使用Cy5通道用Typhoon(GE Healthcare)将凝胶成像。
使用qRT-PCR测定PSMAapt/EV/si存活蛋白对前列腺癌的作用：将LNCaP-FGC细胞与100nM的PSMAapt/EV/si存活蛋白和分别包含3WJ/EV/si存活蛋白和PSMAapt/EV/si加扰纳米颗粒的对照一起孵育。在48小时处理之后，收集细胞并且通过qRT-PCR评价靶基因下调作用。PC-3细胞被用作阴性对照细胞系。
遵循制造商的说明(Life Technologies)使用Trizol RNA提取试剂处理细胞以为了得到总RNA。使用SuperscriptTMIII第一链合成系统(Invitrogen)，在来自用多种RNA处理的细胞的总RNA(1μg)中合成第一cDNA链。使用TaqMan测定进行实时PCR。所有反应均使用TaqMan快速通用PCR主混合物以20μL的终体积进行并且以一式三份测定。用于人类BIRC5、18S和GAPDH的引物/探针集从Life Technologies购买。在Step-One Plus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行PCR。相对的存活蛋白-mRNA表达水平对于体外测定以18SRNA且对于体内测定以GAPDH作为内部对照进行归一化。通过比较CT方法(ΔΔCT方法)将数据进行分析。
由于细胞培养物之间的高的重现性和一致性，预测在体外研究中，至少n＝3的样品尺寸将允许进行适当的分析以获得有意义的数据结论。然而，在体内研究中，在组织样品中观察到较高的变异(variance)；因此，需要更高的样品集来补偿这种天然变异。在这些研究中，对于PSMAapt/EV/si加扰肿瘤n＝4，而由于有限的肿瘤样品对于PSMAapt/EV/si存活蛋白肿瘤n＝2，并且以一式三份完成重复实验。在乳腺癌小鼠研究中，对于来自所有组的肿瘤，N＝3。在整个实验中将样品和动物随机分到组中。
蛋白印迹和抗体：将LNCaP-FGC细胞与100nM PSMAapt/EV/si存活蛋白和分别包含3WJ/EV/si存活蛋白和PSMAapt/EV/si加扰纳米颗粒的对照一起孵育。在48小时处理之后，收集细胞并且用具有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma)裂解。用于蛋白印迹分析的第一抗体为兔抗人类存活蛋白抗体(R&D system,AF886)、兔抗人类β-肌动蛋白(Abeam,ab198991)、兔抗人类TSG101(Thermo Scientific,PA5-31260)、兔抗人类整联蛋白α4(Cell Signaling,4711S)、兔抗人类整联蛋白α6(Cell Signaling,3750S)、兔抗人类整联蛋白β1(Cell Signaling,4706S)、兔抗人类整联蛋白β4(Cell Signaling,4707S)、兔抗人类整联蛋白β5(Cell Signaling,4708S)、兔抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(ThermoFisher,PA5-28055)、GAPDH抗体(Santa Cruz Biotechnology)。
细胞毒性测定：用MTT测定试剂盒(Promega)根据制造商的方案评价PSMAapt/EV/si存活蛋白的细胞毒性。将LNCaP-FGC和PC-3细胞在96孔板中以一式三份用EV处理。在48小时之后，细胞存活率在酶标仪(Synergy4,Bio Tek Instruments,Inc)上通过MTT测定来分析。
在全身注射EV之后肿瘤异种移植物的体内靶向测定：为了产生KB细胞异种移植小鼠模型，使用雄性无胸腺裸Nu/Nu(6-8周龄)小鼠(Taconic)。将在100μL PBS中的2×106个KB细胞皮下注射至每一只小鼠中。当肿瘤达到～500mm3的体积时，将小鼠使用异氟烷气体(在氧气中2％，以0.6L/分钟流动速率)麻醉，并且用单一剂量2mg/kg的EV/小鼠重量通过尾静脉静脉内注射。在8小时之后将小鼠安乐死，取出器官和肿瘤用于荧光成像以使用IVISSpectrum Station(Caliper Life Sciences)比较EV的生物分布谱。该动物实验用肯塔基大学的动物管理和使用委员会(IACUC)(the Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)of University of Kentucky)批准的方案完成。
用在100μL体积中的4μM EV经由尾静脉注射一次携带具有约200mm3尺寸的MDA-MB-468原位异种移植物肿瘤的每组3只小鼠。在全身施用8小时之后，将小鼠在麻醉下通过颈椎脱臼处死，并且立即将乳腺肿瘤切离。通过使用IVIS Lumina Series III临床前体内成像系统(Perkin Elmer)以在640nm处的激发和在660nm处的发射持续1min暴露检查切离的肿瘤来检测来自EV的Alexa647的荧光信号。荧光强度被表示为平均辐射效率[p/s/cm2/sr]/[μW/cm2]。PBS注射的小鼠被用作阴性对照以用于背景荧光。该动物实验用俄亥俄州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)(the Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)of The Ohio State University)批准的方案完成。
EV在前列腺癌小鼠模型中的体内治疗作用：6-8周龄的雄性裸小鼠(Nu/Nu)从Charles River(Wilmington,MA)购买。使用IVC系统(Innovive)将小鼠维持在无菌条件下。肿瘤异种移植物通过在小鼠的侧腹区域皮下注射与等体积Matrigel基质(Corning LifeSciences)混合的2×106个癌细胞来建立。以0.5mg siRNA/5mg EV/kg小鼠体重的剂量通过尾静脉注射施用PSMAapt/EV/si存活蛋白、PSMAapt/EV/si加扰和PBS，每周两次，持续三周。用卡尺测量肿瘤的两个轴(L，最长轴；W，最短轴)。肿瘤体积计算为：V＝(L×W2)/2。该动物实验用北达科他州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)the Institutional AnimalCare and Use Committee(IACUC)of North Dakota State University批准的方案完成。对于肿瘤抑制测定，n＝10，从一开始就不发展肿瘤的小鼠被排除在分析之外。
EV在乳腺癌小鼠模型中的体内治疗作用：4周龄雌性无胸腺nu/nu远交小鼠从在俄亥俄州立大学的Target验证共享资源维持的无胸腺裸小鼠种群(colony)中获得；用于该种群的原始种畜(breeders)(品系#553和#554)从NCI Frederick机构接收，并且用于所有研究。通过注射先前维持在DMEM/10％FBS/1％青霉素和链霉素中的2×106个MDA-MB-468细胞在小鼠中产生原位乳腺脂肪垫异种移植物肿瘤。每组5只具有在乳腺形成的尺寸为约100mm3的肿瘤的小鼠经由尾静脉用0.5mg siRNA/5mg EV/kg小鼠体重注射。PBS和EGFRapt/EV/si加扰被用作阴性对照组。总计5个剂量被一周一次注射到小鼠中。每一次注射时，肿瘤体积被确定为V＝(L×W2)/2(mm3)。该动物实验用俄亥俄州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)批准的方案完成。
到SCID小鼠中的患者肿瘤移植：雄性NOD-scid IL2Rγnull小鼠从JacksonLaboratory(BarHarbor,ME)购买。将用于这些动物的安置维持在具有12h光照/12h黑暗周期的灭菌笼内的HEPA过滤的环境中。所有动物程序均经肯塔基大学动物管理和使用委员会批准并且遵守执行。将原始患者CRC肿瘤(F0世代)分离并植入到NOD scidγ小鼠的侧腹(The Jackson Laboratory；005557)。当所得的肿瘤生长至1cm3时，切除每一个肿瘤(F1世代)，分割为2-mm3片段(pieces)并且植入到小鼠中用于实验程序(F2世代)。将患者肿瘤移植小鼠经由尾静脉注射0.5mg siRNA/5mg EV/kg小鼠体重。FA/EV/si加扰被用作阴性对照组。总计5个剂量被一周一次注射到小鼠中。每一次注射时，肿瘤体积被确定为V＝(L×W2)/2(mm3)。
统计：对于每一个测试样品，每一个实验以一式三份重复至少3次。除非另外指明，结果被呈现为平均值±标准差。统计学差异用GraphPad软件使用非配对t检验评价，并且p<0.05被认为是显著的。
结果
1.用于在EV表面上展示的箭头状RNA纳米结构的设计和构建。
噬菌体phi29马达pRNA的3-式连接(3WJ)(Shu,D.,等Nature Nanotechnology 6:658-667(2011)；Zhang,H.,等RNA 19:1226-1237(2013))经由其内在性质折叠为在螺旋区域之间具有60°、120°、和180°三个角度的计划排列(planner arrangement)(图12a-12b)(Zhang,H.,等RNA 19:1226-1237(2013))。通过掺入用作用于与癌细胞上过表达的特定受体结合的靶向配体的RNA适配体，将pRNA-3WJ延伸为箭头状结构。使用工程化的pRNA-3WJ来装饰从HEK293T细胞培养物上清液中纯化的EV以产生配体装饰的EV。使用HEK293T EV，因为它们与由其他细胞产生的EV相比包含最小的内在生物货物(Lamichhane,T.N.,等Mol.Pharm.12:3650-3657(2015))。如蛋白印迹(图18a)中显示的，HEK293T分离的EV显示几种常见整联蛋白标志物的阴性染色，如在癌症起源的EV上观察到的(Rak,J.Nature 527:312-314(2015)；Melo,S.A.等Nature 523:177-182(2015))，仅TSG101阳性染色。采取另外的步骤去除来自HEK293T细胞培养物中使用的FBS的EV；虽然离心可能未完全去除FBS EV(Witwer,K.W.,J Extracell.Vesicles.2,(2013)；Shelke,G.V.,等JExtracell.Vesicles.3,(2014))。使用OptiPrep超速离心方法纯化EVs(Thery,C,等Curr.Protoc.Cell Biol Chapter 3,Unit 3.22(2006))。添加用于超速离心的等渗OptiPrep缓冲垫层大大增强了EV纯化在纯度方面的重现性(图18c)，并且还使EV被超速离心沉淀的物理破坏最小化，如通过电子显微术(EM)成像(图12c)显示的。OptiPrep缓冲垫层的存在并未显著改变EV的颗粒尺寸分布或ζ电位(图12d-e)，而是保存了EV的天然形状。不用OptiPrep缓冲垫层纯化的EV表现为扁平球体(图12c右侧)，而大部分用缓冲垫纯化的EV表现为完整球体(图12c左侧)。因此，来自EM图像的EV的尺寸可能并不总是代表其在群体中的粒径分布。纳米颗粒追踪分析(NTA)和动态光散射(DLS)显示分离的天然EV为物理均匀的，具有以约96nm为中心的窄尺寸分布(图12d)和负ζ电位(图12e)。
纯化的EV经由蛋白印迹，通过EV特异性标志物TSG101的存在进一步鉴定(Kumar,D.,等Oncotarget 6:3280-3291(2015))(图18a)。来自HEK293T细胞培养物上清液的纯化的EV的收率为约10-15μg(以蛋白浓度测量)，或0.1-1.9×109个EV颗粒(通过NTA测量)/106个细胞。将单个类固醇分子胆固醇-四甘醇(TEG)缀合到pRNA-3WJ的箭头尾部以促进3WJ锚定到EV膜上(图12b)。胆固醇经由其疏水性部分自发地插入到EV的膜中(Bunge,A.,等J PhysChem.B113:16425-16434(2009)；Pfeiffer,I.,等J Am.Chem.Soc 126:10224-10225(2004))。在纯化的EV的表面上展示RNA纳米颗粒通过在37℃简单地将胆固醇-修饰的RNA纳米颗粒与EV一起孵育1小时实现。
EV具有极大希望作为新兴的治疗性载体在细胞通信中发挥其作用。它们可以通过多于一种途径进入细胞，所述多于一种途径包括膜融合、四次穿膜蛋白和整联蛋白受体介导的胞吞、脂筏介导的胞吞或微胞饮；但是关于受体细胞存在有限的特异性(Marcus,M.E.,等Pharmaceuticals.(Basel)6:659-680(2013)；van Dongen,H.M.,等Microbiol.Mol.Biol.Rev.80:369-386(2016))。为了赋予EV向癌细胞的特异性靶向，将三类靶向配体，叶酸、PSMA RNA适配体或EGFR RNA适配体缀合至3WJ以用于在EV表面上展示。叶酸为一种有吸引力的靶向配体，因为许多上皮起源的癌症诸如结肠直肠癌，过表达叶酸受体(Parker,N.,等Anal.Biochem.338:284-293(2005))。PSMA在前列腺癌细胞中以异常高水平表达，并且其表达也与更具侵袭性的疾病相关(Dassie,J.P.,等Mol Ther.22:1910-1922(2014))。PSMA-结合2'-氟(2'-F)修饰的RNA适配体A9g(Rockey,W.M.,等Nucleic AcidTher.21:299-314(2011)；Binzel,D.,等Molecular Therapy 24,1267-1277(2016))被展示在EV上以增强对前列腺癌细胞的靶向效率。PSMA适配体A9g为A9的43-mer截短形式，其以130nM的Kd特异性结合PSMA(Rockey,W.M.,等Nucleic Acid Ther.21:299-314(2011))并且被用作基于RNA的配体。EGFR在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤和转移性TNBC肿瘤中高度过表达(Hynes N.E.,等Nat Rev.Cancer 5,341-354(2005))。EGFR特异性2'F-RNA适配体(Esposito,C.L,等PLoS ONE 6,e24071(2011)；Shu,D.,等ACS Nano9,9731-9740(2015))被掺入至pRNA-3WJ的一个末端，并且从而展示在EV上以用于增强的乳腺癌细胞靶向。对于成像，pRNA-3WJ链中的一条用荧光染料Alexa647进行末端标记(图12h)。如通过NTA和DLS测量，RNA纳米颗粒修饰的EV的尺寸分布和ζ电位与天然EV相比未显著改变(图12f-g)。
存活蛋白(一种细胞凋亡的抑制剂)为用于癌症疗法的有吸引力的靶，因为它的敲低可以减少致瘤性并且抑制转移(Paduano,F.,等Molecular Cancer Therapeutics 5,179-186(2006)；Khaled,A.,等Nano Letters 5,1797-1808(2005))。与装载在EV中的存活蛋白siRNA(图12i)组合，制备了具有靶向部分的siRNA装载的EV以评价体内前列腺癌、乳腺癌和结肠癌抑制效力。为了改进siRNA在体内的稳定性，过客链为在嘧啶上2'-F修饰的以提供RNA酶耐受性，而指导链保持未修饰(Cui,D.等Scientific reports 5,10726(2015)；Lee,T.J.等Oncotarget 6,14766-14776(2015))。为了追踪EV中的siRNA装载效率，将存活蛋白siRNA与Alexa647标记的3WJ核心融合并且组装为RNA纳米颗粒(图18b)。在将siRNA装载到EV中并且用PSMAapt/3WJ/胆固醇RNA纳米颗粒装饰EV之后，如通过NTA测量在103nm和120nm处具有两个峰，EV的尺寸未显著改变(图12f)。将存活蛋白-3WJ RNA纳米颗粒在具有ExoFect但不具有EV的PBS中处理，显示出不同的粒径分布谱(PBS/si存活蛋白)和低约40倍的颗粒浓度(图18e)。如通过游离RNA纳米颗粒的荧光强度测量，siRNA-3WJ RNA纳米颗粒的装载效率为约70％(图18d)。不具有EV或仅具有ExoFect试剂的对照显示出低至15％沉淀。
2.RNA纳米颗粒的箭头头部或箭头尾部胆固醇标记分别导致EV装载或膜展示。
2.1.使用血清消化测定区分进入EV或EV上的表面展示。
使用箭头状pRNA-3WJ纳米结构的取向和角度来控制EV的RNA装载或表面展示。进行血清消化以确认2'-F RNA纳米颗粒与EV的定位。尽管2'-F 3WJ RNA纳米颗粒对RNA酶相对耐受(图19a)，它们可以在67％胎牛血清(FBS)中消化并且在37℃孵育2小时(图19b)。通过超速离心从游离RNA纳米颗粒纯化展示Alexa647-2'F RNA纳米颗粒的EV，然后经历血清消化。在37℃FBS孵育之后，EV装饰的箭头尾部上具有胆固醇的Alexa647-2'F RNA(31.6％±8.8％)比箭头头部胆固醇装饰的对应物(9.5％±11.9％)降解多得多(图13a-d)。这些结果表明箭头尾部上的胆固醇促进了EV表面上的叶酸-3WJ或RNA适配体的展示并且因此被降解；而箭头头部上的胆固醇促进RNA纳米颗粒进入EV，如通过Alexa647-2'F RNA纳米颗粒针对血清消化的保护所证明的。在箭头尾部构型中，似乎形成60°角的两个臂可以充当钩以将RNA纳米颗粒锁定在适当位置。如果是这种情况，该作用会阻止钩状RNA通过膜(图13a)。
在血清消化实验中使用的FBS的浓度有目的地保持非常高以降解EV上的外部展示的RNA。已经证明装饰的PSMAapt-3WJ 2'F RNA纳米颗粒在生理条件下保持稳定和完整(Binzel,D.,等Molecular Therapy 24,1267-1277(2016)；Shu,D.,等ACS Nano 9,9731-9740(2015))。
2.2.通过竞争测定区分进入EV或EV上的表面展示。
如以上描述的，当胆固醇与pRNA-3WJ的箭头尾部附接时，RNA纳米颗粒被锚定在EV的膜上，并且所掺入的配体展示在EV的外表面上(图13a)。通过使用箭头-尾部胆固醇RNA纳米颗粒在EV表面上展示叶酸来检测EV与过表达叶酸受体的KB细胞结合的增加(图13e、图13f)。当与低叶酸受体表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞一起孵育时，与无箭头尾部配体3WJ/EV相比，箭头尾部状FA-3WJ/EV未增强其细胞结合(图13g)。叶酸的表面展示通过游离叶酸竞争测定进一步确认，其中建立了由胆固醇箭头尾部FA-3WJ/EV与KB细胞的结合基线。当添加10μM游离叶酸以与胆固醇-箭头-尾部FA-3WJ/EV竞争叶酸受体结合时，检测到与KB细胞的细胞结合的减少(48.3％±0.6％)(图13f)。相比之下，箭头状FA-3WJ/EV中游离叶酸与KB细胞的结合的竞争(图13h)低得多(24.8％±0.6％)(图13i)，这可能是由于箭头-头部状FA-3WJ纳米颗粒部分内化到EV中，这导致EV表面上叶酸的展示强度较低。
EV可以通过在细胞之间转运mRNA、siRNA、miRNA或蛋白和肽来介导细胞间通讯。它们通过多种途径内化进受体细胞，所述多种途径包括微胞饮、受体介导的胞吞或脂筏介导的胞吞(Marcus,M.E.,等Pharmaceuticals.(Basel)6:659-680(2013))。尽管用于EV摄取的天然过程不是配体依赖性的，箭头-尾部胆固醇RNA-3WJ允许将配体展示到EV表面上，并且增加其对对应的受体过表达癌细胞的靶向效率。
3.在细胞培养物中RNA展示EV的癌症靶向和基因沉默
特异性癌细胞靶向为将纳米囊泡应用于癌症疗法的一个重要先决条件。在PSMA阳性的LNCaP前列腺癌细胞中检查PSMA适配体-展示EV的靶向、递送和基因沉默效率。为了赋予RNA酶耐受性，将2'-F修饰应用于放置于EV的表面上的RNA纳米颗粒(Shu,D.,等NatureNanotechnology 6:658-667(2011))，而pRNA-3WJ的热力学稳定性提供了确保RNA适配体的正确折叠的刚性结构(Shu,D.,等Nature Nanotechnology6:658-667(2011)；Binzel,D.W.等Biochemistry 53:2221-2231(2014))。通过流式细胞术和共聚焦显微术分析，与不具有PSMA适配体的EV相比，PSMA适配体展示EV显示出对PSMA(+)LNCaP细胞的增强的结合和明显的摄取，但对PC-3细胞(其为低PSMA受体表达细胞系)未显示出(图14a)。在与LNCaP细胞一起孵育后，PSMAapt/EV/si存活蛋白能够在mRNA水平(如通过实时PCR证明的)(69.8.1％±9.37％,p<0.001)(图14b)和蛋白水平(如通过蛋白印迹显示的)(62.89％±8.5％,p<0.05)(图20)敲低存活蛋白表达。通过MTT测定的细胞存活力表明，由于存活蛋白siRNA递送，LNCaP细胞的存活力降低(69.6％±6.4％,p<0.05)(图14c)。
4.配体展示EV靶向肿瘤
评价配体展示EV的肿瘤靶向和生物分布特性。将FA-3WJ/EV经由尾静脉全身施用到KB皮下异种移植物小鼠模型中。测试3WJ/EV和PBS治疗的小鼠作为对照。在8小时之后拍摄的小鼠健康器官和肿瘤的离体图像显示FA-3WJ/EV主要在肿瘤中积累，与PBS对照小鼠相比在重要器官中低积累，并且与3WJ/EV对照小鼠相比在肿瘤中更多积累(图15a)。不具有表面修饰的正常EV通常在全身递送之后显示在肝中积累(Ohno,S.,等Mol Ther.21:185-191(2013))。RNA和细胞膜两者带负电荷。已经证明静电排斥作用在降低健康器官中RNA纳米颗粒的积累方面发挥作用(Binzel,D.,等Molecular Therapy 24:1267-1277(2016)；Shu,D.,等ACS Nano 9:9731-9740(2015)；Haque,F.,等Nano Today 7:245-257(2012))。推测在EV表面上展示靶向RNA降低它们在正常器官中的积累，并且理想纳米尺寸的RNA展示EV经由增强渗透性和保留(EPR)作用便于肿瘤靶向，从而避免毒性和副作用。
5.如动物试验中证明的，通过配体-3WJ-展示EV抑制肿瘤生长
5.1.PSMA适配体展示EV完全抑制小鼠中前列腺癌的生长。
PSMA适配体展示EV用于前列腺癌治疗的治疗作用使用LNCaP-LN3肿瘤异种移植物来评价(Li,Y.,等Prostate Cancer Prostatic.Dis.5:36-46(2002)；Pettaway,C.A.,等Clin.Cancer Res 2:1627-1636(1996))。与对照组相比，用PSMAapt/EV/si存活蛋白治疗(每3天1个剂量；总计6个剂量)完全抑制体内肿瘤生长(图15b)。EV为生物相容的并且在体内良好耐受的，因为未观察到显著的毒性，如在治疗后40天内评价的小鼠体重指示的(图15c)。通过使用GAPDH作为内部对照的实时PCR分析肿瘤中的存活蛋白mRNA表达水平显示通过PSMAapt/EV/si存活蛋白敲低存活蛋白的趋势(图15d)。总之，PSMA适配体展示EV为用于在体内递送存活蛋白siRNA的有前景的载体，并且PSMAapt/EV/si存活蛋白的全身注射可以实现期望的治疗效力。
在前列腺癌研究中，体内癌症生长抑制作用比体外MTT测定更明显。PSMA适配体在EV的表面上的展示轻微增强了其在体外对PSMA受体过表达的癌细胞的靶向，而EV表面上的带负电荷RNA可能已经最小化其对健康细胞的非特异性分布，如在FA-3WJ/EV生物分布测试中观察到的。EPR作用还可以促进将纳米尺寸EV在体内归巢到肿瘤中；尽管图15a中呈现的生物分布可能不适于图15b中呈现的功能评价。所有这些结果表明RNA适配体展示EV适于体内应用。
5.2.EGFR适配体展示EV抑制小鼠中乳腺癌的生长。
乳腺癌细胞中EGFR的过表达与高度增殖以及接受治疗的患者中的复发风险相关(Rimawi,M.F.,等Cancer 116:1234-1242(2010))。构建携带EGFR适配体的pRNA-3WJ纳米颗粒(图21a)用于在EV表面上展示，并且EV被装载有存活蛋白siRNA。将所得的EGFRapt/EV/si存活蛋白经由尾静脉施用到携带MDA-MB-468原位异种移植物肿瘤的小鼠中。3WJ/EV/si存活蛋白(不具有靶向配体)和PBS治疗的小鼠用作对照。分析用每组三只小鼠来完成。在8小时之后拍摄的离体图像显示在肿瘤中积累的EGFRapt/EV/si存活蛋白比对照组的多(图16a)，表明在EV的表面上展示EGFR适配体大大增强了其在体内的肿瘤靶向能力(Li,Y.,等Prostate Cancer Prostatic.Dis.5:36-46(2002)；Pettaway,C.A.,等Clin.Cancer Res2:1627-1636(1996))。如通过肿瘤体积监测的，与对照相比，用0.5mg siRNA/kg小鼠体重的剂量的EGFRapt/EV/si存活蛋白的治疗(每周6个剂量)显著抑制体内肿瘤生长(图16b)。通过蛋白印迹(图16c)和定量实时PCR(图16d)(其中GAPDH被用作内部归一化对照)两者，由来自每一组的三个代表性肿瘤验证了存活蛋白的特异性敲低。结果表明，存活蛋白siRNA至乳腺肿瘤细胞的成功递送在蛋白和mRNA水平两者均抑制了存活蛋白的表达。
5.3.叶酸展示EV抑制小鼠中结肠直肠癌的生长。
如通过对来自9名结肠直肠癌患者的肿瘤组织的免疫组织化学(IHC)成像测试的，存活蛋白基因(抗凋亡蛋白)在大多数结肠直肠癌中上调(图22)。利用相似的策略，构建携带叶酸的pRNA-3WJ纳米颗粒(图21b)用于在EV表面上展示，并且EV被装载有存活蛋白siRNA。然后在临床相关的患者来源的CRC异种移植物(PDX-CRC)小鼠模型中评价官能化的EV。与对照组相比，用0.5mg siRNA/kg小鼠体重的剂量的FA/EV/si存活蛋白的治疗(每周6个剂量)显著抑制体内肿瘤生长，如通过肿瘤体积和肿瘤重量测量的(图17a-b)。数据表明叶酸展示EV可以被用作递送用于结肠直肠癌治疗的siRNA的载体。
讨论
RNA干扰技术(诸如siRNA)敲低基因表达的应用已经引起了极大关注(Pecot,C.V.,等Nat Rev.Cancer 11:59-67(2011))。纳米尺寸EV(EL-Andaloussi S.,等NatRev.Drug Discov.12:347-357(2013)；Valadi,H.等Nat Cell Biol 9:654-659(2007)；El-Andaloussi,S.等Adv.Drug Deliv.Rev.65:391-397(2013)；van Dommelen,S.M.,等JControl Release 161:635-644(2012))可以通过四次穿膜蛋白结构域与细胞膜直接融合或与内体区室膜回融合(back-fusion)以用于释放内体逃逸将生物分子递送到细胞中。治疗性有效载荷诸如siRNA在递送至细胞中之后可以是有完整功能的(Pecot,C.V.,等NatRev.Cancer 11:59-67(2011))。纳米尺寸EV(EL-Andaloussi S.,等Nat Rev.DrugDiscov.12:347-357(2013)；Valadi,H.等Nat Cell Biol 9:654-659(2007)；El-Andaloussi,S.等Adv.Drug Deliv.Rev.65:391-397(2013)；van Dommelen,S.M.,等JControl Release 161:635-644(2012))。然而，EV缺乏选择性，并且还可以与健康细胞随机融合。为了产生特异性细胞靶向EV，已经探索了通过在EV的表面上体内表达细胞特异性肽配体的方法(varez-Erviti,L.,等Nat Biotechnol.29:341-345(2011)；Ohno,S.,等MolTher.21:185-191(2013))。然而，蛋白配体的体内表达限于配体在产生其的细胞类型中的可用性(EL-Andaloussi S.,等Nat Rev.Drug Discov.12:347-357(2013)；van Dommelen,S.M.,等J Control Release 161:635-644(2012)；Wiklander,O.P.,等JExtracell.Vesicles.4,26316(2015))。使用在EV上展示基于核酸或化学靶向配体的体外表面展示技术用于体内癌细胞靶向将是期望的。
该实施例报道了RNA纳米技术的体外应用(Guo,P.Nature Nanotechnology 5:833-842(2010))，以重编程天然EV以用于将siRNA特异性递送至体外癌症模型和动物模型中(图12a-图12c)。利用pRNA-3WJ的热力学稳定特性(Shu,D.,等Nature Nanotechnology6:658-667(2011)；Binzel,D.W.等Biochemistry 53:2221-2231(2014)；Shu,D.,等NucleicAcids Res.42:e10(2013))，产生携带膜锚定脂质结构域、成像模块和靶向模块的多功能RNA纳米颗粒。箭头状pRNA-3WJ提供了控制将RNA部分装载到EV中或装饰EV的表面上的配体的机会。随着胆固醇放置于3WJ的箭头尾部上，RNA-配体被阻止运输到EV中，确保用于癌症受体结合的靶向模块的定向表面展示。这由以下明确地证明：通过血清消化和叶酸竞争测定(图13f)、以及通过在PSMA适配体展示之后增强的与LNCaP细胞的结合(图14a)以及在体内乳腺癌期间通过EGFR适配体展示(图16a)。另外，在箭头头部上放置胆固醇允许RNA纳米颗粒部分内化到EV内(图13b、图13h)。将箭头尾部3WJ-RNA纳米颗粒掺入至EV的表面不仅向EV提供了靶向配体，而且在EV表面添加了负电荷。在EV表面上展示带负电荷的RNA纳米颗粒可能能够降低EV与正常细胞的非特异性结合，因为具有适当配体的带负电荷的RNA纳米颗粒在全身施用之后倾向于特异性积累到肿瘤中(Binzel,D.,等Molecular Therapy 24:1267-1277(2016)；Shu,D.,等ACS Nano9:9731-9740(2015)；Haque,F.,等Nano Today 7:245-257(2012))。胆固醇-TEG修饰的RNA纳米颗粒应该优先锚定到EV的脂质双层的筏形成结构域上(Bunge,A.,等J Phys Chem.B 113:16425-16434(2009))，并且有必要进行进一步的研究说明这一过程。EV具有在受体介导的胞吞之后与内体区室膜反融合的内在能力(EL-Andaloussi S.,等Nat Rev.Drug Discov.12:347-357(2013)；Valadi,H.等Nat Cell Biol9:654-659(2007)；El-Andaloussi,S.等Adv.Drug Deliv.Rev.65:391-397(2013))。公开的体外装饰方法保存了作为递送载体的EV的有利内源组成，因此与使用用于siRNA递送的其他合成纳米载体相比，消除了将人工内体逃逸策略构建到EV载体中的需求(Varkouhi,A.K.等J Control Release 151:220-228(2011)；Kilchrist,K.V.等Cell Mol Bioeng.9:368-381(2016))。
总之，该实施例证明了使用RNA纳米技术对天然EV的有效重编程。纳米颗粒取向控制EV上的RNA装载或表面展示以用于有效的细胞靶向、siRNA递送和癌症衰退。重编程的EV展示出稳健的生理化学特性、增强的癌细胞特异性结合、以及抑制动物模型中的肿瘤生长的有效的细胞内siRNA释放。
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物及关于其引用的材料通过引用被特别并入。
本领域技术人员仅仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物意图被以下权利要求包括。
用于通过RNA纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的RNA配体展示外来体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月6日提交的美国临时申请第62/319,104号、和2016年8月26日提交的申请序列第62/380,233号的权益，将这些申请在此通过引用以其整体并入本文。
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本发明根据由美国国立卫生研究院(the National Institute of Health)授予的资助号R01EB019036；R01EB012135；U01CA151648；RO1EB003730；R01EB019036；R01EB012135；U01CA151648；R01EB003730；UH3TR000875；和UH3TR000875在政府支持下进行。政府具有本发明中的某些权利。
背景
特异性癌细胞靶向RNAi药物递送为用于许多疾病治疗包括癌症的非常有前景的策略。来自细胞内体膜的天然来源的纳米囊泡的外来体体外显示出非常令人鼓舞的将siRNA递送到细胞中的能力。但为了克服生理屏障并且在体内实现治疗作用，需要具有特异性癌细胞靶向特性的外来体。本文公开了用于生物发生后将配体展示到外来体表面的方法和组合物。RNA纳米结构可以被用作将基于RNA或化学品的配体展示到外来体表面上的工具，因此增加它们的细胞靶向特异性，并且因此可以被用于将治疗试剂(诸如RNAi治疗剂)特异性递送至靶向的细胞。
源自phi29DNA包装马达的包装RNA的RNA纳米结构已经显示出对于药物递送的巨大前景。pRNA的3WJ结构域为高度热力学稳定的，可以由3个具有高亲和力的短RNA寡核苷酸片段形成。此外，当使用3WJ作为核心用于构建RNA纳米颗粒时，3WJ可以驱动RNA纳米颗粒的总体折叠并且确保融合的适配体序列的正确折叠以保持功能。
将胆固醇应用至修饰的pRNA-3WJ以用于将配体展示到外来体表面。结果表明，化学配体和RNA适配体两者均可以经由胆固醇修饰的pRNA3WJ被展示在外来体上。配体展示外来体在体外具有增强的特异性肿瘤结合效率。在动物实验中，配体展示外来体在全身注射之后在肿瘤中显示出特异性积累。外来体还装载有siRNA，配体展示外来体可以在体外和体内增强至靶癌细胞的siRNA递送效率。
RNAi治疗剂对于治疗多种疾病包括癌症是非常有前景的，因为它具有修饰疾病基因表达的能力。然而，尽管经过多年的广泛研究，仍然缺乏有效且生物相容的RNAi递送系统。尽管脂质体在体外siRNA递送方面显示出巨大的成功，但当体内全身性施用时，问题在于肝积累和冻融循环，引起最终产物不稳定。
外来体，是一种起源于细胞内体膜的纳米级囊泡，近来作为RNAi药物递送系统已经被广泛研究。但要实现特异性癌细胞靶向仍然具有挑战性。当前的技术正在探索在外来体产生细胞上表达癌细胞特异性配体以增加外来体特异性，诸如在HEK293T细胞上的作为融合蛋白的外来体膜上的过表达肽配体。但使用融合肽用于靶向的外来体递送的一个问题为展示的肽可能在外来体生物发生期间被降解。
本领域需要的是用于通过RNA技术将治疗剂特异性递送至细胞的RNA配体展示外来体。
概述
在不损害健康细胞的情况下将治疗剂递送至患病细胞为医学中的主要挑战。外来体(20-100nm胞吞起源的特化膜囊泡)由于其以下的固有能力具有将RNA干扰(RNAi)剂、基因组编辑和修复模块以及化学治疗剂递送至患病细胞的巨大潜力：(1)以高效率与受体细胞融合以及(2)将包装的治疗性货物(cargo)递送至胞质溶胶，充分表达DNA和RNA，而在内体中不被捕获。然而，它们缺乏特异性细胞靶向能力以及在肝和其他健康器官中的非特异性积累为降低其治疗效力的主要问题。RNA纳米技术可以用于产生能够特异性靶向癌细胞的RNA纳米颗粒，而在健康的重要器官中很少或没有积累。然而，在经由受体介导的胞吞内化到癌细胞之后，RNA纳米颗粒可能在内体中被捕获，并且其内体逃逸效率仍然很低，因此治疗性货物具有有限的效力。本文将“外来体”和“RNA纳米技术”的领域组合以在外来体表面上展示特定配体。工程化外来体能够特异性靶向患病细胞并且有效地进入细胞以将其货物递送至胞质溶胶而在内体中不被捕获。
本文公开了一种组合物，所述组合物包含外来体，其中所述外来体在其表面上展示RNA纳米颗粒，例如锚定在外来体膜内。纳米颗粒可以是基于核酸诸如RNA的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒由三条或更多条核糖核酸链组装，所述三条或更多条核糖核酸链被双链化在一起以形成具有三个或更多个突出茎环的二级结构。在一些实施方案中，纳米颗粒在三个或更多个突出茎环中的一个处包含膜锚定部分。在一些实施方案中，纳米颗粒在剩余茎环处包含一个或更多个功能部分。
在一些实施方案中，三个或更多个核糖核酸链中的至少一个包含pRNA-3WJ核。例如，RNA纳米颗粒可以由三条核糖核酸链组装，所述三条核糖核酸链包含核酸序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，膜锚定部分包含胆固醇或修饰的胆固醇。胆固醇为疏水性的，并且当与寡核苷酸缀合时，可以便于摄取到细胞。在一些实施方案中，胆固醇还包含三甘醇(TEG)间隔物，其可以进一步增加细胞摄取。也可以使用能够将寡核苷酸锚定在外来体的脂质双层膜中的其他亲脂性部分。
在一些实施方案中，一个或更多个功能部分包含靶向部分。靶向部分可以例如将外来体导向感兴趣的细胞。在一些实施方案中，靶向部分选自RNA适配体、修饰的RNA适配体、DNA适配体、修饰的DNA适配体和化学配体。
在一些实施方案中，功能部分包含治疗部分或诊断部分。例如，治疗部分或诊断部分可以包括RNA适配体、核酶、siRNA、蛋白结合RNA适配体或小分子。
在一些实施方案中，纳米颗粒的三个或更多个突出茎环被构造为使得第一茎环在第一方向突出，并且所述第二茎环和第三茎环基本上远离所述第一方向突出。
还公开了一种将外来体靶向细胞的方法，所述方法包括：使细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分，其中所述靶向部分将所述外来体导向感兴趣的细胞。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞，诸如癌细胞。在一些实施方案中，RNA纳米颗粒还包含功能部分，诸如治疗部分或诊断部分。
还公开了一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括将在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体施用至所述受试者，其中纳米颗粒包含至少一个靶向部分，并且其中所述外来体还包含功能部分，其中所述功能部分部分能够治疗受试者中的疾病。例如，在一些实施方案中，疾病为感染。在一些实施方案中，疾病为癌症。
还公开了一种使细胞成像的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分、至少一个诊断部分。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞。
附图说明
图1示出了用于编程天然外来体的RNA纳米技术方法。外来体用携带以下的RNA纳米颗粒的装饰：用于膜锚定的疏水性结构域；用于特异性细胞结合的靶向配体；以及用于物理障碍以阻断在外来体中包封的RNA凸起(knobs)。包装到外来体中用于细胞递送的货物包括siRNA、miRNA、dsDNA或CRISPR-RNA模块。
图2A和图2B示出了携带以下的pRNA-3WJ纳米颗粒的示意图(图2A)和组装(图2B)：用于靶向的叶酸、用于膜锚定的胆固醇；以及用于成像的Alexa-647。a3WJ(SEQ ID NO:1)-叶酸；b3WJ(SEQ ID NO:2)-胆固醇；c3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图3A至图3D示出了来自HEK293细胞的外来体的表征。图3A包含显示外来体具有特征性杯形形态的EM图像。图3B包含显示提取的外来体的尺寸(66±15nm)的DLS(动态光散射)测定。图3C示出了外来体的明显的ζ电位(--18±15mV)。图3B包含显示外来体标志物TSG101富集的蛋白印迹。
图4A示出了从游离RNA尺寸排阻纯化携带pRNA-3WJ的外来体。图4B包含显示在细胞周围明亮的荧光环的共聚焦图像，表明胆固醇部分在细胞膜中的成功锚定(与没有胆固醇的对照相比)。a3WJ(SEQ ID NO:1)-叶酸；b3WJ(SEQ ID NO:2)；b3WJ(SEQ ID NO:2)-胆固醇；C3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图5A示出了外来体进入到受体细胞的常见机制。图5B示出了携带叶酸作为靶向配体的外来体可以通过叶酸受体介导的胞吞以及通过经由四跨膜蛋白和融合蛋白结构域与质膜融合进入HT29结肠直肠癌细胞。共聚焦图像为细胞核；细胞质；和具有表面锚定RNA的外来体的叠加。
图6A和图6B为全身(图6A)和内脏器官(图6B)的图像，显示全身注射后FA-3WJ-外来体特异性靶向的叶酸受体(+)KB细胞皮下异种移植物，并且在8小时之后在任何重要器官中未被检测到。
图7A为显示将RNAi装载到外来体中的效率>95％的荧光测定。图7B为显示在叶酸-3WJ-外来体与表达萤光素酶的叶酸受体(+)KB细胞一起孵育之后萤光素酶的特异性敲低(knockdown)(>80％)的双重萤光素酶测定。
图8A和图8B示出了基于生物发光成像，在全身注射之后KB细胞异种移植物中萤光素酶的特异性敲低。处理：靶向包封萤光素酶siRNA的3WJ-外来体的叶酸受体。对照：不具有叶酸但具有活性siRNA(萤光素酶)的3WJ-外来体。箭头指示注射时间点。(N＝3)；***p<0.001。
图9A至图9C为显示siRNA对Akt2的抑制抑制了结肠直肠癌细胞(在脾内注射)建立肝转移的能力的图像(图9A)、qRT-PCR结果(图9B)、和蛋白印迹结果(图9C)。NTC：无模板对照。图9D示出了在全身递送PI3KsiRNA之后对转移性肿瘤生长的抑制(在第35天成像)。癌细胞表达GFP。NTC：无模板对照。
图10包含显示Alexa647-pRNA-3WJ-EpCAM-适配体强结合并且进入HT29结肠直肠癌细胞的共聚焦图像。适配体选自基于RNA纳米技术的新型2'-F 3WJ文库。
图11A和图11B示出在原位小鼠模型中全身递送pRNA-3WJ-EGFR-antimiR-21之后对三阴性乳腺肿瘤生长的抑制。图11C为显示miR-21靶基因PTEN和PDCD4的上调的蛋白印迹。图11D示出了使用Ki67作为肿瘤细胞增殖的指示物以及活化的胱天蛋白酶-3作为肿瘤细胞凋亡的指示物的免疫组织化学测定的结果。
图12A至图12I示出了用于装饰天然EV的RNA纳米技术。图12A为噬菌体phi29的马达pRNA的延伸的3WJ的AFM图像。图12B为3WJ的箭头头部或箭头尾部(arrow-tail)的胆固醇标记的位置的图示。图12C包含来自用差速超速离心法和缓冲垫修改超速离心法(cushionmodified ultracentrifugation method)纯化的HEK293T细胞的EV的阴性染色的EM图像。图12D至图12G示出了用于尺寸分析的NTA和用于ζ电位测量的DLS。图12H示出了用于测试来自三个组分链的3WJ组装的2D结构(左图)及天然PAGE，如指示的。图12I示出了EV装载和RNA适配体展示。a3WJ(SEQ ID NO:1)；a3WJ(SEQ ID NO:1)-胆固醇；b3WJ(SEQ ID NO:2)；b3WJ(SEQ ID NO:2)-胆固醇；b3WJ(SEQ ID NO:2)-Alexa647；c3WJ(SEQ ID NO:3)；c3WJ-PSMAapt(SEQ ID NO:7)。
图13A至图13I示出了箭头头部与箭头尾部3WJ之间作用的比较。图13A和图13B包含显示箭头头部与箭头尾部展示之间的差异的图示。图13C示出了通过FBS中的RNA酶测试箭头头部和箭头尾部的Alexa647-3WJ/EV降解的Syner凝胶。图13D示出了在Alexa647通道成像的凝胶以及通过Image J定量的条带的结果。图13E至图13I示出了比较叶酸受体阳性和阴性细胞上的叶酸-3WJ箭头尾部(图13E至图13G)和箭头头部(图13H至图13I)的细胞结合的测定的结果。
图14A至图14C示出了使用PSMA适配体展示EV在体外对细胞的特异性结合和siRNA递送。图13A包含显示PSMA RNA适配体展示EV与PSMA-受体阳性和阴性细胞的结合的流式细胞术图像(左)和共聚焦图像(右)。细胞核、细胞骨架和RNA在共聚焦图像中被标记。图13B示出了通过EV的PSMA适配体介导的存活蛋白siRNA向PSMA(+)前列腺癌细胞的递送的RT-PCR测定。统计：n＝3；实验以双侧t检验以三个生物学重复和三个技术重复运行；将PSMAapt/EV/si存活蛋白分别与PSMAapt/EV/si加扰(PSMAapt/EV/siScramble)和3WJ/EV/si存活蛋白进行比较，p＝0.0061，0.0001。图13C包含显示降低的细胞增殖的MTT测定。n＝3，将PSMAapt/EV/si存活蛋白分别与PSMAapt/EV/si加扰和3WJ/EV/si存活蛋白进行比较，p＝0.003，0.031。*p<0.05,**p<0.01。
图15A至图15C示出了使用配体展示EV用于肿瘤抑制的动物试验。图15A示出了用PSMAapt/EV/si存活蛋白或PSMAapt/EV/si加扰(两者具有0.6mg/kg，siRNA/小鼠体重)和PBS对携带LNCaP-LN3皮下异种移植物的裸小鼠的静脉内治疗，每周两次注射持续三周。n＝10个生物学重复，2个独立实验，并且统计使用双侧t检验计算以平均值以及标准差表示，与对照相比，PSMAapt/EV/存活蛋白分别在第15天、第18天、第22天、第25天、第29天、第32天、第36天和第39天时，p＝0.347、0.6-2、1.5e-6、8.2e-8、2.1e-7、1.0e-7、1.9e-7、1.8e-6。图15B包含显示在EV治疗之后前列腺肿瘤中敲低的存活蛋白mRNA表达的趋势的RT-PCR的结果。图15C示出了在EV治疗时间过程期间小鼠的体重。
图16A至图16D示出了EGFR适配体展示EV可以将存活蛋白siRNA递送至乳腺癌原位异种移植物小鼠模型中。图16A示出了EGFR适配体展示EV在原位异种移植物小鼠模型中显示出对乳腺肿瘤的增强的靶向作用。图16B示出了用EGFRapt/EV/si存活蛋白和对照(n＝5)对携带乳腺癌原位异种移植物的裸小鼠的静脉内治疗。在6周之后，EGFRapt/EV/si存活蛋白治疗的组具有显著小于其他对照的肿瘤尺寸。将EGFRapt/EV/si存活蛋白与EGFRapt/EV/si加扰进行比较，p＝0.008。图16C包含肿瘤提取物中蛋白表达的分析，其显示EGFRapt/EV/si存活蛋白处理显著降低存活蛋白的表达，将EGFRapt/EV/si存活蛋白与EGFRapt/EV/si加扰进行比较，p＝0.0004。图16D包含来自肿瘤的提取的RNA的定量实时PCR分析，其显示EGFRapt/EV/si存活蛋白治疗的小鼠中的存活蛋白mRNA与对照相比的降低。将EGFRapt/EV/si存活蛋白与EGFRapt/EV/si加扰进行比较，p＝0.024。误差条(Error bars)指示s.e.m。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图17A至图17C示出了叶酸展示EV可以将存活蛋白siRNA递送至患者来源的结肠直肠癌异种移植物(PDX-CRC)小鼠模型。图17A包含器官图像，显示在将叶酸展示EV全身注射到具有皮下KB细胞异种移植物的小鼠之后8小时的特异性肿瘤靶向，n＝2，两个独立实验。图17B示出了用FA/EV/si存活蛋白和对照(n＝4)对携带PDX-CRC异种移植物的裸小鼠的静脉内治疗。在6周之后，FA/EV/si存活蛋白治疗的组具有显著更小的肿瘤尺寸，分别在第4周和第5周将FA/EV/si存活蛋白与FA/EV/si加扰进行比较，p＝0.0098和0.0387。图17C示出了在治疗之后与对照相比更低的肿瘤重量。将FA/EV/si存活蛋白与FA/EV/si加扰进行比较，p＝0.0024。误差条(Error bars)指示s.e.m。*p<0.05，**p<0.01。
图18A至图18E示出了PSMAapt/EV/si存活蛋白纳米颗粒的物理特性。图18A示出了测试来自纯化的HEK293T EV的EV标志物TSG101的存在的蛋白印迹测定。检测到EV对于整联蛋白α5、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β4、整联蛋白β5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的表达为阴性。HEK293T细胞裂解物和LNCaP细胞裂解物被用作对照。等量的细胞裂解物被用作阴性对照。图18B示出了携带存活siRNA序列的3WJ的一级序列和二级结构。图18C示出了用差速超速离心法或OptiPrep缓冲垫修改超速离心法从HEK293T细胞培养基纯化的EV的EM图像。图18D示出了siRNA到EV中的装载效率。对没有转染试剂Exo-Fect或EV的对照样品进行测试。在“无EV”对照样品中，将Alexa647标记的3WJ-存活蛋白RNA纳米颗粒用ExoFect处理，并且在添加ExoTC之后沉淀下来。在沉淀物中检测到约15％的Alexa647-3WJ-存活蛋白RNA，这可能是由与ExoTC形成复合物引起的。图18E示出了对3WJ-存活蛋白siRNA装载的EV或不具有EV的阴性对照或仅PBS定量颗粒量并且测试粒径分布的NTA的结果。a3WJ-存活蛋白基因(SEQ ID NO:5)；存活蛋白反义(SEQ ID NO:6)；b3WJ(SEQ ID NO:2)；C3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图19A和图19B示出了消化3WJ-胆固醇2'F RNA纳米颗粒的条件。图19A示出了2'FAlexa647-3WJ-胆固醇RNA纳米颗粒不能被在测试浓度的RNA酶A消化。图19B示出了它可以在67％FBS中被消化。将天然聚丙烯酰胺凝胶使用Cy5通道用Typhoon(GE healthcare)成像。在37℃与67％FBS一起孵育2小时的条件用于测试EV是否可以保护箭头头部或箭头尾部胆固醇展示3WJ 2'F RNA纳米颗粒。
图20A至图20D示出了在体外使用PSMA适配体展示EV对细胞的特异性siRNA递送。通过EV的PSMA适配体介导的存活蛋白siRNA至PSMA(+)前列腺癌LNCaP细胞(图20A)和PSMA(-)前列腺癌PC3细胞(图20B)的递送的蛋白印迹测定。图20C和图20D示出了用Image J软件并且将相对存活蛋白表达水平归一化为β-肌动蛋白的3个独立实验的定量条带强度。
图21A和图20B示出了RNA纳米颗粒的一级序列和二级结构。图21A显示用于乳腺癌研究的EGFRapt/3WJ/胆固醇RNA纳米颗粒。图21B示出了用于结肠直肠癌研究的FA/3WJ/胆固醇RNA纳米颗粒。a3WJ(SEQ ID NO:1)-胆固醇；b3WJ(SEQ ID NO:2)；b3WJ-EGFRapt(SEQ IDNO:10)；c3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647；叶酸-c3WJ(SEQ ID NO:3)-Alexa647。
图22示出了CRC PDX肿瘤中存活蛋白表达的分析。对于存活蛋白(存活蛋白(71G4B7)兔mAb#2808；Cell Signaling,1:500)的免疫组织化学染色的实例(n＝9个患者样品)。
详细说明
通过参考本文包括的以下详细描述、附图和实施例，可以更容易地理解所公开的主题。
在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应当理解的是，除非另外指明，它们不限于特定的合成方法，或者除非另外指明，它们不限于特定的试剂，因此它们当然可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅为了描述特定的方面的目的并且不被意图是限制性的。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料均可以用于实践或测试本发明，现在描述了示例性方法和材料。
此外，应当理解的是，除非另外明确说明，不以任何方式意图将本文阐述的任何方法解释为要求以特定顺序进行其步骤。因此，在方法权利要求实际上未叙述其步骤应遵循的顺序，或者在权利要求或说明书中未另外具体说明步骤被限于特定顺序的情况下，在任何方面决不意图顺序被推断出来。这适于任何可能的非明示的解释基础，包括关于步骤或操作流程的布置的逻辑问题、源自语法组织或标点的明确含义以及说明书中描述的方面的数目或类型。
本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开并且描述所引用的出版物相关的方法和/或材料。提供本文讨论的出版物仅由于它们的公开内容在本申请的递交日期之前。本文不应解释为承认由于先前发明使得本发明不具有优先于此类出版物的资格。此外，本文提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立确认。
应当理解的是，所公开的方法和系统不限于所描述的特定方法、方案和系统，因为这些可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限制。
SiRNA和miRNA具有沉默基因的潜力，DNA可以救援基因，并且RNA模块可以通过CRISPR方法编辑基因组。但，它们向人类身体中的细胞的胞质溶胶的递送是主要障碍。几种合成的纳米平台已经在特定的癌症靶向和递送方面取得了一定程度的成功，但纳米颗粒可能被肝脏中的Kupffer细胞以及肺和脾中的巨噬细胞捕获，导致到达靶细胞的低效率以及非特异性毒性或副作用。一种策略为使用外来体用于递送治疗剂。外来体能够跨越异质生物学屏障将其内容物递送至受体细胞而在内体中不被捕获。它们在体内是良好耐受的，并且可以是免疫原性惰性的。然而，它们缺乏选择性，并且也可以与正常细胞随机融合。对于临床翻译，主要障碍是对这些天然来源的外来体进行重编程以携带靶向配体以确保向患病细胞的特异性递送。有限数目的出版物已经证明具有体内表达的蛋白质配体的外来体可以增强特定细胞的靶向。然而，蛋白配体的体内表达限于配体种类的可用性并且取决于外来体和配体表达细胞类型。蛋白配体的使用导致较大尺寸的外来体在肝、肺和脾中被捕获。在外来体表面上的较低频率的分子展示不能有效地降低其与健康细胞的结合和融合比率。
使用RNA干扰、基因递送和CRISPR介导的基因组编辑的方法是有前景的，但这些技术在临床治疗剂中的重大挑战是对选择性靶向患病细胞的低效率和有限的特异性。健康器官中的非特异性进入和积累显著降低了治疗指数，并且通常导致严重的副作用。RNAi剂作为治疗剂具有令人难以置信的潜力，但以它们的天然形式易于在血清中降解，从血液中快速清除，可能产生非法免疫反应，并且它们的负电荷限制了细胞膜通过和细胞摄取。已经开发了几种纳米递送平台来解决这些问题，但障碍仍然存在，诸如毒性、免疫原性、肝积累和内体中的截留(entrapment)。天然来源的外来体可以被导出用于将RNA或DNA治疗剂靶向递送至患病细胞，而对健康细胞很少或没有附带损伤(collateral damage)。
靶向递送在医学中极为重要，包括用于RNAi疗法的siRNA/miRNA递送、用于补救遗传缺陷的基因递送、用于DNA修复的核酸递送以及用于所有类型疾病的化学治疗剂递送。外来体和RNA纳米技术两种领域已经证明了治疗剂体内递送的潜力。然而，当前各领域均缺乏一个关键方面来满足临床转化目标：(1)外来体可以通过膜融合有效地进入细胞并且递送功能活性蛋白和RNA/DNA以诱导靶细胞中的转录和翻译改变；然而，通过融合的细胞进入是非特异性的，并且特异性细胞靶向尚未解决。(2)经由RNA纳米技术构建的RNA纳米颗粒可以有效地和特异性地靶向癌细胞，但RNA纳米颗粒在细胞进入之后可能在内体中被捕获，并且内体逃逸效率仍然很低。
所公开的策略为通过RNA纳米技术方法在外来体表面上展示携带RNA适配体或化学配体的RNA纳米颗粒(图1)。使用纯化的外来体和RNA纳米颗粒的体外展示和装饰技术导致RNA配体展示的高频率以阻断由于物理障碍导致的外来体与健康细胞的非特异性融合。通过体外方法展示RNA或化学品配体扩大了靶向配体多样性的范围，便于工业规模生产，并且由于不诱导由RNA或化学试剂引起的宿主免疫应答而允许重复治疗慢性疾病。所公开的方法利用外来体和RNA纳米技术平台两者来实现特异性靶向、特定细胞进入的高效率以及体内递送到胞质溶胶中之后的siRNA、miRNA、mRNA或dsDNA的最佳功能。
外来体为源自由许多细胞类型释放的胞吞区室的20-100nm的特化膜囊泡。在许多研究中已经确认了外来体在经由转移生物活性脂质、细胞质和膜蛋白以及RNA介导细胞-细胞通讯的基本元件中的重要性。在癌症中，外来体能够刺激血管生成，诱导肿瘤增殖和转移，并且促进免疫逃逸。外来体作为递送载体具有很大的潜力，因为它们：(1)易于提取和再设计；(2)在体内是良好耐受的，因为它们已经被大多数细胞分泌；(3)如果源自适当的细胞，是免疫惰性的；(4)对于个体化疗法可以是患者来源的。它们不太可能被患者循环中的固有免疫细胞、抗体、补体或凝血因子攻击；(5)天然地能够基于它们将其内容物转移至受体细胞的先天能力细胞内递送生物分子；(6)具有大的表面积用于展示多个靶向配体；(7)具有纳米级尺寸和弹性(可变形)形状，具有跨越生物学屏障(诸如血脑屏障)以及规避肾和肝清除的内在能力；以及(8)可以避免对内体逃逸策略的需要，因为外来体可以通过其四次穿膜蛋白(tetraspanin)结构域与靶细胞上的表面糖蛋白相互作用直接与细胞膜融合并且将内容物直接递送至胞质溶胶。它们也可以在受体介导的胞吞之后与内体区室膜反融合(back-fuse)以将其包封的货物释放至胞质溶胶。因此，治疗性有效载荷诸如miRNA、siRNA、dsDNA或mRNA在递送到细胞中之后可以是有完整功能的。
基于以下方面，RNA作为构建材料具有独特的特性：(1)RNA是一种聚合物，可以用于以定义的结构、尺寸和化学计量控制合成；因此它们可以规避由颗粒异质性引起的非特异性副作用。(2)根据形状和化学计量RNA纳米颗粒具有10-50nm的尺寸，并且足以携带适配体作为细胞靶向配体。(3)RNA纳米颗粒的弹性和分支棘轮形状便于经由受体介导的胞吞的癌细胞膜结合、跨越和进入。这对于克服机械屏障、紊乱的脉管系统(disorganizedvasculatures)和高度免疫抑制性肿瘤微环境特别有用。(4)模块化设计和自下而上(bottom up)的自组装使经济工业规模生产成为可能。(5)RNA纳米颗粒是高度可溶性的，不易聚集，并且不需要连接至通常用于基于蛋白的试剂的PEG或白蛋白。(6)多价性质允许同时掺入多个靶向和成像模块，而无任何交联。(7)pRNA-3WJ纳米颗粒为热力学稳定的，这确保了所掺入的功能模块的正确折叠和独立活性。(8)pRNA-3WJ构建体在2'-氟(2'-F)修饰之后展示化学稳定性；基于RNA序列中2'-F核苷酸的数目和位置，体内半衰期是可调的。(9)基于pRNA的纳米颗粒展示出有利的PK/PD谱；是无毒的；并且甚至在重复施用30mg/kg之后也未诱导小鼠中的干扰素或细胞因子产生。RNA纳米颗粒不包含蛋白，并且不诱导宿主抗体应答，这允许重复治疗癌症。(10)在全身注射后，pRNA-3WJ纳米颗粒在3-4小时内在肿瘤中特异性积累，并且从健康器官诸如肝、肺、脾和肾中清除。(11)最后，RNA被分类为化学试剂。与基于蛋白的临床试剂相比，预期监管过程会更加有利。
外来体已经显示出有效的细胞进入和有效的内体逃逸能力；然而，缺乏特异性细胞靶向导致了低的治疗效力。与健康细胞的非特异性融合以及在肝和其他健康重要器官中的显著积累导致了毒性。一些出版物指示，外来体可以被工程化为经由将蛋白编码基因靶向外来体跨膜蛋白诸如LAMP2的遗传融合在外来体表面上表达某些细胞类型特异性的基于蛋白的靶向配体。然而，蛋白配体的体内表达限于配体的可用性并且取决于外来体和配体产生细胞类型。另外，蛋白配体的使用导致更大尺寸的颗粒可以在肝、肺和其他器官中被捕获，并且可以刺激宿主抗体的产生。通过内体蛋白酶降解靶向肽通常在外来体生物发生期间发生，这进一步限制了它们的能力。其他挑战包括来自供体细胞的外来体的大规模生产和纯化以及治疗性货物到外来体的低效装载。尽管RNA纳米技术已经快速发展，经由受体介导的胞吞将RNA纳米颗粒用于体内递送的使用导致了RNA纳米颗粒在内体中的捕获，并且因此限制了递送的治疗性货物的效力。
定义
除非另外明确说明，不以任何方式意图将本文阐述的任何方法或方面解释为要求其步骤以特定顺序进行。因此，在方法权利要求在权利要求或说明书中未具体说明步骤被限于特定顺序的情况下，不以任何方式意图顺序在任何方面被推断出来。这适于任何可能的非明示的解释基础，包括关于步骤或操作流程的布置的逻辑问题，源自语法组织或标点的明确含义或说明书中描述的方面的数目或类型。
除非上下文另外清楚地指明，如该说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
如本文使用的词语“或”意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
范围可以在本文中被表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当此类范围被表示时，另外方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该特定值形成另外方面。还应当理解的是，每一个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时均是重要的。还应当理解的是，本文公开了许多值，并且除了值本身以外，每一个值也在本文中被公开为“约”该特定值。例如，如果值“10”被公开，则“约10”也被公开。还应当理解的是，两个特定单元之间的每一个单元也被公开。例如，如果10和15被公开，则11、12、13和14也被公开。
如本文使用的，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可以发生或可以不发生，并且意指该描述包括其中所述事件或情形发生的情况和其中该事件或情形未发生的情况。
如本文使用的，术语“转化”和“转染”意指将核酸(例如，表达载体)引入受体细胞中，包括将核酸引入至所述细胞的染色体DNA中。本领域熟悉用于实现将核酸引入到受体细胞中的多种组合物、方法、技术等。本领域熟悉用于真核细胞和原核细胞两者的此类组合物、方法、技术等。本领域熟悉用于优化将核酸引入到受体细胞中并且在受体细胞中表达的此类组合物、方法、技术等。
术语“生物相容的”通常指通常对受体无毒且未对受试者造成任何显著副作用的物质及其任何代谢物或其降解产物。
术语“生物可降解的”通常指在生理条件下会降解或侵蚀为能够被受试者代谢、消除或排泄的较小单位或化学品物质。
降解时间为聚合物组成和形态的函数。合适的降解时间从几天至几个月。
术语“抗体”指选择性结合靶抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，还包括在术语“抗体”中的是那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物、以及选择性结合靶抗原的人类或人源化形式的免疫球蛋白分子。
术语“肽”、“蛋白”和“多肽”可互换使用，指包含通过一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的α氨基基团连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。
术语“蛋白结构域”指显示结构完整性的蛋白的一部分、蛋白的部分(portions)或整个蛋白；该确定可以基于蛋白的一部分、蛋白的部分或整个蛋白的氨基酸组成。
术语“核酸”指包含单个核苷酸或者在一个核苷酸的3'位置处与另一个核苷酸的5’末端处通过磷酸基团连接的两个或更多个核苷酸的天然或合成分子。核酸不受长度的限制，并且因此核酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
如本文使用的，当提及多肽(包括抗体)或受体时，术语“特异性结合”指确定蛋白或多肽或受体在蛋白和其他生物物质(biologies)的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定的条件下(例如在抗体情况下的免疫测定条件)，指定的配体或抗体当它不以显著量与样品中存在的其他蛋白结合或与配体或抗体可以在生物体中接触的其他蛋白结合时与其特定“靶”“特异性结合”(例如抗体与内皮抗原特异性结合)。
“嵌合分子”为通过连接在其天然状态分开存在的两个或更多个分子产生的单个分子。单个的嵌合分子具有其所有组成分子的期望的功能。通常，嵌合分子的组成分子之一为“靶向分子”或“靶向部分”。靶向分子为与其对应的靶例如细胞表面上的受体特异性结合的分子，诸如配体或抗体。
如本文使用的术语“特异性递送”指分子与携带特定靶分子或标志物的细胞或组织的优先缔合，且不与缺乏该靶分子的细胞或组织优先缔合。当然，认识到分子与非靶细胞或组织之间可能发生一定程度的非特异性相互作用。尽管如此，特异性递送可以被区分为通过特异性识别靶分子来介导。
通常，特异性递送导致递送的分子与携带靶分子的细胞之间的缔合比递送的分子与缺乏靶分子的细胞之间的缔合强得多。
如本文使用的“间隔物”指连接蛋白包括融合蛋白的肽。通常，除了连接蛋白或保存它们之间的一定最小距离或其他空间关系以外，间隔区不具有特殊的生物学活性。然而，可以选择间隔物的组成氨基酸以影响分子的一些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
术语“载体”或“构建体”指能够将载体序列所连接的另一种核酸转运到细胞中的核酸序列。术语“表达载体”包括包含呈适于被细胞表达的形式(例如，与转录控制元件连接)的基因构建体的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)。
术语“可操作地连接”指一种核酸与另一种核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列为与其他序列可操作地连接的核酸序列的实例。例如，DNA与转录控制元件的可操作连接指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得此类DNA的转录由启动子通过特异性识别、结合并且转录DNA的RNA聚合酶启动。
如本文使用的，“多肽”指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白。多肽包含连续的氨基酸。术语“多肽”涵盖天然存在的或合成的分子。
如本文使用的，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词语的列表。本文使用的氨基酸缩写为氨基酸的常规一个字母代码并且如下表示：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸(glutamate)、谷氨酸(glutamicacid)；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。
术语“变体”指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(即简并变体)、编码氨基酸的每一个密码子(即DNA和RNA)的摆动位置内的取代、添加至肽的C-末端的氨基酸的氨基酸序列或肽序列、或与参考序列具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性百分比的肽。
术语“序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比之后候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。为了确定序列同一性百分比的目的，比对可以以本领域技术范围内的多种方式，例如使用公众可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件来实现。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在比较的全长序列中实现最大比对所需的任何算法。在一个方面，一种或更多种治疗剂选自一种或更多种抗微生物化合物、一种或更多种抗细菌化合物、一种或更多种抗真菌化合物或一种或更多种抗癌剂或其组合。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种抗癌剂。在一个方面，一种或更多种抗癌剂可以包含顺铂。在一个方面，一种或更多种抗癌药物诱导凋亡。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种化学治疗性药物。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种辐射敏化剂。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含药学上可接受的载体。
如本文使用的，术语“受试者”指施用的靶，例如，动物。因此，本文公开的方法的对象可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。可选地，本文公开的方法的主题可以是人类、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不表示特定年龄或性别。因此，意图涵盖成人和新生儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性。在一个方面，受试者为患者。患者指罹患疾病或紊乱诸如例如癌症和/或异常细胞生长的受试者。术语“患者”包括人类和兽医受试者。在一个方面，受试者已经被诊断为需要治疗癌症和/或异常细胞生长。
如本文使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“疗法(therapy)”和“治疗性治疗(therapeutic treatment)”指治愈性疗法、预防性疗法(prophylactictherapy)和预防性疗法(preventative therapy)。如本文使用的，该术语指意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或紊乱(诸如例如癌症或肿瘤)的受试者或患者的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理状况或紊乱的改进的治疗，并且还包括因果治疗，即针对相关疾病、病理状况或紊乱的原因的去除的治疗。另外，该术语包括姑息治疗，即为减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或紊乱而设计的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或紊乱的发展的治疗；以及支持治疗，即用于补充针对相关疾病、病理状况或紊乱的改进的另一种特定疗法的治疗。在多个方面，该术语涵盖受试者(包括哺乳动物(例如，人类))的任何治疗，并且包括：(i)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中预防该疾病发生；(ii)抑制疾病，即阻止其发展；或(iii)缓解疾病，即引起疾病衰退。在一个方面，疾病、病理状况或紊乱为癌症，诸如例如乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肝癌或胰腺癌。在一个方面，癌症可以是本领域已知的任何癌症。
如本文使用的，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”指排除、避开(averting)、消除(obviating)、预防(forestalling)、停止、或阻止某些事情发生，特别是通过预先行动。应当应理解的是，除非另外明确指示，在本文中使用降低、抑制或预防的情况下，还明确地公开了使用其他两个词。例如，在一个方面，预防可以指预防癌细胞的复制或预防癌细胞的转移。
如本文使用的，术语“诊断的”意指已经由技术人员(例如医师或研究人员)进行身体检查，并且发现其具有可以通过本文公开的组合物或方法诊断或治疗的状况。例如，“诊断为患有癌症”意指已经由技术人员(例如医师或研究人员)进行身体检查，并且发现其具有可以通过减轻或改善癌症和/或异常细胞生长的化合物或组合物诊断或治疗的状况。
如本文使用的，术语“施用(administering)”和“施用(administration)”指向受试者提供组合物的任何方法。此类方法是本领域技术人员熟知的，并且包括，但不限于，心脏内施用、口服施用、经皮施用、通过吸入施用、鼻腔施用、局部施用、阴道内施用、眼部施用、耳内施用、大脑内施用、直肠施用、舌下施用、含服施用和肠胃外施用(包括可注射诸如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用和皮下施用)。施用可以是连续的或间歇的。在多个方面，制品(preparation)可以治疗性地施用；即施用以治疗现有的疾病或状况。在另外的多个方面，制品可以预防性地施用；即施用用于预防疾病或状况。
如本文使用的术语“接触”指使公开的组合物或肽或药物制品与细胞、靶受体或其他生物学实体以这样的方式在一起：化合物可以直接(即通过与靶本身相互作用)或间接(即通过与靶的活性所依赖于的另一种分子、辅因子、因子或蛋白相互作用)影响靶(例如，受体、转录因子、细胞等)的活性。
如本文使用的，术语“确定”可以指测量或确定表达和/或活性水平的数量或量或改变。
如本文使用的，术语“有效量(effective amount)”和“有效的量(amounteffective)”指足以实现期望的结果或对不期望的状况具有作用的量。例如，在一个方面，聚合物纳米颗粒的有效量为杀死和/或抑制细胞生长而未对周围非癌细胞造成额外损伤的量。例如，“治疗有效量”指足以实现期望的治疗结果或对不期望的症状具有作用但通常不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括被治疗的紊乱和紊乱的严重程度；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体化合物组合或同时使用的药物以及医学领域熟知的类似因素。
“调控”意指通过增加或减少来改变。如本文使用的，“调控物”可以意指可以增加或减少基因或基因产物诸如肽的表达水平或活性水平的组合物。
表达或活性的调控不必是完整的。例如，与其中基因或基因产物的表达或活性尚未被组合物调控的对照细胞相比，表达或活性可以被调控了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或在中间的任何百分比。
术语“药学上可接受的”描述了不是生物学上或其他方面不期望的，即不引起不可接受水平的不期望的生物学作用或以有害方式相互作用的材料。如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于临使用之前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂、或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的预防可以通过包括多种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、硼酸等来确保。还可以期望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过包括延迟吸收的剂，诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。可以通过在生物可降解聚合物(诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))中形成药物的微囊基质来制备可注射的长效(depot)形式。取决于药物与聚合物的比率以及采用的特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。长效可注射制剂还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射制剂可以例如通过截留细菌的过滤器过滤，或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在临使用之前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可以包括糖诸如乳糖。期望地，按重量计至少95％的活性成分颗粒具有在0.01至10微米范围内的有效粒径。
如本文使用的，术语“癌症”指由已经对正常生长控制失去易感性的细胞增殖引起或表征的增殖性紊乱或疾病。术语“癌症”包括肿瘤和任何其他增殖性紊乱。相同组织类型的癌症起源于相同的组织，并且可以基于其生物学特征将其分为不同的亚型。癌症包括，但不限于，黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和慢性淋巴细胞白血病。癌症还包括，但不限于，脑癌、骨癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、垂体癌、肾癌、胃癌、食管癌、肛门癌和直肠癌。
如本文使用的，术语“抗癌”或“抗赘生物”药物指可以用于治疗癌症和/或异常细胞生长的一种或更多种药物。
公开了用于制备本文公开的组合物的组分以及待用于本文公开的方法中的组合物本身。这些及其他材料被本文公开，并且应当理解的是，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，尽管不能明确公开对这些化合物的多种个体和集合性组合以及置换的每一种的具体引述，但每一个都被本文明确地设想和描述。例如，如果特定化合物被公开并讨论，并且讨论了可以对许多分子包括化合物做出的许多修饰，除非另外明确相反指示，则化合物以及可能的修饰的每一种及每种组合和置换被明确设想。因此，如果一类分子A、B、和C以及一类分子D、E、和F被公开，并且组合分子的实例A-D被公开，则即使每一个未被单独列举，每一个被单独或集合性地被设想意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F被认为是公开的。同样，也公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组将被认为是公开的。该概念适于本申请的所有方面，包括，但不限于，制造和使用本文公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多种另外的步骤，应当理解的是，这些另外的步骤的每一个可以与本文公开方法的任何具体的实施方案或实施方案的组合一起进行。
本文任何地方提及的所有专利、专利申请及其他科学或技术著作(writings)通过引用以其整体并入本文。公开的主题可以在不存在本文未明确公开的任何一个要素或更多个要素(any element or elements)、一个限制或更多个限制(limitation orlimitations)的情况下被实践。因此，例如，在本文的每一个实例中，术语“包括(comprising)”、“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“由......组成(consisting of)”的任何一个可以被另外两个术语中的任一个代替，同时保留它们的普通含义。已经采用的术语和表述被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所显示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但应认识到，多种改变在本发明要求保户的范围内是可能的。因此，应当理解的是，尽管本发明已经通过实施方案、任选的特征被具体公开，但本领域技术人员可以寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在如由本说明书及所附的权利要求所限定的本发明的范围内。
组合物
本文公开了组合物和方法，所述组合物和方法包括在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体。例如，这些外来体可以用于将药剂靶向细胞。这些剂可以被掺入到纳米颗粒中，分开展示在外来体的表面上，或者作为货物掺入于外来体内。
RNA纳米颗粒可以以为DNA的特征的简单性水平被制造，同时具有模拟一些蛋白的多功能三级结构和催化功能。
在一些实施方案中，RNA纳米颗粒由三个或更多个RNA寡核苷酸组装，所述三个或更多个RNA寡核苷酸被双链化在一起以形成具有三个或更多个突出茎环的二级结构。每一个茎环的数目、长度和相对角度可以被设计以提供化学计量的优点。例如，本文公开了具有“箭头尾部”构型的纳米颗粒。在该实施方案中，一个茎环与另一个茎环具有约60度的角度，但与其他杆环具有约180度的角度。这可以产生可以将RNA纳米颗粒锁定在适当地方的“钩(hook)”效应。此外，取决于哪个茎环被锚定于膜中，纳米粒子将有区别地存在于外来体上。因此，可以调整纳米颗粒的形状以根据需要更好地展示或保护部分。设想了其他形状，诸如源自“钩”形状的形状。
如本文公开的，可以以精确控制形状、尺寸和化学计量来制造RNA纳米颗粒。在一些实施方案中，三个或更多个RNA寡核苷酸中的至少一个源自pRNA 3-式连接(pRNA 3-wayjunction)(3WJ)基序。
在一些实施方案中，三个或更多个RNA寡核苷酸中的至少一个源自噬菌体包装RNA(pRNA)。噬菌体phi29DNA包装马达的pRNA经由互锁环的交互(hand-in-hand)相互作用形成二聚体、三聚体和六聚体。
在一些实施方案中，三个或更多个RNA寡核苷酸中的至少一个包含来自pRNA的天然或修饰的3-式连接(3WJ)基序。3WJ基序可以见于，例如，GA1、SF5、M2、B103、和phi29噬菌体pRNA中。3WJ在不存在金属盐的情况下由具有异常高亲和力的三个RNA寡核苷酸组装；耐8M尿素变性；展示热力学稳定的特性；并且在超低浓度不解离。可以使用2'-氟(2'-F)修饰来产生耐RNA酶降解的RNA纳米颗粒，同时保留真正的折叠和生物学活性。因此，在一些实施方案中，RNA纳米颗粒可以由a3WJ RNA寡核苷酸(SEQ ID NO:1)、b3WJ RNA寡核苷酸(SEQ IDNO:2)、和c3WJ RNA寡核苷酸(SEQ ID NO:3)组装。在一些实施方案中，RNA寡核苷酸包含人工和/或合成3WJ基序。
在一些实施方案中，分子具有范围从约-150mV至约150mV的ζ电位。RNA分子具有范围从约-140mV至约140mV、从约-130mV至约130mV、从约-120mV至约120mV、从约-110mV至约110mV的ζ电位。在一些实施方案中，分子具有范围从约-100mV至约100mV的ζ电位。RNA分子具有范围从约-95mV至约95mV、从约-90mV至约90mV、从约-85mV至约85mV、从约-80mV至约80mV、从约-75mV至约75mV、从约-70至约70mV、从约-65mV至约65mV、从约-60mV至约60mV、从约-55mV至约55mV、从约-50mV至约50mV的ζ电位。分子具有范围从约-45mv至约45mV、从约-40mV至约40mV、从约-35mV至约35mV、从约-35mV至约30mV、从约-35mV至约20mV、从约-25mV至约15mV的ζ电位。
在一些实施方案中，RNA纳米结构分子在从约2至约13的pH范围内基本上是稳定的。RNA分子在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的pH下是稳定的。如本文使用的，术语“基本上稳定的”可以指物理和/或化学稳定性。如本领域普通技术人员将认识到的，术语“基本上稳定的”可以指在某些条件下组合物相对于初始组合物(即当初始制备特定批次的组合物时)的稳定性。在这方面，如本领域普通技术人员将认识到的，藉以可以确定特定实施方案的组合物的稳定性的一种方式如下：制备一个批次实施方案的组合物，对组合物样品(对照样品)进行初始评价，使组合物样品经历感兴趣的条件(例如，在特定条件储存特定时间段)(测试样品)，对测试样品进行评价，并且将对照样品的评价与测试样品的评价进行比较。可以进行计算以确定测试样品中存在的量是否为在对照样品中的量的100％+20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％。
除了DNA、蛋白、脂质和碳水化合物以外，RNA为五种最重要的生物学大分子之一。关于一些与DNA相似的方面，包括四种核苷酸(包括腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟苷(G)和尿苷(U))的RNA在其均一性上是特殊的。RNA为核苷酸的均聚物，但也为A、U、G和C的杂聚物。每一个核苷酸包含核糖、核碱基和磷酸基团。核苷酸通过相邻核糖单元之间的3'→5'磷酸二酯键共价连接在一起，赋予定义RNA为多核酸的糖-磷酸骨架方向性。骨架中的磷酸部分带负电荷，使RNA在生理pH成为聚阴离子大分子。RNA分子通常为单链的；然而，沃森-克里克(Watson-Crick)(典型(canonical))碱基对相互作用(A:U和G:C)，摆动碱基配对(诸如G:U)或其他非典型碱基配对，诸如具有糖苷键相对于氢键的取向(顺式或反式)的12个基本几何家族的边缘与边缘相互作用(沃森-克里克、Hoogsteen/CH或糖边缘)，所有的一起产生显示环、发夹、凸起、茎、假结、连接等的多种结构构象，这些为引导和驱动RNA分子组装为期望的结构的基本要素。
定义RNA并且将其与DNA区分开的RNA的特征为骨架的每一个核糖上的2'-羟基。2'-OH基团为RNA提供了一种特殊特性，这可能是优点或缺点。从结构的角度来看，该另外的羟基的优点在于它可以将核糖糖锁定到3'-内椅型构象(3'-endo chair conformation)中。因此，RNA双螺旋在结构上有利的是采用与DNA双螺旋中通常存在的B型相比，短且宽约20％的A型。此外，RNA中的2'-OH基团为化学活性的，并且能够在S 2反应中启动对相邻3'磷酸二酯键的亲核攻击。这裂解了RNA糖磷酸骨架并且这种化学机制成为核酶中观察到的催化自我裂解的基础。缺点在于2'-OH基团使RNA对核酸酶消化敏感，因为许多RNA酶识别包括2'-OH基团的RNA结构作为特异性结合位点。
然而，此类酶不稳定性可以通过对2'-OH基团应用化学修饰来克服。例如，用氟(2-F)、O甲基(Omethyl)(2'-O-Me)或胺(2'-N3/4)取代2'羟基基团通过防止被RNA酶降解显著增加体内RNA稳定性。最近的研究还表明siRNA在血清中的稳定性还高度依赖于特定的RNA序列，并且短和长RNA双链体两者的降解主要发生在UA/UA或CA/UG位点处。因此，在一些实施方案中，RNA纳米颗粒在RNA寡核苷酸的2'位置处包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包括2'氟、2'胺和2'O-甲基。
在一些实施方案中，纳米颗粒在三个或更多个突出茎环中的一个、两个、或三个处包含膜锚定部分。例如，膜锚定部分可以是胆固醇分子。
在一些实施方案中，纳米颗粒在剩余茎环中的一个或更多个处包含一个或更多个功能部分。例如，在一些实施方案中，RNA纳米颗粒在剩余茎环中的一个或更多个处包含靶向部分。可以选择靶向部分诸如基于化学或核酸的配体以靶向特定组织类型，诸如，例如，肌肉、脑、肝、胰腺和肺，或靶向患病组织诸如肿瘤。在一些实施方案中，RNA纳米颗粒包含多于一个功能部分。在一些情况下，外来体具有多于一种类型的RNA纳米颗粒，每一种具有不同的功能部分。
在一些情况下，配体为化学配体，诸如叶酸、半乳糖或其衍生物。
在一些实施方案中，配体为基于核酸的配体，诸如RNA或DNA适配体。例如，一个或更多个突出茎环可以是RNA适配体序列，或者配体可以与公开的纳米颗粒的茎环缀合。适配体靶的实例提供于下表1中。
表1中适配体的核酸序列是本领域已知的并且可以见于以下中：例如，Wilner SE等Molecular Therapy Nucleic Acids.2012 1(5):e21；Shigdar S,等Cancer Sci.2011102(5):991-8；Rockey WM,等Nucleic Acid Therapeutics.2011 21(5):299-314；Kim MY,等Nucleic Acid Ther.2011 21(3):173-8；Chen CB,等Proc Natl Acad Sci U S A.2003100(16):9226-9231；Esposito CL,PLoS One.2011 6(9):e24071；Liu Y,等BiolChem.2009 390(2):137-44；Lee YJ,等Gastroenterology.2012 143(1):155-65.e8；DavisKA,等Nucleic Acids Res.1998 26(17):3915-24；Mallikaratchy PR,等Nucleic AcidsResearch.2011；39(6):2458-2469；Xiao Z,等Chemistry.2008；14(6):1769-75；ShangguanD,等Clin Chem.2007Jun；53(6):1153-5；Daniels DA,等Proc Natl Acad Sci U SA.2003Dec 23；100(26):15416-21；Ababneh N,等Nucleic Acid Therapeutics.2013 23(6):401-407；和Shigdar S,等Cancer Lett.2013Mar1；330(1):84-95，其所有关于这些适配体包括其合适序列的教导通过引用并入本文。
在一些实施方案中，公开的外来体被装载有治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，诊断剂为成像部分。成像部分包括荧光染料，放射性核素和/或造影剂。
荧光染料的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料或近红外染料。荧光染料的另外的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料、近红外(近IR或NIR)染料，包括但不限于，IRdyegoo、Alexae47、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(Indocyanine green)(ICG)。在一些实施方案中，成像模块包括报告物成像模块。
在一些实施方案中，术语“放射性核素”包括具有不同同位素的放射性标记肽和蛋白。放射性同位素的非限制性实例包括86Y、90Y、111ln、177Lu、225Ac、212Bi、213Bi、66Ga、67Ga、68Ga、64Cu、67Cu、71As、72As、76As、77As、65Zn、48V、203Pb、209Pb、212Pb、166Ho、149Pm、153Sm、201TI、188Re、186Re和99mTc。在一些实施方案中，放射性核素与RNA纳米颗粒的多于一个茎环偶联。在一些实施方案中，放射性核素通过螯合剂螯合。在一些实施方案中，螯合剂与RNA纳米颗粒的至少一个茎环偶联。螯合剂的非限制性实例包括EDTA、DOTA和NOTA。
如本文使用的，术语“造影剂”指用于改进内部身体结构在图像中的可见性的化合物，包括但不限于，X射线图像或扫描图像(例如CAT(计算机化的轴向层面摄影)扫描、MRI(磁共振成像)扫描)。术语造影剂在本文中也被称为放射造影剂。造影剂用于多种诊断(例如，心导管插入(cardiac catheterization))和治疗(例如，血管分流放置(vascularshunt placement))程序。磁共振成像(MRI)为一种功能强大的非侵入性技术，其提供高质量的组织三维图像，包括关于体内组织的解剖、功能和代谢的信息。钆为一种常见的Ti加权MRI造影剂。在一些实施方案中，造影剂为MRI造影剂。在一些实施方案中，MRI造影剂为胃肠MRI、静脉内MRI、血管内(血池)MRI肿瘤特异性MRI、肝胆MRI和网状内皮MRI。MRI造影剂的一个非限制性实例为钆造影剂。
在一些实施方案中，治疗剂为治疗性核酸。使用核酸，例如，寡核苷酸的治疗方法，已经被详细研究。这些方法包括小干扰RNA(siRNA)以及对过表达的miRNA的反义序列(antisense)或者疾病中被降低的miRNA的miRNA模拟物。普遍认为，治疗性寡核苷酸的递送为这些剂的临床开发中的主要瓶颈。寡核苷酸在循环中本质上(inheren)不稳定。由于寡核苷酸的尺寸和电荷，在脂质转染剂不存在的情况下它们很难穿透细胞膜。虽然脂质纳米颗粒为当前用于寡核苷酸递送的标准方法，它们具有某些限制。包含合成成分的脂质纳米颗粒将在体内分解产生细胞毒性或免疫原性活性。例如，显示脂质纳米颗粒产生多种毒性，包括促炎性反应和toll样受体4的活化(Kedmi R,等Biomaterials.2010 31:6867-75)。所公开的组合物提供了用于递送治疗性核酸的优良方法。
在一些实施方案中，治疗性核酸为通常不与外来体缔合的异源多核苷酸。因此，在一些实施方案中，治疗性核酸通常不与外来体缔合。治疗性核酸可以是单链的或双链的。治疗性核酸序列的非限制性实例包括siRNA、dsRNA、dsDNA、shRNA、mRNA、微小RNA、antagomir、反义序列、适配体和dsRNA/DNA杂合体。在一些情况下，剂为在过客链的嘌呤碱基上包含2'-氟化物修饰的合成siRNA。
可以基于对预期待递送到的细胞的期望作用和该作用藉以被实现的机制选择治疗性核酸。例如，治疗性核酸可以用于基因疗法，例如以为了在细胞或细胞组中表达期望的基因。此类核酸通常呈编码所期望的基因的质粒DNA或病毒载体的形式，并且被可操作地连接至适当的调节序列，诸如启动子、增强子等，使得质粒DNA在已经被递送至待治疗细胞后被表达。对基因疗法敏感的疾病的实例包括血友病B(因子IX)、囊性纤维化(CTFR)和脊髓性肌萎缩(SMN-1)。
治疗性核酸也可以用于例如免疫中以表达期望针对其产生免疫应答的一种或更多种抗原。因此，治疗性核酸可以编码期望针对其产生免疫应答的一种或更多种抗原，包括但不限于肿瘤抗原、来自病原体诸如病毒、细菌或真菌病原体的抗原。
治疗性核酸也可以用于基因沉默。此类基因沉默可以用于治疗以关闭异常基因表达或在动物模型研究中产生单个或更多个基因敲除。治疗性核酸分子可以充当靶分子所具有的特定活性的效应物、抑制剂(inhibitor)、调控物和刺激物，或者治疗性核酸分子可以具有独立于任何其他分子的从头活性。
治疗性核酸分子可以与任何大分子诸如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链相互作用。通常基于靶分子与治疗性核酸分子之间的序列同源性将治疗性核酸设计为与其他核酸相互作用。在其他情况下，治疗性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于治疗性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许特异性识别发生的三级结构的形成。
反义分子被设计为通过典型或非典型碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用被设计为通过，例如，RNAseH介导的RNA-DNA杂合体降解来促进靶分子的破坏。可选地，反义分子被设计为阻断通常会发生在靶分子上的加工功能，诸如转录或复制。可以基于靶分子的序列设计反义分子。存在用于通过找到所存在的靶分子的最易接近区域来优化反义效率的许多方法。
适配体为与靶分子相互作用的分子，优选地以特定的方式相互作用的分子。通常，适配体为长度范围从15-50个碱基的小核酸，其折叠为定义的二级和三级结构，诸如茎环或G四集体(G-quartets)。适配体可以结合小分子，诸如ATP(美国专利第5,631,146号)和茶碱(美国专利第5,580,737号)，以及大分子诸如逆转录酶(美国专利第5,786,462号)和凝血酶(美国专利第5,543,293号)。适配体可以以少于10-12M的Ka与靶分子非常紧密地结合。例如，已经分离了在靶分子和与该分子仅在单个位置上有区别的另一个分子之间的结合亲和力方面具有大于10,000倍的差异的适配体(美国专利第5,543,293号)。优选的是，适配体与靶分子具有比3/4与背景结合分子低至少10倍、100倍、1000倍、10,000倍、或100,000倍的Ka。当例如比较多肽时，背景分子是不同的多肽是优选的。如何制备并且使用适配体结合多种不同的靶分子的代表性实例可以见于美国专利第5,476,766号、5,503,978号、5,631,146号、5,731,424号、5,780,228号、5,792,613号、5,795,721号、5,846,713号、5,858,660号、5,861,254号、5,864,026号、5,869,641号、5,958,691号、6,001,988号、6,011,020、6,013,443号、6,020,130号、6,028,186号、6,030,776号、和6,051,698号。
基因表达也可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异性的方式有效沉默。最初随着双链RNA(dsRNA)的添加观察到该沉默(FireA,等(1998)Nature,391:806-11；Napoli,C,等(1990)Plant Cell 2:279-89；Hannon,G.J.(2002)Nature,418:244-51)。在dsRNA进入细胞后，它被RNA酶III样酶Dicer裂解为长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA)，其在3'末端上包含2个核苷酸突出端(Elbashir,S.M.,等(2001)Genes Dev.,15:188-200；Bernstein,E.,等(2001)Nature,409:363-6；Hammond,S.M.等(2000)Nature,404:293-6)。在ATP依赖性步骤中，siRNA整合到通常被称为RNAi诱导沉默复合物(RISC)的多亚基蛋白复合物中，其将siRNA引导至靶RNA序列(Nykanen,A.,等(2001)Cell,107:309-21)。在某一时刻，siRNA双链体解开，并且似乎反义链仍然与RISC结合并且通过内切核酸酶和外切核酸酶的组合指导互补mRNA序列的降解(Martinez,J.,等(2002)Cell,110:563-74)。然而，iRNA或siRNA的作用或者其使用不限于任何类型的机制。
短干扰RNA(siRNA)为一种双链RNA，其可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而减少甚至抑制基因表达。在一个实例中，siRNA触发siRNA与靶RNA两者之间的序列同一性区域内的同源RNA分子(诸如mRNA)的特异性降解。例如，WO 02/44321公开了当与3'突出端末端碱基配对时能够对靶mRNA进行序列特异性降解的siRNA，关于制备这些siRNA的方法通过引用并入本文。序列特异性基因沉默可以使用模拟由酶dicer产生的siRNA的合成的短双链RNA在哺乳动物细胞中实现(Elbashir,S.M.等(2001)Nature,411:494 498)(Ui-Tei,K.,等(2000)FEBS Lett 479:79-82)。siRNA可以是化学或体外合成的，或者可以是在细胞内被加工为siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)的结果。合成siRNA通常使用算法和常规DNA/RNA合成仪来设计。供应商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、Glen Research(Sterling,Virginia)、MWB Biotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colorado)、和Qiagen(Vento,TheNetherlands)。siRNA也可以使用试剂盒诸如Ambion的siRNA构建试剂盒在体外合成。
从载体产生siRNA通常通过短发夹RNA(shRNA)的转录来完成。用于产生包含shRNA的载体的试剂盒是可用的，诸如，例如，Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。本文公开了如以上描述基于本文公开的炎症介质的序列设计的任何shRNA。
microRNA(miRNA)为小的调节性非编码RNA。miRNA基因通常位于编码基因或非编码基因的内含子中，并且也在外显子和基因间区域中被鉴定出(Kim VN,等TrendsGenet.2006 22:165-73)。内源miRNA通过RNA聚合酶II转录为长的初级转录物或pri-miRNA。通过核糖核蛋白复合物Drosha/DGCR8pri-miRNA被加工为～75nt的pre-miRNA。pri-miRNA和pre-miRNA两者均包含特征性发夹结构。在通过输出蛋白5进行细胞质转运之后，将pre-miRNA装载到去除发夹环的Dicer复合物中。将双链miRNA装载到miRISC复合物中，并且去除具有较差5’末端稳定性的链(Schwarz DS,等Cell.2003 115:199-208)。然后复合物扫描信使RNA以定位miRNA的靶。成熟miRNA的结合(经由7nt 5’种子序列的完全杂交)通常发生在mRNA的3'UTR中并且导致翻译抑制。迄今，在研究的所有癌症中均观察到改变的miRNA表达。根据miRNA、其表达水平及癌症类型，miRNA可能是致癌的或肿瘤抑制的。在过去的10年中，关于miRNA在HCC中的作用已经认识了很多，在(Braconi C,等Seminars inoncology.2011 38:752-63)中综述。与大多数癌症一样，某些miRNA在患有HCC的患者的肿瘤中表达增加，包括miR-221(Budhu A,等Hepatology.2008 47:897-907；Gramantieri L,等Cancer Res.2007 67:6092-9；Jiang J,等Clin Cancer Res.200814:419-27；Pineau P,等Proc Natl Acad Sci U S A.2009；Wang Y,等J Biol Chem.2008 283:13205-15)、miR-21(Budhu A,等Hepatology.200847:897-907；Jiang J,等Clin Cancer Res.2008 14:419-27；Meng F,等Gastroenterology.2007 133:647-58；Pineau P,等Proc Natl Acad Sci US A.2009)、和miR-181b(Ji J,等Hepatology.2009 50:472-80；Wang B,等Oncogene.201029(12):1787-97)。原发性HCC肿瘤具有降低的其他miRNA的表达，其他miRNA诸如miR-199a-3p(miR-199a*)(Jiang J,等Clin Cancer Res.2008 14:419-27；Murakami Y,等Oncogene.2006 25:2537-45；Wang Y,等J Biol Chem.2008 283:13205-15)、miR-122(Bai,等J Biol Chem.2009284:32015-27；Coulouarn C,等Oncogene.2009 28:3526-36；FornariF,等Cancer Res.2009 69:5761-7；Kutay H,等J Cell Biochem.2006 99:671-8)和miR-26a(Chen L,等Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy.2011 19:1521-8)。
Antagomirs为用于沉默内源微小RNA的一类特定的miRNA拮抗剂。例如，定制设计的Dharmacon meridianTM微小RNA发夹抑制剂从Thermo Scientific商购可得。这些抑制剂包括化学修饰和二级结构基序。具体地，在反向补体核心周围掺入高度结构化的双链侧翼区域显著增加抑制剂功能并且允许在亚纳摩尔浓度的多miRNA抑制。设想antagomir设计中的其他此类改进用于在所公开的方法中使用。
在一些情况下，治疗剂为抗癌药物。抗癌药物或抗赘生物药物的实例包括，但不限于以下：阿西维辛(Acivicin)；阿柔比星(Aclarubicin)；盐酸阿考达唑(AcodazoleHydrochloride)；AcrQnine；阿多来新(Adozelesin)；阿地白介素(Aldesleukin)；六甲蜜胺(Altretamine)；(安波霉素(Ambomycin)；乙酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)；氨鲁米特(Aminoglutethimide)；安吖啶(Amsacrine)；阿那曲唑(Anastrozole)；氨茴霉素(Anthramycin)；天冬酰胺酶(Asparaginase)；曲林菌素(Asperlin)；阿扎胞苷(Azacitidine)；阿扎替派(Azetepa)；阿佐霉素(Azotomycin)；巴马司他(Batimastat)；苯佐替派(Benzodepa)；比卡鲁胺(Bicalutamide)；盐酸必桑郡(BisantreneHydrochloride)；双奈法德(Bisnafide Dimesylate)；比折来新(Bizelesin)；硫酸博莱霉素(Bleomycin Sulfate)；布喹那钠(Brequinar Sodium)；溴匹立明(Bropirimine)；白消安(Busulfan)；放线菌素(Cactinomycin)；卡鲁睾酮(Calusterone)；卡醋胺(Caracemide)；卡贝替姆(Carbetimer)；卡铂(Carboplatin)；卡莫司汀(Carmustine)；盐酸卡米诺霉素(Carubicin Hydrochloride)；卡折来新(Carzelesin)；西地芬戈(Cedefingol)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；西罗霉素(Cirolemycin)；顺铂(Cisplatin)；克拉屈滨(Cladribine)；甲磺酸克雷斯托(Crisnatol Mesylate)；环磷酰胺(Cyclophosphamide)；阿糖孢苷(Cytarabine)；达卡巴嗪(Dacarbazine)；更生霉素(Dactinomycin)；盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)；地西他滨(Decitabine)；右奥马铂(Dexormaplatin)；地扎呱宁(Dezaguanine)；甲磺酸地扎呱宁(Dezaguanine Mesylate)；地吖醌(Diaziquone)；多西他赛(Docetaxel)；多柔比星(Doxorubicin)；盐酸多柔比星(DoxorubicinHydrochloride)；屈洛昔芬(Droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬(Droloxifene Citrate)；丙酸屈他雄酮(Dromostanolone Propionate)；达佐霉素(Duazomycin)；依达曲沙(Edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(Eflomithine Hydrochloride)；依沙芦星(Elsamitrucin)；恩洛铂(Enloplatin)；恩普氨酯(Enpromate)；依匹哌啶(Epipropidine)；盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)；厄布洛唑(Erbulozole)；盐酸依索比星(Esorubicin Hydrochloride)；雌莫司汀(Estramustine)；雌莫司汀磷酸钠(EstramustinePhosphate Sodium)；依他硝唑(Etanidazole)；乙碘油I131(Ethiodized Oil I 131)；依托泊苷(Etoposide)；磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)；艾托卜宁(Etoprine)；盐酸法屈唑(Fadrozole Hydrochloride)；法扎拉滨(Fazarabine)；维甲酰酚胺(Fenretinide)；氟尿苷(Floxuridine)；磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)；氟尿嘧啶(Fluorouracil)；氟西他滨(Flurocitabine)；磷喹酮(Fosquidone)；福司曲星钠(Fostriecin Sodium)；吉西他滨(Gemcitabine)；盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)；Gold Au 198；羟基脲(Hydroxyurea)；盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride)；异环磷酰胺(Ifosfamide)；llmofosine；干扰素α-2a(Interferon Alfa-2a)；干扰素α-2b(Interferon Alfa-2b)；干扰素α-n1(Interferon Alfa-n1)；干扰素α-n3(Interferon Alfa-n3)；干扰素β-I a(Interferon Beta-I a)；干扰素β-I b(Interferon Gamma-I b)；异丙铂(Iproplatin)；盐酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride)；醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)；来曲唑(Letrozole)；乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)；盐酸利阿唑(LiarozoleHydrochloride)；洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)；环己亚硝脲(Lomustine)；盐酸洛索蒽醌(Losoxantrone Hydrochloride)；马索罗酚(Masoprocol)；美登素(Maytansine)；盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)；乙酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)；乙酸美伦孕酮(Melengestrol Acetate)；美法仑(Melphalan)；美诺立尔(Menogaril)；巯嘌呤(Mercaptopurine)；甲氨蝶呤(Methotrexate)；甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)；氯苯氨啶(Metoprine)；美妥替哌(Meturedepa)；米丁度胺(Mitindomide)；米托卡星(Mitocarcin)；丝裂红素(Mitocromin)；米托洁林(Mitogillin)；米托马星(Mitomalcin)；丝裂霉素(Mitomycin)；丝裂帕菌素(Mitosper)；米托坦(Mitotane)；盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)；霉酚酸(Mycophenolic Acid)；诺考达唑(Nocodazole)；诺加霉素(Nogalamycin)；奥马铂(Ormaplatin)；奥昔舒仑(Oxisuran)；紫杉醇(Paclitaxel)；培门冬酶(Pegaspargase)；培利霉素(Peliomycin)；戊氮芥(Pentamustine)；硫酸培洛霉(Peplomycin Sulfate)；培磷酰胺(Perfosfamide)；哌泊溴烷(Pipobroman)；哌泊舒凡(Piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(Piroxantrone Hydrochloride)；普卡霉素(Plicamycin)；普洛美坦(Plomestane)；卟吩姆钠(Porfimer Sodium)；泊非霉素(Porfiromycin)；泼尼莫司汀(Prednimustine)；盐酸甲基苄肼(ProcarbazineHydrochloride)；嘌呤霉素(Puromycin)；盐酸嘌呤霉素(Puromycin Hydrochloride)；吡唑呋喃菌素(Pyrazofurin)；利波腺苷(Riboprine)；罗谷亚胺(Rogletimide)；沙芬戈(Safmgol)；盐酸沙芬戈(Safingol Hydrochloride)；司莫司汀(Semustine)；辛曲秦(Simtrazene)；司泊索非钠(Sparfosate Sodium)；司帕霉素(Sparsomycin)；盐酸锗螺胺(Spirogermanium Hydrochloride)；螺莫司汀(Spiromustine)；螺铂(Spiroplatin)；链黑菌素(Streptonigrin)；链脲霉素(Streptozocin)；氯化锶Sr-89(Strontium ChlorideSr89)；磺氯苯脲(Sulofenur)；他利霉素(Talisomycin)；紫杉烷(Taxane)；紫杉烷(Taxoid)；替康兰钠(Tecogalan Sodium)；喃氟啶(Tegafur)；盐酸替洛蒽醌(TeloxantroneHydrochloride)；替莫泊芬(Temoporfin)；替尼泊苷(Teniposide)；替罗昔隆(Teroxirone)；睾内酯(Testolactone)；硫咪嘌呤(Thiamiprine)；硫鸟嘌呤(Thioguanine)；塞替派(Thiotepa)；噻唑呋啉(Tiazofurin)；替拉扎明(Tirapazamine)；盐酸拓扑替康(Topotecan Hydrochloride)；柠檬酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)；乙酸曲托龙(Trestolone Acetate)；磷酸曲西立滨(Triciribine Phosphate)；三甲曲沙(Trimetrexate)；葡萄糖醛酸三甲曲沙(Trimetrexate Glucuronate)；曲普瑞林(Triptorelin)；盐酸妥布氯唑(Tubulozole Hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(UracilMustard)；乌瑞替派(Uredepa)；伐普肽(Vapreotide)；维替泊芬(Verteporfin)；硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)；硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)；长春地辛(Vindesine)；硫酸长春地辛(Vindesine Sulfate)；硫酸长春匹定(Vinepidine Sulfate)；硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)；硫酸长春罗新(Vinleurosine Sulfate)；酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)；硫酸长春罗定(Vinrosidine Sulfate)；硫酸长春利定(Vinzolidine Sulfate)；伏罗唑(Vorozole)；折尼铂(Zeniplatin)；净司他丁(Zinostatin)；盐酸左柔比星(Zorubicin Hydrochloride)。
其他抗赘生物化合物包括：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、酰基富烯(acylfulvene)、阿的培诺(adecypenol)、阿多来新(adozelesin)、阿地介白素(aldesleukin)；ALL-TK拮抗剂(ALL-TKantagonists)；六甲蜜胺；氨莫司汀(ambamustine)；艾美多(amidox)；氨磷汀(amifostine)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑；穿心莲内酯(andrographolide)；血管生成抑制剂(angiogenesisinhibitors)；拮抗剂D(antagonistD)；拮抗剂G(antagonist G)；安雷利克斯(antarelix)；抗背部化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogeneticprotein-1)；抗雄激素(antiandrogen)；前列腺癌(prostatic carcinoma)；抗雌激素(antiestrogen)；抗新普拉通(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)、凋亡基因调控物(apoptosis gene modulator)、凋亡调节物(apoptosis regulator)、脱嘌呤核酸(apurinic acid)、ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶(arginine deaminase)；奥沙那宁(asulacrine)；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀(atrimustine)；阿新司坦汀1(axinastatin1)；阿新司坦汀2(axinastatin2)；阿新司坦汀3(axinastatin3)；阿扎司琼(azasetron)；阿扎托新(azatoxin)；重氮酪氨酸(azatyrosine)；巴卡亭III衍生物(baccatin III derivatives)；班兰诺(balanol)；巴马司他(batimastat)；BCR/ABL拮抗剂(BCR/ABL antagonist)；苯并二氢卟吩(benzochlorin)；苯甲酰基星形孢菌素(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物(betalactam derivative)；β-阿立辛(beta-alethine)；β可来霉素B(betaclamycinB)；桦木酸(betulinic acid)；bFGF抑制剂(bFGFinhibitor)；比卡鲁胺(bicalutamide)；比生群(bisantrene)；双氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德(bisnafide)；bistratene A；比折来新(bizelesin)；比锐来特(breflate)；溴匹立明(bropirimine)；布多替钛(budotitane)；丁硫氨酸磺酰亚胺(buthionine sulfoximine)；卡泊三醇(calcipotriol)；钙磷酸蛋白C(calphostin C)；喜树碱衍生物(camptothecinderivatives)；丝雀痘病毒IL-2(canarypox IL-2)；卡培他滨(capecitabine)；甲酰胺-氨基-三唑(carboxamide-amino-triazole)；羧酰胺基三唑(carboxyamidotriazole)；CaRestM3；CARN700；软骨源性抑制剂(cartilagederivedinhibitor)；卡折来新(carzelesin)；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)(caseinkinase inhibitors(ICOS))；栗树精胺(castanospermine)；杀菌肽B(cecropin B)；西曲瑞克(cetrorelix)；二氢卟酚(chlorin)；氯喹喏啉磺酰胺(chloroquinoxaline sulfonamide)、西卡前列素(cicaprost)；顺式卟啉(cis-porphyrin)；克拉屈滨(cladribine)；氯米芬类似物(clomifene analogue)；克霉唑(clotrimazole)；克立霉素A(collismycin A)；克立霉素B(collismycin B)；康柏斯达汀A4(combretastatin A4)；康柏斯达汀类似物(combretastatin analogue)；康纳京尼(conagenin)；卡那贝西汀816(crambescidin 816)；克里斯奈托(crisnatol)；念珠藻环肽8(cryptophycin 8)；念珠藻环肽A衍生物(cryptophycinA derivative)；卡拉新A(curacinA)；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinones)；环普兰姆(cycloplatam)；西匹霉素(cypemycin)；十八烷基磷酸阿糖胞苷(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子(cytolyticfactor)；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨(decitabine)；去氢膜海鞘素B(dehydrodidemnin B)；地洛瑞林(deslorelin)；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生(dexrazoxane)；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌(diaziquone)；膜海鞘素B(didemninB)；地多西(didox)；二乙基降精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞嘧啶核苷(dihydro-5-azacytidine)；9-二氢紫杉醇(dihydrotaxol，9-)；二恶霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀(diphenylspiromustine)；多可沙诺(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；脱氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；多卡霉素SA(duocannycin SA)；依布硒啉(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星(epirubicin)；爱普列特(epristeride)；雌莫司汀类似物(estramustine analogue)；雌激素激动剂(estrogen agonist)；雌激素拮抗剂(estrogen antagonist)；依他硝唑(etanidazole)；磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)；依西美坦(exemestane)；法屈唑(fadrozole)；法扎拉滨(fazarabine)；维甲酰酚胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；非那雄安(fmasteride)；夫拉平度(flavopiridol)；夫来折司汀(flezelastine)；夫斯特隆(fluasterone)；氟达拉滨(fludarabine)；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克(forfenimex)；福美司坦(formestane)；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀(fotemustine)；钆德卟啉(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓(gallium nitrate)；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；明胶酶抑制剂(gelatinasein hibitor)；吉西他滨(gemcitabine)；谷胱甘肽抑制剂(glutathione inhibitor)；和普苏姆(hepsulfam)；和瑞古林(heregulin)；六亚甲基双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊达比星(idarubicin)；艾多昔芬(idoxifene)；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新(ilmofosine)；伊洛马司他(ilomastat)；咪唑吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特(imiquimod)；免疫刺激剂肽(immunostimulantpeptide)；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂(insulin-likegrowthfactor-1receptorinhibitor)；干扰素激动剂(interferon agonist)；干扰素；白细胞介素；碘苄胍(iobenguane)；碘多柔比星(iododoxorubicin)；4-甘薯醇(ipomeanol，4-)；伊立替康(irinotecan)；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；异苯胍唑(isobengazole)；异质哈立康定B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼(itasetron)；杰斯普拉克立德(jasplakinolide)；卡哈拉立得F(kahalalide F)；三乙酸层状素-N(lamellarin-Ntriacetate)；兰乐肽(lanreotide)；leinamycin；来格司亭(lenograstim)；硫酸香菇多糖(lentinan sulfate)；leptolstatin；来曲唑(letrozole)；白血病抑制因子(leukemiainhibiting factor)；白血球α干扰素(leukocyte alpha interferon)；亮丙立德+雌激素+孕酮(leuprolide+estrogen+progesterone)；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑(liarozole)；直链聚胺类似物(linear polyamine analogue)；亲脂性二糖肽(lipophilic disaccharide peptide)；亲脂性铂化合物(lipophilic platinumcompound)；立索克林酰胺7(lissoclinamide 7)；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索(lometrexol)；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌(losoxantrone)；洛伐他汀(lovastatin)；洛索立宾(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；镥德卟啉(lutetium texaphyrin)；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽(lyticpeptides)；美坦新(maitansine)；麦洛坦汀A(mannostatin A)；马立马斯他(marimastat)；马索罗酚(masoprocol)；马司非(maspin)；基质溶素抑制剂(matrilysin 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endopeptidase)；尼鲁米特(nilutamide)；丽沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调物物；氮氧化物抗氧化剂；里挫林(nitrullyn)；O6-苯甲基鸟嘌呤(O6-benzylguanine)；奥曲肽(octreotide)；奥克恩(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼(ondansetron)；昂丹司琼；奥拉新(oracin)；口服细胞因子诱导物；奥马铂(ormaplatin)；奥沙特隆(osaterone)；奥赛力铂(oxaliplatin)；厄诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕诺明(palauamine)；十六酰基根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸(pamidronic acid)；人参三醇(panaxytriol)；帕诺米芬(panomifene)；帕拉贝新(parabactin)；帕折普汀(pazelliptine)；培门冬酶(pegaspargase)；皮地新(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠(pentosan polysulfate sodium)；喷司他汀(pentostatin)；喷唑(pentrozole)；潘氟隆(perflubron)；培磷酰胺(perfosfamide)；紫苏子醇(perillyl alcohol)；苯连氮霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；皮西板尼(picibanil)；盐酸毛果芸香碱(pilocarpinehydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；普来司汀A(placetinA)；普来司汀B(placetin B)；血纤维蛋白溶酶原活化物抑制剂；铂络合物(platinumcomplex)；铂化合物(platinum compound)；铂-三胺络合物(platinum-triaminecomplex)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；丙基双吖啶酮(propylbis-acridone)；前列腺素J2(prostaglandin 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1)；角鲨胺(squalamine)；干细胞抑制剂(stem cellinhibitor)；干细胞分裂抑制剂；斯替皮米德(stipiamide)；基质溶素(stromelysin)抑制剂；索非罗新(sulfinosine)；超活性激脉肠肽拮抗剂(superactivevasoactive intestinal peptide antagonist)；磺化偏端霉素(suradista)；苏拉明(suramin)；苦马豆素(swainsonine)；合成糖胺(synthetic glycosaminoglycan)；他莫司汀(tallimustine)；甲碘化他莫昔芬(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀(tauromustine)；他扎罗汀(tazarotene)；替康兰钠(tecogalan sodium)；喃氟啶(tegafur)；碲哌喃鎓(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬(temoporfin)；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊苷(teniposide)；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；替唑明(tetrazomine)；噻立拉斯汀(thaliblastine)；沙利度胺(thalidomide)；噻考瑞林(thiocoraline)；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；促胸腺生成素受体激动剂(thymopoietin receptor agonist)；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone)；锡乙基初卟啉(tinethyl etiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；二氯二茂钛(titanocene dichloride)；拓扑替康(topotecan)；托普升替(topsentin)；托瑞米芬(toremifene)；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸(tretinoin)；三乙酰基尿苷(triacetyluridine)；曲西立滨(triciribine)；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司琼(tropisetron)；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖窦源性生长抑制因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor)；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽(vapreotide)、凡瑞林B(variolin B)、载体系统(vectorsystem)、红细胞基因疗法；维拉雷琐(velaresol)；凡拉明(veramine)；凡啶(verdins)；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；维萨汀(vinxaltine)；维他欣(vitaxin)；伏罗唑(vorozole)；扎诺特隆(zanoterone)；折尼铂(zeniplatin)；亚苄维C(zilascorb)；净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)。
如本文使用的，辐射敏化剂使得癌细胞更可能受损。辐射敏化剂增强了癌细胞和/或肿瘤对电离辐射的敏感性，从而增加了放射疗法的效力。辐射敏化剂的实例包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、己酮可可碱(pentoxifylline)和长春瑞滨。
外来体由许多不同类型的细胞产生，所述许多不同类型的细胞包括免疫细胞诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞(DC)和大部分细胞。外来体还由例如，神经胶质瘤、血小板、网织红细胞、神经元、肠上皮细胞和肿瘤细胞产生。用于在公开的组合物和方法中使用的外来体可以源自任何合适的细胞，包括以上鉴定的细胞。外来体也已经从生理体液，诸如血浆、尿液、羊水和恶性积液中分离出来。用于大量生产的合适外来体产生细胞的非限制性实例包括树突状细胞(例如，未成熟的树突状细胞)、人类胚肾293(HEK)细胞、293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人类ESC-来源的间充质干细胞。
在一些实施方案中，外来体源自DC，诸如未成熟的DC。由未成熟的DC产生的外来体不表达MHC-II、MHC-I或CD86。因此，这些外来体不以显著程度刺激幼稚T细胞(na'ive Tcells)，并且不能在混合淋巴细胞反应中诱导应答。因此，由未成熟的树突状细胞产生的外来体可以用于在递送遗传物质中使用。
外来体也可以从任何自体患者来源的、异源单倍型匹配的或异源干细胞获得，以减少或避免外来体被递送至的患者中免疫应答的产生。任何外来体产生细胞均可以用于该目的。
可以通过任何合适的方法从培养基中收集由细胞产生的外来体。通常可以通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液制备外来体制品。例如，可以通过差速离心(即低速(<20000g)离心以沉淀较大的颗粒，随后是高速(>100000g)离心以沉淀外来体)、用适当的过滤器(例如，0.22μm过滤器)尺寸过滤、梯度超速离心(例如，用蔗糖梯度)或这些方法的组合来制备外来体。
公开的外来体可以通过任何合适的手段施用至受试者。至人类或动物受试者的施用可以选自肠胃外、肌内、脑内、血管内、皮下或经皮施用。通常，递送方法为通过注射。优选地注射为肌内或血管内(例如静脉内)。医师将能够确定每一个特定患者所需的施用途径。
外来体优选地作为组合物递送。组合物可以被配制用于肠胃外、肌内、脑内、血管内(包括静脉内)、皮下或透皮施用。用于肠胃外施用的组合物可以包括无菌水性溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。外来体可以以药物组合物配制，除了外来体以外，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂和其他药学上可接受的载体或赋形剂等。
方法
还公开了一种将外来体靶向细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分，其中所述靶向部分将外来体导向感兴趣的细胞。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞，诸如癌细胞。在一些实施方案中，RNA纳米颗粒还包含功能部分，诸如治疗部分或诊断部分。
还公开了一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括将在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体施用至所述受试者，其中纳米颗粒包含至少一个靶向部分，并且其中所述外来体还包含功能部分，其中所述功能部分部分能够治疗受试者中的疾病。例如，在一些实施方案中，疾病为感染。在一些实施方案中，疾病为癌症。
还公开了一种使细胞成像的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分、至少一个诊断部分。例如，在一些实施方案中，细胞为受试者中的细胞。
施用
肠胃外施用通常以注射为特征，诸如皮下、肌内或静脉内。用于肠胃外施用的制品包括即用型注射用无菌溶液、无菌干燥可溶性产品诸如冻干粉末(临使用之前易于与溶剂组合，包括皮下片剂)、即用型注射用无菌悬浮液、使用之前易于与媒介物组合的无菌干燥不溶性产品及无菌乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
如果静脉内施用，合适的载体包括，生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及包含增稠剂和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。肠胃外制品中使用的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、多价螯合剂(sequestering agents)或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物起源的不挥发性油，棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。必须将抗细菌或抗真菌浓度的抗微生物剂添加至在多于一个(multiple)剂量容器中包装的肠胃外制品中，所述抗微生物剂包括酚类或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。
抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procainehydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的多价螯合剂或螯合剂包括EDTA。药学上的载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。调节药学上的活性化合物的浓度，使得注射提供有效量以产生所期望的药理学作用。如本领域已知的那样，精确剂量取决于患者或动物的年龄、重量和状况。
单位剂量肠胃外制品包装在安瓿、小瓶或注射器具有针头的中。如本领域已知和实践的那样，所有肠胃外施用制剂均应该是无菌的。
施用治疗有效量的组合物。剂量可以根据多种参数确定，特别是根据待治疗的患者的状况的严重程度、年龄和重量；施用途径；和所需的方案确定。医师将能够确定用于任何特定患者的所需施用途径和剂量。最佳剂量可以根据单独构建体的相对效力而变化，并且可以通常基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50来评价。通常，剂量为从0.01mg/kg至100mg/kg体重。根据具体构建体的效力、待治疗受试者的年龄、重量和状况、疾病的严重程度以及施用的频率和途径，典型的每天剂量为从约0.1mg/kg至50mg/kg，优选地从约0.1mg/kg至10mg/kg体重。根据施用是通过肌内注射还是全身(静脉内或皮下)注射，可以施用不同剂量的构建体。
优选地，单次肌内注射的剂量在约5μg至20μg的范围内。优选地，单次或多于一次全身注射的剂量在10mg/kg至100mg/kg体重的范围内。
由于构建体清除(以及任何靶向的分子的分解)，患者可能必须重复治疗，例如每天、每周、每月或每年一次或更多次。本领域普通技术人员可以基于测量的构建体在体液或组织中的停留时间和浓度容易地评价用于给药的重复频率。在成功治疗之后，让患者经历维持疗法可以是可期望的，在该维持疗法中构建体以维持剂量施用，范围从0.01mg/kg至100mg体重，每天一次或更多次至每20年一次。
在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含(i)一种或更多种治疗剂，(ii)一种或更多种抗癌剂，(iii)一种或更多种化学治疗性药物，和/或(iv)一种或更多种辐射敏化剂。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种抗癌剂和一种或更多种化学治疗性药物。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种抗癌剂和一种或更多种辐射敏化剂。在一个方面，公开的治疗性组合物可以包含一种或更多种化学治疗剂和一种或更多种辐射敏化剂。
在一个方面，公开的治疗性组合物可以全身施用至受试者。在一个方面，受试者可以是哺乳动物。在一个方面，哺乳动物可以是灵长类动物。在一个方面，哺乳动物可以是人类。在一个方面，人类可以是患者。
在一个方面，公开的治疗性组合物可以重复施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以至少两次施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以两次或更多次施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以以常规间隔或规律间隔施用至受试者。例如，在一个方面，公开的治疗性组合物可以每天一次、或每天两次、或者每天三次或更多次施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以每天、或每周一次、或每周两次、或者每周三次或更多次等施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以每周、或每隔一周、或每三周、或每四周等施用至受试者。在一个方面，公开的治疗性组合物可以每月、或每隔一个月、或每三个月、或每四个月等施用至受试者。在一个方面，公开的组合物的重复施用在预定的或明确的持续时间内发生。在一个方面，公开的组合物的重复施用在不确定的时间段内发生。
在一个方面，在公开的治疗性组合物施用之后，使细胞对治疗敏感。在一个方面，在公开的治疗性组合物施用之后，可以使受试者对治疗敏感。在一个方面，可以根据如本领域已知的用于特定治疗的一种或更多种方法来测量对治疗(诸如治疗性治疗)的增加的敏感性或降低的敏感性。在一个方面，测量对治疗的敏感性的方法包括，但不限于，细胞增殖测定和细胞死亡测定。在一个方面，细胞或受试者对治疗的敏感性可以通过将在施用公开的治疗性组合物之后的细胞或受试者的敏感性与尚未施用公开的治疗性组合物的细胞或受试者的敏感性进行比较来测量或确定。
例如，在一个方面，在施用公开的治疗性组合物之后，细胞可以比尚未施用公开的治疗性组合物的细胞对治疗敏感2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、或更大。在一个方面，在施用公开的治疗性组合物之后，细胞可以比尚未施用公开的治疗性组合物的细胞对治疗的耐受低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、或更大。细胞或受试者的敏感性或耐受性的确定可以是本领域常规的并且在普通临床医师和/或研究人员的技能范围内。
在一个方面，细胞或受试者对治疗的敏感性或耐受性的确定可以被监测。例如，在一个方面，关于敏感性或耐受性的数据可以被周期性地获得，诸如每周、每隔一周、每月、每隔一个月、每3个月、每6个月、每9个月或每年、每隔一年、每5年、每10年持续受试者(例如，患有癌症和/或异常细胞生长的人类受试者或患者)的生命。在一个方面，关于灵敏性或耐受性的数据可以在多种时间而不是在周期性时间获得。在一个方面，可以基于关于细胞或受试者对治疗的敏感性或耐受性的数据修改受试者的治疗。例如，在一个方面，可以通过改变公开的组合物的剂量、公开的组合物的施用途径、公开的组合物的施用频率等来改变治疗。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供关于如何使用和评价本文要求保护的化合物、组合物、和方法的完整的公开内容和描述并且意图公开的主题的仅仅示例性的，并且不意图限制发明人认为是他们的发明的范围。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在被公开的具体方面做出许多改变，并且仍然获得同类或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。已经做出努力以确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指示，份数是按重量计份数，温度以℃计或处于环境温度，并且压力处于大气压下或临近大气压。
实施例1：
在该实施例中，使用RNA纳米技术方法来重编程天然来源的外来体，以用于将miRNA、siRNA、dsDNA或CRISPR-RNA货物靶向递送至癌细胞(图1)。使用源自噬菌体phi29DNA包装马达pRNA的超稳定3-式连接(3WJ)基序作为用于在外来体表面上展示具有真正的折叠和功能的靶向模块(化学配体或RNA适配体)的稳健多功能支架。靶向模块识别并且结合癌细胞膜上的特定受体并且经由受体介导的胞吞递送其治疗性内容物。靶向配体的密集网络不仅增强癌细胞特异性摄取，而且还使与正常细胞的相互作用最小化，因此降低非特异性细胞融合。在每一个3WJ纳米颗粒中掺入膜锚定结构域的策略确保RNA纳米颗粒被嵌入并因此展示在外来体表面上，但不包封在外来体中。使用体外方法展示非蛋白配体扩大了配体多样性的范围，以成本效益方式便于工业规模生产，并且由于RNA或化学品不诱导宿主抗体而允许重复治疗癌症。重要的是，这种方法保留了外来体用于有效细胞进入的所有有利的内源特性，诸如脂质组成，以及外来体蛋白的膜嵌入式专属家族(membrane embeddedexclusive families)(四次穿膜蛋白、热休克蛋白、溶酶体蛋白和融合蛋白)。
天然来源的外来体为生物相容的。它们由许多不同的细胞定期地释放。特化的脂质和膜蛋白阵列的组合有助于外来体和受体细胞之间的有效融合。重要的是，使用外来体可以消除对困扰治疗领域的内体逃逸策略的需要。
在外来体提取之后掺入RNA纳米颗粒确保外来体的内源组成被保留。体外装饰程序便于工业规模生产。RNA配体的使用进一步扩大了配体多样性的范围，超出了由抗体结合的某些可能性。RNA配体的负电荷使与带负电荷的细胞膜的非特异性结合最小化，因此降低毒性。
本文作为用于配体展示的支架使用的pRNA-3WJ纳米颗粒具有一些有利的属性。它们在尺寸、结构和化学计量上是均匀的；可以大量化学合成，并且以高效率自组装；热力学和化学稳定；无毒；无免疫原性；并且展示有利的生物分布和PK/PD谱。每一个掺入的靶向模块保留其折叠和用于特异性细胞结合和进入体内异种移植物和转移性细胞的独立功能。已经解析了(solved)pRNA-3WJ的晶体结构，这便于RNA纳米颗粒设计(适于在外来体表面上展示具有多种构象的配体)。
外来体可以一次递送多于一种治疗试剂而不是单个试剂。在miRNA或siRNA的情况下，可以同时抑制功能相关的基因。外来体不仅具有作为直接递送方法的临床潜力，而且在递送后，通过外来体介导的向肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞、细胞外基质和免疫细胞的转移可增强治疗的治疗程度。
方法和结果
使用RNA纳米技术构建携带细胞受体结合RNA适配体或化学配体以在外来体表面展示的膜锚定RNA复合物
该方法包括(1)构建携带靶向配体、成像剂和疏水性膜锚定结构域的多功能RNA纳米颗粒用于在外来体表面上展示；(2)分离纳米尺寸的外来体用于高效肿瘤靶向同时避免在健康器官中积累；和(3)RNA纳米颗粒和外来体的工业规模生产和纯化。
用于在外来体上展示的多功能RNA纳米颗粒的构建
pRNA-3WJ基序被用作用于构建用于外来体表面展示的多功能RNA纳米颗粒的稳健支架。pRNA-3WJ核心利用包含在不存在金属盐的情况下以非常高的亲和力组装的三个片段的模块化设计，对由8M尿素变性耐受，为热力学稳定的，并且在超低浓度不解离。解链温度为～60℃，并且解链曲线的斜率接近90°，表明极低的自由能(AG。37℃＝-28kcal/mol)，以及三个片段的同时组装。2'-F修饰导致RNA纳米颗粒耐受RNA酶降解，同时保留用于支架和所有功能模块的真正的折叠和生物学活性。
疏水性膜锚定结构域的掺入
胆固醇亚磷酰胺商购可得(Glen Research)，其携带三甘醇(TEG)接头。已知胆固醇-TEG标记的寡核苷酸自发插入到疏水性脂质核心中而不改变膜结构。用作一个结构域的一个pRNA-3WJ链(b3wj)在使用亚磷酰胺化学的化学合成期间用胆固醇标记(图2A)。
确保RNA纳米颗粒锚定在外来体表面上而不进入到外来体中的RNA纳米颗粒设计：
除了设计疏水性膜锚定结构域以外，还将更大的亲水性凸起设计到RNA纳米颗粒的胞外结构域中用于膜插入和表面展示。凸起可以使用具有多种形状和结构的RNA纳米颗粒构建。
靶向配体与pRNA-3WJ的缀合
已经通过体外SELEX产生了以高选择性和高敏感性与癌细胞表面受体结合的新兴类型的基于RNA适配体的靶向治疗性分子。已经构建了携带许多不同细胞受体结合适配体(参见表1)或化学配体的RNA纳米颗粒。
所得的RNA构建体保留其真正的折叠并且能够在体内有效结合并内化到癌细胞中。此外，模块化设计确保每一条链均可以通过高批次保真度和适应性修改用于控制体内降解进行化学合成。这些适配体的可用性和易于掺入确保外来体靶向配体的多样化以用于特异性靶向患病的细胞和组织。
成像剂与pRNA-3WJ支架的缀合
pRNA-3WJ链(C3WJ)中的一个用Alexa-647荧光团进行末端标记(图2A)。
由三条官能化组分链组装pRNA-3WJ
在将链(a3WJ-叶酸或RNA\适配体):(b3WJ-胆固醇):(c3WJ-Alexa-647)以1:1:1摩尔比混合后，pRNA-3WJ以高效率组装(图2B)。RNA构建体的生物物理特性使用良好建立的方法构建：(1)使用天然PAGE凝胶测定RNA纳米颗粒折叠和组装。(2)用SYBR Green、温度梯度凝胶或UV吸光度通过qPCR评价Tm。
(3)通过使用放射性标记的RNA或表面等离子体共振的竞争测定来评价KD。
(4)通过将RNA与RNA酶或50％FBS一起孵育来评价化学稳定性。
(5)在变性PAGE凝胶中检查对2-8M尿素变性的耐受性。
(6)通过原子力显微术(AFM)成像的结构表征：通过‘m-折叠'和其他RNA折叠算法预测2D结构。
携带功能模块的所有多功能pRNA-3WJ构建体在凝胶或HPLC纯化之后必须满足>95％的纯度；显示真正的折叠和结构，通过AFM成像证实；保留化学和热力学稳定特性，通过Tm分析、变性凝胶和血清稳定性测定进行验证。
从非免疫原性人类胚肾细胞系293(HEK293)中提取外来体
为了确保有利的生物分布和避免肝捕获，已经开发了用于从HEK293细胞中提取高质量外来体而不共纯化蛋白聚集体和其他膜状颗粒(membranous particles)的方法。通过电子显微术(图3A)、尺寸和表面电荷的动态光散射(DLS)(图3B-C)和真正外来体标志物的蛋白质组图谱(图3D)已经表征了外来体。
RNA纳米颗粒和外来体的大规模生产和纯化
纯化大量的RNA复合物对于动物试验和临床应用来说是至关重要的。已经开发了用于大规模纯化RNA的程序。先前，通过HPLC或凝胶电泳进行纯化，收率相对较低。还已经建立了一种使用柱凝胶的RNA工业规模纯化的新方法。已经设计了等渗压缓冲梯度超速离心(iso-osmotic pressure cushioned gradient ultracentrifugation method)方法，用于温和纯化外来体而不沉淀。该方法利用高密度的碘克沙醇代替显示出可损伤外来体的高渗透压的CsCl或蔗糖。通过该方法纯化的外来体保留高生物学活性和纯度，对外来体的形状和尺寸没有不利影响。
在外来体表面上RNA纳米颗粒的掺入
将荧光多功能pRNA-3WJ与纯化的外来体一起孵育。剩余的RNA悬浮液通过尺寸排阻层析去除(图4A)。共聚焦图像显示细胞膜展示出明亮的荧光环，表明胆固醇部分在膜中成功锚定而没有内化到细胞中(图4B)。
优化外来体尺寸和表面配体密度以增强肿瘤靶向并改进体内生物分布谱
调整外来体的尺寸，并且控制在外来体表面上展示的靶向配体的密度。外来体的尺寸和外来体膜锚定靶向配体的密度对于确保以下是关键的：外来体(1)以高效率特异性递送至肿瘤；以及外来体(2)不被健康细胞吸收，被健康细胞吸收可能导致非特异性副作用。使用结肠直肠癌和肝癌异种移植物和转移小鼠模型来评价递送平台。还可以探索外来体施用的最佳途径(静脉内与腹膜内)以实现有利的生物分布和药理学谱(稳定性；PK；PD；吸收、分布、代谢、排泄(ADME)；毒性和免疫应答)。
外来体表面上展示的配体对特异性细胞结合和进入的作用的评价
对于细胞结合和摄取研究，将展示pRNA-3WJ-叶酸或其他受体结合RNA适配体的外来体与叶酸或各自的受体阳性癌细胞一起孵育，并且通过流式细胞术和共聚焦显微术遵循已建立的程序测定。外来体能够通过受体介导的胞吞以及通过与癌细胞膜融合有效地结合并内化到特定细胞(KB、头颈癌和HT29结肠直肠癌)中(图5A和5B)。对于体内验证，在裸小鼠中通过皮下异种移植物产生KB细胞并且全身注射展示pRNA-3WJ-叶酸(或没有叶酸的对照)的外来体。全身和内脏器官成像显示携带叶酸的外来体能够靶向KB细胞肿瘤，在施用后8小时在健康的重要器官中很少或没有积累。结果突出显示了外来体介导的肿瘤靶向的‘主动和‘被动’机制之间的差异。
调整外来体表面配体密度以通过物理障碍阻断非特异性细胞进入
RNA纳米颗粒经由膜锚定结构域的高效膜整合使得通过体外方法在外来体表面修饰高密度的RNA配体是可能的。控制靶向配体的密度通过滴定pRNA-3WJ纳米颗粒(携带靶向配体和胆固醇(图2A))和外来体悬浮液的比率简单地实现。已经证实，300:1的pRNA-3WJ-叶酸与外来体的比率产生可以靶向叶酸受体(+)皮下肿瘤同时避免在健康器官中被截留的外来体(图6A和6B)。另外，一系列RNA支架(图3)可用于呈现特定构象的靶向配体。大量靶向配体且以不同构象的存在以及外来体上靶向配体的总负电荷可以消除与健康细胞的非特异性结合。
调整外来体尺寸以用于降低健康的器官和组织积累
几项研究表明纯化的外来体的静脉内施用导致肝、肾和脾中的非特异性积累。该生物分布谱与大多数纳米颗粒递送媒介物的生物分布谱一致，其通常通过胆汁排泄、肾清除或网状内皮系统的循环被清除。避免被肝、肺和脾非特异性摄取的RNA纳米颗粒的最佳尺寸在10-60nm范围内，这与使用60nm外来体的观察结果一致，所述外来体显示出特异性肿瘤靶向，而在健康器官和组织中不累积(图6A和6B)。外来体的尺寸是可变的并且取决于细胞类型。已经发现了将具有不同尺寸的囊泡分开的超速离心方法，其可以用于研究生物分布谱。可选地，可以调整外来体的尺寸。先前的经验已经表明，具有低多分散性的单层脂质体悬浮液可以以有效和快速的方式用聚碳酸酯膜过滤器来制备。在本文，将提取的外来体悬浮液加热高于外来体脂质混合物的相变温度，并且然后通过商购可得的过滤器(10nm、30nm、50nm、75nm和100nm)(Avanti Polar Lipids)挤出悬浮液以产生均匀尺寸的外来体。在生物分布研究之前，表征它们的尺寸和形态以及验证真正的外来体标志物的存在。
外来体的PK/PD和ADME(吸收、分布、代谢、排泄)的表征
已经建立了用于评价RNA纳米颗粒的PK/PD谱的稳健的测定，其用于评价外来体。在荷瘤小鼠中施用Alexa-647标记的外来体，用于PK/PD和ADME研究。关键PK参数，t1/2(半衰期)、AUC(曲线下面积)、Vd(分布体积)、C0(在时间零时的浓度)、CL(清除率)、和MRT(平均停留时间)遵循先前出版物通过毛细管电泳(CE)确定。使用基于生理学的药代动力学(PBPK)模型，遵循公布的RNA纳米颗粒程序，通过体内和离体实验两者分析外来体到器官和肿瘤中的分布。该模型允许模拟使外来体分配到肿瘤中最大化同时使健康器官中的积累最小化所需的最佳剂量。非靶向外来体被用作对照。外来体的排泄途径在体内通过研究肾和肝排泄来表征。
用于癌症靶向的外来体的腹膜内(i.p)对比静脉内(i.v)递送的比较
全身注射通常为能够将治疗剂递送至转移性细胞的唯一策略。由于其位于腹膜腔内，原发性结肠直肠肿瘤和肝肿瘤以及肝中的转移性细胞进一步适于i.p.施用。对于具有最佳切除肿瘤的患者，相对于i.v.注射，i.p注射标准化学治疗剂改进治疗结果。
外来体与血浆蛋白结合的评价
外来体与血浆蛋白结合显著影响其生物分布、清除和治疗作用。通常使用的蛋白质组学方法包括2D凝胶电泳、CE和LC-MS/MS，被用于既定性地又定量地表征与外来体结合的血浆蛋白(例如，诸如白蛋白、脂蛋白、糖蛋白以及α、β和γ球蛋白)。
外来体的毒性评价
用于使用外来体作为递送平台的一个重要标准为其安全性谱。用由先前出版物改进的方法，通过LC50确定体内外来体的急性全身毒性。可以使用3种不同的小鼠品系(BALB/c、C57BL/6和Swiss Webster)提供发现毒性的最大的机会。将小鼠以分级剂量水平注射外来体，并且监测死亡率、体重和毒性征象。收集血液样品用于标准组临床化学(包括PT、aPTT)、肝酶AST、ALT和LDH(评价肝毒性)、BUN和肌酸酐(评价肾毒性)、以及测量血清INF-α，TNF-α、IL-6和IFN-γ(确定脱靶作用)。记录总体病理学和器官重量，并且检查代表性部分的组织学损伤证据，其包括肝中的局灶性坏死或肝炎、肾中的肾小管坏死或肾病以及肺中的弥漫性肺泡损伤或肺炎。
在临床相关的异种移植物和实验转移小鼠模型中携带靶向配体作为载体的外来体的靶向的药物递送效率
RNAi货物到外来体中的优化装载
通常，使用电穿孔将siRNA/miRNA装载到细胞外的外来体中。但是，这种转移过程可能是低效的，使外来体的完整性受损并且产生RNA沉淀物。已经以成本效益方式发现了使用转染试剂的独特组合装载外来体的稳健且温和的方法。基于在装载之后包封的和游离的荧光siRNA货物的测量结果，到纯化的外来体中的RNA的包封效率被计算为>95％(图8A)。重要的是，外来体的尺寸、形状、表面特性和稳定性在RNAi包封之后保持几乎相同。
使用萤光素酶siRNA验证siRNA的递送和内体逃逸
对于功能测定，将萤光素酶siRNA装载的外来体与没有任何转染试剂的表达萤光素酶的KB细胞(KB-Luc)一起孵育。与加扰对照相比，在仅50nM siRNA装载的外来体的存在下敲低效率>80％(图8B)。对于体内验证，KB-Luc细胞异种移植物被产生并且全身注射装载有萤光素酶siRNA的叶酸-3WJ-外来体。基于降低的生物发光信号观察到萤光素酶的有效敲低，这表明siRNA装载的叶酸-3WJ-外来体能够内体逃避并且在体内触发基因沉默(图15)。通过可视化siRNA与染色内体/溶酶体区室的Lysotracker Red(Invitrogen)的共定位执行细胞内运输研究。在结肠直肠癌治疗中失败或耐受的主要因素是由于PI3K/Akt和RAS/RAF/MEK途径两者的同时活化。使用siRNA对这两种途径的双重抑制可以增强抗增殖作用，并且对药物耐受性结肠直肠癌特别有效。在高度转移性结肠直肠细胞中抑制Akt2和KRAS选择性地抑制其转移能力并增加结肠直肠细胞凋亡(图9A至9D)。在本文，评价了展示与EpCAM结合的RNA适配体的外来体(图10)和阻断PI3K和/或RAS途径的siRNA(单一治疗和组合治疗)的作用，以及它们在抑制结肠直肠癌进展和转移中的效力和安全性。
miRNA至癌细胞的靶向的递送
miRNA在肿瘤进展，细胞周期、分化、转移和凋亡的调节中发挥重要作用。使用展示靶向配体的外来体作为载体用于递送反义-miRNA以通过下调致癌miRNA，诸如牵涉在肿瘤进展和转移中的熟知的参与者miR-21来抑制结肠直肠肿瘤或肝肿瘤生长。在癌细胞膜上过表达的EpCAM抗原对于靶向是有吸引力的，因为它们在原发性和转移性结肠癌和肝癌(包括癌症干细胞)中过表达>1000倍。已经通过SELEX开发出了来自基于RNA纳米技术的2'-F 3WJ文库的对EpCAM具有异常强的结合亲和力的2'F RNA适配体(图10)，其展示在外来体表面上用于靶向结肠直肠肿瘤和肝肿瘤。还已经开发了一种配制用于有效递送反义-miRNA种子序列的RNA纳米颗粒构建体的方法。锁核酸(LNA)修饰的8核苷酸序列可以以高亲和力与miRNA种子区域结合并且触发miRNA抑制。在将反义-miR-21与EGFR靶向RNA适配体一起掺入到pRNA-3WJ支架之后，RNA纳米颗粒在全身注射之后，可以在三阴性乳腺癌原位异种移植物中敲低miR-21表达并且抑制肿瘤增殖和生长(图11)。通过qRT-PCR和蛋白印迹测定，靶向miR-21导致肿瘤抑制因子和促凋亡基因(包括PTEN、PDCD4、RECK和Bcl2)的直接上调。评价携带EpCAM适配体和反义-miR-21货物的外来体在结肠直肠肿瘤和肝肿瘤模型中随时间推移诱导持续肿瘤生长抑制的能力。
可选的反义-miRNA:与健康和相邻的良性肝相比，miR-221表达为肝中上调最多的miRNA之一。MiR-221靶向许多关键的肿瘤抑制因子，包括p27、p57、PTEN、TIMP3和mTOR途径调控物。
用于基因救援的dsDNA的靶向的递送
将编码GFP蛋白的载体质粒装载到外来体中，将其与GFP阴性细胞一起孵育而没有任何转染试剂。GFP基因也可以被装载到展示RNA适配体的外来体(在表1中)中，其然后可以在具有表达对应于外来体上的配体的受体的癌症异种移植物的动物模型中被测试。用于在异种移植物肿瘤中表达GFP的组织学谱可以用于确定用于体内基因救援的dsDNA递送的可行性。
用于基因组编辑的CRISPR RNA模块的靶向的递送
细菌CRISPR-Cas(CRISPR:成簇的规律间隔的短回文重复；Cas：CRISPR相关)基因座编码几种蛋白，作为与针对病毒感染的RNA干扰相似的适应性免疫系统一起工作。这种适应性的自我防御系统被许多细菌使用以保护自身免受外来核酸的伤害，由Cas核酸酶和将靶指定至侵入物的基因组内的裂解位点的小RNA指导来介导。在II型CRISPR-Cas系统中，RNA指导的Cas9核酸酶可以重编程以在多种生物体(包括人类细胞)的基因组中产生双链DNA断裂。编辑机制通过同源定向修复或非同源末端连接机制实现，导致核苷酸缺失、取代或插入。用于CRISPR/Cas9系统的最著名的转化药物为将受调控的RNA指导的特异性原核基因组编辑过程应用到真核细胞中，作为不利疾病包括癌症、病毒感染和几种遗传疾病的有希望的基因组编辑疗法。然而，由于有限的非病毒体内RNA递送系统，将CRISPR组分递送到真核细胞中用于CRISPR介导的基因组编辑疗法是非常具有挑战性的。在本文，将特定设计的包含特定gRNA和Cas9mRNA的质粒DNA或RNA货物装载到外来体中。将CRISPR组分特异性递送至患病细胞通过在外来体表面展示特定配体(表1)来实现。通过使用细胞或动物模型破坏或修复编码与Cas9融合的标志物不同的基因(诸如β-gal、萤光素酶或荧光蛋白)的报告物基因关注概念验证集。
用于外来体评价的临床相关的异种移植物和转移小鼠模型
异种移植物模型：通过将HT29肿瘤细胞直接注射到侧腹已经建立了用于产生皮下结肠直肠癌异种移植物的程序，以及通过在外科手术之后将细胞(或患者来源的细胞)直接注射到裸小鼠的盲肠建立更多临床上相关的原位模型。可选地，可以使用原位肝癌小鼠模型。原位肝肿瘤通过将悬浮于Matrigel中的表达萤光素酶的PLC/PRF/5细胞直接肝内注射到肝叶中来建立。
转移模型：肝、肺和淋巴结转移通过将表达萤光素酶的HT29细胞注射到脾或盲肠来建立并且通过生物发光成像监测。已经证明，在全身注射之后，Alexa-647标记的pRNA-3WJ纳米颗粒可以有效靶向HT29异种移植物以及肝、肺和淋巴结转移性细胞。在健康重要器官和正常肝/实质中观察到很少或没有积累。
siRNA和miRNA的靶基因表达通过在mRNA水平的qRT-PCR以及通过在蛋白水平的蛋白印迹评价。RNA纳米颗粒对细胞生长和凋亡的作用可以通过WST-1、TUNEL、原位胱天蛋白酶活性、DNA片段化和膜联蛋白V/PI染色来测定。最后，可以探索治疗性外来体的PK/PD、ADME、和毒性谱。
实施例2控制用于前列腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌的衰退的细胞外囊泡上的RNA表面展示的纳米颗粒取向
在该实施例中，RNA纳米技术被用于重编程天然细胞外囊泡，以用于在体外和体内将siRNA特异性递送至癌症模型。
材料和方法
已经报道了具有或不具有2'-F修饰或Alexa647标记的RNA纳米颗粒的构建、合成和纯化(Shu,D.,等Nature Nanotechnology 6:658-667(2011))。
所有RNA链的序列(小写字母指示2'-F核苷酸)为：
a3wj：5'-uuG ccA uGu GuA uGu GGG-3'(SEQ ID NO:1)。
b3WJ：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc-3’(SEQ ID NO:2)。
c3WJ：5’-GGA ucA Auc AuG GcA A-3’(SEQ ID NO:3)。
a3WJ-sph1：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG AAu ccc GcG Gcc AuG Gcc GGG AG-3’(SEQ ID NO:4)。
a3WJ-存活蛋白有义：5'-uuG ccA uGu GuA uGu GGG GcA GGu uCC uuA ucuGucAuu-3'(SEQ ID NO:5).
a3WJ-存活蛋白有义(加扰)：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG AAu ccc GcG Gcc AuGGcc GGG AG-3’(SEQ ID NO:6)。
c3WJ-PSMA适配体：5’-GGA ucA Auc AuG GcA AuG GGA ccG AAA AAG Acc uGA cuucuA uAc uAA Guc uAc Guu ccc-3’(SEQ ID NO:7)。
存活蛋白反义：5’-UGA CAG AUA AGG AAC CUG C-3’(SEQ ID NO:8)。
存活蛋白反义(加扰)：5’-CUC CCG GCC AUG GCC GCG GGA UU-3’(SEQ ID NO:9)。
b3WJ-EGFR适配体：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc Gcc uuA GuA AcG uGc uuuGAu Guc GAu ucG AcA GGA GGc-3’(SEQ ID NO:10)。
a3WJ-叶酸：5’-(叶酸)uuG ccA uGu GuA uGu GGG-3’(加下划线的部分为SEQ IDNO:1)。
a3WJ-胆固醇：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG(胆固醇TEG)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:1)。
b3WJ-叶酸：5’-(叶酸)ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc-3’(加下划线的部分为SEQID NO:2)。
b3WJ-胆固醇：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc(胆固醇TEG)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:2)。
b3WJ-Alexa647：5’-(Alexa647)(AmC6)-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccc-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:2)。
c3WJ-Alexa647：5’-GGA ucA Auc AuG GcA A(C6-NH)(Alexa647)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:3)。
叶酸-c3WJ-Alexa647：5’-(叶酸)GGA ucA Auc AuG GcA A(C6-NH)(Alexa647)-3’(加下划线的部分为SEQ ID NO:3)。
EV纯化：使用修改的差速超离心方法纯化EV(Thery,C.,等Curr.Protoc.CellBiol Chapter 3,Unit 3.22(2006))。简言之，将用于细胞培养的胎牛血清(FBS)以100,000×g离心70min以去除现有的血清EV。已知FBS包含EV，并且先前已经报道了离心可能未去除所有的EV，因此从HEK293T细胞分离的一些EV实际上可能包含来自FBS的EV(Witwer,K.W.,JExtracell.Vesicles.2,(2013)；Shelke,G.V.,等J Extracell.Vesicles.3,(2014))。在细胞铺板之后48小时收获HEK293T细胞培养物(富含EV的培养基)的上清液并且以300×g离心10min以去除死亡的细胞，随后在4℃以10,000×g离心30min以去除细胞碎片和/或微泡。通过使用OptiPrep Cushion程序从培养基中浓缩EV(Jasinski,D.,等Methods in MolecularBiology 1297:67-82(2015))。OptiPrep缓冲垫提供等渗压并且防止EV的物理破坏。将200μL的60％碘克沙醇(Sigma)添加至每一个管的底部以形成缓冲垫层。在使用Beckman Sw28转子在4℃以100,000×g离心70min之后，EV迁移并且浓缩至60％碘克沙醇与富含EV的培养基之间的界面层。收集1mL靠近界面和缓冲垫的级分。将6mL EV溶液进一步洗涤并且用包含50μL 60％碘克沙醇缓冲垫的SW28管中的30mL PBS沉淀，然后在4℃以100,000×g离心70min。收集缓冲垫中的所有沉淀物，并且悬浮于1mL无菌PBS中以供进一步使用。
已经报道了用于细胞培养、EM成像、共聚焦显微术、DLS测量和流式细胞术的方法(varez-Erviti,L,等Nat Biotechnol.29:341-345(2011)；Shu,D.,等NatureNanotechnology 6:658-667(2011)；Shu,D.,等ACS Nano9:9731-9740(2015))。HEK293T、KB、LNCaP-FGC、和PC-3细胞从ATCC获得，并且LNCaP-LN3细胞从MD Anderson癌症中心获得。从ATCC购买的细胞培养物在购买之前通过短串联重复(STR)验证，并且在作为礼物接受细胞之前验证LNCaP-LN3细胞。测试每一个细胞系的支原体。尽管KB细胞系已经被列为由HeLa细胞污染来源的错误识别的细胞系，它在这些研究中用作理想的模型。已知KB细胞过表达叶酸受体，允许通过在RNA纳米颗粒上使用叶酸的适当的特异性靶向。KB细胞系的来源不影响其用作测试RNA展示EV的叶酸受体靶向特性的模型。
NTA：使用Malvern NanoSight NS300系统对以10μg蛋白/mL的浓度重悬于PBS中的EV进行NTA以用于分析。系统使激光束聚焦通过样品悬浮液。使用与光束轴对齐的常规光学显微镜通过光散射将EV可视化，该常规光学显微镜收集从视野中的每个颗粒散射的光。三个10秒的视频记录所有事件以用于通过NTA软件进一步分析。每一个颗粒的布朗运动在帧之间被追踪，最终允许通过应用Stokes Einstein方程来计算尺寸。
尺寸排阻层析：将Sephadex G200凝胶柱用PBS平衡并且装载荧光标记的EV样品。在用PBS洗涤之后，以5滴/孔收集级分。
收集的级分中的Alexa647的荧光强度使用酶标仪(Synergy 4,Bio TekInstruments,Inc)来测量。
将siRNA装载到EV中：将EV(100μg总蛋白)和RNA(10μg)在具有10μL ExoFectExosome转染(System Biosciences)的100μL PBS中混合，随后是热休克方案。将胆固醇修饰的RNA纳米颗粒与siRNA装载的EV在37℃孵育45min，然后在冰上放置1小时以制备RNA修饰的EV。装饰的RNA纳米颗粒以10μg RNA纳米颗粒/按蛋白量计100μg EV的比率保持。为了纯化RNA修饰的EV，将400μL RNA装饰的EV用包含20μL 60％碘克沙醇缓冲垫的SW-55管中的5mLPBS洗涤并且在4℃以100,000×g离心70min。收集缓冲垫中的所有沉淀物，并且悬浮于400μL无菌PBS中以供进一步使用。
测定到EV中的siRNA装载效率：将待装载到EV中的siRNA纳米颗粒在一条链的末端处用Alexa647标记。在如以上描述装载siRNA之后，将装载siRNA的EV用ExoTC(SystemBiosciences)沉淀下来，并且从上清液中收集未装载的siRNA纳米颗粒。游离RNA纳米颗粒和总输入RNA纳米颗粒的浓度使用荧光计以在635nm处的激发、在650-750nm处的发射，通过Alexa647荧光强度来测量。siRNA装载效率通过以下公式计算：
FBS消化实验：将15μL纯化的Alexa647-RNA-装饰的EV与30μL FBS(Sigma)混合并且在37℃孵育2小时。将样品装载到1％syner凝胶中以用于在TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mMEDTA)缓冲液中电泳以测试修饰的RNA的降解。使用Cy5通道用Typhoon(GE Healthcare)将凝胶成像。
使用qRT-PCR测定PSMAapt/EV/si存活蛋白对前列腺癌的作用：将LNCaP-FGC细胞与100nM的PSMAapt/EV/si存活蛋白和分别包含3WJ/EV/si存活蛋白和PSMAapt/EV/si加扰纳米颗粒的对照一起孵育。在48小时处理之后，收集细胞并且通过qRT-PCR评价靶基因下调作用。PC-3细胞被用作阴性对照细胞系。
遵循制造商的说明(Life Technologies)使用Trizol RNA提取试剂处理细胞以为了得到总RNA。使用SuperscriptTMIII第一链合成系统(Invitrogen)，在来自用多种RNA处理的细胞的总RNA(1μg)中合成第一cDNA链。使用TaqMan测定进行实时PCR。所有反应均使用TaqMan快速通用PCR主混合物以20μL的终体积进行并且以一式三份测定。用于人类BIRC5、18S和GAPDH的引物/探针集从Life Technologies购买。在Step-One Plus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行PCR。相对的存活蛋白-mRNA表达水平对于体外测定以18SRNA且对于体内测定以GAPDH作为内部对照进行归一化。通过比较CT方法(ΔΔCT方法)将数据进行分析。
由于细胞培养物之间的高的重现性和一致性，预测在体外研究中，至少n＝3的样品尺寸将允许进行适当的分析以获得有意义的数据结论。然而，在体内研究中，在组织样品中观察到较高的变异(variance)；因此，需要更高的样品集来补偿这种天然变异。在这些研究中，对于PSMAapt/EV/si加扰肿瘤n＝4，而由于有限的肿瘤样品对于PSMAapt/EV/si存活蛋白肿瘤n＝2，并且以一式三份完成重复实验。在乳腺癌小鼠研究中，对于来自所有组的肿瘤，N＝3。在整个实验中将样品和动物随机分到组中。
蛋白印迹和抗体：将LNCaP-FGC细胞与100nM PSMAapt/EV/si存活蛋白和分别包含3WJ/EV/si存活蛋白和PSMAapt/EV/si加扰纳米颗粒的对照一起孵育。在48小时处理之后，收集细胞并且用具有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma)裂解。用于蛋白印迹分析的第一抗体为兔抗人类存活蛋白抗体(R&D system,AF886)、兔抗人类β-肌动蛋白(Abeam,ab198991)、兔抗人类TSG101(Thermo Scientific,PA5-31260)、兔抗人类整联蛋白α4(Cell Signaling,4711S)、兔抗人类整联蛋白α6(Cell Signaling,3750S)、兔抗人类整联蛋白β1(Cell Signaling,4706S)、兔抗人类整联蛋白β4(Cell Signaling,4707S)、兔抗人类整联蛋白β5(Cell Signaling,4708S)、兔抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(ThermoFisher,PA5-28055)、GAPDH抗体(Santa Cruz Biotechnology)。
细胞毒性测定：用MTT测定试剂盒(Promega)根据制造商的方案评价PSMAapt/EV/si存活蛋白的细胞毒性。将LNCaP-FGC和PC-3细胞在96孔板中以一式三份用EV处理。在48小时之后，细胞存活率在酶标仪(Synergy4,Bio Tek Instruments,Inc)上通过MTT测定来分析。
在全身注射EV之后肿瘤异种移植物的体内靶向测定：为了产生KB细胞异种移植小鼠模型，使用雄性无胸腺裸Nu/Nu(6-8周龄)小鼠(Taconic)。将在100μL PBS中的2×106个KB细胞皮下注射至每一只小鼠中。当肿瘤达到～500mm3的体积时，将小鼠使用异氟烷气体(在氧气中2％，以0.6L/分钟流动速率)麻醉，并且用单一剂量2mg/kg的EV/小鼠重量通过尾静脉静脉内注射。在8小时之后将小鼠安乐死，取出器官和肿瘤用于荧光成像以使用IVISSpectrum Station(Caliper Life Sciences)比较EV的生物分布谱。该动物实验用肯塔基大学的动物管理和使用委员会(IACUC)(the Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)of University of Kentucky)批准的方案完成。
用在100μL体积中的4μM EV经由尾静脉注射一次携带具有约200mm3尺寸的MDA-MB-468原位异种移植物肿瘤的每组3只小鼠经。在全身施用8小时之后，将小鼠在麻醉下通过颈椎脱臼处死，并且立即将乳腺肿瘤切离。通过使用IVIS Lumina Series III临床前体内成像系统(Perkin Elmer)以在640nm处的激发和在660nm处的发射持续1min暴露检查切离的肿瘤来检测来自EV的Alexa647的荧光信号。荧光强度被表示为平均辐射效率[p/s/cm2/sr]/[μW/cm2]。PBS注射的小鼠被用作阴性对照以用于背景荧光。该动物实验用俄亥俄州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)(the Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)of The Ohio State University)批准的方案完成。
EV在前列腺癌小鼠模型中的体内治疗作用：6-8周龄的雄性裸小鼠(Nu/Nu)从Charles River(Wilmington,MA)购买。使用IVC系统(Innovive)将小鼠维持在无菌条件下。肿瘤异种移植物通过在小鼠的侧腹区域皮下注射与等体积Matrigel基质(Corning LifeSciences)混合的2×106个癌细胞来建立。以0.5mg siRNA/5mg EV/kg小鼠体重的剂量通过尾静脉注射施用PSMAapt/EV/si存活蛋白、PSMAapt/EV/si加扰和PBS，每周两次，持续三周。用卡尺测量肿瘤的两个轴(L，最长轴；W，最短轴)。肿瘤体积计算为：V＝(L×W2)/2。该动物实验用北达科他州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)the Institutional AnimalCare and Use Committee(IACUC)of North Dakota State University批准的方案完成。对于肿瘤抑制测定，n＝10，从一开始就不发展肿瘤的小鼠被排除在分析之外。
EV在乳腺癌小鼠模型中的体内治疗作用：4周龄雌性无胸腺nu/nu远交小鼠从在俄亥俄州立大学的Target验证共享资源维持的无胸腺裸小鼠种群(colony)中获得；用于该种群的原始种畜(breeders)(品系#553和#554)从NCI Frederick机构接收，并且用于所有研究。通过注射先前维持在DMEM/10％FBS/1％青霉素和链霉素中的2×106个MDA-MB-468细胞在小鼠中产生原位乳腺脂肪垫异种移植物肿瘤。每组5只具有在乳腺形成的尺寸为约100mm3的肿瘤的小鼠经由尾静脉用0.5mg siRNA/5mg EV/kg小鼠体重注射。PBS和EGFRapt/EV/si加扰被用作阴性对照组。总计5个剂量被一周一次注射到小鼠中。每一次注射时，肿瘤体积被确定为V＝(L×W2)/2(mm3)。该动物实验用俄亥俄州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)批准的方案完成。
到SCID小鼠中的患者肿瘤移植：雄性NOD-scid IL2Rγnull小鼠从JacksonLaboratory(BarHarbor,ME)购买。将用于这些动物的安置维持在具有12h光照/12h黑暗周期的灭菌笼内的HEPA过滤的环境中。所有动物程序均经肯塔基大学动物管理和使用委员会批准并且遵守执行。将原始患者CRC肿瘤(F0世代)分离并植入到NOD scidγ小鼠的侧腹(The Jackson Laboratory；005557)。当所得的肿瘤生长至1cm3时，切除每一个肿瘤(F1世代)，分割为2-mm3片段(pieces)并且植入到小鼠中用于实验程序(F2世代)。将患者肿瘤移植小鼠经由尾静脉注射0.5mg siRNA/5mg EV/kg小鼠体重。FA/EV/si加扰被用作阴性对照组。总计5个剂量被一周一次注射到小鼠中。每一次注射时，肿瘤体积被确定为V＝(L×W2)/2(mm3)。
统计：对于每一个测试样品，每一个实验以一式三份重复至少3次。除非另外指明，结果被呈现为平均值±标准差。统计学差异用GraphPad软件使用非配对t检验评价，并且p<0.05被认为是显著的。
结果
1.用于在EV表面上展示的箭头状RNA纳米结构的设计和构建。
噬菌体phi29马达pRNA的3-式连接(3WJ)(Shu,D.,等Nature Nanotechnology 6:658-667(2011)；Zhang,H.,等RNA 19:1226-1237(2013))经由其内在性质折叠为在螺旋区域之间具有60°、120°、和180°三个角度的计划排列(planner arrangement)(图12a-12b)(Zhang,H.,等RNA 19:1226-1237(2013))。通过掺入用作用于与癌细胞上过表达的特定受体结合的靶向配体的RNA适配体，将pRNA-3WJ延伸为箭头状结构。使用工程化的pRNA-3WJ来装饰从HEK293T细胞培养物上清液中纯化的EV以产生配体装饰的EV。使用HEK293T EV，因为它们与由其他细胞产生的EV相比包含最小的内在生物货物(Lamichhane,T.N.,等Mol.Pharm.12:3650-3657(2015))。如蛋白印迹(图18a)中显示的，HEK293T分离的EV显示几种常见整联蛋白标志物的阴性染色，如在癌症起源的EV上观察到的(Rak,J.Nature 527:312-314(2015)；Melo,S.A.等Nature 523:177-182(2015))，仅TSG101阳性染色。采取另外的步骤去除来自HEK293T细胞培养物中使用的FBS的EV；虽然离心可能未完全去除FBS EV(Witwer,K.W.,J Extracell.Vesicles.2,(2013)；Shelke,G.V.,等JExtracell.Vesicles.3,(2014))。使用OptiPrep超速离心方法纯化EVs(Thery,C,等Curr.Protoc.Cell Biol Chapter 3,Unit 3.22(2006))。添加用于超速离心的等渗OptiPrep缓冲垫层大大增强了EV纯化在纯度方面的重现性(图18c)，并且还使EV被超速离心沉淀的物理破坏最小化，如通过电子显微术(EM)成像(图12c)显示的。OptiPrep缓冲垫层的存在并未显著改变EV的颗粒尺寸分布或ζ电位(图12d-e)，而是保存了EV的天然形状。不用OptiPrep缓冲垫层纯化的EV表现为扁平球体(图12c右侧)，而大部分用缓冲垫纯化的EV表现为完整球体(图12c左侧)。因此，来自EM图像的EV的尺寸可能并不总是代表其在群体中的粒径分布。纳米颗粒追踪分析(NTA)和动态光散射(DLS)显示分离的天然EV为物理均匀的，具有以约96nm为中心的窄尺寸分布(图12d)和负ζ电位(图12e)。
纯化的EV经由蛋白印迹通过EV特异性标志物TSG101的存在进一步鉴定(Kumar,D.,等Oncotarget 6:3280-3291(2015))(图18a)。来自HEK293T细胞培养物上清液的纯化的EV的收率为约10-15μg(以蛋白浓度测量)，或0.1-1.9×109个EV颗粒(通过NTA测量)/106个细胞。将单个类固醇分子胆固醇-四甘醇(TEG)缀合到pRNA-3WJ的箭头尾部以促进3WJ锚定到EV膜上(图12b)。胆固醇经由其疏水性部分自发地插入到EV的膜中(Bunge,A.,等J PhysChem.B 113:16425-16434(2009)；Pfeiffer,I.,等J Am.Chem.Soc 126:10224-10225(2004))。在纯化的EV的表面上展示RNA纳米颗粒通过在37℃简单地将胆固醇-修饰的RNA纳米颗粒与EV一起孵育1小时实现。
EV具有极大希望作为新兴的治疗性载体在细胞通信中发挥其作用。它们可以通过多于一种途径进入细胞，所述多于一种途径包括膜融合、四次穿膜蛋白和整联蛋白受体介导的胞吞、脂筏介导的胞吞或微胞饮；但是关于受体细胞存在有限的特异性(Marcus,M.E.,等Pharmaceuticals.(Basel)6:659-680(2013)；van Dongen,H.M.,等Microbiol.Mol.Biol.Rev.80:369-386(2016))。为了赋予EV向癌细胞的特异性靶向，将三类靶向配体，叶酸、PSMA RNA适配体或EGFR RNA适配体缀合至3WJ以用于在EV表面上展示。叶酸为一种有吸引力的靶向配体，因为许多上皮起源的癌症诸如结肠直肠癌，过表达叶酸受体(Parker,N.,等Anal.Biochem.338:284-293(2005))。PSMA在前列腺癌细胞中以异常高水平表达，并且其表达也与更具侵袭性的疾病相关(Dassie,J.P.,等Mol Ther.22:1910-1922(2014))。PSMA-结合2'-氟(2'-F)修饰的RNA适配体A9g(Rockey,W.M.,等Nucleic AcidTher.21:299-314(2011)；Binzel,D.,等Molecular Therapy 24,1267-1277(2016))被展示在EV上以增强对前列腺癌细胞的靶向效率。PSMA适配体A9g为A9的43-mer截短形式，其以130nM的Kd特异性结合PSMA(Rockey,W.M.,等Nucleic Acid Ther.21:299-314(2011))并且被用作基于RNA的配体。EGFR在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤和转移性TNBC肿瘤中高度过表达(Hynes N.E.,等Nat Rev.Cancer 5,341-354(2005))。EGFR特异性2'F-RNA适配体(Esposito,C.L,等PLoS ONE 6,e24071(2011)；Shu,D.,等ACS Nano9,9731-9740(2015))被掺入至pRNA-3WJ的一个末端，并且从而展示在EV上以用于增强的乳腺癌细胞靶向。对于成像，pRNA-3WJ链中的一条用荧光染料Alexa647进行末端标记(图12h)。如通过NTA和DLS测量，RNA纳米颗粒修饰的EV的尺寸分布和ζ电位与天然EV相比未显著改变(图12f-g)。
存活蛋白(一种细胞凋亡的抑制剂)为用于癌症疗法的有吸引力的靶，因为它的敲低可以减少致瘤性并且抑制转移(Paduano,F.,等Molecular Cancer Therapeutics 5,179-186(2006)；Khaled,A.,等Nano Letters 5,1797-1808(2005))。与装载在EV中的存活蛋白siRNA(图12i)组合，制备了具有靶向部分的siRNA装载的EV以评价体内前列腺癌、乳腺癌和结肠癌抑制效力。为了改进siRNA在体内的稳定性，过客链为在嘧啶上2'-F修饰的以提供RNA酶耐受性，而指导链保持未修饰(Cui,D.等Scientific reports 5,10726(2015)；Lee,T.J.等Oncotarget 6,14766-14776(2015))。为了追踪EV中的siRNA装载效率，将存活蛋白siRNA与Alexa647标记的3WJ核心融合并且组装为RNA纳米颗粒(图18b)。在将siRNA装载到EV中并且用PSMAapt/3WJ/胆固醇RNA纳米颗粒装饰EV之后，如通过NTA测量在103nm和120nm处具有两个峰，EV的尺寸未显著改变(图12f)。将存活蛋白-3WJ RNA纳米颗粒在具有ExoFect但不具有EV的PBS中处理，显示出不同的粒径分布谱(PBS/si存活蛋白)和低约40倍的颗粒浓度(图18e)。如通过游离RNA纳米颗粒的荧光强度测量，siRNA-3WJ RNA纳米颗粒的装载效率为约70％(图18d)。不具有EV或仅具有ExoFect试剂的对照显示出低至15％沉淀。
2.RNA纳米颗粒的箭头头部或箭头尾部胆固醇标记分别导致EV装载或膜展示。
2.1.使用血清消化测定区分进入EV或EV上的表面展示。
使用箭头状pRNA-3WJ纳米结构的取向和角度来控制EV的RNA装载或表面展示。进行血清消化以确认2'-F RNA纳米颗粒与EV的定位。尽管2'-F 3WJ RNA纳米颗粒对RNA酶相对耐受(图19a)，它们可以在67％胎牛血清(FBS)中消化并且在37℃孵育2小时(图19b)。通过超速离心从游离RNA纳米颗粒纯化展示Alexa647-2'F RNA纳米颗粒的EV，然后经历血清消化。在37℃FBS孵育之后，EV装饰的箭头尾部上具有胆固醇的Alexa647-2'F RNA(31.6％±8.8％)比箭头头部胆固醇装饰的对应物(9.5％±11.9％)降解多得多(图13a-d)。这些结果表明箭头尾部上的胆固醇促进了EV表面上的叶酸-3WJ或RNA适配体的展示并且因此被降解；而箭头头部上的胆固醇促进RNA纳米颗粒进入EV，如通过Alexa647-2'F RNA纳米颗粒针对血清消化的保护所证明的。在箭头尾部构型中，似乎形成60°角的两个臂可以充当钩以将RNA纳米颗粒锁定在适当位置。如果是这种情况，该作用会阻止钩状RNA通过膜(图13a)。
在血清消化实验中使用的FBS的浓度有目的地保持非常高以降解EV上的外部展示的RNA。已经证明装饰的PSMAapt-3WJ 2'F RNA纳米颗粒在生理条件下保持稳定和完整(Binzel,D.,等Molecular Therapy 24,1267-1277(2016)；Shu,D.,等ACS Nano 9,9731-9740(2015))。
2.2.通过竞争测定区分进入EV或EV上的表面展示。
如以上描述的，当胆固醇与pRNA-3WJ的箭头尾部附接时，RNA纳米颗粒被锚定在EV的膜上，并且所掺入的配体展示在EV的外表面上(图13a)。通过使用箭头-尾部胆固醇RNA纳米颗粒在EV表面上展示叶酸来检测EV与过表达叶酸受体的KB细胞结合的增加(图13e、图13f)。当与低叶酸受体表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞一起孵育时，与无箭头尾部配体3WJ/EV相比，箭头尾部状FA-3WJ/EV未增强其细胞结合(图13g)。叶酸的表面展示通过游离叶酸竞争测定进一步确认，其中建立了由胆固醇箭头尾部FA-3WJ/EV与KB细胞的结合基线。当添加10μM游离叶酸以与胆固醇-箭头-尾部FA-3WJ/EV竞争叶酸受体结合时，检测到与KB细胞的细胞结合的减少(48.3％±0.6％)(图13f)。相比之下，箭头状FA-3WJ/EV中游离叶酸与KB细胞的结合的竞争(图13h)低得多(24.8％±0.6％)(图13i)，这可能是由于箭头-头部状FA-3WJ纳米颗粒部分内化到EV中，这导致EV表面上叶酸的展示强度较低。
EV可以通过在细胞之间转运mRNA、siRNA、miRNA或蛋白和肽来介导细胞间通讯。它们通过多种途径内化进受体细胞，所述多种途径包括微胞饮、受体介导的胞吞或脂筏介导的胞吞(Marcus,M.E.,等Pharmaceuticals.(Basel)6:659-680(2013))。尽管用于EV摄取的天然过程不是配体依赖性的，箭头-尾部胆固醇RNA-3WJ允许将配体展示到EV表面上，并且增加其对对应的受体过表达癌细胞的靶向效率。
3.在细胞培养物中RNA展示EV的癌症靶向和基因沉默
特异性癌细胞靶向为将纳米囊泡应用于癌症疗法的一个重要先决条件。在PSMA阳性的LNCaP前列腺癌细胞中检查PSMA适配体-展示EV的靶向、递送和基因沉默效率。为了赋予RNA酶耐受性，将2'-F修饰应用于放置于EV的表面上的RNA纳米颗粒(Shu,D.,等NatureNanotechnology 6:658-667(2011))，而pRNA-3WJ的热力学稳定性提供了确保RNA适配体的正确折叠的刚性结构(Shu,D.,等Nature Nanotechnology6:658-667(2011)；Binzel,D.W.等Biochemistry 53:2221-2231(2014))。通过流式细胞术和共聚焦显微术分析，与不具有PSMA适配体的EV相比，PSMA适配体展示EV显示出对PSMA(+)LNCaP细胞的增强的结合和明显的摄取，但对PC-3细胞(其为低PSMA受体表达细胞系)未显示出(图14a)。在与LNCaP细胞一起孵育后，PSMAapt/EV/si存活蛋白能够在mRNA水平(如通过实时PCR证明的)(69.8.1％±9.37％,p<0.001)(图14b)和蛋白水平(如通过蛋白印迹显示的)(62.89％±8.5％,p<0.05)(图20)敲低的存活蛋白表达。通过MTT测定的细胞存活力表明，由于存活蛋白siRNA递送，LNCaP细胞的存活力降低(69.6％±6.4％,p<0.05)(图14c)。
4.配体展示EV靶向肿瘤
评价配体展示EV的肿瘤靶向和生物分布特性。将FA-3WJ/EV经由尾静脉全身施用到KB皮下异种移植物小鼠模型中。测试3WJ/EV和PBS治疗的小鼠作为对照。在8小时之后拍摄的小鼠健康器官和肿瘤的离体图像显示FA-3WJ/EV主要在肿瘤中积累，与PBS对照小鼠相比在重要器官中低积累，并且与3WJ/EV对照小鼠相比在肿瘤中更多积累(图15a)。不具有表面修饰的正常EV通常在全身递送之后显示在肝中积累(Ohno,S.,等Mol Ther.21:185-191(2013))。RNA和细胞膜两者带负电荷。已经证明静电排斥作用在降低健康器官中RNA纳米颗粒的积累方面发挥作用(Binzel,D.,等Molecular Therapy 24:1267-1277(2016)；Shu,D.,等ACS Nano 9:9731-9740(2015)；Haque,F.,等Nano Today 7:245-257(2012))。推测在EV表面上展示靶向RNA降低它们在正常器官中的积累，并且理想纳米尺寸的RNA展示EV经由增强渗透性和保留(EPR)作用便于肿瘤靶向，从而避免毒性和副作用。
5.如动物试验中证明的，通过配体-3WJ-展示EV抑制肿瘤生长
5.1.PSMA适配体展示EV完全抑制小鼠中前列腺癌的生长。
PSMA适配体展示EV用于前列腺癌治疗的治疗作用使用LNCaP-LN3肿瘤异种移植物来评价(Li,Y.,等Prostate Cancer Prostatic.Dis.5:36-46(2002)；Pettaway,C.A.,等Clin.Cancer Res 2:1627-1636(1996))。与对照组相比，用PSMAapt/EV/si存活蛋白治疗(每3天1个剂量；总计6个剂量)完全抑制体内肿瘤生长(图15b)。EV为生物相容的并且在体内良好耐受的，因为未观察到显著的毒性，如在治疗后40天内评价的小鼠体重指示的(图15c)。通过使用GAPDH作为内部对照的实时PCR分析肿瘤中的存活蛋白mRNA表达水平显示通过PSMAapt/EV/si存活蛋白敲低存活蛋白的趋势(图15d)。总之，PSMA适配体展示EV为用于在体内递送存活蛋白siRNA的有前景的载体，并且PSMAapt/EV/si存活蛋白的全身注射可以实现期望的治疗效力。
在前列腺癌研究中，体内癌症生长抑制作用比体外MTT测定更明显。PSMA适配体在EV的表面上的展示轻微增强了其在体外对PSMA受体过表达的癌细胞的靶向，而EV表面上的带负电荷RNA可能已经最小化其对健康细胞的非特异性分布，如在FA-3WJ/EV生物分布测试中观察到的。EPR作用还可以促进将纳米尺寸EV在体内归巢到肿瘤中；尽管图15a中呈现的生物分布可能不适于图15b中呈现的功能评价。所有这些结果表明RNA适配体展示EV适于体内应用。
5.2.EGFR适配体展示EV抑制小鼠中乳腺癌的生长。
乳腺癌细胞中EGFR的过表达与高度增殖以及接受治疗的患者中的复发风险相关(Rimawi,M.F.,等Cancer 116:1234-1242(2010))。构建携带EGFR适配体的pRNA-3WJ纳米颗粒(图21a)用于在EV表面上展示，并且EV被装载有存活蛋白siRNA。将所得的EGFRapt/EV/si存活蛋白经由尾静脉施用到携带MDA-MB-468原位异种移植物肿瘤的小鼠中。3WJ/EV/si存活蛋白(不具有靶向配体)和PBS治疗的小鼠用作对照。分析用每组三只小鼠来完成。在8小时之后拍摄的离体图像显示在肿瘤中积累的EGFRapt/EV/si存活蛋白比对照组的多(图16a)，表明在EV的表面上展示EGFR适配体大大增强了其在体内的肿瘤靶向能力(Li,Y.,等Prostate Cancer Prostatic.Dis.5:36-46(2002)；Pettaway,C.A.,等Clin.Cancer Res2:1627-1636(1996))。如通过肿瘤体积监测的，与对照相比，用0.5mg siRNA/kg小鼠体重的剂量的EGFRapt/EV/si存活蛋白的治疗(每周6个剂量)显著抑制体内肿瘤生长(图16b)。通过蛋白印迹(图16c)和定量实时PCR(图16d)(其中GAPDH被用作内部归一化对照)两者，由来自每一组的三个代表性肿瘤验证了存活蛋白的特异性敲低。结果表明，存活蛋白siRNA至乳腺肿瘤细胞的成功递送在蛋白和mRNA水平两者均抑制了存活蛋白的表达。
5.3.叶酸展示EV抑制小鼠中结肠直肠癌的生长。
如通过对来自9名结肠直肠癌患者的肿瘤组织的免疫组织化学(IHC)成像测试的，存活蛋白基因(抗凋亡蛋白)在大多数结肠直肠癌中上调(图22)。利用相似的策略，构建携带叶酸的pRNA-3WJ纳米颗粒(图21b)用于在EV表面上展示，并且EV被装载有存活蛋白siRNA。然后在临床相关的患者来源的CRC异种移植物(PDX-CRC)小鼠模型中评价官能化的EV。与对照组相比，用0.5mg siRNA/kg小鼠体重的剂量的FA/EV/si存活蛋白的治疗(每周6个剂量)显著抑制体内肿瘤生长，如通过肿瘤体积和肿瘤重量测量的(图17a-b)。数据表明叶酸展示EV可以被用于递送用作结肠直肠癌治疗的siRNA的载体。
讨论
RNA干扰技术(诸如siRNA)敲低基因表达的应用已经引起了极大关注(Pecot,C.V.,等Nat Rev.Cancer 11:59-67(2011))。纳米尺寸EV(EL-Andaloussi S.,等NatRev.Drug Discov.12:347-357(2013)；Valadi,H.等Nat Cell Biol 9:654-659(2007)；El-Andaloussi,S.等Adv.Drug Deliv.Rev.65:391-397(2013)；van Dommelen,S.M.,等JControl Release 161:635-644(2012))可以通过四次穿膜蛋白结构域与细胞膜直接融合或与内体区室膜回融合(back-fusion)以用于释放内体逃逸将生物分子递送到细胞中。治疗性有效载荷诸如siRNA在递送至细胞中之后可以是有完整功能的(Pecot,C.V.,等NatRev.Cancer 11:59-67(2011))。纳米尺寸EV(EL-Andaloussi S.,等Nat Rev.DrugDiscov.12:347-357(2013)；Valadi,H.等Nat Cell Biol 9:654-659(2007)；El-Andaloussi,S.等Adv.Drug Deliv.Rev.65:391-397(2013)；van Dommelen,S.M.,等JControl Release 161:635-644(2012))。然而，EV缺乏选择性，并且还可以与健康细胞随机融合。为了产生特异性细胞靶向EV，已经探索了通过在EV的表面上体内表达细胞特异性肽配体的方法(varez-Erviti,L.,等Nat Biotechnol.29:341-345(2011)；Ohno,S.,等MolTher.21:185-191(2013))。然而，蛋白配体的体内表达限于配体在产生其的细胞类型中的可用性(EL-Andaloussi S.,等Nat Rev.Drug Discov.12:347-357(2013)；van Dommelen,S.M.,等J Control Release 161:635-644(2012)；Wiklander,O.P.,等JExtracell.Vesicles.4,26316(2015))。使用在EV上展示基于核酸或化学靶向配体的体外表面展示技术用于体内癌细胞靶向将是期望的。
该实施例报道了RNA纳米技术的体外应用(Guo,P.Nature Nanotechnology 5:833-842(2010))，以重编程天然EV以用于将siRNA特异性递送至体外癌症模型和动物模型中(图12a-图12c)。利用pRNA-3WJ的热力学稳定特性(Shu,D.,等Nature Nanotechnology6:658-667(2011)；Binzel,D.W.等Biochemistry 53:2221-2231(2014)；Shu,D.,等NucleicAcids Res.42:e10(2013))，产生携带膜锚定脂质结构域、成像模块和靶向模块的多功能RNA纳米颗粒。箭头状pRNA-3WJ提供了控制将RNA部分装载到EV中或装饰EV的表面上的配体的机会。随着胆固醇放置于3WJ的箭头尾部上，RNA-配体被阻止运输到EV中，确保用于癌症受体结合的靶向模块的定向表面展示。这由以下明确地证明：通过血清消化和叶酸竞争测定(图13f)、以及通过在PSMA适配体展示之后增强的与LNCaP细胞的结合(图14a)以及在体内乳腺癌期间通过EGFR适配体展示(图16a)。另外，在箭头头部上放置胆固醇允许RNA纳米颗粒部分内化到EV内(图13b、图13h)。将箭头尾部3WJ-RNA纳米颗粒掺入至EV的表面不仅向EV提供了靶向配体，而且在EV表面添加了负电荷。在EV表面上展示带负电荷的RNA纳米颗粒可能能够降低EV与正常细胞的非特异性结合，因为具有适当配体的带负电荷的RNA纳米颗粒在全身施用之后倾向于特异性积累到肿瘤中(Binzel,D.,等Molecular Therapy 24:1267-1277(2016)；Shu,D.,等ACS Nano 9:9731-9740(2015)；Haque,F.,等Nano Today 7:245-257(2012))。胆固醇-TEG修饰的RNA纳米颗粒应该优先锚定到EV的脂质双层的筏形成结构域上(Bunge,A.,等J Phys Chem.B 113:16425-16434(2009))，并且有必要进行进一步的研究说明这一过程。EV具有在受体介导的胞吞之后与内体区室膜反融合的内在能力(EL-Andaloussi S.,等Nat Rev.Drug Discov.12:347-357(2013)；Valadi,H.等Nat Cell Biol9:654-659(2007)；El-Andaloussi,S.等Adv.Drug Deliv.Rev.65:391-397(2013))。公开的体外装饰方法保存了作为递送载体的EV的有利内源组成，因此与使用用于siRNA递送的其他合成纳米载体相比，消除了将人工内体逃逸策略构建到EV载体中的需求(Varkouhi,A.K.等J Control Release 151:220-228(2011)；Kilchrist,K.V.等Cell Mol Bioeng.9:368-381(2016))。
总之，该实施例证明了使用RNA纳米技术对天然EV的有效重编程。纳米颗粒取向控制EV上的RNA装载或表面展示以用于有效的细胞靶向、siRNA递送和癌症衰退。重编程的EV展示出稳健的生理化学特性、增强的癌细胞特异性结合、以及抑制动物模型中的肿瘤生长的有效的细胞内siRNA释放。
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物及关于其引用的材料通过引用被特别并入。
本领域技术人员仅仅使用不超过常规实验就将认识到或能够确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物意图被以下权利要求包括。
序列表
<110> 俄亥俄州国家创新基金会
<120> 用于通过RNA纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的RNA配体展示外来体
<130> 321501-2020
<150> US 62/319,104
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<150> US 62/380,233
<151> 2016-08-26
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 1
uugccaugug uauguggg 18
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 2
cccacauacu uuguugaucc c 21
<210> 3
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 3
ggaucaauca uggcaa 16
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 4
uugccaugug uaugugggaa ucccgcggcc auggccggga g 41
<210> 5
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 5
uugccaugug uauguggggc agguuccuua ucugucauu 39
<210> 6
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 6
uugccaugug uaugugggaa ucccgcggcc auggccggga g 41
<210> 7
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 7
ggaucaauca uggcaauggg accgaaaaag accugacuuc uauacuaagu cuacguuccc 60
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 8
ugacagauaa ggaaccugc 19
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 9
cucccggcca uggccgcggg auu 23
<210> 10
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 10
cccacauacu uuguugaucc cgccuuagua acgugcuuug augucgauuc gacaggaggc 60

Claims (20)

1.一种组合物，所述组合物包含锚定在外来体膜内的RNA纳米颗粒，
其中所述纳米颗粒由三条或更多条核糖核酸链组装，所述三条或更多条核糖核酸链被双链化在一起以形成具有三个或更多个突出茎环的二级结构，
其中所述纳米颗粒在所述三个或更多个突出茎环中的一个处包含膜锚定部分，
其中所述纳米颗粒在剩余茎环处包含一个或更多个功能部分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述三个或更多个核糖核酸链中的至少一个包含pRNA-3WJ核。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA纳米颗粒由三条核糖核酸链组装，所述三条核糖核酸链包含核酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述膜锚定部分包含胆固醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述功能部分中的一个或更多个包含靶向部分。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述靶向部分将所述外来体导向感兴趣的细胞。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述靶向部分选自RNA适配体、修饰的RNA适配体、DNA适配体、修饰的DNA适配体和化学配体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述功能部分中的一个或更多个包含治疗部分或诊断部分。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述治疗部分或诊断部分包括RNA适配体、核酶、siRNA、蛋白结合RNA适配体或小分子。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒的所述三个或更多个突出茎环被构造为使得第一茎环在第一方向突出，并且所述第二茎环和茎环基本上远离所述第一方向突出。
11.一种将外来体靶向感兴趣的细胞的方法，所述方法包括：使细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分，其中所述靶向部分将所述外来体导向感兴趣的细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞位于受试者中。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述细胞为癌细胞。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述RNA纳米颗粒还包含功能部分。
15.一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括将组合物施用至所述受试者，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述RNA纳米颗粒包含至少一个靶向部分，并且其中所述外来体还包含功能部分，其中所述功能部分能够治疗所述受试者中的疾病。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病为感染。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病为癌症。
18.一种使细胞成像的方法，所述方法包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含在其表面上展示RNA纳米颗粒的外来体，其中所述纳米颗粒包含至少一个靶向部分，并且其中所述外来体还包含诊断部分。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞位于受试者中。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法，其中所述组合物包含权利要求1至10中任一项所述的组合物。
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