ES2444640T3 - Señuelos de factores de transcripción - Google Patents

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Abstract

Un método no terapéutico para reducir la viabilidad de células procariotas, comprendiendo el método: (a) proporcionar un polinudeótido set'iuelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana (una secuencia señuelo); (b) introducir el polinucle6tido señuelo en una célula procariota que comprende un sitio de unión para el factor de transcripción , unido operativamente a un gen o genes; en el que la introducción del polinucleótido set'iuelo reduce la unión del factor de transcripción diana al sitio de unión en la célula y causa una alteración en la expresión del gen o genes unidos operativa mente; y en el que el factor de transcripción diana comprende un regulador de la expresión de un gen o genes que codifican uno o más de: (i) una respuesta celular adaptativa; (ii) un mecanismo celular intrlnseco de resistencia a antibióticos; (iii) un factor celular de virulencia; (iv) una respuesta celular a estrés; o (v) un gen celular esencial.

Description

Señuelos de factores de transcripción
la presente invención se refiere a métodos y composiciones para modutar fenotipos de procariotas, particutarmente bacterias patogénicas, usando secuencias señuelo de factores de transcripción.
El control del crecimiento y virulencia bacteriano plantea un problema creciente, particularmente en aplicaciones médicas y veterinarias, y puede convertirse en un reto importante para la salud pública. los antibióticos para uso frente a bacterias patogénicas son muy conocidos en la técnica. Sin embargo, el uso extenso de dichos antibióticos ha dado lugar al surgimiento de bacterias que son resistentes al menos a uno, y en algunos casos, a múltiples antibióticos (las denominadas cepas resistentes a múltiples fánnacos). la situación se exacerba por una disminución en el número de antibióticos convencionales que se descubren y que están en desarrollo. De hecho, la resistencia a antibióticos es un reto importante para la investigación antibacteriana y amenaza la potencia de los antibióticos comercializados asi como los que todavla están en desarrollo. Consecuentemente, existe una necesidad para nuevos agentes anti-bacterianos que puedan usarse para abordar la diseminación e infección bacteriana.
Como un ejemplo, Staphylococcus aureus representa un reto importante para la salud global causando numerosas enfermedades humanas y animales, con un amplio espectro de gravedad desde infecciones en la piel hasta sepsis mortal por choque tóxico (lowy, New Engl. J. Med. (1998) 339: 520-532). Se estima que el 20% de la población humana es portador de las bacterias en infección de tejido blando, frecuentemente con caracleristicas clinicas no perceptibles, a partir de donde las bacterias pueden penetrar en el cuerpo para infectar la sangre y posterionnente los tejidos óseo y cardiaco (Gordon y lowy, Clin. Infec!. Dis. (2008) 40 (SS): S350-9). Aunque en un principio se pensó que era un patógeno extracelular, está surgiendo una evidencia sustancial que sugiere que S. aureus puede evitar la acción antibacleriana o el engullimiento por macrófagos persistiendo intercelularmente (Garzoni y Kelley, Trends Microbio!. (2009) 17: 59-65), complicando potencialmente su tratamiento. los mecanismos de resistencia también se han adquirido o se han desarrollado desde la primera exposición a antibióticos hasta tal grado que las cepas resistentes a múltiples fánnacos son ahora la nonna en la clinica (Hawkey, J. Antimicrob. Chemother. (2008) 62 (S1): il-9), lo que ha limitado adicionalmente las opciones de tratamiento.
Existen varias razones por las que S. aureus es un patógeno tan versátil: posee mecanismos para evadirse de la respuesta inmune del huésped (Foster, Na!. Rev. Microbio!. (2005) 3: 948-958); puede producir una amplio rango de detenninantes de virulencia (Novick, Mol. Micro. (2003) 48: 1429-1449); tiene la capacidad de catabolizar los tejidos del huésped (Vojtov et al. (2002) Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 99: 10102-10107) y puede adaptarse fácilmente a entornos con nutrientes limitados y anóxicos encontrados en el interior del huésped (Haselbeck et al, Curr. Phann. Des. (2002) 8: 1155-1172). Muchos de estos procesos están controlados a nivel de la transcripción y como tales actualmente no son las dianas de los antibióticos tradicionales (que actúan mayoritariamente en la sintesis de la pared celular, proteinas o ADN).
las infecciones por Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A: GAS) pueden tratarse habitualmente con muchos antibióticos diferentes. El tratamiento temprano puede reducir el riesgo de muerte por la enfermedad invasiva streptococcal del grupo A. Sin embargo, induso el mejor cuidado médico no previene la muerte en cada caso. Para aquellos con una enfermedad muy grave, puede necesitarse el cuidado paliativo en una unidad de cuidado intensivo. Para las personas con fascitis necrosante, frecuentemente es necesaria la cirugra para eliminar el tejido dañado. Han surgido cepas de S. pyogenes resistentes a antibióticos macrólidos, sin embargo todas las cepas permanecen uniformemente sensibles a penicilina.
la resistencia de Streptococcus pneumoniae a penicilina y otras bela-Iactamas se está incrementando en todo el mundo. El mecanismo principal de resistencia implica la introducción de mutaciones en genes que codifican proteínas de unión a penicilina. Se piensa que la presión selectiva juega un papel importante y el uso de antibióticos beta-Iactama se ha implicado como un factor de riesgo para infección y colonización. streptococcus pneumoniae es responsable de neumonia, bacteremia, otitis media, meningitis, sinusitis, peritonitis y artritis.
la neumonia resistente a penicilina causada por Streptococcus pneumoniae (conocida comúnmente como pneumococcus), se detectó por primera vez en 1967, como lo fue la gonorrea resistente a penicilina. la resistencia a sustitutos de penicilina también se conoce más allá de S. aureus. Hacia 1993 Escherichia coIi era resistente a cinco variantes de f1uoroquinolona. Myoobacterium tuben;ufosis es resistente comúnmente a isoniazida y rifampina y algunas veces resistente universalmente a los tratamientos comunes. Otros patógenos que muestran alguna resistencia incluyen Salmonelfa, Campylobactery Streptococci.
Enterococcus faecium es otro microorganismo multirresistente encontrado en hospitales. los Enterococcus resistentes a penicilina se observaron en 1983, enterococcus resistentes a vancomicina (VRE) en 1987 y Enterococcus resistentes a linezolida (lRE) al final de la década de 1990.
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista altamente prevalente. Una de las características más preocupantes de P. aeruginosa consiste en su baja susceptibilidad a antibióticos. Esta baja susceptibilidad es atribuible a una acción concertada de bombas de eflujo multifánnaco con genes de resistencia a antibióticos codificados cromosómicamente (por ejemplo, mexAB-oprM, mexXY etc) y la baja permeabilidad de las cubiertas celulares bacterianas. Además de la resistencia intrinseca, P. aeruginosa desarrolla fácilmente resistencia adquirida bien por mutación en genes codificados cromosómicamente o por transferencia génica horizontal de determinantes de resistencia a antibióticos. El desarrollo de resistencia a múltiples fármacos por aislados pele P. aeruginosa requiere varios eventos genéticos diferentes que incluyen la adquisición de diferentes mutaciones y/o la transferencia horizontal de genes de resistencia a antibióticos. la hipermutación favorece la selección de resistencia a antibióticos dirigida por mutación en cepas de P. aeruginosa que producen infecciones crónicas, mientras que el agrupamiento de varios genes de resistencia a antibióticos diferentes en integrones favorece la adquisición concertada de determinantes de resistencia a antibióticos. Algunos estudios recientes han mostrado que la resistencia fenollpica asociada con la formación de biopelicula o con el surgimiento de variantes de colonia pequena puede ser importante en la respuesta de poblaciones de P. aeruginosa al tratamiento con antibióticos (Comelis P. (editor) Pseudomonas: Genomics and Molecular-Biology (1-ed.) (2008) Caister Academic Press).
C/ostridium difficile es un patógeno nosocomial que causa enfermedad diarreica en hospitales de todo el mundo. Se indicó que C. difficile resistente a clindamicina era el agente causante de grandes brotes de enfermedad diarreica en hospitales en Nueva York. Arizona. Florida y Massachusetts entre 1989 y 1992 (Johnson S. et al, New England Journal of Medicine (1999) 341 : 1645-1651). los brotes dispersos geográficamente de cepas de C. difficile resistentes a antibióticos fluoroquinolona, tales como ciprofloxacina y levofloxacina, también se indicaron en América del Norte en 2005 (loo V. et al N. Engl. J. Med. (2005) 353 (23): 2442-9).
E. eoli y Salmonella provienen directamente de comida contaminada. De la carne que está contaminada con E. coli. el ochenta por ciento de las bacterias son resistentes a uno o mas fármacos preparados; causa infecciones de vejiga que son resistentes a antibióticos ("HSUS Fact Sheen. Salmonella se encontró por primera vez en los seres humanos en los años 70 y en algunos casos es resistente a tantos como nueve antibióticos diferentes rHSUS Facl Sheef). Cuando ambas bacterias se diseminan, surgen afecciones serias para la salud. Mucha genle se hospitaliza cada ano después de haber sido infectada y como resullado algunos mueren.
El 5 de noviembre de 2004, los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) indicaron un número creciente de infecciones sanguineas por Acinetobacter baumannii en pacientes en instalaciones médicas militares en las que se trataron integrantes de las Fuerzas Armadas lesionados en la región Iraq/Kuwait y en Afganistán. la mayor parte de éstos mostraron resistencia a múltiples fármacos con unos pocos aislados resistentes a todos los fármacos ensayados.
Norris et al (Gene Therapy (2000), 7: 723-725) revisan estrategias de terapia génica usando bacteriófagos para combatir bacterias que son resistentes a múltiples antibióticos, mientras Cranenburgh et al (Nucl. Acid Res. (2001) 29(5): e26) describen la creación de dos cepas de E. eoll que permiten el uso de titulación de represor, en lugar de selección con antibiótico, para la selección y propagación de plásmidos.
las terapias basadas en ADN constituyen una nueva clase de agentes anti-bacterianos que se diseñan para funcionar en dianas génicas que son esenciales para la viabilidad o patogenicidad. Dichas terapias son potencialmente aplicables a una amplia diversidad de patógenos y se anticipa que el desarrollo de resistencia a estos terapéuticos, a través de la modificación del sitio diana, es un evento altamente Improbable. Además, los agentes tienen las ventajas de tiempos de desarrollo potencialmente más rápidos y actúan simultáneamente en un número de dianas nuevas sin resistencia.
las terapias basadas en ADN tienen el potencial de superar las limitaciones de las terapias existentes porque pueden disenarse para tratar potencialmente a cualquier patógeno bien previniendo la expresión de un mecanismo de resistencia a antibióticos o inhibiendo el crecimiento mediante la regulación a la baja de genes esenciales o adaptativos. Ademas, es improbable que las bacterias desarrollen resistencia a estos agentes ya que esto requerirla mutaciones simultáneas que afectaran tanto al factor de transcripción como a su o sus sitios de unión afines. Esto es particularmente cierto para agentes que controlan varios genes esenciales.
los Senuelos de Factores de TranScripción (TFD) son uno de dichos terapéuticos basados en ADN. los oligonudeótidos senuelo se diseñan para mimetizar los sitios de unión de factores de transcripción y prevenir que estos últimos se unan a sus dianas genómicas afines. con una modificación consecuente de la expresión génica (Mann y Dzau. J. Clin. Investigation (2000) 106: 1071-1075).
Su utilidad se ha demostrado principalmente en sistemas eucariotas. en los que un estimulo para su desarrollo fue su potencial para funcionar como nuevas clases de agentes terapéuticos (Mann y Ozau (2000». Para este fin. los oligonucleótidos señuelo se han usado para demostrar que el factor de transcripción EF2 reprime la proliferación del músculo liso en ratas (MorisMa et al, Proc. NaU. Acad. Sci. USA (1995) 95: 5855-5859); para bloquear la proliferación mediada por STAT3 de carcinomas (leong et al, Proc. NaU. Acad. Sci. USA (2003) 100: 4138-4143); Y para mostrar que tomar como diana el elemento de respuesta AMPc puede controlar la proliferación del cáncer in vivo (Park et al, J. Biol. Chem. (1999) 274: 1573-1580).
los TFD tienen ventajas únicas sobre otros terapéuticos basados en ADN. Su mecanismo de acción es sencillocontrolan la expresión génica secuestrando factores de transcripción, previniendo que estos últimos se unan a promotores inundando la célula con numerosas copias de las secuencias de unión especificas (por esto, el término ~senuelos·). Esto contrasta con las estrategias antisentido en las que las dianas son diflciles de definir debido a la estructura secundaria compleja del ARNm. En comparación con las estrategias antisentido, los TFD tienen las ventajas adicionales de que actúan rápidamente, previniendo la expresión de genes, mientras que las estrategias antisentido está dirigida a las consecuencias de la expresión. Como resultado, los TFD son eficaces a concentraciones mucho más bajas, porque una única interacción TFD-factor de transcripción puede bloquear la transcripción de un único gen que de otra manera puede dar lugar a muchos miles de copias de ARNm, que constituyen las dianas para la estrategia antisentido.
Por lo que saben los inventores, se han hecho dos publicaciones del uso de señuelos en procariotas. En la primera, se usó un oligonudeótido señuelo rico en AT, diseñado para mimetizar un elemento rico en AT en el promotor de los genes de ribulosa 1 ,5,-bifosfato carboxilasafoxigenasa (rbc), para alterar la regulación por C02 de la expresión de los genes rbc en Cyanobacterium (Onizuka et al, FEBS Lett. (2003) 542: 42-46).
En la segunda publicación, se usaron oligonucleótidos señuelo para identificar nuevas secuencias reguladoras en cis en el promotor de actll-orf4 en S. coefico/or A3(2), que codifica el activador especIfico de la ruta para la producción del antibiótico actinorhodina (McArthur y Bibb, PNAS (2008) 105; 1020-1025).
La presente invención se ha concebido ante estos antecedentes.
Los inventores han usado la tecnologia TFO para alterar la regulación de rutas celulares, respuestas y mecanismos de resistencia en procariotas con el fin de alterar la viabilidad celular. Por ejemplo, los métodos pueden usarse para alterar uno o más de los fenotipos de resistencia a antibióticos, respuestas celulares adaptativas a condiciones medioambientales, virulencia celular y metabolismo celular esencial. Haciendo esto, los inventores han proporcionado medios para tralar infecciones bacterianas y contener el crecimiento bacteriano.
De acuerdo con esto, en un aspecto la Invención reside en el uso de factores señuelo de la transcripción (TFD) para reducir la viabilidad de células procariotas.
En particular, la invención engloba un método para reducir la viabilidad de células procariotas, comprendiendo el método:
(a)
proporcionar un polinucle6tido señuelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripdón diana (una secuencia señuelo);
(b)
introducir el polinuc!eótido señuelo en una celula procariota que comprende un sitio de unión para el factor de transcripción, unido operativamente a un gen o genes;
en el que la introducción del polinucleótido señuelo reduce la unión del factor de transaipción diana al sitio de unión en la célula y causa una alteración en la expresión del gen o genes unidos operalivamente;
y en el que el factor de transcripción diana comprende un regUlador de la expresión de un gen o genes que codifican uno o más de:
(i)
una respuesta celular adaptativa;
(ii)
un mecanismo celular inlrlnseco de resistencia a antibióticos;
(iii) un factor celular de virulencia;
(iv)
una respuesta celular al estrés; o
(v)
un gen celular esencial. En otro aspecto, la invención proporciona: -un método para incrementar la susceptibilidad procariota a antibióticos, comprendiendo el método:
(a)
proporcionar un polinucle6tido señuelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana (una secuenda señuelo);
(b)
introducir el polinudeótido señuelo en una célula procariota que comprende un silfo de unión para el factor de transaipción, unido operativamente a un gen o genes;
en el que la introducción del polinucleótido señuelo reduce la unión del factor de transcripción diana al sitio de unión en la célula y causa una alteración en la expresión del gen o genes unidos operalivamente, incrementando de esta manera la susceptibilidad a antibióticos de la célula;
y en el que el factor de transcripción diana comprende un regulador de la expresión de un gen o genes que oodifican uno o más de:
(i)
una respuesta celular adaptativa;
(ii)
un mecanismo celular intrlnseco de resistencia a antibióticos;
(iii) un factor celular de virulencia;
(iv) un gen celular esencial.
También se describe:
-
un polinude6tido sel'luelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana, en el que el sitio de unión no está unido operativamente a un gen, y en el que el factor de transcripción corJl)rende un regulador de la expresión de un gen o genes que codifican uno o más de:
(i)
una respuesta celular adaptativa:
(ii)
un mecanismo celular intrlnseco de resistencia a antibiótioos:
(iii) un factor celular de virulencia;
(IV) un gen celular esencial.
El factor de transcripción diana puede seleccionarse de: lJI/hiB7 (SEO ID NOs: 5 y 9); FabB (SEO ID NO: 6); LytM (SEO ID NO: 7); Ssa (SEO ID NO: 8); FadR (SEO ID NO: 10); YycGfYycF (SEO ID NOs: 11 y 12); Sigma 54 (o SigA) (SEO ID NOs: 13 y 14);Fur (SEO ID NOs: 15, 16 Y 17); TcdR (SEO ID NO: 18); Vfr (SEO ID NOs: 19, 20 Y 21); NtrC (SEO ID NO: 22); ArsR (SEO ID NOs: 23 y 24); TcaA (SEO ID NO: 25); AgrA (SEO ID NOs: 26 y 27); WalR (SEO ID NOs: 44, 45, 48, 49 Y 57); sigB (SEO ID NO: 58); o Ksig (SEO ID NOs: 59 y 60); o una variante u homólogo funcional de cualquiera de éstos.
También se describe un polinude6tido sei"luelo OOm:) se ha descrito anterionnente que comprende más de un sitio de unión para mas de un factor de transcripción diana.
-
una célula que oomprende un polinude6tido senuelo exógeno, comprendiendo el poIinude6tido un silio de unión para un factor de transcripción diana que no está unido operativa mente a un gen; en el que la célula comprende un sitio de unión para el factor de transcripción unido operativamente a un gen o genes; y en el que el factor de transcripción diana comprende un regulador de la expresión de un gen o genes que codifican uno o más de:
(i)
una respuesta celular adaptativa;
(ii)
un mecanismo celular intrlnseco de resistencia a antibióticos; (jii) un factor celular de virulencia;
(iv)
un gen celular esencial.
-
un método para tralar una infección bacteriana en un sujeto que comprende administrar un polinucleótido senuelo de la invención, opcionalmente en combinación con uno o más antibióticos ylo agentes antibacterianos.
-
un método ex vivo para matar bacterias, inhibir el crecimiento bacteriano o reducir la virulencia bacteriana, comprendiendo el método aplicar un polinude6tido sel'luelo de la invención, opcionalmente en combinación con uno
o más antibióticos ylo agentes antibacterianos.
-
una composición fannacéutica que comprende un polinude6tido sef'iuelo de la invención y un excipiente o vehiculo fannacéuticamente aceptable, opcionalmente en combinación con uno o más antibióticos ylo agentes antibacterianos.
-
una composición desinfectante que comprende un polinucle6tido sel'luelo de la invención, opcionalmente en combinación con uno o más antibióticos ylo agentes antibacterianos.
-
una composición de lavado que comprende un poIinucle6tido set'\uelo de la invención, opcionalmente en oombinaci6n con uno o más antibióticos ylo agentes antibacterianos.
-
un kit que oomprende un polinude6tido sel'luelo de la invención, y uno o más antibióticos ylo agentes antibacterianos, en el que el senuelo y el uno o más antibióticos ylo agentes antibacterianos son para uso combinado para matar bacterias, inhibir el crecimiento bacteriano o reducir la virulencia bacteriana.
-
un método para reducir la virulencia de una célula procariota, comprendiendo el método:
S
(a)
proporcionar un polinucle6tido se/'luelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana;
(b)
introducir el polinucleótido señuelo en una célula procariota que comprende un sitio de unión para el factor de transcripción, unido operativamente a un gen o genes;
en el que la introducción del polinudeólido se/'luelo reduce la unión del factor de transcripción diana al sitio de unión en la célula y causa una alteración en la expresión del gen o genes unidos operativamente, reduciendo de esta manera la virulencia;
y en el que el factor de transcripción diana comprende un regulador de la expresión de un gen o genes que codiftcan uno o más de:
(i)
una respuesta celular adaptativa;
(ii)
un mecanismo celular intrinseco de resistencia a antibióticos;
(iii) un factor celular de virulencia;
(iv) un gen celular esencial.
-
un polinucle6tido se/'luelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana, en el que el sitio de unión tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 57, SEQ 10 NO: 58 o SEQ ID NO: 60.
-
uso de un polinucle6tido sel'luelo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 57, SEQ 10 NO: 58 o SEQ ID NO: 60 en el tratamiento de una infección bacteriana.
En general, una secuencia de señuelo de factor de transcripción (TFO) (o secuencia señuelo) comprende un sitio de unión de factor de transcripción que comprende o compite con una secuencia reguladora en cis nativa o endógena en una célula para la unión a un factor de transcripción afin en la célula. Cuando se introduce en células huésped aderuadas que comprenden la secuencia reguladora en cis (por un método descrito en la presente memoria o de otra manera) la secuencia señuelo compite con la secuencia reguladora en cis en una célula para la unión al factor de transcripción afino Dicha competición reduce la unión del factor de transcripción a la secuencia reguladora en cis en la célula y altera la expresión de un gen o genes cuya expresión está regulada por la unión del factor de transcripción a la secuencia reguladora en cis. la función señuelo como se usa en la presente memoria se refiere a la capacidad de una secuencia para competir con una secuencia reguladora en cis para la unión a un factor de transcripción afin de esta manera.
Una secuencia o elemento regulador en cis se refiere generalmente a una secuencia de nucleótidos que ocurre en 5' (5') o en 3' (3') del sitio de oomienzo de la transcripción de un gen o genes y que funciona para regular la expresión del gen o genes. Tlpicamente, una secuencia reguladora en cis comprende un sitio de unión para una proteína (factor de transcripción) y la unión de la protelna regula la transcripción del gen o genes dados. la unión de la proteína a la secuencia resulta directamente o indirectamente en la modulación de la expresión del gen o genes. Por ejemplo, la protelna unida puede interaccionar con otra protelna unida a una región cercana que se necesita para la transcripción y el anclaje de la proteína en la posición correcta, o puede inhibir la unión de otra proteína que es necesaria para la transcripción. Tipicamente, la secuencia o elemento regulador en cis ocurre en ta región promotora de un gen, pero no es raro en procariotas que las secuencias reguladoras en Gis estén situadas cientos de pares de bases en 5' o en 3' de tos genes en los que influyen.
Una secuencia reguladora en cis puede ser represora (inhibe o reduce la transcripción del gen o genes cuando está unida por un factor de transcripción) o activadora (activa o incrementa la transcripción del gen o genes cuando está unida por un factor de transcripción). Así, un factor de transcripción que se une a una seruencia reguladora en cis puede ser un efector negativo (proteína represora) o un efector positivo (activador).
Una secuencia diana para un polinudeótido señuelo o secuencia señuelo se refiere al sitio de unión celular del factor de transcripción oon el que compite para la unión del factor de transcripción. De manera similar, el regulador diana es el factor de transcripción al que se une la secuencia señuelo. El gen o genes diana de la secuencia señuelo es el gen o genes que está/están unidos operativamente al sitio de unión celular del factor de transcripción. Asi , una seruencia señuelo altera la regulación de la expresión del gen o genes diana.
Los inventores han usado señuelos para alterar fenotipos procariotas, especialmente fenotipos que son relevantes para la patogenicidad bacteriana y para abordar la infección bacleriana. En particular, los inventores han usado señuelos para alterar la expresión de rutas celulares, respuestas y mecanismos de resistencia con el fin de hacer que las células sean más susceptibles a la muerte o inhibición del crecimiento, y/o menos capaces de sobrevivir en condiciones hostiles, y/o menos virulentas.
En un aspecto, los presentes métodos alteran la expresión génica con el fin de hacer que las células sean menos viables, por ejemplo, en las oondiciones predominantes. Por ejemplo, las células pueden volverse menos viables debido a una susceptibilidad incrementada a antibióticos, respuesta deficiente al estrés, respuesta de vIrulencia defICiente y/o expresión alterada de genes esenciales. Los presentes métodos pueden usar señuelos para debilitar los sistemas celulares de defensa o supervivencia y/o los sistemas de virulencia. Los métodos pueden hacer que las células sean más vulnerables a la muerte celular y/o inhibir el crecimiento o patogenicidad. Así, en un aspecto, los presentes señuelos pueden producir un efecto bactericida o bacteriostático.
Por ejemplo, en un aspecto, los inventores han usado señuelos para alterar el fenotipo de susceptibilidad a antibióticos de procariotas, en particular baderias y especialmente bacterias patogénicas. En un aspecto, el incremento en la susceptibilidad no es especifico para un antibiótico o dase de antibiótico. En un aspecto, el incremento en la susceptibilidad no es específico para la estructura y/o mecanismo de un antibiótico cualquiera o clase de antibiótico. En un aspecto, se incrementa la sensibilidad para un amplio espectro de antibióticos o clases de antibióticos.
En un aspecto, un incremento en la susceptibilidad no es especifico para un antibiótico cualquiera o clase de antibiótico seleccionado de: aminoglicósidos (tal como kanamicina); de los carbapenemos (tal como meropenem); las cefalosporinas (tal como cefepima); los glicopéptidos (tal como vancomicina y daptomicina); las penicilinas (tal como ampicilina, carbenicilina y penicilina); los antibióticos polipeptrdicoS (tal como polimixcina B); las quinolinas (tal como levaquina); las sulfonamidas (tal como Bactrim); las telracidinas (tal como tetraciclina); y de forma diversa, cloranfenicol, rifampicina, Zyvox.
Los métodos señuelo descritos en la presente memoria también pueden usarse para alterar fenotipos tales como respuestas celulares adaptativas o virulencia celular. Los métodos también pueden usarse para alterar la expresión celular de genes esenciales y supervivencia celular, por ejemplo, en condiciones dadas de cultivo o fisiológicas, por ejemplo, nutrientes limitantes.
En general, los métodos proporcionan nuevos medios para tomar como diana infecciones baclerianas y enfermedades asociadas. Esto puede ser por la potenciación de los efectos de un antibiótico o por un efecto inhibidor directo en las bacterias, por ejemplo, inhibición del crecimiento o supervivencia, inhibición de la expresión de determinantes de virulencia, inhibición de la expresión de genes esenciales. Así, un TFD puede actuar como un antibiótico o un agente antibacteriano en sí mismo. En un aspecto, los métodos usan señuelos que alteran la expresión de genes que determinan la viabilidad celular.
Como anteriormente, los presentes métodos usan señuelos para alterar la regulación de rutas celulares, respuestas y mecanismos de resistencia. En algunos casos, esto implica tomar como diana la unión de una molécula reguladora global. El o los genes diana pueden ser aquellos que están regulados en respuesta a antibiótico.
las dianas pueden induir reguladores de mecanismos intrínsecos de resistencia a antibióticos, incluyendo mecanismos intrínsecos de resistencia a múltiples fármacos. los mecanismos intrínsecos pueden proporcionar una barrera física a los fármacos tales como antibióticos, por ejemplo incrementando la velocidad a la que los antibióticos se eliminan de la célula o reduciendo la penetrabilidad o permeabilidad de la pared celular. los mecanismos intrínsecos pueden proporcionar resistencia a antibióticos que han entrado en el citoplasma. los mecanismos intrinsecos de resistencia pueden inducirse en respuesta a condiciones medioambientales, tales como estrés u otras condiciones listadas en la presente memoria. En algunos casos, la expresión de genes que codifican mecanismos intrlnsecos de resistencia esta regulada en respuesta a antibióticos. Por ejemplo, éstos pueden ser genes que codifican protelnas con un papel fisiológico cuya expresión está regulada de manera diferente en respuesta a antibióticos. los genes que codifican proteínas con un papel en la resistencia intrinseca pueden codificar por ejemplo, bombas de eflujo o proteínas que determinan la composición de la pared celular o densidad o metabolismo de la pared celular. En un aspecto, los genes diana codifican un mecanismo de resistencia que no es específico de antibiótico o no específico de dase de antibióticos, por ejemplo, en términos de estructura o mecanismo del antibiótico.
las dianas pueden incluir reguladores de las respuestas celulares adaptativas. Típicamente, éstas son respuestas adaptativas a condiciones medioambientales, por ejemplo. condiciones medioambientales hostiles. Por ejemplo, éstas incluyen respuestas al estrés tales como respuestas al estrés oxidativo o respuestas al estrés de peróxido. respuestas a carencia de nutrientes, por ejemplo, limitación de nitrógeno. respuestas a toxinas, por ejemplo, matalotoxinas tales como condiciones de alto hierro, respuestas a condiciones de alta acidez (pH bajo). Asi, las dianas pueden incluir reguladores de genes de respuesta al estrés, proteínas metaloreguladoras, y reguladores de los genes de fijación del nitrógeno.
los genes celulares adaptativos son aquellos cuya expresión está determinada por factores medioambientales e influyen en la capacidad de la bacteria para sobrevivir y causar enfermedad en ese medioambiente. Por ejemplo, una bacteria puede necesitar adaptarse a condiciones de baja concentración de hierro encontradas en el interior de un huésped y hacen esto induciendo un conjunto de genes que expresan proteínas capaces de secuestrar el hierro y llevarlo al interior de la célula. También incluirá la formación de biopelículas, fisiología de la pared celular y cambios en el metabolismo primario.
los genes de respuesta al estrés forman una clase de genes celulares adaptativos. Éstos son un número limitado de conjuntos de genes, todos o parte de los cuales se inducen en respuesta a un amplio rango de eslreses. los
estreses pueden incluir factores fisiológicos (cambios en la temperatura, acidez, oxígeno bajo), fadores bióticos (en respuesta a huésped u otra bacteria) y factores químicos (tales como tratamiento con antibióticos).
También se incluyen respuestas a condiciones fisiológicas. Así, las dianas pueden inckJir reguladores de la expresión de genes de patogenicidad o factores de virulencia, tales como toxinas. Las dianas también incluyen reguladores de proteínas que determinan la formación de bio-película y captación de nutrientes (por ejemplo, hierro).
los genes de factores de virulencia son aquellos que controlan la producción de moléculas especificas de la bacteria que causan enfermedad, tales como toxinas, o incitan una respuesta del huésped que afeda la capacidad de la bacteria para sobrevivir y causar enfermedad.
las dianas también incluyen reguladores de genes esenciales. ¡;'stos son genes cuya expresión es esencial para la supervivencia celular en las condiciones medioambientales predominantes. Por ejemplo, una diana puede ser un regulador de genes que codifican proteínas que se necesitan para la replicación del AON, rutas metabólicas principales, síntesis de áddos grasos o división celular.
los genes esenciales son aquellos que se requieren para que la bacteria sobreviva en cualquier entamo.
Frecuentemente, existe una superposidón en la célula entre los sistemas descritos anteriormente. Así, una proteina reguladora puede regular la expresión de genes que codifican factores de virulencia y metabolismo de la pared celular en respuesta a estrés medioambiental. En otro ejemplo, una proteína reguladora puede controlar la expresión de un gen que es esencial para la célula bajo condiciones medioambientales particulares, por ejemplo, escasez de nulrientes.
En un aspecto, el presente método puede estar dirigido a genes, la regulación de la expresión de los ruales determina la capacidad de la célula para sobrevivir en presencia de anlibióticos generalmente, por ejemplo, más de un antibiótico o más de una clase de antibiótico.
los ejemplos de genes de resistencia a antibióticos están descritos en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB200Bl003353. los señuelos tales como los descritos en la presente memoria pueden usarse para tomar como diana uno o más de los genes en PCT/GB200Bl003353 que codifican beta lactamasas, bombas de eflujo, por ejemplo, las de la Figura 1, enzimas que modifican aminoglicósido o gen ermB, con el fin de alterar, por ejemplo, incrementar, la resistencia a antibióticos. De hemo, los señuelos pueden contener dos o más secuencias dirigidas para actuar en más de un gen o factor de transcripción y/o más de una cepa baderiana. Por ejemplo, un señuelo puede comprender el conjunto de unión Sig de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.
los TFO pueden usarse para tratar una variedad de infecciones bacterianas en el sitio que ocurran en el cuerpo humano. Pueden describirse cinco áreas generales de infección bacteriana. las infecciones del tracto respiratorio están entre las más comunes, las infecciones del tracto respiratorio superior incluyendo los oídos, garganta y senos nasales que pueden tratarse con aplicaciones tópicas o preparaciones de aerosol. Las infecciones del tracto inferior incluyen neumonía (que está causada por un rango de patógenos bacterianos, bronquitis y complicaciones infecciosas de la fibrosis quistica. Un problema común tanto en la práctica de comunidad como de hospital son las infecciones del tracto urinario, en las que la orina se infecta y se necesitan antibacterianos que entren en la vejiga, próstata, uretra y riñones. El intestino es vulnerable a infecciones (un ejemplo de infecciones gastrointestinales), en las que las bacterias causan enfermedad bien por invasión mucosal o producción de toxinas, un ejemplo de la cual incluye epidemia de cólera y cuando se usan antibióticos se ingieren o se administran intravenosamente. Las infecciones de la piel y del tejido blando, que pueden tratarse por aplicaciones tópicas, son comunes después de lesión traumática o quemaduras, que permiten la colonización e ingresión de microorganismos que resulta en infecciones que están localizadas o se diseminan rápidamente a través de los tejidos. los microbios responsables de las infecciones de la piel surgen frecuentemente de la flora normal de la piel, tal como Streptococcus pyogenes causando infecciones superficiales en la piel (impétigo), celulitis (infección asentada más profundamente que puede diseminarse en la sangre) y fascitis necrosante, una infección que progresa rápidamente que frecuentemente es un riesgo para la vida. Finalmente, las infecciones del sistema nervioso central, tales como meningitis bacteriana, son quizá las más exigentes para tratar ya que las terapias deben penetrar la barrera hemato-encefática, como deben hacer10 también las bacterias patogénicas.
los sef'iuelos pueden prepararse y ensayarse como se describe en la solicitud en tramitación con la presente
PCT/GB20OB/003353.
Uno cualquiera o más de los aspectos anteriores pueden combinarse cuando se consideran los presentes métodos.
los presentes métodos usan polinucleótidos señuelo para alterar la expresión génica en procariotas. Un polinucleótido señuelo comprende un sitio de unión de factor de transcripción (secuencia señuelo). Generalmente, en los presentes métodos, se introduce un polinude6tido señuelo en una célula diana, que comprende un gen o genes unidos operativamente a una secuencia reguladora en cis que comprende un sitio de uniÓn para el factor de transcripción. El polinucleótido titula el factor de transcripción del sitio de uniÓn celular y altera la regulación de la
expresión del gen o genes unidos operativamente en la célula. La alteración de la expresión génica causa cambios en los fenotipos celulares.
los fadores de transcripción y genes que pueden tomarse como diana usando los presentes métodos induyen aquellos descritos en la presente memoria y en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB2008loo3353. los ejemplos especificos induyen los reguladores y secuencias reguladoras siguientes que también se listan en la Figura 2.
la referencia a cada uno de los reguladores especificos incluye referencia a ese regulador en las especies listadas y a cualquier homOlogo de especie de éstas. Para cada diana, se presenta un sitio de unión nativo y/o una secuencia de unión consenso. Una secuencia señuelo dirigida al regulador puede comprender la secuencia nativa o secuencia consenso presentada o una variante o fragmento de ésta que tiene función señuelo como se describe en la presente memoria, por ejemplo, un sitio de unión nativo en otra especie. los métodos para ensayar una secuencia variante para funciOn señuelo se describen en la solicitud en tramitaciOn con la presente PCT/GB2oo8/oo3353. los señuelos dirigidos a un regulador particular son particulannente adecuados para uso en procariotas en los que aparece el regulador, como se lista más adelante. También se listan para cada regulador ejemplos de usos de señuelos dirigidos al regulador, por ejemplo, antibióticos para los que una célula se vuelve tipicamente más susceptible después de tratamiento con un senuelo.
Las secuencias proporcionadas en la presente memoria ilustran cadenas únicas de los sitios de unión. Sin embargo, se apreciará que en la naturaleza y en los TFD de la presente invención, las secuencias serán bicatenarias. la cadena complementaria a las secuencias listadas en la presente memoria son claramente y fácilmente derivables, por ejemplo de Molecular Cloning: A laboratory Manual (3-Edición), 2001 por Joseph Sambrook y David Russell.
WhiB7
WhiB7 es un regulador transcripcional de genes de resistencia a antibióticos en Actinomycetes induyendo Mycobacleria (por ejemplo, M. smegmatis y M. tuberculosis) y Streptomyces (Nguyen et al, Trends in Microbiology
(2006) 14, 304-312).
El sitio de uniOn de WhiB7 nativo en M. smegmatis cepa MC2 155 comprende:
5'· CACCAGCCGA AAAGGCCACG GACCCGCAGT CACCCGGATC CGTGGCCATT
TTTGTCGGAC CCCCCGAGAA ATCTGGTCGC AGGATCCATC AGCTCAGACA
GATCAC· 3' (SEQ ID NO: 9)
LOCUS CP000480 6988209 pb ADN circular SCT 12-DIC-2Q06 DEFINICiÓN Mycobaderium smegmalis cepa MC2 155, genoma completo.
REGISTRO CP000480
VERSiÓN CP00Q480.1 GI: 118168627
COORDENADAS 20313637-2031742
Usos: incrementar la eficacia de un amplio rango de antibióticos hidrofílicoslhidrofóbicos, incluyendo macrólidos, lincosamidas, cloranfenicol, imipenem, pristinamicina, rifampicina, estreptomicina, espectinomicina, telraciclina, isoniazid, etambulol.
Un ejemplo de una secuencia TFO WhiS7 comprende:
WhiB7 TFD 5' TGG CCA CGG A TC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3'
(SEQ ID NO: 5; Ejemplo 2)
FadR es un regulador de la expresión de genes en una ruta esencial para la slntesis de acidos grasos (incluyendo fabA y fabB) en E. col; (Campbell y Cronan, J. Bacteriology (2001) 183: 5982-5990).
El sitio de uniOn de FadR nativo en E. coIi K12 comprende la secuencia:
S' AGTAAGTTTC GAATGCACAA TAGCGTACAC TTGTACGCCG AACAAGTCCG
ATCAGCCATTTAA·3' (SEQ ID NO: 10)
lOCUS CPOOO948 4686137 pb ADN circular BCT 05-JUN-2008
DEFINICiÓN Escherichia coli cepa K12 sustrato DH10B, genoma complelo,
REGISTRO CP000948
VERSiÓN CP000948.1 Gl: 169887498
COORDENADAS 2531419-2531481
Usos: Incrementar la eficacia de cualquier antibiótico dirigido a la slntesis de ácidos grasos, tales como:
platensimicina, derivados de plalnecina, ácido fomalenico, corituberina, salfonas cíclicas, derivados del ácido anlranllico, ácído cerulénico. Un ejemplo de una secuencia TFD FadR comprende
FabB TFD S' TIT ATI CCG AAC TGA TCG GAC TTG TIC AGC GTA CAC GTG TIA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3', (SEQ ID NO: 6; Ejemplo 3)
YycGNycF YycGNycF es un regulador de dos componenles en bacterias gram positivas bajas en G+C, induyendo S. aureus,
B. subtifis, S. pneumoniae, S. pyogenes, Usteria monocytogenes. Se sabe que YycGNycF es un regulador esencial de al menos 12 genes, incluyendo lytM y SsaA y también genes para la determinación de la virulencia y la sintesis de la pared celular (Dubrac y Msadek, Journal of Bacteriology (2004) 186: 1175-1181).
los sitios de unión nativos para YycF e YycG en S. aureus (en los promotores lytM y Ssa) comprenden:
YycF_LytM
5'-GCTATTTIGTAATGACAATGTAATGAGTTIAGTAAAAA-3' (SEQ ID NO: 11)1 lOCUS CPOOO730 2872915 pb ADN circular BCT 16-NOV-2007 DEFINICiÓN Staphylococcus aureus subesp. aureus USA300_TCH1516, genoma completo. REGISTRO CPOOO730 VERSICN CPOOO730.1 GI: 160367075 COORDENADAS 322073-322109
5'-ATTACAAATTIGTAACAGACTTATTTIA-3' (SEQ ID NO: 12)1 lOCUS CPOOO730 2872915 pb AON circular BCT 16-NOV-2007 DEFINICICN Staphylococcus aureus subesp. aureus USA300_TCH1516. genoma completo. REGISTRO CPOOO730 VERSiÓN CPOOO730.1 GI: 160367075 COORDENADAS 2415067-2415093 Usos: Incrementar la eficacia de antibi6tioos macrólido-lincosamida-estreptogramina B (MlSB) los ejemplos de una secuencia TFD de YycGNycF incluyen:
LytM TFD S' GCT ATT TIG T AA TGA CAA TGT AA T GAG TTI AGT AAA AA 3'
SsaA TFDS' ATI ACAAATTIGTAACAGACTTATTTI A3',
(SEQ ID NO. 7 Y 8; Ejemplo 4)
Sigma 54 o SigB
Sigma 54 o SigB_es un controlador principal de la respuesta adaptativa y aparece en aproximadamente 60% de las bacterias, incluyendo M. smegmatis. P. aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae (Wigneshweraraj, Molecular Microbiology (2008) 68: 538-546).
Los sitios de unión nativos en S. aureus y K. pneumoniae comprenden:
5'-TTATTATATA CCCATCGAAA TAATTTCTAA TCTTC-3' (SEQ ID NO: 13)
LOCUS CPOOO730 2872915 pb ADN circutar BCT 16-NOV-2oo7 DEFINICiÓN Staphylococcus aureus subesp. aureus USA300_TCH1516, genoma completo. REGISTRO CPOOO730 VERSiÓN CPOOO730.1 GI: 160367075 COORDENADAS 2187051-2187017
5'-CCGATAAGGG CGCACGGTTT GCATGGTTAT-3' (SEQ ID NO: 14)
LOCUS X13303 24206 pb ADN lineal BCT 18-ABR-2oo5 DEFINICiÓN ADN de Klebsiella pneumoniae para el agrupamiento de genes nito REGISTRO X13303 VERSiÓN X13303.1 GI: 43820
COORDENADAS 18301-18330
Usos: Incrementar la eficacia de antibióticos bactericidas y bacleriostálicos, por ejemplo, los descritos en la presente memoria. Fur la regulación de Fur se describió inicialmente como que era importante para la regulación del hierro pero cada vez
se admite más que está implicado en otras rutas adaptativas. más especialmente metaloreguladoras (Zn-Zur) y también en la determinación de la resistencia a peroxidasa (Per). la regulación de Fur ocurre en al menos S. aureus, E. coli, Heficobacterpylori, B. subtifis (Fur, PerRo Zur, MntR), (Horsburgh 2001; lavarr 2003; y Delany 2(01).
Una secuencia consenso para la unión de Fur en S. aureus y E. coli comprende:
5'-ACT ACAAGT ACT AH AGT AAT AGT TAA CCCTT-3' (SEQIO NO: 15)
Secuencia consenso ("CAJA FUI") como se describe en Horsburgh, J. Bacleriology (2001) 183: 468. EC_fur 5'-GATAATGATAATCATTATC-3' (SEQ ID NO: 16) Secuencia consenso como se describe en de Lorenzo, J. Mol. Biol. (1998) 283: 537.
Una secuencia de unión nativa en H. pylorf comprende: HP _fur
5'-GTT GTC CCA TAA TTA TAG CAT AAA TGA TAA TGA AAA AGT AAA-3' {SEQ ID NO: 17)1 LOCUS CP0010721608548 pb ADN circular BCT 12-JUN-2008 DEFINICiÓN Helicobacler pylori Shi470, geooma completo.
REGISTRO CP001072 VERSIÓN CPOO1072.2 GI: 189491895 COORDENADAS 691415-691374 Usos: Incrementar la eficacia de antibióticos en general que pueden inducir eslrés (bactericidas). los señuelos Fur
5 pueden usarse sin antibiótico para perturbar los mecanismos de respuesta al estrés y adaptación medioambiental.
TedR es un factor sigma alternativo que está autorregulado y que regula la expresión de dos exotoxinas principales que determinan virulencia. Se sabe que la regulación de TedR ocurre en Cfostridium diff/Cile, C. bolulinum (en el que el homólogo es BotR), C. tetani (retR) y C. perfringes (UviA) (Matamourous, Molecular Microbiology (2007) 64:
10 1274-1288)
Un sitio de unión consenso en C. difticile comprende:
TcdR
5'-AAG lTT ACAMA TTAlAl lAG AAl AAC TTl lTT A TT-3' (SEQ ID NO: 18j
Secuencia consenso (TedR, en el que las cajas -35 y -10 están subrayadas) como se describe en Dupuy, Mol. Micro. 15 (2006) 55: 1196.
Usos: Incrementar la eficacia de muchos antibióticos más especialmente aquellos con propiedades bacteriostáticas.
VI,
Vfr es un regulador global de los factores de virulencia en P. aeruginosa y E. col¡ (Kanack, Microbiology (2006) 152: 3485-3496). El homólogo de E. co/i es CRP, con sitios de unión que aparecen en el promotor del gen loxA y 20 promotor P1 del gen regA.
Un consenso y dos sitios de unión nativos en P. aeruginosa son:
PA_Vfr
5'-MA lGl GAl ClA GAl CAC ATTl-3' (SEQ ID NO: 19)1
Secuencia consenso como se describe en Kanack, Microbio!. (2006) 55: 1196.
5'-CAClClGCAA lCCAGTTCAl MAlCC-3' (SEQ ID NO: 20)
lOCUS EU595736 26 pb ADN lineal BCT 15-JUN-2008 DEFINICIÓN Pseudomonas aeruginosa cepa PACS458 clon . fa1366, secuencia completa. . REGISTRO EU595736 REGiÓN: 10145 .. 10170 30 VERSiÓN EU595736.1 GI: 187939551 COORDENADAS 10145-10170 PA_RegA
5'-GlAACAGCGGAACCACTGCACAG -3' (SEQ ID NO: 21)1
lOCUS EU595736 26 pb ADN lineal BCT 15-JUN-2008 DEFINICiÓN Pseudomonas aeruginosa cepa PACS458 clon 35 fa1366, secuencia completa. REGISTRO EU595736 REGIÓN: 10145 .. 10170 VERSiÓN EU595736.1 GI: 187939551 COORDENADAS 312-334
Antibióticos: los señuelos pueden usarse sin antibiótico para controlar la expresión de un conjunto de genes que determina virulencia en P. aeruginosa y E. coli. los señuelos pueden usarse para incrementar la eficacia de antibióticos mas especialmente aquellos con propiedades bacteriostaticas.
NtrC es un regulador de un gen esencial, 91nA, que se requiere para la adaptación medioambiental en al menos Klebsiella pneumoniae (Minchin et al, The EMBO Joumal (1989) 8: 3491-3499).
Un sitio de unión nativo en K. pneumoniae comprende:
KP _NtrC
5'-GCTITGCACTACCGCGGCCCATCCCTGCCCCAAAACGATCGCT -3' (SEQ ID NO: 22)1
lOCUS X 13303 24206 pb ADN lineal BCT 18-ABR-2005 DEFINICiÓN ADN de Klebsiella pneumoniae para el agrupamiento de genes nit.
REGISTRO X 13303
VERSiÓN X13303.1 GI: 43820
COORDENADAS 18159-18201
Usos: los señuelos pueden usarse sin antibiótico para perturbar la expresión del 9en esencial, g/nA, requerido para la adaptación medioambiental, o en combinación con antibióticos en general que pueden inducir estrés (bactericidas).
ArsR
ArsR es un regulador de genes que codifican adaptación a acido en al menos Helicobacfer pylori, H. acireonychis y
H. felis (Ptlock et al, J. Bacteriology (2006) 188: 3449-3462). los sitios de unión aparecen en el promotor amiE y el promotor rocF como se describe en Ptlock el al.
los ejemplos de una secuencia de unión nativa comprenden:
5'-A TAATCAT AA TGATTAAAGT TTTCA TATTC A TTAT AAA TC CGTITACACA AlTATT -)' (SEQ ID NO: 23)
lOCUS AEOOO511 56 pb ADN lineal BCT 27-DIC-2oo5 DEFINICiÓN Helicobacter pylori 26695, genoma completo. REGISTRO AEOOO511 REGiÓN: 310910 ..310965 VERSiÓN AEOOO511.1 GI: 6626253 COORDENADAS 310910-310965 HP_RocF
5'-GAAA TTGTTC TATITATTAT CCATITGCTT ATTAATAATT GGTTGTT AA T TITGGTITAG A -3' (SEQ ID NO: 24)
lOCUS AEOOO511 61 pb ADN lineal BCT 27-DIC-2005 DEFINICiÓN Helicobacter pylori 26695, genoma completo. REGISTRO AEOOO511 REGiÓN: 1459830 ..1459890 VERSiÓN AEOOO511 .1 GI: 6626253 COORDENADAS 1459830-1459890 Usos: los señuelos pueden usarse por si mismos para perturbar la expresión de los genes esenciales que median la
captación de hierro que se reqUieren para la adaptación medioambiental, o en combinación con antibióticos en general que pueden inducir estrés (bactericidas).
Secuencia consenso resistente a glicopéptido (GISA) Se determin6 una secuencia consenso por análisis bioinformático de datos de micromatrices no patentadas. Se encontraron restos en genes que se mostró que estaban regulados al alza cuando se compara una cepa resistente a
glicopéptido con su parental, y la misma cepa resistente con un revertante (Sdlerl, BMC Genomics (2006) 7: 296). Se encontró que 17f22 promotores tenlan una secuencia consenso compartida. Un ejemplo de la secuencia consenso, encontrado en el promotor de tcaA, un regulador positivo conocido de
virulencia (Maki, Antimicrobial Agents Chemother. (2004) 48: 1953) puede usarse en un señuelo (véase más adelante). SA_TcaA
5'-TGAACACCTTCTTTTTA -3' (SEQ ID NO: 25~ lOCUS CP000730 2872915 pb ADN circular BCT 16-NOV-2007 DEFINICiÓN Staphylococcus aureus subesp. aureus USA300_ TCH1516, genoma completo.
REGISTRO CP000730 VERSIÓN CP000730.1 GI: 160367075 COORDENADAS 2476452-2476436 la secuencia consenso aparece al menos en S. aurous. los señuelos dirigidos a la secuencia pueden usarse para
tomar como diana cualquiera de las proteínas reguladoras que se unen a las secuencias en los promotores nativos. Típicamente, los genes regulados por unión a las secuencias nativas contribuyen a la resistencia a glicopéptidos y/o virulencia.
Usos: los señuelos pueden usarse para incrementar la eficacia de antlbióticos glicopeptldicos.
Se determin6 una seruencia consenso por análisis bioínformatico de datos de micromatrices no patentadas .Se encontraron restos en genes que se mostró que estaban regulados positivamente por Agr, un regulador asociado con virulencia (Dunman, J. Bacteriol. (2001) 183: 7341).
Se encontró que el resto potencial aparecía en dos promotores que se pensó que estaban probablemente implicados en la determinación de la patogenicidad (SA2093 en 5' de un regulador transcripcional semejante a AraC y SA1269, un gen semejante a Bit).
SA_Agr_2093 5'-AGA AAG ACA AAC AGG AGT AA -3' (SEQ ID NO: 26) I
lOCUS CPOO0730 2872915 pb ADN circular BCT 16-NOV-2oo7 DEFINICiÓN Staphylococcus aureus subesp. aureus USA300_TCH1516, genoma completo. REGISTRO CPoo0730 VERSiÓN CP000730.1 GI: 160367075
COORDENADAS 2414790-2414771 SA_Agr-1269
5'-GAAGAAACAAAAAGCAGCAT -3' (SEQIO NO: 27)
lOCUS AP009324 2880168 pb ADN circular BCT 09-ENE-2oo8 DEFINICiÓN Slaphylococcus aureus subesp. aureus ADN Mu3, genoma completo. REGISTRO AP009324 VERSIÓNAPOO9324.1 GI: 156720466
COORDENADAS 1549580-1549561 El resto se unión aparece al menos en S. aureus y contiene homólogos en muchas especies Gram-negativas, tales como P. aeruginosa y E. co/i. los setluelos dirigidos al reslo pueden usarse para lomar como diana cualquier
proteína reguladora que se une al resto en los promotores nativos. Típicamente, los genes regulados por la unión a las secuencias nativas determinan virulencia en la célula.
usos: los sel'iuelos pueden usarse para controlar la expresión de un conjunto de genes que determina virulencia en
P. aeruginosa y E. eoli.
Generalmente, la secuencia sel'iuelo (sitio de unión del factor de transcripción) en el polinudeótido no esta unida operativamente a un gen. El sitio de unión del factor de transcripción puede aislarse de cualesquiera otros elementos de un promotor afln.
El polinuc1eótido sel'iuelo puede comprender un vector plasmidico. Por ejemplo, el polinucleótido señuelo puede comprender un plasmido nlsnare1 como se describe en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB2008/003353 '110 prepararse según un método descrito en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB2008/003353.
El polinucle6tldo sel'iuelo puede comprender mas de una copia de la secuencia sel'iuelo. El polinuc1e6tido puede comprender una molécula multimérica que comprende múltiples copias de la secuencia senuelo. Por ejemplo de 1 a
1.000 copias. Tlpicamente, hay dos o más copias, por ejemplo, 2-1.000 copias, por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ó 900 copias. Por ejemplo puede haber 10-200, 10-150, 20-120,20-100,30-100, 30-SO, 3O-SO, 30-40 copias. Por ejemplo, puede haber 30 copias de la secuencia sel'iuelo. Típicamente, hay múltiples copias del sel'iuelo, por ejemplo, múltiples repeticiones directas de la secuencia sel'iuelo.
Altemativamente, el polinude6tido señuelo puede comprender mas de una secuencia sel"iuelo asl como múltiples copias de las secuencias señuelo.
El polinucle6tido sel'iuelo puede comprender secuencias adicionales además de la secuencia sel'iuelo. Típicamente, la secuencia adicional resulla en una resistencia incrementada a la degradación de la secuencia sel'iuelo debido a la acción de exo '110 endonudeasas. El polinuc1e6tido señuelo puede comprender al menos un elemento de estructura secundaria. Tipicamente, esta estructura secundaria resulta en resistencia incrementada a la degradación de la secuencia señuelo debido a la acción de exo '110 endonuc1easas. El polinudeótido se/'iuelo puede comprender bases
o azúcares modificados para conferir resistencia mayor a nucleasa. El polinucleótido señuelo puede comprender nuc1eótidos 2' OH o aminas en el extremo del polinudeótido para reducir o inhibir la actividad exonucleasa. El polinuc1eótido señuelo puede comprender un oligonuc1eótido lineal. El polinuc1e6tido señuelo puede comprender ADN bicatenario circular, por ejemplo, una configuración denominada en forma de mancuema. (Ahn et al, Biochemical Biophysical Res. Comm. (2003) 310: 1048-1053). Una mancuerna típicamente tiene una región bicatenaria que incorpora la secuencia diana flanqueada por pequel'ias estructuras en horquilla, u otras secuencias. El polinucleótido señuelo puede comprender una modificación de colesterol en uno o en cada uno de los extremos 5' de la molécula.
El polinucle6tido señuelo puede comprender una cualquiera o mas de las caracteristicas anteriores en cualquier combinación adecuada.
Un polinude6tido señuelo puede comprender cualquiera de las secuencias señuelo descritas en la presente memoria '110 identificadas según los métodos descritos en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB2008/003353 '1 también pueden comprender secuencia adicional como se describe.
Como anteriormente, un pOlinuc1e6tido señuelo puede comprender un plasmido n {snarel. los plasmidos tienen la ventaja, por ejemplo, comparado con los oligonuc1eótidos lineales, de que se introducen facilmente en bacterias, pueden mantenerse por selección positiva '1 eluden el problema de la degradación por exonudeasa.
las ventajas de crear versiones portadas por plásmidos de oligonuc1eótidos señuelo inc1uyen coste de fabricación reducido, resistencia incrementada a degradación in vivo por nuc1easas, mantenimiento de la concentración de plasmido (por auto-repllcación y selección positiva si es necesario), amplio rango de huéspedes '1 la capacidad de ensayar combinaciones o secuencias reguladoras en cis usando plásmidos n (snare] distintos pero compatibles (para ensayar para efectos sinérgícos).
Un plasmido n Isnare1 es adecuado para uso como un polinudeótido señuelo en los presentes métodos. los plasmidos y bibliotecas n [snare] también son adecuados para ensayar una funci6n señuelo posible de una secuencia reguladora en cis conocida o potencial, o para cribar nuevas secuencias regUladoras en cis (que pueden actuar como secuencias senuelo).
El principio de uso de un plásmido n (snare] se ilustra en la Figura 3. El plásmido comprende una secuencia "snare" (mostrada en múltiples copias en la Figura). Si la "snare" comprende un sitio de unión de factor de transcripción que compite con una secuencia reguladora en cis celular para unión a un factor de transcripción (es decir, tiene función señuelo), la introducción del plásmido n [snare1 en la célula resultará en una liberación del factor de transcripción de la secuencia reguladora en cis celular y en la snare. Esto puede detectarse como un cambio en la expresión de un gen o genes cuya expresión está regulada en la célula por esa secuencia reguladora en cis o por la alteración del fenotipo de la célula.
En general, un plásmido n [snare] comprende un vector plasmidico y una secuencia inserto (comprendiendo el inserto la snare). La incorporación de la secuencia snare en un plásmido aborda los problemas en la lécnica de la degradación del señuelo y permite el mantenimiento eslable del señuelo (y cualquier efecto en la expresión génica) en la célula.
La secuencia inserto comprende una o más copias de una secuencia monomérica (que comprende la snare). Así, el inserto puede comprender (por ejemplo) de 1 a 200 secuencias monoméricas. Típicamente, hay dos o más copias, por ejemplo, 2-200 copias, por ejemplo, al menos 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ó 190 copias. Por ejemplo, puede haber 5-200,5-150,5-100, 10-150,10-50, 5-50, 5-40, 10-40, 5-30 copias. Por ejemplo, puede haber 30 copias de la secuencia monomérica. El plásmido comprende Upicamente un homopolímero del monómero. Tlpicamente, hay múltiples copias del monómero, por ejemplo, múltiples repeticiones directas de la secuencia monomérica. El proporcionar múhiples copias del monómero (y asl de la snare) incrementa el poder de titulación del señuelo.
La secuencia monomérica comprende la secuencia snare.
Tipicamente, un sitio de unión de un factor de transcripción en una snare no está unido operativamente a un gen, por ejemplo, en la snare o plásmido snare. En este sentido, el sitio de unión se aisla de su gen o genes afines. Un sito de unión en una snare también puede aislarse de otros elementos en su promotor afino En un caso, la secuencia monomérica no comprende un gen.
Un monómero puede comprender secuencia adicional además de la snare. Habitualmente, dicha secuencia adicional deriva del método usado para producir la snare y/o el inserto del plásmido. Por ejemplo, un monómero puede comprender una secuencia adaptadora, tal como la secuencia adaptadora que resulta típicamente cuando se producen snare ·personalizadas" para una biblioteca de n [snare] personalizada según los métodos de la presente memoria. Una secuencia adaptadora pUede comprender, por ejemplo, sitios de reconocimiento y/o corte para una o más enzimas de restriCCión.
Un monómero puede comprender una secuencia de nucleótidos que proporciona un sito de unión para un cebador, por ejemplo, un cebador usado en la prodUCCión del monómero o de un inserto que comprende múltiples monÓmeros.
Por ejemplo, cuando un inserto de plásmido se prepara usando un método de amplificación por circulo rodante como se describe en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB200BlOO3353, un monómero comprende tlpicamente un segmento que corresponde al sitio de unión para el cebador usado en la replicación por circulo rodante, por ejemplo un cebador T7.
Un monómero que comprende una secuencia snare aleatorizada también comprende típicamente una región o regiones de secuencia constante. Por ejemplo, una seClJencia snare aleatorizada de n nucle6tidos puede estar flanqueada por regiones de secuencia constante. Altemativamente, un núcleo central de seClJencia constante puede estar flanqueado por regiones de secuencia de nucleótidos aleatorizados.
La longitud de un monómero puede ser, por ejemplo, hasta 1.000 nucle6tidos, por ejemplo, hasta 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 ó 10 nucleótidos. Típicamente, la longitud del monómero está en el intervalo, por ejemplo, de 10-100, 10-50, 20-75, 30-60, 30-50, 35-55 tal como 35-54 nucleótidos. Por ejemplo, la longitud de un monómero puede ser 30, 40 6 50 nucleótidos.
Una parte snare de un monómero puede variar típicamente en tamaño de 10-30 nucleótidos, por ejemplo, 10-25, 1020,15-20, tal como 15, 16, 17, 18, 19 ó20, por ejemplo, 19 nucleÓlidos.
Una secuencia adaptadora puede comprender, por ejemplo, 5-30 nucleótidos, por ejemplo, 5-25, 5-20, 5-15 ó 5-10 , nucle6tidos tal como 10, 11 , 12, 13, 14615 nucleótidos.
Tlpicamente, un inserto en el plásmido n [snare] comprende una o más copias de un monómero como se describe en la presente memoria. Cuando el inserto comprende múltiples repeticiones de un mon6mero, éstas pueden ser repeticiones en tándem.
Un inserto en el vector plasmidico puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 1,5 kb, por ejemplo, 1-2 kb, por ejemplo 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,761,8 kb. Sin embargo, puede usarse cualquier tamaño de inserto adecuado, que permita el mantenimiento estable del plásmido en una célula huésped adecuada y uso eficaz en los presentes métodos.
Tipicamente, las secuencias de todos los mon6meros en un único plásmido son las mismas.
El vector plasmidico para uso en el plásmido n [snare] puede ser adecuado para uso en un huésped procariota o eucariota. Por ejemplo, el vector puede ser para uso en un procariota tal como un huésped bacteriano, por ejemplo, actinomycete. Por ejemplo, el vector plasmidico puede ser adecuado para uso en una cepa de Streptomycete o E. eoli, por ejemplo una o más de StrePtomyces eoelicolor, por ejemplo, A3(2) (o cepa M145 o M600), E. coli.
Streptomyees fividans o Streptomyees einnamoneous. los huéspedes adecuados se describen adicionalmente en la presente memoria.
Tlpicamente, el vector es un vector de amplio rango de huéspedes y/o lanzadera y puede por lo tanto mantenerse y propagarse en más de un huésped. El plásmido puede ser un plásmido conjugaüvo. Esto permite una transferencia fácil de una célula a otra por conjugación.
Preferiblemente, el plásmido es auto-replicativo. Tfpicamente, el plásmido es un plásmido de alto numero de copias. Por ejemplo, el plásmido puede mantenerse a, por ejemplo, 20-100 copias por célula, por ejemplo 20, 30, 40, 50, 60. 70, 80, 90 ó 95 ó 100 copias por célula. El alto numero de copias incrementa el poder de titulación de una secuencia sel'luelo en la snare.
Típícamente, un plásmido n [snare) comprende un origen de replicación. los orígenes adecuados se conocen en la técnica. Típícamente, el plásmído comprende además uno o más genes marcadores detectables, por ejemplo, uno o más genes que codifican resistencia a antibióticos, por ejemplo, el gen aae que codifica resistencia a apramicina. la expresión del gen o genes marcadores permite el cribado para el mantenimiento del plásmido en una célula huésped.
los ejemplos de vectores plasmldicos adecuados incluyen por ejemplo, p1J86. los vectores adecuados se conocen en la técnica.
Una snare puede comprender una secuencia derivada o aislada de un genoma o fragmento genómico. Un fragmento genómico puede comprender un gen o genes que codifican una función o fenotipo particular de interés. Una snare puede comprender, por ejemplo, una secuencia derivada o aislada de la región promotora de dicho gen o genes o secuencias circundantes, por ejemplo, secuencias a una distancia mayor de un gen o genes que el promotor. Una snare puede comprender una secuencia que compite con dicha secuencia para unión del factor de transcripción, como se describe en la presente memoria. los métodos para preparar dichas snares se describen en la presente memoria y en la solicitud en tramitación con la presente PCTlGB2008/OO3353.
los polinuc1eótidos sei'iuelo pueden prepararse por cualquier método adecuado.
Por ejemplo, las estructuras en forma de mancuerna pueden prepararse como oligonucle6tidos lineales y ligarse con ligasa T4. Alternativamente, los sei'iuelos en forma de mancuerna pueden prepararse por PCR usando cebadores apropiados, como se describe en el Ejemplo 1. Cada cebador contiene generalmente una parte que brmará la horquilla de la estructura en forma de mancuerna. los ejemplos de dichos cebadores se proporcionan en el Ejemplo
1. la amplificación por PCR usando los cebadores está seguida típicamente de digestión por restricción del producto de amplificación y ligación para formar la estructura en forma de mancuerna circular cerrada.
Alternativamente, las estructuras en forma de mancuerna pueden prepararse por digestión de restricción de un plásmido como se describe en el Ejemplo 1. la digestión está seguida de ligación para formar la estructura en forma de mancuerna circular cerrada.
los métodos para preparar plásmidos n [snare) y bibliotecas de plásmidos n [snare) se describen en la presente memoria y en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB2008/003353.
los presentes métodos pueden comprender la introducción de más de una secuencia senuelo en una célula. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de secuencia señuelo, que comprende secuencias variantes para unión de un regulador en diferentes cepas, por ejemplo, diferentes cepas dinicas. las secuencias señuelo pueden estar presentes en la mezcla en las mismas proporciOnes en las que aparecen las diferentes cepas en la clínica. En otro ejemplo, puede tomarse como diana más de un regUlador.
En un aspecto, los métodos descritos en la presente memoria comprenden métodos in vitro.
Una célula huésped como se refiere en la presente memoria puede ser una en la que se desea alterar la expresión génica (y fenotipo) usando una molécula señuelo, por ejemplo, una bacteria patogénica.
Típicamente, cuando el método se usa para alterar el fenotipo de una célula, las células huésped presentan el fenotipo en ausencia del señuelo. los setíuelos para la alteración de un fenotipo médicamente o terapéuticamente relevante, por ejemplo, para incrementar la sensibilidad a antibióticos, pueden cribarse en una serie de células. Por ejemplo, los senuelos pueden ensayarse en primer lugar en un modelo bacteriano del fenotipo , por ejemplo, un modelo de resistencia a antibióticos y validarse adicionalmente, por ejemplo, en un aislado patógeno o clínico. los señuelos pueden validarse adicionalmente en un modelo animal, por ejemplo, un modelo de ratón.
Cuando un senuelo es un plásmido, tfpicamente la célula huésped es compatible con el vector plasmídico y/o es una en la que el plásmido puede mantenerse de manera estable y replicarse . la célula hUésped también es típicamente compatible con cualquier gen marcador detectable en el plásmido.
En general, una célula huésped comprende la secuencia reguladora en cis de interés, es decir, la secuencia reguladora en cis que se está cribando o con la que se pretende que compita la secuencia señuelo introducida en la célula, unida operativamente a un gen o genes. la modulación de la expresión del gen o genes puede detectarse, directamente o indirectamente (por ejemplo, por una alteración en el fenotipo).
Tlpicamente, la célula comprende un promotor que contiene la secuencia reguladora en cis, unido operativamente al gen o genes. Por unido operativamente se quiere decir que la secuencia reguladora en cis y/o el promotor está unido al gen o genes de manera tal que la secuencia y/o promotor puede funcionar (en condiciones apropiadas, por ejemplo presencia del factor o factores de transcripción requeridos) para regular la expresión del gen o genes. Así, cuando se une un factor de transcripción afin, la secuencia reguladora en cis funciona para regular (reprimir o activar) la expresión del gen o genes.
El funcionamiento de la secuencia reguladora en cis en la célula puede determinarse monitorizando la expresión del gen o genes unidos. Esto puede hacerse monitorizando la expresión del gen directamente o monitorizando la expresión de un fenotipo particular que esta asociado con la expresión el gen o genes. Por ejemplo, el cribado para función puede comprender el cribado para resistencia a uno o más antibióticos, para respuesta al estrés, para expresión de factores de virulencia o para expresión de genes esenciales. los métodos para cribar se describen en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB2008/003353.
Una célula huésped puede comprender una secuencia reguladora en cis (por ejemplo, un promotor que contiene la secuencia) unida operativamente a su gen o genes nativos (afines), es decir, unida al gen o genes cuya expresión regula la secuencia (o promotor) en su estado nativo. la secuencia reguladora en cis y el gen o genes regulados pueden ser endógenos para la célula, por ejemplo, genes que codifican un mecanismo intrinseco de resistencia en una bacteria patogénica resistente a antibiótico.
las células huésped adecuadas se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria en los presentes Ejemplos.
los presentes métodos son adecuados para uso en procariotas generalmente. En particular, los métodos pueden usarse en patógenos, especialmente bacterias patogénicas, por ejemplo. bacterias patogénicas que afectan a los seres humanos. Éstas incluyen bacterias de los géneros siguientes (listadas según el resultado en el ensayo de tinción de Gram):
Gram negativas: Acinetobacter; Bordetella; Borrelia; Brucella; Campylobacter; Escherichia; Francisella; Haemophilus: Helicobacter; Klebsiella; legionella; leptospira; Neisseria; Proteobacteria; Pseudomonas; Ricketlsia; Salmonella; Shigella; Treponema: Vibrio; Yersinia.
Gram positivas: Bacillus; Clostridium; Corynebacterium; Enterococcus; Usteria; Mycobacterium; Staphylococcus; S1reptococcus.
No teñidas: Chlamydia; Mycoplasma.
los ejemplos de especies patogénicas gram negativas y de enfermedad causada por ellas incluyen: A. barumannii (neumonia, Bacteremia). Bordetella pertussis (tos ferina), Borrelia burgdorferi (enfermedad de lyme), Brucella abortus (Brucelosis), Campylobacter jejuni (Enteritis aguda). Escherichia coli (septicemia y neumonia), Francisella tularensis (fularemia), Haemophilus influenzae (Gripe), Helicobacter pylori (Úlceras pépticas). Klebsiella pneumoniae (neumonia), legionella pneumophilla (Enfermedad del legionario), Neisseria gonorrhoeae (Gonorrea), Acinelobacteria sp (Nosooomia: infecciones), Pseudomonas aeruginosa (sepsis), Ricketlsia ricketlsii (Ricketlsiosis), Salmonella typhimurium (Tifoíde), S. dysenteriae (Disenteria), Vibrio cholerae (Cólera), Yersinia pestis (peste).
los ejemplos de especies patogénicas gram positivas y de enfermedad causada por ellas incluyen: Bacillus . anlhracis (Antrax), Clostridium difficile (Colitis pseudomembranosa). Corynebacterium diphtheriae (Difteria), Enterococcus faecalis (Infecciones nosocomiales), listeria monocytogenes (Usterosis), Mycobacterium tuberculosis (fuberculosis), Staphylococcus aureus (Septicemia), S. pneumoniae (Neumonla).
las bacterias de los géneros siguientes (incluyendo las especies referidas anteriormente) son particularmente adecuadas para con los presentes métodos: Escherichia; Helicobacter; Klebsiella; Neisseria: Proteobacler; Pseudomonas; Salmonella; Bacillus; Closlridium; Enterococcus; Staphylococcus; Shigella.
En un aspecto, la invención se refiere a una célula o células huésped que comprenden un poIinuc!eótido señuelo (molécula senuelo) como se describe en la presente memoria (por ejemplo. introducida en la célula por cualquier método de la presente memoria). En particular, la invención se refiere a dicha célula o células huésped que presentan una expresión génica y/o fenotipo alterado, debido a la presencia del polinucleótido señuelo, por ejemplo, susceptibilidad incrementada a antibiótico o antibióticos, virulencia disminuida, respuesta adaptativa deficiente, comparado con la célula en ausencia del plásmido/molécula señuelo. Por ejemplo. la invención se refiere a patógenos o aislados clínicos que se han convertido en menos viables usando polinudeótidos señuelo como se describe en la presente memoria.
Los polinucleótidos senuelo pueden introducirse en células huésped por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, transformación, transfección, conjugación. Por ejemplo, cuando un polinucle6tido comprende un plasmidoconjugativo, éste puede intrOducirse por conjugación. Los polinucleÓtidos ser'iuelo, por ejemplo, estructuras en forma de mancuerna circulares, pueden introducirse en las células por transfección. Las células pueden estar en cultivo liquido '1 el sel"iuelo af'iadirse al liquido. A1temativamente, las células pueden cultivarse en medio sólido '1 los senuelos transfectarse de discos de papel absorbente saturados con sel'luelo '1 utilizados para cubrir el medio. Tipicamente, el polinucle6tido senuelo se ar'iade al medio de cultivo '1 es captado por las células. Cuando las células se rultivan en medio sólido, los polinucle6tidos ser'iuelo pueden al"iadirse a un disco de filtro '1 ser captados por las células desde el disco. Puede usarse un tampón de permeabilidad para ayudar en la transfección.
En un aspecto, la transfección de polinucle6tidos senuelo puede comprender el uso de colesterol. En particular, los métodos pueden usar polinucleótidos sef'iuelo lineales, que presentan una modificación de colesterol en uno o ambos extremos 5'. La modificación se cree que facilita la captación por las células.
Los senuelos pueden marcarse adicionalmente, por ejemplo, en un extremo 5' con un marcador detectable tal como un agente de tinción de fluorescencia, por ejemplo, Cy5. Esto facilitara ta monitOrizaciÓn de la captación '1 mantenimiento en la célula.
Los ser'iuelos marcados con colesterol '110 detectablemente pueden prepararse usando cebadores marcados con colesterol 'l/o detectables, como se describe en el Ejemplo 1.
La transfección del polinucle6tido ser'iuelo en una célula puede comprender el uso de R9-colesterol, que consiste en una molécula de colesterol unida a una cadena lineal de nueve D-argininas (Kim W.J., el al., Mol. Ther 2006 14: 343350).
En general, se monitoriza la captación 'l/o mantenimiento de los polinucle6tidos ser'iuelo, o biblioteca de plásmido, en las células. Por ejemplo, un ser'iuelo de plásmido puede comprender un marcador detectable, por ejemplo, que codifica resistencia a antibióticos, que permite la selección positiva para la presencia del plásmido '1 monitorización de la propagación del plásmido. la presencia de un polinucle6tido señuelo también puede monitorizarse por crt-PCR.
En general, una secuencia senuelo comprende un sitio de uniÓn para un factor de transcripción que compite con sito de uniÓn de un factor de transcripción celular para uniÓn de un factor de transcripción. Mediante la titulación del factor de transcripción del sitio celular, el ser'iuelo altera la expresión del gen o genes unidos operativamente al sitio de unión en la céluta.
Una secuencia senuelo puede comprender la secuencia de un sitio de unión celular nativo para un factor de transcripción. Las secuencias nativas están disponibles en ta técrlica '1 los ejemplos de secuencias de unión endógenas se presentan en la presente memoria para reguladores especlficos.
Una secuencia ser'iueto puede comprender un sitio de unión consenso para un regulador dado. De nuevo, dichos sitios consenso pueden estar disponibles en la técnica, '1 se proporcionan ejemplos para algunos regutadores específicos en la presente memoria.
Alternativamente, una secuencia senuelo puede comprender una variante de una secuencia de unión nativa o consenso, que retiene la función ser'iueto.
Una variante puede prepararse alterando, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucle6tidos en la secuencia parental. Por ejemplo, los experimentos de impronta pueden indicar que nucle6tidos particulares son menos cruciales para la unión del factor de transcripción '1 podrlan alterarse.
Una secuencia sef'iuelo potencial puede ensayarse para capacidad de competir con un sitio de unión de un factor de transcripción dado introduciendo un polinucle6tido sef'iuelo que comprende la secuencia señuelo en una célula huésped adecuada. La célula huésped incluye el sitio de unión del factor de transa-ipción diana unido operativa mente a un gen o genes cuya expresión puede determinarse directamente o indirectamente, por ejemplo, cribando para un cambio en fenotipo. La función senuelo de una secuencia de ensayo puede determinarse cribando para un cambio en la expresión del gen o genes o un cambio en el fenotipo.
Puede usarse rualquiera de los polinucle6tidos ser'iuelo descritos en la presente memoria. Puede usarse cualquiera de las células huésped descritas en la presente memoria.
Por ejemplo, una secuencia de ensayo puede introducirse en primer lugar en una célula informadora adecuada '1 monitorizarse la expresión de un gen informador para evaluar la función senuelo. Pueden usarse los sistemas de ensayo genériCOS basados en informador usando células informadoras "muertas o vivas" descritas en PCT/GB2008/003353. Esta estrategia resuelve el problema de necesitar un fenotipo puntuable 'la que en cirrunstancias normales cada informador causa la muerte celular, es sólo cuando un señuelo elimina esto mediante la eliminación del factor de transcripción cuando las células pueden crecer. Por lo tanto, la selección para ambos informadores se basa en la supervivencia celular, lo que acelera en gran medida el proceso de cribado. Otra caracterlstica del sistema es que dichos cribados muerto-o-vivo pueden automatizarse fácilmente como una base de cribados rápidos, exhaustivos o de alto rendimiento. También es posible identificar secuencias reguladoras que controlan promotores que en su contexto natural no tienen un fenotipo fácilmente puntuable.
Alternativamente o adicionalmente, una secuencia setluelo puede ensayarse en células huésped que comprenden el sitio de unión diana unido operativa mente a su o sus genes afines, de manera que puede determinarse la capacidad para a~erar la expresión del gen o genes. Cuando un señuelo se pretende para producir un cambio en el fenotipo, la célula huésped usada en el cribado presenta el fenotipo particular.
Por ejemplo, las secuencias señuelo para tomar como diana reguladores descrias en la presente memoria pueden ensayarse cribando para sensibilidad incrementada de la célula huésped al antibiótico. El antibiótico puede elegirse como se describe en la presente memoria.
En algunos casos, las secuencias setluelo pueden ensayarse cribando para otro fenotipo apropiado para el regUlador diana. Por ejemplo, los senuelos dirigidos a reguladores de la respuesta al estrés pueden evaluarse detectando una respuesta deficiente al estrés (como se mide por tolerancia a choque fisiológico). Los setluelos dirigidos a reguladores de factores de virulencia pueden evaluarse determinando un programa de virulencia deficiente. Un ejemplo del último podría ser viabilidad baja después de la re-suspensión de un vial congeladO o incluso la regulación a la baja de un gen especifico (como se mide por cRT-PCR).
Por ejemplo, un set'\uelo FabB dirigido a la regulación de genes esenciales para la síntesis de ácidos grasos puede ensayarse frente a una cepa adecuada, por ejemplo E. coli crecida, por ejemplo, en medio LB luria-Bertani (1 % (pIv) Bacto-triptona. 0,5% [plv) Extracto de levadura, 1% [plv) NaCI) en presencia de un antibiótico que actúa en el proceso de la síntesis de ácidos grasos, por ejemplo, Cerulenina. Por ejemplo, a concentraciones de Cerulenina de 10 lAg/mi, las bacterias no tratadas crecen normalmente y actúan como un comparador para bacterias tratadas con el setluelo, que crecen notablemente más lentamente y hasta una densidad final menor.
Por ejemplo. la respuesta al estrés puede inducirse en una cepa adecuada, por ejemplo, S. aureus creciendo, por ejemplo. en medio LB en condiciones de estrés, por ejemplo, condiciones alcalinas. Por ejemplo, puede usarse medio LB que contiene KOH, por ejemplo, a 30 mM. las bacterias no tratadas crecen bien en este medio. debido a la inducción de la respuesta al estrés por las condiciones alcalinas, mientras que las tratadas con el senuelo SA_sigB, dirigido a la regulación de sigB que es una parte principal de la respuesta reguladora al estrés, crecen mal.
En algunos casos, el cribado para la expresión del gen o genes relevantes comprende determinar la viabilidad de la célula huéSped en condiciones de cultivo adecuadas. Por ejemplo, cuando el fenotipo que se está evaluando es resistencia a antibióticos, el cribado puede comprender cultivar las células en presencia del antibiótico y determinar si las células son viables. En un cribado que comprende las células huésped informadoras "muertas o vivasH , el cribado de las células comprende cultivar las células en condiciones en las que la expresión del gen o genes informadores (el gen o genes unidos operativamente a la secuencia reguladora en cis de interés) es determinante para la viabilidad de la célula huésped y aislar las células viables.
Los presentes métodos pueden comprender cultivar las células huésped en medios liquidos, como se describe en la presente memoria. por ejemplo, si el fenotipo celular que se está determinado es la viabilidad celular. Esto puede tener la ventaja de que sólo queda por analizar un pequeño número de células
Un plásmido n [snare] como se describe en la presente memoria puede prepararse por un método que comprende:
-
proporcionar un polinudeótido que comprende una o más copias de una secuencia monomérica; y
-
clonar el polinucleótido en un vector plasmídico adecuado.
la composición del monómero es como se describe en la presente memoria para el plásmido n [snare]. los vectores . plasmldicos adecuados también se han descrito.
El polinude6tido que comprende una o más copias de una secuencia monomérica puede proporcionarse por un método que comprende:
(1)
proporcionar un oligonudeótido circular que comprende:
(i)
una secuencia de interés; y
(ii)
un silio de unión para un cebador adecuado para uso en amplificación por círculo rodante;
en el que la secuencia monomérica comprende (i) y (ii); Y
(2) realizar la amplificación por circulo rodanle usando el oligonucle6tido circular como molde, proporcionando de esta manera un polinudeótido que comprende repeticiones de la secuencia monomérica.
La etapa (1) del método puede comprender además amplificar los productos de la amplificación por circulo rodante por PCR y aislar los fragmentos de polinucle6tido del tamaño requerido, por ejemplo, los fragmentos que comprenden 30-50 repeticiones de la secuencia monomérica, Esto puede hacerse, por ejemplo, por análisis de PAGE,
Un oligonucle6tido circular puede prepararse por un método que comprende:
-
proporcionar un oligonucle6tido lineal monocatenario que comprende: la secuencia de ensayo de interés (i) y el silio de unión para un cebador adecuado para uso en la amplificación por círculo rodante (ii);
-
círcularizar el oligonucleótido, por ejemplo, usando ligasa Taq, típicamente en presencia de un oligonucle6tido de unión universal;
-
opcionalmente digerir el ADN lineal restante con una exonucleasa; y
-
recuperar los oligonucleótidos circulares monoméricos, por ejemplo usando PAGE.
los cebadores adecuados para uso en la amplifICación por circulo rodante se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un cebador T7.
los métodos para realizar la amplificación por circulo rodante se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede usarse la polimerasa Bst!.
En un ejemplo, la amplificación por PCR de los productos de la amplificación por círculo rodante se realiza usando el mismo cebador que se usó para la amplificación por circulo rodante, por ejemplo el cebador T7.
En general, la secuencia (i) en el monómero comprende una secuencia snare como se describe en la presente memoria.
Como se describe en la presente memoria, las secuencias snare pueden aislarse a partir de ADN genómico, por ejemplo a partir de un genoma completo, o de un fragmento genómico. Una secuencia snare, una vez aislada, puede usarse para formar un plásmido n [snare] por el método descrito en la solicitud en tramitación con la presente PCT/G82000/003353,
Un protocolo para la preparación de secuencias snare a partir de un genoma o fragmento genómico se describe en
PCT/G820001003353.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia snare puede comprender una secuencia de nucle6tidos aleatorizada. Típicamente, la snare comprende una secuencia de nucle6tidos aleatorizada (o variable) con una longitud de "n" nucleótidos. En general, n puede variar de 5-50, por ejemplo 10-50, por ejemplo, 20-40, por ejemplo 25-35, por ejemplo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19ó 20 nucle6tidos.
Puede sintetizarse un oligonucleótido que comprende la secuencia aleatorizada (y opcionalmente una secuencia constante como se describe) usando los métodos conocidos en la técnica.
Puede introducirse un ses90 de nucleótidos en la región aleatorizada (o variable) del oligonucle6tido. Por ejemplo, puede introducirse un sesgo GC si es apropiado.
El monómero en el método anterior puede comprender un 0li90nucleótido preparado de esta manera. Puede prepararse entonces un plásmido n [snare].
Como se ha descrito, un aspecto de la invención es incrementar la susceptiblidad de procariotas a antibióticos. Por ejemplo, esto puede implicar tomar como diana un mecanismo intrínseco de resistencia en la célula, o respuestas celulares adaptativas lo que significa que la célula es menos capaz de sobrevivir en condiciones de estrés inducidas por el antibiótico.
En un aspecto, los presentes métodos son adecuados para incrementar la eficacia de antibióticos generalmente (Alekshun y levy, Cell (2007) 128: 1037-1050), Esto incluye tanto antibióticos bacteriostáticos como bactericidas. los ejemplos incluyen la clase de antibióticos conocida como aminoglicósidos (tal como kanamicina); los carbapenemos (tal como meropenem); las cefalosporinas (tal como cefepima); los glicopéptidos (tal como vancomicina y daptomicina); las penicilinas tal como ampicilina, carbenicilina y penicilina); los antibióticos polipeptidicos (tal como polimixcina 8); las qUinolinas (tal como levaquina); las sulfonamidas (tal como 8actrim); las tetraciclinas (tal como tetraciclina); y de forma diversa, cloranfenicol, rifampicina, Zyvox.
En un aspecto, los métodos que causan la supresión de la respuesta al estrés en una célula, o que causan que la célula se estrese son particularmente adecuados para potenciar los efectos de los antibióticos bactericidas (Kohanski et al, Cen (2007) 130: 797-810),
Los antibióticos bactericidas pueden incluir:
!1-laclamas
(a)
Penicilinas
(b)
Carbapenemos
(e)
Monbactamas
(d)
Cefalosporinas
Primera generación: Cefacetrilo (cefacetrilo), Cefadroxil (cefadroxil; Duricef). Cefalexina (cefalexina; Keflex), Cefalogllcina (cefaloglicina), Cefalonio (eefalonio), Cefaloridina (cefaloradina), Cefalotina (cefalotina; Keflfn), Cefapirina (cefapirina; Cefadril), Cefatricina , Cefazaflur, Cefazedona, Cefazolina (cefazolina; Ancef, Kefzol), Cefradina (cefradina; Velosef), Cefroxadina, Ceftezol;
Segunda generación: Cefaclor (Cedor; Distaclor, Keflor, Ranic1or), Cefonicida (Monocida), Cefprozil (eefproxil; Cefzil), Cefuroxima (Zinnat, Zinacef, Ceftina, Biofurok.sima), Cefuzonam, Cefmctazol, Cefotelano, Cefoxilina, Carbacefemos: loracarbef (lorabld), Cefamicinas: eefbuperazona, cefmetazol (Zefazona), cefminox, cefoletano (Cefotano), cefoxitina (Mefoxina)
Tercera generación: Cefcapeno, Cefdaloxima, Cefdinir (Omnicef), Cefditoreno, Cefetamet, Cefixima (Suprax), Cefmenoxima, Cefodizima, Cefotaxima (Claforano), Cefpimizol, Cefpodoxima (Vanlina, PECEF), Cefteram, Ceftibuteno (Cedax), Ceftiofur, Ceftioleno, Ceftizoxima (Cefizox), Ceftriaxona (Rocefina), Cefoperazona (Cefobid), Ceflazidima (Fortum, Fortaz), Oxacefemos: latamoxef (moxalactama)
Cuarta generación: Cefclidina, Cefepima (Maxipima), Cefluprenam, Cefoselis, Cefozoprano, Cefpiroma, Cefquinoma, Oxacefemos: flomoxef
Todavla por clasificar: Ceftobiprol, Cefac1omezina, Cefaloram, Cefaparol, Cefcanel, Cefedrolor, Cefempidona, CefetrizOI, Cefivitrtt, Cefmatiteno, Cefmepidio, Cefovecina, Cefoxazol, Cefrotilo, Cefsumida, Ceftarolina, Ceftióxido, Cefuracetima
Aminoglieósidos:
(a)
amicacina, gentamicina, kanamieina, neomieina, netilmicina, paromomieina, rodoestreptomicina, estreptomicina, lobramicina, apramicina;
(b)
Antraciclinas, por ejemplo, doxorrubieina Quinolonas:
(a)
Fluoroquinolonas; Primera generación; Segunda generación; Tercera generación; Cuarta generación. Antibióticos glicopeptidieos:
(a)
vancomieina, teicoplanina, telavaneina, bleomieina, ramoplanina, decaplanina y dalbavancina. Anfbi6!ieos peptldicos:
(a)
lantibióticos; Duramicina, risina, epidennina, actagardina, mierobisporieina y mersacidina;
(b)
lipopéptidos; Cubicina.
Estreptograminas:
Quinupristina + dalfopristina (Synercid®),
Sin embargo, los presentes señuelos y métodos también pueden usarse para incrementar la eficacia de antibióticos bacteriosláticos, tales como Macrólidos, Ketólidos, Tetraciclinas, Uncosamidas (por ejemplo, clindamicina), Oxazolidinonas (Linezolid),
Cuando los presentes métodos se usan en terapia, un polinucle6tido señuelo puede aplicarse en combinación con uno o más antibióticos, en general antibiótico(s) a los que la célula se vuelve más susceptible por el señuelo. los antibióticos pueden elegirse de los descritos anteriormente.
En algunos casos, es apropiado seleccionar antibiótico(s) para uso según la especie bacteriana y la infección bacteriana que se está tomando como diana.
Por ejemplo, M. tuberculosis es el agente causante de la tuberculosis que actualmente se trata usando: isoniazid, rifampicina, etanbutol, pirazinimida. Por lo tanto, en un método dirigido a M. tUben::ulosis, podrla seleccionarse uno o más de estos fármacos para uso con un polinucle6tido señuelo. De manera similar, las infecciones por S. aureus se tratan típicamente con penicilinas, las infecciones por Gram-negalivas con bacterias que producen p-Iactamasas de espectro extenso, por ejemplo, E. col; o K. pneumoniae, se tratan frecuentemente con p-Iactamas.
En algunos casos, el tipo de polinucle6tido señuelo y los genes cuya expresión aHera en la célula determinarán el tipo de antibiótico(s) para los que la célula se vuelve más sensible (y asl ello los antibióticos) que puede usarse en combinación con el señuelo. Por ejemplo, el TFD FabB descrito en la presente memoria, está dirigido a un sitio de unión para un regulador (FadR) de enzimas esenciales requeridas para la sfntesis de ácidos grasos, Asl, una célula tralada con el señuelo se vuelve más susceptible en particular a antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos grasos. En la presente memoria se proporciona información adicional para dianas especificas.
los presentes señuelos pueden usarse para alterar las respuestas celulares adaptativas o fisiológicas , por ejemplo, cualquiera de las respuestas descritas en la presente memoria. los señuelos también pueden usarse para alterar la expresión de genes esenciales y por 10 tanto alterar la viabilidad de la célula en condiciones en las que el o los genes son esenciales, los señuelos también pueden usarse para alterar la virulencia de la célula.
los señuelos también pueden usarse para incrementar la captación del antibiótico, por ejemplo, causando cambios en la composición de la pared o membrana celular.
los señuelos también pueden estar dirigidos a la regulación de sistemas genéticos desconocidos, en particular aquellos señuelos descubiertos por el proceso n [snare] descrito en PCT/GB2008/003353. En estos ejemplos, puede medirse la consecuencia del tratamiento de las bacterias con los señuelos, por ejemplo susceptibilidad al antibiótico, pero el mecanismo genético subyacente a ese cambio de la susceptibilidad permanece desconocido.
En algunos casos, el tratamiento con señuelos dirigidos a la regulación de genes conocidos, tales como WhiB7 y sus homólogos en mycobacteria, incrementa la susceptibilidad de la célula a antibióticos pero el mecanismo fenotipico subyacente a ese cambio permanece desconocido.
En algunos casos, los señuelos dirigidos a la regulación de genes implicados en la determinación de la sensibilidad a antibióticos por métodos bioinformálicos, tales como los que se identifican por obtención de perfil transcripcional como implicados en la resistencia a glicopéptido en S. aureus y una proporción de los que se ha encontrado que tienen restos reguladores en cis comunes en sus promotores, incrementan la susceptibilidad de la célula a antibióticos pero el mecanismo fenotípico subyacente a ese cambio permanece desconoddo.
los presentes polinucleótidos señuelo tienen varias aplicaciones, incluyendo uso terapéutico, por ejemplo, médico o ' veterinario, y otras aplicaciones ex vivo, por ejemplO, no terapéuticas, por ejemplO, en desinfectantes y productos de limpieza. los presentes señuelos encuentran uso en métodos en los que existe una necesidad de reducir la viabilidad de células procariotas, malar células, inhibir el crecimiento o reducir la virulencia.
Como se ha descrito, los presentes polinucleótidos señuelo y métodos pueden usarse para incrementar la susceptibilidad de procariotas a antibióticos. Así, los señuelos pueden usarse para potenciar los efectos de uno o más antibióticos, tales como los listados en la presente memoria. Esto puede ser para uso médico o veterinario, por ejemplo, para tratar o prevenir una infección bacteriana en los seres humanos o animales, o para uso in vitro, por ejemplo, en una composición de limpieza. Asl, los señuelos pueden encontrar uso en composiciones bactericidas o bacleriostáticas.
Alternativamente, los pOlinucleótidos señuelo y métodos pueden usarse para proporcionar o incrementar la susceptibilidad de procariotas a faclores medioambientales o agentes antibacterianos letales.
los polinucleótidos señuelo y métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para tralar una infección bacleriana en un sujeto que comprende administrar un polinucleótido setiuelo descrito en la presente memoria. El sujeto puede ser un ser humano o animal. Un polinucleótido señuelo descrito en la presente memoria también puede usarse en medicina, por ejemplo, para uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto, y para la fabricación de un medicamento para tratar una infección bacteriana.
Un señuelo puede usarse en combinación con un antibiótico o antibióticos para los que el senuelo hace a la célula más sensible y/o con otro agente antibacteriano. Los antibióticos adecuados se describen en la presente memoria. El antibiótico puede administrarse simultáneamente con, o antes o después del señuelo. El antibiótico y el señuelo pueden administrarse en la misma composición o en composiciones separadas. Así, la invención incluye terapias de combinación en las que un polinucleótido señuelo, como se identifica y/o como se describe en la presente memoria, se administra a un sujeto en combinación con uno o más antibióticos u otras terapias antibacterianas.
la presente descripción incluye una composición fannacéutica o medicamento que comprende un polinucle6tido ser'luelo y un vehlculo o excipiente fisiológicamente aceptable. la composición puede comprender además uno o más antibióticos u otros anti-bacterianos como se describe.
los vehlcutos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son muy conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Phannaceutical Sciences, Mack Publishing Co (A.R. Gennaro edil. 1985). la elección del vehiculo, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse respecto a la ruta pretendida de administración y práctica farmacéutica estándar. las composiciones fannacéuticas pueden comprender como, o además de, el vehlculo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuado.
Puede usarse una variedad de métodos para administrar los señuelos de la presente invención al sitio de la infección bacteriana. los métodos para la administración in vivo y/o in vitro incluyen, pero no están limitados a, administración bucal u oral, administración intravenosa, inyección directa en la infección o inyección indirecta (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular u otros métodos de inyección), aplicación tópica, exposición directa en disolución acuosa o medio, transfección (por ejemplo, fosfato de calcio, electroporación, basada en DEAE-dextrano y mediada por IIpidos), expresión transgénica (por ejemplo, un sistema de expresión de señuelo administrado por microinyección, generación de células madre embrionarias o transferencia retroviral) o cualquiera de los demás sistemas de administración de ácido nucleico usados comúnmente conocidos en la técnica. la administración puede ser en combinación con una dosis adecuada de antibiótico, administrándose el o los antibióticos al mismo tiempo que el señuelo, o separadamente.
Como se describe en los ejemplos más adelante, el número de TFD necesario para mostrar un efecto predecible en la expresión del gen diana y tener un efecto bacteriostático puede ser tan pequeño como cerca de 5.000 moléculas por célula. Se ha mostrado que en los ensayos In vitro estandarizados discutidos en los ejemplos tantas como
1.000.000 células bacterianas se matan eficazmente con tan poco como 1 nM de TFD, lo que sugiere que es suficiente tener una efICacia de transfección de menos de 0,001 % para conseguir la muerte. la cuantificación de la transfección usando microscopia de fluorescencia para medir la captación de un TFD marcado fluorescentemente demuestra que todas las células de S. 8ureus a la vista están transfectadas. En comparación con otras estrategias basadas en ácido nucleico para abordar infecciones bacterianas, tales como antisentido, este número de moléculas necesarias para matar la célula es 100 a 1.000 veces menor. Esto refleja parcialmente que aunque tanto las estrategias antisentido como TFD actúan para inhibir genes, los TFD actúan en una etapa más temprana para evitar la transcripción mientras que antisentido. en la iteración más común, bloquea estéricamente los productos de la transcripción: muchos miles de moléculas de ARNm. En segundo lugar, los TFD se han diseñado para tomar como diana genes esenciales que se inducen positivamente, de manera que necesitan activarse para la supervivencia, y se regulan positivamente (el factor de transcripción dirige su propia producción). In vitro, esta última caracteristica significa que es probable que estén presentes relativamente pocas copias del factor de transcripción cuando el gen no está inducido y de esta manera un pequeño número de TFD puede bloquear la inducción. Puede ser que en una situación terapéutica haya más fadores de transcripción por célula, debido a la variedad natural entre la población bacteriana o que el gen ya esté inducido. En esta situación, se espera que se necesitarán más TFD para observar un efecto terapéutico y estimar que el incremento de la dosis por un factor de 100 (hasta 100 nM) o mejorar la eficacia de la transfección (dos órdenes de magnitud) será suficiente para observar un efecto beneficioso.
Algunos ser'luelos pueden usarse sin antibióticos para tratar o prevenir una infección bacteriana. Por ejemplo, algunos de los sel"iuelos descritos en la presente memoria reducirán la capacidad de la célula para sobrevivir en condiciones de estrés o para expresar genes esenciales u obtener nutrientes esenciales. Algunos senuelos neutralizarán la virulencia celular, por ejemplo, evitando la expresión de factores de virulencia. AsI, los señuetos usados para tomar como diana genes esenciales podrían usarse en si mismos para evitar el crecimiento de bacterias patogénicas particulares, bien como una terapia en si misma o como una forma de medicina preventiva para abordar las bacterias antes de que se vuelvan infecciones. De manera similar, aquellos señuelos dirigidos a genes determinantes de virulencia podrlan usarse en si mismos para prevenir la diseminación de la infección. En otro ejemplo, los senuelos listados en la presente memoria que actúan frente a H. pylori podrían proporcionar terapias independientes frente a úlceras de estómago/desarrollo de cáncer péptico.
De manera similar, los sel"iuelos que actúan para prevenir el crecimiento de Streptococcus mutans podrían usarse para tratar o prevenir la decoloración dental.
La infección particular o afección asociada que el sel'iuelo se usa para tratar es en general dependiente de la célula patogénica a la que está dirigido el señuelo. Las infecciones bacterianas '1 enfermedades asociadas que pueden ser tomadas como diana usando los presentes métodos se listan en la presente memoria en conexión con bacterias particulares '1 en la Figura 2.
Los polinudeótidos sel'iuelo descritos en la presente memoria también pueden usarse in vitre, por ejemplo, en productos anlibacterianos tales como aquellos para limpiar, por ejemplo, desinfectantes, para matar o prevenir el crecimiento o infectividad de bacterias. Cuando un señuelo incrementa la susceptibilidad a antibióticos, tlpicamente la composición antibacteriana también incluye uno o más antibióticos 'l/o uno o más agentes antibacterianos. En un aspecto, la invención se refiere a dicha composición de limpieza.
Los polinude6tidos señuelo pueden usarse además en productos que se aplican en una superficie, tal como una mesa de trabajo o manos, durante un tiempo '1 en condiciones que son suficientes para reducir o prevenir el crecimiento de un microorganismo 'l/o matar un microorganismo, reduciendo o previniendo de esta manera el crecimiento o matando un microorganismo. Por ejemplo, uno o más señuelos pueden pulverizarse en la superficie. Dicha aplicación por pulverización es util, por ejemplo, para preparar una superficie para la preparación de un producto alimenticio o esterilizar un objeto que se va a insertar en un paciente. Esto es porque la pulverización de la formulación de señuelo reduce la manipulación de la superficie u objeto, reduciendo de esta manera más el riesgo de contaminación. Las aplicaciones de lavado de manos '1 boca también se contemplan en el alcance de la invención.
En las circunstancias anteriores, los señuelos pueden formularse en un formato acuoso adecuado. En este caso, la formulación puede comprender agua para forma '1 composición acuosa. La compOSición acuosa puede comprender además disolventes acuosos '1 orgánicos '1 sus combinaciones.
También se describen kits para uso antibacteriano que comprenden un polinude6tido sel'iuelo como se describe en la presente memoria '1 uno o más antibióticos u otro u otros agentes antibacterianos para uso combinado para matar
o inhibir el crecimiento o virulencia de bacterias. Tipicamente, el kit incluye instrucciones para uso. De nuevo, el kit puede ser para uso terapéutico, por ejemplo, frente a infección bacteriana, o para uso no terapéutico, por ejemplo, para limpieza o desinfección.
La invención se describirá ahora con más detalle mediante ejemplos no limitativos con referencia a las figuras siguientes en las que:
Figura 1. Una copia de la Tabla 1 de Poole J. (Antimicrobial Chemother. (2005) 56. 22-24) que lista la resistencia mediada por eflujo a antibióticos no fluoroquinolina '1 antibióticos fluoroquinolina, respectivamente. Los numeros de referencia en la columna de la derecha se refieren a los proporcionados en la publicación.
Figura 2. Una copia de la Tabla 2 de Poole J. (supra) que lista ejemplos de reguladores '1 secuencias reguladoras que pueden ser diana segun los presentes métodos. La Tabla también proporciona ejemplos de cepas bacterianas en las que aparecen los reguladores o secuencias '1 ejemplos de indicaciones de enfermedad asociadas con estas bacterias.
Figura 3. Proporciona una representación gráfica de cómo los plásmidos n[snare] pueden usarse para influir en la expresión génica. Un gen (A) es transcripcionalmente inactivo debido a la unión de un factor de transcripción represor (B) a una secuencia reguladora en cis (C) en el promotor del gen. Cuando se introduce en una célula el plásmido nlsnare] es capaz de influir en la expresión del gen diana mediante la eliminación del factor de transcripción B del promotor genómico para liberar la represión transcripcional del gen en 3' (O).
Figura 4. Muestra el producto de amplificación obtenido usando los cebadores en SEQ ID NOS: 3 '1 4 '1 un sustrato de vector apropiado (Ejemplo 1,2).
Figura 5. Muestra curvas de crecimiento para M. smegmatis cultivado en presencia de concentraciones subinhibidoras de isoniazid (IZ) o rifampicina (RF), en las que las bacterias se han tratado con una secuencia señuelo WhiB7 (+) o se han tratado con una secuencia control negativo (-) como en el Ejemplo 2.
Figura 6. Muestra curvas de crecimiento para E coli crecido en presencia de cerulenina, en las que las bacterias se han tratado con un sef'luelo FabB (dirigido al sitio de unión FadR) o se han tratado con una secuencia control negativo (-), como en el Ejemplo 3.
Figura 7. Muestra curvas de crecimiento para S aureus en condiciones de estrés que surgen de electroporación, en las que las bacterias no están tratadas (primera curva) o se han tratado con un señuelo SsaA (segunda curva) o un señuelo LytM (tercera curva) como en el Ejemplo 4.
Figura 8. Muestra curvas decrecimiento para S. aureus crecido en presencia de medio no inoculado (BHI control negativo), transfectado con un TFO control que tiene una secuencia TFO desorganizada '1 crecido en medio BHI, transfectado con TFO SsaA (que contiene un sitio WaIR) '1 crecido en medio BHI, transfectado con TFO fhu (diseñado para bloquear la captación de hierro) '1 crecido en medio BHI, transfectado con TFO sig '1 crecido en medio BHI, transfectado con un TFD no relacionado y crecido en medio NRPMI (con hierro limitado comparado con BHI) y transfectado con TFD f1m y crecido en medio NRPMI.
Figura 9. Muestra que los TFD Fur no perturban el crecimiento de S. aureus en medio en el que el hierro no es limitante. S. aureus se creció en medio BHI con el Fur_TFD pero sin Gramicidina como un reactivo de transfección (TFD solo; círculos vacíos) o combinando 60 nM Gramicidina con 1 nM de un TFD control (TFD control; triángulos vaclos) y el FuCTFD (Fur_TFD; cuadrados llenos) que se diseña para manipular la expresión del operón fhu. los resultados son la media de tres repeticiones y las barras de error muestran el error estándar.
Figura 10. Muestra que Fur_TFD elimina la represión de los genes fhu. (A). Transfección mediada por gramicidina de S. aureus. las células se trataron con TFD solo, o Gramicidina y bien el Controlo Fur_TFD se recogieron, se lavaron y se lisaron. Se usó cPCR para establecer los nÚmeros medios de TFO respecto al número de genomas. (B). la transfección de Fur_TFO reprime los genes fur en S. aureus. Se usaron muestras paralelas para determinar los niveles relativos de expresión de fhu por cPCR.
Figura 11_Muestra que Fur_TFO previene el crecimiento de S. aureus en medios con hierro limitado. S. aureus se creció en un medio con hierro limitado, NRPMI, con el Fur_TFO pero sin la Gramicidina como un reactivo de transfección (TFO solo; circulas vaclos) o combinando 60 nM Gramicidina con 1 nM de un TFO control (TFD control; triángulos vacíos) y el Fur_TFO (Fur_TFO; cuadrados llenos). los resultados son la media de tres repeticiones y las barras de error muestran el error estándar.
Figura 12. Muestra los resultados de análisis genético para determinar el rango de huésped eficaz potencial del TFO dirigido a Fur de S. aureus (SAfhu). la secuencia consenso derivada ME ME mostrada en el panel superior de la figura es un resto de sitio de unión Fur de S. aureus creado a partir de las secuencias listadas en el panel inferior.
Figura 13. Muestra curvas de crecimiento de tres cepas MRSA bien en presencia de un TFO controlo un TFO (TFO SA3) que contiene las secuencias de reconocimiento -101-35 para el factor Sigma altemativo SigB de S. aureus.
Figura 14. Muestra que los TFO Sig en una configuración Men mancuerna" reprimen el crecimiento de la cepa MRSA clínicamente aislada MRSA-5.
Figura 15. Muestra que TFD WalR en la configuración en mancuerna previene el crecimiento de EMRSA15. El TFD fhu se usa como un control.
Figura 16. Muestra S. aureus crecido en medio BHI con mezcla 1 nM WaIR_ TFO/DOTAP pero sin lisostafina como un reactivo de transfección (TFO solo; circulas vacíos) o combinando 62 I-lg/ml Gramicidina con 1 nM de un TFO control (Ser _ TFO; triángulos vacíos) y el WalR_TFO (cuadrados llenos) que se diseña para manipular la expresión del regulón WaIKR.
Figura 17. No se ha detectado mecanismo de resistencia. (A) Cuentas viables totales de EMRSA-16 después de la finalización de experimentos de crecimiento in vitro descritos en la Figura 1. (B) las células que no fueron matadas por el tratamiento con WaIR_TFO se sub-cul!ivaron y ensayaron en experimentos de crecimiento in vitro. WaIR_TFO mató eficazmente las células sub-cultivadas. Se realizaron cinco rondas posteriores y no se observó re-crecimiento para aquellas células tratadas con WaIR_TFD como se determina midiendo las cuentas viables totales. (e) De manera similar, las curvas de crecimiento de bacterias que hablan sido expuestas previamente a cuatro rondas de selección con TFD no mostraron signos de resistencia ya que fueron matadas eficazmente. El crecimiento celular se midió registrando A420 de los cultivos durante un periodo de 30 h. las células no se trataron (medio solo; círculos abiertos). se trataron con el TFO control más mezcla de transfección (triángulos abiertos) o el WaIR_TFO más mezcla de transfección (cuadrados llenos).
Figura 18. Experimentos de microdilución demuestran que sólo se necesita un contacto limitado para que WaIR_TFO mate a EMRSA-16. las células no se trataron (medio solo; círculos abiertos). se trataron con el TFO control más mezcla de transfección (triángulos abiertos) o el WaIR_TFO más mezcla de transfección (cuadrados llenos) por incubación durante 30 minutos antes de ser diluidas 100 veces en medio sin agentes de transfecci6n ni complejos de TFO. Sólo aquellas células tratadas originalmente con WaIR_ TFO fueron incapaces de crecer.
Figura 19. WalR_TFO es tan eficaz como vancomicina para matar EMRSA-16 en un modelo de sepsis en ratón. Se midió la carga renal de EMRSA-16 después de la infección sistémica de ratones y tratamiento con el TFO control (Scr_TFO, 1 nM WaIR_TFO, vancornicina y vehiculo solo).
Figura 20. Muestra que la transfección de E coli con TFO FabB sensibiliza a las bacterias a antibióticos (cerulenina) que inhiben la síntesis de ácidos grasos. TFO WhiB7 se usa como un control negativo ya que es un FD que porta una secuencia que no aparece en el genoma de E. coli.
Figura 21. Muestra que la transfección de un TFO que contiene la secuencia de reconocimiento para el factor 0"54 de Klebsiella pneumoniae retarda el crecimiento bacteriano. TFO WhiB7 se usa como un control negativo.
Figura 22. Muestra secuencias identifICadas como sitios de unión WalR para encontrar concordancias cercanas en
S. Bureus y otros organismos. Se muestra un subconjunto de aciertos a partir de los OJales se ha derivado una secuencia consenso.
Figura 23. El panel A muestra una secuencia consenso derivada de MEME para el sitio de unión Siga de S. aureus. El panel S lista ejemplos de ocurrencias (con vatores E < 100) de concordancias a una secuencia consenso en SaciUales (infecciones Gra~positivas para las que los géneros representativos incluyen Bacillus. Listeria y Staphylococcus).
Figura 24. El panel A muestra que TFo KP _Sig mata a K. pneumoniae in vitro. El TFo que contiene la secuencia KP _Sig previno el crecimiento celular in vitro (KP _Sig. cuadrado lleno). Se usaron dos controles: células no tratadas
(K. pneumoniae. circulo vacio) y un TFo control que consiste en una secuencia desorganizada (TF0 control KP. triángulo vacio). El panel S muestra una seruencia consenso derivada de MEME para el sitio de unión Sig de K. pneumoniae.
DesCripción breve de las secuencias
SEO ID NOS: 1 y 2 -cebadores oligonudeotldicos usados para la amplificación de una secuencia diana del vector
pGEMT-Easy como en el Ejemplo 1.1. SEO ID NOS: 3 y 4 -cebadores oligonudeotídicos usados para la amplificación de una secuencia diana del vector pGEMT-Easy en la producción de sefiuelos en mancuema como en el Ejemplo 1.2.
SEO ID NO: 5 -el sefiuelo WhiS7 usado en el Ejemplo 2 SEO ID NO : 6 -el sefiuelo FabS usado en el Ejemplo 3
SEa ID NO: 7 -el sefiuelo LytM usado en el Ejemplo 4 SEa ID NO: 8 -el señuelo SsaA usado en el Ejemplo 4 SEa ID NO: 9 -un sitio de unión nativo WhiS7 en M. smegmstis cepa MC2 155 SEO ID NO: 10 -un sitio de unión nativo FadR en E. coN K12 SEa ID NO: 11 -un sitio de unión nativo para YycFNycG en S. aureus SEO ID NO: 12 -un sitio de unión nativo para YycFNycG en S. aureus SEa ID NO: 13 -un sitio de unión nativo para SigB en S. sureus SEa ID NO: 14 -un sitio de unión nativo para SigB en K. pneumoniae SEa ID NO: 15 -una secuencia consenso para la unión de Fur en S. aureus SEa ID NO: 16 -una secuencia consenso para la unión de Fur en E. coli SEa 10 NO: 17 -una secuenda de unión nativa para Fur en H. pylori SEa ID NO: 18 -un sitio de unión consenso para TcdR en C. difficile
SEa 10 NO: 19 -un sitio de unión consenso para Vfr en P. aeruginosa SEa ID NO: 20 -un sitio de unión nativo para Vfr en P. aeruginosa SEa 10 NO: 21 -un sitio de unión nativo para Vfr en P. aeruginosa SEa ID NO: 22 -un sitio de unión nativo para NtrC en K. pneumoniae SEa 10 NO: 23 -una secuencia de unión nativa para ArsR en H. pylori SEa ID NO: 24 -una secuencia de unión nativa para ArsR en H. pylori SEO ID NO: 25 -una secuencia consenso resistente a glicopéplido en S. aureus SEa ID NO: 26 -un resto de unión Agr en S. aumus SEa ID NO: 27 -un resto de unión Agr en S. aumus
SEa ID NO: 28 -secuencia de cebador directo para la preparación por PCR del TFO SaslgB
SEO ID NO: 29 -secuencia de cebador inverso para la preparación por PCR del TFo SasigB SEO ID NO: 30 -secuencia de cebador directo para la preparación por PCR del TFO SAfhu SEO 10 NO: 31 -secuencia de cebador inverso para la preparación por PCR del TFO SAfhu SEO ID NO: 32 -secuencia de cebador directo para la preparación por PCR del TFO SsaA SEO ID NO: 33 -secuencia de cebador inverso para la preparación por PCR del TFO SsaA SEO 10 NO: 34 -secuencia control SEO ID NO: 35 -secuencia control SEO 10 NO: 36 -secuencia de cebador directo para la amplificación por PCR de ARNr 16s SEO 10 NO: 37 -secuencia de cebador inverso para la amplificación por PCR de ARNr 16s SEO 10 NO: 38 -secuencia de cebador directo para la cuantificación por PCR del gen fhu
SEO 10 NO: 39 -secuencia de cebador inverso para la cuantificación por PCR del gen fhu SEO 10 NO: 40 -secuencia oIigonudeotídica del TFO Sig en mancuerna fosforilada SEO ID NO: 41 -secuencia oligonucleotidica del TFo Sig en mancuerna fosforilada SEO 10 NO: 42 -cebador fosforilado para TFO en mancuerna que contiene la versión desorganizada del sitio de
unión Sig
SEO ID NO: 43 -cebador fosforilado para TFo en mancuerna que contiene la versión desorganizada del sitio de unión Sig SEO 10 NO: 44 -oligonucleótido en mancuerna fosforilado que incorpora la secuencia de unión para WalR SEO 10 NO: 45 -oligonude6tido en mancuerna fosforilado que incorpora la secuencia de unión para WalR SEO 10 NO: 46 -oligonudeótido en manOJerna fosforilado que incorpora una versión desorganizada del sitio de
unión de WalR
SEO 10 NO: 47 -oligonucleótido en manOJerna fosforilado que incorpora una versión desorganizada del sitio de unión de WalR SEO ID NO: 48 -oligonucleótido fosforilado que incorpora el sitio de unión para WalR SEO 10 NO: 49 -oligonude6tido fosforilado que incorpora el sitio de unión para WalR SEO 10 NO: 50 -cebador directo para el promotor FabB SEO ID NO: 51 -cebador inverso para el promotor FabB SEO ID NO: 52 -cebador directo para TFO WhiB7 SEO 10 NO: 53 -cebador inverso para TFO WhiB7 SEO 10 NO: 54 -cebador directo para TFo que contiene la secuencia de reconocimiento para el factor 0"54 de K.
pneumoniae
SEO 10 NO: 55 -cebador inverso para TFO que contiene la secuencia de reconocimiento para el factor 0"54 de K
pneumoniae
SEO ID NO: 56 -secuencia de un péplido que penetra en células SEO 10 NO: 57 • secuencia consenso de TFo WalR SEO ID NO: 58 -secuencia consenso de TFO SigB SEO ID NO: 59 -secuencia de TFo KP _Sig SEO 10 NO: 60 -secuencia consenso de TFo KP _Sig
EJEMPLOS
Aunque en general muchas de las técnicas mencionadas en la presente memoria son muy conocidas en la técnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook y Russell, 3' Edición 2001, Molecular Cloning: a laboratory
manual.
Ejemplo 1
1.1 TFD marcados con colesterol en presencia de Estreptofisina-O
Usando cebadores oligonucleotídicos, uno de los cuales tiene una modificación 5' con colesterol y el otro una modificación similar en su extremo 5' o alguna otra (tal como un agente de tinción fluorescente, tal como Cy5, de manera que la captación del señuelo del factor de transcripción (TFD) puede medirse fácilmente) se prepara un TFD por PCR. Si el TFD se ha clonado previamente en un vector (pGEMT-Easy) los cebadores se diseñan para hibridar con las secuencias del vector que flanquean inmediatamente el inserto, por ejemplo:
SEQ ID NO: I ChoIJEf: S' Colesterol -TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG
AArrC
SEQ ID NO: 2 Cy5_TEr: 5' Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CACTAG TG.
Si la secuencia que se va a usar para un TFD no se ha donado puede sintetizarse directamente (si es lo suficientemente corta) e hibridarse para formar el TFD o amplificarse directamente a partir del ADN genómico usando cebadores disenados para hibridar en el TFD.
El producto de PCR se precipita con etanol y se resuspende en tampón TE (10 mM Tris.HCI, 1 mM EDTA pH 8,0) a una concentración de 500-1.000 ngl~.II. Típicamente, los ensayos de sensibilidad a antibiótico se realizan usando placas de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo 200 mi de caldo. Por ejemplo, en el caso de Enterococcus faecium este caldo es medio BHI (Infusión Cerebro Corazón) (Becton Dickinson) suplementado con 0,2 Ulml de Estreptolisina-Q (Sigma) y 5 IJg/ml de antibiótico vancomícina y se inocula con una cepa resistente a vancomicina de
E. faecium.
1.2 Preparación de Estructuras en Forma de Mancuerna por PCR
los señuelos en forma de mancuerna son ADN monocalenario cerrado covalentemente caracterizados por un centro bicatenario, que contiene el sitio de unión para el factor diana, flanqueado por estructuras en horquilla. las horquillas estabilizan el señuelo evitando la acción de exonudeasas que de otra manera degradarían el polinucleótido señuelo. Por lo tanto, los señuelos en forma de mancuerna (DB) se llaman as! por su forma característica.
los DB se preparan por PCR usando como molde un plásmido derivado de pGEMTEasy que contiene el sitio de unión diana, como se describe en la sección 1.1. los cebadores usados en la amplificación son:
SEQ ID NO: 3 DBTEf: S' P-mGG 111 11 CCAAG AGAAGAGC CCG CCA TGG
CGG CCG CGG GAA TIC
SEQ ID NO: 4 DBrEr: P-CCG Ter m TGA CGO COA AOA GCA GOC GOC CGC
GAA Trc ACT AGT GA
la parte de los cebadores que formará las horquillas está subrayada. la amplificación con el vector apropiado proporciona el producto de ADN mostrado en la Figura 4, en el que la parte del DB que se unirá al factor de transcripción se proporciona por "NNN NNN". las secuencias mostradas en negrita representan un sitio de unión' para la enzima de restricción de mellado Nt.BspQ1 . En la segunda parte de la Figura 4, se muestra la consecuencia de digerir el producto de PCR con Nt.BspQ1; esto expone las estructuras en horquilla como regiones monocatenarias que formarán una horquilla y pueden ligarse posteriormente por tratamiento con ADN ligasa T4 para formar un circulo cerrado covalentemente y DB.
1.3 Preparación de ofigonucleótidos en forma de mancuerna por digestión por restricción del plásmido
Alternativamente, pueden preparase estructuras en forma de mancuerna clonando el producto de PCR romo mostrado en la Figura 4 en un vector de donación de PCR adecuado, lo que confirma su identidad y preparación del plásmido. El plásmido puede digerirse para liberar el inserto que se digiere adicionalmente con Nt.BspQ1 para liberar el fragmento mostrado en la segunda parte de la Figura 4. ~ste puede tratarse de manera similar con ADN
ligasa T4 con el fin de cerrar covalentemente la molécula de ADN y formar un DB.
La ventaja de esta estrategia es que es más factible, tanto prácticamente como económicamente, para aumentar de
escala si la estructura en forma de mancuema se requiere en grandes canlldades.
5 1.4 Trans{ección con el agente R9-cofesterof.
El R9-colesterol se ha descrito por sus propiedades de ayudar en la transfecci6n de moléculas de siARN (u otra terapia basada en ácido nucleico) y semejantes en células eucariotas (Solicitud de Patente US No. 2007-0207966). Aquí describimos su utilidad para transfectar varias bacterias con TFD.
El R9-colesterol, que consiste en una molécula de colesterol unida a una cadena lineal de nueve D-argininas, se
10 sintetiz6 como se ha descrito previamente (Kim w.J. et al., Mol. Ther (2006) 14: 343-350). Los TFD se mezclaron con cantidades crecientes de R9-colesterol en un tampón basado en TE suplementado con 5% glucosa. La mezcla se incub6 a temperatura ambiente durante 1 hora y se us6 directamente en transfecciones o se analiz6 por electroforesis en gel de agarosa. Tlpicamente, se us6 la cantidad minima de R9-colesterol que causaba que el complejo con ADN no corriera en el gel; es decir, la carga del nucleo de ácido nucleico se habla neutralizado por la
15 unión de poli-arginina. La molécula de colesterol ayuda a que el TFD se asocie con la membrana bacteriana y de esta manera entre en la célula.
Los conjugados TFD/R9-colesterol se mezclaron a varias concentraciones en 200 !JI de cultivo en una placa de 96 pocillos. Por ejemplo, en el caso de Enteroooceus {aeeium este caldo es medio BHI (Becton Dickinson) suplementado con 0,2 U/mi de Estreptolisina-O (Sigma) y 5 !Jg/ml de antibiótico vancomicina y se inocul6 con una
20 cepa resistente a vancomicina de E. {aedum.
Ejemplo 2
Sel'luelo WhiB7 para sensibilizar Mvcobaclerium smegmatis a antibióticos
WhiB7 es un gen en Mycobaclerium smegmat;s que se ha mostrado que tiene un papel en la deteOllinaci6n de la
sensibilidad de esta bacteria a antibióticos. La deleción funcional de este gen convierte a la baderia en hipersensible
25 a antibióticos (PNAS (2005) 102: 122(0). Se cree que WhiB7 es un regulador transcripcional y varios de dichos genes se han descrito en la bibliografla. Un homólogo cercano de WhiB7 existe en el pat6geno Myeobaeterium tuberculosis que es el agente causante de la Tuberculosis.
Se prepar6 un oligonucle6tido setiuelo que contiene la secuencia señuelo WhiB7 como se describe en el Ejemplo
1.1 y se usaron varias concentraciones para transfedar M. smegmatis crecido en 20 mi de caldo (en matraces con
30 agitaci6n de 200 mi que contienen un deflector metálico). El medio usado fue 9H11 (Becton Dickinson) suplementado con 10% ODAC (Becton Dickinson) y concentraciones sub-inhibidoras de los antibi6ticos isoniazid (IZ)
o rifampicina (RF). los matraces se incubaron a 3'tC con agitación y a varios intervalos se tomaron muestras y se midieron sus absorbancias (para monitorizar el crecimiento celular). Los matraces se trataron con 100 nM del TFD WhiB7 (+) o se trataron con el TFD control negativo (-). Fue evidente que en los matraces tratados con el TFD
35 WhiB7, pero no con el TFD control, las células se volvieron sensibles a los dos antibióticos ensayados (véase la Figura 5).
SEQ ID NO: 5 -WhiB7 TFO S' TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG
TGG CCT 3'
Ejemplo 3
Señuelo FabB para regular a la baja genes esenciales de Escherichia col;
40 El sel'\uelo FabB contiene el sitio de unión para el regulador FadR que controla la expresión de genes implicados en . la ruta esencial de la síntesis de ácidos grasos (incluyendo fabA y fabB). Se ha demostrado que la ínactivación funcional del gen fadR resulta en Escherichia 00/; resulta en una cepa que es deficiente en aspectos de la síntesis de ' ácidos grasos y es íncapaz de crecer en presencia del antibiótico cerulenina (que está dirigido a la síntesis de ácidos grasos (J. Bacteriol. (2005) 183: 5292»
45 El señuelo FabB contenla la secuencia:
SEQ ID NO: 6 FabB TFD S' TIT ATI CCG AAC TGA TCG GAC TIG TIC AGC GTA
CAC GTG TIA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3'
El sel'luelo se preparó como se describe en el Ejemplo 1.1 y se usó a varias concentraciones para transfectar un pocillo de una placa de 96 pocillos que contenía 200 I.!I de medio Rico (10 g Triptona, 5 g NaCI, 1 g Extracto de
45 lOSe transfectaron polinudeótidos s~uelo en S. aureus por eletroporación. Las células bacterianas se prepararon ~r
levadura por litro y sUplementado con 0,2% glucosa y 0,4% acetato, concentraciones finales) suplementado con 1 ",g/mi cerulenina (Sigma). Las placas se incubaron a 3f1C con agitación y se tomaron lecturas de absorbancia (a 595 nm) usando un lector de placas. Todos los puntos de datos se realizaron en triplicada. Las bacterias bien no se trataron con los TFD (No tratadas), se Iransfectaron con TFD FabB (FabB) o un control negativo que consistió en un TFO cuya secuencia no aparecia en el genoma de E. coli (Van).
Como es evidente en la Figura 6, la muestra no tratada y el control negativo crecieron ambos a velocidades comparables en el caldo pero el tratamiento con el TFO FabB causó que las células no crecieran apenas.
Ejemplo 4
Señuelos para sensibi~zar Staphylococcus aureus a repuesta al estrés
métodos estándar. Brevemente, las células se crecieron hasta la fase exponencial temprana en medio LB a 3"fC como se define al alcanzar una Absorbancia de 0,3 a 420 nM. Las células se enfriaron hasta 4°C y se recogieron por centrifugación a velocidad baja y se lavaron tres veces en un volumen similar de glicerol 10"10 (vlv) estéril, enfriado en hielo. Finalmente, las células se resuspendieron en un décimo de su volumen original en 10% glicerol. La electroporación se realizó mezdando 50 ",1 de células con 1 ",1 de TFO (tlpicamente 100 ng a 1 ",g de AON) en una cubeta de electroporación y se electroporaron en un GenepUlser de BioRad con ajustes de 2,5 kEV, 100 n y 25 ",F, proporcionando constantes de tiempo en el intervalo 3,8 a 4,8 ms. Tipicamente, se usaron 50 ",1 de células electroporadas para inoaJlar 10 mi de medio BHI o LB con 30 mM KOH (para inducir respuesta al estrés). Se alicuotaron 200 ",1 de células en pocillos de una placa de 96 pocillos que se incubó a 3f1C con agitación moderada, el crecimiento se monitorizó midiendo la absorbancia. Las representaciones de las curvas de crecimiento demostraron los efectos de TFO especificos en ralentizar la velocidad de crecimiento comparado con un control que se habia obtenido mediante una electroporaciÓrl simulada (en la que no se habla transfectado AON) o transfectado con una secuencia no relacionada (Figura 7). Las secuencias set'iuelo siguientes fueron capaces de ralentizar el crecimiento de S. 8ureus en condiciones de estrés:
SEQID NO: 7: LytM TFD S' GCT AITITG TAA TGA CAA TGT AAT GAG ITT
AGT AAAAA3'
SEQ IDNO: 8SsaA TFO 5'ATI ACAAATTIGTAA CAGACTTATTTT A3'.
Ejemplo 5
El TFD Sig inhibió el crecimiento de S. aureus
Sig_ TFO contenia el sitio de unión para la proteína SigB de S. aureus. Esta proteína es el factor sigma alternativo que controla un gran conjunto de genes relacionados con el estrés (Wigneshawerajaj, Molecular Microbiology (2008)
68: 538). Mediante la transfección de células de S. aureus con este TFO y crecimiento de las células en placas de 96 pocillos en medio definido. es evidente que el TFO inhibe el crecimiento de las células. El AON de Fhu contiene el sitio de unión para el factor de transcripción Fur que regula la captación de hierro en condiciones en las que este Ión es limitante (Horsburgh et al, J. Bacteria!. (2001) 183: 468). SsA contiene el sitio de unión para el regulador con dos componentes WaIR, que se ha mostrado previamente que regula 12 genes que influyen en la velocidad de crecimiento (Dubrac y Msadek, J. Bacteriology (2004) 186: 1175).
5.1 Preparación de TFD por PCR
Los TFD se preparan por PCR como se describe en la solicitud en tramitación con la presente PCT/GB20081003353. Los cebadores oligonucleotidicos usados en la reacción de PCR modificados típicamente en el extremo 5', por ejemplo, uno de los cuales tiene una modificación 5' colesterol. Otras modificaciones usadas induyen biotina, aminas, péptidos que penetran en células, marcador fluorescente, tal como Cy5 o fluoresceína, de manera que la captación del TFD puede medirse fácilmente. Otras modificaciones consideradas para ensayar induyen lipidos que son caracteristicos de las membranas de bacterias patogénicas. los TFO generados por PCR pueden modificarse por lo tanto en sus extremos 5' con una variedad de moléculas que sirven para: incrementar la estabilidad in vivo del TFO; incrementar la eficiencia de la captación; permitir la detección por fluorescencia. Si el TFD se ha donado previamente en un vector (pGEMT-Easy), los cebadores se diseñan para hibridar con las secuencias del vector que flanquean inmediatamente el inserto, por ejemplo:
SEQ ID NO: 1-ChoLTEf: S' Colesterol-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG
AATTC3'
SEO ID NO: 2-Cy5_ TEr: S Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG 3'.
El producto de PCR se precipita con etanol y se resuspende en tampón TE a una ooncentración de 500-1.000 ng/f.ll
los TFD se clonan hibridando entre si parejas de oligonudeótidos fosforilados sintéticos que contienen el sitio de unión que se va a ensayar. Cada pareja de oligonude6tidos contiene una adenina en el extremo 3', esto es para facilitar la clonación en el vector pGEM_Teasy que tiene protuberancias de timina en 5' (para acelerar la donación de los productos de PCR).
las secuencias de cebador que se usaron para el TFD Sig son:
SEQ ID NO: 28-SasigB DIR: GAA GATTAG AAA TTA TTTCGA TGGGTAT ATA
ATA A
SEQ ID NO: 29 -SASigB INV: TATTAT ATA CCC ATC GAA ATA ATITCf AAT
CTICA
las secuencias de cebador que se usaron para el TFO Fhu son:
SEQ ID NO: 30 -SAfhu DIR: ACf ACA AGT ACf ATI AGT AAT AGT TAA CCC
TA
SEQID NO: 31-SAfhu INV: AGGGTT AACTATTACTAA TAGTACTIGTAG
TA
las secuencias de cebador que se usaron para el TFD SsaA son:
SEQIDND:32-SsaA DIR:ATI ACAMTTIGTMCAGACTTATTTI A SEQIDND:33-SsaA INV: AMATAAGTCTGTIA CM ATI TGT MTA
5.2 Realización de estudios de crecimientQ en placas de 96 pocillos
Se prepararon polinucleótidos senuelo marcados con colesterollCy5 como en la sección 5.1. Tipicamente, se formó un complejo con 1 f.lg de TFO y 0,3 f.l1 del reactivo de transfección liposomal OOTAP (Rache) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 mino los ensayos para determinar su efedo en el crecimiento de células bacterianas se realizaron usando placas de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo 200 f.l1 de caldo que consistía en medio BHI (de Bedon Dickinson), que no está limitado en hierro, suplementado con 60 nM Gramicidina (de Sigma Corporation. Cal# G5002) o medio desprovisto de hierro (NRPMI) suplementado de manera similar con Gramicidina. El método para la depleción del hierro se describe completamente en otro lugar (Science (2004) 305: 1626-1628). Se anadió 1 f.l1 de varias concentraciones de un senuelo marcado con ColesterollCy5 formando un complejo con TFD a cada pocillo y su efedo en el crecimiento bacteriano de S. aureus se monitorizó midiendo la absorbancia del caldo a intervalos durante la incubación. las placas se incubaron a 3'flC con agitación y se tomaron lecturas de absorbancia (a 450 nM) usando un lector de placas. Se ensayaron varios senuelos: Sig, fhu y SsaA.
Como se puede observar en la Figura 8, es evidente que el tratamiento con tan poco como 10 nM de TFD Sig previno el crecimiento en medio BHI, mientras que una cantidad similar del TFO fhu no tuvo efedo en el crecimiento bacteriano en este medio, que no es limitado en hierro. 10 nM del TFD SsaA resultaron en un retraso mensurable en el crecimiento bacteriano.
Cuando se usó un medio con hierro limitado, 10 nM del TFD fhu se mostró capaz de prevenir el crecimiento, mientras que una cantidad similar de un TFO control (SsaA) no tuvo efecto en el crecimiento bacteriano en estas condiciones
Ejemplo 6
los TFD Fur controlan la expresión de nJU y previenen el crecimiento de S. aureus en medios con hierro limitado
Se diseñaron TFO para unirse al factor de transcripción Fur, que juega un papel central en el control de la captación de hierro bacteriana (Somerville y Proctor (2009) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 73: 233-248), regulando negativamente el operón n/U que controla la entrada de hierro secuestrado. El hierro es esencial para el crecimiento -se necesita para la transferencia de electrones y actúa como un cofador en muchos procesos enzimáticos. Sin embargo, en el huésped, el hierro está presente en cantidades limitadas y habitualmente se vuelve inaccesible a las bacterias por la incorporación en proteínas vehículares del huésped tales como transferrina y lactoferrina. En respuesta a esto, S. aureus sintetiza quelantes de hierro de alta afinidad, siderÓforos, que unen hierro y usan transportadores ABC, tales como el codificado por fhuCBG, para importar el complejo hierro-sideróforo en el citoplasma bacteriano. Como la importación de hierro en exceso resultaria en la formación de radicales libres por la reacciÓn de Fenton, con daño celular posterior (Wandersman y Oelepelaire, Ann Rev Microbiol (2004) 58: 611--647), la captación de hierro debe estar muy regulada. Las cepas con inactivación de Fur crecen poco en medios con hierro limitado in vitro y pierden su patogenicidad en modelos animales (Horsburgh, et al. J. Bacteriol (2001) 183: 468-475), lo que demuestra el potencial de Fur como una diana terapéutica.
6.1 M¡;;TOOOS 6.1.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se crecieron cultivos de S. aureus ATCC 6538NA y se mantuvieron en medio BHI (Becton Oickinson). Se prepararon preparaciones madre congeladas mezclando volúmenes iguales de un cultivo en crecimiento exponenciallemprano (DO de 0,3 a~)con 50% glicerol y congelando a _80oC. BHI fue el medio usado para condiciones no limitanles de hierro y NRPMI, que se había preparado como se ha descrito previamente (Skaar et al. 2004), para condiciones de crecimiento limitantes de hierro.
6.1.2 Preparación de TFO
Los plásmidos que contienen las secuencias TFO se crearon hibridando oligonucleótidos que contienen el sitio de unión para Fur (SAFur1, 5' P-ACT ACA AGT ACT ATT AGT MT AGT TM CCC TA-3' (SeQ ID NO: 30) y SAFur2, 5' P-AGG GTT MC TAT TAC TM TAG TAC TTG TAG TA-3' (SeQ ID NO: 31» y una secuencia control (Con1 , 5' P-TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TA-3' (seQ ID NO: 34) y Con2, 5' P-ACG GAC CCG CAG TCA CCC GGA TCC GTG GCC M-3' (SeQ ID NO: 35», ligándolos en el vector pGEMTEasy (Promega) y transformándolos en E. coli OH5a. (Invitrogen). los TFO se amplificaron por PCR usando cebadores marcados dirigidos pGEMTeasy col-Tef (5'-CoIesterol-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG MT TC-3' (SeQ ID NO: 1» y cy5-Ter (5'-Cy5-AGG CGG CCG CGA A TT CAC T AG TGA-3' (SEQ ID NO: 2» y se purifICaron por precipitación con etanol.
6.1.3 Procedimiento de transfección
Una disolución madre de gramicidina (Sigma) se preparó fresca disolviendo 21 mg en 1 mi de metanOí, diluido antes de uso en agua y diluyendo ademas 1/100 en medio de crecimiento para proporcionar una concentración final de 60 nM. El medio suplementado se inoculó 1/100 con la preparación madre congelada de S. aUleus y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min o Se formaron complejos TFO-OOTAP mezclando 1 f.lg de TFO con 2 f.lg de OOTAP (Roche) e incubando a temperatura ambiente durante 10 min en la mesa de trabajo. El complejo TFO se mezcló con medio inoculado, se alicuoló en placas de 96 pocillos de fondo redondo y el crecimiento se analizó cultivando a 3"fC con agitación en un lector de placas BioTek.
6.1.4 Cuantificación del número de TFO porcPCR en tiempo real
las células de pocillos individuales se lavaron dos veces en PBS (disolución salina tamponada con fosfato) y se resuspendieron en 100 f.l1 de agua. Se usó 1 f.l1 de cada muestra en cada reacción de cPCR, mezclando los estandares de AON o muestras con cebadores para amplificar el TFO (Tef y Ter; SEQ ID NOs 1 Y 2) o ARNr 16S (stypF, 5'-ACG GTC TTG CTG TCA CTT ATA-3' (SeQ ID NO: 36); stypR, 5'-TAC ACA TAT GTI CTI CCC TM TM-3' (SeQ ID NO: 37» en 12,5 f.l1 de mezcla de AON SYBR Green suplementada con 0,5 f.lI de ROX (Invitrogen). los datos resultantes se usaron para calcular el número de TFO presentes por genoma.
6. 1.5 Análisis de ARN
Los cultivos se trataron con reactivo protector de ARN (Qiagen) y las bacterias se recogieron como se ha descrito y se almacenaron a _80oC. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 111 de tampón TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EOTA) que contenía 100 I1g/mllisostafina y se incubó a 3"fC durante 30 min para lisar las células. Se af'ladieron 700 111 de tampón RLT (kit de extracción de ARN de Qiagen) y el ARN se recogió según el protocolo del fabricante . • Cualquier AON restante se digirió usando una AONasa 1 de Invitrogen, mezclando 2,5 I1g de la muestra de ARN con 1,25 U de AONasal en 25 111 a temperatura ambiente durante 15 mino la enzima AONasal se desactivó añadiendo 2,5 111 de 25 mM EOTA y calentando a 650C durante 10 min y el ARN tratado se usó para slntesis de AONc usando sintesis de cebador aleatoria (NEB Protoscripl). Usando métodos estándar de PCR en tiempo real, el AONc se usó para cuantificar la transcripción relativa usando cebadores para el gen fhu (qSAfhuF, 5'-CGT CM TCA TTG GTC
CTA ACG GCT GC-3' (SEQ ID NO: 38); qSAfhuR, 5'-GCC ATC TGC TAC TIC AGG TGA TIG AGG-3' (SEQ 10 NO: 39» y nonnalizando usando niveles de ARNr 16S (usando los cebadores stypF y stypR; SEQ ID NOs: 36 y 37).
6.2 RESULTADOS 6.2.1 Transfecci6n de TFD Furen medio no limitante de hienDo
la disponibilidad del hierro influye en la regulación de cincuenta y nueve genes de S. aureus de los cuales se ha mostrado que diecisiete están regulados por Fur (Allard el al, Microbiol. Infecl. (2006) 8: 1679-1690; Xiong el al, J. Infect. Dis. (2000) 181: 1020-1026; Horsbur9h et al, J. Bacteriol. (2001a) 183: 468-475). Fur también actúa como un regulador positivo de algunos genes regulados por Per, incluyendo katA, que codifica una catálisis requerida para la resistencia al estrés oxidativo (Horsburgh et al, Infect. Immun. (2001b) 69: 3744-3754; Morrissey et al, Infect. Immun. (2004) 72: 972-979) y consecuentemente los mutantes fur están así comprometidos en su capacidad de prevenir la fonnación de radical hídroxilo tóxico. Estas propiedades reguladoras diversas y complejas pueden ser las responsables de la reducida virulencia del mutante fur de S. aureus. Para evaluar la aplicabilidad de la estrategia TFD para modular la actividad de Fur, se diseñó un TFO que incorpora el sitio de unión de Fur, que se habla identificado previamente por experimentos de impronta realizados en el promotor fhu de S. aureus (Xiong el al. 2000). El TFO control consistió en una secuencia no relacionada con una composición en nucle6tidos similar que no aparece en el genoma de S. Bureus; esto fue para establecer si la acción del TFO Fur era especifica de secuencia y su habia un efecto de producir la muerte causado sólo por el procedimiento de transfección. Cada secuencia de nucle6tido se li9Ó en el vector de EscherichiB coli pGEMTEasy y los plásmidos resultantes se usaron con cebadores que flanquean el sitio de inserción para generar los TFD por PCR. los cebadores se modificaron rutinariamente en el extremo 5', parcialmente para incrementar la estabilidad de los TFD Prote9iéndolos de exonucleasas, pero también para funcionalizar la molécula con colesterol (cebador directo) y un marcador cy5 (cebador inverso). Por lo tanto, las longitudes totates de los TFD fueron 60 pb para el TFD Fur y 62 pb para el TFO Control.
Para conse9uir la transfección, los TFO se mezclaron con la preparación lipldica disponible comercialmente DOTAP para formar un complejo estable y proteger la carga negativa del núcleo fosfato. El complejo TFD-DOTAP se mezcló con S. aureus en BHI, un medio no limitante en hierro, que se habla suplementado con 60 nM gramicidina. la gramicidina es un péptido antimicrobiano con actividad frente a las membranas de bacterias Gram-positivas (Herrell y Heilman, J. Clin. tnvesl. (1941) 20: 583-591). Experimentos previos por los inventores han establecido que concentraciones sub-letales de gramicidina eran suficientes para permitir la fusión del complejo TFD-DOTAP con la membrana bacteriana y captación del TFO. la adición de los reactivos de transfección junto con el TFO control resultó en una reducción de la velocidad de crecimiento de S. aureus Esto se debe probablemente a alguna actividad bactericida causada a través del debilitamiento de la pared celular. la transfección usando 1 nM bien de TFD Fur o control resultó en curvas de crecimiento muy similares en un medio rico en hierro (Figura 9). De forma interesante, la inactivación de furmostró un defecto en el crecimiento en medio rico (Horsburgh el al, 2001) mientras que no se observó diferencia entre la muestra tratada con control y Fur_TFO. Una explicación para la diferencia podría ser tas diferentes condiciones decrecimiento (por ejemplo, baja aireación en las placas de 96 pocillos) y medios pero más pertinente podria ser las diferencias fundamentales entre una inactivación genética y los efectos del tratamiento con TFD. El FuCTFO prevendrá la Ulión de cualquier factor de transcripción capaz de unirse a ese sitio, no sólo la proteina Fur sino proteinas adicionales que se unen al mismo sitio. Se está aceptando cada vez más que la regulación transcripcional en bacterias es mas compleja de lo que se pensaba previamente y, como en eucariotas, tiene contribuciones de muchas redes reguladoras y por lo tanto es modular, con más de un factor de transcripción influyendo en la expresión (Bamard et al, Curro Opino Microbiol. (2004) 7: 102-108).
Se realizó PCR cuantitativa para establecer si la transfección de la célula había ocurrido y si era asi cuántos TFD habían entrado por genoma. En ausencia de gramicidina y DOTAP, los TFD no se detectaron en el interior de o unidos a las células bacterianas, lo que demuestra que los TFO no entran en las células espontáneamente y que el procedimiento de lavado habia eliminado con éxito cualquier TFD asociado no específicamente con la superficie celular. En presencia de los reactivos de transfección, Fur y el TFD Control se detectaron a 4.500 y 5.340 TFD por genoma, respectivamente (Figura 10A). Por lo tanto, el procedimiento de transfección estaba administrando un número sustancial de ambas TFD a las células bacterianas sin tener ningún efecto diferencial observable en el crecimiento en medio rico en hierro.
6.2.2 Expresión de !hu controlada por TFD.
Si el Fur_TFD estaba actuando para unir Fur y asi prevenir que se uniera al promotor fhu se esperaría que la represión de los genes fhu debería eliminarse. Para ensayar esto, se comparó el número de copias de los transcritos de !hu (estandarizado respecto al ADN ribasamal) presentes en la muestra tratada con Fur_TFD con la muestra Control (Figura 10B). la realización de RT-PCR cuantitativa en tiempo real en ARN aislado de las muestras mostradas en la Figura 9 estableció que el Fur_TFO había producido el cambio predicho en la transcripción de fhu: era cinco veces mayor que en la muestra Control. Por lo tanto, la transfección de TFO especlficos puede usarse para modificar los patrones de expresión de genes en S. aureus que se sabe que son esenciales para la patogenicidad.
6.2.3 Efecto en el crecimiento de TFD Furen medio con hierro limitante
Usando el mismo protocolo de transfección, los TFD Fur y Control se introdujeron en S. aureus cultivado en un medio con hierro limitado (Skaar et al, Science (2004) 305: 1626-8). Como se esperaba, el crecimiento se retrasó en este medio cuando se compara con el crecimiento en aH!. Sin embargo, el cultivo que se habla transfectado con el TFO Fur no mostró ningún signo de crecimiento durante el curso del experimento (Figura 11), lo que demuestra que la perturbación de la regulación del hierro en condiciones con hierro limitado es perjudicial para el crecimiento y reproduce los resultados observados con el mutante con inaclivaci6n de Fur (Horsburgh el al, 2oo1a).
Generalmente se piensa en el factor de transcripción Fur como un represor que actúa globalmente que regula a la baja la transcripción de los genes de captación de hIerro en condiclones en las que el hierro está en exceso, previniendo la toxicidad del hierro, que está causada por la reacción de Fenton (Wandersman y Oelepelaire, Ann. Rev. Microbio!. (2004) 58: 611-647). La mutación de fur de S. aureus también tiene un efecto perjudicial en la virulencia con una incapacidad de ascer en oondiciones limitantes de hierro, resultando en una atenuación in IlÍvo (Horsburgh et al. 2oo1a). Las razones para esto permanecen sin aclararse, pero quizá reflejan el papel central de Fur en la adaptación de las bacterias a cambios en el medioambiente, y una capacidad comprometida para responder al estrés oxidativo. El efecto en la virulencia no parece ser único para S. aureus. La mutación de furcausa la atenuación de Vibrlo cholerae, Campylobacter jejunl, Helicobacter pylori, Actinobaciffus pleuropneumoniae y Baciffus cereus in vivo (Mey et al, Infect. Immun. (2005) 73: 8167-8178; Palyada et al, J. Bacteriol. (2004) 186: 47144729; Bury-Mone et al, Mol. Microbio!. (2004) 53: 623-638; Jacobsen et al, Infect. Immun. (2005) 73: 3740-3744; Harvie et al, Microblol. (2005) 151: 569-577). El análisis bioinformático de la secuencia consenso de Fur de S. aU/l1US (usando software MEME (http://meme.sdsc.edu/meme4Jlintro.html) y secuencias previamente identificadas (Horsburgh et al. 2oo1a) demostró que estaba altamente conservada en Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus sUbtifis, Lysteria monocytogenes as! oomo en S. aureus (Figura 12), lo que predice una actividad frente a otros Bacillales.
Se han usado moléculas antisentido para tratar bacterias patogénicas. Más especialmente usando nücleos modificados, tales como ácidos nucleicos peptldicos (Good y Nielsen, Nat. Biotech. (1998) 16: 355-358) y oHgonucle6tidos morfolino (Shen et al, Proc. Nat!. Acad . Sci. USA (2009) 106: 8163-8168) y consiguiendo la administración con péptidos catiónicos. ~stos regulan a la baja la traducción de ARNm diana a concentraciones micromolares para inhibir el crecimiento de microbios in vilm e in vivo. El cambio a núaeos modificados tiene las ventajas de que Incrementa la estabilidad del ollgonucle6tido en fluidos biológicos y reduce o elimina la carga negativa del núcleo fosfato. Este último efecto tiene la ventaja de Que los oligonucleótidos modificados son más fáciles de transfectar a través de la membrana externa cargada negativamente de las bacterias. Sin embargo, como los TFO funcionan interfiriendo con las interacciones AON-protelna y es probable que el núcleo fosfato sea importante para el reconocimiento de protelnas no puede reemplazarse fácilmente.
En este ejemplo, se ha demostrado que los TFO, como oIigonudeótidos grandes con núcleos naturales, pueden administrarse eficazmente a las células, usando una combinación de péptidos y liposomas para matar a las bacterias a concentraciones nanomolares. Los TFO son eficaces a concentraciones mucho más bajas ya que bloquean un proceso enzimático (transcripción) mientras que el antisentido funciona como bloques estéricos en los productos de la transcripción (ARNm). Una ventaja adicional de usar TFO es que bloquean la expresión de muchos genes esenciales, en lugar de tener una única diana, 10 que les hace menos susceptibles a los mecanismos de resistencia.
Ejemplo 7
TFO Si9 inhibe el crecimiento de cepas MRSA
Se prepararon polinucle6tidos sei'iuelo marcados con CoIesteroVCy5 como en el Ejemplo 5.1. Tlpicamente, se formó un complejo con 1 J.lg de TFO Sig y 0,3 J.l1 del reactivo de transfección liposomal OOTAP (1 ,2-dioleil·3-trimetilamonio propano; Roche) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 mino Los ensayos para determinar su efecto en el crecimiento de células bacterianas se realizaron usando placas de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo 200 ,.d de caldo que consistía en medio BHI (Becton Oickinson) suplementado con 60 nM Gramlcldina (Sigma Corporation. Cat# G5002). Se ai'iadió 1 ,.11 de varias concentraciones de un sei'iuelo marcado con ColesteroVCy5 formando un complejo con TFO a cada pocillo y se monitorizó el efecto en el crecimiento bacteriano de aislados cllnicos de S. au~us que se habla determinado que eran cepas resIstentes a meticilina (MRSA). El crecimiento se monitorizó midiendo la absorbancia del caldo a intervalos de tiempo durante la incubación. Las placas se Incubaron a 3flc con agitación y se tomaron lecturas de absorbancia (a 450 nM) usando un lector de placas.
Como se muestra en la Figura 13, fue evidente que el tratamiento con tan poco como 10 nM 8ig previno el crecimiento de las cepas MRSA en medio aH!. Una cantidad similar de TFO control que contenia una secuencia no relacionada con una longitud similar no encontrada en el genoma de S. aureus no tuvo efecto en el crecimiento bacteriano en este medio.
Ejemplo 8
TFO Sig potencia la acción de anfbióticos frente a EMRSA 15 (una cepa epidémica aislada cllnlcamente)
Se preparó TFO Sig en forma de mancuerna como se describe en el Ejemplo 9.1 (véase más adelante). Se realizó un ensayo de crecimiento como se describe en el Ejemplo 5.2 con una cepa MRSA bien caracterizada, EMRSA 15.
Esta cepa muestra resistencia a meticilina (siendo capaz de crecer en 2 mglml de los antibióticos), 0,5 mglml eritromicina y 0,5 mglml Ciprofloxacina (Porter y Oamani. J. Hospital Infection (2007) 65: 88).
Como se muestra en la Tabla 1 más adelante, la cepa EMRSA15 se resensibilizó a meticilina, eritromicina y ciprofloxacina, en presencia de 10 nM de TFO Sig, como se mide determinando el tiempo de latencia en el 5 crecimiento del cultivo bacteriano. En dichos experimentos, un tiempo de latencia de °h para el medio tratado con TFO Control (como se describe en el Ejemplo 5.1) y un antibiótico indica que el cultivo empezó a crecer en el mismo punto de tiempo que las bacterias no tratadas crecidas en medio suplementado con el antibiótico. Para los cultivos tratados con el TFO Sig, el tiempo de latencia es el retraso en el crecimiento comparado con el observado con el TFO Control en presencia de antibiótico. Por lo tanto, los tiempos de lalencia de 6,4 h (en presencia de 2 mgJml de
10 meticilina), 8,2 h (en presencia de 0,5 mglml de eritromicina) y 8,3 h (en presencia de 0,5 mgJml de Ciprofloxacina) indican que el TFO Sig actuó sinérgicamente con estos antibióticos para retrasar el crecimiento.
Et mecanismo para este efecto es probable que sea que el TFO Sig previene o regula a la baja la inducciÓfl mediada por antibiótico del regulón de respuesta al estrés, haciendo que las células sean más sensibles. Como la mayor parte de los antibióticos causan respuesta al estrés se esperarla que si los TFO se usaran en combinación se
15 incrementaría la eficacia de todos o la mayoria de dichos antibióticos.
Antibiótico
Tiempo de Latencia del TFO Control (h) Tiempo de Latencía del TFO Sig (h)
Meticilina 2 mgJL
0,2 6,_
Erilromicina 0,5 mgJL
-0,3 8,2
Ciprofloxacina 0,5 mglL
0,3 8,3
El tiempo de latencia se define como el tiempo en le que el crecimiento está retrasado (en comparación con un cultivo con transfecdón simUlada) debido al tratamiento del TFO. 20 Ejemplo 9 Los TFO Si9 en configuración de manQJema reprimen el cre<:imlento de una cepa MRSA aislada c!fnicamente
9,1 Preparación de TFO en forma de roancvema porligación IQB=TFOJ
Se sintetizaron dos 0ligonude6tidos, cada uno conteniendo una cadena del sitio de reconocimiento para la proteína sigma alternativa de S. aureus. En cada extremo de la molécula un pequeño bucle en horquilla actu6 para proteger a 25 la molécula de la degradación. Cada 0ligonucle6tido se re-suspendió en dHzO a una concentración de 250 pmolesll.d.
Para formar el TFD Sig en forma de mancuerna (referido como TFO SA3) se sintetizaron los oligonuc1e6tidos fosforilados siguientes:
SEQlO NO: 40 -SigOB_SA3: CTIGG 1"1"111 CCAAG GAA GATTAG AAA TIA
TTICGATGGGTAT ATA ATA SEQ 10 NO: 41-SigOB_SA3: P-CCGTCTTTTTGA CGG TATTAT ATA cec ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C
30 Cuando se hibridan éstos formaron la molécula siguiente:
T CCAAG gaa gat tag aaa Ua IU. cga! ggg tal ata ala r~
Tipicamente, 30 III de cada 0ligonucle6tido se mezclaron con 27 J.l1 de dH20 y se hibridaron usando el programa de PCR siguiente: HIBRIOACIÓN: 95°C 3 min, enfriamiento a _0,1 oC/s hasta 8°C, final. Después de lo cual, se
anadieron 10}.t1 de tampón Ligasa I OxNEB y 3}.t1 AON ligasa He T4 (NEB). La mezcla se incubO toda la noche a 1SoC. El material se digirió extensamente con exonucleasa T7 (NEB) para eliminar cualquier oligonude6tido no ligado y se recuperó por dos rondas de precipitaciOn con etanol.
También se preparO un OB_TFO que contenia una versiOn desorganizada del sitio de uniOn Sigo En este caso, los cebadores fostonlados usados fueron:
SEQ ID NO: 42 -SigScr_SA1: CITGG T1111 CCAAG TAG AAA GAAGATTTA GGGCGATTTT ATA ATA TAT
SEQ ID NO: 43 -SigScr_SA2: CCGTCTTTTTGA CGG ATA TATTAT AAA ATC GCC CTA AA T CTT CTT TCT A
9.2 Realización de estudios de crecimiento en placas de 96 pocillos
Se realizO un ensayo de crecimiento como se describe en el Ejemplo 5.1 usando el TFO Sig en su configuraciOn en
mancuerna y una cepa MRSA aislada cllnicamente. Como se muestra en la Figura 14, las concentraciones de TFD Sig tan bajas como 10 nM pudieron inhibir el crecimiento celular, mientras que una concentración similar del TFO control no pudo.
Ejemplo 10 OS-I FO WalR previene el crecimiento de EMRSA 15
1Q.1 Preparación de DB TFD que contienen sitio de unión WalR
La secuencia de unión para WalR se incorporo en oligonucle6tidos en forma de mancuema y se prepararon como se describe en el Ejemplo 9.1. Las secuencias de estos otigonucle6tidos fosforilados fueron:
SEQID NO: 44-WalRDB2.1: CTTGG I1 In CCAAG TAA TGA ATG AGTTTAA
AGC CCA TGT AAA AG GGG TAT CAG TAC
SEQ ID NO: 45 -WaIRDB2.2: CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT
TTA CATGGG CTTTAA ACTCATTCA TTA
Una segunda pareja de oligOlludeOtidos que contenia una versión desorganizada del sitio de unión WalR se uSÓ para generar la estructura en mancuerna control (Scr.WaIR). Las secuencias de estos oligonudeOlidos fosfonlados fueron :
SEQ ID NO: 46 -WaIRDB3.1: P-CTTGG 1111'1 CCAAG GTA ATA TGA C AAG ATT
GTA AAT GAC CTA GTT GAG AG ATGCCA
SEQ ID NO: 47 -WaIRDB3.1: P-CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA ACT
AGGTCA TTT ACA ATCTTGTCA TATTAC
10.2 I ransfecciOn de EMRSA15 por co-tratamiento con LiSQstafina
Se realizaron ensayos de crecimiento como se describe en el Ejemplo 7.1 con la única diferencia de Que el medio se suplementó con entre 0,5 y 2,5 pglml de Llsostafina en lugar de Gramicidina. La Llsostafina es una enzima semejante a lisozirna que es especifica pa ra las paredes de S. aureus.
Como puede observarse en la Figura 15, tan poco como 10 nM de OB·I FO Sig fue capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, mientras que cantidades similares del DB-TFO control no tuvieron efecto.
Ejemplo 11
TFO WalR inhibe el crecimiento de MRSA en un modelo de sepsis en ratón
El TFO usado en este Ejemplo bloquea la acción del sistema de dos componentes WaIKR. Estas protelnas forman una ruta de transducción de la señal esencial que conlrola la expresión de un pequeoo regulón de genes implicado en el melabolismo de la pared celular, particularmente la slntesis de peptidoglicano.
11 .1 MÉTODOS
11.1.1 Cepas baderianas y crecimiento
Se crecieron cultivos de S. aureus EMRSA16 y se mantuvieron en medio BHI (Beclon Oickenson). Se prepararon preparaciones madre congeladas mezclando volúmenes Iguales de un cultivo en crecimiento exponencial temprano (DO de 0.3 a Aem) con 50% glicerol y congelando a _80°C.
11.1.2 Preparación de TFD
Se prepararon TFO en una configuración en mancuema como se ha desaito previamente (Ahn et al , 2003). Los TFO se prepararon ligando parejas de oligonucieótidos fosforilados para foonar un TFO que contenra el sitio de unión para la proteína WalR como aparece en el promotor de IylM (WalR_TFO) o un TFO que contenía una versión desorganizada del sitio de unión (Scr_TFO). Los oligonucle6lidos se resuspendieron a una concentración final de 100 pmoleslJ.lI en un tampón de AON ligasa T4 (New England Biolabs) y 400 U de AON ligasa T4 y se incubó a 16°C toda la noche. la mañana siguiente el tampón de reacción se suplementó con 10 U ExonucJeasa I (NES) y se digiri6 durante 30 min a 3"fC antes de purificar pOI" extracción con fenolcloroformo y precipitación con etanol. los TFO se resuspendieron en agua a una concentración de 1 mM.
las secuencias de las parejas de oligonucle6tidos usados para formar WaIR_TFO fueron:
SEQ 10 NO: 48-WaIRI : 5'· P-CTTGGTTTTTCC AAGTAA TGA ATG AGTTTA AAG CCC ATG TAA AAG GGG TAT CAG TAC· 3'
y
SEQ 10 NO: 49-WalR2: 5'· P·CCCTCTTTTTGA GGG GTA CTG ATA CCCCIT ITA CAT GGG en TAA ACT CAT TCA ITA· 3'.
Para Scr_TFO las secuencias fueron:
SEQ ID NO: 46 -WaIRDB3.1: 5'· P-CTT GGTTTTTCC AAG GTA ATA TGA CAA GATTGT AAA TGA CCT AGTTGA GAG ATG CCA· 3'
y
SEQ 10 NO: 47-WaIRDB3.1: 5'· p·CCC TCTTTT TGA GGG TGG CAT CTCTC¡I ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TAC· 3'.
11.1.3 Transfección de MRSA in vitro
Se formaron complejos TFO-OOTAP mezclando 1 ~g de TFO con 2 ~Q de OOTAP (Roche) e incubando a temperatura ambiente durante 10 min en la mesa de trabajo. El complejo de TFO se mezcló con medio inOOJlado suplementado con 10 nglml de Lisostafina (Sigma; 19043), se alicuotó en placas de 96 pocillos con fondo plano y el crecimiento se analizó mediante cultivo a 3flc con agitación en un lector de placas BioTek.
11 .1.4 Modelo de sepsis en ratón
El estudio de sepsis en ratón se realizó por Euprotec (Reino Unido). Los ratones usados en este estudio. ratones COi macho, fueron suministrados por Chal1es River (Margate, Reino Unido) y caredan de patógenos específicos (16-18 g en la entrega). Todos los ratones pesaron 22-25 g al comienzo del experimento.
11.1.5 Estudio de tolerabilidad
Para el estudio de tolerabilidad, los animales se trataron en grupos de 2 ratones por grupo de tratamiento, por lo tanto 10 en total para el estudio. Todos los ratones se pesaron en el día 1 del estudio y se pusieron aleatoriamente en cajas. Los ratones tenían los tratamientos siguientes administrados intravenosamente usando 10 mllkg, los cinco grupos de tratamiento fueron: 100 ).1M WaIR_TFD; 2,5 mM DOTAP; 6,3 ¡..tG/ml lisostafina; una mezda de TFDIDOTAP/lisostafina; disolución salina. los ratones se pesaron diariamente después del tratamiento durante un periodo de 100 h antes de ser sometidos a eutanasia y los pulmones, hfgado, bazo y rinones se extrajeron y examinaron visualmente y se pesaron.
11.1.6 Estudio PK
Para el estudio PK, los animales se trataron en grupos de 3 ratones por punto de tiempo, por lo tanto 24 en total para el estudio. Los ratones se trataron con administración intravenosa de una mezda de 5 nMlkg WaIR_TFD, 25 nMlkg DOTAP, 31,5 mlkg Usostafina. Se extrajo sangre de los conjuntos de ratones por punción cardiaca después de anestesia oon isofluorano a los 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas y 24 horas después de la dosis. Todas las muestras se recogieron como plasma (anticoagulado con heparina y almacenado en hielo antes de la separación). Después de la recogida de sangre, los riñones se extrajeron y homogeneizaron en 1 mi de PBS enfriado en hielo. Los TFD se detectaron en las muestras biológicas con cPCR.
11. 1. 7 Estudio de carga tisular
Para el estudio de carga tisular, los animales se trataron en grupos de 8 ratones por grupo de tratamiento, por lo tanto 48 en total para el estudio. Se prepararon cuhivos 2 x 10 mi de Staphylococcus aUIlWs EMRSA 16 y se pusieron en agitador orbital (220 rpm) toda la nodle a 3'tC. Al dla siguiente, los cultivos de Staphylococcus aureus EMRSA 16 se quitaron del agitador, se sedimentaron y se lavaron dos veces antes de resuspenderlos en disolución salina hasta una DO de 0,132 (1,5 x 108 cfu/ml). Esta disolución madre de Staphylococcus aureus EMRSA 16 se diluyó más 1:1,5 en disolución salina (1 x 108 cfu/ml), es decir, 2,0 x 107 bacterias por ratón. Se infectaron 48 ratones con 0,2 mi de la suspensión 1,0 x 108/ml. El número de bacterias Staphylococcus aureus EMRSA 16 por mL en el resto de las suspensiones después de la inoculación también se contó para confinnar la carga de infección. los ratones se trataron 1, 9 Y 17 horas después de la infección con el compuesto o vehlculo, aunque la vancomicina sólo se administró después de 1 h. Los tratamientos fueron como previamente una mezda de TFDIDOTAP/Lisostafina usando una concentración de 1nM/kg TFD en una proporción molar 5:1 con DOTAP y 63 ¡..tglkg Lisostafina. Después de 25 horas después de la infección, todos los animales se pesaron y se sometieron a eutanasia. los riñones se extrajeron inmediatamente y se homogeneizaron en disolución salina tamponada con fosfato estéril enfriada en hielo + 0,05% Tween 80. los homogenados de órganos se cultivaron cuantltatlvamente en agar CLED y se incubaron a 3'fC durante hasta 3 días y se contaron las colonias. los datos del las cargas del cultivo se analizaron por el ensayo de Kruskal-Wallis usando Stats Direct.
11 .2 RESULTADOS
11.2.1 WaIR_TFO mata rápidamente el crecimiento de MRSA in vitro
En experimentos de inadivación génica se ha mostrado que el sistema de dos componentes altamente conservado WalKN.!alR (también referido como YycGNycF) es esencial para la viabilidad en S. aureus y otros patógenos Grampositivos. El sitio de unión para el factor de transcripción WalR se ha identificado en varios promotores de genes en el regulón, induyendo lytMfSA0265 (Dubrac, Boneca et al. 2007). Fue esta versión la que se usó en el WaIR_TFD y una versión desorganizada en la que la secuencia se re-organizó aleatoriamente, Scr_TFD.
En el estudio, se usó EMRSA-16, una cepa MRSA endémica en los hospitales del Reino Unido (Cox. Mallaghan et al. 1995). los TFD se mezdaron con una formulación lipídica disponible comercialmente, DOTAP, y se mezdó con medio inoculado con EMRSA-16 y lisostafina. la lisostafina es un agente lisozima que actúa en las paredes de S. aureus, el uso de ésta en este experimento fue para adelgazar la capa de peptidoglicano externa de las bacterias y permitir al TFD transfeclar la célula después de la fusión del vehículo oOTAP con la membrana interna expuesta de la bacteria. Usando este protocolo de transfección se observó que el tratamiento con el TFo control, Scr_TFD, no tuvo un efecto detectable en el crecimiento bacteriano cuando se compara con una muestra no tratada. Sin embargo, el WalR TFo previno el crecimiento de EMRSA-16 in vitro a una concentración de 1 nM (Figura 16). las cuentas viables totales confinnaron los resultados de que el tratamiento con WaIR_TFD redujo el numero de células vivas cinco órdenes de magnitud (Figura 17A). las bacterias que no fueron matadas por el tratamiento con WaIR_TFD se sub-cultivaron con el fin de detenninar si había alguna incidencia de resistencia. El proceso se repitió un total de cuatro veces y se registró tanto la reducción en las cuentas viables (Figura 178) como las curvas de crecimiento in vitro (Figura 17G, cuadrados negros: bacterias en el cuarto subcultivo). Por lo tanto, ausencia de evidencia del desarrollo de un mecanismo de resistencia frente a la muerte mediada por TFo.
Con el fin de determinar si los TFo mataban bacterias en contado o necesitaban una exposición prolongada para funcionar. se transfectó EMRSA-16 con 1 nM de complejo WaIR_TFoIDOTAP y se incubó durante 30 minutos antes de microdiluirse en medio fresco, sin ningún complejo de TFD o lisostafina. El crecimiento in vitro se siguió durante
3S
48 horas adicionales (Figura 18) y fue evidente que no se observó ningún crecimiento, lo que confirma que los TFO mataban efectivamente a las células en un primer contacto.
11.2.2 Estudio de lo/erabilidad
Todos los fármacos fueron bien tolerados después de administración IV; no hubo eventos agudos indicados. Después del tratamiento, los ratones se comieron y bebieron con normalidad sin signos de distrés. El incremento en el peso de los ratones tratados fue el mismo que el de los controles con vehículo. l a autopsia no mostró anormalidades gruesas de los riñones, pulmones, hlgado o tracto GI. l os pesos de los rinones, pulmones e hígado estuvieron en el rango normal. Todos los compuestos de ensayo se toleran y son adecuados para una dosificación adicional hasta la dosis máxima usada en este estudio de tolerabilidad.
11.2.3 Estudio de carga tisular
l a dosis infecciosa administrada se dirigiÓ a 2,0 x 107 bacterias por ratón para asegurar una infección relativamente suave se estableciÓ (ésta es mas sensible a tratamiento). l os ratones se trataron con inyección sistémica bien del vehlculo, 1 nM del complejo Scr_TFD, 1 nM del complejo WaIR_TFD o vancomícina, usados a una concentración suficiente para conseguír una reducción de 2 veces en las unidades formadoras de colonias (cfu). Después del tratamiento, los ratones se sacrificaron y se midió la carga encontrada en los riñones (Figura 19). El análisis estadístico de los resultados mostró que los ratones tratados con el WaIR_TFD consiguieron una reducciÓn similar en la carga a la conseguida por vancomicina cuando se compara con el control Su_TFD (Tabla 2, más adelante).
Tabla 2. Análisis estadístico de los resultados in vivo. Kruska\.Wallis: todas las comparaciones por parejas (DwassSteel-Chritchlow-Fligner) para Scr_TFD
1 nM Scr_TFD
1 nM WaIR_TFD
Vancomicina
Vehlcul0
0,0043
1 nM Scr_TFD
0,0062
0.7804
1 nM WalR_TFD
0,2549
0.0062
0,0173
Vancomicina
Vehículo
.. ..
Se encontró que el WarR_ TFD en este expenmento llene una actIVidad bactenClda ráPIda a concentraCIones nanomolares frente a MRSA tanto in vitro como in vivo.
Ejemplo 12
Transfecci6n de E. coli con rED FabB sensibiliza a las bacterias a antibiÓticos que inhiben la slntesis de ácidos grasos
12. f Preparaci6n de TFD FabB
l os TFO FabB se diseñaron para incorporar el sitio de uniÓn para el regulador transcripcional de las enzimas de la síntesis de ácidos grasos, FadR, que aparece en S' del gen FabB en Escherichia coIi. El gen FabB codifica una enzima implicada en la slnlesis de ácidos grasos (J. Baderiology (2OOS) 183: 5292).
Se prepararon TFD por PCR como se describe en el Ejemplo 4.1 con la excepción de una parte de 60 pares de bases del promotor FabB que se clonó en el vedor pGEMT-Easy. los oligonucleótidos usados para amplificar la seruencia del promotor fueron:
SEa ID NO: 50 -fabBf: TCT TIA AAT GGC TGA TCG GAC TIG SEa ID NO: 51-fabBr: AGT AAG TTT CGAATG CACAAT AGC GTA
También se generÓ un TFD control que tiene la secuencia que dio lugar a un fragmento de PCR con un tamaño similar cuando se uSÓ en una reacción de amplificación COn AON gen6mico aislado de Mycobacterium smegmatis. las secuencias de estos oligonucle6tidos fueron;
SEa ID NO: 52 -WhiB7.t. CAC CAG CCG AAA AGG CCA CGG
SEQ ID NO: 53 -WhiB7.r. CM MA. TGG CCACGGATC CGG GTG
12.2 Ensayos de crecimiento
El efecto de los TFD en el crecimiento de cultivos bacterianos de E. coli se midió como se describe en el Ejemplo 4.1 con unas pocas modificaciones: el medio usado fue l B; el co-transfectanle usado fue 40 nM polimixina, en lugar de gramicidina; el medio también se suplementó con 10 l1g/ml Cerulenina (CER). CER es un antibiótico que actúa en la sintesis de ácidos grasos. A las concentraciones usadas no tiene efecto perceptible en el crecimiento de E. coli.
La Figura 20 muestra que el tratamiento de E. ooli con 10 nM del TFD FabB, pero un TFO control (WhiB7; que contiene una secuencia que se sabe que no aparece en el gen ama de E. 0011), volvió a las bacterias sensibles a la acción de cerulenina. El antibiótico usado, cerulenina (CER), empieza a inhibir el crecimiento celular en presencia del TFD control a 20 ¡.tg/ml, punto en el cual las células estaban siendo matadas por la acción sinérgica del TFO FabB.
Como el TFD FabB está diseñado para regular a la baja los genes del operón de la síntesis de ácidos grasos, nuestra hipótesis es que este TFD podria usarse en combinación con cualquier antibiótico que bien perturbe la síntesis de ácidos grasos, directamente o indirectamente, para incrementar la eficacia de ese antibiótico o contrarreste un mecanismo de resistencia.
Ejemplo 13
La transfección de un TFD que contiene la secuencia de reconocimiento para el factor 0"54 de K1ebsiella pneumoniae retarda el crecimiento bacteriano
Se preparó por PCR y se ensayó un TFO que contiene el sitio de unión para el factor sigma alternativo, 054, del organismo patogénico Klebsiella pneumoniae. Comparado con la actividad de un TFD control no relacionado, el TFD Sig inhibió el crecimiento de las células. 054 es otro ejemplo de un factor sigma que controla la regulación de la respuesta al estrés en bacterias.
13. 1 Preparación de TFD
El TFO se preparó como se describe en el Ejemplo 5.1. las secuencias de los oligonucleótidos hibridados usados fueron:
SEQ ID NO: 54 -Ks54t P-CCG ATA AGG GCG CAC GGT TTG CAT GGT TAT A
SEQ ID NO: 55-Ks54r. P-ATAACCATG CM ACC GTG CGC CCTTATCGG A
13.2 Transfección de K. pneumoniae
los ensayos de crecimiento se realizaron como se describe en la Sección 4.1 siendo la diferencia que el medio usado fue medio M9 (Sambrook et al (1989) Molecular Cloning. 21 Edición vol. 3 p. A3). El medio no se suplementó con ningún co-transfectante.
la transfección se consiguió formando un complejo del TFD con un péptido que penetra en las células. El péptido consistió en dos partes: una cadena lineal de nueve O-argininas y una secuencia peptldica previamente descrita que se encontró que era capaz de penetrar la membrana de K. pneumoniae (Vaara, Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1996) 40: 1801). las argininas (R9) cargadas positivamente siNen para unir el núcleo fosfato del TFD mediante una interacción de carga. El uso de dichas colas R9 para formar un complejo de los restos transfectantes para transfectar baclerias se ha descrito previamente (Kim, Molecular Therapy (2006) 14: 343). La secuencia completa del péptido usado fue:
SEQ ID NO: 56-IKFlKFLKFl-(O-arginina) 9
los TFO se mezclaron con cantidades crecientes de péptido IKFlKFlKKl-R9 en un tampón basado en TE suplementado con 5% glucosa. la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se usó bien directamente en transfecciones o se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Típicamente, se usó la cantidad minima de IKFlKFlKKL-R9 que causaba que el complejo con ADN no corriera en el gel; es decir, la carga del núcleo de ácido nucleíco se había neutralizado por unión de poli-arginina. los conjugados IKFlKFlKKL-R9-TFD se mezclaron a varias concentraciones en 200 ¡.tI de cultivo en una placa de 96 pocillos.
la Figura 21 muestra que 10 nM de TFD Sig fue suficiente para inhibir el crecimiento del cultivo de K. pneumoniae, mientras que no se obseNÓ inhibición con el TFO control.
Ejemplo 14
Análisis bioinformático para deteclar las apariciones de los sitios de unión WalR en S. aureus y deducir su secuencia consenso.
Se usó una búsqueda MEME (http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi-binlmeme.cgi) para encontrar apariciones adicionales de ejemplos publicados del sitio de unión WalR en S. aureus (SA) y otros organismos palogénicos en los que se encontró que aparecía, tales como Enterococcus faecium (EF), Streptococcus pneumoniae (SP), Lysteria monocytogenes (lM) y Streptococcus mutans (SM).
Un subconjunto de los aciertos derivados de la búsqueda se muestra en la Figura 22. A partir del conjunto completo, se derivó un sitio consenso, que liene la secuencia:
TGT WAW NNN NNT GTA AW [SEQ ID NO: 57]
Se usa el código de una letra de la IUPAC, en el que: W es A o T.
Por lo tanto, se espera que la secuencia consenso de TFD WalR Influya en el crecimiento de los organismos listados anteriOfTTlente.
Ejemplo 15
Análisis bioinformático para detectar las apariciones de los sitios de unión SigB en S. aureus y deducir su secuencia consenso,
Se usó una búsqueda MEME (hltp:/lmeme.sdsc.edu/meme4/cgl-blnlmeme.cgi) para encontrar ejemplos de apariciones (con valores E < 100) de concordancias con una secuencia consenso del silio de unión SigB en S. 8ureus y Bacillales (infecciones Gram-positivas) de los que los géneros representativos incluyen Baeillus, Lisieria y Staphylococcus.
l os eJemplos de los aciertos derivados de la búsqueda se muestran en la Figura 23. A partir del conjunto completo, se derivó un sitio consenso, que tiene la secuencia:
GKT TWA NNN NNN NNN NNN NNK GGT AW [SEQ ID NO: 58]
Se usa el código de una letra de la IUPAC, en el que: K es G o T; W es A o T.
Ejemplo 16
Análisis bioinformático para detectar las apariciones de los sitios de uni6n Sig en Klebsiella pneumoniae y deducir su secuencia consenso,
Se tomó un TFD que contiene el sitio de unión para el factor sigma altemativo (sigma 54) de la región del promotor del gen glnA de K. pneumoniae, como se describe en Barrios et al. 1999 (Nucl. Acids Res. 22: 4305-4313) y, cuando se incorpora en un PCR_TFD, se mostró que mata a las células de K. pneumoniae in vitro (véase la Figura 24A).
l a secuencia de TFD usada fue:
SEQ ID NO: 59 -KP _ Sig TGG CAC ag. ttT CGC T I
las células se transfectaron como se desa-ibe en el Ejemplo 13, usando un péplido que penelra en las células. El TFD que contiene la secuencia KP _Sig previno el crecimiento celular in vitro mientras los dos controles no mostraron efecto en el crecimiento celular. los dos controles usados fueron: células no tratadas (K. pneumoniae) y un TFD control que consiste en una secuencia desorganizada.
Se usaron sitios de unión similares encontrados en otros genes de K. pneumoniae (nffEJ, nifE, nifH, nifJ, nifL, nifM y n/fU) para definir una secuencia consenso:
SEa ID NO: 60 -TGG NNN NNN WTT TGC wl Se usa el código de una letra de la IUPAC, en el que W es A o T. Solicitante de la Qrganizaci60 Calle : Norwich Bio-Incubator, Norwich Research Park, Colney l ane Ciudad : Norwich Estado: País : UK Código Postal: NR4 7UH Número de teléfono: Número de fax: Direcci6n de correo electrónico:
<110> Nombre de la Organización: Procarta Biosystems Limited Proyecto de la solicitud
<120> Titulo: Transcriplion Factor Oecoys
<130> Referencia Archivo Solicitud: P395OWO
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<141> Fecha Presentación Actual: Solicitudes Anteriores
<150> Numero de Solicitud Anterior: US 61/102.414
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<213> Nombre de Organismo:
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cttggttttt ccaagagaag agcccgccat ggcggccgcg ggaattc
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tttallccga actgalcgga ctIgtlcagc gtacacgtgt tagctatcct gcgtgctlca
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gctattttgt aatgacaatg taatgagttt agtaaaaa 38
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Secuencia
<213> Nombre de Organismo: P. aeruginosa
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glaacagcgg aaccaclgca cag 23
5
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Secyencia
10
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15
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SeCUencia
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<212> Tipo: AON
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Descripción de Secuencia:
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Secuencia
<213> Nombre de Organismo: H. pylori
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qa..ttgttc tatttattat ccatttgctt atta.t.att qgttgtta.t tttqqtttaq•
60 61
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Descripción de Secuencia:
Secuencia
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35
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Secuencia
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Secuencia
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Descripción de Secuencia:
Secuencia
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Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
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Secuencia
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Secuencia
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Secuencia
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28
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SO
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<211> Longitud: 49
Nombre de Secuencia: SEa ID NO: 42
Descripción de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de presecuencia:
52
ccglcltttt gacggalala tlalaaaalc gccctaaalc tlctttcta 49
<212> Tipo: ADN
<211> longitud: 49
Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 43
Descripción de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de presecuencia:
cttggtlttt ccaaglaatg aatgagltla aagcccatgl aaaaggggta tcaglaC
57
<212> Tipo: AON
<211> longitud: 57
Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 44
Descripción de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de presecuencia:
ccctcttttt gaggggtact gatacccctt tlacalgggc Ittaaactca ttcalla
57
<212> Tipo: AON
<211> longitud: 57
Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 45
Descripción de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de presecuencia:
cttggttttt ccaaggtaat atgacaagat tgtaaatgac ctagltgaga gatgcca
57
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 57
Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 46
Descripción de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de presecuencia:
ccctcttttt gagggtggca Ictdcaad agglcaltta caalcltgtc atattac
57
<212> Tipo: AON
<211> longitud: 57
Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 47
53
Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de presecuencia: cttggttttt ccaagtaatg aatgagttta aagcccatgt aaaaggggta tcagtac
<212> Tipo: AoN
<211> longitud: 57 Nombre de Secuencia: SEO 10 NO: 48 Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de preseruencia: ccctcttttt gaggggtact gatacccctt ttacatgggc tttaaactca ttcatta 57
<212> Tipo: AoN
<211> longitud: 57 Nombre de Secuencia: SEO 10 NO: 49 Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo:
<400> Cadena de preseruencia: tctttaaatg gclgatcgga cttg 24
<212> TIpo: AoN
<211> longitud: 24 Nombre de Secuencia: SEO 10 NO: 50 Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo: S. aureus
<400> Cadena de preseruencia: agtaagtttc gaatgcacaa tagcgta 27
<212> Tipo: AoN
<211> longitud: 27 Nombre de Secuencia: SEO 10 NO: 51 Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo: M. smegmatis
<400> Cadena de presecuencia:
caccagccga aaaggccacg 9 21
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 21
Nombre de Secuencia: SEQ ID NO: 52
Descripción de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: M. smegmatis
<400> Cadena de presecuencia:
caaaaatggc cacggatccg ggtg 24
<212> Tipo: ADN
<211 > Longitud: 24
Nombre de Secuencia: SEQ ID NO: 53
Oesa ipci6n de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: K. pneumoniae
<400> Cadena de presecuencia:
ccgataaggg cgcacggttt gcatggttat a
31
<212> Tipo: AON
<211> Longitud: 31
Nombre de Secuencia: SEQ ID NO: 54
Descripci6n de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo: K. pneumoniae
<400> Cadena de presecuetlcia:
ataaccatgc aaaccgtgcg cccttatcgg a
31
<212> Tipo: AON
<211 > Longitud: 31
Nombre de Secuencia: SEQ ID NO: 55
Oescripci6n de Secuencia:
Secuencia
<213> Nombre de Organismo:
<400> Cadena de presecuencia:
IKFLKFLKKL R 11
<212> Tipo: PRT
<211 > Longitud: 11
Nombre de Secuencia: SEQ ID NO: 56
Descripción de Secuencia: Seruencia
<213> Nombre de Organismo: Bacteria
<400> Cadena de presecuencia: tgtwawnnnn ntgtaarv 17
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 17 Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 57 Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo: Bacteria
<400> Cadena de presecuencia: gkttwannnn nnnnnnnnnn kggtaw 26
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 26 Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 58 Descripción de Secuencia: Seruencia
<213> Nombre de Organismo: K. pneumoniae
<400> Cadena de preseruencia: tggcacagat ttcgct 16
<212> Tipo: AON
<211> Longitud: 16 Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 59 Descripción de Secuencia: Secuencia
<213> Nombre de Organismo: K. pneumoniae
<400> Cadena de preseruencia: tggnnnnnnw tttgcw 16
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 16 Nombre de Secuencia: SEO ID NO: 60 Descripción de Secuencia:

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método no terapéutico para reducir la viabilidad de células procariotas, comprendiendo el método:
    (a)
    proporcionar un polinudeótido set'iuelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana (una secuencia señuelo);
    (b)
    introducir el polinucle6tido señuelo en una célula procariota que comprende un sitio de unión para el factor de transcripción, unido operativamente a un gen o genes;
    en el que la introducción del polinucle6tido set'iuelo reduce la unión del factor de transcripción diana al sitio de unión en la célula y causa una alteración en la expresión del gen o genes unidos operativa mente;
    y en el que el factor de transcripción diana comprende un regulador de la expresión de un gen o genes que codifican uno o más de:
    (i)
    una respuesta celular adaptativa;
    (ii)
    un mecanismo celular intrlnseco de resistencia a antibióticos;
    (iii) un factor celular de virulencia;
    (iv)
    una respuesta celular a estrés; o
    (v)
    un gen celular esencial.
  2. 2. Un método no terapéutico para incrementar la susceptibilidad procariota a antibióticos, comprendiendo el método:
    (a)
    proporcionar un polinucleótido sef'iuelo que comprende un sitio de unión para un factor de transcripción diana (una secuencia sef'iuelo);
    (b)
    introducir el poi nucleótido senuelo en una célula procariota que comprende un sitio de unión para el factor de transcripción, unido operativamente a un gen o genes;
    en el que la introducción del polinudeótido señuelo reduce la unión del factor de transcripción diana al sitio de unión en la célula y causa una alteración en la expresión del gen o genes unidos operativamente, incrementando de esta manera la susceptibilidad a antibióticos de la célula;
    y en el que el factor de transcripción diana comprende un regulador de la expresión de un gen o genes que codifican uno o mas de:
    (i)
    una respuesta celular adaptativa;
    (ii)
    un mecanismo celular intrinseco de resistencia a antibióticos;
    (iii) un factor celular de virulencia;
    (iv) un gen celular esencial.
  3. 3. Un método segun la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la reducción de la viabilidad comprende uno o más de:
    (i)
    inhibir una respuesta celular adaptativa tal como una respuesta al estrés;
    (ii)
    incrementar la susceptibilidad celular a antibióticos; (jii) inhibir la expresión de uno o más genes esenciales;
    (iv)
    inhibir la expresión de uno o más genes de virulencia.
  4. 4.
    Un método segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el factor de tranSCripción diana se selecciona de: WhiB7; FadR; YycGNycF; Sigma 54 (o SigA); Fur; TcdR; Vfr; NtrC; ArsR; TcaA; AgrA; WaIR; sigB; Ksig; fhu; o una variante u homólogo funcional de cualquiera de éstos.
  5. 5.
    Un método segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el procariota es una bacteria.
  6. 6.
    Un método según la reivindicación 5, en el que la bacteria es patogénica.
  7. 7.
    Un método segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el sitio de unión del factor de transcripción en el polinucle6tido señuelo no está unido operativamente a un gen.
  8. 8.
    Un polinucleótido señuelo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en el tratamiento de infección bacteriana.
  9. 9.
    Un pOlinucleótido señuelo según la reivindicación 8 para uso en el tratamiento de infección bacteriana, en el que
    el tratamiento de la infección bacteriana comprende el uso de uno o más antibióticos y/o otro(s) agente(s) 5 antibacteriano(s).
  10. 10. Un polinucleótido señuelo según la reivindicación 8 o reivindicación 9 para uso en el tratamiento de infección bacteriana, en el que el tratamiento de la infección bacteriana comprende tratar una afección seleccionada de: neumonia, bacteremia, tosferina, enfermedad de Iyme, brucelosis, enteritis aguda, septicemia, tularemia, gripe, úlceras pépticas, enfermedad del legionario, gonorrea, infecciones nosocomiales, sepsis, rickettsiosis, tifus,
    10 disentería, cólera, peste, ántrax, colitis pseudomembranosa, difteria, listerosis, tuberculosis, septicemia, meningitis.
  11. 11. Un método ex vivo para matar bacterias, inhibir el crecimiento bacteriano, o reducir la virulencia bacteriana, comprendiendo el método aplicar un polfnucleótido señuelo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, opcionalmente en combinaciÓn con uno o más antibióticos y/o agentes antibacterianos.
  12. 12. Uso de señuelos de factores de transcripción (TFD) para reducir la viabilidad de células procariotas ex vWo. 15 13. Uso de señuelos de factores de transcripción (TFD) para reducir la virulencia de células procariotas ex vivo.
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