CN102604950A - 抑制DAAO基因表达的siRNA及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物技术领域内的抑制D型氨基酸氧化酶基因表达的siRNA及其医药用途；所述siRNA选自SEQIDNO:1～SEQIDNO:10所示的序列；本发明还涉及所述siRNA在制备抑制DAAO基因表达药物中的用途。同时，本发明还涉及包含所述siRNA的聚阳离子复合物、脂质体以及产生所述siRNA的重组质粒pDC316-EGFP-U6/shRNA。本发明中的siRNA能高效抑制DAAO的表达，鞘内注射对大鼠福尔马林二相疼痛有60%以上的镇痛作用；本发明所公开的siRNA及其表达质粒具有特异性强、效率高、稳定性好和毒性低的特点，不仅可以有效的抑制基因DAAO的表达，同时能够应用于制备人用抑制DAAO基因表达药物、镇痛药物、精神分裂症药物等诸多用途。

Description

抑制DAAO基因表达的siRNA及其医药用途

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域内的小分子干扰核糖核酸（siRNA）及其医药用途，

具体为一种涉及抑制D型氨基酸氧化酶基因（DAAO基因）表达的siRNA及其医药用途。

背景技术

疼痛是一种不愉快却无法避免的反应，它能使人避免重度伤害，但是长期疼痛会成为人们严重的生活负担，病理性的疼痛是相当多的病人痛苦的原因。慢性疼痛是人类最常见，也是最缺乏治疗手段的疾病之一。据统计，每年有3.2亿人群受到慢性疼痛的困扰，至少有40%～50%的慢性疼痛病人缺乏有效的治疗。文献《P. Ganju, J. Hall, Potential applications of siRNA for pain therapy, Exp. Opin. Biol. Ther. 4 (2004) 531–542》披露了如下内容：尽管对疼痛治疗需求很大，近年来对于致痛的分子与细胞机制的研究有了很大进步，但是仍缺乏有效控制慢性疼痛且副作用小的药物。研究发现并证明脊髓D-型氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）是一个治疗神经源性疼痛的新靶点分子（见文献《hao W-J, Gao Z-Y, Wei-H, Nie H-Z, Zhao Q, Zhou X-J et.al. Spinal D-Amino acid oxidase contributes to neuropathic pain in rats. J.Pharmacol. Exp.Ther.(2010)332:248-254》）。

DAAO能够催化中性和极性D型氨基酸的氧化去氨基作用，生成相应的α-酮酸、NH3、H₂O，哺乳动物体内肝脏、肾脏和中枢神经系统都有表达。D-Ser在疼痛中的作用和机制是目前的研究热点之一。已有研究表明：-Ser可能通过兴奋NMDA受体参与疼痛的产生和痛觉机制。文献《Zhang YH, Shu YS, Zhao ZQ. Substance P potentiates thermal hyperalgesia induced by intrathecal administration of D-serine in rats. Acta Pharmacol Sin, 2001, 22(9): 817-820》披露了如下内容：DAAO是D-Ser的主要清除剂，DAAO作为一个抑痛因素，通过影响D-Ser的代谢清除而调节NMDA受体的功能，从而参与了疼痛的传递和调节。Fang等则发现一类明显抑制DAAO功能的吡唑类化合物《Fang QK, Hopkins S, Jones S, Heffernan M, Chytil M, Wipf P. Use of heterobicyclic compounds as D-amino acid oxidase enzyme inhibitor for enhancing learning, memory and/or cognition of mammal. 2005, Patent Number(s): US2005143434-A1；WO2005066143-A2；CZ200600426-A3；EP1711478-A2；AU2004312511-A1; US7166725-B2; MX2006007536-A1; BR200417910-A; KR2006128978-A; CN1922157-A; JP2007534657-W; ZA200605384-A.》能显著抑制L5/L6脊神经结扎所致慢性神经源性疼痛大鼠的机械性痛敏，推测吡唑类化合物可能通过抑制DAAO代谢清除D-ser，减少D-ser毒性氧化产物H₂O₂，发挥镇痛作用；Fang等的实验结果提示DAAO可能作为一个致痛因子促进慢性疼痛中枢敏感化的发生《Fang QK，Hopkins S，Jones S (Inventors). Pyrazole and pyrazole DAAO inhibitors. International Publication Number: WO 2005/066135 A2. International Publication Date: 21 July 2005》。

虽然有证据表明DAAO与慢性疼痛的产生与调节有关，但是对DAAO在慢性疼痛中的作用及其作用机制尚不确定，但是，不管是其底物D-Ser、NMDA受体系统还是其产物H₂O₂、活性氧系统在慢性疼痛的发生和痛觉调制中都具有重要作用，均说明DAAO在慢性疼痛的发生、发展和持续状态中可能发挥重要作用，是一个潜在的治疗慢性疼痛的作用靶点。

DAAO可能通过催化D-Ser等D-型氨基酸代谢产生H₂O₂参与了慢性疼痛的发生和痛觉调制。在神经源性疼痛等慢性疼痛模型大鼠体内DAAO的基因表达和酶活性可能增强，从而参与神经源性疼痛等慢性疼痛的发生和持续过程。目前，尚未见大鼠DAAO基因开发以及相关药物的报道。

发明内容

    本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种抑制DAAO基因表达的siRNA

及其医药用途。本发明中的siRNA能高效抑制对DAAO的表达，本发明所公开的siRNA及其表达质粒具有特异性强、效率高、稳定性好和毒性低的特点，不仅可以有效的抑制基因DAAO的表达，同时能够应用于抑制DAAO基因表达药物，镇痛药物，制备精神分裂症药物等诸多医药用途。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种抑制DAAO基因表达的siRNA，所述siRNA选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10所示的序列。

优选地，所述siRNA序列的3’端加有UU或者TT。

优选地，所述siRNA序列经过硫代修饰、碱基修饰、核糖修饰、末端3’端或5’端偶联胆固醇修饰、或者细胞穿透肽修饰。

第二方面，本发明还涉及前述抑制DAAO基因表达的siRNA在制备抑制DAAO基因表达药物中的用途。

优选地，所述用途为在制备抑制疼痛药物中的用途。

优选地，所述用途为在制备精神分裂症药物中的用途。

第三方面，本发明还涉及包含前述抑制DAAO基因表达的siRNA的聚阳离子复合物。

第四方面，本发明还涉及包含所述抑制DAAO基因表达的siRNA的脂质体。

第五方面，本发明还提供了产生所述抑制DAAO基因表达的siRNA的重组质粒，该所述重组质粒为pDC316-EGFP-U6/shRNA。

优选地，重组质粒中，所述载体与shRNA双链通过BamH I和 Hind III两个酶切位点连接。

优选地，所述shRNA双链的结构如下：5’BamHI酶切位点+反义链+loop+正义链+终止子+HindIII酶切位点 3’；其中loop序列为TTCAAGAGA，终止子为AAAAA/TTTTT。

第六方面，本发明还涉及一种包含所述重组质粒的聚阳离子复合物。

第七方面、本发明还涉及一种包含所述重组质粒的脂质体。

第八方面、本发明还涉及一种包含所述重组质粒的包装病毒。

本发明具有如下的有益效果：本发明中的siRNA能高效抑制DAAO的表达，并且鞘内注射对大鼠福尔马林二相疼痛有60%以上的镇痛作用；本发明所公开的siRNA及其表达质粒具有特异性强、效率高、稳定性好和毒性低的特点，不仅可以有效的抑制大鼠脊髓基因DAAO的表达，同时能够应用于抑制人DAAO基因表达药物，镇痛药物，制备精神分裂症药物等诸多医药用途。

附图说明

图1为pDC316-EGFP-U6/shRNA结构图谱；

图2为荧光显微镜检测转染效率的结果图； 

图3 为Western-blot检测R，11，21组的干扰效率；其中，1、2泳道为空白对照组，3、7泳道为R组，5、6泳道为11组，8、9泳道为21组，4号泳道为预染marker；

图4为鞘内注射siRNA7天后大鼠福尔马林实验和Real-timePCR检测DAAO的干扰沉默效率；其中图A和图B中，PEI为载体；图C和图D中，腺病毒为载体；

图5为鞘内注射siRNA7天后检测DAAO的干扰沉默效率，其中泳道顺序如下：（1）Saline；（2）Nonsense/viral vector；（3）siRNA/viral vector；（4）siRNA/DAAO；（5） siRNA /Nonsense；（6）Vehicle；（7）Saline；（8）Marker；

图6为siRNA基因沉默的机制示意图。

 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版（科学出版社，2002）中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。

实施例1、siRNA表达质粒有效抑制大鼠神经胶质瘤细胞C6中DAAO基因的表达

构建抑制大鼠DAAO基因表达的siRNA表达载体，并检测大鼠神经胶质瘤细胞C6中DAAO的表达。

 1、siRNA设计

以DAAO基因（GeneID：114027）读码框（CDS）区（NCBI的编号：NM_053626）为目标序列，根据siRNA设计的通常经验，从CDS区的第50个碱基后进行选择，在www.promega.com/siRNADesigner/default.htm网站在线设计siRNA，共出现53个备选序列，根据以下条件挑选出潜在可行的siRNA序列：

（1）    GC含量36%-52%；

（2）    Sense链的第3碱基为A；

（3）    Sense链的第6碱基为A；

（4）    Sense链的第10碱基为U；

（5）    Sense链的第13碱基不是G；

（6）    Sense链的第18，19碱基不是G/C；

（7）    不含反向重复序列；

（8）    不能形成环；

（9）    Sense链的5’端第1个碱基为G/C；

（10）Sense链的15-19碱基中至少含有3个A/U。

出于目的序列与其他编码序列同源性的考虑，防止设计的siRNA对其他无关基因进行干扰，用NCBI服务器上的BLAST软件进行匹配，最终筛选出2条siRNA，分别命名为11和21，它们符合上述的设计规则且与DAAO以外的基因不存在同源性，同时设计了一条随机序列，即与设计的siRNA有着相同的核苷酸组成，但是与基因组序列缺少大的序列同源性，命名为R,其碱基序列如下：

2、shRNA设计与合成

选用质粒pDC316-EGFP-U6（已经在《王天宝， 石汉平， 黄文生等. AdMax腺病毒介导c-kit RNA干扰对胃肠间质瘤裸鼠移植瘤株生长的影响, 2011,91(8): 560-564.》中公开）做为载体，该质粒存在多个多态酶切位点，选用BamH I和 Hind III作为酶切位点。在shRNA设计时，将上述siRNA中所有U用T代替，并在其5’端加入BamH I酶切位点，3’端 加入Hind III酶切位点，loop序列为TTCAAGAGA，用于连接siRNA与其互补链，终止子为AAAAA/TTTTT。

shRNA的 结构模式如下：

5’BamHI酶切位点+反义链+loop+正义链+终止子+HindIII酶切位点 3’；

shRNA序列分别命名为da316-11,da316-21,dar-11，并针对shRNA序列设计其互补链，分别命名为da316-12，da316-22，dar-12，送上海生工生物技术有限公司合成。碱基序列如下：

3、构建siRNA表达质粒

利用分子克隆技术，在体外合成编码DAAO基因的shRNA核苷酸序列单链，退火形成shRNA双链之后，利用限制性内切酶技术将其克隆到真核表达载体pDC316-EGFP-U6中。

对载体质粒进行双酶切，并对shRNA进行退火，形成shRNA模板插入物，用T4连接酶，在体外将shRNA模板插入物连接到双酶切质粒上，转化TOP10感受态细胞，由于pDC316-EGFP-U6质粒具有Amp抗性，故用含Amp的LB培养基挑取转化子，进行质粒抽提，对提取得到的质粒进行双酶切鉴定，若质粒能够被切动且出现59 bp左右大小的条带，即可初步判断外源DNA片断已成功插入到载体质粒中。

挑选能够被切动的质粒，送invitrogen公司测序，如果测序结果中出现设计的shRNA的碱基序列，则连接成功，外源基因成功导入载体质粒。测序结果表明：完全与设计预期一致，成功地构建pDC316-EGFP-U6/shRNA真核表达载体，该载体的结构图谱如图1所示。

 4、将表达质粒pDC316-EGFP-U6/shRNA转染C6细胞

将C6细胞放置于37℃，5%CO₂ 培养箱中，用F-12K培养基（Gibco, Invitrogen,美国）+10%马血清（Gibco, Invitrogen,美国）+5%胎牛血清（Gibco, Invitrogen,美国）培养至80%-90%，利用转染试剂

2000 （Invitrogen,美国）,按照其说明书操作步骤，将构建的pDC316-EGFP-U6/shRNA转染至C6细胞(中科院细胞所)，转染效率＞70%，如图2所示：（1）

 2000 为转染试剂对大鼠神经胶质瘤细胞C6进行转染，2A为转染带有21组siRNA的质粒的转染结果，2B为转染带有11组siRNA的质粒的转染结果；（2）腺病毒为转染载体对大鼠神经胶质瘤细胞转染，2C为将21组siRNA包装为腺病毒转染上述细胞的转染结果，转染效率最高，达到90%以上。

 5、目的基因沉默效率检测：蛋白印迹技术（Western-blot）

细胞转染48h后，裂解细胞并收集蛋白进行SDS-PAGE电泳,检测目的基因沉默效率，具体操作如下：

（1）样品制备：收获细胞加入4倍体积的NP-40(含PMSF)冰上裂解30min，将裂解液移至1.5ml离心管，4℃离心12000rpm，5min，取上清；

（2）蛋白定量：BCA法测定上清中蛋白含量；

（3）SDS-PAGE电泳：上清加5xloading buffer 煮沸5min，每孔等量的蛋白上样，12%的SDS-PAGE凝胶电泳约1h；

（4）转膜：100mA转2h，注意加冰浴；

（5）封闭：5%脱脂牛奶封闭1h；

（6）一抗：一抗1:400于4℃孵育24h，PBST洗膜5min，10min，15min；

（7）二抗：HRP标记的二抗1:750室温孵育2h，PBST洗膜5min，10min，15min；

（8）DAB显色：DAB浓度（0.5mg/ml），加入30%H2O2(1ul/ml)，显色3min左右，检测蛋白表达变化。结果见图3所示：为11组，为21组，4号泳道为预染marker，从条带颜色深浅中可以看出21组（8、9泳道）,11组的条带（5、6泳道）相比其他泳道（1、2泳道为空白对照组，3、7泳道为R组）条带几乎不可见，说明达到了很好的干扰效果。

实施例2、鞘内注射DAAO基因siRNA抑制大鼠福尔马林二相疼痛

1、大鼠福尔马林疼痛模型

致痛前，大鼠在透明观察笼中熟悉环境约30min，由最初探索状变为静息状态后，将大鼠分别置入特制布袋中，于大鼠右后足背皮下注射5% 福尔马林50μl，注射后即刻将大鼠从布袋中取出，放入透明观察笼中观察。

每10min观察一次，用计数器计数记录大鼠1min内注射足缩腿次数（自发性回缩或震摇的次数），即记录注射福尔马林后0-1，10-11，20-21，30-31，40-41，50-51，60-61，70-71，80-81，90-91 min大鼠注射足缩腿次数，共观察90min。

 2、大鼠鞘内注射

戊巴比妥钠（50 mg/kg, i.p.）麻醉，置大鼠于腹卧位，以髂棘（L6）为中点，沿背部正中间切开皮肤（约1cm），测量进针处（L5、L6 间隙，平髂棘，与末肋的距离约3～3.5cm /200～250 g体重），沿L5、L6棘突正中间垂直插入导针。进入蛛网膜下腔有明确的突破感，并可见尾巴甩动。然后使导针头端向大鼠头端倾斜，用无菌的PE-10（内径：0.28 mm，外径：0.61 mm）管自导针插入，当PE-10管进入蛛网膜下腔时可见尾巴甩动，然后继续向头端插入PE-10管，深入3～3.5 cm即可到达腰膨大，此过程中可见后肢抽动。拔出导针，将PE-10管外端自皮下由颈部中间引出，用缝合线在插管处和颈部多点固定，热熔封闭PE-10管的外末端口。肌层、皮肤分层缝合。

 3、大鼠鞘内注射DAAO siRNA

应用两种载体进行siRNA的体内输送,选择干扰效率最高的21组siRNA序列（见图 3 ）和R组序列进行腺病毒包装或者体外化学合成，polyetherimide (PEI)（polyscience,美国）-siRNA复合体的方式进行局部脊髓转染。

大鼠分为六组，分别鞘内注射saline, siRNA-R viral vector,siRNA-21viral vector；PEI，siRNA-R-PEI，siRNA-21-PEI。

注射剂量如下：30μl，5.04*106pfu/ 30μl，5.04*106pfu/ 30μl；7.5μg/10μl，5μg R-siRNA-5μgPEI/10μl，5μg 21-siRNA+7.5μgPEI/10μl。每天注射一次，连续注射7天。

 4、siRNA 沉默脊髓DAAO效率及其对福尔马林二相疼痛的作用

第8天测试各组大鼠福尔马林疼痛实验，见图4A，4C，siRNA-21viral vector和5μg 21-siRNA+7.5μgPEI/10μl组与各自对照组相比福尔马林二相疼痛显著降低约60%，处死全部大鼠，取其脊髓腰膨大部分，进行基因沉默效率检测。基因沉默效率检测过程如下： 

（a）荧光实时定量PCR （Real-time PCR）

 1.1脊髓总RNA提取

（1）  取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min；

（2）  加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min；

（3）  4℃离心，12000g×15min，取上清；

（4）  加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

（5）  4℃离心，12000g×10min，弃上清；

（6）  加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g×5min，弃上清；

（7）  晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解（65℃促溶10-15min）；

（8）  测定RNA的浓度，A260/A280在1.8-2.0。

 1.2 RT反应

      (1) RT反应体系：

 (2) RT反应条件：

37℃ 15分钟，95℃ 5分钟，4℃ 保存。

 1.3 Real-time PCR反应

（1）采用TIANGEN公司生产的RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒。

以GAPDH作为控制组。

（2）PCR反应条件：

94℃ 2 min ；( 94℃ 30 sec,61℃ 30 sec,72℃ 30 sec)×35 cycles；72℃ 4 min；4℃ forever；Real-time PCR结果用待测样品的含量通过比较目的基因的Ct值和内参基因的Ct值差异的2-ΔΔCt法来计算。计算公式： 

ΔΔCt =（Ct DAAO-Ct GAPDH）Experimenta -（Ct DAAO-Ct GAPDH）Control 

2-ΔΔCt即为实验组DAAO基因较对照组DAAO基因表达量的倍数。结果见图4B,4D，可以看出，在DAAO的转录mRNA水平上，实验组分别比各自的对照组下降40%-50%，siRNA较好的实现了体内DAAO的沉默效果。

 (b)、蛋白印迹技术

（1）样品制备：干净的剪刀剪碎组织，将少量组织块置于匀浆器中球状部位，加入4倍体积的NP-40(含PMSF)于匀浆器中研磨匀浆，于冰上进行，几分钟后再碾一会，重复几次使组织尽量破碎；冰上裂解30min，将裂解液移至1.5ml离心管，4℃离心12000rpm，5min，取上清；

（2）蛋白定量：BCA法测定上清中蛋白含量；

（3）SDS-PAGE电泳：上清加5x loading buffer 煮沸5min，每孔等量的蛋白上样，12%的SDS-PAGE凝胶电泳约1h；

（4）转膜：100 mA转2h，注意加冰浴；

（5）封闭：5%脱脂牛奶封闭1h；

（6）一抗：一抗1:400于4℃孵育24h，pbst洗膜5min，10min，15min；

（7）二抗：HRP标记的二抗1:750室温孵育2h，pbst洗膜5min，10min，15min；

（8）DAB显色：DAB浓度（0.5mg/ml），加入30%H₂O₂(1μl/ml)，显色3min左右，检测蛋白表达变化。结果见图5，1-3为腺病毒为载体鞘内注射后脊髓DAAO蛋白表达的变化，可以看到携带DAAO siRNA 21组的（3）号DAAO表达相比对照组（1）和（2）明显降低，而β-actin蛋白表达量基本未变。4-7为PEI为载体鞘内注射后脊髓DAAO蛋白表达的变化，可以看到PEI包裹DAAO siRNA 21组的（4）号DAAO表达相比对照组（5）（6）和（7）明显降低，而β-actin蛋白表达量也是基本未变。Western blot的结果再次表明21组siRNA可以成功干扰大鼠脊髓DAAO。

实施例3、DAAO siRNA在制备治疗人类慢性疼痛及精神分裂症药物中的用途

siRNA基因沉默的机制如图6所示。RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片断，即siRNA。

随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应（Caterina M J, Schumacher M A, Tominaga M, et al. The capsaicin receptor:a heat-activated ion channel in the pain pathway[J]. Nature,1997,398:816-24）。

RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（Guide Strand），序列特异性地结合在靶标mRNA上并切断靶标mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。从动物实验实施例中确定了所述SEQ ID NO:1对DAAO的沉默效果并由此产生的镇痛作用，对比同大鼠基因同一位点的人类基因mRNA CDS区的序列SEQ ID NO:9，其只有两个碱基的差别，该位点的SEQ ID NO:9会对人类的DAAO有很好的沉默效果，并达到镇痛作用。人类精神分裂症与DAAO蛋白活性增加有关（Caroline Madeira, Maria Eliza Freitas, Rogério Panizzutti et al。Increased brain d-amino acid oxidase (DAAO) activity in schizophrenia Schizophrenia Research  Volume 101,Issues 1-3,April 2008:76-83），SEQ ID NO:9对DAAO的沉默使之其能够用于治病治疗人类的精神分裂症的药物，SEQ ID NO:10也有相同的作用。

综上所述，本发明中的siRNA能高效抑制DAAO的表达，并且鞘内注射对大鼠福尔马林二相疼痛有60%以上的镇痛作用；本发明所公开的siRNA及其表达质粒具有特异性强、效率高、稳定性好和毒性低的特点，不仅可以有效的抑制大鼠脊髓基因DAAO的表达，同时能够应用于制备人用抑制DAAO基因表达药物，人用镇痛药物，制备人用精神分裂症药物等诸多用途。

Claims (14)

1.一种抑制DAAO基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10所示的序列。

2.如权利要求1所述的抑制DAAO基因表达的siRNA，其特征是，所述siRNA序列的3’端加有UU或者TT。

3.如权利要求1所述的抑制DAAO基因表达的siRNA，其特征是，所述siRNA序列经过硫代修饰、碱基修饰、核糖修饰、末端3’端或5’端偶联胆固醇修饰、或者细胞穿透肽修饰。

4.一种如权利要求1所述抑制DAAO基因表达的siRNA在制备抑制DAAO基因表达药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征是，所述用途为在制备抑制疼痛药物中的用途。

6.如权利要求4所述的用途，其特征是，所述用途为在制备精神分裂症药物中的用途。

7.一种包含权利要求1所述抑制DAAO基因表达的siRNA的聚阳离子复合物。

8.一种包含权利要求1所述抑制DAAO基因表达的siRNA的脂质体。

9.一种产生权利要求1所述抑制DAAO基因表达的siRNA的重组质粒，其特征是，所述重组质粒为pDC316-EGFP-U6/shRNA。

10.如权利要求9所述的重组质粒，其特征是，所述载体与shRNA双链通过BamH I和 Hind III两个酶切位点连接。

11.如权利要求9所述的重组质粒，其特征是，所述shRNA双链的结构如下：5’BamHI酶切位点+反义链+loop+正义链+终止子+HindIII酶切位点 3’；其中loop序列为TTCAAGAGA，终止子为AAAAA/TTTTT。

12.一种包含权利要求9所述重组质粒的聚阳离子复合物。

13.一种包含权利要求9所述重组质粒的脂质体。

14.一种包含权利要求9所述重组质粒的包装病毒。

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