CN113365607A

CN113365607A - 用于口服药物递送的脂质囊泡

Info

Publication number: CN113365607A
Application number: CN202080010224.4A
Authority: CN
Inventors: P·格罗森; M·凯勒
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2021-09-07
Also published as: US20210346293A1; JP2022518500A; WO2020152303A1; EP3914232A1

Abstract

本发明涉及携带用作药物的核酸分子的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡具有小于300nm的流体动力学直径D_h。所述脂质囊泡用于口服施用，并且所述核酸分子被递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

Description

用于口服药物递送的脂质囊泡

技术领域

背景技术

药物向特定细胞和组织的递送受多种因素影响，例如药物的稳定性、药物到达靶组织前的代谢、药物穿过细胞膜的能力、细胞之间的紧密连接或血脑屏障。使用大分子药物(例如核酸、肽和蛋白质)的疾病疗法目前限于肠胃外施用，这通常会导致药物随时间的全身分布。这主要是由于这些药物的化学和物理特性不符合Lipinski五法则，以及许多药物在胃肠道(GIT)的恶劣条件下可能具有低稳定性。最近描述了几种口服施用此类药物的策略，例如使用乳外泌体(mExo)递送微小RNA(miRNA)。外泌体是所有类型细胞分泌的细胞外囊泡。在最近发表的Manca等人2018Scientific Reports 8：11321，分析了口服施用后包含合成miRNA的乳外泌体的分布。根据Manca，不同的miRNA货载具有独特的组织分布模式。此外，Munagala等人2016Cancer Lett.37l(1)：48-61描述了从牛乳中分离外泌体，和将化学治疗剂封装到分离的外泌体中。

尽管初步结果看起来很有希望，但在将此类系统应用于商业规模之前，需要解决技术限制，例如乳外泌体的分离和纯化、批次间的差异、微生物污染和有效的载药量(参见例如Somiya等人.2018J Extracell Vesicles.7(1)：1440132)。

非常需要提供技术可开发性并且可以以稳健和可重复的方式生产的替代系统。

Lu等人2018Int J Pharm.550(1-2)：100-113描述了外泌体模拟囊泡的产生以及所产生囊泡与常规脂质体的比较。结果表明，外泌体模拟囊泡能够将VEGF siRNA递送至A549和HUVEC细胞。然而，没有进行体内实验。

据我们所知，外泌体模拟中治疗性核酸分子的口服递送从未被证明会导致中枢神经系统、胃肠道、脾脏或T细胞中的靶标调节。

发明目的

发明人在作为本发明基础的研究中表明，携带核酸分子(例如单链反义寡核苷酸)的脂质囊泡的口服施用允许调节在中枢神经系统(例如大脑)、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中的靶核酸(参见实施例部分)。脂质囊泡具有小于300nm的流体动力学直径Dh，和模拟天然存在的细胞外囊泡的特性。它们可以很容易地大量生产，而无需从乳中进行耗时且昂贵的分离。此外，它们缺乏来自活的来源分离的外泌体(如乳、细胞培养物和天然体液)的潜在污染。

包含一种或多种核酸分子的脂质囊泡，当口服施用时，能够将所述核酸分子递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞，调节组织中的靶核酸。本发明的发现在治疗多种疾病中特别有用，例如与异常表达相关的疾病，例如中枢神经系统(例如脑)、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中靶核酸的表达增加、表达减少或不希望的抑制、剪接转换错误或突变错误。

附图说明

图1：在本申请中测试的脂质囊泡F1-F34中的脂质组分以及它们基于未负载的囊泡的尺寸和在模拟胃液(SGF)或模拟禁食状态肠液(FaSSIF)中孵育后的尺寸变化评价的口服递送的稳定性的总结。++＝Dh为60nm至180nm，SGF中Dh变化百分比低于60％，FaSSIF中Dh变化百分比低于25％的稳定囊泡；+＝Dh为50nm至300nm，SGF中Dh的变化百分比低于90％，FaSSIF中的Dh变化低于40％的稳定囊泡；-＝在SGF和FaSSIF中孵育之前或之后的Dh高于300或在SGF中Dh的百分比变化高于90％，在FaSSIF中Dh的百分比变化高于40％。脂质组分缩写如下：Chol＝胆固醇，SM＝鞘磷脂，PC＝磷脂酰胆碱，DSPC＝1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DLPC＝1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DOPC＝二油酰-磷脂酰胆碱，PE＝磷脂酰乙醇胺，PS＝磷脂酰丝氨酸，DAG＝二酰甘油，TAG＝三酰甘油，PI＝磷脂酰肌醇，LBPA＝溶血双磷脂酸。

发明内容

本发明提供了一种携带用作药物的核酸分子的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡口服施用，其中所述核酸分子用于递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。优选地，脂质囊泡具有通过动态光散射(DLS)测量的小于300nm的流体动力学直径Dh，如本文更详细描述。

有利地，脂质囊泡在20℃的温度于胃液中稳定长达5h。

在一个实施例中，所述脂质囊泡具有根据DLS测量的小于180mm的流体动力学直径，特别是60nm至180nm的范围内的直径。

在一个实施例中，其中，基于未负载的脂质囊泡本身的总量[mol]，所述脂质囊泡包含量在10mol％至70mol％(mol％)的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，和量在2mol％至45mol％，优选4mol％至15mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，其中所述脂质囊泡任选地包含至少一种二酰甘油和/或至少一种三酰甘油和/或至少一种磷脂酰肌醇，其中基于未负载的脂质囊泡总量[mol]，二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇总和的总量小于15mol％。在一个进一步的实施例中，基于未负载的脂质囊泡本身的总量[mol]，所述脂质囊泡包含小于5mol％的二酰甘油和小于5mol％的三酰甘油和小于5mol％的磷脂酰肌醇。

在一个实施例中，所述脂质囊泡包含胆固醇、至少一种磷脂酰乙醇胺、至少一种乳鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种二酰甘油、至少一种三酰甘油、至少一种磷脂酰肌醇、溶血双磷脂酸和至少一种磷脂酰丝氨酸。在一个进一步的实施例中，基于未负载的脂质囊泡本身的总量[mol]，所述脂质囊泡包含量在10mol％至25mol％的范围内的胆固醇、4mol％至10mol％的范围内的鞘磷脂、小于5mol％的二酰甘油、小于5mol％的三酰甘油和小于5mol％的磷脂酰肌醇，以及量为10mol％至30mol％的磷脂酰乙醇胺。

核酸分子是治疗或诊断核酸分子。在本发明的一个实施例中，核酸分子是RNAi分子，例如siRNA或shRNA。在本发明的另一个实施例中，核酸分子是单链反义分子，例如修饰的单链反义寡核苷酸。单链反义寡核苷酸的长度通常为7至30个核苷酸，例如10至30个核苷酸。

在一个实施例中，核酸分子，例如修饰的单链反义寡核苷酸具有至少一个修饰的核苷间键，例如至少50％修饰的核苷间键。

在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸具有至少一个修饰的核苷，例如至少3个2′糖修饰的核苷。

本发明进一步提供了一种制备携带核酸分子的脂质囊泡的方法，以及通过所述方法可获得或获得的脂质囊泡，组合物，其中所述脂质囊泡具有通过DLS测量的小于300nm的流体动力学直径Dh，其中所述脂质囊泡口服施用，其中所述核酸分子用于递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

定义

脂质囊泡

在本发明的含义内，术语“脂质囊泡”是指由至少一个脂质双层或多层(脂质膜)制成的人工、优选合成制备的囊泡，其中所述脂质囊泡包含天然来源的或合成的磷脂或其他表面活性剂或隐形组分(减少巨噬细胞识别)，如聚乙二醇化脂质(例如DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000或其他脂质锚或PEG尺寸)，以及任选地其他膜组分，例如胆固醇和蛋白质。脂质囊泡的结构可以充当药物活性组分(例如本文所述的核酸分子)的物理储库。

本发明的脂质囊泡的通过DLS测量的流体动力学直径(粒度，本文也称为“直径”)小于300nm，更优选地为小于280nm，更优选地为小于250nm，更优选地为小于220nm，更优选地为小于200nm，更优选地为小于180nm。

优选地，通过DLS测量的流体动力学直径为10nm至300nm、20nm至280nm、更优选地为30nm至250nm、更优选地为40nm至220nm、更优选地为50nm至200nm、更优选地为60nm至180nm、更优选地为70nm至180nm的范围内。

优选地，本文提供的脂质囊泡在生理条件下具有负到中性的zeta电位，优选地为-30mV至0mV、更优选地为-15mV至0的范围内的zeta电位，该zeta电位在0.1x DPBS中于25℃用Zetasizer ZSP(Malvern Instruments，Malvern，UK)在0.1mM的总脂质浓度下测量。

在一个实施例中，脂质囊泡是合成的脂质囊泡。因此，它是通过组合如本文所述的各种组分而人工生成的。预计它不是从动物来源，例如从哺乳动物中分离出来的。例如，它不得从乳(如牛乳)中分离出来。脂质囊泡的各个组分(例如鞘磷脂)可以是从天然(例如动物或植物)来源中分离出来的。

粒度/直径

术语“粒度”或“流体动力学直径”是指通过光子相关谱法-本文中称为动态光散射(DLS)测量的脂质囊泡的平均/平均的流体动力学直径(D_h)。平均的/平均的流体动力学直径(D_h)指在脂质囊泡组合物中，单个囊泡可以落在给定范围之外，然而组合物的平均粒度在给定范围内。DLS方法基于粒子对激光的散射，并利用粒子由于布朗运动而扩散的速度的测量。粒子速度与粒子的尺寸相关。在本申请中，使用Malvern Zetasizer Ultra(MalvernPanalytical，Malvern，UK)在685nm的激光波长下进行光子相关谱法(DLS)。以173°的角度检测到散射光。结果表示为室温下DPBS(No.14190250，Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)中n＝3次测量的平均±SD。对于脂质囊泡稳定性评价，已使用未负载的囊泡。

稳定性

优选地，根据本发明的脂质囊泡在胃液中是稳定的。本申请中使用的术语“在胃液中稳定”定义为当在模拟胃液[SGF](NaCl 34mM，HCl 0.83M，0.1％Triton X-100(pH 1.2))中以1mM的脂质囊泡浓度在20℃的温度孵育至少5h时，脂质囊泡的平均流体动力学直径(D_h)的变化(即减少或增加)至多90％，例如至多86％(当与如上所述测量的相应初始Dh相比时)。优选地，在胃液中孵育后的时间0或5h的脂质囊泡的平均流体动力学直径(D_h)小于300nm，例如50nm至250nm的范围内。

根据一个实施例，当在模拟胃液[SGF](NaCl 34mM，HCl 0.83M，0.1％Triton X-100(pH 1.2))中以1mM的浓度在20℃的温度孵育至少5h时，脂质囊泡的流体动力学直径仅变化至多60％，例如50％、例如40％、例如30％，更优选地为至多25％。优选地，在时间0和在胃液中孵育5h后的脂质囊泡的平均流体动力学直径(D_h)小于300nm，例如在60nm至180nm的范围内。在一个优选的实施例中，尺寸变化至多25％，并且包括在胃液中孵育后0或5h时，脂质囊泡的尺寸和平均流体动力学直径(D_h)在100nm至165nm的范围内减少和增加。

优选地，在SGF中孵育后脂质囊泡的平均流体动力学直径(D_h)小于300nm，例如50nm至250nm、并且优选地为60nm至180nm、并且更优选地为100nm至165nm的范围内。

此外，根据本发明的脂质囊泡优选在禁食状态的肠液中也是稳定的。本申请中使用的术语“在禁食状态的肠液中稳定”定义为当在模拟禁食状态肠液[FaSSIF](NaH₂PO₄28.6mM、牛磺胆酸钠盐3mM、卵磷脂0.75mM、NaCl 105.8mM(pH 6.5))中以1mM的浓度在20℃的温度孵育至少3h，例如至少5h时，脂质囊泡的平均流体动力学直径(D_h)变化(即减少或增加)至多40％。

优选地，当在模拟禁食状态肠液[FaSSIF](NaH₂PO₄ 28.6mM、牛磺胆酸钠盐3mM、卵磷脂0.75mM、NaCl 105.8mM(pH 6.5))中以1mM的浓度在20℃的温度孵育至少3h，例如至少5h时，脂质囊泡的流体力学直径变化至多40％，更优选至多35％，更优选至多30％，更优选至多25％，更优选至多200％，更优选至多15％，更优选至多10％。优选地，当在FaSSIF中孵育后0和5h时，脂质囊泡的平均流体动力学直径(D_h)小于300nm，例如50至275的范围内，例如60至180的范围内。在一个优选的实施例中，尺寸变化至多15％，并且包括在FaSSIF中孵育后0和5h时，脂质囊泡的尺寸和平均流体动力学直径(D_h)在100nm至150nm的范围内减少和增加。在一个优选的实施例中，稳定的脂质囊泡在上述SGF和FaSSIF的参数范围内。

在一个进一步优选的实施例中，稳定的脂质囊泡被定义为满足以下参数：在SGF中孵育后，尺寸变化小于55％，并且包括在SGF中孵育后0和5h时，脂质囊泡的尺寸和平均流体动力学直径(D_h)减小和增加80nm至165nm，在FaSSIF中孵育后，尺寸变化小于25％，并且包括在FaSSIF中孵育后0和5h时，脂质囊泡的尺寸和平均流体动力学直径(D_h)在80nm至150nm范围内的减少和增加。

在一个进一步优选的实施例中，稳定的脂质囊泡被定义为满足以下参数：在SGF中孵育后，尺寸变化小于25％，并且包括在SGF中孵育后0和5h时，脂质囊泡的尺寸和平均流体动力学直径(D_h)减小和增加的范围为100nm至165nm，并且在FaSSIF中孵育后，尺寸变化小于15％，并且包括在FaSSIF中孵育后0和5h时，脂质囊泡的尺寸和平均流体动力学直径(D_h)在100nm至150nm的范围内减少和增加。

脂质囊泡的组分

脂质囊泡的优选组分(如上定义)在此更详细地描述。如果没有另外指明，基于未负载的脂质囊泡的总量[以mol计]，即囊泡的量(不含核苷酸)，以mol％给出脂质囊泡的每个相应组分的优选量。

胆固醇

在本发明的含义内使用的术语胆固醇包括酯化和非酯化的胆固醇。

对于本发明的优选脂质囊泡，胆固醇以基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的4mol％至50mol％的量存在，更优选以5mol％至45mol％的量存在，更优选以10mol％至25mol％的量存在，更优选以4mol％至20mol％的量存在，更优选以14mol％至35mol％的量存在。

磷脂酰乙醇胺

术语“磷脂酰乙醇胺”是指具有磷酰乙醇胺头部基团的磷酸甘油酯。在本发明的含义内使用的术语“至少一种磷脂酰乙醇胺”包括一种特定的磷脂酰乙醇胺以及两种或更多种不同磷脂酰乙醇胺的混合物。

磷脂酰乙醇胺可以具有以下结构：

R₁和R₂残基是脂肪酸残基，通常是天然存在的脂肪酸或天然存在的脂肪酸衍生物的残基。在另一个实施例中，脂肪酸残基是衍生自饱和脂肪酸部分的残基。“饱和”是指烃链中不存在双键。合适的脂肪酸的非限制性示例是14:0；15:0、16:0、16:1、17:0、18:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:0、20:1、20:2、20:3、10:4、22:0、22:1、22:4、22:6、24:0和24:1。因此，R₁和R₂优选地彼此独立地选自由以下项组成的组：14:0；15:0、16:0、16:1、17:0、18:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:0、20:1、20:2、20:3、20:4、22:0。22:1、22:4、22:6、24:0和24:1。R₁和R₂的优选组合是在任何可能的脂肪酸长度组合中的两种完全饱和脂肪酸(例如14:0、14:0、14:0、16:0等)，一种完全脂肪酸加一种具有至少一个双键的不饱和脂肪酸(例如14:0、14:1、14:0、16:1等)或两个具有至少一个双键的不饱和脂肪酸(例如14:1、14:1、14：1、16:1等)。

应当理解，脂质囊泡可以包含两种或更多种不同磷脂酰乙醇胺的混合物。

磷脂酰乙醇胺可以是天然存在的磷脂酰乙醇胺或合成的磷脂酰乙醇胺。优选地，磷脂酰乙醇胺是天然存在的磷脂酰乙醇胺。

磷脂酰乙醇胺的非限制性示例是二甲基二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、L-α-磷脂酰乙醇胺、(2-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE))和用上文列举的任何脂肪酸部分修饰的磷脂酰乙醇胺。优选地，磷脂酰乙醇胺是L-α-磷脂酰乙醇胺。

对于大多数，例如所有本发明的脂质囊泡，磷脂酰乙醇胺以基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的2mol％至70mol％、例如10mol％至70mol％、例如10mol％至50mol％、更优选地为10mol％至30mol％、更优选地为19mol％至23.5mol％的脂质囊泡的量存在。

磷脂酰乙醇胺和胆固醇

根据本发明的一个实施例，根据本发明的脂质囊泡包含胆固醇和至少一种磷脂酰乙醇胺。

优选地，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)在2mol％至90mol％、例如30mol％至90mol％、优选30mol％至80mol％、更优选31mol％至65mol％的范围内的磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总量，并计算为磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。优选地，磷脂酰乙醇胺是L-α-磷脂酰乙醇胺。

优选地，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)5mol％至50mol％的胆固醇。根据本发明的一个实施例，脂质囊泡包含基于每个脂质囊泡的总量的4mol％至50mol％、更优选地为5mol％至45mol％、更优选地为10mol％至25mol％、更优选地为4mol％至20mol％、更优选地为14mol％至35mol％的胆固醇，以及基于每个脂质囊泡的总量在2mol％至90mol％、更优选地为30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的范围内的磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和，并且优选地磷脂酰乙醇胺为L-α-磷脂酰乙醇胺。

优选地，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量的2mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺，更优选地为L-α-磷脂酰乙醇胺。更优选地，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量的10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺，特别是L-α-磷脂酰乙醇胺。

根据本发明的一个优选实施例，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量的10mol％至70mol％、更优选地为10mol％至50mol％、更优选地为10mol％至30mol％、更优选地为19mol％至23.5mol％的磷脂酰乙醇胺、更优选地为L-α-磷脂酰乙醇胺，以及基于负载的脂质囊泡本身的总量的2mol％至90mol％、例如30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。

在一个进一步的实施例中，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量的4mol％至50mol％、更优选地为5mol％至45mol％、更优选地为10mol％至25mol％、更优选地为4mol％至20mol％、更优选地为14mol％至35mol％的胆固醇，以及2mol％至70mol％、更优选地为10mol％至70mol％、更优选地为10mol％至50mol％、更优选地为10mol％至30mol％、更优选地为19mol％至23.5mol％的磷脂酰乙醇胺、更优选地为L-α-磷脂酰乙醇胺，其中具有2mol％至90mol％、例如30mol％至90mol％、例如30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。

在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量的4mol％至50mol％的胆固醇和10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺，其中具有30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。

磷脂酰胆碱

术语“磷脂酰胆碱”是指具有磷酸胆碱头部基团的磷酸甘油酯。在本发明的含义内使用的术语“至少一种磷脂酰胆碱”包括一种特定的磷脂酰胆碱以及两种或更多种不同磷脂酰胆碱的混合物。

磷脂酰胆碱化合物通常具有以下结构：

R₃和R₄残基是脂肪酸残基，通常是天然存在的脂肪酸或天然存在的脂肪酸衍生物的残基。在另一个实施例中，脂肪酸残基是衍生自饱和脂肪酸部分的残基。“饱和”是指烃链中不存在双键。合适的脂肪酸的非限制性示例是辛酸、CH3(CH2)6COOH，8:0；癸酸、CH3(CH2)8COOH，10:0；月桂酸，CH3(CH2)10COOH，12:0；肉豆蔻酸，CH₃(CH₂)₁₂COOH，14:0；棕榈酸，CH₃(CH₂)₁₄COOH，16:0；硬脂酸，CH₃(CH₂)₁₆COOH，18:0；花生酸，CH₃(CH₂)₁₈COOH，20:0；二十二酸，CH₃(CH₂)₂₀COOH，22:0；二十四酸，CH₃(CH₂)₂₂COOH，24:0；二十六酸，CH₃(CH₂)₂₄COOH，26:0，以及15:0、16：1、17:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:1、20:2、20:3、20:4、22:1、22:4、22:6、24:0和24:1。

因此，R₃和R₄优选地彼此独立地选自由以下项组成的组：8:0、10:0、12:0、14:0；15:0、16:0、16:1、17:0、18:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:0、20:1、20:2、20:3、20:4、22:0。22:1、22:4、22:6、24:0和24:1。应当理解，脂质囊泡可包含两种或更多种不同磷脂酰胆碱的混合物。

至少一种磷脂酰胆碱可以是天然存在的磷脂酰胆碱或合成的磷脂酰胆碱。优选地，磷脂酰胆碱是对称的磷脂酰胆碱(即其中两个脂肪酸部分相同的磷脂酰胆碱)。

磷脂酰胆碱的非限制性示例是大豆磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱(Egg-PC)、二(山萮酸)磷脂酰胆碱(DBPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱(DMPC)、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、二油酰-磷脂酰胆碱(DOPC)、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)和用上文列举的任何脂肪酸部分修饰的磷脂酰胆碱。

如本文所用，术语“大豆磷脂酰胆碱”是指磷脂酰胆碱的多种不饱和和饱和脂肪酸组合物。在一个实施例中，大豆磷脂酰胆碱已从大豆植物，例如，从大豆种子中分离。通常，大豆磷脂酰胆碱包含含有选自由以下项组成的组的脂肪酸残基的磷脂酰胆碱的混合物：16:0、18:0、18：1、18:2和18:3。在一个实施例中，大豆磷脂酰胆碱包含含有源自16:0、18:0、18:1、18:2和18:3的脂肪酸残基的磷脂酰胆碱的混合物。

在一个进一步的实施例中，大豆磷脂酰胆碱包含约12％-约33mol％的棕榈酸(16:0)；约3％-约12％mol％的硬脂酸(C18:0)；约4％-至约40mol％的油酸(18:1)；约17％-约66mol％的亚油酸(18:2)；约2％-至约10mol％的亚麻酸(18:3)(Szuhaj，B.F.(Ed.)。(1989)中所述的技术，用配体试剂标记抗体，该配体试剂结合、螯合或以其他方式复合放射性同位素金属，其中该试剂与抗体的工程半胱氨酸硫醇反应。卵磷脂：来源、制造和用途(AOCS专著，American Oil Chemists′Society，ISBN 9780935315271，Urbana，USA)。

本申请中使用的术语“卵磷脂酰胆碱”是指L-α-磷脂酰胆碱的组合物，包括但不限于各种饱和和不饱和脂肪酸。优选地，卵磷脂酰胆碱包含约33mol％的棕榈酸；约10％mol％的硬脂酸；约31％mol％的油酸；以约18mol％的量存在的亚油酸。

在一个实施例中，至少一种磷脂酰胆碱是Egg-PC和/或DLPC和/或DOPC，特别是Egg-PC和/或DOPC。

此外，设想磷脂酰胆碱不是DSPC或DLPC，因此脂质囊泡优选地不包含DSPC和/或不包含DLPC，优选地既不包含DSCP也不包含DLCP。

此外，设想磷脂酰胆碱是合成衍生的并且包含混合的饱和和不饱和脂肪酸基团(例如14:0-16:0；14:0-18:0；16:0-14:0；16:0-18:0；16:0-18:1；16:0-18:2；16:0-20:4；16:0-22:6；18:0-14:0；18:0-16:0；18:0-18:1；18:0-18:2；18:0-20:4；18:0-22:6；18:1-14:0；18:1-16:0；18:1-16:0；18:1-18:0；16:0-20:0)。

对于本发明的脂质囊泡，磷脂酰胆碱以基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的0至40mol％、例如1.9mol％至40mol％、例如4mol％至36mol％、优选地为4mol％至15mol％、优选地为20mol％至36mol％的脂质囊泡的量存在。

磷脂酰丝氨酸

术语“磷脂酰丝氨酸”是指包含以酯键连接到甘油的第一个和第二个碳的两个脂肪酸，和通过磷酸二酯键连接到甘油的第三个碳的丝氨酸的磷脂。在本发明的含义内使用的术语“至少一种磷脂酰丝氨酸”包括一种特定的磷脂酰丝氨酸以及两种或更多种不同磷脂酰胆碱的混合物。

磷脂酰丝氨酸可以具有以下结构：

R₅和R₆残基是通过酯键连接的脂肪酸残基，通常是天然存在的脂肪酸或天然存在的脂肪酸衍生物的残基。在另一个实施例中，脂肪酸残基是衍生自饱和脂肪酸部分的残基。“饱和”是指烃链中不存在双键。合适的脂肪酸的非限制性示例是8:0、10:0、12:0、14:0；15:0、16:0、16:1、17:0、18:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:0、20:1、20:2、20:3、20:4、22:0、22:1、22:4、22:6、24:0和24:1，特别是16:0、18:0、18:1、18:2、18:3、20:4和22:6。因此，R₅和R₆优选地彼此独立地选自由以下项组成的组：8:0、10:0、12:0、14:0；15:0、16:0、16:1、17:0、18:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:0、20:1、20:2、20:3、20:4、22:0。22:1、22:4、22:6、24:0和24:1。应当理解，脂质囊泡可包含两种或更多种不同磷脂酰丝氨酸的混合物。

至少一种磷脂酰丝氨酸可以是天然存在的或合成的磷脂酰丝氨酸。优选地，磷脂酰丝氨酸是对称的磷脂酰丝氨酸(即其中两个脂肪酸部分相同的磷脂酰丝氨酸)。

磷脂酰丝氨酸的非限制性示例是L-α脑PS(通常包含源自18:0、18:1和20:4、22:6的脂肪酸残基)或大豆PS(通常包含源自16:0、18:0、18:1、18:2和18:3的脂肪酸残基)。优选地，磷脂酰丝氨酸为1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(L-α-PS)，优选地来自大豆。优选地，磷脂酰丝氨酸是1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(L-α-PS)，优选地来自牛脑(通常包含衍生自18:0、18:1、20:4和22:6的脂肪酸残基)。

对于本发明的脂质囊泡，磷脂酰丝氨酸以基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的0至45mol％、例如2mol％至20mol％、例如4mol％至36mol％、优选地为12mol％至20mol％、优选地为20mol％至31mol％的脂质囊泡的量存在。

溶血双磷脂酸.

术语“溶血双磷脂酸”也称为双(单酰甘油)磷酸酯(′BMP′)是指带负电荷的磷脂，更具体地是甘油-磷脂。BMP最初是从兔肺中分离出来的，但现在已知是所有动物组织中常见但次要的成分。其立体化学构型与其他动物甘油磷脂的立体化学构型的不同在于，磷酸二酯部分与甘油的sn-1和sn-1′位相连接，而不是与sn-3位相连接。尚不清楚甘油部分中的sn-3和3′或sn-2和sn-2′位是否被脂肪酸酯化。

溶血双磷脂酸的非限制性示例是18:1 BMP(R，R)、sn-(1-油酰基-2-羟基)-甘油-3-磷酸-sn-3′-(1′-油酰基-2′-羟基)-甘油；18:1 BMP(S，S)、sn-(3-油酰基-2-羟基)-甘油-1-磷酸-sn-1′-(3′-油酰基-2′-羟基)-甘油；14:0 BMP(S，R)、双(单肉豆蔻酰基甘油)磷酸酯(S，R异构体)；18:1 BMP(S，R)、双(单油酰甘油)磷酸酯(S，R异构体)。

优选地，溶血双磷脂酸是双(单油酰甘油)磷酸酯(S，R异构体)。

优选地，脂质囊泡包含基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)的量在0至12mol％、例如4mol％至12mol％、更优选地为4mol％至6mol％、更优选地为10mol％到12mol％的范围内的至少一种溶血双磷脂酸。

磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和落血双磷脂酸

上文和下文描述的脂质囊泡优选地进一步包含至少一种磷脂酰胆碱和/或至少一种磷脂酰丝氨酸和/或至少一种溶血双磷脂酸。

优选地，以磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和溶血双磷脂酸的总和计算的并且基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)，脂质囊泡中存在的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和溶血双磷脂酸的总和在10mol％至54mol％的范围内。优选地，基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)，脂质囊泡包含0至45mol％、例如1.9mol％至40mol％、例如10mol％至40mol％、例如4mol％至36mol％、优选地为4mol％至15mol％、优选地为20mol％至36mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱。优选地，脂质囊泡包含在未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的0至45mol％脂质囊泡、例如2mol％至20mol％、例如4mol％至36mol％、优选地为12mol％至20mol％、优选地为14mol％至42mol％、更优选地为14mol％至20mol％、优选地为20mol％至31mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸。

优选地，脂质囊泡包含＞0mol％，例如2mol％至40mol％的磷脂酰胆碱，其中更优选地，所述磷脂酰胆碱为Egg-PC和/或DOPC。如果脂质囊泡包含至少一种磷脂酰胆碱，基于未负载的脂质囊泡的总量并且以存在于脂质囊泡中的所有磷脂酰胆碱的总和计算，优选地以4mol％至36mol％的量包含磷脂酰胆碱。

在一个进一步的实施例中，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量，

i)量在4mol％至50mol％、更优选地为5mol％至45mol％、更优选地为10mol％至25mol％、更优选地为4mol％至20mol％、更优选地为14mol％至35mol％的范围内的胆固醇，以及

ii)量在2mol％至70mol％、更优选地为10mol％至70mol％、更优选地为10mol％至50mol％、更优选地为10mol％至30mol％、更优选地为19mol％至23.5mol％的范围内的磷脂酰乙醇胺、更优选地为L-α-磷脂酰乙醇，

其中磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和为30mol％至80mol％，以及

iii)磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和/或溶血双磷脂酸以磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和溶血双磷脂酸的总和计算的并且基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)以在10mol％至54mol％范围内存在。

在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含

i)基于未负载的脂质囊泡本身的总量的4mol％至50mol％的胆固醇，以及

ii)10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺

其中具有30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和；以及

iii)量在0至40mol％、例如4mol％至36mol％的范围内的磷脂酰胆碱。

iv)量在0至45mol％脂质囊泡、例如12mol％至20mol％的范围内的磷脂酰丝氨酸；

v)量在0至12mol％、例如4mol％至12mol％的范围内的溶血双磷脂酸，

其中具有在10mol％至54mol％的范围内存在的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和/或溶血双磷脂酸的总和。

更多组分

如上所述，脂质囊泡可以进一步包含至少一种鞘磷脂和/或二酰甘油和/或三酰甘油和/或磷脂酰肌醇。

鞘磷脂

术语“鞘磷脂”是技术人员已知的，并且是指通常包含磷酸胆碱头部基团、鞘氨醇和脂肪酸的脂质。它是少数不是由甘油合成的膜磷脂之一。

鞘磷脂可选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂、合成鞘磷脂及其两种或更多种的混合物，或完全合成衍生的鞘磷脂。鞘磷脂可以例如包含衍生自脂肪酸衍生物，例如8:0、10:0、12:0、14:0；15:0、16:0、16:1、17:0、18:0、18:1、18:2、18:3、19:0、20:0、20:1、20:2、20:3、20:4、22:0。22:1、22:4、22:6、23:0、24:0和24:1的脂肪酸衍生物。

例如，鞘磷脂是脑鞘磷脂，例如猪或猴脑鞘磷脂，优选地通常包含鞘磷脂的混合物，所述鞘磷脂包含衍生自脂肪酸例如16:0、18:0、20:0、22:0、24:0和24:1的脂肪酸衍生物。

或者，鞘磷脂是卵鞘磷脂，优选地通常包含鞘磷脂的混合物，所述鞘磷脂包含衍生自脂肪酸例如16:0、18:0和24:0的脂肪酸衍生物。

或者，鞘磷脂是乳鞘磷脂，优选地通常包含鞘磷脂的混合物，所述鞘磷脂包含衍生自脂肪酸例如16:0、22:0、23:0、24:0、24:1的脂肪酸衍生物。

优选地，鞘磷脂可以是乳鞘磷脂。

如果脂质囊泡包含至少一种鞘磷脂，则脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的2mol％至45mol％、例如15mol％至45mol％、例如4mol％至25mol％、更优选地为2mol％至15mol％、更优选地为4mol％至13mol％、更优选地为2mol％至7mol％的范围内的量的至少一种鞘磷脂。

i)基于所述未负载的脂质囊泡本身的总量，量在4mol％至50mol％、更优选地为5mol％至45mol％、更优选地为10mol％至25mol％、更优选地为4mol％至20mol％、更优选地为14mol％至35mol％的胆固醇，并且

其中，磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和为30mol％至80mol％；以及

iii)量在2mol％至45mol％、例如15mol％至45mol％、例如4mol％至25mol％、更优选地为2mol％至15mol％、更优选地为4mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂。

ii)10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺

iii)磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和/或溶血双磷脂酸通过以脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和溶血双磷脂酸的总和计算并且基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)而在10mol％至54mol％的范围内存在；以及

iv)量在2mol％至45mol％、例如15mol％至45mol％、例如4mol％至25mol％、更优选地为2mol％至15mol％、更优选地为4mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂。

在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含

ii)10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺

iii)量在2mol％至40mol％、例如4mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂。

在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含

ii)10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺

iii)量在0至40mol％、例如4mol％至36mol％的范围内的磷脂酰胆碱，

iv)量在0至45mol％、例如12mol％至20mol％的范围内的磷脂酰丝氨酸，

v)量在0至12mol％脂质囊泡、例如4mol％至12mol％的范围内的溶血双磷脂酸，

其中具有以10mol％至54mol％的范围内存在的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸和/或溶血双磷脂酸的总和；以及

vi)量在2mol％至45mol％、例如2mol％至15mol％、更优选地为4mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂。

二酰甘油

术语“二酰甘油”(DAG)是指包含通过酯键共价连接至甘油的两个脂肪酸残基的甘油酯。存在两种可能的形式，1，2-二酰甘油和1，3-二酰甘油。尽管1，2-二酰基-外消旋-甘油是有用的，但二酰甘油优选地为1，2-二酰甘油，并且最优选地为1，2-二酰基-sn-二醇。

连接至甘油的脂肪酸残基可源自的代表性饱和游离脂肪酸(脂肪酸)包括但不限于：甲酸；乙醇；丙酸；丁酸；戊酸；己酸；庚酸；辛酸；壬酸；癸酸；十一酸；十二酸(月桂酸)；十三酸；十四酸(肉豆蔻酸)；十五酸；十六烷酸(棕榈酸)；十七酸；十八酸(硬脂酸)；十九酸；二十酸(花生酸)；二十一酸；二十二酸(山嵛酸)；二十三酸；二十四酸；二十五酸；二十六酸(蜡酸)；二十七酸；二十八酸(褐煤酸)；二十九酸；三十酸(蜂花酸)等。

优选地，如果存在的话，二酰甘油是二棕榈酸甘油酯，连接到甘油上的脂肪酸残基因此优选衍生自十六酸(棕榈酸)。

优选地，脂质囊泡包含基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)的量在0至5mol％、例如3mol％至5mol％的范围内的至少一种二酰甘油。

三酰甘油

术语“三酰甘油”(TAG)是指包含通过酯键共价连接至甘油的三个脂肪酸残基的甘油酯。

连接至甘油的脂肪酸残基可源自的代表性饱和游离脂肪酸(脂肪酸)包括但不限于：甲酸、乙醇、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十二酸(月桂酸)、十三酸、十四酸(肉豆蔻酸)、十五酸、十六烷酸(棕榈酸)、十七酸、十八酸(硬脂酸)、十九酸、二十酸(花生酸)、二十一酸、二十二酸(山嵛酸)、二十三酸、二十四酸、二十五酸、二十六酸(蜡酸)、二十七酸、二十八酸(褐煤酸)、二十九酸、三十酸(蜂花酸)等。

优选地，甘油三酯(TAG)是甘油三硬脂酸酯，因此连接到甘油的脂肪酸残基优选地衍生自十八酸。

优选地，基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)，脂质囊泡包含基于脂质囊泡的总量(以[mol]计)的量在0至5mol％、例如3mol％至5mol％的范围内的至少一种三酰甘油。

磷脂酰肌醇

术语“磷脂酰肌醇”或“PI”是指含有连接至磷脂酸的磷酸酯基团的肌醇的酸性磷脂。

磷脂酰肌醇可以是天然磷脂酰肌醇或合成磷脂酰肌醇。作为天然磷脂酰肌醇，例如可以提及L-a-磷脂酰肌醇(钠盐)(例如，来自牛肝或大豆)、L-a-磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(铵盐)(例如，来自猪脑)(脑PI(4)P)或L-a-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(铵盐)(例如来自猪脑)(脑PI(4，5)P2)。优选地，磷脂酰肌醇包含选自由以下项组成的组的脂肪酸：16:0、18:0、18:1、18:2、18:3、20:3、20:4及其组合。

优选地，磷脂酰肌醇是L-a-磷脂酰肌醇，更优选地为L-a-磷脂酰肌醇(牛肝(“肝PI”))。

优选地，在脂质囊泡包含至少一种二酰甘油和/或至少一种三酰甘油和/或至少一种磷脂酰肌醇的情况下，其中二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇的总和的总量为0至15mol％的范围内的脂质囊泡。

优选地，脂质囊泡包含量在0至5mol％的范围内的二酰甘油，和量在0至5mol％的范围内的三酰甘油，和量在0至5mol％的范围内的磷脂酰肌醇。

其中，磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和为30mol％至80mol％；以及

iii)量在0至5mol％的范围内的至少一种二酰甘油；

iv)量在0至5mol％的范围内的至少一种三酰甘油；和

v)量在0至5mol％的范围内的至少一种磷脂酰肌醇。

其中，磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和为30mol％至80mol％；以及

iv)量在至少一种2mol％至45mol％、例如15mol％至45mol％、例如4mol％至25mol％、更优选地为2mol％至15mol％、更优选地为4mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂；和

v)至少一种二酰甘油和/或至少一种三酰甘油和/或至少一种磷脂酰肌醇的情况下，其中二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇的总和的总量为0至15mol％的范围内的脂质囊泡。

在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含

ii)10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺

iii)量在至少一种0至5mol％的范围内的二酰甘油；

iv)量在0至5mol％的范围内的至少一种三酰甘油；和

v)量在0至5mol％的范围内的至少一种磷脂酰肌醇。

在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含

ii)10mol％至70mol％的磷脂酰乙醇胺

vii)至少一种二酰甘油和/或至少一种三酰甘油和/或至少一种磷脂酰肌醇的情况下，其中二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇的总和的总量为0至15mol％的范围内的脂质囊泡。

核酸分子

本文提供的脂质囊泡应携带核酸分子，例如寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)或RNA干扰(RNAi)分子。如本文所用，术语“核酸分子”或“治疗性核酸分子”如技术人员通常理解的那样定义为包含两个或更多个共价连接的核苷(即核苷酸序列)的分子。本发明方法中提及的核酸分子通常是长度低于50个核苷酸的治疗性寡核苷酸。核酸分子可以是或包含反义寡核苷酸，或者可以是另一种核酸分子，例如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、适体或核酶。治疗性核酸分子通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化和分离来制备。然而，shRNA通常使用慢病毒载体传递至细胞中(参见例如Soan和Yang 2010 N Am J Med Sci 2(12)：598)，然后转录以产生单链RNA，该单链RNA将形成茎环(发夹)RNA结构，该结构能够与RNA干扰机制(包括RNA诱导沉默复合物(RISC))相互作用。当提及核酸分子的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的核酸分子是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。在一些实施例中，本发明的核酸分子不是在进入靶细胞时从载体转录的shRNA。本发明的核酸分子可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。

在一些实施例中，本发明的核酸分子包含长度为7个至60个的核苷酸或由其组成，例如长度为8个至60个、例如10个至55个、例如12个至50个、例如13个至45个、例如14个至40个、例如15个至30个、例如16个至22个、例如16个至18个或15个至17个的连续核苷酸。

在一些实施例中，核酸分子或其连续核苷酸序列包含24个或更少的核苷酸或由其组成，例如22个、例如20个或更少、例如18个或更少、例如14个、15个、16个或17个核苷酸。应知在本文中给定的所有范围均包括范围端点。因此，如果说核酸分子包含12个至30个核苷酸，则12个和30个核苷酸均包含在内。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含或由长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个邻接核苷酸组成

核酸分子用于调节哺乳动物中靶核酸的表达。在一些实施例中，核酸分子，例如siRNA、shRNA和反义寡核苷酸的核酸分子通常用于抑制靶核酸的表达。

在本发明的一个实施例中，核酸分子选自RNAi剂，例如siRNA或shRNA。在另一个实施例中，核酸分子是单链反义寡核苷酸，例如与RNA酶H相互作用的高亲和力修饰的反义寡核苷酸。

在一些实施例中，核酸分子包含硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，核酸分子可以缀合至非核苷部分(缀合物部分)。

核酸分子文库应理解为变体核酸分子的集合。核酸分子文库的目的可以变化。在一些实施例中，核酸分子文库由具有重叠核碱基序列的寡核苷酸组成，该序列靶向一个或多个哺乳动物FUBP1靶核酸，目的是识别核酸分子文库中最有效的序列。在一些实施例中，核酸分子文库是亲代或祖代核酸分子的核酸分子设计变体(子核酸分子)文库，其中核酸分子设计变体保留了亲代核酸分子的核心核碱基序列。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过寡核苷酸合成然后纯化和分离来制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2′糖修饰的核苷。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要内部或之间自我互补性的程度跨寡核苷酸全长小于50％即可。

有利的是，本发明的单链反义寡核苷酸不含有RNA核苷，因为这将会降低核酸酶抗性。

有利的是，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2′糖修饰的核苷。此外，有利的是，所述未经修饰的核苷是DNA核苷。

RNAi分子

在本文中，术语“RNA干扰(RNAi)分子”是指能够通过细胞质中RNA诱导沉默复合物(RISC)来诱导RNA依赖性基因沉默的短双链RNA分子，其中它们与催化RISC组分AGO(argonaute)相互作用。RNAi分子的一种类型是小干扰RNA(siRNA)，它是由两个互补寡核苷酸组成的双链RNA分子，其中转录后一条链与互补mRNA的结合导致其降解和翻译损失。小发夹RNA(shRNA)是基于单链RNA分子，可形成茎环(发夹)结构，该结构在表达时能够通过DICER和RNA减少沉默复合物(RISC)减少mRNA。可以基于目的基因(靶核酸)的序列设计RNAi分子。然后可以化学合成或通过体外转录合成相应的RNAi，或从载体或PCR产物表达。

shRNA分子的长度通常为40个至70个核苷酸，例如长度为45个至65个核苷酸，例如长度为50个至60个核苷酸，并且与被称为Dicer的核酸内切酶相互作用，据信Dicer将dsRNA加工成19-23个具有特征性的两个碱基3′突出端的碱基对短干扰RNA，然后将碱基3′突出端整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。siRNA分子是双链的，每条链的长度为18个至35.个核苷酸，例如长度为20个至30个核苷酸，例如长度为22个至27个核苷酸。siRNA通常设计有两个碱基3′突出端，以类似于Dicer生成的产物，该产物形成RISC底物。Dicer底物的有效扩展形式已在US 8,349,809和US 8,513,207中进行了描述，在此通过引用并入。与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一个或多个核酸内切酶切割靶以诱导沉默。RNAi寡核苷酸可以使用修饰的核苷酸间键和2′糖修饰的核苷进行化学修饰，例如2′-4′双环核糖修饰的核苷(包括LNA和cET)或2′取代的修饰，例如2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和三环DNA(TcDNA；Nature Medicine 2015，3(21)，270-275)。

在一些实施例中，RNAi核酸分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。在RNAi分子中，硫代磷酸酯核苷间键可能会减少或在RICS中进行核酸酶切割，因此有利的是，并非所有核苷间键都被修饰。硫代磷酸酯核苷间键可以优选地位于RNAi核酸分子的3′和/或5′端，特别是在与靶核酸不互补的分子的一部分(例如siRNA分子中的正义链或过客链)。然而，与靶核酸互补的RNAi分子区域(例如siRNA分子中的反义链或引导链)也可以在3′和/或5′末端的前2至3个核苷间键中进行修饰。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“邻接核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含与靶核酸杂交的连续核苷酸序列，例如F-G-F′缺口聚物区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸连接基区域。核苷酸连接基区域可以与靶核酸互补或可以不互补。冒险地，连续核苷酸序列与靶核酸100％互补。

核苷酸

核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷及核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤及鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry Suppl.371.4.1中。

核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于含有LNA的寡核苷酸，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

修饰的核苷间键

如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域F和区域F′)中起到保护免受核酸酶剪切的作用。

在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。

在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。在一些实施例中，本文所提到的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是修饰的核苷间键，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是修饰的核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列都是修饰的核苷间键。

在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列都是抗核酸酶核苷间键。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。

优选地，修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键、二硫代磷酸酯核苷间键或硼烷磷酸酯核苷间键。

优选的修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯键，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯键。

抗核酸酶键，诸如硫代磷酸酯键，在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚物的区域G。然而，硫代磷酸酯键也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，诸如缺口聚物或混聚物和全聚物的区域F和F′。在一些实施例中，缺口聚物寡核苷酸可在区域F或F′或区域F和F′两者均包含一个或多个磷酸二酯键合，其中区域G中的核苷间键可以完全是硫代磷酸酯。

有利地，寡核苷酸的连续核苷酸序列中的所有核苷间键合都是硫代磷酸酯键合。

应当认识到的是，如EP2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键合(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯间核苷，其根据EP2 742135可以例如以其他方式被DNA硫代磷酸酯的间隔区域中所耐受。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入形成寡核苷酸骨架的部分的一种或多种化学修饰而修饰的核苷，例如对糖部分的修饰或用替代化学结构取代糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。

已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善核酸分子的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

这些修饰包括对核糖环结构的修饰，例如替代为己糖环(HNA)或双环，其通常在核糖环(LNA)上的C2与C4碳原子之间具有双基桥(biradicle bridge)，或通常在C2与C3碳原子之间无键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。

修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(PMO)

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于RNA和DNA核苷中的-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5′位引入取代基。

具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。

如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。

2′糖修饰的核苷。

2′糖修饰的核苷是在2′位置具有除H或-OH以外的取代基的核苷(2′取代的核苷)或包含能够在核糖环中的2′碳与第二碳之间形成桥的2′连接的双基的核苷，诸如LNA(2′-4′双基桥接的)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2′取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2′取代修饰的核苷的示例包括′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA及2′-F-ANA核苷。有关进一步的示例，请参见例如Freier与Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213和Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些2′取代的修饰的核苷的示意图。

除了基于核糖的核苷修饰外，所谓的三环DNA(TcDNA)是对上述核苷修饰清单的进一步补充。

关于本发明，2′取代不包括2′桥接的分子如LNA。

修饰的反义寡核苷酸

如本文所用，修饰的反义寡核苷酸是其中寡核苷酸骨架与天然存在的RNA或DNA寡核苷酸相比已经被修饰的寡核苷酸。寡核苷酸骨架是指核苷酸间键和/或糖部分，但通常不指碱基部分的修饰。

反义寡核苷酸骨架的修饰通常用于治疗性寡核苷酸以增加稳定性，特别是对核酸酶的稳定性或增加对靶核酸的亲和力。

增加稳定性的修饰是例如修饰的核苷间键、一些糖修饰以及肽骨架。增加亲和力的修饰是例如糖修饰。

本文所提到的修饰的单链反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。寡核苷酸可以包含2′糖修饰的核苷酸和DNA或RNA核苷的混合物，例如在缺口聚物或混聚物设计中，这些有时也称为“嵌合”寡核苷酸。PNA和吗啉代寡核苷酸通常由相同的骨架组成，因此它们仅由PNA部分或吗啉代部分组成。

在一些实施例中，修饰的寡核苷酸可以包含以下项或由其组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列，诸如缺口聚物、混聚物或全聚物区域，以及另外的可以不与靶核酸完全互补的5′和/或3′核苷。这种另外的末端核苷可以是例如2至4个磷酸二酯连接的DNA核苷，并且用作与靶核酸互补的连续核苷酸序列和例如缀合物部分之间的生物可切割连接基。

修饰的单链反义寡核苷酸的长度通常为7个至35个核苷酸。在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸的长度为7至30个核苷酸。在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸的长度为10至30个核苷酸。在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸的长度为14至30个核苷酸。在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸的长度为14至20个核苷酸。在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸的长度为7至14个核苷酸。在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸的长度为8至12个核苷酸。

单数形式的术语反义寡核苷酸“反义寡核苷酸”或“修饰的反义寡核苷酸”是指一群寡核苷酸，它们共享共同的核碱基序列和化学修饰模式，并且通常源自共同的生产过程。

锁定核酸(LNA)

“LNA核苷”是一种2′-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2′和C4′的双基(也称为“2′-4′桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷耐互补双链体的解链温度确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人(Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76，Seth等人.J.Org.Chem.2010，Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research2009，37(4)，1225-1238和Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016，59，9645-9667中。

其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。

方案1：

特别的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA，诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)及ENA。

一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。

缺口聚物

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是缺口聚物，也称为缺口聚物寡核苷酸或缺口聚物设计。反义缺口聚物一般用于通过核糖核酸酶H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚物寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，分别为“5-＞3”方向的5′侧翼、缺口和3′侧翼F-G-F′。“缺口”区域(G)包含连续DNA核苷酸的区段，其使得寡核苷酸能够募集RNA酶H，例如5-16个连续的DNA核苷酸。所述缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地为高亲和力糖修饰的核苷)的5′侧翼区域(F)，有利地是高亲和力的2′糖修饰的核苷，和包含一种或多种糖修饰的核苷的3′侧翼区域(F′)，有利地是高亲和力的2′糖修饰的核苷。侧翼区域独立地由1-8个连续的核苷酸组成，每个末端都有一个糖修饰的核苷。区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷是2′糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2′糖修饰、诸如独立地选自LNA和2′-MOE。

在缺口聚物设计中，缺口区域的5′和3′最末端核苷为DNA核苷，例如70％、75％、80％、85％、90％或100％。DNA总是分别位于5′(F)或3′(F′)区域的糖修饰核苷附近。在某些情况下，Gap区域可以包含不阻止RNA酶H切割的修饰核苷，例如，α-L-LNA、C4′烷基化DNA(如描述于WO/2009/090182和Vester等人.，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，两者均通过引用并入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷例如ANA和2′F-ANA(Mangos等人，2003J.AM.CHEM.SOC.125，654-661)、UNA(非锁定核酸)(如Fluiter等人，Mol.Biosyst.，2009，10，1039中所述，通过引用并入本文)。所述侧翼可进一步定义为在距离所述缺口区域最远的端，也就是在5′侧翼的5′端及在3′侧翼的3′端具有至少一个糖修饰的核苷。

区域F-G-F′形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F′的缺口聚物区域。

缺口聚物设计F-G-F′的总长度可以是例如12个至32个核苷，诸如13个至24个核苷、诸如14个至22个核苷、诸如14个至20个核苷、诸如16个至18个核苷。

举例来说，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以由下式表示：

F_1-8-G_5-16-F′_1-8，诸如

F_1-8-G_7-16-F′_2-8

前提条件是缺口聚物区域F-G-F′的总长度至少为12个，诸如至少14个核苷酸。

LNA缺口聚物

本文提供的脂质囊泡的修饰的单链反义寡核苷酸可以是LNA缺口聚物。LNA缺口聚物是其中区域F和F′中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚物。β-D-氧基缺口聚物是其中区域F和F′中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚物。

在经典的LNA缺口聚物中，两侧翼均由LNA核苷组成。然而，还描述了交替侧翼LNA缺口聚物，其中一个或两个侧翼区域包含LNA和DNA核苷(参见例如WO2016/127002)。在这样的交替设计中，侧翼区域F或F′，或F和F′两者都包含至少三个核苷，其中F和/或F′区域的5′和3′最末端核苷是LNA核苷。

在一些实施例中，LNA缺口聚物具有下式：[LNA]_1-5-[G]_6-16-[LNA]_1-5，其中G是RNA酶募集缺口区域。具有3-10-3(LNA-DNA-LNA)设计的LNA缺口聚物已广泛用于现有技术中。

MOE缺口聚物

本文提供的脂质囊泡的修饰的单链反义寡核苷酸可以是MOE缺口聚物。MOE缺口聚物是其中区域F和F′由MOE核苷组成的缺口聚物。在一些实施例中，该MOE缺口聚物的设计为[MOE]_1-8-[G]_5-16-[MOE]_1-8，例如[MOE]_2-7-[G]_6-14-[MOE]_2-7，例如[MOE]_3-6-[G]_8-12-[MOE]_3-6，其中区域G是RNA酶募集缺口区域。具有5-10-5设计的MOE缺口聚物(MOE-DNA-MOE)已在本领域中广泛使用。

混合型翼缺口聚物

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是混合型翼缺口聚物。混合型翼缺口聚物是一种LNA缺口聚物，其中区域F及F′中的一者或两者都包含2′取代的核苷，诸如独立选自由以下项组成的组的2′取代核苷：2′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元及2′-氟-ANA单元。在一些实施例中，区域F及F′中的至少一者或区域F及F′两者均包含至少一个LNA核苷，区域F及F′的其余核苷独立选自由以下项组成的组：MOE和LNA。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。

混合型翼缺口聚物设计已公开于WO2008/049085及WO2012/109395，该两者在此以引用方式并入。

会聚物

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是全聚物。全聚物是单链修饰的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列，其不包含DNA或RNA核苷，并且通常仅包含一种类型的核苷类似物。全聚物寡核苷酸的连续核苷酸序列通常为7个至16个核苷酸，例如8个至12个2′糖修饰的核苷，其中所述2′糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA(锁核酸)核苷。

通常短的全聚物(长度低于10个核苷酸)由100％LNA单元组成。对于更长的全聚物，一个或多个核苷单元可以选自非LNA核苷酸类似物，例如本文中提到的2′糖取代的核苷。

在一些实施例中，全聚物由仅由LNA单元组成的连续核苷酸序列组成或包含仅由LNA单元组成的连续核苷酸序列。

PNA和吗啉代寡核苷酸也可被视为全聚物。

全聚物设计已显示作为治疗性寡核苷酸是有效的，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡核苷酸(SSO)时。

混聚物

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是混聚物。混聚物是单链修饰的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列，其中与缺口聚物不同，没有超过5个天然存在的DNA核苷的连续序列，因此它不会招募RNA酶H。

通常，混聚物包含一种类型的核苷类似物(例如2′糖修饰的核苷)和天然存在的核苷(例如DNA)的重复模式的连续核苷酸序列或由其组成。例如，这可以是LNA核苷和DNA核苷的重复模式，在5′末端和3′末端以LNA开始和结束。然而，混聚物也可以组合不同类型的核苷类似物，使得重复模式例如是每两个或每三个核苷是核苷类似物，例如LNA，而其余核苷是天然存在的核苷，例如DNA，或2′糖取代的核苷类似物，例如2′氟类似物的2′MOE或本文提及的其他2′糖取代的核苷。混聚物通常在5′或3′末端有核苷类似物(独立选择的)。混聚物的示例描述于WO2007/027894、WO2007/112754、WO2007/112754(抗miR)和WO2008/131807(SSO)。核苷类似物和DNA的分布模式根据寡核苷酸序列进行优化。

混聚物设计作为治疗性寡核苷酸非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗mir)、mRNA上的微小RNA结合位点(阻断mir)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。

抗miR

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是抗mir。抗miR，也称为抗miRNA寡核苷酸，是一种能够控制微小RNA(miRNA)体内活性的反义寡核苷酸。miRNA是mRNA的互补序列(大约22bp)，参与RNA的切割或翻译的抑制。抗miR主要通过隔离成熟miRNA与细胞靶标mRNA竞争而发挥作用，从而导致miRNA的功能性抑制和直接靶标的去抑制(参见例如WO2009/043353和Stenvang等人2012Silence 3:1)。抗miR设计为具有更高的微小RNA结合亲和力和更高的核酸酶抗性，以提高其阻止微小RNA与靶标mRNA结合的能力。抗miR通常被设计为不诱导RNA酶H切割的全聚物或混聚物。

阻断mir

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是阻断mir。阻断mir，也称为拮抗剂mir，是一种反义寡核苷酸，可防止其他分子与mRNA分子上的所需位点结合。例如，这可以是mRNA上的微小RNA结合位点，从而阻止miRNA对其进行调节。因此，在抗miR直接靶向miRNA的情况下，阻断mir仅靶向特定的mRNA，防止它与例如miRNA相互作用。阻断mir通常被设计为不诱导RNA酶H切割的全聚物或混聚物。

剪接转换反义寡核苷酸(SSO)

本文提供的脂质囊泡所包含的修饰的单链反义寡核苷酸可以是剪接转换反义寡核苷酸。剪接转换寡核苷酸(SSO)是一种反义寡核苷酸，它与前体mRNA进行碱基配对，并通过阻断剪接机制的组分与前体mRNA之间发生的RNA-RNA碱基配对或蛋白质-RNA结合相互作用，来破坏转录物的正常剪接库。在由导致正常剪接破坏的突变引起的疾病或干扰基因转录的正常剪接过程可以具有治疗作用的情况下，剪接调节特别有价值(参见例如Havens和Hastings 2016Nucleic Acid Research 44：6549)。目前市场上有两种获批的SSO分子，Exondys 51(吗啉代SSO)用于治疗假肥大性肌营养不良，并且Spinraza(MOE全聚物SSO)用于治疗脊髓性肌萎缩。SSO通常被设计为不诱导RNA酶H切割的全聚物或混聚物。

缀合物

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。

单链反义寡核苷酸与脂质的缀合可以通过增加寡核苷酸的疏水性来改善单链反义寡核苷酸在脂质囊泡中的包封。

在一个实施例中，待封装到脂质囊泡中的单链反义寡核苷酸在5′或3′末端与亲脂性缀合物部分缀合。亲脂性缀合物部分可以选自由以下项组成的组：甾醇、甾烷醇、类固醇、多环芳族基团、脂肪族基团、脂质、磷脂、亲脂醇、脂肪酸和脂肪酯。

在一些实施例中，缀合物部分是或包含脂质、磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸酯或亲脂醇、棕榈基部分、阳离子脂质、中性脂质、鞘脂和脂肪酸，例如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、反亚油酸、亚麻酸和肉豆蔻酸。在一些实施例中，脂肪酸包含C4-C30饱和或不饱和烷基链。烷基链可以是直链或支链的。

亲脂性缀合物部分包括例如，甾醇、甾烷醇和类固醇和相关化合物，例如胆固醇(美国专利号4,958,013和Letsinger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553)、硫胆固醇(Oberhauser等人，Nucl Acids Res.，1992，20，533)、羊毛甾醇、粪醇、豆甾醇、麦角甾醇、骨化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、生育酚、雄甾酮、去氧皮质酮、可的松、17-羟基皮质酮、它们的衍生物等。在一些实施例中，缀合物可选自由以下项组成的组：胆固醇、硫代胆固醇、己氨基-羰基-氧胆固醇、羊毛甾醇、粪醇、豆甾醇、麦角甾醇、骨化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质酮、可的松和17-羟基皮质酮。在一些实施例中，缀合物部分包含生育酚。在一些实施例中，缀合物部分包含胆固醇。

其他亲脂性缀合物部分包括脂族基团，例如直链、支链和环状烷基、烯基和炔基。脂族基团可具有例如5个至约50个、6个至约50个、8个至约50个，或10个至约50个碳原子。示例性脂族基团包括例如十二烷二醇或十一烷基残基、十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、萜烯、冰片基、金刚烷基、其衍生物等。在一些实施例中，脂族基团中的一个或多个碳原子可以被杂原子例如O、S或N(例如，香叶氧基己基)替代。其他合适的亲脂性缀合物部分包括甘油的脂族衍生物，例如烷基甘油、双(烷基)甘油、三(烷基)甘油、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。在一些实施例中，亲脂性缀合物是二-己基癸基-外消旋-甘油或1，2-二-O-己基癸基-外消旋-甘油(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651；Shea，等人，Nuc.Acids Res.，1990，18，3777)或其膦酸酯。饱和和不饱和脂肪官能团，例如脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯和脂肪胺，也可用作亲脂性缀合物部分。在一些实施例中，脂肪官能团可包含约6个碳至约30个或约8个至约22个碳。示例性脂肪酸包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸等。

在进一步的实施例中，亲脂性缀合物部分可以是具有6个至约50个、10个至约50个或14个至约40个碳原子的多环芳族基团。示例性多环芳族基团包括芘、嘌呤、吖啶、呫吨、芴、菲、蒽、喹啉、异喹啉、萘、其衍生物等。其他合适的亲脂性缀合物部分包括薄荷醇、三苯甲基(例如二甲氧基三苯甲基(DMT))、吩噁嗪、硫辛酸、磷脂、醚、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、其衍生物等。寡核苷酸的亲脂性缀合物的制备在本领域中有详细描述，例如在Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10，1111；Kabanov等人，FEBSLett.，1990，259，327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75，49；Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229，和Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651中。

生物可切割的核苷酸连接基

在一些实施例中，待封装到脂质囊泡中的单链反义寡核苷酸可包含与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成，例如缺口聚物F-G-F′、全聚物或混聚物区域，并且可以进一步包含另外的5′和/或3′核苷。另外的5′和/或3′核苷可以或可以不与靶核酸完全互补，这种另外的5′和/或3′核苷在本文中可以称为区域D′和D”。

区域D′或D”的添加可用于以允许缀合物到达其靶组织后从连续核苷序列中去除的方式，将连续核苷酸序列，例如缺口聚物、全聚物或混聚物的连续核苷酸序列连接到缀合物部分或另一个官能团。为了在连续核苷酸序列和缀合物部分之间形成可生物切割的连接基，另外的核苷(区域D′或D”)与核酸酶易感键连接，例如磷酸二酯核苷间键。区域D′或D″可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。通过从硫代磷酸酯连接的糖修饰核苷到磷酸二酯连接的非糖修饰核苷(例如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式)的转变，识别区域D′或D”与缺口聚物、混聚物或全聚物之间的转变。在一些实施例中，另外的5′和/或3′末端核苷酸通过磷酸二酯键连接，既在区域D′或D”核苷(DNA或RNA)之间，还有在缺口聚物、混聚物或全聚物的末端连接糖修饰核苷的核苷间键，其中另外的5′和/或3′末端核苷酸(区域D)优选地为磷酸二酯键。在一些实施例中，另外的5′和/或3′末端核苷酸是磷酸二酯连接的DNA或RNA，优选地在缺口聚物、混聚物或全聚物和缀合物部分的5′末端或3′末端之间存在至少两个，例如至少三个，例如至少5个连续的磷酸二酯键。

适于用作区域D′或D″的核苷酸基生物可切断型连接基可参照WO2014/076195的公开，举例而言可包括磷酸二酯连接DNA二核苷酸。

对于缺口聚物，使用生物可切割核苷酸连接基的设计可以通过以下公式D′-F-G-F′、F-G-F′-D”或D′-F-G-F′-D”来描述。在这种情况下，F-G-F′是寡核苷酸的缺口聚物部分，而区域D′或D″构成寡核苷酸的单独部分。

在一个实施例中，除了构成缺口聚物、混聚物或全聚物的连续核苷酸序列之外，待包封到本发明脂质囊泡中的单链反义寡核苷酸还包含区域D′和/或D”。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以由下式表示：

F-G-F′，特别是F_1-8-G_5-16-F′_2-8

D′-F-G-F′，特别是D′_1-3-F_I-8-G_5-16-F′_2-8

F-G-F′-D"，特别是F_1-8-G_5-16-F′₂-₈-D"_1-3

D′-F-G-F′-D"，特别是D′_1-3-F_1-8-G_5-16-F′_2-8-D"_1-3

在一些实施例中，位于区域D′和区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F′和区域D′之间的核苷间键是磷酸二酯键。

互补性

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。

如本文所用，术语“互补性％”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列内核苷酸的比例，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸或靶序列)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(中与之形成沃森克里克碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5′-3′和寡核苷酸序列从3′-5′对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在这种比较中，未对准(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。

术语“完全互补”是指100％的互补性。

同一性

本文所用的术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸所占的比例(以百分比表示)，所述核酸分子跨越所述连续核苷酸序列。因此，通过计算两个序列(例如在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同的比对碱基(匹配)数，将该数除以比对区域的核苷酸总数再乘以100来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区域(例如连续核苷酸序列)长度。计算连续核苷酸序列的同一性百分比时不允许进行插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要核碱基形成沃森克里克碱基配对的功能留存，即可不考虑核碱基的化学修饰(例如在计算％同一性时，5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶视为相同)。

靶核酸

如本文所用，术语“靶核酸”是指由如本文所提到的修饰的单链反义寡核苷酸有意调节的基因、RNA、微小RNA、mRNA和前体mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。本发明的靶核酸至少在中枢神经系统(例如脑组织)、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中表达。应当理解，靶核酸与待治疗的疾病相关。因此，通过改变靶核酸或由靶核酸直接调节的靶标或由靶核酸编码的蛋白质的水平，预测将改善通过本文提及的分离的脂质囊泡治疗的疾病。在一个实施例中，疾病是由靶核酸或由靶核酸编码的蛋白质的异常水平引起的。在另一个实施例中，疾病是由靶核酸编码的蛋白质的故障变体，例如剪接变体或突变变体引起的。在另一个实施例中，与正常水平相比，可以通过增加/来自靶核酸的表达来改善疾病，如果这种增加例如用于降低另一种引起疾病的蛋白质的异常水平。特别地，可以通过调节中枢神经系统(例如脑组织)、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中的靶核酸来改善疾病。术语“异常水平”为本领域技术人员所熟知，且通常指靶核酸或由其编码的蛋白质的水平，其在患有待治疗疾病的受试者中与未患有该疾病的受试者相比增加或减少(特别是在中枢神经系统(例如脑组织)、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中)。在一些实施例中，通过下调靶核酸的表达来治疗疾病。

靶核酸可以是在上述细胞或组织中表达的任何核酸。在一个实施例中，靶核酸是mRNA。在另一个实施例中，靶核酸是前体mRNA。在另一个实施例中，靶核酸是长链非编码RNA(lncRNA)。在另一个实施例中，靶核酸是miRNA。

修饰的单链反义寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与靶核酸互补，例如80％，例如90％，例如95％，例如完全互补，如在寡核苷酸的长度上测量的。有利的是，修饰的单链反义寡核苷酸与靶核酸完全互补。任选地，可以允许与靶核酸的一个或两个错配。序列互补性通常在寡核苷酸的全长上或优选在寡核苷酸的连续核苷酸序列上测量，任选地不包括可以将寡核苷酸连接到任选的官能团(如缀合物或其他非互补末端)的基于核苷酸的连接基区域。

靶序列

如本文所用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与负载到脂质囊泡中的寡核苷酸互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上的区域组成，所述区域具有与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列。

靶标的调节

如本文所用，术语“调节”应理解为当与施用本发明的脂质囊泡之前的靶核酸量相比时，寡核苷酸改变靶核酸量的能力的总称。替代性地，表达的调节可参照对照实验进行确定。例如，对照是用盐水组合物或未负载的分离脂质囊泡处理的个体或靶细胞。

在一个实施例中，通过修饰的单链反义寡核苷酸或RNAi寡核苷酸与靶核酸的杂交来实现调节，从而i)下调，即降低所述靶核酸的表达，ii)影响靶核酸的剪接转换，导致靶核酸剪接变体的表达或iii)阻断靶核酸，例如miRNA或mRNA，以增加来自下游mRNA或靶mRNA的蛋白质表达。

在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸是通过非共价相互作用(如静电相互作用、疏水相互作用和它们的互补形状)，而不是通过Watson-Crick碱基配对与靶核酸或靶蛋白结合的适体，从而阻止或激活它的靶标。

与靶标的正常表达水平相比，靶标的调节为至少20％，更优选地与靶标的正常表达水平相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

在一些实施例中，在口服施用具有至少一种1μM核酸分子(例如寡核苷酸或RNAi分子)，例如5μM寡核苷酸或RNAi分子的脂质囊泡后，本发明脂质囊泡负载的寡核苷酸可以能够在体内抑制靶mRNA的表达水平至少40％。

在一些实施例中，在口服施用具有至少一种1μM核酸分子(例如寡核苷酸或RNAi分子)，例如5μM寡核苷酸或RNAi分子的脂质囊泡后，脂质囊泡负载的寡核苷酸可以能够在体内提高靶蛋白质的表达水平至少20％。

在一些实施例中，在口服施用具有至少1μM核酸分子(例如寡核苷酸或RNAi分子)，例如5μM寡核苷酸或RNAi分子的脂质囊泡后，本发明脂质囊泡负载的寡核苷酸可以能够改变靶核酸的剪接转换，以提供一种可替代的剪接的靶蛋白，该蛋白占体内总靶蛋白的至少20％。

治疗

本文所用的术语“治疗”是指治疗既有疾病(例如本文所提及的疾病或疾患)，或防范疾病，也就是预防。因此应知，在一些实施例中，本文中所称的治疗可以是预防性的。待治疗的受试者优选地为哺乳动物，例如小鼠。在一个实施例中，受试者是人类受试者。待治疗的疾病包括中枢神经系统疾病(如脑部疾病)、脾脏疾病、胃肠道疾病、肝脏疾病和涉及T细胞的疾病。优选疾病在本文其他地方公开。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及一种脂质囊泡，例如合成制备的脂质囊泡，其小于300nm携带核酸分子(例如反义寡核苷酸或RNAi分子)用作药物，其中所述脂质囊泡口服施用，即所述囊泡被配制用于口服施用。

术语脂质囊泡已在以上定义中定义。优选地，如上所述，根据DLS测量，所述脂质囊泡具有小于300nm的流体动力学直径Dh。优选地，所述脂质囊泡具有50nm至300nm的范围内的直径。在进一步的实施例中，根据DLS测量，脂质囊泡的流体动力学直径D_h小于200nm，优选地直径在50nm至275nm、例如50nm至250nm、并且优选地为60nm至180nm的范围内。

根据第一个实施例，脂质囊泡包含一种或多种，例如至少两种、至少三种或至少四种脂质，所述脂质独立地选自选自由以下项组成的组：胆固醇、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种磷脂酰丝氨酸、至少一种磷脂酰乙醇胺、至少一种二酰甘油、至少一种三酰甘油、至少一种磷脂酰肌醇、至少一种溶血双磷脂酸和磷脂酰丝氨酸。

在进一步的实施例中，脂质囊泡优选包含一种或多种脂质，所述脂质独立地选自由以下项组成的组：

-量在4mol％至50mol％、更优选地为5mol％至45mol％、更优选地为10mol％至25mol％、更优选地为4mol％至20mol％、更优选地为14mol％至35mol％的范围内的至少一种胆固醇，

-任选地量在0至45mol％、例如2mol％至45mol％、例如15mol％至45mol％、例如4mol％至25mol％、更优选地为2mol％至15mol％、更优选地为4mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在0至40mol％、例如1.9mol％至40mol％脂质囊泡、例如4mol％至36mol％、优选地为4mol％至15mol％、优选地为20mol％至36mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，

-量在2mol％至70mol％、更优选地为10mol％至70mol％、更优选地为10mol％至50mol％、更优选地为10mol％至30mol％、更优选地为19mol％至23.5mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，

-量在0至45mol％脂质囊泡、例如2mol％至20mol％、例如4mol％至36mol％、优选地为12mol％至20mol％、优选地为20mol％至31mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

-量在0至12mol％、例如4mol％至12mol％、更优选地为4mol％至6mol％、更优选地为10mol％至12mol％的范围内的至少一种溶血双磷脂酸，

-少于5mol％的二酰甘油，

-少于5mol％的三酰甘油，和

-少于5mol％的磷脂酰肌醇，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的2mol％至90mol％、优选地为30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的总量的磷脂酰乙醇胺和胆固醇，并计算为磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。

在一个实施例中，脂质囊泡包含以下范围内的所有脂质或由其组成：

-量在10mol％至15mol％、例如12mol％至14.5mol％的范围内的至少一种胆固醇，

-量在2mol％至8mol％、例如3mol％5mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在25mol％至30mol％、例如26mol％至29mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，

-量在10mol％至25mol％、例如15mol％19.5mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，

-量在12mol％至20mol％、例如12mol％至14.5mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

-量在3mol％至5mol％的范围内的至少一种溶血双磷脂酸，

-量在3mol％至5mol％的范围内的至少一种二酰甘油，

-量在3mol％至6mol％的范围内的至少一种三酰甘油，和

-量在3mol％至5mol％的范围内的至少一种磷脂酰肌醇，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。优选地，脂质囊泡包含以下项或由其组成：上述优选范围内的脂质、胆固醇、L-α-磷脂酰乙醇胺、L-αPS、至少一种磷脂酰胆碱、二棕榈酸甘油酯、甘油三硬脂酸酯、L-α-磷脂酰肌醇和双(单油酰甘油)磷酸酯，并且其中所述鞘磷脂选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其混合物，并且其中磷脂酰胆碱是卵PC和/或DOPC。

根据第二个实施例，脂质囊泡包含以下项或由其组成：胆固醇、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种磷脂酰乙醇胺和至少一种磷脂酰丝氨酸。在一个优选的实施例中，脂质囊泡包含以下项或由其组成：

-量在10mol％至25mol％、优选地为14mol％至22mol％、更优选地为17mol％至19mol％的范围内的至少一种胆固醇，

-量在至少一种4mol％至10mol％、优选地为4mol％至8mol％、更优选地为5mol％至6mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在至少一种10mol％至40mol％、优选地为10mol％至37mol％、更优选地为30mol％至36mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，优选地所述磷脂酰胆碱选自EG PC、DLPC和/或DOPC，

-量在至少一种10mol％至30mol％、优选地为15mol％至25mol％、更优选地为20mol％至24mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，

-量在10mol％至20mol％、更优选地为15mol％至18mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。优选地，脂质囊泡包含上述优选范围内的胆固醇、L-α-磷脂酰乙醇胺、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱和L-αPS，并且其中所述鞘磷脂选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其混合物，并且其中磷脂酰胆碱是卵PC和/或DOPC。

在第二实施例的另一个优选的实施例中，脂质囊泡包含以下项或由其组成：

-量在4mol％至14.5mol％，或16mol％至19mol％，或30mol％至50mol％的范围内的至少胆固醇，

-量在2mol％至24mol％、例如3mol％至4.8mol％、或5.9mol％至24mol％、或35mol％至45mol％的范围内的至少一种鞘磷脂。

-量在1.5mol％至29mol％、例如12mol％至29mol％、或32mol％至36mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，

-量在2.5mol％至3mol％、或10mol％至20mol％、例如11mol％至19mol％、或22mol％至25mol％、例如23mol％至25mol％、或30mol％至40mol％、或44mol％至70mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，和

-量在2mol％至3mol％、或10mol％至20mol％、例如10mol％至14.5mol％、例如16mol％至18mol％、或25mol％至45mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。优选地，脂质囊泡包含上述优选范围内的胆固醇、L-α-磷脂酰乙醇胺、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱和L-α PS，并且其中所述鞘磷脂选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其混合物，并且其中磷脂酰胆碱是卵PC和/或DOPC。优选地，实施例的脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的每个脂质囊泡2mol％至90mol％、优选地为30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的总量的磷脂酰乙醇胺和胆固醇，并计算为磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。

根据第三个优选的实施例，脂质囊泡包含以下项或由其组成胆固醇、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种磷脂酰乙醇胺，和至少一种磷脂酰丝氨酸和至少一种溶血双磷脂酸。根据该实施例，脂质囊泡优选包含以下项或由其组成：

-量在10mol％至25mol％、优选地为15mol％至22mol％、更优选地为15mol％至18mol％的范围内的至少一种胆固醇，

-量在4mol％至10mol％、优选地为4mol％至13mol％、更优选地为5mol％至6mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在15mol％至40mol％、优选地为20mol％至37mol％、更优选地为25mol％至35mol％、更优选地为31mol％至34mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，

-量在15mol％至45mol％、优选地为18mol％至25mol％、更优选地为20mol％至23mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，

-量在10mol％至30mol％、优选地为12mol％至20mol％、更优选地为15mol％至18mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

-量在小于7mol％、优选地为3mol％至6mol％的范围内的至少一种溶血双磷脂酸，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。优选地，脂质囊泡包含以下项或由其组成：上述优选范围内的胆固醇、L-α-磷脂酰乙醇胺、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、双(单油酰甘油)磷酸酯和L-αPS，并且其中磷脂酰胆碱是卵PC和/或DOPC，并且其中所述鞘磷脂选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其混合物，优选乳鞘磷脂。

根据第四个优选的实施例，脂质囊泡包含胆固醇、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰乙醇胺和至少一种溶血双磷脂酸或由其组成。根据该实施例，脂质囊泡优选包含以下项或由其组成：

-量在10mol％至50mol％、优选地为20mol％至38mol％、更优选地为31mol％至34mol％、或25mol％至38mol％的范围内的胆固醇，

-量在4mol％至15mol％、优选地为8mol％至13mol％、更优选地为10mol％至13mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在20mol％至50mol％、优选地为40mol％至50mol％、更优选地为43mol％至40mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，

-量在0至12mol％、优选地为1mol％至9mol％、优选地为3mol％至7mol％、优选地为4mol％至12mol％、优选地为10mol％至12mol％的范围内的至少一种溶血双磷脂酸，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。优选地，脂质囊泡包含以下项或由其组成：上述优选范围内的胆固醇、L-α-磷脂酰乙醇胺、至少一种乳鞘磷脂、和双(单油酰甘油)磷酸酯，并且其中所述鞘磷脂选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其混合物，优选乳鞘磷脂。优选地，实施例的脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡本身的总量(以mol计)的每个脂质囊泡2mol％至90mol％、优选地为30mol％至80mol％、更优选地为31mol％至65mol％的总量的磷脂酰乙醇胺和胆固醇，并计算为磷脂酰乙醇胺和胆固醇的总和。

根据第五个实施例，脂质囊泡包含以下项或由其组成：胆固醇、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种磷脂酰乙醇胺和至少一种磷脂酰丝氨酸。根据该实施例，脂质囊泡优选包含以下项或由其组成：

-量在40mol％至55mol％、优选地为45mol％至50mol％的范围内的至少一种胆固醇，

-量在至少一种10mol％至15mol％、例如12mol％15mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在至少一种10mol％至15mol％、例如12mol％至15mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，

-量在至少一种10mol％至15mol％、例如12mol％15mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，和

-量在至少一种10mol％至15mol％、例如12mol％15mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

其中所有mol％的量是基于未负载的脂质囊泡的量[以mol计]计算的。优选地，脂质囊泡包含上述优选范围内的胆固醇、L-α-磷脂酰乙醇胺、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱和L-αPS，并且其中所述鞘磷脂选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其混合物，并且其中磷脂酰胆碱优选卵PC和/或DOPC。

根据第六个实施例，脂质囊泡包含以下项或由其组成：胆固醇、至少一种鞘磷脂、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种磷脂酰乙醇胺和至少一种磷脂酰丝氨酸。根据该实施例，脂质囊泡优选包含以下项或由其组成：

-量在2mol％至10mol％、优选地为4mol％至6mol％的范围内的至少一种胆固醇，

-量在2mol％至10mol％、优选地为4mol％至5mol％的范围内的至少一种鞘磷脂，

-量在2mol％至10mol％、优选地为4mol％至6mol％的范围内的至少一种磷脂酰胆碱，

-量在60mol％至75mol％、例如68mol％72mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，

-量在10mol％至20mol％、例如16mol％至18mol％的范围内的至少一种磷脂酰丝氨酸，

在本发明的研究中已经表明-在口服施用本发明的脂质囊泡之后-如本文所述的脂质囊泡所包含的核酸分子被递送至中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞(参见实例部分)。

因此，本发明提供了一种如本文所述的携带用作药物的核酸分子的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡口服施用，其中所述核酸分子递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

本发明提供了一种将核酸分子递送至中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞的方法，其允许在口服施用后有效调节这些细胞/组织中的靶核酸。

本发明提供了一种如本文所述的携带用作药物的核酸分子的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡口服施用，其中所述靶核酸在选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种中的表达受到调节：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

术语“核酸分子”已在上文定义。在一个实施例中，核酸分子是反义寡核苷酸。在另一个实施例中，核酸分子是RNAi分子。

在一个实施例中，本文提供的脂质囊泡所包含的核酸分子是具有选自修饰的核苷间键合和/或修饰的糖核苷的至少一个骨架修饰的修饰的siRNA。

优选地，寡核苷酸是反义寡核苷酸，例如单链反义寡核苷酸。单链反义寡核苷酸可以是修饰的单链反义寡核苷酸。

在一个实施例中，本文提供的脂质囊泡所包含的核酸分子是具有选自修饰的核苷间键合和/或修饰的糖核苷的至少一个骨架修饰的修饰的单链反义寡核苷酸。

在一个实施例中，本文提供的脂质囊泡包含的修饰的单链反义寡核苷酸是具有至少一个修饰的核苷间键的单链反义寡核苷酸。在一个实施例中，反义寡核苷酸中至少50％，例如至少75％的核苷间键是修饰的核苷间键。此外，设想所述单链反义寡核苷酸的所有核苷间键都是修饰的核苷间键。

在一个实施例中，修饰的核苷间键选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、二酰胺磷酸酯和硼烷磷酸酯键。特别地，修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。在一个实施例中，所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，本文提供的脂质囊泡包含的修饰的单链反义寡核苷酸是在骨架中具有至少一个糖修饰的单链反义寡核苷酸。糖修饰可以例如选自吗啉代、PNA或2′糖修饰的核苷。

在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸是单链吗啉代反义寡核苷酸。在另一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸是单链肽核酸(PNA)。

在一个优选的实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键和一个或多个2′糖修饰的核苷或由其组成。如果单链反义寡核苷酸包含至少三个2′糖修饰的核苷，特别是位于寡核苷酸或其连续核苷酸序列的5′和3′末端，则是有利的。一个或多个2′糖修饰的核苷可以独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA(锁核酸)核苷。在一个优选的实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸是具有至少一个修饰的核苷间键的单链反义寡核苷酸，并且包含一个或多个LNA(锁核酸)核苷。因此，修饰的单链反义寡核苷酸优选是具有至少一个修饰的核苷间键，例如至少50％，例如至少75％硫代磷酸酯核苷键的单链反义LNA寡核苷酸。

具有至少一个2′糖修饰核苷和优选地至少一个修饰核苷间键的修饰的单链反义寡核苷酸选自缺口聚物、混聚物、全聚物、抗miR、阻断miR和剪接转换寡核苷酸(SSO)。因此，修饰的单链反义寡核苷酸可以是如本文定义的缺口聚物(例如LNA缺口聚物)。可替代地，修饰的单链反义寡核苷酸可以是如本文定义的混聚物。可替代地，修饰的单链反义寡核苷酸可以是如本文定义的全聚物。可替代地，修饰的单链反义寡核苷酸可以是如本文定义的抗miR。可替代地，修饰的单链反义寡核苷酸可以是如本文定义的剪接转换寡核苷酸。

特别地，设想修饰的单链反义寡核苷酸是LNA反义寡核苷酸。

修饰的单链反义寡核苷酸，例如待负载到本文提供的脂质囊泡中的骨架修饰的单链反义寡核苷酸通常具有7个至35个核苷酸，例如7个至30个核苷酸的长度。它们可以是药用盐的形式。

在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸包含7个至35个核苷酸，例如7个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列与靶组织中的靶核酸至少90％互补，例如完全互补。

在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸包含至少7个至26个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列与靶组织中的靶核酸至少90％互补例如完全互补。

在一个实施例中，修饰的单链反义寡核苷酸包含10个至30个核苷酸，例如7个至14个核苷酸，或14个至20个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列与靶组织中的靶核酸至少90％互补例如完全互补。

在一个实施例中，其中单链反义寡核苷酸与亲脂性缀合物部分缀合。优选地，单链反义寡核苷酸在亲脂性缀合物部分共价连接的寡核苷酸的5′末端或3′末端中包括生物可切割的核苷酸连接基。

在一个实施例中，单链反义寡核苷酸包含位于缺口聚物、混聚物或全聚物的连续核苷酸序列和亲脂性缀合物部分(例如胆固醇或生育酚缀合物部分)之间的生物可切割核苷酸区域(区域D′和/或D”)。

本文的脂质囊泡应携带，即包含本文所提到的核酸分子(例如修饰的单链寡核苷酸或RNAi分子)。因此，核酸分子被包封在脂质囊泡中或吸附在脂质囊泡上。换言之，本文提供的脂质囊泡负载有核酸分子。在另一个实施例中，脂质囊泡被配制用于口服递送。

脂质囊泡包含一定量的核酸分子，其允许修饰靶核酸(特别是在靶组织/靶细胞中)。也可以说携带核酸分子的脂质囊泡包含核酸分子的有效负载。因此，脂质囊泡可包含允许调节靶基因表达的一定量的核酸。

携带核酸分子，例如本文中提道的反义寡核苷酸或RNAi寡核苷酸的脂质囊泡口服施用。优选地，施用药物有效量的携带核酸分子的脂质囊泡。口服施用允许将脂质囊泡，因此将核酸分子的有效负载递送到选自由以下项组成的组的靶组织中：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

根据本发明待治疗的疾病与靶核酸的表达相关，或可以通过改变靶核酸的表达来治疗。因此，所述疾病可由靶核酸的异常水平引起。在一个优选的实施例中，所述疾病与靶核酸在中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中的表达有关。因此，所述疾病可由中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中靶核酸的异常水平引起。在一个优选的实施例中，所述疾病是可以通过降低靶核酸水平，特别是在中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中的靶核酸水平来治疗的疾病。在一个优选的实施例中，所述疾病是可以通过靶核酸的剪接转换以增加从靶核酸，特别是在中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和/或T细胞中的靶核酸表达的功能蛋白的量来治疗的疾病。

在一个实施例中，核酸分子被递送至中枢神经系统。术语“中枢神经系统”优选地包括脑和脊髓。单链反义寡核苷酸可递送至的大脑中的特定组织包括小脑、大脑皮层、中脑、丘脑、下丘脑、海马、纹状体、额颞叶、运动皮层和脑干。脊髓中的特定组织是基底根神经节、背角和腹角。因此，修饰的单链反义寡核苷酸被递送至脑、脊髓或递送至脑和脊髓两者或它们的特定组织。

优选地，递送至中枢神经系统(例如递送至脑)允许治疗选自由以下项组成的组的疾病：脑癌(例如脑瘤)、癫痫发作失调、神经退行性疾病、神经精神障碍和运动障碍。更优选地，递送至中枢神经系统(例如至脑)允许治疗选自以下的疾病：快乐木偶综合征、亚历山大病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、弗里德希氏共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森病、脊髓性肌萎缩症、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、自闭症、癫痫、额颞叶痴呆、进行性延髓麻痹、进行性核上性麻痹、瑞特综合征、妥瑞氏综合征、神经纤维瘤病、进行性肌肉萎缩、遗传性痉挛性截瘫、佩-梅二氏病、高雪氏病、脊髓小脑共济失调、弗里德赖希共济失调；脊髓小脑共济失调、Pagon Bird Detter综合征、迪格奥尔格综合征、Dup15q综合征、Doose综合征、GIutl缺陷综合征、CDKL5障碍、额叶癫痫、儿童失神癫痫、早期肌阵挛性脑病(EME)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Ohta-Kandle综合征和兰达-克莱夫纳综合征。因此，上述疾病可以通过口服施用如本文所提到的脂质囊泡来治疗。

在一个实施例中，核酸分子被递送至脾脏。

优选地，递送至脾允许治疗选自由以下项组成的组的疾病：诸如脾癌的癌症、炎症性疾病和免疫紊乱。因此，上述疾病可以通过口服施用如本文所提到的脂质囊泡来治疗。

在一个实施例中，核酸分子被递送至肝脏。

优选地，递送至肝脏允许治疗选自由以下项组成的组的疾病：肝癌、心血管疾病、凝血级联缺陷、炎症性疾病、代谢性疾病和感染。更优选地，递送至肝脏允许治疗选自以下的疾病：肝细胞癌、从其他组织中的原发性癌症转移的肝脏恶性肿瘤、1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素抵抗、血糖水平控制、HDL/LDL胆固醇失衡、动脉粥样硬化、血脂异常、家族性混合型高脂血症(FCHI)、获得性高脂血症、他汀类药物耐药性高胆固醇血症、心血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝、肥胖、急性冠状动脉综合征(ACS)、血栓形成、罕见的出血性疾病、乙型或丙型肝炎、巨细胞病毒感染、血吸虫病感染和钩端螺旋体病感染、疟疾、筋膜炎、类风湿性关节炎、肝纤维化、肝硬化、肝卟啉症、急性间歇性卟啉症(AIP)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症(aHUS)、重症肌无力、视神经脊髓炎、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、库欣综合征和转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性。因此，上述疾病可以通过口服施用如本文所提到的脂质囊泡来治疗。

在一个实施例中，核酸分子被递送至T细胞。

优选地，递送至T细胞允许治疗选自由以下项组成的组的疾病：癌症、炎症性疾病和感染性疾病。

在一个实施例中，核酸分子被递送至胃肠道。胃肠道是消化系统的一部分，包括胃和肠。因此，核酸分子可被递送至胃和/或肠，即小肠或大肠。优选地，递送至胃肠道允许治疗结直肠癌、胃癌、代谢紊乱或炎性肠病(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)。

在另一方面，本发明提供包含本文提供的脂质囊泡的药物组合物，所述脂质囊泡携带核酸例如寡核苷酸(例如本文别处定义的单链反义寡核苷酸)。所述药物组合物可进一步包含药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐及钾盐。在一些实施例中，所述药用稀释剂为无菌磷酸盐缓冲盐水。特别地，药物组合物是适合于口服施用的制剂。

本发明提供了通过向患有该疾病的受试者口服施用治疗有效量的包含(例如配制、包含、封装、负载)在如上文提到的本文提供的脂质囊泡，或本发明的药物组合物中的核酸分子来治疗疾病的方法。

本发明提供了通过向患有该疾病的受试者口服施用治疗有效量的包含(例如配制、包含、封装、负载)在如上文提到的本文提供的脂质囊泡，或本发明的药物组合物中的核酸分子来治疗中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞疾病的方法。优选的疾病如上所述。在口服施用后，核酸分子如修饰的单链反义寡核苷酸被递送至一种或多种选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

本发明还提供了包含核酸分子，例如上述修饰的单链反义寡核苷酸的脂质囊泡在制备用于治疗疾病的药物中的用途。优选的疾病如上所述。上面给出的定义和解释相应地适用。优选地，脂质囊泡口服施用，从而将核酸分子递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

制造方法

在另一方面，本发明提供了制造携带，即包含本文中提到的与本发明相关的核酸分子的脂质囊泡的方法。以上的定义相应地适用。

根据本发明的脂质囊泡优选地使用薄膜再水化方法制备。该方法优选地包括以下步骤：

-在有机溶剂中形成至少一种脂质囊泡形成组分的溶液

-去除溶剂从而形成脂质膜

-在核酸分子，例如反义寡核苷酸或RNAi分子存在下，在水性溶剂(优选地为缓冲液)中再水化膜，

从而形成携带核酸分子的脂质囊泡。

有机溶剂优选地选自由以下项组成的组：甲醇、氯仿和二氯甲烷、乙醇、二氯甲烷以及异丙醇及其两种或更多种的混合物。作为水性溶剂，优选地使用水性缓冲液。

本发明因此还涉及上述方法，以及通过所述方法获得或可获得的脂质囊泡。

实施例列表

在下文中，列出了本发明的特别优选的实施例：

1.一种携带用作药物的核酸分子的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡具有根据DLS测量的小于300nm的流体动力学直径D_h，优选地具有在50nm至300nm的范围内的直径，其中所述脂质囊泡口服施用，其中所述核酸分子用于递送至选自由以下项组成的组的靶组织中的一种或多种：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞。

2.根据实施例1所使用的脂质囊泡，其中脂质囊泡具有根据DLS测量的小于200nm的流体动力学直径D_h，优选地具有在50nm至250nm的范围内的直径。

3.根据实施例1或2所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡具有根据DLS测量的小于180nm的流体动力学直径Dh，优选地在60nm至180nm的范围内的直径，例如100nm至160nm。

4.根据实施例1至3中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡在20℃的温度于胃液中稳定至少5h。

5.根据实施例1或4中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡在20℃的温度于禁食状态的肠液中稳定至少5h。

6.根据实施例4或5所使用的脂质囊泡，其中当与孵育前测量的各个初始Dh相比时，在胃液中孵育5h后，脂质囊泡的流体动力学直径变化至多90％。

7.根据实施例0所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡的流体动力学直径在孵育后0和5h时变化至多60％，并且所述脂质囊泡的Dh在80nm至180nm的范围内。

8.根据实施例4至0所使用的脂质囊泡，其中当与孵育前测量的各个初始Dh相比时，在肠液中孵育5h后，脂质囊泡的流体动力学直径变化至多40％。

9.根据实施例0所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡的流体动力学直径在孵育后0和5h时变化至多25％，并且所述脂质囊泡的Dh在80nm至180nm的范围内。

10.根据实施例1至0中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含胆固醇和至少一种磷脂酰乙醇胺。

11.根据实施例10所使用的脂质囊泡，其中所述磷脂酰乙醇胺是L-α-磷脂酰乙醇胺。

12.根据实施例1至11中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为4mol％至50mol％的胆固醇。

13.根据实施例12所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为4mol％至14.5mol％、或16mol％至19mol％、或30mol％至50mol％的胆固醇。

14.根据实施例1至13中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为2mol％至70mol％的L-α-磷脂酰乙醇胺。

15.根据实施例14所使用的脂质囊泡，其中脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为11mol％至19mol％、或23mol％至25mol％、或30mol％至40mol％或44mol％至70mol％的L-α-磷脂酰乙醇胺。

16.根据实施例1至15中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为2mol％至90mol％、优选地为30mol％至80mol％的至少一种磷脂酰乙醇胺，优选L-_αα-磷脂酰乙醇胺，以及胆固醇。

17.根据实施例10至16中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡进一步包含至少一种磷脂酰胆碱和/或至少一种磷脂酰丝氨酸和/或至少一种溶血双磷脂酸。

18.根据实施例17所使用的脂质囊泡，其中

i.磷脂酰胆碱的量为0mol％至40mol％、例如1.5mol％至29mol％、例如12mol％至29mol％、例如32mol％至36mol％和/或

ii.磷脂酰丝氨酸的量为至少一种0至45mol％、例如2mol％至3mol％、例如10mol％至20mol％、例如25mol％至45mol％；和/或

iii.至少一种溶血双磷脂酸的量为0至12mol％、例如4mol％至12mol％、例如10mol％至12mol％。

19.根据实施例17或18所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡中磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和溶血双磷脂酸的总量基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)在10mol％至54mol％的范围内。

20.根据实施例17或19所使用的脂质囊泡，其中所述至少一种磷脂酰胆碱是Egg-PC、DLPC或DOPC。

21.根据实施例17或20所使用的脂质囊泡，其中所述至少一种磷脂酰胆碱是Egg-PC或DOPC。

22.根据实施例10至21中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡进一步包含至少一种鞘磷脂，特别是选自由以下项组成的组：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂及其两种或更多种混合物的鞘磷脂。

23.根据实施例22所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在2至45mol％、例如2mol％至24mol％、例如3mol％至4.8mol％、例如4mol％至15mol％、例如5.9mol％至24mol％、例如35mol％至45mol％的范围内的至少一种鞘磷脂。

24.根据实施例10至23中任一项所使用的脂质囊泡，其中脂质囊泡任选地进一步包含至少一种二酰甘油和/或至少一种三酰甘油和/或至少一种磷脂酰肌醇，其中二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇总和的总量基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)在0至15mol％的范围内。

25.根据实施例24所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含

i.量为0至5mol％、例如3mol％至5mol％的二酰甘油；

ii.量为0至5mol％、例如3mol％至5mol％的三酰甘油；和

iii.量为0至5mol％、例如3mol％至5mol％的磷脂酰肌醇，

并且其中所述脂质囊泡中二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇的总量各自基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)在4mol％至15mol％的范围内。

26.根据实施例1至25中任一项所使用的脂质囊泡，其中脂质囊泡具有50nm至250nm的流体动力学直径D_h，并包含

i.基于未负载的脂质囊泡的总量(以mol计)，量为4mol％至50mol％的胆固醇；

ii.在10mol％至70mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺，其中脂质囊泡

iii.在4mol％至15mol％的范围内的至少一种鞘磷脂；以及，其中脂质囊泡

iv.任选地包含至少一种二酰甘油和/或至少一种三酰甘油和/或至少一种磷脂酰肌醇，其中二酰甘油和三酰甘油和磷脂酰肌醇的总和的总量基于未负载的脂质囊泡总量在0至15mol％、例如4mol％至15mol％的范围内。

27.根据实施例26所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡进一步包含磷脂酰胆碱和/或磷脂酰丝氨酸和/或溶血双磷脂酸。

28.根据实施例26或27所述的脂质囊泡，其中所述磷脂酰胆碱是Egg-PC或DOPC。

29.根据实施例27或28所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量的量在4mol％至36mol％的范围内的Egg-PC或在4mol％至36mol％的范围内的DOPC。

30.根据实施例26至29中任一项所述的脂质囊泡，其中所述磷脂酰丝氨酸基于未负载的脂质囊泡总量的量在12mol％至20mol％的范围内。

31.根据实施例26至30所述的脂质囊泡，其中所述溶血双磷脂酸基于未负载的脂质囊泡总量的量在4mol％至12mol％的范围内。

32.根据实施例1至31中任一项所使用的脂质囊泡，其中脂质囊泡具有60nm至180nm的范围内的流体动力学直径Dh，并包含

i.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在10mol％至15mol％、例如12mol％至14.5mol％的范围内的胆固醇；

ii.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在10mol％至25mol％、例如15mol％至19.5mol％的范围内的至少一种磷脂酰乙醇胺；

iii.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在2mol％至8mol％、例如3mol％5mol％的范围内的至少一种乳鞘磷脂；

iv.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在25mol％至30mol％、例如26mol％至29mol％的范围内的Egg-PC；

v.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在3mol％至5mol％的范围内的至少一种二酰甘油，

vi.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在3mol％至5mol％的范围内的至少一种三酰甘油，

vii.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在3mol％至5mol％的范围内的至少一种磷脂酰肌醇，

viii.基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在3mol％至6mol％的范围内的溶血双磷脂酸；和

ix.占未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在12mol％至20mol％、例如12mol％至14.5mol％的范围内的磷脂酰丝氨酸。

33.根据实施例1所使用的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡选自F1、F3、F12、F13、F14、F17、F18、F20、F21、F22、F23、F24、F25、F26、F28、F30、F33或F34。

34.根据实施例1或33所使用的脂质囊泡或，其中所述脂质囊泡选自组合物F1、F12、F13、F14、F17、F21、F22、F23、F25或F33。

35.根据实施例1至32中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述核酸分子能够调节靶组织中的靶核酸。

36.根据实施例l至35中任一项所使用的脂质囊泡，其中核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键和/或修饰的核苷。

37.根据实施例36所使用的脂质囊泡，其中所述修饰的核苷为独立地选自由以下项组成的组的2′糖修饰的核苷：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA(锁核酸)核苷。

38.根据实施例36或37所使用的脂质囊泡，其中所述修饰的核苷间键选自由以下项组成的组：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯键。

39.根据实施例1至38中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述核酸是反义寡核苷酸或RNAi分子。

40.根据实施例39所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸是单链寡核苷酸。

41.根据实施例39或40所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸的长度为7个至30个核苷酸，例如8至12个核苷酸，例如14个至20个核苷酸。

42.根据实施例39至41所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸选自缺口聚物、混聚物、全聚物、抗miR、阻断miR和剪接转换寡核苷酸。

43.根据实施例40至42所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸中至少50％，例如至少75％的核苷间键是硫代磷酸酯键。

44.根据实施例43所使用的脂质囊泡，其中所述单链反义寡核苷酸的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

45.根据实施例40至44中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述单链反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷。

46.根据实施例45所使用的脂质囊泡，其中所述修饰的核苷是核糖，其中所述核糖被选自由以下项组成的组的修饰取代：己糖环(HNA)、未连接的核糖环UNA、二环己糖、三环核苷、肽核苷核酸(PNA)或吗啉代核酸。

47.根据权利要求45所使用的脂质囊泡，其中所述修饰的核苷为2′糖修饰的核苷，例如2′糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA(锁核酸)核苷。

48.根据实施例47所述的反义寡核苷酸，其中该LNA核苷选自氧基-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA、cET及ENA。

49.根据实施例47或48所述的反义寡核苷酸，其中该经修饰的LNA核苷为具有下列2′-4′桥-O-CH₂-的氧基-LNA。

50.根据实施例49所使用的脂质囊泡，其中所述氧-LNA是β-D-氧基-LNA。

51.根据实施例42所述的脂质囊泡，其中该反义寡核苷酸为具有式5′-F-G-F′-3′的缺口聚物，其中该F及F′翼区域独立地包含或包括1-7个根据实施例47至50所述的2′糖修饰的核苷，并且G为能够募集RNA酶H(例如DNA)的5个至18个核苷的区域。

52.根据权利要求1至51中任一项所使用的脂质囊泡，其中

a)所述核酸分子可递送至中枢神经系统，诸如脑和/或脊髓，并且其中所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：脑癌(例如脑瘤)、癫痫发作失调、神经退行性疾病、神经精神障碍和运动障碍，诸如癫痫发作失调、神经退行性疾病、神经精神障碍或运动障碍选自由以下项组成的组：快乐木偶综合征、亚历山大病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、弗里德希氏共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩症、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、自闭症、癫痫、额颞叶痴呆、进行性延髓麻痹、进行性核上性麻痹、瑞特综合征、妥瑞氏综合征、神经纤维瘤病、进行性肌肉萎缩、遗传性痉挛性截瘫、佩-梅二氏病、高雪氏病、脊髓小脑共济失调、Pagon Bird Detter综合征、弗里德希氏共济失调；脊髓小脑共济失调、迪格奥尔格综合征、Dup15q综合征、杜斯综合征、Glut1缺陷综合征、CDKL5障碍、额叶癫痫、儿童失神癫痫、早期肌阵挛性脑病(EME)、伦-格综合征(LGS)、大田原综合征和兰达-克莱夫纳综合征，

b)所述核酸分子可递送至所述脾脏，并且

其中所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：癌症例如脾癌、炎症性疾病和免疫失常，

c)所述核酸分子可递送至T细胞，并且其中所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：癌症、炎症性疾病和感染性疾病，和/或

d)所述核酸分子可递送至所述肝脏，并且其中所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：肝癌、心血管疾病、凝血级联缺陷、炎症性疾病、代谢性疾病和感染，例如其中肝脏疾病选自由以下项组成的组：肝细胞癌、从其他组织中的原发性癌症转移的肝脏恶性肿瘤、1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素抵抗、血糖水平控制、HDL/LDL胆固醇失衡、动脉粥样硬化、血脂异常、家族性混合型高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类药物耐药性高胆固醇血症、心血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病、肥胖、急性冠状动脉综合征(ACS)、血栓形成、罕见的出血性疾病、乙型或丙型肝炎、巨细胞病毒感染、血吸虫病感染和钩端螺旋体病感染、疟疾、片吸虫感染、类风湿性关节炎、肝纤维化、肝硬化、肝性卟啉病、急性间歇性卟啉症(AIP)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、重症肌无力、视神经脊髓炎、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、库欣综合征和转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性。

53.一种携带核酸分子的脂质囊泡的制备方法，其中所述脂质囊泡具有根据DLS测量的小于300nm的流体动力学直径Dh，优选地为50nm至300nm的范围内的直径，其中所述脂质囊泡用于口服施用，其中所述寡核苷酸用于递送至选自由以下项组成的组的一种或多种靶组织：中枢神经系统、脾脏、胃肠道、肝脏和T细胞，所述方法包括以下步骤

-在有机溶剂中形成至少一种脂质囊泡形成组分的溶液

-去除溶剂从而形成脂质膜

-在核酸分子存在下，在水性溶剂(优选地为缓冲液)中再水化膜，

从而形成携带核酸分子的脂质囊泡。

54.通过根据实施例53所述的方法获得或可获得的脂质囊泡。

55.根据实施例54所述的脂质囊泡，其具有根据实施例1至51所描述的性质。

实例

材料和方法

反义寡核苷酸列表

表1：使用的寡核苷酸：

SEQ ID NO	CMP ID	化合物	靶标
				1	ASO1	GAGttacttgccaACT	Malat 1

大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键，除非另有说明，小写字母o表示磷酸二酯核苷间键

流体动力学直在分析

脂质囊泡的平均流体动力学直径通过动态光散射(DLS)使用Zetasizer Ultra(Malvem PanalyticaI，Malvem，UK)在685nm激光波长下测定。以165°的角度检测到散射光。结果表示为室温下DPBS(No.14190250，Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)中n＝3次测量的平均±SD。

通过透射电子显微镜分析颗粒形态

可以在醋酸双氧铀负染色后使用透射电子显微镜(TEM)分析颗粒形态。聚醋酸甲基乙烯脂(Formvar)涂覆的铜网格进行辉光放电，并与DPBS(No.14190250，ThermoScientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)中的5μL脂质囊泡样品孵育1分钟。取出样品并用超纯水(No.10977023，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)清洗网格两次。然后使用2％乙酸双氧铀洗涤网格一次，随后在2％乙酸双氧铀中孵育15秒。去除乙酸双氧铀并在分析前让网格干燥。使用JEM-1400Plus透射电子显微镜(JEOL，东京，日本)获取图像。

动态和电泳光散射的Zeta电位

根据制造商的建议，可以使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical，莫尔文，英国)测定脂质囊泡的Zeta电位。在0.1x DPBS中于25℃测量脂质囊泡F1。结果在以下实例3中的表6中显示为n＝3次测量的平均值±SD。根据这些数据，脂质囊泡F1被表征为具有轻微负表面电荷的单分散性。

将锁核酸反义寡核苷酸(LNA ASO)负载到脂质囊泡中

LNA ASO通过在DPBS(No.14190250，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)中用LNA ASO再水化薄脂质膜来负载。

脂质囊泡的制备如上文“脂质囊泡制备”部分所述进行，并在再水化步骤中加入所需量的LNA-ASO。使用300kDa的MWCO(Float-a-lyzer，No.G235036，Repligen，Waltham，马萨诸塞州，美国)，通过在4℃对DPBS透析72小时去除未封装的LNA ASO。

负载LNA ASO的脂质囊泡的表征

负载有LNA ASO的脂质囊泡可通过以下分析表征

纯化撕

可以使用琼脂糖凝胶电泳确认去除未封装的LNA ASO。20μL的负载LNA ASO的脂质囊泡以75的振幅超声处理3次5分钟以释放LNA ASO货载(封装的LNA ASO)。将20μL未处理的负载LNA ASO的脂质囊泡、20μL超声处理的负载LNA ASO的脂质囊泡和DPBS中的LNA ASO标样加载到SYBR Green标记的2％琼脂糖凝胶中(No.G521802，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)，并且核酸分离10min。然后使用E-Gel成像仪(ThermoScientific.Waltham，马萨诸塞州，美国)对凝胶成像。

LNA ASO载药量定量

使用HPLC(Water，Milford，马萨诸塞州，美国)分析载药量。将样品注入C18色谱柱(XBridge BEH C182.5μm，4.6x100mm色谱柱XP；No.186006039，Waters，Milford，马萨诸塞州，美国)，并且样品在乙腈/200mM乙酸盐梯度上运行，柱温为50℃。在260nm的波长下检测LNA ASO。制备LNA ASO的校准曲线并用于定量封装的LNA ASO。

体外细胞培养

原代人肝细胞

在37℃和5％CO₂下，将原代人冷冻保存肝细胞(PHH，No.F00995，BioIVT，西萨塞克斯郡，英国)在补充有10U/mL青霉素和链霉素(No.15140122，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)和10％FBS(No.97068-085，VWR International，Radnor，宾夕法尼亚州，美国)的Williams培养基E(No.W1878，Sigma Aldrich，St.Louis，MI，美国)中培养。将4x10⁴个细胞接种在拼贴涂覆的(No.356407，BD Biosciences，Franklin Lakes，新泽西州，美国)96孔培养板(No.3474，Coming，Coming，纽约，美国)上。在加入测试物质之前，让细胞粘附4小时。

HepG2细胞

在37℃和5％CO₂下，将HepG2人肝细胞癌细胞(ATCC HB-8065)在补充有10％FBS(No.A3160401，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)和Glutamax(No.41090101，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)的Eagle最低必需培养基(No.M2279，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)中培养。对于敲低实验，将细胞用DPBS(No.14190250，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)洗涤一次，并使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(No.25200056，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)分离。加入完全培养基并通过以1300rpm和5min离心收集细胞。吸出上清液并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。死细胞使用0.4％台盼蓝(No.T10282，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)染色，并且细胞使用Countess II FL自动细胞计数器(ThermoScientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)进行计数。然后将细胞以每孔2x10⁴个细胞的密度接种在96孔板(No.3474，Corning，Corning，纽约，美国)中，并在加入测试物质前使其贴壁过夜。

乳酸脱氢酶测定

在与脂质囊泡孵育48小时后收集PHH细胞培养上清液，并根据制造商的建议使用细胞毒性检测试剂盒(No.1 1644793001，罗氏诊断，Rotkreuz，瑞士)测定LDH释放。简而言之，将收集的细胞培养上清液稀释并转移到底部透明的96孔板(No.3906，Corning，Corning，纽约，美国)。细胞毒性检测反应混合物新鲜制备并添加到每个孔中，板以1000rpm振荡1分钟，并在室温下孵育30min。使用EnSpire酶标仪(Perkin Elmer，Waltham，马萨诸塞州，美国)在490nm处测量吸光度。使用Precipath U(No.10171778122罗氏诊断，Rotkreuz，瑞士)作为LDH标准测定LDH浓度。DPBS处理的细胞用作对照。结果表示为n＝4次技术重复的平均值±SD。

胞内ATP含量

根据制造商的说明，在孵育48小时后使用Cell Titer Glo试剂盒(No.G7571，Promega，Madison，威斯康辛州，美国)测定脂质囊泡处理的PHH中的胞内ATP含量。简而言之，将50μL Cell Titer Glo试剂添加到含有50μL完全培养基中处理过的PHH(参见第3.11节)的每个孔中，将平板振荡2min以诱导细胞裂解，并将板在室温下孵育10min。将70μL细胞裂解物转移到白色不透明96孔板(No.3601，Coming，Coming，纽约，美国)中，并在EnVision酶标仪(Perkin Elmer，Waltham，马萨诸塞州，美国)上收集发光。ATP在完全培养基中的稀释液用作标准品。DPBS处理的细胞用作对照。结果表示为n＝4次技术重复的平均值±SD。

白蛋白释放测定

根据制造商的建议，在孵育48小时后使用不含AlphaLISA生物素的人血清白蛋白检测试剂盒(No.AL363，Perkin Elmer，Waltham，马萨诸塞州，美国)测定脂质囊泡处理后PHH的白蛋白分泌。结果显示为n＝4次技术重复的平均值±SD。

使用杂交ELISA(hELISA)测定组织匀浆中的ASO浓度

Straarup等人在2010Nucleic Acids Res，38(20)：p.7100-11中描述了通常的方法。简而言之，通过向5x SSC缓冲液(No.93017，Sigma Aldrich，St.Louis，MI，美国)补充0.05％Tween-20(No.P9416，Sigma Aldrich，St.Louis，MI，美国)，并添加终浓度为35nM的生物素化捕获探针和地高辛缀合检测探针(RTR No.35148-3和No.31443-7，哥本哈根罗氏创新中心，赫斯霍尔姆，丹麦)来制备捕获检测溶液(CDS)。链霉亲和素涂覆的96孔板(No.436014，Thermo Scientific，WaItham，马萨诸塞州，美国)用5x SSC-T缓冲液和100μL组织匀浆(在CDS中按1:10稀释)或CDS中的RTR17293标准液洗涤3次。样品在持续搅拌下，在室温孵育1小时。板用2x SSCT缓冲液洗涤三次。将孔与在补充有0.05％Tween-20的DPBS中以1∶3′000稀释的碱性磷酸酶缀合的抗地高辛抗体(No.11093274910，罗氏诊断，Rotkreuz，瑞士)，持续搅拌下，在室温孵育1h。板用2x SSCT缓冲液洗涤三次。根据制造商的说明混合Blue Phos底物(No.55-88-02，Seracare Life Sciences，Milford，马萨诸塞州，美国)，并在每个孔中加入100μL底物。使用GlowMax Discoverer酶标仪(Promega，麦迪逊，威斯康辛州，美国)在600nm波长处测量吸光度，并通过使用GraphPad Prism 6.07版(GraphPadSoftware，La Jolla，加利福尼亚州，美国)制备西格摩德(4PL)标准曲线来确定未知浓度。结果表示为n＝4次重复的平均值±SD。

实例1：脂质囊泡的制备

本实例描述了本发明中测试的脂质囊泡的组分和制备。

表2：使用的脂质/组分：

(a)薄膜再水化

下表3中列出的脂质囊泡(脂质体)使用薄膜再水化方法制备。将脂质溶解在氯仿/甲醇(2∶1v/v)中并以指定的摩尔比混合。将脂质转移到圆底烧瓶中，并在旋转蒸发仪上在65℃和＜20mbar下除去溶剂。使用1.5g 3mm玻璃珠在65℃用磷酸盐缓冲溶液(PBS)再水化干脂质膜，最终脂质浓度为10mM。大型多层囊泡(LUV)经5次冻融循环(干冰和65℃)以破坏多层结构。随后，通过使用具有200nm孔径的手动挤出机(Avanti Polar Lipids)在65℃挤出11-21次来减小囊泡尺寸。脂质体在4℃储存＜1周直至进一步分析。制备的囊泡的各组分的量以[mol]在表3中给出。

(b)微流体

可以可替代地使用微流体制备选择的脂质囊泡。脂质溶解在合适的水混溶性溶剂中，例如乙醇、甲醇、DMSO、DMF或丙酮。然后通过使用NanoAssemblr(PrecisionNanosystems，温哥华，加拿大)将脂质与水性缓冲液混合来制备脂质体。流量比(FRR)和总流量(TFR)可相应调整。然后通过使用300kDa的截留分子量对PBS进行透析除去溶剂。

(c)探头超声

将总脂质浓度为10mM的制剂F1(表3)的脂质分散在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中。然后使用探头超声处理(Q700，Qsonica L.L.C.，Newtown，康涅狄格州，美国)以10的振幅通过两个周期的超声处理(30和20min)制备小的、均匀的脂质囊泡。然后使用0.22μm注射过滤器(Merck KGaA，达姆施塔特，德国)对小脂质囊泡进行无菌过滤，并在4℃储存。

表3.制备的囊泡的脂质组合物。所使用的脂质列于表2中

¹乳SM，除非另有说明

²脑SM

³卵SM

⁴卵PC，除非另有说明

⁵DSPC

⁶DLPC

⁷DOPC

稳定性测试

模拟胃液(SGF：NaCl 34mM，HCl 0.83M，0.1％Triton X-100(pH 1.2))和禁食状态肠液(FaSSIF：NaH₂PO₄ 28.6mM、牛磺胆酸钠盐3mM、卵磷脂0.75mM、NaCl 105.8mM(pH 6.5))中脂质囊泡的稳定性通过DLS测量Dh的变化随时间进行测试，如上文材料和方法部分所述。

脂质囊泡与SGF或FaSSIF混合，最终脂质浓度为1mM，并在20℃在指定时间点测量Dh。数据显示为n＝1实验的平均值。

表4：稳定性测试的结果，表中的尺寸(Dh)以nm为单位给出，以及与0h时尺寸相比，孵育5h后尺寸的变化。

基于表4中的数据，以下脂质囊泡组合物F1、F3、F12、F13、F14、F17、F18、F20、F21、F22、F23、F24、F25、F26、F28、F30、F33、F34已被表征稳定，并且适合口服递送。特别地，脂质囊泡组合物F1、F12、F13、F14、F17、F21、F22、F23、F25、F33被认为特别适合口服递送。脂质囊泡的脂质组分和稳定性的总结如图1所示。

实例2脂质囊泡F1的体外评估

研究了来自实例1的纯化脂质囊泡F1在体外细胞培养物中是否耐受。

如材料和方法部分所述培养原代人冷冻保存的肝细胞。基于通过HPLC分析确定的总脂质浓度，将脂质囊泡在无FBS培养基中稀释，以达到0.04mg/mL和0.4mg/mL的最终测定浓度。将脂质囊泡加入孔中，并将PHH在37℃孵育24小时。将培养基更换为完全培养基，并将PHH在37℃再培养24小时。

使用乳酸脱氢酶测定、胞内ATP含量和白蛋白释放测定评价耐受性，所有这些都在材料和方法部分进行了描述。

结果显示在表5中，并且清楚地表明PPH细胞对F1的脂质囊泡具有良好的耐受性。

表5.对冷冻保存的原代人肝细胞(PHH)进行体外毒性评估。结果显示为n＝4次技术重复的平均值±SD。

实例3LNA ASO负载到脂质囊泡F1

通过在LNA-ASO存在下使脂质薄膜再水合，使来自实例1的脂质囊泡F1负载有ASO1，如材料和方法部分所述。

分析了负载的脂质囊泡中的物理化学性质以及LNA ASO含量，如材料和方法部分所述。负载有ASO1的脂质囊泡的结果显示在下表6中。如恒定尺寸和PDI所示，负载LNA ASO的脂质囊泡在4℃可稳定超过2个月

表6.仿生脂质囊泡的物理化学表征。结果显示为n＝3次实验的平均值±SD。

实例4Hep2G细胞中负载LNA ASO的脂质囊泡F1的体外评估

在HepG2细胞中测试如实例3中所述的负载有ASOl的脂质囊泡F1，以评价在体外细胞培养物中是否耐受以及是否可以实现靶标的降低。

如材料和方法部分所述培养HepG2细胞。用DPBS(No.14190250，ThermoScientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)中的ASO1或封装在脂质囊泡中的ASO1处理细胞，其中LNA-ASO浓度为10nM、50nM、100nM、500nM、1′000nM和5′000nM。细胞在37℃孵育24小时。然后，吸出培养基，用DPBS洗涤细胞一次，并用新鲜的完全培养基再培养24小时。孵育48小时后，用DPBS洗涤细胞两次。

使用PureLink Pro 96总RNA纯化试剂盒(No.12173011A，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)分离RNA。在LightCycler 480仪器上使用LightCyclerMultiplex RNA Virus Master试剂盒(No.07083173001，罗氏诊断，Rotkreuz，瑞士)分析RNA表达。Malat-1 lncRNA(Hs00273907_s1)和GAPDH(Hs02786624_g1)引物购自ThermoScientific(Waltham，马萨诸塞州，美国)。Malat-l lncRNA表达通过Δ Δct方法针对GAPDH进行分析。结果表示为n＝4次技术重复的平均倍数变化±SD。

结果显示在表7中，表明使用负载LNA-ASO的脂质囊泡可以在体外达到与DPBS配制的LNA-ASO相同水平的malat-1靶标敲低。

表7.HEP2G细胞中负载LNA-ASO的脂质囊泡的体外评估。结果显示为n＝4次技术重复的对照平均值±SD的百分比。

浓度ASO1[nM]	DPBS中的ASO1	脂质囊泡F1中的ASO1
			10	73±11	80±11
50	88.2±13	72±8
			100	73±5	61±13
500	60±2	55±15
			1000	55±10	59±9
5000	50±8	53±10

实例5负载LNA-ASO的脂质囊泡F1的体内评估

使用静脉注射或口服施用在小鼠体内评估负载LNA-ASO的脂质囊泡的生物分布和实现靶标减少的能力。

所有动物实验均根据瑞士动物保护立法以及国际准则和良好实践进行。

C57BL6小鼠被施用DPBS中的ASO1或如实例3中所述的包封在脂质囊泡F1中的ASO1。施用方案总结在下表8中

表8：体内施用方案

治疗3天后处死小鼠，收集器官并用0.9％NaCl冲洗。脾脏被分成两部分，并且在4℃将一半置于RPMI-1640培养基(No.11875093，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)中，立即分离T细胞(参见下文)。所有其他器官均在-80℃储存在RNAlater溶液(No.AM7021，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)中，直至进一步处理。将器官置于3倍体积的QIAzol裂解试剂(No.79306，Qiagen，希尔登，德国)中，转移到2mL或5mL含有陶瓷珠的Precellys管(No.KT03961-1-002.2或No.KT03961-1-302.7，BertinInstruments，蒙蒂尼勒布勒托讷，法国)，并使用Precellys进化匀浆器(BertinInstruments，蒙蒂尼勒布勒托讷，法国)匀浆。如材料和方法部分所述，使用杂交ELISA(hELISA)测定组织匀浆中的ASO1浓度。ASO 1的生物分布显示在表9中，清楚地表明负载LNA_ASO的脂质囊泡在I.V.和口服填喂时分布到若干组织中。I.V.似乎提供最大的寡核苷酸浓度。

表9：ASO1的体内生物分布评估。指定组织中ASO1的浓度以nM为单位，并且显示为n＝4次重复的平均值±SD。

治疗	DPBS中的ASO1	脂质囊泡F1中的ASO1	脂质囊泡F1中的ASO1
				施用途径	i.v.注射	i.v.注射	p.o.填喂
肝	6.533±3.635	21.005±10.283	2.130±0.618
				左肾	14.098±0.660	10.696±1.227	0.822±0.439
右肾	14.682±1.218	11.378±1.028	1.586±1.202
				小肠	1.822±0.353	2.934	1.629±0.850
脑	未测定	未测定	未测定
				脾	3.623±0.868	13.147±5.490	3.077
T细胞	未测定	未测定	未测定

nd＝检测不到hELISA

还通过RT-PCR在收集的组织中分析了靶RNA(Malat-1 mRNA)的敲低。简而言之，根据制造商的建议，使用miRNeasy迷你试剂盒(No.217004，Qiagen，希尔登，德国)从组织匀浆中分离出总RNA。使用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒(R11490，Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国)定量总RNA。在LightCycler 480仪器(罗氏诊断，Rotkreuz，瑞士)上使用LightCycler Multiplex RNA Virus Master试剂盒(No.07083173001，罗氏诊断，Rotkreuz，瑞士)分析RNA表达。Malat-1 lncRNA(Mm01227912_s1)和GAPDH(Mm99999915_g1)引物购自Thermo Scientific(Waltham，马萨诸塞州，美国)。通过ΔΔct方法针对GAPDH分析Malat-1 mRNA表达，归一化为总RNA含量。结果显示在表10中，并表示为n＝4次重复的平均倍数变化±SD。结果表明，可以在肝脏、大脑、脾脏和T细胞中实现靶标减少。通过口服填喂施用的负载LNA ASO的脂质囊泡似乎在脾脏中产生了非常有效的靶标敲低。口服施用后，在大脑和T细胞中也观察到了一些敲低，尽管它没有超过由DPS中的ASO或脂质囊泡中的ASO的I.V.所达到的水平。当口服施用脂质囊泡中的ASO时，肾脏中的靶标敲低似乎被消除。

表10.ASO1 LNA ON的体内靶标敲低效率。在DPBS中配制或包封在脂质囊泡(F1)中的ASO1通过静脉注射(0.5mg/kg)或口服填喂(1mg/kg)在小鼠体内施用。靶标RNA(Malat-1)的敲低通过rt-qPCR分析，归一化为总RNA含量。表达值显示为n＝4次重复的对照(DPBS治疗的动物)的倍数变化±SD。

Claims

2.根据权利要求1所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡在20℃的温度于胃液中稳定至少5h。

3.根据权利要求1或2所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡在20℃的温度于禁食状态的肠液中稳定至少5h。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为5mol％至50mol％的胆固醇。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于所述未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量为2mol％至70mol％的L-α-磷脂酰乙醇胺。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于所述未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的总量为30mol％至90mol％的至少一种磷脂酰乙醇胺，优选地为L-α-磷脂酰乙醇胺，以及胆固醇。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡进一步包含至少一种磷脂酰胆碱和/或至少一种磷脂酰丝氨酸和/或至少一种溶血双磷脂酸。

8.根据权利要求7所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡中磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和溶血双磷脂酸的总量在基于所述未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的10mol％至54mol％的范围内。

9.根据权利要求7或8所述的脂质囊泡，其中所述至少一种磷脂酰胆碱为Egg-PC或DOPC。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡进一步包含至少一种鞘磷脂，特别是选自由以下项组成的组的鞘磷脂：乳鞘磷脂、脑鞘磷脂、卵鞘磷脂和它们中的两种或更多种的混合物。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡包含基于所述未负载的脂质囊泡总量(以mol计)的量在4mol％至15mol％的范围内的所述至少一种鞘磷脂。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的脂质囊泡，其中所述脂质囊泡具有根据DLS测量的小于200nm的流体动力学直径D_h，优选地具有在50nm至200nm的范围内的直径。

13.根据权利要求1至12中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述核酸分子能够调节所述靶组织中的靶核酸。

14.根据权利要求1至13中任一项所使用的脂质囊泡，其中核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键和/或修饰的核苷。

15.根据权利要求14所使用的脂质囊泡，其中所述修饰的核苷为独立地选自由以下项组成的组的2′糖修饰的核苷：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA(锁核酸)核苷。

16.根据权利要求1至15中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述核酸分子为反义寡核苷酸或RNAi分子。

17.根据权利要求16所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸是长度为7个至30个核苷酸的单链修饰的反义寡核苷酸。

18.根据权利要求17所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸选自缺口聚物、混聚物、全聚物、抗miR、阻断miR和剪接转换寡核苷酸。

19.根据权利要求17或18所使用的脂质囊泡，其中所述反义寡核苷酸中至少50％的核苷间键为硫代磷酸酯键，特别是单链反义寡核苷酸的所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

20.根据权利要求17至19中任一项所使用的脂质囊泡，其中所述单链修饰的反义寡核苷酸包含至少三个2′糖修饰的核苷，其独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA(锁核酸)核苷。

21.根据权利要求1至20中任一项所使用的脂质囊泡，其中

a)所述核酸分子可递送至所述中枢神经系统，诸如脑和/或脊髓，并且其中所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：脑癌(例如脑瘤)、癫痫发作失调、神经退行性疾病、神经精神障碍和运动障碍，诸如癫痫发作失调、神经退行性疾病、神经精神障碍或运动障碍选自由以下项组成的组：快乐木偶综合征、亚历山大病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、弗里德希氏共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩症、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、自闭症、癫痫、额颞叶痴呆、进行性延髓麻痹、瑞特综合征、妥瑞氏综合征、神经纤维瘤病、进行性肌肉萎缩、遗传性痉挛性截瘫、佩-梅二氏病、高雪氏病、脊髓小脑共济失调、Pagon Bird Detter综合征、弗里德希氏共济失调；脊髓小脑共济失调、迪格奥尔格综合征、Dup15q综合征、杜斯综合征、Glut1缺陷综合征、CDKL5障碍、额叶癫痫、儿童失神癫痫、早期肌阵挛性脑病(EME)、伦-格综合征(LGS)、大田原综合征和兰达-克莱夫纳综合征，

b)所述核酸分子可递送至脾脏，并且

d)所述核酸分子可递送至肝脏，并且其中所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：肝癌、心血管疾病、凝血级联缺陷、炎症性疾病、代谢性疾病和感染，例如其中肝脏疾病选自由以下项组成的组：肝细胞癌、从其他组织中的原发性癌症转移的肝脏恶性肿瘤、1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素抵抗、血糖水平控制、HDL/LDL胆固醇失衡、动脉粥样硬化、血脂异常、家族性混合型高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类药物耐药性高胆固醇血症、心血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病、肥胖、急性冠状动脉综合征(ACS)、血栓形成、罕见的出血性疾病、乙型或丙型肝炎、巨细胞病毒感染、血吸虫病感染和钩端螺旋体病感染、疟疾、片吸虫感染、类风湿性关节炎、肝纤维化、肝硬化、肝性卟啉病、急性间歇性卟啉症(AIP)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、重症肌无力、视神经脊髓炎、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、库欣综合征和转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性。