CN110522724A - 包载基因药物的靶向EpCAM脂质体纳米颗粒及制备方法、应用 - Google Patents

包载基因药物的靶向EpCAM脂质体纳米颗粒及制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，包括步骤：(1)将DOTAP、HSPC、Chol、DSPE‑PEG2000‑COOH按预设配比共同溶于有机溶剂中；(2)减压蒸发除去有机溶剂，得到透明均匀的脂质体膜；(3)使脂质体膜水化，并挤出成膜，形成空白脂质体纳米颗粒；(4)将EDC、NHS加入所述的空白脂质体纳米颗粒中，以活化所述的空白脂质体纳米颗粒表面的羧基，将NH2‑修饰的EpCAM核酸适配体储存液加入活化的空白脂质体纳米颗粒中，孵育，以将所述的空白脂质体纳米颗粒进行EpCAM核酸适配体修饰，而获得所述的脂质体纳米颗粒。

Description

包载基因药物的靶向EpCAM脂质体纳米颗粒及制备方法、应用
技术领域
本发明涉生物医药技术领域，具体涉及一种可包载基因类药物的纳米颗粒，其具有EpCAM靶向性。
背景技术
微小RNA(microRNA/miRNA/miR)代表了一类新的小型非编码RNA，其通过与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)中的互补序列的碱基配对来转录后调控基因表达。功能研究表明miRNA几乎控制着每个生物学过程，并且它们的异常表达导致疾病状态，如癌症。然而，与其他基因类药物相同，miRNA模拟物的亲水性质，对血清中核酸酶降解的敏感性，渗透性差和肿瘤细胞吸收减少是实现其有效的体内递送的主要障碍。
脂质体是目前最成功的药物输送载体，美国食品和药品管理局(FDA)已经批准约30多种脂质体系统进入临床疾病的治疗。脂质体载药以前的机理主要也是通过肿瘤组织的EPR效应。为了实现更特异的靶向，核酸适配体功能化脂质体是更佳选择。
上皮特异性黏附分子(EpCAM)是一种单次跨膜蛋白，于1979年由Herlyn等在结肠癌中发现，被认为是人类结肠癌组织的主要肿瘤相关抗原，可作为结肠癌靶向给药的潜在靶点。
因此，通过构建靶向EpCAM的脂质体纳米药物传递系统包载miRNA等基因类药物，可有效增加其在EpCAM高表达肿瘤部位的积蓄，提高其体内稳定性，以更好地发挥肿瘤治疗效果。
发明内容
针对现有的医药技术缺陷和不足，本发明借助DSPE-PEG2000-COOH、DOTAP、HSPC以及Chol的组合和配比，将具有靶向功能的EpCAM核酸适配体修饰于脂质体纳米颗粒上，实现了具有EpCAM靶向功能的、可载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备。制备工艺简单，可提高肿瘤治疗效率，对基因药物用于靶向治疗EpCAM高表达的癌症治疗有重要意义。
本发明提供了一种具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒，所述的脂质体纳米颗粒包括组分DOTAP、HSPC、Chol合DSPE-PEG2000-COOH，且所述的脂质体纳米颗粒的表面经EpCAM核酸适配体修饰。
本发明提供一种具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，所述的靶向脂质体纳米颗粒粒径均匀，低毒性，具有长循环效果，能增动肿瘤靶向富集作用和提高肿瘤治疗效果；所述的制备方法简单、重复性高，对基因药物的临床应用有重要意义。
为实现本发明的目的，采用以下制备方法，其具体步骤如下：
(1)将DOTAP、HSPC、Chol、DSPE-PEG2000-COOH按预设配比共同溶于有机溶剂中；
(2)减压蒸发除去有机溶剂，得到透明均匀的脂质体膜；
(3)使所述的脂质体膜水化，并挤出成膜，形成空白脂质体纳米颗粒(NPs)；
(4)将EDC、NHS加入所述的空白脂质体纳米颗粒中，以活化所述的空白脂质体纳米颗粒表面的羧基，将NH2-修饰的EpCAM核酸适配体储存液加入活化的空白脂质体纳米颗粒中，孵育，以将所述的空白脂质体纳米颗粒进行EpCAM核酸适配体修饰，而获得所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒(ANPs)。
较佳地，所述的步骤(1)中的有机溶剂为氯仿与甲醇的混合液，其中氯仿8mL，甲醇2mL；所述的预设配比为摩尔比8.6:8.6:12.7:1.4。
较佳地，所述的步骤(2)具体为：使用超声以充分溶解各组分后，减压蒸发除去有机溶剂，高压氮气吹尽残余有机溶剂，获得透明均匀的脂质体膜；所述的的超声的时间为2min，减压旋蒸条件为42℃、45rpm。
较佳地，所述的步骤(3)具体为：将去离子水加入所述的脂质体膜中，摇晃使所述的脂质体膜水化，水浴孵育以使各组分相变，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头进行超声处理，通过挤出器挤出200nm膜，形成空白脂质体纳米颗粒；所述的水浴的温度为50-60℃，孵育时间为45-60min，超声处理条件为：100w，10min，工作1s，间隔1s。
较佳地，所述的步骤(4)中EDC的浓度为1.6μM，NHS储备液的浓度为0.4μM；羧基的活化时间为15-25min；羧基的活化温度为室温；DSPE-PEG2000-COOH与NH2-修饰的EpCAM核酸适配体摩尔比为28:1；所述的NH2-修饰的EpCAM核酸适配体储存液浓度为100μM；孵育温度为4℃，时间为16-24h。
本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括基因药物和所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒。所述的药物组合物可以在制备用于治疗EpCAM高表达的癌症的药品进行应用。
由本发明提供的制备方法获得的脂质体纳米颗粒，可用于包载基因药物，具体步骤为：
将基因储存液加入所述的ANPs中，孵育，得到载基因药物的ANPs(MANPs)。其中ANPs与基因的氮磷比最低为10:1；优选地，孵育温度为4℃，时间为2h。
本发明的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法的优点在于：利用薄膜水化法制备了一种脂质体纳米颗粒，DOTAP制备得到的脂质体纳米颗粒具有正电性，有利于包载负电性的基因药物，聚乙二醇长链使制备得到的脂质体纳米颗粒具有体内的长循环效应，有利于药物在作用部位的积蓄；利用活化羧基和氨基的反应缀合EpCAM核酸适配体，使制备得到的脂质体纳米颗粒具有EpCAM靶向性，有利于药物在体内的靶向运输。本发明制备得到的脂质体纳米颗粒赋予基因药物体内长循环和对EpCAM高表达肿瘤的靶向功能。
附图说明
图1-A为修饰了EpCAM核酸适配体后的NPs(即ANPs)的琼脂糖凝胶电泳图，ANPs未有游离的适配体条带显示，表明EpCAM核酸适配体与NPs缀合成功。
图1-B为不同氮磷比条件下MANPs的琼脂糖电泳图，氮磷比大于10时，未显示基因的条带，表明ANPs完全包载基因。
图2-A1和图2-A2分别为MNPs及MANPs的粒径分布、粒径大小、zeta电位及聚合物分散性指数，MNPs及MANPs粒径分布均匀、粒径均小于200nm、正电性、具有良好的聚合物分散性指数。
图2-B1和图2-B2分别为MNPs及MANPs的形态，MNPs及MANPs分布均一，呈圆整的球形。
图3-A及3-B分别为NPs及ANPs在7天内的粒径及聚合物分散性指数变化，浮动微小，具有较佳稳定性。
图4为不同浓度MANPs的溶血性评价，实验浓度下MANPs的溶血性均小于6％，有较佳生物安全性，1mg/mL为体内给药浓度。
图5-A为Western Blot实验验证不同肿瘤细胞中EpCAM的表达水平，SGC7901、HCT116、HCT8为EpCAM表达阳性细胞，HeLa细胞为EpCAM表达阴性细胞。
图5-B为包载了FAM标记的基因药物(FAM-miR)的MANPs与不同细胞孵育6h后的荧光显微镜观察图，MANPs将荧光标记的基因药物迅速递送到EpCAM表达阳性的细胞中，而未递送到EpCAM表达阴性的细胞中，细胞水平显示了MANPs的靶向性。
图6-A为尾静脉注射游离DiR、NPs包载的DiR(DiR-NPs)、ANPs包载的DiR(DiR-ANPs)后1h、8h、24h、48h时皮下荷HCT116瘤小鼠的活体荧光图像，给药后24h和48h，肿瘤部位DiR-ANPs荧光信号明显强于其他各组肿瘤荧光信号，说明经EpCAM核酸适配体修饰的脂质体纳米颗粒更有利于肿瘤部位的蓄积。
图6-B为48h后离体主要脏器和肿瘤组织荧光强度定量分析，表明本发明制备的EpCAM核酸适配体修饰的载药脂质体纳米粒具有良好的肿瘤靶向性。
图7-A为不载药Lipo2000(对照)、NPs、ANPs的HCT8细胞毒性实验，NPs及ANPs不影响细胞的增殖，无细胞毒性。
图7-B为包载了基因药物的MLipo2000(阳性对照)、MNPs、MANPs的HCT8细胞毒性实验，MLipo2000、MNPs、MANPs对HCT8细胞增殖有显著抑制作用，且MANPs对细胞增殖的抑制效果优于MNPs，在细胞水平显示出MANPs递送基因药物的高效性，更优地抑制细胞增殖。
图8-A、8-B分别为NPs、MNPs、MANPs对皮下荷HCT8瘤小鼠的体内抗肿瘤作用，其中图8-A为治疗结束后所有离体肿瘤的图像，图8-B为治疗结束后离体肿瘤的重量，MNPs、MANPs均显示出显著的体内抗肿瘤作用，MANPs显示出更强的体内抗肿瘤效果，最有效地抑制了肿瘤生长，体现了EpCAM核酸适配体修饰的靶向脂质体纳米颗粒递送基因药物用于体内治疗的优异性。
图9为小鼠治疗结束后，对主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行组织固定及H&E染色，结果显示各组处理均未引起脏器损伤，体现了EpCAM核酸适配体修饰的靶向脂质体纳米颗粒递送基因药物用于体内治疗的安全性。
具体实施方式
以下结合具体实施实例，进一步阐述本发明。这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
为了能够更清楚的理解本发明的技术内容，特举以下实例详细说明。
实施例1MANPs的制备
精密称取处方量30.0mg DOTAP，33.5mg HSPC，24.5mg Chol，19.5mg DSPE-PEG2000-COOH(处方中各物质摩尔比：DOTAP：HSPC：Chol：DSPE-PEG2000-COOH＝8.6：8.6：12.7：1.4)，共同溶于混合有机溶剂(40mL氯仿，10mL甲醇)。水浴超声2min使其充分溶解。在42℃、45rpm下，减压蒸发除去有机溶剂，得到透明均匀的脂质体膜。高压氮气吹尽残余氯仿，置于4℃冰箱过夜。加入10.0mL去离子水，摇晃使其水化。60℃水浴下孵育45min。冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体(100W，10min，工作1s，间隔1s)。最后分别通过挤出器挤出200nm膜15次形成空白脂质体纳米颗粒(NPs)。
吸取2mL浓度为20μM的miR-139-5p mimis储存液加入10.0mL上述NPs中，混匀，4℃孵育2h，得包载miR-139-5p mimis的脂质体纳米颗粒(MNPs)。
将EDC、NHS分别用去离子水提前配制成0.64mM、0.16mM的储备液，各取25μL加入10mL NPs中，于室温下活化脂质体表面的羧基，加入2.5μL 100μM的EpCAM核酸适配体储存液(摩尔比，DSPE-PEG2000-COOH：EpCAM核酸适配体＝28:1)，混匀，4℃孵育24h，得EpCAM核酸适配体修饰的靶向脂质体纳米颗粒(ANPs)。
吸取2mL浓度为20μM的miR-139-5p mimis储存液加入上述ANPs中，混匀，4℃孵育2h，得包载miR-139-5p mimis的EpCAM靶向脂质体纳米颗粒(MANPs)。
实施例2效果
按照上述方法制备得到包载FAM-miR-139-5p mimics的靶向脂质体纳米颗粒FAM-MANPs，将FAM-MANPs与EpCAM表达阳性或阴性的肿瘤细胞共同孵育6h，如图5-A和5-B所示，荧光显微镜观察结果显示在EpCAM表达阳性的细胞中观察到FAM荧光，而在EpCAM表达阴性的细胞中未观察到荧光，表面FAM-MANPs靶向性地将FAM-miR-139-5p mimics递送到EpCAM表达阳性的细胞中，体外水平显示出本发明所制备的EpCAM靶向脂质体纳米颗粒的靶向性。
按照上述方法制备得到包载近红外染料DiR的脂质体纳米颗粒(DiR-NPs)及包载近红外染料DiR的靶向脂质体纳米颗粒(DiR-ANPs)，取皮下荷EpCAM阳性细胞瘤小鼠，分别注射生理盐水、游离DiR、DiR-NPs、DiR-ANPs，使用小动物活体成像仪观察发现(如图6-A和6-B所示)，在24h及48h时，仅注射DiR-ANPs的小鼠肿瘤中显示出荧光强度，表明本发明所制备的EpCAM靶向脂质体纳米颗粒具有长循环效应，能够选择性在EpCAM阳性肿瘤中聚集，体内水平显示出本发明所制备的EpCAM靶向脂质体纳米颗粒的靶向性，同时降低对于其他组织的毒性。
按照上述方法制备得到NPs、ANPs，选择EpCAM表达阳性的肿瘤细胞，将NPs及ANPs与细胞共孵育5天，或不处理细胞，如图7-A所示，发现NPs与ANPs对细胞的增殖没有影响，表明本发明制备的脂质体纳米颗粒的生物安全性。
按照上述方法制备得到MNPs、MANPs，选择EpCAM表达阳性的肿瘤细胞，将MNPS及MANPs与细胞共孵育5天，如图7-B所示，发现MNPs与MANPs均显著抑制细胞的增殖，其中MANPs效果强于MNPs，体外水平显示出本发明所制备的EpCAM靶向脂质体纳米颗粒递送药物及发挥药效的高效性。
按照上述方法制备得到NPs、MNPs、MANPs，取皮下荷EpCAM阳性细胞瘤小鼠，分别注射生理盐水、NPs、MNPs、MANPs，治疗结束后发现，如图8-A、8-B、9所示，注射MANPs的小鼠肿瘤体积明显比其他组小，表明本发明所制备的EpCAM靶向脂质体纳米颗粒能够将药物聚集于EpCAM阳性的肿瘤部位，从而产生可预见的最优的肿瘤抑制效果。
本发明通过上述实施实例制备得到的载药EpCAM靶向脂质体纳米颗粒，具有生物安全性、长循环效果、能增强肿瘤主动富集作用，使药物更好地发挥疗效。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施实例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (10)

1.一种具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒，其特征在于，所述的脂质体纳米颗粒包括组分DOTAP、HSPC、Chol和DSPE-PEG2000-COOH，且所述的脂质体纳米颗粒的表面经EpCAM核酸适配体修饰。
2.一种权利要求1所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括步骤：
(1)将DOTAP、HSPC、Chol、DSPE-PEG2000-COOH按预设配比共同溶于有机溶剂中；
(2)减压蒸发除去有机溶剂，得到透明均匀的脂质体膜；
(3)使所述的脂质体膜水化，并挤出成膜，形成空白脂质体纳米颗粒；
(4)将EDC、NHS加入所述的空白脂质体纳米颗粒中，以活化所述的空白脂质体纳米颗粒表面的羧基，将NH2-修饰的EpCAM核酸适配体储存液加入活化的空白脂质体纳米颗粒中，孵育，以将所述的空白脂质体纳米颗粒进行EpCAM核酸适配体修饰，而获得所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的有机溶剂为氯仿与甲醇的混合液；所述的预设配比为摩尔比8.6:8.6:12.7:1.4。
4.根据权利要求2所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)具体为：
使用超声以充分溶解各组分后，减压蒸发除去有机溶剂，高压氮气吹尽残余有机溶剂，获得透明均匀的脂质体膜。
5.根据权利要求4所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的的超声的时间为2min，减压旋蒸条件为42℃、45rpm。
6.根据权利要求2所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)具体为：
将去离子水加入所述的脂质体膜中，摇晃使所述的脂质体膜水化，水浴孵育以使各组分相变，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头进行超声处理，通过挤出器挤出200nm膜，形成空白脂质体纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的水浴的温度为50-60℃，孵育时间为45-60min，超声处理条件为：100w，10min，工作1s，间隔1s。
8.根据权利要求2所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中EDC的浓度为1.6μM，NHS储备液的浓度为0.4μM；羧基的活化时间为15-25min；羧基的活化温度为室温；DSPE-PEG2000-COOH与NH2-修饰的EpCAM核酸适配体摩尔比为28:1；所述的NH2-修饰的EpCAM核酸适配体储存液浓度为100μM；孵育温度为4℃，时间为16-24h。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括基因药物和权利要求1所述的具有EpCAM主动靶向功能的可包载基因药物的脂质体纳米颗粒。
10.一种权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗EpCAM高表达的癌症的药品的应用。
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