KR102453872B1 - 생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법 - Google Patents

생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 비드 복합체에 의하면, 생물학적 샘플 내에서 효과적으로 표적 핵산 분자를 분리, 추출, 및 검출할 수 있고, 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하는지의 여부를 분석함으로써, 분석의 민감도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법{BEAD COMPLEX FOR DETECTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHOD OF DETECTING NUCLEIC ACID USING THE SAME}
생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
검체 내 핵산을 추출하는 방식은 크게 컬럼(Column) 방식과 자성 비드(Magnetic Bead)를 이용한 방식으로 나뉜다. 컬럼을 이용한 정제는 검체 내 존재하는 세포를 용해(Lysis) 한 이후 컬럼을 이용하여 포집한 후, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 검사하는 방식이다. 자성 비드를 이용한 정제는 자성 비드의 표면전하를 이용하여 핵산과 전하-전하 상호작용(charge-charge interaction)을 통해 원하는 핵산을 포집 및 정제하는 방식이다. 하지만 이러한 방식들은 검체 내에 다양한 단백질이나 inhibitor 또는 genomic DNA, RNA 또한 비특이적으로 포집하기 때문에 추가적인 정제과정이 필요하다. 또한 다양한 inhibitor로 인하여 PCR 반응을 수행하여도 정확도가 낮은 편이다.
예를 들어, 자궁경부암(cervical cancer)을 일으키는 주요 병원체인 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV)를 진단할 때, 현재 검진하는 방식은 자궁경부에 면봉을 넣어 세포를 채취한 뒤 염색을 통하여 암세포의 유무를 관찰하는 세포진(cytodiagnosis) 검사가 주로 이루어지고 있다. 하지만 이러한 세포진검사의 경우 민감도가 50-70%로 다소 낮아, 이를 보완하기 위해 추가적으로 HPV 유전자 검사를 실시하여 자궁경부 세포 내에서 HPV 바이러스의 존재 유무를 판별한다. HPV 검사가 양성이라면 세포진검사의 결과가 음성이라도 자궁경부암 확률이 높기 때문에 현재는 추가적으로 PCR 검사를 많이 사용하고 있다.
현재 HPV 검진에 사용되는 방법은 크게 2가지로 팹 테스트(pap smear test), pad 형 검출 방법이 있다. 팹 테스트는 자궁경부에 면봉을 넣어 세포를 채취하여 PCR 반응을 통해 HPV 바이러스 유무를 확인하는 방법이다. Pad 형 검출 방법은 패드를 착용하여 분비물 내 HPV 바이러스를 채취하여 PCR로 HPV 바이러스 유무를 확인하는 방법이다.
팹 테스트의 경우, 침습적이고 전문 의료진이 있어야 검출할 수 있다는 단점이 있다. Pad 형 검출 방법은 검사하기 전 24-72 시간 전부터 샤워나 질 세척이 불가능하고 오랜 시간 동안 패드를 착용하는 단점이 있다. 따라서 소변(Urine) 내에 존재하는 DNA나 RNA를 검출하여 HPV 바이러스 존재 유무를 알아낼 수 있다면, 기존의 검사방법이 가진 단점을 충분히 보완할 수 있으며, 상대적으로 짧은 시간 내에 HPV 감염 여부를 확인할 수 있다. 하지만 소변 내에는 다양한 inhibitors와 단백질, DNA, RNA가 존재하는데 소변의 양에 비해 극소량이다. 현재 사용중인 컬럼을 이용한 정제방법과 자성 비드를 이용한 정제방법은 소변 내 모든 전하를 가진 물질을 정제하는 방식이다. 따라서, 의도하였던 핵산 이외에 다른 이물질이 같이 분리되므로, PCR 반응의 정확도가 떨어질 뿐만 아니라, 추가적인 정제 과정이 요구되며, PCR 반응의 민감도(specificity)가 저하되는 문제가 있다.
일 양상은 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 특이적으로 포집 및 정제하여 효과적으로 검출할 수 있는 비드 복합체를 제공하고자 하는 것이다.
다른 양상은 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 특이적으로 포집 및 정제하여 효과적으로 검출할 수 있는 비드 복합체의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
또 다른 양상은 비드 복합체를 이용하여 소변을 포함한 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
일 양상은 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드의 일 말단이 비드 표면에 축합(conjugation)한 비드 복합체로써, 상기 비드의 표면과 상기 올리고-뉴클레오타이드 사이가 하기 화학식 1의 구조로 결합되어 있는 비드 복합체일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112022040511155-pat00001
,
상기 식에서 X는 수소 또는
Figure 112022040511155-pat00002
이고, 적어도 하나의 X는
Figure 112022040511155-pat00003
이고,
상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 R2는 및 R3는 각각 독립적으로 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 n은 적어도 1 이상의 정수, 예를 들면, 1 내지 100,000, 1 내지 10,000, 1 내지 1,000, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10의 정수이고,
R1 왼쪽의 별표는 나노 비드 표면에 연결되는 부위를 나타내고, R3 오른쪽의 별표는 올리고-뉴클레오타이드의 말단에 연결되는 부위를 나타낸다.
화학식 1에서 R1은 직접 결합이거나, C1-C20 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기로 구성되는 군에서 선택되는 지방족 탄화수소기일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 화학식 1의 R1을 구성하는 지방족 탄화수소기는 C1-C10 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 화학식 1에서 R2 및 R3는 각각 독립적으로 C2-C20 알킬렌기(alkylene group), 예를 들어 C2-10 알킬렌기 또는 C5-10 알킬렌기 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 R2는 C2-C10 알킬렌기일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 비드는 무기 소재로 이루어질 수 있다.
상기 무기 소재는 산화철, 실리카, 금, 은, 구리 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 비드는 유기 소재로 이루어질 수 있다.
상기 유기 소재는 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 플루란, 플루란 아세테이트, 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 키토산, 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 비드는 자성화된 비드일 수 있다.
상기 비드는 직경 0.1 - 100 μm, 바람직하게는 0.2 - 10 μm, 더욱 바람직하게는 0.4 - 1 μm일 수 있다.
상기 자성화된 비드의 자성화 수치는 0.1 - 1,000 emu/g, 바람직하게는 1 - 100 emu/g, 더욱 바람직하게는 5 - 10 emu/g일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 비드는 그 형태에 있어서 제한이 없으며, 예를 들어, 구형, 로드형(막대형), 와이어형(선형), 평면형, 무정형 등 어떠한 형태라도 가능하다.
일 실시예에 있어서, 상기 비드는 아미노기, 티올기, 알데하이드기, 카르복시기, 하이드록시기, 말레이미드기 또는 C2-C10 알케닐기로 개질된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 축합은 아마이드 결합, 포름아마이드 결합, 에스테르 결합, 티오에스테르 결합, 다이설파이드 결합, 에테르 결합 및 글리코사이드 결합 중에서 선택되는 어느 하나의 결합을 통해 축합 될 수 있다.
상기 표적 핵산 분자는 암세포 또는 병원체에서 유래할 수 있으며, DNA 또는 RNA 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 병원체는 병원성 바이러스 및 병원성 박테리아를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 병원성 바이러스는 EBV(Epstein-Barr virus), HAV(hepatitis A virus), HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus), HDV(hepatitis Dvirus), HEV(hepatitis E virus), 한탄바이러스(Hantaan virus), CMV(cytomegalovirus), HIV(human immunodeficiency virus), 독감 바이러스(influenza virus), HPV(human papilloma virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 에볼라 바이러스(ebola virus), 로타바이러스(rotavirus), 댕기열바이러스(dengue virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열바이러스(yellow fever virus), 아데노바이러스(adenovirus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), BK 바이러스(BK virus), 천 연두 바이러스(smallpox virus), 지카 바이러스(Zika virus), 중증열성혈소판감소증후근 바이러스 (SFTS virus) 및 HSV(herpes simplex virus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 병원성 박테리아는 폐렴막대균(Klebsiella penumoniae), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii),　녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터(Enterobacter spp.), 살모넬라균(salmonella), 이질균(shigella), 리케차(R. rickettsii), 대장균(E. coli), 콜레라균(V. cholerae), 페스트균(Y. pestis), 임질구균(N. gonorrhoeae), 수막염균(N. meningitidis), 나선상균(spirochaeta), 포도상구균(staphylococcus), 연쇄상구균(streptococcus),　폐렴균(pneumococcus), 나병균(M. leprae), 디프테리아균(C. diphtheriae), 파상풍균(C. tetani), 탄저균(B. anthracis), 방선균(actinobacteria) 및 고초균(B. subtilis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 고형암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 암은 췌장암 또는 자궁경부암일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수구성백혈병(acute myeloid leukemia), 급성림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성단구성백혈병(acute monocytic leukemia), 호지킨림프종(Hodgkin's lymphoma), 또는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 표적 핵산 분자는 암의 발병 여부 또는 병원체 관련 질환의 감염 여부를 나타내는 마커로서의 핵산 분자일 수 있다. 일례로, 암 또는 종양은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 피부암, 췌장암, 전립선암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 선택적인 측면에서, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 종양 항원 또는 이의 단편, 이들의 변이체 또는 유도체인 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자일 수 있다.
일례로, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-코엔자임 A 라세메이즈, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, 칼레티쿨린(calreticulin), CAMEL, CASP-8/m, 카뎁신 B(cathepsin B), 카뎁신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신-유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEKCAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-L1, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미숙 라미닌 수용체, 칼리크레인(kallikrein)-2, 크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈(mammaglobin) A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 기질 단백질(matrix protein) 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린(mesothelin), MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 클래스 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, 네오-PAP, 네오-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로테이나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 및 림프성 혈구의 면역글로불린 유전자형 또는 림프구 혈구의 T 세포 수용체 유전자형, 이들의 단편, 이들의 변이체 또는 이들의 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 전사체(transcript) 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 표적 핵산 분자는 무세포 핵산(Cell free DNA, cfDNA)일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "cfDNA"는 세포핵 안에 존재하지 않고 혈액에 떠돌아다니는 DNA의 조각을 의미한다. 상기 cfDNA는 암세포 또는 병원체에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 혈액, 혈장 또는 소변 등과 같은 체액에서는 종양 세포 또는 병원체에서 유래된 cfDNA를 발견할 수 있다.
상기 올리고-뉴클레오타이드는 5' 말단 또는 3' 말단이 티올기로 개질된 것일 수 있으며, 티올기를 통하여 상기 비드의 말레이미드기와 결합할 수 있다.
상기 올리고-뉴클레오타이드는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
상기 올리고-뉴클레오타이드는 프라이머일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오타이드로부터 폴리뉴클레오타이드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 무세포 핵산과 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
다른 양상은 (a) 하기 화학식 2로 표시되는 에폭시기가 표면에 연결된 비드와 폴리에틸렌이민(PEI)을 반응시켜, 상기 비드의 표면을 아미노기가 개질된 하기 화학식 3의 구조로 변형시키는 단계;
(b) 아미노기가 개질된 하기 화학식 3의 구조를 갖는 비드와 하기 화학식 4의 카르복실산을 반응시켜, 상기 비드의 표면을 말레이미드기가 개질된 하기 화학식 5의 구조로 변형시키는 단계; 및
(c) 말레이미드기가 개질된 하기 화학식 5의 구조를 갖는 비드와 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하며, 말단이 하기 화학식 6의 지방족 티올로 변형된 올리고-뉴클레오타이드를 반응시켜 축합시키는 단계를 포함하는 비드 복합체를 제조하는 방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112022040511155-pat00004
,
[화학식 3]
Figure 112022040511155-pat00005
,
[화학식 4]
Figure 112022040511155-pat00006
,
[화학식 5]
Figure 112022040511155-pat00007
,
상기 화학식 5에서 Y는 수소 또는
Figure 112022040511155-pat00008
이고, 적어도 하나의 Y는
Figure 112022040511155-pat00009
이고,
[화학식 6]
Figure 112022040511155-pat00010
,
상기 화학식 2 내지 화학식 6에서, R1, R2, R3, n 및 별표는 각각 청구항 제1항에서 정의된 것과 동일하다.
일 실시예에 있어서, 단계(a)의 상기 PEI는 에폭시기가 표면에 연결된 비드 1중량부에 대하여 0.1 내지 1.5 중량부, 바람직하게는 0.3 내지 1.2 중량부, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.0 중량부로 혼합되어 반응될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 단계(a)는 12-24시간 수행될 수 있다.
상기 PEI는 1,000 내지 100,000, 바람직하게는 10,000 내지 70,000, 더욱 바람직하게는 20,000 내지 50,000의 분자량을 가질 수 있다.
상기 PEI는 선형 또는 분지된 PEI일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 화학식 4의 카르복실산에는 특별한 제한이 없으며, 3-말레이미도프로판산, 6-말레이미도헥산산, 11-말레이미도운데칸산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 화학식 4의 카르복실산은 6-말레이미도헥산산일 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 비드 복합체를 포함하는, 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하는 키트를 제공한다.
상기 생물학적 샘플은 소변(urine), 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 키트는 상기 비드 복합체를 구성하는 상기 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 중합 반응용 완충 용액을 포함하는 핵산 증폭 키트, 전기영동 키트 또는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing) 키트일 수 있다.
상기 키트는 비드 복합체를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 증폭 반응용 완충액을 포함하는 핵산 증폭 키트일 수 있다.
상기 핵산 증폭 반응용 완충액은 비드 복합체 및 핵산 중합 효소 이외에도, 디옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP) 및/또는 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP), 핵산 증폭 반응에 따른 증폭 산물의 존재 여부를 검출할 수 있도록 형광 물질 및/또는 방사선 동위원소 등으로 표지된(labeled) 탐침(probe) 및 중합 효소 안정화제 등과 같은 기능성 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 중합 효소 안정화제는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이나, 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 다당류를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 중합 효소 안정화제의 함량은 0.01 내지 10%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 5%(w/v) 또는 0.5 내지 3%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다. 중합 효소 안정화제의 함량이 전술한 범위를 충족할 때, 핵산 증폭 반응이 효율적으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "중합 효소(polymerase)"는 일반적으로 중합 반응을 촉매하는 물질을 의미한다. 중합 효소는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 도입에 의해 주형 가닥과 쌍-형성된 핵산 프라이머를 연장시키는데 사용될 수 있다. 중합 효소는 포스포디에스테르 결합의 생성을 통해서 한번에 하나씩 주형 가닥에 부응하는 새로운 뉴클레오타이드를 첨가하여, 존재하는 뉴클레오타이드 사슬의 3' 말단을 연장시킴으로써 DNA의 새로운 가닥을 첨가할 수 있다.
이러한 핵산 중합 효소는 해당 중합 효소를 이용하여 표적 핵산 분자의 증폭 반응이 수행될 수 있다면, 특별히 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 중합 효소는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 열안정성 중합 효소, 야생형 중합 효소 및 변형 중합 효소를 포함한다. 보다 구체적으로, 중합 효소는 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 박테리오파아지 T7 DNA 중합 효소, 박테리오파지 T4 DNA 중합 효소, 029 (phi29) DNA 중합 효소제, Taq 중합 효소, Tth 중합 효소, Tli 중합 효소, Pfu 중합 효소, Pwo 중합 효소, VENT 중합 효소, DEEPVENT 중합 효소, EXTaq 중합 효소, LA-Taq 중합 효소, Sso 중합 효소, Poc 중합 효소, Pab 중합 효소, Mth 중합 효소, ES4 중합 효소, Tru 중합 효소, Tac 중합 효소, Tne 중합 효소, Tma 중합 효소, Tea 중합 효소, Tih 중합 효소, Tfi 중합 효소, 플래티늄 Taq 중합 효소, Tbr 중합 효소, Tfl 중합 효소, Pfutubo 중합 효소, Pyrobest 중합 효소, Pwo 중합 효소, KOD 중합 효소, Bst 중합 효소, Sac 중합 효소, 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합 효소, 및 이의 변이체 및 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 중합 효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소로써, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 및/또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 핵산 증폭 반응용 완충액에 중합 효소와, dNTP 및/또는 NTP는 프리믹스(premix) 형태로 상용화된 것을 사용할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 핵산 중합 효소와 dNTP (및/또는 NTP)는 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 10 내지 33%(w/v) 또는 15 내지 25%(w/v)의 함량으로 포함될 수 있다.
핵산 증폭 반응용 완충액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및/또는 NTP 혼합물(ATP, CTP, GTP, TTP), 기타 핵산 증폭 반응 첨가제 및 핵산 중합효소 조인자를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응을 수행할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dNTP를 원하는 증폭 반응이 달성될 수 있을 정도로 반응액에 공급될 수 있다.
예를 들어, 핵산 증폭 반응에서 어닐링(annealing)은 표적 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격한 조건 하에서 수행된다. 용어 어닐링 또는 프라이밍(priming)은 주형 핵산 분자에 올리고 뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 이에 따라 중합 효소가 뉴클레오타이드를 중합하여 주형 핵산 분자 또는 그 단편에서 상보적인 핵산 분자가 형성된다. 어닐링을 위한 엄격한 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 예시적인 측면에서 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 본 발명에 따른 비드 복합체(100)는 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 5 내지 30%(w/v) 또는 5 내지 20%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
필요한 경우, 핵산 증폭 반응용 완충액은 핵산 증폭 반응용 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 일례로, 핵산 증폭 반응용 첨가제는 만니톨(mannitol), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG 10,000), 트레할로오스, 베타인 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 이때, 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 상기 핵산 증폭 반응용 첨가제는 0.5 내지 30%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 20%(w/v) 또는 1 내지 15%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다.
핵산 증폭 반응용 완충액은 핵산 증폭 반응을 위한 적절한 완충제를 포함할 수 있다. 완충제의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(예를 들어, 트리스-EDTA), HEPES(Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic acid), 아미노산 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
증폭된 표적 핵산 분자는 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 예시적인 측면에서, 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 방출하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 표지 물질은 풀루오레세인(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다.
표적 핵산 분자를 증폭할 때, 올리고-뉴클레오타이드의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하고, 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행하면, 표적 핵산이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행할 때, P32 및/또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 본 발명에 따른 핵산 증폭 반응용 완충액에 첨가하여, 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
표지는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 수행될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 인광, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노-크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 신호(signal)을 제공한다
핵산 증폭 반응, 예를 들어 중합효소연쇄반응(PCR)과 관련하여, 표적 핵산 분자와 올리고-뉴클레오타이드 이중 사슬 분리를 위한 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 중합 반응(polymerization)은 올리고-뉴클레오타이드(122) 및 이에 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자의 조성 및 길이에 따라 적절하게 조정, 제어될 수 있다.
생물학적 샘플 내에 존재할 수 있는 표적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다면, 핵산 증폭 반응은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 핵산 증폭 반응은, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사 반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction), 멀티플렉스 PCR, 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 루프-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), 실시간 염기순서기반 증폭(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 다중 변위 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction, LCR), 헬리카제 의존형 증폭(Helicase Dependent Amplification, HDA), 분지-연장 증폭법(Ramification-extension Amplification Method, RAM), 전사 기반 증폭 시스템(in vitro transcription-based amplification system, TAS) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 비드 복합체(100)를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드(122)와 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하기 위한 분석 키트는 전기영동 키트 또는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 양상은 상기 비드 복합체를 생물학적 샘플과 반응시키는 단계;
상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산과 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 복합체를 분리하는 단계; 및
상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 생물학적 샘플은 소변, 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자가 DNA 형태인 경우, 생물학적 샘플과 비드 복합체가 반응하기 전에 생물학적 샘플 내의 핵산 분자를 단일 사슬 핵산 분자로 변형시킬 수 있다.
예를 들어, 단일 사슬 핵산 분자로의 변형은 생물학적 샘플에 열을 가하여 수행될 수 있고, 이 경우 열처리는 70 내지 100℃에서 2 내지 10분간 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
생물학적 샘플 내에는 표적 핵산 분자 이외에도, 다양한 비표적 핵산 분자가 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 비드 복합체의 외측에는 표적 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 올리고-뉴클레오타이드가 결합하고 있다. 따라서, 표적 핵산 분자가 존재하는 생물학적 샘플에 본 발명에 따른 비드 복합체를 반응시키면, 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자만이 본 발명에 따른 비드 복합체를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한다. 반면, 생물학적 샘플 내에 존재하는 비표적 핵산 분자들은 본 발명에 따른 비드 복합체에 결합하지 못하고, 생물학적 샘플 내에 자유 핵산 분자(free nucleic acid molecule)로 잔존한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 비드가 자성화된 비드로 이루어진 경우, 자석을 이용하여 표적 핵산과 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 복합체를 생물학적 샘플 내에 잔존하는 비표적 핵산 분자와 분리할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계는, 상기 올리고-뉴클레오타이드에 결합된 표적 핵산 분자를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중합효소연쇄반응과 관련하여, 표적 핵산 분자와 올리고-뉴클레오타이드 이중 사슬 분리를 위한 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 중합 반응(polymerization)은 올리고-뉴클레오타이드 및 이에 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자의 조성 및 길이에 따라 적절하게 조정, 제어될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "에폭시 비드"는 비드의 표면에 에폭시기가 연결된 비드를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "에폭시-PEI 비드"는 에폭시 비드와 폴리에틸렌이민(PEI)을 반응시켜 비드의 표면을 아미노기를 포함하는 PEI로 코팅한 비드를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "에폭시-PEI-말레이미드 비드"는 에폭시-PEI 비드 표면의 아미노기를 말레이미드기와 카르복실기를 양 끝에 가지고 있는 화합물의 카르복실기와 반응시켜 비드의 표면이 말레이미드기로 개질된 비드를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비드 복합체"는 에폭시-PEI-말레이미드 비드 및 하나의 말단이 상기 말레이미드기와 축합(conjugation)하여 상기 비드 표면에 결합하고, 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드” 또는 "핵산 분자"는 교환가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)를 지칭하고 DNA (예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 "뉴클레오타이드”는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체 (analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "엄격한 조건(stringent condition)에서 혼성화(hybridization)"은 2개의 단일 가닥 핵산 분자가 적어도 70%, 예를 들어 80% 이상 또는 90% 이상의 뉴클레오타이드가 상보적(complementary) 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 지칭한다.
예시적인 측면에서, 올리고-뉴클레오타이드는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 올리고-뉴클레오타이드를 구성하는 뉴클레오타이드가 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 올리고-뉴클레오타이드는 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자와 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있다. 이에 따라, 올리고-뉴클레오타이드에 특이적인 표적 핵산 분자를 높은 민감도로 분리, 정제할 수 있다.
일 양상에 따른 비드 복합체에 의하면, 생물학적 샘플 내에서 효과적으로 표적 핵산 분자를 분리, 추출, 및 검출할 수 있고, 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하는지의 여부를 분석함으로써, 분석의 민감도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1a 내지 도 1b은 구체예에 따른 비드 복합체의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 비드 복합체를 이용하여 생물학적 샘플 내 표적 핵산 분자를 포집하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3a 내지 도 3b는 구체예에 따른 비드 복합체의 평균 입자 크기를 측정한 결과이다.
도 4a 내지 도 4b는 구체예에 따른 비드의 표면전하 측정결과이다.
도 5a 내지 도 5b는 구체예에 따른 비드 복합체를 이용하여 cfDNA를 추출한 결과를 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 구체예에 따른 비드 복합체를 이용하여 cfDNA를 추출한 결과를 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 에폭시-PEI-말레이미드 비드 및 올리고뉴클레오타이드-비드 복합체의 제조
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 비드 합성과정을 나타내는 모식도를 나타낸다.
구체적으로, 에폭시 작용기가 표면에 연결된 비드(AccuNanoBeadTM Epoxy Magnetic Nanobeads, size 400 nm, Catalogue number (TA-1013-1), 바이오니아)를 10 mg/ml 농도로 증류수 3 ml에 분산시켰다. 분자량 25,000의 분지화 폴리에틸렌이민(PEI)을 10 mg/ml 농도로 증류수 2 ml에 용해시켰다. 에폭시기와 아미노기를 결합시키기 위해 PEI를 녹인 용액을 에폭시 비드에 점적한 후 12-24시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 비드(에폭시-PEI 비드)는 pH 5.5 MES buffer로 3번 세척 후 10 mg/ml 농도로 보관하였다.
비드 표면의 아민기와 6-maleimidohexanic acid의 carboxyl기의 carbodiimide 반응을 이용하여 결합시키기 위해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노　프로필　)카보디이미드(EDC),　N-하이드록시　숙신이미드(NHS)를 PEI의 1차 아미노기 100배의 몰당량만큼 4 ml의 pH 5.5 MES buffer에서 용해시켰다. 그 후 용액을 비드가 분산된 용액에 점적하여 12-24시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, MES buffer로 비드를 3번 세척 후, pH 7.4 100 mM tris buffer에 보관하였다.
반응이 완료된 비드(에폭시-PEI-말레이미드 비드) 표면의 말레이미드기와 올리고-뉴클레오타이드를 결합시키기 위해 5' 말단이 티올기로 치환된 올리고-뉴클레오타이드를 이용하였다. 구체적으로, 올리고-뉴클레오타이드는 HPV L1 부위에 특이적인 프라이머를 제작 후, 5' 말단에 티올기를 부여한 것을 사용하였다. 프라이머는 한국 코스모진텍에서 구입하여 사용하였고, 사용한 프라이머의 서열을 아래 표 1에 나타내었다.
프라이머 이름 뉴클레오티드 서열 서열번호
GP6-16 5ThioMC6-D/GAAAA ATAAA CTGTA AATCA TATTC 서열번호 1
GP6-50 5ThioMC6-D/GCAGT TAAGG TTATT TTGCA CAGTT GAAAA ATAAA CTGTA AATCA TATTC 서열번호 2
티올기로 치환된 올리고-뉴클레오타이드는 1 um 농도의 Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)가 녹아 있는 pH 7.4 Tris buffer에서 2시간 환원시켰다. 말레이미드기가 부여된 비드 10 mg과 티올기가 부여된 올리고-뉴클레오타이드 10 nM을 pH 7.4 tris buffer에서 12-24시간 실온 반응시켰다. 반응이 완료된 비드는 tris buffer로 3번 세척 후 10 mg/ml 농도로 pH 8.0 tris buffer에 보관하였다.
Epoxy Bead는 에폭시 작용기가 있는 비드를 의미하고,
PEI_Epoxy Bead는 Epoxy Bead에 폴리에틸렌이민이 결합한 비드를 의미하고,
Mal_PEI_Epoxy Bead는 PEI_Epoxy Bead에 말레이미드기가 개질된 비드를 의미하고,
GP6-16_Mal_PEI_Epoxy Bead는 Mal_PEI_Epoxy Bead에 GP6-16 프라이머가 결합한 비드를 의미하고,
GP6-50_Mal_PEI_Epoxy Bead는 Mal_PEI_Epoxy Bead에 GP6-50 프라이머가 결합한 비드를 의미한다.
비교예 1. NH 2 -말레이미드 비드 및 올리고뉴클레오타이드-비드 복합체의 제조
NH2-말레이미드 비드를 제조하기 위해, 아민 작용기가 표면에 연결된 비드(AccuNanoBeadTM NH2 Magnetic Nanobeads, size 400 nm, Catalogue number (TA-1011-1), 바이오니아)를 100 mg/ml의 농도로 100 mM MES buffer (pH 5.5) 1 ml에 분산시켰다. 비드 표면의 아민기와 6-maleimidohexanic acid의 carboxyl기의 carbodiimide 반응을 이용하여, 비드 표면을 변형시켰다. 구체적으로, 비드 표면에 아마이드 결합을 갖는 연결기로 1차 변형하기 위하여, EDC, NHS를 비드 표면에 연결된 아미노기 100배의 몰당량만큼 4 ml의 MES buffer에 용해시켰다. 그 후 용액을 비드가 분산된 용액에 점적하여 12 내지 24시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, MES 버퍼를 사용하여 3회 세척하고, pH 7.4 100 mM tris 버퍼에 보관하였다. 다음으로 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 올리고-뉴클레오타이드를 비드 표면의 말레이미드기와 결합시켰다.
NH2 Bead는 아민 작용기가 있는 비드를 의미하고,
Mal_NH2 Bead는 NH2 Bead에 말레이미드기가 개질된 비드를 의미하고,
GP6-16_Mal_NH2 Bead는 Mal_NH2 Bead에 GP6-16 프라이머가 결합한 비드를 의미하고,
GP6-50_Mal_NH2 Bead는 Mal_NH2 Bead에 GP6-50 프라이머가 결합한 비드를 의미한다.
비교예 2. 실리카 비드
추가적인 비교예 2로는 바이오니아사의 실리카비드(AccuNanoBeadTM Silica Magnetic Nanobeads, size 400 nm, Catalogue number (TA-1010-1), 바이오니아)를 이용하였다.
실험예 1. 비드 복합체의 형태학적 특성
1.1. 비드 복합체의 평균 입자 크기 측정
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 비드 복합체의 비드의 입자 크기를 알아보기 위해 dynamic light scattering(DLS)를 이용하여 평균 입자 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다.
DLS는 SEM, TEM과 같은 microscopy method와 다르게, 물리적인 diameter만 측정을 하는 것이 아닌 입자 표면에 흡착된 분자층(polymer, surfactant)을 포함한 두께 및 solvation layer를 측정한다. 따라서 입자 크기를 측정하면 입자 표면에 변화가 생겼는지 간접적으로 판단할 수 있는 지표가 된다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, Epoxy Bead, PEI_Epoxy Bead, Mal_PEI_Epoxy Bead, GP6-16_Mal_PEI_Epoxy Bead, GP6-50_Mal_PEI_Epoxy Bead의 평균 입자크기는 각각 552.5, 679.8, 644.2, 927.6, 846.9 임을 알 수 있다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, NH2 Bead, Mal_NH2 Bead, GP6-16_Mal_NH2 Bead, GP6-50_Mal_NH2 Bead의 평균 입자크기는 각각 433.9, 586.7, 736.8, 1025.0 임을 알 수 있다.
도 3a 및 3b에서 나타난 것과 같이 표면에 새로운 작용기를 축합할 경우, 크기가 점진적으로 증가하는 경향을 확인할 수 있었다.
1.2. 제타전위측정기(Zetasizer)를 이용한 비드의 평균 표면전하 측정
상기 실시예 1 및 비교예 1의 제조 과정 중의 비드의 평균 표면전하를 알아보기 위해 제타전위측정기를 이용하여 표면전하를 측정하였고, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타냈다.
Zeta potential(제타전위)은 입자 주위에 존재하는 액상층의 전하를 측정하여 확인한다. 입자 주위에는 2가지의 액상층이 존재하게 되는데, 이온이 강한 경계를 이루는 내부층과 약하게 결합되어 있는 외부영역으로 구성된다. 외부영역은 확산층(diffuse layer)라고 하며, 이 확산층의 전위를 제타전위라고 명명한다. 이러한 제타전위는 분산액 내에서 하전된 입자들 간의 반발력의 정도를 나타내므로 입자의 안정성을 평가하는 척도로 사용된다. 또한 안정성 외에도 표면의 전하를 측정할 수 있기 때문에 새로운 작용기가 붙었는지 확인할 수 있는 지표로도 사용된다. 위의 실험에서는 새로운 작용기가 붙었는지 확인하는 보조적인 지표로 사용하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, Epoxy Bead, PEI_Epoxy Bead, Mal_PEI_Epoxy Bead, GP6-16_Mal_PEI_Epoxy Bead, GP6-50_Mal_PEI_Epoxy Bead의 평균 표면전하는 각각 -26.22, 46.41, -26.88, -33.21, -22.73 임을 알 수 있었다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, NH2 Bead, Mal_NH2 Bead, GP6-16_Mal_NH2 Bead, GP6-50_Mal_NH2 Bead의 평균 표면전하는 각각 17.70, -25.35, -24.94, -12.50 임을 알 수 있다.
상기 결과로부터 실시예 1 및 비교예 1의 제조 과정 중에 있어서, 비드 표면에 새로운 작용기가 부착된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 임상검체를 이용한 핵산 분자의 추출 효율 평가
2.1. 핵산의 검출
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 복합체와 비교예 2의 DNA 분리 가능성을 확인하기 위해, 세포 유리 DNA(cell free DNA, cfDNA)의 포집 및 회수 효율을 평가하였다.
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 각각 제조된 비드 복합체가 특정 cfDNA에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위하여 HPV 및 성매개병(sexually transmitted disease, STD) 양성이력이 있는 액상검체를 준비하였다. 비드 복합체의 최적 추출 pH (8-9)를 고려하여. pH 8.5 1M tris 완충액, 200mM EDTA (ethylenediamine-N, N, N', N'- tetraacetic acid) 용액을 1:9 비율로 액상검체와 섞어주었다. kingfisher Magmax 96 Cell-Free DNA isolation kit를 이용하여 Kingfisher 장비를 이용하여 kingfisher magmax protocol을 이용하여 추출을 진행하였다.
2.2. PCR을 이용한 핵산 추출 효율 평가
상기 추출한 cfDNA 중 HPV cfDNA와 STD cfDNA의 증폭여부를 확인하기 위하여 추출 용액에 Taq polymerase, primer, probe, dNTP, Evargreen을 넣고 실시간 PCR(real time PCR, RT-PCR)을 진행하였다.
HPV PCR의 경우, Invitrogen사의 platinum Ⅱ Hot start DNA Taq polymerase, dNTP, MgCl2 가 혼합된 mixture 12 μl, 자사의 GP5 & GP6 타겟팅 서열이 들어간 primer 5 μl, TE buffer 0.8 μl, EvaGreen 1.2μl, urine 추출물 5 μl를 사용하였다.
핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 95℃에서 10분 동안 처리하고, 95℃에서 20초, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초의 핵산 증폭 사이클을 45회 수행하고, 마지막으로 60~95℃에서 5초 처리하였다.
STD PCR의 경우, 자사의 Ezplex® STD PCR Kit(체외 제허 18-828 호 분류번호[등급] : N05030.01[3])를 사용하였다. STD RQ mixture 10μl, Primer mix 6μl, urine 추출물 4μl를 사용하였다. 핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 25℃에서 2분, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 순차 처리하고, 95℃에서 20초, 60℃에서 1분의 핵산 증폭 사이클을 40회 수행하였다. 본 실시예에 따른 핵산 증폭 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5a에서 나타낸 바와 같이, HPV L1 영역에 특이적인 프라이머인 GP6-16이 합성된 실시예 1에서 제조된 비드 복합체는 비교예1, 비교예 2 보다 Cq값이 각각 1.28, 2.39 앞서 있음을 알 수 있었다. STD의 경우 비교예 2의 실리카비드가 실시예 1과 비교예 1의 비드 복합체에 비해 Cq 값이 각각 1.29, 1.35 앞서 있음을 알 수 있었다.
도 5b에서 나타낸 바와 같이, HPV L1 영역에 특이적인 프라이머인 GP6-50이 합성된 실시예 1에서 제조된 비드 복합체는 비교예1, 비교예 2의 비드보다 Cq값이 각각 1.43, 1.85 앞서 있음을 알 수 있었다. STD의 경우 비교예 2의 실리카비드가 실시예 1과 비교예 1의 비드 복합체에 비해 Cq 값이 각각 1.36, 1.19 앞서 있음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 실시예 1에서 제조된 비드 복합체가 비교예 1 및 2의 비드에 비해 HPV cfDNA에 훨씬 특이적으로 결합함을 알 수 있다. 이러한 결과는 실시예 1에서 제조된 비드 복합체가 샘플 내에서 cfDNA를 효율적으로 추출할 수 있음을 의미한다.
2.3. 전기영동을 이용한 cfDNA 추출 효율 평가
상기 추출한 cfDNA 중 HPV cfDNA와 STD cfDNA를 확인하기 위해 추출한 용액을 4 μl씩 로딩하여 150 V로 15분간 전기영동하였다. 상기 결과는 도 6에 나타내었다.
HPV의 경우, Invitrogen사의 platinum Ⅱ Hot start DNA Taq polymerase, dNTP, MgCl2 가 혼합된 mixture 12μl, 자사의 GP5 & GP6 타겟팅 서열이 들어간 primer 5 μl, TE buffer 2 μl, urine 추출물 5μl를 사용하여 실시간 PCR를 진행하였다. 실시간 PCR 진행 후 샘플 내의 표적 핵산을 증폭한 후, 아가로스 겔 상에서 전기영동 (150V, 20분)을 수행하였다. 실시간 핵산 증폭 반응(PCR)을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 95℃에서 5분 동안 처리하고, 95℃에서 20초, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초의 핵산 증폭 사이클을 45회 수행하고, 마지막으로 60℃에서 5분, 10℃에서 순차 처리하였다. STD PCR의 경우, 자사의 Ezplex® STD PCR Kit(체외 제허 18-828 호 분류번호[등급] : N05030.01[3])를 사용하였다. STD RQ mixture 8μl, Primer mix 2μl, Internal control 2μl, urine 추출물 4μl를 사용하였다. 핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 5℃에서 2분, 94℃에서 10분 동안 처리하고, 94℃에서 20초, 62℃에서 80초, 72℃에서 1분의 핵산 증폭 사이클을 40회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분, 4℃에서 순차 처리하였다. 상기 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 비드 복합체를 이용해서 cfDNA를 추출한 경우의 전기영동 결과에서 HPV에 상당하는 밴드가 더 선명하게 나타나고, 비교예 2의 실리카비드를 이용해서 cfDNA를 추출한 경우의 전기영동 결과에서 STD에 상당하는 밴드가 더 선명하게 나타나는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 실시예 1에서 제조된 비드 복합체가 비교예의 실리카비드에 비해 훨씬 특이적으로 HPV cfDNA와 결합하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 실시예 1에서 제조된 비드 복합체가 샘플 내에서 cfDNA를 효율적으로 추출할 수 있음을 의미한다.
SEQUENCE LISTING <110> SML Genetree Co.,Ltd. <120> BEAD COMPLEX FOR DETECTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHOD OF DETECTING NUCLEIC ACID USING THE SAME <130> pn220225 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP6-16 Primer <400> 1 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP6-50 primer <400> 2 gcagttaagg ttattttgca cagttgaaaa ataaactgta aatcatattc 50

Claims (18)

  1. 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드의 일 말단이 비드 표면에 축합(conjugation)한 비드 복합체로써, 상기 비드는 자성화된 비드이고, 상기 비드의 표면과 상기 올리고-뉴클레오타이드 사이가 하기 화학식 1의 구조로 결합되어 있는 비드 복합체:
    [화학식 1]
    Figure 112022073393272-pat00011
    ,
    상기 식에서 X는 수소 또는
    Figure 112022073393272-pat00012
    이고, 적어도 하나의 X는
    Figure 112022073393272-pat00013
    이고,
    상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
    상기 식에서 R2 및 R3는 각각 독립적으로 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
    상기 식에서 n은 1 내지 100,000의 정수이고,
    R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타내고, R3 오른쪽의 별표는 올리고-뉴클레오타이드의 말단에 연결되는 부위를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R2는 C2-C10 알킬렌기인 것인 비드 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R2는 C5 알킬렌기인 것인 비드 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비드는 무기 또는 유기 소재로 이루어진 것인 비드 복합체.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자는 암세포 또는 병원체에서 유래하는 것인 비드 복합체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 병원체는 병원성 바이러스 및 병원성 박테리아를 포함하는 것인 비드 복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자는 암의 발병 여부 또는 병원체 관련 질환의 감염 여부를 나타내는 마커로서의 핵산 분자인 비드 복합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자는 무세포 핵산(cell free nucleic acid)인 것인 비드 복합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 올리고-뉴클레오타이드는 5' 말단 또는 3' 말단이 티올기로 개질된 것인 비드 복합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 올리고-뉴클레오타이드는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것인 비드 복합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 올리고-뉴클레오타이드는 프라이머인 것인 비드 복합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 프라이머는 무세포 핵산(cell free nucleic acid)과 상보적으로 결합하는 것인 비드 복합체.
  14. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비드 복합체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 하기 화학식 2로 표시되는 에폭시기가 표면에 연결된 비드와 폴리에틸렌이민(PEI)을 반응시켜, 상기 비드의 표면을 아미노기가 개질된 하기 화학식 3의 구조로 변형시키는 단계;
    (b) 아미노기가 개질된 하기 화학식 3의 구조를 갖는 비드와 하기 화학식 4의 카르복실산을 반응시켜, 상기 비드의 표면을 말레이미드기가 개질된 하기 화학식 5의 구조로 변형시키는 단계; 및
    (c) 말레이미드기가 개질된 하기 화학식 5의 구조를 갖는 비드와 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하며, 말단이 하기 화학식 6의 지방족 티올로 변형된 올리고-뉴클레오타이드를 반응시켜 축합시키는 단계를 포함하는 비드 복합체를 제조하는 방법을 제공한다:
    [화학식 2]
    Figure 112022502123168-pat00014
    ,
    [화학식 3]
    Figure 112022502123168-pat00015
    ,
    [화학식 4]
    Figure 112022502123168-pat00016
    ,
    [화학식 5]
    Figure 112022502123168-pat00017
    ,
    상기 화학식 5에서 Y는 수소 또는
    Figure 112022502123168-pat00018
    이고, 적어도 하나의 Y는
    Figure 112022502123168-pat00019
    이고,
    [화학식 6]
    Figure 112022502123168-pat00020
    ,
    상기 화학식 2 내지 화학식 6에서, R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
    상기 식에서 R2 및 R3는 각각 독립적으로 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
    상기 식에서 n은 1 내지 100,000의 정수이고,
    R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타내고, R3 오른쪽의 별표는 올리고-뉴클레오타이드의 말단에 연결되는 부위를 나타낸다.
  15. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비드 복합체를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 키트.
  16. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비드 복합체를 생물학적 샘플과 반응시키는 단계;
    상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산과 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 복합체를 분리하는 단계; 및
    상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 소변, 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계는, 상기 올리고-뉴클레오타이드에 결합된 표적 핵산 분자를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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