CN105734075B - 干扰abcb5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干扰ABCB5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用。本发明的一种干扰ABCB5基因表达的载体，包括发夹结构，所述干扰ABCB5基因表达的载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明所述的干扰ABCB5基因表达的载体在制备针对黑色素瘤干细胞治疗药物中的应用。本发明提供了一种全新的、高效的、安全的、低廉的、方便的干扰小鼠黑色素瘤干细胞基因ABCB5表达的载体及其应用。

Description

干扰ABCB5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及干扰ABCB5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用。
背景技术
黑色素瘤是皮肤癌中最危险的一种，其恶性程度高，侵袭性强，是皮肤癌死亡的主要原因之一。近年来随着我国经济的发展，人民生活习惯的变化，恶性黑色瘤已成为我国所有恶性肿瘤中发病率增长最快者之一。由于恶性黑色素瘤早期症状较轻，不易引起患者重视，容易错过早期诊断和治疗。恶性黑色素瘤一旦发生转移，病情进展迅速，放化疗效果差，死亡率高。目前主要治疗黑色素瘤的化疗药物包括亚硝基脲类、紫杉醇、长春生物碱等，但是这些药物都没有显著提高黑色素瘤病人的生存率，究其原因，发现肿瘤细胞对化疗药物产生耐受是限制其疗效的主要原因，因此迫切需要解决黑色素瘤对化疗药物耐受的问题。
越来越多研究表明肿瘤内存在一类肿瘤干细胞，这类细胞与肿瘤化学治疗的耐药现象相关。肿瘤干细胞一般处于静止状态，过表达抗凋亡蛋白和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白等而获得耐药性。因此针对不同肿瘤干细胞的耐药机制，制定出相应的耐药治疗策略，可以增加化疗效果，提高患者生存时间。
RNA 干扰是将双链RNA(double strained RNA，dsRNA) 导入细胞内引起特异靶基因mRNA 降解的一种细胞反应过程，它是一种转录后的基因沉默(PTGS) 现象。关于RNAi 机制的探讨还不够完善，目前研究比较明确的结论是：Dicer 是特异性核糖核酸酶家族的一个成员，与内源性mRNA 互补的外源性dsRNA 与Dicer 结合，被切割成2l ～ 23nt 长的小片段，即小分子干扰核糖核酸(siRNA)。一部分siRNA 与Dicer 形成RNA 诱导的沉默复合体(RNA-inducing silencing complex，RISC)，RISC 再与目标基因转录出的mRNA 结合并降解该mRNA ；部分siRNA 可作为引物，以mRNA 为模板合成新的dsRNA，这些新合成的dsRNA又可以与Dicer 结合并被切割成siRNA，从而产生级连、放大和传递效应，沉默该基因。
目前临床研究试图通过ABC转运体蛋白抑制剂联合化疗药物克服肿瘤干细胞耐药性，然而临床效果甚微，推测其原因可能有抑制剂与其他化疗药物联用影响了其药物动力学，以及ABC抑制剂可能不能有效杀死肿瘤干细胞等；除此以外，ABC转运蛋白在血脑屏障，胎盘中高表达以避免血液中有毒物质影响，因此需要设计一个针对肿瘤干细胞的干扰系统，特异性杀伤肿瘤干细胞，改善其对化疗药物的耐受而避免对正常干细胞的毒害。
目前，缺乏一种高效的干扰ABCB5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种高效安全的干扰ABCB5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用。
进一步地，本发明提供了一种克服黑色素瘤对化疗药物耐受的方法。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的一种干扰ABCB5基因表达的载体，包括发夹结构，其特征在于：所述干扰ABCB5基因表达的载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。
进一步地，所述干扰ABCB5基因表达的载体的上游引物序列是SEQ ID NO: 4 所示的核苷酸序列，所述干扰ABCB5基因表达的载体的下游引物序列是SEQ ID NO: 5 所示的核苷酸序列；所述干扰ABCB5基因表达的载体的发夹结构的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3 所示的核苷酸序列。
进一步地，所述上游引物的5’端添加了GATCC，与 BamH
Figure 981040DEST_PATH_IMAGE001
酶切后形成的粘端互补；下游引物的5’端添加了AGCTT，与 Hind
Figure 259574DEST_PATH_IMAGE002
酶切后形成的粘端互补。
本发明的一种在乏氧环境中特异性表达ABCB5干扰质粒的方法，将ABCB5干扰质粒转染在乏氧特异性的减毒沙门氏菌中，从而实现ABCB5干扰质粒在乏氧环境中的高水平表达。
本发明的一种含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物的联合应用，将菌浓度为103-106的含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联合应用，所述的化学药物为环磷酰胺、阿霉素、紫杉醇，环磷酰胺药物浓度范围30-50 mg/kg，阿霉素药物浓度为100-1000 nmol/L，紫杉醇药物浓度为1000-50000 nmol/L。
本发明所述的干扰ABCB5基因表达的载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）含目的基因上、下游引物退火形成双链；
（2）退火完成的含目的片段的双链和载体用BamH
Figure 955129DEST_PATH_IMAGE001
和Hind
Figure 838772DEST_PATH_IMAGE002
酶切；
（3）酶切后的含目的片段的双链与载体连接；
（4）将连接后的含目的片段的载体转化到大肠杆菌中，进行单克隆筛选和扩增；
（5）对获得的单克隆进行DNA序列测定分析。
本发明的所述的干扰ABCB5基因表达的载体在制备针对黑色素瘤干细胞治疗药物中的应用。
本发明的所述的在乏氧环境中特异性表达ABCB5干扰质粒的方法的应用，利用含有ABCB5 RNA干扰的表达质粒的沙门氏菌VNP20009及其衍生菌株的乏氧特异性，实现ABCB5RNA干扰在黑色素瘤组织中特异性的表达从而下调肿瘤ABCB5的表达。
进一步地，下调ABCB5表达的RNA干扰序列的质粒的乏氧特异性的沙门氏菌VNP20009，以减毒沙门氏菌为输送载体，特异性靶向肿瘤干细胞，并在肿瘤乏氧环境内繁殖，并释放干扰质粒，抑制相关蛋白的表达，所述的减毒细菌株为减毒沙门氏菌VNP20009，将含有ABCB5 RNA干扰的表达质粒的沙门氏菌VNP20009及其衍生菌株与化疗药物联合使用。
本发明所述的干扰ABCB5基因表达的载体在制备克服肿瘤对化疗药物抗性中的应用。
有益效果：本发明提供了一种全新的、高效的、安全的、低廉的、方便的干扰ABCB5表达的载体及其应用。减毒沙门氏菌携带该干扰载体能够特异性靶向肿瘤干细胞，抑制肿瘤干细胞内ABCB5的表达，降低肿瘤干细胞对化疗药物的耐受。
与现有的ABC转运体蛋白抑制剂和抗ABC转运蛋白抗体相比，本发明的特点在于：
（1）选择ABCB5作为干扰靶点，设计和筛选针对ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列，下调ABCB5基因的表达。设计和筛选针对ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列，下调ABCB5基因的表达。本专利发明了高效的减毒沙门氏菌携带的干扰肿瘤干细胞耐药性基因ABCB5的系统，构建一个高效的沙门氏菌干扰载体，以实现对肿瘤干细胞ABC转运体蛋白ABCB5的特异性干扰表达。
（2）构建含有下调ABCB5表达的RNA干扰序列的质粒的乏氧特异性的沙门氏菌VNP20009，特异性抑制肿瘤干细胞ABC转运体蛋白ABCB5的表达，为改善肿瘤干细胞对化疗药物的耐受奠定基础。
（3）由于高效的干扰小鼠黑色素瘤干细胞基因ABCB5表达的载体，再加上利用方便培养的沙门氏菌作为递呈工具，成本低廉，具有大规模推广的应用前景。
（4）利用沙门氏菌携带针对小鼠黑色素瘤干细胞基因ABCB5的干扰质粒，可以改善黑色素瘤对化学药物的耐受，并利用小鼠模型证实该系统，可以抑制小鼠肿瘤体积生长，延长小鼠存活时间。该减毒沙门氏菌携带的干扰小鼠黑色素瘤干细胞相关基因ABCB5的载体与化学药物联用可能够显著提高化疗药物的抗肿瘤疗效、克服肿瘤对化疗药物的抵抗。
附图说明
图1为本发明ABCB5干扰序列的设计和筛选图；
（1A）shRNA载体构建; 其中：1、干扰载体1特异性RNA干扰序列，2、干扰载体2特异性RNA干扰序列，3、干扰载体3特异性RNA干扰序列
（1B）ABCB5-shRNA载体干扰效果验证；其中：0、不含干扰ABCB5基因表达的对照RNA干扰序列；1、干扰ABCB5基因表达的特异性RNA干扰载体1；2、干扰ABCB5基因表达的特异性RNA干扰载体2；3、干扰ABCB5基因表达的特异性RNA干扰载体3；ABCB5 RNA干扰载体3能有效干扰B16F10中ABCB5的表达；
图2为本发明ABCB5能够调节小鼠黑色素瘤细胞生长和其对药物的耐受图；
（2A）小鼠黑色素瘤细胞B16F10转染ABCB5干扰质粒后体内肿瘤体积生长示意图；其中：1、B16F10转染空载质粒；2、B16F10转染干扰质粒；在B16F10细胞中抑制ABCB5的表达能够有效抑制小鼠肿瘤的生长；
（2B）小鼠黑色素瘤细胞B16F10转染ABCB5干扰质粒后与化学药物紫杉醇联用检测细胞存活示意图；其中：1、B16F10转染空载质粒；2、B16F10转染干扰质粒；（2C）小鼠黑色素瘤细胞B16F10转染ABCB5干扰质粒后与化学药物阿霉素联用检测细胞存活示意图；其中：1、B16F10转染空载质粒；2、B16F10转染干扰质粒；在B16F10细胞中抑制ABCB5能够提供其对化学药物的敏感性；
（2D）ABCB+，ABCB5-细胞体内成瘤率示意图；分别将100，1000，10000个ABCB5阳性或阴性细胞注射到小鼠腋下，观察小鼠肿瘤的发生发展，用ELDA软件计算肿瘤形成概率；
（2E）小鼠黑色素瘤干细胞ABCB5表达的示意图；CD44+CD133+CD24+细胞已被鉴定是小鼠黑色素瘤干细胞，其中：1、CD44-CD133-CD24-；2、CD44+CD133+CD24+。
图3为本发明构建含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌及重组沙门氏菌与化学药物联用的抗肿瘤效果图；
（3A）小鼠注射含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌后，小鼠黑色素瘤内ABCB5 mRNA水平示意图；其中：1、携带空载质粒的沙门氏菌治疗组；2、携带干扰质粒的沙门氏菌治疗组；构建的含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌能有效抑制小鼠黑色素瘤内ABCB5的表达图；
（3B）含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，小鼠肿瘤体积生长示意图；其中：1、PBS； 2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，能有效抑制小鼠肿瘤的生长；
（3C）含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，小鼠存活时间示意图；其中：1、PBS； 2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用。含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，能有效延长小鼠的存活时间；
图4为本发明含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，Ki67 表达水平和TUNNEL检测分析图；
（4A）含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，Ki67 表达水平示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；
（4B）含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，Ki67 表达水平定量示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；
（4C）含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，TUNNEL检测分析示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；
（4D）含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，TUNNEL检测分析定量示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种干扰ABCB5基因表达的载体，包括发夹结构，所述干扰ABCB5基因表达的载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。
所述干扰小鼠肿瘤干细胞ABCB5基因表达的载体的上游引物的核苷酸序列是SEQID NO: 4所示的核苷酸序列，所述干扰小鼠肿瘤干细胞ABCB5基因表达的载体的下游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；所述干扰小鼠肿瘤干细胞ABCB5基因表达的载体的发夹结构的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
所述正义链模板的5’端添加了 GATCC ，与 BamH
Figure 204156DEST_PATH_IMAGE001
酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了 AGCTT，与 Hind
Figure 704408DEST_PATH_IMAGE002
酶切后形成的粘端互补。
本发明的一种干扰小鼠肿瘤干细胞ABCB5基因表达的载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）含目的基因上、下游引物退火形成双链；
（2）退火完成的含目的片段的双链和载体用BamH
Figure 328287DEST_PATH_IMAGE001
和Hind
Figure 128753DEST_PATH_IMAGE002
酶切；
（3）酶切后的含目的片段的双链与载体连接；
（4）将连接后的含目的片段的载体转化到大肠杆菌中，进行单克隆筛选和扩增；
（5）对获得的单克隆进行DNA序列测定分析。
本发明的所述的干扰ABCB5基因表达的载体在制备针对黑色素瘤干细胞治疗药物中的应用。利用含有ABCB5 RNA干扰的表达质粒的沙门氏菌VNP20009及其衍生菌株的乏氧特异性，实现ABCB5 RNA干扰在黑色素瘤组织中特异性的表达从而下调肿瘤ABCB5的表达。
下调ABCB5表达的RNA干扰序列的质粒的乏氧特异性的沙门氏VNP20009，以减毒沙门氏菌为输送载体，特异性靶向肿瘤干细胞，并在肿瘤乏氧环境内繁殖，并释放干扰质粒，抑制相关蛋白的表达，所述的减毒细菌株为减毒沙门氏菌VNP20009，将含有ABCB5 RNA干扰的表达质粒的沙门氏菌VNP20009及其衍生菌株与化疗药物联合使用。能够显著提高化疗药物的抗肿瘤疗效、克服肿瘤对化疗药物的抵抗。
实施例2
ABCB5干扰载体的构建
如图1所示，为本发明ABCB5干扰序列的设计和筛选图；本发明首先设计了3个含有针对ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列，然后分别将含有针对ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列构建到pRNA-U6.1质粒中。如图1A所示，为 shRNA载体构建，灰色标注为干扰ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列；为了鉴定出有效干扰ABCB5基因表达的RNA干扰序列，将构建好的含有针对ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列的质粒转染到B16F10细胞中，然后利用WESTERN的方法验证ABCB5的表达情况。结果显示只有干扰载体3能有效抑制ABCB5基因的表达。如图1B所示，ABCB5-shRNA载体干扰效果验证，其中：0、不含干扰ABCB5基因表达的对照RNA干扰载体，1、干扰ABCB5基因表达的干扰载体1；2、干扰ABCB5基因表达的干扰载体2；3、干扰ABCB5基因表达的干扰载体3（SEQ ID NO 1）；ABCB5 RNA干扰载体3能有效干扰B16F10中ABCB5的表达。
利用siRNA Construct Builder（Genscript Corporation）软件，构建可以连接到载体pRNA-U6.1/Neo、转录后可经加工产生siRNA、进而干扰目的基因表达的寡核苷酸片段。
合成的DNA片段包括：正义链（sense strand，与目标序列相同）、发夹结构、反义链（antisense strand，与正义链互补）、3′端的使转录终止的poly T；为了与载体pRNA-U6.1/Neo相连 ，在两端分别添加BamHⅠ(G↓GATCC)、HindⅢ(A↓AGCTT)的酶切位点。
按照上述寡聚DNA片段的特点，选择siABCB5干扰片段，合成下述寡核苷酸片段，设计片段时根据酶切位点的特点设计为黏性末端，序列如下：
1、干扰载体1上游引物（SEQ ID NO. 6）
5’-GATCCCGATTGAGACCTTTCAGAACCTTGATATCCGGGTTCTGAAAGGTCTCAATTTTTTTCCAAA-3’；
干扰载体1下游引物（SEQ ID NO .7）5’-AGCTTTTGGAAAAAAATTGAGACCTTTCAGAACCCGGATATCAAGGTTCTGAAAGGTCTCAATCGG -3’；
2、干扰载体2上游引物（SEQ ID NO. 8）
5’- GATCCCG TCTCAATAGGTCCAACAGC TTGATATCCG GCTGTTGGACCTATTGAGATTTTTTCCAAA-3’；
干扰载体2下游引物（SEQ ID NO .9）
5’-AGCTTTTGGAAAAAATCTCAATAGGTCCAACAGCCGGATATCAAGCTGTTGGACCTATTGAGACGG-3’.
3、干扰载体3上游引物（SEQ ID NO.4）
5’-GATCCCGTTCCATTTGTTCATCGACCTTGATATCCGGGTCGATGAACAAATGGAATTTTTTCCAAA-3’；
干扰载体3下游引物（SEQ ID NO.5）
5’-AGCTTTTGGAAAAAATTCCATTTGTTCATCGACCCGGATATCAAGGTCGATGAACAAATGGAACGG-3’.
所述干扰小鼠肿瘤干细胞ABCB5基因表达的载体，其特征在于:所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1，上游扩增引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:4 所示的核苷酸序列，所述下游扩增引物的核苷酸序列是SEQ ID NO: 5 所示的核苷酸序列；
所述发夹结构的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3 所示的核苷酸序列。
将合成的寡聚核苷酸按照下述条件进行退火：
组成 体积 (ml)
Sence 1
Antisence 1
20 ×SSC 1
ddH<sub>2</sub>O 17
合计 20
混合后置于95℃10 min，然后25℃1 h，最后稀释混合物至终浓度为 40 ng/μl（1.25倍稀释），-20℃存放备用。并将pRNA-U6.1采用BamH I和Hind III进行双酶切，反应体系如下：
组成 体积 (ml)
pRNA-U6.1 5（1μg）
BamHⅠ 1
HindⅢ 1
10× K buffer 2
ddH<sub>2</sub>O 11
合计 20
将以上反应混合物置于37 ℃水浴中反应6 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收目的片段，然后建立以下酶连体系：
组成 体积 (ml)
pRNA-U6.1 12
退火片段 5
T4连接酶 1
T4 ligase buffer 2
合计 20
将以上酶连体系置于16 ℃水浴中反应12 h后，采用热激法将酶连产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化后37℃复苏1 h后涂于含50 μg/ml的氨苄LB平板上，37 ℃倒置培养16 h后，挑取单克隆进行DNA测序分析。测序正确的克隆提取质粒，以备后续使用。
试验1
重组减毒沙门氏菌的电穿孔转化：
沙门氏菌电转感受态的制备：接种新鲜减毒沙门氏菌到200 ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD值在0.4-0.6之间，离心6000g×5 min收集菌体，用无菌双蒸水洗涤菌体一遍，离心6000 g×5 min，用10%甘油的洗涤菌体二遍，离心6000 g×5 min，用500微升10%甘油重悬，分装50微升/管，用于电转。
采用电穿孔方法将含shABCB5干扰片段的载体转化到减毒沙门氏菌VNP20009内：在无菌条件下，将0.5-5 μg 构建好的重组载体加入在电转感受态中，混匀后，转移到0.2 μM的电转杯中，用于电击，电转条件为1.8 KV，600 Ω，2 μF，电转后涂氨苄平板筛选，长出的菌落即为重组菌。
实验2
含ABCB5干扰质粒的B16F10细胞与化学药物联用后，细胞死亡率增加
转染前一天将B16F10细胞铺到6孔板中，待细胞密度达到60%时进行转染。转染之前60分钟更换细胞培养液，1 μg pRNA U6.1-shABCB5质粒用50 μl高糖无血清培养基稀释，2 μl PolyJet用50 μl高糖无血清培养基稀释，然后将将PolyJet稀释液加到质粒稀释液中，混合后轻轻混匀。室温孵育15分钟，已形成PolyJet/DNA复合物，孵育完毕后，将试剂加到六孔板中，轻轻地摇动，混匀。培养24 h后细胞荧光显微镜下观察细胞EGFP的表达量，确定细胞转染的效率，若细胞转染效率>70%，则进行后续试验。
将103-104转染后的B16F10细胞铺到96孔板中，静置培养12小时后，用不同浓度紫杉醇或阿霉素处理细胞24小时。药物处理结束后，每孔加入100 μl 5 mg/ml的MTT静置培养4小时。然后去除上清，每孔加入100 μl DMSO，96孔板摇晃10分钟后，将96孔板置于酶标仪570 nm下读取吸光值。
试验3
B16F10小鼠黑色素瘤模型构建
B16F1O小鼠黑色素瘤细胞采用DMEM培养基培养至指数生长期，用0.5%胰酶消化，1000 rpm/min离心3 min，PBS洗涤2次后，细胞计数，用PBS重悬细胞，将终浓度调整为1×106个/ml。每只小鼠接种100 μl于C57/B6小鼠腋下脂肪垫处， 即1×105个/只。接种小鼠饲养于清洁级动物房，待肿瘤生长至体积约150 mm3时进行后续实验。
试验4
含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，小鼠肿瘤体积的测量
取荷B16F10小鼠黑色素瘤的C57/B6小鼠，随机分为PBS、环磷酰胺、VNP20009-空载、VNP-shABCB5、环磷酰胺联合VNP20009-空载和环磷酰胺联合VNP20009-shABCB5组。PBS组给予腹腔注射PBS 100 μl；VNP20009-空载组联合环磷酰胺组给予腹腔注射VNP20009-空载1×104 cfu/ml；VNP-shABCB5联合环磷酰胺组给予腹腔注射VNP-shABCB5 1×104 cfu/ml；环磷酰胺联合VNP20009-空载在腹腔注射VNP20009-空载同时每隔一天注射30-50 mg/kg 环磷酰胺（30、35、40、45、50 mg/kg）；环磷酰胺联合VNP20009-shABCB5组在腹腔注射VNP20009-shABCB5同时每隔一天注射45 mg/kg 环磷酰胺。自腹腔给药起，每隔两天测定每组小鼠肿瘤体积一次，并记录小鼠在治疗过程中的存活情况。在30-50 mg/kg 环磷酰胺的使用剂量范围内，不同剂量组与VNP-shABCB5联用都用增强的效果，但是以45 mg/kg 环磷酰胺效果最佳，因此，以下呈现45 mg/kg 环磷酰胺剂量组的结果。同理，本课题组以前的实验结果表明:103-106 cfu/ml的VNP20009与化疗药物联合使用都用效果，我们也尝试将1X103、1X 104、1X 105、1X106 cfu/ml的VNP20009及其衍生改造的菌株VNP20009DAsn等进行了联合应用，都取得了一定的联用效果。综合考虑联用后的疗效和毒性，1×104 cfu/ml效果较佳，因此，以下呈现经优化过的45 mg/kg 环磷酰胺与1×104 cfu/ml VNP20009菌株的联合应用结果。
为了鉴定ABCB5在黑色素瘤生长和抗化学药物治疗中发挥的作用，图2为本发明ABCB5能够调节小鼠黑色素瘤细胞生长和其对药物的耐受图；
如图2A所示，为小鼠黑色素瘤细胞B16F10转染ABCB5干扰质粒后体内肿瘤体积生长示意图；其中：1、B16F10转染空载质粒；2、B16F10转染干扰质粒；在B16F10细胞中抑制ABCB5的表达能够有效抑制小鼠肿瘤的生长；分析了ABCB5被抑制后，肿瘤体积的生长，与对照组相比（图2A，1），干扰组的肿瘤生长速率（图2A，2）要明显低于对照组。
如图2B所示，为小鼠黑色素瘤细胞B16F10转染ABCB5干扰质粒后与化学药物联用检测细胞存活示意图；其中：1、B16F10转染空载质粒；2、B16F10转染干扰质粒；在B16F10细胞中抑制ABCB5能够提供其对化学药物的敏感性；并且在1000，5000，10000，25000，50000nMol/l 紫杉醇处理下和100，250，500，1000 nMol/L阿霉素处理下，干扰组的细胞死亡率（图2C，2）要明显高于对照组(图 2C，1)。
同时发现ABCB5阳性细胞的成瘤率要明显高于ABCB5阴性细胞的成瘤率（图2D），并且在已报道的具有肿瘤干细胞特性B16F10细胞群中高表达（图2E）这些结果表明ABCB5不仅是小鼠黑色素瘤干细胞标志物，还参与调节肿瘤细胞在体内的生长和对化学药物的敏感性。如图2D所示，ABCB+， ABCB5-细胞体内成瘤率示意图；分别将100，1000，10000个ABCB5阳性或阴性细胞注射到小鼠腋下，观察小鼠肿瘤的发生发展，用ELDA软件计算肿瘤形成概率；如图2E所示，小鼠黑色素瘤干细胞ABCB5表达的示意图；CD44+CD133+CD24+细胞已被鉴定是小鼠黑色素瘤干细胞，其中：1、CD44-CD133-CD24-，2、CD44+CD133+CD24+。而作为肿瘤干细胞最为通用的分子标志CD133却并不能作为黑色素瘤干细胞标志物，从而显示黑色素瘤干细胞标志物有其自身的特性。
如图3所示，为本发明构建含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌及重组沙门氏菌与化学药物联用的抗肿瘤效果图；本发明进一步评估了含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后的抗肿瘤效果，在验证构建过含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌能有效抑制B16F10荷瘤小鼠肿瘤内ABCB5的表达(图3A，2)，如图3A所示，小鼠注射含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌后，小鼠黑色素瘤内ABCB5 mRNA水平示意图；其中：1、携带空载质粒的沙门氏菌治疗组；2、携带干扰质粒的沙门氏菌治疗组；构建的含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌能有效抑制小鼠黑色素瘤内ABCB5的表达图；
评价了B16F10荷瘤小鼠在注射含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物环磷酰胺联用后的肿瘤体积和生存率，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后肿瘤体积（图3B,4）要明显对于含空载质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后的肿瘤体积（图3B,3），如图3B所示，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，小鼠肿瘤体积生长示意图；其中：1、PBS； 2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，能有效抑制小鼠肿瘤的生长；
含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后的生存率为89%（图3C,4）,而含空载质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用的生存率为33%（图3C,3）。这些结果表明含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌能有效抑制小鼠黑色素瘤干细胞中ABCB5的表达，改善肿瘤干细胞对化学药物的耐受。如图3C所示，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，小鼠存活时间示意图；其中：1、PBS； 2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用。含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，能有效延长小鼠的存活时间；
本发明评估了含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后Ki-67的表达水平，图4为本发明含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，Ki67 表达水平和TUNNEL检测分析图；含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后Ki-67表达量为2%（图4A，2、图4B,2），而含空载质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后Ki-67表达量为11%（图4A，1、图4B,1），同时含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后细胞死亡比例为35%（图4C，2、图4D,2）, 而含空载质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后细胞死亡比例为18%（图4C，1、图4D,1）。这说明含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌在抑制黑色素瘤干细胞的ABCB5表达后，可以改善肿瘤细胞对化学药物环磷酰胺的耐受性，增加细胞死亡。如4A所示，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，Ki67 表达水平示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；如4B所示，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，Ki67 表达水平定量示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 如图4C所示，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，TUNNEL检测分析示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用； 如图4D所示，含ABCB5干扰质粒的减毒沙门氏菌与化学药物联用后，TUNNEL检测分析定量示意图；其中：1、PBS；2、环磷酰胺；3、携带空载质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用；4、携带干扰质粒的沙门氏菌与环磷酰胺联用。
综上所述，本发明以减毒沙门氏菌为载体，携带针对ABCB5基因表达的特异性RNA干扰序列，通过shRNA抑制小鼠黑色素瘤内ABCB5的表达，改善黑色素瘤对化疗药物的耐受。本系统与化疗药物联用能改善小鼠黑色素瘤细胞对化学药物的耐受，并获得良好治疗效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京大学
<120> 干扰ABCB5基因表达的载体及其在肿瘤干细胞治疗中的应用
<130> 2019
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体3的干扰序列）
<400> 1
ttccatttgt tcatcgacct tgatatccgg gtcgatgaac aaatggaa 48
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体3的目标序列）
<400> 2
ggtcgatgaa caaatggaa 19
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体的干扰序列中的发夹结构）
<400> 3
ttgatatccg 10
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰abcb5基因表达载体3上游引物核苷酸序列）
<400> 4
gatcccgttc catttgttca tcgaccttga tatccgggtc gatgaacaaa tggaattttt 60
tccaaa 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体3下游引物核苷酸序列）
<400> 5
ccgttccatt tgttcatcga ccttgatatc cgggtcgatg aacaaatgga attttttcca 60
aaagct 66
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体1的上游引物核苷酸序列）
<400> 6
gatcccgatt gagacctttc agaaccttga tatccgggtt ctgaaaggtc tcaatttttt 60
tccaaa 66
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体1的下游引物核苷酸序列）
<400> 7
ccgattgaga cctttcagaa ccttgatatc cgggttctga aaggtctcaa tttttttcca 60
aaagct 66
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体2的上游引物核苷酸序列）
<400> 8
gatcccgtct caataggtcc aacagcttga tatccggctg ttggacctat tgagattttt 60
tccaaa 66
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（干扰ABCB5基因表达载体2的下游引物核苷酸序列）
<400> 9
ccgtctcaat aggtccaaca gcttgatatc cggctgttgg acctattgag attttttcca 60
aaagct 66

Claims (6)

1.一种干扰ABCB5基因表达的载体，其特征在于：载体含有干扰ABCB5基因表达的核苷酸序列，所述干扰ABCB5基因表达的核苷酸序列为包含RNA的正义链、发夹结构和反义链的如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的干扰ABCB5基因表达的载体，其特征在于：扩增所述干扰ABCB5基因表达的核苷酸序列的上游引物序列是如SEQ ID NO: 4 所示的核苷酸序列，下游引物序列是如SEQ ID NO: 5 所示的核苷酸序列；所述干扰ABCB5基因表达的核苷酸序列中发夹结构的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 3 所示的核苷酸序列。
3.权利要求2所述的干扰ABCB5基因表达的载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）上、下游引物退火，形成含有如SEQ ID NO: 2 所示核苷酸序列的双链；
（2）退火完成的双链和载体用BamHI和HindIII酶切；
（3）酶切后的双链与载体连接；
（4）将连接后的载体转化到大肠杆菌中，进行单克隆筛选和扩增；
（5）对获得的单克隆进行DNA序列测定分析。
4.权利要求1 所述的干扰ABCB5基因表达的载体在制备针对黑色素瘤干细胞药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于干扰ABCB5基因表达的载体以乏氧特异性的减毒沙门氏菌VNP20009为载体。
6.权利要求1所述的干扰ABCB5基因表达的载体在制备降低肿瘤对化疗耐受的药物中的应用。
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