CN115472238A - 一种基于体外pk-pd模型的药物胞内递送预测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一种基于体外PK‑PD模型的药物胞内递送预测方法,步骤为:(1)构建药物体外PK‑PD模型;(2)通过体外实验获得非纳米药物或/和纳米药物在细胞及细胞核中的分布、浓度数据、细胞直径以及细胞核直径;(3)模型参数求解和数据拟合。本发明所描述的方法克服药物体外‑体内转化的障碍,即将细胞外药物浓度转化为对细胞核内有效药物量,从而更加准确的预测药物胞内递送预测规律,以期为制剂开发,尤其是脂质体开发提供合理的参考。
Description
技术领域
本发明涉及药代动力学技术领域,尤其涉及一种基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法。
背景技术
定量药理学应用数学和统计学方法,通过建立数学模型,定量描述并预测药物在生物体内的吸收、分布、代谢和排泄,同时将疾病进程中的一些生物标志物的信息进行量化。
纳米药物主要有脂质体、聚合物胶束、聚合物-药物偶联物无和机纳米颗粒等。与常规药物相比,纳米药物在宏观机体和微观细胞中的分布涉及多种转运机制,其粒径、电位和表面涂层等理化性质也一定程度上影响了药物的药代动力学行为。
目前已有定量药理学模型研究,但是主要集中描述制剂靶向肿瘤组织的递送效果。迄今为止,鲜有微观层面的药动学研究描述其在细胞内有效作用位点的递送情况。
发明内容
发明目的:本发明旨在提供一种精准度高、微观层面的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法。
技术方案:本发明的一种基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)构建药物体外PK-PD模型:药物为非纳米药物D或/和纳米药物F,其中药物F内载有药物D;若为非纳米药物,则通过线路一构建体外PK-PD模型;若药物为纳米药物,则通过线路二构建体外PK-PD模型;若药物为纳米药物和非纳米药物的混合药物,则通过线路三构建体外PK-PD模型;
线路一:非纳米药物PK-PD模型的药物浓度描述基于细胞外、细胞胞浆中、细胞核三种状态,其中细胞核中非纳米药物分为结合和游离两种状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;质量平衡方程包括细胞外药物D的浓度、跨膜进入胞浆的药物D的浓度、进入细胞核内的药物D的浓度、细胞核内游离药物D的浓度、细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度;
线路二:纳米药物PK-PD模型的药物浓度描述包括药物F的浓度描述和药物D'的浓度描述,其中纳米药物F的外壳在胞浆中被包裹吞噬可释放出内载的小分子非纳米药物D';药物F的药物浓度描述基于细胞外、细胞膜接触过程中和细胞内的状态,药物D'的药物浓度描述基于细胞胞浆中、细胞核两种状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;质量平衡方程包括细胞外药物F的浓度、细胞膜上结合的药物F的质量、细胞膜内化的药物F的浓度、胞浆内药物F转化为药物D'的浓度、进入细胞核内的药物D'的浓度、细胞核内游离药物D'的浓度、细胞核内与药物DNA结合的药物D'的浓度;
线路三:混合药物由药物D和药物F组成,药物F进入胞浆内转化为药物D',药物D'与跨膜进入胞浆的药物D构成胞浆内的药物D”;混合药物PK-PD模型的药物浓度描述包括药物F的浓度描述、药物D、药物D'、药物D”的浓度描述;药物F的药物浓度描述基于细胞外、细胞膜接触过程中和细胞内的状态;药物D的药物浓度描述基于细胞外的状态;药物D'的药物浓度描述基于细胞胞浆中的状态;药物D”的药物浓度描述基于细胞胞浆中、细胞核的状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;质量平衡方程包括细胞外药物F的浓度、细胞膜上结合的药物F的质量、细胞膜内化的药物F的浓度、胞浆内药物F转化为药物D'的浓度、胞浆内药物D”的浓度、进入细胞核内的药物D”的浓度、细胞核内游离药物D”的浓度、细胞核内与药物DNA结合的药物D”的浓度;
(2)通过体外实验获得非纳米药物或/和纳米药物在细胞及细胞核中的分布、浓度数据、细胞直径以及细胞核直径;
(3)模型参数求解和数据拟合。
进一步地,步骤(1)中,根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程,依据的公式如下:
药量变化速率=进入速率-输出速率-消除速率。
进一步地,线路一中质量平衡方程包括:
细胞外药物D的浓度:
其中,Cout_D为细胞外药物D的浓度,即给药浓度;Ka为药物D从细胞外跨膜向细胞胞浆内转移的速率常数;Aout_D为细胞外药物D的质量;Vout细胞外药物体积,即含药溶液体积;Kb为药物D从细胞胞浆内跨膜向细胞外转移的速率常数;Cin_D为跨膜进入胞浆的药物D的浓度;
跨膜进入胞浆的药物D的浓度:
其中,Cin_D为跨膜进入胞浆的药物D的浓度;Kb为药物D从细胞胞浆内跨膜向细胞外转移的速率常数;Kin_nucl为药物D从细胞胞浆内向细胞核内转移的速率常数;Kout_nucl为药物D从细胞核内向细胞胞浆内转移的速率常数;Cnucl_freeD为细胞核内游离药物D的浓度;
进入细胞核内的药物D的浓度:
其中,Cnucl_D为进入细胞核内的药物D的浓度;
细胞核内游离药物D的浓度:
其中,Ctdna为DNA上药物结合位点的浓度;Kd=Koff/Kon,Kd为药物与DNA结合-解离过程的平衡常数。Kon和Koff分别表示药物与DNA结合和解离常数;
细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度:
Cbound=Cnucl_D-Cnucl_freeD
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D的浓度。
进一步地,线路二中质量平衡方程包括:
细胞外药物F的质量:
其中,Aout_F为细胞外游离的药物F的质量;Kb_off为药物F与细胞膜解离速率常数;Abin为细胞膜上结合的药物F的质量;Kb_on为药物F与细胞膜的结合速率常数;Bmax为药物F在细胞膜上的最大结合量;
细胞外药物F的浓度:
Cout_F=Aout_F/Vout
其中,Cout_F为细胞外游离的药物F的浓度;Vout为细胞外药物体积(含药溶液体积);
细胞膜上结合的药物F的质量:
其中,Abin为细胞膜上结合的药物F的质量;Kb_on为药物F与细胞膜的结合速率常数;Kdeg为与膜结合的药物F经细胞膜内化的速率常数;
细胞膜内化的药物F的质量:
其中,Ain_F为经细胞膜内化的药物F的质量;Kdeg为与膜结合的药物F经细胞膜内化的速率常数;Krel为胞浆中药物F释放速率常数;
细胞膜内化的药物F的浓度:
Cin_F=Ain_F/Vcell
其中Cin_F为经细胞膜内化的药物F的浓度;Vcell为整个细胞体积。
胞浆内药物F转化为药物D'的浓度
Cin_D′=Cin_F*Krel
其中Cin_D'为胞浆内药物D'的浓度;Krel为F转化为D'的转化速率常数。
进入细胞核内的药物D的浓度:
其中,Cnucl_D为进入细胞核内的药物D的浓度;
细胞核内游离药物D的浓度:
细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度:
Cbound=Cnucl_D-Cnucl_freeD
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D的浓度。
进一步地,线路三中质量平衡方程包括:
细胞外药物F的质量:
细胞外药物F的浓度:
Cout_F=Aout_F/Vout
细胞膜上结合的药物F的质量:
细胞膜内化的药物F的浓度:
Cin_F=Ain_F/Vcell
其中Cin_F为经细胞膜内化的药物F的浓度;Vcell为整个细胞体积。
胞浆内药物F转化为药物D'的浓度
Cin_D′=Cin_F*Krel
其中Cin_D'为胞浆内药物D'的浓度;Krel为F转化为D'的转化速率常数。
胞浆内药物D”的浓度
Cin_D″=Cin_D′+Cin_D
进入细胞核内的药物D”的浓度
其中,Cnucl_D”为进入细胞核内的药物D”的浓度;Cnucl_free”为细胞核内游离药物D”的浓度;
细胞核内游离药物D”的浓度
细胞核内与药物DNA结合的药物D”的浓度;
Cbound=Cnucl_D″-Cnucl_freeD″
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D”的浓度
进一步地,步骤(1)中药效模型采用转导模型来表示肿瘤细胞生存率的变化,模型变量为与药物DNA结合的药物浓度方程表示:
其中:C为与药物DNA结合的药物浓度μg/1000mm3,Kg为肿瘤细胞自我生长速率常数h-1,Kl为肿瘤细胞呈时间依赖性死亡的速率常数h-1,S为细胞存活率%,t表示给药时间h。
进一步地,药物D为普通制剂多柔比星,药物F为脂质体制剂多柔比星;细胞为肿瘤细胞。
进一步地,步骤(2)中,体外实验方法包括以下步骤:(1)用荧光酶标仪检测样品荧光值;(2)给药方式为:配制低、中、高剂量的无血清高糖DMEM无酚红含药培养基对细胞培养至相应的一段时间;(3)使用活细胞成像仪进行平均细胞核直径的测定。
进一步地,步骤(3)中,利用建模软件描述体外PK-PD模型的质量平衡方程,建模软件为Monolix或Berkelery Madonn。
进一步地,还包括步骤(4)采用敏感性分析方法进行模型参数评价。
更进一步地,步骤(4)中设定脂质体多柔比星相关参数分别正、负两倍变化,将变化后的各参数值代入细胞药动学模型并获得相应药动学曲线和曲线下面积,考察相应的参数对脂质体多柔比星的药(4)采用敏感性分析方法进行模型参数评价物浓度-时间曲线的贡献程度,以识别关键转运参数。
本发明构建的PK-PD模型包含以下几个房室:细胞外、细胞膜、细胞内、细胞核共四个房室。各部位通过细胞间液或胞浆该模型认为外部环境中的阿霉素可逆地进入细胞膜的外部小连接在一起;每一个部位中的药物浓度在任意时刻都是动态平衡的;药物在各组织房室中均符合膜限制性模型相关特性。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下显著优点:(1)预测结果精准,可以有效预测待测药物在细胞内有效作用位点的药物浓度变化,更加精准的描述和评价药物药动学和药效学特性;(2)考察了药物在胞内递送关键转运步骤,尤其是纳米药物在胞内递送关键转运步骤,预估微观层面下纳米制剂递送的障碍,从而可以指导制剂的开发。
附图说明
图1为非纳米药物D的细胞药动学-药效学模型框架图;
图2为纳米药物F的细胞药动学-药效学模型框架图;
图3为混合药物的细胞药动学-药效学模型框架图;
图4为实施例1中的普通制剂和脂质体多柔比星的细胞药动学-药效学模型框架图;
图5为实施例1中的多柔比星系列浓度的平均荧光强度-浓度标准曲线;
图6为实施例1中的普通制剂和脂质体多柔比星在HepG2中细胞药动学模型研究。普通制剂多柔比星给药浓度为5μg/mL(A)、10μg/mL(C)和20μg/mL(E)以及脂质体多柔比星给药浓度为5μg/mL(B)、10μg/mL(D)和20μg/mL(F)时HepG2全细胞(Cell)及细胞核(Nucleus)内药物浓度。散点代表体外实验实验观测值(Observed);实线代表拟合药物浓度(Fit);
图7为实施例1中的普通制剂和脂质体多柔比星在HepG2中细胞药效学模型研究。不同给药浓度下普通制剂多柔比星(A)和脂质体多柔比星(B)对HepG2细胞毒性作用。散点代表体外实验实验观测(Observed);实线代表拟合药物浓度(Fit);
图8为实施例1中的脂质体多柔比星在HepG2中细胞药动学模型参数敏感性分析。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
在一实施例中,提供一种基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,包括以下步骤:
(1)构建药物体外PK-PD模型:
其中,PK-PD模型采用数学和统计学方法,定量研究药物在体内外ADME过程与药效之间关系。药动学模型结构的构建需要依据生理学、生物化学以及药理学的相关研究,描述药物的代谢过程。PK研究主要考察药物的ADME过程随时间变化的规律,而PD研究在于考察药物与机体之间的作用关系。在确定模型结构之后,再根据质量平衡的基本思路描述药物的动态变化过程,即药量变化速率=进入速率-输出速率-消除速率,数学描述形式包括常微分方程、偏微分方程和差分方程等。PK-PD模型的构建可采用种软件进行建立,如MonolixSuite、Berkelery Madonna和Winnolin等。
本实施例构建的PK-PD模型包含以下几个房室:细胞外、细胞膜、细胞内、细胞核共四个房室。各部位通过细胞间液或胞浆该模型认为外部环境中的非纳米药物D可逆地进入细胞膜的外部小连接在一起;每一个部位中的药物浓度在任意时刻都是动态平衡的;药物在各组织房室中均符合膜限制性模型相关特性。药效学研究基于转导模型,效应指标为细胞存活率。
药物为非纳米药物D或/和纳米药物F,其中药物F内载有药物D;若为非纳米药物,则通过线路一构建体外PK-PD模型;若药物为纳米药物,则通过线路二构建体外PK-PD模型;若药物为纳米药物和非纳米药物混合药物,则通过线路三构建体外PK-PD模型;
其中,根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程,依据的公式如下:
药量变化速率=进入速率-输出速率-消除速率。
如图1所示,线路一:非纳米药物PK-PD模型的药物浓度描述基于细胞外、细胞胞浆中、细胞核三种状态,其中细胞核中非纳米药物分为结合和游离两种状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;质量平衡方程包括细胞外药物D的浓度、跨膜进入胞浆的药物D的浓度、跨膜进入细胞药物D的质量、进入细胞核内的药物D的浓度、细胞核内游离药物D的浓度、细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度;
细胞外药物D的浓度:
其中,Cout_D为细胞外药物D的浓度,即给药浓度;Ka为药物D从细胞外跨膜向细胞胞浆内转移的速率常数;Aout_D为细胞外药物D的质量;Vout细胞外药物体积,即含药溶液体积;Kb为药物D从细胞胞浆内跨膜向细胞外转移的速率常数;Cin_D为跨膜进入胞浆的药物D的浓度;
跨膜进入胞浆的药物D的浓度:
其中,Cin_D为跨膜进入胞浆的药物D的浓度;Kb为药物D从细胞胞浆内跨膜向细胞外转移的速率常数;Kin_nucl为药物D从细胞胞浆内向细胞核内转移的速率常数;Kout_nucl为药物D从细胞核内向细胞胞浆内转移的速率常数;Cnucl_freeD为细胞核内游离药物D的浓度;
进入细胞核内的药物D的浓度:
其中,Cnucl_D为进入细胞核内的药物D的浓度;
细胞核内游离药物D的浓度:
其中,Ctdna为DNA上药物结合位点的浓度;Kd=Koff/Kon,Kd为药物与DNA结合-解离过程的平衡常数。Kon和Koff分别表示药物与DNA结合和解离常数;
细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度:
Cbound=Cnucl_D-Cnucl_freeD
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D的浓度。
如图2所示,线路二:纳米药物PK-PD模型的药物浓度描述基于细胞外、细胞膜接触过程中和细胞内三种状态,其中纳米药物外壳在胞浆中被包裹吞噬可释放出内载的小分子非纳米药物;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;质量平衡方程包括细胞外药物F的浓度、细胞膜上结合的药物F的质量、细胞膜内化的药物F的浓度;
细胞外药物F的质量:
其中,Aout_F为细胞外游离的药物F的质量;Kb_off为药物F与细胞膜解离速率常数;Abin为细胞膜上结合的药物F的质量;Kb_on为药物F与细胞膜的结合速率常数;Bmax为药物F在细胞膜上的最大结合量;
细胞外药物F的浓度:
Cout_F=Aout_F/Vout
其中,Cout_F为细胞外游离的药物F的浓度;Vout为细胞外药物体积(含药溶液体积);
细胞膜上结合的药物F的质量:
其中,Abin为细胞膜上结合的药物F的质量;Kb_on为药物F与细胞膜的结合速率常数;Kdeg为与膜结合的药物F经细胞膜内化的速率常数;
细胞膜内化的药物F的质量:
其中,Ain_F为经细胞膜内化的药物F的质量;Kdeg为与膜结合的药物F经细胞膜内化的速率常数;Krel为胞浆中药物F释放速率常数;
细胞膜内化的药物F的浓度:
Cin_F=Ain_F/Vcell
其中Cin_F为经细胞膜内化的药物F的浓度;Vcell为整个细胞体积。
胞浆内药物F转化为药物D'的浓度
Cin_D′=Cin_F*Krel
其中Cin_D'为胞浆内药物D'的浓度;Krel为F转化为D'的转化速率常数。
进入细胞核内的药物D的浓度:
其中,Cnucl_D为进入细胞核内的药物D的浓度;
细胞核内游离药物D的浓度:
其中,Ctdna为DNA上药物结合位点的浓度;Kd=Koff/Kon,Kd为药物与DNA结合-解离过程的平衡常数。Kon和Koff分别表示药物与DNA结合和解离常数;细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度:
Cbound=Cnucl_D-Cnucl_freeD
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D的浓度。
如图3所示,线路三:混合药物由药物D和药物F组成,药物F进入胞浆内转化为药物D',药物D'与跨膜进入胞浆的药物D构成胞浆内的药物D”;混合药物PK-PD模型的药物浓度描述包括药物F的浓度描述、药物D、药物D'、药物D”的浓度描述;药物F的药物浓度描述基于细胞外、细胞膜接触过程中和细胞内的状态;药物D的药物浓度描述基于细胞外的状态;药物D'的药物浓度描述基于细胞胞浆中的状态;药物D”的药物浓度描述基于细胞胞浆中、细胞核的状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;质量平衡方程包括细胞外药物F的浓度、细胞膜上结合的药物F的质量、细胞膜内化的药物F的浓度、胞浆内药物F转化为药物D'的浓度、胞浆内药物D”的浓度、进入细胞核内的药物D”的浓度、细胞核内游离药物D”的浓度、细胞核内与药物DNA结合的药物D”的浓度;
线路三中质量平衡方程包括:
细胞外药物F的质量:
细胞外药物F的浓度:
Cout_F=Aout_F/Vout
细胞膜上结合的药物F的质量:
细胞膜内化的药物F的浓度:
Cin_F=Ain_F/Vcell
其中Cin_F为经细胞膜内化的药物F的浓度;Vcell为整个细胞体积。
胞浆内药物F转化为药物D'的浓度
Cin_D′=Cin_F*Krel
其中Cin_D'为胞浆内药物D'的浓度;Krel为F转化为D'的转化速率常数。
胞浆内药物D”的浓度
Cin_D″=Cin_D′+Cin_D
进入细胞核内的药物D”的浓度
其中,Cnucl_D”为进入细胞核内的药物D”的浓度;Cnucl_free”为细胞核内游离药物D”的浓度;
细胞核内游离药物D”的浓度
细胞核内与药物DNA结合的药物D”的浓度;
Cbound=Cnucl_D″-Cnucl_freeD″
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D”的浓度。
其中,中药效模型采用转导模型来表示肿瘤细胞生存率的变化,模型变量为与药物DNA结合的药物浓度方程表示:
其中:C为与药物DNA结合的药物浓度μg/1000mm3,Kg为肿瘤细胞自我生长速率常数h-1,Kl为肿瘤细胞呈时间依赖性死亡的速率常数h-1,S为细胞存活率%,t表示给药时间h。
(2)通过体外实验获得非纳米药物或/和纳米药物在细胞及细胞核中的分布、浓度数据、细胞直径以及细胞核直径;(1)用荧光酶标仪检测样品荧光值;(2)给药方式为:配制低、中、高剂量的无血清高糖DMEM无酚红含药培养基对细胞培养至相应的一段时间;(3)使用活细胞成像仪进行平均细胞核直径的测定。
(3)模型参数求解和数据拟合。利用建模软件描述体外PK-PD模型的质量平衡方程,建模软件为Monolix或Berkelery Madonn。为了简化处理过程,仅考虑体外实验的药动学和药效学研究中的数据平均值用于模型参数求解,暂不考虑组内SD的影响。同时,假设肿瘤细胞为球形,按照V=4π(d/2)3/3这一公式求细胞体积和细胞核体积,以及细胞核的体积在细胞体积中的占比。根据可视化检验、倍数误差法对预测值与实测值进行比较,评价模型的拟合情况。计算方法为:
当CObserved>CFit,此时倍数误差值为CObserved/CFit;
当CObserved<CFit,此时倍数误差值为CFit/CObserved。
若倍数误差值<2,则认为该时间点出药物浓度拟合良好;若倍数误差值>2,则认为需要重新求解参数。
(4)采用敏感性分析方法进行模型参数评价:设定脂质体多柔比星相关参数分别正、负两倍变化,将变化后的各参数值代入细胞药动学模型并获得相应药动学曲线和曲线下面积,考察相应的参数对脂质体多柔比星的药物浓度-时间曲线的贡献程度,有效识别关键转运参数。
下面以药物D为普通制剂多柔比星,药物F为脂质体制剂多柔比星为例进行具体说明。
实施例1:
步骤1:构建药物体外PK-PD模型;
普通制剂DOX和Lipo-DOX的细胞药动学-药效学模型框架图如图4所示。变量名和参数名见表1和表2.
表1普通制剂DOX和Lipo-DOX的细胞药动学模型变量和参数列表
(接上表)
表2转导房室模型变量和参数列表
(1)细胞外DOX的浓度:
细胞外DOX的质量:
Aout_dox=Cout_dox*Vout (2)
(2)跨膜进入胞浆的DOX的浓度:
跨膜进入细胞DOX的质量:
Ain_dox=Cin_dox*Vcell (4)
(3)进入细胞核内的DOX的浓度:
进入细胞核内的DOX的质量:
Anucl_dox=Cnucl_dox*Vnucl (6)
(4)细胞核内游离Dox的浓度:
Cnucl_freedox=0.5*((Cnucl_dox-Ctdna-Kd)+((Cnucl_dox-Ctdna-Kd)2+4*Kd*Cnucl_dox)^0.5)(7)
细胞核内的游离DOX的质量:
Anucl_freedox=Cnucl_freedox*Vnucl (8)
(5)细胞核内与DNA结合的Dox的浓度:
Cbound=Cnucl_dox-Cnucl_freedox (9)
细胞核内与DNA结合的DOX的质量:
Abound=Cbound*Vnucl (10)
(6)细胞外Lipo-DOX的质量:
细胞外Lipo-DOX的浓度:
Cout_lipo=Aout_lipo/Vout (12)
(7)细胞膜上结合的Lipo-DOX的质量:
(8)细胞膜内化的Lipo-DOX的质量:
细胞膜内化的Lipo-DOX的浓度:
Cin_lipo=Ain_lipo/Vcell (15)
(9)细胞存活率可表示为:
步骤2.通过体外实验获得普通制剂和脂质体多柔比星在肿瘤细胞及细胞核中的分布和浓度数据,以及相应的抗肿瘤效果数据;
2.1所述普通制剂多柔比星(DOX)为阿拉丁盐酸阿霉素(纯度>98%),CAS号:25316-40-9;脂质体多柔比星(Lipo-DOX)为常州金远药业(中国)盐酸多柔比星脂质体注射液(10mL:20mg),国药准字:H20123273。
2.2体外实验研究选用的肿瘤细胞类型为人肝脏肿瘤细胞HepG2。
2.3给药分组包括:正常组(Control):不含血清的DMEM培养基处理;多柔比星组(普通制剂DOX):含DOX的不含血清的DMEM培养基处理;脂质体多柔比星组(Lipo-DOX):含Lipo-DOX的不含血清的DMEM培养基处理。
2.4DOX荧光强度-药物浓度标准曲线建立
已有大量研究证实DOX红色荧光强度可以用于反映药物的分布和相对浓度,因此可以根据这一特性在体内外实验中对DOX进行半定量,本研究据此建立DOX荧光强度半定量方法。
精密称取盐酸普通制剂DOX(2.0mg),加入适量PBS溶液溶解,定容至1mL,得到DOX的PBS储备液(1.0mg/mL)。将储备液稀释一系列浓度(5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01μg/mL),每个浓度取100μL加入96孔荧光定量板中,用荧光酶标仪检测每孔的荧光值(激发波长488nm,发射波长580nm[12],读板方式:顶读)每个浓度设置3个复孔,记录荧光酶标仪测定的不同浓度普通制剂DOX对应的荧光值,以荧光值(Y)为纵坐标,DOX的浓度(X)为横坐标,用GraphPad 8.0绘制散点图,作一元线性回归分析,拟合得到标准曲线、方程和相关系数(R2),见附图5,并计算每个浓度的平均荧光值、标准差(SD)和相对标准差(RSD)。
2.5普通制剂DOX和Lipo-DOX在HepG2细胞株中的药动学研究
将HepG2细胞以每孔4*105个细胞点入6孔板中,培养12~24h细胞贴壁后给药。吸去各孔培养基,PBS溶液洗3遍,对照组每孔加入1mL无血清DMEM培养基,复孔数为3。其余每孔分别加入1mL的含普通制剂DOX和Lipo-DOX浓度为5、10、20μg/mL的DMEM培养基,每组3个复孔。用含药培养基孵育HepG2细胞1、3、6、12、24h后进行处理。含药DMEM培养基孵育至相应的一段时间后,吸去各孔培养基,将细胞用冷的PBS溶液冲洗2次,分别将每孔细胞用0.25%胰蛋白酶消化、离心、弃上清,向细胞沉淀中分别加入1mL 0.2%Triton X-100的PBS溶液重悬。重复测定三次。
(1)全细胞内DOX荧光测定
向提取到的1mL细胞PBS混悬液中加入25μL Triton X-100,在室温下静置15分钟后,加入预冷的375μL酸化的异丙醇溶液[13],将混合物涡旋,在-20℃下孵育,处理过程中避光。过夜后解冻,震荡摇匀,取100μL细胞混悬液点入96孔板,复孔数为6,用荧光酶标仪检测每孔的荧光值(激发波长488nm,发射波长580nm,读板方式:顶读),记录荧光酶标仪测定的不同浓度DOX对应的荧光值。
(2)细胞核内DOX荧光测定
细胞核内DOX的分离和测定基于Nabbi和Riabowol的方法[14]进行了修改。以8,000rpm离心1min。取上清300μL细胞裂解物作为“全细胞裂解物”弃掉,留剩余的约700μL细胞裂解液;吹打混匀,以8000rpm离心1min,取上清液300μl作为“细胞质”组分弃掉;吹打混匀,以8000rpm离心1min,弃全部上清液,留沉淀。沉淀中加入1ml含0.2%Triton X-100的PBS溶液,混悬。混匀后200μL酸化异丙醇中-20℃孵育[15],处理过程中避光。过夜后室温解冻,震荡摇匀,取100μL细胞混悬液点入96孔板,复孔数为9,用荧光酶标仪检测每孔的荧光值(激发波长488nm,发射波长580nm,读板方式:顶读),记录荧光酶标仪测定的不同浓度DOX对应的荧光值。
(3)HepG2细胞和细胞核直径的测定
取20μL细胞混悬液点入细胞计数板中,在细胞自动计数仪中获得细胞平均直径,重复上述过程3次,计算平均值为细胞平均直径,进而获得HepG2细胞体积数据。使用活细胞成像仪在20X镜头下,观察Hoechst 33342细胞核的染色及成像,将细胞核的蓝色荧光图片在图像处理软件Image J 1.51中处理,对视野内的细胞核直径进行测定,复孔数为9统计并计算平均细胞核直径。
(4)全细胞内及细胞核内药物浓度
全细胞或细胞核内药物浓度计算如下:首先,根据随行荧光强度-药物浓度标准曲线,由各组荧光强度值转换得到DOX浓度,根据测定溶液体积获得该组分内药物总质量。随后,将每个样品中细胞数平均值乘以细胞或细胞核的体积,从而获得细胞或细胞核的总体积。然后,将药物总质量除以每个样品中细胞或核的总体积,获得各部位药物浓度。
2.6普通制剂DOX和Lipo-DOX抗肿瘤活性研究
细胞培养和给药方法同药动学研究步骤。用含药培养基孵育HepG2细胞至相应时间点后,弃去各孔内含药培养基,用PBS溶液洗2遍,加入适量固定液,室温固定15min;去除固定液,用适量洗涤液洗3次,每次3~5min;去除洗涤液,加入适量通透液室温孵育10~15min,去除通透液,用洗涤液洗1-2次,每次3~5min,去除洗涤液,每孔加入适量Hoechst33342溶液,室温孵育10min,吸去Hoechst 33342溶液,用PBS溶液洗3次,每次3~5min。每孔加入100μL PBS溶液,选择377~477nm的波长范围在Cell Image Neo细胞成像仪中对各组活细胞进行荧光成像,视野下活细胞细胞核结合Hoechst 33342发出蓝色荧光,拍摄并统计各孔的活细胞数目。计算每孔平均活细胞数目与对照组每孔平均活细胞数目的比值,据此统计各组细胞存活率。
步骤3.模型参数求解和数据拟合。
本实例中建模软件为Lixoft公司的Monolix Suite 2019R2版本。
模型拟合图见图6、图7。
参数求解情况见下表3-表5。
表3普通制剂DOX在HepG2中细胞药动学模型参数求解
表4Lipo-DOX在HepG2中细胞药动学模型参数求解
表5基于HepG2体外药动学的PK-PD模型参数
步骤4.采用敏感性分析方法进行模型参数评价。
在Monolix中优化体外PK-PD模型之后,在软件中预测脂质体与肿瘤细胞相互作用参数改变引起的细胞内药物浓度变化的趋势。具体操作为:用以上细胞药动学模型可求解出Lipo-DOX在肿瘤细胞HepG2中药物浓度-时间曲线,为了考虑参数估算差异对AUC值的影响,我们设定参数为正负两倍变化,将变化后的各参数值代入细胞药动学模型并获得相应药动学曲线和AUC值变化情况。
基于Lipo-DOX体外研究的生理药代动力学模型敏感性分析结果如图8所示,相关的考察因素在全细胞及细胞核药物浓度表现出相似的影响,相应转运参数对Lipo-DOX的浓度-时间曲线的贡献排序:Kdeg>Krel>Kb_on>Kb_off>Bmax。
Claims (10)
1.一种基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)构建药物体外PK-PD模型:药物为非纳米药物D或/和纳米药物F,其中药物F内载有药物D;若为非纳米药物,则通过线路一构建体外PK-PD模型;若药物为纳米药物,则通过线路二构建体外PK-PD模型;若药物为纳米药物和非纳米药物的混合药物,则通过线路三构建体外PK-PD模型;
线路一:非纳米药物PK-PD模型的药物浓度描述基于细胞外、细胞胞浆中和细胞核状态,其中细胞核中非纳米药物分为结合和游离状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;
线路二:纳米药物PK-PD模型的药物浓度描述包括药物F的浓度描述和药物D'的浓度描述,其中纳米药物F的外壳在胞浆中被包裹吞噬可释放出内载的小分子非纳米药物D';药物F的药物浓度描述基于细胞外、细胞膜接触过程中和细胞内的状态,药物D'的药物浓度描述基于细胞胞浆中、细胞核两种状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;;
线路三:混合药物由药物D和药物F组成,药物F进入胞浆内转化为药物D',药物D'与跨膜进入胞浆的药物D构成胞浆内的药物D″;混合药物PK-PD模型的药物浓度描述包括药物F、药物D、药物D'、药物D″的浓度描述;药物F的药物浓度描述基于细胞外、细胞膜接触过程中和细胞内的状态;药物D的药物浓度描述基于细胞外的状态;药物D'的药物浓度描述基于细胞胞浆中的状态;药物D″的药物浓度描述基于细胞胞浆中、细胞核的状态;根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程;
(2)通过体外实验获得非纳米药物或/和纳米药物在细胞及细胞核中的分布、浓度数据、细胞直径以及细胞核直径;
(3)模型参数求解和数据拟合。
2.根据权利要求1所述的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,步骤(1)中,根据膜限制模型原理和质量平衡确立各状态的质量平衡方程,依据的公式如下:
药量变化速率=进入速率-输出速率-消除速率。
3.根据权利要求1所述的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,线路一中质量平衡方程包括:
细胞外药物D的浓度:
其中,Cout_D为细胞外药物D的浓度,即给药浓度;Ka为药物D从细胞外跨膜向细胞胞浆内转移的速率常数;Aout_D为细胞外药物D的质量;Vout细胞外药物体积,即含药溶液体积;Kb为药物D从细胞胞浆内跨膜向细胞外转移的速率常数;Cin_D为跨膜进入胞浆的药物D的浓度;
跨膜进入胞浆的药物D的浓度:
其中,Cin_D为跨膜进入胞浆的药物D的浓度;Kb为药物D从细胞胞浆内跨膜向细胞外转移的速率常数;Kin_nucl为药物D从细胞胞浆内向细胞核内转移的速率常数;Kout_nucl为药物D从细胞核内向细胞胞浆内转移的速率常数;Cnucl_freeD为细胞核内游离药物D的浓度;
进入细胞核内的药物D的浓度:
其中,Cnucl_D为进入细胞核内的药物D的浓度;
细胞核内游离药物D的浓度:
其中,Ctdna为DNA上药物结合位点的浓度;Kd=Koff/Kon,Kd为药物与DNA结合-解离过程的平衡常数。Kon和Koff分别表示药物与DNA结合和解离常数;
细胞核内与药物DNA结合的药物D的浓度:
Cbound=Cnucl_D-Cnucl_freeD
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D的浓度。
4.根据权利要求1所述的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,线路二中质量平衡方程包括:
细胞外药物F的质量:
其中,Aout_F为细胞外游离的药物F的质量;Kb_off为药物F与细胞膜解离速率常数;Abin为细胞膜上结合的药物F的质量;Kb_on为药物F与细胞膜的结合速率常数;Bmax为药物F在细胞膜上的最大结合量;
细胞外药物F的浓度:
Cout_F=Aout_F/Vout
其中,Cout_F为细胞外游离的药物F的浓度;Vout为细胞外药物体积(含药溶液体积);
细胞膜上结合的药物F的质量:
其中,Abin为细胞膜上结合的药物F的质量;Kb_on为药物F与细胞膜的结合速率常数;Kdeg为与膜结合的药物F经细胞膜内化的速率常数;
细胞膜内化的药物F的质量:
其中,Ain_F为经细胞膜内化的药物F的质量;Kdeg为与膜结合的药物F经细胞膜内化的速率常数;Krel为胞浆中药物F释放速率常数;
细胞膜内化的药物F的浓度:
Cin_F=Ain_F/Vcell
其中Cin_F为经细胞膜内化的药物F的浓度;Vcell为整个细胞体积。
细胞外药物D的浓度:
胞浆内药物F转化为药物D'的浓度
Cin_D′=Cin_F*Krel
其中Cin_D'为胞浆内药物D'的浓度;Krel为F转化为D'的转化速率常数。
进入细胞核内的药物D'的浓度:
其中,Cnucl_D'为进入细胞核内的药物D'的浓度;
细胞核内游离药物D'的浓度:
细胞核内与药物DNA结合的药物D'的浓度:
Cbound=Cnucl_D′-Cnucl_freeD′
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D'的浓度。
5.根据权利要求1所述的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,线路三中质量平衡方程包括:
细胞外药物F的质量:
细胞外药物F的浓度:
Cout_F=Aout_F/Vout
细胞膜上结合的药物F的质量:
细胞膜内化的药物F的浓度:
Cin_F=Ain_F/Vcell
其中Cin_F为经细胞膜内化的药物F的浓度;Vcell为整个细胞体积。
胞浆内药物F转化为药物D'的浓度
Cin_D′=Cin_F*Krel
其中Cin_D'为胞浆内药物D'的浓度;Krel为F转化为D'的转化速率常数。
胞浆内药物D″的浓度
Cin_D″=Cin_D′+Cin_D
进入细胞核内的药物D″的浓度
其中,Cnucl_D″为进入细胞核内的药物D″的浓度;Cnucl_free″为细胞核内游离药物D″的浓度;
细胞核内游离药物D″的浓度
细胞核内与药物DNA结合的药物D″的浓度;
Cbound=Cnucl_D″-Cnucl_freeD″
其中,Cbound为细胞核内与DNA结合的药物D″的浓度。
7.根据权利要求1所述的的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,药物D为普通制剂多柔比星,药物F为脂质体制剂多柔比星;细胞为肿瘤细胞。
8.根据权利要求6所述的的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,步骤(2)中,体外实验方法包括以下步骤:(1)用荧光酶标仪检测样品荧光值;(2)给药方式为:配制低、中、高剂量的无血清高糖DMEM无酚红含药培养基对细胞培养至相应的一段时间;(3)使用活细胞成像仪进行平均细胞核直径的测定。
9.根据权利要求1所述的的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,步骤(3)中,利用建模软件描述体外PK-PD模型的质量平衡方程,建模软件为Monolix或Berkelery Madonn。
10.根据权利要求1所述的的基于体外PK-PD模型的药物胞内递送预测方法,其特征在于,还包括步骤(4)采用敏感性分析方法进行模型参数评价:设定脂质体多柔比星相关参数分别正、负两倍变化,将变化后的各参数值代入细胞药动学模型并获得相应药动学曲线和曲线下面积,考察相应的参数对脂质体多柔比星的药物浓度-时间曲线的贡献程度,以识别关键转运参数。
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