JP2018023367A - 転写因子デコイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】結合部位は遺伝子に機能的に結合しておらず、標的転写因子は、WhiB7、YycG/YycF、Sigma54(もしくはSigA)、Fur、TcdR、Vfr、NtrC、ArsR、TcaA、AgrA、WalR、sigB、Ksig、もしくはfhu、またはこれらのいずれかの機能的変異体もしくはホモログから選ばれ、標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは細胞の適応機構、細胞の固有の抗生物質耐性機構、細胞のビルレンス因子、細胞のストレス機構のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含み、二次構造の少なくとも1つのエレメントを含む、標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド。
【選択図】なし
Description
(a)標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド(デコイ配列)を提供すること、
(b)1個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した上記転写因子の結合部位を含む原核細胞に上記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
上記デコイポリヌクレオチドの導入は、上記細胞における上記結合部位への上記標的転写因子の結合を低減させ、上記機能的に結合した1個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、かつ
上記標的転写因子は、
(i)細胞の適応応答、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞のストレス応答、もしくは
(v)細胞の必須遺伝子、のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む、方法である。
・原核生物の抗生物質感受性を増加させる方法であって、当該方法は、
(a)標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド(デコイ配列)を提供すること、
(b)1個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した上記転写因子の結合部位を含む原核細胞に上記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
上記デコイポリヌクレオチドの導入は、上記細胞における上記結合部位への上記標的転写因子の結合を低減させ、上記機能的に結合した1個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより上記細胞の抗生物質感受性を増加させ、かつ
上記標的転写因子は、
(i)細胞の適応応答、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞の必須遺伝子、のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む、方法である。
・標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、
上記結合部位は、遺伝子に機能的に結合しておらず、かつ
上記標的転写因子は、
(i)細胞の適応応答、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞の必須遺伝子、のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む。
(i)細胞の適応応答、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞の必須遺伝子、のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む。
(a)標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドを提供すること、
(b)1個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した上記転写因子の結合部位を含む原核細胞に上記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
上記デコイポリヌクレオチドの導入は、上記細胞における結合部位への上記標的転写因子の結合を低減させ、上記機能的に結合した1個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより細胞ビルレンスを低減させ、かつ
上記標的転写因子は、
(i)細胞の適応応答、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞の必須遺伝子、のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む、方法である。
WhiB7は、マイコバクテリア(Mycobacteria)(例えば、恥垢菌(M. smegmatis)および結核菌(M. tuberculosis))を含む放線菌(Actinomycetes)およびストレプトミセス(Streptomyces)中の抗生物質耐性遺伝子の転写レギュレーターである(Nguyenら、「Trends in Microbiology」(2006年)14:304〜312)。
5’−CACCAGCCGA AAAGGCCACG GACCCGCAGT CACCCGGATC CGTGGCCATT TTTGTCGGAC CCCCCGAGAA ATCTGGTCGC AGGATCCATC AGCTCAGACA GATCAC−3’(配列番号9)
定義Mycobacterium smegmatis str.MC2 155、全ゲノム。
アクセッションCP000480
バージョンCP000480.1 GI:118168627
座標20313637−2031742
WhiB7 TFD 5’ TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3’(配列番号5、実施例2)
FadRは、大腸菌における脂肪酸合成の必須経路中の遺伝子(fabAおよびfabBを含む)の発現のレギュレーターである(CampbellおよびCronan、「J.Bacteriology」(2001年)183:5982〜5990)。
5’ AGTAAGTTTC GAATGCACAA TAGCGTACAC TTGTACGCCG AACAAGTCCG ATCAGCCATT TAA−3’(配列番号10)
定義Escherichia coli str.K12 substr.DH10B、全ゲノム。
アクセッションCP000948
バージョンCP000948.1 GI:169887498
座標2531419−2531481
FabB TFD 5’ TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3’(配列番号6、実施例3)
YycG/YycFは、黄色ブドウ球菌、枯草菌(B. subtilis)、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、リステリア菌(Listeria monocytogenes)を含む、低G+Cグラム陽性菌中の二成分レギュレーターである。YycG/YycFは、LytMおよびSsaAを含む少なくとも12個の遺伝子ならびにビルレンス決定および細胞壁合成の遺伝子の必須レギュレーターであることが知られている(DubracおよびMsadek、「Journal of Bacteriology」(2004年)186:1175〜1181)。
YycF_LytM
5’−GCTATTTTGTAATGACAATGTAATGAGTTTAGTAAAAA−3’(配列番号11)
定義Staphylococcus aureus subsp.aureus USA300_TCH1516、全ゲノム。
アクセッションCP000730
バージョンCP000730.1 GI:160367075
座標322073−322109
5’−ATTACAAATTTGTAACAGACTTATTTTA−3’(配列番号12)
定義Staphylococcus aureus subsp.aureus USA300_TCH1516、全ゲノム。
アクセッションCP000730
バージョンCP000730.1 GI:160367075
座標2415067−2415093
LytM TFD 5’ GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAA AA 3’
SsaA TFD 5’ ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A 3’
(配列番号7および8、実施例4)
Sigma54すなわちSigBは、適応応答の主要なコントローラであり、恥垢菌、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)を含む細菌の約60%に存在する(Wigneshweraraj、「Molecular Microbiology」(2008年)68:538〜546)。
SA_sig
5’− TTATTATATA CCCATCGAAA TAATTTCTAA TCTTC−3’(配列番号13)
定義Staphylococcus aureus subsp.aureus USA300_TCH1516、全ゲノム
アクセッションCP000730
バージョンCP000730.1 GI:160367075
座標2187051−2187017
5’−CCGATAAGGG CGCACGGTTT GCATGGTTAT−3’(配列番号14)
定義Klebsiella pneumoniae DNA for nif gene cluster
アクセッションX13303
バージョンX13303.1 GI:43820
座標18301−18330
Fur調節は当初、鉄の調節に関して重要であると記載されが、中でも金属調節(Zn−Zur)や過酸化物(Per)に対する耐性の決定という他の適応経路に関与するとの認識が高まっている。Fur調節は、少なくとも黄色ブドウ球菌、大腸菌、ピロリ菌、枯草菌で起こる(Fur、PerR、Zur、MntR)(Horsburgh2001年、Lavarr2003年、およびDelany2001年)。
SA_fur
5’−ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TT−3’(配列番号15)
Horsburgh、「J.Bacteriology」(2001年)183:468に記載のコンセンサス配列(「Fur BOX」)
5’−GATAATGATAATCATTATC−3’(配列番号16)
de Lorenzo、「J.Mol.Biol.」(1998年)283:537に記載のコンセンサス配列。
HP_fur
5’−GTT GTC CCA TAA TTA TAG CAT AAA TGA TAA TGA AAA AGT AAA−3’(配列番号17)
定義Helicobacter pylori Shi470、全ゲノム
アクセッションCP001072
バージョンCP001072.2 GI:189491895
座標691415−691374
TcdRは、自己調節され、ビルレンスを決定する2種類のメジャーな菌体外毒素の発現を調節する代替シグマ因子である。TcdR調節は、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、ボツリヌス菌(C. botulinium)(ホモログはBotR)、C.テタニ(C. tetani)(TetR)、およびウェルシュ菌(C. perfringens)(UviA)において起こることが知られている(Matamourous、「Molecular Microbiology」(2007年)64:1274〜1288)。
TcdR
5’−AAG TTT ACA AAA TTA TAT TAG AAT AAC TTT TTT A TT−3’(配列番号18)
Vfrは、緑膿菌および大腸菌中の毒性因子のグローバルレギュレーターである(Kanack、「Microbiology」(2006年)152:3485〜3496)。大腸菌のホモログはCRPであり、結合部位は、toxA遺伝子のプロモーターおよびregA遺伝子のプロモーターP1に生じる。
PA_Vfr
5’−AAA TGT GAT CTA GAT CAC ATT T−3’(配列番号19)
Kanack、「Microbiol.」(2006年)55:1196に記載のコンセンサス配列。
5’−CACTCTGCAA TCCAGTTCAT AAATCC−3’(配列番号20)
定義Pseudomonas aeruginosa strain PACS458 clone fa1366、全配列
アクセッションEU595736 領域:10145..10170
バージョンEU595736.1 GI:187939551
座標10145−10170
5’−GTAACAGCGGAACCACTGCACAG−3’(配列番号21)
定義Pseudomonas aeruginosa strain PACS458 clone fa1366、全配列
アクセッションEU595736 領域:10145..10170
バージョンEU595736.1 GI:187939551
座標312−334
NtrCは、少なくとも肺炎桿菌における環境適応に必要な必須遺伝子glnAのレギュレーターである(Minchinら、「The EMBO Journal」(1989年)8:3491〜3499)。
KP_NtrC
5’−GCTTTGCACTACCGCGGCCCATCCCTGCCCCAAAACGATCGCT−3’(配列番号22)
定義Klebsiella pneumoniae DNA for nif gene cluster
アクセッションX13303
バージョンX13303.1 GI:43820
座標18159−18201
ArsRは、少なくともピロリ菌、H.アシノニチス(H. acinonychis)、およびH.フェリス(H. felis)における酸適応をコードする遺伝子のレギュレーターである(Pflockら、「J.Bacteriology」(2006年)188:3449〜3462)。結合部位は、Pflockらに記載のように、amiEプロモーターおよびrocFプロモーター中に存在する。
HP_AmiE
5’−ATAATCATAA TGATTAAAGT TTTCATATTC ATTATAAATC CGTTTACACA ATTATT −3’(配列番号23)
定義Helicobacter pylori26695、全ゲノム
アクセッションAE000511 領域:310910..310965
バージョンAE000511.1 GI:6626253
座標310910−310965
5’−GAAATTGTTC TATTTATTAT CCATTTGCTT ATTAATAATT GGTTGTTAAT TTTGGTTTAG A−3’(配列番号24)
定義Helicobacter pylori26695、全ゲノム
アクセッションAE000511 領域:1459830..1459890
バージョンAE000511.1 GI:6626253
座標1459830−1459890
コンセンサス配列は、公開されているマイクロアレイデータの生物情報分析により決定された。モチーフは、糖ペプチド耐性菌とその親株との、および当該耐性菌と復帰変異株との比較を行った際に、アップレギュレートされることが示された遺伝子において発見された(Scherl、「BMC Genomics」(2006年)7:296)。17/22のプロモーターが、共通するコンセンサス配列を有すると分かった。
5’−TGAACACCTTCTTTTTA−3’(配列番号25)
定義Staphylococcus aureus subsp.aureus USA300_TCH1516、全ゲノム
アクセッションCP000730
バージョンCP000730.1 GI:160367075
座標2476452−2476436
コンセンサス配列は、公開されているマイクロアレイデータの生物情報分析により決定された。モチーフは、ビルレンスに関連するレギュレーターであるAgrにより正に調節されることが示された遺伝子において見出された(Dunman、「J.Bacteriol.」(2001年)183:7341)。
5’−AGA AAG ACA AAC AGG AGT AA−3’(配列番号26)
定義Staphylococcus aureus subsp.aureus USA300_TCH1516、全ゲノム
アクセッションCP000730
バージョンCP000730.1 GI:160367075
座標2414790−2414771
5’−GAA GAA ACA AAA AGC AGC AT−3’(配列番号27)
定義Staphylococcus aureus subsp.aureus Mu3 DNA、全ゲノム
アクセッションAP009324
バージョンAP009324.1 GI:156720466
座標1549580−1549561
・モノマー配列の1より多いコピーを含むポリヌクレオチドを提供すること、および
・適切なプラスミドベクターへポリヌクレオチドをクローニングすること。
(1)(i)対象となる配列と(ii)ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位とを含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること(ここで上記モノマー配列は(i)および(ii)を含む)、ならびに
(2)鋳型として上記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと。これによってモノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドが提供される。
・対象となる試験配列(i)と、ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位(ii)とを含む直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、
・典型的にはユニバーサル連結オリゴヌクレオチドの存在下において、例えばTaqリガーゼを使用して、上記オリゴヌクレオチドを環状にすること、
・任意に、エキソヌクレアーゼにより残存する直鎖DNAを消化すること、および
・例えばPAGEを用いて、単量体環状オリゴヌクレオチドを回収すること。
(a)ペニシリン
(b)カルバペネム
(c)モノバクタム(Monbactams)
(d)セファロスポリン
第一世代:セファセトリル(Cefacetrile)(セファセトリル(cephacetrile))、セファドロキシル(Cefadroxil)(セファドロキシル(cefadroxyl)、デュリセフ(Duricef))。セファレキシン(Cefalexin)(セフレキシン(cephalexin)、ケフレックス(Keflex))、セファログリシン(Cefaloglycin)(セファログリシン(cephaloglycin))、セファロニウム(Cefalonium)(セファロニウム(cephalonium))、セファロリジン(Cefaloridine)(セファロラジン(cephaloradine))、セファロチン(Cefalotin)(セファロチン(cephalothin)、ケフリン(Keflin))、セファピリン(Cefapirin)(セファピリン(cephapirin)、セファドリル(Cefadryl))、セファトリジン(Cefatrizine)、セファザフル(Cefazaflur)、セファゼドン(Cefazedone)、セファゾリン(Cefazolin)(セファゾリン(cephazolin)、アンセフ(Ancef)、ケフゾール(Kefzol))、セフラジン(Cefradine)(セフラジン(cephradine)、ベロセフ(Velosef))、セフロキサジン(Cefroxadine)、セフテゾール(Ceftezole);
第二世代:セファクロル(Cefaclor)(セクラー(Ceclor)、ジスタクロル(Distaclor)、ケフラール(Keflor)、ラニクロル(Raniclor))、セフォニシド(Cefonicid)(モノシド(Monocid))、セフプロジル(Cefprozil)(セフプロキシル(cefproxil)、セフジル(Cefzil))、セフロキシム(Cefuroxime)(ジンナット(Zinnat)、ジナセフ(Zinacef)、セフチン(Ceftin)、ビオフロクシム(Biofuroksym))、セフゾナム(Cefuzonam)、セフメタゾール(Cefmetazole)、セフォテタン(Cefotetan)、セフォキシチン(Cefoxitin)、カルバセフェム(Carbacephems):ロラカルベフ(Lorabid)、セファマイシン(Cephamycins):セフブペラゾン(cefbuperazone)、セフメタゾール(cefmetazole)(ゼファゾン(Zefazone))、セフミノックス(cefminox)、セフォテタン(cefotetan)(セフォタン(Cefotan))、セフォキシチン(cefoxitin)(メフォクシン(Mefoxin))
第三世代:セフカペン(Cefcapene)、セフダロキシム(Cefdaloxime)、セフジニル(Cefdinir)(オムニセフ(Omnicef))、セフジトレン(Cefditoren)、セフェタメト(Cefetamet)、セフィキシム(Cefixime)(スプラックス(Suprax))、セフメノキシム(Cefmenoxime)、セフォジジム(Cefodizime)、セフォタキシム(Cefotaxime)(クラフォラン(Claforan))、セフピミゾール(Cefpimizole)、セフポドキシム(Cefpodoxime)(バンティン(Vantin)、PECEF)、セフテラム(Cefteram)、セフチブテン(Ceftibuten)(セダックス(Cedax))、セフチオフル(Ceftiofur)、セフチオレン(Ceftiolene)、セフチゾキシム(Ceftizoxime)(セフィゾクス(Cefizox))、セフトリアキソン(Ceftriaxone)(ロセフィン(Rocephin))、セフォペラゾン(Cefoperazone)(セフォビッド(Cefobid))、セフタジディム(Ceftazidime)(フォータム(Fortum)、フォルタズ(Fortaz))、オキサセフェム(Oxacephems):ラタモキセフ(latamoxef)(モキサラクタム(moxalactam))
第4世代:セフクリジン(Cefclidine)、セフェピム(Cefepime)(マキシピーム(Maxipime))、セフルプレナム(Cefluprenam)、セフォセリス(Cefoselis)、セフォゾプラン(Cefozopran)、セフピロム(Cefpirome)、セフキノム(Cefquinome)、オキサセフェム(Oxacephems):フロモキセフ(flomoxef)
まだ分類されていないもの:セフトビプロル(Ceftobiprole)、セファクロメジン(Cefaclomezine)、セファロラム(Cefaloram)、セファパロル(Cefaparole)、セフカネル(Cefcanel)、セフェドロロール(Cefedrolor)、セフェムピドン(Cefempidone)、セフェトリゾール(Cefetrizole)、セフィビトリル(Cefivitril)、セフマチレン(Cefmatilen)、セフメピジウム(Cefmepidium)、セフォベシン(Cefovecin)、セフォキサゾール(Cefoxazole)、セフロチル(Cefrotil)、セフスマイド(Cefsumide)、セフタロリン(Ceftaroline)、セフチオキシド(Ceftioxide)、セフラセチム(Cefuracetime)
(a)アミカシン(amikacin)、ゲンタマイシン(gentamicin)、カナマイシン(kanamycin)、ネオマイシン(neomycin)、ネチルマイシン(netilmicin)、パロモマイシン(paromomycin)、ロドストレプトマイシン(rhodostreptomycin)、ストレプトマイシン(streptomycin)、トブラマイシン(tobramycin)、アプラマイシン(apramycin);
(b)アントラサイクリン(anthracyclines)、例えばドキソルビシン(doxorubicin)
(a)フルオロキノロン系;
第一世代;
第二世代;
第三世代;
第4世代。
(a)バンコマイシン(vancomycin)、テイコプラニン(teicoplanin)、テラバンシン(telavancin)、ブレオマイシン(bleomycin)、ラモプラニン(ramoplanin)、デカプラニン(decaplanin)、およびダルババシン(dalbavancin)。
(a)ランチビオティック系;
デュラマイシン(duramycin)、ナイシン(nisin)、エピデルミン(epidermin)、アクタガルジン(actagardine)、ミクロビスポリシン(microbisporicin)、およびメルサシジン(mersacidin);
(b)リポペプチド系;
キュービシン(cubicin)。
キヌプリスチン(Quinupristin)+ダルホプリスチン(dalfopristin)(シナシッド(Synercid)(登録商標))。
配列番号1および2−実施例1.1のpGEMT−Easyベクターからの標的配列の増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号3および4−実施例1.2の、ダンベルデコイの産生におけるpGEMT−Easyベクターからの標的配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号5−実施例2で用いたWhiB7デコイ
配列番号6−実施例3で用いたFabBデコイ
配列番号7−実施例4で用いたLytMデコイ
配列番号8−実施例4で用いたSsaAデコイ
配列番号9−恥垢菌株mc2 155における未変性のWhiB7結合部位
配列番号10−大腸菌K12における未変性のFadR結合部位
配列番号11−黄色ブドウ球菌におけるYycF/YycGの未変性の結合部位
配列番号12−黄色ブドウ球菌におけるYycF/YycGの未変性の結合部位
配列番号13−黄色ブドウ球菌におけるSigBの未変性の結合部位
配列番号14−肺炎桿菌 におけるSigBの未変性の結合部位
配列番号15−黄色ブドウ球菌におけるFur結合のコンセンサス配列
配列番号16−大腸菌におけるFur結合のコンセンサス配列
配列番号17−ピロリ菌におけるFurの未変性の結合配列
配列番号18−クロストリジウム・ディフィシレ におけるTcdRのコンセンサス結合部位
配列番号19−緑膿菌におけるVfrのコンセンサス結合部位
配列番号20−緑膿菌におけるVfrの未変性の結合部位
配列番号21−緑膿菌におけるVfrの未変性の結合部位
配列番号22−肺炎桿菌におけるNtrCの未変性の結合部位
配列番号23−ピロリ菌におけるArsRの未変性の結合配列
配列番号24−ピロリ菌におけるArsRの未変性の結合配列
配列番号25−黄色ブドウ球菌における糖ペプチド耐性コンセンサス配列
配列番号26−黄色ブドウ球菌におけるAgr結合モチーフ
配列番号27−黄色ブドウ球菌におけるAgr結合モチーフ
配列番号28−SasigB TFDのPCR調製のためのフォワードプライマー配列
配列番号29−SasigB TFDのPCR調製のためのリバースプライマー配列
配列番号30−SAfhuTFDのPCR調製のためのフォワードプライマー配列
配列番号31−SAfhu TFDのPCR調製のためのリバースプライマー配列
配列番号32−SsaA TFDのPCR調製のためのフォワードプライマー配列
配列番号33−SsaA TFDのPCR調製のためのリバースプライマー配列
配列番号34−制御配列
配列番号35−制御配列
配列番号36−16s rRNAのPCR増幅のためのフォワードプライマー配列
配列番号37−16s rRNAのPCR増幅のためのリバースプライマー配列
配列番号38−fhu遺伝子のPCR定量のためのフォワードプライマー配列
配列番号39−fhu遺伝子のPCR定量のためのリバースプライマー配列
配列番号40−リン酸化SigダンベルTFDオリゴヌクレオチド配列
配列番号41−リン酸化SigダンベルTFDオリゴヌクレオチド配列
配列番号42−Sig結合部位のスクランブル型を含むダンベルTFDのためのリン酸化プライマー
配列番号43−Sig結合部位のスクランブル型を含むダンベルTFDのためのリン酸化プライマー
配列番号44−WalRの結合配列を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号45−WalRの結合配列を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号46−WalR結合部位のスクランブル型を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号47−WalR結合部位のスクランブル型を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号48−WalRの結合部位を組み込んだリン酸化オリゴヌクレオチド
配列番号49−WalRの結合部位を組み込んだリン酸化オリゴヌクレオチド
配列番号50−FabBプロモーターのフォワードプライマー
配列番号51−FabBプロモーターのリバースプライマー
配列番号52−WhiB7 TFDのフォワードプライマー
配列番号53−WhiB7 TFDのリバースプライマー
配列番号54−肺炎桿菌のσ54因子の認識配列を含むTFDのフォワードプライマー
配列番号55−肺炎桿菌のσ54因子の認識配列を含むTFDのリバースプライマー
配列番号56−細胞透過性ペプチドの配列
配列番号57−WalR TFDコンセンサス配列
配列番号58−SigB TFDコンセンサス配列
配列番号59−KP_Sig TFD配列
配列番号60−KP_Sig TFDコンセンサス配列
一般に、本明細書において言及される技術の多くは当技術分野において周知であるが、特にSambrookおよびRussell、第三版、2001年、Molecular Cloning:a laboratory manualを参照してもよい。
1.1ストレプトリジンOの存在下でのコレステロール標識TFD
オリゴヌクレオチドプライマー(1つは5’コレステロール修飾を有しており、もう1つはその5’末端または他に類似の修飾(例えば、Cy5などの蛍光染料など、容易に転写因子デコイ(TFD)の取り込みを測定することができるように)を有する)を使用して、TFDをPCRにより調製する。TFDが前もってベクター(pGEMT−Easy)へクローニングされている場合、プライマーは、挿入物に最も近接するベクター配列にアニーリングするように設計される、例えば:
配列番号1 Chol_TEf:5’コレステロール−TEG−GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC
配列番号2 Cy5_TEr−5’Cy5−AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG
ダンベルデコイは、標的因子の結合部位を含み、ステムループ構造が隣接する、二本鎖中心を特徴とする共有結合的に閉環した一本鎖DNAである。ステムループは、通常はデコイポリヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼの作用を阻止することによりデコイを安定化させる。それゆえ、ダンベルTFD(DB)は、その特徴的形状のためにそう呼ばれる。
配列番号3 DBTEf:5’P−CTTGG TTTTT CCAAG AGAAGAGC CCG CCA TGG CGG CCG CGG GAA TTC
配列番号4 DBTEr−P−CCG TCT TTT TGA CGG CGA AGA GCA GGC GGC CGC GAA TTC ACT AGT GA
あるいは、ダンベルは、適切なPCRクローニングベクターへ図4に示す平滑末端化PCR産物をクローニングすることにより作成することができ、同一性やプラスミドの調製が確認される。次いで、プラスミドは消化させることができ、挿入物が放出され、これはNt.BspQ1でさらに消化されて図4の後半部分に示す断片を放出する。これは、DNA分子を共有結合的に閉環させそしてDBを形成させるため、T4 DNAリガーゼで同様に処理することができる。
R9コレステロールは、真核細胞においてsiRNA(または他の核酸ベースの治療剤)分子などの形質移入を支援する特性に関して記載されている(米国特許出願番号第2007−0207966号)。ここで、我々はTFDを用いて様々な細菌を形質移入してR9コレステロー有用性を記載する。
恥垢菌(Mycobacterium smegmatis)に抗生物質に対する感受性を与えるためのWhiB7デコイ
WhiB7は、抗生物質に対する恥垢菌の感受性を決定することに関与することが示されている、恥垢菌中の遺伝子である。この遺伝子を機能的に欠如させることによって、この細菌が抗生物質に過敏になる(PNAS(2005年)102:12200)。WhiB7は転写レギュレーターであると考えられており、このような遺伝子はいくつか文献に記載されている。WhiB7の近縁相同体は、結核の原因物質である病原体結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に存在する。
大腸菌(Escherichia coli)の必須遺伝子を下方制御するためのFabBデコイ
FabBデコイは、脂肪酸合成の必須経路に関与する遺伝子(fabAおよびfabBを含む)の発現を調節するFadRレギュレーターの結合部位を含有する。fadR遺伝子を機能的にノックアウトすると、その結果、脂肪酸合成に関する欠失があり、抗生物質セルレニン(脂肪酸合成を標的とする(「J.Bacteriol」(2005年)183:5292))の存在下で増殖できない大腸菌株が得られることが明らかになっている。
配列番号6 FabB TFD 5’TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3’を含有した。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)にストレス応答に対する感受性を与えるデコイ
エレクトロポレーションによってデコイポリヌクレオチドを黄色ブドウ球菌に形質移入した。標準的方法によって細菌細胞を調製した。簡潔に述べると、420mMで吸収が0.3に到達することにより規定される初期対数期まで、LB培地中にて37℃で細胞を増殖させた。この細胞を4℃に冷却し、低速遠心によって回収し、同程度の体積の滅菌氷冷10%(v/v)グリセロールで3回洗浄した。最後に、この細胞を10%グリセロール中で元の体積の10分の1で再懸濁した。エレクトロポレーションキュベット中で細胞50μLをTFD1μL(典型的には、DNA100ngから1μg)と混合し、2.5kEV、100Ωおよび25μFの設定(3.8〜4.8msの範囲の時定数となる。)で、BioRad Genepulserにおいて電気穿孔処理を行うことによって、エレクトロポレーションを行った。典型的には、エレクトロポレーション済み細胞50μLを使用して、30mM KOH(ストレス応答を誘導するため)入りのBHI培地またはLB培地10mLに接種した。96ウェルプレートのウェルに細胞200μLを分注し、このプレートを穏やかに振盪させながら37℃で温置し、吸収を測定することにより増殖をモニタリングした。増殖曲線のプロットから、擬似エレクトロポレーション(この場合は、DNAが形質移入されていない)を通じて得られたかまたは無関係の配列により形質移入を行った対照と比較して増殖速度が低下したことにおいて、特異的TFDの影響が明らかになった(図7)。次のデコイ配列は、ストレス条件下で黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することが可能であった。
配列番号8:SsaA TFD 5’ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A3’
Sig TFDは黄色ブドウ球菌の増殖を阻害した
Sig_TFDは、黄色ブドウ球菌SigBタンパク質の結合部位を含有していた。このタンパク質は、ストレス関連遺伝子の多くを調節する代替シグマ因子である(Wigneshawerajaj、「Molecular Microbiology」(2008年)68:538)。黄色ブドウ球菌細胞に対してこのTFDにより形質移入を行い、96ウェルプレートにおいて、限定培地中で細胞を増殖させることによって、TFDがこの細胞の増殖を阻害することは明白である。Fhu DNAは、鉄制限条件下で鉄の取り込みを制御するFur転写因子の結合部位を含有する(Horsburghら、「J.Bacteriol.」(2001年)183:468)。SsaAは、増殖速度に影響を与える12種類の遺伝子を制御することが既に示されている、二成分レギュレーターWalRの結合部位を含有する(DubracおよびMsadek、「J.Bacteriology」(2004年)186:1175)。
同時係属中の出願PCT/GB2008/003353に記載のように、PCRによってTFDを調製する。このPCR反応で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、5’末端が修飾されており、例えば、このうち1つは、5’コレステロール修飾を有する。使用されるその他の修飾には、TFDの取り込みを容易に測定することができるように、ビオチン、アミン、細胞浸透性ペプチド、蛍光色素(例えば、Cy5またはフルオレセインなど)が挙げられる。試験が検討されるその他の修飾としては、病原性細菌の膜に特有である脂質が挙げられる。したがって、PCRにより作製されるTFDは、その5’末端が、TFDのインビボでの安定性を向上させるため、取り込み効率を向上させるため、蛍光による検出を可能にするため、に役立つ様々な分子によって修飾され得る。TFDが既にベクター(pGEMT−Easy)にクローニングされている場合、挿入物に直接隣接するベクター配列とアニーリングするようにプライマーを設計し、例えば:
配列番号1−Chol_TEf:5’コレステロール−TEG−GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC 3’
配列番号2−Cy5_TEr:5’Cy5−AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG 3’である。
配列番号28−SasigB FOR:GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA ATA A
配列番号29−SASigB REV:TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C Aである。
配列番号30−SAfhu FOR:ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA
配列番号31−SAfhu REV:AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TAである。
配列番号32−SsaA FOR:ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A
配列番号33−SsaA REV:AAA ATA AGT CTG TTA CAA ATT TGT AAT Aである。
セクション5.1におけるように、コレステロール/Cy5で標識したデコイポリヌクレオチドを調製した。次いで、典型的には、TFD1μgをリポソーム形質移入試薬DOTAP(Roche)0.3μLと複合体形成させ、室温で10分間温置した。60nMグラミシジン(Sigma Corporationより。カタログ番号G5002)を添加した、鉄制限培地ではないBHI培地(Becton Dickinsonより)または同様にグラミシジンを添加した鉄欠乏培地(NRPMI)からなる培養液200μLが各ウェルに入った96ウェルプレートを用いて、細菌細胞の増殖におけるそれらの影響を明らかにするためのアッセイを行った。鉄欠乏に対する方法は他所で詳細に記載されている(「Science」(2004年)305:1626〜1628)。様々な濃度の、TFDと複合体化させたコレステロール/Cy5標識デコイ1μLを各ウェルに添加し、温置中、間隔を置いて培養液の吸収を測定することによって、黄色ブドウ球菌の細菌増殖におけるそれらの影響をモニタリングした。プレートを振盪しながら37℃で温置し、プレートリーダーを用いて吸収の読み取り(450nM)を行った。いくつかのデコイ:Sig、fhuおよびSsaAを試験した。
fhuのFur TFD調節発現および鉄制限培地中での黄色ブドウ球菌の増殖抑制
細菌の鉄取り込みの調節において中心的役割を果たすFur転写因子(SomervilleおよびProctor(2009年)「Microbiol.Mol.Biol.Rev.」73:233〜248)に結合するようにTFDを設計し、これは捕捉された鉄の移入を調節するfhuオペロンを負の方向に制御する。鉄は、増殖に必須であり、電子伝達に必要とされ、多くの酵素的プロセスにおいて補因子として作用する。しかし、宿主において、鉄の存在量は限定されており、通常、トランスフェリンおよびラクトフェリンなどの宿主担体タンパク質へ組み込まれることにより、細菌が鉄を利用できなくなっている。これに応じて、黄色ブドウ球菌は、高親和性の鉄キレート剤であるシデロホアを合成し、これは、鉄に結合し、ABC輸送体(fhuCBGによりコードされるものなど)を使用して、鉄・シデロホア複合体を細菌細胞質に移入させる。過剰な鉄を移入すると、フェントン反応により遊離基が形成され、続いて細胞損傷が起こるので(WandersmanおよびDelepelaire、「Ann Rev Microbiol」(2004年)58:611〜647)、鉄取り込みは厳重に制御されねばならない。Furノックアウト株は、インビトロで、鉄制限培地中ではあまり増殖せず、動物モデルにおいてその病原性を喪失し(Horsburghら、「J.Bacteriol」(2001年)183:468〜475)、これにより、治療標的としてのFurの可能性が明らかとなる。
6.1.1 細菌株および培養条件
黄色ブドウ球菌ATCC6538NA培養物をBHI培地(Becton Dickenson)中で増殖させ、維持した。50%グリセロールと初期対数期(A600で0.3のOD)の培養物を同じ体積で混合することによって、凍結保存物を調製し、−80℃で凍結した。BHIは、非鉄制限条件に対して使用される培地であり、鉄制限増殖条件の場合は、既に記載のように調製したNRPMI(Skaarら、2004年)であった。
Furの結合部位(SAFur1、5’P−ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA−3’(配列番号30)およびSAFur2、5’P−AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA−3’(配列番号31))および調節配列(Con1、5’P−TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TA−3’(配列番号34)およびCon2、5’P−ACG GAC CCG CAG TCA CCC GGA TCC GTG GCC AA−3’(配列番号35)を含有するオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、TFD配列を含有するプラスミドを作製し、これらをpGEMTEasyベクター(Promega)に連結し、大腸菌DH5α(Invitrogen)へと形質転換した。次に、pGEMTeasyを標的とした標識化プライマーchol−Tef(5’−コレステロール−GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC−3’(配列番号1))およびcy5−Ter(5’−Cy5−AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TGA−3’(配列番号2))を用いてPCRによってTFDを増幅し、エタノール沈殿により精製した。
1mLメタノール中で21mgを溶解させることによってグラミシジン(Sigma)の保存溶液を新たに調製し、使用前に水中で希釈し、増殖培地中でさらに100分の1に希釈して、60nMの最終濃度とした。凍結黄色ブドウ球菌保存物を100分の1、グラミシジン添加済み培地に接種し、室温で10分間温置した。TFD1μgをDOTAP(Roche)2μgと混合し、ベンチ上で室温にて10分間温置することによって、TFD−DOTAP複合体を形成させた。次に、このTFD複合体を接種済み培地と混合し、96ウェル平底プレートに分注し、BioTekプレートリーダー中で振盪しながら37℃で培養することによって増殖を分析した。
個々のウェルからの細胞をPBS(リン酸緩衝食塩水)中で2回洗浄し、100μLの水中で再懸濁した。各qPCR反応において各試料1μLを使用し、ROX(Invitrogen)0.5μLを添加したSYBR Green DNA混合液12.5μL中で、TFD(TefおよびTer;配列番号1および2)または16S rRNA(stypF、5’−ACG GTC TTG CTG TCA CTT ATA−3’(配列番号36);stypR、5’−TAC ACA TAT GTT CTT CCC TAA TAA−3’(配列番号37))の何れかを増幅させるためのプライマーとDNA標準物質または試料を混合した。得られたデータを使用して、ゲノム1個当たりに存在するTFD数を計算した。
RNA Protect試薬(Qiagen)で培養物を処理し、記載のように細菌を回収し、−80℃で保存した。100μg/mLリソスタフィンを含有するTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA)100μL中で細胞ペレットを再懸濁し、37℃で30分間温置して細胞を溶解した。RLT緩衝液700μLを添加し(Qiagen RNA抽出キット)、製造者のプロトコールに従いRNAを回収した。室温にて15分間、Invitrogen DNaseIを用い、25μL中でRNA試料2.5μgを1.25U DNAseIと混合して、残存DNAを全て消化した。25mM EDTA2.5μLを添加し、65℃で10分間加熱することによって、DNAseI酵素を不活性化し、ランダムプライマー合成(NEB Protoscript)を用いたcDNA合成に対してこの処理済RNAを使用した。標準的リアルタイムPCR法を用い、cDNAを使用して、fhu遺伝子に対するプライマー(qSAfhuF、5’−CGT CAA TCA TTG GTC CTA ACG GCT GC−3’(配列番号38);qSAfhuR、5’−GCC ATC TGC TAC TTC AGG TGA TTG AGG−3’(配列番号39))を用い、16s rRNAのレベル(プライマーstypFおよびstypR;配列番号36および37を使用)を用いて正規化して、相対的転写を定量した。
6.2.1 非鉄制限培地中でのFur TFDの形質移入
鉄利用率は、59種類の黄色ブドウ球菌遺伝子(そのうち17種類は、Fur制御されることが分かっている(Allardら、「Microbiol.Infect.」(2006年)8:1679〜1690;Xiongら、「J.Infect.Dis.」(2000年)181:1020〜1026;Horsburghら、「J.Bacteriol.」(2001a)183:468〜475))の制御に影響を与える。Furはまた、酸化ストレス耐性に必要とされる触媒をコードするkatAを含む一部のPer−制御を受ける遺伝子の正のレギュレーターとしても作用し(Horsburghら、「Infect.Immun.」(2001b)69:3744〜3754;Morrisseyら、「Infect.Immun.」(2004年)72:972〜979)、したがって、結果的に、fur変異体は、その、毒性のあるヒドロキシラジカル形成阻止能に支障をきたしている。これらの幅広く複雑な制御特性は、黄色ブドウ球菌fur変異体のビルレンス低下の主な原因であり得る。Fur活性を調節するためにTFD法を適用可能であるかを評価するために、Fur結合部位(これは、黄色ブドウ球菌のfhuプロモーターにおいて行われるフットプリンティング実験により既に同定されていた(Xiongら、2000年))を組み込むTFDを設計した。対照TFDは、黄色ブドウ球菌ゲノムには存在しない類似ヌクレオチド組成物の無関係な配列から構成され;これは、Fur TFDの作用が配列特異的であるか否かおよび形質移入手順のみにより生じる死滅効果があるか否かを立証するためであった。各ヌクレオチド配列を大腸菌ベクターpGEMTEasyに連結し、得られたプラスミドを挿入部位に隣接するプライマーとともに使用して、PCRによりTFDを作製した。このプライマーは、通常どおり、一部はエキソヌクレアーゼからTFDを保護することによりTFDの安定性を向上させるために、5’末端を修飾したが、また、コレステロール(フォワードプライマー)およびcy5色素(リバースプライマー)でもその分子を官能化した。故に、TFDの全長は、Fur TFDの場合は60bpであり、対照TFDの場合は62bpであった。
Fur_TFDが、Furに結合し、fhuプロモーターにFurが結合することを妨害するように作用している場合、fhu遺伝子の抑制が解除されるはずであることが予想される。これを調べるために、Fur_TFDで処理した試料中に存在するfhu転写産物のコピー数(リボソームDNAに対して標準化)を対照試料と比較した(図10B)。図9で示される試料から単離したRNAにおいて定量的リアルタイムRT−PCRを行い、Fur_TFDがfhu転写に対して予想される変化をもたらしたことが分かった:対照試料の場合よりも5倍高かったことが立証された。故に、病原性に対して必須であることが知られている黄色ブドウ球菌中の遺伝子発現のパターンを変化させるために、特異的TFDの形質移入を使用することができる。
同じ形質移入プロトコールを用いて、鉄制限培地中で培養した黄色ブドウ球菌にFurおよび対照TFDを導入した(Skaarら、「Science」(2004年)305:1626〜8)。BHI中での増殖と比較した場合、予想されるように、この培地中での増殖が遅延した。しかし、Fur TFDにより形質移入を行った培養物は、実験中を通じて、増殖の徴候を何ら示さず(図11)、このことから、鉄制限条件下での鉄制御のかく乱は、増殖に悪影響を及ぼすことが分かり、Furノックアウト変異体で見られた結果が再現された(Horsburghら、2001a)。
Sig TFDはMRSA株の増殖を阻害する
実施例5.1におけるように、コレステロール/Cy5で標識したデコイポリヌクレオチドを調製した。典型的には、次に、Sig TFD1μgをリポソーム形質移入試薬DOTAP(1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン;Roche)0.3μLと複合体形成させ、室温で10分間温置した。96ウェルプレート(各ウェルが、60nMグラミシジン(Sigma Corporation、カタログ番号G5002)を添加したBHI培地(Becton Dickinson)からなる培養液200μLを含有する)を用いて、細菌細胞の増殖におけるそれらの影響を調べるためのアッセイを行った。様々な濃度の、TFDと複合体化した、コレステロール/Cy5標識デコイ1μLを各ウェルに添加し、メチシリン耐性株(MRSA)であると判定された黄色ブドウ球菌の臨床分離株の細菌増殖に対する影響をモニタリングした。温置中、間隔を置いて、培養液の吸収を測定することにより、増殖をモニタリングした。このプレートを振盪しながら37℃で温置し、プレートリーダーを用いて吸収読み取り(450nM)を行った。
Sig TFDは、EMRSA15(臨床分離流行株)に対する抗生物質の作用を増強する
実施例9.1(下記参照)に記載のように、Sigダンベル型TFDを調製した。実施例5.2に記載のように、よく特徴が分かっているMRSA株であるEMRSA15を用いて増殖アッセイを行った。この株は、メチシリン(この抗生物質2mg/mL中で増殖可能)、0.5mg/mLエリスロマイシンおよび0.5mg/mLシプロフロキサシンに対して耐性を示す(PorterおよびDamani、「J.Hospital Infection」(2007年)65:88)。
ダンベル形状のSig TFDは臨床分離MRSA株の増殖を抑制する
9.1 ライゲーションによるTFDダンベルの調製(DB−TFD)
それぞれ黄色ブドウ球菌代替シグマタンパク質の認識部位の一方の鎖を含有する2種類のオリゴヌクレオチドを合成した。この分子の何れかの末端で、低分子ヘアピンループは、この分子を分解から保護するように作用した。各オリゴヌクレオチドを250pmol/μLの濃度でdH2O中で再懸濁した。
配列番号41−SigDB_SA3:P−CCG TCT TTT TGA CGG TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C
配列番号42−SigScr_SA1:CTTGG TTTTT CCAAG TAG AAA GAA GAT TTA GGG CGA T TTT ATA ATA TAT
配列番号43−SigScr_SA2:CCG TCT TTT TGA CGG ATA TAT TAT AAA ATC GCC CTA AAT CTT CTT TCT A
であった。
ダンベル形状のSig TFDおよび臨床分離MRSA株を用いて、実施例5.1に記載のように、増殖アッセイを行った。
WalR DB−TFDはEMRSA15の増殖を阻止する
10.1 WalR結合部位を含有するDB TFDの調製
WalRの結合配列をダンベル型オリゴヌクレオチドに組み込み、実施例9.1に記載のように調製した。これらのリン酸化オリゴヌクレオチドの配列は:
配列番号44−WalRDB2.1:CTTGG TTTTT CCAAG TAA TGA ATG A GTT TAA AGC CCA TGT AAA AG GGG TAT CAG TAC
配列番号45−WalRDB2.2:CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT TTA CAT GGG CTT TAA ACT CAT TCA TTAであった。
配列番号46−WalRDB3.1:P−CTTGG TTTTT CCAAG GTA ATA TGA C AAG ATT GTA AAT GAC CTA GTT GAG AG ATGCCA
配列番号47−WalRDB3.1:P−CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TACであった。
グラミシジンの代わりに0.5〜2.5pg/mLのリソスタフィンを培地に添加したことを除き、実施例7.1に記載のように、増殖アッセイを行った。リソスタフィンは、黄色ブドウ球菌の細胞壁に特異的であるリゾチーム様酵素である。
WalR TFDはマウス敗血症モデルにおけるMRSAの増殖を阻害する
この実施例で使用したTFDは、二成分系WalKRの作用を阻害する。当該タンパク質は、細胞壁代謝、特にペプチドグリカン合成に関与する遺伝子の低分子レギュロンの発現を調節する必須シグナル伝達経路を形成する。
11.1.1 細菌株および増殖
BHI培地(Becton Dickenson)中で、黄色ブドウ球菌EMRSA16培養物を増殖させ、維持した。50%グリセロールと初期対数増殖期(A600で0.3のOD)の培養物を同じ容量で混合し、−80℃で凍結することによって、凍結保存物を調製した。
既に記載のように、ダンベル形状になるようにTFDを調製した(Ahnら、2003年)。リン酸化オリゴヌクレオチドの対を連結して、lytMのプロモーターに存在するようなWalRタンパク質の結合部位を含有するTFD(WalR_TFD)または結合部位のスクランブル型を含有するTFD(Scr_TFD)を形成させることによって、TFDを調製した。T4 DNAリガーゼ緩衝液(New England Biolabs)およびT4 DNAリガーゼ400U中で100pmol/μLの最終濃度となるようにこれらのオリゴヌクレオチドを再懸濁し、16℃で一晩温置した。翌朝、反応緩衝液に10UエキソヌクレアーゼI(NEB)を添加し、37℃で30分間消化し、その後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。水中で1mMの濃度になるようにTFDを再懸濁した。
配列番号48−WalR1:5’−P−CTT GGT TTT TCC AAG TAA TGA ATG AGT TTA AAG CCC ATG TAA AAG GGG TAT CAG TAC−3’および
配列番号49−WalR2:5’−P−CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT TTA CAT GGG CTT TAA ACT CAT TCA TTA−3’であった。
配列番号46−WalRDB3.1:5’−P−CTT GGT TTT TCC AAG GTA ATA TGA CAA GAT TGT AAA TGA CCT AGT TGA GAG ATG CCA−3’および
配列番号47−WalRDB3.1:5’−P−CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TAC−3’であった。
TFD1μgをDOTAP(Roche)2μgと混合し、ベンチ上で室温にて10分間温置することによって、TFD−DOTAP複合体を形成させた。次に、10ng/mLリソスタフィン(Sigma;L9043)を添加した接種済み培地とこのTFD複合体を混合し、96ウェル平底プレートに分注し、BioTekプレートリーダー中で振盪しながら37℃で培養することによって、増殖を分析した。
Euprotec(UK)によりマウス敗血症実験が行われた。この実験で使用したマウス(雄CD1マウス)は、Charles River(Margate UK)により提供され、特定病原体不在であった(配達時16〜18g)。マウスは全て、実験開始時に体重が22〜25gであった。
忍容性試験のために、1処置群当たり2匹のマウスの群(したがってこの試験に対して合計10匹)で、マウスを処置した。この試験の第1日目に全マウスの体重測定を行い、無作為に飼育箱に入れた。これらのマウスに対して、10mL/kgを用いて静脈内投与により次の処置を行い、5種類の処置群は:100μM WalR_TFD;2.5mM DOTAP;6.3μg/mLリソスタフィン;TFD/DOTAP/リソスタフィンの混合物;食塩水であった。処置後、100時間にわたりこれらのマウスの体重測定を毎日行い、その後、これらを安楽死させ、肺、肝臓、脾臓および腎臓を摘出し、目視検査および重量測定を行った。
PK試験のために、1つの時点当たり3匹のマウスとなる群(したがってこの試験に対して合計24匹)で、マウスを処置した。5nM/kg WalR_TFD、25nM/kg DOTAP、31.5m/kgリソスタフィンの混合物の静脈内送達によりマウスを処置した。投与後5分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間および24時間の時点で、イソフルオラン麻酔後、心臓穿刺によって、マウスの各セットから採血した。全試料を血漿として回収した(ヘパリンで抗凝固剤処理し、分離前に氷上で保存)。血液回収後、腎臓を摘出し、1mL氷冷PBS中でホモジナイズ処理した。qPCRを用いて生体試料中のTFDを検出した。
組織負荷試験のために、1処置群当たり8匹のマウスとなる群(したがってこの試験に対して合計48匹)で、マウスを処置した。黄色ブドウ球菌EMRSA16の2x10mL培養物を調製し、37℃で一晩、オービタルシェーカー(220rpm)上に置いた。翌日、この黄色ブドウ球菌EMRSA16培養物をシェーカーから取り出し、ペレット化し、2回洗浄し、その後、0.132のOD(1.5x108cfu/mL)になるように食塩水中で再懸濁した。次に、この黄色ブドウ球菌EMRSA16の保存溶液をさらに食塩水中で1:1.5希釈し(1x108cfu/mL)、即ち細菌2.0x107個/マウスとした。次に、1.0x108/mL縣濁液0.2mLを用いて48匹のマウスに感染させた。感染量を確認するために、接種後の残存懸濁液中の1mL当たりの黄色ブドウ球菌EMRSA16細菌数も数えた。感染から1、9時間および17時間後に化合物またはビヒクルの何れかでマウスを処置したが、バンコマイシンの投与は1時間後のみであった。処置物質は、以前のように、DOTAPと5:1のモル比の1nM/kgTFD濃度及び63μg/kgリソスタフィンを用いた、TFD/DOTAP/リソスタフィンの混合物であった。感染から25時間後、全動物の体重測定を行い、次いで安楽死させた。すぐに腎臓を摘出し、氷冷滅菌リン酸緩衝食塩水+0.05%Tween80中でホモジナイズした。CLED寒天上で臓器ホモジネートを定量的に培養し、37℃で最長3日間温置し、コロニー数を数えた。Stats Directを用いて、この培養負荷(culture burden)からのデータをKruskal−Wallis試験により分析した。
11.2.1 WalR TFDは、インビトロでMRSAを迅速に抑制する
保存性が高い2成分系WalK/WalR(YycG/YycFとも呼ばれる)は、遺伝子ノックアウト実験において、黄色ブドウ球菌およびその他のグラム陽性病原体の生存に必須であることが示されている。転写因子WalRの結合部位が、lytM/SA0265を含むレギュロンにおける遺伝子のいくつかのプロモーターで同定されている(Dubrac、Bonecaら、2007年)。WalR_TFDおよび配列が無作為に再編成されたスクランブル型(Scr_TFD)で使用したものは、この型であった。
IV投与後、全薬物が忍容性良好であり、報告すべき急性事象はなかった。処置後、マウスは、苦痛の徴候なく、通常どおり摂餌および摂水した。処置したマウスの体重増加はビヒクル対照マウスと同様であった。剖検からは、腎臓、肺、肝臓またはGI管の全体的な異常は示されなかった。腎臓、肺および肝臓重量は正常範囲内であった。試験化合物は全て、忍容性があり、この忍容性試験で使用した最大用量までのさらなる投与に適している。
比較的穏やかな感染を確実に成立させるために(これは処置に対してより感受性がある)、投与感染用量は、細菌2.0x107個/マウスを目標とした。ビヒクル、Scr_TFD複合体1nM、WalR_TFD複合体1nMまたはバンコマイシン(コロニー形成単位(cfu)を2分の1にするために十分な濃度で使用)の何れかを全身的に投与することによってこれらのマウスを処置した。処置後、これらのマウスを屠殺し、その腎臓内で見られる負荷を測定した(図19)。結果の統計学的分析から、WalR_TFD処置マウスにおいて、Scr_TFD対照と比較した場合に、バンコマイシンにより達成されたものと同程度、負荷量が低下したことが分かった(下記表2)。
FabB TFDによる大腸菌の形質移入によって、脂肪酸合成を阻害する抗生物質に対して細菌が感受性になる
12.1FabB TFDの調製
大腸菌のFabB遺伝子の上流にある、脂肪酸合成酵素の転写レギュレーターであるFadRの結合部位を組み込むように、FabB TFDを設計した。FabB遺伝子は、脂肪酸合成に関与する酵素をコードする(「J.Bacteriology」(2005年)183:5292)。
配列番号50−fabBf:TCT TTA AAT GGC TGA TCG GAC TTG
配列番号51−fabBr:AGT AAG TTT CGA ATG CAC AAT AGC GTAであった。
配列番号52−WhiB7.f:CAC CAG CCG AAA AGG CCA CGG
配列番号53−WhiB7.r:CAA AAA TGG CCA CGG ATC CGG GTGであった。
数ヶ所変更したことを除いて実施例4.1に記載のように、大腸菌細菌培養物の増殖に対するTFDの影響を測定した:使用培地はLBであり;使用した同時形質移入物は、グラミシジンではなく40nMポリミキシンであり;この培地には10μg/mLセルレニン(CER)も添加した。CERは、脂肪酸合成に対して作用する抗生物質である。これは、使用した濃度で、大腸菌の増殖に対して顕著な影響はなかった。
肺炎桿菌のσ54因子に対する認識配列を含有するTFDの形質移入により細菌増殖が遅延する
病原性生物である肺炎桿菌由来の代替シグマ因子σ54の結合部位を含有するPCR TFDを作製し、試験した。無関係の対照TFDの活性と比較して、Sig TFDは細胞増殖を阻害した。σ54は、細菌でのストレス反応の制御を調節するシグマ因子のさらなる例である。
実施例5.1に記載のようにTFDを調製した。使用した、アニーリングされるオリゴヌクレオチドの配列は:
配列番号54−Ks54f:P−CCG ATA AGG GCG CAC GGT TTG CAT GGT TAT A
配列番号55−Ks54r:P−ATA ACC ATG CAA ACC GTG CGC CCT TAT CGG Aであった。
使用培地をM9培地(Sambrookら(1989年)Molecular Cloning、第2版、第3巻、ページA3)に変更して、セクション4.1に記載のように増殖アッセイを行った。この培地には同時形質移入物を何ら添加しなかった。
配列番号56−IKFLKFLKFL−(D−アルギニン)9であった。
黄色ブドウ球菌内のWalR結合部位の存在を検出し、そのコンセンサス配列を推測するためのバイオインフォマティクス分析
黄色ブドウ球菌(SA)ならびに、エンテロコッカス・フェシウム(EF)、肺炎連鎖球菌(SP)、リステリア・モノサイトゲネス(LM)およびミュータンス菌(SM)など、WalR結合部位が存在することが分かったその他の病原性生物における公開されているWalR結合部位の例の有無を調べるために、MEME検索(http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi−bin/meme.cgi)を使用した。
TGT WAW NNN NNT GTA AW(配列番号57)を有するコンセンサス部位が抽出された。
黄色ブドウ球菌内のSigB結合部位の存在を検出し、そのコンセンサス配列を推測するためのバイオインフォマティクス分析
バチルス目(グラム陽性感染物)(この代表的な属としては、バチルス、リステリアおよびスタフィロコッカスが含まれる。)の黄色ブドウ球菌のSigB結合部位のコンセンサス配列に対する一致の存在例を見出すために、(E−値<100で)MEME検索(http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi−bin/meme.cgi)を使用した。
GKT TWA NNN NNN NNN NNN NNK GGT AW(配列番号58)を有するコンセンサス部位が抽出された。
肺炎桿菌内のSig結合部位の存在を検出し、そのコンセンサス配列を推測するためのバイオインフォマティクス分析
Barriosら1999(「Nucl.Acids Res.」22:4305〜4313)に記載のように、肺炎桿菌glnA遺伝子のプロモーター領域から、代替シグマ因子(シグマ54)の結合部位を含有するTFDを取り出し、PCR_TFDに組み込んだ場合に、インビトロで、肺炎桿菌細胞を死滅させることが示された(図24A参照)。
配列番号59−KP_Sig TGG CAC aga ttT CGC Tであった。
配列番号60−TGG NNN NNN WTT TGC W
Claims (22)
- 標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、前記結合部位は遺伝子に機能的に結合しておらず、
前記標的転写因子は、WhiB7、YycG/YycF、Sigma54(もしくはSigA)、Fur、TcdR、Vfr、NtrC、ArsR、TcaA、AgrA、WalR、sigB、Ksig、もしくはfhu、またはこれらのいずれかの機能的変異体もしくはホモログから選ばれ、
前記標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは
(i)細胞の適応機構、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞のストレス機構
のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含み、
二次構造の少なくとも1つのエレメントを含む、デコイポリヌクレオチド。 - 前記標的転写因子が、
(a)細胞の排出ポンプタンパク質、細胞壁の組成、細胞壁密度もしくは細胞壁代謝を決定するタンパク質をコードする1個のまたは複数個の遺伝子、
(b)細胞のストレス応答の1個のまたは複数個の遺伝子、
(c)金属調節タンパク質をコードする1個のまたは複数個の遺伝子、
(d)窒素固定タンパク質をコードする1個のまたは複数個の遺伝子、
(e)病原性タンパク質もしくはビルレンス因子をコードする1個のまたは複数個の遺伝子、
(f)1個のまたは複数個の必須遺伝子、
のうち1つ以上を発現させるためのレギュレーターを含む、請求項1に記載のデコイポリヌクレオチド。 - 前記デコイポリヌクレオチドが、環状二本鎖DNAもしくは直鎖オリゴヌクレオチド、および/または前記転写因子の結合部位の1より多いコピー、および/または前記結合部位に付加的な配列、および/または前記ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾塩基もしくは修飾糖、および/またはプラスミドもしくはプラスミドライブラリーを含む、請求項1または2に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 前記デコイポリヌクレオチドが、前記転写因子結合部位の複数のダイレクトリピートを含む、請求項3に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 前記デコイポリヌクレオチドが、複数の転写因子結合部位を含む、請求項3に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 前記デコイポリヌクレオチドが、少なくとも1つの5’コレステロール修飾を有する直鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項3、4、または5に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 前記デコイポリヌクレオチドが、環状ダンベルを含む、請求項3〜6のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 前記デコイポリヌクレオチドが、プラスミドを含み、当該プラスミドが、スネア配列を含むモノマー配列の1つ以上のコピーを有し、当該スネア配列が前記転写因子結合部位を含み、当該結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、請求項3に記載のデコイポリヌクレオチド。
- デコイポリヌクレオチド中の前記転写因子の結合部位が、配列番号7〜8、18〜27、44、45、48、49、57〜60のいずれかまたはデコイ機能を保持するその変異体もしくはフラグメントを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号57、配列番号58または配列番号60の配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチド。
- 細菌感染の治療用薬剤の製造のための、請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドの使用。
- 前記細菌感染の治療が、1種以上の抗生物質および/または他の抗菌剤の使用を含む、請求項11に記載の使用。
- 細菌感染が、肺炎、菌血症、百日咳、ライム病、ブルセラ症、急性腸炎、敗血症(septicaemia)、野兎病、インフルエンザ、消化器潰瘍、レジオネラ症、淋病、院内感染、敗血症(sepsis)、リケッチア、腸チフス、赤痢、コレラ、疫病、炭疽菌、偽膜性大腸炎、ジフテリア、リステリア病、結核、敗血症(septicemia)から選ばれることを含む、請求項11または12に記載の使用。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを、任意に1種以上の抗生物質および/または抗菌剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドを、任意に1種以上の抗生物質および/または抗菌剤と組み合わせて含む、洗浄組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドと、1種以上の抗生物質および/または抗菌剤とを含むキットであって、前記デコイと前記1種以上の抗生物質および/または抗菌剤とは、殺菌、細菌増殖阻害、細菌のビルレンス低減のために組み合わせて使用される、キット。
- 殺菌する、細菌増殖を阻害する、または細菌ビルレンスを低減させる生体外方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドを、任意に1種以上の抗生物質および/または抗菌剤と組み合わせて適用することを含む、方法。
- 原核細胞の生存能力を低減させる方法であって、
(a)請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドを提供すること、
(b)1個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した前記転写因子の結合部位を含む原核細胞に前記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
前記デコイポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における前記結合部位への前記標的転写因子の結合を低減させ、前記機能的に結合した1個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、かつ
前記標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは
(i)細胞の適応機構、
(ii)細胞の固有の抗生物質耐性機構、
(iii)細胞のビルレンス因子、
(iv)細胞のストレス機構
のうち1つ以上をコードする1個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含む、方法。 - 原核生物の抗生物質感受性を増加させる方法であって、
(a)請求項1〜10のいずれか1項に記載のデコイポリヌクレオチドを提供すること、
(b)1個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した前記転写因子の結合部位を含む原核細胞に前記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
前記デコイポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における結合部位への前記標的転写因子の結合を低減させ、前記機能的に結合した1個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより前記細胞の抗生物質感受性を増加させ、かつ
前記標的転写因子は、細胞の固有の抗生物質耐性機構をコードする1個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含む、方法。 - 生存能力を低減させることが、
(i)ストレス応答などの細胞の適応応答を阻害すること、
(ii)抗生物質に対する細胞の感受性を増加させること、
(iii)1個以上の必須遺伝子の発現を阻害すること、
(iv)1個以上のビルレンス遺伝子の発現を阻害すること、のうち1つ以上を含む、請求項18に記載の方法。 - 原核生物が菌類である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記菌類が病原性である、請求項21に記載の方法。
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