CN110214005A - 用于基因治疗的结构和方法 - Google Patents

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CN110214005A CN201780083137.XA CN201780083137A CN110214005A CN 110214005 A CN110214005 A CN 110214005A CN 201780083137 A CN201780083137 A CN 201780083137A CN 110214005 A CN110214005 A CN 110214005A
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liposome
alkyl
polynucleotide
polymer
deuterium
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CN201780083137.XA
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马布西吉·艾哈迈德
蒂莫西·保罗·戴
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Dnalite Therapeutics Inc
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Abstract

本发明提供了包含多核酸的脂质体结构。还公开了由多核酸编码的多肽、脂质体结构的药物组合物以及制备和使用它们的方法。

Description

用于基因治疗的结构和方法
交叉引用
本申请要求于2016年11月11日提交的美国临时申请号62/421,103和于2017年4月14日提交的美国临时申请号62/485,493的权益；所述申请均通过引用以其全文并入本文。
背景技术
尽管基因治疗在过去50年中取得了进展，但仍存在许多对常规方法不适用的疾病，特别是在基因治疗的靶标位置可能对递送提出挑战的情况下。
本文中公开的组合物和方法可用于生成用于基因治疗的纳米颗粒。纳米颗粒可以非侵入性地向疾病部位提供治疗基因。
援引并入
本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全文并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。如果本文中的术语与所并入的参考文献中的术语之间存在冲突，则以本文中的术语为准。
发明内容
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。脂质体结构可包含表面修饰。与相当的脂质体结构相比，表面修饰可增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率。可以用聚合物对相当的脂质体结构进行表面修饰。聚合物可以是聚乙二醇(PEG)。PEG可具有约2000至约3000道尔顿(Da)的平均分子量。在一些情况下，脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。在一些情况下，脂质体结构可以是脂质体。脂质体结构可以是lipoplex。脂质体结构可以是lipopolyplex。在一些情况下，表面修饰可包含式I的聚合物：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中当R3和R4不相同时，*可独立地为R或S；其中当R5、R6和R7不相同时，**可为R或S；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n为1-100。在一些情况下，R1可以是C1-6烷基。在一些情况下，R3、R4、R5或R6中的任一个可选自氘和氢。在一些情况下，X可以是氧。式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。表面修饰可包含聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。表面修饰可处于约0.05ug/nm2至约0.25ug/nm2的密度。脂质体结构在粘液中移动的平均速率可以是相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。在一些情况下，多核酸可包含DNA。多核酸可以是微环DNA或闭合线性DNA。在一些情况下，多核酸可包含微环DNA。在一些情况下，多核酸可包含RNA。多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。脂质体结构可包含至少两种多核酸。脂质体结构可进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。在一些情况下，脂质体结构可包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与表面修饰接触的细胞受体。在一些情况下，脂质体结构可包含肽。肽可以是细胞穿透肽。脂质体结构可包含抗体或其片段。脂质体结构可包含可靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)的抗体或其片段。脂质体结构可进一步包含外部包衣。外部包衣可以是阳离子的。外部包衣可以是阴离子的。外部包衣可以是中性的。外部包衣可包含聚合形式的丙烯酸乙酯。外部包衣可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。在一些情况下，近中性的ζ电位可为约-100mV至约100mV。脂质体结构可包含脂质双层。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5。脂质双层可包含MVL5和GMO。在一些情况下，MVL5与GMO的摩尔比为约10:1至约1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。脂质双层可包含DOGS和DOPE。多核酸可完全包封在脂质双层中。多核酸可与脂质双层接触。在一些情况下，多核酸可不与脂质双层接触。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含第二脂质双层。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含连接体。连接体可以是酸敏感连接体。连接体与脂质体结构的表面修饰相关联。连接体可与脂质体结构的表面修饰直接相关联。在一些情况下，连接体可与脂质体结构的表面修饰间接相关联。多核酸可编码蛋白质的至少一个片段。蛋白质的至少一个片段可在胃肠(GI)道中是有活性的。在一些情况下，蛋白质的至少一个片段可在包含粘膜的身体区域中是有活性的。多核酸可编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个片段。在一些情况下，脂质体结构可具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。多核酸可不含细菌复制起点。可以用聚合物对脂质体结构进行表面修饰。脂质体结构可包含聚合物，其包含式I：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。在一些情况下，R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6可选自氘和氢。X可以是氧。在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。在一些情况下，聚合物可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。脂质体结构可以是脂质体。脂质体结构可以是lipoplex。脂质体结构可以是lipopolyplex。在一些情况下，聚合物可具有约0.05ug/nm2至约0.25ug/nm2的密度。与在其他方面相当的脂质体结构相比，聚合物可增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率，其中所述相当的脂质体结构用聚乙二醇(PEG)进行表面修饰。在一些情况下，PEG可具有2000Da至3000Da的平均分子量。脂质体结构在粘液中移动的平均速率可以是所述相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。与相当的脂质体结构相比，脂质体结构可具有增加的亲水性。多核酸可包含DNA。多核酸可以是微环DNA或闭合线性DNA。多核酸可包含微环DNA。多核酸可包含核糖核酸(RNA)。多核酸可以是至少部分水溶性的。多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。脂质体结构可包含至少两种多核酸。多核酸可包含至少一种启动子。至少一种启动子可选自巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。脂质体结构可进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。脂质体结构可包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与聚合物接触的细胞受体。脂质体结构可包含肽，其中肽可以是细胞穿透肽。在一些情况下，肽可与多核酸接触。肽可不与多核酸接触。脂质体结构可包含抗体或其片段，其中抗体或其片段可靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含核酸酶抑制剂。核酸酶抑制剂可选自金精三羧酸(ATA)、Zn2+、DMI-2、其盐或其组合。脂质体结构可进一步包含RNA干扰(RNAi)的效应子。RNA干扰(RNAi)的效应子可以是CEQ508或其盐。脂质体结构可进一步包含外部包衣。外部包衣可以是阳离子的。外部包衣可以是阴离子的。外部包衣可以是中性的。外部包衣可包含聚合形式的丙烯酸乙酯。在一些情况下，外部包衣可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。近中性的ζ电位可为约-100mV至约100mV。脂质体结构可包含脂质双层。在一些情况下，多核酸可存在于封闭在脂质双层中的水溶液中。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5。脂质双层可包含MVL5和GMO。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。脂质双层可包含DOGS和DOPE。多核酸可完全包封在脂质双层中。多核酸可与脂质双层接触。多核酸可不与脂质双层接触。脂质体结构可进一步包含第二脂质双层。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含连接体。连接体可以是酸敏感连接体。连接体可与聚合物相关联。连接体可与聚合物直接相关联。连接体可与聚合物间接相关联。多核酸可编码蛋白质的至少一个片段。在一些情况下，蛋白质的至少一个片段可在胃肠(GI)道中是有活性的。蛋白质的至少片段可在包含粘膜的身体区域中是有活性的。多核酸可编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个片段。脂质体结构可具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。脂质体结构可具有约100nm至约200nm的直径，如通过动态光散射所测量的。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。可以用以下式I的聚合物对脂质体结构进行表面修饰：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。在一些情况下，R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6可选自氘和氢。X可以是氧。在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。在一些情况下，聚合物可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。脂质体结构可以是脂质体。脂质体结构可以是lipoplex。脂质体结构可以是lipopolyplex。在一些情况下，聚合物可具有约0.05ug/nm2至约0.25ug/nm2的密度。与在其他方面相当的脂质体结构相比，聚合物可增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率，其中所述相当的脂质体结构用聚乙二醇(PEG)进行表面修饰。在一些情况下，PEG可具有2000Da至3000Da的平均分子量。脂质体结构在粘液中移动的平均速率可以是所述相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。与相当的脂质体结构相比，脂质体结构可具有增加的亲水性。多核酸可包含DNA。多核酸可以是微环DNA或闭合线性DNA。多核酸可包含微环DNA。多核酸可包含核糖核酸(RNA)。多核酸可以是至少部分水溶性的。多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。脂质体结构可包含至少两种多核酸。多核酸可包含至少一种启动子。至少一种启动子可选自巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。脂质体结构可进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。脂质体结构可包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与聚合物接触的细胞受体。脂质体结构可包含肽，其中肽可以是细胞穿透肽。在一些情况下，肽可与多核酸接触。肽可不与多核酸接触。脂质体结构可包含抗体或其片段，其中抗体或其片段可靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含核酸酶抑制剂。核酸酶抑制剂可选自金精三羧酸(ATA)、Zn2+、DMI-2、其盐或其组合。脂质体结构可进一步包含RNA干扰(RNAi)的效应子。RNA干扰(RNAi)的效应子可以是CEQ508或其盐。脂质体结构可进一步包含外部包衣。外部包衣可以是阳离子的。外部包衣可以是阴离子的。外部包衣可以是中性的。外部包衣可包含聚合形式的丙烯酸乙酯。在一些情况下，外部包衣可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。近中性的ζ电位可为约-20mV至约20mV。近中性的ζ电位还可为约-100mV至约100mV。脂质体结构可包含脂质双层。在一些情况下，多核酸可存在于封闭在脂质双层中的水溶液中。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5。脂质双层可包含MVL5和GMO。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。脂质双层可包含DOGS和DOPE。多核酸可完全包封在脂质双层中。多核酸可与脂质双层接触。多核酸可不与脂质双层接触。脂质体结构可进一步包含第二脂质双层。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含连接体。连接体可以是酸敏感连接体。连接体可与聚合物相关联。连接体可与聚合物直接相关联。连接体可与聚合物间接相关联。多核酸可编码蛋白质的至少一个片段。在一些情况下，蛋白质的至少一个片段可在胃肠(GI)道中是有活性的。蛋白质的至少一个片段可在包含粘膜的身体区域中是有活性的。多核酸可编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个片段。脂质体结构可具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。脂质体结构可具有约100nm至约200nm的直径，如通过动态光散射所测量的。
本文公开了药物组合物。药物组合物可包含脂质体结构。药物组合物可包含赋形剂。药物组合物可包含稀释剂。药物组合物可包含载体。药物组合物可处于单位剂型。药物组合物可以是片剂的形式。药物组合物可以是液体的形式。药物组合物可以是糖浆的形式。药物组合物可以是口服制剂的形式。药物组合物可以是静脉内制剂的形式。药物组合物可以是鼻内制剂的形式。药物组合物可以是皮下制剂的形式。药物组合物可以是可吸入呼吸制剂的形式。药物组合物可以是栓剂的形式。药物组合物可以是片剂、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、皮下制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂及其任意组合的形式。
本文公开了治疗有需要的受试者的方法。在一些情况下，治疗受试者的方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的脂质体结构。在一些情况下，治疗受试者的方法可包括向有需要的受试者施用药物组合物。在一些情况下，脂质体结构或药物组合物的施用可以至少部分地改善有需要的受试者中的疾病或病况。疾病或病况可包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、癌症、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病、回肠克罗恩病或其任意组合。疾病或病况可以是FAP。受试者可在胃肠道中具有息肉。有需要的受试者可在施用脂质体结构或药物组合物之前、之后或同时手术去除息肉。脂质体结构或药物组合物可口服、直肠或者口服和直肠施用。脂质体结构或药物组合物可常规施用。脂质体结构或药物组合物可预防性施用。脂质体结构或药物组合物可每日1次、每日2次、每日3次、每日、每周、每年或其任意组合施用。受试者可以以治疗有效量施用另外的疗法。另外的疗法可包括非甾体抗炎药(NSAID)或其盐、针对β-连环蛋白的miRNA、粘液破坏剂或其盐，或其任意组合。非甾体抗炎药(NSAID)可包括塞来昔布。粘液破坏剂可包括愈创甘油醚。可对有需要的受试者进行疾病或病况的遗传筛查。
本文所述的脂质体结构或药物组合物可包含在试剂盒中。试剂盒可包含本文所述的药物组合物及其使用说明。试剂盒可进一步包含容器。本文还公开了制备试剂盒的方法。制备试剂盒的方法可包括将本文所述的脂质体结构或本文所述的药物组合物置于容器中。试剂盒或制备试剂盒的方法可进一步包括使用说明。
本文公开了制备脂质体结构的方法。本文还公开了制备药物组合物的方法。制备脂质体结构或药物组合物的方法可包括在多核酸周围形成脂质体。可以用聚合物对脂质体结构进行表面修饰。多核酸可编码可在胃肠道中有活性的蛋白质或其部分或者肿瘤抑制蛋白或其部分。脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。脂质体结构可以是脂质体。聚合物可包含式I：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6中的任一个可选自氘和氢。X可以是氧。在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。聚合物可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。方法可进一步包括引入溶剂。溶剂可包括氯仿。方法可进一步包括干燥溶剂。干燥可包括将溶剂暴露于干燥氮气、氩气流、旋转蒸发、真空或其任意组合。干燥可包括将溶剂暴露于干燥氮气。干燥可包括将干燥暴露于真空。在一些情况下，干燥可包括将溶剂暴露于干燥氮气流，然后暴露于真空。干燥可形成脂质膜，其可通过添加水溶液而水合。方法可进一步包括水溶液。方法可包括包含DNA、RNA或其任意组合的多核酸。多核酸可包含DNA。多核酸可包含微环DNA。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。纯化的多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。与相当的脂质体结构相比，脂质体结构可具有增加的亲水性。相当的脂质体结构可包含聚乙二醇(PEG)表面修饰。在一些情况下，增加的亲水性可由非PEG表面修饰引起。非PEG表面修饰可包含以下式I的聚合物：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中当R3和R4不相同时，*可独立地为R或S；其中当R5、R6和R7不相同时，**可独立地为R或S；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6中的任一个可选自氘和氢。X可以是氧。式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。表面修饰可包含聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。多核酸可包含微环DNA。脂质体结构可包含脂质双层。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5和GMO。
本文公开了纳米结构。在一些实施方案中，纳米结构可包含：编码至少一种蛋白质或其部分的至少一种多核酸；与至少一种聚合物接触的至少一个脂质双层；以及至少一个外部包衣；其中多核酸可至少部分地包封在脂质双层内，并且外部包衣可至少部分地包覆纳米结构，并且其中可包括以下中的至少一种：外部包衣可以是肠溶衣，至少一种聚合物包括聚乙二醇聚合物，或其任意组合。在一些情况下，多核酸可被分离。在一些情况下，多核酸可被纯化。在一些情况下，多核酸可被分离并纯化。在一些情况下，多核酸可以是环状的。在一些情况下，纳米结构可具有约500nm或更小的直径。在其他情况下，纳米结构可具有选自包括以下的列表的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm或约400nm至约500nm。至少一个外部包衣可部分包覆。至少一个外部包衣可完全包覆。在一些情况下，纳米结构可包含至少一个外部包衣，其选自包括以下的列表：醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2或聚(丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)7:3:1。至少一个外部包衣可以是聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1。至少一个外部包衣可以是粘膜粘附水凝胶。粘膜粘附水凝胶可选自羟乙基纤维素(HEC)、聚丙烯酸酯(卡波姆)、藻酸盐、壳聚糖和纤维素衍生物(羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)。在一些情况下，至少一个外部包衣可以是pH敏感的。当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下溶于1L水中时，pH敏感包衣可在pH5.5以上溶解，如在37摄氏度下用pH计所测量的。当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下溶于1L水中时，pH敏感包衣可在pH 7以上溶解，如在37摄氏度下用pH计所测量的。在其他情况下，当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下溶于1L水中时，pH敏感包衣可在pH 6以上溶解，如在37摄氏度下用pH计所测量的。溶解可发生在肠道中。在其他情况下，溶解可发生在选自十二指肠、空肠、髂骨和结肠等器官中。在一些情况下，溶解可发生在接近于肠隐窝细胞。接近可以指邻近于肠隐窝细胞。例如，邻近可意指紧挨着。在其他情况下，邻近可意指在肠的相同部分内。例如，如果溶解发生在小肠的十二指肠中，则其可被认为邻近于见于十二指肠中的肠隐窝细胞。在一些实施方案中，至少一种聚合物可直接地、共价地、非共价地、经由连接体或其任意组合连接至脂质双层。聚合物可共价连接至脂质双层。至少一种聚合物可以是聚乙二醇(PEG)、PEG-聚环氧丙烷的三嵌段共聚物、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基醚)、聚(N-[2-羟基丙基]甲基丙烯酰胺)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚(甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯)(pDMAEMA)和聚-L-赖氨酸(pLL)、其修饰形式或衍生物。在一些情况下，聚合物包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)或PEG。在一些情况下，至少一种聚合物可不与粘液相互作用，如通过包含至少一种可能不与粘液相互作用的聚合物的纳米结构与可能不含聚合物的纳米结构相比横穿的粘液的距离增加所测量的。在一些情况下，PEG可以是PEG 2000，其具有1900g/mol至2200g/mol的平均分子量。PEG可以以每100nm2约10至20条链连接至脂质双层。可以使用脂质体中脂质-PEG的实际摩尔比和计算的脂质体的加权平均表面积来估计PEG表面密度。可测定的脂质-PEG的实际摩尔比可以是在D2O中制备的1HNMR，1％w/w DSS作为参考。500MHz，10s弛豫时间，并且ZG脉冲设置为90度。PEG峰出现在3.3-4.1ppm，并且它们的积分可与标准进行比较。在一些情况下，PEG可以呈蘑菇形构型。在其他情况下，PEG可以呈刷形构型。在其他情况下，PEG可以呈薄饼形构型。脂质双层可以是脂质体的形式。在一些情况下，脂质双层可由选自以下的脂质列表生成：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、其衍生物及其组合。脂质双层可由DOGS和DOPE组成。在一些情况下，DOGS和DOPE可以是80Mol比20Mol的比率。在一些情况下，PEG可与至少一种脂质以5Mol比10Mol的浓度进行组合。在一些情况下，PEG浓度可选自包括以下的列表：DOGS/DOPE/PEG为80mol/20mol/5mol、80mol/20mol/6mol、80mol/20mol/7mol、80mol/20mol/8mol、80mol/20mol/9mol或80mol/20mol/10mol。在一些情况下，MVL5和GMO可用作脂质体结构中的脂质。MVL5与GMO的摩尔浓度可为约10:1至1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。在其他情况下，MVL5与GMO的摩尔比可为约50:1至1:1。例如，摩尔比可为约50:1至1:1、40:1至1:1、30:1至1:1、20:1至1:1、10:1至1:1或约5:1至1:1。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。在一些情况下，MVL5/GMO/脂质-HPEG的摩尔比可为约50mol/45mol/5mol、50mol/44mol/6mol、50mol/43mol/7mol、50mol/42mol/8mol、50mol/41mol/9mol至约50mol/40mol/10mol。在一些情况下，脂质如MVL5可与多核酸如微环多核酸氢键结合。在一些情况下，聚合物可进一步包含肽、抗体、碳水化合物或其组合。肽或抗体可选自包含以下的列表：抗体、单链可变片段(scFv)、细胞受体、条形码、连接体或其任意组合。肽可以是细胞穿透肽。在一些情况下，抗体可以是富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。纳米结构可以是阳离子的、阴离子的、中性的或其任意组合。纳米结构可以是中性的。在一些情况下，纳米结构可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。在一些情况下，在1mL的高电阻率水中DNA电荷比为10的情况下，纳米结构的电荷可以是-20mV至20mV，如通过Malvern Nanosizer ZS所测量的。在一些情况下，在1mL的高电阻率水中DNA电荷比为10的情况下，纳米结构的电荷可以是-100mV至约20mV，如通过Malvern Nanosizer ZS所测量的。DNA电荷比可以是0至20。在一些情况下，可形成纳米颗粒的聚合物可包含“电荷比”。电荷比可以指包含聚合物的第二嵌段的阳离子单体上的正电荷(阳离子)的数目(N)与掺入纳米结构的多核苷酸上的负电荷(阴离子)的数目(P)的比率。在一些实施方案中，阳离子电荷是阳离子单体的阳离子胺。在一些实施方案中，阴离子电荷是多核酸(例如，微环DNA)的骨架上的磷酸基团的阴离子电荷。在一些实施方案中，该比率可在生理pH、中性pH或其组合下计算。在进一步的实施方案中，为了计算N:P比，假定阳离子单体在中性和/或生理pH下其阳离子物质(例如，胺)的约一半(50％)带电荷。可以以特定的N:P比形成示例性纳米结构，以便确定或估计纳米颗粒中多核苷酸的剂量。示例性的纳米颗粒还可以以实现纳米颗粒的期望特性，包括大小、稳定性、表面电荷等的N:P比来制备。在一些实施方案中，N:P比可以是约0.5至约20之间的值。在一些实施方案中，N:P比可以是约1.0至约30之间的值。在一些实施方案中，N:P比可以是约5.0至约15之间的值，或约10至10之间的值。在进一步的实施方案中，N:P比可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或最多约20的值。在一些情况下，多核酸可以是DNA、RNA或其任意组合。多核酸可以是DNA。DNA可以是微环DNA。在一些情况下，多核酸可以是水溶性的。多核酸可悬浮在脂质双层内的水溶液中。在一些情况下，至少一种蛋白质或其部分可以是腺瘤性结肠息肉(APC)、B-半乳糖苷酶(B-Gal)或其任意组合。在一些情况下，至少一种蛋白质或其部分可以是腺瘤性结肠息肉(APC)。在一些情况下，多核酸可包含至少一种启动子。启动子可选自包含以下的列表：巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。本文公开的可以是进一步包含蛋白质或肽的纳米结构。蛋白质或肽可包含核定位信号。在一些情况下，蛋白质或肽可与多核酸结合。在一些情况下，纳米结构可进一步包含DNA酶抑制剂。纳米结构可以是粘液穿透颗粒(MPP)。MPP可以能够穿透厚度为1至200微米的粘液。MPP可具有约-20mV至约20mV的近中性ζ电位。纳米结构可以是至少部分可生物降解的。纳米结构可以是冷冻干燥的。纳米结构可作为丸剂、作为水凝胶或其任意组合施用。本文公开的可以是包含本文公开的纳米结构的药物组合物。药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下，本文公开的药物组合物可以以单位剂型施用于患者。在一些情况下，本文公开的方法可治疗或预防患者中的至少一种病况。在一些情况下，纳米结构可用于治疗家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、结直肠癌、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病或其任意组合。纳米结构可用于治疗FAP。纳米结构可口服或直肠施用。纳米结构可常规施用。纳米结构可预防性施用。在一些情况下，可向患者施用至少一种另外的疗法。一种另外的疗法可以是非甾体抗炎药、NSAID、针对B-连环蛋白的miRNA或任何破坏粘液的药剂。在一些情况下，非甾体抗炎药可以是塞来昔布。本文公开的可以是包含SEQ ID 5的多核酸的纳米结构。
本文公开了制备用于基因治疗的纳米结构的方法。制备纳米结构的方法可包括在至少一种溶剂的存在下使至少一种脂质与至少一种聚合物接触以形成混合物；将混合物重新悬浮在水溶液中；温育混合物以形成至少一种脂质体；使脂质体与编码至少一种蛋白质或其部分的至少一种多核酸接触；并且施加包含至少一种聚合物的至少一种部分包衣。在一些情况下，多核酸可被分离。在一些情况下，多核酸可被纯化。在一些情况下，多核酸可被分离并纯化。在一些情况下，至少一种脂质可以是DOGS(二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺)、DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)或其组合。在一些情况下，DOGS和DOPE可以以80/20Mol/Mol的比率混合。在一些情况下，至少一种聚合物可与DOGS和DOPE混合。在一些情况下，聚合物可以以5比10Mol的比率的浓度混合。聚合物可以是聚乙二醇(PEG)。PEG可以是PEG 2000。在一些情况下，DOGs、DOPE和PEG2000可以以80/20/8Mol/Mol/mol进行混合。在一些情况下，方法可进一步包括脂质的至少一种修饰。修饰可选自包括以下的列表：添加肽、抗体、单链可变片段(scFv)、细胞受体、条形码、连接体或其任意组合。溶剂可以是有机溶剂。溶剂可以是氯仿。方法可进一步包括干燥溶剂。在一些情况下，干燥溶剂包括干燥氮气、氩气流、旋转蒸发、真空或其任意组合。干燥可以是干燥氮气干燥。在其他情况下，干燥可以是真空处理。在一些情况下，干燥可以是干燥氮气流，然后真空处理。干燥可形成脂质膜，其可通过添加水溶液而水合。水溶液可以是高电阻率水。在一些情况下，方法可具有在37摄氏度下发生的温育。多核酸可以是DNA、RNA或其任意组合。多核酸可以是DNA。多核酸可以是微环DNA。在一些情况下，微环DNA可以以4比1的比率与脂质体混合。在一些情况下，至少一种包衣可以是pH敏感的。pH敏感包衣可在高于5.5的pH下溶解。pH敏感包衣可以是聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1。在一些情况下，至少一种蛋白质可以是腺瘤性结肠息肉(APC)、B-半乳糖苷酶(B-Gal)或其任意组合。在一些情况下，至少一种蛋白质可以是APC。在一些情况下，纳米结构可以是粘液穿透颗粒(MPP)。MPP可以能够穿透厚度为1至200微米的粘液。MPP可具有约-20mV至约20mV的近中性ζ电位。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。脂质体结构可包含表面修饰。与相当的脂质体结构相比，表面修饰可增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率。可以用聚合物对相当的脂质体结构进行表面修饰。聚合物可以是聚乙二醇(PEG)。PEG可具有约2000至约3000道尔顿(Da)的平均分子量。在一些情况下，脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。在一些情况下，脂质体结构可以是脂质体。脂质体结构可以是lipoplex。脂质体结构可以是lipopolyplex。在一些情况下，表面修饰可包含式I的聚合物：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中当R3和R4不相同时，*可独立地为R或S；其中当R5、R6和R7不相同时，**可为R或S；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n为1-100。在一些情况下，R1可以是C1-6烷基。在一些情况下，R3、R4、R5或R6中的任一个可选自氘和氢。在一些情况下，X可以是氧。式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。表面修饰可包含聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。表面修饰可处于约0.05μg/nm2至约0.25μg/nm2的密度。脂质体结构在粘液中移动的平均速率可以是相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。在一些情况下，多核酸可包含DNA。多核酸可以是微环DNA或闭合线性DNA。在一些情况下，多核酸可包含微环DNA。在一些情况下，多核酸可包含RNA。多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。脂质体结构可包含至少两种多核酸。脂质体结构可进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。在一些情况下，脂质体结构可包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与表面修饰接触的细胞受体。在一些情况下，脂质体结构可包含肽。肽可以是细胞穿透肽。脂质体结构可包含抗体或其片段。脂质体结构可包含可靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)的抗体或其片段。脂质体结构可进一步包含外部包衣。外部包衣可以是阳离子的。外部包衣可以是阴离子的。外部包衣可以是中性的。外部包衣可包含聚合形式的丙烯酸乙酯。外部包衣可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。在一些情况下，近中性的ζ电位可为约-20mV至约20mV。在一些情况下，近中性的ζ电位可为约-100mV至约100mV。脂质体结构可包含脂质双层。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5。脂质双层可包含MVL5和GMO。在一些情况下，MVL5与GMO的摩尔比为约10:1至约1:25。脂质双层可包含DOGS和DOPE。多核酸可完全包封在脂质双层中。多核酸可与脂质双层接触。在一些情况下，多核酸可不与脂质双层接触。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含第二脂质双层。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含连接体。连接体可以是酸敏感连接体。连接体与脂质体结构的表面修饰相关联。连接体可与脂质体结构的表面修饰直接相关联。在一些情况下，连接体可与脂质体结构的表面修饰间接相关联。多核酸可编码蛋白质的至少一个片段。蛋白质的至少一个片段可在胃肠(GI)道中是有活性的。在一些情况下，蛋白质的至少一个片段可在包含粘膜的身体区域中是有活性的。多核酸可编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个片段。在一些情况下，脂质体结构可具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。多核酸可不含细菌复制起点。可以用聚合物对脂质体结构进行表面修饰。脂质体结构可包含具有以下式1的聚合物：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。在一些情况下，R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6可选自氘和氢。X可以是氧。在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。在一些情况下，聚合物可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。脂质体结构可以是脂质体。脂质体结构可以是lipoplex。脂质体结构可以是lipopolyplex。在一些情况下，聚合物可具有约0.05μg/nm2至约0.25μg/nm2的密度。与在其他方面相当的脂质体结构相比，聚合物可增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率，其中所述相当的脂质体结构用聚乙二醇(PEG)进行表面修饰。在一些情况下，PEG可具有2000Da至3000Da的平均分子量。脂质体结构在粘液中移动的平均速率可以是所述相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。与相当的脂质体结构相比，脂质体结构可具有增加的亲水性。多核酸可包含DNA。多核酸可以是微环DNA或闭合线性DNA。多核酸可包含微环DNA。多核酸可包含核糖核酸(RNA)。多核酸可以是至少部分水溶性的。多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。脂质体结构可包含至少两种多核酸。多核酸可包含至少一种启动子。至少一种启动子可选自巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。脂质体结构可进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。脂质体结构可包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与聚合物接触的细胞受体。脂质体结构可包含肽，其中肽可以是细胞穿透肽。在一些情况下，肽可与多核酸接触。肽可不与多核酸接触。脂质体结构可包含抗体或其片段，其中抗体或其片段可靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含核酸酶抑制剂。核酸酶抑制剂可选自金精三羧酸(ATA)、Zn2+、DMI-2、其盐或其组合。脂质体结构可进一步包含RNA干扰(RNAi)的效应子。RNA干扰(RNAi)的效应子可以是CEQ508或其盐。脂质体结构可进一步包含外部包衣。外部包衣可以是阳离子的。外部包衣可以是阴离子的。外部包衣可以是中性的。外部包衣可包含聚合形式的丙烯酸乙酯。在一些情况下，外部包衣可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。近中性的ζ电位可为约-20mV至约20mV。近中性的ζ电位可为约-100mV至约100mV。脂质体结构可包含脂质双层。在一些情况下，多核酸可存在于封闭在脂质双层中的水溶液中。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5。脂质双层可包含MVL5和GMO。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。脂质双层可包含DOGS和DOPE。多核酸可完全包封在脂质双层中。多核酸可与脂质双层接触。多核酸可不与脂质双层接触。脂质体结构可进一步包含第二脂质双层。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含连接体。连接体可以是酸敏感连接体。连接体可与聚合物相关联。连接体可与聚合物直接相关联。连接体可与聚合物间接相关联。多核酸可编码蛋白质的至少一个片段。在一些情况下，蛋白质的至少一个片段可在胃肠(GI)道中是有活性的。蛋白质的至少一个片段可在包含粘膜的身体区域中是有活性的。多核酸可编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个片段。脂质体结构可具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。脂质体结构可具有约100nm至约200nm的直径，如通过动态光散射所测量的。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。可以用以下式I的聚合物对脂质体结构进行表面修饰：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。在一些情况下，R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6可选自氘和氢。X可以是氧。在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。在一些情况下，聚合物可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。脂质体结构可以是脂质体。脂质体结构可以是lipoplex。脂质体结构可以是lipopolyplex。在一些情况下，聚合物可具有约0.05μg/nm2至约0.25μg/nm2的密度。与在其他方面相当的脂质体结构相比，聚合物可增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率，其中所述相当的脂质体结构用聚乙二醇(PEG)进行表面修饰。在一些情况下，PEG可具有2000Da至3000Da的平均分子量。脂质体结构在粘液中移动的平均速率可以是所述相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。与相当的脂质体结构相比，脂质体结构可具有增加的亲水性。多核酸可包含DNA。多核酸可以是微环DNA或闭合线性DNA。多核酸可包含微环DNA。多核酸可包含核糖核酸(RNA)。多核酸可以是至少部分水溶性的。多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。脂质体结构可包含至少两种多核酸。多核酸可包含至少一种启动子。至少一种启动子可选自巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。脂质体结构可进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。脂质体结构可包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与聚合物接触的细胞受体。脂质体结构可包含肽，其中肽可以是细胞穿透肽。在一些情况下，肽可与多核酸接触。肽可不与多核酸接触。脂质体结构可包含抗体或其片段，其中抗体或其片段可靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含核酸酶抑制剂。核酸酶抑制剂可选自金精三羧酸(ATA)、Zn2+、DMI-2、其盐或其组合。脂质体结构可进一步包含RNA干扰(RNAi)的效应子。RNA干扰(RNAi)的效应子可以是CEQ508或其盐。脂质体结构可进一步包含外部包衣。外部包衣可以是阳离子的。外部包衣可以是阴离子的。外部包衣可以是中性的。外部包衣可包含聚合形式的丙烯酸乙酯。在一些情况下，外部包衣可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。近中性的ζ电位可为约-20mV至约20mV。近中性的ζ电位可为约-100mV至约100mV。脂质体结构可包含脂质双层。在一些情况下，多核酸可存在于封闭在脂质双层中的水溶液中。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5。脂质双层可包含MVL5和GMO。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。脂质双层可包含DOGS和DOPE。多核酸可完全包封在脂质双层中。多核酸可与脂质双层接触。多核酸可不与脂质双层接触。脂质体结构可进一步包含第二脂质双层。在一些情况下，脂质体结构可进一步包含连接体。连接体可以是酸敏感连接体。连接体可与聚合物相关联。连接体可与聚合物直接相关联。连接体可与聚合物间接相关联。多核酸可编码蛋白质的至少一个片段。在一些情况下，蛋白质的至少一个片段可在胃肠(GI)道中是有活性的。蛋白质的至少一个片段可在包含粘膜的身体区域中是有活性的。多核酸可编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个片段。脂质体结构可具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。脂质体结构可具有约100nm至约200nm的直径，如通过动态光散射所测量的。
本文公开了药物组合物。药物组合物可包含脂质体结构。药物组合物可包含赋形剂。药物组合物可包含稀释剂。药物组合物可包含载体。药物组合物可处于单位剂型。药物组合物可以是片剂的形式。药物组合物可以是液体的形式。药物组合物可以是糖浆的形式。药物组合物可以是口服制剂的形式。药物组合物可以是静脉内制剂的形式。药物组合物可以是鼻内制剂的形式。药物组合物可以是皮下制剂的形式。药物组合物可以是可吸入呼吸制剂的形式。药物组合物可以是栓剂的形式。药物组合物可以是片剂、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、皮下制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂及其任意组合的形式。
本文公开了治疗有需要的受试者的方法。在一些情况下，治疗受试者的方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的脂质体结构。在一些情况下，治疗受试者的方法可包括向有需要的受试者施用药物组合物。在一些情况下，脂质体结构或药物组合物的施用可以至少部分地改善有需要的受试者中的疾病或病况。疾病或病况可包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、癌症、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病、回肠克罗恩病或其任意组合。疾病或病况可以是FAP。受试者可在胃肠道中具有息肉。有需要的受试者可在施用脂质体结构或药物组合物之前、之后或同时手术去除息肉。脂质体结构或药物组合物可口服、直肠或者口服和直肠施用。脂质体结构或药物组合物可常规施用。脂质体结构或药物组合物可预防性施用。脂质体结构或药物组合物可每日1次、每日2次、每日3次、每日、每周、每年或其任意组合施用。受试者可以以治疗有效量施用另外的疗法。另外的疗法可包括非甾体抗炎药(NSAID)或其盐、针对β-连环蛋白的miRNA、粘液破坏剂或其盐、或其任意组合。非甾体抗炎药(NSAID)可包括塞来昔布。粘液破坏剂可包括愈创甘油醚。可对有需要的受试者进行疾病或病况的遗传筛查。
本文所述的脂质体结构或药物组合物可包含在试剂盒中。试剂盒可包含本文所述的药物组合物及其使用说明。试剂盒可进一步包含容器。本文还公开了制备试剂盒的方法。制备试剂盒的方法可包括将本文所述的脂质体结构或本文所述的药物组合物置于容器中。试剂盒或制备试剂盒的方法可进一步包括使用说明。
本文公开了制备脂质体结构的方法。本文还公开了制备药物组合物的方法。制备脂质体结构或药物组合物的方法可包括在多核酸周围形成脂质体。可以用聚合物对脂质体结构进行表面修饰。多核酸可编码可在胃肠道中有活性的蛋白质或其部分或者肿瘤抑制蛋白或其部分。脂质体结构可以是脂质体、lipoplex或lipopolyplex。脂质体结构可以是脂质体。聚合物可包含式I：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6中的任一个可选自氘和氢。X可以是氧。在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。聚合物可包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。方法可进一步包括引入溶剂。溶剂可包括氯仿。方法可进一步包括干燥溶剂。干燥可包括将溶剂暴露于干燥氮气、氩气流、旋转蒸发、真空或其任意组合。干燥可包括将溶剂暴露于干燥氮气。干燥可包括将干燥暴露于真空。在一些情况下，干燥可包括将溶剂暴露于干燥氮气流，然后暴露于真空。干燥可形成脂质膜，其可通过添加水溶液而水合。方法可进一步包括水溶液。方法可包括包含DNA、RNA或其任意组合的多核酸。多核酸可包含DNA。多核酸可包含微环DNA。
本文公开了脂质体结构。脂质体结构可包含多核酸。多核酸可被分离。多核酸可被纯化。多核酸可被分离并纯化。纯化的多核酸可至少部分地封闭在脂质体结构内。与相当的脂质体结构相比，脂质体结构可具有增加的亲水性。相当的脂质体结构可包含聚乙二醇(PEG)表面修饰。在一些情况下，增加的亲水性可由非PEG表面修饰引起。非PEG表面修饰可包含以下式I的聚合物：
其中R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中当R3和R4不相同时，*可独立地为R或S；其中当R5、R6和R7不相同时，**可独立地为R或S；其中X可独立地选自氧或硫；Y可独立地选自氘或氢；A可为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。R1可以是C1-6烷基。R3、R4、R5或R6中的任一个可选自氘和氢。X可以是氧。式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。表面修饰可包含聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。多核酸可包含微环DNA。脂质体结构可包含脂质双层。脂质双层可包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐或其任意组合。在一些情况下，材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。脂质双层可包含MVL5和GMO。
本文公开了纳米结构。在一些实施方案中，纳米结构可包含：编码至少一种蛋白质或其部分的至少一种多核酸；与至少一种聚合物接触的至少一个脂质双层；以及至少一个外部包衣；其中多核酸可至少部分地包封在脂质双层内，并且外部包衣可至少部分地包覆纳米结构，并且其中可包括以下中的至少一种：外部包衣可以是肠溶衣，至少一种聚合物包括聚乙二醇聚合物，或其任意组合。在一些情况下，多核酸可被分离。在一些情况下，多核酸可被纯化。在一些情况下，多核酸可被分离并纯化。在一些情况下，多核酸可以是环状的。在一些情况下，纳米结构可具有约500nm或更小的直径。在其他情况下，纳米结构可具有选自包括以下的列表的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm或约400nm至约500nm。至少一个外部包衣可部分包覆。至少一个外部包衣可完全包覆。在一些情况下，纳米结构可包含至少一个外部包衣，其选自包括以下的列表：醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2或聚(丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)7:3:1。至少一个外部包衣可以是聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1。至少一个外部包衣可以是粘膜粘附水凝胶。粘膜粘附水凝胶可选自羟乙基纤维素(HEC)、聚丙烯酸酯(卡波姆)、藻酸盐、壳聚糖和纤维素衍生物(羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)。在一些情况下，至少一个外部包衣可以是pH敏感的。当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下溶于1L水中时，pH敏感包衣可在pH5.5以上溶解，如在37摄氏度下用pH计所测量的。当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下溶于1L水中时，pH敏感包衣可在pH 7以上溶解，如在37摄氏度下用pH计所测量的。在其他情况下，当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下溶于1L水中时，pH敏感包衣可在pH 6以上溶解，如在37摄氏度下用pH计所测量的。溶解可发生在肠道中。在其他情况下，溶解可发生在选自十二指肠、空肠、髂骨和结肠等器官中。在一些情况下，溶解可发生在接近于肠隐窝细胞。接近可以指邻近于肠隐窝细胞。例如，邻近可意指紧挨着。在其他情况下，邻近可意指在肠的相同部分内。例如，如果溶解发生在小肠的十二指肠中，则其可被认为邻近于见于十二指肠中的肠隐窝细胞。在一些实施方案中，至少一种聚合物可直接地、共价地、非共价地、经由连接体或其任意组合连接至脂质双层。聚合物可共价连接至脂质双层。至少一种聚合物可以是聚乙二醇(PEG)、PEG-聚环氧丙烷的三嵌段共聚物、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基醚)、聚(N-[2-羟基丙基]甲基丙烯酰胺)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚(甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯)(pDMAEMA)和聚-L-赖氨酸(pLL)、其修饰形式或衍生物。在一些情况下，聚合物包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)或PEG。在一些情况下，至少一种聚合物可不与粘液相互作用，如通过包含至少一种可能不与粘液相互作用的聚合物的纳米结构与可能不含聚合物的纳米结构相比横穿的粘液的距离增加所测量的。在一些情况下，PEG可以是PEG 2000，其具有1900g/mol至2200g/mol的平均分子量。PEG可以以每100nm2约10至20条链连接至脂质双层。可以使用脂质体中脂质-PEG的实际摩尔比和计算的脂质体的加权平均表面积来估计PEG表面密度。可测定的脂质-PEG的实际摩尔比可以是在D2O中制备的1HNMR，1％w/w DSS作为参考。500MHz，10s弛豫时间，并且ZG脉冲设置为90度。PEG峰出现在3.3-4.1ppm，并且它们的积分可与标准进行比较。在一些情况下，PEG可以呈蘑菇形构型。在其他情况下，PEG可以呈刷形构型。在其他情况下，PEG可以呈薄饼形构型。脂质双层可以是脂质体的形式。在一些情况下，脂质双层可由选自以下的脂质列表生成：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、其衍生物及其组合。脂质双层可由DOGS和DOPE组成。在一些情况下，DOGS和DOPE可以是80Mol比20Mol的比率。在一些情况下，PEG可与至少一种脂质以5Mol比10Mol的浓度进行组合。在一些情况下，PEG浓度可选自包括以下的列表：DOGS/DOPE/PEG为80mol/20mol/5mol、80mol/20mol/6mol、80mol/20mol/7mol、80mol/20mol/8mol、80mol/20mol/9mol或80mol/20mol/10mol。在一些情况下，MVL5和GMO可用作脂质体结构中的脂质。MVL5与GMO的摩尔浓度可为约10:1至1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。在其他情况下，MVL5与GMO的摩尔比可为约50:1至1:1。例如，摩尔比可为约50:1至1:1、40:1至1:1、30:1至1:1、20:1至1:1、10:1至1:1或约5:1至1:1.在一些情况下，MVL5/GMO/脂质-HPEG的摩尔比可为约50mol/45mol/5mol、50mol/44mol/6mol、50mol/43mol/7mol、50mol/42mol/8mol、50mol/41mol/9mol至约50mol/40mol/10mol。在一些情况下，脂质如MVL5可与多核酸如微环多核酸氢键结合。在一些情况下，聚合物可进一步包含肽、抗体、碳水化合物或其组合。肽或抗体可选自包含以下的列表：抗体、单链可变片段(scFv)、细胞受体、条形码、连接体或其任意组合。肽可以是细胞穿透肽。在一些情况下，抗体可以是富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。纳米结构可以是阳离子的、阴离子的、中性的或其任意组合。纳米结构可以是中性的。在一些情况下，纳米结构可具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。在一些情况下，在1mL的高电阻率水中DNA电荷比为10的情况下，纳米结构的近中性电荷可以是-100mV至100mV，如通过Malvern Nanosizer ZS所测量的。DNA电荷比可以是0至20。在一些情况下，可形成纳米颗粒的聚合物可包含“电荷比”。电荷比可以指包含聚合物的第二嵌段的阳离子单体上的正电荷(阳离子)的数目(N)与掺入纳米结构的多核苷酸上的负电荷(阴离子)的数目(P)的比率。在一些实施方案中，阳离子电荷是阳离子单体的阳离子胺。在一些实施方案中，阴离子电荷是多核酸(例如，微环DNA)的骨架上的磷酸基团的阴离子电荷。在一些实施方案中，该比率可在生理pH、中性pH或其组合下计算。在进一步的实施方案中，为了计算N:P比，假定阳离子单体在中性和/或生理pH下其阳离子物质(例如，胺)的约一半(50％)带电荷。可以以特定的N:P比形成示例性纳米结构，以便确定或估计纳米颗粒中多核苷酸的剂量。示例性的纳米颗粒还可以以实现纳米颗粒的期望特性，包括大小、稳定性、表面电荷等的N:P比来制备。在一些实施方案中，N:P比可以是约0.5至约20之间的值。在一些实施方案中，N:P比可以是约1.0至约30之间的值。在一些实施方案中，N:P比可以是约5.0至约15之间的值，或约10至10之间的值。在进一步的实施方案中，N:P比可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或最多约20的值。在一些情况下，多核酸可以是DNA、RNA或其任意组合。多核酸可以是DNA。DNA可以是微环DNA。在一些情况下，多核酸可以是水溶性的。多核酸可悬浮在脂质双层内的水溶液中。在一些情况下，至少一种蛋白质或其部分可以是腺瘤性结肠息肉(APC)、B-半乳糖苷酶(B-Gal)或其任意组合。在一些情况下，至少一种蛋白质或其部分可以是腺瘤性结肠息肉(APC)。在一些情况下，多核酸可包含至少一种启动子。启动子可选自包含以下的列表：巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。本文公开的可以是进一步包含蛋白质或肽的纳米结构。蛋白质或肽可包含核定位信号。在一些情况下，蛋白质或肽可与多核酸结合。在一些情况下，纳米结构可进一步包含DNA酶抑制剂。纳米结构可以是粘液穿透颗粒(MPP)。MPP可以能够穿透厚度为1至200微米的粘液。纳米结构可以是至少部分可生物降解的。纳米结构可以是冷冻干燥的。纳米结构可作为丸剂、作为水凝胶或其任意组合施用。本文公开的可以是包含本文公开的纳米结构的药物组合物。药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下，本文公开的药物组合物可以以单位剂型施用于患者。在一些情况下，本文公开的方法可治疗或预防患者中的至少一种病况。在一些情况下，纳米结构可用于治疗家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、结直肠癌、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病或其任意组合。纳米结构可用于治疗FAP。纳米结构可口服或直肠施用。纳米结构可常规施用。纳米结构可预防性施用。在一些情况下，可向患者施用至少一种另外的疗法。一种另外的疗法可以是非甾体抗炎药、NSAID、针对B-连环蛋白的miRNA或任何破坏粘液的药剂。在一些情况下，非甾体抗炎药可以是塞来昔布。本文公开的可以是包含SEQ ID 5的多核酸的纳米结构。
本文公开了制备用于基因治疗的纳米结构的方法。制备纳米结构的方法可包括在至少一种溶剂的存在下使至少一种脂质与至少一种聚合物接触以形成混合物；将混合物重新悬浮在水溶液中；温育混合物以形成至少一种脂质体；使脂质体与编码至少一种蛋白质或其部分的至少一种多核酸接触；并且施加包含至少一种聚合物的至少一种部分包衣。在一些情况下，多核酸可被分离。在一些情况下，多核酸可被纯化。在一些情况下，多核酸可被分离并纯化。在一些情况下，至少一种脂质可以是DOGS(二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺)、DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)或其组合。在一些情况下，DOGS和DOPE可以以80/20Mol/Mol的比率混合。在一些情况下，至少一种聚合物可与DOGS和DOPE混合。在一些情况下，聚合物可以以5比10Mol的比率的浓度混合。聚合物可以是聚乙二醇(PEG)。PEG可以是PEG 2000。在一些情况下，DOGs、DOPE和PEG2000可以以80/20/8Mol/Mol/Mol进行混合。在一些情况下，方法可进一步包括脂质的至少一种修饰。修饰可选自包括以下的列表：添加肽、抗体、单链可变片段(scFv)、细胞受体、条形码、连接体或其任意组合。溶剂可以是有机溶剂。溶剂可以是氯仿。方法可进一步包括干燥溶剂。在一些情况下，干燥溶剂包括干燥氮气、氩气流、旋转蒸发、真空或其任意组合。干燥可以是干燥氮气干燥。在其他情况下，干燥可以是真空处理。在一些情况下，干燥可以是干燥氮气流，然后真空处理。干燥可形成脂质膜，其可通过添加水溶液而水合。水溶液可以是高电阻率水。在一些情况下，方法可具有在37摄氏度下发生的温育。多核酸可以是DNA、RNA或其任意组合。多核酸可以是DNA。多核酸可以是微环DNA。在一些情况下，微环DNA可以以4比1的比率与脂质体混合。在一些情况下，至少一个包衣可以是pH敏感的。pH敏感包衣可在高于5.5的pH下溶解。pH敏感包衣可以是聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1。在一些情况下，至少一种蛋白质可以是腺瘤性结肠息肉(APC)、B-半乳糖苷酶(B-Gal)或其任意组合。在一些情况下，至少一种蛋白质可以是APC。在一些情况下，纳米结构可以是粘液穿透颗粒(MPP)。MPP能够穿透厚度为1至200微米的粘液。
附图说明
本公开内容的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对可利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1示出了APC载体。
图2示出了编码APC蛋白的微环DNA载体。
图3示出了用于脂质体生成的脂质。
图4示出了示例性脂质-HPEG的化学结构。
图5示出了封闭在脂质体复合物中的示例性多核酸。
图6A示出了示例性lipoplex结构。图6B示出了示例性lipopolyplex结构。
图7示出了使用薄层色谱(TLC)的HPEG2K-脂质分析。使用碘蒸气和UV吸收检测斑点。PL代表中性pH下的HPEG2k-脂质，并与在pH4下温育20min的HPEG-2K-脂质进行比较。在pH4时，HPEG2k-脂质分解，刺激将发生的增强内体逃逸的情况。
图8A示出了用MVL5/GMO/HPEG脂质体转染的转化细胞系。图8B示出了用阴性对照转染的转化细胞系。
图9示出了与阳性和阴性对照相比，在低和高电荷比下用脂质体结构转染的绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞百分比的流式细胞术数据。
图10示出，合成分子量为5kDa且N＝50的聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOZ)并用腙连接体与脂质连接。
图11示出了具有DNA的MVL5/GMO/脂质-HPMOZ复合物。从左至右：单独的DNA(NTC-eGFP)，0％mol脂质HPMOZ，2％mol脂质-HPMOZ，4％mol脂质-HPMOZ，6％mol脂质-HPMOZ，8％mol脂质-HPMOZ，10％mol脂质-HPMOZ。在任何复合物中均未发现游离DNA，这证明脂质-HPMOZ不影响DNA复合效率，并且在电荷比为5时存在很少的游离DNA。
图12示出了用Lipofectamine 2000转染的Caco-2细胞。
图13示出了用PMOZ 4％转染的Caco-2细胞。
图14示出了Caco-2细胞中的PMOZ转染效率。
图15A示出了猪上皮层切片的染色。白框表示针对PMOZ 4％的像素强度所选择的上皮区域。图15B示出了猪上皮层切片的染色。白框表示针对Lipofectamine 2000的像素强度所选择的上皮区域。
图16示出了100Min时的离体粘液穿透。
图17示出了存在于转染的大鼠结直肠细胞中的APC的western印迹。
图18示出了体内内窥镜监测。该图显示在给药4周后，可在大鼠细胞的上皮和息肉中观察到GFP。
图19示出了4周后在上皮和息肉中仅在LiteA1+GFP动物中通过内窥镜监测观察到的GFP表达。
图20示出了LiteA1+GFP对照组(给药7周)中肿瘤的组织学，显示在肿瘤横截面中可观察到在整个肿瘤中发现表达。相对于在内窥镜检查期间使用的探针来测量肿瘤大小。然后可以纵向跟踪肿瘤大小。
图21A示出了Lipofectamine处理的动物的肿瘤大小，并且图21B示出了Lipofectamine处理的动物的第二肿瘤的肿瘤大小。图21C示出了LiteA1处理的动物的肿瘤大小(以mm计)。图21D示出了LiteA1处理的动物的第二肿瘤的肿瘤大小(以mm计)。图21E示出了LiteA1处理的动物的第三肿瘤的肿瘤大小(以mm计)。图21F示出了LiteA1处理的动物的第四肿瘤的肿瘤大小(以mm计)。图21G示出了LiteA1处理+GFP的动物的肿瘤的肿瘤大小(以mm计)。图21H示出了LiteA1处理+GFP的动物的第二肿瘤的肿瘤大小(以mm计)。
图22示出了体外粘液穿透分析的琼脂糖凝胶电泳。从右至左(+5，+3，+2，仅DNA和+1)。
图23描绘了在+2、+3和+5的电荷比下的MVL5/GMO/Lipid0HPEG以及Lipofectamine2000对照的体外粘液穿透测定的荧光贡献。
图24A描绘了在2的电荷比下HEK 293T的转染，图24B描绘了在3的电荷比下HEK293T的转染，图24C描绘了在5的电荷比下HEK293T的转染。
图25A描绘了用Cy5进行的对照5min时的代表性图像，并且图25B示出了离体猪粘液实验5min时的明视野。图25C描绘了用Cy5进行的对照60min时的代表性图像，并且图25D示出了离体猪粘液实验60min时的明视野。图25E描绘了用Cy5进行的对照100min时的代表性图像，并且图25F示出了离体猪粘液实验100min时的明视野。
图26A在左方示出了媒介物+60bp-Cy5 5min时的代表性图像，并且图26B示出了离体猪粘液实验5min时的明视野。图26C示出了媒介物+60bp-Cy5 60min时的代表性图像，并且图26D示出了离体猪粘液实验60min时的明视野。图26E示出了媒介物+60bp-Cy5 60min时肠隐窝的代表性图像，并且图26F示出了离体猪粘液实验60min时的明视野。
图27A在左方示出了媒介物+60bp-Cy5 100min时的代表性图像，并且图27B示出了离体猪粘液实验100min时的明视野。图27C示出了媒介物100bp-Cy5 60min时肠隐窝的代表性图像，并且图27D示出了离体猪粘液实验100min时肠隐窝的明视野。
图28A示出了来自脂质体递送媒介物(Lite)-APC(阴性对照)的肠上皮细胞。图28B示出了来自Lite和GFP(阳性对照)的肠上皮细胞。
图29示出了用脂质体递送媒介物(Lite)处理的Pirc大鼠的肠隐窝细胞中经由GFP表达的转染。
图30A示出了用脂质体递送媒介物(Lite)-APC处理的Pirc大鼠的抗GFP染色的肿瘤组织样品。图30B示出了用脂质体递送媒介物(Lite)-GFP处理的Pirc大鼠的抗GFP肿瘤组织样品。图30C示出了表达GFP的Pirc大鼠肿瘤的高分辨率图像。
图31A示出了脂质体媒介物处理的Pirc大鼠的正常结肠上皮(epethleium)的4种不同幅度的HTLV相对于HPRT管家基因的覆盖图。图31B示出了脂质体媒介物处理的Pirc大鼠的结肠肿瘤的4种不同幅度的HTLV相对于HPRT管家基因的覆盖图。图31C示出了脂质体媒介物处理的Pirc大鼠的肝组织的4种不同幅度的HTLV相对于HPRT管家基因的覆盖图。图31D示出了脂质体媒介物处理的Pirc大鼠的脾脏的4种不同幅度的HTLV相对于HPRT管家基因的覆盖图。图31E示出了脂质体媒介物处理的Pirc大鼠的血清(无细胞DNA)的4种不同幅度的HTLV相对于HPRT管家基因的覆盖图。图31F示出了未处理的Pirc大鼠的正常结肠上皮的4种不同幅度的HTLV相对于HPRT管家基因的覆盖图。
图32示出了用(Lipo)-APC、(Lite)-APC和(Lite)-GFP处理的Pirc大鼠的平均肿瘤重量(mg)。注意，Lite-GFP的平均肿瘤重量低于显示，因为最大的Lite-GFP肿瘤被固定用于组织学而不是称重。
具体实施方式
以下描述和实例详细阐述了本公开内容的实施方案。应当理解，此公开内容不限于本文所述的特定实施方案，并因此可有变化。本领域技术人员将意识到，本公开内容存在许多变化和修改，其包含在本公开内容的范围内。
定义
如本文所用，关于参考数值的术语“约”及其语法等同项以及其语法等同项可包括数值加减该数值的10％的范围。例如，量“约10”包括从9到11的量。关于参考数值的术语“约”还可包括数值加减该数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的范围。
术语“施用”及其语法等同项可以指向受试者提供本文所述的结构的任何方法。这样的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于口服给药、经皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼内给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药和肠胃外给药，包括注射，如静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，本文公开的结构可治疗性施用。在一些情况下，可施用结构以治疗存在的疾病或病况。在进一步的各个方面，可预防性施用结构以防止疾病或病况。
术语“可生物降解的”及其语法等同项可以指聚合物、组合物和制剂，诸如本文所述的旨在在使用期间降解的那些聚合物、组合物和制剂。术语“可生物降解的”旨在涵盖也称为“可生物侵蚀的”材料和过程。
如本文所用的术语“癌症”及其语法等同项可以指细胞的过度增殖，其失去正常控制的独特特质导致不受调节的生长、缺少分化、局部组织侵袭和转移。关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括急性淋巴细胞癌、急性髓样白血病、腺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌、直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾脏癌、喉癌、白血病、液态肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或膀胱癌中的任一种。如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长，例如恶性类型或良性类型。
如本文所用的术语“细胞”及其语法等同项可以指生物体的结构和功能单元。细胞的大小可以是微观的，并且可由封闭在膜中的细胞质和细胞核组成。细胞可以指肠隐窝细胞。隐窝细胞可以指利贝昆(Lieberkuhn)隐窝，它是围绕肠绒毛基部的凹陷状结构。细胞可以是人或非人来源的。
如本文所用的“化学治疗剂”或“化学治疗化合物”及其语法等同项可以是用于治疗疾病例如癌症的化学化合物。
如本文所用的术语“功能”及其语法等同项可以指操作、拥有或服务于预期目的的能力。功能性可包括从基线到预期目的的100％的任何百分比。例如，功能性可包括或包括约预期目的的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多约100％。在一些情况下，术语功能性可意指超过或超过约正常功能的100％，例如，预期目的的125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％或最多约1000％。
如本文所用的术语“亲水的”及其语法等同项是指具有易与水相互作用的极性基团的物质或结构。
如本文所用的术语“疏水的”及其语法等同项是指具有不易与水相互作用的极性基团的物质或结构。
如本文所用的术语“粘液”及其语法等同项可以指主要含有粘液糖蛋白和其他物质的粘弹性天然物质，其保护各种器官/组织的上皮表面，该器官/组织包括但不限于呼吸系统、鼻系统、宫颈阴道系统、胃肠系统、直肠系统、视觉系统和听觉系统。
如本文所用的术语“结构”及其语法等同项可以指纳米颗粒或纳米结构。结构可以是脂质体结构。结构还以可指颗粒。结构或颗粒可以是纳米颗粒或纳米结构。颗粒或结构可以是具有约1nm直至约1微米的直径的任何形状。纳米颗粒或纳米结构可以是或可以是约100至200nm。纳米颗粒或纳米结构还可以是最高500nm。具有球形形状的纳米颗粒或纳米结构可称为“纳米球”。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”及其语法等同项可互换使用，并且可以指线性或环状构象并且处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸聚合物。出于本公开内容的目的，这些术语不应被解释为对长度的限制。该术语还可包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸骨架)中进行修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物可具有相同的碱基配对特异性，即腺嘌呤“A”的类似物可与胸腺嘧啶“T”碱基配对。
术语“药学上可接受的载体”及其语法等同项可以指无菌水性或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在使用前重建成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。这些溶液、分散体、悬浮液或乳液还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等可确保防止微生物的作用。还可能需要包含等渗剂如糖、氯化钠等。通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射药物形式的延长吸收。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微囊基质来制备可注射的储库形式。
如本文所用的术语“易感的”可理解为意味着受试者将会患上疾病或病况的概率增加(例如，概率增加至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多)。
如本文所用的术语“启动子”可以是启动特定基因或其部分的转录的DNA区域。
如本文所用的术语“接受者”及其语法等同项可以指受试者。受试者可以是人或非人动物。接受者也可以是有需要的，诸如需要治疗疾病如癌症。在一些情况下，接受者可能对预防性治疗是有需要的。在其他情况下，接收者可不是有需要的。
如本文所用的术语“风险”及其语法等同项可以指事件将在特定时间段内发生的概率，并且可意指受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可参考相关时间组群的实际测量后观察，或参考已进行跟踪相关时间段的统计上有效的历史组群所得到的指数值来进行测量。相对风险是指受试者的绝对风险与低风险组群的绝对风险之比或与平均群体风险之比，其可根据临床风险因素的评估方式而变化。
如本文所用的术语“受试者”及其语法等同项可以指人或非人类。受试者可以是哺乳动物。受试者可以是男性或女性的人类哺乳动物。受试者可以是任何年龄。受试者可以是胚胎。受试者可以是新生儿或最高约100岁。受试者可以是有需要的。受试者可患有疾病如癌症。
如本文所用的术语“序列”及其语法等同项可以指核苷酸序列，其可以是DNA和/或RNA；可以是线性的、圆形的或分支的；并且可以是单链的或双链的。序列可以是任何长度，例如，长度为2至1,000,000个或更多个核苷酸(或者其间或更大的任何整数值)，例如，约100至约10,000个核苷酸或约200至约500个核苷酸。
如本文所用，“表面改变剂”可以指修饰结构表面的一种或多种性质的试剂或材料，该性质包括但不限于亲水性(例如，可使表面或多或少具有亲水性)、表面电荷(例如，使表面中性或近中性或者更带负电或正电)以及/或者增强在体液和/或组织如粘液之中或穿过体液和/或组织如粘液的运输。表面改变剂可以是聚合物。
如本文所用的术语“干细胞”可以指多细胞生物体的未分化细胞，其能够产生无限多的相同类型的细胞。干细胞还可通过分化产生其他种类的细胞。干细胞可见于隐窝中。干细胞可以是见于肠绒毛表面上的上皮细胞的祖细胞。干细胞可以是癌性的。干细胞可以是全能的、单能的或多能的。干细胞可以是诱导型干细胞。
术语“治疗”或“处理”及其语法等同项可以指受试者的医学管理，其旨在治愈、减轻、稳定或者预防疾病、病况或病症。治疗可包括积极治疗，即特别针对疾病、病况或病症的改善的治疗。治疗可包括病因治疗，即针对去除相关疾病、病况或病症的病因的治疗。此外，该治疗可包括姑息治疗，即被设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病况或病症的治疗。治疗可包括预防性治疗，即针对最小化或者部分或完全抑制疾病、病况或病症的发生的治疗。治疗可包括支持性治疗，即用于补充针对疾病、病况或病症的改善的另一特定疗法的治疗。在一些情况下，病况可以是病理性的。在一些情况下，治疗可能无法完全治愈、减轻、稳定或者预防疾病、病况或病症。
当在化学基团的上下文中使用时，“氢”意指—H；“羟基”意指—OH；“卤素”意指—F、—Cl、—Br或—I。
对于本文提供的结构，以下插入性下标进一步将基团定义如下：“(Cn)”定义了该基团中碳原子的确切数目(n)。例如，“(C2-10)烷基”表示具有2至10个碳原子(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10，或可衍生自其中的任何范围(例如，3至10个碳原子))的烷基。
当在没有“取代的”修饰物的情况下使用时，术语“烷基”是指具有饱和碳原子作为连接点的非芳香性单价基团，其为直链或支链，成环、环状或非环状结构，无碳碳双键或三键并且没有除碳和氢以外的原子。基团—CH3(Me)、—CH2CH3(Et)、—CH2CH2CH3(n-Pr)、—CH(CH3)2(异Pr)、—CH(CH2)2(环丙基)、—CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、—CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、—CH2CH(CH3)2(异丁基)、—C(CH3)3(叔丁基)、—CH2C(CH3)3(新戊基)、环丁基、环戊基、环己基和环己基甲基是烷基基团的非限制性实例。取代烷基是指具有饱和碳原子作为连接点的非芳香性单价基团，其为直链或支链，成环、环状或非环状结构，无碳碳双键或三键以及至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。以下基团是取代烷基基团的非限制性实例：—CH2OH、—CH2Cl、—CH2Br、—CH2SH、—CF3、—CH2CN、—CH2C(O)H、—CH2C(O)OH、—CH2C(O)OCH3、—CH2C(O)NH2、—CH2C(O)NHCH3、—CH2C(O)CH3、—CH2OCH3、—CH2OCH2CF3、—C H2OC(O)CH3、—CH2NH2、—CH2NHCH3、—CH2N(CH3)2、—CH2CH2Cl、—CH2CH2OH、—CH2CF3、—CH2CH2OC(O)CH3、—CH2CH2NHC O2C(CH3)3和—CH2Si(CH3)3。
当在没有“取代的”修饰物的情况下使用时，术语“炔基”是指具有非芳香性碳原子作为连接点的单价基团，其为直链或支链，成环、环状或非环状结构，至少一个碳碳三键并且没有除碳和氢以外的原子。基团—C≡CH、—C≡CH3、—C≡CC6H5和—CH2C≡CCH3是炔基基团的非限制性实例。取代炔基是指具有非芳香性碳原子作为连接点以及至少一个碳碳三键的单价基团，其为直链或支链，环状，环状或非环状结构以及至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。基团—C≡CSi(CH3)3是取代炔基基团的非限制性实例。
当在没有“取代的”修饰物的情况下使用时，术语“芳基”是指具有芳香性碳原子作为连接点的单价基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳环结构的一部分，其中环原子均为碳，并且其中所述单价基团不包含除碳和氢以外的原子。芳基基团的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、—C6H4CH2CH3(乙基苯基)、—C6H4CH2CH2CH3(丙基苯基)、—C6H4CH(CH3)2、—C6H4CH(CH2)2、—C6H3(CH3)CH2CH3(甲基乙基苯基)、—C6H4CH═CH2(乙烯基苯基)、—C6H4CH═CHCH3、—C6H4C≡CH、—C6H4C≡CCH3、萘基，以及衍生自联苯基的单价基团。取代芳基是指具有芳香性碳原子作为连接点的单价基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳环结构的一部分，其中环原子均为碳，并且其中所述单价基团进一步具有至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。取代芳基基团的非限制性实例包括以下基团：—C6H4F、—C6H4Cl、—C6H4Br、—C6H4I、—C6H4OH、—C6H4OC H3、—C6H4OCH2CH3、—C6H4OC(O)CH3、—C6H4NH2、—C6H4NHCH3、—C6H4N(CH3)2、—C6H4CH2OH、—C6H4CH2OC(O)CH3、—C6H4CH2NH2、—C6H4CF3、—C6H4CN、—C6H4CHO、—C6H4CHO、—C6H4C(O)CH3、—C6H4C(O)C6H5、—C6H4CO2H、—C6H4CO2CH3、—C6H4CONH2、—C6H4CONHCH3和—C6H4CON(CH3)2。
术语“环烷基”是指具有三个或更多个碳原子(例如，3-6个碳原子)的饱和脂环部分，并且其可任选地在任何可用的位置苯并稠合。环烷基的非限制性实例包括基团环丙基、环丁基、环戊基、环己基、2,3-二氢茚基和四氢萘基。
当在没有“取代的”修饰物的情况下使用时，术语“杂芳基”是指具有芳香性碳原子或氮原子作为连接点的单价基团，所述碳原子或氮原子形成芳环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中所述单价基团不包含除碳、氢、芳香氮、芳香氧和芳香硫以外的原子。杂芳基基团的非限制性实例包括吖啶基、呋喃基、咪唑并咪唑基、咪唑并吡唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并嘧啶基、吲哚基、吲唑啉基(indazolinyl)、甲基吡啶基、噁唑基、苯基咪唑基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、四氢喹啉基、噻吩基、三嗪基、吡咯并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡咯并吡嗪基、吡咯并三嗪基、吡咯并咪唑基、苯并吡喃基(chromenyl)(其中连接点是芳香性原子之一)和苯并二氢吡喃基(其中连接点是芳香性原子之一)。取代杂芳基是指具有芳香性碳原子或氮原子作为连接点的单价基团，所述碳原子或氮原子形成芳环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中所述单价基团进一步具有至少一个独立地选自非芳香氮、非芳香氧、非芳香硫、F、Cl、Br、I、Si和P的原子。
当在没有“取代的”修饰物的情况下使用时，术语“烷氧基”是指基团—OR，其中R为烷基，如该术语在上文所定义的。烷氧基基团的非限制性实例包括：—OCH3、—OCH2CH3、—OCH2CH2CH3、—OCH(CH3)2、—OCH(CH2)2、—O-环戊基和—O-环己基。取代烷氧基是指基团—OR，其中R为取代烷基，如该术语在上文所定义的。例如，—OCH2CF3是取代烷氧基基团。
概述
本文公开了可用于基因治疗的组合物和方法。全文描述的组合物和方法可使用结构例如纳米颗粒来局部递送多核酸。有效的基因递送可用于治疗疾病，例如家族性腺瘤性息肉(FAP)患者。在一些情况下，编码治疗基因的微环DNA可包封在纳米颗粒内，以供对诸如肠隐窝细胞等部位进行局部基因治疗。
脂质体
脂质体可以是囊泡结构，其可经由以能量有利的方式彼此相互作用的脂质的累积而形成。脂质体通常可通过溶解的脂质分子的自组装而形成，每个脂质分子可含有亲水性头部基团和疏水性尾部。脂质体可由被一个或多个由天然或合成脂质组成的双层包裹的水性核心组成。在一些情况下，脂质体可以是高反应性和免疫原性的，或者是惰性的和弱免疫原性的。由天然磷脂组成的脂质体可以是生物学惰性的和弱免疫原性的，并且脂质体可具有低的内在毒性。此外，脂质体可携带货物。货物可以是多核酸，诸如微环DNA或药物。药物可以是当施用时可引起受试者中的生理变化的物质。药物可以是用于治疗疾病如癌症的药品。在一些情况下，药物可完全包埋在脂质体脂质双层中、水性隔室中，或者脂质体脂质双层和水性隔室两者中。强亲脂性药物可几乎完全包埋在脂质双层中。强亲水性药物可仅位于水性隔室中。具有中等logP的药物可在双层和水性核心两者中在脂质与水相之间容易地划分。脂质体可根据其层片性(单层、寡层和多层囊泡)、大小(小、中或大)和制备方法(诸如反相蒸发囊泡，VET)进行分类。
在一些情况下，脂质体结构可以是囊泡。囊泡可以是单层的或多层的。单层囊泡可包含脂质双层，并且通常具有约50nm至约250nm的直径。单层囊泡可包含脂质双层，并且通常具有约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm或最大约250nm的直径。单层囊泡可含有大的水性核心，并且可优选地用于包封药物。在一些情况下，单层囊泡可部分地包封药物。多层囊泡可包含处于洋葱皮排列中的几个同心脂质双层，并且具有约1-5μm的直径。洋葱皮排列可具有约1μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或最大5.0μm或更大的直径。在一些情况下，单层囊泡或脂质体结构可具有高脂质含量。高脂质含量可允许单层囊泡或多层囊泡被动地包埋脂溶性药物。在一些情况下，单层囊泡可具有小于一微米，在一些情况下小于约500nm的直径。形成囊泡的脂质可具有至少一个烃链。形成囊泡的脂质可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或最多20个或更多的烃链。烃链可以是酰基链。形成囊泡的脂质可具有头部基团。头部基团可以是极性的或非极性的。烃链可以是饱和的或不饱和的。烃链可具有不同的饱和度。存在多种合成的形成囊泡的脂质和天然存在的形成囊泡的脂质，包括但不限于鞘脂类、醚脂类、甾醇类、磷脂类(特别是磷酸甘油酯类)和糖脂类如脑苷脂类和神经节苷脂类。
脂质体可以是生物相容的和可生物降解的。例如，在一些情况下，脂质体可在引入受试者中后生物降解。在一些情况下，生物降解可在引入后立即开始。生物降解可发生在已经接受脂质体或脂质体结构给药的受试者的粘膜道内。生物降解可导致脂质体货物如多核酸的释放。在其他情况下，生物降解可包括脂质体结构的组分如聚合物的分解。生物降解可在标准身体条件下发生，诸如约97.6°F至约99°F。在其他情况下，生物降解可在约95°F至约106°F的温度下发生。生物降解可在约95°F、96°F、97°F、98°F、99°F、100°F、101°F、102°F、103°F、104°F、105°F或最高106°F下发生。在其他方面，生物降解可在约50°F至约150°F下发生。
在其他情况下，可能不会发生生物降解。当生物降解发生时，在将脂质体或结构施用于受试者后其可花费约1分钟至约100年。生物降解可花费约1分钟、5分钟、30分钟、1小时、3小时、7小时、10小时、15小时、20小时、25小时、2天、4天、8天、12天、20天、30天、1.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1.5年、3年、5年、8年、10年、15年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年或至少约100年。诸如脂质体等结构的脂质可以是或可包含：脂肪酸类、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类、糖脂类、聚酮类(衍生自酮脂酰亚基的缩合)、甾醇脂类、异戊烯醇脂类(衍生自异戊二烯亚基的缩合)或其任意组合。
甘油脂类可主要由单取代、二取代或三取代甘油组成，最熟知的是甘油的脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时可与“甘油三酯”同义使用，但后者的脂质不含羟基基团。在甘油脂类中，甘油的三个羟基基团可通常通过不同的脂肪酸进行酯化。
甘油磷脂类，通常称为磷脂类，可含有甘油二酯、磷酸基团和简单的有机分子如胆碱。在一些情况下，甘油磷脂可不含甘油二酯、磷酸基团和简单的有机分子。可不含甘油二酯、磷酸基团和简单的有机分子的甘油磷脂可以是鞘磷脂。鞘磷脂可源自鞘氨醇而不是甘油。
磷脂分子的结构通常由疏水性尾部和亲水性头部组成。亲水性头部可含有带负电荷的磷酸基团，并且可含有其他极性基团。疏水性尾部可由长脂肪酸烃链组成。当置于水中时，磷脂类可根据磷脂的特定性质形成多种结构。当疏水性尾部相对彼此排成行时，可产生脂质双层，从而在面向水的两侧形成亲水性头部的膜。基于真核生物和真细菌中甘油骨架的-3位或者古菌的-1位的极性头部基团的性质，甘油磷脂类可细分为不同的类别。在生物膜中发现的甘油磷脂类的实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。在真核生物中，磷脂类通常分为两类：二酰基甘油酯类和鞘氨醇磷脂(phosphingolipids)。二酰基甘油酯类的实例包括但不限于磷脂酸(磷脂酸酯)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷酸肌醇，如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。鞘氨醇磷脂类的实例包括但不限于神经酰胺磷酸胆碱(鞘磷脂)(SPH)、神经酰胺磷酸乙醇胺(鞘磷脂)(Cer-PE)和神经酰胺磷酰脂。
磷酸甘油酯类包括但不限于磷脂类，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油(心磷脂)。在一些情况下，磷酸甘油酯的两条烃链的长度可为约14至约22个碳原子。在一些情况下，磷酸甘油酯的两条烃链的长度可为约1至约100个碳原子。磷酸甘油酯的两条烃链的长度可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或最多约100个碳原子。在一些情况下，磷酸甘油酯的两条烃链可具有不同的不饱和度。如本文所用，缩写“PC”是指磷脂酰胆碱，并且“PS”是指磷脂酰丝氨酸。含有饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的脂质对于本领域技术人员是广泛可用的。脂肪酸，或当是脂质的一部分时的脂肪酸残基可以是多个组的分子。在一些情况下，脂肪酸残基可合成地制备或天然合成。在一些情况下，脂肪酸残基可通过乙酰辅酶A引物与丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A基团的链延长在称为脂肪酸合成的过程中天然合成。脂肪酸可以由能够以羧酸基团终止的烃链制成；这种排列可赋予分子极性亲水末端和可不溶于水的非极性疏水末端。通常4至24个碳长的碳链可以是饱和的或不饱和的。在一些情况下，碳链可连接至含有氧、卤素、氮和/或硫的官能团。当碳链中存在双键时，可能有顺式或反式几何异构性，其显著影响分子的构型。顺式双键可导致脂肪酸链弯曲，这种效应与链中的更多双键相复合。大多数天然存在的脂肪酸具有顺式构型，尽管反式形式确实存在于一些天然和部分氢化的脂肪和油中。脂肪酸类别中的其他脂质可以是脂肪酯和脂肪酰胺。另外，脂质的两条烃链可以是对称的或不对称的。本文所述的脂质和磷脂可含有酰基链。在一些情况下，酰基链可具有不同的长度和饱和度。酰基链的不同长度和饱和度可在商业上获得或者根据公开的方法制备。
在一些情况下，脂质体结构可包含磷脂酰胆碱。示例性的磷脂酰胆碱包括但不限于二月桂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二花生酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二亚油酰基-磷脂酰胆碱、二芥酰基磷脂酰胆碱、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰基-棕榈酰基磷脂酰胆碱、棕榈酰基-肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰基-硬脂酰基磷脂酰胆碱、棕榈酰基-硬脂酰基-磷脂酰胆碱、硬脂酰基-棕榈酰基磷脂酰胆碱、硬脂酰基-油酰基-磷脂酰胆碱、硬脂酰基-亚油酰基磷脂酰胆碱和棕榈酰-亚油酰基-磷脂酰胆碱。不对称的磷脂酰胆碱可称为1-酰基,2-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，其中酰基基团彼此不同。对称的磷脂酰胆碱可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。如本文所用，缩写“PC”是指磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱在本文中可缩写为“DMPC”。磷脂酰胆碱1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱在本文中可缩写为“DOPC”。磷脂酰胆碱1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱在本文中可缩写为“DPPC”。通常，在各种脂质中发现的饱和酰基基团包括具有以下名称的基团：丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、月桂酰基、十三烷酰基、肉豆蔻酰基、十五烷酰基、棕榈酰基、植烷酰基、十七烷酰基、硬脂酰基、十九烷酰基(nonadecanoyl)、花生酰基、二十一烷酰基(heneicosanoyl)、山嵛酰基(behenoyl)、二十三烷酰基(trucisanoyl)和二十四烷酰基(lignoceroyl)。饱和酰基基团的对应IUPAC名称为三酸根、四酸根、戊酸根、己酸根、庚酸根、辛酸根、壬酸根、癸酸根、十一烷酸根、十二烷酸根、十三烷酸根、十四烷酸根、十五烷酸根、十六烷酸根、3,7,11,15-四甲基十六烷酸根、十七烷酸根、十八烷酸根、十九烷酸根、二十烷酸根、二十一烷酸根、二十二烷酸根、二十三烷酸根和二十四烷酸根。在对称和不对称磷脂酰胆碱两者中发现的不饱和酰基基团包括肉豆蔻脑酰基(myristoleoyl)、棕榈油酰基、油酰基、反式油酰基(elaidoyl)、亚油酰基、亚麻酰基、二十碳烯酰基(eicosenoyl)和花生四烯酰基(arachidonoyl)。不饱和酰基基团的对应IUPAC名称为9-顺式-十四烷酸根、9-顺式-十六烷酸根、9-顺式-十八烷酸根、9-反式-十八烷酸根、9-顺式-12-顺式-十八碳二烯酸根、9-顺式-12-顺式-15-顺式十八碳三烯酸根、11-顺式-二十碳烯酸根和5-顺式-8-顺式-11-顺式-14-顺式-二十碳四烯酸根。示例性的磷脂酰乙醇胺包括二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基-磷脂酰乙醇胺和卵磷脂酰乙醇胺。磷脂酰乙醇胺在IUPAC命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，这取决于它们是对称的还是不对称的脂质。示例性的磷脂酸包括二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸和二油酰基磷脂酸。磷脂酸在IUPAC命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸，这取决于它们是对称的还是不对称的脂质。示例性的磷脂酰丝氨酸包括二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、棕榈酰基-油基磷脂酰丝氨酸和脑磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸在IUPAC命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸]或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸]，这取决于它们是对称的还是不对称的脂质。如本文所用，缩写“PS”是指磷脂酰丝氨酸。示例性的磷脂酰甘油包括二月桂酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰甘油和卵磷脂酰甘油。磷脂酰甘油在IUPAC命名系统下也可称为1,2-二酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(l-甘油)]或1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(l-甘油)]，这取决于它们是对称的还是不对称的脂质。磷脂酰甘油1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(l-甘油)]在本文中缩写为“DMPG”。磷脂酰甘油1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-(磷酸-外消旋-l-甘油)(钠盐)在本文中缩写为“DPPG”。合适的鞘磷脂可包括脑鞘磷脂、卵鞘磷脂、二棕榈酰基鞘磷脂和二硬脂酰基鞘磷脂。其他合适的脂质包括糖脂、鞘脂、醚脂、糖脂如脑苷脂和神经节苷脂，以及甾醇如胆固醇或麦角甾醇。
在一些情况下，脂质体结构可包含胆固醇或其衍生物、磷脂、磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物，或其组合。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆甾烯基-2'-羟基乙基醚、胆甾烯基-4'-羟基丁基醚及其混合物。当脂质体结构包含磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物时，脂质体结构可占脂质体结构中存在的总脂质的至多约40、50或60mol％。一种或多种磷脂和/或胆固醇可占脂质体结构中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％、约15mol％至约60mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约60mol％、约30mol％至约60mol％、约10mol％至约55mol％、约15mol％至约55mol％、约20mol％至约55mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约55mol％、约13mol％至约50mol％、约15mol％至约50mol％或约20mol％至约50mol％。
取决于本体溶液的结构、组成或其组合，脂质体可从溶液中分离疏水分子或亲水分子。在一些情况下，脂质体可称为囊泡。在一些情况下，脂质体可以是刚性或非刚性的。脂质体可以不是刚性的形成物而是可以是通用的超分子复合物的流体实体。脂质体可具有广泛的用途。脂质体可根据脂质组成以多种形状和大小布置。脂质体可用于递送分子货物如DNA以获得治疗益处。用于形成脂质体的脂质可以是阳离子的、阴离子的、中性的或其混合物。脂质体可以是阳离子脂质体、中性脂质体或阴离子脂质体。
在特定的实施方案中，脂质体结构可包括第二氨基脂质或阳离子脂质、中性脂质、甾醇以及被选择用于减少形成期间脂质颗粒的聚集的脂质中的一种或多种。聚集可以由脂质体结构的空间稳定化引起，其可以防止形成期间电荷诱导的聚集。脂质体结构可包含两种或更多种阳离子脂质。可选择脂质以贡献不同的有利性质。例如，可在脂质体结构中使用性质如胺pKa、化学稳定性、循环半衰期、组织中的半衰期、组织中的净累积或毒性不同的阳离子脂质。特别地，可以选择阳离子脂质，使得混合脂质的脂质体结构的性质比单一脂质的单脂质结构的性质更理想。通过在给定制剂中选择阳离子脂质的混合物而不是选择单一阳离子脂质，可以以有利的方式调节来自阳离子脂质的净组织累积和长期毒性(若存在)。此类混合物还可以提供编码基因如APC的至少一部分的多核酸的更好的包封和/或释放。与制剂中的单一实体相比，阳离子脂质的组合也可影响系统稳定性。
脂质体的每种脂质可具有相同或不同的结构方面，诸如头部基团大小和烃尾长度。在一些情况下，头部基团面积可为约0.1nm2至约10nm2。例如，头部基团面积可为约0.1nm2、0.2nm2、0.3nm2、0.4nm2、0.5nm2、0.6nm2、0.6nm2、0.7nm2、0.8nm2、0.9nm2、1.0nm2、2.0nm2、3.0nm2、4.0nm2、5.0nm2、6.0nm2、7.0nm2、8.0nm2、9.0nm2至约10.0nm2。在一些情况下，头部基团面积可为约0.40nm2至约5nm2。在一些情况下，阳离子脂质可具有大致约1.66nm2的头部基团面积。
在一些情况下，脂质的烃尾的长度可为约8至约18个碳。在一些情况下，烃尾的长度可为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或多于18个碳。烃尾的长度也可以是恰好8个或恰好18个碳。烃尾可以是饱和的。在一些情况下，烃尾可以是不饱和的。在其他情况下，饱和烃尾可具有单个双键。在一些情况下，烃链的组合可以是对称的、不对称的或任意组合。在一些情况下，可调节烃尾的对称性以改善转染效率。例如，与对称烃尾的混合制剂相比，具有较短的饱和碳链和长的不饱和碳链的不对称烃尾可产生高转染效率。
脂质体可通过任何手段形成。在一些情况下，脂质体可通过溶解的脂质分子的自组装形成。在一些情况下，亲水性脂质头部基团和疏水性脂质尾部可参与自组装。亲水性脂质可呈现关联性，其可产生低自由能的熵有利状态，在一些情况下形成双分子脂质小叶。小叶的特征可在于彼此面对的疏水性脂质烃尾以及面向外的以与水溶液缔合的亲水性脂质头部基团。此时，双层形成可能仍然在能量上是不利的，因为脂质分子的疏水部分可能仍然与水接触，这可以通过在其自身上形成双层膜的弯曲以形成具有封闭边缘的囊泡来克服。在一些情况下，脂质体可形成囊泡。脂质体可包括外表面和内部隔室。用于生成脂质体的脂质分子可以是具有头部基团和经由骨架连接体连接的疏水烃尾的保守实体。骨架连接体可以是甘油。可使用的连接体种类的实例包括但不限于酰胺、烷基胺、硫醇醚、烷基、环烷基和/或芳基连接。
在某些应用中，一旦药物如多核酸进入细胞，就可能期望释放部分。部分可用于鉴定已接受多核酸的细胞的数目。部分可以是抗体、染料、scFv、肽、糖蛋白、碳水化合物、配体、聚合物等。部分可与连接体接触。连接体可以是不可切割的。因此，在一些情况下，连接体可以是可切割的连接体。这可使得一旦与靶细胞接触，部分就从脂质体结构中释放。当部分在与脂质体结构分离时具有更大的治疗作用时，这可能是期望的。在一些情况下，当与脂质体结构分离时，部分可具有更好的被细胞如肠隐窝细胞或肠隐窝干细胞的细胞内组分吸收的能力。在一些情况下，连接体可包括二硫键、酰基腙、乙烯基醚、原酸酯或N-PO3。
因此，可能必需或期望将部分与脂质体结构分离，使得部分可进入细胞内区室。释放部分的连接体的切割可由于与外部细胞相比细胞内的条件变化，例如，由于细胞内pH的变化。由于细胞内存在一旦药物(例如多核酸)进入细胞就切割连接体的酶，因此可发生连接体的切割。或者，可以响应于施加到细胞的能量或化学物质而发生连接体的切割。可用于实现连接体切割的能量类型的实例包括但不限于光、超声、微波和射频能量。在一些情况下，连接体可以是光不稳定连接体。用于连接复合物的连接体还可以是酸不稳定连接体。酸不稳定连接体的实例包括通过使用顺式乌头酸、顺式羧基链三烯、聚马来酸酐形成的连接体和其他酸不稳定性连接体。
在一些情况下，阳离子脂质可通过极性头部基团中存在的一种或多种胺获得正电荷。在一些情况下，脂质体可以是阳离子脂质体。在一些情况下，脂质体可以是用于携带带负电荷的多核酸如DNA的阳离子脂质体。带正电荷的胺的存在可促进与阴离子如在DNA中发现的阴离子的结合。由此形成的脂质体可能是范德华力的能量贡献和与DNA货物静电结合的结果，其可部分地促进脂质体形状。在一些情况下，阳离子(和中性)脂质可用于基因递送。在其他情况下，阴离子脂质体可用于递送其他治疗剂。
在一些情况下，阴离子脂质体结构可用于递送多核酸如DNA。使用阴离子脂质形成含DNA的脂质体可通过使用二价阳离子来抵消相互的静电排斥并促进lipoplex的组装来引起。阴离子lipoplex可由生理上安全的组分组成，包括阴离子脂质、阳离子和DNA。该类别中常用的脂质是可在细胞膜中天然发现的磷脂，如磷脂酸、磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸。
阴离子脂质可在疏水区域中含有多种脂肪酸链中的任一种。所掺入的特定脂肪酸在相行为和弹性方面负责脂质体的流体特性。可能由于宿主细胞膜中特定磷脂的天然存在，通过具有净负表面电位的lipoplex的基因递送与较低的清除率和巨噬细胞的吞噬作用相关，这与有利的生物相容性一致。二价阳离子可掺入阴离子脂质体系统中，以实现在通过阴离子脂质包封之前压缩核酸。几种二价阳离子可用于阴离子lipoplex，如Ca2+、Mg2+、Mn2+和Ba2+。在一些情况下，Ca2+可用于阴离子脂质体系统。
阳离子脂质可用于形成脂质体。阳离子脂质可通常通过在极性头部基团中存在的一种或多种胺获得正电荷。带正电荷的胺的存在促进与阴离子如在DNA中发现的阴离子的结合。所形成的脂质体可能是范德华力的能量贡献和与DNA静电结合的结果，其可部分地决定脂质体形状。由于DNA的多聚阴离子性质，通常使用阳离子(和中性)脂质进行基因递送，而阴离子脂质体的使用已在很大程度上限于其他治疗性大分子的递送。
通常与中性辅助脂质一起形成的阳离子脂质溶液可与DNA混合，以形成称为lipoplex的带正电荷的复合物。用于阳离子脂质转染的试剂可包括N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)和二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)。二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，一种中性脂质，由于其在低pH下具有可有助于内溶酶体逃逸的膜去稳定作用而通常可与阳离子脂质结合使用。
脂质体可用中性辅助脂质形成。脂质体可使用以下物质生成：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、其盐及其任意组合。
在一些情况下，脂质体结构可由MVL5和GMO构成。MVL5与GMO的摩尔浓度可为约10:1至1:25。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:10。在其他情况下，MVL5与GMO的摩尔比可为约50:1至1:1。例如，摩尔比可为约50:1至1:1、40:1至1:1、30:1至1:1、20:1至1:1、10:1至1:1或约5:1至1:1。MVL5与GMO的摩尔比可为约10:1至约1:1，或10:1至约1:25。
在一些情况下，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，一种中性脂质，由于其在低pH下具有可有助于内溶酶体逃逸的膜去稳定作用而可与阳离子脂质结合使用。在一些情况下，可以使用其他试剂生成阳离子脂质体。在一些情况下，可以使用DOGS和DOPE的组合。在制造过程中，DOGS和DOPE可与至少一种聚合物如PEG组合。DOGS可以是阳离子的并且可与阴离子多核酸如DNA氢键结合。在一些情况下，多核酸DNA可与支链PEI形成盐，并且可由中性脂质体包封。
DOTMA可由两个不饱和的油酰基链(C18:Δ9)组成，通过醚键与甘油的三碳骨架结合，其中季胺作为阳离子头部基团。在一些情况下，可以进行修饰。例如，对DOTMA的修饰可以是侧链和与头部基团的烷基连接、用羟基取代DOTMA的季胺上的甲基基团或其任意组合的不同组合。{2,3-二油基氧基-N-[2(精胺酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐}或称DOSPA可以是作为DOTMA衍生物合成的另一种阳离子脂质。其结构可类似于DOTMA，但精胺基团可经由肽键与其疏水链结合。通常，添加精胺官能团可允许在脂质体大小方面更有效地包装DNA。
DOTAP可由与具有两条油酰基链的甘油骨架偶联的季胺头部基团组成。DC-Chol可由通过酯键与可水解的二甲基乙二胺连接的胆固醇部分组成。DOGS可具有类似于DOSPA的结构。在一些情况下，两种分子均可具有多价精胺头部基团和两条18碳烷基链。然而，DOGS中的链可以是饱和的，可通过肽键与头部基团连接，并且可缺少季胺。
在某些情况下，脂质双层可由选自磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰二乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘脂和乙氧基化甾醇或其混合物的一种或多种组成生成。在此类实施方案的说明性实例中，磷脂可以是卵磷脂；磷脂酰肌醇可来源于大豆、油菜、棉籽、蛋及其混合物；鞘脂可以是神经酰胺、脑苷脂、鞘氨醇和鞘磷脂及其混合物；乙氧基化甾醇可以是植物甾醇、PEG-(聚乙二醇)-5菜籽甾醇。在某些实施方案中，植物甾醇包括下列组成中的至少两种的混合物：谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇。在其他实施方案中，脂质层可由一种或多种选自以下的磷脂酰基团组成：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇或溶血磷脂酰肌醇。在其他情况下，脂质双层可由选自单酰基或二酰基磷酸甘油酯的磷脂组成。在其他情况下，脂质双层可由一种或多种选自以下的磷酸肌醇组成：磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI-3-P)、磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI-4-P)、磷脂酰肌醇-5-磷酸(PI-5-P)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(PI-3,4-P2)、磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸(PI-3,5-P2)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PI-4,5-P2)、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5-P3)、溶血磷脂酰肌醇-3-磷酸(LPI-3-P)、溶血磷脂酰肌醇-4-磷酸(LPI-4-P)、溶血磷脂酰肌醇-5-磷酸(LPI-5-P)、溶血磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(LPI-3,4-P2)、溶血磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸(LPI-3,5-P2)、溶血磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(LPI-4,5-P2)和溶血磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(LPI-3,4,5-P3)、磷脂酰肌醇(PI)或溶血磷脂酰肌醇(LPI)。
可修饰本公开内容的脂质或脂质体。修饰可以是表面修饰。与相当的脂质体结构相比，表面修饰可提高脂质体结构在粘液中移动的平均速率。相当的脂质体结构可不进行表面修饰，或者相当的脂质体结构可用聚乙烯醇(PEG)聚合物修饰。修饰可有利于防止体内降解。修饰还可有助于脂质体的运输。例如，由于pH敏感性修饰，修饰可允许脂质体在具有酸性pH的胃肠(GI)道内运输。表面修饰还可改善脂质体在粘液中移动的平均速率。例如，当与不具有修饰的相当的脂质体结构或具有包含PEG的修饰的脂质体结构相比时，修饰可将速率提高1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、100X、300X、500X、700X、900X或最多约1000X。在一些情况下，经由键合发生对脂质体的修饰。键合可以是共价的、非共价的、极性的、离子的、氢的或其任意组合。键合可被认为是两个基团或基团部分的关联。例如，脂质体结构可经由包含共价键的连接体与PEG结合。在一些情况下，两个相邻基团之间可发生键合。键合可以是动态的。当一个基团临时与第二个基团相关联时，可出现动态键合。例如，脂质体内悬浮的多核酸可在其悬浮期间与脂质双层的部分键合。
在一些情况下，修饰可以是聚乙二醇(PEG)添加。用PEG修饰脂质体表面的方法可包括其在脂质体表面上的物理吸附、其在脂质体上的共价连接、其对脂质体上的包覆或其任意组合。在一些情况下，PEG可在脂质体能够形成之前共价连接至脂质颗粒。
可使用多种分子量的PEG。PEG可为约10至约100单位的乙烯PEG组分，其可通过按包含在脂质双层中的脂质的重量计包含或包含约1％至约20％，优选约5％至约15％，约10％的胺基团与磷脂缀合。
在某些情况下，纳米结构可进一步包含至少一种靶向剂。术语靶向剂可以指与特定类型或类别的细胞和/或其他特定类型化合物特异性结合的部分、化合物、抗体等(例如，靶向特定细胞或细胞类型的部分)。靶向剂可对某些靶细胞的表面、靶细胞表面抗原、靶细胞受体或其组合具有特异性(例如，具有亲和力)。在一些情况下，靶向剂可以指当暴露于特定类型或类别的物质和/或细胞时具有特定作用(例如，切割)的试剂，并且该作用可驱动纳米结构靶向特定类型或类别的细胞。因此，术语靶向剂可以指可以是纳米结构的一部分并且在纳米结构的靶向机制中起作用的药剂，尽管药剂本身可对细胞本身的特定类型或类别具有或不具有特异性。在某些情况下，通过将靶向剂掺入本发明的纳米结构中，可增强由纳米结构递送的多核酸的细胞摄取的效率和/或使其更具特异性。在某些实施方案中，本文所述的纳米结构可包含一种或多种小分子靶向剂(例如，碳水化合物部分)。作为非限制性实例，合适的靶向剂还包括抗体、抗体样分子、或肽如整联蛋白结合肽(诸如含RGD的肽)、或小分子如维生素(例如，叶酸)、糖如乳糖和半乳糖或其他小分子。细胞表面抗原包括细胞表面分子，如细胞表面上的蛋白质、糖、脂质或其他抗原。在具体的实施方案中，细胞表面抗原经历内化。由本发明纳米颗粒的实施方案的靶向剂靶向的细胞表面抗原的实例包括但不限于1型和2型转铁蛋白受体、EGF受体、HER2/Neu、VEGF受体、整联蛋白、NGF、CD2、CD3、CD4、CDS、CDI9、CD20、CD22、CD33、CD43、)38、CD56、CD69和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。靶向剂还可包含人工亲和分子，例如肽模拟物或适体。肽模拟物可以指其中肽如治疗性肽的至少一部分得以修饰的化合物，并且肽模拟物的三维结构保持与肽的三维结构基本上相同。肽模拟物(肽和非肽基类似物)可具有改善的性质(例如，减少的蛋白水解、增加的保留或增加的生物利用度)。肽模拟物通常具有改善的口服利用度，这使得它们特别适合于治疗人或动物中的病症。应当注意，肽模拟物可具有或可不具有相似的二维化学结构，但共享共同的三维结构特征和几何结构。
在一些实施方案中，靶向剂可以是蛋白质靶向剂(例如，肽和抗体、抗体片段)。在一些具体实施方案中，纳米结构可包含多种不同的靶向剂。
在一些实施方案中，一种或多种靶向剂可与形成纳米结构的聚合物偶联。在一些情况下，靶向剂可与包覆纳米结构的聚合物结合。在一些情况下，靶向剂可与聚合物共价偶联。在一些情况下，靶向剂可与聚合物结合，使得靶向剂可基本上在所得纳米结构的表面处或其附近。在某些实施方案中，可使包含靶向剂残基的单体(例如，靶向剂的可聚合衍生物如肽的(烷基)丙烯酸衍生物)共聚合以形成构成本文提供的纳米结构的共聚物。在某些实施方案中，一种或多种靶向剂可通过连接部分与本发明纳米颗粒的聚合物偶联。在一些实施方案中，将靶向剂偶联至膜-去稳定聚合物的连接部分可以是可切割的连接部分(例如，包含可切割的键)。在一些实施方案中，连接部分可以是可切割的并且/或者包含可在内体条件下可切割的键。在一些实施方案中，连接部分可以是可切割的并且/或者包含可被特定酶(例如，磷酸酶或蛋白酶)切割的键。在一些实施方案中，连接部分可以是可切割的并且/或者包含可在细胞内参数(例如，pH、氧化还原电位)改变时可切割的键，在一些实施方案中，连接部分可以是可切割的并且/或者包含可在暴露于基质金属蛋白酶(MMP)时进行切割的键(例如，MMP-可切割肽的连接部分)。
在某些情况下，纳米颗粒的靶向机制可取决于聚合物中可切割区段的切割。例如，本发明聚合物可包含可切割区段，其在切割时暴露纳米颗粒和/或纳米颗粒的核心。在一些实施方案中，可切割区段可位于本发明聚合物的任一个或两个末端。在一些实施方案中，可切割区段沿聚合物的长度定位，并且任选地可位于聚合物嵌段之间。例如，在某些实施方案中，可切割区段可位于聚合物的第一嵌段与第二嵌段之间，并且当纳米颗粒可暴露于特定切割物质时，第一嵌段可从第二嵌段切割。在具体的实施方案中，可切割区段可以是MMP-可切割肽，其可在暴露于MMP时被切割。
可以以任何合适的方式实现靶向剂如抗体与聚合物的连接，例如，通过许多缀合化学方法中的任一种，包括但不限于胺-羧基连接体、胺-巯基连接体、胺-碳水化合物连接体、胺-羟基连接体、胺-胺连接体、羧基-巯基连接体、羧基-碳水化合物连接体、羧基-羟基连接体、羧基-羧基连接体、巯基-碳水化合物连接体、巯基-羟基连接体、巯基-巯基连接体、碳水化合物-羟基连接体、碳水化合物-碳水化合物连接体和羟基-羟基连接体。在具体的实施方案中，“点击”化学可用于将靶向剂连接至本文提供的纳米颗粒的聚合物。任选地利用多种缀合化学物质，在一些实施方案中，靶向剂可连接至单体，然后所得化合物可用于在本文所述的纳米颗粒中使用的聚合物(例如，共聚物)的聚合合成。在一些实施方案中，靶向剂可连接至与纳米颗粒的聚合物结合的siRNA的有义链或反义链。在某些实施方案中，靶向剂可连接至有义链或反义链的5'端或3'端。
用于连接化合物的方法可包括但不限于蛋白质、标记物和其他化学实体与核苷酸连接。交联剂如正马来酰亚胺基丁酰基氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)和磺基-GMBS具有降低的免疫原性。使用酰胺化物或H-磷酸盐化学将取代基连接至预先构建的寡核苷酸的5'端。取代基还可连接至寡聚物的3'端。最后一种方法利用与固体支撑物连接的2,2'-二硫代乙醇从携带吖啶部分的3'磷酸中置换二异丙胺，随后在磷的氧化后得以缺失。或者，寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，其具有经由连接臂连接至碱基的基团。例如，可利用通过烯丙胺连接臂将生物素与dUTP的C-5位的连接。还可进行经由连接臂将生物素和其他基团与嘧啶的5位的连接。
化学交联可包括使用间隔臂，即连接体或系链。间隔臂提供分子内柔性或调节缀合部分之间的分子内距离，从而可帮助保持生物活性。间隔臂可以是包含间隔氨基酸的肽部分的形式。或者，间隔臂可以是交联剂的一部分，诸如在“长链SPDP”中。
多种偶联剂或交联剂可用于公知的程序来合成靶向构建体，该偶联剂或交联剂诸如蛋白质A、碳二亚胺、二马来酰亚胺、二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶-基二硫代)丙酸酯(SPDP)、6-肼基烟酰胺(HYNIC)、N3S和N2S2。例如，可以使用双环酸酐法经由DTPA将生物素与寡核苷酸缀合。此外，磺基琥珀酰亚胺基6-(生物素酰氨基)己酸酯(NHS-LC-生物素，其可购自PierceChemical Co.Rockford、Ill.)“生物胞素”，一种生物素的赖氨酸缀合物，由于对伯胺的可用性可用于制备生物素化合物。此外，相应的生物素酸氯化物或酸前体可通过已知方法与治疗剂的氨基衍生物偶联。通过将生物素部分与颗粒表面偶联，另一部分可与亲和素偶联，然后通过强亲和素-生物素亲和力偶联至颗粒，反之亦然。在聚合物颗粒在颗粒表面上包含PEG部分的某些实施方案中，PEG的游离羟基基团可用于将另外的分子或部分联结或连接(例如，共价连接)至颗粒。
在实施方案中，脂质体修饰可提供生物相容性并且可被修饰以具有靶向物质，包括例如靶向肽，包括抗体、适体、聚乙烯或其组合。靶向物质还可以是受体。在一些情况下，使用T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、单链可变片段(scFv)、嵌合抗原受体(CAR)或其组合。
脂质体可具有任何大小和形态。形态可以是单层囊泡。单层囊泡的特征可在于单个双层膜，其可包封内部水溶液。阳离子胺头部基团和阴离子磷脂头部基团两者都可形成单壁囊泡。脂质体还可以是多层的。多层脂质体可含有多个同心双层。寡层脂质体可含有两个同心双层。多囊泡脂质体可在一个巨大囊泡内含有多个较小的单层囊泡。
囊泡大小落入纳米至微米范围内：小单层囊泡为20-200nm，大单层囊泡为200nm-1μm，并且巨大单层囊泡大于1μm。在一些情况下，囊泡的大小范围可从1μm到大于100μm。在一些情况下，可将多核酸压缩以通过脂质体结构适当地包封。DNA的压缩可通过二价金属离子如Mn2+、Ni2+、Co2+和Cu2+进行，这些金属离子可通过中和DNA骨架的磷酸基团并通过与碱基氢键结合使B-DNA结构变形，从而允许DNA的局部弯曲和螺旋间的关联来压缩DNA。在一些情况下，用于压缩的金属离子的浓度可取决于在压缩中使用的介质的介电常数。添加乙醇或甲醇也可降低压缩所需的金属离子的浓度。在一些情况下，乙醇可用于在按体积计约0.5％至约60％的浓度下压缩DNA。在一些情况下，乙醇可用于在按体积计约0.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或最高60％的浓度下压缩DNA。在一些情况下，Ca2+也可用于压缩。Ca2+不仅与DNA磷酸结合，还可与鸟嘌呤的氮(7)和氧(6)形成复合物，从而破坏碱基配对。
在一些情况下，脂质体的外表面可用聚合物包覆。在其他情况下，外表面可未被包覆。脂质体可携带治疗基因。脂质体可以是纳米容器的形式，诸如可用于包封治疗剂的纳米颗粒或脂质体。脂质体可用中性磷脂制成，如1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、二磷脂酰基磷酸胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)或胆固醇，伴随少量(1％)阳离子脂质如二(十二烷基)二甲基溴化铵(DDAB)。在一些情况下，可处于脂质双层中的材料可以是具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。在一些情况下，阳离子脂质可用于稳定包封在脂质体内的治疗剂，如DNA。
在一些情况下，多核酸如微环可完全包封在脂质体结构中。完全包封可表明脂质体结构中的多核酸在暴露于将显著降解游离DNA、RNA或蛋白质的血清或核酸酶或蛋白酶测定后可不显著降解。在完全包封的系统中，在通常将会降解100％游离多核酸的处理中，脂质体结构中优选少于约25％的多核酸可被降解，脂质体结构中更优选少于约10％，并且最优选少于5％的多核酸可被降解。在多核酸的条件下，可通过测定来确定完全包封。是一种超灵敏荧光核酸染色剂，用于量化溶液中的寡核苷酸和单链DNA或RNA(可从Invitrogen Corporation；Carlsbad、Calif.获得)。“完全包封”还可表明脂质体结构可以是血清稳定的，即它们在体内施用时会快速分解成它们的组分部分。
如本文所用的粘液穿透颗粒或MPP可以指已经包覆有粘膜穿透增强包衣的颗粒。在一些情况下，颗粒可以是或可递送活性剂颗粒，诸如可用粘膜穿透增强包衣包覆的治疗剂、诊断剂、预防剂和/或营养剂(即，药物颗粒)。在其他情况下，颗粒可由基质材料如聚合物材料形成，其中可包封、分散和/或关联治疗剂、诊断剂、预防剂和/或营养剂。包衣材料可与药物颗粒或聚合物颗粒II共价或非共价关联。
此外，本文提供的可以是脂质体结构，其可比其他脂质体结构(例如，未修饰的脂质体结构)以更高的速率穿过粘膜屏障。脂质体结构可以以例如相似大小的未修饰的脂质体结构的至少2、5、10、20、30、50、100、200、500、1000倍或更高的速率穿过粘膜屏障。在一些情况下，非PEG修饰的脂质体结构可比PEG修饰的脂质体结构更有效地穿透粘膜屏障，如通过transwell迁移测定所测量的。
粘液穿透纳米颗粒(MPP)或纳米颗粒可含有聚合物。聚合物可以是任何聚合物颗粒。可使用任何数目的生物相容性聚合物来制备纳米颗粒。在一个实施方案中，生物相容性聚合物可以是可生物降解的。在另一实施方案中，颗粒可以不是不可降解的。在其他实施方案中，颗粒可以是可降解和不可降解颗粒的混合物。
MPP可具有约-100mV至约100mV的近中性ζ电位。MPP可具有约-50mV至约50mV、约-30mV至约30mV、约-20mV至约20mV、约-10mV至约10mV、约-5mV至约5mV的ζ电位。
可生物降解的聚合物通常不同于不可生物降解的聚合物，因为前者可在使用期间降解。在某些实施方案中，这样的使用涉及体内使用，诸如体内治疗，并且在其他某些实施方案中，这样的使用涉及体外使用。通常，可归因于生物降解性的降解涉及可生物降解的聚合物降解成其组分亚单位，或者聚合物例如通过生物化学过程消化成较小的非聚合物亚单位。在某些实施方案中，通常可鉴定两种不同类型的生物降解。例如，一种类型的生物降解可涉及聚合物骨架中的键(无论是共价的还是其他的)的切割。在这样的生物降解中，典型地产生单体和寡聚物，甚至更典型地，这样的生物降解通过切割连接聚合物的一个或多个亚单位的键而发生。相反，另一种类型的生物降解可涉及侧链内部或将侧链连接到聚合物骨架的键(无论是共价的还是其他的)的切割。例如，作为侧链连接至聚合物骨架的治疗剂或其他化学部分可通过生物降解而释放。在某些实施方案中，在聚合物的使用过程中可发生一种或另一种或两种通常类型的生物降解。可生物降解聚合物的降解速率通常部分取决于多种因素，包括负责任何降解的连接的化学特征，这样的聚合物的分子量、结晶度、生物稳定性和交联度，植入物的物理特性(例如，形状和大小)，以及施用的模式和位置。例如，分子量越大、结晶度越高和/或生物稳定性越大，任何可生物降解聚合物的生物降解通常越慢。
在某些实施方案中，可生物降解聚合物还可具有治疗剂或与其关联的其他材料，这样的聚合物的生物降解速率可通过这样的材料的释放速率来表征。例如，生物降解速率可不仅取决于聚合物的化学特征和物理特性，还可取决于掺入其中的材料的特征。在一些情况下，本发明的聚合物制剂在期望应用中的可接受的一段时间内生物降解。在某些实施方案中，诸如体内治疗，在暴露于pH为6至8且具有25至37℃的温度的生理溶液时，这样的降解发生在通常短于约五年、一年、六个月、三个月、一个月、十五天、五天、三天甚至一天或更短(例如，4-8小时)的一段时间内。在其他实施方案中，取决于期望的应用，聚合物在约一小时至数周的一段时间内降解。
聚合物
聚合物可包括但不限于含环糊精的聚合物，特别是含阳离子环糊精的聚合物，如在美国专利号6,509,323中所述的那些；由内酯制备的聚合物，如聚(己内酯)(PCL)；聚羟基酸及其共聚物，如聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D-丙交酯)(PDLA)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)和聚(2-正丙基-2-噁唑啉)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)及其共混物、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚氨基酸如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚(戊酸)和聚-L-谷氨酸；甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)；聚酐；聚酯；聚原酸酯；聚(酯酰胺)；聚酰胺；聚(酯醚)；聚碳酸酯；聚亚烷基，如聚乙烯和聚丙烯；聚亚烷基二醇如聚乙二醇(PEG)和聚环氧乙烷(PEO)，及其嵌段共聚物如聚氧化烯氧化物；聚亚烷基对苯二甲酸酯，如聚对苯二甲酸乙二醇酯；乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)；聚乙烯醇(PVA)；聚乙烯醚；聚乙烯酯，如聚(乙酸乙烯酯)；聚乙烯卤化物，如聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮；聚硅氧烷；聚苯乙烯(PS)；纤维素，包括衍生化纤维素，如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；丙烯酸的聚合物，如聚(甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)(本文统称为“聚丙烯酸”)；聚对二氧环己酮及其共聚物；聚羟基链烷酸酯；聚丙烯富马酸酯；聚甲醛；泊洛沙姆；聚(丁酸)；三亚甲基碳酸酯；聚磷腈，或其任意组合。天然聚合物的实例可包括蛋白质如白蛋白、胶原、明胶和谷醇溶蛋白(例如玉米醇溶蛋白)，以及多糖如藻酸盐。还可以使用上述的共聚物，如无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物，或上面列出的聚合物的共混物。聚合物可以是PEG。聚合物可以是PEG 2000。聚合物还可以是非PEG聚合物，如聚(2-烷基-2-噁唑啉)。在一些情况下，聚合物中的侧链变化可能有助于结构通过粘膜屏障的扩散。在一些情况下，非PEG可包括L-氨基酸修饰的复合物。
聚合物可以是聚(乙二醇)，也称为PEG。PEG可用于在某些配置中降低在粘液中的粘附，例如，其中控制从表面延伸的PEG链的长度(使得贯穿进入ECM的长的非支化链得以减少或消除)。例如，线性高MW PEG可用于制备颗粒，使得仅部分线性链从颗粒表面延伸(例如，长度等同于较低MW PEG分子的部分)。或者，可使用支化的高MW PEG。在此类实施方案中，尽管PEG分子的分子量可能较高，但是从颗粒表面延伸的分子的任何单个链的线性长度将对应于较低MW PEG分子的线性链。在一些方面，PEG的平均分子量可以是至少200Da、500Da、950Da、1000Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da、5000Da、5500Da、6000Da、6500Da、7000Da、7500Da、8000Da、8500Da、9000Da、9500Da或10000Da。
在备选实施方案中，聚合物可以是泊洛沙姆，诸如以销售的聚乙二醇-聚氧乙烯嵌段共聚物。PEG替代聚合物可以是可溶的，亲水的，具有高度柔性的主链和高生物相容性。合成聚合物如聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)和聚(丙烯酰胺)(PAA)是其他潜在保护性聚合物的最突出的实例。在一些情况下，含有与聚(2-甲基-2-噁唑啉)或聚(2-乙基-2-噁唑啉)共价连接的DSPE的脂质体也可表现出延长的血液循环时间。在一些情况下，含有与聚(2-甲基-2-噁唑啉)或聚(2-乙基-2-噁唑啉)共价连接的DSPE的脂质体也可表现出肝和/或脾的摄取减少。聚合物还可以是聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]、两亲性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、基于L-氨基酸的可生物降解的聚合物-脂质缀合物和聚乙烯醇。还可以使用基于L-氨基酸的聚合物。
在一些情况下，与非硫醇化纳米颗粒相比，硫醇化纳米颗粒可显示很少穿透到胃粘膜中。在一些情况下，PEG化和POZ化颗粒可更多地穿透进入粘膜和穿透通过粘膜。在一些情况下，硫醇化在纳米颗粒粘膜穿透方面可能不如PEG化和POZ化。在其他情况下，PEG化在纳米颗粒粘膜穿透方面可能不如POZ化。在一些情况下，当与非POZ化颗粒比较时，包含POZ化的纳米颗粒可具有增加约2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、13X、14X、15X或大于20X的粘膜穿透。可通过一种或多种测定来测量粘膜穿透。在一些情况下，通过transwell迁移测定来测量粘膜穿透。在其他情况下，可通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)来测量粘膜穿透。在其他情况下，可通过多粒子跟踪(MPT)来测量粘膜穿透。
POZ化可包含式I。例如，POZ化(POZ)聚合物可包含式I：
R1可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合。
在一些情况下，R2可独立地选自能够偶联至连接体或基底的偶联基团；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合。
在一些情况下，R3可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合。
R4可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合。
R5可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合。
R6可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合。
R7可独立地选自氢；氘；C1-6烷基；C2-6炔基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；环烷基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X独立地选自氧或硫；Y独立地选自氘或氢；A为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n可为约1至约100。在其他情况下，n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或最多100。
在一些情况下，聚合物可包含式I的至少一部分。例如，在一些情况下，聚合物可包含式I的至少50％。在其他情况下，聚合物可包含式I的50％至约100％。聚合物与式I的相似性百分比为式1的50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或最高100％。
聚-2-噁唑啉的磷酸盐可具有至少约1000的重均分子量，如通过特性粘度-通用校准曲线所确定的。在其他情况下，聚-2-噁唑啉可具有至少约10,000的重均分子量。在其他情况下，聚-2-噁唑啉可具有至少约250,000的重均分子量。在其他情况下，优选聚-2-噁唑啉可具有至少约1,000,000的重均分子量。在其他情况下，聚-2-噁唑啉可具有至少约500,000的重均分子量。聚-2-噁唑啉可具有约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、1000000、200000、300000、400000或最大约500000Da或更大的平均分子量。在某些情况下，聚合物可被烷基、烷氧基、酰基或芳基基团取代。在一些情况下，聚合物如POZ或PEG可与脂质体的脂质直接缀合，或者可经由连接体部分与脂质体的脂质连接。可使用适合于将聚合物与脂质偶联的任何连接体部分，包括例如不含酯的连接体部分和含酯的连接体部分。连接体部分可以是不含酯的连接体部分。如本文所用，术语“不含酯的连接体部分”可以指不含羧酸酯键(—OC(O)—)的连接体部分。合适的不含酯的连接体部分包括但不限于氨基(—C(O)NH—)、氨基(—NR—)、羰基(—C(O)—)、氨基甲酸酯(—NHC(O)O—)、尿素(—NHC(O)NH—)、二硫化物(—S—S—)、醚(—O—)、琥珀酰基(—(O)CCH2CH2C(O)—)、琥珀酰胺基(—NHC(O)CH2CH2C(O)NH—)、醚、二硫化物及其组合(诸如含有氨基甲酸酯连接体部分和氨基连接体部分两者的连接体)。氨基甲酸酯连接体可用于将PEG与脂质偶联。在其他实施方案中，含酯的连接体部分可用于将PEG与脂质偶联。合适的含酯的连接体部分包括但不限于例如碳酸酯(—OC(O)O—)、琥珀酰基、磷酸酯(—O—(O)POH—O—)、磺酸酯及其组合。
在一些情况下，式I可具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。式I可具有约500Da至约10000Da的平均分子量。式I可具有约500Da、550Da、600Da、650Da、700Da、750Da、800Da、850Da、900Da、950Da、1000Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da、5000Da、5500Da、6000Da、6500Da、7000Da、7500Da、8000Da、8500Da、9000Da、9500Da或最大10000Da或更大的平均分子量。
在一些情况下，掩蔽硫醇基团可导致粘膜穿透增加。例如，POZ化可掩蔽硫醇基团。在一些情况下，使用聚2-噁唑啉化合物可导致PEG化脂质体结构上的粘膜穿透增加。与PEG相比，POZ还可以经由肾途径更容易地排泄。例如，与PEG相比，POZ基团可具有高1％至100％的肾排泄。POZ可具有比PEG高约1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或最高约100％的肾排泄。在一些情况下，与PEG基团相比，POZ基团可以是更可生物降解的。在一些情况下，可通过氧化降解来测量生物降解。
在一些情况下，与PEG相比，POZ还可以经由肾途径更容易地排泄。例如，与PEG相比，POZ基团可具有高1％至100％的肾排泄。POZ可具有比PEG高约1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或最高约100％的肾排泄。在一些情况下，与PEG基团相比，POZ基团可以是更可生物降解的。在一些情况下，可通过氧化降解来测量生物降解。
在一些情况下，可对聚合物进行修饰。聚合物上的官能团可被封端以改变聚合物的性质和/或修饰(例如，降低或增加)官能团的反应性。例如，含有羧酸的羧基末端的聚合物如含丙交酯和乙交酯的聚合物可任选地通过例如酯化封端，并且羟基末端可任选地通过例如醚化或酯化封端。PEG与其衍生物与上述任何聚合物的共聚物可用于制备聚合物颗粒。在某些实施方案中，PEG或衍生物可位于共聚物的内部位置。或者，PEG或衍生物可位于共聚物的末端位置附近或共聚物的末端位置处。例如，上述一种或多种聚合物可用聚乙二醇的嵌段封端。在一些实施方案中，核心聚合物可以是PEG化聚合物和非PEG化聚合物的共混物，其中基础聚合物可以是相同的(例如，PLGA和PLGA-PEG)或不同的(例如，PLGA-PEG和PLA)。在某些情况下，纳米颗粒可以在可允许PEG的区域相分离或以其他方式定位于纳米颗粒表面的条件下形成。单独的表面定位的PEG区域可执行表面改变剂的功能或包含表面改变剂。在一些情况下，纳米颗粒可由采用聚乙二醇嵌段作为表面改变材料封端的一种或多种聚合物来制备。在一些情况下，纳米颗粒可用PEG包覆。在一些情况下，脂质体可用PEG包覆。在一些情况下，PEG可在脂质体能够形成之前与脂质相关联。
聚合物可具有任何大小和重量。在一些情况下，聚合物的重量可根据给定的聚合物而变化，但可以是约25道尔顿、50道尔顿、100道尔顿、200道尔顿、300道尔顿、400道尔顿、500道尔顿、600道尔顿、700道尔顿、800道尔顿、900道尔顿、1000道尔顿至1,000,000道尔顿、1000道尔顿至500,000道尔顿、1000道尔顿至250,000道尔顿、1000道尔顿至100,000道尔顿、5,000道尔顿至100,000道尔顿、5,000道尔顿至75,000道尔顿、5,000道尔顿至50,000道尔顿或5,000道尔顿至25,000道尔顿。
在一些情况下，纳米颗粒可用作基因载体。在一些实施方案中，纳米颗粒可由一种或多种聚阳离子聚合物形成，该聚阳离子聚合物与可带负电荷的一种或多种核酸复合。阳离子聚合物可以是任何合成的或天然的聚合物，每分子带有至少两个正电荷并且具有足够的电荷密度和分子大小以在生理条件(即，在体内或细胞内遇到的pH和盐条件)下与核酸结合。在某些实施方案中，聚阳离子聚合物含有一个或多个胺残基。
在一些情况下，可用粘膜穿透增强包衣包覆含有治疗剂、诊断剂、预防剂和/或营养剂的纳米颗粒。纳米颗粒可以是微米颗粒或纳米颗粒。可使用任何手段、技术、供料或其组合来施加包衣。粘膜穿透增强包衣可与脂质、聚合物或任意组合共价或非共价地相关联。在一些实施方案中，其可以是非共价关联的。在其他实施方案中，脂质或聚合物可含有反应性官能团，或者可向其掺入粘膜穿透增强包衣可共价结合的官能团。
纳米颗粒可包覆有或包含一种或多种表面改变剂。在一些情况下，表面改变剂可提供直接的治疗效果，诸如减少炎症。可以包覆纳米颗粒，诸如一种为纳米颗粒提供近中性的ζ电位的包衣。包衣可以是PEG化。包衣可以是部分包衣或全包衣。表面改变剂的实例包括但不限于蛋白质，包括阴离子蛋白质(例如，白蛋白)、表面活性剂、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、治疗剂和聚合物。聚合物还可包括肝素、聚乙二醇("PEG")和泊洛沙姆(聚氧乙烯嵌段共聚物)。聚合物可以是PEG、PLURONICPEG2000或其任何衍生物、修饰形式或其组合。
表面改变剂可增加脂质体结构或脂质体颗粒的电荷或亲水性，或者以其他方式减少颗粒与粘液之间的相互作用，从而促进穿过粘液的运动性。表面改变剂可增强聚合物或脂质体颗粒或颗粒部分在粘液中或穿过粘液移动的平均速率。合适的表面改变剂的实例包括但不限于阴离子蛋白质(例如，血清白蛋白)、核酸、表面活性剂如阳离子表面活性剂(例如，二甲基二(十八烷基)溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、聚乙二醇、粘液溶解剂或其他非粘膜粘附剂。某些试剂，例如环糊精，可与其他分子形成包合复合物，并且可用于形成与另外部分的连接并促进颗粒表面和/或连接的分子或部分的官能化。在一些情况下，表面改变剂可引起表面修饰。表面改变剂可以是PEG，PEG可以是用于脂质体结构中的聚合物。表面修饰可通过修饰互换。在一些情况下，修饰可以指表面修饰。在其他情况下，修饰可以不指表面修饰。
在一些情况下，粘液破坏剂可被递送或可在颗粒上发现。粘液可以是生物凝胶，其包覆通常暴露于外部环境的组织表面，诸如气道、胃肠道、眼睛和生殖道。其可形成捕获或阻止外来体和致病细菌到达潜在的细胞并引起损害或疾病的防御屏障。粘液主要由水(约95％)、糖蛋白(2-5％)、脂质和盐组成。糖基化蛋白质可来自MUC家族。在一些药物施用途径如口、鼻、肺或阴道中，粘液可作为屏障。携带多核酸或其他货物的脂质体结构可能需要特别设计以在经由粘液清除被去除粘膜层之前穿透粘膜层。因此，增强粘膜穿透和渗透对于避免粘膜屏障的捕获和排泄以及充分利用基于纳米颗粒的药物递送的益处是必要的。
粘液破坏剂可以是NSAID，一种针对B-连环蛋白的miRNA，或可已知破坏粘液的试剂。粘液破坏剂可以是表面改变剂。在一些情况下，破坏粘液可以是消除粘液的产生。在其他情况下，破坏粘液可以是减少粘液的产生。例如，减少粘液可意指通过靶向生成粘液的细胞来减少粘液的产生。粘液破坏还可意指调整粘液的稠度。例如，粘液破坏可意指减弱粘液的稠度。
在一些情况下，脂质体结构可包含NSAID。NSAID可以是布洛芬、阿司匹林、酮洛芬、萘普生、依托度酸、非诺洛芬、双氯芬酸、氟比洛芬、酮咯酸、吡罗昔康、吲哚美辛、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普秦、酮洛芬、法莫替丁、甲氯芬那酸、托美丁、双水杨酯或其组合。
在一些情况下，CEQ508，一种用于治疗家族性腺瘤性息肉病(FAP)的RNAi治疗剂，可被包封在脂质体复合物内递送至有需要的受试者。CEQ508可通过利用RNA干扰(tkRNAi)平台起作用。CEQ508可包含减毒细菌，其被工程化以进入发育异常组织并释放短发夹RNA(shRNA)(一种RNAi途径中的介质)的有效载荷。shRNA靶向已知在经典FAP中失调的β-连环蛋白的mRNA。CEQ508可以是施用的治疗，以降低小肠和大肠的上皮细胞中β-连环蛋白的水平。
在一些情况下，纳米颗粒可包覆有或含有聚乙二醇(PEG)。或者，PEG可以是与用于形成纳米颗粒的脂质共价结合(例如，在内部或在一个或两个末端处)的嵌段形式。在特定的实施方案中，纳米颗粒可由含有PEG的嵌段共聚物形成。纳米颗粒还可由含有PEG的嵌段共聚物制备，其中PEG可与基础脂质的末端共价结合。代表性的PEG分子量可包括300Da、600Da、1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、6kDa、8kDa、10kDa、15kDa、20kDa、30kDa、50kDa、100kDa、200kDa、500kDa和1MDa，以及300道尔顿至1MDa范围内的所有值。在一些情况下，PEG可为约2kDa。任何给定分子量的PEG可在其他特性如长度、密度和支化方面有所变化。
可以以任何浓度施加PEG包衣。在一些情况下，脂质与PEG之间的浓度可为5至10％。浓度可为至少5％或至多10％。在一些情况下，浓度可超过10％。浓度可为或可为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或超过10％。在一些实施方案中，可通过由PEG化和非PEG化颗粒的混合物制备纳米颗粒来控制PEG表面密度。例如，通过由聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)的混合物(PLGA-PEG)制备颗粒，可精确地控制纳米颗粒上PEG的表面密度。
在一些情况下，可测量PEG包衣在纳米颗粒上的密度。可使用定量1H核磁共振(NMR)测量纳米颗粒上的表面PEG密度。在一些情况下，密度可为或可为约10至16条PEG链/100nm2。在一些情况下，密度可超过10至16条PEG链/100nm2。该密度阈值可取决于多种因素而变化，该因素包括纳米颗粒的脂质体、粒径和/或PEG的分子量。可施加于脂质体的包衣的密度可基于多种因素而变化，该因素包括表面改变材料和颗粒的组成。在一个实施方案中，如通过1H NMR所测量的表面改变材料如PEG的密度可为或可为约0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10、15、20、25、40、50、60、75、80、90或100条链/nm2。上述范围可包括0.1至100个单位/nm2的所有值。在一些情况下，表面改变材料如PEG的密度可为或可为约1至约25条链/nm2、可为或可为约1至约20条链/nm2、可为或可为约5至约20条链/nm2、可为或可为约5至约18条链/nm2、可为或可为约5至约15条链/nm2或者可为或可为约10至约15条链/nm2。在其他情况下，密度可为或可为约0.05至约0.5条PEG链/nm2。PEG可为10至20条链/100nm2。
表面改变材料如PEG的浓度也可改变。在特定的实施方案中，表面改变材料(例如，PEG)的密度可使得表面改变材料(例如，PEG)采用延伸的刷形构型。在其他实施方案中，表面改变部分的质量可为至少或可为至少约纳米颗粒的质量的1/10,000、1/7500、1/5000、1/4000、1/3400、1/2500、1/2000、1/1500、1/1000、1/750、1/500、1/250、1/200、1/150、1/100、1/75、1/50、1/25、1/20、1/5、1/2或9/10。上述范围可包括从1/10,000至9/10的所有值。
聚合物如PEG或POZ可具有约0.05μg/nm2至约0.25μg/nm2的密度。聚合物的密度还可为约0.01μg/nm2、0.02μg/nm2、0.03μg/nm2、0.04μg/nm2、0.05μg/nm2、0.06μg/nm2、0.07μg/nm2、0.08μg/nm2、0.09μg/nm2、0.1μg/nm2、0.15μg/nm2、0.2μg/nm2、0.25μg/nm2、0.3μg/nm2、0.35μg/nm2、0.4μg/nm2、0.45μg/nm2、0.5μg/nm2、0.55μg/nm2、0.6μg/nm2、0.65μg/nm2、0.7μg/nm2、0.75μg/nm2、0.8μg/nm2、μg/nm2、0.85μg/nm2、0.9μg/nm2、0.95μg/nm2或最大1μg/nm2。在一些实施方案中，关于密度的μg/nm2可以指每nm2脂质体结构或脂质体结构表面的μg聚合物。在一些实施方案中，μg是指微克。在一些实施方案中，nm是指纳米。
在一些情况下，聚合物可以是聚(2-烷基-2-噁唑啉)添加剂。与PEG类似，聚(2-烷基-2-噁唑啉)具有“隐形”性质，是无毒且生物相容的，具有用于进一步官能化的侧基，以及高程度的肾清除率伴随低生物累积。聚(2-烷基-2-噁唑啉)可增加结构的粘膜穿透。在一些情况下，非PEG包覆的结构相对于包覆有PEG的结构可具有增加的粘膜穿透。可通过transwell迁移测定来测量增加的粘膜穿透。可用于测量粘膜穿透的另外的测定可包括多粒子跟踪(MPT)、使用室或其组合。在一些情况下，粘膜穿透测定可使用荧光显微镜检查记录粘液中脂质体结构的动态运输，诸如荧光漂白恢复(FRAP)和多粒子跟踪(MPT)。FRAP可以是荧光标记的脂质体结构暴露于激光束以形成漂浮的白斑。扩散系数可通过荧光强度恢复来获得，该荧光强度恢复导致随后荧光标记的分子扩散到具有脂质体结构流的区域中。
为了更好地理解颗粒的命运以及结果如何在人体中转化，粘膜穿透研究可采用动物模型来研究脂质体结构的治疗作用或药代动力学，其主要包括分离的肠实验、原位实验和体内实验。例如，在粘膜穿透的原位实验中，可从腹腔切除一部分小肠，随后连接两端以制成分离的“环”，并且可将脂质体结构直接注射到环中。在选定的时间段之后，可处死动物并且可以从体腔移除肠环以供进一步的形态学或定量分析。
在一些情况下，包衣可以是肠溶衣。可利用肠溶衣来预防或最小化在胃中的溶解但允许在小肠中溶解。在一些实施方案中，包衣可包括肠溶衣。肠溶衣可以是应用于口服药物的屏障，其防止药物在到达小肠之前释放。延迟释放制剂如肠溶衣可防止施用的药物溶解在胃中而对胃产生刺激作用。此类包衣还用于保护酸不稳定药物免受胃的酸性暴露，而是将它们转移到碱性pH环境(肠的pH为5.5及以上)，在那里它们不会降解。
溶解可发生在器官中。例如，溶解可发生在十二指肠、空肠、髂骨和/或结肠，或其任意组合内。在一些情况下，溶解可发生在十二指肠、空肠、髂骨和/或结肠附近。一些肠溶衣通过呈现在胃中所见的高度酸性pH下稳定但在较低酸性(相对更为碱性)的pH下快速分解的表面而起作用。因此，肠溶衣药丸可不在胃的酸性环境中溶解，但可在小肠中存在的碱性环境中溶解。肠溶衣材料的实例包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、藻酸钠和硬脂酸。
可以以功能浓度施加肠溶衣。肠溶衣可为醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2、聚(丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)7:3:1或其任意组合。可施加约6mg/(cm2)至约12mg/(cm2)的肠溶衣。肠溶衣还可以以约1mg/(cm2)、2mg/(cm2)、3mg/(cm2)、4mg/(cm2)、5mg/(cm2)、6mg/(cm2)、7mg/(cm2)、8mg/(cm2)、9mg/(cm2)、10mg/(cm2)、11mg/(cm2)、12mg/(cm2)、13mg/(cm2)、14mg/(cm2)、15mg/(cm2)、16mg/(cm2)、17mg/(cm2)、18mg/(cm2)、19mg/(cm2)至约20mg/(cm2)施加于结构。
在一些实施方案中，药物组合物可由被设计用于提供延迟释放的多种药物制剂口服施用。延迟口服剂型包括例如片剂、胶囊、囊片，并且还可包括多种可包封或可不包封的颗粒、珠子、粉末或丸剂。片剂和胶囊可代表口服剂型，在这种情况下可使用固体药物载体。在延迟释放制剂中，可将一种或多种屏障包衣施加于丸剂、片剂或胶囊，以促进将药物缓慢溶解并伴随的释放到肠内。通常，屏障包衣可含有一种或多种聚合物，所述聚合物包裹、包围治疗组合物或活性核心或者形成围绕治疗组合物或活性核心的层或膜的。在一些实施方案中，活性剂如多核酸可在制剂中递送，以在施用后的预定时间提供延迟释放。延迟的长度可长达约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时或最长1周。在一些情况下，肠溶衣可不用于包覆颗粒。
在一些情况下，可用于实现肠释放的聚合物或包衣可以是阴离子聚甲基丙烯酸酯(甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯的共聚物)，基于纤维素的聚合物，例如乙酸邻苯二甲酸纤维素)，或聚乙烯基衍生物，例如聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯
取决于多核酸与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可控制多核酸如微环DNA释放的速率。在一些情况下，可通过将多核酸包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储液注射制剂。可注射制剂可是灭菌的，例如，通过细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，该灭菌剂可在使用前即时溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。
纳米颗粒可具有多种形状和横截面几何形状，其可部分取决于用于制备纳米颗粒的方法。在一种情况下，纳米颗粒可具有可以是球状、杆状、管状、薄片状、纤维状、板状、线状、立方状或晶须状的形状。纳米颗粒可包括具有两种或更多种上述形状的颗粒。在另一种情况下，颗粒的横截面几何形状可以是圆形、椭圆形、三角形、矩形或多边形中的一种或多种。在一个实施方案中，纳米颗粒可以是非球形颗粒。例如，纳米颗粒可具有椭球的形式，其可具有不同长度的所有三个主轴，或者可以是旋转的扁圆椭球或长椭球。非球形纳米颗粒备选地可以是层状形式的，其中层状是指其中沿一个轴的最大尺寸可大大小于沿其他两个轴中每个轴的最大尺寸的颗粒。非球形纳米颗粒还可具有金字塔的截头椎体或锥体，或者细长杆的形状。在一个实施方案中，纳米颗粒的形状可以是不规则的。在一个实施方案中，多个纳米颗粒可基本上由球形纳米颗粒组成。
细胞穿透肽
表1：细胞穿透肽：使用单字母代码。L-氨基酸为大写，D-氨基酸为小写。重复在括号中写出。
本文所述的细胞穿透肽可包含表1中所述的一种或多种序列。在一些情况下，细胞穿透肽可具有可含有较高相对丰度的带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸的氨基酸组成。在其他情况下，细胞穿透肽可具有含有极性/带电氨基酸和非极性疏水氨基酸的交替模式的序列。细胞穿透肽可以是聚阳离子或阳离子的。细胞穿透肽可以是两亲性的。细胞穿透肽可具有使质膜移位并促进各种分子货物向靶细胞的细胞质或细胞器的递送的能力。细胞穿透肽可直接穿透细胞膜。细胞穿透肽可使用内吞作用介导的进入来进入细胞内。在一些情况下，细胞穿透肽可使用通过形成瞬时结构的移位。细胞穿通肽可具有氨基酸序列，其具有约5至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸。在一些情况下，细胞穿透肽可具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或最多约99个氨基酸或更多。优选地，细胞穿透肽可包含天然氨基酸、氨基酸衍生物、D-氨基酸、修饰的氨基酸、β-氨基酸衍生物、α,α-二取代的氨基酸衍生物、N-取代的α-氨基酸衍生物、脂肪胺或环胺、氨基和羧基取代的环烷基衍生物、氨基和羧基取代的芳族衍生物、γ-氨基酸衍生物、脂肪族α-氨基酸衍生物、二胺和多胺。进一步修饰的氨基酸是本领域技术人员已知的。
在一些情况下，细胞穿透肽可在其各自的一级氨基酸序列中具有至少25％、至少30％带正电荷的氨基酸残基。如本文所用的术语“带正电荷的氨基酸”可表示特定肽中存在的赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)残基的整体。在某些情况下，所用的肽可在其氨基酸序列中包含约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或最多约35％带正电荷的氨基酸残基。在其他情况下，本文使用的肽可在氨基酸序列中包含至少约35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％带正电荷的氨基酸残基。
多核酸货物
本文公开的可以是携带多核酸的脂质体。多核酸可以是载体。多核酸可以是基于DNA或RNA的。基于DNA的载体可以是非病毒的，并且包括诸如质粒、微环、闭合线性DNA(doggybone)、线性DNA和单链DNA等分子。可存在于脂质-核酸颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文使用的核酸可以是单链DNA或RNA，或者双链DNA或RNA，或者DNA-RNA杂交体。双链DNA的实例包括结构基因、包含控制区和终止区的基因以及自我复制系统如病毒或质粒DNA。双链RNA的实例包括siRNA和其他RNA干扰试剂。单链核酸包括反义寡核苷酸、核酶、微小RNA和形成三链体的寡核苷酸。存在于脂质-核酸颗粒中的核酸可包括以下所述的一种或多种寡核苷酸修饰。核酸可具有各种长度，其通常取决于核酸的特定形式。例如，在特定的实施方案中，质粒或基因的长度可为约1,000至100,000个核苷酸残基。在特定的实施方案中，寡核苷酸的长度可为约10至100个核苷酸。在各个相关的实施方案中，单链、双链和三链寡核苷酸的长度可为约10至约50个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、约20至约30个核苷酸的长度。在特定的实施方案中，寡核苷酸的长度可为约2个核苷酸至10个核苷酸。
基于DNA的载体还可以是病毒的，并且包括腺相关病毒、慢病毒、腺病毒等。载体还可以是RNA。RNA载体可以是未修饰RNA的线性或环状形式。它们还可包括被设计用于增加半衰期、降低免疫原性和/或提高翻译水平的各种核苷酸修饰。如本文所用的载体可由DNA或RNA组成。在一些实施方案中，载体可由DNA组成。载体可以能够在用于生长的原核生物如大肠杆菌(E.Coli)中自主复制。在一些实施方案中，载体可稳定整合到生物体的基因组中。在其他情况下，载体可在细胞质或核中保持分离。在一些实施方案中，载体可含有靶向序列。在一些实施方案中，载体可含有抗生素抗性基因。载体可含有用于调节基因表达的调节元件。在一些情况下，可将微环封闭在脂质体内。
在某些实施方案中，本文描述的可以是用于递送脂质体结构的方法和组合物。脂质体结构可含有治疗性多核酸。多核酸可以是基因、高分子量DNA、质粒DNA、反义寡核苷酸、肽、肽模拟物、核酶、肽核酸、化学剂如化疗分子或者任何大分子，包括但不限于DNA、RNA、病毒颗粒、生长因子、细胞因子、免疫调节剂和其他蛋白质，包括在表达时呈递刺激或抑制免疫系统的抗原的蛋白质。在一些情况下，基因的一部分可由多核酸表达。基因的一部分可以是三个核苷酸直至整个全基因组序列。例如，基因的一部分可以是内源基因组序列的约1％至约100％。基因的一部分可以是基因的全基因组序列的约1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或最多约100％。
由于由载体的细菌区域(即编码细菌复制起点和可在间隔区中编码的选择标记的区域)介导的启动子失活，可降低质粒载体的转基因表达持续时间。这可导致转基因表达的持续时间短。改善转基因表达持续时间的策略可涉及去除质粒的细菌区域。例如，已经开发了不含细菌区域的微环和‘线性最低限度免疫原性定义的基因表达’(MIDGE)载体。去除微环载体中的细菌区域改善了转基因表达持续时间。在微环载体中，真核区聚腺苷酸化信号可与真核区启动子共价连接。该连接(间隔区)可耐受至少500bp的间隔序列，随后体内表达持续时间可用其中细菌区域可被去除或被长度为最多500bp的间隔序列(间隔区)取代的质粒载体来改善。在一些情况下，多核酸可以是微环载体，表3。
微环(MC)DNA可类似于质粒DNA，因为两者都可含有表达盒，其可允许转基因产物在递送后不久以高水平制备。在一些情况下，MC的不同之处可在于MC DNA可以缺乏原核序列元件(例如，细菌复制起点和抗生素抗性基因)。在附加型DNA分离之前，可经由大肠杆菌中的位点特异性重组实现原核序列元件从骨架质粒DNA中的去除。缺乏原核序列元件可减小MC相对于其亲本全长(FL)质粒DNA的大小，这可导致增强的转染效率。结果可能是，当与它们的FL质粒DNA对应物相比时，MC可转染更多细胞并且可允许递送时持续的高水平转基因表达。
在一些情况下，微环DNA可不含细菌复制起点。例如，微环DNA或闭合线性DNA可在约50％的细菌复制起点序列或最多100％的细菌复制起点方面没有细菌复制起点。在一些情况下，细菌复制起点是截短的或无活性的。多核酸可衍生自最初编码细菌复制起点的载体。可利用方法去除整个细菌复制起点或其部分，留下不含细菌复制起点的多核酸。在一些情况下，细菌复制起点可通过其高腺嘌呤和胸腺嘧啶含量来鉴定。
微环DNA载体可以是超螺旋的最小表达盒，通过在大肠杆菌中的体内位点特异性重组衍生自常规质粒DNA，用于非病毒基因治疗和疫苗接种。微环DNA可缺乏或具有减少的细菌骨架序列，如抗生素抗性基因、复制起点和/或细菌DNA内在的炎性序列。除了改善的安全性特征外，微环还可大大提高转基因表达的效率。
脂质体可携带最大超过100％重量的容量：定义为(货物重量/脂质体重量)x 100。货物的最佳负载可为或可为约1％至100％的脂质体结构重量。例如，脂质体结构可含有约1％结构重量至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％或更大的结构重量的多核酸货物。
货物可包括例如小分子药物、肽、蛋白质、抗体、DNA(例如，微环DNA)、双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、RNA(包括shRNA和siRNA，其还可由作为货物掺入脂质体内的质粒DNA表达)、荧光染料(包括荧光染料肽，其可由掺入脂质体内的DNA表达)或其任意组合。
在一些情况下，多核酸可编码异源序列。异源序列可提供亚细胞定位(例如，用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)；用于靶向线粒体的线粒体定位信号；用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号；ER保留信号；等等)。在一些情况下，多核酸如微环DNA或闭合线性DNA可包含核定位序列(NLS)。
在一些实施方案中，载体编码蛋白质如APC。载体可包含一个或多个核定位序列(NLS)。NLS序列的数目可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，载体包含在氨基末端处或其附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS、在羧基末端处或其附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS或这些的组合(例如，在氨基末端处的一个或多个NLS和在羧基末端处的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，可彼此独立地选择每个NLS，使得单个NLS可存在于多于一个拷贝中和/或与一个或多个拷贝中存在的一个或多个其他NLS组合。
NLS的非限制性实例可包括衍生自以下的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，具有氨基酸序列PKKKRKV；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK的核质蛋白二分体NLS)；c-myc NLS，具有氨基酸序列PAAKRVKLD或RQRRNELKRSP；hRNPA1M9NLS，具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP和PPKKARED；人p53的序列POPKKKPL；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP；流感病毒NS1的序列DRLRR和PKQKKRK；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK；以及类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK。通常，一个或多个NLS可具有足够的强度以驱动微环DNA载体或短线性DNA载体以可检测的量在真核细胞的细胞核中累积。真核细胞可以是人肠隐窝细胞。
可通过任何合适的技术进行核中的累积的检测。例如，可检测标志物可与载体融合，使得细胞内的位置可被可视化，诸如与用于检测核位置的手段(例如，对核具有特异性的染色剂，如DAPI)组合。细胞核还可从细胞分离，然后可通过任何合适的用于检测蛋白质的方法分析其内容物，该方法诸如免疫组织化学、Western印迹或酶活性测定。本文中的实施方案可展现出脂质体货物进入靶位点的时间依赖性pH触发的释放。本文中的实施方案可包含并提供复杂的多种货物的细胞递送。另外的货物可以是小分子、抗体、抑制剂如DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂。
在一些情况下，颗粒可含有DNA酶抑制剂。DNA酶抑制剂可定位在颗粒内或颗粒上。在其他情况下，编码抑制剂的多核酸可封闭在颗粒内。在其他情况下，抑制剂可以是DNA甲基转移酶抑制剂，如DNA甲基转移酶抑制剂-2(DMI-2)。DMI-2可由链霉菌属(Streptomyces)物种菌株560号产生。DMI-2的结构可以是4″′R,6aR,10S,10aS-8-乙酰基-6a,10a-二羟基-2-甲氧基-12-甲基-10-[4′-[3″-羟基-3″,5″-二甲基-4″(Z-2′″,4″′-二甲基-2′″-庚烯酰氧基)四氢吡喃-l″-基氧基]-5′-甲基环己烷-l′-基氧基]-1,4,6,7,9-五氧代-l,4,6,6a,7,8,9,10,10a,11-十氢化并四苯。其他抑制剂如氯喹也可封闭在颗粒内或颗粒上，诸如在颗粒表面上。
可将多核酸递送至肠道细胞。例如，多核酸可通过脂质体递送至肠隐窝干细胞。例如，递送的多核酸可：(1)通常不存在于肠上皮干细胞中；(2)通常存在于肠上皮干细胞中，但不以生理上显著的水平表达；(3)通常存在于肠上皮干细胞中，并且通常在干细胞或其后代中以生理期望水平表达；(4)任何其他可被修饰以在肠上皮干细胞中表达的DNA；(5)上述的任何组合。
可将多种蛋白质和多肽递送至肠隐窝干细胞，包括用于治疗代谢病症和内分泌病症的蛋白质。蛋白质的实例是苯丙氨酸羟化酶、胰岛素、抗利尿激素和生长激素。病症包括苯丙酮尿症、糖尿病、有机酸尿症、酪氨酸血症、尿素循环障碍、家族性高胆固醇血症。可将能够校正苯丙酮尿症、糖尿病、有机酸尿症、酪氨酸血症、尿素循环障碍、家族性高胆固醇血症中的缺陷的任何蛋白质或肽的基因引入干细胞中，使得该蛋白质或肽产物由肠上皮表达。同样地，可在肠上皮中产生凝血因子如抗血友病因子(因子8)、克里斯马斯因子(因子9)和因子7。可用于治疗循环蛋白缺乏的蛋白质也可在肠上皮中表达。可用于治疗循环蛋白缺乏的蛋白质可以是例如用于治疗白蛋白血症的白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、激素结合蛋白。另外，可通过将正常囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的基因插入肠上皮的干细胞中来治疗囊性纤维化的肠症状。可通过插入载脂蛋白B来治疗无β脂蛋白血症。可通过插入蔗糖酶-异麦芽糖、乳糖酶-根皮苷水解酶和麦芽糖酶-葡糖淀粉酶来治疗二糖酶不耐受。可将用于吸收维生素B12的内因子的插入物或用于吸收维生素B12的内因子/钴胺素复合物的受体以及胆汁酸的转运蛋白插入肠上皮中。此外，可由核酸编码的任何药物都可插入肠上皮的干细胞中，从而以局部高浓度进行分泌，以供治疗癌症。在这方面，本领域技术人员将容易认识到，反义RNA可在产生反义后编码到干细胞中，该反义可掺入癌细胞中以供治疗癌症。
在一些情况下，可测量和量化由包含在脂质体结构内的多核酸编码的蛋白质。在一些情况下，可分离修饰的细胞并对修饰的细胞进行western印迹以确定与未修饰的细胞相比蛋白质产生的存在和相对量。在其他情况下，可进行利用流式细胞术的蛋白质的细胞内染色以确定蛋白质产生的存在和相对量。还可进行另外的测定以确定蛋白质如APC是否是功能性的。例如，可测量表达APC转基因的修饰细胞的细胞溶质β-连环蛋白表达，并与未修饰的细胞进行比较。与未修饰的细胞相比，修饰细胞的胞质溶胶中β-连环蛋白的表达降低可指示功能性APC转基因。在其他情况下，可利用FAP的鼠模型来确定编码APC蛋白的转基因的功能。例如，具有FAP的小鼠可以用编码APC的修饰细胞处理，并且相对于未处理小鼠测量FAP疾病的减少。
在一些情况下，脂质体货物可不限于多核酸。本文公开的可以是在其中包封有、在其中分散有和/或与一种或多种治疗剂或药物的表面共价或非共价相关联的纳米颗粒。治疗剂或药物可以是小分子、蛋白质、多糖或糖、核酸分子、脂质、肽模拟物或其组合。脂质体结构可包含能够对细胞、组织、器官或受试者发挥期望作用的任何分子或化合物。例如，此类作用可以是生物的、生理的或美容的。分子或化合物可包括例如核酸、肽和多肽，包括例如抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；人源化抗体、重组抗体、重组人抗体和PrimatizedTM抗体、细胞因子、生长因子、凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体及其配体；激素；以及小分子，包括小有机分子或化合物。在一个实施方案中，分子或化合物可以是治疗剂或者其盐或衍生物。治疗剂衍生物本身可以是治疗活性的，或者它们可以是前药，其在进一步修饰后变得有活性。因此，在一个实施方案中，与未修饰的药剂相比，分子或化合物衍生物可保留一些或所有治疗活性，而在另一个实施方案中，治疗剂衍生物缺乏治疗活性。
在各个实施方案中，治疗剂包括任何治疗上有效的药剂或药物，诸如抗炎化合物、抗抑郁药、兴奋剂、镇痛药、抗生素、避孕药、解热药、血管舒张药、抗血管生成药、细胞血管药、信号转导抑制剂、心血管药物例如抗心律失常剂、血管收缩药、激素和类固醇。在某些实施方案中、分子或化合物可以是肿瘤学药物，其还可称为抗肿瘤药、抗癌药、肿瘤药、抗肿瘤剂等。可使用的肿瘤学药物的实例包括但不限于阿霉素、alkeran、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、araC、三氧化二砷、硫唑嘌呤、贝沙罗汀、biCNU、博来霉素、静脉白消安、口服白消安、卡培他滨(Xeloda)、卡铂、卡莫司汀、CCNU、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环孢菌素A、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、柔红霉素、环磷酰胺、柔红霉素、地塞米松、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星、DTIC、表柔比星、雌莫司汀、磷酸依托泊苷、依托泊苷和VP-16、依西美坦、FK506、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、吉西他滨(Gemzar)、吉妥珠单抗(gemtuzumab-ozogamicin)、醋酸戈舍瑞林、羟基脲(hydrea)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素、伊立替康(Camptostar、CPT-111)、来曲唑、亚叶酸、leustatin、亮丙瑞林、左旋咪唑、阿利维A酸(litretinoin)、甲地孕酮、美法仑、L-PAM、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇、帕米膦酸、聚乙二醇-腺苷脱氨酶、喷司他丁、卟吩姆钠、泼尼松、利妥昔单抗、链佐星、STI-571、他莫昔芬、泰索帝、替莫唑胺、替尼泊苷、VM-26、拓扑替康(Hycarntin)、托瑞米芬、维A酸、ATRA、戊柔比星、velban、长春碱、长春新碱、VP16和长春瑞滨。可使用的肿瘤学药物的其他实例是玫瑰树碱和玫瑰树碱类似物或衍生物、埃博霉素、细胞内激酶抑制剂和喜树碱。
在某些实施方案中，脂质体结构可包含可进一步连接至可检测标记物(例如，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)的显像剂。活性部分可以是放射性剂，诸如：放射性重金属如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体，43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。包含这样的部分的脂质体结构可用作显像剂，并且可以以对于哺乳动物如人的诊断用途有效的量施用。以这种方式，可检测显像剂的定位和累积。可通过放射性闪烁照相术、核磁共振成像、计算机断层扫描或正电子发射断层扫描来检测显像剂的定位和累积。如对于本领域技术人员将显而易见，待施用的放射性同位素的量取决于放射性同位素。本领域普通技术人员可基于用作活性部分的给定放射性核素的比活度和能量，容易地配制待施用的显像剂的量。通常可施用每剂量显像剂0.1-100毫居里、1-10毫居里和2-5毫居里。因此，可用作显像剂的组合物可包含与放射性部分缀合的靶向部分，该放射性部分可包含0.1-100毫居里，在一些实施方案中优选1-10毫居里，在一些实施方案中优选2-5毫居里，在一些实施方案中更优选1-5毫居里。用于检测标记物的检测手段取决于所用标记物的性质和所用生物样品的性质，并且还可包括荧光偏振、高效液相色谱、抗体捕获、凝胶电泳、示差沉淀、有机萃取、尺寸排阻色谱、荧光显微镜检查或荧光激活细胞分选(FACS)测定。靶向部分还可以指蛋白质、核酸、核酸类似物、碳水化合物或小分子。实体可以是例如治疗性化合物如小分子，或诊断实体如可检测标记物。场所可以是组织、特定细胞类型或亚细胞区室。在一个实施方案中，靶向部分可指导活性实体的定位。活性实体可以是小分子、蛋白质、聚合物或金属。活性实体如包含核酸的脂质体可用于治疗、预防或诊断目的。在一些情况下，部分可允许脂质体结构穿透血脑屏障。
在其他情况下，可采用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)。可对5mm或更小的切片厚度进行CT。如果CT扫描具有大于5mm的切片厚度，则可测量病变的最小尺寸应为切片厚度的两倍。在一些情况下，可使用FDG-PET扫描。FDG-PET可用于评估新病变。基线时阴性FDG-PET且随访时阳性FDG-PET是基于新病变的疾病进展(PD)的指征。基线时没有FDG-PET且随访时阳性FDG-PET：如果随访时阳性FDG-PET对应于由CT证实的新疾病部位，则为PD。如果随访时阳性PDG-PET对应于CT上预先存在的疾病部位，其在解剖学想象的基础上可能不是进行性的，则这可能不是PD。在一些情况下，在认为残留的放射照相异常代表纤维化或瘢痕形成的情况下，FDG-PET可用于以类似于活组织检查的方式升级对CR的反应。阳性FDG-PET扫描病变意指在衰减校正图像上具有比周围组织大两倍的摄取的FDG狂热病变。
在一些情况下，可进行病变的评估。完全反应(CR)可以是所有靶病变的消失。任何病理性淋巴结(靶标或非靶标)的短轴可减小至小于10mm。部分反应(PR)可以是以靶直径的基线总和作为参考，靶病变直径的总和减小至少30％。疾病进展(PD)可以是以最小总和作为参考，靶病变直径的总和增大至少20％。除了相对增大20％之外，总和还必须展示绝对增大至少5mm。疾病稳定(SD)可以是以直径的最小总和作为参考，既不能充分收缩至PR的质量，也不能充分提高至PD的质量。
在一些情况下，可评估非靶病变。非靶病变的完全反应可以是肿瘤标志物水平的消失和正常化。所有淋巴结的大小必须是非病理性的(短轴小于10mm)。如果肿瘤标志物最初高于正常上限，则它们对于患者必须正常化以被认为是完全临床反应。非CR/非PD是一种或多种非靶病变的持续和/或肿瘤标志物水平维持高于正常限度。疾病进展可以是一种或多种新病变的出现和/或现有非靶病变的明确进展。明确进展通常不应超过靶病变状态。
在一些情况下，最佳总体反应可以是从治疗开始直至疾病进展/复发记录的最佳反应。
药物组合物和制剂
全文所述的组合物可被配制成制药学药物，并用于治疗被诊断患有疾病例如家族性腺瘤性息肉病(FAP)的有需要的人或哺乳动物。药物可与任何其他治疗共同施用。
可用脂质体结构治疗的疾病可以是癌性的或非癌性的。疾病可以是家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、癌症、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病、回肠克罗恩病或其任意组合。在一些情况下，可通过遗传筛查鉴定疾病。例如，遗传筛查可鉴定受试者中的BCRA突变，该突变可使其易患乳腺癌。在其他情况下，遗传筛查可鉴定APC基因中可导致FAP的突变。疾病还可以是心血管疾病、神经变性疾病、眼部疾病、生殖疾病、胃肠疾病、脑疾病、皮肤疾病、骨骼疾病、肌肉骨骼疾病、肺疾病、胸部疾病等等。疾病可以是遗传疾病，如囊性纤维化、泰-萨克斯(Tay-Sachs)病、脆性X综合征、亨廷顿病、神经纤维瘤病、镰状细胞、地中海贫血、迪谢内(Duchenne)肌营养不良或其组合。疾病可在胃肠道中产生息肉。在一些情况下，疾病是FAP。FAP可发展成癌症。胃肠疾病可以是遗传性的。例如，遗传性胃肠疾病可以是日尔贝(Gilbert)综合征、毛细血管扩张、黏多糖贮积症(mucopolysaccaride)、奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)综合征、胰腺炎、角化棘皮瘤、胆道闭锁、莫尔基奥(Morquio)综合征、胡尔勒(Hurler)综合征、亨特(Hunter)综合征、克-纳(Crigler-Najjar)综合征、罗托(Rotor)综合征、波伊茨-耶格(Peutz-Jeghers)综合征、杜宾-约翰逊(Dubin-Johnson)综合征、骨软骨病(Osteochondroses)、骨软骨发育不良、息肉病或其组合。
对于口服给药，赋形剂可包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。如果需要，脂质体组合物还可含有少量无毒辅助物质，如润湿剂、乳化剂或缓冲液。
组合物可口服、通过皮下或其他注射、静脉内、脑内、肌肉内、肠胃外、经皮、经鼻或直肠施用。化合物或组合物施用的形式至少部分取决于施用化合物的途径。在一些情况下，脂质体组合物可以以固体制剂的形式使用以供口服给药；制剂可以是片剂、颗粒、粉末、胶囊等。在片剂制剂中，组合物通常与添加剂一起配制，该添加剂例如，赋形剂如糖或纤维素制剂、粘合剂如淀粉糊或甲基纤维素、填充剂、崩解剂和通常用于制造医学制剂的其他添加剂。用于制备此类剂型的方法对于本领域技术人员是显而易见的。待施用的脂质体组合物可含有一定量的药学上有效量的纳米颗粒，以供在生物系统(包括患者或受试者)的治疗用途。药物组合物可每日施用或根据需要施用。在某些实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前施用于受试者。在一些实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前立即施用。在一些实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前约两小时内施用，优选在就寝时间之前约一小时内施用。在另一个实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前约两小时施用。在进一步的实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前至少两小时施用。在另一个实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前约一小时施用。在进一步的实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前至少一小时施用。在更进一步的实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前小于一小时施用。在更进一步的实施方案中，药物组合物可在就寝时间之前立即施用。药物组合物口服或直肠施用。
组合物中活性剂的适当剂量(“治疗有效量”)可取决于例如病况的严重程度和病程、给药模式、特定药剂的生物利用度、受试者的年龄和体重、受试者的临床病史和对活性剂的反应、医师的判断或其任意组合。待施用于受试者的组合物中的活性剂的治疗有效量可为约100μg/kg体重/天至约1000mg/kg体重/天的范围，无论是通过一次施用还是多次施用。在一些实施方案中，每日施用的每种活性剂的范围可为约100μg/kg体重/天至约50mg/kg体重/天、100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、500μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、500μg/kg体重/天至约50mg/kg体重/天、500μg/kg体重/天至约5mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至约50mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、5mg/kg体重/剂量至约100mg/kg体重/天、5mg/kg体重/剂量至约50mg/kg体重/天、10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天和10mg/kg体重/天至约50mg/kg体重/天。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、甜味剂、盐、缓冲液等。药学上可接受的载体可由多种材料制备，包括但不限于调味剂、甜味剂和混杂材料，诸如为了制备特定治疗组合物可能需要的缓冲液和吸收剂。
脂质体复合物可在给药前的合理时间内在无菌条件下配制。在一些情况下，还可施用二次治疗。例如，可在复合物给药之前或之后施用另一种疗法，如化学疗法或放射疗法，例如在12小时至7天内。除了复合物的给药外，可采用诸如化学疗法和放射疗法的治疗组合。
可与所公开的结构联合使用的化学治疗剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。化学治疗剂还可包括长春新碱、长春碱、长春地辛和NavelbineTM(长春瑞滨，5'-去甲脱水长春碱)。在其他情况下，化学治疗剂包括拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物。如本文所用，“喜树碱化合物”包括CamptosarTM(盐酸伊立替康)、HycamtinTM(盐酸拓扑替康)和衍生自喜树碱的其他化合物及其类似物。可用于本文公开的方法和组合物的另一类别的化学治疗剂可以是鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷、替尼泊苷和米托肼。本公开内容进一步包括称为烷化剂的其他化学治疗剂，其将肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。化学治疗剂包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、尿嘧啶氮芥、chlomaphazin和达卡巴嗪。本公开内容包括抗代谢药作为化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。可用于本文公开的方法和组合物的另一类别的癌症化学治疗剂包括抗生素。实例包括但不限于多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。本公开内容进一步包括用于治疗疾病的其他癌症化学治疗剂或药剂，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮胞苷、安吖啶、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。化学治疗剂可用于治疗疾病，如癌症或非癌症疾病。非癌症疾病可以是FAP。癌症可以是结直肠癌。
本文中所公开的结构可与其他化学治疗剂，包括细胞毒性剂/抗肿瘤剂和抗血管生成剂联合施用。细胞毒性剂/抗肿瘤剂可被定义为攻击并杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、尿嘧啶氮芥、chlomaphazin和达卡巴嗪。其他细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是肿瘤细胞的抗代谢药，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是抗生素，例如多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在这些化合物的可商购获得的多种脂质体制剂。其他细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些抑制剂包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。各种细胞毒性剂/抗肿瘤剂包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
还可使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他的血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑制素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)。还可使用小分子，包括拓扑异构酶如雷佐生、具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
可与所公开的结构联合使用的其他药剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；安维汀(avastin)；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；甲硫酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋林；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫卟吩；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药包括但不限于：20-epi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogeneticprotein-1)；抗雄激素；前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮络氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢扑酚；苯甲酰基星状孢菌素；β-内酰胺衍生物；β-alethine；βclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；双曲群A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢泰素；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA(duocarmycin SA)；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度(flavopiridol)；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘代多柔比星；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；加斯普拉诺利得(jasplakinolide)；卡哈拉里德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；雷波斯他汀；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦辛；曼诺他汀A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；阿伏瑞林；蛋氨酸酶(methioninase)；胃复安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福星；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥子抗癌剂；印度洋海绵B(mycaperoxideB)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；泊泽尼普定；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；喷曲唑；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；紫菜霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白质A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；甲氧基吡唑啉吖啶；吡哆基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸盐；根霉素；核糖酶；RII异维A酰胺(RII retinamide)；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑素1(spongistatin1)；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；斯蒂酰胺(stipiamide)；溶基质蛋白酶抑制剂；索菲欣(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基锡初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯化二茂钛(titanocene bichloride)；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西瑞宾；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统；红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；威科萨汀(vinxaltine)；vitaxin；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；和净司他丁斯酯。在一个实施方案中，抗癌药物可以是5-氟尿嘧啶、泰素或亚叶酸。在进一步的实施方案中，结构可与化学疗法、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体治疗、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射联合使用。这些药物可抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和F 506)或抑制可对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。
使用方法
诊断方法的备选方案可用于监测患者的家族性腺瘤性息肉病(FAP)或其他疾病状态的治疗。可向患者施用有效量的纳米颗粒，并且诊断方法可包括确定掺入细胞基因组中的APC的水平，随之患者中的治疗开始之前和治疗期间和/或之后的APC水平的差异将证明治疗对患者的有效性，包括患者是否已完成治疗或者疾病状态是否已被抑制或消除。在其他情况下，可将用于通过脂质体递送的基因作为预防措施施用于受试者。例如，受试者可未诊断出疾病并且可能看起来易患疾病如癌症。在一些情况下，癌症可以是结肠癌。
在一些情况下，可用包含多核酸的结构靶向的细胞可以是上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其他肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血细胞、血液前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原始干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星形细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、枯否细胞、平滑肌细胞、施旺细胞(Schwanncell)和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、睾丸间质细胞、管周细胞、塞托利细胞(sertoli cell)、黄体细胞、宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、滤泡细胞、黏液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。此外，所述一种或多种细胞可以是胰岛细胞和/或细胞簇等，包括但不限于胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞(例如，PP细胞)或胰腺ε细胞。细胞可以是胰腺α细胞。在另一种情况下，细胞可以是肠隐窝细胞。
在一些情况下，可对与可通过结构递送的多核酸接触的细胞进行遗传修饰。例如，多核酸可转导其接触的细胞。例如，用本文所述的多核酸转导的效率可为或可为约接触的细胞的总数目的20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或多于99.9％。
例如，结构如脂质体可在引入有需要的受试者后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100天是功能性的。结构可在引入受试者后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月是功能性的。结构如脂质体可在引入受试者后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30年是功能性的。在一些情况下，脂质体可在最长接受者的一生中是功能性的。此外，结构如脂质体可发挥其正常预期操作的100％。脂质体还可发挥其正常预期操作的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。脂质体的功能可以指递送效率、脂质体的持久性、脂质体的稳定性或其任意组合。
脂质体或脂质体结构还可发挥其正常预期操作的大于100％。例如，脂质体可发挥其正常预期操作的110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。功能可包括预期用途。例如，功能性脂质体可将货物如微环DNA载体递送至靶细胞。在一些情况下，功能可包括从脂质体接收微环DNA载体的细胞的百分比。在其他情况下，功能可以指从多核酸生成蛋白质的频率或效率。例如，脂质体可将载体递送至编码基因如APC的至少一部分的细胞。从载体生成APC的效率的频率可描述载体或脂质体的功能性。
微环载体浓度可为0.5纳克至50微克。微环载体浓度可为约0.5ng、1ng、2ng、5ng、10ng、50ng、100ng、150ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1000ng、1μg、2μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg或最高50μg或更高。在一些情况下，可通过结构引入细胞的核酸(例如，ssDNA、dsDNA、RNA)的量可有所改变，以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，可将少于约100皮克的核酸引入受试者。在一些情况下，可将至少约100皮克、至少约200皮克、至少约300皮克、至少约400皮克、至少约500皮克、至少约600皮克、至少约700皮克、至少约800皮克、至少约900皮克、至少约1微克、至少约1.5微克、至少约2微克、至少约2.5微克、至少约3微克、至少约3.5微克、至少约4微克、至少约4.5微克、至少约5微克、至少约5.5微克、至少约6微克、至少约6.5微克、至少约7微克、至少约7.5微克、至少约8微克、至少约8.5微克、至少约9微克、至少约9.5微克、至少约10微克、至少约11微克、至少约12微克、至少约13微克、至少约14微克、至少约15微克、至少约20微克、至少约25微克、至少约30微克、至少约35微克、至少约40微克、至少约45微克或至少约50微克的核酸添加至每个细胞样品(例如，被电穿孔的一个或多个细胞)。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的核酸(例如，dsDNA)的量可对细胞类型具有特异性。
在一些情况下，结构的有效量可意指足以提高可在治疗之前在受试者中降低的至少一种基因的表达水平的量，或者足以缓解癌症的一种或多种症状的量。例如，有效量可以是与参考值或未经任何化合物治疗的表达水平相比，足以将选自胃肠分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤抑制基因的至少一种基因的表达水平提高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多的量。
在一些实施方案中，有效量意指足以降低可在治疗之前在受试者中提高的至少一种基因的表达水平的量，或者足以缓解癌症的一种或多种症状的量。例如，有效量可以是与参考值或未经任何化合物治疗的表达水平相比，足以将选自hedgehog途径基因、MYC和EZH2的至少一种基因的表达水平降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多的量。
本文公开的方法可以是通过以下确定有需要的受试者中的癌症治疗功效的方法：(a)测量从受试者获得的样品中至少一种基因的表达水平，(b)将步骤(a)中至少一种基因的表达水平与参考值或先前测量值进行比较，以及(c)基于比较步骤确定癌症治疗的功效。例如，当测试受试者在以下情况下至少一种基因的表达增加时，治疗可以是有效的：1)与参考值或先前测量值相比；或2)在所监测的时间段期间，如1、2、3、4、5、6或7天，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间。当现有治疗可能无效时，应针对测试受试者寻求新的治疗或现有治疗的剂量增加(例如，增加施用于受试者的结构的剂量)。在其他情况下，可进行更频繁的施用。
针对受试者的有效量将取决于受试者的体重、尺码和健康；病况的性质和程度；以及被选择进行施用的治疗剂。对于给定情况的有效量可通过常规实验来确定，该常规实验可在临床医师的技能和判断范围内。如本文所用，有效量可以指足以产生可测量的生物反应(例如，细胞中APC的存在)的纳米结构的量。纳米结构的实际剂量水平可有所改变，以便施用一定量的抗氧化剂分子，该抗氧化剂分子可有效地实现针对特定受试者和/或应用的期望反应。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所处理的组织的类型、所使用的细胞和凝胶珠的类型、与其他药物或治疗的联合、所治疗的病况的严重程度以及所治疗的受试者的身体状况和既往病史。优选地，可施用最小剂量，并且可以在没有剂量限制性毒性的情况下将剂量提升至最小有效量。
在一些情况下，可常规施用结构。常规施用可包括向受试者每小时、每日、每月或每年施用结构。例如，在一些情况下，可在受试者的整个生命期间向受试者每日施用结构。在其他情况下，可在受试者中疾病存在的持续时间内每日施用结构。可向受试者施用包含多核酸的结构以治疗疾病或病症，直至疾病或病症得以减少、控制或消除。疾病控制可包括疾病的稳定。例如，被控制的癌症可具有停止的生长或扩散，如通过CT扫描所测量的。癌症可以是结肠癌。在其他情况下，可预防性施用结构。在一些情况下，受试者可已经历了遗传筛查，其将受试者鉴定为易患癌症，如结肠癌。在这种情况下，易感受试者可通过接受包含多核酸的结构开始预防性治疗。在受试者包含使受试者易患结肠癌的遗传突变的情况下，该受试者可用包含编码APC基因的至少一部分的多核酸的结构开始预防性治疗。
在一些情况下，预防性治疗可预防疾病，如癌症。当预防可涉及病况如局部复发(例如，疼痛)、疾病如癌症、综合征如心力衰竭或任何其他医学病况而使用时，预防可包括施用组合物，相对于未接受该组合物的受试者，该组合物减少受试者中的医学病况的症状的频率或延迟其发作。因此，预防癌症包括，例如，相对于未经治疗的对照群体，减少接受预防性治疗的患者群体，的可检测的癌性生长的数目，以及/或者相比于未经治疗的对照群体，延迟经治疗的群体的可检测的癌性生长的出现，该减少或延迟例如，通过统计上和/或临床上显著的量。预防感染包括，例如，相比于未经治疗的对照群体，减少经治疗的群体的感染诊断的数目，以及/或者相比于未经治疗的对照群体，延迟经治疗的群体的感染症状的发作。预防疼痛包括，例如，相比于未经治疗的对照群体，减少经治疗的群体中的受试者经历的疼痛感的量级，或者延迟该疼痛感。
多核酸可编码肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因通常可编码可以以某种方式抑制细胞增殖的蛋白质。这些“制动器”中的一个或多个的丧失可有助于癌症的发生。五大类蛋白质通常可被认为是由肿瘤抑制基因编码：细胞内蛋白，如p16细胞周期蛋白激酶抑制剂，其可调节或抑制通过细胞周期的特定阶段的进展；针对于分泌的激素的受体(例如，肿瘤衍生生长因子β)，其可起到抑制细胞增殖的作用；检查点控制蛋白，其在DNA可能受损或染色体异常的情况下阻止细胞周期；可促进细胞凋亡的蛋白质；参与DNA修复的酶；或其组合。尽管DNA修复酶可不直接起到抑制细胞增殖的作用，但是已经失去修复DNA的错误、间隙或断端的能力的细胞在包括对控制细胞生长和增殖至关重要的基因在内的许多基因中积累突变。因此，编码DNA修复酶的基因的功能丧失突变可促进其他肿瘤抑制基因的失活以及癌基因的活化。由于肿瘤抑制基因的一个拷贝通常足以控制细胞增殖，因此为了促进肿瘤发生，肿瘤抑制基因的两个等位基因必须都得以丧失或失活。因此，肿瘤抑制基因中的致癌功能丧失突变隐性地起作用。许多癌症中的肿瘤抑制基因具有阻止任何蛋白质产生或导致非功能性蛋白质产生的缺失或点突变。在一些情况下，引入编码蛋白质的肿瘤抑制基因可在受试者中改善疾病、预防疾病或治疗疾病。
在一些情况下，遗传肿瘤抑制基因APC的突变等位基因的受试者可具有发生结肠癌的高风险。遗传另一个肿瘤抑制基因的一个突变等位基因使受试者将会发生特定肿瘤的概率提高到几乎100％。在一些情况下，遗传了APC或肿瘤抑制基因的突变等位基因的受试者可接受本文所述的结构。在一些情况下，结构可含有编码由受试者遗传的突变等位基因产生的蛋白质的多核酸。突变等位基因可以是肿瘤抑制蛋白，如APC。蛋白质还可以是GLB1、DEFA5、WAC、DEFA6或其组合。可递送另外的肿瘤抑制基因。在一些情况下，肿瘤抑制因子可以是具有卷曲螺旋的含WW结构域的衔接子(WAC)基因。
具有功能丧失突变的基因列表很大—数百个。在一些情况下，可使用网站，如范德比尔特大学医学中心生物信息学和系统医学实验室(the Bioinformatics and SystemsMedicine Laboratory of Vanderbilt University Medical Center)，TS基因肿瘤抑制基因数据库http://bioinfb.mc.vanderbiit.edu/TSGene/index.html。包含716个人基因(637个编码基因和79个非编码基因)、628个小鼠基因和567个大鼠基因的数据库可用于鉴定由本文所述的结构引入的基因。本公开内容的结构可包含所述基因。在一些情况下，可利用结构来运输基因，该基因的功能丧失突变可导致新生肿瘤(neoplasm)或肿瘤生长或癌症；并且本领域技术人员很好地理解癌症中的功能丧失突变(以及癌症中的功能获得突变，并且本公开内容可类似地适用于此类突变)。术语"肿瘤抑制因子"在本文中如本领域所理解的那样使用，即包括新生肿瘤或肿瘤生长或癌症之中的，或参与其，或导致其，或有助于其，或是其因素的功能丧失突变，该新生肿瘤或肿瘤生长或癌症包括肿瘤形成和/或扩散和/或增生(改变的细胞以不受控制的方式分裂，从而导致组织区域中的细胞过量)和/或发育异常(增生细胞中另外的遗传变化导致逐渐增加的异常生长；细胞和组织看起来不再正常；细胞和组织可变得紊乱)和/或原位癌(另外的变化使细胞和组织出现更多异常细胞，扩散到更大的区域，并且所涉及的组织区域主要包含改变的细胞；细胞通常'退化'或其能力变得更加原始，例如，肝细胞不再产生肝脏特异性蛋白；细胞可以是去分化的或间变性的以及/或者'良性肿瘤'以及/或者癌症(包括恶性肿瘤))。待靶向的基因的实例包括编码涉及肿瘤抑制的蛋白质的基因或任何肿瘤抑制基因，如该术语在本文所用，包括例如，涉及“功能丧失”的TS基因肿瘤抑制基因数据库的任何基因，或可以是与本公开内容中该术语的使用一致的肿瘤抑制基因。
可通过结构如脂质体递送的肿瘤抑制基因可以是APC、ARHGEF12、ATM、BCL11B、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、CARS、CBFA2T3、CDH1、CDH11、CDK6、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CREB1、CREBBP、CYLD、DDX5、EXT1、EXT2、FBXW7、FH、FLT3、FOXP1、GPC3、IDH1、IL2、JAK2、MAP2K4、MDM4、MEN1、MLH1、MSH2、NF1、NF2、NOTCH1、NPM1、NR4A3、NUP98、PALB2、PML、PTEN、RB1、RUNX1、SDHB、SDHD、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、VHL、WRN、WT1及其任意组合。可递送的基因可为或可为约与SEQ ID NO:761至SEQ IDNO:764中的任一个50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或最多约100％同源的基因。
表2：用于递送的基因的总结
合适的制剂可包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、杀菌抗生素以及使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。合适的惰性载体可包括糖，如乳糖。在一些情况下，组合物可采取诸如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，以供在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构建。
载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油如植物油(例如，花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合。例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。在许多情况下，将优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。作为游离酸或碱或者其药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液和分散体可在水或其他溶剂或分散介质中与一种或多种药学上可接受的赋形剂合适地混合来制备，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂及其组合。合适的表面活性剂可以是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的实例包括钠型、钾型、铵型的长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如双-(2-乙硫基)-磺基琥珀酸钠；以及烷基硫酸盐，如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂酰二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰油胺。非离子表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油基-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰基单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛油基酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性乙酸酯(myristoamphoacetate)、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可含有抗氧化剂以防止活性剂降解。在重构时通常将制剂缓冲至pH为3-8以供肠胃外给药。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。水溶性聚合物通常可用于制剂中以供肠胃外给药。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与上文所列的一种或多种赋形剂一起掺入适当的溶剂或分散介质中，然后过滤灭菌来制备。通常，可通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外期望成分的粉末。粉末可以以颗粒本质上是多孔的方式制备，这可增加颗粒的溶解。用于制备多孔颗粒的方法是本领域公知的。
制剂可以是眼部制剂或局部形式。用于眼部给药的药物制剂可以是由一种或多种聚合物-药物缀合物形成的无菌水溶液或颗粒的悬浮液的形式。可接受的溶剂包括例如水、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和等渗氯化钠溶液。制剂还可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂如1,3-丁二醇中的无菌溶液、悬浮液或乳液。在其他实施方案中，脂质体可被配制用于局部施用于粘膜。用于局部施用的合适剂型包括乳膏、软膏、油膏、喷雾剂、凝胶、洗液、乳液、液体和经皮贴剂。制剂可被配制用于经粘膜、经上皮、经内皮或经皮给药。组合物含有一种或多种化学穿透促进剂、膜渗透剂、膜转运剂、润肤剂、表面活性剂、稳定剂及其组合。在一些实施方案中，脂质体可作为液体制剂如溶液或悬浮液、半固体制剂如洗液或软膏或者固体制剂施用。在一些实施方案中，脂质体可被配制成液体，包括溶液和悬浮液，如滴眼剂，或者配制成半固体制剂，如软膏或洗液，以供局部施加至粘膜，如眼或阴道或直肠。制剂可含有一种或多种赋形剂，如润肤剂、表面活性剂、乳化剂和穿透促进剂。
在一些情况下，制剂可以以单位剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以以冷冻或冷冻干燥(冻干)状况储存，仅需要在使用前即刻添加无菌液体载体。对于口服给药，组合物可采取例如通过常规技术制备的片剂或胶囊的形式，伴有药学上可接受的赋形剂，如粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。在一些情况下可对片剂进行包覆。用于口服给药的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们可作为干燥产品呈现，以供在使用前用水或其他合适的媒介物重构。此类液体制剂可通过常规技术制备，伴有药学上可接受的添加剂，如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可视情况含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服给药的制剂可适当配制，以产生活性化合物的控制释放。对于颊给药，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。在一些情况下，组合物还可被配制成用于植入或注射的制剂。因此，例如，结构可用合适的聚合材料、水性材料和/或亲水性材料或树脂配制，或者被配制成微溶衍生物(例如，配制成微溶盐)。化合物还可被配制在直肠组合物、乳膏或洗液或者经皮贴剂中。
在一些情况下，药物组合物可包含盐。盐可以是相对无毒的。药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸和硫酸的盐，以及衍生自有机酸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。用于形成盐的合适无机碱的实例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐还可用合适的有机碱形成，包括那些无毒且足够强以形成此类盐的有机碱。出于说明目的，此类有机碱的种类可包括单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，如甲胺、二甲胺和三乙胺；单羟基烷基胺、二羟基烷基胺或三羟基烷基胺，如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡葡糖胺；N-甲基葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；(三羟基甲基)氨基乙烷；等等。
在一些情况下，纳米结构可在受试者中具有约6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时的循环半衰期。在一些实施方案中，纳米颗粒可包含大于约48小时的循环半衰期。在一些实施方案中，可通过增加聚合物的疏水单体的浓度，从而增加解组装纳米结构所需的力来增加循环半衰期。
在一些实施方案中，将纳米结构递送至具有相对较低pH的环境可导致纳米结构的至少部分解组装。特别地，一些纳米结构具有pH响应性特性，并且当暴露于较低pH时，纳米结构至少部分地解组装以暴露纳米结构的核心。不受理论或机制的束缚，在一些实施方案中，较低的pH可增加纳米颗粒的核中存在的阳离子单体上的阳离子电荷，并且由增加的阳离子电荷导致的排斥力可导致纳米结构至少部分地解组装。纳米结构的至少部分解组装可将结合在纳米结构的核中的多核酸暴露于周围环境。因此，纳米结构的至少部分解组装可允许多核酸被递送至其最终靶标。至少部分解组装还可使阳离子单体和疏水单体暴露于周围环境，并且阳离子单体和/或疏水单体可具有膜破坏特性。更具体地，包含纳米结构的聚合物的第二嵌段中单体的暴露可诱导含有纳米结构的任何膜的破坏。因此，在一些实施方案中，在将纳米结构摄取到细胞中之后，纳米结构可至少部分地解组装以通过pH响应性方式递送多核酸。在一些实施方案中，纳米结构在约或低于内体pH下至少部分地解组装，因此在将纳米结构摄取到内体中之后，内体pH可驱动纳米结构解组装。然后，至少部分解组装的纳米结构可破坏内体或脂质体膜，从而可将多核苷酸递送至特定细胞的胞质溶胶。
在一些情况下，可与脂质体治疗方案顺序地或同时确定疾病水平。靶病变的疾病水平可被测量为完全反应(CR)：所有靶病变的消失，部分反应(PR)：以最长直径(LD)的基线总和作为参考，靶病变的LD的总和减小至少30％，进展(PD)：以自治疗开始以来记录的最小总LD作为参考，靶病变的LD的总和增大至少20％，或者出现一种或多种新病变，疾病稳定(SD)：以最小总LD作为参考，既没有足够的收缩率以符合PR，也没有足够的增大以符合PD。在其他情况下，可测量非靶病变。非靶病变的疾病水平可以是完全反应(CR)：所有非靶病变的消失和肿瘤标志物水平的正常化，非完全反应：一种或多种非靶病变的持续存在，进展(PD)：出现一种或多种新病变、现有非靶病变的明确进展。
试剂盒
本文公开的可以是包含脂质体组合物的试剂盒。本文公开的还可以是用于治疗或预防本文公开的癌症、病原体感染、免疫病症或疾病或病况的试剂盒。在一些情况下，试剂盒可包含治疗性或预防性脂质体组合物，其含有有效量的包含单位剂型核酸的脂质体。在一些情况下，试剂盒包含无菌容器，其可含有脂质体的治疗组合物；此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。
实施例
实施例1：脂质体制备
为了产生粘液穿透颗粒(MPP)，可将DOGS(二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺)/DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)/PEG2000以80/20/8％的比例在氯仿中混合。在将脂质溶液在氯仿中混合后，可首先通过氮气流干燥混合物，然后在真空中干燥12小时。可使用适当量的无菌高电阻率(18.2MΩcm)水达到1mM的脂质的最终浓度。可将所得混合物在37摄氏度下温育16小时以形成脂质体。温育后，可使用尖端超声波仪对脂质体溶液进行超声处理以形成小的单层囊泡。
使用动态光散射可确定纳米颗粒大小，并且可通过激光多普勒测速测量理想的近中性ζ电位，其指示表面可充分PEG化。
实施例2：亲本载体构建和转染
可如下构建pSAR-MT诱导型表达质粒。可使两种寡核苷酸(5'-GATCTCGAGCTCCCTGCA-3'和5'-GGGAGCTCGA-3')退火，并且可将所得片段克隆到含有支架附着区(SAR)的质粒的BamHI和PstI位点。所得质粒pJM7可由位于含有XhoI和PstI的限制性位点的短多连接体侧翼的两个SAR序列组成。可通过PCR扩增突变体金属硫蛋白(MT)启动子并将其克隆到用BglII和NotI线性化的pCEP4(Invitrogen)中，产生pCEP-MT。然后可将含有来自珠蛋白基因的内含子的SalI-BamHI片段插入pCEP-MT的XhoI和BamHI位点，产生pCEP-MTi。MT启动子/内含子/多聚(A)区域可通过用SalI消化从pCEP-MTi移除，并克隆到pJM7的XhoI位点中，产生pSAR-MT，如图1所示。
实施例3：NTC9385R-APC载体构建
可通过将以下寡核苷酸克隆到SalI/BglII消化的NTC9385R亲本载体中来生成PstI BamHI相容载体：“TCGACGCCGCCATGGCTGCAGAAAAAAGGATCCA”和“GATCTGGATCCTTTTTTCTGCAGCCATGGCGGCG”。随后，可将APC片段克隆到载体(PstI-BamHI，如PstI-BglI(1537bp)和BglI BamHI(6987bp))中。载体如图2所示。
实施例4：脂质体转染
可通过以4比1的电荷比稀释编码APC的微环-DNA和脂质体溶液并温育6小时来形成APC-脂质体复合物。阳离子脂质自发地与微环DNA结合。
实施例5：动态光散射和ζ电位
可使用Malvern Nanosizer ZS(Malvern Instruments)测量APC-PEG2K纳米颗粒的大小和有效电荷测量值。纳米颗粒可在光散射小瓶中以10的电荷比制备，悬浮在1mL适当的缓冲液中，并在室温下温育20分钟。动态光散射可在高电阻率水中进行。图显示出z-平均直径。动态光散射和ζ电位的数据点是对同一样品进行的两次测量的平均值。
实施例6：Caco-2细胞的体外转染
可在补充有20％胎牛血清(HyClone)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的ATCC配制的Eagle最低必需培养基中培养人结直肠腺癌Caco-2细胞(ATCC编号：HTB-37)。细胞可在含有5％CO2的潮湿气氛中保持在37℃下，并且可每72h重新接种以维持近汇合(subconfluency)。对于转染研究，可将细胞接种在24孔板中，使得转染时的汇合可以是60-80％。APC-萤光素酶-DNA纳米结构可通过用Optimem(Invitrogen)将1μg DNA和适量的脂质体溶液各稀释至250μL并混合来形成。纳米结构可在室温下温育20分钟，然后添加至细胞。随后可将细胞用PBS洗涤一次，然后与200μL复合物悬浮液(每孔0.4μg DNA)一起温育6h。6h后，可去除转染培养基，并且可将细胞用PBS冲洗一次，然后在补充的DMEM中培养18h。细胞可在150μL被动裂解缓冲液(Promega)中收获并进行一次冷冻-融化循环。可使用Perkin-Elmer 1420Victor3V多标记计数器按照分析制造商(Promega)的说明书来测量萤光素酶表达。TE结果可相对于总细胞蛋白进行归一化，如通过Bradford测定(Bio-Rad)所测量的。数据点代表两次测量的平均值，误差条显示标准偏差。
实施例7：体内鼠模型
可在C57BL/6J-ApcMin/J(Jackson实验室)突变体小鼠模型中进行鼠研究，以确定APC载体(表3)是否能够拯救疾病。该小鼠模型中的APC基因与人类基因维持90％的同源性，并导致超过100处肠息肉。C57BL/6J-ApcMin/J小鼠经历经口管饲，其中一个组群接受APC纳米结构，一个组群接受GFP阴性对照纳米结构。纳米结构可每周给予，持续共6周。随后可处死小鼠并且可进行息肉计数并用于评估肿瘤消退。还可进行免疫组织化学以确定LGR5+细胞中的APC表达。免疫组织化学可用于确定CD3+或CD11b+细胞群是否增加，从而测量对纳米结构或APC蛋白的免疫应答。
表3：APC微环载体序列
实施例8：HPEG2K-脂质的合成
以下提供了可用于合成酸不稳定PEG-脂质的方案(图4)。PEG的氧化可如(MassonC,Scherman D,Bessodes M.2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyl-oxyl/[bis(acetoxy)-iodo]benzene-mediated oxidation:a versatile and convenient route to poly(ethylene glycol)aldehyde or carboxylic acid derivatives.J Polym Sci A 2001；39:4022–4)所述进行。疏水性结构单元DOB(3,4-二(油基氧基)苯甲酸)与β-丙氨酸乙酯的偶联以高产率进行以得到产物，该产物可用最少量的氯仿/甲醇溶剂中大量过量的水合肼处理，产生DOB-β-Ala-酰肼。MW 2000的单甲基化PEG(n≈44)可被双(乙酰氧基)-碘代]苯和催化性TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基-氧基)氧化成对应的醛。两种组分可在无水二氯甲烷/甲醇混合物中与添加的分子筛偶联。所得PEG-脂质可通过制备性薄层色谱纯化。
实施例9：HPEG2K-脂质在不同pH下的稳定性的TLC分析
可在pH 4、5、6(柠檬酸(0.1M)/磷酸盐(0.2M))和pH 7.4(0.1M HEPES)下制备缓冲溶液。对于每个测试的pH，通过将约1mg HPEG2K-脂质溶解在二氯甲烷/甲醇1:1中，并首先在氮气流下然后在真空中蒸发14小时来蒸发溶剂，可在小玻璃瓶中制备样品。可将小瓶加热至37℃保持30分钟，并可添加100μl所需pH的温(37℃)缓冲液。可将所得混合物温育5分钟，超声处理2.5分钟并进一步温育(所有温育均可在37℃下进行)。在指定的时间点，可移取10μl的等分试样，与20μl甲醇混合并立即通过TLC分析。氯仿/甲醇/浓NH4OH(100:15:1)可用作流动相。TLC板(Merck，硅胶60，玻璃背衬)可在没有样品的情况下在相同溶剂中预运行并在短暂风干后使用。可通过UV吸收(在该上下文中对DOB衍生物具有特异性)、碘蒸气的吸收(非特异性染色)和使用对PEG具有特异性的喷雾试剂(改进的Dragendorff试剂)来检测斑点。
实施例10：中性脂质体复合物制备
可将脂质的氯仿溶液混合并通过旋转蒸发干燥成薄膜。可在高真空下去除残留溶剂达至少4hrs或过夜。干燥的脂质可用10mM Tris缓冲液pH 7.4(TB 7.4)分散至80mM总脂质的浓度，体积范围为1至5ml。可通过探头超声(Fisher Scientific)形成小单层囊泡(SUV)。超声程序(5个循环的3分钟脉冲，1分钟关闭)和在整个过程中将样品管浸入冰浴中可用于使样品加热最小化。然后脂质体可在Eppendorf 5415C离心机中以12,000rpm离心5min以去除碎片，并通过0.2μm灭菌膜过滤。
可从大肠杆菌分离并纯化质粒(pCMV-APC)。质粒制剂的纯度可通过1％琼脂糖凝胶电泳然后进行SYBR绿荧光染色来确定。DNA浓度可通过260nm处的UV吸收来测量。超螺旋pDNA的百分比可在80-95％的范围内，并且OD260/280比率可在1.85至1.9之间。可使用显色性鲎变形细胞裂解物测定(LAL BioWhitaker,Walkersville,MD)确定pDNA的内毒素水平。值可低于20EU/mg。
可通过首先混合SUV(250μl，20μmol)、质粒(0.1mg)和TB7.4以产生400μl的总体积来形成中性脂质体复合物(NLC)。可向其中添加600μl的无水乙醇、氯化钙(来自500mM储液)和TB 7.4的给定混合物。可在最大涡旋混合下在大约30s内逐滴进行添加。所得聚集复合物可针对500体积的TB 7.4透析24h，缓冲液更换两次。对于需要生理张力的实验，样品可进一步针对500体积的PBS透析24h。对于给定的脂质组合物，可使用具有两个因素(乙醇和钙浓度)和四个中心点的中心复合实验设计来优化质粒包载和粒度。可使用EssentialExperiment Design(Microsoft Excel的加载宏)执行设计和分析。因素范围可由初步捕获实验估计，并且这些对于每种脂质组合物可以是不同的：DOPC，35–50％乙醇，0–5mM Ca2+；DOPC/DOPE，20–40％乙醇，0–10mM Ca2+；DOPC/DOPE/Chol，35–45％乙醇，5–15mM Ca2+。具有最多六个项的二次模型可对来自每个设计的测量的包载数据进行拟合，但是仅有对拟合有显著贡献(P<0.05)的那些项可用于预测最佳制剂。优化的标准可以是最大包载和平均粒度小于200nm。可需要单一设计来优化每种脂质制剂，但每种可进行重复以验证所得模型和项。
实施例11：中性脂质体复合物大小分析
平均粒径可通过使用BI-9000AT相关器(Brookhaven Instruments,Holtsville,NY)的准弹性光散射(QELS)来确定。样品可视情况在水或PBS中稀释成1.0mM脂质，以通过最小针孔(100μm)得到足够的散射强度。各自在在5×104计数/s的最小散射强度下在1min内收集的三个自相关的平均值可转换为高斯分布，从中可使用制造商提供的软件推导平均直径和标准偏差。还可注意到多分散性。
实施例12：包载测定
可使用荧光DNA探针TO-PRO-1确定通过络合过程包载的质粒部分。可用TB 7.4将复合物稀释100倍至2.0ml总体积，并且可添加来自DMSO储液的1μl的1mM TO-PRO-1。可在Perkin-Elmer LS50B分光荧光计上测量荧光，其中激发和发射波长分别为514nm和531nm，狭缝宽度为2.5nm，并且光电倍增器电压设定为900V。在添加TO-PRO-1之前由于散射引起的信号可被设定为零荧光。包载百分比可计算为TO-PRO-1的荧光信号除以添加20μl的100mMTriton X-100以从脂质释放DNA后的荧光，校正体积增加1％。在指定的浓度下，可确定中性脂质和Triton X-100在游离DNA质粒存在下对TO-PRO-1荧光没有影响。增加TO-PRO-1的浓度不会增加荧光，表明其可能以足够的过量存在。
实施例13：纳米颗粒的POZ化
可将炔烃封端的POZ(100mg)添加至5mL荧光纳米颗粒(19±3mg mL-1)的悬浮液中，该悬浮液在反应之前已经用5mL DMSO稀释。此后，可添加200μL三乙胺(TEA)，并在黑暗中持续搅拌下将反应放置24小时。
实施例14：使用NTA评估纳米颗粒在猪胃粘蛋白分散体中的扩散
可使用具有LM14顶板和注射泵的Nano-Sight LM10进行所有扩散测量。荧光纳米颗粒可在去离子水中稀释10,000倍。然后可将10μL该稀释液添加至1％w/v胃粘液的990μL悬浮液，形成1:1,000,000的最终稀释液。可将样品注入NanoSight系统，并且可将流速设定为70AU，以便在分析过程中使纳米颗粒的荧光漂白最小化。可通过长通滤波器录制所有视频，截止波长为550nm(Thorlabs,UK)。可在25℃和37℃下录制6×60秒的视频。每种独立的粘蛋白储液分散体可用每种纳米颗粒类型分析三次，每个温度总共产生9×660秒的视频，其中在25℃下粘度为25cP，且在37℃下粘度为28cP(如流变学分析所确定的)。
实施例15：颗粒跟踪分析
可使用在MATLAB(MathWorks,Natick,MA)中自定义编写的自动颗粒跟踪软件来分析颗粒穿透粘液的影片。确定颗粒随时间的x和y位置。可以通过将图像用空间带通滤波器进行卷积来首先处理图像，从而减少噪声和非均匀背景。像素强度的局部最大值可被鉴定为候选颗粒位置。可通过计算亮点的强度加权形心来细化这些位置，从而产生亚像素分辨率。通过检查颗粒的亮度、大小和偏心率，可保留真实颗粒并丢弃虚假颗粒(噪声)。可通过最近邻方法连接在后续帧中鉴别的颗粒位置来构造轨迹。可丢弃短于1秒的轨迹。每个轨迹的时间平均的均方位移(MSD)可计算为MSD(τ)＝<[x(t+τ)-x(t)]2>+<[y(t+τ)-y(t)]2>，其中τ可以是时间尺度，并且尖括号表示许多起始时间t的平均值。
可通过首先计算来自实验影片的信噪比来估计跟踪分辨率。可将这些与作为信噪比的函数的静态误差的标准曲线进行比较，以估计实验影片中的静态误差。标准曲线可通过将颗粒固定到载玻片上并在不同的照射强度下跟踪它们来产生；这些固定颗粒的明显运动可能是由静态误差造成的。
实施例16：前体合成
可合成基于酰基腙的PEG-2000脂质(HPEG2K-脂质)。简言之，3,4-二(油基氧基)苯甲酸(DOB)可通过在碳酸钾和碘化钾存在下使油基溴化物(过量)和原儿茶酸乙酯(有限)在环己酮中反应并在氮气下在100℃下搅拌来合成。可过滤反应混合物，并在含有氢氧化钾的乙醇中将残余物溶解并回流。酸化该反应混合物产生白色沉淀物(DOB)，其可经过过滤作为残余物收集。DOB可在O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)和N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)存在下与B-丙氨酸乙酯偶联。可将氯仿/甲醇溶剂中的水合肼添加至产物，得到DOB-B-Ala-酰肼。在分子筛存在下，DOB-B-Ala-酰肼可与无水二氯甲烷/甲醇混合物中的氧化单甲基化PEG(MW：2000)偶联。可使用制备性TLC纯化产物(来自DOB偶联的产率为约50％)，并在pH 4和中性pH下温育产物后使用TLC确认其酸敏感性质。数据示于图7中。
实施例17：纳米颗粒制剂
采用组成MVL5(Avanti Polar Lipids)/单油酸甘油酯(MP Biomedicals LLC)/HPEG-2K-LIPD以50/43/7％mol的比率形成脂质体。在CHCl3/MeOH(9:1)中制备单独的脂质储液，并根据组成在小圆底烧瓶中来混合适当体积的储液。脂质薄膜可通过旋转蒸发并进一步在真空下干燥5小时来制备。然后通过在摇床上在37℃下温育4-5小时，用5ml Milli-Q水使脂质水合。然后使用小探头超声波仪以5-10min的间隔对脂质进行多次超声处理。可在每次超声处理结束时监测粒度。10-15min的超声处理后粒径可为150nm。然后可将脂质体稀释至1mM并在BSC罩中通过0.45um过滤器过滤。脂质体-DNA复合物以5的电荷比配制，假设MVL5具有完全质子化(即头部基团电荷+5e)。可将20uL的1μg/mL DNA稀释至1mL，添加至1mL的0.125mM(总脂质)溶液，并通过上下吸移迅速混合。然后使用Brookhaven ZetaPALS粒度分析仪在10-20min温育后测量粒度和ζ电位。与如表4中所示的起始脂质体相比，观察到DNA复合物的粒度和ζ电位值减小。
表4：纳米颗粒大小和ζ电位
仅脂质体 脂质体+DNA
粒度 134.7±2.2nm 82.0±1.9nm
ζ电位(Milli-Q水) 31.8±3.1mV 8.3±1.3mV
实施例18：体外转染
使用具有由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的eGFP表达质粒(NTC9385-eGFP载体)的Caco-2和HT29细胞进行体外转染研究。NTC9385质粒可被设计为具有减少的细菌骨架和无抗生素选择(不对肠道细菌赋予抗生素抗性)。
脂质体-DNA制剂
脂质体-DNA可以以+5或+10的电荷比(假设MVL5上有+5电荷)配制。可将1mM MVL5/GMO/HPEG脂质体的储液添加至在OPTI-MEM培养基中稀释的质粒，通过吸移混合，放置以在室温下偶联20分钟，然后施加至细胞。
转染
将浓度范围为100ng至2μg的DNA转染到具有80％汇合的细胞的12孔板中。然后在转染后48小时使用Zeiss AxioObserver落射荧光显微镜对板进行荧光成像，图8A和图8B。
流式细胞术
在48小时的转染后，用PBS洗涤约4×105个细胞一次，然后将细胞从每个孔移入500uLPBS中。使用Millipore Guava HT6台式流式细胞仪，利用488nm的激光激发波长测定样品的荧光。对于每个测定样品，收集10,000个事件。仅具有细胞的阴性对照可用于设定门控阈值，并且还可评估阳性lipofectamine对照，图10。
实施例19：PMOZ制剂
以不同比例(50/50-x/x％mol)配制MVL5/GMO/脂质-HPMOZ。简言之，将每种脂质在氯仿:甲醇(9:1)中的溶液以适当比率混合在一起。通过对溶液进行真空处理直至形成薄膜，并添加Milli-Q水以悬浮脂质来使用薄膜水合方法。然后将脂质在室温下振荡过夜。然后使用探头超声波仪将脂质以30秒的间隔超声处理10-15分钟。发现脂质与DNA复合，效率几乎为100％(图2)。简言之，将脂质以5的电荷比(假设MVL5具有+5电荷)添加至NTC-eGFPDNA并通过上下吸移进行混合。将复合物在室温下静置20分钟。将DNA预先偶联至溴化乙锭，最终浓度为0.5μg/ml。将复合物加载到1％琼脂糖凝胶上并在80mV下运行(图11)。
实施例20：PMOZ转染
在第一天，将24孔板用Caco-2细胞接种至80％汇合。24小时后，将6μL以下每个样品各自与1μg NTC9385R-GFP质粒偶联，温和吸移以混合，并使其在室温下静置15min，然后施加至细胞。对于每个样品，一式三份进行。48小时后，用Keyence BZ-X700以4x放大率对孔的GFP表达进行成像。使用图像J确定并绘制每个孔的平均像素强度。PMOZ 4％显示出所测试的PMOZ样品的最强GFP表达。
样品：(a)MVL5/GMO/脂质-HPMOZ(50:50-x:x)。在2-10％之间分析PMOZ，图13和图14。(b)MVL5/GMO/脂质-HPEG(50:43:7)(c)MVL5:GMO(d)Lipofectamine 2000对照，图12。
实施例21：离体粘液穿透
收集从当地屠宰场获得的新鲜猪结肠并在冰上保存。纵向切开结肠，然后平放。切割2mm x 4mm大小的切片并置于6孔板中，粘液层朝上。在前一天，将50uL的1mM媒介物(MVL5、PMOZ 2％、PMOZ 4％、PMOZ 6％、PMOZ 8％或PMOZ 10％)与8μg Cy5标记的60bp寡核苷酸偶联30min，然后在4℃下储存过夜。然后将这些媒介物直接施加至粘液层并在37℃下与5％CO2一起温育100min。对于每个样品，一式三份进行。将组织包埋在OCT培养基中并在干冰/乙醇浆液中冷冻。然后将样品冷冻切片成30μm切片并置于载玻片上。随后用KeyenceBZ-X700以4倍放大率曝光1/3秒对载玻片进行成像。之后使用ImageJ分析图像，并且使用直接放置在上皮层上的160x 260像素矩形的平均像素强度来确定在100min后穿透的染料的相对水平。发现PMOZ 4％具有最大的粘液穿透率，图15A、图15B和图16。
实施例22：Pirc大鼠结直肠癌模型
使用F344-Apcam1137/+PIRC大鼠(4-7月龄)作为家族性腺瘤性息肉病(FAP)的动物模型。递送的治疗性转基因是人腺瘤性结肠息肉病(APC)的野生型拷贝，给予GFP作为对照，两者均由CMV启动子驱动。测试了三个不同组群，每个组群具有5只动物(3只雌性和2只雄性)。组群1用Lipofectamine 2000+APC处理，组群2用LiteA1+APC处理，组群3用LiteA1+GFP处理以用作阴性对照以及允许媒介物定位。每只动物用30μg DNA直肠内给药，每周三次，总共7周。在给药前立即如下将递送媒介物和DNA偶联。对于LiteA1媒介物，将30μL的1μg/μL DNA(CMV-APC或CMV-GFP)与187.5μL的1mM LiteA1偶联，OPTI-MEM的体积最大为750μL。对于Lipofectamine组，将30μL的1μg/μL DNA(CMV-APC)与30μL Lipofectamine 2000偶联。一旦添加组分，将管温和倒置20次并允许偶联在室温下进行30min。
用异氟烷麻醉动物并直肠内给药。在给药之前施用PBS灌肠并且进行手动蠕动以去除任何堵塞并清理结肠。然后沿着结肠的下三分之二以相等的分配递送药物(30μg DNA与媒介物偶联)。将肛门物理上夹紧并保持2min以防止渗漏。在给药前、给药2周、给药4周、给药6周和给药7周尸检前进行常规内窥镜监测。进行NTC9385R-APC质粒的体外测试以验证蛋白质表达。将4μg DNA(NTC9385R-APC或NTC9385R-GFP作为对照)与25μL的1mM LiteA1偶联，并转染到6孔板的单个孔中。一式三份进行。允许其表达48小时。然后将细胞悬浮在RIPA缓冲液中并经由振荡裂解1小时。通过离心沉淀裂解物，并测量上清液中的蛋白质浓度。然后将40μg上清液添加至4x NuPAGE LDS样品缓冲液。随后使蛋白质在95℃水浴中变性5min。然后将样品在4-20％Mini-PROTEAN TG预制凝胶上在150V下运行2.5小时。随后将蛋白质转移至PVDF膜上。随后将其与来自Abcam的1:2000第一抗APC抗体(ab15270)在4℃下温育过夜。洗涤膜，然后与来自Abcam的第二山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)在室温下温育1小时。然后洗涤膜并使用1步Ultra TMB-Blotting溶液处理30min来完成可视化，图17。对肠上皮细胞进行死后肠隐窝染色，图28A和图28B。在肠隐窝内检测到GFP表达，图29。
为了治疗和预防FAP，测量了转染肿瘤的能力。用LiteA1+GFP或LiteA1+APC(对照)处理具有结直肠肿瘤的Pirc大鼠。死后，收集肿瘤并通过显微镜检查测量GFP。在Pirc大鼠的肿瘤中检测到Lite+GFP，图30B和图30C，而在GFP阴性对照中测量到很少至没有GFP表达，图30A。在死后测量肿瘤重量，图32。Lite-GFP的最大肿瘤被取出进行组织学而无法称重，因此Lite-GFP平均值显示的值低于应有的值。
数字小液滴PCR
对来自LiteA1+GFP组群的动物进行数字小液滴PCR。动物与组织之间添加到每个ddPCR的DNA范围：肝(200ng)，脾(约800ng-1ug)，血清(<1ng)，正常上皮(500ng)，肿瘤(100ng-1ug)。图表描绘了叠加的4只单独的动物，图31A、图31B、图31C、图31D、图31E和图31F。所有动物具有大致相同的载体探针表示。通道1是HTLV引物和用FAM标记的探针。通道2是HPRT管家基因(用HEX标记)以显示DNA添加。
实施例23：体外粘液穿透分析
I.转染效率
使用体外粘液测定来测量以不同电荷比(+5、+3、+2和+1)与DNA复合的Lite递送系统(MVL5/GMO/脂质-HPEG 50:43:7)的粘液穿透。使用Lipofectamine 2000作为粘膜粘附对照。基于DNA结合效率、转染效率和粘液穿透来确定比率。为了评估复合物的结合效率和总电荷，将Lite递送系统与DNA复合并进行琼脂糖凝胶电泳。简言之，DNA与溴化乙锭以0.5μg/ml复合，然后与适当比率的Lite递送系统混合。在80mV的恒定电压下进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。对于+5、+3和+2的电荷比未检测到游离DNA。电荷比+1显示DNA的结合很少。通过使用以不同电荷比与NTC-eGFP质粒复合的的Lite转染HEK细胞来确定转染效率，表5。
II.粘液收集
为了评估粘液的穿透，从猪结肠收集生理上相关的粘附粘液。收集从当地屠宰场获得的新鲜猪结肠并在冰上保存。物理去除食糜，并用生理盐水(NaCl 0.9％)小心冲洗肠以去除残留物。制作侧切口并将肠平放。通过用载玻片从膜上刮下粘液层来进行粘液收集。向1g粘液添加5mL的0.1M氯化钠并搅动1h(以50rpm振荡)，然后将悬浮液离心2h(13000rpm)。物理去除大的碎片，仅保留沉淀物的清洁部分。将粘液储存在-20℃下并在使用前温热至37℃。
III.体外粘液测定
如上制备的未稀释的清洁粘液用于该测定。具有一个封闭端的薄圆柱形聚丙烯管(约4mm)用粘液填充，直至10mm。一式三份分析每种电荷比和脂质类型。将4μg Cy5标记的DNA与适当比率的脂质复合。用仅MVL5/GMO/脂质-HPEG和OPTI-MEM进行一式三份的阴性对照。用OPTI-MEM将Lipoplex-DNA复合物稀释至50ul的最终体积并移液至粘液上方。将样品在37℃下以50rpm温育4小时，然后将它们在-80℃下冷冻过夜。将每个管以2mm长度切割，其中0mm点位于粘液弯月面的顶部。从末端到顶部切割管，以防止由切割的物理力引起的粘液的人工穿透。还储存和分析水性部分。从收集的样品移取聚丙烯管片，并向管添加120uL提取缓冲液(0.1M醋酸钠pH 5.4、20％DMSO和1％SDS)以破坏粘液并释放Cy5标记的DNA。将样品涡旋30s并在37℃下以300rpm振荡1h。通过在13,200g离心5min使粘液沉淀，并使用微板读取仪分析上清液(ex：633nm，em：670nm，截止值：665nm)。通过减去阴性对照的平均荧光强度来调整每个2mm切片的背景。计算并分析每个管的每个切片的荧光贡献百分比，图23。
或者，甚至来自同一结肠的粘液中观察到的异质性可引入变异。然而，发现2的电荷比表现出相比于其他颗粒更高的粘膜穿透。单独的Cy5-DNA主要在水层中发现，并且未展现出与所示颗粒相似的特性。
表5：转染
电荷比 μL Lite递送系统(1mM) μL pCMV-GFP(1μg/uL)
5+ 12.5 2
3+ 7.5 2
2+ 5 2
如下将Lite递送系统偶联以产生递送2μg pCMV-GFP的载体，并在室温下温育10min。然后将每种载体转染到80％汇合的HEK293T细胞的6孔板中。然后使用EVOS FLoid细胞成像站(Life Technologies)以20％绿光在48小时后对每个孔进行成像，图24A、图24B和图24C。
实施例24：离体猪粘液测定
使用薄膜-水合方法将媒介物配制成MVL5/GMO/脂质-HPEG(50:43:7)。从加利福尼亚州佩塔卢马的屠宰场Marin Sun Farms收集了大约4英尺的较大猪肠。沿着肠进行纵向切口，并在具有最少食糜的区域中切割2mm x 4mm的切片。测试了两个条件；将与Cy5连接的60bp ssDNA寡核苷酸与递送媒介物或单独的媒介物偶联。将100μL的每种条件移液到结肠切片上，并在37℃和5％CO2下温育不同的时间点：5min、60min、100min。对于每种条件和时间点，一式三份进行。然后将切片包埋在OCT包埋培养基中并在干冰浆液中快速冷冻。随后将样品储存在-80℃下直至对其进行冷冻切片。从每个样品的中心取出几个大约40μm的切片，图25A、图25B、图25C、图25D、图25E、图25F、图27A、图27B、图27A、图27B、图27C、图27D和图27E。
虽然本文中已经示出并描述了一些实施方案，但这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。

Claims (170)

1.一种结构，其包含：
a)分离并纯化的环状多核酸，其编码在胃肠道中有活性的蛋白质的至少一个片段；以及
b)包含脂质双层的脂质体，其中所述脂质体的外表面与聚合物接触，其中所述分离并纯化的环状多核酸至少部分地包封在所述脂质体中。
2.根据权利要求1所述的结构，其中所述结构为纳米结构。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的结构，其中所述结构具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。
4.根据权利要求3所述的结构，其中所述结构具有约100nm至约200nm的直径，如通过动态光散射所测量的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的结构，其进一步包含外部包衣。
6.根据权利要求5所述的结构，其中所述外部包衣为肠溶衣。
7.根据权利要求5至6中任一项所述的结构，其中所述外部包衣完全包覆所述结构的表面。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的结构，其中所述外部包衣包含选自以下的材料：醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、羟乙基纤维素(HEC)、聚丙烯酸酯(卡波姆)、藻酸盐、壳聚糖、纤维素衍生物(羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素)及其任意组合。
9.根据权利要求8所述的结构，其中所述外部包衣包含聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的结构，其中所述外部包衣是粘膜粘附水凝胶。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的结构，其中所述外部包衣是pH敏感的。
12.根据权利要求11所述的结构，其中当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下置于1L水中时在如在37摄氏度下用pH计所测量的约5.5至约14的pH时，所述pH敏感外部包衣至少部分地溶解。
13.根据权利要求11所述的结构，其中当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下置于1L水中时在如在37摄氏度下用pH计所测量的约6至约14的pH时，所述pH敏感外部包衣至少部分地溶解。
14.根据权利要求11所述的结构，其中当在搅拌棒以200转/分钟旋转的情况下置于1L水中时在如在37摄氏度下用pH计所测量的约7至约14的pH下，所述pH敏感外部包衣至少部分地溶解。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的结构，其中当口服施用于灵长类动物时，所述结构在十二指肠、空肠、髂骨、结肠或其任意组合中至少部分地溶解。
16.根据权利要求15所述的结构，其中当口服施用于灵长类动物时，所述结构邻近于肠隐窝细胞至少部分地溶解。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的结构，其中所述至少一种聚合物允许所述结构比不包含所述至少一种聚合物但其它方面相当的结构更多地穿过粘液，如通过transwell迁移测定所测量的。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的结构，其中所述聚合物选自含聚乙二醇(PEG)的聚合物、PEG-聚环氧丙烷的三嵌段共聚物、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基醚)、聚(N-[2-羟基丙基]甲基丙烯酰胺)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚(甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯)(pDMAEMA)及其任意组合。
19.根据权利要求18所述的结构，其中所述聚合物包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)。
20.根据权利要求18所述的结构，其中所述聚合物包括PEG。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的结构，其中所述聚合物经由连接体与所述脂质双层相关联。
22.根据权利要求21所述的结构，其中所述连接体是酸不稳定连接体。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的结构，其中所述连接体进一步包括二硫键、酰基腙、乙烯基醚、原酸酯或N-PO3基团中的至少一种。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的结构，其中所述脂质双层形成脂质体。
25.根据权利要求24所述的结构，其中所述聚合物基本上均匀地分散在所述脂质体的至少部分表面上。
26.根据权利要求25所述的结构，其中所述脂质体具有外表面和内表面，并且其中所述聚合物基本上均匀地分散在所述外表面上。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的结构，其中所述聚合物不均匀地分散在所述脂质体上。
28.根据权利要求27所述的结构，其中所述脂质体具有外表面和内表面，并且其中所述聚合物不均匀地分散在所述外表面上。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的结构，其中当所述聚合物是含PEG的聚合物时，其具有约1900g/mol至约2200g/mol的重均分子量。
30.根据权利要求29所述的结构，其中当所述聚合物是具有约1900g/mol至约2200g/mol的重均分子量的含PEG的聚合物时，所述聚合物与所述脂质双层以约10条链/100nm2所述脂质双层至约20条链/100nm2所述脂质双层的比率相关，如通过脂质PEG的实际摩尔比与所述脂质体的计算的重均表面积的相对比较所测量的。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的结构，其中所述聚合物至少部分呈蘑菇形构型。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的结构，其中所述聚合物至少部分呈刷形构型。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的结构，其中所述脂质双层包含选自以下的材料：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、这些中的任一种的盐及其任意组合。
34.根据权利要求33所述的结构，其中所述材料包括具有净正电荷的脂质或具有中性电荷的脂质。
35.根据权利要求33或34所述的结构，其中所述材料包括MVL5和GMO。
36.根据权利要求35所述的结构，其中MVL5与GMO的摩尔比为约1:10至约1:1。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的结构，其中MVL5/GMO/脂质-HPEG的摩尔比选自：约50mol/45mol/5mol、50mol/44mol/6mol、50mol/43mol/7mol、50mol/42mol/8mol、50mol/41mol/9mol至约50mol/40mol/10mol。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的结构，其中当所述脂质双层包含所述MVL5时，所述MVL5与所述分离并纯化的环状多核酸氢键结合。
39.根据权利要求18至38中任一项所述的结构，其进一步包含PEG复合物。
40.根据权利要求24至39中任一项所述的结构，其中所述环状多核酸完全包封在所述脂质体中。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的结构，其进一步包含连接体。
42.根据权利要求41所述的结构，其中所述连接体与所述聚合物共价关联。
43.根据权利要求41至42所述的结构，其中所述连接体是酸敏感连接体。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的结构，其中所述结构进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。
45.根据权利要求44所述的结构，其中所述结构进一步包含肽、抗体或其片段、单链可变片段(scFv)或与所述聚合物接触的细胞受体。
46.根据权利要求45所述的结构，其中当所述结构包含所述肽时，其为细胞穿透肽。
47.根据权利要求44所述的结构，其中当所述结构包含所述抗体或其片段时，其靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)。
48.根据权利要求5至47中任一项所述的结构，其中所述外部包衣是阳离子的。
49.根据权利要求5至47中任一项所述的结构，其中所述外部包衣是阴离子的。
50.根据权利要求5至47中任一项所述的结构，其中所述外部包衣是中性的。
51.根据权利要求5至50中任一项所述的结构，其中所述外部包衣的电荷通过激光多普勒测速测量。
52.根据权利要求51所述的结构，其中对于在1mL高电阻率水中DNA电荷比为约5至约15的结构，所述电荷为约-10 0mV至约100mV，如通过双角度粒子和分子尺寸分析仪所测量的。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸是DNA或RNA。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸是单链的。
55.根据权利要求1至53中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸是双链的。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸是DNA。
57.根据权利要求56所述的结构，其中所述DNA是微环DNA。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸是至少部分水溶性的。
59.根据权利要求58所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸存在于封闭在所述脂质双层中的水溶液中。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的结构，其中所述在胃肠道中有活性的蛋白质的至少一个片段是腺瘤性结肠息肉(APC)的至少一部分、B-半乳糖苷酶(B-Gal)的至少一部分或其任意组合。
61.根据权利要求60所述的结构，其中所述在胃肠道中有活性的蛋白质的至少一个片段是腺瘤性结肠息肉(APC)的至少一部分。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的结构，其中所述在胃肠道中有活性的蛋白质的至少一个片段包括防卫素α5(HD-5)的至少一部分、防卫素α6(HD-6)的至少一部分或其任意组合。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸包含至少一个启动子。
64.根据权利要求63所述的结构，其中所述启动子选自包含以下的列表：巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸至少部分地与所述结构接触、与所述结构的至少一个组分接触或其组合。
66.根据权利要求65所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸与阳离子脂质接触。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的结构，其进一步包含蛋白质或肽。
68.根据权利要求67所述的结构，其中所述蛋白质或肽包含核定位信号(NLS)。
69.根据权利要求67至68中任一项所述的结构，其中所述蛋白质或肽与所述分离并纯化的环状多核酸接触。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的结构，其中所述蛋白质或肽不与所述分离并纯化的环状多核酸接触。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的结构，其进一步包含核酸酶抑制剂。
72.根据权利要求71所述的结构，其中所述核酸酶抑制剂选自金精三羧酸(ATA)、Zn2+、DMI-2或其组合。
73.根据权利要求1至72中任一项所述的结构，其进一步包含封闭在所述结构中的RNA干扰(RNAi)的效应子。
74.根据权利要求73所述的结构，其中所述RNA干扰(RNAi)的效应子是CEQ508或其盐。
75.根据权利要求1至74中任一项所述的结构，其中所述盐是阳离子金属。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的结构，其中所述缓冲剂是选自以下的缓冲液：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三-(羟基甲基)-氨基甲烷盐酸盐(TRIS)缓冲液、N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、甘氨酸缓冲液、谷氨酸及其任意组合。
77.根据权利要求76所述的结构，其中所述缓冲剂是PBS。
78.根据权利要求1至77中任一项所述的结构，其中所述结构是粘液穿透颗粒(MPP)。
79.根据权利要求78所述的结构，其中所述MPP具有约-20mV至约20mV的近中性ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。
80.根据权利要求78至79所述的结构，其中所述MPP能够穿透厚度为1μm至200μm的粘液，如通过transwell迁移测定所测量的。
81.根据权利要求1至80中任一项所述的结构，其中所述结构是球形的。
82.根据权利要求1至81中任一项所述的结构，其中所述结构是至少部分可生物降解的。
83.根据权利要求1至82中任一项所述的结构，其中所述结构是冷冻干燥的。
84.根据权利要求1至83中任一项所述的结构，其中所述结构包含在丸剂、水凝胶或其任意组合中。
85.根据权利要求1至84中任一项所述的结构，其中所述分离并纯化的环状多核酸编码肿瘤抑制蛋白或其前体。
86.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至85中任一项所述的结构。
87.根据权利要求86所述的药物组合物，其中所述药物组合物处于单位剂型。
88.根据权利要求86至87中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
89.一种方法，其包括将根据权利要求1至88中任一项的结构或药物组合物施用于有需要的受试者。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者中的疾病或病况，并且其中所述结构或药物组合物以治疗有效量施用。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述疾病或病况是家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、癌症、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病、回肠克罗恩病或其任意组合。
92.根据权利要求89至91中任一项所述的方法，其中所述结构或药物组合物用于治疗FAP。
93.根据权利要求89至92中任一项所述的方法，其中所述受试者在胃肠道中具有息肉。
94.根据权利要求89至93中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述结构或所述药物组合物的所述施用之前、之后或同时手术去除息肉。
95.根据权利要求89至94中任一项所述的方法，其中所述结构或药物组合物口服、直肠或者口服和直肠施用。
96.根据权利要求89至95中任一项所述的方法，其中所述结构或药物组合物常规施用。
97.根据权利要求89至96中任一项所述的方法，其中所述结构或药物组合物预防性施用。
98.根据权利要求89至97中任一项所述的方法，其中所述结构或药物组合物每日1次、每日2次、每日3次、每日、每周、每年或其任意组合施用。
99.根据权利要求89至98中任一项所述的方法，其中所述受试者以治疗有效量施用另外的疗法。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述另外的疗法包括非甾体抗炎药(NSAID)、愈创甘油醚、针对β-连环蛋白的miRNA、粘液破坏剂、或盐，或其任意组合。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述另外的疗法包括NSAID，并且所述NSAID为塞来昔布。
102.根据权利要求89至101中任一项所述的方法，其中对所述受试者进行疾病的遗传筛查。
103.一种方法，其包括采用至少30％的所述结构向胃肠细胞的递送效率施用根据权利要求1至85中任一项所述的结构，如通过Transwell-Snapwell扩散室测定所测量的。
104.一种与SEQ ID 5具有至少50％同源性的多核酸。
105.根据权利要求104所述的多核酸，其中所述多核酸由与SEQ ID 5的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最多99％的同源性组成。
106.一种包含SEQ ID 5的多核酸。
107.根据权利要求104至106中任一项所述的多核酸，其中所述多核酸是分离并纯化的。
108.一种制备结构的方法，其包括在编码肿瘤抑制蛋白或其部分的环状多核酸周围形成脂质体。
109.一种制备结构的方法，其包括在编码在胃肠道中有活性的蛋白质或其部分的环状多核酸周围形成脂质体。
110.根据权利要求108至109中任一项所述的方法，其进一步包括引入溶剂。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述溶剂包括氯仿。
112.根据权利要求108至111中任一项所述的方法，其进一步包括干燥所述溶剂。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述溶剂的所述干燥通过包括干燥氮气流、氩气流、旋转蒸发、真空或其任意组合的方法进行。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述方法包括干燥氮气流。
115.根据权利要求113所述的方法，其中所述方法包括真空处理。
116.根据权利要求113至115中任一项所述的方法，其中所述干燥通过干燥氮气流然后真空处理来进行。
117.根据权利要求112至116中任一项所述的方法，其中所述干燥形成脂质膜，所述脂质膜通过添加水溶液而水合。
118.根据权利要求108至117中任一项所述的方法，其进一步包括水溶液。
119.根据权利要求108至118中任一项所述的方法，其中所述环状多核酸包括DNA或RNA。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述环状多核酸包括DNA。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述环状多核酸包括微环DNA。
122.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至85中任一项所述的结构及其使用说明。
123.一种试剂盒，其包含根据权利要求106至107所述的多核酸及其使用说明。
124.一种制备根据权利要求122或权利要求123所述的试剂盒的方法。
125.一种制备药物组合物的方法，其包括使根据权利要求1至85中任一项所述的结构与药学上可接受的赋形剂接触。
126.一种脂质体结构，其包含：
a)分离并纯化的环状多核酸，其中所述脂质体结构用聚合物进行表面修饰，其中与相当的脂质体结构相比，所述聚合物增强脂质体结构在粘液中移动的平均速率，其中所述相当的脂质体结构用平均分子量为约2000Da至约3000Da的聚乙二醇(PEG)进行表面修饰。
127.根据权利要求126所述的脂质体结构，其中与所述相当的脂质体结构相比，所述脂质体结构具有增加的亲水性。
128.一种脂质体结构，其包含：
分离并纯化的多核酸，其中所述多核酸不含细菌复制起点，其中所述脂质体结构用聚合物进行表面修饰。
129.根据权利要求128所述的脂质体结构，其中所述多核酸是环状的。
130.根据权利要求126至129中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构选自脂质体、lipoplex或lipopolyplex。
131.根据权利要求126至130中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构用以下式I的聚合物进行表面修饰：
其中R1独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；
R2独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；XCY2X或其任意组合；
R3独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；
R4独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；
R5独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；
R6独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；
R7独立地选自键；氢；氘；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C3-8环烷基；杂芳基；C1-6烷基杂芳基；C1-6烷基芳基；和烷基环烷基；除氢和氘以外，其各自可单独地且独立地被以下基团取代一次或多次：XA；卤素；NY2；CXXY；XCY3；烷基；氢；氘；羧酸；醚；胺；XX2NY2；＝X；XCY2X或其任意组合；其中*可独立地为R、S或非手性的；其中**可独立地为R、S或非手性的；其中X独立地选自氧或硫；Y独立地选自氘或氢；A为氢、氘、芳基或杂芳基，并且n为约1至约100。
132.根据权利要求131所述的脂质体结构，其中R1为C1-6烷基。
133.根据权利要求131至132中任一项所述的脂质体结构，其中R3、R4、R5或R6中的任一个选自氘和氢。
134.根据权利要求131至133中任一项所述的脂质体结构，其中X为氧。
135.根据权利要求131至134中任一项所述的脂质体结构，其中式I具有约1000Da至约8000Da的平均分子量。
136.根据权利要求126或128所述的脂质体结构，其中所述聚合物包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、其盐、其二嵌段聚合物、其三嵌段聚合物或其组合。
137.根据权利要求126至136中任一项所述的脂质体结构，其中所述聚合物具有约0.05ug/nm2至约0.25ug/nm2的密度。
138.根据权利要求126至137中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构在粘液中移动的所述平均速率是相当的脂质体结构的平均速率的约2倍至约5倍，如通过transwell迁移测定所测量的。
139.根据权利要求138所述的脂质体结构，其中所述多核酸包括微环DNA或闭合线性DNA。
140.根据权利要求126至139中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。
141.根据权利要求126至140中任一项所述的脂质体结构，其进一步包含外部包衣。
142.根据权利要求141所述的脂质体结构，其中所述外部包衣包含聚合形式的丙烯酸乙酯。
143.根据权利要求141至142中任一项所述的脂质体结构，其中所述外部包衣具有近中性的ζ电位，如通过激光多普勒测速所测量的。
144.根据权利要求126至143中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构包含脂质双层。
145.根据权利要求144所述的脂质体结构，其中所述脂质双层包含以下中的一种或多种：胆固醇、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[1,2-双(油酰基氧基)-3(三甲基铵基)丙烷](DOTAP)、3β[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、甘油单油酸酯(GMO)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、其盐或其任意组合。
146.根据权利要求145所述的脂质体结构，其中所述脂质双层包含MVL5和GMO。
147.根据权利要求146所述的脂质体结构，其中MVL5与GMO的摩尔比为约10:1至约1:10，或10:1至约1:25。
148.根据权利要求144至147中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构进一步包含第二脂质双层。
149.根据权利要求126至148中任一项所述的脂质体结构，其进一步包含酸敏感连接体。
150.根据权利要求149所述的脂质体结构，其中所述酸敏感连接体与所述脂质体结构的所述聚合物相关联。
151.根据权利要求126至150中任一项所述的脂质体结构，其中所述多核酸编码蛋白质的至少一个生物活性片段。
152.根据权利要求151所述的脂质体结构，其中所述蛋白质的所述生物活性片段在包含粘膜的身体区域中是有活性的。
153.根据权利要求126至152中任一项所述的脂质体结构，其中所述多核酸编码腺瘤性结肠息肉(APC)、防卫素α5(HD-5)、防卫素α6(HD-6)或其任意组合的至少一个生物活性片段。
154.根据权利要求126至153中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构具有选自以下的直径：约10nm至约100nm、约100nm至约200nm、约200nm至约300nm、约300nm至约400nm和约400nm至约500nm，如通过动态光散射所测量的。
155.根据权利要求126至154中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构包含至少两种多核酸。
156.根据权利要求126至155中任一项所述的脂质体结构，其中所述多核酸包含至少一种启动子。
157.根据权利要求156所述的脂质体结构，其中所述至少一种启动子选自巨细胞病毒(CMV)衍生的启动子、鸡β-肌动蛋白(CBM)衍生的启动子、腺瘤性结肠息肉(APC)衍生的启动子、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)、CAG启动子、β肌动蛋白启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、早期生长反应1(EGR-1)启动子、真核起始因子4A(EIF4A1)启动子或其任意组合。
158.根据权利要求126至157中任一项所述的脂质体结构，其中所述脂质体结构进一步包含肽、抗体或其片段、碳水化合物、单链可变片段(scFv)、细胞受体或其任意组合。
159.一种药物组合物，其包含：
a.根据权利要求126至158中任一项所述的脂质体结构；以及
b.以下至少一种：赋形剂；稀释剂；或载体。
160.根据权利要求159所述的药物组合物，其中所述药物组合物处于单位剂型。
161.根据权利要求159至160中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物为片剂、液体、糖浆、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、皮下制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂及其任意组合的形式。
162.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求126至158中任一项所述的脂质体结构或根据权利要求159至161中任一项所述的药物组合物。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述脂质体结构或所述药物组合物的施用至少部分地改善所述有需要的受试者中的疾病或病况。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述疾病或病况包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、减毒FAP、结直肠癌、慢性炎性肠病、慢性炎性肠病、回肠克罗恩病或其任意组合。
165.根据权利要求162至164中任一项所述的方法，其中所述脂质体结构或所述药物组合物口服、直肠或者口服和直肠施用。
166.根据权利要求162至165中任一项所述的方法，其中所述脂质体结构或所述药物组合物常规施用、预防性施用或其组合。
167.根据权利要求162至166中任一项所述的方法，其中所述脂质体结构或所述药物组合物每日1次、每日2次、每日3次、每日、每周、每年或其任意组合施用。
168.根据权利要求162至167中任一项所述的方法，其中所述受试者以治疗有效量施用另外的疗法，所述另外的疗法包括非甾体抗炎药(NSAID)或其盐、针对β-连环蛋白的miRNA、粘液破坏剂或其盐，或其任意组合。
169.一种试剂盒，其包含：
a.根据权利要求126至158中任一项所述的脂质体结构或根据权利要求159至161中任一项所述的药物组合物；
b.及其使用说明。
170.根据权利要求169所述的试剂盒，其进一步包含容器。
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