JP6572247B2 - 磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリーｄｎａ検出および回収用の磁性ナノ構造体 - Google Patents

磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリーｄｎａ検出および回収用の磁性ナノ構造体 Download PDF

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Description

本発明は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体に関するものである。
最近全世界的に、がん疾患の早期診断の重要性が大きく浮かび上がっており、したがってがんの早期診断方法に関する研究の割合が増加している傾向である。しかし、今までがんの診断方法は組織サンプルの採取および内視鏡の検査などの侵襲的な方法が主になっている。特に、現在主に活用されている組織検査は疾病が疑わる部位の一部を摘出して顕微鏡で観察する方式で行われるため、組織のサンプルを採取するために針やパンチ、内視鏡、または腹腔鏡などを用いて人体を切開して、患者が感じる不便さが少なくなく、傷跡が残り、回復にも時間がかかる。
このような従来の侵襲的な診断および検査方法の対案として、リキッドバイオプシーを用いた分子診断法が注目をあびている。リキッドバイオプシーは非侵襲的（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）な方法を用いるため、検査結果の導出速度が速く、疾病の一部分のみを分析することができる組織サンプルとは異なり、体液、つまり液体生体サンプルは疾病に関して多角的な分析を行うことができる。特に、リキッドバイオプシーはがんの診断に卓越した効用性を発揮すると見込まれ、血液、尿などの体液検査のみで身体の部位別の血液内に存在するがん細胞由来のＤＮＡを分析してがんの発生および転移などに関する詳細な観察が可能であると予測される。
また、分子診断法は体外診断の代表的な技術で、血液、尿などの遺伝子情報が入っている試料から、ＤＮＡ、ＲＮＡで起こる分子レベルの変化を数値または映像を通じて検出し、診断する技法である。これは正確度が高くて、組織検査をしなくてもいいというメリットがあるので、遺伝体分析技術の急速な発展をともに費用の節減のメリットをもとにがんの診断技術に応用しようとする努力が試みられている。
また、セルフリーＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ；ｃｆＤＮＡ）は腫瘍細胞から起因してがん患者から由来される血液、血漿または尿などの生物学的な試料で発見されることができるがん細胞由来のＤＮＡを意味して、壊死、細胞死滅または泌尿器官の正常細胞および／またはがん細胞で活性化され、様々な細胞の生理学的な過程を通じて、尿、血液などで放出される。したがって、血液、血漿または尿などの生物学的な試料から由来されるｃｆＤＮＡを分離して検出する技術が発展することに従い、リキッドバイオプシーががん危険群の患者をモニタリングするのにより効果的かつ信頼性の高いツールとなるだろう。実際に尿、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ；ＣＳＦ）、血漿、血液、または体液は簡単に得られる試料であるので、繰り返したサンプリングを通じて多量の単純かつ非侵襲的な検体の収集が可能である。これによりがんの診断において、もっとも非侵襲的なリキッドバイオプシーを通じて、病原体のＤＮＡを検出して分析する方法が注目をあびている。
しかし、血液、尿などの液体試料内のｃｆＤＮＡを検出して遺伝子で発生する変異を発見して、がんを早期診断する方法には、現在の技術では多くの制限がある（韓国公開特許第１０−２０１６−０１２９５２３号）。特に、尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液の試料内にｃｆＤＮＡが非常に少ない濃度で存在して、ｃｆＤＮＡが老化の過程で自然な遺伝子変異が発生することがあるが、これは必ずしもがんに進まれることではなく、たとえがんに進まれても大きな問題を起こさない場合もある。したがって、検出の敏感度の向上および正確ながんの早期診断のための方法が切実に求められている実情である。
したがって、ｃｆＤＮＡが液体試料から極めて低いレベルで発見されるので、高い品質と少ない試料の量でＤＮＡ抽出プロトコルを開発することが分子分析の過程で最も重要なステップであり、本発明の磁性ナノ構造体を用いて、尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの液体試料からｃｆＤＮＡの超高感度の検出、濃縮、分離の技術が確立されることができるものと期待する。
本発明者は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を製造して、上記の構造体が少量の尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの生物学的な試料から、様々な種類のセルフリーＤＮＡを効率的に検出することができ、試料で極微量に存在するセルフリーＤＮＡの検出、分離および回収において、はるかに向上された効果を有することを確認したので、これに基づいて本発明を完成することになった。
よって、本発明の目的は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含む、セルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を提供することである。
また、本発明の他の目的は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いてセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡの検出および／または回収方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を有効成分として含むがんの診断用の組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を含むがんの診断キットを提供することである。
また、本発明の他の目的は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いてがんの発病および／または予後を診断するための情報提供方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いてがんの診断方法を提供することである。
しかし、本発明が解決しようとする技術的な課題は以上で言及した課題に制限されなく、言及されていない他の課題は以下の記載から当業者に明確に理解されることができるだろう。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を提供する。
この際、上記の磁性ナノ構造体は上記の陽イオン性高分子で表面処理されることを特徴とする。
本発明の一実施例として、上記の陽イオン性高分子はポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）であることができる。
本発明の他の実施例として、上記の陽イオン性高分子および上記の導電性高分子はビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）およびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の結合で成り立つことができる。
本発明の他の実施例として、上記の導電性高分子はポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）またはこれの誘導体であることができる。
本発明の他の実施例として、上記の磁性ナノ構造体は磁性ナノワイヤであることができる。
本発明の他の実施例として、上記のセルフリーＤＮＡはｐＨの変化により上記の磁性ナノ構造体から分離されることができる。
また、本発明は（１）本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を個体試料に処理するステップ；（２）上記の試料に含まれたセルフリーＤＮＡが上記の磁性ナノ構造体に付着されるステップ；（３）上記の個体試料から上記のセルフリーＤＮＡが付着された磁性ナノ構造体を分離するステップ；（４）上記のセルフリーＤＮＡが付着された上記の（３）ステップの磁性ナノ構造体からｐＨの変化により上記のセルフリーＤＮＡを分離させるステップを含むセルフリーＤＮＡ検出および回収方法を提供する。
本発明の一実施例として、上記の検出および回収方法において、上記の試料は尿、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ；ＣＳＦ）、血漿、血液、または体液であることができる。
また、本発明は本発明のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を有効成分で含むがんの診断用の組成物を提供する。
本発明の一実施例として、上記のがんは子宮頸がん、肺がんまたは乳がんを含む。
また、本発明は本発明のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を含むがんの診断キットを提供する。
また、本発明は本発明によるセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体からＤＮＡを抽出または回収して分析するステップを含むがんの発病および／または予後を診断するための情報提供方法を提供する。
また、本発明は本発明によるセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いるがんの診断方法を提供する。
本発明による磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体は少量の尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの生物学的な試料から様々な種類のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を効率的に検出することができる。より具体的に、多量の磁性ナノ粒子を電気重合の過程の中で搭載することにより発生される強い磁場による試料に極微量に存在するセルフリーＤＮＡを効率的に捕獲することができ、セルフリーＤＮＡの検出、分離および回収において、磁性ナノワイヤ構造体の長い構造により、多量の陽イオン性高分子であるポリエチレンイミンを付着することができるし、これで試料に存在するＤＮＡの捕獲の効率をはるかに高めることができるので、検出の敏感度が向上され従来の技術に比べて顕著に増加されたセルフリーＤＮＡの検出および回収の効果を表す。また、磁性ナノワイヤの糸のように細くて長い構造は血液または尿に存在する多量の細胞またはタンパク質などの隙間をくぐって入り、がんに関連するｃｆＤＮＡを効果的に探し捕獲することができるので、はるかに向上された検出効率をみせる。したがって、本発明によるセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体は、がんの早期診断、治療だけでなく、ＤＮＡを抽出して、遺伝子の変異診断サービスとしての活用が期待される。
図１ａおよび図１ｂは本発明の陽イオン性高分子であるポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）が表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いてセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出および回収する方法に関する概念的な模式図を示したものである。 図２ａは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）のイメージを示したものである。 図２ｂおよび図２ｃは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）のイメージを示したものである。 図２ｄは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の磁気ヒステリシスループ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ ｌｏｏｐ）を示した結果である。 図２ｅは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ付着および分離の過程で表面電荷の変化をモニタリングするためのゼータ電位の値を調べた結果である。 図３ａは本発明の磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、ゲノムＤＮＡの高い回収効率を確認した結果である。 図３ｂおよび図３ｃは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ捕集の後、回収されたＤＮＡを直接的に確認した共焦点蛍光イメージの結果である。 図４ａおよび図４ｂは陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）を示した結果である。 図５ａは子宮頸がん患者の子宮頸部から綿棒で採取された細胞試料で、ＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を確認するために、本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔを使用して比較した結果である。 図５ｂは子宮頸がん患者の子宮頸部の標本試料から回収されたＤＮＡの増幅を代表的に図式した結果である。 図６は本発明の陽イオン性高分子であるポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）が表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて尿試料でのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出および回収する方法に関する概念的な模式図を示したものである。 図７ａおよび図７ｂはＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＨｅＬａ）細胞またはＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＳｉＨａ）細胞をＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅの尿試料に混合して、それぞれ異なる分子量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ ８００Ｄａまたは２５ｋＤａ）が接合された本発明の磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のｃｆＤＮＡ捕集および回収効率を示したものである。 図７ｃおよび７ｄはＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＨｅＬａ）細胞またはＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＳｉＨａ）細胞をＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅの尿試料に混合して、それぞれ異なる時間で反応させた結果、本発明の磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のｃｆＤＮＡ捕集および回収効率を示したものである。 図８は本発明の陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の尿試料でのＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）を示した結果である。 図９ａは子宮頸がん患者の尿試料で回収されたｃｆＤＮＡの濃度を測定した結果である。 図９ｂは子宮頸がん患者のＨＰＶ遺伝子型プロファイルを分析した結果である。 図１０ａは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、健康な対照群と子宮頸がん患者の尿試料で回収されたｃｆＤＮＡの濃度を測定した結果である。 図１０ｂおよび図１０ｃは尿試料または綿棒で採取した子宮頸部の細胞試料で類型特異的なＨＰＶ検出を確認した結果である。 図１１ａは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて抽出されたｃｆＤＮＡのサイズ別の検出効率を確認した結果である。 図１１ｂは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、磁性ナノ構造体の長さによるＤＮＡ検出効率を確認した結果である。 図１１ｃは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ検出効率を比較した結果である。 図１１ｄは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ回収効率を比較した結果である。 図１１ｅは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いて乳がんおよび肺がん患者の血漿内に存在するｃｆＤＮＡ検出効率を比較した結果である。 図１１ｆは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡを回収した後、ＰＣＲ増幅してＤＮＡの変異を確認した結果である。 図１１ｇは本発明の 磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡを回収した後、ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ １９ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ遺伝子の変異を評価した結果である。 図１１ｈは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡを回収した後、ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８５８Ｒ 遺伝子の変異を評価した結果である。 図１１ｉは本発明の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて肺がん患者の血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）から検出したｃｆＤＮＡおよびがん組織の遺伝子の変異を比較した結果である。
本発明はセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体に関するものである。また、本発明による磁性ナノ構造体は少量の尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの生物学的な試料から、様々な種類のセルフリーＤＮＡを効率的に検出することができ、試料に極微量に存在するセルフリーＤＮＡの検出、分離および回収において、はるかに向上された効果を有することを確認したので、がんの予防、診断または治療に有用に活用することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体として、上記の磁性ナノ構造体は上記の陽イオン性高分子で表面処理されることを特徴とする。
本発明で用いられる用語、「セルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）」は腫瘍細胞で起因してがん患者から由来された尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの生物学的な試料で発見されることができるがん細胞由来のＤＮＡを意味して、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）もやはりこれに含まれる。尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの生物学的な試料から上記のセルフリーＤＮＡを分析して、体液検査方法を用いる非侵襲的かつ非手術的な方法として、がん細胞由来ＤＮＡを分析してがんの発生および転移などに関する詳細な観察が可能であり、従来の侵襲的な診断および検査方法の代案になることができる。また、上記のセルフリーＤＮＡの検出を通じて、がん診断およびがん患者の予後を観察することができる。
本発明の上記の陽イオン性高分子はその種類において制限はないが、望ましくはポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）であることができ、より望ましくは陽イオン性の分枝型高分子ポリエチレンイミン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）であることができる。
また、本発明の上記の陽イオン性高分子および上記の磁性ナノ構造体はビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）およびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の結合で成り立つことができる。
また、本発明の上記の導電性高分子はポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）またはこれの誘導体であることができ、これに制限されるものではない。
また、本発明の上記の磁性ナノ構造体は磁性ナノワイヤであることができ、これに制限されるものではない。本発明の磁性ナノワイヤは電気化学的な蒸着の過程の間、多量の磁性ナノ粒子、導電性高分子であるポリピロールおよびビオチンが一緒にドーピング（ｄｏｐｉｎｇ）されて、その結果、究極的に陽イオン性の分枝型高分子であるポリエチレンイミンが上記の磁性ナノ構造体に多くの容量で導入されることができる。より具体的に、上記の磁性ナノ構造体は磁性ナノ粒子およびビオチン分子がドーピングされたフリースタンディングポリピロールナノワイヤ（ｆｒｅｅ―ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐｐｙ ＮＷｓ）の形態で製造されて、生成されたナノワイヤにＮ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）およびＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）を添加してカルボン酸（−ＣＯＯＨ；ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）基を活性化させ、生成された磁性ナノワイヤにストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を標識させる。その後、ストレプトアビジンが標識されたナノワイヤをビオチンが導入されたＰＥＩ溶液に添加して、磁性ナノワイヤにビオチンーストレプトアビジンの相互作用を通じて、陽イオン性分枝型ポリエチレンイミン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＰＥＩ）を追加で接合させる。その結果、陽イオン性高分子であるポリエチレンイミンが表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の中に磁性ナノ粒子が高い密度で、不規則に分布され埋め立てることができる。このような磁性ナノワイヤは高い効率で低い濃度でもゲノムＤＮＡを成功的に捕集することができる。特に、ＤＮＡなどの標的分子との結合のための広い表面積、ＤＮＡとの相互作用の促進のために向上された移動性、およい適用された磁場に対する高い反応性から発生する磁性ナノワイヤの特徴により、効率的かつ効果的であり、静電気的な相互作用を通じて標的ＤＮＡに対する卓越な接触および結合を誘導することができる。
本発明で上記のセルフリーＤＮＡはヒトパピローマウイルスＤＮＡ（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ；ＨＰＶ ＤＮＡ）であることができるが、これに制限されるものではない。ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）は人体感染の際にいぼ、子宮頸がんの発生原因になるパピローマウイルス科に属する二重螺旋状のＤＮＡウイルスであり、皮膚および粘膜の上皮異常を来す最も一般的なウイルスである。この中で高危険群（ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｇｒｏｕｐ）である発癌性のヒトパピローマウイルスが子宮頸がんと連関性が高いだと知られており、高危険群であるＨＰＶ遺伝子が宿主の遺伝子に挿入され増殖して、子宮頸部の上皮内の腫瘍というがんの前ステップを経て腫瘍を形成すると報告されている。特に、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は子宮頸部の上皮内の腫瘍（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｈｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ、ＣＩＮ）、扁平上皮細胞腫瘍（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＳＣＣ）組織の９０％以上で検出され、したがって、発がん性ヒトパピローマウイルスの中で、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８が最も重要であり、全世界的に７０％以上の子宮頸がんで発見される。一般的にヒトパピローマウイルスの分子診断法は臨床サンプルから抽出したゲノムＤＮＡを増幅させてＨＰＶ感染の可否を確認するのによく使われる。このような分子診断法は分子レベルで特定の遺伝子配列の存在を確認することで、疾病の進行の予測とモニタリングに関する重要な洞察力を提供する。実際に、標的化された遺伝物質の効率的な検出は疾病の根本的なメカニズムを明らかにするだけでなく収集された情報に入閣して、治療の決定を容易にする。しかし、従来の分子診断法で用いられているリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）ベースの方法は低い臨床敏感性と特異性によりＨＰＶ感染の早期診断を提供することができない限界がある。現在、ＨＰＶ感染の選別検査の方法では伝統的な方式の子宮頸部細胞検査（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃｙｔｏｌｏｇｙ）が用いられており、このような従来の検査法は子宮頸部で細胞を採取しなければならないので、拒否感および不便感により定期的な検診の難しさが発生する。しかし、定期的な子宮頸がんの検診は子宮頸がんの発生を６０％予防することができ、したがって、非侵襲的かつ拒否感が低い尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液の試料を用いた正しい子宮頸がんの選別検査の施行は低費用、高効率の子宮頸がんの発生を予防して、および死亡率を減らすのに核心的な要素になれることができる。
したがって、本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いて、尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液の試料からｃｆＤＮＡを超高感度で検出した後、抽出されたｃｆＤＮＡを用いてＨＰＶの分子的な診断を施行することができる。
また、本発明のセルフリーＤＮＡはｐＨの変化により上記の磁性ナノ構造体から分離されることができる。より望ましくは、酸性または中性（ｐＨ３ないし７）の環境でＤＮＡの捕獲が顕著に増加して、同じく塩基性（ｐＨ１０）の環境でＤＮＡの分離効率が顕著に増加する。これは低いｐＨでポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のアミノ基（ＮＨ２；ｐＫａ＝７．１１）のプロトン化（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）に起因して、その結果、ＤＮＡで陰に荷電されたりん酸基との静電気的な相互作用を強化させて結局磁性ナノワイヤのＤＮＡ付着能力を極大化させる。磁性ナノワイヤに結合されたＤＮＡのｐＨ依存性の放出パターンを定量的に確認した結果、磁性ナノワイヤから溶出されたＤＮＡはｐＨ値が増加することに従い有意に増加した。このような様相はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のアミノ基（ＮＨ２；ｐＫａ＝７．１１）の脱プロトン化（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）と直接的な関連があり、究極的にポリエチレンイミン／ＤＮＡ複合体の形成を変更させることと確認された。
本発明の他の様態として、本発明はセルフリーＤＮＡの検出および／または回収方法を提供する。より具体的に（１）セルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を個体試料に処理するステップ；（２）上記の試料に含まれたセルフリーＤＮＡが上記の磁性ナノ構造体に付着されるステップ；（３）上記の個体試料から上記のセルフリーＤＮＡが付着された磁性ナノ構造体を分離するステップ；および（４）上記のセルフリーＤＮＡが付着された上記の（３）ステップの磁性ナノ構造体からｐＨの変化により上記のセルフリーＤＮＡを分離させるステップを含むことができる。
本発明で上記の試料は生物学的な試料であることができ、望ましくは尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液などの液体試料であることができるが、これに制限されるものではない。
本発明の他の様態として、本発明は本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を有効成分として含むがん診断用の組成物を提供する。
また、本発明の上記のがんはその種類において制限はなく、様々な癌腫に適用することができる。したがって、肝がん、大腸がん、直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん、腎盂がん、膵臓がん、小腸がん、肝膵胆道がん、胃がん、脳腫瘍および乳がんなどを含むことができる。
本発明の他の様態として、本発明は本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を含むがん診断キットを提供する。より具体的に、上記の診断キットはバイオセンサーであることができるが、これに制限されるものではない。
本発明の他の様態として、本発明はがんの発病および／または予後を診断するための情報提供方法を提供する。より具体的に上記の方法は本発明のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体からＤＮＡを抽出または分離して分析するステップを含むことができ、上記の分析は試料の中のＤＮＡの濃度、コピーの数または塩基配列を分析して遺伝子変異の可否を確認することができる。
本発明の他の様態として、本発明は本発明のセルフリーＤＮＡ検出および回収用のナノ構造体を含むがんの診断方法を提供する。
本発明の一実施例では本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体として、ポリエチレンイミンの陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を製造して、上記の磁性ナノ構造体の形態学的な特性を評価した結果、磁性ナノ粒子が高い密度で本発明の磁性ナノ構造体に埋め立てられたことを確認した（実施例１参考）。
また、本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の子宮頸部の標本試料（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）でのＤＮＡ検出および回収の効率を評価するため、ｐＨ変化によるＤＮＡ捕集および分離効率を評価（実施例２−１参考）して、子宮頸部の標本試料から本発明による磁性ナノ構造体のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）を評価（実施例２−２参考）したし、子宮頸部の標本試料から本発明による磁性ナノ構造体および商業用Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ システムを用いたＨＰＶ遺伝子型の分析およびＤＮＡ捕集の効率を比較（実施例２−３参考）した。
また、本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の尿試料からＤＮＡ検出および回収の効率を評価（実施例３−１参考）し、尿試料から本発明による磁性ナノ構造体のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）を評価（実施例３−２参考）して、尿試料から本発明による磁性ナノ構造体を用いたＨＰＶ ＤＮＡを回収（実施例３−３参考）したし、尿試料から本発明による磁性ナノ構造体を用いたがん患者または健康な対照群のＨＰＶ遺伝子型の分布パターンを評価（実施例３−４参考）した。
また、本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の血漿試料からＤＮＡ検出効率を評価（実施例４−１参考）し、血漿試料から本発明による磁性ナノ構造体の長さによるＤＮＡ捕集および回収の効率を評価（実施例４−２参考）して、血漿試料から本発明による磁性ナノ構造体および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔとのＤＮＡ検出効率を比較（実施例４−３参考）したし、乳がんまたは肺がん患者の血漿試料から本発明による磁性ナノ構造体および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔとのＤＮＡ検出効率を比較（実施例４−４参考）し、肺がん患者の血漿試料から本発明による磁性ナノ構造体および商業用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔで回収されたＤＮＡの変異を確認（実施例４−５参考）した。また、本発明のセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、血漿または脳脊髄液の試料からＤＮＡ検出効率を評価（実施例４−６参考）した。
したがって、本発明によるセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体は尿、脳脊髄液、血漿、血液、または体液の試料に存在するＤＮＡの検出および回収においてその効率をはるかに高めることができ、敏感度が向上されたので、がんの早期診断、治療だけでなく、ＤＮＡを抽出して、遺伝子変異診断サービスでの活用が期待される。
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより理解しやすくするために提供されるだけであり、下記の実施例の本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の製造および形態学的な特性評価
１−１．陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の製造
図１ａおよび図１ｂに示すように、陽イオン性高分子であるポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）が表面に接合された磁性ナノ構造体を製造した。ＡＡＯ鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の一面をＱ１５０Ｔモジュラーコーティングシステム（Ｑｕｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）を用いて５×１０−３ｍｂａｒおよび５０ｍＡで６００秒間、金（Ａｕ）層（約１５０ｎｍの厚さ）でコーティングした。すべての電気化学的な実験は金（Ａｕ）でコーティングされたＡＡＯ鋳型で白金ワイヤの相対電極とＡｇ／ＡｇＣｌ（３．０ Ｍ ＮａＣｌ ｔｙｐｅ）比較電極を具備したｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＳＰ−１５０）を用いて測定した。陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の製造のために磁性ナノ粒子（ＭＮＰ、５μｇ／ｍｌ、ｄｉａｍｅｔｅｒ １０ｎｍ）を金（Ａｕ）コーティングされたＡＡＯディスクの上に付着させるために、磁性ナノ粒子を培養して常温（ＲＴ）で適当な吸引でＡＡＯ気孔に浸透させた。ＡＡＯ鋳型の気孔に０．０１Ｍポリ（４−スチレンスルホン酸）（ｐｏｌｙ（４−ｓｔｙｒｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））および１ｍｇ／ｍｌのビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を含有する０．０１Ｍピロール溶液と一緒に１．０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）で７分の間にクロノアンぺロメトリー（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）を適用して電気化学的な蒸着を行った。生成されたＡＡＯ鋳型を蒸留水で数回洗浄して、２Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に３時間浸した後、超音波の処理のために（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＣＤ−２００、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）に入れて、磁性ナノ粒子およびビオチン分子がドーピングされたフリースタンディングポリピロールナノワイヤ（ｆｒｅｅ―ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐｐｙ ＮＷｓ）を得た。その後、生成されたナノワイヤに３０ｍＭ Ｎ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）および６ｍＭ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）を添加してカルボン酸（−ＣＯＯＨ；ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）基を活性化した。続いて、生成されたナノワイヤをストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；１０μｇ／ｍｌ）と一緒に４５分間培養して蒸留水で洗浄した。この後、ストレプトアビジンが標識されたナノワイヤをビオチンが導入されたＰＥＩ溶液に添加した後、追加で常温で１時間培養して、水で洗った後、磁場を用いて分離（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）した。ポリエチレンイミンが表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を脱イオン水に分散させて使用するまでに室温で保管した。このような製造方法により、ＡＡＯ鋳型が選択的に溶解された後、それぞれのポリピロール（Ｐｐｙ）磁性ナノワイヤがＡＡＯ鋳型から放出されて、磁性ナノワイヤにビオチンーストレプトアビジンの相互作用を通じ陽イオン性の分枝型ポリエチレンイミン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＰＥＩ、２５ｋＤａ）が追加で接合された。
１−２．陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の形態学的な特性評価
ポリエチレンイミンが表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）は走査型電子顕微鏡（ｆｉｅｌｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ、ＪＳＭ ７８００Ｆ、ＪＥＯＬ）および透過電子顕微鏡（ｆｉｅｌｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＴＥＭ、Ｇ２Ｆ３０、Ｔｅｃｎａｉ）を用いて観察した。磁気力の測定はＳＱＵＩＤ−ＶＳＭ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒ（ＭＰＭＳ−ＶＳＭ、Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｅｓｉｇｎ）を用いて行った。また、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷの表面電荷（ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒｇｅ）はゼータ電位測定器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。
その結果、図２ａに示した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）のイメージ（スケールバー１０μｍ、拡大図のスケールバー１μｍ）および図２ｂに示した透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）のイメージ（スケールバー５００ｎｍ）を通じて、約２００ｎｍの直径および約１６μｍの平均長さを有する比較的に長い長さの磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の合成を確認した。また、相対的に様々な長さ分布を有するＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷの形態を確認した。このようなナノワイヤの長い形態はより大きい柔軟性および多目的性を保する。
また、図２ｃに示すように、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）のイメージ（スケールバー５０ｎｍ）はポリエチレンイミンが表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の中に磁性ナノ粒子（ＭＮＰ；＜１０ｎｍ直径）が高い密度で、不規則に分布されて埋め立てられたことを確認した。
また、図２ｄに示すように、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）および磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ；ＭＮＷ）に対する飽和磁化値を測定して、磁化曲線を図式した結果、同じ数の磁性ナノ粒子がナノワイヤに結合される際に、磁性ナノワイヤの磁化挙動（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ）（飽和磁化＝８２ｅｍｕ／ｇ）がＭＮＰ（飽和磁化＝４５ｅｍｕ／ｇ）の磁化挙動より大きいことを確認した。特に、磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の磁気力はナノワイヤの内に存在する高密度の酸化鉄ナノ粒子の幾何学的閉じ込め（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）と、その結果によるそれぞれのナノ粒子の磁気モーメントの整列結果により強化された。
また、図２ｅに示すように、ＤＮＡ捕獲および回収の過程で表面電荷の変化をモニタイングするためにゼータ電位値を調べた結果、ｐｏｓｉｔｉｖｅ（＋）（II）からｎｅｇａｔｉｖｅ（−）（III）へのゼータ電位の変化はＤＮＡが磁性ナノワイヤに付着された結果で発生した。その後、磁性ナノワイヤから捕獲されたＤＮＡのｐＨにより分離した結果、純粋ＤＮＡ（I）の値と類似にゼータ電位（IV）値が明白に減少されることを確認した。（II）：磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）、（III）：磁性ナノワイヤに捕集されたＤＮＡ（ＤＮＡ−ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ 複合体）、（IV）ｐＨ１０でＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷから放出されたＤＮＡ（純粋なＤＮＡが溶出される）
実施例２．子宮頸部の標本試料（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の効率評価
２−１．ｐＨ変化による陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ捕集および回収効率の評価
陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ分離技術としての活用可能性を確認するために、ＤＮＡ捕集および回収の効率を評価した。ＨＰＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞株であるＨｅＬａ細胞（ＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）またはＳｉＨａ細胞（ＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｒｍｉｃ ＤＮＡ）を分離して、知られている濃度のゲノムＤＮＡを体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合（ｓｐｉｋｅ）して評価した。より具体的に、ＨｅＬａ細胞またはＳｉＨａ細胞から回収されたゲノムＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（緩衝液）（１０ｍＭ）で様々な量（０．０１ないし１０００ｎｇ／ｍｌ）に入れた後、様々な濃度になるように製造した。即刻的なＤＮＡ捕集のために、上記の実施例１で製造した陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を（５ｕｌ、０．０５ｍｇ／１００ｕｌ）をゲノムＤＮＡを含有する溶液に添加して常温で１時間、やさしく振ってくれた。その後、３０分間マグネティックラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）に置いた後、結合されなかったり、または非特異的に結合した成分を分離して、磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）に付着されたＤＮＡを捕集した。捕集されたＤＮＡを常温の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１０．０）で１時間渦流させ（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）ＤＮＡを溶出させた。捕集された後、放出されたＤＮＡを製造社の指示に従いＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析法で定量化して、共焦点顕微鏡でＤＮＡの捕集を確認した。
その結果、図３ａに示すように、混合したゲノムＤＮＡの量に関係なく、磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いたＤＮＡの回収で高い性能を確認し、磁性ナノワイヤは９５％以上の高率で１０ｐｇ／ｍｌの低い濃度でもゲノムＤＮＡを成功的に捕集した。標的分子との結合のための広い表面積、ＤＮＡとの相互作用の促進のために向上された移動性、および適用された磁場に対する高い反応性から発生する磁性ナノワイヤの特徴により、効率的かつ効果的であり、静電気的な相互作用を通して標的ＤＮＡに対する卓越な接触および結合を誘導することができることを確認した。
また、図３ｂおよび図３ｃに示すように、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎで染色した後、共焦点蛍光イメージを通し、磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）で捕集の後、回収されたＤＮＡを直接的に確認した。ｐＨ１０でＤＮＡ−ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ複合体の培養の後、捕集されたＤＮＡは磁性ナノワイヤから完全に分離されたことを確認して、ＤＮＡ捕集効率が酸性または中性の環境（ｐＨ３ないし７）で顕著に増加することを観察した。このような傾向は低いｐＨでポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のアミノ基（ＮＨ２；ｐＫａ＝７．１１）のプロトン化（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）に起因するし、これはＤＮＡで陰に荷電されたリン酸基との静電気的な相互作用を強化させて結局磁性ナノワイヤのＤＮＡ付着能力を極大化させる。磁性ナノワイヤに結合されたＤＮＡのｐＨ依存性の放出パターンを定量的に確認した結果、磁性ナノワイヤから溶出されたＤＮＡはｐＨ値が増加することにより有意に増加した。このような様相はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のアミノ基の脱プロトン化（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）と直接的な関連があり、究極的にポリエチレンイミン／ＤＮＡ複合体の形成を変更させることで確認された。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬は二重鎖ＤＮＡに対する特異的な結合により、鮮やかな緑色シグナルを示し、これは磁性ナノワイヤによるＤＮＡ捕集および回収の明確な指標である。ｐＨ７で磁性ナノワイヤの共焦点イメージは強い緑色蛍光を示してＰＥＩ−ＭＮＷ表面にＤＮＡが直接に吸着されたことを示し、逆に、ｐＨ１０で磁性ナノワイヤの電荷反転が起こり、ＤＮＡがｐＨにより解離され蛍光信号が観察されなかった。標識されたデータは五つの独立的な実験の平均±標準偏差で示した。
２−２．子宮頸部の標本試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）評価
上記の実施例２−１で示すように、ＨＰＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞株であるＨｅＬａ細胞（ＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）またはＳｉＨａ細胞（ＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を回収して、知られている濃度のゲノムＤＮＡを体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合（ｓｐｉｋｅ）して、陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）を評価しようとした。より具体的に、ＤＮＡ配列の検出および増幅において、磁性ナノワイヤの広範囲な適用可能性を評価するためにＨｅＬａ（ＨＰＶ１８、１０ないし５０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）およびＳｉＨａ（ＨＰＶ１６、１ないし２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）の検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬＯＤ）を分析した。一般的に検出限界（ＬＯＤ）は臨界サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ；Ｃｔ）値を基準に９５％以上の陽性結果が検出されるＨＰＶ ＤＮＡの最低濃度で定義する。
その結果、図４ａに示すように、陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）はＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対して３ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。これと類似に、図４ｂに示すように、ＳｉＨａ（左）およびＨｅＬａ（右）細胞株から回収されたゲノムＤＮＡを緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に追加して、その量により臨界サイクル（Ｃｔ）値を図式した。磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）から回収されたＤＮＡの臨界サイクル（Ｃｔ）値の減少はＳｉＨａ（左）およびＨｅＬａ（右）細胞株からの回収して追加したゲノムＤＮＡの量の関数で観察された。このような結果から磁性ナノワイヤは分析敏感度、定量正確度および再現性を大きく向上させ、ＤＮＡ捕獲および回収において適合することを確認した。特に、極めて低いレベルのＨＰＶ ＤＮＡを探知する際に、ＤＮＡの検出において効率がはるかに改善された。
２−３．子宮頸部の標本試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＣｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ システムを用いたＨＰＶ遺伝子型分析およびＤＮＡ捕集効率の比較
ＨＰＶ関連のがんの発病率が急速に増加しているので、ＨＰＶ遺伝子型、特に高危険ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のより敏感かつ具体的な検出戦略は疾病の診断および治療のための臨床に適用することができると判断して、子宮頸がんの患者の子宮頸部から採収された綿棒細胞試料（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）でＨＰＶ ＤＮＡの抽出効率を評価して、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、および１２種類の追加類型など様々なＨＰＶ遺伝子型を確認することで、上記の実施例１で製造した陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の臨床的な有用性を確認するようにして、その結果はＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔを用いて得た結果と比較された。より具体的に、上記の実施例１で製造した陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＦＤＡ承認されたＣｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶシステムのＤＮＡ捕集効率を比較するため、子宮頸部の標本試料（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）を無菌ＰＢＳで処理して、リアルタイムの重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を通じて増幅した後、多重ＨＰＶ遺伝子型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ）を分析した。国立がんセンター（高陽市、韓国）の子宮頸がん患者から、子宮頸部の綿棒標本試料を採収した。すべての検体を収集してＣｏｂａｓ ＰＣＲ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）に入れて４℃で検査を行うまで保管した。試料の多重ＨＰＶ遺伝子型分析のために、Ｃｏｂａｓ ｘ ４８０機器（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）およびＣｏｂａｓ ｚ ４８０ 分析機（ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲの分析を通じて、Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔを行った。Ｃｏｂａｓ ｘ ４８０を用いてＨＰＶ ＤＮＡを抽出するために、各試料（４００μｌ）をｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ試薬で段々温度を上げながら溶解させた。ＨＰＶ ＤＮＡは磁性ガラス粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｇｌａｓｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）と一緒に細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）で抽出および精製されて、溶離緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ；１５０ｕｌ）で溶出した。その後、溶離液（ｅｌｕａｔｅ；２５ｕｌ）を同じ体積のＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘに添加して、Ｃｏｂａｓ ｚ ４８０装備で増幅させた。同じく、陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、各試料（３００ｕｌ）でＨＰＶ ＤＮＡを抽出した。細胞溶解のために各試料（３００ｕｌ）にガラスビーズ（８０ｍｇ）を入れた後、即時、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ（５ｕｌ、０．０５ｍｇ／１００ｕｌ）を溶液に添加して１時間渦流（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）させた。ＨＰＶ ＤＮＡをｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（５８ｕｌ）で溶出させた後、溶出されたＤＮＡ（１３ｕｌ）を同じ体積のＣｏｂａｓ ＨＰＶ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと混合してＲｏｃｈｅ ＬＣ４８０装備で増幅させた。
その結果、図５ａに示すように、子宮頸がん患者の子宮頸部から綿棒で採取された細胞試料から、ＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を確認するために、磁性ナノワイヤおよびＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔを用いて比較した。Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ ＴｅｓｔはＦＤＡが承認したリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた、ＤＮＡ増幅キットとして多重ＨＰＶ遺伝子型の検出のために臨床敏感度、特異性および強力な再現性を提供する。磁性ナノワイヤを用いて子宮頸がん患者の子宮頸部の標本試料（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）のゲノムＤＮＡを回収して、液体ベース細胞培地でＤＮＡを収集した後、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎを用いてＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８および追加１２個の遺伝子型の存在を直接に確認した。分析敏感度は３つの種類のＨＰＶでＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ＨＰＶ Ｔｅｓｔの分析敏感度の結果と比較して決定された。特に、ＨＰＶ ＤＮＡは磁性ナノワイヤおよびＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔ、すべてで優れた相関関係をみせた。また、Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔで得た結果と比較した際に、磁性ナノワイヤで抽出したＤＮＡは標的遺伝子の臨界サイクル（Ｃｔ）値が有意に低かった。場合によって、磁性ナノワイヤとＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔの間の平均臨界サイクル（Ｃｔ）値は試料の標的ＤＮＡ量に約２５６倍の差があることを示す８周期の差を示した。
また、図５ｂに示すように、上記の図５ａのＰ４患者に対する子宮頸部の標本試料から回収されたＤＮＡの増幅を代表的に図式した。より具体的に、これは本発明の陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、ＨＰＶ ＤＮＡの優れた回収および標的遺伝子特異的な信号の増幅が生成されたことを確認した。しかし、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）がない磁性ナノワイヤでは遺伝子の増幅が現れなく、ＨＰＶ ＤＮＡの検出が得られなかった（緑色）。このような結果は子宮頸部から綿棒で採取された細胞試料で陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）がＨＰＶ ＤＮＡの高効率な捕集および分析が可能であり、Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔに比べてより高い敏感度と特異性を有するＨＰＶ ＤＮＡの多重遺伝子型を効率的に捕集、回収および分析することができることを示す。したがって、本発明の磁性ナノワイヤはＨＰＶ関連のがんの早期発見および治療に意味のある結果を提供して、ＨＰＶ関連のがん患者の診断および治療の効能を向上させることができる。
実施例３．尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の効率評価
３−１．尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ捕集および回収の効率評価
図６に図式した尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ捕集および回収効率を評価するために、上記の実施例１に記載するように、陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を製造して、この際に、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が導入されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の分子量を８００または２５０００Ｄａでそれぞれ異なるようにして、常温で１時間ストレプトアビジンが標識されたナノワイヤに添加した。尿試料は国立がんセンター（ＮＣＣ）の臨床試験審査委員会の承認手続きによりＨＰＶ陽性患者（ＨＰＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔ）３０人と健康な志願者５人を対象で尿試料を採取した。収集された尿試料は使用する前までに−２０℃で保管した。生体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）ＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＨｅＬａ）細胞またはＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＳｉＨａ）細胞から知られた一定量のゲノムＤＮＡをＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅ尿試料で０．０１ないし１，０００ｎｇ／ｍｌ範囲の濃度で混合（ｓｐｉｋｅ）した。続いて、ゲノムＤＮＡを含む尿試料３００ｕｌに陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）０．５ｍｇ／ｍｌを添加して、様々な時間（１０分、３０分、６０分または９０分）の間、１，０００ｒｐｍで攪拌した。その後、上記の攪拌された溶液を３０分間マグネティックラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）に置いた後、結合されなかったり、または非特異的に結合した成分を分離して磁性ナノワイヤに付着されたＤＮＡを捕獲した。その後、捕獲されたＤＮＡを常温で様々な時間（１０分、３０分、６０分、または９０分）の間、最大速度２，５００ｒｐｍで攪拌（ｓｈａｋｉｎｇ）した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ １０．０）で溶出させた。捕集および回収されたＤＮＡを製造社の指示に従いＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析法で定量化した。
その結果、図７ａおよび図７ｂに図式するように、ＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＨｅＬａ）細胞またはＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＳｉＨａ）細胞をＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅ尿試料に混合して、それぞれ異なる分子量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ ８００Ｄａまたは２５ｋＤａ）が接合された磁性ナノワイヤの能力を検証した。添加したｇＤＮＡの濃度の範囲により２５ｋＤａのＰＥＩで標識された磁性ナノワイヤを用いて９０％以上の高い捕集および回収の効率で、ＤＮＡの回収が可能であることを確認した。一方、低分子量のＰＥＩ（８００Ｄａ）と接合された磁性ナノワイヤの効率はｇＤＮＡの濃度が増加することに従い顕著に減少した。したがって、より高い分子量（２５ｋＤａ）が導入されたＰＥＩが低分子量が導入されたＰＥＩ（８００Ｄａ）よりＤＮＡ分子とより良い結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）および凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）の能力を示すことを確認した。これは静電気の相互作用（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によるＤＮＡ−ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ複合体の形成がＰＥＩの分子量に依存することを示す。
また、図７ｃおよび図７ｄに図式するように、ＨＰＶ１８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＨｅＬａ）細胞またはＨＰＶ１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ＳｉＨａ）をＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅ尿試料に混合して、それぞれ異なる時間で反応させた結果、反応時間が長いほど捕集および回収の効率がより高いことを確認した。より具体的にＤＮＡ捕集および回収の効率はポリエチレンイミンが表面に接合された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）が２５ｋＤａ ＰＥＩを用いて６０分以上反応させた際に、向上された。上記の結果から、ＤＮＡ回収の効率および安定性を向上させる条件を確認することができた。
３−２．尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）の評価
尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出限界（ＬＯＤ）を評価するために、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でＨｅＬａ（ＨＰＶ１８、１０ないし５０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）またはＳｉＨａ（ＨＰＶ１６、１ないし２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）細胞株から一定量のゲノムＤＮＡをそれぞれのＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅ尿試料に混合（ｓｐｉｋｅ）した。その後、各試料にポリエチレンイミンが表面に接合された磁性ナノワイヤ０．５ｍｇ／ｍｌを添加して、常温で１時間、１，０００ｒｐｍで攪拌（ｓｈａｋｅｉｎｇ）して、ＨＰＶ ＤＮＡは核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ）がない水で溶離させた。最後に、回収されたＤＮＡを同量のＣｏｂａｓ ＨＰＶ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと混合して、Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０装備で増幅させた。
その結果、図８に図示するように、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でＨｅＬａ（ＨＰＶ１８、１０ないし５０ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）またはＳｉＨａ（ＨＰＶ１６、１ないし２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）細胞株から一定量のゲノムＤＮＡをそれぞれのＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅ尿試料に混合した結果、様々な濃度で検出限界（ＬＯＤ）を確認した。尿試料の内の陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の検出限界はＨＰＶ１６の場合、１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＨＰＶ１８の場合、３０ｃｅｌｌｓ／ｍｌで現れた。
３−３．尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いたＨＰＶ ＤＮＡの回収
陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）０．５ｍｇ／ｍｌおよびＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡａｍｐ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｋｉｔ Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造社の指示に従いＨＰＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅおよびＨＰＶ−ｎｅｇａｔｉｖｅ尿試料３００ｕｌでｃｆＤＮＡを回収した。尿で溶出されたｃｆＤＮＡの収率はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光分析法および直接的な定量化、視覚化のためのゲル電気泳動分析で行われた。続いて、溶出されたＤＮＡ１３ｕｌの検出および遺伝子型分析のために、Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ Ｔｅｓｔを用いて同一な体積のＣｏｂａｓ ＨＰＶ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｒｅａｇｅｎｔと標的（ｔａｒｇｅｔ）ＨＰＶ ＤＮＡを増幅させた。本発明の磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の分析的および臨床的な効率は尿ベースＨＰＶ ＤＮＡの検出から確認された。総２７個のＨＰＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ患者の尿試料または綿棒で採取された子宮頸部の細胞試料を対象に分析した。
その結果、図９ａに図式するように、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ（黒いバー）またはＱｉａｇｅｎキット（赤いバー）を用いて子宮頸がん患者１０人の尿試料から回収されたｃｆＤＮＡ濃度を測定したら、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷを用いて尿試料で得たｃｆＤＮＡ総量はＱｉａｇｅｎキットを用いて得たものより約４倍高かった。より具体的に、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷまたはＱｉａｇｅｎキットに尿試料を適用して、ＨＰＶ ＤＮＡを効率的に分離して遺伝子型プロファイルを明らかにし、２７個のＨＰＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ検体の中で、２６個の検体（９６％）でＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷを用いてＨＰＶ ＤＮＡを確認した。一方、Ｑｉａｇｅｎキットで抽出したＨＰＶ ＤＮＡは１６個の検体（５９％）で検出された。また、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷｓにより回収されたＨＰＶ ＤＮＡはＱｉａｇｅｎキットにより回収されたＨＰＶ ＤＮＡよりはるかに低い臨界サイクル（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；Ｃｔ）値を示した。これはＤＮＡ回収および無欠性において本発明の磁性ナノワイヤの高い性能を強力に示唆する。
また、図９ｂに図式するように、溶出されたｃｆＤＮＡがＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）と密接な関連があることが分かった。子宮頸がん患者のＨＰＶ遺伝子型分析プロファイルは綿棒で採取された子宮頸部の細胞試料を用いて行われて、高危険ＨＰＶ類型（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびその他１２種類のタイプ）のＲｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ テストを行って確認された。より具体的に、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷｓを用いて、尿試料から回収されたＤＮＡが綿棒で採取された子宮頸部の細胞試料で得たものと同様に、ＨＰＶ遺伝子型で類似な分布を示すことを確認した。
上記の結果、本発明の磁性ナノワイヤの長い形態が生体活性を維持しながら、ＨＰＶ ＤＮＡと多くの相互作用をすることができるようにして、露出期間および頻度が増加するため、尿試料から標的ＨＰＶ配列の全体収率が顕著に向上された。鉛筆の模様のナノワイヤは表面対体積比が大きく、尿に存在する複合的な構成成分を通じ自由に移動することができるため、ＨＰＶ ＤＮＡに優先的に結合することができる。
３−４．尿試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いたがん患者または健康な対照群のＨＰＶ遺伝子型分布パターンの評価
がん患者または健康な対照群の尿試料でＨＰＶ遺伝子型分布パターンを確認して、その結果を綿棒で採取した子宮頸部の細胞試料の結果と比較することで、尿ベースＨＰＶ検出の臨床的な性能を調べようとした。ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷを用いて健康な対照群と子宮頸がん患者の総３５個の尿試料（３０ ＨＰＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅおよび５ ＨＰＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ試料）から抽出したｃｆＤＮＡの量を比較した。
その結果、図１０ａに示すように、ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷを用いて健康な対照群と子宮頸がん患者の尿試料で回収されたｃｆＤＮＡの濃度を測定した結果、健康な対照群またはがん患者から溶出されたｃｆＤＮＡの濃度に大きな差がないことを確認した。
また、図１０ｂおよび図１０ｃに示すように、綿棒で採取した子宮頸部の細胞試料または３００ｕｌの尿試料の一対で類型特異的ＨＰＶ検出をさらに調べた結果、少量の尿試料３００ｕｌを用いても、尿試料および子宮頸部の細胞試料の間にＨＰＶ類型検出が８３％ではるかに高い一致性をみせた。このような結果は尿ベースのＨＰＶ選別検査（スクリーニング）でＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷの使用がＨＰＶ ＤＮＡの様々な高危険遺伝子型の回収、同定および分析に相当に有利であることを示唆する。
上記の結果から、子宮頸がん患者の尿試料で循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ｃｆＤＮＡを回収して、本発明の磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷｓ）の機能を成功的に評価した後、類型別ＨＰＶ ＤＮＡを確認して検出することで、臨床的な有用性を立証した。ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷｓベースのＨＰＶ ＤＮＡ分離および検出戦略は大規模の臨床試験で子宮頸がんの臨床的な選別検査および診断のための開発および評価において、他の尿ベース方法より高い感度および正確性をもとに、費用効率的であり、広く活用できる技術として判断される。
実施例４．血漿または脳脊髄液の試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の効率評価
４−１．陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）のＤＮＡ検出効率の評価
上記の実施例１に記載された陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を製造して、血漿内のｃｆＤＮＡを効果的に検出しようとした。ｌｏｗ−ｒａｎｇｅ（１０ないし１００ｂｐ）、ｍｉｄｄｌｅ−ｒａｎｇｅ（１００ないし２０００ｂｐ）、またはｈｉｇｈ−ｒａｎｇｅ（３．５ないし２１ｋｂ）ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒｓを健康なヒトの血漿（ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ）に濃度別に混合（ｓｐｉｋｅ）させた。
その結果、図１１ａに示すように、本発明の磁性ナノワイヤを用いて抽出されたｃｆＤＮＡの大きさ別の検出効率を確認した結果、ＤＮＡ濃度に関係なく高い効率で血漿内の循環する小さい断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の腫瘍由来ｃｆＤＮＡの抽出が可能であることを確認した。
４−２．陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体の長さによるＤＮＡ捕集および回収の効率評価
陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の長さによるＤＮＡ検出効率を評価するために、磁性ナノ粒子、７ｕｍおよび１６ｕｍの長さで磁性ナノワイヤを製作した。
その結果、図１１ｂに示すように、磁性ナノワイヤの長さが長いほど血漿内の循環する小さい断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の腫瘍由来ｃｆＤＮＡの抽出が有利であることを確認した。
４−３．陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔとのＤＮＡ検出効率の比較
陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）および最も一般的に用いられているＱｉａｇｅｎ ｋｉｔとのＤＮＡ検出効率を比較するために、血漿からｃｆＤＮＡの付着／回収の効率を比較した。健康なヒトの血漿にｌｏｗ−ｒａｎｇｅ（１０ないし１００ｂｐ）、ｍｉｄｄｌｅ−ｒａｎｇｅ（１００ないし２０００ｂｐ）、ｈｉｇｈ−ｒａｎｇｅ（３．５ないし２１ｋｂ）ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒｓを混合（ｓｐｉｋｅ）した。また、ｃｆＤＮＡの大きさ別の検出効率をゲル電気泳動（ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行って分析した。
その結果、図１１ｃに示すように、本発明の磁性ナノワイヤのｃｆＤＮＡ検出効率が商業的な製品よりもはるかに高いことを確認したし、また、図１１ｄに図示するように、本発明の磁性ナノワイヤがＱｉａｇｅｎ ｋｉｔよりはるかに高い回収効率を示して、これを通じて、血漿内の循環する小さな断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の腫瘍由来のｃｆＤＮＡ抽出において非常に有利であると期待される。
４−４．乳がんまたは肺がん患者の血漿試料から陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔとのＤＮＡ検出効率の比較
本発明の磁性ナノワイヤベースｃｆＤＮＡの検出能力を評価するために、乳がんまたは肺がん患者の血漿試料から陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔとのＤＮＡ検出効率を比較した。
その結果、図１１ｅに示すように、ほとんどの患者群で本発明の磁性ナノワイヤのｃｆＤＮＡ検出効率が商業的な製品よりはるかに高いことを確認した。
４−５．肺がん患者の血漿試料から陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔで回収されたＤＮＡ変異の確認
肺がん患者の血漿試料から陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔで回収されたＤＮＡの変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を確認するために、検出されたｃｆＤＮＡの変異をｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて確認した。
その結果、図１１ｆに示すように、血漿内の循環するほとんどのがんと関連するｃｆＤＮＡの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）は２００ｂｐ以下だと知られているので、磁性ナノワイヤを通じた腫瘍関連のｃｆＤＮＡの抽出効能は商業的なキットよりはるかな能力をみせるので、がん組織と一致する変異結果を確認した。
特に、１０人の肺がん患者の血漿を通じて、本発明の磁性ナノワイヤおよびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いる方法でｃｆＤＮＡを抽出した後、ｄｄＰＣＲで証明した結果、５人のＥＧＦＲ ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８５８Ｒの変異を有する患者の血漿では磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）およびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔですべてがん組織と一致する変異を発見した。
また、磁性ナノワイヤ（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）を用いて、３００ｕｌの患者血漿（ｐｌａｓｍａ）のみを用いたときにも、１ｍｌを用いたＱｉａｇｅｎ ｋｉｔと同じ変異が確認された。特に本発明の磁性ナノワイヤを用いた場合、Ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡに比べてＷｉｌｄｔｙｐｅ ＤＮＡが相対的にはるかに低いことを確認して、本発明の磁性ナノワイヤは血漿内の循環する小さな断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ抽出に非常に有利であることと期待される。
以外にも、残りの５人の肺がん患者群、つまりＥＧＦＲ ｅｘｏｎ １９ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎを有する患者の血漿でも本発明の磁性ナノワイヤおよびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いて、同一にｃｆＤＮＡを抽出した。磁性ナノワイヤを通じて検出されたｃｆＤＮＡをｄｄＰＣＲで確認した結果５人の患者の中で４人からがん組織と一致する変異を発見したが、Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔで確認した結果５人のすべてで変異が発見されなかった。磁性ナノワイヤは低い量の血漿、つまり３００ｕｌの血漿でもがん組織と一致度が高いｃｆＤＮＡの検出効率をみせた。
また、図１１ｇに示すように、肺がん患者の血漿で磁性ナノワイヤおよびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてｃｆＤＮＡを抽出した後、ｄｄＰＣＲを通して検出した後、ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ １９ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎを有する肺がん患者の血漿で検出したｃｆＤＮＡを増幅した結果、Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔを通して検出されたｃｆＤＮＡには多くの量のｗｉｌｄｔｙｐｅ ＤＮＡが存在するが、ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡは確認されなかった。一方、磁性ナノワイヤを通じた患者の血漿でｃｆＤＮＡを検出した結果、多くの量のｗｉｌｄｔｙｐｅ ＤＮＡが存在しなかったが、ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡが明確にみえることを確認した。
また、図１１ｈに示すように、肺がん患者の血漿で磁性ナノワイヤおよびＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いてｃｆＤＮＡを抽出した後、ｄｄＰＣＲを通じ検出した後、ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８５８Ｒ ｍｕｔａｉｏｎを有する肺がん患者の血漿で検出したｃｆＤＮＡを増幅した結果、Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔを通じて検出されたｃｆＤＮＡには多くの量のｗｉｌｄｔｙｐｅ ＤＮＡが存在した。一方、磁性ナノワイヤを通じて検出されたｃｆＤＮＡには多くの量のｗｉｌｄｔｙｐｅ ＤＮＡが存在しなかったが、Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔと類似なレベルのｍｕｔａｎｔ ＤＮＡが存在することを確認した。この際に、磁性ナノワイヤは３００ｕｌの血漿でｃｆＤＮＡを抽出したのに比べて、Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔは１ｍｌの血漿を用いた。
４−６．脳脊髄液の試料での陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）の効率評価
上記の実施例４−５に記載された方法を用いて、肺がん患者の血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料から陽イオン性高分子で表面処理された磁性ナノ構造体（ＰＥＩ／ｍＰｐｙ ＮＷ）で回収されたＤＮＡの変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を確認するために、検出されたｃｆＤＮＡの変異をｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて確認した。その結果、図１１ｉに示すように本発明の磁性ナノワイヤを通じ肺がん患者の血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）から検出したｃｆＤＮＡとがん組織の遺伝子変異を比較した結果、９人の患者の体液から検出されたｃｆＤＮＡを通じた遺伝子変異検査はがん組織と一致することと確認された。
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有するものは本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更しなくて他の具体的な形態に容易に変形できることを理解することが可能だろう。したがって、以上で技術した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。

Claims (11)

  1. 磁性ナノ粒子およびビオチンが搭載された導電性高分子、ならびにビオチンが導入された陽イオン性高分子、を含むセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体として、上記の磁性ナノ構造体はワイヤ形状であって、上記の陽イオン性高分子がビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を通して磁性ナノ構造体の表面に接合されることを特徴とする、セルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体。
  2. 上記の陽イオン性高分子はポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）であることを特徴とする、請求項１に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体。
  3. 上記の導電性高分子はポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）またはこれの誘導体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体。
  4. 上記の導電性高分子の中に磁性ナノ粒子が埋めたてられていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体。
  5. 上記のセルフリーＤＮＡはｐＨの変化により上記の磁性ナノ構造体から分離されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体。
  6. （１）請求項１〜５のいずれか１項に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を個体試料に処理するステップ；
    （２）上記の試料に含まれたセルフリーＤＮＡが上記の磁性ナノ構造体に付着されるステップ；
    （３）上記の個体試料から上記のセルフリーＤＮＡが付着された磁性ナノ構造体を分離するステップ；および
    （４）上記のセルフリーＤＮＡが付着された上記の（３）ステップの磁性ナノ構造体からｐＨの変化により上記のセルフリーＤＮＡを分離させるステップを含む、セルフリーＤＮＡ検出および回収方法。
  7. 上記の試料は尿、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ；ＣＳＦ）、血漿、血液、または体液であることを特徴とする、請求項６に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収方法。
  8. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を有効成分として含むがんの診断用の組成物。
  9. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を含むがんの診断キット。
  10. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のセルフリーＤＮＡ検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いて、生物学的な試料から、ＤＮＡを抽出または分離して分析するステップを含む、がんの発病または予後を診断するための情報提供方法。
  11. 上記の分析は前記生物学的な試料の中のＤＮＡの濃度、コピーの数または塩基配列を分析して遺伝子変異の可否を確認することを特徴とする、請求項１０に記載の情報提供方法。
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