KR20110084213A - 전사 인자 디코이 - Google Patents

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KR20110084213A
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마이클 맥아더
제인 매리온 무어
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프로카르타 바이오시스템즈 리미티드
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Abstract

원핵 세포의 항생제 감수성을 포함하는 생존력에 관한 표현형을 변화시키기 위한 조성물 및 방법.

Description

전사 인자 디코이 {TRANSCRIPTION FACTOR DECOYS}
본 발명은 전사 인자 디코이 서열을 이용하여 원핵 생물, 특히 병원성 박테리아의 표현형을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 2008년 10월 3일 출원된 미국 가출원 61/102,414호, 2008년 10월 3일 출원된 국제 출원 PCT/GB2008/003353호, 2009년 4월 4일 출원된 미국 가출원 61/167,592호 및 2009년 4월 4일 출원된 영국 출원 09069130호에 관한 것으로, 그 내용은 참고 문헌으로 전체가 본 발명에 포함된다.
박테리아의 생장 및 병독성을 제어하는 것은 특히 의학 및 수의학적 응용 영역에 있어서 날로 심해지는 문제가 되고 있고, 공중 보건에 대한 중대한 도전이 될 수 있다. 병원성 박테리아에 대항하기 위한 용도의 항생제들이 본 기술 분야에서 널리 알려져 있다. 그러나, 이러한 항생제의 과다 사용은 하나 이상, 그리고 몇몇 경우에 있어서는, 다수의 항생제에 대하여 내성을 가지는 박테리아 (소위 다중-약물 내성 균주)라는 비상 사태를 초래하였다. 이 상황은 발견된 그리고 개발중이던 많은 종래 항생제들의 감소로 인하여 악화되었다. 실제로, 항생제 내성은 항박테리아 연구에 있어서 중대한 도전이고 여전히 개발중인 항생제들 뿐 아니라 시중의 항생제들의 효능을 위협하고 있다. 결과적으로 박테리아의 확산과 감염에 맞서기 위하여 사용될 수 있는 새로운 항박테리아 제제가 필요하다.
한 예시로, 스태피로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)는 독성 쇼크에 기해 피부 감염에서 치명적 패혈증에 이르기까지 광범위한 병증을 나타내는[Lowy, New Engl. J. Med. (1998) 339:520-532], 인간과 동물의 다양한 질병을 야기하는 세계 보건에 대한 중대한 도전의 전형이다. 인구의 20%가 연조직 감염으로 이 박테리아의 담체라고 추정되며, 종종 임상적 특징이 드러나지 않으므로, 그로부터 박테리아가 인체 내로 침입하여 혈액을 감염시키고 그 후에는 뼈와 심장 조직까지 침투할 수 있다[Gordon and Lowy, Clin. Infect. Dis. (2008) 40 (S5):S350-9]. 주로 세포 외 병원체라고 여겨지고 있음에도 에스 . 아우레우스는 세포 사이를 고집[Garzoni and Kelley, Trends Microbiol. (2009) 17:59-65], 잠재적으로 그 처리를 복잡하게 함으로써 항박테리아 작용 또는 대식세포의 포식작용을 피할 수 있다고 제안하는 실질적인 증거가 드러나고 있다. 내성 기전은 항생제에 노출되는 처음 순간부터 습득되거나 발달되어 현재는 병원에서 다수-약물 내성 균주가 일반적일 정도이고 (Hawkey, J. Antimicrob. Chemother. (2008) 62 (Sl):il-9), 이는 치료 옵션을 더 제한하고 있다.
에스 . 아우레우스가 이렇게 다능한 병원균인 데에는 몇 가지 이유가 있다: 이 병원균은 숙주의 면역 반응을 회피하는 기전을 가지고 있고 (Foster, Nat. Rev. Microbiol. (2005) 3:948-958); 광범위한 발병 인자를 만들어 낼 수 있으며 (Novick, MoI. Micro. (2003) 48:1429-1449); 숙주의 조직을 대사할 수 있는 능력이 있고 (Vojtov et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10102-10107) 숙주 내에서 있을 수 있는 영양-제한 및 무산소 환경에 쉽게 적응할 수 있다 (Haselbeck et al, Curr. Pharm. Des. (2002) 8:1155-1172). 이 많은 과정들이 전사 수준에서 조절되는데 이는 현재 전통적인 항생제들 (이들은 주로 세포벽, 단백질 또는 DNA 합성에 작용한다)의 표적이 아니기 때문이다.
스트렙토코쿠스 피오제네스 ( Streptococcus pyogenes ) (그룹 A 스트렙토코쿠스: GAS) 감염은 통상적으로 여러 가지 다양한 항생제들로 치료될 수 있다. 초기 치료는 그룹 A 스트렙토코쿠스의 침습성 질병에서 기인하는 사망 위험률을 감소시킨다. 그러나, 최고의 의학적 치료라도 모든 경우의 죽음을 예방할 수는 없다. 매우 심한 질환의 경우, 중환자실 내에서 보충적 치료가 필요할 수도 있다. 괴사성 근막염에 걸린 사람에게는, 종종 손상된 조직을 제거하기 위해 외과적 수술이 필요하다. 마크롤라이드 계 항생제 내성인 에스 . 피오제네스 균주가 출현하였으나, 모든 균주가 한결같이 페니실린에는 여전히 민감하다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 ( Streptococcus pneumoniae )의 페니실린 및 기타 베타-락탐에 대한 내성이 세계적으로 증가하고 있다. 내성의 주요 기전은 페니실린-결합 단백질을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 선택압 (selective pressure)이 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고, 베타-락탐 항생제의 사용이 감염 및 콜로니화 (colonization)의 위험 인자로서 원인이 되어 왔다. 스트 렙토코쿠스 뉴모니아에는 폐렴, 균혈증, 중이염, 수막염, 굴염, 복막염, 관절염의 원인이다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 [통상 뉴모코쿠스 ( pneumococcus )로 알려져 있다]로부터 야기되는 페니실린-내성 폐렴은 1967년에 처음 발견되었고, 페니실린-내성 임균이었다. 페니실린 대체물에 대한 내성도 또한 에스 . 아우레우스 이상 알려져 있다. 1993년에는 대장균 (Escherichia coli)이 5종의 플루오로퀴놀론 변이종에 대하여 내성을 나타내었다. 미코박테리움 투베르큘로시스 ( Mycobacterium tuberculosis)는 통상 이소니아지드 및 리팜피신에 내성이 있고 때때로는 일반적으로 통상의 치료에 내성을 나타낸다. 기타 일부 내성을 나타내는 병원균으로는 살모 넬라 ( Salmonella ), 캠필로박터 (Campylobacter ), 및 스트렙토코치 (Streptococci)를 들 수 있다.
엔테로코쿠스 파에시움 (Enterococcus faecium)은 병원에서 발견되는 또 다른 수퍼버그 (superbug)이다. 페니실린-내성 엔테로코쿠스는 1983년에, 반코마이신-내성 엔테로코쿠스 (VRE)는 1987년에, 그리고 리네졸리드-내성 엔테로코쿠스 (LRE)는 1990년대 후반에 발견되었다.
수도모나스 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa )는 매우 일반적인 기회감염성의 병원균이다. 가장 우려되는 피. 아에루기노사의 특징 중 하나는 낮은 항생제 감수성에 있다. 이 낮은 감수성은 다중약물 유출 펌프와 염색체상에서 암호화되는 항생제 내성 유전자 (예컨대, mexAB - oprM , mexXY 등)의 협동 작용 및 박테리아 세포 외피의 낮은 투과성으로부터 기인한다. 내인적 내성 외에 피. 아에루기노사는 염색체상에서 암호화되는 유전자의 돌연변이나 항생제 내성 결정인자의 수평적 유전자 전달를 통하여 쉽게 습득된 내성을 발달시킨다. 피. 아에루기노사 분리주에 의한 다중-약물 내성의 발달은 여러 가지 돌연변이의 습득 및/또는 항생제 내성 유전자의 수평적 전달을 포함하는 몇 가지 다양한 유전적 사건 (genetic event)을 필요로 한다. 과다돌연변이 (hypermutation)는 만성 감염을 일으킬 수 있도록, 피. 아에루기노사 균주 내에서 돌연변이로 유발된 항생제 내성 선택을 선호하는 반면, 유전자 모듬체 (integron) 내 몇몇 다양한 항생제 내성 유전자의 군집은 항생제 내성 결정인자의 협동 습득을 선호한다. 최근의 몇몇 연구는 생물막 형성 또는 소-집락-변이종 (small-colony-variants)의 출현과 관련된 표현형 내성이 항생제 치료에 대한 피. 아에루기노사 개체수의 반응에서 중요할 수 있다는 것을 보여준다 (Cornelis P. (editor) Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology (1st ed.) (2008) Caister Academic Press).
클로스트리디움 디피실레 ( Clostridium difficile )는 전 세계 병원에서 설사 질병을 일으키는, 병원에서 감염되는 병원균이다. 클린다마이신-내성 씨. 디피실레는 1989년과 1992년 사이에 뉴욕, 애리조나, 플로리다 및 매사추세츠 병원에서 발생했던 대규모 설사 병증의 원인이 되었던 물질로 보고되었다 (Johnson S. et al, New England Journal of Medicine (1999) 341:1645-1651). 치프로플록사신 및 레보플록사신 등의 플루오로퀴놀론계 항생제에 내성인 씨. 디피실레 균주의 발생이 지리적으로 분산되어 2005년 북미에서도 보고된 바 있다 (Loo V. et al N. Engl. J. Med. (2005) 353 (23):2442-9).
대장균과 살모넬라는 오염된 음식으로부터 직접 발생한다. 대장균으로 오염된 육류 중에서, 80%의 박테리아가 1종 이상의 기존 약물에 대해 내성을 나타낸다; 이는 항생제 내성 방광염의 원인이 된다 (“HSUS 자료표”). 살모넬라는 1970년대 처음 인간에게서 발견되었고 몇몇 경우에 9종의 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내었다 (“HSUS 자료표”). 두 가지 박테리아가 확산되면, 심각한 건강 문제를 초래할 수 있다. 매년 많은 사람들이 감염되어 입원하고 그 결과 몇몇은 사망하고 있다.
2004년 11월 5일, 질병 통제 및 예방 센터[Centres for Disease Control and Prevention (CDC)]는 이라크/쿠웨이트 지역 및 아프가니스탄에서 부상당한 군인들이 치료받고 있는 군 의료 시설에서 환자들의 아시네토박터 바우만니 ( Acinetobacter baumannii)에 의한 혈액 감염의 수가 증가하고 있다고 보고했다. 이들 중 대부분은 다중-약물 내성을, 몇몇 분리주는 시험한 모든 약물에 대해서 내성을 나타내었다.
생존 또는 병원성에 필수적인 표적 유전자에 작용하도록 설계된 DNA 기반 치료법들이 새로운 범주의 항박테리아 제제를 구성하고 있다. 이러한 치료법들은 잠재적으로 막대한 수의 병원체에 응용될 수 있고, 표적 사이트 변형을 통한 이러한 치료법들에 대한 내성을 발달시키는 것은 그다지 있음직한 일이 아님이 예상된다. 이에 더하여, 상기 제제들은 잠재적으로 신속한 개발 시간 및 많은 수의 신규한, 내성 없는 표적에 동시에 작용할 수 있다는 이점을 갖는다.
DNA 기반 치료법들은, 그들이 잠재적인 임의의 병원체를, 항생제 내성 기전의 발현을 방해함으로써 또는 필수적인 유전자 또는 적응 유전자를 하향 조절하여 생장을 억제함으로써 치료하도록 설계될 수 있기 때문에 현존하는 치료법들의 한계를 극복할 수 있는 잠재력을 갖는다. 이에 더하여 박테리아가 이 제제들에 내성을 발달시키기 위해서는 전사 인자와 그 관련 결합 부위 모두에 영향을 미치는 돌연변이를 동시에 일으켜야 하므로 이 제제들에 대한 내성을 발달시키기는 어렵다. 이는 몇몇 필수 유전자를 조절하는 제제들에 대하여 특히 사실이다.
전사 인자 디코이 (TFD)는 이러한 DNA 기반 치료법 중 하나이다. 디코이 올리고뉴클레오티드는 전사 인자의 결합 자리의 모방체로 설계되어 있어 전사 인자가 그와 관련된 유전자 표적에 결합하는 것을 방해함으로써, 결과적으로 유전자 발현을 변화시킨다 (Mann and Dzau, J. Clin. Investigation (2000) 106:1071-1075).
그들의 유용성은 주로 진핵 생물계에서 증명되어 왔는데, 그 개발에 박차를 가하여 새로운 범주의 치료 제제로서 기능할 수 있는 잠재력을 보인 바 있다 (Mann & Dzau (2000)). 이를 위하여 디코이 올리고뉴클레오티드는 전사 인자 EF2가 쥐의 민무늬근 증식을 억제한다는 사실 (Morishita et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 95: 5855-5859); 암종의 STAT3-매개 증식을 봉쇄한다는 사실 (Leong et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:4138-4143); 및 cAMP 반응 요소의 표적화가 생체 내에서 종양 증식을 조절할 수 있다는 사실 (Park et al, J. Biol. Chem. (1999) 274: 1573-1580)을 증명하는데 사용되어 왔다.
TFD는 기타 DNA 기반 치료법들을 넘어서는 뚜렷한 이점을 갖는다. 그 작용 기전은 단순하다 - 세포를 대량의 특정 결합 서열로 범람하게 만듦으로써 전사 인자가 프로모터에 결합하는 것을 방해하고 전사 인자를 격리시켜 유전자 발현을 조절한다 (따라서, 용어 “디코이 (미끼)”가 사용된 것이다). 이것은 mRNA의 복잡한 2차 구조 때문에 표적을 정하기 힘든 안티센스 전략과는 대조적이다. 안티센스 접근법과 비교할 때, TFD는 유전자 발현을 방해하면서 빠르게 작용하는 반면, 안티센스 접근법은 발현의 결과에 대응하는 것이라는 점에서 더 이점을 갖는다. 그 결과로, TFD는 하나의 TFD-전사 인자 상호 작용만으로 하나의 유전자, 달리 말하여 안티센스 접근법의 표적을 구성하는 수천개의 mRNA 카피 (copy)를 생산해 낼 수 있는 유전자의 전사를 봉쇄할 수 있기 때문에, 훨씬 작은 농도로 효과적이게 된다.
본 발명의 발명자들이 아는 한, 원핵 생물에서 디코이를 사용하는 것에 대한 보고서가 두 개 작성되었다. 첫번째 보고서에서는, 리뷸로오스 1,5,-비스포스페이트 탈탄산효소/산소화효소 (rbc) 유전자 프로모터의 AT-리치 부분과 유사하게 설계된, AT-리치 (AT-rich) 디코이 올리고뉴클레오티드가 시아노박테리움 (Cyanobacterium)에서 rbc 유전자 발현을 조절함으로써 이산화탄소-조절을 변화시키는 데 사용되었다 (Onizuka et al, FEBS Lett. (2003) 542:42-46).
두번째 보고서에서는, 디코이 올리고뉴클레오티드가 에스 . 코엘리콜로르 A3 (2)의 actII-orf4의 프로모터 내 새로운 시스-조절 서열, 이는 악티노르호딘 항생제 생산에 대한 경로 특이적 액티베이터를 암호화하고 있다, 을 규명하는 데 사용되었다 (McArthur and Bibb, PNAS (2008) 105:1020-1025).
본 발명이 창안해 낸 것은 이러한 배경기술과는 대조되는 것이다.
본 발명의 발명자들은 TFD 기술을 원핵 생물에서 세포 생존력을 변화시키기 위하여 세포 내 경로 조절, 반응 및 내성 기전을 교란시키는데 사용하였다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 하나 이상의 항생제 내성 표현형, 환경 조건에 대한 세포 적응 반응, 세포 병독성 및 세포의 필수 대사를 변화시키기 위하여 사용될 수 있다. 이를 위하여, 본 발명의 발명자들은 박테리아 감염 치료 및 박테리아 생장 억제 방법을 제공한다.
따라서 본 발명의 일 관점은 원핵 세포의 생존율을 감소시키기 위한 전사 인자 디코이의 사용에 있다.
특히, 본 발명은 원핵 세포의 생존력을 감소시키는 방법을 망라하며, 그 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 표적 전사 인자의 결합 부위 (디코이 서열)를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(b) 디코이 폴리뉴클레오티드를 하나의 유전자 또는 유전자들에 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 원핵 세포 내로 도입하는 단계; 상기 디코이 폴리뉴클레오티드의 도입은 표적 전사 인자가 세포 내 결합 부위에 결합하는 것을 감소시켜 작동적으로 연관된 유전자(들)의 발현의 변화를 야기하며; 여기서 상기 표적 전사 인자는
(i) 세포 적응 반응;
(ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
(iii) 세포 병독성 인자;
(iv) 세포 스트레스 반응; 또는
(v) 세포의 필수 유전자
중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 조합하여 이루어지는, 원핵 생물의 항생제 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) 표적 전사 인자의 결합 부위 ( 디코이 서열)를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(b) 디코이 폴리뉴클레오티드를 하나의 유전자 또는 유전자들에 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 원핵 세포 내로 도입하는 단계; 상기 디코이 폴리뉴클레오티드의 도입은 표적 전사 인자가 세포 내 결합 부위에 결합하는 것을 감소시켜 작동적으로 연관된 유전자(들)의 발현의 변화를 야기함으로 해서, 세포의 항생제 감수성이 증가한다; 여기서 상기 표적 전사 인자는 다음 중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것이다:
(i) 세포 적응 반응;
(ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
(iii) 세포 병독성 인자;
(iv) 세포의 필수 유전자.
본 발명은 또한 다음을 제공한다:
- 표적 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드, 상기 결합 부위는 유전자에 작동적으로 연관되어 있지 않고, 상기 전사 인자는 다음 중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것이다:
(i) 세포 적응 반응;
(ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
(iii) 세포 병독성 인자;
(iv) 세포의 필수 유전자.
표적 전사 인자는 WhiB7 (SEQ ID NOs: 5 & 9); FabB (SEQ ID NO: 6); LytM (SEQ ID NO: 7); Ssa (SEQ ID NO: 8); FadR (SEQ ID NO: 10); YycG/YycF (SEQ ID NOs: 11 & 12); Sigma 54 (or SigA) (SEQ ID NOs: 13 & 14); Fur (SEQ ID NOs: 15, 16 & 17); TcdR (SEQ ID NO: 18); Vfr (SEQ ID NOs: 19, 20 & 21); NtrC (SEQ ID NO: 22); ArsR (SEQ ID NOs: 23 & 24); TcaA (SEQ ID NO: 25); AgrA (SEQ ID NOs: 26 & 27); WaIR (SEQ ID NOs: 44, 45, 48, 49 & 57); sigB (SEQ ID NO: 58); 또는 Ksig (SEQ ID NOs: 59 & 60); 또는 그들 중 임의의 것에 대한 기능적 변이체 또는 동족체로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 두개 이상의 표적 전사 인자의 두개 이상의 결합 부위를 포함하는 상기 기술된 바와 같은 디코이 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
- 유전자와 작동적으로 연관되어 있지 않은 표적 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 외인성 디코이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포; 상기 세포는 하나의 유전자 또는 유전자들과 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함한다; 그리고 상기 표적 전사 인자는 다음 중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함한다:
(i) 세포 적응 반응;
(ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
(iii) 세포 병독성 인자;
(iv) 세포의 필수 유전자.
- 필요에 따라 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제와 함께, 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 대상자의 박테리아 감염을 치료하는 방법.
- 필요에 따라 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제와 함께, 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드를 적용하는 것을 포함하는, 박테리아의 생장을 방해, 또는 박테리아의 병독성을 감소시키는 체외 (ex vivo) 박테리아 박멸 방법.
- 필요에 따라 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제와 함께, 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 필요에 따라 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제와 함께, 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 살균제 조성물.
- 필요에 따라 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제와 함께, 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세정 조성물.
- 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드, 및 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제를 포함하는 키트 (kit), 상기 디코이 및 하나 이상의 항생제 및/또는 항박테리아 제제는 박테리아를 박멸, 박테리아의 생장을 방해, 또는 박테리아의 병독성을 감소시키기 위하여 조합 사용하기 위한 것이다.
- 원핵 세포의 병독성을 감소시키는 방법, 그 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 표적 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(b) 하나의 유전자 또는 유전자들과 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함하는, 디코이 폴리뉴클레오티드를 원핵 세포 내로 도입하는 단계; 상기 디코이 폴리뉴클레오티드의 도입은 세포 내에서 표적 전사 인자가 결합 부위에 결합하는 것을 감소시켜 작동적으로 연관된 유전자(들)의 발현의 변화를 야기함으로써, 세포의 병독성을 감소시킨다; 여기서 상기 표적 전사 인자는 다음 중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것이다:
(i) 세포 적응 반응;
(ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
(iii) 세포 병독성 인자;
(iv) 세포의 필수 유전자.
- 표적 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드, 상기 결합 부위는 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 60로 제시되는 서열을 갖는다.
- 박테리아 감염 치료에 있어서 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드의 용도.
일반적으로, 전사 인자 디코이 (TFD) 서열 (또는 디코이 서열)은 세포 내 관련 전사 인자에 결합하기 위한 세포 내의 태생적 또는 내인적 시스-조절 서열과 경쟁, 또는 이를 포함하고 있는 전사 인자 결합 부위를 포함한다. (여기 기술된 방법 또는 기타 방법에 의하여) 시스-조절 서열을 포함하는 적절한 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 디코이 서열은 관련된 전사 인자에 결합하기 위하여 세포 내에서 시스-조절 서열과 경쟁한다. 이러한 경쟁은 세포 내에서 시스-조절 서열에 전사 인자가 결합하는 것을 감소시켜, 그 발현이 전사 인자가 시스-조절 서열에 결합함으로써 조절되는 유전자의 발현을 변화시킨다. 본 발명에서 사용되는 디코이의 기능은 관련된 전사 인자에 결합하기 위하여 이런 방식으로 시스-조절 인자와 경쟁하는 서열의 역량을 말한다.
시스-조절 서열 또는 부위는 일반적으로 하나의 유전자 또는 유전자들의 전사 시작 부위의 상류 (5’) 또는 하류 (3’)에 존재하고, 유전자(들)의 발현을 조절하는 기능을 하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 통상, 시스-조절 서열은 단백질 (전사 인자) 결합 부위를 포함하고, 단백질의 결합이 그 유전자(들)의 전사를 조절한다. 이 서열에 단백질이 결합함으로써 직접 또는 간접적으로 유전자(들)의 발현을 조절하는 결과를 낳는다. 예를 들어, 결합 단백질은 주변 부위에 결합한 전사에 필요한 다른 단백질과 상호 작용하여 그 단백질을 정확한 위치에 고정시키거나, 혹은 전사에 필요한 다른 단백질의 결합을 방해할 수도 있다. 통상적으로 시스-조절 서열 또는 요소는 유전자의 프로모터 부위에 존재하지만, 원핵 생물에서는 시스-조절 서열이 그들이 작용하는 유전자로부터 수백 염기쌍만큼 상류 또는 하류에 위치하는 것도 드문 일은 아니다.
시스-조절 서열은 억제적 (전사 인자가 결합된 경우 유전자(들)의 전사가 방해되거나 감소한다)일수도 또는 활성적 (전사 인자가 결합된 경우 유전자(들)의 전사가 활성화되거나 증가한다)일수도 있다. 그러므로 시스-조절 서열에 결합하는 전사 인자는 음성적 작동인자 (억제 단백질) 또는 양성적 작동인자 (액티베이터)일 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드 또는 디코이 서열의 표적 서열은 전사 인자와의 결합을 두고 디코이 서열과 경쟁해야 하는 세포의 전사 인자 결합 부위를 말한다. 유사하게 표적 조절자는 디코이 서열이 결합하는 전사 인자이다. 디코이 서열의 표적 유전자(들)은 세포의 전사 인자 결합 부위에 작동적으로 연관된 유전자(들)이다. 그러므로 디코이 서열은 표적 유전자(들)의 발현 조절을 교란시킨다.
본 발명의 발명자들은 원핵 생물의 표현형, 특히 박테리아의 병원성 및 박테리아 감염의 제동에 관한 표현형을 변경시키기 위하여 디코이를 사용하였다. 특히 발명자들은 세포가 사멸 또는 생장 방해에 대하여 더 높은 감수성을 갖도록, 및/또는 적대적 환경에서 생존 능력이 낮아지도록, 및/또는 덜 병독성이도록 하기 위하여, 세포 내 경로, 반응 및 내성 기전의 발현을 교란하기 위하여 디코이를 사용하였다.
일 관점에 있어서, 본 발명의 방법은 예컨대 우세한 조건 하에서 세포가 덜 생존하도록 하기 위하여 유전자 발현을 교란한다. 예를 들어, 세포는 항생제에 대한 감수성 증가, 스트레스 반응의 손상, 병독성 반응의 손상 및/또는 필수 유전자들의 발현 교란으로 인하여 생존률이 감소할 수 있다. 본 발명의 방법은 세포의 방어 또는 생존 계 및/또는 병독성 계를 약화시키기 위하여 디코이를 사용할 수 있다. 본 방법은 세포를 세포 사멸에 대하여 더 취약하게 만들 수 있고/있거나 생장 또는 병원성을 억제할 수도 있다. 그러므로 일 관점에서, 본 디코이는 살균 또는 정균 효과를 나타낼 수 있다.
예를 들어, 일 관점에서 본 발명의 발명자들은 원핵 생물, 특히 박테리아 및 병원성 박테리아의 항생제 감수성에 대한 표현형을 변화시키기 위하여 디코이를 사용하였다. 일 관점에서 감수성의 증가는 하나의 항생제 또는 일 범주의 항생제에 특정되지 않았다. 일 관점에서 감수성의 증가는 임의적인 하나의 항생제 또는 일 범주의 항생제의 구조 및/또는 기전에 특정되지 않았다. 일 관점에서 광범위한 항생제 또는 항생제 범주에서 감수성이 증가하였다.
일 관점에서 감수성의 증가는 아미노글리코시드계 (카나마이신 등); 카바피넴계 (메로피넴 등); 세팔로스포린계 (세페핌 등); 글리코펩티드계 (반코마이신 및 댑토마이신); 페니실린계 (앰피실린, 카베니실린 및 페니실린 등); 폴리펩티드계 항생제 (폴리믹신 비 등); 퀴놀린계 (레바퀸 등); 설폰아미드계 (바크트림 등); 테트라사이클린계 (테트라사이클린 등); 및 클로람페니콜, 리팜피신, 지복스로부터 선택되는 임의의 한 항생제 또는 항생제 범주에 특정되지 않는다.
본 명세서에 기술된 디코이 방법은 또한 세포 적응 반응, 또는 세포 병독성 등의 표현형을 변화시키는데도 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 예컨대 제한된 영양 상태 등의 주어진 배양 또는 생리적 조건 하에서 필수 유전자들의 세포 내 발현 및 세포 생존률을 변화시키는데 사용될 수도 있다.
일반적으로 본 방법은 박테리아 감염 및 관련 질병을 표적으로 하는 새로운 수단을 제공한다. 이는 항생제 효과를 증가시키거나, 예컨대 생장 또는 생존률 억제와 같은 박테리아에 대한 직접적인 억제 효과, 병독성 결정인자의 발현 억제, 필수 유전자들의 발현 억제에 의할 수 있다. 그러므로, TFD는 타에 의존하지 않고 항생제 또는 항박테리아 제제로서 작용할 수 있다. 일 관점에서 본 방법은, 세포 생존률을 결정하는 유전자의 발현을 교란하는 디코이를 사용한다.
상기와 같이, 본 방법은 세포 경로의 조절, 반응 및 내성 기전을 교란시키기 위해 디코이를 사용한다. 몇몇 경우에 있어 이는 포괄적 조절 분자의 결합을 표적화하는 것을 포함한다. 표적 유전자(들)은 항생제에 대한 반응시 조절되는 유전자들이다.
표적은 내재적 다중-약물 내성 기전 등의, 내재적 항생제 내성 기전의 조절자들을 포함할 수 있다. 내재적 기전은 항생제와 같은 약물에 대한 물리적 장벽, 예컨대 항생제가 세포로부터 제거되는 속도를 증가시킨다거나 세포벽의 침투성 또는 투과성을 감소시키는 등의 물리적 장벽을 제공할 수 있다. 내재적 기전은 세포질 내로 진입한 항생제에 대한 내성을 제공할 수도 있다. 내재적 내성 기전은 스트레스나 본 명세서에 나열된 기타 조건 등의 환경적 상태에 대한 반응으로 유도될 수도 있다. 몇몇 경우에, 내재적 내성 기전을 암호화하는 유전자들의 발현은 항생제에 대한 반응으로 조절된다. 예를 들어, 이들은 그 발현이 항생제에 대한 반응으로 다양하게 조절되는 생리적 역할을 하는 단백질을 암호화하는 유전자들일 수 있다. 내재적 내성에 관련된 단백질을 암호화하는 유전자들은 예를 들어, 유출 펌프, 또는 세포벽 조성 또는 밀도 또는 세포벽 대사를 결정하는 단백질들을 암호화할 수 있다. 일 관점에서, 표적 유전자는 예컨대 항생제 구조 또는 기전 면에서 항생제 비-특이 또는 항생제 범주 비-특이 내성 기전을 암호화한다.
표적은 세포 적응 반응의 조절자를 포함할 수 있다. 통상 이들은 예컨대 적대적 환경 조건과 같은 환경 상태에 대한 적응 반응이다. 예를 들어, 이들은 산화 스트레스 반응 또는 과산화 스트레스 반응, 예컨대 질소 제한과 같은 영양 부족 반응, 예컨대 고 철 (iron) 상태 등의 금속 독소와 같은 독소에 대한 반응, 고 산도 (낮은 pH) 상태 등의 스트레스 반응을 포함한다. 그러므로 표적은 스트레스 반응 유전자의 조절자, 금속 조절 단백질, 및 질소 고정 유전자의 조절자를 포함할 수 있다.
세포 적응 유전자들은 그 발현이 환경 요인에 의해 결정되고 박테리움이 생존하고 그 환경에서 질병을 야기할 수 있는 능력에 영향을 미치는 유전자들이다. 예를 들어, 박테리움은 숙주 내의 낮은 철 농도 상태에 적응해야 할 필요가 있을 수 있고 철을 격리시켜 세포 내로 가져올 수 있는 단백질을 발현하는 일련의 유전자들을 도입함으로써 그렇게 한다. 이는 또한 생물막의 형성, 세포벽 생리 및 기본적 대사에 대한 변화를 포함한다.
스트레스 반응 유전자들은 세포 적응 유전자 범주를 형성한다. 이들은 제한된 수의 일련의 유전자들이고, 그 중 전부 또는 일부는 광범위한 스트레스에 대한 반응으로 유도된다. 스트레스는 물리적 요인 (온도 변화, 산도, 저 산소), 생물적 요인 (숙주 또는 기타 박테리움에 대한 반응) 및 화학적 요인 (항생제 치료 등)을 포함할 수 있다.
또한 생리적 조건에 대한 반응도 포함된다. 따라서 표적은 병원성 유전자 또는 독소와 같은 병독성 요인의 발현에 대한 조절자를 포함할 수 있다. 표적은 또한 생물막 형성 및 영양 (예컨대 철) 제거를 결정하는 단백질의 조절자를 포함한다.
병독성 요인 유전자들은 독소 등 질병을 야기하는 박테리움의 특정 분자들의 생성을 조절하거나, 박테리움의 생존 및 질병을 야기할 수 있는 능력에 영향을 미치는 반응을 숙주로부터 유도해 내는 유전자들이다.
표적은 또한 필수적 유전자들의 조절자를 포함한다. 이들은 일반적인 환경 조건에서 그 발현이 세포 생존에 필수적인 유전자들이다. 예를 들어, 표적은 DNA 복제, 기본적 대사 경로, 지방산 합성 또는 세포 분열에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자의 조절자일 수 있다.
필수적인 유전자들은 박테리움이 임의의 환경에서 생존하기 위하여 필요한 유전자들이다.
종종 세포 내에서 상기 기술한 시스템들 간 공통부분이 있다. 그러므로 하나의 조절자 단백질이 병독성 인자 및 환경 스트레스에 반응하는 세포벽 대사를 암호화하는 유전자들의 발현을 조절할 수도 있다. 또 다른 예로, 한 조절자 단백질이 예컨대 영양 결핍과 같은 특정 환경 조건 하에서 세포에 필수적인 유전자의 발현을 조절할 수도 있다.
일 관점에서 본 발명의 방법은 유전자들, 그 발현의 조절이 예컨대 하나 이상의 항생제 또는 하나 이상의 항생제 범주의 항생제 존재 하에서 세포의 생존 능력을 결정하는 유전자들을 표적으로 할 수 있다.
항생제 내성 유전자의 예는 동시 계류중인 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있다. 본 발명에 개시된 것과 같은 디코이들을 항생제 내성을 변화시키기 위하여, 예컨대 증가시키기 위하여, 도 1에 나타난 것과 같은 유출 펌프, 아미노글리코시드-변형 효소 또는 ermB 유전자 또는 베타 락탐가수분해효소를 암호화하는, PCT/GB2008/003353호에 개시된 하나 이상의 임의의 유전자를 표적화시키는데 사용할 수도 있다. 실제로, 디코이들은 하나 이상의 유전자 또는 전사 인자 및/또는 하나 이상의 박테리아 균주에 작용하도록 표적화된 2 이상의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 디코이는 그람-음성 및 그람-양성 박테리아의 Sig 결합 세트를 포함할 수 있다.
TFD는 인체 어디서든 발생할 수 있는 다양한 박테리아 감염의 치료를 위해 사용될 수도 있다. 5가지 일반적인 박테리아 감염 부문이 설명될 수 있다. 호흡계 감염이 그중 가장 일반적인데, 귀, 목, 및 부비강 등의 상부 호흡기 감염은 국부 투여 또는 에어로졸 제조로 치료될 수 있다. 하부 호흡기 감염은 폐렴 (다양한 박테리아 병원체로부터 야기된다), 기관지염 및 낭포성 섬유증의 전염성 합병증을 포함한다. 사회 및 병원 업무 모두에서 흔한 문제는 비뇨기계 감염인데, 소변이 감염되고 항박테리아제가 방광, 전립선, 요관, 및 신장으로 들어가야 할 필요가 있다. 내장은 감염에 취약한데 (일례로 위장 감염), 여기서 박테리아는 점막 침입 또는 독소 생성으로 질병을 야기하게 되며 콜레라 전염병과 같은 예를 들 수 있고 항생제를 사용하는 경우 경구 또는 정맥주사에 의한다. 심각한 외상 또는 화상 이후 피부 및 연조직 감염 (국부 투여로 치료될 수 있다)도 일반적인데, 이들은 미생물의 대량 서식 및 이입을 가능하게 하여 조직을 통하여 국부적으로 또는 급속히 퍼져나가게 된다. 피부 감염에 관한 미생물은 종종 표피 감염 (농가진), 연조직염 (혈액으로 확산될 수 있는 더 깊숙한 감염) 및 괴사근막염, 종종 생명을 위협하는 급속히 진행되는 감염을 야기하는 스트렙토코쿠스 피오제네스와 같은 피부 정상균무리로부터 나타난다. 마지막으로 박테리아성 수막염과 같은 중추 신경계 감염은 병원성 박테리아가 그랬던 것처럼, 치료법 역시도 혈액-뇌 장벽을 침투해야 하기 때문에 아마도 치료하기가 가장 어려울 수 있다.
디코이는 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시된 바와 같이 제조되고 시험될 수 있다.
하나 이상의 임의의 상기 구체예들은 본 발명의 방법들을 고려하였을 때 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 원핵 생물에서 유전자 발현을 교란시키기 위하여 디코이 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 전사 인자 결합 부위 (디코이 서열)를 포함한다. 일반적으로 본 방법에서는, 전사 인자에 대한 결합 부위를 포함하는 시스-조절자 서열에 작동적으로 연관된 유전자(들)을 포함하는 표적 세포 내로 디코이 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 폴리뉴클레오티드는 전사 인자를 결합 부위로부터 적정하여 세포 내 작동적으로 연관된 유전자(들)의 발현 조절을 교란시킨다. 유전자 발현의 변화는 세포의 표현형 변화를 야기한다.
본 발명의 방법에 의해 표적이 될 수 있는 전사 인자 및 유전자들은 본 명세서에 개시된 것 및 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시된 것들을 포함한다. 특정 실시예들은 도 2.에도 목록화된 이하의 조절자 및 조절 서열을 포함한다.
각 특정 조절자들에 대한 참고 자료는 목록화된 종 및 그들의 임의적인 상동체 종에 있어서의 참고 자료를 포함한다. 각 표적에 대하여 본래 결합 부위 및/또는 공통 결합 서열이 제시되어 있다. 조절자를 표적으로 하는 디코이 서열은 제시된 본래 서열 또는 공통 서열, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같이 디코이 기능을 갖는 예컨대 다른 종에 있어서의 본래 결합 부위인 그들의 변이 서열 또는 분절을 포함할 수 있다. 디코이 기능 여부에 대한 변이 서열의 시험 방법은 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있다. 특정 조절자를 표적으로 하는 디코이는 이하 목록화 된 바와 같이 특히 그 조절자가 존재하는 원핵 생물에 사용하기에 적합하다. 또한 각 조절자에 대한 목록은 예컨대 디코이를 처리함에 따라 통상 항생제에 대하여 감수성이 높아지는, 그 조절자를 표적으로 한 디코이의 사용에 대한 실시예이다,
본 명세서에 제공된 서열들은 결합 부위의 단일 가닥을 나타낸다. 그러나, 자연적으로 및 본 발명의 TFD에서는 그 서열이 이중 가닥이 될 것이라는 것을 인식할 수 있을 것이다. 본 발명에 목록화된 서열에 대한 상보적 서열은 예컨대 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition), 2001 by Joseph Sambrook and David Russell 과 같은 저서로부터 명확하고 쉽게 추론된다.
WhiB7
WhiB7은 미코박테리아 (예컨대 엠. 스메그마티스 및 엠. 튜베르큘로시스) 및 스트렙토마이세스 등 악티노마이세츠 항생제 내성 유전자의 전사 조절자이다 (Nguyen et al, Trends in Microbiology (2006) 14:304-312).
엠. 스메그마티스 균주 MC2 155의 본래 WhiB7 결합 부위는 다음을 포함한다:
5'- CACCAGCCGA AAAGGCCACG GACCCGCAGT CACCCGGATC CGTGGCCATT TTTGTCGGAC CCCCCGAGAA ATCTGGTCGC AGGATCCATC AGCTCAGACA GATCAC- 3' (SEQ ID NO: 9)
유전자좌 CP000480 6988209 bp 원형 DNA BCT 12-DEC-2006
정의 미코박테리움 스메그마티스 균주 MC2 155, 완전 유전자.
수탁 CP000480
버전 CP000480.1 GI:l18168627
좌표 20313637-2031742
용도: 광범위한 친수/친유계 항생제, 예컨대 마크롤라이드계, 린코스아미드계, 클로람페니콜, 이미피넴, 프리스티나마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 이소니아지드, 에탐부톨 등의 효능을 증가시킨다.
WhiB7 TFC 서열 중 일 실시예는 다음을 포함한다:
WhiB7 TFD 5' TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3'
(SEQ ID NO: 5; 실시예 2)
FadR
FadR은 대장균의 지방산 합성을 위한 필수적 경로에 관여하는 유전자 (fabA 및 fabB 등) 발현의 조절자이다 (Campbell & Cronan, J. Bacteriology (2001) 183:5982-5990)
대장균 K12의 FadR 본래의 결합 부위는 다음 서열을 포함한다:
5' AGTAAGTTTC GAATGCACAA TAGCGTACAC TTGTACGCCG AACAAGTCCG ATCAGCCATT TAA-3' (SEQ ID NO: 10)
유전자좌 CP000948 4686137 bp 원형 DNA BCT 05-JUN-2008
정의 대장균 균주 K12 하위군 DHlOB, 완전 유전자.
수탁 CP000948
버전 CP000948.1 GI:169887498
좌표 2531419-2531481
용도: 지방산 합성을 표적으로 하는 임의의 항생제, 예컨대 플라텐시마이신, 플라트네신 유도체, 포말레닉산, 코리튜버린, 사이클릭 솔폰, 안트라닐산 유도체, 세룰레닉산 등의 효능을 증가시킨다.
FadR TFD 서열의 한 실시예는 다음을 포함한다:
FabB TFD 5' TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3'.
(SEQ ID NO: 6; 실시예 3)
YycG / YycF
YycG/YycF는 에스 . 아우레우스 , 비. 서브틸리스 , 에스 . 뉴모니아에 , 리스테리아 모노사이토제네스 등의 낮은 G+C 함량의 그람 양성 박테리아에서 발견되는 두 가지 구성요소로 이루어진 조절자이다. YycG/YycF는 LytM, SsaA 및 병독성 결정 및 세포벽 합성에 관여하는 유전자들 등의 최소 12개의 유전자들의 필수 조절자로 알려져 있다 (Dubrac & Msadek, Journal of Bacteriology (2004) 186:1175-1181).
에스 . 아우레우스의 YycF 및 YycG의 본래 결합 부위 (LytM 및 Ssa의 프로모터 내)는 다음을 포함한다:
YycF _ LytM
5'- GCTATTTTGTAATGACAATGTAATGAGTTTAGTAAAAA-S ' (SEQ ID NO: 11)
유전자좌 CP000730 2872915 bp 원형 DNA BCT 16-NO V-2007
정의 스태피로코쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 USA300 TCH1516, 완전 유전자.
수탁 CP000730
버전 CP000730.1 GI:160367075
좌표 322073-322109
YycF_SsaA
5'- ATTACAAATTTGTAACAGACTTATTTTA-S ' (SEQ ID NO: 12)
유전자좌 CP000730 2872915 bp 원형 DNA BCT 16-NO V-2007
정의 스태피로코쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 USA300 TCH1516, 완전 유전자.
수탁 CP000730
버전 CP000730.1 GI:160367075
좌표 2415067-2415093
용도: 마크롤라이드-린코스아미드-스트렙토그라민 비 (MLSB) 계 항생제들의 효능을 증가시킨다.
YycG/YycF TFD 서열의 실시예는 다음을 포함한다:
LytM TFD 5 ' GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAA AA 3 '
SsaA TFD 5' ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A 3'.
(SEQ ID NOs 7 & 8; 실시예 4)
Sigma 54 또는 Sig B
Sigma 54 또는 SigB 는 엠. 스메그마티스 , 피. 아에루기노사 , 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 , 클레브시엘라 뉴모니아에 등 약 60%의 박테리아에 존재하는 적응 반응의 주요 조절자이다 (Wigneshweraraj, Molecular Microbiology (2008) 68: 538-546).
에스 . 아우레우스 및 케이 . 뉴모니아에의 본래 결합 부위는 다음을 포함한다:
SA_sig
5'- TTATTATATA CCCATCGAAA TAATTTCTAA TCTTC-3' (SEQ ID NO: 13)
유전자좌 CP000730 2872915 bp 원형 DNA BCT 16-NO V-2007
정의 스태피로코쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 USA300 TCH1516, 완전 유전자.
수탁 CP000730
버전 CP000730.1 GI:160367075
좌표 2187051-2187017
KP_sig
5'- CCGATAAGGG CGCACGGTTT GCATGGTTAT-3' (SEQ ID NO: 14)
유전자좌 X13303 24206 bp 선형 DNA BCT 18-APR-2005
정의 클레크시엘라 뉴모니아에 nif 유전자 클러스터 DNA.
수탁 X13303
버전 X13303.1 GI:43820
좌표 18301-18330
용도: 예컨대 본 발명에 개시된 것들과 같은 살균 및 세균 발육 저지 항생제들의 효능을 증가시킨다.
Fur
Fur 조절은 최초에는 철 조절에 중요한 것으로 알려졌으나 점차 다른 적응 경로들, 가장 괄목할 만한 것으로 금속조절계 (Zn- Zur) 및 과산화효소 (Per)에 대한 내성을 결정하는데 관여되어 있음이 알려졌다. Fur 조절은 적어도 에스 . 아우레우스 , 대장균, 헬리코박터 파일로리 , 비. 서브틸리스에 존재한다 (Fur, PerR, Zur, MntR), (Horsburgh 2001; Lavarr 2003; and Delany 2001).
에스 . 아우레우스 및 대장균의 Fur 결합 공통 서열은 다음을 포함한다:
SA_fur
5'- ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TT-3' (SEQ ID NO: 15)
Horsburgh, J. Bacteriology (2001) 183:468에 개시된 공통 서열 (‘Fur BOX’).
EC_fur
5'- GATAATGATAATCATTATC-S' (SEQ ID NO: 16)
de Lorenzo, J. MoI. Biol. (1998) 283:537에 개시된 공통 서열.
에이치. 파일로리의 본래 결합 서열은 다음을 포함한다:
HP_fur
5'- GTT GTC CCA TAA TTA TAG CAT AAA TGA TAA TGA AAA AGT AAA-3'
(SEQ ID NO: 17)
유전자좌 CP001072 1608548 bp 원형 DNA BCT 12- JUN-2008
정의 헬리코박터 파일로리 Shi470, 완전 유전자.
수탁 CPOO1072
버전 CP001072.2 GI:189491895
좌표 691415-691374
용도: 스트레스 (살균)를 유발할 수 있는 항생제들의 효능을 일반적으로 증가시킨다. Fur 디코이는 스트레스-반응 기전 및 환경 적응을 동요하게 하는 항생제 없이 사용될 수 있다.
TcdR
TcdR은 자기 조절 및 병독성을 결정하는 두 가지 주요 외독소의 발현을 조절하는 대체적 시그마 인자이다. TcdR 조절은 클로스트리디움 디피실레 , 씨. 보툴리니움 (상동체는 BotR), 씨. 테트라니 (TetR) 및 씨. 페르프린젠스 (UviA)에 존재한다고 알려져 있다 (Matamourous, Molecular Microbiology (2007) 64:1274-1288).
씨. 디피실레의 공통 결합 부위는 다음을 포함한다:
TcdR
5 '- AAG TTT ACA AAA TTA TAT TAG AAT AAC TTT TTT A TT-3 ' (SEQ ID NO: 18)
Dupuy, MoI. Micro. (2006) 55: 1196에 개시된 공통 서열 (TcdR, -35 및 -10 상자는 밑줄로 표기하였다)
용도: 많은 항생제들의 효능, 가장 괄목하게는 세균 발육 저지 특성을 증가시킨다.
Vfr
Vfr은 피. 아에루기노사 및 대장균에서의 일반적인 병독성 인자의 조절자이다 (Kanack, Microbiology (2006) 152:3485-3496). 대장균의 상동체는 CRP이고, toxA 유전자의 프로모터 및 regA 유전자의 프로모터에 존재하는 결합 부위를 가진다.
피. 아에루기노사의 두 개의 공통된 본래 결합 부위는:
PA_Vfr
5'- AAA TGT GAT CTA GAT CAC ATT T-3' (SEQ ID NO: 19)
Kanack, Microbiol. (2006) 55: 1196에 개시된 공통 서열.
PA_ToxA
5'- CACTCTGCAA TCCAGTTCAT AAATCC-3' (SEQ ID NO: 20)
유전자좌 EU595736 26 bp 선형 DNA BCT 15-JUN-2008
정의 수도모나스 아에루기노사 균주 PACS458 클론 fal366, 완전 유전자.
수탁 EU595736 REGION: 10145..10170
버전 EU595736.1 GI: 187939551
좌표 10145-10170
PA_RegA
5'- GTAACAGCGGAACCACTGCACAG -3' (SEQ ID NO: 21)
유전자좌 EU595736 26 bp 선형 DNA BCT 15-JUN-2008
정의 수도모나스 아에루기노사 균주 PACS458 클론 fal366, 완전 유전자.
수탁 EU595736 REGION: 10145..10170
버전 EU595736.1 GI: 187939551
좌표 312-334
항생제: 피. 아에루기노사 및 대장균의 병독성을 결정하는 일련의 유전자들의 발현을 조절하기 위하여 디코이는 항생제 없이 사용될 수 있다. 디코이는 항생제의 효능, 가장 괄목하게는 세균 발육 저지 특성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
NtrC
NtrC는 적어도 클레브시엘라 뉴모니아에의 환경 적응에 필요한, glnA, 필수 유전자의 조절자이다 (Minchin et al, The EMBO Journal (1989)8:3491-3499).
케이 . 뉴모니아에의 본래 결합 부위는 다음을 포함한다:
KP_NtrC
5'- GCTTTGCACTACCGCGGCCCATCCCTGCCCCAAAACGATCGCT -3' (SEQ ID NO: 22)
유전자좌 X13303 24206 bp 선형 DNA BCT 18-APR-2005
정의 클레브시엘라 뉴모니아에 nif 유전자 클러스터 DNA.
수탁 X13303
버전 X13303.1 GI:43820
좌표 18159-18201
용도: 디코이는 환경 적응에 필요한 필수 유전자, glnA의 발현을 동요시키기 위하여 항생제 없이 사용되거나, 스트레스 (살균)를 유발할 수 있는 항생제와 함께 일반적으로 조합하여 사용될 수 있다.
ArsR
ArsR은 적어도 헬리코박터 파일로리 , 에이치. 아시노니키스 및 에이치. 펠리스의 산도 적응을 암호화하는 유전자들의 조절자이다 (Pflock et al, J. Bacteriology (2006) 188:3449-3462). Pflock et al에 개시된 amiE 프로모터 및 rocF 프로모터에 존재하는 결합 부위.
본래 결합 서열의 실시예는 다음을 포함한다:
HP_AmiE
5'- ATAATCATAA TGATTAAAGT TTTCATATTC ATTATAAATC CGTTTACACA ATTATT -3' (SEQ ID NO: 23)
유전자좌 AE000511 56 bp 선형 DNA BCT 27-DEC-2005
정의 헬리코박터 파일로리 26695, 완전 유전자.
수탁 AE000511 REGION: 310910..310965
버전 AE000511.1 GI:6626253
좌표 310910-310965
HP_RocF
5'- GAAATTGTTC TATTTATTAT CCATTTGCTT ATTAATAATT GGTTGTTAAT TTTGGTTTAG A -3' (SEQ ID NO: 24)
유전자좌 AE000511 61 bp 선형 DNA BCT 27-DEC-2005
정의 헬리코박터 파일로리 26695, 완전 유전자.
수탁 AE000511 REGION: 1459830..1459890
버전 AE000511.1 GI:6626253
좌표 1459830-1459890
용도: 디코이는 환경 적응에 필요한 철-흡수를 매개하는 필수 유전자의 발현을 동요시키기 위하여 그 자체만으로 사용되거나, 스트레스 (살균)를 유발할 수 있는 항생제와 함께 일반적으로 조합하여 사용될 수 있다.
글리코펩티드 -내성 공통 서열 ( GISA )
공통 서열은 비전매특허 마이크로어레이 결과의 생물정보학적 분석을 통하여 결정되었다. 모티프는 글리코펩티드 내성 균주와 그 모체, 및 같은 내성 균주와 복귀 돌연변이체를 비교하여 상향-조절된 유전자에서 찾아내었다 (Scherl, BMC Genomics (2006) 7:296). 17/22 프로모터가 공유된 공통 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.
tcaA의 프로모터에서 발견된 병독성의 양 조절자 (positive regulator)인 공통 서열의 한 실시예는 디코이로 사용될 수 있다 (이하 참조).
SA_TcaA
5'- TGAACACCTTCTTTTTA -3' (SEQ ID NO: 25)
유전자좌 CP000730 2872915 bp 원형 DNA BCT 16-NO V-2007
정의 스태피로코쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 USA300_TCH1516, 완전 유전자.
수탁 CP000730
버전 CP000730.1 GI:160367075
좌표 2476452-2476436
공통 서열은 적어도 에스 . 아우레우스에 존재한다. 그 서열을 표적으로 하는 디코이는 본래 프로모터의 그 서열에 결합하는 어떤 임의의 조절 단백질이라도 표적으로 하여 사용될 수 있다. 본래 서열에 결합함으로써 조절되던 유전자들은 통상적으로 글리코펩티드 내성 및/또는 병독성에 기여하는 것이다.
용도: 디코이는 글리코펩티드계 항생제의 효능을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
AgrA
공통 서열은 비전매특허 마이크로어레이 결과의 생물정보학적 분석을 통하여 결정되었다. 모티프는 병독성과 관련된 조절자, Agr에 의하여 양적으로 조절된 것으로 보이는 유전자들 중에서 찾아내었다 (Dunman, J. Bacteriol. (2001) 183:7341).
추정되는 모티프는 병원성을 결정하는 데 관여하는 것으로 여겨지는 두 개의 프로모터에 존재하는 것이 발견되었다 (AraC-유사 전사 조절자의 상류 SA2093 및 SA1269, Blt-유사 유전자).
SA_Agr_2093
5'- AGA AAG ACA AAC AGG AGT AA -3' (SEQ ID NO: 26)
유전자좌 CP000730 2872915 bp 원형 DNA BCT 16-NO V-2007
정의 스태피로코쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 USA300 TCH1516, 완전 유전자.
수탁 CP000730
버전 CP000730.1 GI: 160367075
좌표 2414790-2414771
SA_Agr_1269
5'- GAA GAA ACA AAA AGC AGC AT -3' (SEQ ID NO: 27)
유전자좌 AP009324 2880168 bp 원형 DNA BCT 09-JAN-2008
정의 스태피로코쿠스 아우레우스 아종 아우레우스 Mu3 DNA, 완전 유전자.
수탁 AP009324
버전 AP009324.1 GI: 156720466
좌표 1549580-1549561
결합 모티프는 적어도 에스 . 아우레우스에 존재하고, 피. 아에루기노사 및 대장균 등의 많은 그람-음성 종에서 상동체를 함유한다. 그 모티프를 표적으로 하는 디코이는 본래의 프로모터에 존재하는 그 모티프에 결합하는 모든 조절 단백질을 표적화하는데 사용될 수 있다. 본래의 서열에 결합함으로써 조절되던 유전자들이 통상적으로 세포 내에서 병독성을 결정하는 것들이다.
용도: 디코이는 피. 아에루기노사 및 대장균의 병독성을 결정하는 일련의 유전자들의 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드 내 디코이 서열 (전사 인자 결합 부위)은 유전자와 작동적으로 연관되어 있지 않다. 전사 인자 결합 부위는 관련 프로모터의 임의의 다른 요소들로부터 분리되어 있을 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어 디코이 폴리뉴클레오티드는 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시된 바와 같이 및/또는 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시된 방법에 따라 제조된 n[스네어(snare)] 플라스미드를 포함할 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 디코이 서열 카피 (copy)를 하나 이상 포함할 수 있다. 그 폴리뉴클레오티드는 디코이 서열 카피 다수를 포함하는 다중 결합 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1 내지 1000개의 카피를 포함할 수 있다. 통상적으로 2 또는 그 이상의 카피, 예를 들어, 2 내지 1000 카피, 예컨대 최소 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개의 카피이다. 예를 들어, 10-200, 10-150, 20- 120, 20-100, 30-100, 30-80, 30-50, 30-40의 카피일 수 있다. 예를 들어, 디코이 서열 카피 30개일 수 있다. 통상적으로 다수의 디코이 카피, 예를 들어, 다수의 디코이 서열 동향 반복이 있을 수 있다.
혹은, 디코이 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 디코이 서열 및 다수의 디코이 서열 카피를 포함할 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 디코이 서열에 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 추가적인 서열은 엑소- 및/또는 엔도뉴클리에이즈의 작용에 의한 디코이 서열의 분해에 대한 저항성을 증가시키는 결과를 낳는다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 2차 구조 요소를 포함할 수 있다. 통상적으로 이 2차 구조는 엑소- 및/또는 엔도뉴클리에이즈의 작용에 의한 디코이 서열의 분해에 대한 저항성을 증가시키는 결과를 낳는다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 보다 높은 뉴클리에이즈 저항성을 부여하기 위해 변형된 염기 또는 당을 포함할 수 있다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 엑소뉴클리에이즈 활성을 감소 또는 억제하기 위하여 2’OH 뉴클레오티드 또는 아민을 폴리뉴클레오티드 말단에 포함할 수 있다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 선형 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 원형 이중 가닥 DNA, 예컨대 소위 아령 구조를 포함할 수 있다 (Ahn et al, Biochemical Biophysical Res. Comm. (2003) 310:1048-1053). 아령은 통상적으로 스템 루프 구조로 묶여진 표적 서열, 또는 기타 서열을 포함하는 이중 가닥 부위를 갖는다. 디코이 폴리뉴클레오티드는 분자의 한쪽 또는 모든 5’말단에 콜레스테롤 변형을 포함할 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 적합한 임의의 조합으로 임의의 상기 특징들을 하나 이상 포함할 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 개시된 및/또는 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시된 방법에 따라 규명된 임의의 디코이 서열을 포함할 수 있고, 또한 개시된 추가적인 서열도 포함할 수 있다.
상기와 같이, 디코이 폴리뉴클레오티드는 n[스네어] 플라스미드를 포함할 수 있다. 이 플라스미드는 예컨대 선형 올리고뉴클레오티드와 비교했을 때, 박테리아 내로 쉽게 도입되고, 양성 선택으로 유지될 수 있으며, 엑소뉴클리에이즈 분해 문제를 회피할 수 있다는 이점을 갖는다.
플라스미드-유래 버전의 디코이 올리고뉴클레오티드를 제작하는 이점은 제작비 절감, 뉴클리에이즈에 대한 생체 내 저항성의 증가, 플라스미드 수의 유지 (자가-복제 및 필요하다면 양성 선택에 의하여), 광범위한 숙주, 및 별개이지만 양용 가능한 n[스네어] 플라스미드를 이용하여 조합 또는 시스-조절 서열을 시험해 볼 수 있는 능력 (시너지 효과를 시험하기 위하여)을 포함한다.
n[스네어] 플라스미드는 본 발명의 방법에서 디코이 폴리뉴클레오티드로 사용하기에 적합하다. n[스네어] 플라스미드 및 라이브러리는 또한 알려진 또는 추정되는 시스-조절 서열의 가능한 디코이 기능을 시험하기 위하여, 또는 새로운 시스-조절 서열 (디코이 서열로 작용할 수 있는)을 선별하기 위하여 적합하다.
n[스네어] 플라스미드의 사용 원리가 도 3. 에 설명되어 있다. 이 플라스미드는 “스네어 (snare)”서열 ( 도.에는 다중 카피로 나타나 있다)을 포함한다. “스네어”가 전사 인자에 대한 결합을 두고 세포의 시스-조절 서열과 경쟁하는 전사 인자 결합 부위를 포함하면 (즉, 디코이 기능을 갖는 것), n[스네어] 플라스미드를 세포로 도입하는 것은 전사 인자를 세포의 시스-조절 서열로부터 분리시켜 스네어에 적정되도록 하는 결과를 낳는다. 이는 세포 내에서 그 발현이 그 시스-조절 서열에 의해 조절되는 유전자(들)의 발현 변화로부터, 또는 세포의 표현형 변화에 의하여 감지될 수 있다.
일반적으로 n[스네어] 플라스미드는 플라스미드 벡터와 인서트 서열 (insert sequence) (인서트는 스네어를 포함한다)을 포함한다. 플라스미드에 스네어 서열을 포함시킴으로써 본 기술의 디코이 분해 문제가 해결되고, 세포 내에서 디코이의 안정한 유지 (및 유전자 발현에 대한 임의의 영향)가 가능하게 된다.
인서트 서열은 단량체 서열 (스네어를 포함한다) 카피를 하나 이상 포함한다. 그러므로 상기 인서트는 (예를 들어) 1 내지 200개의 단량체 서열을 포함할 수 있다. 통상 2 이상의 카피, 예를 들어 2 내지 200개의 카피, 예컨대, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 또는 190개의 카피가 있을 수 있다. 예를 들어, 5-200, 5-150, 5-100, 10-150, 10-50, 5-50, 5-40, 10-40, 5-30개의 카피가 있을 수 있다. 예를 들어, 단량체 서열 의 30개 카피가 있을 수 있다. 상기 플라스미드는 통상 단량체의 단독중합체를 포함한다. 통상 그들은 단량체의 다중 카피, 예를 들어 단량체 서열의 다중 동향 반복이다. 단량체의(그러므로 스네어의) 다중 카피 를 제공함으로써 디코이의 적정력은 증가하게 된다.
단량체 서열은 스네어 서열을 포함한다.
통상 스네어 내의 전사 인자 결합 부위는 유전자와 작동적으로 연관되지 않는다, 예컨대, 스네어 내 또는 스네어 플라스미드 내에 존재한다. 그러한 측면에서 결합 부위는 그 관련 유전자(들)로부터 격리되어 있다. 스네어 내의 결합 부위 역시 그 관련 프로모터 내의 다른 요소들로부터 격리되어 있다. 일례로, 단량체 서열은 유전자를 포함하지 않는다.
단량체는 스네어 외에 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 본 발명으로부터 유래한 이러한 추가적인 서열은 종종 스네어 및/또는 플라스미드 인서트를 제작하는데 사용된다. 예를 들어, 단량체는 본 발명의 방법에 따라 커스텀 n[스네어] 라이브러리 용으로 “커스텀”스네어들을 제작할 때 통상 발생하는 어댑터 서열 등의 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 어댑터 서열은 예를 들어 하나 이상의 제한 효소에 대한 인식 및/또는 절단 부위를 포함할 수 있다.
단량체는 예컨대, 단량체 또는 다중 단량체를 포함하는 인서트의 제작에 사용되는 프라이머의 결합 부위를 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 플라스미드 인서트가 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있는 롤링 서클 증폭 방법 (rolling circle amplification method)을 사용하여 제조되는 경우, 단량체는 예컨대 T7 프라이머와 같은 롤링 서클 복제에 사용된 프라이머의 결합 부위에 상응하는 분절을 통상 포함하게 된다.
또한 무작위의 스네어 서열을 포함하는 단량체는 통상 일정한 서열을 갖는 부분 또는 부분들을 포함한다. 예를 들어, n 뉴클레오티드의 무작위 스네어 서열은 일정한 서열 부분에 의해 측면 배치될 수 있다. 혹은, 일정한 서열의 중앙의 핵심부가 무작위의 뉴클레오티드 서열 부분에 의하여 측면 배치될 수도 있다.
단량체의 길이는 예를 들어 1000개 뉴클레오티드까지, 예를 들어, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10개 뉴클레오티드까지 일 수 있다. 통상 단량체의 길이는 예를 들어, 35-54개와 같이10-100, 10- 50, 20-75, 30-60, 30-50, 35-55개의 뉴클레오티드의 범위 내일 수 있다. 예를 들어, 단량체의 길이는 30, 40 또는 50개의 뉴클레오티드일 수 있다.
단량체의 스네어 부분은 통상 10-30개의 뉴클레오티드 크기 범위일 수 있다. 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개와 같이 10-25, 10-20, 15-20개의 범위, 예를 들어 19개의 뉴클레오티드일 수 있다.
어댑터 서열은 예를 들어 5-30개의 뉴클레오티드, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개와 같은 5-25, 5-20, 5-15 또는 5-10개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
통상, n[스네어] 플라스미드 내의 인서트는 본 명세서에서 설명하고 있는 바와 같이 하나 이상의 단량체 카피를 포함한다. 인서트는 단량체의 다중 반복을 포함, 이는 탠덤 리피트 (tandem repeat)일 수 있다.
플라스미드 벡터 내의 인서트는 예를 들어, 약 1.5kb, 예를 들어, 1-2 kb, 예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8kb를 포함할 수 있다. 그러나, 적합한 숙주 세포 내에서 플라스미드를 안정하게 유지되도록 하고 본 발명에 있어서 효율적인 사용이 가능하다면 적합한 크기의 임의의 인서트가 사용될 수 있다.
통상 단일 플라스미드 내의 모든 단량체 서열은 동일하다.
n[스네어] 플라스미드용 플라스미드 벡터는 원핵 또는 진핵 생물 숙주용으로 적합할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 예컨대, 악티노마이세트 숙주 등의 박테리아와 같은 원핵 생물용일 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터는 예컨대, 하나 이상의 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 예컨대, A3(2) (또는 균주 M145 또는 M600), 대장균, 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 시나모네우스와 같은 스트렙토마이세트 또는 대장균 균주용으로 적합할 수 있다. 적합한 숙주는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.
통상, 상기 벡터는 광범위한 숙주에 대한 및/또는 셔틀 벡터이고, 그러므로 ?颱毬? 이상의 숙주에서 유지 및 전파될 수 있다. 상기 플라스미드는 접합 플라스미드일 수 있다. 이는 접합을 통하여 한 세포로부터 다른 세포로 쉽게 전이될 수 있도록 한다.
좋기로는 상기 플라스미드는 자가-복제가 가능한 것이다. 통상 상기 벡터는 높은 카피 수를 갖는 플라스미드이다. 예를 들어 상기 플라스미드는 예컨대 세포 당 20-100 카피, 예컨대 세포 당 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 또는 100 카피를 유지할 수 있다. 높은 카피수는 스네어 내의 디코이 서열의 적정력을 증가시킨다.
통상 n[스네어] 플라스미드는 복제 시작점 (origin of replication)을 함유한다. 적절한 시작점은 이 기술 분야에 알려져 있다. 통상 상기 플라스미드는 예컨대, 항생제 내성을 암호화하는 하나 이상의 유전자, 예컨대, 아프라마이신 내성을 암호화하는 aac 유전자와 같은 하나 이상의 감지용 마커 유전자를 추가적으로 함유하고 있다. 상기 마커 유전자(들)의 발현은 숙주 내에서 플라스미드의 유지 여부를 스크리닝할 수 있게 한다.
적합한 플라스미드 벡터의 예로, 예컨대, pIJ86을 들 수 있다. 적합한 벡터가 이 기술 분야에 알려져 있다.
스네어는 게놈 또는 게놈의 분절로부터 유래 또는 분리된 서열을 포함할 수 있다. 게놈의 분절은 관심 대상인 특별 기능 또는 표현형을 암호화하는 유전자(들)을 포함할 수 있다. 스네어는 예를 들어, 이러한 유전자(들)의 프로모터 부분 또는 주변 서열로부터 유래하거나 분리된 서열, 예컨대, 유전자(들)로부터의 거리가 프로모터보다 더 먼 서열을 포함할 수 있다. 스네어는 본 명세서에서 개시하는 바와 같이 전사 인자가 결합하는 이러한 서열과 경쟁하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 스네어를 제조하기 위한 방법이 본 발명 및 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
예를 들어, 아령형은 선형 올리고뉴클레오티드를 준비하고 T4 연결 효소 (T4 ligase)로 연결시켜 제조할 수 있다. 혹은 실시예 1에 설명하고 있는 바와 같이 아령형 디코이는 적당한 프라이머를 사용하여 PCR로 제조할 수도 있다. 각 프라이머는 일반적으로 아령 구조의 스템 루프를 형성하게 될 부분을 함유한다. 이러한 프라이머의 예가 실시예 1에 주어져 있다. 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 통상 증폭된 생산물을 제한 효소 처리하고 닫힌 원형 아령형 (closed circular dumbbell)을 형성하기 위하여 연결하는 과정이 뒤따른다.
혹은, 아령형은 실시예 1에 설명되어진 플라스미드를 제한 효소 처리함으로써 제조할 수 있다. 그 후 닫힌 원형 아령형 구조를 형성하기 위하여 연결 과정이 뒤따른다.
n[스네어] 플라스미드 및 n[스네어] 플라스미드 라이브러리를 제조하는 방법이 본 명세서 및 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있다.
본 발명의 방법은 세포 내로 하나 이상의 디코이 서열을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 여러 다른 균주들 예컨대, 여러 가지 임상적 균주들의 조절자에 결합하는 다양한 서열을 포함하는 디코이 서열의 칵테일이 사용될 수 있다. 칵테일 내의 디코이 서열들은 임상적으로 존재하는 여러 가지 균주들과 동일한 비율로 존재한다. 또 다른 실시예로, 하나 이상의 조절자가 표적이 될 수 있다.
일 관점에서 본 명세서에 기술되어 있는 방법은 인 비트로 (in vitro) 방법을 포함한다.
본 명세서에서 언급하고 있는 숙주는 디코이 분자를 이용하여 그 유전자 발현 (및 표현형)을 변화시키고 싶은 것, 예컨대, 병원성 박테리아일 수 있다.
통상, 본 발명의 방법이 세포의 표현형을 변화시키는 데 사용되는 숙주 세포는 디코이 부재시의 표현형을 나타낸다. 관련 표현형을 의학적 또는 치료적으로 변화시키기 위한 예컨대, 항생제 감수성을 증가시키기 위한 디코이는 일련의 세포들 내에서 스크리닝된다. 예를 들어, 디코이는 그 표현형을 갖는 박테리아 모델, 예컨대, 항생제 내성 모델에서 우선 시험되고, 그 후 추가로 예컨대, 병원체 또는 임상적 분리주에서 입증된다. 디코이는 그 후 동물 모델, 예컨대 마우스 모델에서 시험된다.
디코이가 플라스미드인, 숙주 세포는 통상 플라스미드 벡터와 양립 가능하고 및/또는 그 안에서 상기 플라스미드가 안정적으로 유지 및 복제할 수 있는 것이다. 또한 숙주 세포는 통상 플라스미드 내 임의의 탐지 마커 유전자와도 양립 가능하다.
일반적으로, 숙주 세포는 관심 대상인 시스-조절 서열, 즉, 스크리닝된, 또는 디코이 서열이 그와 경쟁하기 위하여 세포 내로 도입된, 작동적으로 유전자(들)과 연관된 시스-조절 서열을 함유한다. 유전자(들)의 발현 조절은 직접 또는 간접으로 (예컨대, 표현형의 변화에 의하여) 탐지될 수 있다.
통상 상기 세포는 유전자(들)과 작동적으로 연관된, 시스-조절 서열을 함유하는 프로모터를 포함한다. 작동적으로 연관되었다 함은 시스-조절 서열 및/또는 프로모터가, 그 서열 및/또는 프로모터가 그 유전자(들)의 발현을 조절하도록 기능하는 [적당한 조건 하에서, 예컨대, 필요적 전사 인자(들)의 존재 하에서] 방식으로 유전자(들)과 연관되어있다는 것을 의미한다. 그러므로, 관련 전사 인자와 결합하였을 때 시스-조절 서열은 유전자(들)의 발현을 조절하도록 (억제 또는 활성화) 기능한다.
세포 내에서 시스-조절 서열의 기능은 연관된 유전자(들)의 발현을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 이는 그 유전자의 발현을 직접 모니터링함으로써 또는 그 유전자(들)의 발현과 관련되어 있는 특정 표현형의 발현을 모니터링함으로써 이루어 질 수 있다. 예를 들어, 기능에 대한 스크리닝은 하나 이상의 항생제에 대한 내성, 스트레스 반응, 병독성 인자 또는 필수 유전자들의 발현에 대한 스크리닝을 포함할 수 있다. 스크리닝 방법은 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있다.
숙주 세포는 그 본래의 (관련) 유전자(들)과 작동적으로 연관된, 즉 그 유전자의 발현을 그 서열 (또는 프로모터)이 본래의 위치에서 조절하는 유전자와 연관된 시스-조절 서열 (예컨대, 프로모터 함유 서열)을 포함할 수 있다. 시스-조절 서열 및 조절 대상인 유전자(들)은 예컨대, 항생제 내성 병원성 박테리움의 내재적 내성기전을 암호화하는 유전자와 같은 세포 내생성 (endogenous)인 것일 수 있다.
적합한 숙주 세포들이 이 기술 분야에 알려져 있고 본 명세서에 실시예로 개시되어 있다.
본 발명의 방법은 일반적으로 원핵생물에 대하여 사용하기에 적합하다. 특히 본 방법은 병원체, 특히 병원성 박테리아, 예를 들어, 인간에게 영향을 미치는 병원성 박테리아에 사용할 수 있다. 이 박테리아로는 이하의 속 (genuses) (그람 염색 시험 결과에 따른 목록)을 들 수 있다.
그람 음성: 아시네토박터 (Acinetobacter); 보르데텔라 (Bordetella); 보렐리아 (Borrelia); 브루셀라 (Brucella); 캄필로박터 (Campylobacter); 대장균 (Escherichia); 프란시셀라 (Francisella); 해모필러스 (Haemophilus); 헬리코박터 (Helicobacter); 클레브시엘라 (Klebsiella); 레지오넬라 (Legionella); 렙토스피라 (Leptospira); 네이세리아 (Neisseria); 프로테오박테리아 (Proteobacteria); 수도모나스 (Pseudomonas); 리케트시아 (Rickettsia); 살모넬라 (Salmonella); 시젤라 (Shigella); 트레포네마 (Treponema); 비브리오 (Vibrio); 예르시니아 (Yersinia).
그람 양성: 바실러스 (Bacillus); 클로스트리듐 (Clostridium); 코리네박테리움 (Corynebacterium); 엔테로코쿠스 (Enterococcus); 리스테리아 (Listeria); 미코박테리움 (Mycobacterium); 스태피로코쿠스 (Staphylococcus); 스트렙토코쿠스 (Streptococcus).
염색되지 않은 박테리아: 클라미디아 (Chlamydia); 미코플라즈마 (Mycoplasma).
그람 음성 병원성 종 및 그들로부터 야기되는 질병의 예로는 에이. 바루만니 (A. barumannii) - 폐렴, 세균혈증 (Pneumonia, Bacteremia), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis) - 백일해 (whooping cough), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi) - 라임병 (Lyme's disease), 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus) - 브루셀라증 (Brucellosis), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) - 급성 장염 (Acute enteritis), 대장균 (Escherichia coli) - 패혈증, 폐렴(septicemia, pneumonia), 프란시셀라 튤라렌시스 (Francisella tularensis) - 야토병 (Tularemia), 헤모필러스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae) - 인플루엔자 (Influenza), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) - 위궤양 (Peptic ulcers), 클레브시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) - 폐렴 (pneumonia), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophilla) - 레지오넬라병 (Legionnaire's disease), 네이세리아 고노르호에 (Neisseria gonorrhoeae) - 임질 (Gonorrhoeae), 아시네토박테리아 다수종 (Acinetobacteria spp) - 병원 내 감염 (Noscomial infections), 수도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) - 패혈증 (sepsis), 리케트시아 리케트시 (Rickettsia rickettsii) - 리케차병 (Ricketts), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) - 장티푸스 (Typhoid), 에스. 디센테리아에 (S. dysenteriae) - 이질 (Dysentery), 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae) - 콜레라 (Cholera), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) - 흑사병 (plague)이 있다.
그람 양성 병원성 종 및 그들로부터 야기되는 질병의 예로는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) - 탄저병 (Anthrax), 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile) - 위막성 대장염 (Pseudomembranous colitis), 코리네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diptheriae) - 디프테리아 (Diptheria), 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis) - 병원 내 감염 (Noscomial infections), 리스텐스 모노사이토제네스 (Listens monocytogenes) - 리스테리아증 (Listeriosis), 미코박테리움 튜베르큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) - 결핵 (Tuberculosis), 스태피로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) - 패혈증 (Septicemia), 에스. 뉴모니아에 (S. pneumoniae) - 폐렴 (Pneumonia)이 있다.
다음의 속에 해당하는 박테리아 (상기 언급한 종들을 포함한다)가 특히 본 발명의 방법으로 적합하다: 대장균, 헬리코박터, 클레크시엘라, 네이세리아, 프로페오박터, 수도모나스, 살모넬라, 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코쿠스, 스태피로코쿠스, 시젤라.
일 관점에서 본 발명은 이 명세서에 개시된 디코이 폴리뉴클레오티드 (디코이 분자) (예컨대, 본 명세서 내의 임의의 방법으로 세포로 도입된)를 포함하는 세포 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 디코이 폴리뉴클레오티드의 존재로 인하여 예컨대, 플라스미드/디코이 분자의 부재시의 세포와 비교하여 항생제(들)에 대한 감수성의 증가, 병독성의 감소, 적응 반응의 손상과 같은 변화된 유전자 발현 및/또는 표현형을 나타내는 숙주 세포(들)에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 이 명세서에 개시된 바와 같이 디코이 폴리뉴클레오티드를 사용하면 생존력이 약화되는 병원체 또는 임상적 분리주들에 관한 것이다.
디코이 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 방법에 의해서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 (transformation), 트랜스펙션 (transfection), 접합 (conjugation)의 방법이 있을 수 있다. 예를 들어, 접합 플라스미드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 경우, 이는 접합에 의하여 도입될 수 있다. 예컨대, 원형 아령형 구조의 디코이 폴리뉴클레오티드는 트랜스펙션을 통하여 세포로 도입될 수 있다. 세포는 액체 배양되어 디코이를 액체 내로 첨가할 수 있다. 혹은 세포를 고체 배지 상에 배양하고 디코이를 디코이로 포화된 압지 디스크로 트랜스펙션하고 배지 상에 덮어씌울 수도 있다. 통상, 디코이 폴리뉴클레오티드를 배양 배지로 첨가하면 세포가 이를 흡수한다. 세포를 고체 배지 상에서 배양하면, 디코이 폴리뉴클레오티드를 필터 디스크로 첨가하고 세포가 디스크로부터 이를 흡수한다. 트랜스펙션을 돕기 위하여 투과 완충액을 사용할 수 있다.
일 관점에서, 디코이 폴리뉴클레오티드의 트랜스펙션은 콜레스테롤의 사용을 포함할 수 있다. 특히, 이 방법은 한쪽 또는 양쪽 5’말단을 콜레스테롤로 변형시킨 선형 디코이 폴리뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 상기 변형이 세포의 흡수를 용이하게 한다고 여겨진다.
예컨대, 형광 염료, 예컨대 Cy5 등 탐지 가능한 표지로 디코이의 5’말단을 추가적으로 표지할 수 있다. 이는 세포 내의 흡수 및 유지에 관한 모니터링을 용이하게 할 수 있다.
콜레스테롤 및/또는 탐지 가능하게 표지된 디코이는 실시예 1에 개시되어 있는 바처럼 콜레스테롤 및/또는 탐지 가능한 표지된 프라이머를 이용하여 제조될 수 있다.
디코이 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 트랜스펙션은 R9-콜레스테롤의 이용을 포함할 수 있는데, 이는 아홉 개의 D-아르기닌의 선형 사슬에 콜레스테롤 분자가 부착되어 이루어진다 (Kim W.J. et al, Mol Ther. (2006) 14:343-350).
일반적으로, 세포 내에서 디코이 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드 라이브러리의 흡수 및/또는 유지를 모니터한다. 예를 들어, 플라스미드 디코이는 예컨대 항생제 내성을 암호화하는, 그러므로 플라스미드의 존재를 양성 선택할 수 있게 하고 플라스미드의 증식을 모니터링할 수 있게 하는 탐지 마커를 포함할 수 있다. 디코이 폴리뉴클레오티드의 존재는 정량 리얼타임 PCR (qrt-PCR)에 의해서도 모니터될 수 있다.
일반적으로 디코이 서열은 전사 인자가 결합하기 위한 세포의 전사 인자 결합 부위와 경쟁하는 전사 인자 결합 부위를 함유한다. 세포의 결합 부위로부터 전사 인자를 적정함으로써, 상기 디코이는 세포 내의 결합 부위에 작동적으로 연관되어 있는 유전자(들)의 발현을 교란시킨다.
디코이 서열은 전사 인자의 세포 내 본래 결합 부위 서열을 포함할 수도 있다. 본래의 서열들은 이 기술 분야에서 쉽게 이용 가능하고 특정 조절자들의 내성성인 결합 서열의 예들이 본 명세서에 제시되어 있다.
디코이 서열은 특정 조절자의 공통 결합 부위를 포함할 수 있다. 재차, 이러한 공통 부위는 이 기술 분야에서 쉽게 이용 가능하고 몇몇 특정 조절자들의 예들이 본 명세서에 주어져 있다.
혹은 디코이 서열은 디코이 기능을 유지하고 있는 본래의 결합 서열 또는 공통 결합 서열의 변이 서열을 포함할 수 있다.
변이 서열은 모 서열에서 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 변화시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 풋프린팅 실험 (footprinting experiment)은 특정한 뉴클레오티드가 전사 인자 결합에 중요하지 않아 변화되어도 좋은지 보여줄 수 있다.
디코이로 추정되는 서열의 주어진 전사 인자 결합 부위와 경쟁할 수 있는 능력을, 디코이 서열을 함유하는 디코이 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주 세포 내로 도입하여 시험할 수 있다. 상기 숙주 세포는 유전자(들)의 발현을 직접 또는 간접적으로, 예컨대, 표현형의 변화를 스크리닝함으로써 측정할 수 있는, 상기 유전자(들)과 작동적으로 연관되어 있는 표적 전사 인자 결합 부위를 함유한다. 시험 서열의 디코이 기능을 유전자(들)의 발현 변화 또는 표현형의 변화를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 상기 디코이 폴리뉴클레오티드 중 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 상기 숙주 세포 중 어떤 것이라도 사용할 수 있다.
예를 들어, 시험 서열을 그 디코이 기능을 평가하기 위해서 우선 적합한 리포터 세포 (reporter cell) 내로 도입하여 리포터 유전자 (reporter gene)의 발현을 모니터할 수 있다. PCT/GB2008/003353에 기재되어 있는 “사멸 또는 생존 (dead or alive) ”리포터 세포를 이용하는 통칭 리포터-기반 실험 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 접근은 각 리포터가 세포 사멸을 야기하는 일반적인 조건 하에서 점수를 매길 수 있는 표현형 (scoreable phenotype)을 필요로 하는 문제점을 해결하는데, 이는 디코이가 세포가 생장할 수 있는 전사 인자를 적정 제거할 때에만 경감되는 것이다. 그러므로 두 리포터 양자 모두에 대한 선별은 세포 생존에 의존하고, 스크리닝 과정을 매우 신속하게 처리하게 한다. 본 시스템의 또 다른 특징은 이러한 사멸 또는 생존 스크리닝이 신속, 종합적이거나 고효율 스크리닝을 기반으로 쉽게 자동화될 수 있다는 점이다. 또한 자연 상태에서는 쉽게 점수를 매길 수 있는 표현형을 가지지 못하는 프로모터를 제어하는 조절 서열을 규명하는 것도 가능하다.
혹은 또는 추가적으로, 디코이 서열은 그 관련 유전자(들)과 작동적으로 연관된 표적 결합 부위를 포함하는 숙주 세포 내에서 시험될 수 있고, 유전자(들)의 발현을 교란시키는 능력이 결정될 수 있다. 어떤 디코이가 표현형의 차이를 만들어 내는 경우, 스크리닝에 사용된 숙주 세포는 특정 표현형을 나타낸다.
예를 들어, 본 발명에서 개시되고 있는 표적 조절자들에 대한 디코이 서열은 숙주 세포의 항생제에 대한 감수성 증가 여부를 스크리닝함으로써 시험될 수 있다. 항생제는 본 명세서에 개시된 바와 같이 선택될 수 있다.
어떤 경우에는, 디코이 서열을 표적 조절자에 적절한 또 다른 표현형에 대한 스크리닝을 함으로써 시험할 수 있다. 예를 들어, 스트레스 반응에 대한 조절자를 표적으로 하는 디코이는 손상된 스트레스 반응을 탐지함으로써 (생리적 충격에 대한 내성으로 측정된다) 시험될 수 있다. 병독성 인자에 대한 조절자를 표적으로 하는 디코이는 손상된 병독성 프로그램을 조사함으로써 시험될 수 있다. 후자에 대한 한 예로 냉동 바이알 (vial)로부터 현탁된 후 또는 특정 유전자의 하향 조절 (정량 리얼 타임 PCR로 측정된다) 후 낮은 생존력을 보이는 경우가 있다.
예를 들어, 지방산 합성에 필수적인 유전자들의 조절자를 표적으로 하는 FabB 디코이를 적합한 균주, 예컨대 대장균에 대하여, 예컨대, 로리아-버타니 LB 배지 (Luria-Bertani LB media) (1% [w/v] 박토-트립톤, 0.5% [w/v] 이스트 추출물, 1% [w/v] 염화 나트륨)에서 지방산 합성 과정에 작용하는 예컨대, 세룰레닌과 같은 항생제의 존재하에 시험할 수 있다. 예를 들어, 세룰레닌 10 μg/ml 농도에서, 무처리 박테리아는 정상적으로 생장하고 디코이로 처리한 박테리아에 대한 비교기로 작용하는데, 이는 눈에 띄게 매우 천천히 그리고 낮은 최종 밀도로 생장한다.
예를 들어, 스트레스 반응은 적합한 균주, 예컨대, 에스 . 아우레우스를 예컨대 LB 배지에서 예컨대, 알칼리 조건과 같은 스트레스 조건 하에서 기름으로써 유도될 수 있다. 예를 들어 수산화 칼륨을 함유하는 LB 배지, 예컨대, 30mM이 사용될 수 있다. 무처리 박테리아의 경우 알칼리 조건에 의하여 스트레스 반응을 유도하여 이 배지에서 잘 자라는 반면, 스트레스에 대한 조절 반응의 주요한 부분을 차지하는 sigB 조절자를 표적으로 하는 SA_sigB 디코이로 처리한 박테리아는 잘 자라지 못한다.
몇몇 예로는, 관련 유전자(들)의 발현에 대한 스크리닝은 적절한 조건 하에서 숙주 세포 생존력 결정 단계를 포함한다. 예를 들어, 시험하고자 하는 표현형이 항생제 내성인 경우, 스크리닝은 항생제의 존재 하에 세포를 배양하고 세포가 생존하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. “사멸 또는 생존 (dead or alive) ”리포터 숙주 세포를 포함하는 스크리닝에 있어서 세포 스크리닝은 세포를 리포터 유전자(들) (관심 대상인 시스-조절 서열에 작동적으로 연관된 유전자(들))의 발현이 숙주 세포의 생존력을 결정짓는 조건 하에서 배양하고, 살아있는 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 본 명세서에 개시되어 있는 바와 같이 예컨대, 결정되어야 할 세포의 표현형이 세포 생존력인 경우, 액체 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이는 적은 수의 세포만을 분석하면 된다는 이점을 갖는다.
본 명세서에 개시된 n[스네어] 플라스미드는
- 단량체 서열 카피 하나 이상을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계 및
- 상기 폴리뉴클레오티드를 적합한 플라스미드 벡터 내로 재조합하는 단계
를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
n[스네어] 플라스미드용 상기 단량체 조성물이 본 명세서에 개시되어 있다. 적합한 플라스미드 벡터도 또한 개시되어 있다.
단량체 서열 카피 하나 이상을 함유하는 폴리뉴클레오티드는
(1) (i) 관심 대상 서열 및
(ii) 롤링 서클 증폭에 사용할 적합한 프라이머에 대한 결합 부위
를 함유하는 원형 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계와,
여기서 상기 단량체 서열은 (i) 및 (ii)를 포함하는 것이다.
(2) 상기 원형 올리고뉴클레오티드를 주형으로 사용하여 롤링 서클 증폭을 수행함으로써, 그로부터 단량체 서열의 반복물을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계
를 포함하는 방법에 의하여 제공될 수 있다.
상기 방법의 단계 (1)은 롤링 서클 증폭 결과물을 PCR로 증폭시키고 원하는 크기의 폴리뉴클레오티드 조각으로 분리, 예컨대, 단량체 서열의 30-50 반복물을 포함하는 조각으로 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 이는 예컨대, PAGE 분석으로 수행될 수 있다.
원형 올리고뉴클레오티드는
- (i) 관심 대상인 시험 서열과
(ii) 롤링 서클 증폭에 사용할 적합한 프라이머에 대한 결합 부위
를 함유하는 선형 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계와,
- 예컨대, Taq 라이게이즈를 사용하여, 일반적으로 범용성 결합 올리고뉴클레오티드 (joining oligonucleotide)의 존재 하에서 상기 뉴클레오티드를 원형화하는 단계와,
- 필요에 따라 나머지 선형 DNA를 엑소뉴클리에이즈로 분해하는 단계 및
- 단량체 원형 올리고뉴클레오티드를 예컨대, PAGE를 이용하여 회복하는 단계
를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
롤링 서클 증폭용으로 적합한 프라이머는 이 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, T7 프라이머가 사용될 수 있다.
롤링 서클 증폭을 수행하기 위한 방법이 이 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, BstI 중합효소가 사용될 수 있다.
하나의 실시예로, 롤링 서클 증폭 결과물의 PCR 증폭은 롤링 서클 증폭용으로 사용되었던 동일한 프라이머, 예컨대, T7 프라이머를 사용하여 수행된다.
일반적으로 단량체 내의 서열 (i)은 본 명세서에 개시되어 있는 바와 같이 스네어 서열을 함유한다.
본 명세서에 개시되어 있는 바와 같이, 스네어 서열은 게놈 DNA, 예컨대 전체 게놈, 또는 게놈 분절로부터 분리될 수 있다. 일단 분리된 스네어 서열은 n[스네어] 플라스미드를 형성하기 위하여 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353에 개시되어 있는 방법으로 사용될 수 있다.
게놈 또는 게놈 분절로부터 스네어 서열을 제작하기 위한 프로토콜이 PCT/GB2008/003353에 개시되어 있다.
본 명세서에 개시되어 있는 바와 같이, 스네어 서열은 무작위의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 통상 상기 스네어는 무작위의 (또는 다양한) “n”뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로 n은 5-50의 범위, 예를 들어 10-50, 예를 들어 20-40 예컨대 25-35 예컨대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19또는 20개의 뉴클레오티드일 수 있다.
무작위의 서열 (및 필요에 따라 개시된 바와 같은 일정 서열)을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 이 기술 분야에서 공지의 방법으로 합성될 수 있다.
뉴클레오티드 바이어스 (bias)가 올리고뉴클레오티드의 무작위 (또는 다양한) 부분에 도입될 수 있다. 예를 들어, 적절하다면 GC 바이어스가 도입될 수 있다.
상기 본 발명의 단량체는 이러한 방식으로 제조되는 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. n[스네어] 플라스미드가 그 후 제조될 수 있다.
개시된 바와 같이, 본 발명의 일 관점은 원핵 생물의 항생제에 대한 감수성을 증가시키는 것이다. 예를 들어, 이는 세포가 항생제로부터 유도된 스트레스 조건 하에서 덜 생존할 수 있음을 의미하는 세포 내의 내재적 내성 기전, 또는 세포 적응 반응에 대한 표적화를 포함할 수 있다.
일 관점에서, 본 발명의 방법은 일반적으로 항생제의 효능을 증가시키기 위한 것으로 적합하다 (Alekshun and Levy, Cell (2007) 128:1037-1050). 이는 세균발육 저지 및 살균 항생제 양자를 모두 포함한다. 실시예로는 아미노글리코시드계 (카나마이신 등); 카바피넴계 (메로피넴 등); 세파로스포린계 (세페핌 등); 글리코펩티드계 (반코마이신 및 댑토마이신); 페니실린계 (앰피실린, 카베니실린 및 페니실린 등); 폴리펩티드계 항생제 (폴리믹신 비 등); 퀴놀린계 (레바퀸 등); 설폰아미드계 (바크트림 등); 테트라사이클린계 (테트라사이클린 등); 및 다양하게 클로람페니콜, 리팜피신 및 지복스로 알려진 항생제 범주를 포함한다.
일 관점에서, 세포 내 스트레스 반응을 억제하는 또는 세포가 스트레스를 받도록 하는 방법들이 특히 살균 항생제의 효과를 증대시키기 위하여 적합하다 (Kohanski et al, Cell (2007) 130:797-810).
살균 항생제는 다음을 포함할 수 있다:
β-락탐계
(a) 페니실린
(b) 카바피넴
(c) 몬박탐
(d) 세파로스포린
일세대: 세파세트릴 (Cefacetrile, cephacetrile), 세파드록실 (Cefadroxil ,cefadroxyl; 듀리세프). 세팔렉신 (Cefalexin ,cephalexin; 케플렉스), 세팔로글리신 (Cefaloglycin ,cephaloglycin), 세팔로니움 (Cefalonium ,cephalonium), 세팔로리딘 (Cefaloridine ,세팔로라딘), 세팔로틴 (Cefalotin ,cephalothin; 케플린), 세파피린 (Cefapirin ,cephapirin; 세파드릴), 세파트리진 (Cefatrizine), 세파자플러 (Cefazaflur), 세파제돈 (Cefazedone), 세파졸린 (Cefazolin ,cephazolin; 안세프, 케프졸), 세프라딘 (Cefradine ,cephradine; 벨로세프), 세프록사딘 (Cefroxadine), 세프테졸 (Ceftezole);
이세대: 세파클로 (Cefaclor ,세클로, 디스타클로, 케플로, 라니클로), 세포니시드 (Cefonicid , 모노시드), 세프로질 (Cefprozil ,세프록실; 세프질), 세푸록심 (Cefuroxime , 진낫, 지나세프, 세프틴, 바이오푸록심), 세푸조남 (Cefuzonam), 세프메타졸 (Cefmetazole), 세포테탄 (Cefotetan), 세폭시틴 (Cefoxitin), 카바세핌즈 (Carbacephems): 로라카베프 (loracarbef, 로라비드), 세파마이신 (Cephamycins): 세프부페라존 (cefbuperazone), 세프메타졸 (cefmetazole, 제파존), 세프미녹스 (cefminox), 세포테탄 (cefotetan, 세포탄), 세폭시틴 (cefoxitin, 메폭신)
삼세대: 세프카핀 (Cefcapene), 세프달록심 (Cefdaloxime), 세프디니어 (Cefdinir, 옴니세프), 세프디토렌 (Cefditoren), 세페타메트 (Cefetamet), 세픽심 (Cefixime, 수프락스), 세프메녹심 (Cefmenoxime), 세포디짐 (Cefodizime), 세포탁심 (Cefotaxime, 클라포란), 세피미졸 (Cefpimizole), 세포도심 (Cefpodoxime, 반틴, PECEF), 세프테람 (Cefteram), 세프티부텐 (Ceftibuten, 세닥스), 세프티오퍼 (Ceftiofur), 세프티올렌 (Ceftiolene), 세프티조심 (Ceftizoxime, 세피족스), 세프트리아존 (Ceftriaxone, 로세핀), 세포페라존 (Cefoperazone, 세포비드), 세프타지딤 (Ceftazidime, 포텀, 포타즈), 옥사시핌 (Oxacephems): 락타모제프 (latamoxef, 목살락탐)
사세대: 세프클리딘 (Cefclidine), 세페핌 (Cefepime, 막시핌), 세플루프레남 (Cefluprenam), 세포셀리스 (Cefoselis), 세포조프란 (Cefozopran), 세피롬 (Cefpirome), 세프퀴놈 (Cefquinome), 옥사세펨 (Oxacephems): 플로목세프 (flomoxef)
미정세대: 세프토비프롤 (Ceftobiprole), 세파클로메진 (Cefaclomezine), 세파롤람 (Cefaloram), 세파롤 (Cefaparole), 세프카넬 (Cefcanel), 세페드롤로어 (Cefedrolor), 세펨피돈 (Cefempidone), 세페트리졸 (Cefetrizole), 세피비트릴 (Cefivitril), 세피나틸렌 (Cefinatilen), 세피네피듐 (Cefinepidium), 세포벡신 (Cefovecin), 세폭사졸 (Cefoxazole), 세프로틸 (Cefrotil), 세프수미드 (Cefsumide), 세프타롤린 (Ceftaroline), 세프티옥사이드 (Ceftioxide), 세푸락세팀 (Cefuracetime)
아미노글리코시드 :
(a) 아미카신 (amikacin), 젠타마이신 (gentamicin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 (neomycin), 네틸마이신 (netilmicin), 파로모마이신 (paromomycin), 로도스트렙토마이신 (rhodostreptomycin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 토브라마이신 (tobramycin), 아프라마이신 (apramycin);
(b) 안트라시클린 (Anthracyclines), 예컨대, 독소루비신 (doxorubicin)
퀴놀론 :
(a) 플루오로퀴놀론;
일세대;
이세대;
삼세대;
사세대.
글리코펩티드 항생제:
(a) 반코마이신 (vancomycin), 테이코플라닌 (teicoplanin), 텔라반신 (telavancin), 블레오마이신 (bleomycin), 라모플라닌 (ramoplanin), 디카플라닌 (decaplanin) 및 달바반신 (dalbavancin).
펩티드 항생제:
(a) 란티바이오틱스;
듀라마이신 (Duramycin), 니신 (nisin), 에피더민 (epidermin), 악타가르딘 (actagardine), 마이크로비스포리신 (microbisporicin) 및 머사시딘 (mersacidin);
(b) 리포펩티드;
큐비신 (Cubicin).
스트렙토그라민:
퀴누프리스틴 (Quinupristin) + 달포프리스틴 (dalfopristin) (Synercid®).
그러나, 본 발명의 디코이 및 방법은 또한 마크롤라이드 (Macrolides), 케토라이드 (Ketolides), 테트라사이클린 (Tetracyclines), 린코스아미드 (Lincosamides) (예컨대, 클린다마이신), 옥사졸리돈 (Oxazolidinones, 리네졸리드)와 같은 세균 발육 저지 항생제의 효능을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법이 치료법으로 사용되는 경우, 디코이 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 항생제와 조합하여 적용될 수 있는데, 일반적으로 세포는 디코이에 의하여 항생제에 더 민감하게 된다. 항생제를 상기 개시된 항생제들 중에서 선택할 수 있다.
몇몇 예에서는, 표적이 될 박테리아 종 및 박테리아 감염에 따른 용도로 항생제(들)을 선택하는 것이 적당하다.
예를 들어, 엠. 튜베르큘로시스는 현재 이소니아지드, 리팜피신, 에탐부톨,피라진이미드를 사용하여 치료하는 결핵의 원인 물질이다. 그러므로, 엠. 튜베르큘로시스를 표적으로 하는 방법에서는, 이 약물들 중 하나 이상이 디코이 폴리뉴클레오티드와 함께 사용되기 위하여 선택된다. 유사하게, 에스 . 아우레우스 감염은 통상 페니실린으로 치료되는데, 예컨대, 대장균 또는 케이 . 뉴모니아에와 같은 확장된 범위의 β-락타메이즈를 생산하는 박테리아에 의한 그람-음성 감염은 종종 β-락탐으로 치료된다.
몇몇 예로서는, 디코이 폴리뉴클레오티드의 유형 및 세포 내에서 그 디코이가 그 발현을 교란하는 유전자들이, 상기 세포가 더 민감하게 되는 디코이와 조합하여 사용될 수 있는 항생제(들)의 유형을 결정한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시되는 FabB TFD는 지방산 합성에 필요한 필수 효소의 조절자 (FadR)의 결합 부위를 표적으로 한다. 그러므로, 상기 디코이로 처리한 세포는 특히 지방산 합성을 억제하는 항생제에 더 민감하게 된다. 이에 더하여 특정 표적들에 대한 정보가 본 명세서에 제공되어 있다.
본 발명의 디코이는 세포의 적응 또는 생리적 반응, 예컨대, 본 명세서에 개시되어 있는 임의의 반응을 변화시키는 데 사용될 수 있다. 디코이는 또한 필수적 유전자들의 발현을 변화시키고 따라서 그 유전자(들)이 필수적인 조건 하에서 세포의 생존력을 변화시키는 데 사용될 수 있다. 디코이는 또한 세포의 병독성을 변화시키는 데 사용될 수 있다.
디코이는 또한 예컨대, 세포벽 또는 세포막의 조성의 변화를 야기하는, 항생제의 흡수를 증가시키는 데 사용될 수 있다.
상기 디코이는 또한 알려지지 않은 유전자 시스템의 조절을 표적으로 할 수 있는데, 특히 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있는 n[스네어] 과정에 의하여 발견되는 디코이들이다. 이 실시예들에 있어서, 박테리아를 디코이로 처리한 결과는 예를 들어 항생제 감수성으로 측정될 수 있지만, 감수성의 변화를 뒷받침하는 유전적 기전은 알려져 있지 않다.
몇몇 경우에 미코박테리아의 WhiB7 및 그 상동체와 같은 공지의 유전자들의 조절을 표적으로 하는 디코이의 처리는 항생제에 대한 감수성을 증가시키지만 그 변화를 뒷받침하는 표현형의 기전은 알려져 있지 않다.
몇몇 경우에 에스. 아우레우스의 글리코펩티드 내성에 관련된 전사 프로파일링에 의하여 알려진 그리고 그 프로모터 내에 공통적인 시스-조절 모티프를 가지는 것으로 알려진 부분과 같은 생물 정보학적 방법에 의하여 항생제 민감성 결정에 연루된 것으로 알려진 유전자들의 조절을 표적으로 하는 디코이들은 세포의 항생제에 대한 감수성을 증가시키지만 그 변화를 뒷받침하는 표현형의 기전은 알려져 있지 않다.
본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드는 많은 응용법 예컨대, 의학적 또는 수의학적 용도와 같은 치료적 용도 및 생체 외 (ex vivo) 예컨대, 비치료적 응용법, 예컨대, 살균제 및 세정 용품들을 포함한 많은 응용이 가능하다. 본 발명의 디코이들은 원핵 세포의 생존력 감소, 세포 사멸, 생장 억제 또는 병독성 감소를 위하여 필요한 방법에 있어 용도가 있다.
설명되어진 바와 같이, 본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드 및 방법은 원핵 생물의 항생제에 대한 감수성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 그러므로 상기 디코이들은 본 명세서에 제시된 것과 같은 하나 이상의 항생제들의 효능을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이것은 예컨대, 인간 또는 동물에 있어서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 의학적 또는 수의학적 용도, 또는 예컨대 세정용 조성물에서와 같은 인 비트로 (in vitro) 용도일 수 있다. 그러므로 상기 디코이들은 살균제 또는 세균 발육 저지용 조성물로서의 용도가 있다.
혹은, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드 및 방법은 치명적인 환경적 요인 또는 항균제에 대한 원핵 생물의 감수성을 제공 또는 증가시키는 데 사용될 수 있다.
그러므로 일 관점에서 본 발명은 본 명세서에 개시되어진 디코이 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 어떤 대상의 박테리아 감염을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 대상은 인간 또는 동물일 수 있다. 본 발명은 또한 개시되어진 디코이 폴리뉴클레오티드의 예컨대, 어떤 대상의 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 용도와 같은 의약용 및 박테리아 감염을 치료하기 위한 약품의 제조용 디코이의 용도를 제공한다.
디코이는 그것이 세포를 어떤 항생제(들)에 대하여 더 민감하게 만드는 항생제(들) 및/또는 기타 항균 제제들과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 항생제들이 본 명세서에 개시되어 있다. 상기 항생제는 상기 디코이와 동시에 또는 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 상기 항생제 및 디코이는 동일한 또는 분리된 조성물로 투여될 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 명세서에서 정의, 및/또는 개시하고 있는 디코이 폴리뉴클레오티드가 대상에게 하나 이상의 항생제 또는 기타 항균 치료법들과 함께 조합하여 투여되는 조합된 치료법을 포함한다.
일 관점에서 본 발명은 디코이 폴리뉴클레오티드 및 생리적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물 또는 약품에 관한 것이다. 상기 조성물은 하나 이상의 항생제 또는 개시한 바와 같은 기타 항균제들을 더 포함할 수 있다.
치료적 용도로 허용되는 담체 또는 희석제는 약학 분야에서 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington' Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 개시되어 있다. 약학적 담체, 첨가제 또는 희석제는 예상되는 투여 경로 및 표준 약학적 관례에 따라 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 담체, 첨가제 또는 희석제로서 또는 그에 더하여 임의의 적합한 바인더, 윤활제, 서스펜션화제, 코팅제, 용해제를 포함할 수 있다.
본 발명의 디코이를 박테리아 감염 부위에 전달하기 위하여 다양한 방법이 사용될 수 있다. 생체 내 및/또는 인 비트로 전달 방법은 구강 또는 경구 전달, 정맥내 전달, 감염된 부위로 직접 주입 또는 간접 주입 (예컨대, 피하, 복강내, 근내 또는 기타 주입 방법), 국소적 적용, 수용액 또는 배지 용액에 직접 노출, 트랜스펙션 ( 예컨대, 칼슘 포스페이트법, 전기천공법, DEAE-덱스트란계, 및 지질 중개법), 트랜스제닉 (transgenic) 발현 (예컨대, 마이크로인젝션, 배아 줄기 세포 생성, 또는 레트로바이러스 전이법에 의한 디코이 발현 시스템의 전달), 또는 기타 이 기술 분야에서 흔하게 사용되는 핵산 전달 시스템 중 임의의 것을 포함하나, 그에 한정되지는 않는다. 투여는 적합한 양의 항생제와 조합하여 이루어질 수 있고, 항생제(들)은 디코이와 동시에 또는 별개로 투여될 수 있다.
이하 실시예들에 개시되는 바와 같이 표적 유전자의 발현에 예측 가능한 효과를 보여주고 세균 발육 저지 효과를 갖는 것으로 보여지는 데 필요한 TFD의 수는 세포당 약 5000 분자이면 될 수 있다. 실시예에서 다뤄지는 표준화된 인 비트로 실험은 1nM 의 TFD 만으로 1000000 만큼의 박테리아 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 이는 박테리아를 사멸시키기 위하여 0.001%보다도 낮은 트랜스펙션 효율이면 충분하다는 것을 의미한다. 형광 표지된 TFD의 흡수를 측정하기 위한 형광 현미경을 이용한 정량 트랜스펙션 실험에서 시야 내의 모든 에스 . 아우레우스 세포가 트랜스펙션 되었다. 박테리아 감염에 제동을 거는 여타 핵산계 전략, 예컨대, 안티센스 등과 비교했을 때 세포를 사멸시키는데 필요한 이러한 분자의 숫자는 100배 내지 1000배 적은 것이다. 이것은 안티센스 접근 및 TFD 양자 모두 유전자를 억제하지만 TFD가, 가장 흔한 반복으로 전사 결과물: 수천 개의 mRNA 분자들을 입체적으로 봉쇄하는 안티센스보다 전사를 방해하는 초기 단계에 작용한다는 것을 부분적으로 반영한다. 다음으로 TFD는 양적으로 유도되는 (positively induced), 그러므로써 생존하기 위하여 스위치가 켜져야 할 필요가 있는 그리고 양적으로 조절되는 (전사 인자가 그 자체의 생산을 추진한다) 필수 유전자들을 표적으로 설계된다. 인 비트로에서 이러한 후자의 특징은 상기 유전자가 유도되지 않았을 때에는 상대적으로 적은 수의 전사 인자가 존재할 것이고 그러므로 적은 수의 TFD가 유도를 차단할 수 있다는 것을 의미한다. 치료 상황에서는 박테리아 종류의 다양성 또는 이미 유도된 유전자로 인하여 세포당 더 많은 전사 인자들이 있을 수 있다. 이러한 경우 약학적 효과를 보는 데 더 많은 TFD가 필요하고 처리량을 100배로 증가시키거나 (100 nM까지) 트랜스펙션 효율을 향상시켜야만 (두자릿수까지) 유익한 효과를 보기에 충분할 것임을 예상할 수 있다.
몇몇 디코이들은 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위하여 항생제 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 상기 디코이들 중 일부는 세포가 스트레스 조건 하에서 생존 또는 필수적 유전자들의 발현 또는 필수 영양 성분의 획득하는 능력을 감소시킨다. 몇몇 디코이들은 예컨대, 병독성 인자의 발현을 방해함으로써 세포의 병독성을 중화시킨다. 그러므로 필수적인 유전자들을 표적으로 하는 디코이들은 그 자체로 특정 병원성 박테리아의 생장을 방해하기 위하여 그 자체가 치료법으로서 또는 박테리아에 감염되기 전 그를 막아내기 위한 예방 약품의 형태로서 사용될 수 있다. 유사하게 병독성 결정 유전자들을 표적으로 하는 그 디코이들은 그 자체로 감염의 전파를 예방하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서 본 명세서에 제시된 에이치. 파일로리에 작용하는 상기 디코이들은 위궤양/ 소화계 암의 진행에 대한 무료 상비 치료법을 제공할 수 있다. 유사하게 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장을 예방하는 디코이들은 치아 변색을 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 디코이가 치료용으로 사용되는 특정 감염 또는 관련 조건은 일반적으로 디코이가 표적으로 하는 병원성 세포에 의존한다. 특정 박테리아와 관련하여 본 발명의 방법을 사용하여 표적화되는 박테리아 감염 및 관련 질병들이 본 명세서 및 도 2에 제시되어 있다.
본 명세서에 개시되는 디코이 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 예컨대, 살균제와 같은 세정용 항균 제품으로 박테리아의 생장 또는 감염성을 없애거나 예방하기 위하여 인 비트로 방법으로 사용될 수 있다. 디코이가 항생제에 대한 감수성을 증가시키는 경우, 통상 그 항균 조성물은 또한 하나 이상의 항생제 및/또는 하나 이상의 항박테리아 제제를 포함한다. 일 관점에서 본 발명은 이러한 세정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 디코이 폴리뉴클레오티드는 미생물의 생장을 감소 또는 예방, 및/또는 미생물을 없애기에 충분한 시간과 조건하에서 작업대 또는 손 등 표면에 도포하는 제품에 더 사용될 수 있고, 그럼으로써 미생물 생장을 감소 또는 예방 또는 사멸시킨다. 예를 들어, 하나 이상의 디코이들이 상기 표면에 분사될 수 있다. 이러한 분사 도포는 예를 들어 음식물의 제조를 위한 표면 준비 또는 환자에게 투여할 물건의 소독에 유용하다. 이것은 상기 디코이제를 분사하는 것은 표면 또는 물건을 다루는 것을 감소시켜 오염의 위험을 더 감소시키기 때문이다. 핸드 워시 및 구강 워시도 또한 본 발명의 범위 내로 고려된다.
상기와 같은 정황에서, 디코이는 적합한 수용액 포맷으로 제조될 수 있다. 어떠한 경우, 상기 제제는 물 및 수용액 조성물을 포함할 수 있다. 수용액 조성물은 수용성 및 유기 용매 및 그들의 조합을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 박테리아를 사멸시키거나 생장 또는 병독성을 억제하기 위한 조합된 용도로 본 명세서에 개시된 디코이 폴리뉴클레오티드와 하나 이상의 항생제 또는 기타 항균 제제(들)을 포함하는 항박테리아용 키트에 관한 것이다. 통상 상기 키트는 사용 지침을 포함한다. 다시 말해 상기 키트는 예컨대, 박테리아 감염에 대항한 치료적 용도 또는 예컨대, 세정 또는 살균을 위한 비치료적 용도를 위한 것일 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참고 자료로써 포함되었다.
본 발명은 이하 다음 도들을 포함하는 참고 자료와 함께 비 제한적 실시예의 방식으로 더 자세하게 개시될 것이다.
도 1. 비플루오르퀴놀론 항생제 및 플루오로퀴놀론 항생제 각각에 대한 유출-매개 내성을 목록화한 Poole J. (Antimicrobial Chemother. (2005) 56, 22-24)의 표 1의 복사본. 오른쪽 컬럼의 레퍼런스 번호는 상기 문헌에서 주어진 번호를 말한다.
도 2. 본 발명의 방법에 따라 표적화 될 수 있는 조절자 및 조절 서열의 예를 목록화한 Poole J. (상동)의 표 2의 복사본. 이 표는 또한 상기 조절자 또는 서열이 존재하는 박테리아 균주들의 예 및 이 박테리아들과 관련된 질병 지표의 예를 제공한다.
도 3. n[스네어] 플라스미드가 어떻게 유전자 발현에 영향을 미치는지를 나타낸 도면. 유전자 (A)는 그 유전자의 프로모터 내 시스-조절 서열 (C)에 억제적 전사 인자 (B)가 결합하고 있어 전사 불활성 상태이다. n[스네어] 플라스미드가 세포 내로 도입되면 유전자 프로모터로부터 전사 인자 B를 적정 제거함으로써 표적 유전자의 발현에 영향을 미쳐서 하류의 유전자 (D)의 전사 억제를 경감시키게 된다.
도 4. SEQ ID NO: 3 및 4의 프라이머를 이용하여 얻어지는 증폭 생산물 및 적절한 벡터 기질을 보여준다 (실시예 1.2).
도 5. 실시예 2에서와 같이 박테리아를 WhiB7 디코이 서열 (+) 또는 음성 대조군 서열 (-)로 처리하고, 이소니아지드 (IZ) 또는 리팜피신 (RF)이 준-억제 농도로 존재하는 조건 하에서 배양된 엠. 스메그마티스의 생장 곡선을 보여준다.
도 6. 실시예 3에서와 같이 대장균을 FabB 디코이 (FabR 결합 부위를 표적으로 한다) 또는 음성 대조군 서열로 처리하고, 세룰레닌의 존재 하에서 생장된 상기 박테리아의 생장 곡선을 보여준다.
도 7. 실시예 4에서와 같이 에스 . 아우레우스를 미처리 (첫번째 곡선) 또는 SsaA 디코이 (두번째 곡선) 또는 LytM 디코이 (세번째 곡선)으로 처리하고, 전기천공법으로 유발된 스트레스 조건 하에서 상기 박테리아의 생장 곡선을 보여준다.
도 8. 미접종 배지 (BHI 음성 대조군), 뒤섞인 TFD 서열을 갖는 대조군 TFD로 트랜스펙션하고 BHI 배지에서 배양, SsaA TFD (WalR 부위를 포함)로 트랜스펙션하고 BHI 배지에서 배양, fhu TFD (철 흡수를 봉쇄하도록 설계)로 트랜스펙션하고 BHI 배지에서 배양, sig TFD로 트랜스펙션하고 BHI 배지에서 배양, 관련없는 TFD로 트랜스펙션하고 NRPMI 배지 (BHI와 비교하여 철 제한된 배지)에서 배양, fhu TFD로 트랜스펙션하고 NRPMI 배지에서 배양한 에스 . 아우레우스의 생장 곡선을 보여준다.
도 9. Fur_TFD는 철-비제한 배지에서 에스 . 아우레우스의 생장을 방해하지 못함을 보여준다. 에스 . 아우레우스는 Fur_TFD는 있지만 트랜스펙션 제제인 그라미시딘은 없이 (TFD 단독; 빈 원), 또는 60 nM 그라미시딘 과 1 nM 대조군 TFD의 조합 (대조군 TFD; 빈 삼각형)으로 및 Fur_TFD (Fur_TFD; 색칠된 사각형) 로 BHI 배지에서 배양되었다. Fur_TFD는 fhu 오페론의 발현을 조작하기 위하여 설계되었다. 결과는 세 번을 반복한 평균값이고 에러 바는 표준 에러를 나타낸다.
도 10. Fur_TFD가 fhu 유전자의 억제를 북돋운다는 것을 보여준다. (A)에스. 아우레우스의 그라미시딘-매개 트랜스펙션. TFD 단독, 또는 그라미시딘과 대조군 또는 Fur_TFD중 하나로 처리된 세포를 모아서 세척하고 용해시켰다. 정량 PCR이 게놈 수에 대한 TFD의 평균 숫자를 밝히기 위하여 사용되었다. (B) Fur_TFD의 트랜스펙션은 에스. 아우레우스의 fur 유전자를 억제한다. 병행 샘플은 정량 PCR에 의한 fhu 발현의 상대적인 수준을 결정하기 위해서 사용되었다.
도 11. Fur_TFD가 철이 제한된 배지에서 에스 . 아우레우스의 생장을 방해함을 보여준다. 에스 . 아우레우스는 Fur_TFD는 있지만 트랜스펙션 제제인 그라미시딘은 없이 (TFD 단독; 빈 원), 또는 60 nM 그라미시딘 과 1 nM 대조군 TFD의 조합 (대조군 TFD; 빈 삼각형)으로 및 Fur_TFD (Fur_TFD; 색칠된 사각형)로 철-제한 배지인 NRPMI에서 배양되었다. 결과는 세 번을 반복한 평균값이고 에러 바는 표준 에러를 나타낸다.
도 12. 에스 . 아우레우스 Fur 표적 TFD (SAfhu)의 잠재적 유효 숙주 범위를 결정하기 위한 유전자 분석의 결과를 보여준다. 도의 상단 패널에서 보여지는 MEME-유도 공통 서열은 하단 패널에 제시된 서열들로부터 만들어진 에스 . 아우레우스 Fur 결합 부위 모티프이다.
도 13. 에스 . 아우레우스의 대안 시그마 인자 SigB에 대한 -10/-35 인식 서열을 포함하는 TFD (SA3TFD) 또는 대조군 TFD 중 어느 하나의 존재 하에서 세가지 MRSA 균주의 생장 곡선을 보여준다.
도 14. “아령”구조의 Sig TFD가 MRSA의 임상적 분리 균주 MRSA-5의 생장을 억제함을 보여준다.
도 15. 아령 구조의 WalR TFD가 EMRSA15의 생장을 방해함을 보여준다. 대조군으로 fhu TFD가 사용되었다.
도 16. 1 nM WalR_TFD/DOTAP 혼합물은 있으나 트랜스펙션 제제인 리소스타핀은 없이 (TFD 단독; 빈 원), 또는 62 μg/ml 그라미시딘과 1 nM의 대조군 TFD (Scr_TFD; 빈 삼각형) 및 WalR_TFD (색칠된 사각형)와 함께 BHI 배지에서 배양한 에스 . 아우레우스를 보여준다. WalR_TFD는 WalKR 레귤론의 발현을 조작하기 위하여 설계되었다.
도 17. 어떤 내성 기전도 발견되지 않았다. (A) 도 1에 개시되어 있는 인 비트로 생장 실험의 완료 후 EMRSA-16의 총 생존 수. (B) WalR_TFD 처리로 사멸되지 않은 세포들을 계대배양 (sub-culture)하고 인 비트로 생장 실험을 하였다. WalR_TFD는 계대배양된 세포들을 효과적으로 사멸시켰다. 잇달아 5대를 수행한 결과 총 생존 수를 측정함으로써 결정한 바에 따라 WalR_TFD로 처리한 세포들에서 어떠한 재생장도 보이지 않았다. (C) 유사하게 이미 4대의 TFD-선별에 노출되었던 박테리아의 생장 곡선은 그들이 효율적으로 사멸되었기 때문에 어떠한 내성 표지를 나타내지 않았다. 세포의 생장은 30시간 이후 배양액의 A420 기록에 의하여 측정되었고, 세포는 미처리 (배지 단독; 빈 원), 대조군 TFD와 트랜스펙션 혼합물 (빈 삼각형) 또는 WalR_TFD와 트랜스펙션 혼합물 (색칠된 사각형) 중 어느 하나로 처리되었다.
도 18. 마이크로희석 실험으로부터 WalR_TFD가 EMRSA-16을 사멸시키는데 단지 제한적인 접촉만이 필요하다는 것이 증명되었다. 세포는 트랜스펙션 제제 또는 TFD 복합체 어느 것도 없이 배지 내로 100배 희석되기 전에 30분 동안 미처리 (배지 단독; 빈 원), 대조군 TFD와 트랜스펙션 혼합물로 (빈 삼각형) 또는 WalR_TFD와 트랜스펙션 혼합물 (색칠된 사각형) 중 하나로 처리되었다. 오로지 WalR_TFD로 처리된 세포들만이 생장하지 못했다.
도 19. WalR_TFD는 마우스 패혈증 모델의 EMRSA-16를 사멸시키는데 반코마이신만큼 효율적이다. 마우스를 전신 감염시킨 다음 대조군 TFD로 치료한 후 (Scr_TFD, 1 nM SalR_TFD, 반코마이신 및 운반체 단독) EMRSA-16의 신장 부담을 측정하였다.
도 20. 대장균에 FabB TFD를 트랜스펙션하면 박테리아가 지방산 합성을 억제하는 항생제 (세룰레닌)에 민감해진다는 것을 보여준다. WhiB7 TFD는 대장균 유전자 내에서는 발견되지 않는 서열을 가지므로 음성 대조군으로 사용되었다.
도 21. 클레브시엘라 뉴모니아에의 σ54 인자에 대한 인식 서열을 포함하는 TFD를 트랜스펙션하면 박테리아 생장을 지연시킨다는 것을 보여준다. WhiB7 TFD가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 22. 에스 . 아우레우스 및 기타 생물에서 가까운 매치를 찾아 WalR 결합 부위로 규명된 서열을 보여준다. 공통 서열을 이끌어 낼 수 있음을 하위 집단에서 볼 수 있다.
도 23. 패널 A는 에스 . 아우레우스 SigB 결합 부위의 MEME-유래 공통 서열을 보여준다. 패널 B는 바실라레스 (바실러스 , 리스테리아 및 스태피로코쿠스를 포함하는 대표 속에 대한 그람-양성 감염)에서의 공통 서열 매치의 예를 제시하고 있다 (E 값 < 100).
도 24. 패널 A는 KP_Sig TFD가 케이 . 뉴모니아에를 인 비트로 실험에서 사멸시킨다는 것을 보여준다. 인 비트로 실험에서 KP_Sig 서열을 포함하는 TFD는 세포 생장을 방해하였다 (KP_Sig, 색칠된 사각형). 미처리 세포 (케이 . 뉴모니아에, 빈 원) 및 뒤섞인 서열로 이루어진 대조군 TFD (KP-대조군 TFD, 빈 삼각형)의 두 가지 대조군이 사용되었다. 패널 B는 케이 . 뉴모니아에 Sig 결합 부위의 MEME-유래 공통 서열을 보여준다.
서열들에 대한 간단한 설명
SEQ ID NO: 1 및 2 - 실시예 1.1에서와 같이 표적 서열의 증폭에 사용되는 pGEMT-Easy 벡터로부터의 올리고뉴클레오티드 프라이머.
SEQ ID NO: 3 및 4 - 실시예 1.2에서와 같이 아령 디코이들을 제작하기 위하여 표적 서열의 증폭에 사용되는 pGEMT-Easy 벡터로부터의 올리고뉴클레오티드 프라이머.
SEQ ID NO: 5 - 실시예 2에서 사용되는 WhiB7 디코이
SEQ ID NO: 6 - 실시예 3에서 사용되는 FabB 디코이
SEQ ID NO: 7 - 실시예 4에서 사용되는 LytM 디코이
SEQ ID NO: 8 - 실시예 4에서 사용되는 SsaA 디코이
SEQ ID NO: 9 - 엠. 스메그마티스 균주 MC2 155의 본래 WhiB7 결합 부위
SEQ ID NO: 10 - 대장균 K12의 본래 FadR 결합 부위
SEQ ID NO: 11 - 에스 . 아우레우스의 YycF/YycG의 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 12 - 에스 . 아우레우스의 YycF/YycG의 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 13 - 에스 . 아우레우스의 SigB의 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 14 - 케이 . 뉴모니아에의 SigB의 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 15 - 에스 . 아우레우스의 Fur 결합 공통 서열
SEQ ID NO: 16 - 대장균의 Fur 결합 공통 서열
SEQ ID NO: 17 - 에이치. 파일로리의 Fur 결합 공통 서열
SEQ ID NO: 18 - 씨. 디피실레의 TcdR 결합 공통 서열
SEQ ID NO: 19 - 피. 아에루기노사의 Vfr 공통 결합 서열
SEQ ID NO: 20 - 피. 아에루기노사의 Vfr 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 21 - 피. 아에루기노사의 Vfr 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 22 - 케이 . 뉴모니아에의 NtrC 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 23 - 에이치. 파일로리의 ArsR 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 24 - 에이치. 파일로리의 ArsR 본래 결합 부위
SEQ ID NO: 25 - 에스 . 아우레우스의 글리코펩티드-내성 공통 서열
SEQ ID NO: 26 - 에스 . 아우레우스의 Agr 결합 모티프
SEQ ID NO: 27 - 에스 . 아우레우스의 Agr 결합 모티프
SEQ ID NO: 28 - SasigB TFD의 PCR 용 포워드 프라이머 서열
SEQ ID NO: 29 - SasigB TFD의 PCR 용 리버스 프라이머 서열
SEQ ID NO: 30 - SAfhu TFD의 PCR 용 포워드 프라이머 서열
SEQ ID NO: 31 - SAfhu TFD의 PCR 용 리버스 프라이머 서열
SEQ ID NO: 32 - SsaA TFD의 PCR 용 포워드 프라이머 서열
SEQ ID NO: 33 - SsaA TFD의 PCR 용 리버스 프라이머 서열
SEQ ID NO: 34 - 대조군 서열
SEQ ID NO: 35 - 대조군 서열
SEQ ID NO: 36 - 16s rRNA의 PCR 용 포워드 프라이머 서열
SEQ ID NO: 37 - 16s rRNA의 PCR 용 리버스 프라이머 서열
SEQ ID NO: 38 - fhu 유전자의 PCR 용 포워드 프라이머 서열
SEQ ID NO: 39 - fhu 유전자의 PCR 용 리버스 프라이머 서열
SEQ ID NO: 40 - 인산화 Sig 아령 TFD 올리고뉴클레오티드 서열
SEQ ID NO: 41 - 인산화 Sig 아령 TFD 올리고뉴클레오티드 서열
SEQ ID NO: 42 - Sig 결합 부위의 뒤섞인 버전을 함유하는 아령 TFD 용 인산화 프라이머
SEQ ID NO: 43 - Sig 결합 부위의 뒤섞인 버전을 함유하는 아령 TFD 용 인산화 프라이머
SEQ ID NO: 44 - WaIR의 결합 서열을 포함하는 인산화 아령 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 45 - WaIR의 결합 서열을 포함하는 인산화 아령 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 46 - WaIR의 결합 부위의 뒤섞인 버전을 포함하는 인산화 아령 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 47 - WaIR의 결합 부위의 뒤섞인 버전을 포함하는 인산화 아령 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 48 - WaIR의 결합 부위를 포함하는 인산화 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 49 - WaIR의 결합 부위를 포함하는 인산화 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 50 - FabB 프로모터용 포워드 프라이머
SEQ ID NO: 51 - FabB 프로모터용 포워드 프라이머
SEQ ID NO: 52 - WhiB7 TFD용 포워드 프라이머
SEQ ID NO: 53 - WhiB7 TFD용 리버스 프라이머
SEQ ID NO: 54 - 케이 . 뉴모니아에 σ54 factor 인식 서열을 함유하는 TFD용 포워드 프라이머
SEQ ID NO: 55 - 케이 . 뉴모니아에 σ54 factor 인식 서열을 함유하는 TFD용 리버스 프라이머
SEQ ID NO: 56 - 세포 투과 펩티드 서열
SEQ ID NO: 57 - WaIR TFD 공통 서열
SEQ ID NO: 58 - SigB TFD 공통 서열
SEQ ID NO: 59 - KP Sig TFD 서열
SEQ ID NO: 60 - KP Sig TFD 공통 서열
실시예
일반적으로 본 명세서에 언급되어 있는 기법들은 일반적으로 이 기술 분야에 잘 알려져 있으나, 특히 참고 자료 Sambrook and Russell, 3rd Edition 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual을 따를 수 있다.
실시예 1
1.1 스트렙토리신 -오 ( Streptolysin -O)의 존재 하 콜레스테롤 표지된 TFD
프라이머 중 하나는 5’콜레스테롤로 변형되고 다른 것은 그 5’말단이 유사한 변형 또는 다른 (Cy5와 같은 형광 염료 등으로 변형되어, 전사 인자 디코이 (TFD)의 흡수를 쉽게 측정할 수 있도록 함) 변형이 된 프라이머들을 사용하여, PCR로 TFD를 제조하였다. TFD가 이미 벡터 (pGEM-Easy) 안으로 클로닝되어 있다면 프라이머가 인서트 바로 측면의 벡터 서열과 어닐링될 수 있도록 프라이머를 설계한다, 예를 들면 다음과 같다:
SEQ ID NO : 1 Chol TEf: 5’Cholesterol-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG
AAT TC
SEQ ID NO : 2 Cy5 TEr: 5’Cy5- AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG.
TFD로 사용될 서열이 클로닝되어 있지 않다면 직접 합성되어 (충분히 짧다면) TFD를 형성하도록 어닐링되거나, TFD 내로 어닐링되도록 설계된 프라이머를 이용하여 유전체 DNA로부터 직접 증폭될 수 있다.
PCR 결과물은 에탄올 침전시켜 TE 완충액 (10 mM 트리스.HCl, 1 mM EDTA pH8.0)에 500-1000 ng/μl의 농도로 재현탁한다. 통상 항생제 감도 실험은 96 웰 플레이트를 사용하여 수행하고, 각 웰은 200 ml의 배양액을 함유한다. 예를 들어, 엔테로코쿠스 파에시움의 경우 이 배양액은 0.2 U/ml 스트렙토리신-오 (Sigma) 및 5 μg/ml 반코마이신 항생제로 보충된 BHI (뇌 심장 수액) 배지 (Becton Dickinson)이고 반코마이신 내성 균주인 이. 파에시움으로 접종된다.
1.2 PCR 에 의한 아령 구조의 제조
아령 디코이는 스템-루프 구조로 묶여진, 표적 인자의 결합 부위를 함유하는 이중 가닥 중심부로 특징지워지는 공유결합으로 닫힌 형태의 단일가닥 DNA이다. 스템-루프는 상기 디코이 폴리뉴클레오티드를 분해할 수 있는 엑소뉴클리에이즈의 작용을 방해하여 디코이를 안정화시킨다. 그러므로 아령 TFD (DB)를 그들의 특징적 모양으로부터 그렇게 부른다.
섹션 1.1에 개시되어 있는 바와 같이 DB는 표적 결합 부위를 함유하는 pGEMT-Easy 유래 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR에 의하여 제조된다. 증폭에 사용되는 프라이머들은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 3 DBTEf: 5’P- CTTGG TTTTT CCAAG AGAAGAGC CCG CCA TGG CGG CCG CGG GAA TTC
SEQ ID NO : 4 DBTEr: P- CCG TCT TTT TGA CGG CGA AGA GCA GGC GGC CGC GAA TTC ACT AGT GA
스템-루프를 형성하게 될 프라이머의 부분에 밑줄을 그었다. 적절한 벡터로 증폭하면 도 4에서 보여지는 것과 같은 DNA 결과물을 얻을 수 있고, 전사 인자와 결합할 DB 부분은 'NNN NNN'으로 나타내었다. 볼드체로 보여지는 서열은 절단 제한효소 Nt.BspQ1의 결합 부위를 나타낸다. 도 4의 두번째 부분에서는 상기 PCR 결과물을 Nt.BspQ1으로 절단한 결과물을 보여준다; 이것은 스테-루프 구조를 스템-루프를 형성할 단일 가닥 부분으로 노출하고 있고, 이후 공유 결합으로 닫힌 원형 및 DB를 형성하기 위하여 T4 DNA 라이게이즈 처리로 결합될 수 있다.
1.3 플라스미드의 제한 절단을 통한 아령 올리고뉴클레오티드의 제조
혹은 도 4에서 보여지는 블런트 PCR 결과물을 적합한 PCR 클로닝 벡터 내로클로닝하고 그 신원을 확인하고 플라스미드를 제조함으로써 만들 수 있다. 상기 플라스미드는 절단되어 인서트를 방출하고 Nt.BspQ1으로 더 절단되어 도 4의 두번째 부분에서 보여지는 조각을 방출할 수 있다. 이것은 공유 결합으로 닫힌 DNA 및 DB를 형성하기 위하여 유사하게 T4 DNA 라이게이즈 처리될 수 있다.
이 접근법의 장점은 다량이 필요한 아령 구조 제조에 있어 실질적으로 및 경제적으로 규모를 키우기에 유연하다는 것이다.
1.4 R9-콜레스테롤 제제를 이용한 트랜스펙션
R9-콜레스테롤은 siRNA (또는 기타 핵산 계 치료법) 분자 및 진핵 세포에서 그 유사한 것의 트랜스펙션을 용이하게 하는 특성이 개시되어 있다 (미국 특허 출원 번호 2007-0207966). 본 명세서에서는 다양한 박테리아를 TFD로 트랜스펙션하는 데 있어 그 유용성을 개시한다.
R9-콜레스테롤, 이는 아홉 개의 D-아르기닌의 선형 사슬에 콜레스테롤 분자가 부착되어 이루어지는 것으로, 종래 개시되어진 바와 같이 합성된다 (Kim W.J. et al, MoI. Ther. (2006) 14:343-350). TFD를 5% 글루코스로 보충된 TE 계 완충용액 내에서 R9-콜레스테롤의 양을 증가시켜가면서 혼합하였다. 혼합물은 1시간 동안 실온에서 반응시키고, 직접 트랜스펙션에 사용하거나 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. DNA와의 복합체는 겔 내에서 진행하지 않기 때문에, 즉, 핵산의 백본 (backbone) 전하가 폴리-아르기닌과 결합하여 중화되기 때문에 통상 R9-콜레스테롤은 최소량이 사용된다. 콜레스테롤 분자는 TFD가 박테리아의 세포막과 부착하는 것을 돕고 따라서 세포 내 진입을 돕는다.
TFD/R9-콜레스테롤 짝은 96 웰 플레이트의 200 μl 배양액 내에서 다양한 농도로 혼합된다. 예를 들어, 엔테로코쿠스 파에시움의 경우 이 배양액은 0.2 U/ml 스트렙토리신-오 (Sigma) 및 5 μg/ml 반코마이신 항생제로 보충되고 반코마이신-내성 균주 이. 파에시움으로 접종된 BHI 배지 (Becton Dickinson)이다.
실시예 2
미코박테리움 스메그마티스 를 항생제에 민감하게 하는 WhiB7 디코이
WhiB7은 미코박테리움 스메그마티스의 항생제에 대한 감도를 결정하는 역할을 하는 것으로 보여지는 유전자이다. 기능적으로 이 유전자의 결손시키면 상기 박테리움은 항생제에 대하여 초민감성을 나타낸다 (PNAS (2005) 102:12200). WhiB7은 전사 조절자로 여겨져 왔고 몇몇 이러한 유전자들이 문헌에 개시되어 있다. WhiB7의 가까운 상동체는 결핵을 유발하는 병원성 미코박테리움 튜베르큘로시스가 있다.
WhiB7 디코이 서열을 함유하는 디코이 폴리뉴클레오티드는 실시예 1.1에 개시되어 있는 바와 같이 제조되고 다양한 농도로 20 ml의 배양액 (철사 배플 (baffle)을 포함하는 200 ml 쉐이크 플라스크 내)에서 배양한 엠. 스메그마티스를 트랜스펙션하는데 사용되었다. 사용된 배지는 10% ODAC (Becton Dickinson) 및 준-억제 농도의 항생제 이소니아지드 (IZ) 또는 리팜피신 (RF)로 보충된 9H11 (Becton Dickinson)이다. 상기 플라스크는 37℃에서 쉐이킹하면서 배양되고 다양한 시간 간격으로 샘플을 채취하여 그 흡광도를 측정하였다 (세포 생장을 모니터하기 위하여). 플라스크는 100 nM의 WhiB7 TFD (+) 또는 음성 대조군 TFD (-) 중 어느 하나로 처리되었다. WhiB7 TFD로 처리한 플라스크에서, 대조군 TFD를 처리한 플라스크와는 다르게 세포가 시험된 두 가지 항생제 양자에 대하여 민감하다는 것이 명백하였다 (도 5 참고).
SEQ ID NO : 5 - WhiB7 TFD 5’TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3’
실시예 3
대장균 의 필수 유전자를 하향-조절하는 FabB 디코이
FabB 디코이는 지방산 합성의 필수 경로에 관여하는 유전자들 (fabA 및 fabB 포함)의 발현을 조절하는 FadR 조절자의 결합 부위를 함유한다. 대장균에서 fadR 유전자를 기능적으로 넉아웃시키면 지방산 합성의 측면에서 결손인 균주가 되고 항생제 세룰레닌 [지방산 합성을 표적으로 한다 (J. Bacteriol. (2005) 183:5292)]의 존재 하에서는 자랄 수 없음이 증명되었다.
FabB 디코이는 다음의 서열을 함유한다:
SEQ ID NO : 6 FabB TFD 5’TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA
CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3’
상기 디코이를 실시예 1.1에서 개시되어 있는 바와 같이 제조하고 1 μg/ml 세룰레닌 (Sigma)으로 보충된 200 μl의 리치 배지 (10 g 트립톤, 5 g NaCl, 최종 농도 기준으로 0.2% 글루코오스와 0.4% 아세테이트로 보충된 리터 당 1 g 효모 추출물)를 포함하는 96 웰 플레이트의 웰에 다양한 농도로 트랜스펙션하기 위하여 사용하였다. 플레이트는 37℃에서 쉐이킹하며 배양되었고 플레이트 리더를 사용하여 흡광도 측정 (595 nM에서)이 이루어졌다. 모든 측정점은 3회에 걸쳐 이루어졌다. 박테리아는 TFD로 처리되지 않거나 (미처리), FabB TFD로 트랜스펙션 (FabB) 또는 그 서열이 대장균의 게놈 내에서는 존재하지 않는 서열로 이루어지는 TFD의 음성 대조군 (Van) 중의 하나로 처리되었다.
도 6에서 명백하듯이, 미처리 샘플 및 음성 대조군 양자는 배양액에서 비슷한 속도로 생장하였으나, FabB TFD로 처리한 경우는 세포가 거의 생장하지 못하는 원인이 되었다.
실시예 4
스트레스 반응에 대하여 스태피로코쿠스 아우레우스 를 민감하게 하는 디코이
디코이 폴리뉴클레오티드를 에스 . 아우레우스 안으로 전기천공법을 통하여 트랜스펙션하였다. 박테리아 세포를 표준 방법으로 준비하였다. 간단히, 세포를 37℃에서 LB 배지로 420 nM에서 0.3의 흡광도에 이르는 것으로 정의되는 초기 지수기까지 배양하였다. 세포를 4℃로 냉각하고 저속 원심분리로 수거한 후 비슷한 부피의 멸균, 빙냉 10% (v/v) 글리세롤로 세 번 세척하였다. 최종적으로 세포를 최초 부피의 1/10 의 10% 글리세롤에 현탁하였다. 전기천공은 50 μl 의 세포를 1 μl 의 TFD (통상 DNA 100 ng 내지 1 μg)와 함께 전기천공 큐벳 (cuvette)에서 혼합하고 2.5 kEV, 100 Ω 및 25 μF, 3.8 내지 4.8 ms의 주어진 시간 상수의 세팅으로 BioRad Genepulser에서 천기천공 수행하였다. 통상 50 μl 의 전기천공된 세포는 30 mM의 수산화칼륨 (스트레스 반응을 유도하기 위하여)을 포함하는 BHI 또는 LB 배지 10 ml에 접종되었다. 96 웰 플레이트의 웰에 200 μl의 세포를 덜어 적당히 쉐이킹하면서 37℃에서 배양하고, 흡광도를 측정하여 생장을 모니터하였다. 생장 곡선 플롯 (plot)은 가장-전기천공 (mock-electroporation)을 수행한 대조군 (DNA를 트랜스펙션 하지 않음) 또는 무관한 서열로 트랜스펙션한 경우와 비교하여 생장 속도를 감속시키는 특정 TFD의 효과를 증명해준다 (도 7). 이하의 디코이 서열은 스트레스 조건 하에서 에스 . 아우레우스의 생장을 감속시킬 수 있는 것이다:
SEQ ID NO : 7: LytM TFD 5’ GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT
AGT AAA AA 3’
SEQ ID NO : 8 SsaA TFD 5’ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A 3’
실시예 5
에스 . 아우레우스 의 생장을 저해하는 Sig TFD
Sig_TFD는 에스 . 아우레우스 SigB 단백질의 결합 부위를 함유한다. 이 단백질은 커다란 일련의 스트레스 관련 유전자 군을 조절하는 대안 시그마 인자이다 (Wigneshawerajaj, Molecular Microbiology (2008) 68:538). 에스. 아우레우스 세포를 이 TFD로 트랜스펙션하고 96 웰 플레이트에서 특정 배지로 세포를 배양함으로써 상기 TFD가 세포의 생장을 저해한다는 것이 명확해졌다. Fhu DNA는 철이 제한된 조건 하에서 철의 흡수를 조절하는 Fur 전사 인자의 결합 부위를 함유한다 (Horsburgh et al, J. Bacteriol. (2001) 183:468). SsaA는 생장 속도에 영향을 미친다는 12개의 유전자를 조절한다고 이미 알려져 있는 (Dubrac & Msadek, J. Bacteriology (2004) 186:1175) 2-요소 조절자 WalR의 결합 부위를 포함한다.
5.1 PCR 을 통한 TFD 의 제조
TFD는 동시 계류 출원 PCT/GB2008/003353호에 개시되어 있는 바와 같이 PCR을 통하여 제조된다. PCR 반응에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 통상 5’말단이 변형되어 있다, 예를 들어, 그 중 하나는 5’콜레스테롤 변형이다. 사용되는 다른 변형으로는 비오틴, 아민, 세포 투과 펩티드, Cy5 또는 플루오레신과 같은 형광 염료를 들 수 있는데 그로부터 TFD의 흡수를 쉽게 측정할 수 있다. 시험용으로 고려할 수 있는 다른 변형으로는 병원성 박테리아의 세포막의 특징인 지질을 들 수 있다. PCR에 의하여 생성되는 TFD는 따라서 생체 내에서 TFD의 안정성을 증가시키는데 기여하는; 흡수 효율을 증가시키는 데 기여하는; 형광에 의하여 탐지가 가능하게 하는데 기여하는 다양한 분자로 5’말단을 변형시킨 것일 수 있다. TFD가 이미 벡터 (pGEMT-Easy) 내로 클로닝된 것인 경우 프라이머들은 인서트 바로 측면의 서열에 어닐링될 수 있도록 설계된다, 예를 들면 다음과 같다:
SEQ ID NO : 1 - Chol TEf: 5’Cholesterol-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG
AAT TC 3’
SEQ ID NO : 2 - Cy5 TEr: 5’Cy5- AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG 3’.
PCR 결과물은 에탄올 침전되어 500-1000 ng/μl의 농도로 TE 완충용액에 현탁된다.
TFD는 시험할 결합 부위를 함유하는 인산화 합성 올리고뉴클레오티드 쌍과 함께 어닐링함으로써 클로닝된다. 각 올리고뉴클레오티드 쌍은 3’말단에 아데닌을 함유하고 이는 5’티민 오버행을 가지는 (PCR 결과물의 클로닝을 촉진하기 위하여) pGEMT-easy 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 한다.
Sig TFD용으로 사용되는 프라이머 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 28 - SasigB FOR: GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA
ATA A
SEQ ID NO : 29 - SASigB REV: TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C A
Fhu TFD용으로 사용되는 프라이머 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 30 - SAfhu FOR: ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC
TA
SEQ ID NO : 31 - SAfhu REV: AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG
TA
SsaA TFD용으로 사용되는 프라이머 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 32 - SsaA FOR: ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A
SEQ ID NO : 33 - SsaA REV: AAA ATA AGT CTG TTA CAA ATT TGT AAT A
5.2 96-웰 플레이트에서의 생장 연구 수행
콜레스테롤/Cy5-표지된 디코이 폴리뉴클레오티드는 섹션 5.1에서와 같이 준비된다. 통상 1 μg 의 TFD를 0.3 μl의 리포좀 트랜스펙션 제제 DOTAP (Roche)과 복합체를 이루도록 한 후 10분간 실온에서 반응시킨다. 박테리아 세포의 생장에 미치는 효과를 측정하기 위한 본 실험은 96 웰 플레이트를 사용하여 수행되고, 각 웰은 철이 제한되지 않은, 60 nM 그라미시딘 (Sigma Corporation. Cat# G5002)으로 보충된 BHI 배지 (Becton Dickinson), 또는 유사하게 그라미시딘으로 보충된 철-결핍 배지 (NRPMI)로 이루어지는 배양액 200 μl를 함유한다. 철-결핍 실험 방법은 다른 문헌에 전부 기재되어 있다 [Science (2004) 305:1626-1628]. 다양한 농도의 콜레스테롤/Cy5-표지된 디코이 TFD 복합체 1 μl를 각 웰에 첨가하고 에스. 아우레우스의 박테리아 생장을 배양 중 시간 간격을 두고 배양액의 흡광도를 측정함으로써 모니터하였다. 플레이트를 쉐이킹하며서 37℃에서 배양하고 흡광도 (450 nM에서)는 플레이트 리더를 사용하여 읽었다. Sig, fhu 및SsaA의 몇몇 디코이들을 시험하였다.
도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 10 nM만큼의 Sig TFD 처리로 BHI 배지에서 생장을 방해하였지만, fhu TFD 유사량은 이 배지, 즉 철-비제한 배지에서 박테리아의 생장에 어떠한 효과도 나타내지 못했다. 10 nM의 SsaA TFD는 박테리아 생장에 있어 측정할 수 있을 정도의 지연을 나타내었다.
철-제한 배지를 사용한 경우 10 nM의 fhu TFD는 생장을 방해할 수 있음을 보여주었으나 유사량의 대조군 TFD (SsaA)는 이 조건 하에서 박테리아 생장에 대하여 어떠한 효과도 나타내지 못했다.
실시예6
Fur TFD 는 fhu 의 발현을 조절하고 철-제한 배지에서 에스 . 아우레우스 의 생장을 방해한다.
TFD는 박테리아의 철 흡수를 조절하는 중추적 역할 (Somerville and Proctor (2009) Microbiol. MoI. Biol. Rev. 73: 233-248), 재활용되는 철의 수송을 조절하는 fhu 오페론을 음성적으로 조절하는 역할을 하는 Fur 전사 인자에 결합하도록 설계되었다. 철은 생장에 필수적이다 - 그것은 전자 전달에 필요하고 많은 효소 과정에서 보조인자로 작용한다. 그러나, 숙주에서, 철은 제한된 양으로 존재하고 보통 박테리아로 하여금 트랜스페린 및 락토페린과 같은 숙주의 운반 단백질 내로 끼어들어 접근하도록 허용되지 않는다. 이에 대응하여, 에스 . 아우레우스는 고-흡착 철-킬레이터인 사이드로포어 (siderophore)를 합성하는데, 이는 철과 결합하여, fhuCBG에 의하여 암호화되는 것과 같은 ABC 운송체를 이용하여 철-사이드로포어 복합체를 박테리아 세포질 내로 수송한다. 철의 과량 수송은 펜튼 반응 (Fenton reaction)에 의하여 자유 라디칼을 형성할 수 있기 때문에, 세포의 손상이 뒤따르고 (Wandersman and Delepelaire, Ann Rev Microbiol (2004) 58:611-647), 철 흡수는 견고하게 조절되어야 한다. Fur 넉-아웃 균주는 인 비트로 실험시 철-제한 배지에서 잘 자라지 못하고 동물 모델에서는 그 병원성을 잃는다 (Horsburgh, et al. J. Bacteriol (2001) 183:468-475), 이는 치료 표적으로서 Fur의 잠재력을 증명한다.
6.1 실험방법
6.1.1 박테리아 균주 및 배양 조건
에스 . 아우레우스 ATCC 6538NA 배양체를 BHI 배지 (Becton Dickenson)에서 생육시켜 유지하였다. 냉동 스탁은 초기 지수 생장기 (A600에서의 OD 0.3) 배양액과 50% 글리세롤을 동일 부피로 혼합하여 -80℃에서 냉동시킴으로써 제조하였다. BHI는 철-비제한 조건용으로 사용되는 배지이고 이미 알려진 바와 같이 제조된 NRPMI (Skaar et al. 2004)는 철-제한 생장 조건을 위한 것이다.
6.1.2 TFD 의 제조
TFD 서열을 함유하는 플라스미드를 Fur 결합 서열 [SAFurl, 5’P- ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA- 3’(SEQ ID NO : 30) 및 SAFur2, 5’P- AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA-3’(SEQ ID NO : 31)], 및 대조군 서열 [Conl, 5’P- TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TA- 3’(SEQ ID NO : 34) 및 Con2, 5’P- ACG GAC CCG CAG TCA CCC GGA TCC GTG GCC AA- 3’(SEQ ID NO : 35)]을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, pGEMTEasy 벡터 (Promega) 내로 클로닝하여 제작하고 대장균 DH5α (Invitrogen) 내로 형질전환하였다. 그 후 TFD는 pGEMTeasy를 표적으로 하는 표지된 프라이머 chol-Tef [5’- 콜레스테롤- GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC- 3’(SEQ ID NO : I)] 및 cy5-Ter [5’- Cy5- AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TGA- 3’(SEQ ID NO : 2)] 을 이용하여 PCR을 통해 증폭되고 에탄올 침전으로 정제되었다.
6.1.3 트랜스펙션 방법
그라미시딘 (Sigma) 스탁 용액을 1 ml의 메탄올에 21 mg의 그라미시딘을 녹여 신선하게 준비하고, 사용 전 물에 희석한 후 최종 농도 60 nM이 되도록 생장 배지에 추가로 1/100 희석하였다. 보충 배지는 냉동 에스 . 아우레우스 스탁 1/100로 접종하여 실온에서 10분간 배양되었다. TFD-DOTAP 복합체는 1 μg의 TFD와 2μg의 DOTAP (Roche)을 혼합하고 벤치에서 10분간 실온 배양함으로써 형성된다. 상기 TFD 복합체는 접종된 배지와 혼합되고, 96 웰 평면-바닥 플레이트로 덜어 Bio Tek 플레이트 리더에서 쉐이킹하면서 37℃로 배양함으로써 생장을 분석하였다.
6.1.4 리얼 -타임 qPCR 을 통한 TFD 수의 정량
각 웰로부터의 세포를 PBS [인산 완충된 살라인 (saline)]로 2회 세척하고 lOOμl 물에 현탁하였다. lμl의 각 샘플이, 표준 DNA 또는 샘플을 프라이머와 함께 TFD (Tef 및 Ter; SEQ ID NOs 1 및 2) 또는 16S rRNA [stypF, 5’- ACG GTC TTG CTG TCA CTT ATA- 3’(SEQ ID NO : 36); stypR, 5’- TAC ACA TAT GTT CTT CCC TAA TAA- 3’(SEQ ID NO : 37)] 중 어느 하나를 증폭시키기 위하여 0.5μl의 ROX (Invitrogen)로 보충된 12.5 μl의 SYBR Green DNA 믹스에서 혼합되어 각 qPCR 반응에 사용되었다. 결과 데이터는 게놈 당 제공된 TFD의 수를 계산하는데 사용되었다.
6.1.5 RNA 분석
배양액은 RNA 보호 제제 (Qiagen)로 처리되고 설명된 바와 같이 박테리아를 수확하여 -80℃에 저장하였다. 세포 펠렛은 lOOμg/ml의 리소스타핀을 함유하는 lOOμl의 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA)에 현탁되고 세포를 용해시키기 위하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 700 μl의 RLT 완충액 (Qiagen RNA 추출 키트)이 첨가되고 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 수확되었다. 남아있는 모든 DNA는 2.5μg의 RNA 샘플을 1.25 U DNA 분해효소 I 25 μl와 함께 실온에서 15분간 혼합하여 인비트로젠 DNA 분해효소 I으로 분해하였다. DNA 분해효소 I은 25mM EDTA 2.5μl를 첨가하고 65℃에서 10분간 가열함으로써 비활성화시켰고 처리된 RNA는 무작위 프라이머 합성 (NEB Protoscript)을 이용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 표준 리얼-타임 PCR 방법을 사용하면 상기 cDNA를 fhu 유전자의 프라이머 (qSAfhuF, 5’- CGT CAA TCA TTG GTC CTA ACG GCT GC- 3’(SEQ ID NO : 38); qSAfhuR, 5’- GCC ATC TGC TAC TTC AGG TGA TTG AGG- 3’ (SEQ ID NO : 39))를 사용하여 상대적인 전사를 정량하는데 이용할 수 있고 16s rRNA (프라이머 stypF 및 stypR; SEQ ID NOs : 36 및 37을 사용)의 수준을 이용하여 표준화시킬 수 있다.
6.2 결과
6.2.1 철- 비제한 배지에서의 Fur TFD 의 트랜스펙션
철 이용성은 59개의 에스 . 아우레우스 유전자의 조절, 그 중 17개는 Fur 조절된다고 알려져 있는 유전자의 조절에 영향을 미친다 (Allard et al, Microbiol. Infect. (2006) 8:1679-1690; Xiong et al, J. Infect. Dis. (2000) 181:1020-1026; Horsburgh et al, J. Bacteriol. (2001a) 183:468- 475). Fur는 또한 katA등의 산화적 스트레스 내성에 필요한 촉매를 암호화하는 (Horsburgh et al, Infect. Immun. (2001b) 69:3744-3754; Morrissey et al, Infect. Immun. (2004) 72:972-979) 몇몇 Per-조절 유전자들의 양적 조절자로서 작용하고 그 결과 fur 돌연변이는 따라서 히드록시 라디칼 형성을 방지하는 그 능력이 제한된다. 이 다양하고 복잡한 조절 특성이 에스 . 아우레우스 fur 돌연변이의 병독성 감소를 설명할 수 있다. Fur 활성을 조절하는 TFD 접근법의 응용 가능성을 평가하기 위해서 TFD는 에스 . 아우레우스의 fhu 프로모터에 대하여 수행된 풋프린팅 실험 (Xiong et al. 2000)에 의하여 이미 규명된 Fur 결합 부위를 포함하도록 설계되었다. 대조군 TFD는 유사한 뉴클레오티드 조성의 에스 . 아우레우스 게놈에는 존재하지 않는 무관한 서열로 이루어졌는데; 이는 Fur TFD의 작용이 서열-특이적인지 및 트랜스펙션 실험방법 자체에 의하여 야기되는 살생 효과가 있는지 여부를 알아보기 위한 것이다. 각 뉴클레오티드 서열은 대장균 pGEMPEasy 벡터로 클로닝되고 결과물 플라스미드는 인서트 부위 옆 프라이머와 함께 PCR로 TFD를 생성하기 위하여 사용되었다. 프라이머는 일부는 TFD를 엑소뉴클리에이즈로부터 보호하여 안정성을 증가시키기 위하여, 또한 콜레스테롤 (포워드 프라이머) 및 Cy5 염료 (리버스 프라이머)를 포함하는 분자로 기능화하기 위하여 관례적으로 5’말단을 변형시킨다. 그러므로, Fur TFD의 TFD는 총 길이 60 bp이고 대조군 TFD는 62 bp였다.
트랜스펙션을 하기 위해서, TFD는 안정한 복합체를 형성하기 위하여 및 인산 백본의 음성 전하를 차단하기 위하여 시판 지질 제제 DOTAP과 혼합되었다. 상기 TFD-DOTAP 복합체는 그 후 60 nM 그라미시딘으로 보충된 철-비제한 배지인 BHI에서 에스. 아우레우스와 혼합되었다. 그라미시딘은 그람 양성 박테리아의 세포막에 대한 활성을 갖는 항균 펩티드이다 (Herrell and Heilman, J. Clin. Invest. (1941) 20:583-591). 본 발명의 발명자들에 의한 종래 실험에서 치사량에 가까운 농도의 그라미시딘이 TFD-DOTAP 복합체와 박테리아 세포막의 융합을 가능하게 하고 TFD를 흡수하도록 한다는 것을 알아내었다. 대조군 TFD와 함께 트랜스펙션 제제를 첨가하면 에스 . 아우레우스의 생장률이 감소되는 결과가 나타났다. 이것은 아마도 세포벽을 약화시키는 박테리아의 일부 활성에 기인한 것일 것이다. 1 nM의 FUR 또는 대조군 TFD 중 하나로 트랜스펙션한 결과 철-리치 배지에서는 유사한 생장 곡선을 볼 수 있었다 (도 9). 흥미롭게도, fur 넉-아웃의 경우 리치 배지에서 생장 결함을 보였으나 (Horsburgh et al, 2001) 대조군 및 Fur_TFD로 처리한 샘플 간에는 어떠한 차이도 없었다. 이러한 차이에 대한 한 해석은 다른 생장 조건 (예를 들어, 96 웰 플레이트에서의 통기량 부족) 및 배지 차이가 있을 수 있지만 더 적절한 것은 유전자 넉-아웃과 TFD 처리한 효과 사이의 기본적인 차이점일 것이다. Fur_TFD는 Fur 단백질 뿐 아니라 동일한 부위에 결합하는 다른 단백질에 이르기까지 그 부위에 결합할 수 있는 임의의 전사 인자의 결합을 방해할 것이다. 점차 박테리아에서의 전사 조절이 종래 여겨졌던 것보다 더 복잡하고, 진핵 생물에서처럼, 많은 조절 네트워크의 입력을 받고 그에 따라 발현에 영향을 미치는 하나 이상의 전사 인자와 함께 모듈화되어 있음이 명백해지고 있다 (Barnard et al, Curr. Opin. Microbiol. (2004) 7:102-108).
정량 PCR은 세포에 트랜스펙션이 일어났는지 그렇다면 얼마나 많은 TFD가 게놈 당 들어갔는지를 알아보기 위하여 수행한다. 그라미시딘 및 DOTAP이 없는 경우, TFD는 박테리아 세포 내 또는 부착된 상태가 탐지되지 않았다, 이는 TFD가 세포 내로 자발적으로 들어가지 않으며 세척 과정을 통해 세표 표면에 비-특이적으로 부착되어 있던 임의의 TFD도 모두 제거된다는 것을 증명한다. 트랜스펙션 제제가 있는 경우, Fur 및 대조군 TFD는 각각 게놈 당 4500 및 5340개가 검출되었다 (도 10A). 그러므로, 철-리치 배지에서 트랜스펙션 과정은 생장에 어떤 눈에 띄는 다른 효과 차이를 나타냄이 없이 박테리아 세포 내로 두 TFD 양자 모두에 대하여 실질적 숫자를 운반한 것이다.
6.2.2 TFD -조절된 fhu 의 발현
Fur_TFD가 작용하여 Fur에 결합하므로써 fhu 프로모터에 결합하지 못하게 하면 fhu 유전자가 더 억제될 것이 예상된다. 이를 시험하기 위하여, Fur_TFD 처리된 샘플에 존재하는 fhu 전사물 (리보좀 DNA로 표준화)의 카피수를 대조군 샘플과 비교하였다 (도 10B). 도 9에서 보여지는, 샘플로부터 분리한 RNA에 대한 정량 리얼-타임 RT-PCR 수행결과는 Fur_TFD가 fhu 전사에 예측되었던 변화를 일으켰음을 나타낸다: 그것은 대조군 샘플보다 5배 더 높은 결과를 나타내었다. 그러므로, 특정 TFD의 트랜스펙션은 병독성에 필수적인 것으로 알려진 에스 . 아우레우스의 유전자들의 발현 패턴을 조절하는데 쓰일 수 있다.
6.2.3 철-제한 배지에서 Fur TFD 의 생장에 대한 효과
동일한 트랜스펙션 프로토콜을 이용하여 상기 Fur 및 대조군 TFD를 철-제한 배지에서 배양된 에스 . 아우레우스내로 도입하였다 (Skaar et al, Science (2004) 305:1626-8). 예상된 바와 같이 BHI에서의 생장과 비교했을 때 이 배지에서의 생장이 지연되었다. 그러나, Fur TFD로 트랜스펙션한 배양액은 상기 실험 과정을 넘어서는 생장에 대한 어떠한 징후도 보여주는데 실패하였다 (도 11), 이는 철-제한 조건 하에서 철-조절의 동요가 생장에 유해한 것임을 증명하고, Fur 넉-아웃 돌연변이에서 볼 수 있었던 결과와 일치하는 것이다 (Horsburgh et al, 2001a).
Fur 전사 인자는 일반적으로 철이 과잉인 조건 하에서, 펜튼 반응으로부터 야기되는 철의 독성을 예방하면서 철 흡수 유전자들의 전사를 하향-조절하는 광범위하게 작용하는 억제제로 여겨져 왔다 (Wandersman & Delepelaire, Ann. Rev. Microbiol. (2004) 58:611-647). 에스 . 아우레우스 fur의 돌연변이는 또한 철-제한 조건 하에서 자라지 못하는, 생체 내 감쇠의 결과를 낳는 병독성에 있어 해로운 효과를 나타내었다 (Horsburgh et al. 2001a). 이 결과에 대한 이유는 분명하지 않지만, 아마도 박테리아가 환경 변화에 적응하고 산화 스트레스에 반응하는 중재 능력에 있어서 Fur의 중추적 역할을 반영하는 것이다. 병독성에 대한 효과는 에스 . 아우레우스에만 특별히 나타나는 것은 아니다. fur 돌연변이는 비브리오 콜레라에, 캄필로박터 제주니, 헬리코박터 파일로리 , 악티노바실러스 플레우로뉴모니아에 및 바실러스 세레우스의 생체 내 감쇠를 야기한다 (Mey et al, Infect. Immun. (2005) 73:8167- 8178; Palyada et al, J. Bacteriol. (2004) 186:4714-4729; Bury-Mone et al, MoI. Microbiol. (2004) 53:623-638; Jacobsen et al, Infect. Immun. (2005) 73:3740-3744; Harvie et al, Microbiol. (2005) 151:569-577). 에스 . 아우레우스 Fur 공통 서열 [MEME 소프트웨어를 사용 (http://meme.sdsc.edu/meme4_l/ intro.html)] 및 종래 규명된 서열 (Horsburgh et al. 2001a)의 생물정보학적 분석은 그 서열이 에스 . 아우레우스에서 뿐만이 아니라 (도 12) 바실러스 세레우스 , 바실러스 안트라시스 , 바실러스 서브틸리스 , 리스테리아 모노사이토제네스에서도 매우 보존되어 있음을 증명하고, 기타 바실라레스에 대한 활성을 예상케 한다.
안티센스 분자들은 병원성 박테리아를 치료하는데 사용되어 왔다. 가장 괄목하게는 변형된 백본, 예컨대 펩티드 핵산 [Good & Nielsen, Nat. Biotech. (1998) 16:355-358] 및 모폴리노 올리고뉴클레오티드 (morpholino oligonucleotides) (Shen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009) 106:8163-8168), 및 양이온 펩티드와 함께 전달하도록 사용하는 것을 들 수 있다. 이들은 표적 mRNA의 번역을 마이크로몰 농도에서 하향 -조절하여 인 비트로 및 생체 내 실험에서 미생물 생장을 억제한다. 변형된 백본으로의 전환은 생리적 용액에서 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시키고 인산 백본의 음전하를 감소 또는 제거한다는 장점을 갖는다. 후자의 경우 효과면에서 변형 올리고뉴클레오티드가 박테리아의 음으로 하전된 외막을 통해 트랜스펙션되는 것을 용이하게 한다는 장점을 갖는다. 그러나, TFD는 DNA-단백질 상호작용을 통하여 간섭함으로써 작용하고 인산 백본이 단백질 인식에 중요한 것이기 때문에 그것은 쉽게 대체될 수 없다.
본 실시예에서 천연 백본을 가지는 꽤 큰 올리고뉴클레오티드인 TFD들이 펩티드 및 리포좀과 조합되어 사용됨으로써 세포내로 효과적으로 전달되고 나노몰 농도로 박테리아를 사멸시킬 수 있음이 증명되었다. TFD들은 효소 과정 (전사)를 봉쇄하기 때문에 훨씬 낮은 농도에서 효과적인 반면 안티센스는 전사 결과물 (mRNA)을 입체적으로 봉쇄하여 작용한다. TFD를 사용하는 추가적인 장점은 그들이 단일 표적이 아닌 다수의 필수 유전자들의 발현을 봉쇄하여 내성 기전에 덜 민감하게 한다는 데에 있다.
실시예 7
Sig TFD 의 MRSA 균주에 대한 생장 억제
콜레스테롤/C5-표지된 디코이 폴리뉴클레오티드는 실시예 5.1에서와 같이 제조되었다. 통상 1 μg의 Sig TFD를 0.3 μl의 리포좀 트랜스펙션 제제 DOTAP (l,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane; Roche)과 복합체를 이루게 한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 박테리아 세포의 생장에 미치는 효과를 측정하기 위한 실험을 96 웰 플레이트를 이용하여 수행하였고, 각 웰은 60 nM 그라미시딘 (Sigma Corporation. Cat# G5002)으로 보충된 BHI 배지 (Becton Dickinson)로 이루어진 배양액 200 μl를 포함한다. 다양한 농도의 콜레스테롤/Cy5-표지된 디코이 TFD 복합체 1 μl를 각 웰에 첨가하고 메티실린-내성 균주 (MRSA)로 알려진 에스 . 아우레우스의 임상적 분리주의 박테리아 생장에 대한 효과를 모니터하였다. 생장을 배양 중 시간 간격을 두고 배양액의 흡광도를 측정함으로써 모니터하였다. 플레이트는 37℃에서 쉐이킹하면서 배양되었고 흡광도를 플레이트 리더를 이용하여 읽었다 (450 nM에서).
도 13에서 볼 수 있는 것처럼, 10 nM의 Sig를 처리하는 것만으로 BHI 배지에서 MRSA 균주의 생장을 방해한다는 것이 명백하다. 에스 . 아우레우스 게놈에서 발견되지 않는 유사한 길이의 무관한 서열을 함유하는 대조군 TFD의 유사량은 이 배지에서 박테리아의 생장에 아무런 효과를 나타내지 않았다.
실시예 8
Sig TFD 의 EMRSA15 (표피 균주의 임상적 분리주 )에 대한 항생제 작용의 강화
Sig 아령 TFD는 실시예 9.1에서 개시된 바와 같이 제조된다 (이하 참고). 생장 실험은 특징이 잘 드러나는 MRSA 균주, EMRSA15로 실시예 5.2에 개시된 바와 같이 수행되었다. 이 균주는 메티실린 (항생제 2 mg/ml에서 자랄 수 있음), 0.5 mg/ml 에리스로마이신 및 0.5 mg/ml 시프로플록사신에 대하여 내성을 보인다 (Porter and Damani, J. Hospital Infection (2007) 65:88).
하기 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, EMRSA15 균주는 10 nM의 Sig TFD의 존재 하에서 박테리아 배양액의 생장 지연 시간을 결정함으로써 측정된 바에 따라 메티실린, 에리스로마이신 및 시프로플록사신에 대하여 다시 민감해졌다. 이러한 실험에서 0시간의 지연 시간은 항생제로 보충된 배지에서 자란 무처리 박테리아와 같은 시점에 대조군 TFD (실시예 5.1에서 개시된 바와 같이) 및 항생제로 처리한 배지에서 배양을 시작했음을 나타낸다. Sig TFD로 처리한 배양액에서, 지연 시간은 항생제 존재하에서 대조군 TFD로 보여졌던 것과 비교한 생장의 지연이다. 그러므로, 지연 시간 6.4 h (2 mg/ml 메티실린의 존재 하), 8.2 h (0.5 mg/ml의 에리스로마이신의 존재 하) 및 8.3 h (0.5 mg/ml의 시프로플록사신의 존재 하)은 Sig TFD가 이들 항생제와 함께 생장을 늦추는데 시너지로 작용했다는 것을 나타낸다.
이 효과의 기전은 Sig TFD가 스트레스 반응 레귤론의 항생제-매개 유도를 방해 또는 하향-조절하여, 세포를 더 민감하게 하는 것으로 여겨진다. 대부분의 항생제는 스트레스-반응을 야기하기 때문에 TFD가 조합되어 사용되면 이러한 항생제 모두 또는 대다수의 효능을 증가시킬 것으로 예상할 수 있다.

항생제

대조군 TFD
지연시간 (h)

Sig TFD
지연시간 (h)

메티실린
2mg/L
0.2
6.4

에리스로마이신
0.5 mg/L
-0.3
8.2

시프로플록사신
0.5 mg/L
0.3
8.3
지연 시간은 TFD의 처리로 인하여 생장이 지연된 시간 (가장-트랜스펙션된 배양액과 비교하여)으로 정의한다.
실시예 9
아령 구조 Sig TFD 의 MRSA 임상적 분리주에 대한 생장 억제
9.1 라이게이션을 통한 아령 TFD 의 제조 ( DB - TFD )
각각 에스 . 아우레우스의 대안 시그마 단백질의 인식 부위 한 가닥을 함유하는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 분자의 한 말단에는 작은 헤어핀 루프가 작용하여 이 분자를 분해되지 않도록 보호한다. 각 올리고뉴클레오티드는 250 pmol/μl의 농도로 증류수에 현탁되었다.
Sig 아령 TFD (SA3 TFD로 언급)를 형성하기 위하여 다음의 인산화 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
SEQ ID NO : 40 - SigDB_SA3: CTTGG TTTTT CCAAG GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA ATA
SEQ ID NO : 41 - SigDB_SA3: P-CCG TCT TTT TGA CGG TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C
이들이 어닐링되면 다음의 분자를 형성한다:
Figure pct00001
통상 30 μl의 각 올리고뉴클레오티드를 27 μl의 증류수와 혼합하고 다음의 PCR 프로그램을 이용하여 어닐링하였다: 어닐링: 95℃ 3분, -0.1℃/s로 8℃까지 냉각, 종료. 이어서 10 μl의 10X NEB 라이게이즈 완충용액 및 3 μl의 HC T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 물질을 라이게이션되지 않은 임의의 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위하여 T7 엑소뉴클리에이즈 (NEB)로 강하게 처리하고 2회 에탄올 침전으로 회복시켰다.
DB_TFD는 또한 Sig 결합 부위의 뒤섞인 버전을 함유하도록 제조되었다. 이 경우 인산화 프라이머는 다음과 같다:
SEQ ID NO : 42 - SigScr SAl : CTTGG TTTTT CCAAG TAG AAA GAA GAT TTA GGG CGA T TTT ATA ATA TAT
SEQ ID NO : 43 - SigScr_SA2: CCG TCT TTT TGA CGG ATA TAT TAT AAA ATC GCC CTA AAT CTT CTT TCT A
9.2 96-웰 플레이트에서의 생장 연구 수행
아령 구조 Sig TFD와 MRSA의 임상적 분리주를 사용하여 실시예 5.1에서 개시된 바와 같이 생장 실험을 수행하였다.
도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 10 nM이라는 낮은 농도의 Sig TFD는 세포의 생장을 억제하는 반면 유사 농도의 대조군 TFD는 그러하지 아니하였다.
실시예 10
WalR DB - TFD 의 EMRSA15 의 생장 방지
10.1 WalR 결합 부위를 함유하는 DB TFD 의 제조
WalR의 결합 서열을 아령 올리고뉴클레오티드로 포함시켜 실시예 9.1에 개시된 바와 같이 제조하였다. 이들 인산화 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 44 - WalRDB2.1: CTTGG TTTTT CCAAG TAA TGA ATG A GTT TAA AGC CCA TGT AAA AG GGG TAT CAG TAC
SEQ ID NO : 45 - WalRDB2.2: CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT TTA CAT GGG CTT TAA ACT CAT TCA TTA
WalR 결합 부위의 뒤섞인 버전을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 두번째 쌍을 대조군 아령 구조 (Scr. WaIR)를 생성하기 위하여 사용하였다. 이들 인산화 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 46 - WalRDB3.1 : P-CTTGG TTTTT CCAAG GTA ATA TGA C AAG ATT GTA AAT GAC CTA GTT GAG AG ATGCCA
SEQ ID NO : 47 - WalRDB3.1 : P-CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TAC
10.2 리소스타핀과 함께 공동 처리에 의한 EMRSA15 의 트랜스펙션
배지를 그라미시딘 대신 0.5 내지 2.5 pg/ml의 리소스타핀으로 보충한 것 외에는 실시예 7.1에 개시한 바와 아무 차이점이 없는 생장 실험을 수행하였다. 리소스타핀은 에스 . 아우레우스의 세포벽에 특이적인 리소자임-유사 효소이다.
도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 10 nM의 Sig DB-TFD만으로 박테리아의 생장을 억제할 수 있었던 반면, 유사량의 대조군 DB-TFD는 아무런 효과를 나타내지 못하였다.
실시예 11
마우스 종 모델에서의 WalR TFD 의 MRSA 에 대한 생장 억제
이 실시예에서 사용되는 TFD는 두 개의 구성요소로 이루어진 시스템 WalKR의 작용을 봉쇄한다. 이들 단백질은 세포벽 대사, 특히 펩티도글리칸 합성에 관여하는 유전자들의 작은 레귤론 발현을 조절하는 필수적 신호 변화 경로를 형성한다.
11.1 실험방법
11.1.1 박테리아 균주 및 생장
에스 . 아우레우스 EMRSA16 배양액을 BHI 배지 (Becton Dickenson)에서 배양하고 유지하였다. 냉동 스탁은 초기 지수 생장기 (A600에서의 OD 0.3) 배양액과 50% 글리세롤을 동일 부피로 혼합하여 -80℃에서 냉동시킴으로써 제조하였다.
11.1.2 TFD 의 제조
TFD는 종래 개시된 바와 같이 아령 구조로 제조되었다 (Ahn et al, 2003). TFD는 lyrM (WalR)TFD)의 프로모터 내에 존재하는 WalR 단백질의 결합 서열을 함유하는 TFD, 또는 상기 결합 부위의 뒤섞인 버전을 함유하는 TFD (Scr_TFD)를 형성하기 위하여 인산화 올리고뉴클레오티드 쌍들을 라이게이션시킴으로써 제조되었다. 상기 올리고뉴클레오티드들을 최종 농도 100 pmol/μl가 되도록 T4 DNA 라이게이즈 완충용액 (New England Biolabs)에 현탁하고 400 U의 T4 DNA 라이게이즈와 16℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 아침 반응 완충용액을 10 U의 엑소뉴클리에이즈 I (NEB)로 보충하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하였다. TFD를 1 mM의 농도로 물에 현탁하였다.
WalR_TFD를 형성하는데 사용된 올리고뉴클레오티드 쌍의 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 48 - WaIRl : 5’- P-CTT GGT TTT TCC AAG TAA TGA ATG AGT TTA
AAG CCC ATG TAA AAG GGG TAT CAG TAC- 3’ 및
SEQ ID NO : 49 - WalR2: 5’- P-CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT
TTA CAT GGG CTT TAA ACT CAT TCA TTA- 3’.
Scr_TFD용 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 46 - WalRDB3.1 : 5’- P-CTT GGT TTT TCC AAG GTA ATA TGA CAA
GAT TGT AAA TGA CCT AGT TGA GAG ATG CCA- 3’ 및
SEQ ID NO : 47 - WalRDB3.1 : 5’- P-CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA
ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TAC- 3’.
11.1.3 MRSA 의 인 비트로 트랜스펙션
실험대에서 1 μg의 TFD와 2μg의 DOTAP (Roche)을 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켜 TFD-DOTAP 복합체를 형성하였다. TFD 복합체를 그 후 10 ng/ml의 리소스타핀 (Sigma; L9043)으로 보충된 접종 배지와 혼합하고, 96 웰 평면-바닥 플레이트로 덜어 37℃에서 쉐이킹하면서 배양하여 바이오텍 플레이트 리더로 생장 분석하였다.
11.1.4 마우스 패혈증 모델
마우스 패혈증 연구는 Euprotek (UK)에 의하여 수행되었다. 이 연구에 이용된 마우스는 수컷 CD1 마우스로 Charles River (Margate UK)에 의하여 공급되고 특정 병원체 프리 종이었다 (공급시 16-18g). 모든 마우스는 실험 시작 당시 22-25g무게였다.
11.1.5 저항력 연구
저항력 연구를 위하여, 처리 그룹당 2마리 마우스를 한 그룹으로 하여 총 10 마리를 연구용으로 처리하였다. 모든 마우스를 연구 1일에 무게를 재고 무작위로 상자에 넣었다. 5개 처리 그룹의 마우스는 100 μM WalR TFD; 2.5 mM DOTAP; 6.3 μg/ml 리소스타핀; TFD/DOTAP/리소스타핀의 혼합물; 살라인과 같은 처리를 10 ml/kg으로 정맥 투여 받았다. 마우스를 100 시간 이상의 기간 동안 매일 상기 처리 후 무게를 재고 안락사시켜 폐, 간, 비장 및 신장을 떼어 외관 시험하고 무게를 재었다.
11.1.6 PK 연구
PK 연구를 위하여 시간 포인트당 3마리 마우스를 한 그룹으로 하여 총 24마리를 연구용으로 처리하였다. 마우스에 정맥 전달의 방식으로 5 nM/kg WaIR TFD, 25 nM/kg DOTAP, 31.5 m/kg 리소스타핀의 혼합물을 처리하였다. 투여 후 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간에 이소플루레인 (isofluorane) 마취한 후 심장 천공으로 마우스 세트에서 혈액을 추출하였다. 모든 샘플은 혈장으로 수집하였다 (헤파린으로 응고 방지하고 분리되기 전 얼음에 저장). 혈액 수집 후 신장을 떼어 1 ml의 빙냉 PBS에 균질화시켰다. 생물학적 샘플로부터 TFD는 qPCR로 검출되었다.
11.1.7 조직 부하 연구
조직 부하 연구를 위하여, 처리 그룹당 8마리 마우스를 한 그룹으로 하여 총 48 마리를 연구용으로 처리하였다. 스태피로코쿠스 아우레우스 EMRSA16의 10ml 배양액 2개를 준비하고 37℃에서 밤새 오비탈 쉐이커 (220 rpm)에 놓아두었다. 다음날, 스태피로코쿠스 아우레우스 EMRSA16 배양액을 쉐이커로부터 빼내어, 펠렛 다운 시킨 후 두 번 세척하고 OD 0.132 (1.5 x 108 cfu/ml)로 살라인에 현탁하였다. 이 스태피로코쿠스 아우레우스 EMRSA16 스탁 용액을 그 후 살라인에 1:1.5 (1 x 108 cfu/ml)로 즉, 마우스당 2.0 x 107 박테리아로 더 희석하였다. 48마리 마우스를 그 후 1.0 x 108 /ml의 현탁액 0.2 ml로 감염시켰다. 감염 부하 (infection load)를 확인하기 위하여 접종 후 잔존 현탁액 내의 ml당 스태피로코쿠스 아우레우스 EMRSA16 박테리아의 수를 또한 계수하였다. 감염 1시간, 9시간 및 17시간 이후 마우스에 화합물 또는 부형체를 처리하였으나, 반코마이신은 오로지 1시간 후에만 투여하였다. 전술한 바와 같이 처리제는 1 nM/kg TFD를 DOTAP과 5:1 몰 비의 농도로 그리고 63μg/kg 리소스타핀을 사용한 TFD/DOTAP/리소스타핀 혼합물이다. 감염 25시간 후 모든 동물의 무게를 재고 안락사시켰다. 신장을 즉시 떼어내고 빙냉 멸균 인산 완충된 살라인 + 0.05% 트윈 80에 균질화하였다. 기관의 균질액을 CLED 아가 상에 정량적으로 배양하고 3일에 이르기까지 37℃에서 배양하여 콜로니를 계수하였다. 배양 부하 데이터를 Stats Direct를 이용하여 Kruskal-Wallis 시험을 통하여 분석하였다.
11.2 결과
11.2. 1 인 비트로 실험에서 WalR _ TFD 의 MRSA 의 생장에 대한 신속한 사멸 효과
유전자 넉아웃 실험에서 매우 보존된 2 구성요소 시스템 WalK/WalR (YycG/YycF로도 불린다)이 에스 . 아우레우스 및 기타 그람-양성 병원체들의 생존력에 필수적이라는 것이 밝혀졌다. 전사 인자 WalR의 결합 부위가 lytM/SA0265 등 레귤론 내 유전자들의 몇몇 프로모터에서 규명되었다 (Dubrac, Boneca et al. 2007). WalR_TFD에는 이 버전이, Scr_TFD에는 무작위로 재배열된 뒤섞인 버전이 사용되었다.
영국 병원의 풍토성 MRSA 균주인 EMRSA-16을 본 연구에 사용하였다 (Cox, Mallaghan et al. 1995). TFD를 시판 지질 제제 DOTAP과 혼합하고, EMRSA-16로 접종한 배지 및 리소스타핀과 혼합하였다. 리소스타핀은 에스 . 아우레우스의 세포벽에 작용하는 리소자임으로, 본 실험에서 그 용도는 박테리아의 외곽 펩티도글리칸 층을 얇게 만들어 노출된 박테리움의 내막과 DOTAP 운반체의 혼성에 따른 TFD의 세포 트랜스펙션을 가능하게 하기 위한 것이다. 이 트랜스펙션 프로토콜을 사용함으로써 대조군 TFD, Scr_TFD로 처리한 것이 미처리 샘플과 비교하였을 때 박테리아 생장에 어떤 감지될 만한 효과를 나타내지 않음이 관찰되었다. 그러나, WalR_TFD는 인 비트로 실험에서 1 nM의 농도로 EMRSA-16의 생장을 방해하였다 (도 16). 생존 개체의 총 수로부터, WalR_TFD 처리는 살아있는 세포의 수를 5 자릿수만큼 감소시킨다는 결과를 확인하였다 (도 17A). WalR_TFD 처리로 사멸하지 않은 박테리아를 어떤 내성이 발생한 것인지 여부를 결정하기 위하여 2차 배양하였다. 본 과정을 총 4 회 반복하고, 생존 세포 수의 감소 (도 17B) 및 인 생장 곡선의 비트로 실험 양자 모두 기록하였다 (도 17C, 검은 사각형: 4차 패세지 박테리아). 그 결과, TFD-매개 사멸에 대한 내성 기전 발달에 대한 어떠한 증거도 없었다.
TFD가 박테리아를 접촉하여 사멸시키는지 또는 작용하기까지 장기적인 노출이 필요한지를 결정하기 위하여, EMRSA-16을 1 nM WalR_TFD/DOTAP 복합체로 트랜스펙션하고, 신선한 배지로 마이크로희석하기 전 어떠한 TFD 복합체 또는 리소스타핀 없이 30 분간 배양하였다. 인 비트로 생장 실험을 뒤이어 48 시간 동안 진행하였고 (도 18) 어떠한 생장도 관찰되지 않음이 명백하였으므로 TFD가 일차 접촉으로 세포를 효과적으로 사멸시킴을 확인할 수 있었다.
11.2.2 관용성 연구
모든 약물은 정맥 투여 후 잘 관용되었다; 보고할 만한 어떠한 급성 사건도 일어나지 않았다. 처리 후, 마우스는 어떠한 고통 징후 없이 일상적으로 식음이 가능하였다. 약품 처리를 받은 마우스의 몸무게 증가는 비히클 대조군에서와 동일하였다. 부검 결과도 신장, 폐, 간 또는 위장관에 있어 어떠한 중대 비정상적인 점을 나타내지 않았다. 신장, 폐 및 간의 무게는 정상 범위 내에 속했다. 모든 시험 화합물은 관용되었고 이 관용성 연구에 사용되는 최대 투여량에 이르기까지 추가적으로 투여량을 증가시키는데 적합하였다.
11.2.3 조직 부하 연구
상대적으로 경미한 감염을 일으키기 위하여 (이것이 처리에 더 민감하다) 감염 투여량을 마우스당 2.0 x 107 박테리아로 설정하였다. 마우스를 비히클, 1 nM Scr_TFD 복합체, 1 nM WalR_TFD 복합체 또는 반코마이신 중 하나로 전신 주사 처리하고, 콜로니 형성 단위 (cfu)에 있어 2 배 감소를 이루기에 충분한 농도를 사용하였다. 처리 후 마우스를 죽여 신장에서 발견되는 부하를 측정하였다 (도 19). 통계적 분석 결과 Scr_TFD 대조군과 비교하였을 때 WalR_TFD 처리한 마우스에서 반코마이신에 의하여 이루어지는 것과 유사한 부하 감소가 있었음을 보여주었다 (이하 표 2).
표 2. 생체 내 실험 결과의 통계적 분석. Kruskal-Wallis: Scr_TFD에 대한 모든 쌍별 비교 (Dwass-Steel-Chritchlow-Fligner)
Figure pct00002

본 실험에서 WalR_TFD가 MRSA에 대하여 인 비트로 및 생체내 실험 양자 모두에서 나노몰 농도로 살균 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 12
대장균을 FabB TFD 로 트랜스펙션시키면 지방산 합성을 저해하는 항생제에 대하여 대장균이 민감화된다 .
12.1 FabB TFD 의 제조
FabB TFD는 대장균의 FabB 유전자의 상류에 존재하는 지방산 합성 효소 FadR의 전사 조절자의 결합 부위를 포함하도록 설계되었다. FabB 유전자는 지방산 합성에 관련된 효소를 암호화한다 [J. Bacteriology (2005) 183:5292].
FabB 프로모터의 60 염기쌍 부분을 pGEMT-Easy 벡터에 클로닝하였다는 점을 제외하고는 실시예 4.1에서 개시되어 있는 바와 같이 PCR TFD를 제조하였다. 프로모터 서열을 증폭하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
SEQ ID NO : 50 - fabBf: TCT TTA AAT GGC TGA TCG GAC TTG
SEQ ID NO : 51 - fabBr: AGT AAG TTT CGA ATG CAC AAT AGC GTA
미코박테리움 스메그마티스로부터 분리한 게놈 DNA와 증폭 반응에 사용하였을 때 유사한 크기의 PCR 분획을 얻을 수 있는 서열의 대조군 TFD도 또한 제작하였다. 이들 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 52 - WhiB7.f: CAC CAG CCG AAA AGG CCA CGG
SEQ ID NO : 53 - WhiB7.r: CAA AAA TGG CCA CGG ATC CGG GTG
12.2 생장 실험
배지는 LB; 공동-트랜스펙션 제제로서 그라미시딘이 아니라 40 nM 폴리믹신; 또한 10 μg/ml 세룰레닌 (CER)으로 보충된 배지라는 몇 가지 수정을 가한 것을 제외하고는 실시예 4.1에서 개시된 바와 같이 대장균 박테리아 배양액의 생장에 미치는 TFD의 효과를 측정하였다. CER은 지방산 합성에 작용하는 항생제이다. 사용한 농도에서 세룰레닌은 대장균의 생장에 어떠한 눈에 띄는 효과도 미치지 못하였다.
도 20은 대조군 TFD (WhiB7; 대장균 게놈 내에는 존재하지 않는 것으로 알려진 서열을 포함)와는 달리, 대장균에 10 nM FabB TFD를 처리하면 박테리아가 세룰레닌의 작용에 민감해진다는 것을 보여준다. 사용된 항생제 세룰레닌 (CER)은 대조군 TFD가 20 μg/ml으로 존재할 경우 세포의 생장 억제를 시작하였고, 이 농도에서 FabB TFD와의 시너지 작용으로 세포를 사멸시켰다.
FabB TFD가 지방산 합성 오페론 유전자들을 하향 조절하기 위하여 설계되었기 때문에, 이 TFD를, 지방산 합성을 직접 또는 간접으로 동요시키는 임의의 항생제와 함께 그 항생제의 효능을 증가시키거나, 내성 기전에 대응하기 위하여 조합하여 사용할 수 있다는 것이 우리의 가설이다.
실시예 13
클레브시엘라 뉴모니아에 의 σ54 인자의 인식 서열을 함유하는 TFD 로 트랜스 펙션시키면 박테리아의 생장이 지연된다.
병원성 미생물 클레브시엘라 뉴모니아에의 대안 시그마 인자 σ54의 결합 부위를 함유하는 PCR TFD를 제작하여 시험하였다. 무관한 대조군 TFD의 활성과 비교하였을 때, Sig TFD는 세포의 생장을 억제하였다. σ54는 박테리아에서 스트레스 반응의 조절을 제어하는 시그마 인자의 또 다른 예이다.
13.1 TFD 의 제조
TFD를 실시예 5.1에서 개시된 바와 같이 제조하였다. 사용된 어닐링 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 54 - Ks54f: P-CCG ATA AGG GCG CAC GGT TTG CAT GGT TAT A
SEQ ID NO : 55 - Ks54r: P-ATA ACC ATG CAA ACC GTG CGC CCT TAT CGG A
13.2 케이 . 뉴모니아에의 트랜스펙션
M9 배지를 사용하였다는 것을 제외하고는 아무 차이점 없이 섹션 4.1에 개시된 바와 같이 생장 실험을 수행하였다 [Sambrook et al (1989) Molecular Cloning. 2nd Edition vol.3 p.A3]. 배지는 어떠한 공동-트랜스펙션 제제로도 보충되지 않았다.
트랜스펙션은 세포 투과 펩티드와 TFD의 복합체를 구성함으로써 이루어졌다. 상기 펩티드는 두 부분: 9 개의 D-아르기닌의 선형 사슬 및 케이 . 뉴모니아에의 세포막을 투과할 수 있는 것으로 알려진 종래 알려진 펩티드 서열로 이루어져 있다 (Vaara, Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1996) 40:1801). 양으로 하전된 아르기닌 (R9)이 전하 상호작용을 통하여 TFD 인산 백본과 결합하는 데 기여한다. 박테리아에 트랜스펙션하기 위한 트랜스펙션 복합체의 일부분을 이루는 이러한 R9의 용도가 이미 알려져 있다 [Kim, Molecular Therapy (2006) 14:343]. 사용된 펩티드의 전체 서열은 다음과 같다:
SEQ ID NO : 56 - IKFLKFLKFL-(D-아르기닌)9
5 % 글루코스로 보충한 TE계 완충용액에서 IKFLKFLKKL-R9 펩티드의 양을 증가시키면서 TFD와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 반응시키고 직접 트랜스펙션하거나 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 통상 DNA와의 복합체가 겔에서 진행하지 않기 때문에 즉, 핵산의 백본이 폴리-아르기닌의 결합으로 중화되기 때문에 IKFLKFLKKL-R9은 최소량이 사용된다. IKFLKFLKKL-R9-TFD 짝은 96 웰 플레이트의 200 μl 배양액 내로 다양한 농도로 혼합된다.
도 21은 10 nM의 Sig TFD가 케이 . 뉴모니아에 배양액의 생장을 억제하기에 충분한 반면, 대조군 TFD에서는 어떠한 억제도 볼 수 없다는 것을 보여준다.
실시예 14
에스 . 아우레우스 내의 WalR 결합 부위의 위치 탐지 및 그 공통 서열을 추론하기 위한 생물정보학적 분석
에스 . 아우레우스 (SA) 및 엔테로코쿠스 파에시움 (EF), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (SP), 리스테리아 모노사이토제네스 (LM) 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (SM) 등의 기타 WalR 결합 부위가 존재한다고 알려져 있는 병원성 미생물들의 WalR 결합 서열의 출판된 예들에 대한 추가적인 위치를 알아내기 위하여 MEME 서치 (http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi-bin/meme.cgi)를 사용하였다.
상기 서치를 통하여 밝혀진 일치하는 서브세트를 도 22에서 볼 수 있다. 완전한 세트로부터 공통 부위를 이끌어내었으며, 다음의 서열을 갖는다:
TGT WAW NNN NNT GTA AW [SEQ ID NO : 57]
IUPAC 딘일 문자 코드를 사용하였으며, W는 A 또는 T이다.
그러므로 WalR TFD 공통 서열은 상기 나열된 미생물들의 생장에 영향을 미침을 예상할 수 있다.
실시예 15
에스 . 아우레우스 내의 SigB 결합 부위의 위치 탐지 및 그 공통 서열을 추론하기 위한 생물정보학적 분석
에스 . 아우레우스 및 바실러스 , 리스테리아 , 및 스태피로코쿠스 등의 속으로 대표되는 바실라레스 (그람-양성 감염)의 SigB 결합 부위의 공통 서열과 매치되는 위치의 예를 찾기 위하여 (E-값 < 100) MEME 서치 (http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi-bin/meme.cgi) 를 사용하였다.
서치로부터 밝혀진 일치예를 도 23에서 볼 수 있다. 완전한 세트로부터 공통 부위를 이끌어 내었으며 그 서열은 다음과 같다:
GKT TWA NNN NNN NNN NNN NNK GGT AW [SEQ ID NO : 58]
IUPAC 딘일 문자 코드를 사용하였으며, K는 G 또는 T이고, W는 A 또는 T이다.
실시예 16
클레브시엘라 뉴모니아에 내의 Sig 결합 부위의 위치 탐지 및 그 공통 서열을 추론하기 위한 생물정보학적 분석
또 다른 시그마 인자 (시그마 54)의 결합 부위를 함유하는 TFD를 케이 . 뉴모니아에 glnA 유전자의 프로모터 부분으로부터 Barrios et al. 1999 (Nucl. Acids Res. 22: 4305-4313)에 개시된 바와 같이 얻었고, PCR_TFD로 포함되었을 때 인 비트로 실험에서 케이 . 뉴모니아에 세포를 사멸시키는 것을 볼 수 있었다 (도 24A 참고).
사용된 TFD 서열을 다음과 같다:
SEQ ID NO : 59 - KP_Sig TGG CAC aga ttT CGC T
세포를 실시예 13에 개시되어 있는 바와 같이 세포 투과 펩티드를 이용하여 트랜스펙션하였다. KP_Sig 서열을 함유하는 TFD가 인 비트로 실험에서 세포 생장을 방해하는 반면 두 개의 대조군은 세포 생장에 어떠한 효과도 나타내지 못하였다. 사용된 두 개의 대조군은 미처리 세포 (케이 . 뉴모니아에) 및 뒤섞인 서열로 이루어지는 대조군 TFD이다.
케이. 뉴모니아에 유전자에서 발견되는 기타 유사한 결합 부위를 공통 서열을 규명하는 데 사용하였다:
SEQ ID NO : 60 - TGG NNN NNN WTT TGC W
IUPAC 딘일 문자 코드를 사용하였으며, W는 A 또는 T이다.
SEQUENCE LISTING <110> Procarta Biosystems Limited <120> Transcription Factor Decoys <130> P3950WO <150> US 61/102,414 <151> 2008-10-03 <150> US 61/167,592 <151> 2009-08-04 <150> GB 09069130 <151> 2009-04-08 <150> PCT/GB2008/003353 <151> 2008-10-03 <160> 60 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis H37Ra <400> 1 ggccgccatg gcggccgcgg gaattc 26 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis H37Ra <400> 2 aggcggccgc gaattcacta gtg 23 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis H37Ra <400> 3 cttggttttt ccaagagaag agcccgccat ggcggccgcg ggaattc 47 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis H37Ra <400> 4 ccgtcttttt gacggcgaag agcaggcggc cgcgaattca ctagtga 47 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis str MC2 155 <400> 5 tggccacgga tccgggtgac tgcgggtccg tggcct 36 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Escherichia coli str K12 <400> 6 tttattccga actgatcgga cttgttcagc gtacacgtgt tagctatcct gcgtgcttca 60 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 7 gctattttgt aatgacaatg taatgagttt agtaaaaa 38 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 8 attacaaatt tgtaacagac ttatttta 28 <210> 9 <211> 106 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis str MC2 155 <400> 9 caccagccga aaaggccacg gacccgcagt cacccggatc cgtggccatt tttgtcggac 60 cccccgagaa atctggtcgc aggatccatc agctcagaca gatcac 106 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Escherichia coli K12 <400> 10 agtaagtttc gaatgcacaa tagcgtacac ttgtacgccg aacaagtccg atcagccatt 60 taa 63 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 11 gctattttgt aatgacaatg taatgagttt agtaaaaa 38 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 12 attacaaatt tgtaacagac ttatttta 28 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 13 ttattatata cccatcgaaa taatttctaa tcttc 35 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 14 ccgataaggg cgcacggttt gcatggttat 30 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 15 actacaagta ctattagtaa tagttaaccc tt 32 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 gataatgata atcattatc 19 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 17 gttgtcccat aattatagca taaatgataa tgaaaaagta aa 42 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Clostridium difficile <400> 18 aagtttacaa aattatatta gaataacttt tttatt 36 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 19 aaatgtgatc tagatcacat tt 22 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 20 cactctgcaa tccagttcat aaatcc 26 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 21 gtaacagcgg aaccactgca cag 23 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 22 gctttgcact accgcggccc atccctgccc caaaacgatc gct 43 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 23 ataatcataa tgattaaagt tttcatattc attataaatc cgtttacaca attatt 56 <210> 24 <211> 61 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 24 gaaattgttc tatttattat ccatttgctt attaataatt ggttgttaat tttggtttag 60 a 61 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 25 tgaacacctt cttttta 17 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 26 agaaagacaa acaggagtaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 27 gaagaaacaa aaagcagcat 20 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 28 gaagattaga aattatttcg atgggtatat aataa 35 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 29 tattatatac ccatcgaaat aatttctaat cttca 35 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 30 actacaagta ctattagtaa tagttaaccc ta 32 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 31 agggttaact attactaata gtacttgtag ta 32 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 32 attacaaatt tgtaacagac ttatttta 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 33 aaaataagtc tgttacaaat ttgtaata 28 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 34 tggccacgga tccgggtgac tgcgggtccg ta 32 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 35 acggacccgc agtcacccgg atccgtggcc aa 32 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 36 acggtcttgc tgtcacttat a 21 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 37 tacacatatg ttcttcccta ataa 24 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 38 cgtcaatcat tggtcctaac ggctgc 26 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 39 gccatctgct acttcaggtg attgagg 27 <210> 40 <211> 49 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 40 cttggttttt ccaaggaaga ttagaaatta tttcgatggg tatataata 49 <210> 41 <211> 49 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 41 ccgtcttttt gacggtatta tatacccatc gaaataattt ctaatcttc 49 <210> 42 <211> 49 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 42 cttggttttt ccaagtagaa agaagattta gggcgatttt ataatatat 49 <210> 43 <211> 49 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 43 ccgtcttttt gacggatata ttataaaatc gccctaaatc ttctttcta 49 <210> 44 <211> 57 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 44 cttggttttt ccaagtaatg aatgagttta aagcccatgt aaaaggggta tcagtac 57 <210> 45 <211> 57 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 45 ccctcttttt gaggggtact gatacccctt ttacatgggc tttaaactca ttcatta 57 <210> 46 <211> 57 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 46 cttggttttt ccaaggtaat atgacaagat tgtaaatgac ctagttgaga gatgcca 57 <210> 47 <211> 57 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 47 ccctcttttt gagggtggca tctctcaact aggtcattta caatcttgtc atattac 57 <210> 48 <211> 57 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 48 cttggttttt ccaagtaatg aatgagttta aagcccatgt aaaaggggta tcagtac 57 <210> 49 <211> 57 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 49 ccctcttttt gaggggtact gatacccctt ttacatgggc tttaaactca ttcatta 57 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 50 tctttaaatg gctgatcgga cttg 24 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 51 agtaagtttc gaatgcacaa tagcgta 27 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 52 caccagccga aaaggccacg g 21 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 53 caaaaatggc cacggatccg ggtg 24 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 54 ccgataaggg cgcacggttt gcatggttat a 31 <210> 55 <211> 31 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 55 ataaccatgc aaaccgtgcg cccttatcgg a 31 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a cell-penetrating peptide <400> 56 Ile Lys Phe Leu Lys Phe Leu Lys Lys Leu Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Bacteria <220> <221> misc_feature <222> (7)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 tgtwawnnnn ntgtaaw 17 <210> 58 <211> 26 <212> DNA <213> Bacteria <220> <221> misc_feature <222> (7)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 gkttwannnn nnnnnnnnnn kggtaw 26 <210> 59 <211> 16 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 59 tggcacagat ttcgct 16 <210> 60 <211> 16 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> misc_feature <222> (4)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 tggnnnnnnw tttgcw 16

Claims (36)

  1. 원핵 세포의 생존력을 감소시키는 방법으로서, 이 방법은
    (a) 표적 전사 인자 (디코이 서열)의 결합 부위를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계와,
    (b) 디코이 폴리뉴클레오티드를, 하나의 유전자 또는 유전자들에 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 원핵 세포 내로 도입하는 단계
    를 포함하여 이루어지며, 여기서
    상기 디코이 폴리뉴클레오티드의 도입은 표적 전사 인자가 세포 내 결합 부위에 결합하는 것을 감소시켜 작동적으로 연관된 유전자(들)의 발현의 변경을 야기하고;
    상기 표적 전사 인자는
    (i) 세포 적응 반응;
    (ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
    (iii) 세포 병독성 인자;
    (iv) 세포 스트레스 반응; 또는
    (v) 세포의 필수 유전자
    중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것인, 원핵 세포의 생존력을 감소시키는 방법.
  2. 원핵 생물의 항생제 감수성을 증가시키는 방법으로서, 이 방법은:
    (a) 표적 전사 인자의 결합 부위 (디코이 서열)를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계와,
    (b) 디코이 폴리뉴클레오티드를, 하나의 유전자 또는 유전자들에 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 원핵 세포 내로 도입하는 단계
    를 포함하여 이루어지며, 여기서
    상기 디코이 폴리뉴클레오티드의 도입은 표적 전사 인자가 세포 내 결합 부위에 결합하는 것을 감소시켜 작동적으로 연관된 유전자(들)의 발현의 변경을 야기함으로 해서, 세포의 항생제 감수성 증가를 일으키는 것이고;
    상기 표적 전사 인자는
    (i) 세포 적응 반응;
    (ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
    (iii) 세포 병독성 인자;
    (iv) 세포 스트레스 반응; 또는
    (v) 세포의 필수 유전자
    중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것인, 원핵 생물의 항생제 감수성을 증가시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생존력의 감소는
    (i) 스트레스 반응과 같은 세포 적응 반응의 억제;
    (ii) 항생제에 대한 세포 감수성의 증가;
    (iii) 하나 이상의 필수 유전자들의 발현 억제;
    (iv) 하나 이상의 병독성 유전자들의 발현 억제
    중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 전사 인자는 WhiB7; FadR; YycG/YycF; 시그마 54 (또는 SigA); Fur; TcdR; Vfr; NtrC; ArsR; TcaA; AgrA; WaIR; sigB; Ksig; fhu; 또는 이들 중 임의의 것의 기능적 변이체 또는 동족체로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 원핵 생물은 박테리움인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 병원성인 것인 방법.
  7. 전술한 청구항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드 내의 상기 전사 인자 결합 부위는 임의의 유전자와 작동적으로 연관되어 있지 아니하는 것인 방법.
  8. 표적 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 디코이 폴리뉴클레오티드로서, 상기 결합 부위는 유전자에 작동적으로 연관되어 있지 않고, 상기 전사 인자는
    (i) 세포 적응 반응;
    (ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
    (iii) 세포 병독성 인자;
    (iv) 세포 스트레스 반응; 또는
    (v) 세포의 필수 유전자
    중 하나 이상을 암호화하는 유전자 또는 유전자들의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표적 전사 인자는
    (a) 세포의 유출 펌프 단백질, 세포벽 조성을 결정하는 단백질, 세포벽 밀도 또는 세포벽 대사를 암호화하는 하나의 유전자 또는 유전자들;
    (b) 세포 스트레스 반응 유전자 또는 유전자들;
    (c) 금속 조절 단백질(들)을 암호화하는 하나의 유전자 또는 유전자들;
    (d) 질소 고정 단백질(들)을 암호화하는 하나의 유전자 또는 유전자들;
    (e) 병원성 단백질(들) 또는 병독성 인자(들)을 암호화하는 하나의 유전자 또는 유전자들;
    (f) 필수 유전자 또는 유전자들
    중 하나 이상의 발현 조절자를 포함하는 것인
    디코이 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 표적 전사 인자는 WhiB7; FadR; YycG/YycF; 시그마 54 (또는 SigA); Fur; TcdR; Vfr; NtrC; ArsR; TcaA; AgrA; WaIR; sigB; Ksig; 또는 fhu; 또는 이들의 기능적 변이체 또는 동족체로부터 선택되는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 원형 이중 가닥 DNA 또는 선형 올리고뉴클레오티드; 및/또는 하나 이상의 2차 구조 요소; 및/또는 2 카피 이상의 상기 전사 인자 결합 부위; 및/또는 결합 부위(들)의 추가적 서열; 및/또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클리에이즈 저항성을 증가시키는 변형된 염기 또는 당; 및/또는 하나의 플라스미드 또는 플라스미드 라이브러리를 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 상기 전사 인자 결합 부위의 다중 동향 반복물을 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 다중의 전사 인자 결합 부위를 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  14. 제11항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 5’콜레스테롤 변형을 가지는 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 원형 아령 구조를 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  16. 제11항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 플라스미드를 포함하고, 상기 플라스미드는 스네어 서열을 포함하는 단량체 서열을 1 카피 이상 가지며, 상기 스네어 서열은 상기 전사 인자 결합 부위를 포함하고, 상기 결합 부위는 임의의 유전자와 작동적으로 연관되어 있지 않은 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  17. 전술한 청구항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드 내의 상기 전사 인자 결합 부위는 SEQ ID NO: 25 내지 60 중의 임의의 것, 또는 디코이 기능을 보유하는 이들의 변이체 또는 분절을 포함하는 것인 디코이 폴리뉴클레오티드.
  18. 외인성 디코이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 유전자와 작동적으로 연관되어 있지 않은 표적 전사 인자의 결합 부위를 포함하고; 상기 세포는 하나의 유전자 또는 유전자들과 작동적으로 연관된 전사 인자의 결합 부위를 포함하고; 상기 표적 전사 인자는
    (i) 세포 적응 반응;
    (ii) 세포 내재적 항생제 내성 기전;
    (iii) 세포 병독성 인자; 또는
    (iv) 세포의 필수 유전자
    중 하나 이상을 암호화하는 유전자(들)의 발현에 대한 조절자를 포함하는 것인 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 디코이 폴리뉴클레오티드는 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 것인 세포.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 병원체인 것인 세포.
  21. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 제시된 방법에 따라 제조되는 세포.
  22. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드와, 필요에 따라 1종 이상의 항생제 및/또는 항균 제제를 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 치료 대상의 박테리아 감염을 치료하는 방법.
  23. 박테리아 감염을 치료하기 위한 용도를 갖는 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드.
  24. 박테리아 감염을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드의 용도.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 박테리아 감염의 치료에 1종 이상의 항생제 및/또는 기타 항균 제제(들)을 사용하는 것을 포함하는 것인 디코이 뉴클레오티드 또는 용도.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 감염의 치료는 폐렴, 세균혈증, 백일해, 라임병, 브루셀라증. 급성 장염, 패혈증, 야토병, 인플루엔자, 위궤양, 레지오넬라병, 임질, 병원 내 감염, 패혈증, 리케차병, 장티푸스, 이질, 콜레라, 흑사병, 탄저병, 위막성 대장염, 디프테리아, 리스테리아증, 결핵, 패혈증으로부터 선택되는 질환의 치료를 포함하는 것인 방법, 디코이 폴리뉴클레오티드 또는 용도.
  27. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드와, 필요에 따라 1종 이상의 항생제 및/또는 항균 제제를 조합하여 적용하는 것을 포함하는 박테리아의 사멸, 박테리아의 생장 억제, 또는 박테리아의 병독성 감소를 위한 생체 외 방법.
  28. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드와, 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체와, 필요에 따라 1종 이상의 항생제 및/또는 항균 제제의 조합을 포함하는 약학적 조성물.
  29. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드와, 필요에 따라 1종 이상의 항생제 및/또는 항균 제제의 조합을 포함하는 세정 조성물.
  30. 제8항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 디코이 뉴클레오티드와, 1종 이상의 항생제 및/또는 항균 제제를 포함하는 키트로서, 상기 디코이 및 1종 이상의 항생제 및/또는 항균 제제는 박테리아의 사멸, 박테리아의 생장 억제, 또는 박테리아의 병독성 감소를 위하여 조합하여 사용되는 용도인 키트.
  31. 원핵 세포의 생존력을 감소시키기 위한 전사 인자 디코이 (TFD)의 용도.
  32. 원핵 세포의 병독성을 감소시키기 위한 전사 인자 디코이 (TFD)의 용도.
  33. SEQ ID NO: 57을 포함하는 전사 인자 디코이 (TFD).
  34. SEQ ID NO: 58을 포함하는 전사 인자 디코이 (TFD).
  35. SEQ ID NO: 60을 포함하는 전사 인자 디코이 (TFD).
  36. 제33항, 제34항 또는 제35항 중 어느 하나의 항에 기재된 전사 인자 디코이의 박테리아 감염의 치료를 위한 용도.
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